https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=%C5%A0pela+%C5%A0tor 2026-04-19T15:21:44Z User contributions MediaWiki 1.39.3 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2022/23&diff=22426 2023-05-19T05:17:23Z

<p>Špela Štor: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_tumor_ciljajočih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_dušikov(II)_oksid Priprava tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljeni_ribocim%2C_ki_signale_nativnih_RNA_pove%C5%BEe_z_ortogonalnimi_proteinskimi_izhodnimi_signali Razcepljeni ribocim, ki signale nativnih RNA poveže z ortogonalnimi proteinskimi izhodnimi signali] (Ajda Beltram)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_nadzor_%C5%A1tevila_plazmidov_v_celici_%28Tulip%29 Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)] (Gregor Strniša)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Skupnostna_znanost_je_na%C4%8Drtovala_ribosome_s_koristnimi_fenotipi Skupnostna znanost je načrtovala ribosome s koristnimi fenotipi] (Tanja Gošnjak)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pristop_sintezne_biologije_za_načrtovanje_kandidata_za_cepivo_proti_delta_različici_SARSCoV2_je_razkril_prekinitev_favoriziranega_para_kodonov_kot_boljšo_strategijo_pred_uporabo_redkih_kodonov Pristop sintezne biologije za načrtovanje kandidata za cepivo proti delta različici SARS-CoV-2 je razkril prekinitev favoriziranega para kodonov kot boljšo strategijo pred uporabo redkih kodonov] (Stefanija Ivanova)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Dvosmerni_hibridni_eritritol_–_inducibilni_promotor_za_sintezno_biologijo_v_Yarrowia_lipolytica Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v ''Yarrowia lipolytica''] (Maša Andoljšek)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Utišanje_izražanja_genov_s_strukturo_definirano_zankasto_strukturo_male_nekodirajoče_RNA_s_programiranimi_regulatornimi_aktivnostmi Utišanje izražanja genov s strukturno definirano zankasto strukturo male nekodirajoče RNA s programiranimi regulatornimi aktivnostmi] (Nika Bedrač)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izbolj%C5%A1anje_evolucijske_stabilnosti_obremenjujo%C4%8Dih_in_toksi%C4%8Dnih_funkcij_v_E.coli_z_diferenciacijskim_genetskim_vezjem_posredovanim_z_integrazo Izboljšanje evolucijske stabilnosti obremenjujočih in toksičnih funkcij v E.coli z diferenciacijskim genetskim vezjem posredovanim z integrazo] (Nika Banovšek)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_sintetična_mala_RNA%2C_ki_promovira_prekomerno_izražanje_proteinov_v_brezceličnem_sistemu Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brez-celičnem sistemu] (Ana Godeša) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_kontrolo_hitrosti_rasti_celic%2C_ki_zmanj%C5%A1uje_breme_aktivacije_genov Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov] (Neža Ribnikar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biohibridne_membrane_za_odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_iz_vode Biohibridne membrane za odstranjevanje težkih kovin iz vode] (Tadej Uršič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_CIVT-SELEX_za_izbiro_aptamerov_kot_genskih_delov_za_regulacijo_genetskih_vezij_v_brezceličnem_sistemu Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu] (Klemen Kunej)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_Cyborg_bakterij_preko_intracelularne_hidrogelacije Inženiring Cyborg bakterij preko intracelularne hidrogelacije] (Eva Oven)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezovanje_celi%C4%8Dne_komunikacije_z_optogenetiko:_implementacija_svetlobno_inducibilnega_medceli%C4%8Dnega_sistema_v_kvasovkah Povezovanje celične komunikacije z optogenetiko: implementacija svetlobno inducibilnega medceličnega sistema v kvasovkah] (Nika Perko)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_sinteti%C4%8Dni_biomolekulski_kondenzati_za_nadzor_celi%C4%8Dnih_procesov Programabilni sintetični biomolekulski kondenzati za nadzor celičnih procesov] (Anja Konjc)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljena_%28split%29_aminoacil-tRNA_sintetaza_za_indukcijo_supresije_stop_kodona Razcepljena (split) aminoacil-tRNA sintetaza za indukcijo supresije stop kodona] (Špela Štor)<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NETLANTIS NETLANTIS] (Maša Gabrič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BINANOX BINANOX] (Vivian Nemanič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CoBiota CoBiota] (Petra Sintič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sporadicate Sporadicate] (Gašper Možina)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FISHERLY FISHERLY] (Lucija Pišek)<br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].</div>

Špela Štor https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Razcepljena_(split)_aminoacil-tRNA_sintetaza_za_indukcijo_supresije_stop_kodona&diff=22425 2023-05-19T05:16:11Z

<p>Špela Štor: </p> <hr /> <div>Povzeto po članku: [Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., &amp; Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codon suppression. Proceedings of the National Academy of Sciences, 120(8), e2219758120. https://doi.org/10.1073/pnas.2219758120]<br /> <br /> <br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Razcepljena ortogonalna aminoacil-tRNA sintetaza (o-aaRS) je bila dizajnirana in ustvarjena za kontrolo translacije v bakterijskih (E. coli) in sesalskih celicah (HEK23). Njihova vloga je supresija stop kodonov v prisotnosti majhnih molekul rapamicina in abscisne kisline, kar je omogočeno preko kemično inducirane dimerizacije. V odsotnosti o-aaRS je stop kodon supresija izključena, torej je translacija inhibirana. V članku so uporabili takšno o-aaRS, ki prepozna nekanonične oz. nenaravne aminokisline [2] kot substrat. Če dodamo ncAA in o-aaRS, potem bo aminoacil-tRNA sintetaza vezala ncAA na supresorsko tRNA in to bo omogočilo translacijo tarčnega gena. V članku so uporabili pirolizil-tRNA sintetazo (PylRS) in tirozil-tRNA sintetazo [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Načrtovanje in validacija split tRNA sintetaz ==<br /> <br /> '''Pirolizil-tRNA sintetaza (PylRS)'''<br /> <br /> Za sintezo razcepljene o-aaRS na podlagi PylRS so uporabili PyRS iz arheona ''Ca''. Methanomethylophilus alvus, ki je prepoznala nekanonično aminokislino meta-iodo-L-fenilalanin (mIF) kot substrat. S pomočjo kristalne strukture so določili 7 potencialnih cepitvenih mest, ki so dala N (PylRSN) in C (PylRSC) fragment. Naredili so fuzijo s peptidoma SYNZIP17 (N fragment) in SYNZIP18 (C fragment). Za preverjanje aktivnosti razpolovljene PylRS so fuzijske SYNZIP fragmente soizražali s pirolizin tRNA (tRNAPyl) in zelenim fluorescenčnim proteinom, ki je znotraj odprtega bralnega okvirja vseboval stop kodon TAG na poziciji 2 (sfGFP-2TAG). SfGFP (superfolder GFP [3]) produkcija je pričakovana samo takrat, ko lahko razpolovljena PylRS aminoacilira tRNAPyl z nekanonično aminokislino mIF. SfGFP fluorescenco so merili posledično tako, da so celice gojili v prisotnosti in odsotnosti mIF. Rezultati so pokazali, da je bila produkcija sfGFP v celicah, ki so rastle v prisotnosti mIF drastično večjo od celic, kjer ni bilo dodanih ncAA. To so opazili pri petih od sedmih razpolovljenih variant PylRS – Q23, D112, D137, R137, D195. Najaktivnejši razpolovljeni PylRS varianti sta bili tisti, kjer smo razcepili encim na mestih Q23in D137. Pri variantah Q23 in D137 so ugotovili, da je fluorescenca največja pri celicah, ki izražajo fuzijske proteine iz PylRS in SYNZIP peptidov. Nobene fluorescence niso zaznali, če sta bila oba peptida SYNZIP deletirana. Za potrditev teh rezultatov so naredili naslednji eksperiment v E. coli. Ta je simultano izražala SYNZIP-fuzijske PylRS fragmente skupaj z reporterskim genom CmR-112TAG. Celice so nato rastle na mediju z mIF in različnimi koncentracijami kloramfenikola. Celice, ki so izražale PylRS varianto Q23 so lahko rastle na kloramfenikolu z samo N fragmentom (fuzija s SYNZIP peptidom), medtem ko so celice z varianto D137 rastle samo v prisotnosti obeh fragmentov [1].<br /> <br /> <br /> '''Tirozil-tRNA sintetaza (TyrRS)'''<br /> <br /> Raziskovalci so uporabili tirozil-tRNA iz ''Methanocaldococcus jannaschii'' (MjTyrRS). Določili so 5 potencialnih mest, kjer so lahko cepili encim, da so dobili N (TyrRSN) in C (TyrRSC) terminalni fragment. Naredili so fuzijski protein s SYNZIP17 in SYNZIP18 peptidom. Za ncAA substrat so uporabili para-iodo-L-fenilalaninom (pIF). Aktivnost encima so preverjali s sfGFP, ki je izrazito povečana pri celicah, katerim so dodali pIF. Za normalno delovanje TyrRS so morale celice izražati tako N kot tudi C terminalni fragment. Najaktivnejši varianti MjTyrRS sta bili tisti, ki sta bili cepljeni na mestih K99 in N268. <br /> Za potrditev, da je aktivnost razcepljenega encima odvisna od interakcije peptidov SYNZIP, so merili aktivnost MjTyrRS z in brez fuzije s SYNZIP. Za varianto K99 nista bila ne SYNZIP17 ne SYNZIP18 potrebna za normalno aktivnost. Pri N268 varianti pa je bila sfGFP produkcija opazna samo tam, kjer sta bila tako TyrRSN kot tudi TyrRSC fuzijsko povezana s SYNZIP. To je pomenilo, da je interakcija SYNZIP ključna za vzpostavitev aktivnosti MjTyrRS [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Detekcija terapevtsko relevantnih PPI-jev z razcepljeno PylRS ==<br /> <br /> Cilj je bil detekcija PPI-jev med pomembnimi terapevtskimi tarčami v bakterijah in človeških celicah. Ker MjTyrRS ni ortogonalna v evkariontih, so se osredotočili na razcepljeno PylRS [1].<br /> <br /> '''APOPTOZA'''<br /> <br /> V tem članku so se raziskovalci odločili, da bodo poskusili detektirati interakcije med BH3 domeno proapoptotičnega proteina tBID in antipoptotičnimi proteini Mcl-1 in Bcl-2 (vežeta na tBID in preprečita apoptozo). Klonirali so PylRSN kot fuzijo z Mcl-1 ali Bcl-2 ter PylRSc kot fuzijo z BH3 domeno (tBID) ali z kontrolnim peptidom (Dead BID). Te fuzijske proteine so nato izrazili skupaj z tRNAPyl in sfGFP-2TAG reporterjem. Nato so merili sfGFP fluorescenco z in brez mIF. Rezultati so pokazali, da nastaja sfGFP, če se izražajo fuzijski protein tBID-PylRSC in Mcl-1 ali Bcl-2. Fluorescenco so zaznali samo v primeru, ko so dodali mIF [1].<br /> <br /> '''SARS-COV-2'''<br /> <br /> V članku so želeli detektirati interakcijo med HR1 (heptad repeat 1) in HR2 (heptad repeat 2) motiva spike (S) proteina SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2) virusa. HR1 in HR2 med seboj interagirata in omogočita membransko fuzijo virusa in gostiteljeve membrane. Za detekcijo interakcije HR1 in HR2 s pomočjo PylRS, so v članku dizajnirali 5 helični kompleks (5-HB) sestavljen iz 2 HR2 heliksov in 3 HR1 heliksov z vmesnim linkerjem, ki ima izpostavljeno hidrofobno zanko, kamor se HR2 heliks lahko veže. Ko so se s 5-HB in HR2 spojeni PylRS fragmenti istočasno izrazili in če so dodali tRNAPyl in sfGFP-2TAG, so opazili sfGFP fluorescenco ob prisotnosti mIF. Te niso zaznali, če je manjkal HR2 ali 5-HB del [2]. <br /> <br /> <br /> == Uporaba razpolovljenih aaRS in majhnih molekul kot induktorjev za supresijo stop kodonov ==<br /> <br /> '''Z RAP induciran dimerizacijski sistem'''<br /> <br /> Raziskovalci so N- in C-fragment MjTyrRS spojili s FKBP in FRB proteini, ki so del rapamicin (RAP)-induciranega dimerizacijskega sistema. V tem sistemu receptorja FKBP in FBR tvorita stabilen dimer le v prisotnosti liganda RAP (rapamicina). V celicah E. coli so izrazili sočasno fuzijska proteina TyrRSN-FBR in TyrRSC-FKBP, tRNATyr, sfGFP-2TAG. Nato so spremljali nastanek sfGFP v prisotnosti in odsotnosti RAP in substrata za MjTyrRS pIF. Ko sta bila prisotna tako pIF kot tudi RAP, je bila fluorescenca sfGFP več kot 2x večja kot v celicah, ki smo jim dodali samo RAP oz. samo pIF. Z večanjem koncentracije RAP se je večala fluorescenca [1]. <br /> <br /> '''Z ABA induciran dimerizacijski sistem'''<br /> <br /> ABA oz. abscisna kislina je rastlinski hormon, ki povzroči dimerizacijo ABI in PYL proteinov. Naredili so fuzijski protein ABI in PylRSN ter PYL in PylRSC. Reporter je bil sfGFP-2TAG. Močna produkcija sfGFP je bila v celicah, ki so rastle v mediju z ABA in mIF (substrat PylRS). Tako so sklepali, da lahko ABA učinkovito aktivira PylRS in tako inducira stop kodon supresijo. Sledil je eksperiment v E. coli, kjer so izrazili sočasno ABI- in PYL-PylRS fuzijske proteine, tRNAPyl in CmR-112TAG reporterski gen. Celice so rastle samo tam, kjer je ABA bila dodana. Takšne razpolovljene o-aaRS lahko služijo kot AND vrata, kjer imamo dva inputa (RAP in pIF ali ABA in mIF), da dobimo željen output (read-through čez stop kodon) [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Kontrola genskega izražanja v sesalskih celicah ==<br /> <br /> Najprej so želeli optimizirati aktivnost PylRS v ABA-induciranem sistemu tako, da so optimizirali linkerje med PylRS fragmenti in ABI/PYL proteini. Naredili so 7 fuzijskih proteinov, kjer so bili PylRS fragmenti povezani z ABI in PYL preko fleksibilnega linkerja v obliki G(GSG)nG. N je bil od 0 do 6. Aktivnost PylRS so preverili s sfGFP fluorescenco. Ugotovili so, da je daljši linker omogočil večjo aktivnost PylRS in s tem večjo fluorescenco, vendar pa je z daljšim linkerjem postala PylRS bolj nespecifična, torej do stop kodon supresije je prišlo tudi takrat, ko ni bilo dodanih ncAA. Raziskovalci so na podlagi tega izbrali linker n=4 kot optimizirano varianto [1]. <br /> <br /> Optimizirano varianto so uporabili v HEK293 celicah za predstavitev ABA-inducirane stop kodon supresije. Naredili so fuzijski konstrukt iz PylRSN-ABI in PYL-PylRSC fragmenta, ki so ju povezali s T2A peptidom. Fuzijski gen so izrazili skupaj z tRNAPyl in reporterskim genom (SEAP-41TAG).<br /> HEK291 celice so gojili v mediju s PylRS substratom Nε-boc-L-lizin (BocK) in različnimi koncentracijami ABA. Ugotovili so, da se je SEAP aktivnost povečala za več kot 10x, če so celice gojili v mediju, ki je vseboval tako BocK kot tudi ABA kot pa če so celice gojili v mediju, ki je vseboval eno izmed teh dveh stvari. Če ni bilo ABA ali BocK, je bila SEAP ekspresija podobna intenziteti ozadja. Split PylRS deluje kot AND vrata za sesalske celice, saj imamo dva inputa (ABA in BocK), ki generirata en output (stop kodon supresija) [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Povzetek ==<br /> Split (razcepljene) aminoacil-tRNA sintetaze so orodja, ki omogočajo kontrolo translacije tarčnih genov. Z majhnimi molekulami kot so rapamicin in abscisna kislina lahko učinvkovito induciramo supresijo stop kodonov &quot;in-frame&quot;.<br /> <br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> [1] Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., &amp; Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codon suppression. Proceedings of the National Academy of Sciences, 120(8), e2219758120. https://doi.org/10.1073/pnas.2219758120<br /> <br /> [2] Strack, R. (2020). Noncanonical amino acids on display. Nature Methods 2020 17:5, 17(5), 461–461. https://doi.org/10.1038/s41592-020-0839-3<br /> <br /> [3] Lesne, J., Chang, H. J., de Visch, A., Paloni, M., Barthe, P., Guichou, J. F., Mayonove, P., Barducci, A., Labesse, G., Bonnet, J., &amp;#38; Cohen-Gonsaud, M. (2019). Structural basis for chemically-induced homodimerization of a single domain antibody. Scientific Reports, 9(1). https://doi.org/10.1038/S41598-019-38752-Y</div>

Špela Štor https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Razcepljena_(split)_aminoacil-tRNA_sintetaza_za_indukcijo_supresije_stop_kodona&diff=22424 2023-05-19T05:15:06Z

