Z EEG nadzorovano izražanje transgena preko brezžično napajanega optogenetskega celičnega vsadka.

From Wiki FKKT

(Difference between revisions)
Jump to: navigation, search
(New page: ==UVOD== Optogenetika je tehnologija, ki omogoča hiter in natančen tarčni nadzor nad želenimi dogodki v bioloških sistemih na molekularni ravni. Gre za kombinacijo genetskih in optič...)
Current revision (15:08, 4 June 2015) (view source)
 
Line 4: Line 4:
==RAZISKAVA==
==RAZISKAVA==
-
Cilj raziskave je bil načrtovanje svetlobno občutljivega genetskega vezja v sesalskih celicah za vstavitev v kamrice z LED diodami, ki inducirajo izražanje gena za sekretorno alkalno fosfatazo (SEAP). Kamrice služijo kot podkožni vsadek v miškah, v katerih z uporabo posebnega sprejemniškega   vezja preko EEG z različnimi aktivnostmi možganskih valov sprožijo delovanje LED diod in posledično izražanje SEAP.  
+
Cilj raziskave je bil načrtovanje svetlobno občutljivega genetskega vezja v sesalskih celicah za vstavitev v kamrice z LED diodami, ki inducirajo izražanje gena za sekretorno alkalno fosfatazo (SEAP). Kamrice služijo kot podkožni vsadek v miškah, v katerih z uporabo posebnega sprejemniškega vezja preko EEG z različnimi aktivnostmi možganskih valov sprožijo delovanje LED diod in posledično izražanje SEAP iz načrtovanih celic.  
-
Načrtovanje svetlobno občutljivega genetskega vezja
+
 
