User:Jure Zabret: Difference between revisions

From Wiki FKKT
Jump to navigationJump to search
No edit summary
No edit summary
 
(One intermediate revision by the same user not shown)
Line 26: Line 26:
3.George Vernikos, Duccio Medini, David R Riley et al. Ten years of pan-genome analyses. Current Opinion in Microbiology (2015)
3.George Vernikos, Duccio Medini, David R Riley et al. Ten years of pan-genome analyses. Current Opinion in Microbiology (2015)


4.Bryan Swingle, Eric Markel, Nina Costantino, et al. Oligonucleotide recombination in Gram-negative bacteria. Molecular Microbiology (2010)
4.Li X., T.Thomason, L. C. Sawitzke et al. Bacterial DNA polymerases participate in oligonucleotide recombination. Molecular Microbiology (2013).
 


5.Harris H. Wang1, Farren J. Isaacs1, Peter A. Carr et al. Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution. Nature (2009)
5.Harris H. Wang1, Farren J. Isaacs1, Peter A. Carr et al. Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution. Nature (2009)

Latest revision as of 16:50, 4 January 2016

Uvod

Zadnjo stoletje so bili mikrobni sekundarni metaboliti pogosto vir pri odkrivanju novih vodilnih spojin za nadaljnji razvoj v farmacevtske učinkovine, vendar se število na ta način odkritih vodilnih spojin iz leta v leto manjša. Nasprotno temu pa je razvoj tehnologij visoko zmogljivostnega sekvenciranja in sočasen pojav programskih orodji za in-silico iskanje hipotetičnih biosinteznih genov in poti oziroma operonov. Eden izmed najodmevnejših je antiSMASH (ang. ”antibiotics & Secondary Metabolite Analysis Shell)[2], ki omogoča (meta)genomske raziskave, ki lahko privedejo do odkritja novih (hipotetičnih)biosinteznih genov in operonov. Vendar se je pojavila težava, da večina teh se ne izraža pod laboratorijskimi pogoji, zato so raziskovalci takšne operone in gene, ki jih sestavljajo poimenovali tihi ali kriptični genski skupki (ang. “silent or cryptic gene clusters”). Tukaj se je bakterijski rod Actinobacteria izkazal za še posebej bogatega, vendar je ta pristop tudi pokazal nadaljnji potencial, ze te namene že izrabljenega, rodu Streptomyces. Posebej obetajoč je pristop heterologne ekspresije kriptičnih genskih skupkov v šasijah, ki bile prirejene prav za tovrstne namene[1]. Prvi korak pri optimizaciji šasije je poenostavitev njenega genoma. Ta bi zavzemala odstranitev nepotrebnih biosinteznih in metabolnih poti, čigar namen je zagotoviti nemoteno delovanje vnesenih genetskih naprav, oziroma biosinteznih genov ali celotnih operonov. Zadnje desetletje je preko genomskih in metagenomskih raziskav pokazalo enormno zapletenost delovanja bakterijske celice predvsem zaradi nepoznavanja mehanizmov, ki regulirajo v njej prisotna genetska vezja. Slednje za sintezno biologijo pogosto predstavlja problem, saj je v nepoznanih šasijah interakcija z vzneseno napravo pogosto neizogibna[1]. Tukaj je tudi potrebno omeniti koncept osrednjega genoma (ang.”core genome”), ki predstavlja skupino genov, ki so nepogrešljivi za delovanje določenega klada in njegovim predstavnikom daje fiziološke in morfološke značilnosti[3]. Čeprav je osredji genom dobro izhodišče za zagotavljaje ortolognosti ekspresijskih sistemov, se pri šasijah, namenjenih iskanju ekonomsko zanimivih sekundarnih metabolitov, koncept osrednjega genoma izkaže za neuporabnega. Biosintezne poti, oziroma koraki znotraj teh, potrebujejo določene prekurzorke spojine, katerih samo osrednji genom ne more zagotoviti. Torej so za iskanje novih ekonomsko zanimivih sekundarnih metabolitov bolj primerne šasije z reduciranim kot pa osrednjim genomom[1].

