Sintetični mikrobni konzorcij za biosintezo 2-keto-L-glukonske kisline (2-KLG): Difference between revisions

From Wiki FKKT
Jump to navigationJump to search
Line 57: Line 57:


S to raziskavo so namreč prvič pokazali povečano izražanje 2-KLG z uporabo spremenjene S.cerevisiae. Konstruiran mikrobni konzorcij naj bi se v prihodnosti uporabil v večjih fermentorjih za še večjo sintezo željenega produkta. Optimizacija bi se lahko v prihodnosti zgodila z uporabo spremenjenega seva K.vulgare [3].
S to raziskavo so namreč prvič pokazali povečano izražanje 2-KLG z uporabo spremenjene S.cerevisiae. Konstruiran mikrobni konzorcij naj bi se v prihodnosti uporabil v večjih fermentorjih za še večjo sintezo željenega produkta. Optimizacija bi se lahko v prihodnosti zgodila z uporabo spremenjenega seva K.vulgare [3].


== Viri in literatura ==
== Viri in literatura ==

Revision as of 17:33, 22 May 2022

Izhodiščni članek: Y. Wang, Li Hengchang, Liu Yu, Z. Mengyu, D. Mingzhu, Y. Yingjin, “Construction of synthetic microbial consortia for 2-keto-L-gulonic acid biosynthesis “, Synthetic and Systems Biotechnology, vol. 7.1, 481-489, 2022. doi: 10.1016/j.synbio.2021.12.001.


Uvod

Mikrobni konzorcij predstavlja dve oz. več bakterijskih ali mikrobnih skupin, ki živijo simbiotično preko izmenjavo metabolitov. Glede na to, da lahko mikrobni konzorciji, za razliko od monokultur, opravljajo še bolj zapletene naloge in delujejo v spremenljivih okoljih (pri fizioloških pogojih), so znanstveniki konstruirali sintetične mikrobne konzorcije, da bi povečali sintezo željenega produkta. Na splošnem obstajata dva pristopa konstruiranja mikrobnih konzorcijev, in sicer prvi temelji na rekonstruiranju že obstoječega naravnega konzorcija, kar je zamudno in neobetavno. Drugi pristop je de novo sestavljanje mikrobnega konzorcija s pomočjo sintezne biologije (sestavljanje modulov, genetskih elementov, vezja in metabolnih poti) v kombinaciji z omičnimi tehnikami. [1].

2-keto-L-gukonska kislina (2-KLG) predstavlja direktni prekurzor vitamina C, ki se najpogosteje proizvaja industrijsko, preko dvostopenjske fermentacije. Drugi korak v fermentaciji predstavlja pretvorba L-sorboze v 2-KLG s pomočjo mikrobnega konzorcija, ki sestavljata Ketogulonicigenium vulgare in Bacillus megaterium. K.vulgare lahko sama v majhnih količinah sintetizira 2-KLG, vendar njeno gojenje kot monokultura, v odsotnosti pomožnega seva, kaže relativno slabo rast in sintezo 2-KLG. Genomske, transkriptomske in proteomske analize so pokazale, da ta ne vsebuje ključnih encimov za sintezo določenih aminokislin kot so histidin, treonin, levcin in izolevcin, zato potrebuje kokulturo oziroma pomožni sev, ki ji bo sintetiziral manjkajoče aminokisline, B vitamine in purine. Kot pomožni sevi se v mikrobnem konzorciju s K.vulgare za povečano sintezo 2-KLG najpogosteje uporabljajo različni prokariontski mikroorganizmi (Bacillus megaterium, Bacillus thuringirnsis, Bacillus cereus). Manj pogosto pa se uporabljajo evkariontski [2].

V tej študiji so hoteli raziskati vpliv dodajanja evkariontskega mikoorganizma v mikrobni konzorcij s K.vulgare, in sicer so dodali divji in spremenjen sev S.cerevisiae, BY4741 in VTC2, ter raziskali, kako to vpliva na sintezo željenega produkta 2-KLG [3]. Spremenjeni sev S.cerevisiae VTC2, so konstruirali v njihovem laboratoriju v predhodni študiji, tako da so v divji tip S.cerevisiae BY4741 vstavili pet eksogenih modulov iz Arabidopsis. To je omogočilo prekomerno sintezo vitamina C iz glukoze [4].