 +
===Načrtovanje svetlobno občutljivega genetskega vezja===
Raziskovalci so izdelali posebne kamrice z LED lučkami, ki so svetile s svetlobo v NIR spektru valovne dolžine 700 nm. V kamricah so bile nacepljene sesalske celice HEK-293F, ki so vsebovale načrtovano genetsko vezje.  Celice HEK-293F se od HEK-293T razlikujejo po tem, da lahko rastejo v suspenzijski kulturi brez dodanega seruma. To dejstvo je pomembno za gojenje teh celic v načrtovanih kamricah. Gojitvene kamrice s celicami so bile od zunanjega okolja ločene s polprepustno membrano, ki ima prepustnost za molekule, manjše od 300 kDa.
Raziskovalci so izdelali posebne kamrice z LED lučkami, ki so svetile s svetlobo v NIR spektru valovne dolžine 700 nm. V kamricah so bile nacepljene sesalske celice HEK-293F, ki so vsebovale načrtovano genetsko vezje.  Celice HEK-293F se od HEK-293T razlikujejo po tem, da lahko rastejo v suspenzijski kulturi brez dodanega seruma. To dejstvo je pomembno za gojenje teh celic v načrtovanih kamricah. Gojitvene kamrice s celicami so bile od zunanjega okolja ločene s polprepustno membrano, ki ima prepustnost za molekule, manjše od 300 kDa.
Raziskovalci so načrtovali vnos signalizacijske poti v sesalske celice, ki temelji na izražanju sekundarnega obveščevalca c-di-GMP. Za produkcijo c-di-GMP  so uporabili skrajšano različico svetlobno občutljivega večdomenskega  proteina BphG1 iz bakterije Rhodobacter sphaeroides brez fosfodiesterazne aktivnosti.  Ta protein vsebuje N-terminalno na NIR svetlobo občutljivo domeno in C-terminalno digvanilat ciklazno domeno (DGC).  Protein BphG1 ima tudi fosfodiesterazno aktivnost (PDE), ki omogoča uravnavanje koncentracije c-di-GMP, ki ima v bakterijskih celicah vlogo uravnavanja prehoda celic iz premikajočega stanja v tvorbo biofilma. Skrajšano različico BphG1, ki katalizira nastanek sekundarnega obveščevalca c-di-GMP iz GTP so poimenovali DGCL . Preko tega obveščevalca pride do aktivacije proteina  STING na endoplazemskem retikulumu (ang. »stimulator of interferon genes«), ki povzroči fosforilacijo IRF3 (ang. »interferon-regulatory factor 3«) preko TBK1 (ang. »tank-binding kinase 1«). Nato pride do premestitve fosforiliranega IRF3 v jedro, kjer z vezavo na specifične operatorje aktivira promotorje interferona  I. Pod kontrolo promotorja interferona  I je bilo izražanje SEAP (ang. »Secreted embryonic alkaline phosphatase«), ki je pogosto uporabljan poročevalski sistem. Temelji na izražanju alkalne fosfataze, ki se izloča v gojišče, ob dodatku substrata pa lahko zaznavamo produkt.
Raziskovalci so načrtovali vnos signalizacijske poti v sesalske celice, ki temelji na izražanju sekundarnega obveščevalca c-di-GMP. Za produkcijo c-di-GMP  so uporabili skrajšano različico svetlobno občutljivega večdomenskega  proteina BphG1 iz bakterije Rhodobacter sphaeroides brez fosfodiesterazne aktivnosti.  Ta protein vsebuje N-terminalno na NIR svetlobo občutljivo domeno in C-terminalno digvanilat ciklazno domeno (DGC).  Protein BphG1 ima tudi fosfodiesterazno aktivnost (PDE), ki omogoča uravnavanje koncentracije c-di-GMP, ki ima v bakterijskih celicah vlogo uravnavanja prehoda celic iz premikajočega stanja v tvorbo biofilma. Skrajšano različico BphG1, ki katalizira nastanek sekundarnega obveščevalca c-di-GMP iz GTP so poimenovali DGCL . Preko tega obveščevalca pride do aktivacije proteina  STING na endoplazemskem retikulumu (ang. »stimulator of interferon genes«), ki povzroči fosforilacijo IRF3 (ang. »interferon-regulatory factor 3«) preko TBK1 (ang. »tank-binding kinase 1«). Nato pride do premestitve fosforiliranega IRF3 v jedro, kjer z vezavo na specifične operatorje aktivira promotorje interferona  I. Pod kontrolo promotorja interferona  I je bilo izražanje SEAP (ang. »Secreted embryonic alkaline phosphatase«), ki je pogosto uporabljan poročevalski sistem. Temelji na izražanju alkalne fosfataze, ki se izloča v gojišče, ob dodatku substrata pa lahko zaznavamo produkt.

Current revision

Contents

UVOD

Optogenetika je tehnologija, ki omogoča hiter in natančen tarčni nadzor nad želenimi dogodki v bioloških sistemih na molekularni ravni. Gre za kombinacijo genetskih in optičnih metod, ki povzročijo ali prekinejo delovanje točno določenih procesov v celicah. V najširšem pomenu optogenetika predstavlja orodje za tarčno regulacijo, ki je odvisna od svetlobe in posledično izvaja neko efektorsko funkcijo. Raziskavo, ki je povzeta v seminarju so opravili raziskovalci iz raziskovalne skupine Martina Fusseneggerja z ETH v Zurichu, ki je svetovno znan znanstvenik s področja sintezne biologije in molekularne biotehnologije.

RAZISKAVA

Cilj raziskave je bil načrtovanje svetlobno občutljivega genetskega vezja v sesalskih celicah za vstavitev v kamrice z LED diodami, ki inducirajo izražanje gena za sekretorno alkalno fosfatazo (SEAP). Kamrice služijo kot podkožni vsadek v miškah, v katerih z uporabo posebnega sprejemniškega vezja preko EEG z različnimi aktivnostmi možganskih valov sprožijo delovanje LED diod in posledično izražanje SEAP iz načrtovanih celic.