<p>Špela Štor: </p> <hr /> <div>Povzeto po članku: [Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., &amp; Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codon suppression. Proceedings of the National Academy of Sciences, 120(8), e2219758120. https://doi.org/10.1073/pnas.2219758120]<br /> <br /> <br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Razcepljena ortogonalna aminoacil-tRNA sintetaza (o-aaRS) je bila dizajnirana in ustvarjena za kontrolo translacije v bakterijskih (E. coli) in sesalskih celicah (HEK23). Njihova vloga je supresija stop kodonov v prisotnosti majhnih molekul rapamicina in abscisne kisline, kar je omogočeno preko kemično inducirane dimerizacije. V odsotnosti o-aaRS je stop kodon supresija izključena, torej je translacija inhibirana. V članku so uporabili takšno o-aaRS, ki prepozna nekanonične oz. nenaravne aminokisline [2] kot substrat. Če dodamo ncAA in o-aaRS, potem bo aminoacil-tRNA sintetaza vezala ncAA na supresorsko tRNA in to bo omogočilo translacijo tarčnega gena. V članku so uporabili pirolizil-tRNA sintetazo (PylRS) in tirozil-tRNA sintetazo [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Načrtovanje in validacija split tRNA sintetaz ==<br /> <br /> '''Pirolizil-tRNA sintetaza (PylRS)'''<br /> <br /> Za sintezo razcepljene o-aaRS na podlagi PylRS so uporabili PyRS iz arheona ''''Ca''. Methanomethylophilus alvus'', ki je prepoznala nekanonično aminokislino meta-iodo-L-fenilalanin (mIF) kot substrat. S pomočjo kristalne strukture so določili 7 potencialnih cepitvenih mest, ki so dala N (PylRSN) in C (PylRSC) fragment. Naredili so fuzijo s peptidoma SYNZIP17 (N fragment) in SYNZIP18 (C fragment). Za preverjanje aktivnosti razpolovljene PylRS so fuzijske SYNZIP fragmente soizražali s pirolizin tRNA (tRNAPyl) in zelenim fluorescenčnim proteinom, ki je znotraj odprtega bralnega okvirja vseboval stop kodon TAG na poziciji 2 (sfGFP-2TAG). SfGFP (superfolder GFP [3]) produkcija je pričakovana samo takrat, ko lahko razpolovljena PylRS aminoacilira tRNAPyl z nekanonično aminokislino mIF. SfGFP fluorescenco so merili posledično tako, da so celice gojili v prisotnosti in odsotnosti mIF. Rezultati so pokazali, da je bila produkcija sfGFP v celicah, ki so rastle v prisotnosti mIF drastično večjo od celic, kjer ni bilo dodanih ncAA. To so opazili pri petih od sedmih razpolovljenih variant PylRS – Q23, D112, D137, R137, D195. Najaktivnejši razpolovljeni PylRS varianti sta bili tisti, kjer smo razcepili encim na mestih Q23in D137. Pri variantah Q23 in D137 so ugotovili, da je fluorescenca največja pri celicah, ki izražajo fuzijske proteine iz PylRS in SYNZIP peptidov. Nobene fluorescence niso zaznali, če sta bila oba peptida SYNZIP deletirana. Za potrditev teh rezultatov so naredili naslednji eksperiment v E. coli. Ta je simultano izražala SYNZIP-fuzijske PylRS fragmente skupaj z reporterskim genom CmR-112TAG. Celice so nato rastle na mediju z mIF in različnimi koncentracijami kloramfenikola. Celice, ki so izražale PylRS varianto Q23 so lahko rastle na kloramfenikolu z samo N fragmentom (fuzija s SYNZIP peptidom), medtem ko so celice z varianto D137 rastle samo v prisotnosti obeh fragmentov [1].<br /> <br /> <br /> '''Tirozil-tRNA sintetaza (TyrRS)'''<br /> <br /> Raziskovalci so uporabili tirozil-tRNA iz Methanocaldococcus jannaschii (MjTyrRS). Določili so 5 potencialnih mest, kjer so lahko cepili encim, da so dobili N (TyrRSN) in C (TyrRSC) terminalni fragment. Naredili so fuzijski protein s SYNZIP17 in SYNZIP18 peptidom. Za ncAA substrat so uporabili para-iodo-L-fenilalaninom (pIF). Aktivnost encima so preverjali s sfGFP, ki je izrazito povečana pri celicah, katerim so dodali pIF. Za normalno delovanje TyrRS so morale celice izražati tako N kot tudi C terminalni fragment. Najaktivnejši varianti MjTyrRS sta bili tisti, ki sta bili cepljeni na mestih K99 in N268. <br /> Za potrditev, da je aktivnost razcepljenega encima odvisna od interakcije peptidov SYNZIP, so merili aktivnost MjTyrRS z in brez fuzije s SYNZIP. Za varianto K99 nista bila ne SYNZIP17 ne SYNZIP18 potrebna za normalno aktivnost. Pri N268 varianti pa je bila sfGFP produkcija opazna samo tam, kjer sta bila tako TyrRSN kot tudi TyrRSC fuzijsko povezana s SYNZIP. To je pomenilo, da je interakcija SYNZIP ključna za vzpostavitev aktivnosti MjTyrRS [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Detekcija terapevtsko relevantnih PPI-jev z razcepljeno PylRS ==<br /> <br /> Cilj je bil detekcija PPI-jev med pomembnimi terapevtskimi tarčami v bakterijah in človeških celicah. Ker MjTyrRS ni ortogonalna v evkariontih, so se osredotočili na razcepljeno PylRS [1].<br /> <br /> '''APOPTOZA'''<br /> <br /> V tem članku so se raziskovalci odločili, da bodo poskusili detektirati interakcije med BH3 domeno proapoptotičnega proteina tBID in antipoptotičnimi proteini Mcl-1 in Bcl-2 (vežeta na tBID in preprečita apoptozo). Klonirali so PylRSN kot fuzijo z Mcl-1 ali Bcl-2 ter PylRSc kot fuzijo z BH3 domeno (tBID) ali z kontrolnim peptidom (Dead BID). Te fuzijske proteine so nato izrazili skupaj z tRNAPyl in sfGFP-2TAG reporterjem. Nato so merili sfGFP fluorescenco z in brez mIF. Rezultati so pokazali, da nastaja sfGFP, če se izražajo fuzijski protein tBID-PylRSC in Mcl-1 ali Bcl-2. Fluorescenco so zaznali samo v primeru, ko so dodali mIF [1].<br /> <br /> '''SARS-COV-2'''<br /> <br /> V članku so želeli detektirati interakcijo med HR1 (heptad repeat 1) in HR2 (heptad repeat 2) motiva spike (S) proteina SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2) virusa. HR1 in HR2 med seboj interagirata in omogočita membransko fuzijo virusa in gostiteljeve membrane. Za detekcijo interakcije HR1 in HR2 s pomočjo PylRS, so v članku dizajnirali 5 helični kompleks (5-HB) sestavljen iz 2 HR2 heliksov in 3 HR1 heliksov z vmesnim linkerjem, ki ima izpostavljeno hidrofobno zanko, kamor se HR2 heliks lahko veže. Ko so se s 5-HB in HR2 spojeni PylRS fragmenti istočasno izrazili in če so dodali tRNAPyl in sfGFP-2TAG, so opazili sfGFP fluorescenco ob prisotnosti mIF. Te niso zaznali, če je manjkal HR2 ali 5-HB del [2]. <br /> <br /> <br /> == Uporaba razpolovljenih aaRS in majhnih molekul kot induktorjev za supresijo stop kodonov ==<br /> <br /> '''Z RAP induciran dimerizacijski sistem'''<br /> <br /> Raziskovalci so N- in C-fragment MjTyrRS spojili s FKBP in FRB proteini, ki so del rapamicin (RAP)-induciranega dimerizacijskega sistema. V tem sistemu receptorja FKBP in FBR tvorita stabilen dimer le v prisotnosti liganda RAP (rapamicina). V celicah E. coli so izrazili sočasno fuzijska proteina TyrRSN-FBR in TyrRSC-FKBP, tRNATyr, sfGFP-2TAG. Nato so spremljali nastanek sfGFP v prisotnosti in odsotnosti RAP in substrata za MjTyrRS pIF. Ko sta bila prisotna tako pIF kot tudi RAP, je bila fluorescenca sfGFP več kot 2x večja kot v celicah, ki smo jim dodali samo RAP oz. samo pIF. Z večanjem koncentracije RAP se je večala fluorescenca [1]. <br /> <br /> '''Z ABA induciran dimerizacijski sistem'''<br /> <br /> ABA oz. abscisna kislina je rastlinski hormon, ki povzroči dimerizacijo ABI in PYL proteinov. Naredili so fuzijski protein ABI in PylRSN ter PYL in PylRSC. Reporter je bil sfGFP-2TAG. Močna produkcija sfGFP je bila v celicah, ki so rastle v mediju z ABA in mIF (substrat PylRS). Tako so sklepali, da lahko ABA učinkovito aktivira PylRS in tako inducira stop kodon supresijo. Sledil je eksperiment v E. coli, kjer so izrazili sočasno ABI- in PYL-PylRS fuzijske proteine, tRNAPyl in CmR-112TAG reporterski gen. Celice so rastle samo tam, kjer je ABA bila dodana. Takšne razpolovljene o-aaRS lahko služijo kot AND vrata, kjer imamo dva inputa (RAP in pIF ali ABA in mIF), da dobimo željen output (read-through čez stop kodon) [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Kontrola genskega izražanja v sesalskih celicah ==<br /> <br /> Najprej so želeli optimizirati aktivnost PylRS v ABA-induciranem sistemu tako, da so optimizirali linkerje med PylRS fragmenti in ABI/PYL proteini. Naredili so 7 fuzijskih proteinov, kjer so bili PylRS fragmenti povezani z ABI in PYL preko fleksibilnega linkerja v obliki G(GSG)nG. N je bil od 0 do 6. Aktivnost PylRS so preverili s sfGFP fluorescenco. Ugotovili so, da je daljši linker omogočil večjo aktivnost PylRS in s tem večjo fluorescenco, vendar pa je z daljšim linkerjem postala PylRS bolj nespecifična, torej do stop kodon supresije je prišlo tudi takrat, ko ni bilo dodanih ncAA. Raziskovalci so na podlagi tega izbrali linker n=4 kot optimizirano varianto [1]. <br /> <br /> Optimizirano varianto so uporabili v HEK293 celicah za predstavitev ABA-inducirane stop kodon supresije. Naredili so fuzijski konstrukt iz PylRSN-ABI in PYL-PylRSC fragmenta, ki so ju povezali s T2A peptidom. Fuzijski gen so izrazili skupaj z tRNAPyl in reporterskim genom (SEAP-41TAG).<br /> HEK291 celice so gojili v mediju s PylRS substratom Nε-boc-L-lizin (BocK) in različnimi koncentracijami ABA. Ugotovili so, da se je SEAP aktivnost povečala za več kot 10x, če so celice gojili v mediju, ki je vseboval tako BocK kot tudi ABA kot pa če so celice gojili v mediju, ki je vseboval eno izmed teh dveh stvari. Če ni bilo ABA ali BocK, je bila SEAP ekspresija podobna intenziteti ozadja. Split PylRS deluje kot AND vrata za sesalske celice, saj imamo dva inputa (ABA in BocK), ki generirata en output (stop kodon supresija) [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Povzetek ==<br /> Split (razcepljene) aminoacil-tRNA sintetaze so orodja, ki omogočajo kontrolo translacije tarčnih genov. Z majhnimi molekulami kot so rapamicin in abscisna kislina lahko učinvkovito induciramo supresijo stop kodonov &quot;in-frame&quot;.<br /> <br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> [1] Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., &amp; Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codon suppression. Proceedings of the National Academy of Sciences, 120(8), e2219758120. https://doi.org/10.1073/pnas.2219758120<br /> <br /> [2] Strack, R. (2020). Noncanonical amino acids on display. Nature Methods 2020 17:5, 17(5), 461–461. https://doi.org/10.1038/s41592-020-0839-3<br /> <br /> [3] Lesne, J., Chang, H. J., de Visch, A., Paloni, M., Barthe, P., Guichou, J. F., Mayonove, P., Barducci, A., Labesse, G., Bonnet, J., &amp;#38; Cohen-Gonsaud, M. (2019). Structural basis for chemically-induced homodimerization of a single domain antibody. Scientific Reports, 9(1). https://doi.org/10.1038/S41598-019-38752-Y</div>

Špela Štor https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2022/23&diff=22423 2023-05-19T05:13:24Z

<p>Špela Štor: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_tumor_ciljajočih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_dušikov(II)_oksid Priprava tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljeni_ribocim%2C_ki_signale_nativnih_RNA_pove%C5%BEe_z_ortogonalnimi_proteinskimi_izhodnimi_signali Razcepljeni ribocim, ki signale nativnih RNA poveže z ortogonalnimi proteinskimi izhodnimi signali] (Ajda Beltram)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_nadzor_%C5%A1tevila_plazmidov_v_celici_%28Tulip%29 Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)] (Gregor Strniša)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Skupnostna_znanost_je_na%C4%8Drtovala_ribosome_s_koristnimi_fenotipi Skupnostna znanost je načrtovala ribosome s koristnimi fenotipi] (Tanja Gošnjak)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pristop_sintezne_biologije_za_načrtovanje_kandidata_za_cepivo_proti_delta_različici_SARSCoV2_je_razkril_prekinitev_favoriziranega_para_kodonov_kot_boljšo_strategijo_pred_uporabo_redkih_kodonov Pristop sintezne biologije za načrtovanje kandidata za cepivo proti delta različici SARS-CoV-2 je razkril prekinitev favoriziranega para kodonov kot boljšo strategijo pred uporabo redkih kodonov] (Stefanija Ivanova)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Dvosmerni_hibridni_eritritol_–_inducibilni_promotor_za_sintezno_biologijo_v_Yarrowia_lipolytica Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v ''Yarrowia lipolytica''] (Maša Andoljšek)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Utišanje_izražanja_genov_s_strukturo_definirano_zankasto_strukturo_male_nekodirajoče_RNA_s_programiranimi_regulatornimi_aktivnostmi Utišanje izražanja genov s strukturno definirano zankasto strukturo male nekodirajoče RNA s programiranimi regulatornimi aktivnostmi] (Nika Bedrač)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izbolj%C5%A1anje_evolucijske_stabilnosti_obremenjujo%C4%8Dih_in_toksi%C4%8Dnih_funkcij_v_E.coli_z_diferenciacijskim_genetskim_vezjem_posredovanim_z_integrazo Izboljšanje evolucijske stabilnosti obremenjujočih in toksičnih funkcij v E.coli z diferenciacijskim genetskim vezjem posredovanim z integrazo] (Nika Banovšek)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_sintetična_mala_RNA%2C_ki_promovira_prekomerno_izražanje_proteinov_v_brezceličnem_sistemu Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brez-celičnem sistemu] (Ana Godeša) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_kontrolo_hitrosti_rasti_celic%2C_ki_zmanj%C5%A1uje_breme_aktivacije_genov Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov] (Neža Ribnikar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biohibridne_membrane_za_odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_iz_vode Biohibridne membrane za odstranjevanje težkih kovin iz vode] (Tadej Uršič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_CIVT-SELEX_za_izbiro_aptamerov_kot_genskih_delov_za_regulacijo_genetskih_vezij_v_brezceličnem_sistemu Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu] (Klemen Kunej)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_Cyborg_bakterij_preko_intracelularne_hidrogelacije Inženiring Cyborg bakterij preko intracelularne hidrogelacije] (Eva Oven)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezovanje_celi%C4%8Dne_komunikacije_z_optogenetiko:_implementacija_svetlobno_inducibilnega_medceli%C4%8Dnega_sistema_v_kvasovkah Povezovanje celične komunikacije z optogenetiko: implementacija svetlobno inducibilnega medceličnega sistema v kvasovkah] (Nika Perko)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_sinteti%C4%8Dni_biomolekulski_kondenzati_za_nadzor_celi%C4%8Dnih_procesov Programabilni sintetični biomolekulski kondenzati za nadzor celičnih procesov] (Anja Konjc)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljena_%28split%29_aminoacil-tRNA_sintetaza_za_indukcijo_supresije_izra%C5%BEanje_zaradi_stop_kodona Razcepljena (split) aminoacil-tRNA sintetaza za indukcijo supresije stop kodona] (Špela Štor)<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NETLANTIS NETLANTIS] (Maša Gabrič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BINANOX BINANOX] (Vivian Nemanič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CoBiota CoBiota] (Petra Sintič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sporadicate Sporadicate] (Gašper Možina)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FISHERLY FISHERLY] (Lucija Pišek)<br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].</div>

Špela Štor https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Razcepljena_(split)_aminoacil-tRNA_sintetaza_za_indukcijo_supresije_izra%C5%BEanje_zaradi_stop_kodona&diff=22422 2023-05-19T05:08:57Z

<p>Špela Štor: Razcepljena (split) aminoacil-tRNA sintetaza za indukcijo supresije izražanje zaradi stop kodona moved to Razcepljena (split) aminoacil-tRNA sintetaza za indukcijo supresije stop kodona</p> <hr /> <div>#REDIRECT [[Razcepljena (split) aminoacil-tRNA sintetaza za indukcijo supresije stop kodona]]</div>

Špela Štor https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Razcepljena_(split)_aminoacil-tRNA_sintetaza_za_indukcijo_supresije_stop_kodona&diff=22421 2023-05-19T05:08:57Z

