Vzpostavitev nove biosintezne poti za pridobivanje 3,4-dihidroksibutirične kisline iz ksiloze v bakteriji Escherichia coli

From Wiki FKKT

(Difference between revisions)
Jump to: navigation, search
(New page: [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616302737 '''Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in ''Escherichi...)
Line 26: Line 26:
==Zaključek==
==Zaključek==
-
Končni sev je proizvedel 1,27g/l 3,4-DHBA v stresalnih steklenicah, kar je največja pridobljena koncentracija do sedaj in kaže na velik potencial za proizvodnjo 3,4-DHBA v večjem obsegu. Koncentracija stranskega produkta 1,2,4-butantriola je znašala 0,18 g/l, ki pa bi jo lahko še zmanjšali z inaktivacijo endogenih D-3,4-dihidroksibutanal-reduktaz.
+
Končni sev je proizvedel 1,27 g/l 3,4-DHBA v stresalnih steklenicah, kar je največja pridobljena koncentracija do sedaj in kaže na velik potencial za proizvodnjo 3,4-DHBA v večjem obsegu. Koncentracija stranskega produkta 1,2,4-butantriola je znašala 0,18 g/l, ki pa bi jo lahko še zmanjšali z inaktivacijo endogenih D-3,4-dihidroksibutanal-reduktaz.
==Vir==
==Vir==
Wang J., Shen X., et al. Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 2017; 41: 39-45
Wang J., Shen X., et al. Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 2017; 41: 39-45

Revision as of 19:45, 21 May 2017

Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in Escherichia coli

3,4-dihidroksibutirična kislina (v nadaljevanju: 3,4-DHBA) je hidrolizirana oblika 3-hidroksi-γ-butirolaktona. Veliko se uporabljata v farmacevtski industriji (prekurzor številnih kiralnih zdravilnih učinkovin), pa tudi pri izdelavi polimernih materialov in topil. Trenutna kemična sinteza temelji na uporabi petrokemičnih surovin, za katere pa v današnjem času iščemo primerne nadomestke iz obnovljivih materialov. Kot alternativo bi lahko uporabili ligno-celulozno biomaso, ki vsebuje tudi D-ksilozo. V nadaljevanju bomo opisali pet stopenjsko biosintezno pot za pridobivanje 3,4-DHBA iz D-ksiloze na osnovi nefosfrilacijskega metabolizma D-ksiloze v E. coli. Biosintezno pot so optimizirali z uporabo učinkovitih encimov na vsaki stopnji in s preprečevanjem konkurenčnih metabolnih poti v gostiteljskem sevu.

Contents

Načrtovanje biosintezne poti

Najprej se D-ksiloza pretvori v 2-keto-3-deoksi-D-ksilonat z encimi D-ksiloza-dehidrogenaza, D-ksilonolaktonaza in D-ksilonat-dehidrataza. 2-keto-3-deoksi-D-ksilonat se pretvori v D-3,4-dihidroksibutanal s keto kislina-dekarboksilazo, nato pride do oksidacije v 3,4-DHBA z aldehiddehidrogenazo.

Izbira encimov za izgradnjo biosintezne poti

XylB (D-ksiloza-dehidrogenaza) in XylC (D-ksilonolaktonaza) iz C. crescentus so uporabili, saj že obstajajo študije, kjer so ugotovili, da oba encima učinkovito pretvarjata D-ksilozo v D-ksilonat v E. coli. Za tretji korak, kjer je potrebno delovanje D-ksilonat-dehidrataze, so z in vitro encimskimi testi testirali učinkovitost treh encimov; YjhG in YagF iz E.coli in XylD iz C. crescentus. Največjo aktivnost ima XylD. Za četrti korak, kjer je potrebno delovanje keto kislina-dekarboksilaze, so z in vitro encimskimi testi testirali učinkovitost benzoil formiat-dekarboksilaze (MdlC) iz P. Putide in α-ketoizovalerat dekarboksilaze (KivD) iz L. Lactis. Oba encima sta približno enako aktivna. V E. coli lahko pride do oksidacije aldehidne skupine z različnimi endogenimi aldehid dehidrogenazami.

In vivo pridobivanje 3,4-DHBA

Gena xylB in xylC so klonirali v plazmid pCS7 (v celicah se pojavlja v visokem številu kopij). Ostale gene so klonirali v vektor pZE12-luc (v celicah se pojavlja v visokem številu kopij). Sev E. coli BW25113 so transformirali z plazmidom, ki vsebuje xylB in xylC in plazmidom, ki vsebuje xylD in kivD. Bakterije so gojili v stresalnih steklenicah v gojišču LB z 20 g/l D-ksiloze. Za induciranje izražanja so uporabili IPTG. Vzorce so zbirali 48 h po indukciji. Prvotni sev je proizvedel 0,13 g/L 3,4-DHBA, več je bilo stranskega produkta 1,2,4-butantriola. V E.coli je namreč veliko endigenih aldoketoreduktaz in alkohol-dehidrogenaz, ki lahko aldehide pretvorijo v alkohole.

Izbira učinkovite D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenaze za povečano pridobivanje 3,4-DHBA

Za povečanje koncentracije 3,4-DHBA in zmanjšanje 1,2,4-butantriola so želeli čezmerno izražati D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenazo. Domnevali so, da sta od NADP+ odvisna sukcinat-semialdehid-dehidrogenazi GabD iz P. Putide in YneI iz E. coli sposobni pretvarjati 3,4-dihidroksibutanal v 3,4-DHBA. Sukcinat-semialdehid in D-3,4-dihidroksibutanal sta si strukturno namreč podobna. Z in vitro encimskimi testi so ugotovili, da ima YneI trikrat večjo aktivnost. YneI so klonirali v plazmid, ki je nosil tudi zapis za xylD in kivD in kotransformirali E. coli s plazmidom z zapisoma za xylB in xylC. Koncentracija 3,4-DHBA je bila 6-krat večja kot v originalnem sevu, koncentracija 1,2,4-butantriola se je zmanjšala.

Optimizacija s prekinitvijo kompetitivnih poti

V divjem tipu E.coli se D-ksiloza metabolizira v pentoza fosfatni poti, D-ksilonat pa se lahko pretvori v piruvat in glikoaldehid v Dahmsovi poti. Pentoza fosfatno pot so preprečili z izbitjem xylA, ki nosi zapis za D-ksiloza-izomerazo. Za onemogočenje Dahmsove poti so onesposobili yjhH in yagE.

Zaključek

Končni sev je proizvedel 1,27 g/l 3,4-DHBA v stresalnih steklenicah, kar je največja pridobljena koncentracija do sedaj in kaže na velik potencial za proizvodnjo 3,4-DHBA v večjem obsegu. Koncentracija stranskega produkta 1,2,4-butantriola je znašala 0,18 g/l, ki pa bi jo lahko še zmanjšali z inaktivacijo endogenih D-3,4-dihidroksibutanal-reduktaz.

Vir

Wang J., Shen X., et al. Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 2017; 41: 39-45

Personal tools