Aerobna bakterija K.vulgare je neizogibno izpostavljena oksidativnem stresu kot posledica akumulacije reaktivnih kisikovih spojin (ROS), ki nastanejo pri celičnem dihanju, in s tem zmanjšajo sintezo 2-KLG. Nastajanje ROS je zmanjšano zaradi celičnega encimskega antioksidativnega sistema, sestavljenega iz superoksid dismutaze (SOD), katalaze (CAT), peroksidaze; in neencimskega, sestavljenega iz glutationa, NADPH, trioreduksina, vitamina C itd. Glede na to, da pomožni sev lahko sintetizira proteaze (katalaza, glutaredoksin), in s tem pozitivno regulira izražanje antioksidativnih encimov (SOD, tioredoksin) v K.vulgare, so pri tej študiji izmerili aktivnosti encimov SOD in CAT (po 72 urni fermentaciji). Prav tako so raziskali vpliv vitamina C, kot produkta pomožnega seva S.cerevisiae VTC2 na sintezo 2-KLG v K.vulgare [3].


Rezultati

1. Transkriptomske analize


Stopnjo izražanja določenih genov, vpletenih v metabolne poti in povezanih s sintezo 2-KLG v konstruiranem sevu S.cerevisiae VTC2 in divjem tipu S.cerevisiae BY4741, so zaznavali s pomočjo RNA-sekvenciranja. Opazili so, da je sinteza vitamina C v konstruiranem sevu povzročila spremembo v stopnji izražanja kar 2990 genov (1492 pozitivno reguliranih, 1498 negativno reguliranih) [3].

Večina genov, vključenih v glikolizo, je bila pri večini procesa v sevu VTC2 pozitivno regulirana v primerjavi s sevom BY4741, saj ta je imel večjo porabo glukoze. Geni vključeni v TCA pa so bili negativno regulirani v sevu VTC2 (v primerjavi s sevom BY4741), kar kaže na zmanjšano proizvodnjo redukcijskih snovi in ATP v sevom VTC2. Geni vključeni v pentozo-fosfatno pot so bili pozitivno regulirani v večji meri v sevu VTC2, kar je vodilo do povečano izražanje riboze 5-P kot glavnega prekurzorja nukleotidov. Enako velja tudi za gene, ki zapisujejo za prekurzorje vitamin C, kot tudi za gene, ki so vključeni v sintezo aminokislin Asp, Thr, Ile, Leu, Glu, Arg, Val, Lys, Gly, Cys, Pro, Ser. Transkripcijska raven izražanja genov, ki so povezani s sintezo B vitaminov, metabolizem purinov in antioksidativnih proteaz, je tudi bila povečana v sevu VTC2 v primerjavi z divjim tipa S.cerevisiae [3].

2. Izbira gojišča in konstruiranje mikrobnega konzorcija


Glede na to, da so transkriptomske analize pokazale, da ima S.cerevisiae VTC2 v primerjavi z divjim tipom več prednosti pri metabolizmu ogljikovih hidratov, aminokislin, B vitaminov, purinov in antioksidativnih proteaz, so v raziskavi postavili hipotezo, da S.cerevisiae VTC2 kot pomožni sev lahko spodbuja rast K.vulgare in izboljša sintezo 2-KLG z zagotavljanjem potrebnih metabolitov ter sodeluje pri zmanjševanju oksidativnega stresa. Konstruirali so tudi mikrobni konzorcij z divjim tipom ter naredili primerjavo med obema konzorcijema v primerjavi s sintetiziranim 2-KLG [3].

Najprej so preučevali različne vire ogljika, kot za S.cerevisiae VTC2 tudi za K.vulgare, posamezno, in skupaj v mikrobnem konzorciju. S pomočjo merjenja optične gostote se pokazali, da S.cerevisiae ne raste na gojišču, ki vsebuje L-sorbozo, ki predstavlja vir ogljika za K.vulgare. Izkazalo se je, da ima K.vulgare izboljšano rast na gojišču, ki vsebuje L-sorboze in glukoze, kar kaže na to, da lahko uporablja tudi glukozo za svojo rast, vendar dodajanje glukoze ni imelo značilnega vpliva v primerjavi s sintetiziranim 2-KLG [3].

Pokazali so, da se je pri obeh pomožnih sevih VTC2 in BY4741 v primerjavi z monokulturo dvignila raven sinteze 2-KLG. Koncentracija izločenega 2-KLG v mikrobnem konzorciju VTC2-K.vulgare je bila za 1,5-krat večja kot v monokulturi, in za 1,25-krat večja kot v mikrobnem konzorciju BY474- K.vulgare. V kombinaciji s transkriptomskimi analizami lahko sklepamo, da se sintetizirani intermediati iz metabolizma, kot so ogljikovi hidrati, aminokisline, vitamini in purini, ter antioksidirajoče proetaze, kot tudi vitamin C, ki se izločajo v gojišče, vstopijo v K.vulgare ter spodbujajo rast, ki posledično izboljša sintezo 2-KLG [3].