<p>Špela Štor: Razcepljena (split) aminoacil-tRNA sintetaza za indukcijo supresije izražanje zaradi stop kodona moved to Razcepljena (split) aminoacil-tRNA sintetaza za indukcijo supresije stop kodona</p> <hr /> <div>Povzeto po članku: [Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., &amp; Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codon suppression. Proceedings of the National Academy of Sciences, 120(8), e2219758120. https://doi.org/10.1073/pnas.2219758120]<br /> <br /> <br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Razcepljena ortogonalna aminoacil-tRNA sintetaza (o-aaRS) je bila dizajnirana in ustvarjena za kontrolo translacije v bakterijskih (E. coli) in sesalskih celicah (HEK23). Njihova vloga je supresija stop kodonov v prisotnosti majhnih molekul rapamicina in abscisne kisline, kar je omogočeno preko kemično inducirane dimerizacije. V odsotnosti o-aaRS je stop kodon supresija izključena, torej je translacija inhibirana. V članku so uporabili takšno o-aaRS, ki prepozna nekanonične oz. nenaravne aminokisline kot substrat. Če dodamo ncAA in o-aaRS, potem bo aminoacil-tRNA sintetaza vezala ncAA na supresorsko tRNA in to bo omogočilo translacijo tarčnega gena. V članku so uporabili pirolizil-tRNA sintetazo (PylRS) in tirozil-tRNA sintetazo [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Načrtovanje in validacija split tRNA sintetaz ==<br /> <br /> '''Pirolizil-tRNA sintetaza (PylRS)'''<br /> <br /> Za sintezo razcepljene o-aaRS na podlagi PylRS (pirolizil-tRNA sintetaza) so uporabili PyRS iz arheona ''Ca. Methanomethylophilus alvus'', ki je prepoznala nekanonično aminokislino meta-iodo-L-fenilalanin (mIF) kot substrat. S pomočjo kristalne strukture so določili 7 potencialnih cepitvenih mest, ki so dala N (PylRSN) in C (PylRSC) fragment. Naredili so fuzijo s peptidoma SYNZIP17 (N fragment) in SYNZIP18 (C fragment). Za preverjanje aktivnosti razpolovljene PylRS so fuzijske SYNZIP fragmente soizražali s pirolizin tRNA (tRNAPyl) in zelenim fluorescenčnim proteinom, ki je znotraj odprtega bralnega okvirja vseboval stop kodon TAG na poziciji 2 (sfGFP-2TAG). SfGFP produkcija je pričakovana samo takrat, ko lahko razpolovljena PylRS aminoacilira tRNAPyl z nekanonično aminokislino mIF. SfGFP fluorescenco so merili posledično tako, da so celice gojili v prisotnosti in odsotnosti mIF. Rezultati so pokazali, da je bila produkcija sfGFP v celicah, ki so rastle v prisotnosti mIF drastično večjo od celic, kjer ni bilo dodanih ncAA. To so opazili pri petih od sedmih razpolovljenih variant PylRS – Q23, D112, D137, R137, D195. Najaktivnejši razpolovljeni PylRS varianti sta bili tisti, kjer smo razcepili encim na mestih Q23in D137. Pri variantah Q23 in D137 so ugotovili, da je fluorescenca največja pri celicah, ki izražajo fuzijske proteine iz PylRS in SYNZIP peptidov. Nobene fluorescence niso zaznali, če sta bila oba peptida SYNZIP deletirana. Za potrditev teh rezultatov so naredili naslednji eksperiment v E. coli. Ta je simultano izražala SYNZIP-fuzijske PylRS fragmente skupaj z reporterskim genom CmR-112TAG. Celice so nato rastle na mediju z mIF in različnimi koncentracijami kloramfenikola. Celice, ki so izražale PylRS varianto Q23 so lahko rastle na kloramfenikolu z samo N fragmentom (fuzija s SYNZIP peptidom), medtem ko so celice z varianto D137 rastle samo v prisotnosti obeh fragmentov [1].<br /> <br /> <br /> '''Tirozil-tRNA sintetaza (TyrRS)'''<br /> <br /> Raziskovalci so uporabili tirozil-tRNA iz Methanocaldococcus jannaschii (MjTyrRS). Določili so 5 potencialnih mest, kjer so lahko cepili encim, da so dobili N (TyrRSN) in C (TyrRSC) terminalni fragment. Naredili so fuzijski protein s SYNZIP17 in SYNZIP18 peptidom. Za ncAA substrat so uporabili para-iodo-L-fenilalaninom (pIF). Aktivnost encima so preverjali s sfGFP, ki je izrazito povečana pri celicah, katerim so dodali pIF. Za normalno delovanje TyrRS so morale celice izražati tako N kot tudi C terminalni fragment. Najaktivnejši varianti MjTyrRS sta bili tisti, ki sta bili cepljeni na mestih K99 in N268. <br /> Za potrditev, da je aktivnost razcepljenega encima odvisna od interakcije peptidov SYNZIP, so merili aktivnost MjTyrRS z in brez fuzije s SYNZIP. Za varianto K99 nista bila ne SYNZIP17 ne SYNZIP18 potrebna za normalno aktivnost. Pri N268 varianti pa je bila sfGFP produkcija opazna samo tam, kjer sta bila tako TyrRSN kot tudi TyrRSC fuzijsko povezana s SYNZIP. To je pomenilo, da je interakcija SYNZIP ključna za vzpostavitev aktivnosti MjTyrRS [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Detekcija terapevtsko relevantnih PPI-jev z razcepljeno PylRS ==<br /> <br /> Cilj je bil detekcija PPI-jev med pomembnimi terapevtskimi tarčami v bakterijah in človeških celicah. Ker MjTyrRS ni ortogonalna v evkariontih, so se osredotočili na razcepljeno PylRS [1].<br /> <br /> '''APOPTOZA'''<br /> <br /> V tem članku so se raziskovalci odločili, da bodo poskusili detektirati interakcije med BH3 domeno proapoptotičnega proteina tBID in antipoptotičnimi proteini Mcl-1 in Bcl-2 (vežeta na tBID in preprečita apoptozo). Klonirali so PylRSN kot fuzijo z Mcl-1 ali Bcl-2 ter PylRSc kot fuzijo z BH3 domeno (tBID) ali z kontrolnim peptidom (Dead BID). Te fuzijske proteine so nato izrazili skupaj z tRNAPyl in sfGFP-2TAG reporterjem. Nato so merili sfGFP fluorescenco z in brez mIF. Rezultati so pokazali, da nastaja sfGFP, če se izražajo fuzijski protein tBID-PylRSC in Mcl-1 ali Bcl-2. Fluorescenco so zaznali samo v primeru, ko so dodali mIF [1].<br /> <br /> '''SARS-COV-2'''<br /> <br /> V članku so želeli detektirati interakcijo med HR1 (heptad repeat 1) in HR2 (heptad repeat 2) motiva spike (S) proteina SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2) virusa. HR1 in HR2 med seboj interagirata in omogočita membransko fuzijo virusa in gostiteljeve membrane. Za detekcijo interakcije HR1 in HR2 s pomočjo PylRS, so v članku dizajnirali 5 helični kompleks (5-HB) sestavljen iz 2 HR2 heliksov in 3 HR1 heliksov z vmesnim linkerjem, ki ima izpostavljeno hidrofobno zanko, kamor se HR2 heliks lahko veže. Ko so se s 5-HB in HR2 spojeni PylRS fragmenti istočasno izrazili in če so dodali tRNAPyl in sfGFP-2TAG, so opazili sfGFP fluorescenco ob prisotnosti mIF. Te niso zaznali, če je manjkal HR2 ali 5-HB del [2]. <br /> <br /> <br /> == Uporaba razpolovljenih aaRS in majhnih molekul kot induktorjev za supresijo stop kodonov ==<br /> <br /> '''Z RAP induciran dimerizacijski sistem'''<br /> <br /> Raziskovalci so N- in C-fragment MjTyrRS spojili s FKBP in FRB proteini, ki so del rapamicin (RAP)-induciranega dimerizacijskega sistema. V tem sistemu receptorja FKBP in FBR tvorita stabilen dimer le v prisotnosti liganda RAP (rapamicina). V celicah E. coli so izrazili sočasno fuzijska proteina TyrRSN-FBR in TyrRSC-FKBP, tRNATyr, sfGFP-2TAG. Nato so spremljali nastanek sfGFP v prisotnosti in odsotnosti RAP in substrata za MjTyrRS pIF. Ko sta bila prisotna tako pIF kot tudi RAP, je bila fluorescenca sfGFP več kot 2x večja kot v celicah, ki smo jim dodali samo RAP oz. samo pIF. Z večanjem koncentracije RAP se je večala fluorescenca [1]. <br /> <br /> '''Z ABA induciran dimerizacijski sistem'''<br /> <br /> ABA oz. abscisna kislina je rastlinski hormon, ki povzroči dimerizacijo ABI in PYL proteinov. Naredili so fuzijski protein ABI in PylRSN ter PYL in PylRSC. Reporter je bil sfGFP-2TAG. Močna produkcija sfGFP je bila v celicah, ki so rastle v mediju z ABA in mIF (substrat PylRS). Tako so sklepali, da lahko ABA učinkovito aktivira PylRS in tako inducira stop kodon supresijo. Sledil je eksperiment v E. coli, kjer so izrazili sočasno ABI- in PYL-PylRS fuzijske proteine, tRNAPyl in CmR-112TAG reporterski gen. Celice so rastle samo tam, kjer je ABA bila dodana. Takšne razpolovljene o-aaRS lahko služijo kot AND vrata, kjer imamo dva inputa (RAP in pIF ali ABA in mIF), da dobimo željen output (read-through čez stop kodon) [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Kontrola genskega izražanja v sesalskih celicah ==<br /> <br /> Najprej so želeli optimizirati aktivnost PylRS v ABA-induciranem sistemu tako, da so optimizirali linkerje med PylRS fragmenti in ABI/PYL proteini. Naredili so 7 fuzijskih proteinov, kjer so bili PylRS fragmenti povezani z ABI in PYL preko fleksibilnega linkerja v obliki G(GSG)nG. N je bil od 0 do 6. Aktivnost PylRS so preverili s sfGFP fluorescenco. Ugotovili so, da je daljši linker omogočil večjo aktivnost PylRS in s tem večjo fluorescenco, vendar pa je z daljšim linkerjem postala PylRS bolj nespecifična, torej do stop kodon supresije je prišlo tudi takrat, ko ni bilo dodanih ncAA. Raziskovalci so na podlagi tega izbrali linker n=4 kot optimizirano varianto [1]. <br /> <br /> Optimizirano varianto so uporabili v HEK293 celicah za predstavitev ABA-inducirane stop kodon supresije. Naredili so fuzijski konstrukt iz PylRSN-ABI in PYL-PylRSC fragmenta, ki so ju povezali s T2A peptidom. Fuzijski gen so izrazili skupaj z tRNAPyl in reporterskim genom (SEAP-41TAG).<br /> HEK291 celice so gojili v mediju s PylRS substratom Nε-boc-L-lizin (BocK) in različnimi koncentracijami ABA. Ugotovili so, da se je SEAP aktivnost povečala za več kot 10x, če so celice gojili v mediju, ki je vseboval tako BocK kot tudi ABA kot pa če so celice gojili v mediju, ki je vseboval eno izmed teh dveh stvari. Če ni bilo ABA ali BocK, je bila SEAP ekspresija podobna intenziteti ozadja. Split PylRS deluje kot AND vrata za sesalske celice, saj imamo dva inputa (ABA in BocK), ki generirata en output (stop kodon supresija) [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Zaključek ==<br /> Split (razcepljene) aminoacil-tRNA sintetaze so orodja, ki omogočajo kontrolo translacije tarčnih genov. Z majhnimi molekulami kot so rapamicin in abscisna kislina lahko učinvkovito induciramo supresijo stop kodonov &quot;in-frame&quot;.<br /> <br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> [1] Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., &amp; Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codon suppression. Proceedings of the National Academy of Sciences, 120(8), e2219758120. https://doi.org/10.1073/pnas.2219758120</div>

Špela Štor https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2022/23&diff=22409 2023-05-18T18:02:43Z

<p>Špela Štor: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_tumor_ciljajočih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_dušikov(II)_oksid Priprava tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljeni_ribocim%2C_ki_signale_nativnih_RNA_pove%C5%BEe_z_ortogonalnimi_proteinskimi_izhodnimi_signali Razcepljeni ribocim, ki signale nativnih RNA poveže z ortogonalnimi proteinskimi izhodnimi signali] (Ajda Beltram)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_nadzor_%C5%A1tevila_plazmidov_v_celici_%28Tulip%29 Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)] (Gregor Strniša)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Skupnostna_znanost_je_na%C4%8Drtovala_ribosome_s_koristnimi_fenotipi Skupnostna znanost je načrtovala ribosome s koristnimi fenotipi] (Tanja Gošnjak)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pristop_sintezne_biologije_za_načrtovanje_kandidata_za_cepivo_proti_delta_različici_SARSCoV2_je_razkril_prekinitev_favoriziranega_para_kodonov_kot_boljšo_strategijo_pred_uporabo_redkih_kodonov Pristop sintezne biologije za načrtovanje kandidata za cepivo proti delta različici SARS-CoV-2 je razkril prekinitev favoriziranega para kodonov kot boljšo strategijo pred uporabo redkih kodonov] (Stefanija Ivanova)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Dvosmerni_hibridni_eritritol_–_inducibilni_promotor_za_sintezno_biologijo_v_Yarrowia_lipolytica Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v ''Yarrowia lipolytica''] (Maša Andoljšek)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Utišanje_izražanja_genov_s_strukturo_definirano_zankasto_strukturo_male_nekodirajoče_RNA_s_programiranimi_regulatornimi_aktivnostmi Utišanje izražanja genov s strukturno definirano zankasto strukturo male nekodirajoče RNA s programiranimi regulatornimi aktivnostmi] (Nika Bedrač)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izbolj%C5%A1anje_evolucijske_stabilnosti_obremenjujo%C4%8Dih_in_toksi%C4%8Dnih_funkcij_v_E.coli_z_diferenciacijskim_genetskim_vezjem_posredovanim_z_integrazo Izboljšanje evolucijske stabilnosti obremenjujočih in toksičnih funkcij v E.coli z diferenciacijskim genetskim vezjem posredovanim z integrazo] (Nika Banovšek)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_sintetična_mala_RNA%2C_ki_promovira_prekomerno_izražanje_proteinov_v_brezceličnem_sistemu Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brez-celičnem sistemu] (Ana Godeša) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_kontrolo_hitrosti_rasti_celic%2C_ki_zmanj%C5%A1uje_breme_aktivacije_genov Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov] (Neža Ribnikar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biohibridne_membrane_za_odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_iz_vode Biohibridne membrane za odstranjevanje težkih kovin iz vode] (Tadej Uršič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_CIVT-SELEX_za_izbiro_aptamerov_kot_genskih_delov_za_regulacijo_genetskih_vezij_v_brezceličnem_sistemu Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu] (Klemen Kunej)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_Cyborg_bakterij_preko_intracelularne_hidrogelacije Inženiring Cyborg bakterij preko intracelularne hidrogelacije] (Eva Oven)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezovanje_celi%C4%8Dne_komunikacije_z_optogenetiko:_implementacija_svetlobno_inducibilnega_medceli%C4%8Dnega_sistema_v_kvasovkah Povezovanje celične komunikacije z optogenetiko: implementacija svetlobno inducibilnega medceličnega sistema v kvasovkah] (Nika Perko)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_sinteti%C4%8Dni_biomolekulski_kondenzati_za_nadzor_celi%C4%8Dnih_procesov Programabilni sintetični biomolekulski kondenzati za nadzor celičnih procesov] (Anja Konjc)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljena_%28split%29_aminoacil-tRNA_sintetaza_za_indukcijo_supresije_izra%C5%BEanje_zaradi_stop_kodona Razcepljena (split) aminoacil-tRNA sintetaza za indukcijo supresije izražanje zaradi stop kodona] (Špela Štor)<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NETLANTIS NETLANTIS] (Maša Gabrič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BINANOX BINANOX] (Vivian Nemanič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CoBiota CoBiota] (Petra Sintič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sporadicate Sporadicate] (Gašper Možina)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FISHERLY FISHERLY] (Lucija Pišek)<br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].</div>

Špela Štor https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2022/23&diff=22408 2023-05-18T18:01:31Z

