Wiki FKKT - User contributions [en]

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-29T20:08:42Z

Špela Deučman:

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1186/s12934-021-01732-x S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.]

== UVOD ==
Hitra rast svetovnega prebivalstva skupaj z naraščajočim povpraševanjem po fosilnih gorivih in povečanimi emisijami CO2 je povzročila večjo potrebo po razvoju trajnostnih virov energije in kemikalij iz obnovljivih virov. V zadnjih desetletjih je bilo veliko raziskav osredotočenih na prepoznavanje trajnostnih metod za proizvodnjo obnovljivih biogoriv [1], [2].

Izobutanol je pomembna spojina kot alternativno gorivo zaradi visoke vsebnosti energije (98 % vsebnosti energije v bencinu) in nižjega parnega tlaka v primerjavi z etanolom. Poleg tega ima izobutanol nižjo vsebnost O2 in nižjo topnost v vodi kot etanol, kar pomeni, da je mogoče v bencin vmešati več izobutanola, medtem pa imamo še vedno nizko vsebnost O2 v končnem izdelku [2].

Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za sintezo izobutanola zaradi svoje sposobnosti, da s fotosintezo pretvarjajo CO2 neposredno v kemične spojine z dodano vrednostjo. S cianobakterijami lahko proizvajamo etanol, izobutiraldehid, izobutanol, 1-butanol, sukcinat, 2,3-butandiol, terpenoide, klorofile, maščobne kisline, sladkor in aminokisline [3]–[5].

Zmožne so tudi vezati atmosferski dušik in zato zavzemajo pomembno vlogo v dušikovem ciklu. Cianobakterije, ki vežejo N2, so še posebej zanimive za raziskovalce, ki se ukvarjajo z razvojem industrijskih sevov za proizvodnjo »zelenih« kemikalij, kot so limonen, farnezen, linalol in mircen [1].

== SINTEZA IZOBUTANOLA IN 3-METIL-1-IZOBUTANOLA V CIANOBAKTERIJAH ==

Izobutanol in 3-metil-1-butanol sta pomembna alkohola, saj lahko služita kot alternativa bencinu in ju je mogoče sintetizirati po poti biosinteze aminokislin v cianobakterijah. Najpogostejša sintezna pot za biosintezo izobutanola je pot 2-keto kislin, ki si deli prekurzor (α-ketoizovalerat) s sintezno potjo biosinteze L-valina. 3-metil-1-butanol si deli prekurzor (2-ketoizokaproat) s sintezno potjo biosinteze L-levcina [2].

Biosintezna pot izobutanola vsebuje več encimov. Kodirajo jih geni alsS (''Bacillus subtilis''), ilvC (''E. coli''), ilvD (''E. coli''), ketokislinska dekarboksilaza (kdc) (''Lactococcus lactis'') in alkoholna dehidrogenaza (adh) (''E. coli'') [2], [3].

α-ketoizovalerat dekarboksilaza (Kivd oz. kdc) iz ''L. lactis'', ki dekarboksilira α-keto kisline v aldehide, je pomemben encim v poti 2-keto kislin in je bil uporabljen pri ''E. coli'', ''S.cerevisiae'', ''Corynebacterium glutamicum'' in cianobakterijah za proizvodnjo izobutiraldehida in izobutanola. KDC je homotetramer, njegova optimalna aktivnost je bila opažena pri 45 °C (pH 6,5) in ima visoko specifičnost za α-ketoizovalerat. Poleg tega je bil Kivd oz. kdc zasnovan za uporabo večjega substrata za proizvodnjo alkoholov z daljšo verigo. Cianobakterije so pritegnile pozornost raziskovalcev zaradi zmožnosti izvajanja fotosinteze, in posledične porabe atmosferskega CO2, ter nizke potrebe po hranilih, visoke tolerance na različna okolja in nezahtevnega genskega inženiringa [2].

== MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH ==

Večina pristopov sintezne biologije, ki delujejo v heterotrofnih organizmih, kot je ''E. coli'', ni mogoče uporabiti v cianobakterijah. Na primer, promotorji in RBS, ki močno modulirajo izražanje genov v ''E. coli'', ne delujejo dobro v cianobakterijah. Če se osredotočimo samo na povečanje izražanja genov s promotorskim inženiringom, opazimo, da se pri cianobakterijah uporabljajo močni konstitutivni nativni promotorji, sintetični inducibilni promotorji, kemično inducibilni promotorji in okoljsko inducibilni promotorji [5].

Do danes je bilo opisanihh le nekaj močnih konstitutivnih promotorjev, ki pa so pogosto omejeni na samo nekatere vrste in moč izražanja genov niha s cirkadianim ritmom. Sintetični inducibilni promotorji delujejo v različnih vrstah cianobakterij [5]. Kemično inducibilni promotorji, npr. arabinozni inducibilni promotor, so najpogosteje uporabljeni promotorji, vendar pa niso primerni za velike industrijske bioprocese [3], [5]. Uporaba zunanjih kemičnih induktorjev ni zaželena, saj poveča proizvodne stroške in predstavlja tveganje za okolje, na primer zaradi uporabe težkih kovin. Slednji problem lahko rešimo z uporabo promotorjev, na katere vplivajo okoljski oz. fizični signali kot sta npr. kisik in svetloba.

Znanstveniki so ustvarili s temo inducibilni genski ekspresijski sistem, ki temelji na dvokomponentnem sistemu EnvZ/OmpR iz ''E. coli''. Prav tako so izkoristili prisotnost fikobilisoma v cianobakterijah. Ustvarili so na svetlobo občutljiv genski ekspresijski sistem, ki je sestavljen iz senzorja za zeleno svetlobo CcaS, efektorskega elementa CcaR ter promotor PcpcG2, ki regulira ekspresijo gena za linker cpcG2 fikobilisoma. Na podlagi sistema za preklop iz aerobnega v anaerobni metabolizem (FNR) iz ''E. coli'' so ustvarili prilagojen sistem v sevu Syn6803 cianobakterij. Z uporabo tega sistema in promotorja PFNR o ustvarili genski ekspresijski sistem, ki se odziva na prisotnost kisika [5].

== VPLIV GENSKEGA EKSPRESIJSKEGA SISTEMA CcaS/CcaR NA EKSPRESIJO IZOBUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST ==

V izbranem članku so avtorji želeli pokazati, da s svetlobo inducibilnim promotorjem lahko pridobimo večjo količino izobutanola in 3-metil-1-butanola in da so posledično bolj ekonomični ter obvladljivi genetski ekspresijski sistemi kot sistemi s kemikalijami inducibilnimi promotorji. Poleg tega so tudi vključili vpliv integracije tega genskega ekspresijskega sistema na rast cianobakterij [3].

Za gostiteljski organizem so izbrali cianobakterijo ''Synechocystis sp.'' PCC 6803. V ''E. coli'' K-12 so pripravili 3 različne konstrukte oz. vektorje z inserti [3].

Kot osnovo so uporabili vektor pKT-GSS. Prvi konstrukt so poimenovali pKT-GSS-KDC-ADH. Gena kdc in adh sta bila vstavljena za promotorjem PcpcG2. Sev PCC 6803 ima integriran sistem CcS/CcR. Ta sistem lahko inducira izražanje eksogenih genov iz promotorja PcpcG2 kot odziv na radiacijo z zeleno svetlobo in zavira izražanje genov kot odziv na radiacijo z rdečo svetlobo. V osnovni vektor so vstavili dva gena, potrebna za proizvodnjo alkoholov, in sicer kdc, ki vsebuje zapis za ketokislinsko dekarboksilazo (KDC) in je pridobljen iz ''L. lactis'', ter slr1192, ki vsbuje zapis za alkoholno dehidrogenazo (ADH) in je pridobljen iz PCC 6803. Uporaba kodonov med sevom ''E. coli'' K-12 in PCC 6803 je podobna, zato ni bila potrebna optimizacija rabe kodonov za gen kdc. Pred zapisoma genov kdc in adh so vstavili sekvenco podobno Shine-Dalgarnovem zapordju iz gena cpcB organizma ''Synechococcus sp.'' PCC 7002. Ekspresija genov kdc in adh je bila inducirana z obsevanjem z zeleno svetlobo. Sinteza izobutanola in 3-metil-1-butanola je bila uspešna [3].

