Učinkovita in hitra priprava človeških iPS celic in neposredna transdiferenciacija v mioblaste s sintetično modificirano mRNA: Difference between revisions

From Wiki FKKT
Jump to navigationJump to search
(New page: =='''Reprogramiranje celic'''== Razvoj novih in boljših metod za reprogramiranje celic je zelo aktualna tema. Veliko pozornosti je usmerjeno v pripravo induciranih pluripotentnih matičn...)
 
Line 11: Line 11:


Pri transfekciji s sintetično RNA je izražanje želenih proteinov hitrejše, transfekcija je bolj kontrolirana in transfeciramo lahko več celic v primerjavi s transfekcijo z DNA. In vitro sintezo mRNA iz predhodno pripravljenih matričnih cDNA omogoča bakteriofagna T7 RNA polimeraza,  ki proizvede veliko število pre-mRNA molekul. Warren in sodelavci so optimizirali postopek sinteze mRNA, ki ni bila citotoksična in je tako omogočala učinkovito reprogramiranje celic. Matrice so pripravili z verižno reakcijo s polimerazo (PCR), pri čem so na bralni okvir pripeli 3` in 5` neprevedljivo regijo (UTR), zapis za T7 promotor ter poli T  zaporedje, ki omogoča dodatek poli A repa na prepisani mRNA. Prepisovanje je potekalo v prisotnosti T7 polimeraze, reakcijska mešanica je vsebovala matrične zapise, NTP-je in proti-vzvratni di-gvanozinski analog 5` kape (ARCA), ki je omogočil dodatek 5` kape na 80 % nastalih mRNA. Pri prepisovanju so, poleg nemodificiranih, uporabili modificirane NTP-je : 5-metil-CTP in psevdo-UTP. Namreč, RNA v sesalskih celicah je precej modificirana, zato eksogena, enoverižna, nemodificirana RNA sproži protivirusni odziv celic ter tako deluje citotoksično [4].
Pri transfekciji s sintetično RNA je izražanje želenih proteinov hitrejše, transfekcija je bolj kontrolirana in transfeciramo lahko več celic v primerjavi s transfekcijo z DNA. In vitro sintezo mRNA iz predhodno pripravljenih matričnih cDNA omogoča bakteriofagna T7 RNA polimeraza,  ki proizvede veliko število pre-mRNA molekul. Warren in sodelavci so optimizirali postopek sinteze mRNA, ki ni bila citotoksična in je tako omogočala učinkovito reprogramiranje celic. Matrice so pripravili z verižno reakcijo s polimerazo (PCR), pri čem so na bralni okvir pripeli 3` in 5` neprevedljivo regijo (UTR), zapis za T7 promotor ter poli T  zaporedje, ki omogoča dodatek poli A repa na prepisani mRNA. Prepisovanje je potekalo v prisotnosti T7 polimeraze, reakcijska mešanica je vsebovala matrične zapise, NTP-je in proti-vzvratni di-gvanozinski analog 5` kape (ARCA), ki je omogočil dodatek 5` kape na 80 % nastalih mRNA. Pri prepisovanju so, poleg nemodificiranih, uporabili modificirane NTP-je : 5-metil-CTP in psevdo-UTP. Namreč, RNA v sesalskih celicah je precej modificirana, zato eksogena, enoverižna, nemodificirana RNA sproži protivirusni odziv celic ter tako deluje citotoksično [4].
Nastale mRNA so očistili z dodatkom DNaze, ki je razgradila matrične cDNA ter fosfataze, ki je odstranila imunogene proste trifosfatne skupine iz molekul mRNA, ki niso imele kape na 5` koncu. Namreč, proste trifosfatne skupine na 5` koncih mRNA prepozna RIG-I (z retinojsko kislino inducibilen gen 1), ki sproži imunski odziv celice. Hkrati aktivirajo protein-kinazo R (PKR), ki zavre prevajanje, tako se tudi pravilno sintetizirane mRNA, ki imajo kapo, ne prevedejo v proteine [4].
 
