Zgodnja evolucija transkripcijskih sistemov in ločitev arhej in bakterij

Uvod

Pojav divergence transkripcijskih sistemov sega daleč v zgodovino, v jutro življenja pred okoli 4 bilijoni let. Raziskave na področju molekularne biologije in sorodnih študij nam omogočajo vpogled v same začetke pojava življenja na zemlji v obliki majhne mikrobne strukture, kasneje imenovane zadnji univerzalni skupni prednik (LUCA). Določene strukturne lastnosti encimov, transkripcijskih faktorjev in promotorjev, prisotnih pri najstarejših organizmih, kažejo na delno sorodnost, iz katere lahko sklepamo, da je njihov razvoj tesno povezan. Ta žene divergenco organizmov, najbolj zloglasna pa je mogoče prav tista arhej in bakterij. Težko je univerzalno, neodvisno od študij, na različnih področijh trditi, kaj izvira iz česa, vendar naše hipoteze, razlage in zaključki temeljijo na predpostavki, da so arheje bolj podobne LUCA in zato osnova za bakterijske sisteme. Za primerjavo bi si težko izbrali boljšo referenco kot RNA polimerazo, ki izvaja transkripcijo v kar vseh treh domenah življenja. Ključen za njeno delovanje je motiv dveh dvojnih - sodčkov (2-DPBB). Poznamo predstavnike, ki za matrico uporabljajo RNA in tiste, ki uporabljajo DNA. To nam razodene že prvo dejstvo o razvoju teh encimov. Sklepamo namreč lahko, da se so se uveljavili nekje v času pred DNA-genomskimi organizmi ter šele nadalje privzeli DNA matrico. Za razlago divergence si bomo pomagali tudi s transkripcijskim faktorjem B (TFB) pri arhejah in bakterijski faktor σ , ki naj bi iz TFB izviral.

Evolucija RNAP in DNAP

Motiv 2-DPBB

Značilno 2-DPBB zvitje spada med ‘cradle-loop barrel’ zvitja, pri čemer sekajoči se verigi tvorita značilno psi obliko. Ta predstavlja zvitja aktivnih mest mnogih prej imenovanih polimeraz. Za pravilno delovanje pa je potreben še magnezij, ki se koordinira v zavoje beta sodčkov in sodeluje pri vezavi NTP fosfatov v procesu katalize dodajanja nukleotidov, preko aktivacije 3' kisikovega atoma.

Sodčki so sicer pogost motiv v evolucijski zgodovini. Selekcija jih je izbrala, saj so kompaktne, strukturirane enote s sprejemljivo topnostjo in strukturno celovitostjo. Dober primer je cel opus glikolitičnih encimov s svojimi TIM oziroma (β−α)8 sodčki, kot tudi proteini cikla citronske kisline z Rossmanovim zvitjem iz beta ploskev, ki naj bi izvirale iz (β−α)8 zvitja. Za veliko večino metabolizma gre tako zasluga sodčkom oziroma njihovim pretvorbam v beta ploskve. [1] Zgodnjo evolucijo lahko opišemo kot tekmo grajenja in optimizacije topnih, a stabilnih ogrodij, kjer sodčki blestijo. Poleg tega so s preventivno inhibicijo neugodne kompartmentalizacije, ki bi onemogočala ustrezno proteinsko zvijanje, postali vztrajni prvaki evolucije. Sodčki navadno nastanejo z duplikacijo motiva, po nekaj generacijah se vpeljejo še (primitivna) katalitična mesta. Ugodna duplikacija ni nujno neposredna, prej omenjen, za metabolizem pomemben, 8−β-ploskev obsežen sodček (TIM) je večkrat podlegel duplikaciji motivov, preden je dosegel želeno encimsko aktivnost. Analogno se je 2-DPPB razvil iz duplikacije β − β − α – β motiva in se šele naknadno zvil v sodček ter bolj ali manj modificiral. Modifikacija 2-DPBB vsebujočih encimov poteka pretežno preko insercij elementov v značilne  β − β − α − β − − β − β – α− β zavoje sodčkov.