Rast, transkripcija in proizvodnjo izobutanola ter 3-metil-1-butanola so določili z gojenjem celic PCC 6803ΔGSS. To je sev z delecijo genomskega sistema CcaS/CcaR in PcpcG2. V ta sev so vnesli vektor pKT-GSS-KDC-ADH in nato celice obsevali z rdečo in zeleno svetlobo (induktivni pogoji: 520 nm, 660 nm; 60 μmol/m2 s) ali samo z rdečo svetlobo (660 nm, 30 μmol/m2 s). Rdeča svetloba je potrebna za fotosintezo in ni znatno vplivala na ekspresijo genov pod promotorjem PcpcG2. Zaradi slednjega razloga so celice obsevali tako z zeleno kot rdečo svetlobo. Spremembe v intenzivnosti in/ali valovni dolžini svetlobe lahko aktivirajo metabolizem gostitelja, rast celic in bioprodukcijo. Čeprav je bila za indukcijo uporabljena dvakrat večja intenziteta svetlobe, so pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo opazili rahlo zakasnitev rasti celic v primerjavi z obsevanjem z rdečo svetlobo. Zakasnitev v rasti celic so pripisali integraciji genov kdc in adh v genom. Slednje ni znatno vplivalo na produkcijo alkoholov [3].

Opazovali so tudi transkripcijsko aktivnost celic. Pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo so v celicah PCC 6803ΔGSS z pKT-GSS-KDC-ADH opazili petkrat višjo raven transkripcije gena kdc v primerjavi s tisto pri osvetlitvi z rdečo svetlobo pri 4 urah. Slednje ponovno potrdi njihovo domnevo [3].

Titri proizvodnje izobutanola in 3-metil-1-butanola so se povečevali do petega dne pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo ter dosegli 166 mg/L izobutanola in 51 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh. Pri obsevanju z rdečo svetlobo pa je sev PCC 6803ΔGSS z pKT-GSS-KDC-ADH proizvedel samo 19 mg/Lizobutanola in 9 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh [3].

Ustvarili so tudi kontrolni sev. Ta sev je imel zapise za gena kdc in adh pod nadzorom močnega konstitutivnega promotorja Ptrc-core. Koncentracija izobutanola, proizvedena v kontrolnem sevu, je znašala približno 5 mg/L, koncentracija 3-metil-1-butanola pa je bila pod mejo zaznave. V primerjavi s sevom s sistemom CcaS/CcaR je kontrolni sev počasno rastel [3].

Raziskovalci so želeli nadaljnjo povečati proizvodnjo izobutanola in 3-metil-1-butanola, kar je pomenilo, da so morali povečati nivoje izražanja kdc in adh iz PcpcG2. Njihove prejšnje raziskave so pokazale, da je dodatna ekspresija gena ccaR z uporabo konstitutivnega promotorja povečala ekspresijo genov iz PcpcG2, vendar se je povečalo tudi puščanje tega promotorja. Puščanje promotorja in nizko razmerje ON/OFF (indukcija/brez indukcije) sta negativno vplivala na proizvodnjo alkoholov. Da bi se izognili puščanju promotorja, se mora gen ccaR izražati le takrat, kadar celice obsevamo z zeleno svetlobo. Zato so v vektor vnesli dodaten gen ccaR pod promotor PcpcG2 [3].

Vektor pKT-GSS-KDC-ADH-CcaR je bil konstruiran z vstavitvijo dodatnega gena ccaR z zaporedjem podobnim Shine Dalgarnovem (SD) za genom adh v vektorju pKT-GSS-KDC-ADH. S tem vektorjem so transformirali sev PCC 6803ΔGSS. Pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo je sev proizvedel 238 mg/L izobutanola in 75 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh. Pri obsevanju z rdečo svetlobo pa sta se izobutanol in 3-metil-1-butanol pojavila samo v sledovih. Dodatna ekspresija gena ccaR je izboljšala proizvodnjo izobutanola in 3-metil-1-butanola za 1,5-krat oziroma 1,4-krat [3].

== ZAKLJUČEK ==
Rast svetovnega prebivalstva in povečano povpraševanje po fosilnih gorivih sta povzročila potrebo po razvoju trajnostnih virov energije. Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za proizvodnjo trajnostnih biogoriv, saj lahko s fotosintezo pretvarjajo atmosferski CO2 v kemične spojine. Izobutanol je pomemben kot alternativno gorivo, saj ima visoko vsebnost energije in nižji parni tlak kot etanol. V tem kontekstu so znanstveniki razvili s svetlobo inducibilni genski ekspresijski sistem v cianobakteriji Synechocystis sp. PCC 6803 za proizvodnjo izobutanola in 3-metil-1-butanola. Sistem se je izkazal za uspešnega za sintezo teh alkoholov pod vplivom zelene svetlobe.

== Viri ==
[1] T. J. Johnson, J. L. Gibbons, L. Gu, R. Zhou, and W. R. Gibbons, “Molecular genetic improvements of cyanobacteria to enhance the industrial potential of the microbe: A review,” Biotechnol. Prog., vol. 32, no. 6, pp. 1357–1371, 2016, doi: 10.1002/btpr.2358.

[2] R. Miao, X. Liu, E. Englund, P. Lindberg, and P. Lindblad, “Isobutanol production in Synechocystis PCC 6803 using heterologous and endogenous alcohol dehydrogenases,” Metab. Eng. Commun., vol. 5, no. June, pp. 45–53, 2017, doi: 10.1016/j.meteno.2017.07.003.

[3] S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.

[4] S. Kobayashi et al., “Application of an engineered chromatic acclimation sensor for red-light-regulated gene expression in cyanobacteria,” Algal Res., vol. 44, no. October, p. 101691, 2019, doi: 10.1016/j.algal.2019.101691.

[5] A. Satta, L. Esquirol, and B. E. Ebert, “Current Metabolic Engineering Strategies for Photosynthetic Bioproduction in Cyanobacteria,” Microorganisms, vol. 11, no. 2, pp. 1–34, 2023, doi: 10.3390/microorganisms11020455.

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-29T20:07:19Z

Špela Deučman: /* MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1186/s12934-021-01732-x S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.]

== UVOD ==
Hitra rast svetovnega prebivalstva skupaj z naraščajočim povpraševanjem po fosilnih gorivih in povečanimi emisijami CO2 je povzročila večjo potrebo po razvoju trajnostnih virov energije in kemikalij iz obnovljivih virov. V zadnjih desetletjih je bilo veliko raziskav osredotočenih na prepoznavanje trajnostnih metod za proizvodnjo obnovljivih biogoriv [1], [2].

Izobutanol je pomembna spojina kot alternativno gorivo zaradi visoke vsebnosti energije (98 % vsebnosti energije v bencinu) in nižjega parnega tlaka v primerjavi z etanolom. Poleg tega ima izobutanol nižjo vsebnost O2 in nižjo topnost v vodi kot etanol, kar pomeni, da je mogoče v bencin vmešati več izobutanola, medtem pa imamo še vedno nizko vsebnost O2 v končnem izdelku [2].

Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za sintezo izobutanola zaradi svoje sposobnosti, da s fotosintezo pretvarjajo CO2 neposredno v kemične spojine z dodano vrednostjo. S cianobakterijami lahko proizvajamo etanol, izobutiraldehid, izobutanol, 1-butanol, sukcinat, 2,3-butandiol, terpenoide, klorofile, maščobne kisline, sladkor in aminokisline [3]–[5].

Zmožne so tudi vezati atmosferski dušik in zato zavzemajo pomembno vlogo v dušikovem ciklu. Cianobakterije, ki vežejo N2, so še posebej zanimive za raziskovalce, ki se ukvarjajo z razvojem industrijskih sevov za proizvodnjo »zelenih« kemikalij, kot so limonen, farnezen, linalol in mircen [1].

== SINTEZA IZOBUTANOLA IN 3-METIL-1-IZOBUTANOLA V CIANOBAKTERIJAH ==

Izobutanol in 3-metil-1-butanol sta pomembna alkohola, saj lahko služita kot alternativa bencinu in ju je mogoče sintetizirati po poti biosinteze aminokislin v cianobakterijah. Najpogostejša sintezna pot za biosintezo izobutanola je pot 2-keto kislin, ki si deli prekurzor (α-ketoizovalerat) s sintezno potjo biosinteze L-valina. 3-metil-1-butanol si deli prekurzor (2-ketoizokaproat) s sintezno potjo biosinteze L-levcina [2].

