Transpozoni in rak

Uvod

Transpozoni (TE) so mobilna DNA zaporedja v genomu. Aktivni TE lahko ob dodatnem zunaj ali znotrajceličnem stresu privedejo do mutacij. Zato je veliko TE epigenetsko utišanih, ob mutacijah pa se ta utišanja razveljavijo, kar lahko kot skupek vseh dejavnikov vodi do tvorbe rakavih celic in posledično do rakavih obolenj.

Epigenetske modifikacije na transpozonih

Pri obolenju zdravih celic v rakave se lahko epigenetska utišanja razveljavijo in posledično se TE aktivirajo. Epigenetske modifikacije, ki jih poznamo, so DNA metilacije, histonske modifikacije in od nekodirajočih RNA odvisno izražanje genov. Metilacije DNA so pogoste na CpG otočkih (regije na DNA, ki so v smeri 5' konec proti 3' konec, bogate s citozini in gvanini). Metilacije histona so lahko supresirajoča (metilacije) ali aktivirajoča (acetilacije), odvisno je od lokacije in stopnje, do katere je določen histon modificiran. Poleg tega poznamo še fosforilacije in ubikvitinacije histona.

Ko je retrotranspozicija LINE-1 (dolgi razpršeni nukleotidni element 1; L1) izven nadzora, pride do obolenj. Najbolj pa jo povezujemo s tvorbo raka, ko govorimo o hipometilaciji L1, saj njegova aktivacija vodi do vrsto procesov, ki prispevajo k tvorbi rakavih celic. Pri rakavih celicah opazimo, da na mestih, kjer je prvotno prišlo do metilacije (pretežno je to na CpG otočkih) oziroma utišanja, izgubimo vse te metilacije in jih pridobimo na promotorski regiji genov za kodiranje tumor supresorske proteine. Protein 53 (p53) je eden izmed tumor supresorskih proteinov, katerega mutacije so večkrat opažene v rakastih človeških celicah. Mutiran lahko reaktivira L1.

DNA metilacije so pogostejše pri mlajših TE, še posebej na ERV (endogen retrovirus, spadajo v TE razreda I), saj so bogatejše s CpG otočki kot starejše. Ob metilaciji citozina lahko pride do spontane deaminacije, kar vodi do pretvorbe citozina v timin. Dlje kot je ERV vključen v genom, več takih mutacij dobimo in posledično je tudi manj CpG otočkov na ERV. Ob tem pa ne more priti do metilacij in določen TE, ki je bil nekoč epigenetsko utišan, se lahko aktivira. To privede tudi do ekspanzije genoma.

Pri sesalcih opazimo tudi epigenetsko utišanje, ki ga vodi molekula RNA. Poznamo siRNA (mala interferenčna RNA) in miRNA (mikro RNA), obe zavirata retrotranspozicijo L1 in sodelujeta pri uravnavanju normalnega delovanja celičnih procesov. Omembe vredna je tudi piRNA (PIWI-interakcijska RNA), ki je enoverižna, ta vodi proteine PIWI (proteini izraženi predvsem v zarodni liniji, potrebni so za spermatogenezo, v povezavi s piRNA cepijo TE) do mest v genomu, ki jih je treba utišat. Tudi ta zatira retrotranspozicijo L1 v moških spolnih celicah miši in v induciranih pluripotentnih matičnih celicah ljudi.

Okoljski stresorji in tudi življenjski stil vplivajo na epigenetske spremembe na TE. Že zmerni oksidativni stres in toplotni šok zvišata pogostost transpozicije. Ob kroničnem zvišanju kortizola pa vodi do zmanjšanja demetilacij DNA, to pa povzroči aktivacijo retrotranspozonov. Zdrav življenjski stil je pozitivno vpliva na metilacijo L1, kajenje pa ravno obratno povzroči izražanje metiltransferaz. Kot zanimivost lahko še dodamo, da se je v raziskavah in vitro izkazalo, da polifenoli, kot so epigalokatehin galat, ki je prisoten v zelenem čaju in genistein v soji, inhibirajo delovanje DNA metiltransferaz in tako vplivajo na celične linije raka debelega črevesja, požiralnika, dojk in prostate. Če imamo veliko poškodb na DNA, se SIRT6 - deacetilaza, ki je vključena v popravljalne mehanizme DNA in sodeluje pri zatiranju L1 med staranjem, "izčrpa", kar omeji njeno delovanje. Izražanje L1 in njegovo mobilizacijo nadzoruje melatonin, katerega izražanje se s staranjem slabša, to pa povzroči njegovo aktivacijo. Kljub vsemu se moramo zavedati, da se različna tkiva različno odzovejo na stres, recimo pri akutnem psihološkem stresu se je v malih možganih aktivnost retotranspozona povečala, v hipokampusu pa je prišlo do trimetilacije, ki je zavirala njegovo aktivnost.

