View source for To bee...Hornet to bee, ali uporaba bakterij za boj proti invazivni vrsti

To bee…Hornet to bee  je projekt francoske študentske ekipe iz univerze v Poitiersu, ki je na tekmovanju iGEM 2019 prejel zlato medaljo. Glavni cilj ekipe je bila priprava sintezno biološkega sistema za proizvodnjo učinkovin uporabnih pri zatiranju azijskega sršena.

Spletna stran projekta To bee...Hornet to bee, iGEM 2019, Poitiers https://2019.igem.org/Team:Poitiers <ref> iGem 2019 team Poitiers. To bee…Hornet to bee, or using bacteria to fight against an invasive species [citirano dne 16.5.2020] https://2019.igem.org/Team:Poitiers</ref>

Avtor povzetka: Primož Bembič 
 
=='''Uvod'''==
V zadnjih desetletjih je, skupaj z globalno trgovino ter hitrim in enostavnim transportom dobrin po vsem svetu, prišlo tudi do povečanega širjenja tujerodnih oz. invazivnih rastlinskih in živalskih vrst. Tujerodne vrste običajno v novem okolju nimajo naravnih sovražnikov oz. obstoječi organizmi niso prilagojeni na njihovo prisotnost, kar predstavlja veliko grožnjo lokalnim ekosistemom.

===Azijski sršen===
Eden izmed takih primerov je pojav azijskega sršena (''Vespa velutina nigrithorax'') in njegov vpliv na populacijo čebel v nekaterih evropskih državah. V Evropi so ga prvič opazili leta 2004 na jugozahodu Francije, od tam pa se je hitro razširil v vse sosednje države. Poglavitno težavo predstavlja dejstvo, da večinski delež prehrane azijskega sršena predstavljajo čebele. Te so glavni opraševalec približno 80 % vseh rastlinskih vrst, približno  eno tretjino teh pa predstavljajo rastline, ki jih uporabljamo za prehrano. Močan upad njihovega števila bi tako pomenil veliko ekološko katastrofo, ki bi posledično imela tudi hude ekonomsko-socialne posledice, tako zaradi izgube delovnih mest čebelarjev kakor zaradi težav pri proizvodnje hrane.


====Zatiranje azijskega sršena====
Trenutno se v Evropi uporabljata  predvsem dve metodi zatiranja azijskega sršena, ki pa imata vsaka svoje pomanjkljivosti. Prva metoda je sestavljena iz odkrivanja in uničevanja gnezd azijskega sršena. Glavna težava pri tem je dejstvo, da so gnezda v uporabi samo eno sezono poleg tega pa se običajno nahajajo visoko v krošnjah in jih je zaradi goste vegetacije težko opaziti. Poleg tega se pri uničevanju uporabljajo močni pesticidi in insekticidi, ki imajo izrazito negativen okolijski vpliv. Druga metoda temelji na lovljenju azijskih sršenov v namenske pasti, iz katerih sršen po vstopu ne more pobegniti. Vendar pa vaba, ki se pri tem uporablja privablja tudi druge, koristne žuželke, med njimi tudi čebele, ki se prav tako ujamejo v pasti in tam poginejo. <ref>Jenčič, V. in Pislak Ocepek, M.  Azijski sršen (Vespa velutina nigrithorax). Slovenski čebelar, 2015, 10, str. 320-322</ref>

=='''Projekt To Bee...Hornet to bee'''==
Študentje so se za projekt prvotno odločili na podlagi lastnih opažanj povečevanja števila azijskih sršenov, po podrobnejšem preučevanju področja pa ugotovili, da gre za problem, ki je iz leta v leto bolj pereč. Poleg tega so sklepali, da bi bila rešitev problema lahko tudi tržno zanimiva, kar jim je olajšalo predvsem iskanje investitorjev, ki so projekt podprli. 

===Ideja===
Glavni cilj projekta je bil razvoj sistem, ki bi omogočal pridobivanje vabe, ki bi bila specifična za invazivno vrsto azijskih sršenov. Pri tem so se že od začetka osredotočili na feromone. Feromoni so kemični signali, ki že v majhnih količinah sprožijo nek odziv pri pripadnikih iste vrste organizmov. Pri tem so se odločili uporabiti dva pristopa oz. dva tipa feromonov, spolne feromone (4-oksooktanojska kislina ter 4-oksodekanojska kislina) ter opozorilne feromone (2-nonanon). Kemična sinteza teh spojin je zahtevna, draga ter zahteva uporabo različnih okolju škodljivih topil. Sintezna biologija tako ponuja alternativen način pridobivanja želenih spojin na cenejši in okolju prijaznejši način.<ref> Wen, P., Cheng, Y., Dong, S.,  Wang, Z., Tan, K. in Nieh, J. C. The sex pheromone of a globally invasive honey bee predator, the Asian eusocial hornet, Vespa velutina. Scientific reports, 2017, v7, str. 1-10</ref>
<ref> Cheng, Y., Wen, P., Dong, S., Tan, K. in Nieh, J. C.  Poison and alarm: the Asian hornet Vespa velutina uses sting venom volatiles as an alarm pheromone. (2017) The Company of Biologists, 2017, v220, str. 645-651 </ref>


