Vzpostavitev nove biosintezne poti za pridobivanje 3,4-dihidroksibutirične kisline iz ksiloze v bakteriji Escherichia coli

From Wiki FKKT
Jump to navigationJump to search
The printable version is no longer supported and may have rendering errors. Please update your browser bookmarks and please use the default browser print function instead.

Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in Escherichia coli

3,4-dihidroksibutirična kislina (v nadaljevanju: 3,4-DHBA) je hidrolizirana oblika 3-hidroksi-γ-butirolaktona. Veliko se uporabljata v farmacevtski industriji (prekurzor številnih kiralnih zdravilnih učinkovin), pa tudi pri izdelavi polimernih materialov in topil. Trenutna kemična sinteza temelji na uporabi petrokemičnih surovin, za katere pa v današnjem času iščemo primerne nadomestke iz obnovljivih materialov. Kot alternativo bi lahko uporabili ligno-celulozno biomaso, ki vsebuje tudi D-ksilozo. V nadaljevanju bomo opisali pet stopenjsko biosintezno pot za pridobivanje 3,4-DHBA iz D-ksiloze na osnovi nefosfrilacijskega metabolizma D-ksiloze v E. coli. Biosintezno pot so optimizirali z uporabo učinkovitih encimov na vsaki stopnji in s preprečevanjem konkurenčnih metabolnih poti v gostiteljskem sevu.

Načrtovanje biosintezne poti

Najprej se D-ksiloza pretvori v 2-keto-3-deoksi-D-ksilonat z encimi D-ksiloza-dehidrogenaza, D-ksilonolaktonaza in D-ksilonat-dehidrataza. 2-keto-3-deoksi-D-ksilonat se pretvori v D-3,4-dihidroksibutanal s keto kislina-dekarboksilazo, nato pride do oksidacije v 3,4-DHBA z aldehiddehidrogenazo.

Izbira encimov za izgradnjo biosintezne poti

XylB (D-ksiloza-dehidrogenaza) in XylC (D-ksilonolaktonaza) iz C. crescentus so uporabili, saj že obstajajo študije, kjer so ugotovili, da oba encima učinkovito pretvarjata D-ksilozo v D-ksilonat v E. coli. Za tretji korak, kjer je potrebno delovanje D-ksilonat-dehidrataze, so z in vitro encimskimi testi preverjali učinkovitost treh encimov; YjhG in YagF iz E.coli in XylD iz C. crescentus. Največjo aktivnost ima XylD. Za četrti korak, kjer je potrebno delovanje keto kislina-dekarboksilaze, so z in vitro encimskimi testi preverjali učinkovitost benzoil formiat-dekarboksilaze (MdlC) iz P. Putide in α-ketoizovalerat dekarboksilaze (KivD) iz L. Lactis. Oba encima sta približno enako aktivna. V E. coli lahko pride do oksidacije aldehidne skupine z različnimi endogenimi aldehid dehidrogenazami.

In vivo pridobivanje 3,4-DHBA

Gena xylB in xylC so klonirali v plazmid pCS7 (v celicah se pojavlja v visokem številu kopij). Ostale gene so klonirali v vektor pZE12-luc (v celicah se pojavlja v visokem številu kopij). Sev E. coli BW25113 so transformirali z plazmidom, ki vsebuje xylB in xylC in plazmidom, ki vsebuje xylD in kivD. Bakterije so gojili v stresalnih steklenicah v gojišču LB z 20 g/l D-ksiloze. Za induciranje izražanja so uporabili IPTG. Vzorce so zbirali 48 h po indukciji. Prvotni sev je proizvedel 0,13 g/L 3,4-DHBA, več je bilo stranskega produkta 1,2,4-butantriola. V E.coli je namreč veliko endigenih aldoketoreduktaz in alkohol-dehidrogenaz, ki lahko aldehide pretvorijo v alkohole.

Izbira učinkovite D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenaze za povečano pridobivanje 3,4-DHBA

Za povečanje koncentracije 3,4-DHBA in zmanjšanje 1,2,4-butantriola so želeli čezmerno izražati D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenazo. Domnevali so, da sta od NADP+ odvisna sukcinat-semialdehid-dehidrogenazi GabD iz P. Putide in YneI iz E. coli sposobni pretvarjati 3,4-dihidroksibutanal v 3,4-DHBA. Sukcinat-semialdehid in D-3,4-dihidroksibutanal sta si strukturno namreč podobna. Z in vitro encimskimi testi so ugotovili, da ima YneI trikrat večjo aktivnost. YneI so klonirali v plazmid, ki je nosil tudi zapis za xylD in kivD in kotransformirali E. coli s plazmidom z zapisoma za xylB in xylC. Koncentracija 3,4-DHBA je bila 6-krat večja kot v originalnem sevu, koncentracija 1,2,4-butantriola se je zmanjšala.

Optimizacija s prekinitvijo kompetitivnih poti

V divjem tipu E.coli se D-ksiloza metabolizira v pentoza fosfatni poti, D-ksilonat pa se lahko pretvori v piruvat in glikoaldehid v Dahmsovi poti. Pentoza fosfatno pot so preprečili z izbitjem xylA, ki nosi zapis za D-ksiloza-izomerazo. Za onemogočenje Dahmsove poti so onesposobili yjhH in yagE.

Zaključek

Končni sev je proizvedel 1,27 g/l 3,4-DHBA v stresalnih steklenicah, kar je največja pridobljena koncentracija do sedaj in kaže na velik potencial za proizvodnjo 3,4-DHBA v večjem obsegu. Koncentracija stranskega produkta 1,2,4-butantriola je znašala 0,18 g/l, ki pa bi jo lahko še zmanjšali z inaktivacijo endogenih D-3,4-dihidroksibutanal-reduktaz.

Vir

Wang J., Shen X., et al. Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 2017; 41: 39-45