Biosintezna pot izobutanola vsebuje več encimov. Kodirajo jih geni alsS (''Bacillus subtilis''), ilvC (''E. coli''), ilvD (''E. coli''), ketokislinska dekarboksilaza (kdc) (''Lactococcus lactis'') in alkoholna dehidrogenaza (adh) (''E. coli'') [2], [3].

α-ketoizovalerat dekarboksilaza (Kivd oz. kdc) iz ''L. lactis'', ki dekarboksilira α-keto kisline v aldehide, je pomemben encim v poti 2-keto kislin in je bil uporabljen pri ''E. coli'', ''S.cerevisiae'', ''Corynebacterium glutamicum'' in cianobakterijah za proizvodnjo izobutiraldehida in izobutanola. KDC je homotetramer, njegova optimalna aktivnost je bila opažena pri 45 °C (pH 6,5) in ima visoko specifičnost za α-ketoizovalerat. Poleg tega je bil Kivd oz. kdc zasnovan za uporabo večjega substrata za proizvodnjo alkoholov z daljšo verigo. Cianobakterije so pritegnile pozornost raziskovalcev zaradi zmožnosti izvajanja fotosinteze, in posledične porabe atmosferskega CO2, ter nizke potrebe po hranilih, visoke tolerance na različna okolja in nezahtevnega genskega inženiringa [2].

== MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH ==

Večina pristopov sintezne biologije, ki delujejo v heterotrofnih organizmih, kot je ''E. coli'', ni mogoče uporabiti v cianobakterijah. Na primer, promotorji in RBS, ki močno modulirajo izražanje genov v ''E. coli'', ne delujejo dobro v cianobakterijah. Če se osredotočimo samo na povečanje izražanja genov s promotorskim inženiringom, opazimo, da se pri cianobakterijah uporabljajo močni konstitutivni nativni promotorji, sintetični inducibilni promotorji, kemično inducibilni promotorji in okoljsko inducibilni promotorji [5].

Do danes je bilo opisanihh le nekaj močnih konstitutivnih promotorjev, ki pa so pogosto omejeni na samo nekatere vrste in moč izražanja genov niha s cirkadianim ritmom. Sintetični inducibilni promotorji delujejo v različnih vrstah cianobakterij [5]. Kemično inducibilni promotorji, npr. arabinozni inducibilni promotor, so najpogosteje uporabljeni promotorji, vendar pa niso primerni za velike industrijske bioprocese [3], [5]. Uporaba zunanjih kemičnih induktorjev ni zaželena, saj poveča proizvodne stroške in predstavlja tveganje za okolje, na primer zaradi uporabe težkih kovin. Slednji problem lahko rešimo z uporabo promotorjev, na katere vplivajo okoljski oz. fizični signali kot sta npr. kisik in svetloba.

Znanstveniki so ustvarili s temo inducibilni genski ekspresijski sistem, ki temelji na dvokomponentnem sistemu EnvZ/OmpR iz ''E. coli''. Prav tako so izkoristili prisotnost fikobilisoma v cianobakterijah. Ustvarili so na svetlobo občutljiv genski ekspresijski sistem, ki je sestavljen iz senzorja za zeleno svetlobo CcaS, efektorskega elementa CcaR ter promotor PcpcG2, ki regulira ekspresijo gena za linker cpcG2 fikobilisoma. Na podlagi sistema za preklop iz aerobnega v anaerobni metabolizem (FNR) iz ''E. coli'' so ustvarili prilagojen sistem v sevu Syn6803 cianobakterij. Z uporabo tega sistema in promotorja PFNR o ustvarili genski ekspresijski sistem, ki se odziva na prisotnost kisika [5].

== VPLIV GENSKEGA EKSPRESIJSKEGA SISTEMA CcS/CcR NA EKSPRESIJO IZOBUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST ==

V izbranem članku so avtorji želeli pokazati, da s svetlobo inducibilnim promotorjem lahko pridobimo večjo količino izobutanola in 3-metil-1-butanola in da so posledično bolj ekonomični ter obvladljivi genetski ekspresijski sistemi kot sistemi s kemikalijami inducibilnimi promotorji. Poleg tega so tudi vključili vpliv integracije tega genskega ekspresijskega sistema na rast cianobakterij [3].

Za gostiteljski organizem so izbrali cianobakterijo ''Synechocystis sp.'' PCC 6803. V ''E. coli'' K-12 so pripravili 3 različne konstrukte oz. vektorje z inserti [3].

Kot osnovo so uporabili vektor pKT-GSS. Prvi konstrukt so poimenovali pKT-GSS-KDC-ADH. Gena kdc in adh sta bila vstavljena za promotorjem PcpcG2. Sev PCC 6803 ima integriran sistem CcS/CcR. Ta sistem lahko inducira izražanje eksogenih genov iz promotorja PcpcG2 kot odziv na radiacijo z zeleno svetlobo in zavira izražanje genov kot odziv na radiacijo z rdečo svetlobo. V osnovni vektor so vstavili dva gena, potrebna za proizvodnjo alkoholov, in sicer kdc, ki vsebuje zapis za ketokislinsko dekarboksilazo (KDC) in je pridobljen iz ''L. lactis'', ter slr1192, ki vsbuje zapis za alkoholno dehidrogenazo (ADH) in je pridobljen iz PCC 6803. Uporaba kodonov med sevom ''E. coli'' K-12 in PCC 6803 je podobna, zato ni bila potrebna optimizacija rabe kodonov za gen kdc. Pred zapisoma genov kdc in adh so vstavili sekvenco podobno Shine-Dalgarnovem zapordju iz gena cpcB organizma ''Synechococcus sp.'' PCC 7002. Ekspresija genov kdc in adh je bila inducirana z obsevanjem z zeleno svetlobo. Sinteza izobutanola in 3-metil-1-butanola je bila uspešna [3].

Rast, transkripcija in proizvodnjo izobutanola ter 3-metil-1-butanola so določili z gojenjem celic PCC 6803ΔGSS. To je sev z delecijo genomskega sistema CcaS/CcaR in PcpcG2. V ta sev so vnesli vektor pKT-GSS-KDC-ADH in nato celice obsevali z rdečo in zeleno svetlobo (induktivni pogoji: 520 nm, 660 nm; 60 μmol/m2 s) ali samo z rdečo svetlobo (660 nm, 30 μmol/m2 s). Rdeča svetloba je potrebna za fotosintezo in ni znatno vplivala na ekspresijo genov pod promotorjem PcpcG2. Zaradi slednjega razloga so celice obsevali tako z zeleno kot rdečo svetlobo. Spremembe v intenzivnosti in/ali valovni dolžini svetlobe lahko aktivirajo metabolizem gostitelja, rast celic in bioprodukcijo. Čeprav je bila za indukcijo uporabljena dvakrat večja intenziteta svetlobe, so pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo opazili rahlo zakasnitev rasti celic v primerjavi z obsevanjem z rdečo svetlobo. Zakasnitev v rasti celic so pripisali integraciji genov kdc in adh v genom. Slednje ni znatno vplivalo na produkcijo alkoholov [3].

Opazovali so tudi transkripcijsko aktivnost celic. Pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo so v celicah PCC 6803ΔGSS z pKT-GSS-KDC-ADH opazili petkrat višjo raven transkripcije gena kdc v primerjavi s tisto pri osvetlitvi z rdečo svetlobo pri 4 urah. Slednje ponovno potrdi njihovo domnevo [3].

Titri proizvodnje izobutanola in 3-metil-1-butanola so se povečevali do petega dne pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo ter dosegli 166 mg/L izobutanola in 51 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh. Pri obsevanju z rdečo svetlobo pa je sev PCC 6803ΔGSS z pKT-GSS-KDC-ADH proizvedel samo 19 mg/Lizobutanola in 9 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh [3].

Ustvarili so tudi kontrolni sev. Ta sev je imel zapise za gena kdc in adh pod nadzorom močnega konstitutivnega promotorja Ptrc-core. Koncentracija izobutanola, proizvedena v kontrolnem sevu, je znašala približno 5 mg/L, koncentracija 3-metil-1-butanola pa je bila pod mejo zaznave. V primerjavi s sevom s sistemom CcaS/CcaR je kontrolni sev počasno rastel [3].