Zaradi tega so želeli pripravit oz. optimizirati izbrani bakterijski sev (''E. coli'' JM109), s pomočjo katerega bi lahko pridobivali vse tri tipe  želenih spojin. V ta namen so pripravili vrsto konstruktov. V vseh primerih so uporabili arabinozni promotor pBAD, s pomočjo katerega so lahko po želji oz. potrebi inducirali izražanje želenih genov  z dodatkom arabinoze v gojišče. Prav tako so v vseh primerih zraven dodali oznake (HIS-tag oz. c-myc-tag) bodisi na N ali C konec, ki so služile za detekcijo oz. izolacijo in  čiščenje izraženih proteinov.

===Sinteza spolnih feromonov===
Raziskave so pokazale, da specifična mešanica dveh komponenti spolnega feromona azijskega sršena ( 4-oksooktanojske kisline (4OOK) in 4-oksodekanojske kisline (4ODK)) sproži močan odziv pri moških pripadnikih vrste ter bi zaradi tega lahko bila uporabljena kot močan atraktant.

V okviru projekta so študentje želeli v bakteriji pripraviti sintetično pot za proizvodnjo 4OOK in 4ODK pri čemer bi kot substrat uporabili maščobne kisline. Glede na podatke iz literature so si na začetku za delo izbrali različico seva ''E. coli'' BL21, ki je bila  načrtno modificirana za povečano proizvodnjo tako prostih kakor hidroksiliranih maščobnih kislin.  Sev so pripravili raziskovalci Inštituta za bioenergijo in bioprocesno tehnologijo iz kitajskega Qingdao pri čemer so uvedli 4 spremembe, in sicer ukinitev razgradnje  prostih maščobnih kislin (delecija zapisa za acil-CoA sintetazo), uvedbo dodatnih zapisov za dva proteina (acetil-CoA karboksilazo in tioesterazo), ki sodelujeta pri sintezi prostih maščobnih kislin in prekomerno izražanje le teh ter vnos zapisa za citokrom P450 BM3 za pretvorbo prostih maščobnih kislin v hidroksilirane maščobne kisline. Izražanje vseh treh vnesenih zapisov je bilo mogoče inducirati z dodatkom IPTG-ja. Študentje so za potrebe svojega projekta želeli okarakterizirati sposobnost seva za proizvodnjo oktanojske in dekanojske kisline, pri čemer so analizirali koncentracijo posameznih spojin 24 ur po indukciji s pomočjo plinske kromatografije. Izkazalo se je, da je bila razlika v koncentraciji obeh iskanih kislin pred in po indukciji praktično enaka ter v obeh primerih prenizka za nadaljnje pretvorbe.<ref> Cao, Y., Cheng, T., Zhao, G., Niu, W., Guo, J., Xian, M. in Liu, H.  Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of hydroxy fatty acids from glucose. BMC biotechnology, 2016, v16, str. 26</ref>

Zaradi tega so se odločili za nekoliko drugačen pristop ter za nadaljnje delo uporabili drugi sev. Tega so pripravili v Raziskovalnem laboratoriju za kemijsko in biološko inženirstvo državne univerze v Iowi. Ti so pripravili modificiran sev ''E. coli'' MG1655, ki je bil sposoben prekomerne proizvodnje oktanojske kisline. Raziskovalci so to dosegli s prekomernim izražanjem genov fabZ ter izbitjem genov za fadE, fumAC in ackA.  Uporabnost seva so ponovno okarakterizirali s pomočjo  plinske kromatografije. Rezultati so bili bolj vzpodbudni, izkazalo se je, da sev proizvaja oktanojsko oz. dekanojsko kislino. Vendar pa so imeli pri analizi določene težave. Ker kolona s katero običajno analizirajo ni bila uporabna so bili primorani uporabiti drugo kolono, ki pa ni bila primerna za analizo izbranih kislin, zaradi tega niso dobili primerne ločbe spojin oz. dovolj kvalitetnih spektrov.<ref> Tan, Z., Yoon, J. M., Chowdhury, A., Burdick, K., Jarboe, L. R., Maranas, C. D. in Shanks, J. V. Engineering of E. coli inherent fatty acid biosynthesis capacity to increase octanoic acid production. Biotechnology for Biofuels, 2018, v11, str. 1–15. </ref>

Kljub temu so se odločili, da je ta različica proizvodnje končnih spojin bolj primerna in so se zato odločili pripraviti konstrukta [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3038001 BBa_K3038001][http://parts.igem.org/Part:BBa_K3038000 BBa_K3038000] (razlikujeta se samo v mestu nahajanja oznak), ki vsebujeta zapis za alkohol dehidrogenazo iz ''Bacillus stearothermophillus'' in  so ju  vnesli v sev ''E. coli'' JM109. Encim katalizira reakcije oksidacije, v tem primeru oksidacije maščobnih kislin. Sklepali so, da bi v primeru, če bi  v gojišče dodajali oktanojsko oz. dekanojsko kislino oksidacija potekla v večji meri na teh dveh kislinah in bi na ta način dobili želene produkte.