Nastale mRNA so očistili z dodatkom DNaze, ki je razgradila matrične cDNA ter fosfataze, ki je odstranila imunogene proste trifosfatne skupine iz molekul mRNA, ki niso imele kape na 5` koncu. Namreč, proste trifosfatne skupine na 5` koncih mRNA prepozna RIG-I (z retinojsko kislino inducibilen gen 1), ki sproži imunski odziv celice. Hkrati aktivirajo protein-kinazo R (PKR), ki zavre prevajanje, tako se tudi pravilno sintetizirane mRNA, ki imajo kapo, ne prevedejo v proteine [4].


===Učinkovitost transfekcije===
===Učinkovitost transfekcije===

Revision as of 22:33, 17 January 2016

Reprogramiranje celic

Razvoj novih in boljših metod za reprogramiranje celic je zelo aktualna tema. Veliko pozornosti je usmerjeno v pripravo induciranih pluripotentnih matičnih celic (iPSC), ki kažejo potencial za uporabo pri regenerativnem zdravljenju. Obstoječe metode za pripravo iPSC so nizko učinkovite, hkrati večina metod povzroči spremembe genoma, kar predstavlja veliko tveganje pri vnosu iPSC v človeška tkiva in organe. Zato se znanstveniki osredotočajo na neintegrativne metode dediferenciacije odraslih, somatskih celic v iPSC. Primer ene od neintegrativnih metod je transfekcija celic s sintetično modificirano mRNA, ki zapisuje za faktorje pomembne za dediferenciacijo. Poleg priprave iPSC, omenjena metoda omogoča tudi transdiferenciacijo celic oziroma spremembo enega celičnega tipa v drugi.

Metode pridobivanja induciranih pluripotentnih matičnih celic

Inducirane pluripotentne celice so prvič dobili z retrovirusno transdukcijo mišjih zarodnih in odraslih fibroblastov ter nato tudi človeških odraslih fibroblastov s transkripcijskimi faktorji KLF4 (K), c-MYC (M), OCT4 (O) in SOX2 (S) [1][2]. Ker pri tem lahko pride do virusne integracije v genom, tako pridobljene iPSC niso primerne za zdravljenje. Do danes so za induciranje pluripotentnosti celic razvili veliko metod pri katerih med drugimi uporabljajo lentivirusne, transpozonske, adenovirusne in različne prehodne vektorje. Ker naštete metode temeljijo na DNA, lahko v transfeciranih celicah pride do insercijske mutageneze ali genomske rekombinacije, poleg tega integracija v genom povzroči slabo kontrolo nad izražanjem vnesenih genov [3]. Zato so razvili tudi neintegrativne metode za reprogramiranje celic, kot so transfekcija z episomalnimi plazmidi (Epi reprogramiranje), transdukcija s Sendai virusom (SeV reprogramiranje) in večkratna transfekcija s sintetično modificirano mRNA (RNA metoda). Čeprav so episomalni plazmidi cenejši, SeV reprogramiranje pa bolj robustna metoda kot transfekcija s sintetično mRNA, slednja omogoča hitrejše in učinkovitejše reprogramiranje celic ter zelo nizko stopnjo anevplodije. Prav tako je pri uporabi Epi in SeV metode potrebno dodatno preverjanje iPSC za ostanke episomalne DNA oziroma virusov, mRNA pa se po končani transfekciji hitro razgradi, saj ima kratek razpolovni čas, poleg tega se ne more podvojevati ali inegrirati v genom [4][5].

