View source for Utišanje genov na osnovi majhnih protismernih DNA omogoča manipulacijo in replikacijo genoma bakteriofagov v brezceličnem sistemu

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00402?goto=supporting-info
===UVOD===
V sintezni biologiji se poslužujejo enega od principov sestavljanja, od spodaj navzgor, kjer skušajo sestaviti celotno celico iz različnih bioloških delov [1]. V ta namen je v uporabi brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem. Izražanje genov v brezceličnem sistemu se uporablja v študijah, kjer skušajo sestaviti minimalne žive sisteme. Eden izmed principov je vstavitev potrebnih elementov za izražanje genov v razdelek, ki ga nato vstavijo v šasijo in je zmožen samostojnega izražanja potrebnih genov, ena od zahtev pa je tudi samostojna replikacija genetska materiala znotraj razdelka [2].
Za replikacijo genoma so raziskovali replikacijske sisteme bakteriofagov, ki imajo svoj sistem replikacijen, npr. bakteriofag Q''β'', RNA genom. Za dosego samostojne replikacije genoma sistema, želimo, da je sistem zmožen samostojen izgradnje replikaze in fagnih komponent tekom replikacijskega cikla. V primeru bakteriofaga Q''β'' so ugotovili, da med replikacijo nastanejo kratke parazitske RNA sekvence. Že približno 50 let nazaj je Spiegelman uporabil 218 nt dolgo RNA sekvenco, ki je bila zmožna sintetizirati RNA replikazo. V reakcijsko mešanico je poleg RNA polimeraze dodal še RNA genom bakteriofaga Qβ kar je vodilo v replikacijo genoma [3].  V uporabi je tudi bakteriofag Φ29, katerega genom je dsDNA, in vsebuje DNA polimerazo [2].

V ''in vivo'' pogojih je ena izmed slabih lastnosti bakteriofagov specifičnost vezave na bakterijo, za produkcijo viabilnih fagov pa je le-ta potrebna ohraniti esencialne gene. V primeru uporabe brezceličnega sistema se izognemu specifičnosti vezave na bakterijo, med drugim pa je možno utišati gene esencialne za repklikacijski cikel [2].
Kontrola izražanja genov z majhnimi RNA (''angl.'' small RNA, sRNA) je v biološkem svetu zelo razširjena. Bakterije imajo sRNA, ki je delno ali v celoti komplementarna mRNA. Hibridizacija sRNA na mRNA vpliva na translacijo in stabilnost mRNA. Eden izmed pogostejših načinov regulacije je vezanje na ribosom vezavno mesto (RBS), ki se nahaja v neprevedeni regiji (UTR) na 5' koncu, in prepreči iniciacijo translacije. Bakterije s pomočjo sRNA specifično zavrejo izražanje fagnih genov brez, da bi posegli v sekvenco genoma. V brezceličnem sistemu so namesto sRNA uporabili sDNA, saj je DNA veliko bolj stabilna kot RNA. Uporabili so protismerno sDNA, ki se veže RBS specifične mRNA in tako prepreči translacijo [2].

Za ugotovitev ustreznosti teorije, so opazovali regulacijo trankripcije gena YPet, ki se prepiše v fluorescenčni protein. V brezceličnem sistemu, ekstrakt E. coli, je prišlo do in vitro transkripcije gena YPet, v katerem se je predhodno že nahajala protismerna sDNA. Med nastalo mRNA in sDNA je prišlo do hibridizacije. Izražanje gena YPet so spremljali s fluorometrom pri 29 °C. V eksperimentu so uporabili sDNA, ki je bila dolga 60 nt in je bila komplementarna 8 nt RBS regije. Poleg blokade RBS, je nastali kompleks sDNA-mRNA lahko tarča RNaze H, ki razgradi mRNA [2].

Eksperimente so izvedli pri različnih koncentracijah sDNA, gen YPet pa je bil pod kontrolo promotorja T7 ali konstitutivnega promotorja iz E. coli (J23106). Represijo so primerjali z ON/OFF razmerjem. Za ON se uporabi intenziteto fluorescence negativne kontrole (0 µM sDNA), za OFF pa intenziteto fluorescence za posamezno koncentracijo sDNA [2]. V nadaljevanju so ta pristop preizkusili na bakteriofagu T7, kjer so uporabili protismerno sDNA proti glavnemu kapsidnem proteinu (''angl.'' major capsid protein) [2].

===REZULTATI IN DISKUSIJA===
'''Represija gena YPet'''

S testom represije gena YPet pri različnih koncentracijah protismerne sDNA so ugotovili, da se represija povečuje s večanjem koncentracije sDNA, pri koncentraciji 0,05 µM pa represije niso zaznali. Pri obeh promotorjih so zaznali največjo raven represije pri maksimalni koncentraciji sDNA, 10 µM. Pri promotorju T7 so opazili 50-kratno povečanje razmerja ON/OFF, medtem ko so pri konstitutivnem promotorju opazili le 4-kratno povečanje. Ker ribosom in protismerna sDNA tekmujeta za isto vezavno mesto, RBS, lahko učinkovitost izboljšamo s povečanjem koncentracije protismerne sDNA [2].
Razlika v promotorjih je zaradi hitrosti delovanja RNA polimeraze, 20-90 nt/s pri ''E. coli'' in 240 nt/s pri bakteriofagu T7, kar pomeni, da bakteriofag proizvede več mRNA, poruši se ravnovesje med ribosomi in mRNA in tako se poveča koncentracija nastalih kompleksov sDNA-mRNA [2].

