User:Kmalovrh

Povzeto po projektu iGEM skupine [1]

UVOD

Skoraj ne mine dan, ko nas mediji ne bi opozarjali na problematiko klimatskih okoljskih sprememb. Te nam povzročajo težave na raznih področjih, eden izmed najbolj kritičnih pa je gotovo vsakoletna izguba ogromnih količin pridelka zaradi pojava zmrzali in suše. To so opazili tudi francoski študentje, saj so v njihovi državi samo v letu 2016 opazili kar 12-odstotni upad pridelka. Da bi težavo vsaj nekoliko zmanjšali so se odločili, da bodo skušali razviti mikroorganizme, ki se odzivajo na temperaturo tako, da izločajo spojine, ki zmanjšajo šok rastline ob temperaturni spremembi, projekt pa poimenovali kar Zmanjšani šok.

Problem zmrzali

Mehanizem tvorbe ledenih kristalov ali nukleacija je glavni razlog za izgubo pridelka zaradi zmrzali. Kristali, ki rastejo zunaj celic povzročijo dehidracijo, saj se dostopnost vode zmanjša. Če je temperatura nizka dalj časa pa pride do rekristalizacije, pri kateri nastajajo večji kristali, ki trajno poškodujejo rastlinsko tkivo in strukture. S pomočjo led-vezavnih proteinov (AFP-ji - antifreeze proteini in INP-ji - ice-nucleation proteini) bi tovrstno škodo lahko zmanjšali. Jasno je, zakaj so uporabni AFP proteini - preprečujejo rekristalizacijo in nižajo temperaturo zmrzišča vode. Primer AFP je protein RiAFP iz hrošča Rhagium inquisitor. Na drugi strani bi s pomočjo INP proteinov spodbudili nastajanje kristalov ledu na površini lista, pri čemer se zaradi eksotermnosti reakcije sprošča toplota, ki zaščiti rastlino (to je že sedaj pogosta metoda zaščite pri vinogradnikih).

Problem suše

Poleg pomanjkanja vode in poškodb zaradi sončnih žarkov, je za rastline visoka temperatura (nad 40°C) problematična tudi zaradi denaturacije proteinov. Rastline sicer vršijo mehanizme, s katerimi se pred temi vplivi delno zaščitijo, vendar ob dolgi izpostavljenosti pri tem niso uspešne. Za zaščito pred vročino bi morali mikroorganizmi, ki bi jih nanesli na površino listov, izražati spojine bele barve, ki odbijajo svetlobo. Proteini, ki imajo določen potencial za uporabo v te namene so kazein in razni biopolimeri. Lahko bi uporabili tudi bakterije, ki bi izločale minerale, na primer kalcijev karbonat.

REŠITEV

Raziskovalci so se odločili, da bodo razvili dva tipa mikroorganizmov, ki bi ob nanosu na površino rastline pomagali pri zmanjševanju vpliva temperaturnih sprememb. Prvi tip so bakterije hladnega šoka, ki bi ob temperaturah nižjih od 15 stopnij celzija pričeli z izražanjem in izločanjem ustreznih proteinov. Drugi tip so bakterije toplega šoka, ki bi ustrezne proteine izločale pri temperaturah višjih od 37 stopinj celzija. V ta namen so razvili biološke dele, ki se optimalno odzivajo na dano stanje in rastlino zaščitijo pred ekstremnimi temperaturami.

RAZISKAVA

Razvoja plazmida, ki bi omogočal željene funkcije, se niso lotili z zapisi za proteine, ki bi jih dejansko želeli izražati, temveč so za optimizacijo izbrali dve reporterski spojini, dva različna kromoproteina. Modri kromoprotein, ki so ga izbrali je bil amilCP in naj bi se izražal ob hladnem šoku. Za vroči šok so izbrali rdeči flourescirajoči protein mRFP. Tako so lahko svojo uspešnost transformacije in ustrezne temperaturne regulacije spremljali enostavno, s prostim očesom. Ko bi bili ekspresijski sistemi dokončno optimizirani pa bi lahko zapise za izbrana proteina nadomestili s poljubnimi uporabnimi geni. Cilj, ki ga sicer niso dosegli je bil tudi, da bi oba skonstruirana plazmida vstavili v eno bakterijo in spremljali odzive v obeh ekstremnih temperaturnih območjih.