Raziskovalci so želeli nadaljnjo povečati proizvodnjo izobutanola in 3-metil-1-butanola, kar je pomenilo, da so morali povečati nivoje izražanja kdc in adh iz PcpcG2. Njihove prejšnje raziskave so pokazale, da je dodatna ekspresija gena ccaR z uporabo konstitutivnega promotorja povečala ekspresijo genov iz PcpcG2, vendar se je povečalo tudi puščanje tega promotorja. Puščanje promotorja in nizko razmerje ON/OFF (indukcija/brez indukcije) sta negativno vplivala na proizvodnjo alkoholov. Da bi se izognili puščanju promotorja, se mora gen ccaR izražati le takrat, kadar celice obsevamo z zeleno svetlobo. Zato so v vektor vnesli dodaten gen ccaR pod promotor PcpcG2 [3].

Vektor pKT-GSS-KDC-ADH-CcaR je bil konstruiran z vstavitvijo dodatnega gena ccaR z zaporedjem podobnim Shine Dalgarnovem (SD) za genom adh v vektorju pKT-GSS-KDC-ADH. S tem vektorjem so transformirali sev PCC 6803ΔGSS. Pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo je sev proizvedel 238 mg/L izobutanola in 75 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh. Pri obsevanju z rdečo svetlobo pa sta se izobutanol in 3-metil-1-butanol pojavila samo v sledovih. Dodatna ekspresija gena ccaR je izboljšala proizvodnjo izobutanola in 3-metil-1-butanola za 1,5-krat oziroma 1,4-krat [3].

== ZAKLJUČEK ==
Rast svetovnega prebivalstva in povečano povpraševanje po fosilnih gorivih sta povzročila potrebo po razvoju trajnostnih virov energije. Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za proizvodnjo trajnostnih biogoriv, saj lahko s fotosintezo pretvarjajo atmosferski CO2 v kemične spojine. Izobutanol je pomemben kot alternativno gorivo, saj ima visoko vsebnost energije in nižji parni tlak kot etanol. V tem kontekstu so znanstveniki razvili s svetlobo inducibilni genski ekspresijski sistem v cianobakteriji Synechocystis sp. PCC 6803 za proizvodnjo izobutanola in 3-metil-1-butanola. Sistem se je izkazal za uspešnega za sintezo teh alkoholov pod vplivom zelene svetlobe.

== Viri ==
[1] T. J. Johnson, J. L. Gibbons, L. Gu, R. Zhou, and W. R. Gibbons, “Molecular genetic improvements of cyanobacteria to enhance the industrial potential of the microbe: A review,” Biotechnol. Prog., vol. 32, no. 6, pp. 1357–1371, 2016, doi: 10.1002/btpr.2358.

[2] R. Miao, X. Liu, E. Englund, P. Lindberg, and P. Lindblad, “Isobutanol production in Synechocystis PCC 6803 using heterologous and endogenous alcohol dehydrogenases,” Metab. Eng. Commun., vol. 5, no. June, pp. 45–53, 2017, doi: 10.1016/j.meteno.2017.07.003.

[3] S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.

[4] S. Kobayashi et al., “Application of an engineered chromatic acclimation sensor for red-light-regulated gene expression in cyanobacteria,” Algal Res., vol. 44, no. October, p. 101691, 2019, doi: 10.1016/j.algal.2019.101691.

[5] A. Satta, L. Esquirol, and B. E. Ebert, “Current Metabolic Engineering Strategies for Photosynthetic Bioproduction in Cyanobacteria,” Microorganisms, vol. 11, no. 2, pp. 1–34, 2023, doi: 10.3390/microorganisms11020455.

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-29T20:05:22Z

Špela Deučman:

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1186/s12934-021-01732-x S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.]

== UVOD ==
Hitra rast svetovnega prebivalstva skupaj z naraščajočim povpraševanjem po fosilnih gorivih in povečanimi emisijami CO2 je povzročila večjo potrebo po razvoju trajnostnih virov energije in kemikalij iz obnovljivih virov. V zadnjih desetletjih je bilo veliko raziskav osredotočenih na prepoznavanje trajnostnih metod za proizvodnjo obnovljivih biogoriv [1], [2].

Izobutanol je pomembna spojina kot alternativno gorivo zaradi visoke vsebnosti energije (98 % vsebnosti energije v bencinu) in nižjega parnega tlaka v primerjavi z etanolom. Poleg tega ima izobutanol nižjo vsebnost O2 in nižjo topnost v vodi kot etanol, kar pomeni, da je mogoče v bencin vmešati več izobutanola, medtem pa imamo še vedno nizko vsebnost O2 v končnem izdelku [2].

Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za sintezo izobutanola zaradi svoje sposobnosti, da s fotosintezo pretvarjajo CO2 neposredno v kemične spojine z dodano vrednostjo. S cianobakterijami lahko proizvajamo etanol, izobutiraldehid, izobutanol, 1-butanol, sukcinat, 2,3-butandiol, terpenoide, klorofile, maščobne kisline, sladkor in aminokisline [3]–[5].

Zmožne so tudi vezati atmosferski dušik in zato zavzemajo pomembno vlogo v dušikovem ciklu. Cianobakterije, ki vežejo N2, so še posebej zanimive za raziskovalce, ki se ukvarjajo z razvojem industrijskih sevov za proizvodnjo »zelenih« kemikalij, kot so limonen, farnezen, linalol in mircen [1].

== SINTEZA IZOBUTANOLA IN 3-METIL-1-IZOBUTANOLA V CIANOBAKTERIJAH ==

Izobutanol in 3-metil-1-butanol sta pomembna alkohola, saj lahko služita kot alternativa bencinu in ju je mogoče sintetizirati po poti biosinteze aminokislin v cianobakterijah. Najpogostejša sintezna pot za biosintezo izobutanola je pot 2-keto kislin, ki si deli prekurzor (α-ketoizovalerat) s sintezno potjo biosinteze L-valina. 3-metil-1-butanol si deli prekurzor (2-ketoizokaproat) s sintezno potjo biosinteze L-levcina [2].

Biosintezna pot izobutanola vsebuje več encimov. Kodirajo jih geni alsS (''Bacillus subtilis''), ilvC (''E. coli''), ilvD (''E. coli''), ketokislinska dekarboksilaza (kdc) (''Lactococcus lactis'') in alkoholna dehidrogenaza (adh) (''E. coli'') [2], [3].

α-ketoizovalerat dekarboksilaza (Kivd oz. kdc) iz ''L. lactis'', ki dekarboksilira α-keto kisline v aldehide, je pomemben encim v poti 2-keto kislin in je bil uporabljen pri ''E. coli'', ''S.cerevisiae'', ''Corynebacterium glutamicum'' in cianobakterijah za proizvodnjo izobutiraldehida in izobutanola. KDC je homotetramer, njegova optimalna aktivnost je bila opažena pri 45 °C (pH 6,5) in ima visoko specifičnost za α-ketoizovalerat. Poleg tega je bil Kivd oz. kdc zasnovan za uporabo večjega substrata za proizvodnjo alkoholov z daljšo verigo. Cianobakterije so pritegnile pozornost raziskovalcev zaradi zmožnosti izvajanja fotosinteze, in posledične porabe atmosferskega CO2, ter nizke potrebe po hranilih, visoke tolerance na različna okolja in nezahtevnega genskega inženiringa [2].

== MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH ==

Večina pristopov sintezne biologije, ki delujejo v heterotrofnih organizmih, kot je ''E. coli'', ni mogoče uporabiti v cianobakterijah. Na primer, promotorji in RBS, ki močno modulirajo izražanje genov v ''E. coli'', ne delujejo dobro v cianobakterijah. Če se osredotočimo samo na povečanje izražanja genov s promotorskim inženiringom, opazimo, da se pri cianobakterijah uporabljajo močni konstitutivni nativni promotorji, sintetični inducibilni promotorji, kemično inducibilni promotorji in okoljsko inducibilni promotorji [5].