<p>Špela Štor: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_tumor_ciljajočih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_dušikov(II)_oksid Priprava tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljeni_ribocim%2C_ki_signale_nativnih_RNA_pove%C5%BEe_z_ortogonalnimi_proteinskimi_izhodnimi_signali Razcepljeni ribocim, ki signale nativnih RNA poveže z ortogonalnimi proteinskimi izhodnimi signali] (Ajda Beltram)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_nadzor_%C5%A1tevila_plazmidov_v_celici_%28Tulip%29 Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)] (Gregor Strniša)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Skupnostna_znanost_je_na%C4%8Drtovala_ribosome_s_koristnimi_fenotipi Skupnostna znanost je načrtovala ribosome s koristnimi fenotipi] (Tanja Gošnjak)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pristop_sintezne_biologije_za_načrtovanje_kandidata_za_cepivo_proti_delta_različici_SARSCoV2_je_razkril_prekinitev_favoriziranega_para_kodonov_kot_boljšo_strategijo_pred_uporabo_redkih_kodonov Pristop sintezne biologije za načrtovanje kandidata za cepivo proti delta različici SARS-CoV-2 je razkril prekinitev favoriziranega para kodonov kot boljšo strategijo pred uporabo redkih kodonov] (Stefanija Ivanova)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Dvosmerni_hibridni_eritritol_–_inducibilni_promotor_za_sintezno_biologijo_v_Yarrowia_lipolytica Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v ''Yarrowia lipolytica''] (Maša Andoljšek)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Utišanje_izražanja_genov_s_strukturo_definirano_zankasto_strukturo_male_nekodirajoče_RNA_s_programiranimi_regulatornimi_aktivnostmi Utišanje izražanja genov s strukturno definirano zankasto strukturo male nekodirajoče RNA s programiranimi regulatornimi aktivnostmi] (Nika Bedrač)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izbolj%C5%A1anje_evolucijske_stabilnosti_obremenjujo%C4%8Dih_in_toksi%C4%8Dnih_funkcij_v_E.coli_z_diferenciacijskim_genetskim_vezjem_posredovanim_z_integrazo Izboljšanje evolucijske stabilnosti obremenjujočih in toksičnih funkcij v E.coli z diferenciacijskim genetskim vezjem posredovanim z integrazo] (Nika Banovšek)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_sintetična_mala_RNA%2C_ki_promovira_prekomerno_izražanje_proteinov_v_brezceličnem_sistemu Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brez-celičnem sistemu] (Ana Godeša) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_kontrolo_hitrosti_rasti_celic%2C_ki_zmanj%C5%A1uje_breme_aktivacije_genov Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov] (Neža Ribnikar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biohibridne_membrane_za_odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_iz_vode Biohibridne membrane za odstranjevanje težkih kovin iz vode] (Tadej Uršič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_CIVT-SELEX_za_izbiro_aptamerov_kot_genskih_delov_za_regulacijo_genetskih_vezij_v_brezceličnem_sistemu Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu] (Klemen Kunej)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_Cyborg_bakterij_preko_intracelularne_hidrogelacije Inženiring Cyborg bakterij preko intracelularne hidrogelacije] (Eva Oven)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezovanje_celi%C4%8Dne_komunikacije_z_optogenetiko:_implementacija_svetlobno_inducibilnega_medceli%C4%8Dnega_sistema_v_kvasovkah Povezovanje celične komunikacije z optogenetiko: implementacija svetlobno inducibilnega medceličnega sistema v kvasovkah] (Nika Perko)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_sinteti%C4%8Dni_biomolekulski_kondenzati_za_nadzor_celi%C4%8Dnih_procesov Programabilni sintetični biomolekulski kondenzati za nadzor celičnih procesov] (Anja Konjc)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljena_%28split%29_aminoacil-tRNA_sintetaza_za_indukcijo_supresije_izra%C5%BEanje_zaradi_stop_kodona] (Špela Štor)<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NETLANTIS NETLANTIS] (Maša Gabrič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BINANOX BINANOX] (Vivian Nemanič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CoBiota CoBiota] (Petra Sintič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sporadicate Sporadicate] (Gašper Možina)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FISHERLY FISHERLY] (Lucija Pišek)<br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].</div>

Špela Štor https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Razcepljena_(split)_aminoacil-tRNA_sintetaza_za_indukcijo_supresije_stop_kodona&diff=22391 2023-05-16T19:26:20Z

<p>Špela Štor: </p> <hr /> <div>Povzeto po članku: [Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., &amp; Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codon suppression. Proceedings of the National Academy of Sciences, 120(8), e2219758120. https://doi.org/10.1073/pnas.2219758120]<br /> <br /> <br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Razcepljena ortogonalna aminoacil-tRNA sintetaza (o-aaRS) je bila dizajnirana in ustvarjena za kontrolo translacije v bakterijskih (E. coli) in sesalskih celicah (HEK23). Njihova vloga je supresija stop kodonov v prisotnosti majhnih molekul rapamicina in abscisne kisline, kar je omogočeno preko kemično inducirane dimerizacije. V odsotnosti o-aaRS je stop kodon supresija izključena, torej je translacija inhibirana. V članku so uporabili takšno o-aaRS, ki prepozna nekanonične oz. nenaravne aminokisline kot substrat. Če dodamo ncAA in o-aaRS, potem bo aminoacil-tRNA sintetaza vezala ncAA na supresorsko tRNA in to bo omogočilo translacijo tarčnega gena. V članku so uporabili pirolizil-tRNA sintetazo (PylRS) in tirozil-tRNA sintetazo [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Načrtovanje in validacija split tRNA sintetaz ==<br /> <br /> '''Pirolizil-tRNA sintetaza (PylRS)'''<br /> <br /> Za sintezo razcepljene o-aaRS na podlagi PylRS (pirolizil-tRNA sintetaza) so uporabili PyRS iz arheona ''Ca. Methanomethylophilus alvus'', ki je prepoznala nekanonično aminokislino meta-iodo-L-fenilalanin (mIF) kot substrat. S pomočjo kristalne strukture so določili 7 potencialnih cepitvenih mest, ki so dala N (PylRSN) in C (PylRSC) fragment. Naredili so fuzijo s peptidoma SYNZIP17 (N fragment) in SYNZIP18 (C fragment). Za preverjanje aktivnosti razpolovljene PylRS so fuzijske SYNZIP fragmente soizražali s pirolizin tRNA (tRNAPyl) in zelenim fluorescenčnim proteinom, ki je znotraj odprtega bralnega okvirja vseboval stop kodon TAG na poziciji 2 (sfGFP-2TAG). SfGFP produkcija je pričakovana samo takrat, ko lahko razpolovljena PylRS aminoacilira tRNAPyl z nekanonično aminokislino mIF. SfGFP fluorescenco so merili posledično tako, da so celice gojili v prisotnosti in odsotnosti mIF. Rezultati so pokazali, da je bila produkcija sfGFP v celicah, ki so rastle v prisotnosti mIF drastično večjo od celic, kjer ni bilo dodanih ncAA. To so opazili pri petih od sedmih razpolovljenih variant PylRS – Q23, D112, D137, R137, D195. Najaktivnejši razpolovljeni PylRS varianti sta bili tisti, kjer smo razcepili encim na mestih Q23in D137. Pri variantah Q23 in D137 so ugotovili, da je fluorescenca največja pri celicah, ki izražajo fuzijske proteine iz PylRS in SYNZIP peptidov. Nobene fluorescence niso zaznali, če sta bila oba peptida SYNZIP deletirana. Za potrditev teh rezultatov so naredili naslednji eksperiment v E. coli. Ta je simultano izražala SYNZIP-fuzijske PylRS fragmente skupaj z reporterskim genom CmR-112TAG. Celice so nato rastle na mediju z mIF in različnimi koncentracijami kloramfenikola. Celice, ki so izražale PylRS varianto Q23 so lahko rastle na kloramfenikolu z samo N fragmentom (fuzija s SYNZIP peptidom), medtem ko so celice z varianto D137 rastle samo v prisotnosti obeh fragmentov [1].<br /> <br /> <br /> '''Tirozil-tRNA sintetaza (TyrRS)'''<br /> <br /> Raziskovalci so uporabili tirozil-tRNA iz Methanocaldococcus jannaschii (MjTyrRS). Določili so 5 potencialnih mest, kjer so lahko cepili encim, da so dobili N (TyrRSN) in C (TyrRSC) terminalni fragment. Naredili so fuzijski protein s SYNZIP17 in SYNZIP18 peptidom. Za ncAA substrat so uporabili para-iodo-L-fenilalaninom (pIF). Aktivnost encima so preverjali s sfGFP, ki je izrazito povečana pri celicah, katerim so dodali pIF. Za normalno delovanje TyrRS so morale celice izražati tako N kot tudi C terminalni fragment. Najaktivnejši varianti MjTyrRS sta bili tisti, ki sta bili cepljeni na mestih K99 in N268. <br /> Za potrditev, da je aktivnost razcepljenega encima odvisna od interakcije peptidov SYNZIP, so merili aktivnost MjTyrRS z in brez fuzije s SYNZIP. Za varianto K99 nista bila ne SYNZIP17 ne SYNZIP18 potrebna za normalno aktivnost. Pri N268 varianti pa je bila sfGFP produkcija opazna samo tam, kjer sta bila tako TyrRSN kot tudi TyrRSC fuzijsko povezana s SYNZIP. To je pomenilo, da je interakcija SYNZIP ključna za vzpostavitev aktivnosti MjTyrRS [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Detekcija terapevtsko relevantnih PPI-jev z razcepljeno PylRS ==<br /> <br /> Cilj je bil detekcija PPI-jev med pomembnimi terapevtskimi tarčami v bakterijah in človeških celicah. Ker MjTyrRS ni ortogonalna v evkariontih, so se osredotočili na razcepljeno PylRS [1].<br /> <br /> '''APOPTOZA'''<br /> <br /> V tem članku so se raziskovalci odločili, da bodo poskusili detektirati interakcije med BH3 domeno proapoptotičnega proteina tBID in antipoptotičnimi proteini Mcl-1 in Bcl-2 (vežeta na tBID in preprečita apoptozo). Klonirali so PylRSN kot fuzijo z Mcl-1 ali Bcl-2 ter PylRSc kot fuzijo z BH3 domeno (tBID) ali z kontrolnim peptidom (Dead BID). Te fuzijske proteine so nato izrazili skupaj z tRNAPyl in sfGFP-2TAG reporterjem. Nato so merili sfGFP fluorescenco z in brez mIF. Rezultati so pokazali, da nastaja sfGFP, če se izražajo fuzijski protein tBID-PylRSC in Mcl-1 ali Bcl-2. Fluorescenco so zaznali samo v primeru, ko so dodali mIF [1].<br /> <br /> '''SARS-COV-2'''<br /> <br /> V članku so želeli detektirati interakcijo med HR1 (heptad repeat 1) in HR2 (heptad repeat 2) motiva spike (S) proteina SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2) virusa. HR1 in HR2 med seboj interagirata in omogočita membransko fuzijo virusa in gostiteljeve membrane. Za detekcijo interakcije HR1 in HR2 s pomočjo PylRS, so v članku dizajnirali 5 helični kompleks (5-HB) sestavljen iz 2 HR2 heliksov in 3 HR1 heliksov z vmesnim linkerjem, ki ima izpostavljeno hidrofobno zanko, kamor se HR2 heliks lahko veže. Ko so se s 5-HB in HR2 spojeni PylRS fragmenti istočasno izrazili in če so dodali tRNAPyl in sfGFP-2TAG, so opazili sfGFP fluorescenco ob prisotnosti mIF. Te niso zaznali, če je manjkal HR2 ali 5-HB del [2]. <br /> <br /> <br /> == Uporaba razpolovljenih aaRS in majhnih molekul kot induktorjev za supresijo stop kodonov ==<br /> <br /> '''Z RAP induciran dimerizacijski sistem'''<br /> <br /> Raziskovalci so N- in C-fragment MjTyrRS spojili s FKBP in FRB proteini, ki so del rapamicin (RAP)-induciranega dimerizacijskega sistema. V tem sistemu receptorja FKBP in FBR tvorita stabilen dimer le v prisotnosti liganda RAP (rapamicina). V celicah E. coli so izrazili sočasno fuzijska proteina TyrRSN-FBR in TyrRSC-FKBP, tRNATyr, sfGFP-2TAG. Nato so spremljali nastanek sfGFP v prisotnosti in odsotnosti RAP in substrata za MjTyrRS pIF. Ko sta bila prisotna tako pIF kot tudi RAP, je bila fluorescenca sfGFP več kot 2x večja kot v celicah, ki smo jim dodali samo RAP oz. samo pIF. Z večanjem koncentracije RAP se je večala fluorescenca [1]. <br /> <br /> '''Z ABA induciran dimerizacijski sistem'''<br /> <br /> ABA oz. abscisna kislina je rastlinski hormon, ki povzroči dimerizacijo ABI in PYL proteinov. Naredili so fuzijski protein ABI in PylRSN ter PYL in PylRSC. Reporter je bil sfGFP-2TAG. Močna produkcija sfGFP je bila v celicah, ki so rastle v mediju z ABA in mIF (substrat PylRS). Tako so sklepali, da lahko ABA učinkovito aktivira PylRS in tako inducira stop kodon supresijo. Sledil je eksperiment v E. coli, kjer so izrazili sočasno ABI- in PYL-PylRS fuzijske proteine, tRNAPyl in CmR-112TAG reporterski gen. Celice so rastle samo tam, kjer je ABA bila dodana. Takšne razpolovljene o-aaRS lahko služijo kot AND vrata, kjer imamo dva inputa (RAP in pIF ali ABA in mIF), da dobimo željen output (read-through čez stop kodon) [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Kontrola genskega izražanja v sesalskih celicah ==<br /> <br /> Najprej so želeli optimizirati aktivnost PylRS v ABA-induciranem sistemu tako, da so optimizirali linkerje med PylRS fragmenti in ABI/PYL proteini. Naredili so 7 fuzijskih proteinov, kjer so bili PylRS fragmenti povezani z ABI in PYL preko fleksibilnega linkerja v obliki G(GSG)nG. N je bil od 0 do 6. Aktivnost PylRS so preverili s sfGFP fluorescenco. Ugotovili so, da je daljši linker omogočil večjo aktivnost PylRS in s tem večjo fluorescenco, vendar pa je z daljšim linkerjem postala PylRS bolj nespecifična, torej do stop kodon supresije je prišlo tudi takrat, ko ni bilo dodanih ncAA. Raziskovalci so na podlagi tega izbrali linker n=4 kot optimizirano varianto [1]. <br /> <br /> Optimizirano varianto so uporabili v HEK293 celicah za predstavitev ABA-inducirane stop kodon supresije. Naredili so fuzijski konstrukt iz PylRSN-ABI in PYL-PylRSC fragmenta, ki so ju povezali s T2A peptidom. Fuzijski gen so izrazili skupaj z tRNAPyl in reporterskim genom (SEAP-41TAG).<br /> HEK291 celice so gojili v mediju s PylRS substratom Nε-boc-L-lizin (BocK) in različnimi koncentracijami ABA. Ugotovili so, da se je SEAP aktivnost povečala za več kot 10x, če so celice gojili v mediju, ki je vseboval tako BocK kot tudi ABA kot pa če so celice gojili v mediju, ki je vseboval eno izmed teh dveh stvari. Če ni bilo ABA ali BocK, je bila SEAP ekspresija podobna intenziteti ozadja. Split PylRS deluje kot AND vrata za sesalske celice, saj imamo dva inputa (ABA in BocK), ki generirata en output (stop kodon supresija) [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Zaključek ==<br /> Split (razcepljene) aminoacil-tRNA sintetaze so orodja, ki omogočajo kontrolo translacije tarčnih genov. Z majhnimi molekulami kot so rapamicin in abscisna kislina lahko učinvkovito induciramo supresijo stop kodonov &quot;in-frame&quot;.<br /> <br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> [1] Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., &amp; Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codon suppression. Proceedings of the National Academy of Sciences, 120(8), e2219758120. https://doi.org/10.1073/pnas.2219758120</div>

Špela Štor https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Razcepljena_(split)_aminoacil-tRNA_sintetaza_za_indukcijo_supresije_stop_kodona&diff=22390 2023-05-16T19:25:42Z

