View source for Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science  2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA PRI MIŠIH'''


== Uvod ==


Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času <sup>[1]</sup>. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom <sup>[2]</sup>.	Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši.  Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==


Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) <sup>[3]</sup>. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) ''OPN4'' uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca<sup>2+</sup>.  Te edinstvene lastnosti se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje <sup>[4]</sup>.

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==



=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===


OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca<sup>2+</sup> in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca<sup>2+</sup> iz zunajceličnega okolja v celico  z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca<sup>2+</sup>, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo,  izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje P<sup>NFAT</sup> ter sproži izražanje transgena <sup>[5]</sup>.
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi ''OPN4'' in ''TRPC'' kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje ''OPN4'' v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« <sup>[4]</sup>.

=== Rezultati in ugotovitve ===


Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja <sup>[5]</sup>.
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (P<sub>hCMV</sub>-melanopsin-pA<sub>sv40</sub>) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem P<sub>NFAT</sub>, pGL4.30 (P<sub>NFAT</sub> -luc2P-pA<sub>SV40</sub> ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x10<sup>18</sup> fotonov s<sup>-1</sup> m<sup>-2</sup>. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah <sup>[5]</sup>.
 
Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (P<sub>hCMV</sub>-melanopsin-pA<sub>SV40</sub>) in pHY30 (P<sub>NFAT</sub> -SEAP-pA<sub>SV40</sub>), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem P<sub>NFAT</sub> in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh <sup>[5]</sup>.

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x10<sup>5</sup> pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP <sup>[5]</sup>.

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s P<sub>NFAT</sub> (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA <sup>[5]</sup>.

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov <sup>[5]</sup>.


== Primer možne klinične uporabe ==


Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi.  S polprepustnostjo  bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja.  Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP-1 nivo dovolj visok bi lučko ugasnili <sup>[6]</sup>.


== Zaključek ==


Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje <sup>[3]</sup>.


== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5. 

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science  2011, 1565-1568. 

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.