View source for Vzpostavitev nove biosintezne poti za pridobivanje 3,4-dihidroksibutirične kisline iz ksiloze v bakteriji Escherichia coli

[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616302737 '''Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in ''Escherichia coli'' ''']

3,4-dihidroksibutirična kislina (v nadaljevanju: 3,4-DHBA) je hidrolizirana oblika 3-hidroksi-γ-butirolaktona. Veliko se uporabljata v farmacevtski industriji (prekurzor številnih kiralnih zdravilnih učinkovin), pa tudi pri izdelavi polimernih materialov in topil. 
Trenutna kemična sinteza temelji na uporabi petrokemičnih surovin, za katere pa v današnjem času iščemo primerne nadomestke iz obnovljivih materialov. Kot alternativo bi lahko uporabili ligno-celulozno biomaso, ki vsebuje tudi D-ksilozo.
V nadaljevanju bomo opisali pet stopenjsko biosintezno pot za pridobivanje 3,4-DHBA iz D-ksiloze na osnovi nefosfrilacijskega metabolizma D-ksiloze v ''E. coli''. Biosintezno pot so optimizirali z uporabo učinkovitih encimov na vsaki stopnji in s preprečevanjem konkurenčnih metabolnih poti v gostiteljskem sevu.

==Načrtovanje biosintezne poti==
Najprej se D-ksiloza pretvori v 2-keto-3-deoksi-D-ksilonat z encimi D-ksiloza-dehidrogenaza, D-ksilonolaktonaza in D-ksilonat-dehidrataza. 2-keto-3-deoksi-D-ksilonat se pretvori v D-3,4-dihidroksibutanal s keto kislina-dekarboksilazo, nato pride do oksidacije v 3,4-DHBA z aldehiddehidrogenazo.

==Izbira encimov za izgradnjo biosintezne poti==
XylB (D-ksiloza-dehidrogenaza) in XylC (D-ksilonolaktonaza) iz ''C. crescentus'' so uporabili, saj že obstajajo študije, kjer so ugotovili, da oba encima učinkovito pretvarjata D-ksilozo v D-ksilonat v ''E. coli''.
Za tretji korak, kjer je potrebno delovanje D-ksilonat-dehidrataze, so z ''in vitro'' encimskimi testi preverjali učinkovitost treh encimov; YjhG in YagF iz ''E.coli'' in XylD iz ''C. crescentus''. Največjo aktivnost ima XylD.
Za četrti korak, kjer je potrebno delovanje keto kislina-dekarboksilaze, so z ''in vitro'' encimskimi testi preverjali učinkovitost benzoil formiat-dekarboksilaze (MdlC) iz ''P. Putide'' in α-ketoizovalerat dekarboksilaze (KivD) iz ''L. Lactis''. Oba encima sta približno enako aktivna.
V ''E. coli'' lahko pride do oksidacije aldehidne skupine z različnimi endogenimi aldehid dehidrogenazami.

==''In vivo'' pridobivanje 3,4-DHBA==
Gena ''xylB'' in ''xylC'' so klonirali v plazmid pCS7 (v celicah se pojavlja v visokem številu kopij). Ostale gene so klonirali v vektor pZE12-luc (v celicah se pojavlja v visokem številu kopij). Sev ''E. coli'' BW25113 so transformirali s plazmidom, ki vsebuje ''xylB'' in ''xylC'' in plazmidom, ki vsebuje ''xylD'' in ''kivD''. Bakterije so gojili v stresalnih steklenicah v gojišču LB z 20 g/l D-ksiloze. Za induciranje izražanja so uporabili IPTG. Vzorce so zbirali 48 h po indukciji.
Prvotni sev je proizvedel 0,13 g/L 3,4-DHBA, več je bilo stranskega produkta 1,2,4-butantriola. V ''E.coli'' je namreč veliko endigenih aldoketoreduktaz in alkohol-dehidrogenaz, ki lahko aldehide pretvorijo v alkohole.

==Izbira učinkovite D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenaze za povečano pridobivanje 3,4-DHBA==
Za povečanje koncentracije 3,4-DHBA in zmanjšanje 1,2,4-butantriola so želeli čezmerno izražati D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenazo. Domnevali so, da sta od NADP+ odvisna sukcinat-semialdehid-dehidrogenazi GabD iz ''P. Putide'' in YneI iz ''E. coli'' sposobni pretvarjati 3,4-dihidroksibutanal v 3,4-DHBA. Sukcinat-semialdehid in D-3,4-dihidroksibutanal sta si strukturno namreč podobna. Z ''in vitro'' encimskimi testi so ugotovili, da ima YneI trikrat večjo aktivnost. ''YneI'' so klonirali v plazmid, ki je nosil tudi zapis za ''xylD'' in ''kivD'' in kotransformirali ''E. coli'' s plazmidom z zapisoma za ''xylB'' in ''xylC''.
Koncentracija 3,4-DHBA je bila 6-krat večja kot v originalnem sevu, koncentracija 1,2,4-butantriola se je zmanjšala. 

==Optimizacija s prekinitvijo kompetitivnih poti==
V divjem tipu ''E.coli'' se D-ksiloza metabolizira v pentoza fosfatni poti, D-ksilonat pa se lahko pretvori v piruvat in glikoaldehid v Dahmsovi poti. Pentoza fosfatno pot so preprečili z izbitjem ''xylA'', ki nosi zapis za D-ksiloza-izomerazo. Za onemogočenje Dahmsove poti so onesposobili ''yjhH'' in ''yagE''.

==Zaključek==
Končni sev je proizvedel 1,27 g/l 3,4-DHBA v stresalnih steklenicah, kar je največja pridobljena koncentracija do sedaj in kaže na velik potencial za proizvodnjo 3,4-DHBA v večjem obsegu. Koncentracija stranskega produkta 1,2,4-butantriola je znašala 0,18 g/l, ki pa bi jo lahko še zmanjšali z inaktivacijo endogenih D-3,4-dihidroksibutanal-reduktaz.

==Vir==
Wang J., Shen X., et al. Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 2017; 41: 39-45