Pri od RNA matrice odvisnih RNA-polimerazah so po večini precej ohranjeni motivi brez večjih insertov, zato so nam v temi divergence in razvoja manj zanimivi. Po drugi strani pa od DNA odvisne RNA-polimeraze tipa 2-DPBB bolj zaznamuje dodajane ogromnih insertov, ki jih zlahka prepoznamo in jih zato umestimo v zgodbo razvoja življenja. Pomembnejši izmed teh je sendvič-sodček hibridni motiv (SBHM), ki se vrine med β2 in β3 ploskvi po α1 heliksu enega izmed dvojice sodčkov (DPBB1). Zaradi značilnih dolgih β ploskev v angleščini nosi tudi trivialno ime “flap” ali “wall” domena. Ta specifično interagira s σ podenoto pri bakterijah in transkripcijskim faktorjem (TFB) pri arhejah, pa tudi z nekaterimi ostalimi elongacijskimi ter iniciacijskimi faktorji. Seveda lahko v tem istem zvitju dvojnih sodčkov (DPBB1) najdemo še ostale inserte, na primer tistega med β5 in β6, po α2, ta raje interagira s polimerazno domeno kot pa s transkripcijskimi faktorji. Medtem pa regija med β2 in β3 preostalega motiva (DPBB2) dvojnih sodčkov gosti manj konzervativne inserte, preko katerih lahko direktno, pretežno po sekvenci, pa tudi po sekundarni strukturi razlikujemo arhejski in bakterijski encim.

Analogno RNA polimerazam je tudi v od DNA odvisni DNA polimerazi možno opaziti inserte na primer med β4 in β5 ter med β5 in β6, ki pa jih za enkrat še ni možno interpretirati na isti način kot RNA polimerazne.

Vse to nam začrta možno rdečo nit evolucijske zgodbe teh 2-DPBB encimov. Od RNA odvisna RNA-polimeraza naj bi se tako razvila v času RNA osnovanih genomov, nekje pred LUCA. Njihova zvitja so brez večjih insertov v DPBB, kar nakazuje na največjo ohranjenost zvitja in antičnost encimov ravno pri njih. Od DNA odvisni se pa razširjajo vstran precej neodvisno od starševske oblike.

Divergenco med arhejami in bakterijami v kontekstu teh encimov je moč videti šele, ko pod drobnogled vzamemo motiv cinkovega prsta, ki ga najdemo le v arhejah in evkariontih. Na prvo žogo torej bakterijske rendicije encimov izgledajo preprostejše od arhejskih, kar pa ovrže dejstvo, da se je z bakterijsko RNA-polimerazo vzporedno razvijal še njen sigma kompliment, ki polimerazo razreši nuje po dodatnem NK v vezavnem motivu.

2-Mg mehanizem transkripcije

Vse te strukturne spremembe pa je moralo utrpeti tudi aktivno mesto. Kisli aminokislinski ostanki (E, D), ki v aktivnem mestu držijo dva atoma magnezija, se nahajajo na zankah 2-DPBB motiva. Mg1 ostane vezan na RNA polimerazo (RNAP), medtem ko se Mg2 izmenja z vsakim NTP-jem, ki se doda v RNA verigo. Mg2 vstopi v RNAP vezan na NTP kot NTP-Mg kompleks. Če pogledamo specifičen primer, najdemo ohranjeno sekvenco 737-NADFDGD-743 v bakterijski RNAP Thermus thermophilus, in njej analogno sekvenco 954-NCDGDED-961 v arhejski DNAP PolD Pyrococcus abyssi. V RNAP, ki je od RNA odvisna, in jo najdemo v plesni Neurospora crassa, Mg1 koordinira motiv 1005-GGDYDGD-1011. Kisli aminokislinski ostanki, ki v aktivnem mestu koordinirajo Mg1, so visoko evolucijski ohranjeni v vseh 2-DPBB encimih, kljub temu, da v PolD opazimo zamik regij, ki interagirajo z magnezijem. V najbolj preprostih encimih, ki vsebujejo “cradle-loop barrel” motive, lahko opazimo podobne kisle skupine na ekvivalentni lokaciji v DPBB, torej sklepamo, da so začetni koraki evolucije teh encimov temeljili na optimalni koordinaciji magnezijevih ionov.[3]

