Super

From Wiki FKKT

(Difference between revisions)
Jump to: navigation, search
(Uvod)
(Izražanje tarčnih genov v koreninah tobaka)
Line 15: Line 15:
===Izražanje tarčnih genov v koreninah tobaka===
===Izražanje tarčnih genov v koreninah tobaka===
-
1,2,3 – TCP se povečini nahaja v podtalnici in onesnaženih tleh, zato je bil načrt narediti tak konstrukt, ki bi omogočil izražanje tarčnih genov le v koreninah rastline tobaka. Da bi ragradnjo usmerili v korenine in s tem dobili večjo učinkovitost, so konstitutivni promotor CaMV35s zamenjali z rastlinskim koreninsko-specifičnim promotorjem PYK10 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2286005 BBa_K2286005]) iz ''Arabidopsis thaliana''. Hkrati je bil v vektor vključen še gen za citokinin oksidazo CKX3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2286004 BBa_K2286004]), ki z razgradnjo citokinina vpliva na razvoj rastline. S prekomernim izražanjem gena pa bi pospešili razvoj koreninskega sistema omogočil hitrejšo rast korenin.
+
1,2,3 – TCP se povečini nahaja v podtalnici in onesnaženih tleh, zato je bil načrt narediti tak konstrukt, ki bi omogočil izražanje tarčnih genov le v koreninah rastline tobaka. Da bi ragradnjo usmerili v korenine in s tem dobili večjo učinkovitost, so konstitutivni promotor CaMV35s zamenjali z rastlinskim koreninsko-specifičnim promotorjem PYK10 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2286005 BBa_K2286005]) iz ''Arabidopsis thaliana''. Hkrati je bil v vektor vključen še gen za citokinin oksidazo CKX3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2286004 BBa_K2286004]), ki z razgradnjo citokinina vpliva na razvoj rastline. S prekomernim izražanjem gena pa bi pospešili razvoj koreninskega sistema in omogočili hitrejšo rast korenin.
===Izvencelično izražanje tarčnih genov===
===Izvencelično izražanje tarčnih genov===

Revision as of 16:04, 15 January 2018

Contents

Uvod

Slabost napredka v kmetijstvu in kemični industriji so zagotovo negativni učinki toksičnih in težko razgradljivih spojin. Eden nevarnejših onesnaževalcev okolja, predvsem podtalnih voda, je halogenirana organska spojina 1,2,3-trikloropropan (1,2,3-TCP). Letna proizvodnja znaša okoli 50 tisoč ton, od tega se večinoma uporablja v kemični industriji kot topilo ali kot prekurzor za sintezo drugih kemikalij, npr. dikloropropena, v kmetijstvu pa kot hlapni pesticid - fumigant. Zaradi masovne proizvodnje je 1,2,3-TCP pogosto prisoten na zapuščenih industrijskih mestih, od koder prehaja v podtalnico in nato v pitno vodo. V preteklih 10-ih letih so v več državah dokazali prisotnost v pitni vodi, saj zaradi majhnega adhezijskega koeficienta vanjo lažje prehaja in s tem ogroža okolje ter zdravje ljudi.

1,2,3-TCP se v naravi težko razgradi, saj ni organizma, ki bi ta toksičen odpadni produkt lahko učinkovito odstranjeval. Načini odstranjevanja vključujejo uporabo aktivnega oglja ali reduktivno deklorinacijo z ničvalentnim železom, vendar so te metode za uporabo pri naravnih pogojih precej neučinkovite in drage. Pretekli poskusi razgradnje z bakterijami E. coli na iGEM2013 niso bili uspešni, zato se je ekipa iGEM2017 s kitajske univerze UESTC odločila uporabiti metodo fitodegradacije s pomočjo »Super tobaka«.

Cilj projekta je bilo skonstruirati encimsko pot v rastlini tobaka za petstopenjsko razgradnjo 1,2,3-TCP v netoksičen glicerol. Iz preteklih študij je bilo znano, da sistem vključuje tri ključne encime: mutanto haloalkan dehalogenaze (DhaA31, BBa_K1199043) iz Rhodococcus rhodochrous in mutanto halohidrin dehalogenaze (HheC-W249P, BBa_K2286000) ter epiklorohidrin epoksid hidrolazo (EchA, BBa_K2286003), obe izolirani iz Agrobacterium radiobacter AD1.

Konstrukcija poti za razgradnjo 1,2,3 - TCP

Vektor, ki bi omogočil razgradnjo 1,2,3 – TCP v glicerol, so postopno pripravili v rastlinskem ekspresijskem vektorju piGEM2017, z zapisom za odpornost na kanamicin (NptII).

Izražanje genov za DhaA31, HheC-W249P in EchA v tobaku

Za izražanje tarčnih genov v tobaku so najprej naredili optimizacijo kodonov, potem pa so sintetizirali posamezne gene za encime DhaA31, HheC-W249P in EchA. Z uporabo virusnega peptida 2A in metode Golden Gate so uspešno vnesli posamezni tarčni gen v vektor piGEM2017 (skelet), pod kontrolo konstitutivnega promotorja CaMV35s. V četrti vektor so vnesli vse tri gene, v zadnjega pa le dva; dobili so naslednje vektorje: piGEM2017-001 (DhaA), piGEM2017-002 (HheC-W249P), piGEM2017-003 (EchA), piGEM2017-004 (DhaA, HheC-W249P in EchA) ter piGEM2017-005 (DhaA, HheC-W249P)

Izražanje tarčnih genov v koreninah tobaka

1,2,3 – TCP se povečini nahaja v podtalnici in onesnaženih tleh, zato je bil načrt narediti tak konstrukt, ki bi omogočil izražanje tarčnih genov le v koreninah rastline tobaka. Da bi ragradnjo usmerili v korenine in s tem dobili večjo učinkovitost, so konstitutivni promotor CaMV35s zamenjali z rastlinskim koreninsko-specifičnim promotorjem PYK10 (BBa_K2286005) iz Arabidopsis thaliana. Hkrati je bil v vektor vključen še gen za citokinin oksidazo CKX3 (BBa_K2286004), ki z razgradnjo citokinina vpliva na razvoj rastline. S prekomernim izražanjem gena pa bi pospešili razvoj koreninskega sistema in omogočili hitrejšo rast korenin.