Reprogramiranje celic na osnovi RNA

Priprava sintetično modificirane mRNA in transfekcija celic

Pri transfekciji s sintetično RNA je izražanje želenih proteinov hitrejše, transfekcija je bolj kontrolirana in transfeciramo lahko več celic v primerjavi s transfekcijo z DNA. In vitro sintezo mRNA iz predhodno pripravljenih matričnih cDNA omogoča bakteriofagna T7 RNA polimeraza, ki proizvede veliko število pre-mRNA molekul. Warren in sodelavci so optimizirali postopek sinteze mRNA, ki ni bila citotoksična in je tako omogočala učinkovito reprogramiranje celic. Matrice so pripravili z verižno reakcijo s polimerazo (PCR), pri čem so na bralni okvir pripeli 3` in 5` neprevedljivo regijo (UTR), zapis za T7 promotor ter poli T zaporedje, ki omogoča dodatek poli A repa na prepisani mRNA. Prepisovanje je potekalo v prisotnosti T7 polimeraze, reakcijska mešanica je vsebovala matrične zapise, NTP-je in proti-vzvratni di-gvanozinski analog 5` kape (ARCA), ki je omogočil dodatek 5` kape na 80 % nastalih mRNA. Pri prepisovanju so, poleg nemodificiranih, uporabili modificirane NTP-je : 5-metil-CTP in psevdo-UTP. Namreč, RNA v sesalskih celicah je precej modificirana, zato eksogena, enoverižna, nemodificirana RNA sproži protivirusni odziv celic ter tako deluje citotoksično [4].

Nastale mRNA so očistili z dodatkom DNaze, ki je razgradila matrične cDNA ter fosfataze, ki je odstranila imunogene proste trifosfatne skupine iz molekul mRNA, ki niso imele kape na 5` koncu. Namreč, proste trifosfatne skupine na 5` koncih mRNA prepozna RIG-I (z retinojsko kislino inducibilen gen 1), ki sproži imunski odziv celice. Hkrati aktivirajo protein-kinazo R (PKR), ki zavre prevajanje, tako se tudi pravilno sintetizirane mRNA, ki imajo kapo, ne prevedejo v proteine [4].

Učinkovitost transfekcije

Z opisanim postopkom so pripravili modificirane mRNA zapise za mCherry in GFP, slednji je vseboval še zaporedje za jedrni lokalizacijski signal. Hkratna transfekcija BJ fibroblastov z omenjenimi modificiranimi mRNA je bila uspešna s pravilno umestitvijo proteinov v celične oddelke. Izražanje proteinov pa je bilo le prehodno, zaradi razgradnje tako RNA kot proteinov. Torej je za vzdrževanje koncentracije proteina v celici potrebna večkratna transfekcija. Ugotovili so, da slednja ne povzroči značilne spremembe v molekularnem profilu celic, nekoliko se zviša izražanje genov odzivnih na interferone, ker modifikacije mRNA ne zavrejo popolnoma interferonsko signalizacijo. Za večkratno transfekcijo se je kot najbolj primeren pristop pokazala endocitoza RNA v kompleksu s kationskim veziklom, saj je nizko imunogena in enostavna [5]. Za minimalno citotoksičnost sintetičnih RNA, so celice gojili v prisotnosti rekombinantnega B18R, ki z vezavo interferonov tipa 1 zniža parakrino signalizacijo preko le-teh in tako zviša viabilnost celic [4]. Perskey in sodelavci so preverili učinkovitost transfekcije s sintetično mRNA z izražanjem fluorescenčnega proteina mWasabi v BJ fibroblastih. Kot matrico so uporabili lineariziran komercialni vektor, ki je nosil zapis za mWasabi. In vitro sintezo so izvedli po prej opisanem postopku in celice po transfekciji gojili v prisotnosti B18R. Prisotnost mWasabi v fibroblastih so preverili po 24-ih urah in ugotovili, da je bila transfekcija uspešna v 95 % primerov. Pokazali so tudi, da uporaba modificirane mRNA da več kot dvakrat višjo intenziteto fluorescence v celicah v primerjavi z nemodificirano mRNA, torej nastane več želenega proteina [3].