Hladni šok

V zapisu za hladni šok (reporterski protein amilCP) so uporabili cspA (»cold shock protein A«) promotorski sistem, ki ga inducirajo nizke temperature in ga sestavlja dolga 5'UTR regija, DownStream škatla (DS škatla) in CspA promotor z UP elementom. 5'UTR je 159 baznih parov dolgo zaporedje in glavni regulator izražanja mRNA proteinov hladnega šoka, saj je zaporedje pri visokih temperaturah izredno nestabilno, zaradi česar je izražanje proteina praktično nemogoče. CspA promotor je močni konstitutivni promotor pri vseh temperaturah. Dodali so mu je UP element, ki moč promotorja pri nizkih temperaturah dodatno poveča. DS škatla je zaporedje 5 AK, ki se nahaja v bližini start kodona. Je vezavno mesto za 30S podenoto ribosoma preko ribosomalnega proteina S1 in pri nizkih temperaturah povečuje stopnjo translacije, preko pomoči pri vezavi ribosoma in stabilizaciji zvitja mRNA. Zaporedje se zaključuje z dvojnim terminatorjem. V želji, da bi pripravili bakterijo, ki bi amilCP izražala zgolj pri nizkih temperaturah, so se najprej lotili modeliranja zaporedij, ki bi jih lahko uporabili v ta namen. 3D model amilCP divjega tipa še ni obstajal, zato so se najprej lotili priprave slednjega ter s pomočjo računalniških orodij (Phyre2) in homologij z znanimi zaporedji tudi uspeli. Ko so 3D strukturo razvozlali, so se lotili nadaljne manipulacije z zaporedjem. Raziskovalci so želeli v zapis za protein na N-konec dodati še DS škatlo, ki bi se prepisovala kot del proteina (vsi ostali elementi so pred start kodonom). Ravno zaradi tega je bilo izrednega pomena, da dodatno zaporedje za DS škatlo ne bi vplivalo na strukturo in fukcijo proteina. Nazadnje so preverili še možne modifikacije amilCP, ki bi bile posledica dodatka DS škatle in spremembe, ki bi jih lahko te povzročile. Na podlagi literature so ugotovili, da je izražanje izključno pri nizkih temeraturah, posledica nestabilne strukture mRNA pri višjih. Z analizo 3D struktur, ki so jih pripravili so ugotovili, da je razlika v izražanju verjetno tudi posledica sprememb terciarne strukture. Ugotovili so namreč, da se nekatera za vezavo ribosoma pomembna mesta približajo šele pri nižjih temeraturah, ko pride do ustreznih konformacijskih sprememb.

Topli šok

V zapisu za topli šok (reporterski protein mRFP) so uporabili močni konstitutivni promotor pL iz bakteriofaga lambda, ki enako učinkovito deluje pri vseh temperaturah (0-40 stopinj celzija). Uporabili so ga v kombinaciji z represorjem cI857. Izbrani represor je izredno uporaben od temperature odvisen regulator, saj je pri temperaturah nižjih od 30 stopnij celzija dimeren, kar mu omogoča vezavo na promotor pL in ga posledični inhibira, pri višjih temperaturah pa dimer razpade, inhibicije ni več in prepisovanje steče. Pri temeraturah višjih od 42 stopinj celzija represor cI857 ni več sposoben vezave na pL. V zapisu za topli šok je še RBS in dvojni terminator, za učinkovito zaključevanje transkripcije.

DELI

Raziskovalci so pripravili dva nova dela: -Del, ki nosi zapis za pL promotor in na temperaturo občutljivi represor cI857; oboje za regulacijo prepisovanja mRFP, ki je odvisno od temperature. -Del, ki nosi zapis za UP element, konstitutivni promotor, 5'UTR, DS škatlo in amilCP; vse za regulacijo prevajanja amilCP RNA, ki je odvisno od temperature. Njihov glavni cilj je sestaviti ta dva dela v eno samo Biokocko, ki bi jo lahko prilagodili za uporabo s katerim koli proteinom (tako da bi menjali zapisa za AmilCP/mRFP). Tako bi pripravili termo-inducibilni plazmid, prilagodljiv na najrazličnejše spremembe. Izhajali so iz različnih, že pripravljenih delov, ki pa so jih modificirali in optimizirali glede na potrebe.

REZULTATI

Hladni šok

Del, ki so ga pripravili so najprej pomnožili s PCR in dobljeno količino ocenili s pomočjo rezultatov gelske elektroforeze. Produkta je bilo sicer malo, a dovolj za ligacijo v plazmid pSB1C3 in njegovo pomnoževanje. Pripravljen plazmid so transformirali v DH5-α E.coli in kulturo gojili pri 37 stopinjah celzija na LB plošči z ampicilinom. Uspešnost transformacije so preverjali s selekcijo glede na barvo. Da so transformacijo potrdili, so izvedli še dodatni PCR test. Uspešno transformirane celice so namnožili in nato izolirali plazmid hladnega šoka.

Topli šok

Tudi tu so pripravljeni del najprej pomnožili s PCR, nato pa ga vstavili v plazmid pSB1C3. Plazmid so pomnožili in transformirali v DH5-α E.coli. Kulturo so zopet gojili pri 37 stopnjah celzija na LB plošči, tokrat so selekcijo izvajali s pomočjo kloramfenikola. Zopet so izvedli selekcijo celic in izolirali plazmide. Pripravili so dva tipa plazmida, enega s konstitutivnim promotorjem in enega, katerega izražanje je pogojeno s toplotnim šokom. Eksperiment za odziv na topli šok je bil neuspešen, saj so bile vse kolonije enako obarvane in to že pri temperaturah nižjih, kot bi pričakovali.

ZAKLJUČEK

Sistem za hladni šok je pokazal dobre rezultate, vendar bi bil potreben še dolgotrajen razvoj, preden bi katerega koli od sistemov lahko začeli uporabljati v poljedelstvu. Vprašanja, ki še potrebujejo odgovor so, kako preprečiti prekomerno spiranje bakterij v okolico, kakšen način nanosa bi bil najbolj ugoden, kako priti do čimvečjega izkoristka, kako zmanjšati nevarnost razširjanja GSO v okolje in tako dalje. Raziskovalci se zavedajo, da je njihov produkt, vsaj za enkrat, zgolj teoretične narave, vendar menijo, da bi v prihodnosti s pomočjo sintezne biologije lahko razvili podoben sistem, ki bi bil uporabna zaščita pridelkov.

VIRI

iGEM 2017; ekipa: [2]

[3]

[4]