View source

== Malarija ==

Malarijo prenašajo komarji rodu ''Anopheles'' spp. in je ena izmed resnejših nalezljivih bolezni, za katero po svetu letno zboli več kot 200 milijonov ljudi. Pri človeku okužbo povzročata patogena ''Plasmodium falciparum'' in ''Plasmodium vivax'' [1]. Za boj proti malariji je bilo identificiranih veliko kandidatov za cepiva, vendar pa razvoj le-tega predstavlja resen izziv, predvsem zaradi antigenske kompleksnosti, visoke stopnje polimorfizma med proteini patogena ter visoke cene proizvodnje. Ena izmed možnih in cenovno učinkovitih rešitev je proizvodnja cepiva proti malariji v rastlinah [2].

== Zasnova in izvedba eksperimenta ==

Namen eksperimenta je bil priprava rastlinskega cepiva proti malariji, sestavljenega iz epitopov AMA1 in MSP1<sub>19</sub> iz ''P. falciparium'' ter peptida GK1, ki služi kot adjuvant. Cepivo bi služilo kot dokaz koncepta za proizvodnjo varnih rekombinantnih cepiv v rastlinah. V ta namen so pripravili konstrukt z imenom Malchloroplast, za sočasno ekspresijo AMA1, MSP1<sub>19</sub> ter GK1. Bralne okvirje so optimizirali glede na rabo kodona v kloroplastih [3]. 766 bp dolg Malchloroplast konstrukt so vstavili v pBic plazmid, ki je bil oblikovan za integracijo tujih genov v ''Mun''I restrikcijsko mesto znotraj regije obrnjenih ponovitev kloroplastnega genoma [3], [4]. Plazmid je tako vseboval končni konstrukt, sestavljen iz regij za homologno rekombinacijo INSL ter INSR, ki obdajata Prrn promotor, Malchloroplast insert ter selekcijski marker ''aadA'' [3].

Plazmid so na delcih zlata z gensko pištolo vnesli v 3-5 tednov stare liste rastline ''Nicotiana tabacum''. S selekcijo so prišli do rastlin, ki vsebujejo transgen. To so potrdili s PCR reakcijo z ustreznimi začetnimi oligonukleotidi, ki se vežejo na zaporedje AMA1 in MSP1<sub>19</sub> znotraj regije Malchloroplast. Po cvetenju so uspešno transformiranim T<sub>0</sub> rastlinam pobrali semena in jih prestavili na MS medij z dodanim spektinomicinom, da bi le-ta kalila, in tako dobili T1 rastline. Da bi dokazali homoplazmijo T<sub>1</sub> rastlin, so izvedli PCR analizo z začetnimi oligonukleotidi, ki objemajo mesto insercije transgena v genomu kloroplasta [3]. 

Aktivno transkripcijo Malchloroplast transgena so dokazali s qRT-PCR. Ekspresijo ter velikost posameznih peptidov AMA1, MSK1<sub>19</sub> ter GK1 so dokazali z western prenosom, slednjega so tudi kvantificirali s HPLC. Z ELISA testom so nato analizirali še reaktivnost serumov pacientov okuženih s ''P. falciparium'' na Malchloroplast, imunogenost kandidatnega cepiva pa so proučili tudi z imunizacijo miši. Prisotnost ustreznih protiteles so nato dokazovali z ELISA testom [3].

== Rezultati ==

V eksperimentu so pripravili policistronski konstrukt za ekspresijo AMA1, MSP1<sub>19</sub> ter GK1, ki so ga z gensko pištolo prenesli v liste rastline ''Nicotiana tabacum''. Po selekciji uspešno transformiranih rastlin so pridobili 11 sadik izmed katerih so pri šestih s PCR analizo potrdili prisotnost transgena. Iz semen ene transplastomske rastline so se razvile štiri T<sub>1</sub> rastline, ki jim je bila s PCR analizo na podlagi velikosti inserta v kloroplastih dokazana homoplazmija [3].

Pri analizi transkripcijske aktivnosti so ugotovili, da so željeni transkripti prisotni le pri transplastomskih rastlinah, medtem ko pri divjem tipu niso bili prisotni. Proteine vseh štirih T<sub>1</sub> rastlin so analizirali z western prenosom, pri čemer so s protitelesi anti-AMA1 in anti-GK1 v listih transgenih rastlin dokazali ekspresijo rekombinantnih proteinov. Pri ELISA testu s serumi okuženih pacientov so dobili pozitivne antigenske reakcije v primerih uporabe ekstrakta z Malchloroplast-om, medtem ko pri divjem tipu tobaka pozitivnih reakcij ni bilo, s čimer so dokazali, da so v ekstraktu z Malchloroplast-om prisotne antigenske determinante [3].

Temu je sledila imunizacija BALB/c miši z rastlinskim ekstraktom ene izmed T<sub>1</sub> rastlin. Dokazali so prisotnost protiteles proti AMA1, MSP1<sub>19</sub> in GK1, po zadnji dozi ekstrakta pa so opazili tudi močnejši odziv na ekstrakt transplastomske linije v primerjavi z ekstraktom rastlin divjega tipa [3].

== Zaključki ==

Z eksperimentom so dokazali možen koncept priprave cepiv z različnimi antigeni v kloroplastih tobaka. Komponente kandidatnega cepiva so reagirale s protitelesi v serumu z malarijo okuženih pacientov, prav tako pa so dokazali protitelesa proti AMA1, MSP1<sub>19</sub> in GK1 v imuniziranih miših. Glede na pridobljene rezultate bi ta pristop priprave cepiv lahko še bolje raziskali in potencialno razvili učinkovito oralno cepivo [3].

== Viri ==

1.	M. A. Phillips, J. N. Burrows, C. Manyando, R. H. van Huijsduijnen, W. C. Van Voorhis, T. N. C. Wells: Malaria. ''Nat. Rev. Dis. Prim''. ''2017'', ''3(1)'', str. 17050.

2.	K.-C. Kwon, D. Verma, N. D. Singh, R. Herzog, H. Daniell: Oral delivery of human biopharmaceuticals, autoantigens and vaccine antigens bioencapsulated in plant cells. ''Adv. Drug Deliv. Rev''. ''2013'', ''65(6)'', str. 782–799.

3.	E. M. Milán-Noris, E. Monreal-Escalante, S. Rosales-Mendoza, R. E. Soria-Guerra, O. Radwan, J. A. Juvik, S. S. Korban: An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant-Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals. ''Mol. Biotechnol''. ''2020'', ''62(10)'', str. 534–545.

4.	Z. Zou, C. Eibl, H.-U. Koop: The stem-loop region of the tobacco psbA 5′UTR is an important determinant of mRNA stability and translation efficiency. ''Mol. Genet. Genomics 2003'', ''269(3)'', str. 340–349.