Vloga transpozonov pri rakavih obolenjih

Pri integriteti genoma imajo transpozoni ključno vlogo, zato lahko neregulirana aktivnost transpozonov privede do genomske nestabilnosti in posledično rakavih celic. Znotraj in zunajcelični dejavaniki vplivajo na celični stres in lahko aktivirajo transpozone z metilacijo in spremembami kromatina. Aktivirani transpozoni lahko nadalnje inducirajo genomsko nestabilnost, aktivacijo onkogeneze in transkripcijsko deregulacijo.

Transpozoni so sposobni spremeniti izražanje gena z insercijo v eksonsko regijo. S tem direktno vplivajo na biološko funkcijo gena, premakne se lahko tudi bralni okvir (ORF). Insercija transpozonov v intronske regije vpliva na alternativno izrezovanje genov. Nastanejo lahko napačni ali mutirani produkti. To poveča genomsko nestabilnost in poveča možnosti za nastanka mutacij. Posledica aktivnih transpozonov so tudi dvojni zlomi DNA (DSBs), ki so za celico najnevarnejši in prispevajo k genomski nestabilnosti ter lahko vodijo celico v celično smrt, mutacije ali preureditev kromosomov. DSBs nastanejo zarad endonukleaz, ki nastajajo iz avtonomnih transpozonov in delujejo kot endotoksini, ki naredijo dvojne zlome DNA na naključnih mestih v genomu. Pri nealelni homologni rekombinaciji (NAHR) lahko pride do napak pri prekrižanju med mejozo in mitozo, kar lahko privede do delecije ali duplikacije na rekombinantnih mestih.

Vloga LINE-1 (L1) pri raku

L1 je edini delujoč retrotranspozon pri človeku in ima pomembno vlogo pri genomski nestabilnosti v rakavih celicah. L1 se prepiše preko bicistronske RNA, ki kodira RNA povezovalni protein, odprt bralni okvir 1 protein (ORF1p ali p40) in endonukleazno ter reverzno transktiptazo (ORF2p). L1 elementi so v zdravih celicah epigenetsko utišani, občasno pa preidejo L1 promotorji v aktivno obliko, posledica česar je transkripcija in nastanek ORF1p proteina. ORF1p je ključen za retrotranspozicijo L1 elementov v genomu. L1 elementi se povečajo z aktivnostjo ORF2p, ki z reverznotranskripcijo prepiše L1 mRNA in vstavi L1 DNA na nov položaj v genomu. L1 elementi imajo dvojno vlogo, pri nekaterih mutacijah L1 insercije vodijo mutacije in tako direktno vplivajo na onkogeno transformacijo. V drugih primerih pa so samo zraven, vendar ne vplivajo na razvoj rakavih celic. V študiji ki je analizirala malo pod 3000 genomov iz rakov z 38 podtipi, je identificirala več vlog L1, vključno z kromoskomskimi delecijami tumor supreskorskih genov in strukturnimi spremembami. Odkrili so tudi možnost, da je zgodnja LINE reaktivacija lahko glavni faktor za nastanek rakavih celic, vendar se to zgodi v manj kot 1% primerov.

Regulacija L1 s p53

Tumor supersor P53 je eden glavnih regulatorjev, ki preprečuje raka. TP53 gen je najbolj pogosto mutiran gen pri človeških rakavih obolenjih. Študije prikazujejo nasprotujoče si dokaze o odnosu med L1 in p53. Večina dokazov kaže antagonističen odnos. P53 zavre transkripcijo Alu elementov (SINEs - kratki razpršeni jedrni elementi) z vezavo na 5' konec neprevajajoče se regije (UTR) in spodbuja adicijo histonskih metiltransferaznih proteinov, ki utišajo transkrpicijo L1. Agonističen odnos pa je bil opažen pri zarodnih celicah, kjer P53 spodbuja transkripcijo L1. Posledica česar je nastanetk ORF2p, ki povzroči dvoje zlome DNA in poveča aktivnost P53. Nastane pozitivna aktivacijska zanka, ki nakoncu celico vodi v apoptozo.

L1 retrotranspozicija inducira celični stres preko odziva na poškodbe DNA

Aktivacija L1 elementov in s tem možnost retrotranspozicije lahko aktivira odziv na poškodbe DNA in omeji le celično rast ne pa tudi retrotranspozicijske aktivnosti. To bi lahko uporabili za zdravljenje, saj z aktivacijo L1 pride do genomske nestabilnosti, kar lahko vodi do apoptoze.

Transpozoni v različnih tipih raka in zdravljenje rakovih celic s transpozoni

Transpozoni se lahko vstavljajo v eksonične regije gena, kar povzroči genetsko nestabilnost genoma. To privede do več genetskih bolezni, avtoimunskih ter nevroloških motenj ter tudi do raka. Da bi preprečili mutacijo se transpozoni nahajajo predvsem v somatskih celicah. Ko se zaradi izgube utišanja transpozoni prenesejo v maligne celice, se pojavijo rakave celice. Te izgubijo metilacije na utišanih regijah genoma in jih pridobijo na promotorskih regijah tumorskih genov. Prav tako se modificirajo histoni.

