View source for Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro

'''High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity in vitro'''

Humani tkivni aktivator plazminogena je serinska proteaza, ki pretvori plazminogen v aktivno obliko,  s čimer igra ključno vlogo pri razgradnji fibrinskega čepa. V medicini se humani aktivoator plazminogena uporablja za lajšanje bolezni, ki vključujejo trombozo, na primer  miokardni infarkt, cerebralno trombozo in različne oblike vaskularnega embolizma.
Tkivni aktivator plazminogena je 70 kDa velik monomerni glikoprotein, sestavljen iz petih domen:

* Domena prstov, ki vključuje vezavno mesto za fibrin (F)
* Domena epidermalnega rastnega faktorja z vezavnim mestom za membranski receptor jeternih celic (E)
* Kringle1 domena (K1)
* Kringle 2 domena z drugim vezavnim mestom za fibrin (K2)
* Proteazna domena (P)

Ugotovili so, da sta domeni, ki vežeta fibrin (F in K2) znižujeta aktivnost encima. Če iz proteina odstranimo F domeno zmanjšamo moč vezave in pospešimo trombolizo. Domeni E in K1 sta ključni za odstranjevane tkivnega aktivatorja plazminogena iz sistema. Domena P  ima proteazno aktivnost. Rekombinantni tkivni aktivator plazminogena brez domen F, E in K1 ima večjo stabilnost in nižjo stopnjo razgradnje v jetrih ter s tem podaljšano življensko dobo, hkrati pa ima večjo encimsko aktivnost.
Uporaba mlečnih žlez za produkcijo rekombinantnih proteinov omogoča visoko produktivnost in nizko ceno produkcije, enostavno izolacijo proteinov in pravilne posttranslacijske modifikacije rekombinantnega proteina. Uporaba zajcev za produkcijo proteinov v mleku je zanimiva zaradi enostavne in poceni vzgoje, velikega legla in kratke gastracijske dobe. 

== Materiali in metode ==

Genski konstrukt so sestavljale 3' in 5' regije regulatornega gena za kozji β-kazein, med katere je bil vstavljen gen za rekombinantni humani tkivni aktivator plazminogena (samo fibrin vezavna domena K2 in encimsko aktivna domena P), pod kontrolo CMV promotorja. Konstrukt je bil pomnožen v plazmidu PCL25, na robovih pa je imel restrikcijska mesta za restriktazi  Sal I in Not I, s katerima so 17 kb dolg konstrukt izrezali iz plazmida. Očiščen konstrukt so z metodo mikroiniciranja vnesli v oplojena jajčeca, embrije pa prenesli v samice. Med skotenimi mladiči so z verižno reakcijo s polimerazo identificirali transgenske živali. Vsebnost rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenih samic so določili z encimskim imunskim testom (ELISA)in Western prenosom, njegovo aktivnost pa s testom z agarozno ploščo s fibrinom (FAPA). 

== Rezultati in diskusija ==

Po mikroinicjiranju so 326 embrijev prenesli v 15 samic, skotilo se je 57 zajcev. Z verižno reakcijo s polimerazo so identificirali 18 transgenskih zajcev, 12 samic in 6 samcev.  Med laktacijo so analizirali mleko samic.

Z encimskim imunskim testom so s pomočjo umeritvene krivulje določali izražanje rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena. Med 12 transgenskimi samicami jih je 6 izražalo transgen protein v koncentraciji med 15,2 in 630 μg/mL.  Z encimskim imunskim testom so določali tudi ektopično izražanje, rezultati kažejo, da v krvi in slini zajcev ni bilo prisotnega transgenega proteina. Z Western prenosom so pokazali, da ima rekombinantni humani aktivator plazminogena, izražen v mleku zajcev pravo velikost, 36 kDa.
Specifična aktivnost je bila določena s FAPA testom, pri katerem plazmin, ki ga aktivira tkivni aktivator plazminogena, razgradi fibrin, kar se kaže kot prosojni krog na agarozni plošči. Aktivnost tkivnega aktivatorja plazminogena se določi preko polmera kroga, umerja se na standard, ki ga predstavlja aktivnost alteplaze. Specifična aktivnost  je bila določena iz razmerja aktivnosti encima (določena s FAPA testom) in koncentracije encima (določena z ELISA testom). Specifična aktivnost je bila do 360-krat večja kot pri alteplazi. 
V raziskavi so pokazali da lahko v zajčjem mleku proizvajamo  rekombinantni humanega aktivatorja plazminogena z visoko specifično aktivnostjo, kar bi lahko nadomestilo produkcijo v rekombinantnih bakterijah in celičnih linijah.

[[MBT seminarji 2017]]