Orodja za urejanje genoma

Priprava šasije z reduciranim genomom zajema obširno urejanje genoma izvornega organizma. Metode, ki to omogočajo pogosto temeljijo na homologni rekombinaciji preko organizmu lastnih ali tujih rekombinaz. Med slednjihmi sistemi se najpogosteje uporablja λRED rekombinacijski sistem in njihova prednost leži v večji učinkovitost rekombinacije[3]. Možna je pa tudi rekombinacija brez uporabe rekombinaze, ki temelji na delovanju DNA polimeraze. Tukaj se v gram negativne bakterije vnese med 20 in 120 bp dolge sintetične enoverižne olilgonukleotide, ki so komplementarni želenemu predelu genoma ampak nosijo točkovno mutacijo ali privedejo do delecije predela gena. Te se vstavijo v DNA med njenim podvojevanjem in sicer v obliki okazakijevaih fragmentov[4]. Razširitev tega pristopa je metoda MAGE (ang. “Multiplex Automated Genome Engineering”), ki temelji na večih ciklih tovrstne mutageneze in omogoča pripravo bakterisjkih sevov preko usmerjene evolucije[1]. Tovrstnim namenom pogosto tudi služijo mestno-specifične rekombinaze, ki večinoma temeljijo na fagmen Cre/loxP ali kvasjem Flp/FRT sistemu. Cre in Flp sta rekombinazi, ki prepoznata 34 bp dolgo zaporedje DNA. Takšna zaporedja so vstavljena na 5’ in 3’ konce določenega gena in odvisno od njune orientacije omogočata rekombinazi izrez, oziroma delecijo (direktni ponovitvi) ali obrat (obrnjeni ponovitvi) željnega gena[1]. Zadnje čase se pa vedno bolj uveljavlja sistem za urejanje DNA imenovann CRISPR/Cas9 (ang. “Clusterd Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR assosiated (Cas) proteins”), ki izvira iz bakterijskega adaptivnega imunskega sistema. Poznamo tri različne CRISPR sisteme, ki se ločijo po številu potrebnih Cas proteinov. Najbolj uporaben je CRISPER/Cas9, saj za mestno specifični dvoverižni prelom DNA potrebuje le endonukleazo Cas9 in vodilno RNA[1].

Od zgoraj navzdol ali ang.”top-down” pristop

Od zgoraj navzdol ali ang.”top-down” pristop je biotehnološko najbolj zanimiv in zajema postopno odstranjevanje nezaželjenih genov iz že obstoječega genoma. Takšen pristop se je v preteklosti že izkazal za uporabnega saj je izbitje ne-esencialnih genov privedlo do stabilnejšega genoma, hitrejše rasti, zmanjšanje sekrecijskega metaboloma in (najpomembnejše) sprostitev prekurzorkih molekul za industrisjsko zanimive biosintezne poti in posledično višjih titrov želenega metabolita. Vedno znova se pa je izkazalo, da je redukcija genoma možna samo za okoli 25%, in sicer pri Escherichia coli 15.3, B. subtilis 20.7, S. avermitilis 16.9-18.6 in Corinebacterium glutamicum 22%. Tovrstni pristopi usmerjene mutageneze za optimizacijo šasij so se iskazali za učinkovite tudi pri bakterijah rodu Streptomyces, vendar njihovo uporabnost omejuje pomankljivo poznavanja genetskih vezji prisotnih v produkcijskih organizmih, saj se je zaradi tega težko odločiti katere gene lahko izbijemo brez da vplivamo na sposobnost rasti in produkcije sekundarnih metabolitov[1]. Tukaj nastopi uporaba naključne mutageneze, saj ta ne potrebuje poznavanja vseh genetskih elementov, ampak temelji na selekciji mutant, ki ustrezajo zastavljenim kriterijem in pristop predstavlja nekakšno usmerjeno evolucijo. Pristop je bil že uporabljen za redukcijo genoma bakterije P. putida za 7.4% preko uporabe transpozonov z vstavljenim selekcijskim markerjem in FRT mestom, kar je omogočilo izrez segmenta genoma med dvema tovrstnima transpozicijskema elementa[1]. Zgoraj že omenjena metoda MAGE predstavlja vmesno pot, saj omogoča naključno mutagenezo natančno določenega segmenta genoma. Avtorji so tukaj preko specifičnih oligonukletidov v večih ciklih izvedeli naključno mutagenezo genov biosintezne poti za 1-deoksi-d-ksiloze-5-fosfata (DXP) in tako ustvarili sev, ki je imel petkrat višji titer DXP kot izvorni mikroorganizem[5].