<p>Špela Štor: </p> <hr /> <div>Povzeto po članku: [Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., &amp; Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codon suppression. Proceedings of the National Academy of Sciences, 120(8), e2219758120. https://doi.org/10.1073/pnas.2219758120]<br /> <br /> <br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Razcepljena ortogonalna aminoacil-tRNA sintetaza (o-aaRS) je bila dizajnirana in ustvarjena za kontrolo translacije v bakterijskih (E. coli) in sesalskih celicah (HEK23). Njihova vloga je supresija stop kodonov v prisotnosti majhnih molekul rapamicina in abscisne kisline, kar je omogočeno preko kemično inducirane dimerizacije. V odsotnosti o-aaRS je stop kodon supresija izključena, torej je translacija inhibirana. V članku so uporabili takšno o-aaRS, ki prepozna nekanonične oz. nenaravne aminokisline kot substrat. Če dodamo ncAA in o-aaRS, potem bo aminoacil-tRNA sintetaza vezala ncAA na supresorsko tRNA in to bo omogočilo translacijo tarčnega gena. V članku so uporabili pirolizil-tRNA sintetazo (PylRS) in tirozil-tRNA sintetazo [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Načrtovanje in validacija split tRNA sintetaz ==<br /> <br /> '''Pirolizil-tRNA sintetaza (PylRS)'''<br /> <br /> Za sintezo razcepljene o-aaRS na podlagi PylRS (pirolizil-tRNA sintetaza) so uporabili PyRS iz arheona ''Ca. Methanomethylophilus alvus'', ki je prepoznala nekanonično aminokislino meta-iodo-L-fenilalanin (mIF) kot substrat. S pomočjo kristalne strukture so določili 7 potencialnih cepitvenih mest, ki so dala N (PylRSN) in C (PylRSC) fragment. Naredili so fuzijo s peptidoma SYNZIP17 (N fragment) in SYNZIP18 (C fragment). Za preverjanje aktivnosti razpolovljene PylRS so fuzijske SYNZIP fragmente soizražali s pirolizin tRNA (tRNAPyl) in zelenim fluorescenčnim proteinom, ki je znotraj odprtega bralnega okvirja vseboval stop kodon TAG na poziciji 2 (sfGFP-2TAG). SfGFP produkcija je pričakovana samo takrat, ko lahko razpolovljena PylRS aminoacilira tRNAPyl z nekanonično aminokislino mIF. SfGFP fluorescenco so merili posledično tako, da so celice gojili v prisotnosti in odsotnosti mIF. Rezultati so pokazali, da je bila produkcija sfGFP v celicah, ki so rastle v prisotnosti mIF drastično večjo od celic, kjer ni bilo dodanih ncAA. To so opazili pri petih od sedmih razpolovljenih variant PylRS – Q23, D112, D137, R137, D195. Najaktivnejši razpolovljeni PylRS varianti sta bili tisti, kjer smo razcepili encim na mestih Q23in D137. Pri variantah Q23 in D137 so ugotovili, da je fluorescenca največja pri celicah, ki izražajo fuzijske proteine iz PylRS in SYNZIP peptidov. Nobene fluorescence niso zaznali, če sta bila oba peptida SYNZIP deletirana. Za potrditev teh rezultatov so naredili naslednji eksperiment v E. coli. Ta je simultano izražala SYNZIP-fuzijske PylRS fragmente skupaj z reporterskim genom CmR-112TAG. Celice so nato rastle na mediju z mIF in različnimi koncentracijami kloramfenikola. Celice, ki so izražale PylRS varianto Q23 so lahko rastle na kloramfenikolu z samo N fragmentom (fuzija s SYNZIP peptidom), medtem ko so celice z varianto D137 rastle samo v prisotnosti obeh fragmentov [1].<br /> <br /> <br /> '''Tirozil-tRNA sintetaza (TyrRS)'''<br /> <br /> Raziskovalci so uporabili tirozil-tRNA iz Methanocaldococcus jannaschii (MjTyrRS). Določili so 5 potencialnih mest, kjer so lahko cepili encim, da so dobili N (TyrRSN) in C (TyrRSC) terminalni fragment. Naredili so fuzijski protein s SYNZIP17 in SYNZIP18 peptidom. Za ncAA substrat so uporabili para-iodo-L-fenilalaninom (pIF). Aktivnost encima so preverjali s sfGFP, ki je izrazito povečana pri celicah, katerim so dodali pIF. Za normalno delovanje TyrRS so morale celice izražati tako N kot tudi C terminalni fragment. Najaktivnejši varianti MjTyrRS sta bili tisti, ki sta bili cepljeni na mestih K99 in N268. <br /> Za potrditev, da je aktivnost razcepljenega encima odvisna od interakcije peptidov SYNZIP, so merili aktivnost MjTyrRS z in brez fuzije s SYNZIP. Za varianto K99 nista bila ne SYNZIP17 ne SYNZIP18 potrebna za normalno aktivnost. Pri N268 varianti pa je bila sfGFP produkcija opazna samo tam, kjer sta bila tako TyrRSN kot tudi TyrRSC fuzijsko povezana s SYNZIP. To je pomenilo, da je interakcija SYNZIP ključna za vzpostavitev aktivnosti MjTyrRS [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Detekcija terapevtsko relevantnih PPI-jev z razcepljeno PylRS ==<br /> <br /> Cilj je bil detekcija PPI-jev med pomembnimi terapevtskimi tarčami v bakterijah in človeških celicah. Ker MjTyrRS ni ortogonalna v evkariontih, so se osredotočili na razcepljeno PylRS [1].<br /> <br /> '''APOPTOZA'''<br /> V tem članku so se raziskovalci odločili, da bodo poskusili detektirati interakcije med BH3 domeno proapoptotičnega proteina tBID in antipoptotičnimi proteini Mcl-1 in Bcl-2 (vežeta na tBID in preprečita apoptozo). Klonirali so PylRSN kot fuzijo z Mcl-1 ali Bcl-2 ter PylRSc kot fuzijo z BH3 domeno (tBID) ali z kontrolnim peptidom (Dead BID). Te fuzijske proteine so nato izrazili skupaj z tRNAPyl in sfGFP-2TAG reporterjem. Nato so merili sfGFP fluorescenco z in brez mIF. Rezultati so pokazali, da nastaja sfGFP, če se izražajo fuzijski protein tBID-PylRSC in Mcl-1 ali Bcl-2. Fluorescenco so zaznali samo v primeru, ko so dodali mIF [1].<br /> <br /> '''SARS-COV-2'''<br /> V članku so želeli detektirati interakcijo med HR1 (heptad repeat 1) in HR2 (heptad repeat 2) motiva spike (S) proteina SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2) virusa. HR1 in HR2 med seboj interagirata in omogočita membransko fuzijo virusa in gostiteljeve membrane. Za detekcijo interakcije HR1 in HR2 s pomočjo PylRS, so v članku dizajnirali 5 helični kompleks (5-HB) sestavljen iz 2 HR2 heliksov in 3 HR1 heliksov z vmesnim linkerjem, ki ima izpostavljeno hidrofobno zanko, kamor se HR2 heliks lahko veže. Ko so se s 5-HB in HR2 spojeni PylRS fragmenti istočasno izrazili in če so dodali tRNAPyl in sfGFP-2TAG, so opazili sfGFP fluorescenco ob prisotnosti mIF. Te niso zaznali, če je manjkal HR2 ali 5-HB del [2]. <br /> <br /> <br /> == Uporaba razpolovljenih aaRS in majhnih molekul kot induktorjev za supresijo stop kodonov ==<br /> <br /> '''Z RAP induciran dimerizacijski sistem'''<br /> Raziskovalci so N- in C-fragment MjTyrRS spojili s FKBP in FRB proteini, ki so del rapamicin (RAP)-induciranega dimerizacijskega sistema. V tem sistemu receptorja FKBP in FBR tvorita stabilen dimer le v prisotnosti liganda RAP (rapamicina). V celicah E. coli so izrazili sočasno fuzijska proteina TyrRSN-FBR in TyrRSC-FKBP, tRNATyr, sfGFP-2TAG. Nato so spremljali nastanek sfGFP v prisotnosti in odsotnosti RAP in substrata za MjTyrRS pIF. Ko sta bila prisotna tako pIF kot tudi RAP, je bila fluorescenca sfGFP več kot 2x večja kot v celicah, ki smo jim dodali samo RAP oz. samo pIF. Z večanjem koncentracije RAP se je večala fluorescenca [1]. <br /> <br /> '''Z ABA induciran dimerizacijski sistem'''<br /> ABA oz. abscisna kislina je rastlinski hormon, ki povzroči dimerizacijo ABI in PYL proteinov. Naredili so fuzijski protein ABI in PylRSN ter PYL in PylRSC. Reporter je bil sfGFP-2TAG. Močna produkcija sfGFP je bila v celicah, ki so rastle v mediju z ABA in mIF (substrat PylRS). Tako so sklepali, da lahko ABA učinkovito aktivira PylRS in tako inducira stop kodon supresijo. Sledil je eksperiment v E. coli, kjer so izrazili sočasno ABI- in PYL-PylRS fuzijske proteine, tRNAPyl in CmR-112TAG reporterski gen. Celice so rastle samo tam, kjer je ABA bila dodana. Takšne razpolovljene o-aaRS lahko služijo kot AND vrata, kjer imamo dva inputa (RAP in pIF ali ABA in mIF), da dobimo željen output (read-through čez stop kodon) [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Kontrola genskega izražanja v sesalskih celicah ==<br /> <br /> Najprej so želeli optimizirati aktivnost PylRS v ABA-induciranem sistemu tako, da so optimizirali linkerje med PylRS fragmenti in ABI/PYL proteini. Naredili so 7 fuzijskih proteinov, kjer so bili PylRS fragmenti povezani z ABI in PYL preko fleksibilnega linkerja v obliki G(GSG)nG. N je bil od 0 do 6. Aktivnost PylRS so preverili s sfGFP fluorescenco. Ugotovili so, da je daljši linker omogočil večjo aktivnost PylRS in s tem večjo fluorescenco, vendar pa je z daljšim linkerjem postala PylRS bolj nespecifična, torej do stop kodon supresije je prišlo tudi takrat, ko ni bilo dodanih ncAA. Raziskovalci so na podlagi tega izbrali linker n=4 kot optimizirano varianto [1]. <br /> <br /> Optimizirano varianto so uporabili v HEK293 celicah za predstavitev ABA-inducirane stop kodon supresije. Naredili so fuzijski konstrukt iz PylRSN-ABI in PYL-PylRSC fragmenta, ki so ju povezali s T2A peptidom. Fuzijski gen so izrazili skupaj z tRNAPyl in reporterskim genom (SEAP-41TAG).<br /> HEK291 celice so gojili v mediju s PylRS substratom Nε-boc-L-lizin (BocK) in različnimi koncentracijami ABA. Ugotovili so, da se je SEAP aktivnost povečala za več kot 10x, če so celice gojili v mediju, ki je vseboval tako BocK kot tudi ABA kot pa če so celice gojili v mediju, ki je vseboval eno izmed teh dveh stvari. Če ni bilo ABA ali BocK, je bila SEAP ekspresija podobna intenziteti ozadja. Split PylRS deluje kot AND vrata za sesalske celice, saj imamo dva inputa (ABA in BocK), ki generirata en output (stop kodon supresija) [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Zaključek ==<br /> Split (razcepljene) aminoacil-tRNA sintetaze so orodja, ki omogočajo kontrolo translacije tarčnih genov. Z majhnimi molekulami kot so rapamicin in abscisna kislina lahko učinvkovito induciramo supresijo stop kodonov &quot;in-frame&quot;.<br /> <br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> [1] Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., &amp; Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codon suppression. Proceedings of the National Academy of Sciences, 120(8), e2219758120. https://doi.org/10.1073/pnas.2219758120</div>

Špela Štor https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Razcepljena_(split)_aminoacil-tRNA_sintetaza_za_indukcijo_supresije_stop_kodona&diff=22389 2023-05-16T19:25:14Z

<p>Špela Štor: </p> <hr /> <div>Povzeto po članku: [Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., &amp; Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codon suppression. Proceedings of the National Academy of Sciences, 120(8), e2219758120. https://doi.org/10.1073/pnas.2219758120]<br /> <br /> <br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Razcepljena ortogonalna aminoacil-tRNA sintetaza (o-aaRS) je bila dizajnirana in ustvarjena za kontrolo translacije v bakterijskih (E. coli) in sesalskih celicah (HEK23). Njihova vloga je supresija stop kodonov v prisotnosti majhnih molekul rapamicina in abscisne kisline, kar je omogočeno preko kemično inducirane dimerizacije. V odsotnosti o-aaRS je stop kodon supresija izključena, torej je translacija inhibirana. V članku so uporabili takšno o-aaRS, ki prepozna nekanonične oz. nenaravne aminokisline kot substrat. Če dodamo ncAA in o-aaRS, potem bo aminoacil-tRNA sintetaza vezala ncAA na supresorsko tRNA in to bo omogočilo translacijo tarčnega gena. V članku so uporabili pirolizil-tRNA sintetazo (PylRS) in tirozil-tRNA sintetazo [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Načrtovanje in validacija split tRNA sintetaz ==<br /> <br /> '''Pirolizil-tRNA sintetaza (PylRS)'''<br /> <br /> Za sintezo razcepljene o-aaRS na podlagi PylRS (pirolizil-tRNA sintetaza) so uporabili PyRS iz arheona ''Ca. Methanomethylophilus alvus'', ki je prepoznala nekanonično aminokislino meta-iodo-L-fenilalanin (mIF) kot substrat. S pomočjo kristalne strukture so določili 7 potencialnih cepitvenih mest, ki so dala N (PylRSN) in C (PylRSC) fragment. Naredili so fuzijo s peptidoma SYNZIP17 (N fragment) in SYNZIP18 (C fragment). Za preverjanje aktivnosti razpolovljene PylRS so fuzijske SYNZIP fragmente soizražali s pirolizin tRNA (tRNAPyl) in zelenim fluorescenčnim proteinom, ki je znotraj odprtega bralnega okvirja vseboval stop kodon TAG na poziciji 2 (sfGFP-2TAG). SfGFP produkcija je pričakovana samo takrat, ko lahko razpolovljena PylRS aminoacilira tRNAPyl z nekanonično aminokislino mIF. SfGFP fluorescenco so merili posledično tako, da so celice gojili v prisotnosti in odsotnosti mIF. Rezultati so pokazali, da je bila produkcija sfGFP v celicah, ki so rastle v prisotnosti mIF drastično večjo od celic, kjer ni bilo dodanih ncAA. To so opazili pri petih od sedmih razpolovljenih variant PylRS – Q23, D112, D137, R137, D195. Najaktivnejši razpolovljeni PylRS varianti sta bili tisti, kjer smo razcepili encim na mestih Q23in D137. Pri variantah Q23 in D137 so ugotovili, da je fluorescenca največja pri celicah, ki izražajo fuzijske proteine iz PylRS in SYNZIP peptidov. Nobene fluorescence niso zaznali, če sta bila oba peptida SYNZIP deletirana. Za potrditev teh rezultatov so naredili naslednji eksperiment v E. coli. Ta je simultano izražala SYNZIP-fuzijske PylRS fragmente skupaj z reporterskim genom CmR-112TAG. Celice so nato rastle na mediju z mIF in različnimi koncentracijami kloramfenikola. Celice, ki so izražale PylRS varianto Q23 so lahko rastle na kloramfenikolu z samo N fragmentom (fuzija s SYNZIP peptidom), medtem ko so celice z varianto D137 rastle samo v prisotnosti obeh fragmentov [1].<br /> <br /> <br /> '''Tirozil-tRNA sintetaza (TyrRS)'''<br /> <br /> Raziskovalci so uporabili tirozil-tRNA iz Methanocaldococcus jannaschii (MjTyrRS). Določili so 5 potencialnih mest, kjer so lahko cepili encim, da so dobili N (TyrRSN) in C (TyrRSC) terminalni fragment. Naredili so fuzijski protein s SYNZIP17 in SYNZIP18 peptidom. Za ncAA substrat so uporabili para-iodo-L-fenilalaninom (pIF). Aktivnost encima so preverjali s sfGFP, ki je izrazito povečana pri celicah, katerim so dodali pIF. Za normalno delovanje TyrRS so morale celice izražati tako N kot tudi C terminalni fragment. Najaktivnejši varianti MjTyrRS sta bili tisti, ki sta bili cepljeni na mestih K99 in N268. <br /> Za potrditev, da je aktivnost razcepljenega encima odvisna od interakcije peptidov SYNZIP, so merili aktivnost MjTyrRS z in brez fuzije s SYNZIP. Za varianto K99 nista bila ne SYNZIP17 ne SYNZIP18 potrebna za normalno aktivnost. Pri N268 varianti pa je bila sfGFP produkcija opazna samo tam, kjer sta bila tako TyrRSN kot tudi TyrRSC fuzijsko povezana s SYNZIP. To je pomenilo, da je interakcija SYNZIP ključna za vzpostavitev aktivnosti MjTyrRS [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Detekcija terapevtsko relevantnih PPI-jev z razcepljeno PylRS ==<br /> <br /> Cilj je bil detekcija PPI-jev med pomembnimi terapevtskimi tarčami v bakterijah in človeških celicah. Ker MjTyrRS ni ortogonalna v evkariontih, so se osredotočili na razcepljeno PylRS [1].<br /> <br /> '''APOPTOZA'''<br /> V tem članku so se raziskovalci odločili, da bodo poskusili detektirati interakcije med BH3 domeno proapoptotičnega proteina tBID in antipoptotičnimi proteini Mcl-1 in Bcl-2 (vežeta na tBID in preprečita apoptozo). Klonirali so PylRSN kot fuzijo z Mcl-1 ali Bcl-2 ter PylRSc kot fuzijo z BH3 domeno (tBID) ali z kontrolnim peptidom (Dead BID). Te fuzijske proteine so nato izrazili skupaj z tRNAPyl in sfGFP-2TAG reporterjem. Nato so merili sfGFP fluorescenco z in brez mIF. Rezultati so pokazali, da nastaja sfGFP, če se izražajo fuzijski protein tBID-PylRSC in Mcl-1 ali Bcl-2. Fluorescenco so zaznali samo v primeru, ko so dodali mIF [1].<br /> <br /> '''SARS-COV-2'''<br /> V članku so želeli detektirati interakcijo med HR1 (heptad repeat 1) in HR2 (heptad repeat 2) motiva spike (S) proteina SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2) virusa. HR1 in HR2 med seboj interagirata in omogočita membransko fuzijo virusa in gostiteljeve membrane. Za detekcijo interakcije HR1 in HR2 s pomočjo PylRS, so v članku dizajnirali 5 helični kompleks (5-HB) sestavljen iz 2 HR2 heliksov in 3 HR1 heliksov z vmesnim linkerjem, ki ima izpostavljeno hidrofobno zanko, kamor se HR2 heliks lahko veže. Ko so se s 5-HB in HR2 spojeni PylRS fragmenti istočasno izrazili in če so dodali tRNAPyl in sfGFP-2TAG, so opazili sfGFP fluorescenco ob prisotnosti mIF. Te niso zaznali, če je manjkal HR2 ali 5-HB del [2]. <br /> <br /> <br /> == Uporaba razpolovljenih aaRS in majhnih molekul kot induktorjev za supresijo stop kodonov ==<br /> <br /> '''Z RAP induciran dimerizacijski sistem'''<br /> Raziskovalci so N- in C-fragment MjTyrRS spojili s FKBP in FRB proteini, ki so del rapamicin (RAP)-induciranega dimerizacijskega sistema. V tem sistemu receptorja FKBP in FBR tvorita stabilen dimer le v prisotnosti liganda RAP (rapamicina). V celicah E. coli so izrazili sočasno fuzijska proteina TyrRSN-FBR in TyrRSC-FKBP, tRNATyr, sfGFP-2TAG. Nato so spremljali nastanek sfGFP v prisotnosti in odsotnosti RAP in substrata za MjTyrRS pIF. Ko sta bila prisotna tako pIF kot tudi RAP, je bila fluorescenca sfGFP več kot 2x večja kot v celicah, ki smo jim dodali samo RAP oz. samo pIF. Z večanjem koncentracije RAP se je večala fluorescenca [1]. <br /> <br /> '''Z ABA induciran dimerizacijski sistem'''<br /> ABA oz. abscisna kislina je rastlinski hormon, ki povzroči dimerizacijo ABI in PYL proteinov. Naredili so fuzijski protein ABI in PylRSN ter PYL in PylRSC. Reporter je bil sfGFP-2TAG. Močna produkcija sfGFP je bila v celicah, ki so rastle v mediju z ABA in mIF (substrat PylRS). Tako so sklepali, da lahko ABA učinkovito aktivira PylRS in tako inducira stop kodon supresijo. Sledil je eksperiment v E. coli, kjer so izrazili sočasno ABI- in PYL-PylRS fuzijske proteine, tRNAPyl in CmR-112TAG reporterski gen. Celice so rastle samo tam, kjer je ABA bila dodana. Takšne razpolovljene o-aaRS lahko služijo kot AND vrata, kjer imamo dva inputa (RAP in pIF ali ABA in mIF), da dobimo željen output (read-through čez stop kodon) [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Kontrola genskega izražanja v sesalskih celicah ==<br /> <br /> Najprej so želeli optimizirati aktivnost PylRS v ABA-induciranem sistemu tako, da so optimizirali linkerje med PylRS fragmenti in ABI/PYL proteini. Naredili so 7 fuzijskih proteinov, kjer so bili PylRS fragmenti povezani z ABI in PYL preko fleksibilnega linkerja v obliki G(GSG)nG. N je bil od 0 do 6. Aktivnost PylRS so preverili s sfGFP fluorescenco. Ugotovili so, da je daljši linker omogočil večjo aktivnost PylRS in s tem večjo fluorescenco, vendar pa je z daljšim linkerjem postala PylRS bolj nespecifična, torej do stop kodon supresije je prišlo tudi takrat, ko ni bilo dodanih ncAA. Raziskovalci so na podlagi tega izbrali linker n=4 kot optimizirano varianto [1]. <br /> <br /> Optimizirano varianto so uporabili v HEK293 celicah za predstavitev ABA-inducirane stop kodon supresije. Naredili so fuzijski konstrukt iz PylRSN-ABI in PYL-PylRSC fragmenta, ki so ju povezali s T2A peptidom. Fuzijski gen so izrazili skupaj z tRNAPyl in reporterskim genom (SEAP-41TAG).<br /> HEK291 celice so gojili v mediju s PylRS substratom Nε-boc-L-lizin (BocK) in različnimi koncentracijami ABA. Ugotovili so, da se je SEAP aktivnost povečala za več kot 10x, če so celice gojili v mediju, ki je vseboval tako BocK kot tudi ABA kot pa če so celice gojili v mediju, ki je vseboval eno izmed teh dveh stvari. Če ni bilo ABA ali BocK, je bila SEAP ekspresija podobna intenziteti ozadja. Split PylRS deluje kot AND vrata za sesalske celice, saj imamo dva inputa (ABA in BocK), ki generirata en output (stop kodon supresija) [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Povzetek ==<br /> Split (razcepljene) aminoacil-tRNA sintetaze so orodja, ki omogočajo kontrolo translacije tarčnih genov. Z majhnimi molekulami kot so rapamicin in abscisna kislina lahko učinvkovito induciramo supresijo stop kodonov &quot;in-frame&quot;.<br /> <br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> [1] Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., &amp; Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codon suppression. Proceedings of the National Academy of Sciences, 120(8), e2219758120. https://doi.org/10.1073/pnas.2219758120</div>