'''Vpliv dolžine sDNA na represijo translacije'''

Pri tem eksperimentu so opazovali vpliv dolžine sDNA na represijo translacije tako, da so uporabili različno dolge sDNA, 40, 50 in 60 nt, s koncentracijo 5 µM. Pri obeh promotorjih se je izkazalo, da se z dolžino sDNA zvišuje raven represije zaradi večje termodinamske stabilnosti, saj so daljši dupleksi bolj stabilni. Večji dupleksi so veliko bolj nagnjeni k razgradnji z RNazo H. Pri promotorju T7 so tudi opazili veliko razliko med ON/OFF razmerjem med 50 in 60 nt [2].

'''Utišanje bakteriofagnih genov'''

Bakteriofag T7 za replikacijo genoma potrebuje samo tri fagne proteine, gp5, gp4 in gp2.5, ter en gostiteljev protein, tioredoksin [2].
Pri tem eksperimentu so uporabili protismerno sDNA proti glavnemu kapsidnem proteinu, izbrani gen pa so vnesli pod kontrolo promotorja T7. Na koncu gena se je nahajal še T7 terminator (T7-T phi) [2].
Naprej so v odsotnosti sDNA izvedli ekspresijo fagov in izvedli plak-test, s katerim so dobili koncentracijo od 3 x 109 do 1,3 x 1010 PFU/mL. Poleg tega so morfologijo bakteriofagov preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo. Nato so v reakcijsko mešanico dodali 60 nt dolgo protismerno sDNA, pričakovali so zmanjšano nastajanje bakteriofagov. S qPCR so kvantitativno določili stopnjo replikacije. Pri vzorcih, ki so imeli sDNA, so ugotovili 30-kratno povečanje replikacije. Testirali so tudi nastajanje fagov ob dodatku sDNA in ugotovili, da se produkcija zmanjša za 4-krat [2].
S temi rezultati so dokazali, da je možno spremeniti izražanje gena brez, da bi spremenili sekvenco genoma bakteriofaga. Razlog v zmanjšanju titra fagov je v tem, da inhibiramo nastajanje glavnega kapsidnega proteina, ki je ključen pri izgradnji bakteriofaga. Vzrok v povečani repklicaji pa je povečana koncentracija dostopne DNA, saj se je manj pakira v bakteriofage [2].

'''Replikacija genoma T7 pri serijskih redčitvah'''

Pri tem eksperimentu so inkubirali 0,5 nM fagne DNA v brezceličnem sistemu ob dodatku dNTPjev pri temperaturi 29 °C. Po 4h inkubacije so prenesli del vzorca v sveže pripravljen brezcelični sistem. Pred vsakim korakom redčenja so s qPCR določili koncentracijo fagne DNA. Uspešnost replikacije so preverili tudi z agarozno gelsko elektroforezo. Ugotovili so, da je koncentracija DNA naraščala, vendar so prav tako odkrili, da se je število novonastalih kopij z generacijo nižalo [2].
Fagni genom in brezcelični sistem so vnesli emulzijo in mešali toliko časa, da so nastale lipidne kapljice. Nato so izvedli enake postopke kot so že bili opisani. Rezultati so pokazali 100-kratno povečanje koncentracije DNA v prvih dveh redčitvah, tudi plak-test je pokazal zmanjšanje vrednost PFU/mL z vsako redčitvijo [2].
Zmanjšanje replikacije z redčenjem je lahko posledica mutacij v genih, ki so odgovorni za replikacijo DNA, eden izmed vzrokov pa je lahko tudi pojav parazitske DNA. Vzrok je lahko tudi kopičenje inhibitornih produktov, ki lahko vodijo v znižano izražanje polimeraze. Vsi mehanizmi pa vodijo v zmanjšano nastajanje proteinov esencialnih za DNA replikacijo. V naravnem okolju se bakteriofag temu izogne, saj po replikaciji pride do lize celic [2].

===ZAKLJUČEK===
Protismerna sDNA je zmožna komplementarne vezave na RBS ali kodirajočo regijo mRNA, kar lahko uporabimo v brezceličnem sistemu. Podobni primeri take inhibicije so sRNA pri bakterijah, RNAi pri evkariontih in CRISPRi. Represija translacije s strani sDNA je specifična in zahteva 60 nt dolgo verigo. Z dodatkom sDNA lahko kontroliramo izražanje genov ''in vitro''. S pomočjo bakteriofaga T7 so izvedli podoben eksperiment kot Spiegelman z bakteriofagom Q''β''. Zaradi visoke procesivnosti in majhnega števila napak tekom replikacije (15x10-16 baz) DNA polimeraze faga T7, je velika možnost vpeljave le-te v sintezno celico.

===LITERATURA===
[1]	A. Scott, M. J. Noga, P. De Graaf, I. Westerlaken, E. Yildirim, and C. Danelon, “Cell-free phospholipid biosynthesis by gene-encoded enzymes reconstituted in liposomes,” PLoS One, vol. 11, no. 10, pp. 1–23, 2016, doi: 10.1371/journal.pone.0163058.

[2]	K. Vogele, E. Falgenhauer, S. Von Schonberg, F. C. Simmel, and T. Pirzer, “Small Antisense DNA-Based Gene Silencing Enables Cell-Free Bacteriophage Manipulation and Genome Replication,” ACS Synth. Biol., 2021, doi: 10.1021/acssynbio.0c00402.

[3]	D. R. Mills, R. L. Peterson, and S. Spiegelman, “Self-Duplicating Nucleic Acid Molecule *,” Proc. Natl. Acad. Sci. Biochem., vol. 58, pp. 217–224, 1967.