3. Analiza aktivnosti SOD in CAT v fermentacijskem sistemu


SOD je encim, ki zelo učinkovito spreminja superoksidne radikale v neškodljive molekule, medtem ko CAT razgrajuje vodikov peroksid na molekularni kisik in vodo. S pomočjo komercialnih kitov so zasledili, da je aktivnost SOD v mikrobnem konzorciju KV-VTC2 in KV-BY4741 bila za 6- in 4-krat večja v primerjavi s posamezno monokulturo. Vrednosti za CAT pa sta bila za 2,5- in 1,5-krat večja v primerjavi z monokulturnim sistemom. Torej, antioksidirajoči učinek v mikrobnem konzorciju VTC2-K.vulgare je večji, kot posledica povečane aktivnosti SOD in CAT ter prisotnosti vitamina C [3].

4. Vpliv vitamina C na sintezo 2-KLG

==

==

Z namenom, da bi določili, ali pride do zmanjšanja oksidativnega stresa v K.vulgare kot posledica prisotnosti vitamina C, ki ga sintetizira pomožni sev, so v monokulturo K.vulgare dodajali različne koncetracije le-tega in merili optično gostoto celic, koncentracijo L-sorboze in 2-KLG v gojišču [3].

Izkazalo se je, da K.vulgare boljše raste v prisotnosti vitamina C, in sicer optimalno rast celic in porabo L-sorboze iz gojišča so dosegli ob dodatku 20 mg/L vitamin C. Prav tako, ob isti koncentraciji vitamina C, so zasledili optimalno izražanje 2-KLG, medtem ko ob dodatku 1 mg/L in 100 mg/L vitamina C ni prišlo do izboljšav pri sintezi [3]. S tem so indirektno pokazali, da ima eksogeno dodan vitamin C pri določeni koncentraciji enak učinek kot sintetizirani v pomožnem sevu v mikrobnem konzorciju oziroma, da poveča rast K.vulgare in koncentracijo 2-KLG [3].

Zaključek

Predstavljena študija je prikazala, da tudi kvasovke lahko delujejo popolnoma učinkovito, kot pomožni sevi v simbiozi s K.vulage, in povečajo produkcijo 2-KLG preko izmenjave metabolitov, saj je S.cerevisiae eden izmed najbolj uporabljenih modelnih organizmov za industrijsko rabo. Optimizacijo so dosegli z uporabo genetsko spremenjenega seva S.cerevisiae VTC2 [3].

Efektivno simbiozo med obema sevoma so dosegli z uporabo dveh različnih virov ogljika v gojišču, in sicer glukozo za S.cerevisiae in L-sorbozo za K.vulgare, saj so na ta način preprečili tekmovanje med njima za enak substrat, kar bi lahko vplivalo na sintezo 2-KLG. ROS kot stranski produkti aerobnega metabolizma lahko poškodujejo celične proteine, lipide, DNA v K.vulgare, in s tem omejijo njeno rast ter sintezo 2-KLG. Uporaba pomožnega seva S.cerevisie VTC2, ki je v večji meri izražal SOD, CAT in vitamin C, je torej zmanjšal oksidativni stres v K.vulgare, in povečal raven izražanja 2-KLG. Pomožni sev je tudi v povečani meri sintetiziral manjkajoče aminokisline v K.vulgare, B vitamine in purine, ki naj bi jih ta prevzela in izkoristila za svojo rast [3].

S to raziskavo so namreč prvič pokazali povečano izražanje 2-KLG z uporabo spremenjene S.cerevisiae. Konstruiran mikrobni konzorcij naj bi se v prihodnosti uporabil v večjih fermentorjih za še večjo sintezo željenega produkta. Optimizacija bi se lahko v prihodnosti zgodila z uporabo spremenjenega seva K.vulgare [3].

Viri in literatura

[1] K. Höffner, P. I. Barton, “Design of Microbial Consortia for Industrial Biotechnology “, KeAi, vol. 34, 65-74, 2014. doi: 10.1016/B978-0-444-63433-7.50008-0.

[2] Q. Ma, W. Zhang, L. Zhang, B. Qiao, C. Pan, H. Yi, L. Wang, YJ. Yuan, “Proteomic analysis of Ketogulonicigenium vulgare under glutathione reveals high demand for thiamin transport and antioxidant protection“, PLoS One, vol.7(2), e32156, 2012. doi: 10.1371/journal.pone.0032156.

[3] Y. Wang, Li Hengchang, Liu Yu, Z. Mengyu, D. Mingzhu, Y. Yingjin, “Construction of synthetic microbial consortia for 2-keto-L-gulonic acid biosynthesis “, Synthetic and Systems Biotechnology, vol. 7.1, 481-489, 2022. doi: 10.1016/j.synbio.2021.12.001.

[4] Z. Mengyu, B. Yanhui, D. Mingzhu, Y. Yingjin, “One-Step Biosynthesis of Vitamin C in Saccharomyces cerevisiae “, Frontiers in Microbiology, vol.12, 2021. doi: 10.3389/fmicb.2021.643472.