Do danes je bilo opisanihh le nekaj močnih konstitutivnih promotorjev, ki pa so pogosto omejeni na samo nekatere vrste in moč izražanja genov niha s cirkadianim ritmom. Sintetični inducibilni promotorji delujejo v različnih vrstah cianobakterij [5]. Kemično inducibilni promotorji, npr. arabinozni inducibilni promotor, so najpogosteje uporabljeni promotorji, vendar pa niso primerni za velike industrijske bioprocese [3], [5]. Uporaba zunanjih kemičnih induktorjev ni zaželena, saj poveča proizvodne stroške in predstavlja tveganje za okolje, na primer zaradi uporabe težkih kovin. Slednji problem lahko rešimo z uporabo promotorjev, na katere vplivajo okoljski oz. fizični signali kot sta npr. kisik in svetloba.

Znanstveniki so ustvarili s temo inducibilni genski ekspresijski sistem, ki temelji na dvokomponentnem sistemu EnvZ/OmpR iz ''E. coli''. Prav tako so izkoristili prisotnost fikobilisoma v cianobakterijah. Ustvarili so na svetlobo občutljiv genski ekspresijski sistem, ki je sestavljen iz senzorja za zeleno svetlobo CcS, efektorskega elementa CcR ter promotor PcpcG2, ki regulira ekspresijo gena za linker cpcG2 fikobilisoma. Na podlagi sistema za preklop iz aerobnega v anaerobni metabolizem (FNR) iz ''E. coli'' so ustvarili prilagojen sistem v sevu Syn6803 cianobakterij. Z uporabo tega sistema in promotorja PFNR o ustvarili genski ekspresijski sistem, ki se odziva na prisotnost kisika [5].

== VPLIV GENSKEGA EKSPRESIJSKEGA SISTEMA CcS/CcR NA EKSPRESIJO IZOBUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST ==

V izbranem članku so avtorji želeli pokazati, da s svetlobo inducibilnim promotorjem lahko pridobimo večjo količino izobutanola in 3-metil-1-butanola in da so posledično bolj ekonomični ter obvladljivi genetski ekspresijski sistemi kot sistemi s kemikalijami inducibilnimi promotorji. Poleg tega so tudi vključili vpliv integracije tega genskega ekspresijskega sistema na rast cianobakterij [3].

Za gostiteljski organizem so izbrali cianobakterijo ''Synechocystis sp.'' PCC 6803. V ''E. coli'' K-12 so pripravili 3 različne konstrukte oz. vektorje z inserti [3].

Kot osnovo so uporabili vektor pKT-GSS. Prvi konstrukt so poimenovali pKT-GSS-KDC-ADH. Gena kdc in adh sta bila vstavljena za promotorjem PcpcG2. Sev PCC 6803 ima integriran sistem CcS/CcR. Ta sistem lahko inducira izražanje eksogenih genov iz promotorja PcpcG2 kot odziv na radiacijo z zeleno svetlobo in zavira izražanje genov kot odziv na radiacijo z rdečo svetlobo. V osnovni vektor so vstavili dva gena, potrebna za proizvodnjo alkoholov, in sicer kdc, ki vsebuje zapis za ketokislinsko dekarboksilazo (KDC) in je pridobljen iz ''L. lactis'', ter slr1192, ki vsbuje zapis za alkoholno dehidrogenazo (ADH) in je pridobljen iz PCC 6803. Uporaba kodonov med sevom ''E. coli'' K-12 in PCC 6803 je podobna, zato ni bila potrebna optimizacija rabe kodonov za gen kdc. Pred zapisoma genov kdc in adh so vstavili sekvenco podobno Shine-Dalgarnovem zapordju iz gena cpcB organizma ''Synechococcus sp.'' PCC 7002. Ekspresija genov kdc in adh je bila inducirana z obsevanjem z zeleno svetlobo. Sinteza izobutanola in 3-metil-1-butanola je bila uspešna [3].

Rast, transkripcija in proizvodnjo izobutanola ter 3-metil-1-butanola so določili z gojenjem celic PCC 6803ΔGSS. To je sev z delecijo genomskega sistema CcaS/CcaR in PcpcG2. V ta sev so vnesli vektor pKT-GSS-KDC-ADH in nato celice obsevali z rdečo in zeleno svetlobo (induktivni pogoji: 520 nm, 660 nm; 60 μmol/m2 s) ali samo z rdečo svetlobo (660 nm, 30 μmol/m2 s). Rdeča svetloba je potrebna za fotosintezo in ni znatno vplivala na ekspresijo genov pod promotorjem PcpcG2. Zaradi slednjega razloga so celice obsevali tako z zeleno kot rdečo svetlobo. Spremembe v intenzivnosti in/ali valovni dolžini svetlobe lahko aktivirajo metabolizem gostitelja, rast celic in bioprodukcijo. Čeprav je bila za indukcijo uporabljena dvakrat večja intenziteta svetlobe, so pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo opazili rahlo zakasnitev rasti celic v primerjavi z obsevanjem z rdečo svetlobo. Zakasnitev v rasti celic so pripisali integraciji genov kdc in adh v genom. Slednje ni znatno vplivalo na produkcijo alkoholov [3].

Opazovali so tudi transkripcijsko aktivnost celic. Pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo so v celicah PCC 6803ΔGSS z pKT-GSS-KDC-ADH opazili petkrat višjo raven transkripcije gena kdc v primerjavi s tisto pri osvetlitvi z rdečo svetlobo pri 4 urah. Slednje ponovno potrdi njihovo domnevo [3].

Titri proizvodnje izobutanola in 3-metil-1-butanola so se povečevali do petega dne pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo ter dosegli 166 mg/L izobutanola in 51 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh. Pri obsevanju z rdečo svetlobo pa je sev PCC 6803ΔGSS z pKT-GSS-KDC-ADH proizvedel samo 19 mg/Lizobutanola in 9 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh [3].

Ustvarili so tudi kontrolni sev. Ta sev je imel zapise za gena kdc in adh pod nadzorom močnega konstitutivnega promotorja Ptrc-core. Koncentracija izobutanola, proizvedena v kontrolnem sevu, je znašala približno 5 mg/L, koncentracija 3-metil-1-butanola pa je bila pod mejo zaznave. V primerjavi s sevom s sistemom CcaS/CcaR je kontrolni sev počasno rastel [3].

Raziskovalci so želeli nadaljnjo povečati proizvodnjo izobutanola in 3-metil-1-butanola, kar je pomenilo, da so morali povečati nivoje izražanja kdc in adh iz PcpcG2. Njihove prejšnje raziskave so pokazale, da je dodatna ekspresija gena ccaR z uporabo konstitutivnega promotorja povečala ekspresijo genov iz PcpcG2, vendar se je povečalo tudi puščanje tega promotorja. Puščanje promotorja in nizko razmerje ON/OFF (indukcija/brez indukcije) sta negativno vplivala na proizvodnjo alkoholov. Da bi se izognili puščanju promotorja, se mora gen ccaR izražati le takrat, kadar celice obsevamo z zeleno svetlobo. Zato so v vektor vnesli dodaten gen ccaR pod promotor PcpcG2 [3].

Vektor pKT-GSS-KDC-ADH-CcaR je bil konstruiran z vstavitvijo dodatnega gena ccaR z zaporedjem podobnim Shine Dalgarnovem (SD) za genom adh v vektorju pKT-GSS-KDC-ADH. S tem vektorjem so transformirali sev PCC 6803ΔGSS. Pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo je sev proizvedel 238 mg/L izobutanola in 75 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh. Pri obsevanju z rdečo svetlobo pa sta se izobutanol in 3-metil-1-butanol pojavila samo v sledovih. Dodatna ekspresija gena ccaR je izboljšala proizvodnjo izobutanola in 3-metil-1-butanola za 1,5-krat oziroma 1,4-krat [3].

== ZAKLJUČEK ==
Rast svetovnega prebivalstva in povečano povpraševanje po fosilnih gorivih sta povzročila potrebo po razvoju trajnostnih virov energije. Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za proizvodnjo trajnostnih biogoriv, saj lahko s fotosintezo pretvarjajo atmosferski CO2 v kemične spojine. Izobutanol je pomemben kot alternativno gorivo, saj ima visoko vsebnost energije in nižji parni tlak kot etanol. V tem kontekstu so znanstveniki razvili s svetlobo inducibilni genski ekspresijski sistem v cianobakteriji Synechocystis sp. PCC 6803 za proizvodnjo izobutanola in 3-metil-1-butanola. Sistem se je izkazal za uspešnega za sintezo teh alkoholov pod vplivom zelene svetlobe.