Evolucija arhejskih in bakterijskih bazalnih transkripcijskih faktorjev (GTF)

GTF-ji predstavljajo razred proteinskih transkripcijskih faktorjev, ki se vežejo na promotorska mesta na DNA in tako aktivirajo proces transkripcije[4]. Arheje prepoznavajo osrednjo regijo promotorja s pomočjo TATA box binding proteina (TBP), transkripcijskega faktorja B (TFB) in transkripcijskega faktorja E (TFE). Bakterije pa so medtem iz TFB faktorja razvile σ-faktorje, TFE in TBP pa sta se tekom evolucije izgubila. To je bil ključen dogodek, ki je privedel do ločitve teh prokariontskih domen. TBP in TFB se pri arhejah povežeta v kompleks, ki interagira z DNA. TBP tvori kontakte s TATA škatlo (8 nt) s pomočjo C-terminalnih ponovitev, ki tvorijo psevdo dimer β-ploskev. Te se poravnajo z DNA v malem žlebu, za katero prav tako lahko rečemo, da je psevdo dimerična. TFB pa vsebuje dve ti. ciklinu podobni ponovitvi (CLR), ki oblikujeta 5-α-heliks svežnje, ki se na DNA vežejo navzdol in navzgor od TATA škatle. Zadnji 3 heliksi CLR ponovitev tvorijo tipični HTH DNA vezavni motiv, ki ga sestavljajo H1-T1-H2-T2-H3. Črka H označuje heliks, črka T pa zavoj (turn). V tem motivu heliks 1 (H1) objame H2 in H3. Za vezavo DNA je ključen H3, ki s svojo N-terminalno domeno tvori največ sekvenčno specifičnih kontaktov z velikim žlebom DNA molekule. Regije v arhejskem promotorju, na katere se veže HTH motiv TFB proteina, imenujemo BREup (prepoznavni element TFB navzgor od TATA) in BREdown ( prepoznavni element TFB navzdol od TATA). Prej omenjeni TFE je eden izmed splošnih transkripcijskih faktorjev, ki se na DNA veže dokaj nespecifično, glede na sekvenco.

Bakterijski σ-faktorji so homologi TFB-ja, ki ga najdemo pri arhejah. Raziskovalci so do teh zaključkov prišli preko primerjave HTH regij, te ponovitve naj bi se podvojile in modificirale v bakterijskem σ-faktorju. Specifičino σA naj bi se z duplikacijo razvil iz C terminalnih CLR/HTH enot. Faktor σ54 pa naj bi se razvil iz 6-7 HTH enot, možno, da z zgodnjo duplikacijo σA faktorja. Če HTH enote s strani N-terminalnega konca oštevilčimo, lahko vidimo, da je HTH4 v σA in σ54 ekvivalenten HTH2 enoti v TFB. HTH4 tvori specifične kontakte z –35 regijo bakterijskega promotorja, podobno kot TFB tvori tipične HTH kontakte z BREup in BREdown. Homologija teh faktorjev je vidna tudi v podobnosti iniciacijskih kompleskov bakterijskih in človeških celic. Človeški TFIIB je namreč zelo podoben arhejskemu TFB.

Raziskovalci so v študiji predpostavili, da sta bila TBP in TFB prisotna v zadnjem splošnem skupnem predniku LUCA in sta del enega izmed najzgodnejših mehanizmov razpiranja DNA verig.