Priprava iPSC ter diferenciacija iPSC v različne celične tipe

Po dokazu učinkovitosti metode, so pripravili modificirane sintetične mRNA zapise faktorjev za pripravo iPSC : KLF-4 (K), c-MYC (M), OCT4 (O), SOX-2 (S), NANOG (N) in LIN28 (L). Transfekcijo BJ fibroblastov so izvajali devet dni, pri čem so celice gojili v prisotnosti B18R. Prve kolonije iPSC so pobrali že deseti dan in jih prenesli na hranilne mišje embrionalne fibroblaste MEF. Transfekcija je bila uspešna, saj so celice izražale znotrajcelične (KMOSNL) ter površinske markerje (SSEA3, SSEA4, TRA1-60) značilne za iPSC ter so bile sposobne diferenciacije v tri zarodne plasti. Prav tako so, po šestih pasažah, imele normalen 46XY kariotip [3]. Warren in sodelavci so pripravili z RNA pridobljene iPSC (RiPSC) iz štirih človeških somatskih linij: Detroit 551 (D551), MRC-5 fetalnih fibroblastov, BJ postnatalnih fibroblastov in fibroblastom podobne celične kulture iz biopsije kože pacienta s cistično fibrozo (CF). V vseh primerih so po 18-25 dneh nastale RiPSC, ki so izražale s pluripotentnostjo povezane faktorje kot je NANOG, OCT4, SOX1, REX1, LIN28, DNMT3B, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA3 in SSEA4. Tako je bil vzorec izražanja proteinov pridobljenih RiPSC bolj podoben človeškimi embrionalnim matičnim celicam (ESC) kot starševskim fibroblastom. Nadalje, dH1f -, D551-, BJ-, CF-RiPSC so bile sposobne razvoja v embrioidna telesca (EB) in naprej v kardiomiocite, hematopoetske prekurzorske celice, Tuj-1 pozitivne nevrone in AFP (α-fetoprotein) pozitivne endodermalne celice. Tvorbo treh zarodnih plasti so potrdili in vivo v teratomih, ki so jih tvorile dH1F-,CF- in BJ-RiPSC. Iz človeških fibroblastov pridobljene RiPSC so uspeli tudi dokončno diferencirati v velike večjedrne miotube z gojenjem pri ustreznih pogojih in transfekcijo s modificirano mRNA, ki je zapisovala za MYOD1. Le-ta je vodilni transkripcijski faktor diferenciacije mišičnih celic. Nastanek miotub so potrdili z imunskim označevanjem miogenih markerjov miogenina in MyHC [4]. Transfekcija z modificiranimi mRNA kaže večjo učinkovitost in hitrejšo pretvorbo celic od metod, ki temeljijo na virusih, kar je pokazala primerjava transfekcije dH1f fibroblastov z modificiranimi mRNA (KMOS) in transdukcije z retrovirusi. V prvem primeru so se dva tedna po transfekciji kolonije iPSC že razrasle po ploščah, v drugem primeru pa so bile kolonije vidne šele štiriindvajseti dan po transdukciji. Prav tako je bila učinkovitost pretvorbe celic višja pri transfekciji z modificiranimi mRNA, saj je bila enaka 1,4 % , učinkovitost pretvorbe s transdukcijo pa je dosegla le 0,04 % [4].

Transdiferenciacija celic

Pluripotentnost somatskih celic kot tudi diferenciacijo iPSC omogoča izražanje transkripcijskih faktorjev, ki so značilni za matične oziroma različne tipe diferenciranih celic. Tako bi izražanje določenih transkripcijskih faktorjev lahko omogočilo spremembo celičnega tipa odraslih, diferenciranih celic. To so tudi pokazali z neposredno pretvorbo človeških fibroblastov v delujoče kardiomiocite [6] in mišjih fibroblastov v nevrone [7] s transdukcijo s specifičnimi transkripcijskimi faktorji. Pretvorbo fibroblastov v mioblaste so uspešno izvedli tudi s transfekcijo BJ fibroblastov s sintetično mRNA, ki je zapisovala za MYOD1. Tako pridobljeni mioblasti so bili sposobni nadaljnje diferenciacije v večjedrne miotube [3]. Z reprogramiranjem odraslih, diferenciranih fibroblastov v delujoče kardiomiocite bi se izognili predhodni tvorbi iPSC, kar zniža tveganje za razvoj tumorja [6]. Hkrati je uporaba RNA reprogramiranja neintegrativna, ter bi tako pridobljeni kardiomiociti imeli potencial pri regenerativnem zdravljenju poškodovane srčne mišice [6].

