Vzpostavitev nove biosintezne poti za pridobivanje 3,4-dihidroksibutirične kisline iz ksiloze v bakteriji Escherichia coli

From Wiki FKKT

(Difference between revisions)
Jump to: navigation, search
Current revision (19:55, 22 May 2017) (view source)
 
(4 intermediate revisions not shown.)
Line 9: Line 9:
==Izbira encimov za izgradnjo biosintezne poti==
==Izbira encimov za izgradnjo biosintezne poti==
-
XylB (D-ksiloza-dehidrogenaza) in XylC (D-ksilonolaktonaza) iz ''C. crescentus'' so uporabili, saj že obstajajo študije, kjer so ugotovili, da oba encima učinkovito pretvarjata D-ksilozo v D-ksilonat v ''E. coli''.
+
XylB (D-ksiloza-dehidrogenaza) in XylC (D-ksilonolaktonaza) iz ''Caulobacter crescentus'' so uporabili, saj že obstajajo študije, kjer so ugotovili, da oba encima učinkovito pretvarjata D-ksilozo v D-ksilonat v ''E. coli''.
-
Za tretji korak, kjer je potrebno delovanje D-ksilonat-dehidrataze, so z ''in vitro'' encimskimi testi testirali učinkovitost treh encimov; YjhG in YagF iz ''E.coli'' in XylD iz ''C. crescentus''. Največjo aktivnost ima XylD.
+
Za tretji korak, kjer je potrebno delovanje D-ksilonat-dehidrataze, so z ''in vitro'' encimskimi testi preverjali učinkovitost treh encimov; YjhG in YagF iz ''E.coli'' in XylD iz ''C. crescentus''. Največjo aktivnost ima XylD.
-
Za četrti korak, kjer je potrebno delovanje keto kislina-dekarboksilaze, so z ''in vitro'' encimskimi testi testirali učinkovitost benzoil formiat-dekarboksilaze (MdlC) iz ''P. Putide'' in α-ketoizovalerat dekarboksilaze (KivD) iz ''L. Lactis''. Oba encima sta približno enako aktivna.
+
Za četrti korak, kjer je potrebno delovanje keto kislina-dekarboksilaze, so z ''in vitro'' encimskimi testi preverjali učinkovitost benzoil formiat-dekarboksilaze (MdlC) iz bakterije ''Pseudomonas Putida'' in α-ketoizovalerat dekarboksilaze (KivD) iz ''Lactococcus Lactis''. Oba encima sta približno enako aktivna.
V ''E. coli'' lahko pride do oksidacije aldehidne skupine z različnimi endogenimi aldehid dehidrogenazami.
V ''E. coli'' lahko pride do oksidacije aldehidne skupine z različnimi endogenimi aldehid dehidrogenazami.
==''In vivo'' pridobivanje 3,4-DHBA==
==''In vivo'' pridobivanje 3,4-DHBA==
-
Gena ''xylB'' in ''xylC'' so klonirali v plazmid pCS7 (v celicah se pojavlja v visokem številu kopij). Ostale gene so klonirali v vektor pZE12-luc (v celicah se pojavlja v visokem številu kopij). Sev ''E. coli'' BW25113 so transformirali z plazmidom, ki vsebuje ''xylB'' in ''xylC'' in plazmidom, ki vsebuje ''xylD'' in ''kivD''. Bakterije so gojili v stresalnih steklenicah v gojišču LB z 20 g/l D-ksiloze. Za induciranje izražanja so uporabili IPTG. Vzorce so zbirali 48 h po indukciji.
+
Gena ''xylB'' in ''xylC'' so klonirali v plazmid pCS7 (v celicah se pojavlja v srednjem številu kopij). Ostale gene so klonirali v vektor pZE12-luc (v celicah se pojavlja v visokem številu kopij). Sev ''E. coli'' BW25113 so transformirali s plazmidom, ki vsebuje ''xylB'' in ''xylC'' in plazmidom, ki vsebuje ''xylD'' in ''kivD''. Bakterije so gojili v stresalnih steklenicah v gojišču LB z 20 g/l D-ksiloze. Za induciranje izražanja so uporabili IPTG. Vzorce so zbirali 48 h po indukciji.
-
Prvotni sev je proizvedel 0,13 g/L 3,4-DHBA, več je bilo stranskega produkta 1,2,4-butantriola. V ''E.coli'' je namreč veliko endigenih aldoketoreduktaz in alkohol-dehidrogenaz, ki lahko aldehide pretvorijo v alkohole.
+
Prvotni sev je proizvedel 0,13 g/L 3,4-DHBA, več je bilo stranskega produkta 1,2,4-butantriola. V ''E.coli'' je namreč veliko endogenih aldoketoreduktaz in alkohol-dehidrogenaz, ki lahko aldehide pretvorijo v alkohole.
==Izbira učinkovite D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenaze za povečano pridobivanje 3,4-DHBA==
==Izbira učinkovite D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenaze za povečano pridobivanje 3,4-DHBA==

Current revision

Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in Escherichia coli

3,4-dihidroksibutirična kislina (v nadaljevanju: 3,4-DHBA) je hidrolizirana oblika 3-hidroksi-γ-butirolaktona. Veliko se uporabljata v farmacevtski industriji (prekurzor številnih kiralnih zdravilnih učinkovin), pa tudi pri izdelavi polimernih materialov in topil. Trenutna kemična sinteza temelji na uporabi petrokemičnih surovin, za katere pa v današnjem času iščemo primerne nadomestke iz obnovljivih materialov. Kot alternativo bi lahko uporabili ligno-celulozno biomaso, ki vsebuje tudi D-ksilozo. V nadaljevanju bomo opisali pet stopenjsko biosintezno pot za pridobivanje 3,4-DHBA iz D-ksiloze na osnovi nefosfrilacijskega metabolizma D-ksiloze v E. coli. Biosintezno pot so optimizirali z uporabo učinkovitih encimov na vsaki stopnji in s preprečevanjem konkurenčnih metabolnih poti v gostiteljskem sevu.