Špela Štor https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Razcepljena_(split)_aminoacil-tRNA_sintetaza_za_indukcijo_supresije_stop_kodona&diff=22388 2023-05-16T19:22:57Z

<p>Špela Štor: </p> <hr /> <div>Povzeto po članku: [Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., &amp; Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codon suppression. Proceedings of the National Academy of Sciences, 120(8), e2219758120. https://doi.org/10.1073/pnas.2219758120]<br /> <br /> <br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Razcepljena ortogonalna aminoacil-tRNA sintetaza (o-aaRS) je bila dizajnirana in ustvarjena za kontrolo translacije v bakterijskih (E. coli) in sesalskih celicah (HEK23). Njihova vloga je supresija stop kodonov v prisotnosti majhnih molekul rapamicina in abscisne kisline, kar je omogočeno preko kemično inducirane dimerizacije. V odsotnosti o-aaRS je stop kodon supresija izključena, torej je translacija inhibirana. V članku so uporabili takšno o-aaRS, ki prepozna nekanonične oz. nenaravne aminokisline kot substrat. Če dodamo ncAA in o-aaRS, potem bo aminoacil-tRNA sintetaza vezala ncAA na supresorsko tRNA in to bo omogočilo translacijo tarčnega gena. V članku so uporabili pirolizil-tRNA sintetazo (PylRS) in tirozil-tRNA sintetazo [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Načrtovanje in validacija razpolovljene PylRS ==<br /> <br /> Za sintezo razcepljene o-aaRS na podlagi PylRS (pirolizil-tRNA sintetaza) so uporabili PyRS iz arheona ''Ca. Methanomethylophilus alvus'', ki je prepoznala nekanonično aminokislino meta-iodo-L-fenilalanin (mIF) kot substrat. S pomočjo kristalne strukture so določili 7 potencialnih cepitvenih mest, ki so dala N (PylRSN) in C (PylRSC) fragment. Naredili so fuzijo s peptidoma SYNZIP17 (N fragment) in SYNZIP18 (C fragment). Za preverjanje aktivnosti razpolovljene PylRS so fuzijske SYNZIP fragmente soizražali s pirolizin tRNA (tRNAPyl) in zelenim fluorescenčnim proteinom, ki je znotraj odprtega bralnega okvirja vseboval stop kodon TAG na poziciji 2 (sfGFP-2TAG). SfGFP produkcija je pričakovana samo takrat, ko lahko razpolovljena PylRS aminoacilira tRNAPyl z nekanonično aminokislino mIF. SfGFP fluorescenco so merili posledično tako, da so celice gojili v prisotnosti in odsotnosti mIF. Rezultati so pokazali, da je bila produkcija sfGFP v celicah, ki so rastle v prisotnosti mIF drastično večjo od celic, kjer ni bilo dodanih ncAA. To so opazili pri petih od sedmih razpolovljenih variant PylRS – Q23, D112, D137, R137, D195. Najaktivnejši razpolovljeni PylRS varianti sta bili tisti, kjer smo razcepili encim na mestih Q23in D137. Pri variantah Q23 in D137 so ugotovili, da je fluorescenca največja pri celicah, ki izražajo fuzijske proteine iz PylRS in SYNZIP peptidov. Nobene fluorescence niso zaznali, če sta bila oba peptida SYNZIP deletirana. Za potrditev teh rezultatov so naredili naslednji eksperiment v E. coli. Ta je simultano izražala SYNZIP-fuzijske PylRS fragmente skupaj z reporterskim genom CmR-112TAG. Celice so nato rastle na mediju z mIF in različnimi koncentracijami kloramfenikola. Celice, ki so izražale PylRS varianto Q23 so lahko rastle na kloramfenikolu z samo N fragmentom (fuzija s SYNZIP peptidom), medtem ko so celice z varianto D137 rastle samo v prisotnosti obeh fragmentov [1].<br /> <br /> <br /> <br /> == Načrtovanje in validacija razcepljene tirozil-tRNA sintetaze ==<br /> <br /> Raziskovalci so uporabili tirozil-tRNA iz Methanocaldococcus jannaschii (MjTyrRS). Določili so 5 potencialnih mest, kjer so lahko cepili encim, da so dobili N (TyrRSN) in C (TyrRSC) terminalni fragment. Naredili so fuzijski protein s SYNZIP17 in SYNZIP18 peptidom. Za ncAA substrat so uporabili para-iodo-L-fenilalaninom (pIF). Aktivnost encima so preverjali s sfGFP, ki je izrazito povečana pri celicah, katerim so dodali pIF. Za normalno delovanje TyrRS so morale celice izražati tako N kot tudi C terminalni fragment. Najaktivnejši varianti MjTyrRS sta bili tisti, ki sta bili cepljeni na mestih K99 in N268. <br /> Za potrditev, da je aktivnost razcepljenega encima odvisna od interakcije peptidov SYNZIP, so merili aktivnost MjTyrRS z in brez fuzije s SYNZIP. Za varianto K99 nista bila ne SYNZIP17 ne SYNZIP18 potrebna za normalno aktivnost. Pri N268 varianti pa je bila sfGFP produkcija opazna samo tam, kjer sta bila tako TyrRSN kot tudi TyrRSC fuzijsko povezana s SYNZIP. To je pomenilo, da je interakcija SYNZIP ključna za vzpostavitev aktivnosti MjTyrRS [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Detekcija terapevtsko relevantnih PPI-jev z razcepljeno PylRS ==<br /> <br /> Cilj je bil detekcija PPI-jev med pomembnimi terapevtskimi tarčami v bakterijah in človeških celicah. Ker MjTyrRS ni ortogonalna v evkariontih, so se osredotočili na razcepljeno PylRS [1].<br /> <br /> '''APOPTOZA'''<br /> V tem članku so se raziskovalci odločili, da bodo poskusili detektirati interakcije med BH3 domeno proapoptotičnega proteina tBID in antipoptotičnimi proteini Mcl-1 in Bcl-2 (vežeta na tBID in preprečita apoptozo). Klonirali so PylRSN kot fuzijo z Mcl-1 ali Bcl-2 ter PylRSc kot fuzijo z BH3 domeno (tBID) ali z kontrolnim peptidom (Dead BID). Te fuzijske proteine so nato izrazili skupaj z tRNAPyl in sfGFP-2TAG reporterjem. Nato so merili sfGFP fluorescenco z in brez mIF. Rezultati so pokazali, da nastaja sfGFP, če se izražajo fuzijski protein tBID-PylRSC in Mcl-1 ali Bcl-2. Fluorescenco so zaznali samo v primeru, ko so dodali mIF [1].<br /> <br /> '''SARS-COV-2'''<br /> V članku so želeli detektirati interakcijo med HR1 (heptad repeat 1) in HR2 (heptad repeat 2) motiva spike (S) proteina SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2) virusa. HR1 in HR2 med seboj interagirata in omogočita membransko fuzijo virusa in gostiteljeve membrane. Za detekcijo interakcije HR1 in HR2 s pomočjo PylRS, so v članku dizajnirali 5 helični kompleks (5-HB) sestavljen iz 2 HR2 heliksov in 3 HR1 heliksov z vmesnim linkerjem, ki ima izpostavljeno hidrofobno zanko, kamor se HR2 heliks lahko veže. Ko so se s 5-HB in HR2 spojeni PylRS fragmenti istočasno izrazili in če so dodali tRNAPyl in sfGFP-2TAG, so opazili sfGFP fluorescenco ob prisotnosti mIF. Te niso zaznali, če je manjkal HR2 ali 5-HB del [2]. <br /> <br /> <br /> == Uporaba razpolovljenih aaRS in majhnih molekul kot induktorjev za supresijo stop kodonov ==<br /> <br /> '''Z RAP induciran dimerizacijski sistem'''<br /> Raziskovalci so N- in C-fragment MjTyrRS spojili s FKBP in FRB proteini, ki so del rapamicin (RAP)-induciranega dimerizacijskega sistema. V tem sistemu receptorja FKBP in FBR tvorita stabilen dimer le v prisotnosti liganda RAP (rapamicina). V celicah E. coli so izrazili sočasno fuzijska proteina TyrRSN-FBR in TyrRSC-FKBP, tRNATyr, sfGFP-2TAG. Nato so spremljali nastanek sfGFP v prisotnosti in odsotnosti RAP in substrata za MjTyrRS pIF. Ko sta bila prisotna tako pIF kot tudi RAP, je bila fluorescenca sfGFP več kot 2x večja kot v celicah, ki smo jim dodali samo RAP oz. samo pIF. Z večanjem koncentracije RAP se je večala fluorescenca [1]. <br /> <br /> '''Z ABA induciran dimerizacijski sistem'''<br /> ABA oz. abscisna kislina je rastlinski hormon, ki povzroči dimerizacijo ABI in PYL proteinov. Naredili so fuzijski protein ABI in PylRSN ter PYL in PylRSC. Reporter je bil sfGFP-2TAG. Močna produkcija sfGFP je bila v celicah, ki so rastle v mediju z ABA in mIF (substrat PylRS). Tako so sklepali, da lahko ABA učinkovito aktivira PylRS in tako inducira stop kodon supresijo. Sledil je eksperiment v E. coli, kjer so izrazili sočasno ABI- in PYL-PylRS fuzijske proteine, tRNAPyl in CmR-112TAG reporterski gen. Celice so rastle samo tam, kjer je ABA bila dodana. Takšne razpolovljene o-aaRS lahko služijo kot AND vrata, kjer imamo dva inputa (RAP in pIF ali ABA in mIF), da dobimo željen output (read-through čez stop kodon) [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Kontrola genskega izražanja v sesalskih celicah ==<br /> <br /> Najprej so želeli optimizirati aktivnost PylRS v ABA-induciranem sistemu tako, da so optimizirali linkerje med PylRS fragmenti in ABI/PYL proteini. Naredili so 7 fuzijskih proteinov, kjer so bili PylRS fragmenti povezani z ABI in PYL preko fleksibilnega linkerja v obliki G(GSG)nG. N je bil od 0 do 6. Aktivnost PylRS so preverili s sfGFP fluorescenco. Ugotovili so, da je daljši linker omogočil večjo aktivnost PylRS in s tem večjo fluorescenco, vendar pa je z daljšim linkerjem postala PylRS bolj nespecifična, torej do stop kodon supresije je prišlo tudi takrat, ko ni bilo dodanih ncAA. Raziskovalci so na podlagi tega izbrali linker n=4 kot optimizirano varianto [1]. <br /> <br /> Optimizirano varianto so uporabili v HEK293 celicah za predstavitev ABA-inducirane stop kodon supresije. Naredili so fuzijski konstrukt iz PylRSN-ABI in PYL-PylRSC fragmenta, ki so ju povezali s T2A peptidom. Fuzijski gen so izrazili skupaj z tRNAPyl in reporterskim genom (SEAP-41TAG).<br /> HEK291 celice so gojili v mediju s PylRS substratom Nε-boc-L-lizin (BocK) in različnimi koncentracijami ABA. Ugotovili so, da se je SEAP aktivnost povečala za več kot 10x, če so celice gojili v mediju, ki je vseboval tako BocK kot tudi ABA kot pa če so celice gojili v mediju, ki je vseboval eno izmed teh dveh stvari. Če ni bilo ABA ali BocK, je bila SEAP ekspresija podobna intenziteti ozadja. Split PylRS deluje kot AND vrata za sesalske celice, saj imamo dva inputa (ABA in BocK), ki generirata en output (stop kodon supresija) [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Povzetek ==<br /> Split (razcepljene) aminoacil-tRNA sintetaze so orodja, ki omogočajo kontrolo translacije tarčnih genov. Z majhnimi molekulami kot so rapamicin in abscisna kislina lahko učinvkovito induciramo supresijo stop kodonov &quot;in-frame&quot;.<br /> <br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> [1] Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., &amp; Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codon suppression. Proceedings of the National Academy of Sciences, 120(8), e2219758120. https://doi.org/10.1073/pnas.2219758120</div>

Špela Štor https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Razcepljena_(split)_aminoacil-tRNA_sintetaza_za_indukcijo_supresije_stop_kodona&diff=22387 2023-05-16T19:22:31Z

