The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo

The Chlamy Cleaner [1] je iGEM-projekt iz leta 2020, ki je bil nagrajen s prvim mestom za najboljši projekt na področju rastlinske sintezne biologije. Avtorji projekta so študentje Univerze Sorbonne v Parizu.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Sorbonne_U_Paris

Onesnaženje reke Sene

Sena je reka, ki teče skozi Pariz. Vanjo se izteka veliko odpadnih vod iz gospodinjstev in kmetijstva, zato se sooča z velikim onesnaženjem. Čeprav je danes na reki postavljenih že več čistilnih naprav, le-te ne morejo odstraniti nekaterih mikroonesnaževalcev, kot so antibiotiki, sintetični hormoni in pesticidi [2].

Atrazin

Analize vode v reki Seni so pokazale, da je prisotno močno onesnaženje z atrazinom in njegovimi razgradnimi produkti (dietil atrazin, dezizopropil atrazin).

Atrazin je triazinski herbicid, ki je bil včasih zelo pogosto uporabljen za odstranjevanje plevela [3]. Deluje kot inhibitor fotosistema II in prepreči vezavo plastokinona B [4]. Posledica tega je prekinitev elektronske transportne verige in s tem tudi fotosinteze. Atrazin predstavlja veliko tveganje za človeka in okolje, zato je od leta 2003 njegova uporaba v Evropski uniji prepovedana [3]. Kljub njegovi prepovedi pa je veliko atrazina še vedno prisotnega v vodi, saj je zelo stabilen (njegova razpolovna doba v vodi je več let – lahko tudi do 14 let) [5].

Projekt The Chlamy Cleaner

Ideja

Ideja projekta The Chlamy Cleaner je bila rešiti problematiko onesnaženja reke Sene z atrazinom s pomočjo filtra iz alg, ki bi ta herbicid razgradile. Kot šasijo so izbrali zeleno algo Chlamydomonas reinhardtii, saj ima le-ta že sama po sebi dobro sposobnost bioremediacije. Lahko namreč razgradi antibiotike, hormone in druge farmacevtske spojine, npr. naravne in sintezne estrogene ter antibiotike azitromicin, ciprofloksacin in sulfapiridin [6]. Sposobnost alge za bioremediacijo pa so želeli še izboljšati z vnosom sposobnosti za razgradnjo atrazina.

Projekt je bil sestavljen iz dveh delov:

• vnos metabolne poti za razgradnjo atrazina v C. reinhardtii,

• vnos samomorilskega stikala v C. reinhardtii.

Metabolna pot razgradnje atrazina

Atrazin je organska molekula, ki so jo sposobni razgraditi nekateri mikroorganizmi, med katerimi je tudi Pseudomonas. Bakterija Pseudomonas sp. ima v svojem genomu šest genov (atzA, atzB, atzC, atzD, atzE in atzF), ki zapisujejo za encime metabolne poti razgradnje atrazina do ogljikovega dioksida in amonijaka [7].

Vnos celotne metabolne poti v C. reinhardtii bi bil zahteven, zato se je skupina odločila v algi izraziti le prve tri encime te metabolne poti. Gre za encime atrazin klorohidrolaza (atzA), hidroksiatrazin etilaminohidrolaza (atzB) in N-izopropilamelid izopropil amidohidrolaza (atzC). Razgradnja poteka tako, da najprej encim atzA pretvori atrazin v hidroksiatrazin, nato encim atzB odcepi etilamin, da nastane N-izopropilamelid, na koncu pa še encim atzC katalizira nastanek cianurne kisline in izopropilamina. Končni produkt poti je torej cianurna kislina, ki je bistveno manj toksična spojina kot sam atrazin.

Pripravili so plazmid, ki je vseboval gene atzA, atzB in atzC iz seva ADP bakterije Pseudomonas sp., pri čemer so optimizirali rabo kodona za C. reinhardtii. Uporabili so t.i. metodo Golden Gate Modular Cloning (MoClo) za C. reinhardtii [8]. Metoda temelji na uporabi restriktaz tipa IIS BbsI in BsaI. Postopek kloniranja je bil razdeljen na tri nivoje:

• nivo 0: vnos osnovnih bioloških delov preko restrikcijskih mest BbsI,

• nivo 1: združevanje osnovnih bioloških delov v transkripcijske enote preko restrikcijskih mest BsaI,

• nivo M: združevanje transkripcijskih enot v končne konstrukte preko restrikcijskih mest BbsI.

Celoten postopek kloniranja z metodo Golden Gate Modular Cloning je prikazan na tej sliki. V projektu pa so uporabili prilagojeno metodo za C. reinhardtti, ki se od klasičnega postopka razlikuje v uporabi restriktaze BbsI namesto BpiI.