===Sinteza opozorilnih feromonov===
Poleg spolnih feromonov  so se odločili tudi za sintezo 2-nonanona, spojine, ki je prisotna v strupu azijskega sršena ter za katero je bilo pokazano, da deluje kot opozorilni feromon in sproži močan odziv azijskega sršena. Pri tem so izhajali iz prilagojenega bakterijskega seva, v katerem je bila inhibirana degradacija lipidov in s tem olajšana sinteza metil ketonov. Sev, ki je različica seva E. coli DH1 so pripravil  v Nacionalnem laboratoriju Lawrence Berkley. Sev so pripravili z delecijo genov fadE in fadA, ki sodelujeta pri pretvorbi prostih maščobnih kislin do acetil-CoA ter vnosom in prekomernih izražanjem genov fadB, fadM in acil-CoA oksidazo, kar vodi do povišane proizvodnje metil ketonov. 1 % vseh metil ketonov, ki jih tak sev proizvaja predstavlja 2–nonanon.<ref> Goh, E., Baidoo, E. E. K., Keasling, J. in Beller, H. R. Engineering of Bacterial Methyl Ketone Synthesis for Biofuels.  Applied and Environmental Microbiology, 2012, v78, str. 70–80</ref>

Na podlagi tega so želeli francoski študentje reproducirati ter nato izboljšati sev za namene pridobivanja 2-nonanona. Pripravili so več različnih konstruktov, med drugim konstrukt [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3038003 BBa_3038003] z zapisom za dolgoverižno acil-CoA tioesterazo (fadM), ki sodeluje pri beta oksidaciji maščobnih kislin ter konstrukt [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3038006 BBa_K3038006], ki je vseboval kombinacijo zapisa za acil-ACP tioesterazo (tesA), ki sodeluje pri sintezi prostih maščobnih kislin ter zapisa za acil-CoA oksidazo (Mlut_11700), ki sodeluje pri razgradnji maščobnih kislin do metil ketonov.  S tem konstrukti so transformirali termokompetentne sev E. coli JM109 ter pokazali, da je bil vnos uspešen ter jim je uspelo izraziti izbrane proteine. V naslednjem koraku naj bi sledil še test encimske aktivnosti proteinov in vitro vendar teh podatkov oz. rezultatov niso objavili.

===Priprava HPLC podatkovne zbirke iskanih spojin===
Za namene preverjanja ali bakterijski sev proizvaja želene spojine ter njihovo izolacijo so raziskovalci potrebovali ustrezno analizno metodo. Odločili so se za uporabo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC), tehnike, ki omogoča  ločbo posameznih  komponent v vzorcu. Vzorec s pomočjo mobilne faze potuje čez kromatografsko kolono (stacionarna faza), pri čemer se spojine ločijo glede na njihovo afiniteto do kolone ter imajo zaradi tega različno dolg čas zadrževanja na koloni. Večina novejših HPLC sistemov ima vgrajen spektrofotometer, kar omogoča identifikacijo spojin na podlagi njihovih absorpcijskih spektrov. Ker so bili absorpcijski spektri iskanih spojin neznani so se odločili pripraviti podatkovno zbirko, ki je vsebovala  spektre vseh treh želenih molekul (4OOK, 4DOK in 2-nonanon) ter dveh prekurzorskih spojin, oktanojske in dekanojske kisline. Čiste spojine so analizirali pri čemer so uporabili različne mobilne faze (acetonitril, metanol) ter pri tem pokazali, da je identifikacija ustreznih spojin mogoča tudi pri različnih pogojih.  S pomočjo pripravljene zbirke absorpcijskih spektrov je tako mogoče hitro in enostavno ugotoviti ali bakterije proizvajajo želene spojine s pomočjo primerjave ustreznih spektrov.

=='''Zaključek'''==
Prisotnost azijskega sršena, ki v Evropi predstavlja invazivno vrsto, zaradi ogrožanja populacije čebel predstavlja vse večji problem.  Raziskovalci so zato v okviru iGEM projekta želeli razviti sistem, ki bi omogočal sintezo izbranih spojin. Te bi nato delovale kot vaba, ki bi bila specifična za azijskega sršena. V izbrani sev ''E. coli'' JM109 so uspešno vnesli več pripravljenih konstruktov ter pokazali, da so celice ob dodatku arabinoze sposobne izražati želene proteine. Vendar pa  iz podatkov na njihovi wiki strani ni mogoče ugotoviti ali so uspešno vzpostavili sistem, ki bi omogočal sintezo vseh želenih spojin ter kakšne so pridobljene količine le teh.  Morda je vzrok temu priprava oz. zaščita patenta.

== '''Viri''' ==

<references />