<p>Špela Štor: </p> <hr /> <div>Povzeto po članku: [Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., &amp; Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codon suppression. Proceedings of the National Academy of Sciences, 120(8), e2219758120. https://doi.org/10.1073/pnas.2219758120]<br /> <br /> <br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Razcepljena ortogonalna aminoacil-tRNA sintetaza (o-aaRS) je bila dizajnirana in ustvarjena za kontrolo translacije v bakterijskih (E. coli) in sesalskih celicah (HEK23). Njihova vloga je supresija stop kodonov v prisotnosti majhnih molekul rapamicina in abscisne kisline, kar je omogočeno preko kemično inducirane dimerizacije. V odsotnosti o-aaRS je stop kodon supresija izključena, torej je translacija inhibirana. V članku so uporabili takšno o-aaRS, ki prepozna nekanonične oz. nenaravne aminokisline kot substrat. Če dodamo ncAA in o-aaRS, potem bo aminoacil-tRNA sintetaza vezala ncAA na supresorsko tRNA in to bo omogočilo translacijo tarčnega gena. V članku so uporabili pirolizil-tRNA sintetazo (PylRS) in tirozil-tRNA sintetazo [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Načrtovanje in validacija razpolovljene PylRS ==<br /> <br /> Za sintezo razcepljene o-aaRS na podlagi PylRS (pirolizil-tRNA sintetaza) so uporabili PyRS iz arheona ''Ca. Methanomethylophilus alvus'', ki je prepoznala nekanonično aminokislino meta-iodo-L-fenilalanin (mIF) kot substrat. S pomočjo kristalne strukture so določili 7 potencialnih cepitvenih mest, ki so dala N (PylRSN) in C (PylRSC) fragment. Naredili so fuzijo s peptidoma SYNZIP17 (N fragment) in SYNZIP18 (C fragment). Za preverjanje aktivnosti razpolovljene PylRS so fuzijske SYNZIP fragmente soizražali s pirolizin tRNA (tRNAPyl) in zelenim fluorescenčnim proteinom, ki je znotraj odprtega bralnega okvirja vseboval stop kodon TAG na poziciji 2 (sfGFP-2TAG). SfGFP produkcija je pričakovana samo takrat, ko lahko razpolovljena PylRS aminoacilira tRNAPyl z nekanonično aminokislino mIF. SfGFP fluorescenco so merili posledično tako, da so celice gojili v prisotnosti in odsotnosti mIF. Rezultati so pokazali, da je bila produkcija sfGFP v celicah, ki so rastle v prisotnosti mIF drastično večjo od celic, kjer ni bilo dodanih ncAA. To so opazili pri petih od sedmih razpolovljenih variant PylRS – Q23, D112, D137, R137, D195. Najaktivnejši razpolovljeni PylRS varianti sta bili tisti, kjer smo razcepili encim na mestih Q23in D137. Pri variantah Q23 in D137 so ugotovili, da je fluorescenca največja pri celicah, ki izražajo fuzijske proteine iz PylRS in SYNZIP peptidov. Nobene fluorescence niso zaznali, če sta bila oba peptida SYNZIP deletirana. Za potrditev teh rezultatov so naredili naslednji eksperiment v E. coli. Ta je simultano izražala SYNZIP-fuzijske PylRS fragmente skupaj z reporterskim genom CmR-112TAG. Celice so nato rastle na mediju z mIF in različnimi koncentracijami kloramfenikola. Celice, ki so izražale PylRS varianto Q23 so lahko rastle na kloramfenikolu z samo N fragmentom (fuzija s SYNZIP peptidom), medtem ko so celice z varianto D137 rastle samo v prisotnosti obeh fragmentov [1].<br /> <br /> <br /> <br /> == Načrtovanje in validacija razcepljene tirozil-tRNA sintetaze ==<br /> <br /> Raziskovalci so uporabili tirozil-tRNA iz Methanocaldococcus jannaschii (MjTyrRS). Določili so 5 potencialnih mest, kjer so lahko cepili encim, da so dobili N (TyrRSN) in C (TyrRSC) terminalni fragment. Naredili so fuzijski protein s SYNZIP17 in SYNZIP18 peptidom. Za ncAA substrat so uporabili para-iodo-L-fenilalaninom (pIF). Aktivnost encima so preverjali s sfGFP, ki je izrazito povečana pri celicah, katerim so dodali pIF. Za normalno delovanje TyrRS so morale celice izražati tako N kot tudi C terminalni fragment. Najaktivnejši varianti MjTyrRS sta bili tisti, ki sta bili cepljeni na mestih K99 in N268. <br /> Za potrditev, da je aktivnost razcepljenega encima odvisna od interakcije peptidov SYNZIP, so merili aktivnost MjTyrRS z in brez fuzije s SYNZIP. Za varianto K99 nista bila ne SYNZIP17 ne SYNZIP18 potrebna za normalno aktivnost. Pri N268 varianti pa je bila sfGFP produkcija opazna samo tam, kjer sta bila tako TyrRSN kot tudi TyrRSC fuzijsko povezana s SYNZIP. To je pomenilo, da je interakcija SYNZIP ključna za vzpostavitev aktivnosti MjTyrRS [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Detekcija terapevtsko relevantnih PPI-jev z razcepljeno PylRS ==<br /> <br /> Cilj je bil detekcija PPI-jev med pomembnimi terapevtskimi tarčami v bakterijah in človeških celicah. Ker MjTyrRS ni ortogonalna v evkariontih, so se osredotočili na razcepljeno PylRS [1].<br /> <br /> '''APOPTOZA'''<br /> V tem članku so se raziskovalci odločili, da bodo poskusili detektirati interakcije med BH3 domeno proapoptotičnega proteina tBID in antipoptotičnimi proteini Mcl-1 in Bcl-2 (vežeta na tBID in preprečita apoptozo). Klonirali so PylRSN kot fuzijo z Mcl-1 ali Bcl-2 ter PylRSc kot fuzijo z BH3 domeno (tBID) ali z kontrolnim peptidom (Dead BID). Te fuzijske proteine so nato izrazili skupaj z tRNAPyl in sfGFP-2TAG reporterjem. Nato so merili sfGFP fluorescenco z in brez mIF. Rezultati so pokazali, da nastaja sfGFP, če se izražajo fuzijski protein tBID-PylRSC in Mcl-1 ali Bcl-2. Fluorescenco so zaznali samo v primeru, ko so dodali mIF [1].<br /> <br /> '''SARS-COV-2'''<br /> V članku so želeli detektirati interakcijo med HR1 (heptad repeat 1) in HR2 (heptad repeat 2) motiva spike (S) proteina SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2) virusa. HR1 in HR2 med seboj interagirata in omogočita membransko fuzijo virusa in gostiteljeve membrane. Za detekcijo interakcije HR1 in HR2 s pomočjo PylRS, so v članku dizajnirali 5 helični kompleks (5-HB) sestavljen iz 2 HR2 heliksov in 3 HR1 heliksov z vmesnim linkerjem, ki ima izpostavljeno hidrofobno zanko, kamor se HR2 heliks lahko veže. Ko so se s 5-HB in HR2 spojeni PylRS fragmenti istočasno izrazili in če so dodali tRNAPyl in sfGFP-2TAG, so opazili sfGFP fluorescenco ob prisotnosti mIF. Te niso zaznali, če je manjkal HR2 ali 5-HB del [2]. <br /> <br /> <br /> == Uporaba razpolovljenih aaRS in majhnih molekul kot induktorjev za supresijo stop kodonov ==<br /> <br /> '''Z RAP induciran dimerizacijski sistem'''<br /> Raziskovalci so N- in C-fragment MjTyrRS spojili s FKBP in FRB proteini, ki so del rapamicin (RAP)-induciranega dimerizacijskega sistema. V tem sistemu receptorja FKBP in FBR tvorita stabilen dimer le v prisotnosti liganda RAP (rapamicina). V celicah E. coli so izrazili sočasno fuzijska proteina TyrRSN-FBR in TyrRSC-FKBP, tRNATyr, sfGFP-2TAG. Nato so spremljali nastanek sfGFP v prisotnosti in odsotnosti RAP in substrata za MjTyrRS pIF. Ko sta bila prisotna tako pIF kot tudi RAP, je bila fluorescenca sfGFP več kot 2x večja kot v celicah, ki smo jim dodali samo RAP oz. samo pIF. Z večanjem koncentracije RAP se je večala fluorescenca [1]. <br /> <br /> '''Z ABA induciran dimerizacijski sistem'''<br /> ABA oz. abscisna kislina je rastlinski hormon, ki povzroči dimerizacijo ABI in PYL proteinov. Naredili so fuzijski protein ABI in PylRSN ter PYL in PylRSC. Reporter je bil sfGFP-2TAG. Močna produkcija sfGFP je bila v celicah, ki so rastle v mediju z ABA in mIF (substrat PylRS). Tako so sklepali, da lahko ABA učinkovito aktivira PylRS in tako inducira stop kodon supresijo. Sledil je eksperiment v E. coli, kjer so izrazili sočasno ABI- in PYL-PylRS fuzijske proteine, tRNAPyl in CmR-112TAG reporterski gen. Celice so rastle samo tam, kjer je ABA bila dodana. Takšne razpolovljene o-aaRS lahko služijo kot AND vrata, kjer imamo dva inputa (RAP in pIF ali ABA in mIF), da dobimo željen output (read-through čez stop kodon) [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Kontrola genskega izražanja v sesalskih celicah ==<br /> <br /> Najprej so želeli optimizirati aktivnost PylRS v ABA-induciranem sistemu tako, da so optimizirali linkerje med PylRS fragmenti in ABI/PYL proteini. Naredili so 7 fuzijskih proteinov, kjer so bili PylRS fragmenti povezani z ABI in PYL preko fleksibilnega linkerja v obliki G(GSG)nG. N je bil od 0 do 6. Aktivnost PylRS so preverili s sfGFP fluorescenco. Ugotovili so, da je daljši linker omogočil večjo aktivnost PylRS in s tem večjo fluorescenco, vendar pa je z daljšim linkerjem postala PylRS bolj nespecifična, torej do stop kodon supresije je prišlo tudi takrat, ko ni bilo dodanih ncAA. Raziskovalci so na podlagi tega izbrali linker n=4 kot optimizirano varianto [1]. <br /> <br /> Optimizirano varianto so uporabili v HEK293 celicah za predstavitev ABA-inducirane stop kodon supresije. Naredili so fuzijski konstrukt iz PylRSN-ABI in PYL-PylRSC fragmenta, ki so ju povezali s T2A peptidom. Fuzijski gen so izrazili skupaj z tRNAPyl in reporterskim genom (SEAP-41TAG).<br /> HEK291 celice so gojili v mediju s PylRS substratom Nε-boc-L-lizin (BocK) in različnimi koncentracijami ABA. Ugotovili so, da se je SEAP aktivnost povečala za več kot 10x, če so celice gojili v mediju, ki je vseboval tako BocK kot tudi ABA kot pa če so celice gojili v mediju, ki je vseboval eno izmed teh dveh stvari. Če ni bilo ABA ali BocK, je bila SEAP ekspresija podobna intenziteti ozadja. Split PylRS deluje kot AND vrata za sesalske celice, saj imamo dva inputa (ABA in BocK), ki generirata en output (stop kodon supresija) [1]. <br /> <br /> <br /> <br /> == Povzetek. ==<br /> Split (razcepljene) aminoacil-tRNA sintetaze so orodja, ki omogočajo kontrolo translacije tarčnih genov. Z majhnimi molekulami kot so rapamicin in abscisna kislina lahko učinvkovito induciramo supresijo stop kodonov &quot;in-frame&quot;.<br /> <br /> <br /> <br /> == Viri ==<br /> [1] Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., &amp; Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codon suppression. Proceedings of the National Academy of Sciences, 120(8), e2219758120. https://doi.org/10.1073/pnas.2219758120</div>

Špela Štor https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Razcepljena_(split)_aminoacil-tRNA_sintetaza_za_indukcijo_supresije_stop_kodona&diff=22386 2023-05-16T19:19:54Z

<p>Špela Štor: </p> <hr /> <div>Povzeto po članku: [Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., &amp; Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codon suppression. Proceedings of the National Academy of Sciences, 120(8), e2219758120. https://doi.org/10.1073/pnas.2219758120]<br /> <br /> <br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Razcepljena ortogonalna aminoacil-tRNA sintetaza (o-aaRS) je bila dizajnirana in ustvarjena za kontrolo translacije v bakterijskih (E. coli) in sesalskih celicah (HEK23). Njihova vloga je supresija stop kodonov v prisotnosti majhnih molekul rapamicina in abscisne kisline, kar je omogočeno preko kemično inducirane dimerizacije. V odsotnosti o-aaRS je stop kodon supresija izključena, torej je translacija inhibirana. V članku so uporabili takšno o-aaRS, ki prepozna nekanonične oz. nenaravne aminokisline kot substrat. Če dodamo ncAA in o-aaRS, potem bo aminoacil-tRNA sintetaza vezala ncAA na supresorsko tRNA in to bo omogočilo translacijo tarčnega gena. V članku so uporabili pirolizil-tRNA sintetazo (PylRS) in tirozil-tRNA sintetazo. <br /> <br /> <br /> <br /> == Načrtovanje in validacija razpolovljene PylRS ==<br /> <br /> Za sintezo razcepljene o-aaRS na podlagi PylRS (pirolizil-tRNA sintetaza) so uporabili PyRS iz arheona ''Ca. Methanomethylophilus alvus'', ki je prepoznala nekanonično aminokislino meta-iodo-L-fenilalanin (mIF) kot substrat. S pomočjo kristalne strukture so določili 7 potencialnih cepitvenih mest, ki so dala N (PylRSN) in C (PylRSC) fragment. Naredili so fuzijo s peptidoma SYNZIP17 (N fragment) in SYNZIP18 (C fragment). Za preverjanje aktivnosti razpolovljene PylRS so fuzijske SYNZIP fragmente soizražali s pirolizin tRNA (tRNAPyl) in zelenim fluorescenčnim proteinom, ki je znotraj odprtega bralnega okvirja vseboval stop kodon TAG na poziciji 2 (sfGFP-2TAG). SfGFP produkcija je pričakovana samo takrat, ko lahko razpolovljena PylRS aminoacilira tRNAPyl z nekanonično aminokislino mIF. SfGFP fluorescenco so merili posledično tako, da so celice gojili v prisotnosti in odsotnosti mIF. Rezultati so pokazali, da je bila produkcija sfGFP v celicah, ki so rastle v prisotnosti mIF drastično večjo od celic, kjer ni bilo dodanih ncAA. To so opazili pri petih od sedmih razpolovljenih variant PylRS – Q23, D112, D137, R137, D195. Najaktivnejši razpolovljeni PylRS varianti sta bili tisti, kjer smo razcepili encim na mestih Q23in D137. Pri variantah Q23 in D137 so ugotovili, da je fluorescenca največja pri celicah, ki izražajo fuzijske proteine iz PylRS in SYNZIP peptidov. Nobene fluorescence niso zaznali, če sta bila oba peptida SYNZIP deletirana. Za potrditev teh rezultatov so naredili naslednji eksperiment v E. coli. Ta je simultano izražala SYNZIP-fuzijske PylRS fragmente skupaj z reporterskim genom CmR-112TAG. Celice so nato rastle na mediju z mIF in različnimi koncentracijami kloramfenikola. Celice, ki so izražale PylRS varianto Q23 so lahko rastle na kloramfenikolu z samo N fragmentom (fuzija s SYNZIP peptidom), medtem ko so celice z varianto D137 rastle samo v prisotnosti obeh fragmentov.<br /> <br /> <br /> <br /> == Načrtovanje in validacija razcepljene tirozil-tRNA sintetaze ==<br /> <br /> Raziskovalci so uporabili tirozil-tRNA iz Methanocaldococcus jannaschii (MjTyrRS). Določili so 5 potencialnih mest, kjer so lahko cepili encim, da so dobili N (TyrRSN) in C (TyrRSC) terminalni fragment. Naredili so fuzijski protein s SYNZIP17 in SYNZIP18 peptidom. Za ncAA substrat so uporabili para-iodo-L-fenilalaninom (pIF). Aktivnost encima so preverjali s sfGFP, ki je izrazito povečana pri celicah, katerim so dodali pIF. Za normalno delovanje TyrRS so morale celice izražati tako N kot tudi C terminalni fragment. Najaktivnejši varianti MjTyrRS sta bili tisti, ki sta bili cepljeni na mestih K99 in N268. <br /> Za potrditev, da je aktivnost razcepljenega encima odvisna od interakcije peptidov SYNZIP, so merili aktivnost MjTyrRS z in brez fuzije s SYNZIP. Za varianto K99 nista bila ne SYNZIP17 ne SYNZIP18 potrebna za normalno aktivnost. Pri N268 varianti pa je bila sfGFP produkcija opazna samo tam, kjer sta bila tako TyrRSN kot tudi TyrRSC fuzijsko povezana s SYNZIP. To je pomenilo, da je interakcija SYNZIP ključna za vzpostavitev aktivnosti MjTyrRS. <br /> <br /> <br /> <br /> == Detekcija terapevtsko relevantnih PPI-jev z razcepljeno PylRS ==<br /> <br /> Cilj je bil detekcija PPI-jev med pomembnimi terapevtskimi tarčami v bakterijah in človeških celicah. Ker MjTyrRS ni ortogonalna v evkariontih, so se osredotočili na razcepljeno PylRS.<br /> <br /> '''APOPTOZA'''<br /> V tem članku so se raziskovalci odločili, da bodo poskusili detektirati interakcije med BH3 domeno proapoptotičnega proteina tBID in antipoptotičnimi proteini Mcl-1 in Bcl-2 (vežeta na tBID in preprečita apoptozo). Klonirali so PylRSN kot fuzijo z Mcl-1 ali Bcl-2 ter PylRSc kot fuzijo z BH3 domeno (tBID) ali z kontrolnim peptidom (Dead BID). Te fuzijske proteine so nato izrazili skupaj z tRNAPyl in sfGFP-2TAG reporterjem. Nato so merili sfGFP fluorescenco z in brez mIF. Rezultati so pokazali, da nastaja sfGFP, če se izražajo fuzijski protein tBID-PylRSC in Mcl-1 ali Bcl-2. Fluorescenco so zaznali samo v primeru, ko so dodali mIF.<br /> <br /> '''SARS-COV-2'''<br /> V članku so želeli detektirati interakcijo med HR1 (heptad repeat 1) in HR2 (heptad repeat 2) motiva spike (S) proteina SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2) virusa. HR1 in HR2 med seboj interagirata in omogočita membransko fuzijo virusa in gostiteljeve membrane. Za detekcijo interakcije HR1 in HR2 s pomočjo PylRS, so v članku dizajnirali 5 helični kompleks (5-HB) sestavljen iz 2 HR2 heliksov in 3 HR1 heliksov z vmesnim linkerjem, ki ima izpostavljeno hidrofobno zanko, kamor se HR2 heliks lahko veže. Ko so se s 5-HB in HR2 spojeni PylRS fragmenti istočasno izrazili in če so dodali tRNAPyl in sfGFP-2TAG, so opazili sfGFP fluorescenco ob prisotnosti mIF. Te niso zaznali, če je manjkal HR2 ali 5-HB del. <br /> <br /> <br /> == Uporaba razpolovljenih aaRS in majhnih molekul kot induktorjev za supresijo stop kodonov ==<br /> <br /> '''Z RAP induciran dimerizacijski sistem'''<br /> Raziskovalci so N- in C-fragment MjTyrRS spojili s FKBP in FRB proteini, ki so del rapamicin (RAP)-induciranega dimerizacijskega sistema. V tem sistemu receptorja FKBP in FBR tvorita stabilen dimer le v prisotnosti liganda RAP (rapamicina). V celicah E. coli so izrazili sočasno fuzijska proteina TyrRSN-FBR in TyrRSC-FKBP, tRNATyr, sfGFP-2TAG. Nato so spremljali nastanek sfGFP v prisotnosti in odsotnosti RAP in substrata za MjTyrRS pIF. Ko sta bila prisotna tako pIF kot tudi RAP, je bila fluorescenca sfGFP več kot 2x večja kot v celicah, ki smo jim dodali samo RAP oz. samo pIF. Z večanjem koncentracije RAP se je večala fluorescenca. <br /> <br /> '''Z ABA induciran dimerizacijski sistem'''<br /> ABA oz. abscisna kislina je rastlinski hormon, ki povzroči dimerizacijo ABI in PYL proteinov. Naredili so fuzijski protein ABI in PylRSN ter PYL in PylRSC. Reporter je bil sfGFP-2TAG. Močna produkcija sfGFP je bila v celicah, ki so rastle v mediju z ABA in mIF (substrat PylRS). Tako so sklepali, da lahko ABA učinkovito aktivira PylRS in tako inducira stop kodon supresijo. Sledil je eksperiment v E. coli, kjer so izrazili sočasno ABI- in PYL-PylRS fuzijske proteine, tRNAPyl in CmR-112TAG reporterski gen. Celice so rastle samo tam, kjer je ABA bila dodana. Takšne razpolovljene o-aaRS lahko služijo kot AND vrata, kjer imamo dva inputa (RAP in pIF ali ABA in mIF), da dobimo željen output (read-through čez stop kodon). <br /> <br /> <br /> <br /> == Kontrola genskega izražanja v sesalskih celicah ==<br /> <br /> Najprej so želeli optimizirati aktivnost PylRS v ABA-induciranem sistemu tako, da so optimizirali linkerje med PylRS fragmenti in ABI/PYL proteini. Naredili so 7 fuzijskih proteinov, kjer so bili PylRS fragmenti povezani z ABI in PYL preko fleksibilnega linkerja v obliki G(GSG)nG. N je bil od 0 do 6. Aktivnost PylRS so preverili s sfGFP fluorescenco. Ugotovili so, da je daljši linker omogočil večjo aktivnost PylRS in s tem večjo fluorescenco, vendar pa je z daljšim linkerjem postala PylRS bolj nespecifična, torej do stop kodon supresije je prišlo tudi takrat, ko ni bilo dodanih ncAA. Raziskovalci so na podlagi tega izbrali linker n=4 kot optimizirano varianto. <br /> <br /> Optimizirano varianto so uporabili v HEK293 celicah za predstavitev ABA-inducirane stop kodon supresije. Naredili so fuzijski konstrukt iz PylRSN-ABI in PYL-PylRSC fragmenta, ki so ju povezali s T2A peptidom. Fuzijski gen so izrazili skupaj z tRNAPyl in reporterskim genom (SEAP-41TAG).<br /> HEK291 celice so gojili v mediju s PylRS substratom Nε-boc-L-lizin (BocK) in različnimi koncentracijami ABA. Ugotovili so, da se je SEAP aktivnost povečala za več kot 10x, če so celice gojili v mediju, ki je vseboval tako BocK kot tudi ABA kot pa če so celice gojili v mediju, ki je vseboval eno izmed teh dveh stvari. Če ni bilo ABA ali BocK, je bila SEAP ekspresija podobna intenziteti ozadja. Split PylRS deluje kot AND vrata za sesalske celice, saj imamo dva inputa (ABA in BocK), ki generirata en output (stop kodon supresija). <br /> <br /> <br /> <br /> == Povzetek. ==<br /> Split (razcepljene) aminoacil-tRNA sintetaze so orodja, ki omogočajo kontrolo translacije tarčnih genov. Z majhnimi molekulami kot so rapamicin in abscisna kislina lahko učinvkovito induciramo supresijo stop kodonov &quot;in-frame&quot;.</div>