Izvencelično izražanje tarčnih genov

Vsi trije encimi opravljajo svojo vlogo zunajcelično. To so pri konstruiranju dosegli z dodatkom zapisa za signalni peptid (AO-S) pred tarčni gen (BBa_K2286002), ki poleg transporta encimov v rastlinsko celično steno omogoča stabilnejše izražanje genov. Nazadnje so skonstruirali vektor, ki je namesto gen za CKX3 vseboval še gen za reporter (ß-glukoronidaza - GUS), s čimer so preverili funkcionalnost multigenskih rastlinskih ekspresijskih vektorjev.

Transformacija tobaka in izbira ustreznih rastlin

Za vnos tujih genov v tobak, ki sodi med dvokaličnice, so uporabili transformacijo z Agrobacterium. Plazmide so vnesli v Agrobacterium EHA105, s pomočjo katere so fragment T-DNA s tarčnimi geni integrirali v kromosom tobaka. Po približno desetih tednih so preko rastlinske tkivne kulture (kalusa) dobili transgeni tobak. Z ekstrakcijo genomske DNA prve generacije transgenskega tobaka in reakcije PCR, za pomnoževanje tarčnih genov DhaA31, HheC-W249P in EchA, so izbrali transgene rastline z ustreznim vključkom. V primerjavi z divjim tipom je bilo pomnoževanje uspešno, kar kaže na uspešno izražanje genov za multiencimski sistem. Prisotnost in delovanje multiencimskega sistema so dokazali še s histokemijskem obarvanjem z X-gluc. Korenine transgenih rastlin, z vključenim genom GUS, so bile po 24-ih urah obarvane modro.

Rezultati

Za detekcijo aktivnosti multiencimskega sistema in vitro oz. za določitev koncentracij vseh metabolitov razgradne poti 1,2,3 – TCP so uporabili plinsko kromatografijo. Na projektu so se osredotočili le na aktivnost encimov v listih.

Aktivnost encimov

Aktivnost DhaA31 (piGEM2017-001), ki pretvori 1,2,3–TCP v 2,3-dikloropropan-1-ol (2,3–DCP), je bila po dodatku 5 mM 1,2,3–TCP višja, kot pri divjem tipu tobaka, kjer intermediata 2,3–DCP niso detektirali. Pri tobaku z vključenim piGEM2017-002 so aktivnost mutante HheC-W249P detektirali pri dodatku obeh substratov (2,3-DCP in CPD), niso pa zaznali razgradnih produktov (ECH in GDL). Encim HheC-W249P je v rastlinah manj stabilen, poleg tega pa se mora nahajati v aktivni obliki, ki je tetramer. Namesto optimizacije sistema so testirali aktivnost nemutiranega encima HheC, ki ga je proizvedla rekombinantna E. coli. Komponente v tobaku na njegovo aktivnost nimajo vpliva, zato so ga vključili v celotno razgradno pot 1,2,3–TCP. V sistemu uspešno deluje tudi tretji encim sistema, EchA (piGEM2017-003), ki pretvori intermediat v končni produkt glicerol. Po 7-ih urah je bila opazna razgradnja ECH v CPD tudi pri divjem tipu tobaka, saj je EchA tudi endogeni encim.

Celotno razgradno pot v tobaku so testirali tako v listih tobaka s piGEM2017-004, kot tudi s piGEM2017-005, kjer je prisotna endogena epoksid hidrolaza EchA. V reakcijsko mešanico so dodali HheC, izoliranega iz rekombinantne E. coli, in spremljali uspešnost pretvorbe 1,2,3–TCP v glicerol. Proizvodnjo glicerola, končnega produkta, so spremljali s kombinacijo plinske kromatografije in masne spektrometrije (GC-MS). Glicerol se je pri obeh vzorcih proizvajal sorazmerno z razgradnjo 1,2,3-TCP, in po 30-ih urah je bila razgradnja 80-odstotna.

Aktivnost encimov v hidroponičnih raztopinah

Hidroponika je breztalna tehnika vzgoje rastlin, ki temelji na uporabi hranilnih raztopin, bogatih z minerali. S to tehniko so člani ekipe preverili delovanje njihovega »super tobaka« v vodnem okolju. V ta namen so rastline presadili v hranilne raztopine s 5mM substratom in meritve so pokazale uspešno delovanje DhaA31 in EchA ob dodatku HheC v medij, le pri piGEM2017-004 glicerola ni bilo zaznati, saj se je najverjetneje vključil v rastlinski metabolizem.

Modeliranje

Za natančen vpogled v dinamiko encimskega sistema so sestavili matematični model, postavljen model pa preverili z vstavljanjem eksperimentalnih podatkov, pridobljenih iz znanstvenega članka. Na podlagi rezultatov so nato s pomočjo modela optimizirali sistem in sicer so izbrali ustrezno mutirane encime ter določili njihova optimalna stehiometrična razmerja v vsaki stopnji razgradne poti. Pri tem so upoštevali faktorje, ki otežujejo študije, kot je npr. inhibicija encima z enim od produktov ali afinitet encima do različnih substratov.

Personal tools