Reprogramiranje nedelečih se celic

V nasprotju z uporabo virusnih vektorjev ali drugih metod, ki temeljijo na prenosu DNA, mRNA ne zahteva delitve celice za učinkovito sintezo proteinov. Namreč, da bi se eksogena DNA prepisala v mRNA, mora vstopiti v jedro celice, kar omogoča mitoza celic. S sintetično mRNA pa bi lahko učinkovito izrazili gene v nedelečih se celicah. To so Perskey in sodelavci tudi dokazali s transfekcijo inaktiviranih MEF, ki so 24 ur po transfekciji izražali mWasabi v 80 % primerov. Torej bi nam sintetična mRNA lahko omogočila izražanje želenih genov tudi v primarnih nevronih, kar metode na osnovi DNA ne omogočajo [3].

Zaključek

Prednost transfekcije s sintetično modificirano mRNA pred virusno transdukcijo, poleg večje učinkovitosti in hitrejše pretvorbe somatskih v iPS celice, predstavlja izvajanje poskusov v laboratorijih z nižjo stopnjo varnosti, saj je biološko tveganje značilno manjše kot pri virusih. Nadalje, transfekcija z mRNA ne povzroči integracijo zapisov v genom kot je to primer pri metodah, ki temeljijo na DNA. Dosežemo tudi boljšo regulacijo izražanja proteinov, ki se, pri uporabi integrativnih vektorjev, lahko naključno spreminja. Torej je ta pristop pretvorbe odraslih, diferenciranih celic v iPSC ali diferenciacija le-teh v različne celice učinkovit, nemutagen proces, ki omogoča tvorbo iPSC višje kvalitete kot je to primer pri uporabi virusnih vektorjev. V zadnjih raziskavah so reprogramiranje na osnovi RNA še nekoliko izboljšali, tako da poleg mRNA v celice vnesejo tudi miRNA, ki inducirajo pluripotentnost. Kombinacija mRNA in miRNA je povečala stopnjo uspešnosti metode (odstotek vzorcev v katerih nastanejo vsaj tri iPSC) [8]. Razvoj reprogramiranja na osnovi RNA je znanost približal cilju, da iPSC in tkivno inženirstvo postanejo del regenerativne medicine in zdravljenja na osnovi celic, ki bo prilagojeno posamezniku.

Viri

1. Takahashi, K. in Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embrionic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126(4), 663-676 (2006).

2. Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K. in Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131(5), 861-872 (2007).

3. Perskey, D., Allison, T.F., Jones, M., Mamchaoui, K. in Unger, C. Synthetically modified mRNA for efficient and fast human iPSC cell generation and direct transdifferentiation to myoblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications 1-9 (2015). (v tisku)

4. Warren, L. in sod. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell 7, 618-630 (2010).

5. Zou, S., Scarfo, K., Nantz, M.H. in Hecker, J.G. Lipid-mediated delivery of RNA is more efficient than delivery of DNA in non-dividing cells. International Journal of Pharmaceutics 389, 232-243 (2010).

6. Ieda, M., Fu, J.D., Delgado-Olguin, P. in Vedantham, V. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell 142(3), 375-386 (2010).

7. Vierbuchen,T., Ostermeier, A., Pang, Z.P., Kokubu, Y., Südhof, T.C. in Wernig, M. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature 463, 1035-1041 (2010).

8. Schlaeger, T.M. in sod. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology 33(1), 58-63 (2015).