Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)

Povzeto po članku:S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E. coli strains. Nat. Commun. 2022, 13.

Uvod

Ekspresija proteinov obsega več korakov in zahteva poznavanje več sistemov. Da učinkovito izražamo proteine v bakterijskih celicah moramo razumeti potek transkripcije in translacije. Za razliko od različnih možnosti uravnavanja izražanja proteinov na transkripcijskem in translacijskem nivoju, je na regulacijo števila kopij plazmidov v celici težje vplivati. Vsak plazmid ima fiksno število kopij v bakterijski celici, na katerega navadno ne moremo vplivati. Da bi našli pravo število kopij plazmida v celici, ki je potrebno za ekspresijo proteina, moramo za vsak eksperiment naš konstrukt klonirati v vektorje z različnimi števili kopij v celici in te vektorje transformirati v bakterijske celice. Pri tem dolgotrajnem delu pogosto pride do napak, zato so razvili sistem Tulip (TUnable Ligand Inducible Plasmid), ki omogoča enostavno in učinkovito spreminjanje števila kopij plazmida v celici [1, 2].

Razvoj Tulipa

Plazmid pSC101

Delovanje Tulipa temelji na mehanizmu podvojevanja plazmida pSC101. Ta plazmid v svojem zapisu vsebuje gen za protein repA, ki je dolg 316 aminokislin in se lahko v monomerni obliki veže na vezavno mesto na mestu ori plazmida pSC101. Vezan tvori povezavo z drugimi proteini in spodbudi podvojevanje plazmida. Ob višji koncentraciji v celici protein repA tvori dimere. Kot tak se ne more vezati na vezavno mesto na mestu ori in ne more spodbujati procesa podvojevanje, ampak se veže na lastno regulatorno regijo in inhibira lastno transkripcijo. Zaradi ravnotežja med monomerno in dimerno obliko proteina repA, je število kopij plazmida pSC101 navadno omejeno na 3 kopije na celico [1, 3].

Mutacije v proteinu repA

Mutacije v zapisu za protein repA lahko zmanjšajo medsebojno afiniteto monomerov, da bi tvorili dimere, kar vpliva na število kopij plazmida v celici. Z mutacijami ključnih aminokislinskih ostankov, pomembnih za dimerizacijo, so dobili več mutant proteina repA, katerih zapise so vgradili v vključek, ki je imel vključen še zapis za robustno obliko zelenega fluorescenčnega proteina (sfGFP) pod konstitutivnim promotorjem. Merili so fluorescenco sfGFP v odvisnosti od števila kopij plazmida v celici, ki so ga merili s PCR v realnem času. Ugotovili so, da je fluorescenca sfGFP sorazmerna s številom kopij plazmida v celici [1]. V naslednjem eksperimentu so delali z mutiranim repA, ki ni več tvoril dimerov (repAv7), se je bil pa še vedno zmožen vezati na svoje vezavno mesto na mestu ori plazmida pSC101. Zapis za repAv7 so dali na drug plazmid pod inducibilni promotor PCymRC. Na operatorsko regijo pred promotorjem PCymRC se veže represor cymRAM. Ob prisotnosti kuminske kisline (4-izopropil benzojska kislina), ki se veže na cymRAM, se cymRAM ne more več vezati na opreratorsko regijo in transkripcija genov pod promotorjem PCymRC lahko steče. Poleg tega vektorja so v bakterijske celice transformirali še divji tip vektorja pSC101 z zapisom za sfGFP pod konstitutivnim promotorjem. Ob dodatku kuminske kisline v gojišče pride do sinteze repAv7, ki se veže na mesto ori plazmida pSC101 in inducira njegovo podvojevanje. Ob povečanju koncentracije kuminske kisline so zaznali večjo fluorescenco sfGFP in večje število kopij vektorja pSC101 v bakterijskih celicah [1, 4].