== Viri ==
[1] T. J. Johnson, J. L. Gibbons, L. Gu, R. Zhou, and W. R. Gibbons, “Molecular genetic improvements of cyanobacteria to enhance the industrial potential of the microbe: A review,” Biotechnol. Prog., vol. 32, no. 6, pp. 1357–1371, 2016, doi: 10.1002/btpr.2358.

[2] R. Miao, X. Liu, E. Englund, P. Lindberg, and P. Lindblad, “Isobutanol production in Synechocystis PCC 6803 using heterologous and endogenous alcohol dehydrogenases,” Metab. Eng. Commun., vol. 5, no. June, pp. 45–53, 2017, doi: 10.1016/j.meteno.2017.07.003.

[3] S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.

[4] S. Kobayashi et al., “Application of an engineered chromatic acclimation sensor for red-light-regulated gene expression in cyanobacteria,” Algal Res., vol. 44, no. October, p. 101691, 2019, doi: 10.1016/j.algal.2019.101691.

[5] A. Satta, L. Esquirol, and B. E. Ebert, “Current Metabolic Engineering Strategies for Photosynthetic Bioproduction in Cyanobacteria,” Microorganisms, vol. 11, no. 2, pp. 1–34, 2023, doi: 10.3390/microorganisms11020455.

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-29T16:30:53Z

Špela Deučman: /* ZAKLJUČEK */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1186/s12934-021-01732-x S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.]

== UVOD ==
Hitra rast svetovnega prebivalstva skupaj z naraščajočim povpraševanjem po fosilnih gorivih in povečanimi emisijami CO2 je povzročila večjo potrebo po razvoju trajnostnih virov energije in kemikalij iz obnovljivih virov. V zadnjih desetletjih je bilo veliko raziskav osredotočenih na prepoznavanje trajnostnih metod za proizvodnjo obnovljivih biogoriv [1], [2].

Izobutanol je pomembna spojina kot alternativno gorivo zaradi visoke vsebnosti energije (98 % vsebnosti energije v bencinu) in nižjega parnega tlaka v primerjavi z etanolom. Poleg tega ima izobutanol nižjo vsebnost O2 in nižjo topnost v vodi kot etanol, kar pomeni, da je mogoče v bencin vmešati več izobutanola, medtem pa imamo še vedno nizko vsebnost O2 v končnem izdelku [2].

Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za sintezo izobutanola zaradi svoje sposobnosti, da s fotosintezo pretvarjajo CO2 neposredno v kemične spojine z dodano vrednostjo. S cianobakterijami lahko proizvajamo etanol, izobutiraldehid, izobutanol, 1-butanol, sukcinat, 2,3-butandiol, terpenoide, klorofile, maščobne kisline, sladkor in aminokisline [3]–[5].

Zmožne so tudi vezati atmosferski dušik in zato zavzemajo pomembno vlogo v dušikovem ciklu. Cianobakterije, ki vežejo N2, so še posebej zanimive za raziskovalce, ki se ukvarjajo z razvojem industrijskih sevov za proizvodnjo »zelenih« kemikalij, kot so limonen, farnezen, linalol in mircen [1].

== SINTEZA IZOBUTANOLA IN 3-METIL-1-IZOBUTANOLA V CIANOBAKTERIJAH ==

Izobutanol in 3-metil-1-butanol sta pomembna alkohola, saj lahko služita kot alternativa bencinu in ju je mogoče sintetizirati po poti biosinteze aminokislin v cianobakterijah. Najpogostejša sintezna pot za biosintezo izobutanola je pot 2-keto kislin, ki si deli prekurzor (α-ketoizovalerat) s sintezno potjo biosinteze L-valina. 3-metil-1-butanol si deli prekurzor (2-ketoizokaproat) s sintezno potjo biosinteze L-levcina [2].

Biosintezna pot izobutanola vsebuje več encimov. Kodirajo jih geni alsS (''Bacillus subtilis''), ilvC (''E. coli''), ilvD (''E. coli''), ketokislinska dekarboksilaza (kdc) (''Lactococcus lactis'') in alkoholna dehidrogenaza (adh) (''E. coli'') [2], [3].

α-ketoizovalerat dekarboksilaza (Kivd oz. kdc) iz ''L. lactis'', ki dekarboksilira α-keto kisline v aldehide, je pomemben encim v poti 2-keto kislin in je bil uporabljen pri ''E. coli'', ''S.cerevisiae'', ''Corynebacterium glutamicum'' in cianobakterijah za proizvodnjo izobutiraldehida in izobutanola. KDC je homotetramer, njegova optimalna aktivnost je bila opažena pri 45 °C (pH 6,5) in ima visoko specifičnost za α-ketoizovalerat. Poleg tega je bil Kivd oz. kdc zasnovan za uporabo večjega substrata za proizvodnjo alkoholov z daljšo verigo. Cianobakterije so pritegnile pozornost raziskovalcev zaradi zmožnosti izvajanja fotosinteze, in posledične porabe atmosferskega CO2, ter nizke potrebe po hranilih, visoke tolerance na različna okolja in nezahtevnega genskega inženiringa [2].

== MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH ==

Večina pristopov sintezne biologije, ki delujejo v heterotrofnih organizmih, kot je ''E. coli'', ni mogoče uporabiti v cianobakterijah. Na primer, promotorji in RBS, ki močno modulirajo izražanje genov v ''E. coli'', ne delujejo dobro v cianobakterijah. Če se osredotočimo samo na povečanje izražanja genov s promotorskim inženiringom, opazimo, da se pri cianobakterijah uporabljajo močni konstitutivni nativni promotorji, sintetični inducibilni promotorji, kemično inducibilni promotorji in okoljsko inducibilni promotorji [5].

Do danes je bilo opisanihh le nekaj močnih konstitutivnih promotorjev, ki pa so pogosto omejeni na samo nekatere vrste in moč izražanja genov niha s cirkadianim ritmom. Sintetični inducibilni promotorji delujejo v različnih vrstah cianobakterij [5]. Kemično inducibilni promotorji, npr. arabinozni inducibilni promotor, so najpogosteje uporabljeni promotorji, vendar pa niso primerni za velike industrijske bioprocese [3], [5]. Uporaba zunanjih kemičnih induktorjev ni zaželena, saj poveča proizvodne stroške in predstavlja tveganje za okolje, na primer zaradi uporabe težkih kovin. Slednji problem lahko rešimo z uporabo promotorjev, na katere vplivajo okoljski oz. fizični signali kot sta npr. kisik in svetloba.

Znanstveniki so ustvarili s temo inducibilni genski ekspresijski sistem, ki temelji na dvokomponentnem sistemu EnvZ/OmpR iz ''E. coli''. Prav tako so izkoristili prisotnost fikobilisoma v cianobakterijah. Ustvarili so na svetlobo občutljiv genski ekspresijski sistem, ki je sestavljen iz senzorja za zeleno svetlobo CcS, efektorskega elementa CcR ter promotor PcpcG2, ki regulira ekspresijo gena za linker cpcG2 fikobilisoma. Na podlagi sistema za preklop iz aerobnega v anaerobni metabolizem (FNR) iz ''E. coli'' so ustvarili prilagojen sistem v sevu Syn6803 cianobakterij. Z uporabo tega sistema in promotorja PFNR o ustvarili genski ekspresijski sistem, ki se odziva na prisotnost kisika [5].

== VPLIV GENSKEGA EKSPRESIJSKEGA SISTEMA CcS/CcR NA EKSPRESIJO BUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST ==

V izbranem članku so avtorji želeli pokazati, da s svetlobo inducibilnim promotorjem lahko pridobimo večjo količino izobutanola in 3-metil-1-butanola in da so posledično bolj ekonomični ter obvladljivi genetski ekspresijski sistemi kot sistemi s kemikalijami inducibilnimi promotorji. Poleg tega so tudi vključili vpliv integracije tega genskega ekspresijskega sistema na rast cianobakterij [3].

Za gostiteljski organizem so izbrali cianobakterijo ''Synechocystis sp.'' PCC 6803. V ''E. coli'' K-12 so pripravili 3 različne konstrukte oz. vektorje z inserti [3].