Evolucija arhejskih in bakterijskih promotorjev

Kot omenjeno so arheje bolj podobne skupnemu predniku LUCA, bakterije pa naj bi se iz njih razvile. Obstaja več dokazov, ki to idejo podpirajo. tRNA molekule in tRNAom, ki predstavlja celoten nabor tRNA molekul za nek organizem, naj bi bil pri arhejah bolj preprost in bolj podoben tRNAomu organizma LUCA. Tudi aminoacil-tRNA sintetaze in genetski kod je pri arhejah v primerjavi z bakterijami bolj preprost, kar nakazuje na dejstvo, da so arheje bolj tesno povezane s prednikom LUCA kot bakterije. Primerjava bakterijskega σA promotorja (ki je pod nadzorom σA faktorja) z arhejskim promotorjem razkrije karakteristike močnega promotorja, ki tvori več različnih kontaktov z multiplimi regijami σA faktorja. Regija PPE (“Promoter-Proximal element”), ki jo najdemo v promotorjih arheje Sulfolobus solfataricus navzgor od mesta začetka transkripcije, je z A/T nukleotidi bogata regija. PPE regija je podobna TATA škatli in obstajajo hipoteze, da naj bi se iz nje tudi razvila. Njena pozicija na arhejskemu promotorju je podobna lokaciji bakterijske Pribnove škatle, podobnosti si delita tudi v sekvenci, sklepamo, da bi se zato lahko zelo verjetno razvila iz regije PPE. Pribnovo škatlo prepoznava modificirana HTH2 regija σA faktorja, ki bakterijski promotor razpira tako, da izpostavi baze.[5]

Interakcije z GDP zankami

DPBB zanke RNA polimeraz GTF-je najverjetneje kontaktirajo preko insertov, ki z njimi tvorijo domensko specifične povezave. Ker se arhejski GTF-ji razlikujejo od bakterijskih σ faktorjev, je to najbolj logična razlaga. Aktivno mesto RNAP je skrito globoko v jedru tega encima, kar omejuje dostop do katalitičnega centra. Inserti v DPBB zankah pa bi GTF-jem lahko omogočili vezavo bližje perifernemu delu RNAP za komunikacijo s katalitično domeno. Človeški insert DPBB1 SBHM tako kontaktira domeno HTH1 faktorja TFIIB, ki se nahaja na zgornjem koncu transkripcijskega mehurčka. Podobno vezavo vzpostavi tudi bakterijski faktor σA z domeno HTH3, ki prav tako veže motiv SBHM.

Zaključek

Zgodnja evolucija transkripcijskih sistemov je ključna za divergenco arhej in bakterij, kar lahko vidimo pri razvoju strukturnih motivov encimov kot npr. omenjenih sodčkov kot tudi pri strukturni in funkcionalni pestrosti insertov. Možno je opaziti tudi ohranjenost optimalne koordinacije magnezijevih ionov v aktivnem mestu polimeraz, ključno prisotnost nekaterih faktorjev kot recimo TBP in TFB ter razvoj σ faktorja pri bakterijah. Razvoj tega namreč predstavlja pomembno modifikacijo bakterijskih sistemov, kar splošno gledano rezultira v poenostavitvi njihovih RNA polimeraz v primerjavi z arhejskimi.

Viri

[1] Alva V, Koretke KK, Coles M, Lupas AN. Cradle-loop barrels and the concept of metafolds in protein classification by natural descent. Current Opinion in Structural Biology 2008;18:358–65. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2008.02.006.

[2] Iyer LM, Aravind L. Insights from the architecture of the bacterial transcription apparatus. Journal of Structural Biology 2012;179:299–319. https://doi.org/10.1016/j.jsb.2011.12.013.

[3] Coles M, Djuranovic S, Söding J, Frickey T, Koretke K, Truffault V, et al. AbrB-like Transcription Factors Assume a Swapped Hairpin Fold that Is Evolutionarily Related to Double-Psi β Barrels. Structure 2005;13:919–28. https://doi.org/10.1016/j.str.2005.03.017.

[4] Binda O, Fernandez-Zapico ME. Bases of Chromatin Signaling and Their Impact on Diseases Pathogenesis. In: Binda O, Fernandez-Zapico ME, editors. Chromatin Signaling and Diseases, Boston: Academic Press; 2016, p. xiii–xviii. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-802389-1.02001-3.

[5] Feklístov A, Sharon BD, Darst SA, Gross CA. Bacterial Sigma Factors: A Historical, Structural, and Genomic Perspective. Annual Review of Microbiology 2014;68:357–76. https://doi.org/10.1146/annurev-micro-092412-155737.