YTH

From Wiki FKKT

(Difference between revisions)
Jump to: navigation, search
(YTH)
Current revision (19:43, 28 October 2013) (view source)
 
Line 17: Line 17:
Za potrditev metode dvohibridnega sistema se največkrat uporablja koimunoprecipiracija.
Za potrditev metode dvohibridnega sistema se največkrat uporablja koimunoprecipiracija.
-
Z myc-označen NS3/4A in z V5-označen cdN protein sta se izrazila v HuH7 celicah s prehodno transfekcijo. Celične lizate so imunoprecipitirali z anti-V5 protitelesi, nato pa so izvedli Western-blot test z anti-myc protitelesi. S tem so dokazali, da se proteina vežeta (z myc označen protein NS3/4A je imunoprecipitiral v prisotnosti anti-V5 protiteles in ne v odsotnosti le-teh).
+
Z myc-označen NS3/4A in z V5-označen cdN protein sta se izrazila v HuH7 celicah s prehodno transfekcijo. Celične lizate so imunoprecipitirali z anti-V5 protitelesi, nato pa so izvedli Western-blot test z anti-myc protitelesi. S tem so dokazali, da se proteina vežeta (z myc označen protein NS3/4A je imunoprecipitiral v prisotnosti anti-V5 protiteles in ne v odsotnosti cdN proteina).
   
   
Interakcije proteinov so potrdili tudi s konfokalno mikroskopijo.
Interakcije proteinov so potrdili tudi s konfokalno mikroskopijo.

Current revision

UVOD

Hepatitis C virus predstavlja glavni vzrok za nastanek hepatitsa, ciroze jeter in hepatocelularnega karcinoma. Infekcija je etiološko vključena v razvoj B-celičnega limfoma. Spada v rod Hepacivirus družine Flaviviridae. Genom je pozitivna enoverižna RNA, dolžine 9,6 kb, ki se prevede v protein (poliproteinski prekurzor), ta pa se z gostiteljskimi in virusnimi proteazami pretvori v manjše aktivne proteine. NS3 je 67 kDa protein, pri katerem ima N-konec serin proteazno aktivnost, C-konec pa NTPazno/helikazno aktivnost. Nahaja se v endoplazemskem retikulumu in tvori heterodimerni kompleks z NS4A-kofaktor proteaze. Molekulski mehanizem patogeneze HCV še ni popolnoma razumljiv. Verjetno je NS3 vključen v celično transformacijo. Za razumevanje funkcije proteina so zato izvedli dvohibridni test, za identifikacijo proteinov, ki interagirajo z NS3. Odkrili so, da celična 5’(3’)-deoksiribonukleotidaza (cdN) interagira z NS3, kar vpliva na zaviranje aktivnosti cdN.

DVOHIBRIDNI SISTEM KVASOVK

Za ugotavljanje interakcij med proteini so izvedli dvohibridni sistem Clontech Laboratories (ZDA). Princip metode temelji na principu vabe in plena. Najprej je potrebno izdelati fuzijska proteina. To storimo tako, da segment DNA, ki kodira protein (vaba) vstavimo v plazmid, ta pa vsebuje tudi segment za vezavno domeno Gal4. Plazmid se prepiše in prevede v protein, ki ima vezano tudi Gal4 vezavno domeno. Enak postopek uporabimo tudi pri plenu, vendar nanj vežemo Gal4 aktivacijsko domeno. Če proteina med sabo interagirata, sta aktivacijska in vezavna domena dovolj blizu, da aktivirata transkripcijo genov: najpogosteje LacZ, kjer transkripcija gena povroči modro obarvanje kolonij. Plazmide moramo vstaviti v gostiteljsko celico s procesom transfekcije. Sonifikacija povzroči prepustnost membrane, tako da prehaja plazmid v celico. Po transfekciji izberemo celice, ki vsebujejo oba plazmida na medijih z manjkajočo komponentno, kot npr. triptofan, za rast celic. Če sta vstavljena oba vektorja vsebujeta gen za manjkajočo komponento in celica lahko preživi.

Z metodo dvohobridni sistemi kvasovk so najprej ugotavljali kateri celični proteini interagirajo z NS3 proteinom. S to presejalno tehniko pri kateri so uporabili komercialno dostopno knjižnico “human fetal liver library” so odkrili, da le en klon, ki kodira okrnjen protein cdN (brez N-končnih 44 aminokislin) interagira z NS3. S številnimi negativnimi kotrolami so zagotovili specifičnost testa, uporabili pa so tudi pozitivno konrolo ELKS-d protein (z znano domeno, ki interagira z NS3).


KOIMUNOPRECIPITACIJA

Za potrditev metode dvohibridnega sistema se največkrat uporablja koimunoprecipiracija. Z myc-označen NS3/4A in z V5-označen cdN protein sta se izrazila v HuH7 celicah s prehodno transfekcijo. Celične lizate so imunoprecipitirali z anti-V5 protitelesi, nato pa so izvedli Western-blot test z anti-myc protitelesi. S tem so dokazali, da se proteina vežeta (z myc označen protein NS3/4A je imunoprecipitiral v prisotnosti anti-V5 protiteles in ne v odsotnosti cdN proteina).

Interakcije proteinov so potrdili tudi s konfokalno mikroskopijo.

Vpliv HCV na encimsko aktivnost so testirali s testom 5’(3’)- deoksiribonukleotidazne aktivnosti in dokazali, da NS3 protein zavre aktivnost cdN. Za potrditev točnosti testa so uporabili tehniko s shRNA utišanja genov, s katero so dokazali da večina aktivnosti 5’-nukleotidaz pripada encimu cdN. V študiji so dokazali, da HCV sicer zavre aktivnost cdN, nima pa vpliva na izražanje proteina v celicah.

ZAKLJUČEK

Replikacija DNA in popravljanje zahteva uravnotežen vir štirih deoksiribonukleotidov. Zaloge intracelularnih dNTP-jev se obnavljajo s cikli reakcij z nukleotidazo. Ker NS3 povzroči zmanjšanje aktivnosti encima pride do sprememb v koncentraciji DNA prekurzorjev, neravnovesje le-teh pa izzove številne genetske spremembe. Okužba s HCV je etiološko vključena v razvoj hepatocelularnega karcinoma in B-celičnega limfoma. Znano je, da HCV inducira nastanek tumorskih celic, ker pride do neravnovesja DNA prekurzorjev zaradi interakcije cdN z NS3 proteinom.

Personal tools