Rod Streptomyces

Produkcija industrijsko zanimivih spojin pa potrebuje šasijo, ki poseduje primerno zalogo ustreznih metabolitov, saj te služijo kot njihovi prekurzorji. Bakterije rodu Streptomyces se ravno zaradi tega smatrajo kot idealni kandidati za pripravo optimiziranega ekspresijskega seva za kriptične biosintezne gene in operone, Prvi korak tovrsnega razvoja predstavljata priprava specializiranih ekspresijskih sevov S. avermitilis, za namene izražanja kriptičnih biosinteznih poti. Optimizacijo njenega genoma so dosegli preko odstranitve približno 1.4 Mb od 9.02 Mb wild-tipe genoma. Odstranili so bolj variabilne predele njenega genoma preko homologne in mestno specifične Cre/loxP rekombinacije in tako pripravili dva omembe vredna seva S. avermitilis SUKA17 in 22., ki imata genom reduciran za 17.9 in 18.5%, kar je preprečilo produkcijo endogenih sekundarnih metaboitov prisotnih v wilde-type sevu. Pomembno je tudi izpostaviti, da ti sevi niso izkazali počasnejše rasti kot izvorni wilde-type sev. Primernost tako pripravljenih sevov za heterologno ekspresijo biosinteznih poti so preverili preko izražanja biosinteznih poti za streptomicin, amicin C in pladienolid[6]. Prvi spojini sta antibiotika in druga je makrociklični lakton, ki izkazuje protitumorsko delovanje preko inhibicije zorenja mRNA[7]. Produkcija obeh antibiotikov je bila višja kot v izvornih organimih, proizvodnje pladienolida pa sprve niso opazili. Njegovo produkcijo so pa kasneje omogočili z uvedbo dodatne kopije zapisa za regulatorni protein PldR, ki je transkripcijski aktivator pladenoidnih biosinteznih genov[6]. Bolj ciljna optimizacija bakterije S. coelicolor M145 je bila izvedene z namenom zmanjšanja odtoka ogljika in dušika preko nativnih biosinteznih poti. Raziskovalci so izbili biosintezne gene za aktinorhodin, prodigin, CPK (ang.”cryptic type I polyketide syntetase”) in CDA (ang.”calcium-dependent antibiotic”), uvedli so tudi točkovne mutacije znotraj genov rpoB in rpsL, ki zapisujeta β podenoto RNA polimeraze in 30S ribosomalno podenoto[8]. Točkovne mutacije v teh genih, poleg antibiotične rezistence, povzročijo podoben odziv kot vezava ppGpp na ribosom. Povzročita indukcijo “odziva na težavne razmere” ali ang.”stringent response” in ta privede do aktivacije biosinteznih poti za sekundarne metabolite v rodu Streptomyces[9]. Tako so pleiotropno povišali kočne titre proizvedenih sekundarnih metabolitov, hipoteze so preverili preko vstavitve nativnega antihondrin biosinteznega operona in dveh biosinteznih poti za heterologno proukcijo kloramfenikola in kongocidina in pri vseh so opazili večjo produkcijo kot v izvornem sevu. Dodatna prednost uporabe produkcijkih sevov z reduciranim genomom je tudi lažja analiza proizvedenih spojin zaradi poenostavitve ekstracelularnega metabolitnega profila. Slednje je še posebej pomembno pri presejanju za industrijsko zanimive kriptične biosintezne operone in gene[8].

“Od spodaj navzgor” (ang.”bottom-up”) pristop in naravno optimirani genomi

Od spodaj navzgor strategije predpostavljajo uporabo šasij, izdelanih de-novo za namen iskanja industrijsko zanimivih sekundarnih metabolitov. Tako zajemajo sestavo sintetičnih metabolnih poti, ki bi bile prirejena tako, da drastično zmanjšajo metabolno interferenco in preko tega bi lahko omogočil izdelavo polno ortolognega ekspresijskega sistema. Vendar so takšni cilji zaenkrat še neuresničljivi, saj je največji dosedanji uspeh na tem področju popolna sinteza genoma bakterije Mycoplasma mycoides in njegov prenos v celico M. capricolum, kateri je bil predhodno odstranjen lastni genom[1]. Naravno oprimiran genom pa bi lahko predstavljala bakterija Streptomyces albus J1074, saj je njen genom najmanjši znotraj tega rodu. Njegova velikost (~6.8 Mb) je posledica zmanjšanja števila genskih podvojitev, kar je dobro vodilo za optimiranje drugih predstavnikov tega rodu. Poleg majhnega genoma je ta bakterijska vrsta primerna kot šasija za iskanje industrijsko zanimivih sekundarnih metabolitov tudi zaradi relativno enostavne genetske manipulacije in je v preteklosti že bila uspešno uporabljena za produkcijo stefimicina, ferderikamicina in drugih industrijsko pomembnih spojin[1].

Viri

1.Tiago Beites in Marta V. Mendes. Chassis optimization as acornerstone for the application of synthetic biology based strategies in microbial secondary metabolism. Frontiers in Microbiology (2015)

2.Marnix H. Medema, Kai Blin, Peter Cimermancic et al. antiSMASH: rapid identification, annotation and analysis of secondary metabolite biosynthesis gene clusters in bacterial and fungal genome sequences. Nucleic Acid Reserch (2011)

3.George Vernikos, Duccio Medini, David R Riley et al. Ten years of pan-genome analyses. Current Opinion in Microbiology (2015)

4.Li X., T.Thomason, L. C. Sawitzke et al. Bacterial DNA polymerases participate in oligonucleotide recombination. Molecular Microbiology (2013).


5.Harris H. Wang1, Farren J. Isaacs1, Peter A. Carr et al. Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution. Nature (2009)

6.Mamoru Komatsua, Takuma Uchiyamaa, Satoshi Omurab et al. Genome-minimized Streptomyces host for the heterologous expression of secondary metabolism. PNAS (2010)

7.Akira Yokoi, Yoshihiko Kotake, Kentaro Takahashi et al. Biological validation that SF3b is a target of the antitumormacrolide pladienolide. FEBS Journal (2011)

8.Juan Pablo Gomez-Escribano in Mervyn J. Bibb. Engineering Streptomyces coelicolor for heterologous expression of secondary metabolite gene clusters. Microbial Biotechnology (2011)

9.Haifeng Hu, Qin Zhang in Kozo Ochi. Activation of Antibiotic Biosynthesis by Specified Mutations in the rpoB Gene (Encoding the RNA Polymerase Subunit) of Streptomyces lividans. Journal of Bacteriology (2002)