Samomorilsko stikalo

Ker gre za gensko spremenjen organizem, je morala skupina poskrbeti tudi za varnost, če bi se alga razširila v naravo. Zato so poleg nove metabolne poti za C. reinhardtii pripravili še samomorilsko stikalo. Gre za apoptozno napravo, ki bi sprožila programirano celično smrt ob prisotnosti UV-svetlobe.

Kot efektorski protein, ki bi sprožil celično smrt, so uporabili nukleazo iz bakterije Staphylococcus aureus. Le-ta bi povzročila fragmentacijo DNA, kar bi sprožilo programirano celično smrt C. reinhardtii. Aktivnost nukleaze mora biti natančno regulirana, da pride do celične smrti le, ko alga uide v naravo. Zato so nukleazo modificirali tako, da so ji dodali prepoznavno mesto za proteazo TEV in transmembransko sidro. Nukleaza bi bila torej vsidrana v membrano, dokler je ne bi sprostila proteaza TEV. Poleg tega so nukleazi dodali še jedrni lokalizacijski signal (NLS), ki bi omogočil njeno potovanje v jedro, kjer bi fragmentirala DNA.

Aktivnost proteaze TEV pa je regulirana s prisotnostjo oz. odsotnostjo UV-svetlobe. Zapis za proteazo TEV so razdelili na dva dela; N-konec so fuzirali s proteinom COP1, C-konec pa s proteinom UVR-8. V prisotnosti UV-svetlobe proteina COP1 in UVR-8 heterodimerizirata, zato se proteaza TEV sestavi, postane aktivna in sprosti nukleazo iz membrane.

Filter, v katerem so bodo nahajale alge, mora biti narejen tako, da ne prepušča UV-svetlobe. Celice znotraj filtra torej preživijo, ker proteina COP1 in UVR-8 ne dimerizirata in proteaza TEV ostane neaktivna. Če pa bi alga C. reihnardtii ušla iz filtra, bi postala izpostavljena UV-svetlobi, kar bi aktiviralo proteazo TEV in posledično tudi nukleazo, ki bi sprožila programirano celično smrt.

Pripravili so plazmid, ki je vseboval tri konstrukte:

• zapis za nukleazo iz bakterije Staphylococcus aureus z dodanim NLS iz virusa SV-40, prepoznavnim mestom za proteazo TEV, transmembransko domeno proteina HAPLESS2 iz C. reinhardtii in signalnim peptidom karbonske anhidraze 1 iz C. reinhardtii,

• zapis za fuzijski protein N-končnega dela proteze TEV in proteina COP1 iz Arabidopsis thaliana, med katerima je povezovalec GSAT,

• zapis za fuzijski protein C-končnega dela proteaze TEV in proteina URV-8 iz Arabidopsis thaliana, med katerima je povezovalec GSAT.

Laboratorijsko delo in rezultati

Zaradi pandemije COVID-19 je imela skupina omejen dostop do laboratorija, zato jim ni uspelo narediti vsega, kar so načrtovali. Uspeli so pripraviti plazmida za razgradnjo atrazina in samomorilsko stikalo ter testirati toksičnost atrazina in cianurne kisline za C. reinhardtii. Ni pa jim uspelo transformirati celic C. reinhardtii s tema plazmidoma ter testirati izražanja in funkcionalnosti konstruktov.

V tabeli 1 so prikazani vsi biološki deli, ki so jih pripravili med projektom.

Tabela 1: Biološki deli, ki jih je skupina pripravila med projektom. Vsi biološki deli so bili pripravljeni v skladu s standardom MoClo za C. reinhardtii.

KODA BIOLOŠKEGA DELA	OPIS BIOLOŠKEGA DELA
BBa_K3373001	CDS gena atzA iz Pseudomonas sp. ADP z optimizirano rabo kodona za C. reinhardtii
BBa_K3373002	CDS gena atzB iz Pseudomonas sp. ADP z optimizirano rabo kodona za C. reinhardtii
BBa_K3373003	CDS gena atzC iz Pseudomonas sp. ADP z optimizirano rabo kodona za C. reinhardtii
BBa_K3373004	CDS gena za protein COP1 iz A. thaliana z optimizirano rabo kodona za C. reinhardtii
BBa_K3373005	CDS gena za protein UVR-8 iz A. thaliana z optimizirano rabo kodona za C. reinhardtii
BBa_K3373006	CDS povezovalca GSAT z optimizirano rabo kodona za C. reinhardtii
BBa_K3373007	CDS transmembranske domene proteina HAPLESS2 iz C. reinhardtii
BBa_K3373008	CDS gena za nukleazo iz S. aureus z optimizirano rabo kodona za C. reinhardtii
BBa_K3373009	CDS N-končnega dela gena za proteazo TEV z optimizirano rabo kodona za C. reinhardtii
BBa_K3373010	CDS C-končnega dela gena za proteazo TEV z optimizirano rabo kodona za C. reinhardtii
BBa_K3373011	CDS fuzijskega gena med povezovalcem GSAT in prepoznavnim mestom za proteazo TEV z optimizirano rabo kodona za C. reinhardtii
BBa_K3373012	multigenski konstrukt za metabolno pot razgradnje atrazina v C. reinhardtii
BBa_K3373014	multigenski konstrukt za samomorilsko stikalo v C. reinhardtii