Kot osnovo so uporabili vektor pKT-GSS. Prvi konstrukt so poimenovali pKT-GSS-KDC-ADH. Gena kdc in adh sta bila vstavljena za promotorjem PcpcG2. Sev PCC 6803 ima integriran sistem CcS/CcR. Ta sistem lahko inducira izražanje eksogenih genov iz promotorja PcpcG2 kot odziv na radiacijo z zeleno svetlobo in zavira izražanje genov kot odziv na radiacijo z rdečo svetlobo. V osnovni vektor so vstavili dva gena, potrebna za proizvodnjo alkoholov, in sicer kdc, ki vsebuje zapis za ketokislinsko dekarboksilazo (KDC) in je pridobljen iz ''L. lactis'', ter slr1192, ki vsbuje zapis za alkoholno dehidrogenazo (ADH) in je pridobljen iz PCC 6803. Uporaba kodonov med sevom ''E. coli'' K-12 in PCC 6803 je podobna, zato ni bila potrebna optimizacija rabe kodonov za gen kdc. Pred zapisoma genov kdc in adh so vstavili sekvenco podobno Shine-Dalgarnovem zapordju iz gena cpcB organizma ''Synechococcus sp.'' PCC 7002. Ekspresija genov kdc in adh je bila inducirana z obsevanjem z zeleno svetlobo. Sinteza izobutanola in 3-metil-1-butanola je bila uspešna [3].

Rast, transkripcija in proizvodnjo izobutanola ter 3-metil-1-butanola so določili z gojenjem celic PCC 6803ΔGSS. To je sev z delecijo genomskega sistema CcaS/CcaR in PcpcG2. V ta sev so vnesli vektor pKT-GSS-KDC-ADH in nato celice obsevali z rdečo in zeleno svetlobo (induktivni pogoji: 520 nm, 660 nm; 60 μmol/m2 s) ali samo z rdečo svetlobo (660 nm, 30 μmol/m2 s). Rdeča svetloba je potrebna za fotosintezo in ni znatno vplivala na ekspresijo genov pod promotorjem PcpcG2. Zaradi slednjega razloga so celice obsevali tako z zeleno kot rdečo svetlobo. Spremembe v intenzivnosti in/ali valovni dolžini svetlobe lahko aktivirajo metabolizem gostitelja, rast celic in bioprodukcijo. Čeprav je bila za indukcijo uporabljena dvakrat večja intenziteta svetlobe, so pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo opazili rahlo zakasnitev rasti celic v primerjavi z obsevanjem z rdečo svetlobo. Zakasnitev v rasti celic so pripisali integraciji genov kdc in adh v genom. Slednje ni znatno vplivalo na produkcijo alkoholov [3].

Opazovali so tudi transkripcijsko aktivnost celic. Pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo so v celicah PCC 6803ΔGSS z pKT-GSS-KDC-ADH opazili petkrat višjo raven transkripcije gena kdc v primerjavi s tisto pri osvetlitvi z rdečo svetlobo pri 4 urah. Slednje ponovno potrdi njihovo domnevo [3].

Titri proizvodnje izobutanola in 3-metil-1-butanola so se povečevali do petega dne pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo ter dosegli 166 mg/L izobutanola in 51 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh. Pri obsevanju z rdečo svetlobo pa je sev PCC 6803ΔGSS z pKT-GSS-KDC-ADH proizvedel samo 19 mg/Lizobutanola in 9 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh [3].

Ustvarili so tudi kontrolni sev. Ta sev je imel zapise za gena kdc in adh pod nadzorom močnega konstitutivnega promotorja Ptrc-core. Koncentracija izobutanola, proizvedena v kontrolnem sevu, je znašala približno 5 mg/L, koncentracija 3-metil-1-butanola pa je bila pod mejo zaznave. V primerjavi s sevom s sistemom CcaS/CcaR je kontrolni sev počasno rastel [3].

Raziskovalci so želeli nadaljnjo povečati proizvodnjo izobutanola in 3-metil-1-butanola, kar je pomenilo, da so morali povečati nivoje izražanja kdc in adh iz PcpcG2. Njihove prejšnje raziskave so pokazale, da je dodatna ekspresija gena ccaR z uporabo konstitutivnega promotorja povečala ekspresijo genov iz PcpcG2, vendar se je povečalo tudi puščanje tega promotorja. Puščanje promotorja in nizko razmerje ON/OFF (indukcija/brez indukcije) sta negativno vplivala na proizvodnjo alkoholov. Da bi se izognili puščanju promotorja, se mora gen ccaR izražati le takrat, kadar celice obsevamo z zeleno svetlobo. Zato so v vektor vnesli dodaten gen ccaR pod promotor PcpcG2 [3].

Vektor pKT-GSS-KDC-ADH-CcaR je bil konstruiran z vstavitvijo dodatnega gena ccaR z zaporedjem podobnim Shine Dalgarnovem (SD) za genom adh v vektorju pKT-GSS-KDC-ADH. S tem vektorjem so transformirali sev PCC 6803ΔGSS. Pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo je sev proizvedel 238 mg/L izobutanola in 75 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh. Pri obsevanju z rdečo svetlobo pa sta se izobutanol in 3-metil-1-butanol pojavila samo v sledovih. Dodatna ekspresija gena ccaR je izboljšala proizvodnjo izobutanola in 3-metil-1-butanola za 1,5-krat oziroma 1,4-krat [3].

== ZAKLJUČEK ==
Rast svetovnega prebivalstva in povečano povpraševanje po fosilnih gorivih sta povzročila potrebo po razvoju trajnostnih virov energije. Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za proizvodnjo trajnostnih biogoriv, saj lahko s fotosintezo pretvarjajo atmosferski CO2 v kemične spojine. Izobutanol je pomemben kot alternativno gorivo, saj ima visoko vsebnost energije in nižji parni tlak kot etanol. V tem kontekstu so znanstveniki razvili s svetlobo inducibilni genski ekspresijski sistem v cianobakteriji Synechocystis sp. PCC 6803 za proizvodnjo izobutanola in 3-metil-1-butanola. Sistem se je izkazal za uspešnega za sintezo teh alkoholov pod vplivom zelene svetlobe.

== Viri ==
[1] T. J. Johnson, J. L. Gibbons, L. Gu, R. Zhou, and W. R. Gibbons, “Molecular genetic improvements of cyanobacteria to enhance the industrial potential of the microbe: A review,” Biotechnol. Prog., vol. 32, no. 6, pp. 1357–1371, 2016, doi: 10.1002/btpr.2358.

[2] R. Miao, X. Liu, E. Englund, P. Lindberg, and P. Lindblad, “Isobutanol production in Synechocystis PCC 6803 using heterologous and endogenous alcohol dehydrogenases,” Metab. Eng. Commun., vol. 5, no. June, pp. 45–53, 2017, doi: 10.1016/j.meteno.2017.07.003.

[3] S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.

[4] S. Kobayashi et al., “Application of an engineered chromatic acclimation sensor for red-light-regulated gene expression in cyanobacteria,” Algal Res., vol. 44, no. October, p. 101691, 2019, doi: 10.1016/j.algal.2019.101691.

[5] A. Satta, L. Esquirol, and B. E. Ebert, “Current Metabolic Engineering Strategies for Photosynthetic Bioproduction in Cyanobacteria,” Microorganisms, vol. 11, no. 2, pp. 1–34, 2023, doi: 10.3390/microorganisms11020455.