V rakavih celicah se ERV-ji pogosto izognejo epigenetskemu utišanju. Tumorji, ki imajo bolj izražen ERV imajo več demetilacijskih encimov. Odkrili so več človeških ERV-jev pri raku, ki se redko izražajo sočasno. ERV-K se izraža kot rak dojke, rak jajčnikov, rak trebušne slinavke, rak prostate in melanom. V tumorskih vzorcih raka mod je bilo metiliranih mest na DNK le 0 – 30%, medtem ko zdrava tkiva vsebujejo nekje 80 – 100% metilacij. Primerjava raka prostate in normalnih celic ni pokazala signifikantnih razlik v metilacijah na mestih, kjer ni citozin-fosfat-gvanina oz. CpG otočkov, kar dokazuje, da se značilne spremembe metilacije zgodijo ravno na teh mestih.

Sincitin-1 je edinstven primer, kjer je ERV funkcionalni gen. Pojavlja se v celicah levkemije in limfoma. Vpliv sincitin-1 se sicer razlikuje glede na vrsto raka. Spodbuja nastanek raka dojke in endotelijskih celic ter zmanjša preživetje pri bolnikih z rakom, vendar zvišuje delež preživetja pri bolnikih z rakom dojke ali debelega črevesa.

Pljučni rak je najbolj pogost rak na svetu, ki pa ima tudi najvišjo smrtnost med vsemi. Kar za 18% vseh smrti zaradi raka je bil kriv ravno pljučni rak. Mutacija genoma je pri tej vrsti raka večja kot pri drugih rakih epitelija. Zaradi tako številnih genetskih mutacij je težko določiti specifične dejavnike pri posameznih bolnikih. Pri večini je glavni dejavnik tveganja kajenje. Med glavne dejavnike tveganja spada tudi onesnaženost okolja.

Rak dojke je najpogostejši rak pri ženskah. Gensko izražanje različnih podtipov raka dojk so zelo heterogeni, zato je težko vpeljati nekakšna pravila. Točno koliko mutacij se mora zgoditi, da se pojavi tumor, še ne vemo, so pa dokazali da že 4-5 mutacij povzroči rakave celice v prsih. Glavni dejavniki so starost, pa tudi življenjski slog ter izpostavljenost okolja, kjer vključujemo onesnaženje zraka ter vpliv težkih kovin, kot sta svinec in arzen. Rak debelega črevesa in danke imenujemo tudi kolorektalni rak in je tretji najpogostejši rak na svetu oz. drugi najpogostejši rak pri ženskah ter drugi najsmrtonosnejši. Tud tu se, tako kot pri raku prostate, spremembe metilacije zgodijo na CpG otočkih. Nagnjenost k kolorektalnemu raku se povečuje s kajenjem, starostjo, življenjskim slogom in onesnaženostjo okolja.

Ugotovili so, da bi terapetvska aktivacija transpozomov sproži protitumorski imunski odziv. Pri tem se rakave celice uprejo imunskim celicam. Te jih sicer skupaj z celicami ubijalkami v nekolikšni meri ubijajo, vendar ko rak postane večji, začnejo maligne celice zavirati delovanje imunskega sistema. Z terapevtsko aktivacijo inhibirajo PD-1 in CTLA-4. To imenujemo blokada imunokontrolne točke. Odziv je povezan s količino limfocitov, ki širijo tumor in količino T-celic.

Rakave celice lahko zdravijo tudi z zaviralci DNA metiltransferaze. Ta zmanjšuje metilacijo DNK, s čimer se poviša regulacija dsRNA, ki sproži interferonsko pot. Ta se lahko poveča z dodajanjem zaviralcev HDAC in vitamina C. Zdravljenje z DNMT je povečalo izražanje ERV. Tako lahko zdravijo raka dojk, debelega črevesa, pljuč in jajčnikov.

Viri

[1] Kassiotis G. Endogenous Retroviruses and the Development of Cancer. JI. 2014;192: 1343–1349. doi:10.4049/jimmunol.1302972

[2] Zhang X, Zhang R, Yu J. New Understanding of the Relevant Role of LINE-1 Retrotransposition in Human Disease and Immune Modulation. Front Cell Dev Biol. 2020;8: 657. doi:10.3389/fcell.2020.00657

[3] Grundy EE, Diab N, Chiappinelli KB. Transposable element regulation and expression in cancer. The FEBS Journal. 2022;289: 1160–1179. doi:10.1111/febs.15722

[4] Anwar S, Wulaningsih W, Lehmann U. Transposable Elements in Human Cancer: Causes and Consequences of Deregulation. IJMS. 2017;18: 974. doi:10.3390/ijms18050974

[5] Pradhan RK, Ramakrishna W. Transposons: Unexpected players in cancer. Gene. 2022;808: 145975. doi:10.1016/j.gene.2021.145975