Test toksičnosti so naredili tako, da so celice C. reinhardtii divjega tipa (sev D66) na trdnem gojišču TAP izpostavili različnim koncentracijam atrazina oz. cianurne kisline in jih opazovali 96 ur. Ugotovili so, da cianurna kislina nima negativnega vpliva, atrazin pa zmanjša rast celic C. reinhardtii pri koncentracijah nad 250 µg/L. Poleg tega so naredili test toksičnosti atrazina še v bioreaktorju s tekočim gojiščem TAP. Po dodatku atrazina so 50 ur spremljali optično gostoto pri 740 nm. Rastne krivulje so pokazale, da pride do inhibicije rasti pri koncentracijah atrazina nad 77 µg/L.

Rezultati kažejo, da je atrazin v visokih koncentracijah toksičen za C. reinhardtii. Z dodatkom encimov atzA, atzB in atzC bi alga atrazin lahko pretvorila v cianurno kislino, ki pa zanjo ni toksična.

Zaključek

Na tekmovanju iGEM je lansko leto na področju rastlinske sintezne biologije zmagala skupina študentov iz Univerze Sorbonne. Pripravili so projekt z imenom The Chlamy Cleaner. Gre za algni filter za čiščenje vode na reki Seni. Kot šasijo so izbrali zeleno algo Chlamydomonas reinhardtii, ki ima že sama sposobnost razgradnje antibiotikov in hormonov, dodali pa bi ji metabolno pot za razgradnjo pesticida atrazina. Kot varovalo pred razširjanjem alge v naravo bi vanjo vnesli še samomorilsko stikalo, ki povzroči celično smrt v prisotnosti UV-svetlobe.

Čeprav skupini ni uspelo dokončati vseh eksperimentov, so vseeno razmišljali o implementaciji projekta, tj. o uporabi filtra v čistilnih napravah, da bi s tem povečali sposobnost čiščenja vode reke Sene. Pred implementacijo pa bi bilo potrebno zasnovati rešitvi za naslednja izziva:

• Kje bi bila alga C. reinhardtii imobilizirana in kako bi bila zaščitena pred zunanjimi dejavniki?

• V kateri del čistilne naprave bi postavili filter? Pri tem bi bilo potrebno upoštevati, da pri razgradnji atrazina nastanejo stranski produkti, ki se tudi morajo odstraniti iz vode.

Viri

[1] iGEM 2020 Team Sorbonne U Paris. The Chlamy Cleaner. [citirano 25.3.2021]. Dostopno na: https://2020.igem.org/Team:Sorbonne_U_Paris.

[2] Technische Universität Hamburg.Operation and management of wastewater treatment plants: Wastewater treatment plant. [citirano 31.3.2021]. Dostopno na: https://cgi.tu-harburg.de/~awwweb/wbt/emwater/lessons/lesson_c1/lm_pg_1466.html.

[3] He, H., Liu, Y., You, S., Liu, J., Xiao, H. in Tu, Z. A review on recent treatment technology for herbicide atrazine in contaminated environment. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2019, 16, 24, str. 1-17.

[4] Zhu, J., Patzoldt, W. L., Radwan, O., Tarnel, P. J. in Clough, S. J. Effects of Photosystem‐II‐Interfering Herbicides Atrazine and Bentazon on the Soybean Transcriptome, Plant Genome, 2009, 2, 2, str. 191–205.

[5] Lazorko-Connon, S. in Achari, G. Atrazine: Its occurrence and treatment in water. Environmental Reviews, 2009, 17, str. 199–214.

[6] Hom Díaz, A. Degradation of pharmaceutical compounds by microalgae: Photobioreactor wastewater treatment, biomass harvesting and methanization. 2016.

[7] Martinez, B., Tomkins, J., Wackett, L. P., Wing, R. in Sadowsky, M. J. Complete nucleotide sequence and organization of the atrazine catabolic plasmid pADP-1 from Pseudomonas sp. strain ADP. Journal of Bacteriology, 2011, 183, 19, str. 5684–5697.

[8] Crozet P. et al., Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga Chlamydomonas reinhardtii. ACS Synthetic Biology, 2018, 7, 9, str. 2074–2086.