Špela Štor https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Razcepljena_(split)_aminoacil-tRNA_sintetaza_za_indukcijo_supresije_stop_kodona&diff=22385 2023-05-16T19:18:45Z

<p>Špela Štor: New page: Povzeto po članku: [Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., &amp; Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codon suppressio...</p> <hr /> <div>Povzeto po članku: [Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., &amp; Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codon suppression. Proceedings of the National Academy of Sciences, 120(8), e2219758120. https://doi.org/10.1073/pnas.2219758120]<br /> <br /> <br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Razcepljena ortogonalna aminoacil-tRNA sintetaza (o-aaRS) je bila dizajnirana in ustvarjena za kontrolo translacije v bakterijskih (E. coli) in sesalskih celicah (HEK23). Njihova vloga je supresija stop kodonov v prisotnosti majhnih molekul rapamicina in abscisne kisline, kar je omogočeno preko kemično inducirane dimerizacije. V odsotnosti o-aaRS je stop kodon supresija izključena, torej je translacija inhibirana. V članku so uporabili takšno o-aaRS, ki prepozna nekanonične oz. nenaravne aminokisline kot substrat. Če dodamo ncAA in o-aaRS, potem bo aminoacil-tRNA sintetaza vezala ncAA na supresorsko tRNA in to bo omogočilo translacijo tarčnega gena. V članku so uporabili pirolizil-tRNA sintetazo (PylRS) in tirozil-tRNA sintetazo. <br /> <br /> <br /> <br /> == Načrtovanje in validacija razpolovljene PylRS ==<br /> <br /> Za sintezo razcepljene o-aaRS na podlagi PylRS (pirolizil-tRNA sintetaza) so uporabili PyRS iz arheona ''Ca. Methanomethylophilus alvus'', ki je prepoznala nekanonično aminokislino meta-iodo-L-fenilalanin (mIF) kot substrat. S pomočjo kristalne strukture so določili 7 potencialnih cepitvenih mest, ki so dala N (PylRSN) in C (PylRSC) fragment. Naredili so fuzijo s peptidoma SYNZIP17 (N fragment) in SYNZIP18 (C fragment). <br /> <br /> Za preverjanje aktivnosti razpolovljene PylRS so fuzijske SYNZIP fragmente soizražali s pirolizin tRNA (tRNAPyl) in zelenim fluorescenčnim proteinom, ki je znotraj odprtega bralnega okvirja vseboval stop kodon TAG na poziciji 2 (sfGFP-2TAG). SfGFP produkcija je pričakovana samo takrat, ko lahko razpolovljena PylRS aminoacilira tRNAPyl z nekanonično aminokislino mIF. SfGFP fluorescenco so merili posledično tako, da so celice gojili v prisotnosti in odsotnosti mIF. <br /> <br /> Rezultati so pokazali, da je bila produkcija sfGFP v celicah, ki so rastle v prisotnosti mIF drastično večjo od celic, kjer ni bilo dodanih ncAA. To so opazili pri petih od sedmih razpolovljenih variant PylRS – Q23, D112, D137, R137, D195. Najaktivnejši razpolovljeni PylRS varianti sta bili tisti, kjer smo razcepili encim na mestih Q23in D137.<br /> <br /> Pri variantah Q23 in D137 so ugotovili, da je fluorescenca največja pri celicah, ki izražajo fuzijske proteine iz PylRS in SYNZIP peptidov. Nobene fluorescence niso zaznali, če sta bila oba peptida SYNZIP deletirana.<br /> <br /> Za potrditev teh rezultatov so naredili naslednji eksperiment v E. coli. Ta je simultano izražala SYNZIP-fuzijske PylRS fragmente skupaj z reporterskim genom CmR-112TAG. Celice so nato rastle na mediju z mIF in različnimi koncentracijami kloramfenikola. Celice, ki so izražale PylRS varianto Q23 so lahko rastle na kloramfenikolu z samo N fragmentom (fuzija s SYNZIP peptidom), medtem ko so celice z varianto D137 rastle samo v prisotnosti obeh fragmentov.<br /> <br /> <br /> <br /> == Načrtovanje in validacija razcepljene tirozil-tRNA sintetaze ==<br /> <br /> Raziskovalci so uporabili tirozil-tRNA iz Methanocaldococcus jannaschii (MjTyrRS). Določili so 5 potencialnih mest, kjer so lahko cepili encim, da so dobili N (TyrRSN) in C (TyrRSC) terminalni fragment. Naredili so fuzijski protein s SYNZIP17 in SYNZIP18 peptidom. Za ncAA substrat so uporabili para-iodo-L-fenilalaninom (pIF). Aktivnost encima so preverjali s sfGFP, ki je izrazito povečana pri celicah, katerim so dodali pIF. Za normalno delovanje TyrRS so morale celice izražati tako N kot tudi C terminalni fragment. Najaktivnejši varianti MjTyrRS sta bili tisti, ki sta bili cepljeni na mestih K99 in N268. <br /> Za potrditev, da je aktivnost razcepljenega encima odvisna od interakcije peptidov SYNZIP, so merili aktivnost MjTyrRS z in brez fuzije s SYNZIP. Za varianto K99 nista bila ne SYNZIP17 ne SYNZIP18 potrebna za normalno aktivnost. Pri N268 varianti pa je bila sfGFP produkcija opazna samo tam, kjer sta bila tako TyrRSN kot tudi TyrRSC fuzijsko povezana s SYNZIP. To je pomenilo, da je interakcija SYNZIP ključna za vzpostavitev aktivnosti MjTyrRS. <br /> <br /> <br /> <br /> == Detekcija terapevtsko relevantnih PPI-jev z razcepljeno PylRS ==<br /> <br /> Cilj je bil detekcija PPI-jev med pomembnimi terapevtskimi tarčami v bakterijah in človeških celicah. Ker MjTyrRS ni ortogonalna v evkariontih, so se osredotočili na razcepljeno PylRS.<br /> <br /> '''APOPTOZA'''<br /> V tem članku so se raziskovalci odločili, da bodo poskusili detektirati interakcije med BH3 domeno proapoptotičnega proteina tBID in antipoptotičnimi proteini Mcl-1 in Bcl-2 (vežeta na tBID in preprečita apoptozo). Klonirali so PylRSN kot fuzijo z Mcl-1 ali Bcl-2 ter PylRSc kot fuzijo z BH3 domeno (tBID) ali z kontrolnim peptidom (Dead BID). Te fuzijske proteine so nato izrazili skupaj z tRNAPyl in sfGFP-2TAG reporterjem. Nato so merili sfGFP fluorescenco z in brez mIF. Rezultati so pokazali, da nastaja sfGFP, če se izražajo fuzijski protein tBID-PylRSC in Mcl-1 ali Bcl-2. Fluorescenco so zaznali samo v primeru, ko so dodali mIF.<br /> <br /> '''SARS-COV-2'''<br /> V članku so želeli detektirati interakcijo med HR1 (heptad repeat 1) in HR2 (heptad repeat 2) motiva spike (S) proteina SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2) virusa. HR1 in HR2 med seboj interagirata in omogočita membransko fuzijo virusa in gostiteljeve membrane. Za detekcijo interakcije HR1 in HR2 s pomočjo PylRS, so v članku dizajnirali 5 helični kompleks (5-HB) sestavljen iz 2 HR2 heliksov in 3 HR1 heliksov z vmesnim linkerjem, ki ima izpostavljeno hidrofobno zanko, kamor se HR2 heliks lahko veže. Ko so se s 5-HB in HR2 spojeni PylRS fragmenti istočasno izrazili in če so dodali tRNAPyl in sfGFP-2TAG, so opazili sfGFP fluorescenco ob prisotnosti mIF. Te niso zaznali, če je manjkal HR2 ali 5-HB del. <br /> <br /> <br /> == Uporaba razpolovljenih aaRS in majhnih molekul kot induktorjev za supresijo stop kodonov ==<br /> <br /> Z RAP induciran dimerizacijski sistem<br /> Raziskovalci so N- in C-fragment MjTyrRS spojili s FKBP in FRB proteini, ki so del rapamicin (RAP)-induciranega dimerizacijskega sistema. V tem sistemu receptorja FKBP in FBR tvorita stabilen dimer le v prisotnosti liganda RAP (rapamicina). V celicah E. coli so izrazili sočasno fuzijska proteina TyrRSN-FBR in TyrRSC-FKBP, tRNATyr, sfGFP-2TAG. Nato so spremljali nastanek sfGFP v prisotnosti in odsotnosti RAP in substrata za MjTyrRS pIF. Ko sta bila prisotna tako pIF kot tudi RAP, je bila fluorescenca sfGFP več kot 2x večja kot v celicah, ki smo jim dodali samo RAP oz. samo pIF. Z večanjem koncentracije RAP se je večala fluorescenca. <br /> <br /> Z ABA induciran dimerizacijski sistem<br /> ABA oz. abscisna kislina je rastlinski hormon, ki povzroči dimerizacijo ABI in PYL proteinov. Naredili so fuzijski protein ABI in PylRSN ter PYL in PylRSC. Reporter je bil sfGFP-2TAG. Močna produkcija sfGFP je bila v celicah, ki so rastle v mediju z ABA in mIF (substrat PylRS). Tako so sklepali, da lahko ABA učinkovito aktivira PylRS in tako inducira stop kodon supresijo. Sledil je eksperiment v E. coli, kjer so izrazili sočasno ABI- in PYL-PylRS fuzijske proteine, tRNAPyl in CmR-112TAG reporterski gen. Celice so rastle samo tam, kjer je ABA bila dodana. Takšne razpolovljene o-aaRS lahko služijo kot AND vrata, kjer imamo dva inputa (RAP in pIF ali ABA in mIF), da dobimo željen output (read-through čez stop kodon). <br /> <br /> <br /> <br /> == Kontrola genskega izražanja v sesalskih celicah ==<br /> <br /> Najprej so želeli optimizirati aktivnost PylRS v ABA-induciranem sistemu tako, da so optimizirali linkerje med PylRS fragmenti in ABI/PYL proteini. Naredili so 7 fuzijskih proteinov, kjer so bili PylRS fragmenti povezani z ABI in PYL preko fleksibilnega linkerja v obliki G(GSG)nG. N je bil od 0 do 6. Aktivnost PylRS so preverili s sfGFP fluorescenco. Ugotovili so, da je daljši linker omogočil večjo aktivnost PylRS in s tem večjo fluorescenco, vendar pa je z daljšim linkerjem postala PylRS bolj nespecifična, torej do stop kodon supresije je prišlo tudi takrat, ko ni bilo dodanih ncAA. Raziskovalci so na podlagi tega izbrali linker n=4 kot optimizirano varianto. <br /> <br /> Optimizirano varianto so uporabili v HEK293 celicah za predstavitev ABA-inducirane stop kodon supresije. Naredili so fuzijski konstrukt iz PylRSN-ABI in PYL-PylRSC fragmenta, ki so ju povezali s T2A peptidom. Fuzijski gen so izrazili skupaj z tRNAPyl in reporterskim genom (SEAP-41TAG).<br /> HEK291 celice so gojili v mediju s PylRS substratom Nε-boc-L-lizin (BocK) in različnimi koncentracijami ABA. Ugotovili so, da se je SEAP aktivnost povečala za več kot 10x, če so celice gojili v mediju, ki je vseboval tako BocK kot tudi ABA kot pa če so celice gojili v mediju, ki je vseboval eno izmed teh dveh stvari. Če ni bilo ABA ali BocK, je bila SEAP ekspresija podobna intenziteti ozadja. Split PylRS deluje kot AND vrata za sesalske celice, saj imamo dva inputa (ABA in BocK), ki generirata en output (stop kodon supresija). <br /> <br /> <br /> <br /> == Povzetek. ==<br /> Split (razcepljene) aminoacil-tRNA sintetaze so orodja, ki omogočajo kontrolo translacije tarčnih genov. Z majhnimi molekulami kot so rapamicin in abscisna kislina lahko učinvkovito induciramo supresijo stop kodonov &quot;in-frame&quot;.</div>

Špela Štor https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:%C5%A0pela_%C5%A0tor&diff=22379 2023-05-16T18:19:18Z

<p>Špela Štor: Removing all content from page</p> <hr /> <div></div>

Špela Štor https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:%C5%A0pela_%C5%A0tor&diff=22378 2023-05-16T18:18:34Z

<p>Špela Štor: New page: Razcepljena (split) aminoacil-tRNA sintetaza za indukcijo supresije izražanje zaradi stop kodona</p> <hr /> <div>Razcepljena (split) aminoacil-tRNA sintetaza za indukcijo supresije izražanje zaradi stop kodona</div>

Špela Štor