Načrtovanje svetlobno občutljivega genetskega vezja

Raziskovalci so izdelali posebne kamrice z LED lučkami, ki so svetile s svetlobo v NIR spektru valovne dolžine 700 nm. V kamricah so bile nacepljene sesalske celice HEK-293F, ki so vsebovale načrtovano genetsko vezje. Celice HEK-293F se od HEK-293T razlikujejo po tem, da lahko rastejo v suspenzijski kulturi brez dodanega seruma. To dejstvo je pomembno za gojenje teh celic v načrtovanih kamricah. Gojitvene kamrice s celicami so bile od zunanjega okolja ločene s polprepustno membrano, ki ima prepustnost za molekule, manjše od 300 kDa. Raziskovalci so načrtovali vnos signalizacijske poti v sesalske celice, ki temelji na izražanju sekundarnega obveščevalca c-di-GMP. Za produkcijo c-di-GMP so uporabili skrajšano različico svetlobno občutljivega večdomenskega proteina BphG1 iz bakterije Rhodobacter sphaeroides brez fosfodiesterazne aktivnosti. Ta protein vsebuje N-terminalno na NIR svetlobo občutljivo domeno in C-terminalno digvanilat ciklazno domeno (DGC). Protein BphG1 ima tudi fosfodiesterazno aktivnost (PDE), ki omogoča uravnavanje koncentracije c-di-GMP, ki ima v bakterijskih celicah vlogo uravnavanja prehoda celic iz premikajočega stanja v tvorbo biofilma. Skrajšano različico BphG1, ki katalizira nastanek sekundarnega obveščevalca c-di-GMP iz GTP so poimenovali DGCL . Preko tega obveščevalca pride do aktivacije proteina STING na endoplazemskem retikulumu (ang. »stimulator of interferon genes«), ki povzroči fosforilacijo IRF3 (ang. »interferon-regulatory factor 3«) preko TBK1 (ang. »tank-binding kinase 1«). Nato pride do premestitve fosforiliranega IRF3 v jedro, kjer z vezavo na specifične operatorje aktivira promotorje interferona I. Pod kontrolo promotorja interferona I je bilo izražanje SEAP (ang. »Secreted embryonic alkaline phosphatase«), ki je pogosto uporabljan poročevalski sistem. Temelji na izražanju alkalne fosfataze, ki se izloča v gojišče, ob dodatku substrata pa lahko zaznavamo produkt.

Z EEG nadzorovan elektro-optogenetski sistem

Z mislimi sprožene elektrofiziološke signale so preko EEG pošiljali v BCI (ang. »brain-computer interface«), ki je bil naravnan tako, da ob prehodu EEG signala nad določeno vrednost brezžižčno sproži oddajanje svetlobe v vsadku z lučkami NIR. Sistem za nadzor nad elektro-optogenetskim sistemom temelji na različnih signalih EEG možganskih valov (surov signal v µV), ki ga človek sproži z različnimi stanji zavesti. Za učinkovit nadzor nad sistemom so identificirali za različna psihološka stanja specifične elektronske signale, ki služijo kot stikalo za sprožitev delovanja optogenetskega vezja. Osredotočili so se na stanje meditacije, ki so jo dosegli s priučenim sproščanjem. Drugo stanje je bila osredotočenost, ki so jo dosegli z igranjem računalniških iger. Ko je signal presegel določeno mejo je preko BCI prišlo do osvetlitve celic s pulzom NIR svetlobe. Tako so dosegli različna izražanja SEAP v celicah z načrtovanim optogenetskim vezjem. Kot omenjeno zgoraj, BCI deluje kot generator polja, ki v odvisnosti od EEG signalov brezžično aktivira proizvajanje pulzov NIR svetlobe v podkožnem vsadku.

Brezžično napajani optogenetski vsadki predstavljajo modularen stik elektronike z živimi celicami, ki omogoča neposreden nadzor nad izražanjem genov preko električnih naprav. Pristop, ki je opisan v seminarju pa je stik možganske aktivnosti z elektrogenetsko napravo. Predstavlja nove možnosti načrtovanja elektromehanskih vsadkov, kot so srčni spodbujevalniki, očesne proteze in inzulinske mikročrpalke.

Personal tools