Contents

Načrtovanje biosintezne poti

Najprej se D-ksiloza pretvori v 2-keto-3-deoksi-D-ksilonat z encimi D-ksiloza-dehidrogenaza, D-ksilonolaktonaza in D-ksilonat-dehidrataza. 2-keto-3-deoksi-D-ksilonat se pretvori v D-3,4-dihidroksibutanal s keto kislina-dekarboksilazo, nato pride do oksidacije v 3,4-DHBA z aldehiddehidrogenazo.

Izbira encimov za izgradnjo biosintezne poti

XylB (D-ksiloza-dehidrogenaza) in XylC (D-ksilonolaktonaza) iz Caulobacter crescentus so uporabili, saj že obstajajo študije, kjer so ugotovili, da oba encima učinkovito pretvarjata D-ksilozo v D-ksilonat v E. coli. Za tretji korak, kjer je potrebno delovanje D-ksilonat-dehidrataze, so z in vitro encimskimi testi preverjali učinkovitost treh encimov; YjhG in YagF iz E.coli in XylD iz C. crescentus. Največjo aktivnost ima XylD. Za četrti korak, kjer je potrebno delovanje keto kislina-dekarboksilaze, so z in vitro encimskimi testi preverjali učinkovitost benzoil formiat-dekarboksilaze (MdlC) iz bakterije Pseudomonas Putida in α-ketoizovalerat dekarboksilaze (KivD) iz Lactococcus Lactis. Oba encima sta približno enako aktivna. V E. coli lahko pride do oksidacije aldehidne skupine z različnimi endogenimi aldehid dehidrogenazami.

In vivo pridobivanje 3,4-DHBA

Gena xylB in xylC so klonirali v plazmid pCS7 (v celicah se pojavlja v srednjem številu kopij). Ostale gene so klonirali v vektor pZE12-luc (v celicah se pojavlja v visokem številu kopij). Sev E. coli BW25113 so transformirali s plazmidom, ki vsebuje xylB in xylC in plazmidom, ki vsebuje xylD in kivD. Bakterije so gojili v stresalnih steklenicah v gojišču LB z 20 g/l D-ksiloze. Za induciranje izražanja so uporabili IPTG. Vzorce so zbirali 48 h po indukciji. Prvotni sev je proizvedel 0,13 g/L 3,4-DHBA, več je bilo stranskega produkta 1,2,4-butantriola. V E.coli je namreč veliko endogenih aldoketoreduktaz in alkohol-dehidrogenaz, ki lahko aldehide pretvorijo v alkohole.

Izbira učinkovite D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenaze za povečano pridobivanje 3,4-DHBA

Za povečanje koncentracije 3,4-DHBA in zmanjšanje 1,2,4-butantriola so želeli čezmerno izražati D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenazo. Domnevali so, da sta od NADP+ odvisna sukcinat-semialdehid-dehidrogenazi GabD iz P. Putide in YneI iz E. coli sposobni pretvarjati 3,4-dihidroksibutanal v 3,4-DHBA. Sukcinat-semialdehid in D-3,4-dihidroksibutanal sta si strukturno namreč podobna. Z in vitro encimskimi testi so ugotovili, da ima YneI trikrat večjo aktivnost. YneI so klonirali v plazmid, ki je nosil tudi zapis za xylD in kivD in kotransformirali E. coli s plazmidom z zapisoma za xylB in xylC. Koncentracija 3,4-DHBA je bila 6-krat večja kot v originalnem sevu, koncentracija 1,2,4-butantriola se je zmanjšala.

Optimizacija s prekinitvijo kompetitivnih poti

V divjem tipu E.coli se D-ksiloza metabolizira v pentoza fosfatni poti, D-ksilonat pa se lahko pretvori v piruvat in glikoaldehid v Dahmsovi poti. Pentoza fosfatno pot so preprečili z izbitjem xylA, ki nosi zapis za D-ksiloza-izomerazo. Za onemogočenje Dahmsove poti so onesposobili yjhH in yagE.

Zaključek

Končni sev je proizvedel 1,27 g/l 3,4-DHBA v stresalnih steklenicah, kar je največja pridobljena koncentracija do sedaj in kaže na velik potencial za proizvodnjo 3,4-DHBA v večjem obsegu. Koncentracija stranskega produkta 1,2,4-butantriola je znašala 0,18 g/l, ki pa bi jo lahko še zmanjšali z inaktivacijo endogenih D-3,4-dihidroksibutanal-reduktaz.

Vir

Wang J., Shen X., et al. Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 2017; 41: 39-45

Personal tools