View source for Učinkovita biosinteza vanilina iz izoevgenola z uporabo rekombinantne izoevgenol monooksigenaze Jin1 iz bakterije Pseudomonas nitroreducens

== UVOD ==

Vanilin je organska spojina, ki se v naravi večinoma nahaja v strokih orhidej iz rodu Vanilla. Uporablja se kot aditiv v hrani, dodatek parfumom in drugim kozmetičnim izdelkom ter v farmacevtski industriji. V zadnjem času se vedno bolj raziskuje možnost biotehnološke pridelave vanilina iz različnih naravnih surovin, kot so lignin, izoevgenol, ferulična kislina in glukoza. [1,2]

Izoevgenol je cenovno ugoden substrat, ki se nahaja v eteričnem olju nageljnovih žbic. Hkrati je njegova biotehnološka pretvorba v vanilin zelo enostavna, saj je potreben le en pretvorbeni korak, ki ga katalizirata izoevgenol monooksigenaza (IEM) ali lipoksigenaza. [1,3]

Namen raziskave, ki so jo izvedli Wang in sodelavci, je bil vzpostaviti in optimizirati biotehnološki sistem proizvodnje vanilina iz izoevgenola. Uporabili so izoevgenol monooksigenazo iz seva Jin1 bakterije ''Pseudomonas nitroreducens''. Sintetični gen za IEM so vstavili v ekspresijski vektor in z njim transformirali ''E.coli'' sev BL21(DE3). Po indukciji izražanja IEM z IPTG so celice dodali v reakcijsko zmes z 10 mM izoevgenolom, kjer je v 10 minutah ob 30 °C potekla oksidacija substrata. Na ta način so preverili encimsko aktivnost. Ob optimizaciji so spreminjali posamezne pogoje reakcije. [1]

== REZULTATI ==
=== Vpliv sestave gojišča, temperature in pH gojenja rekombinantnih bakterij===

Najprej so raziskovalci preverili, kako na izražanje encima vpliva sestava gojišča. Transformirano bakterijsko kulturo so inokulirali v več različnih gojiščih, med drugim LB, M9, TB in YT gojišču. Najboljše rezultate je dalo gojišče M9. S spreminjanjem komponent tega gojišča so nato preverili še, kaj je optimalen vir ogljika in dušika. Kot najboljši vir ogljika se je izkazala glukoza (končna koncentracija v gojišču 14 g/L), kot vir dušika pa kvasni ekstrakt v obliki praška (končna koncentracija v gojišču 10 g/L). [1]

Sledila je optimizacija temperature in pH gojenja po indukciji izražanja IEM, optimalni pogoji so bili doseženi pri 25 °C in pH = 7. V optimiziranih pogojih je encimska aktivnost dosegla svoj maksimum po 16h gojenja. Celična masa je bila 5-krat višja (5 g/L), specifična encimska aktivnost pa 4,5-krat višja (409,6 U/g) kot v LB gojišču, ki so ga uporabljali v prejšnjih raziskavah. [1]

=== Vpliv kotopila, temperature, pH in koncentracije produkta na stopnjo pretvorbe substrata v produkt===

Gojenju celic v procesu biotehnološke proizvodnje vanilina sledi oksidacija izoevgenola v vanilin, ki jo katalizirajo rekombinantne bakterije E. coli. Raziskovalci so optimizirali pH in temperaturo reakcije, preverili pa so tudi, kako dodatek kotopil vpliva na topnost substrata in s tem na učinkovitost pretvorbe. Pri teh optimizacijah so uporabili 10 mM koncentracijo substrata. V nadaljevanju so preverili še, ali odstranjevanje produkta iz reakcijske zmesi vpliva na učinkovitost pretvorbe. [1]

Izoevgenol je dokaj slabo topen v vodi, zato so raziskovalci k vodi dodali še organsko topilo, ki bi izboljšalo topnost substrata ter s tem stopnjo pretvorbe substrata v produkt. Preizkusili so štiri organske spojine, in sicer metanol, etanol, izopropanol in DMSO. Kot najboljši dodatek se je izkazal DMSO v 10 % končni koncentraciji, pri čemer se je stopnja pretvorbe izboljšala za 10 %. [1]

Ker je bil encim najbolj stabilen pri pH = 9 (Gly-NaOH pufer) - po 12h je bila njegova preostala aktivnost še vedno nad 90% - je bil ta pH sprejet kot optimalen za izvedbo reakcije. Ob spremembi temperature od 15 °C do 20 °C se je stopnja pretvorba  povečala iz 67 % na 84,1 %, pri temperaturi nad 20 °C pa je bila nižja, kar bi lahko bila posledica slabe temperaturne obstojnosti encima. [1]

Ob 50 in 100mM koncentraciji substrata se je po 8 urah praktično ves izoevgenol pretvoril v vanilin. Ob višjih koncentracijah substrata pa je stopnja pretvorbe začela padati. Glede na prejšnje raziskave lahko sklepamo, da je prišlo do inhibicije s produktom. Če bi sproti iz reakcijske zmesi odvajali produkt, bi tako lahko povečali izkoristek reakcije. Raziskovalci so tako zasnovali magnetni hitozanski film iz hitozana in železovega tetroksida. -NH2 funkcionalne skupine na filmu reagirajo z aldehidno skupino vanilina, pri čemer nastane iminska skupina. Stopnja pretvorbe je po dodatku filma ob 300 mM koncentraciji substrata znašala 84 % oz. kar 36 % več kot pri istih pogojih brez hitozanskega filma. [1]

==ZAKLJUČEK==

Ob primerjavi z rezultati iz literature so raziskovalci ugotovili, da sta končna koncentracija vanilina in stopnja pretvorbe izoevgenola ob koncu optimizacije procesa najvišji med do zdaj poročanimi. To lahko pripišemo visoki encimski aktivnosti ter in-situ izolaciji produkta. Čistost produkta so preverili s HPLC, znašala je 99 %. [1]
 
==VIRI==

1. 	Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5

2. 	Zhao L, Jiang Y, Fang H, et al. Biotransformation of Isoeugenol into Vanillin Using Immobilized Recombinant Cells Containing Isoeugenol Monooxygenase Active Aggregates. Appl Biochem Biotechnol. 2019;189(2):448-458. doi:10.1007/s12010-019-02996-1

3. 	Ryu JY, Seo J, Park S, et al. Characterization of an isoeugenol monooxygenase (Iem) from Pseudomonas nitroreducens Jin1 that transforms isoeugenol to vanillin. Biosci Biotechnol Biochem. 2013;77(2):289-294. doi:10.1271/bbb.120715