View source for Uporaba pristopa načrtovanja eksperimentov za optimizacijo proizvodnje rekombinantnega fragmenta protitelesa v periplazmi Escherichie coli: izbira signalnega peptida in optimalnih pogojev rasti

Proizvodnja rekombinantih proteinov je danes najpomembnejši način pridobivanja terapevtskih proteinov; leta 2015 je bilo 400 od 650 terapevtskih proteinov rezultat rekombinantne proizvodnje, vedno več pa jih je tudi v razvoju<ref>Garcia, L. S. et al. Recombinant pharmaceuticals from microbial cells : a 2015 update. Microb. Cell Fact. 1–7 (2016). doi:10.1186/s12934-016-0437-3</ref>. Echerichia coli zaenkrat ostaja najbolj uporabljena vrsta bakterije, okrog tretjina bioterapevtikov, odobrenih s strani FDA, je namreč proizvedenih v E. coli. Pomembno je torej, da dobro poznamo pogoje rasti E. coli, ki dajo čim večjo količino rekombinantnega proteina, ki pa mora biti hkrati v čim večji meri topen <ref name="dva">Kasli, I. M., Thomas, O. R. T. & Overton, T. W. Use of a design of experiments approach to optimise production of a recombinant antibody fragment in the periplasm of Escherichia coli : selection of signal peptide and optimal growth conditions. AMB Express (2019). doi:10.1186/s13568-018-0727-8</ref>. 

== Fragment protitelesa scFv 13R4 ==
V raziskavi so preučevali proizvodnjo rekombinantnega fragmenta protitelesa scFv. To je fuzijski protein, ki je sestavljen iz variabilnih regij težke in lahke verige, povezanih s fleksibilnim linkerjem. Izbrali so modelni scFv 134R.
scFv 134R so z dvema različnima signalnima peptidoma usmerili v periplazmo. To je v mnogih primerih boljše kot izražanje v citoplazmi, predvsem zaradi oksidativnega okolja, ki omogoča nastanek disulfidnih vezi. Prav tako se v periplazmi nahajajo encimi Dsb, ki katalizirajo nastanek in popravljanje disulfidnih vezi. Poleg tega se v periplazmi nahaja manj proteinov, zaradi česar se zmanjša tveganje za proteolitično razgradnjo med rastjo bakterij, prav tako pa je na tak način možna lažja izolacija, ki temelji na razgradnji zunanje celične stene, ne pa tudi notranje<ref name="dva"/>.


== Načrtovanje eksperimentov ==
V raziskavi so uporabili pristop načrtovanja eksperimentov. To je statistična metoda za preučevanje medsebojnega vpliva določenih faktorjev na nek odziv sistema. Kot odziv sistema so določili produktivnost (količino proizvedenega scFv v ug scFv na mL kulture na uro), delež scFv v periplazmi,  delež topnega scFv, delež zdravih celic in delež retencije plazmidov, od katerih pa sta bila statistično ustrezna produktivnost in delež topnega proteina, zato so se osredotočili nanju. Odločili so se za preučevanje treh faktorjev, ki vplivajo na odziv sistema: fermentacijska temperatura (25 – 40 °C), optična gostota (OD600), pri kateri so sprožili indukcijo (0,2 – 1,2) in količino induktorja (0 – 0,26 % w/v)<ref name="dva"/>.

Vse to so testirali za dva različna signalna peptida, DsbA, ki usmeri protein v periplazmo preko SRP poti (kotranslacijske) in PelB, ki deluje preko SecB (posttranslacijske) poti. V obeh primerih je bil zapis za scFv za promotorjem pBAD, kot induktor pa so uporabili arabinozo<ref name="dva"/>.


== Rezultati ==
Pri signalnem peptidu DsbA je bil najpomembnejši faktor za produktivnost temperatura. Ob zvišanju temperature, predvsem v kombinaciji z nizkim OD600 on indukciji, je produktivnost dosegla 40 ug mL-1 h-1, medtem ko je imela koncentracija arabinoze minimalen vpliv na produktivnost. Pri signalnem peptidu PelB pa je bil vpliv koncentracije arabinoze na produktivnost velik – zviševanje produktivnosti v odvisnosti od koncentracije arabinoze je bilo skoraj linearno. Najvišja produktivnost je bila dosežena pri visoki koncentraciji arabinoze in nizkem OD600 ob indukciji (pod 0,7). Optimalna temperatura je bila v tem primeru pri 32 ˚C. Na splošno pa je bila v vseh pogojih produktivnost večja pri signalnem peptidu DsbA<ref name="dva"/>.

Po drugi strani pa je bil delež topnega scFv pri vseh pogojih višji pri signalnem peptidu PelB. Najpomembnejši faktor za delež topnega scFv je bila pri obeh signalnih peptidih temperatura, pri čemer je bila topnost večja pri manjših temperaturah. Pri signalnem peptidu DsbA so zaznali tudi manjše vplive ostalih dveh faktorjev, pri čemer je bila zgodnja indukcija v skupaj z nizko temperaturo najboljša kombinacija, pri kateri je bilo 90 % proteina v topni obliki. Pri PelB pa je bil vpliv OD600 ob indukciji zanemarljiv, najboljša kombinacija pa je bila nizka temperatura z nizko koncentracijo arabinoze<ref name="dva"/>.

Odločili so se preveriti tudi, kako je z rastjo pri višjih celičnih gostotah, kar pride v poštev v primeru večje proizvodnje rekombinantnih proteinov. Zaradi boljših lastnosti signalnega peptida PelB (večja topnost in lokalizacija, boljša fiziologija celic) so te eksperimente naredili le s celicami z zapisom za scFv s signalnim peptidom PelB. Ugotovili so, da so optimalni pogoji, ki dajo največ proteina, ki je topen in pravilno lokaliziran v periplazmi, nizka temperatura in indukcija pri visokem OD600. Pri 25 ˚C, OD600 = 25 in 6 ur po indukciji je koncentracija dosegla 20 ug mL-1 , pri čemer je bilo 80 % proteina v periplazmi<ref name="dva"/>

Zvišanje produktivnosti s temperaturo je po vsej verjetnosti posledica hiterjše translacije in translokacije proteinov, kar pa je imelo tudi negativen vpliv na topnost. Verjetno je razlog v tem, da pride do neravnotežja translacije in translokacije. Že iz prejšnjih študij je znano, da je pri translokaciji v periplazmo pomemben porni kompleks SecYEG – če je ta preveč zaseden, pride do nabiranja tako nativnih kot rekombinantnega proteina v citoplazmi, kar povzroči napačno zvijanje in ima na splošno slab vpliv na fiziologijo celice <ref>Schlegel, S., Rujas, E., Ytterberg, A. J., Zubarev, R. A. & Luirink, J. Optimizing heterologous protein production in the periplasm of E . coli by regulating gene expression levels. 1–12 (2013)</ref>.

Drug znan vpliv signalnih peptidov je povezan s translacijo, ki je odvisna od morebitnih struktur mRNA. V raziskavi so uporabili program za napoved struktur mRNA in ugotovili, da je pri mRNA za peptid PelB na Shine-Dalgarnovem zaporedju prisotna dvoverižna RNA, medtem ko je pri DsbA to zaporedje na enoverižni RNA <ref name="dva"/>


== Viri ==
<references/>