User:AnaKodra: Difference between revisions

From Wiki FKKT
Jump to navigationJump to search
No edit summary
No edit summary
Line 8: Line 8:
==Princip delovanja stikalnega sistema==
==Princip delovanja stikalnega sistema==
Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.
Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.
Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N<sub>2</sub>O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana norV in norW, sta del operona norRVW, kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ54 podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno.   
Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N<sub>2</sub>O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ<sup>54</sup> podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno.   
Operon fim so odkrili v patogenem sevu E. coli, ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano fimS. FimS vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja fimS se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje fimS proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje fimS samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja.  
Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja.  
Za pripravo bakterij S. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor PnorV iz operona norRVW ter rekombinazo FimE in zaporedje fimS iz operona fim. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja PnorV. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja PlacIq. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma Renilla, imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju fimS, ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo.  
Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P<sub>norV</sub> iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja PnorV. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P<sub>lacIq</sub>. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo.  
NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju fimS, kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.
NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.

Revision as of 18:53, 15 April 2023

GENETSKO PROGRAMIRANJE TUMOR CILJAJOČIH BAKTERIJ S STIKALNIM SISTEMOM, KI SE ODZIVA NA DUŠIKOV(II) OKSID

Povzeto po članku Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.

Uvod

V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov Clostridium, Bifidobacterium, Listeria, Escherichia in Salmonella. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem Salmonella enterica podvrsto enterica serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v S. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju.

Princip delovanja stikalnega sistema

Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon fim. Bakterija Escherichia coli se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N2O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana norV in norW, sta del operona norRVW, kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ54 podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno. Operon fim so odkrili v patogenem sevu E. coli, ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano fimS. FimS vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja fimS se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje fimS proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje fimS samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja. Za pripravo bakterij S. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor PnorV iz operona norRVW ter rekombinazo FimE in zaporedje fimS iz operona fim. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja PnorV. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja PlacIq. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma Renilla, imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju fimS, ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo. NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju fimS, kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.