Seminarji SB 2022/23

2023-05-29T16:14:07Z

Špela Deučman:

V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_tumor_ciljajočih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_dušikov(II)_oksid Priprava tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljeni_ribocim%2C_ki_signale_nativnih_RNA_pove%C5%BEe_z_ortogonalnimi_proteinskimi_izhodnimi_signali Razcepljeni ribocim, ki signale nativnih RNA poveže z ortogonalnimi proteinskimi izhodnimi signali] (Ajda Beltram)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_nadzor_%C5%A1tevila_plazmidov_v_celici_%28Tulip%29 Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)] (Gregor Strniša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Skupnostna_znanost_je_na%C4%8Drtovala_ribosome_s_koristnimi_fenotipi Skupnostna znanost je načrtovala ribosome s koristnimi fenotipi] (Tanja Gošnjak)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pristop_sintezne_biologije_za_načrtovanje_kandidata_za_cepivo_proti_delta_različici_SARSCoV2_je_razkril_prekinitev_favoriziranega_para_kodonov_kot_boljšo_strategijo_pred_uporabo_redkih_kodonov Pristop sintezne biologije za načrtovanje kandidata za cepivo proti delta različici SARS-CoV-2 je razkril prekinitev favoriziranega para kodonov kot boljšo strategijo pred uporabo redkih kodonov] (Stefanija Ivanova)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Dvosmerni_hibridni_eritritol_–_inducibilni_promotor_za_sintezno_biologijo_v_Yarrowia_lipolytica Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v ''Yarrowia lipolytica''] (Maša Andoljšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Utišanje_izražanja_genov_s_strukturo_definirano_zankasto_strukturo_male_nekodirajoče_RNA_s_programiranimi_regulatornimi_aktivnostmi Utišanje izražanja genov s strukturno definirano zankasto strukturo male nekodirajoče RNA s programiranimi regulatornimi aktivnostmi] (Nika Bedrač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izbolj%C5%A1anje_evolucijske_stabilnosti_obremenjujo%C4%8Dih_in_toksi%C4%8Dnih_funkcij_v_E.coli_z_diferenciacijskim_genetskim_vezjem_posredovanim_z_integrazo Izboljšanje evolucijske stabilnosti obremenjujočih in toksičnih funkcij v E.coli z diferenciacijskim genetskim vezjem posredovanim z integrazo] (Nika Banovšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_sintetična_mala_RNA%2C_ki_promovira_prekomerno_izražanje_proteinov_v_brezceličnem_sistemu Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brez-celičnem sistemu] (Ana Godeša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_kontrolo_hitrosti_rasti_celic%2C_ki_zmanj%C5%A1uje_breme_aktivacije_genov Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov] (Neža Ribnikar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biohibridne_membrane_za_odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_iz_vode Biohibridne membrane za odstranjevanje težkih kovin iz vode] (Tadej Uršič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_CIVT-SELEX_za_izbiro_aptamerov_kot_genskih_delov_za_regulacijo_genetskih_vezij_v_brezceličnem_sistemu Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu] (Klemen Kunej)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_Cyborg_bakterij_preko_intracelularne_hidrogelacije Inženiring Cyborg bakterij preko intracelularne hidrogelacije] (Eva Oven)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezovanje_celi%C4%8Dne_komunikacije_z_optogenetiko:_implementacija_svetlobno_inducibilnega_medceli%C4%8Dnega_sistema_v_kvasovkah Povezovanje celične komunikacije z optogenetiko: implementacija svetlobno inducibilnega medceličnega sistema v kvasovkah] (Nika Perko)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_sinteti%C4%8Dni_biomolekulski_kondenzati_za_nadzor_celi%C4%8Dnih_procesov Programabilni sintetični biomolekulski kondenzati za nadzor celičnih procesov] (Anja Konjc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljena_%28split%29_aminoacil-tRNA_sintetaza_za_indukcijo_supresije_stop_kodona Razcepljena (split) aminoacil-tRNA sintetaza za indukcijo supresije stop kodona] (Špela Štor)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/S_svetlobo_inducirana_produkcija_izobutanola_in_3-metil-1-butanola_z_modificiranimi_cianobakterijami S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola s cianobakterijami] (Špela Katarina Deučman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Raziskovanje_temperaturno_posredovane_replikacije_plazmida_kot_reverzibilnega_in_preklopljivega_proteinskega_ekspresijskega_sistema_v_Escherichia_coli Raziskovanje temperaturno posredovane replikacije plazmida kot reverzibilnega in preklopljivega proteinskega ekspresijskega sistema v ''Escherichia coli''] (Timotej Sotošek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konstrukcija_na_manitol_odzivnih_genetskih_stikal_na_osnovi_MtlR_škatle Konstrukcija na manitol odzivnih genetskih stikal na osnovi MtlR škatle] (Žan Fortuna)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetski_nadzor_bioprodukcije_beta-karotena_v_kvasovkah_v_%C5%A1tevilnih_laboratorijskih_proizvodnjah Optogenetski nadzor bioprodukcije beta-karotena v kvasovkah na številnih laboratorijskih skalah] (David Verdel)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NETLANTIS NETLANTIS] (Maša Gabrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BINANOX BINANOX] (Vivian Nemanič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CoBiota CoBiota] (Petra Sintič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sporadicate Sporadicate] (Gašper Možina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FISHERLY FISHERLY] (Lucija Pišek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/!MPACT !MPACT] (Jure Povšin)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AngelRoots AngelRoots] (Iva Matić)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-28T14:46:40Z

Špela Deučman: /* ZAKLJUČEK */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1186/s12934-021-01732-x S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.]

== UVOD ==
Hitra rast svetovnega prebivalstva skupaj z naraščajočim povpraševanjem po fosilnih gorivih in povečanimi emisijami CO2 je povzročila večjo potrebo po razvoju trajnostnih virov energije in kemikalij iz obnovljivih virov. V zadnjih desetletjih je bilo veliko raziskav osredotočenih na prepoznavanje trajnostnih metod za proizvodnjo obnovljivih biogoriv [1], [2].

Izobutanol je pomembna spojina kot alternativno gorivo zaradi visoke vsebnosti energije (98 % vsebnosti energije v bencinu) in nižjega parnega tlaka v primerjavi z etanolom. Poleg tega ima izobutanol nižjo vsebnost O2 in nižjo topnost v vodi kot etanol, kar pomeni, da je mogoče v bencin vmešati več izobutanola, medtem pa imamo še vedno nizko vsebnost O2 v končnem izdelku [2].

Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za sintezo izobutanola zaradi svoje sposobnosti, da s fotosintezo pretvarjajo CO2 neposredno v kemične spojine z dodano vrednostjo. S cianobakterijami lahko proizvajamo etanol, izobutiraldehid, izobutanol, 1-butanol, sukcinat, 2,3-butandiol, terpenoide, klorofile, maščobne kisline, sladkor in aminokisline [3]–[5].

Zmožne so tudi vezati atmosferski dušik in zato zavzemajo pomembno vlogo v dušikovem ciklu. Cianobakterije, ki vežejo N2, so še posebej zanimive za raziskovalce, ki se ukvarjajo z razvojem industrijskih sevov za proizvodnjo »zelenih« kemikalij, kot so limonen, farnezen, linalol in mircen [1].

== SINTEZA IZOBUTANOLA IN 3-METIL-1-IZOBUTANOLA V CIANOBAKTERIJAH ==

Izobutanol in 3-metil-1-butanol sta pomembna alkohola, saj lahko služita kot alternativa bencinu in ju je mogoče sintetizirati po poti biosinteze aminokislin v cianobakterijah. Najpogostejša sintezna pot za biosintezo izobutanola je pot 2-keto kislin, ki si deli prekurzor (α-ketoizovalerat) s sintezno potjo biosinteze L-valina. 3-metil-1-butanol si deli prekurzor (2-ketoizokaproat) s sintezno potjo biosinteze L-levcina [2].

Biosintezna pot izobutanola vsebuje več encimov. Kodirajo jih geni alsS (''Bacillus subtilis''), ilvC (''E. coli''), ilvD (''E. coli''), ketokislinska dekarboksilaza (kdc) (''Lactococcus lactis'') in alkoholna dehidrogenaza (adh) (''E. coli'') [2], [3].

α-ketoizovalerat dekarboksilaza (Kivd oz. kdc) iz ''L. lactis'', ki dekarboksilira α-keto kisline v aldehide, je pomemben encim v poti 2-keto kislin in je bil uporabljen pri ''E. coli'', ''S.cerevisiae'', ''Corynebacterium glutamicum'' in cianobakterijah za proizvodnjo izobutiraldehida in izobutanola. KDC je homotetramer, njegova optimalna aktivnost je bila opažena pri 45 °C (pH 6,5) in ima visoko specifičnost za α-ketoizovalerat. Poleg tega je bil Kivd oz. kdc zasnovan za uporabo večjega substrata za proizvodnjo alkoholov z daljšo verigo. Cianobakterije so pritegnile pozornost raziskovalcev zaradi zmožnosti izvajanja fotosinteze, in posledične porabe atmosferskega CO2, ter nizke potrebe po hranilih, visoke tolerance na različna okolja in nezahtevnega genskega inženiringa [2].

== MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH ==

Večina pristopov sintezne biologije, ki delujejo v heterotrofnih organizmih, kot je ''E. coli'', ni mogoče uporabiti v cianobakterijah. Na primer, promotorji in RBS, ki močno modulirajo izražanje genov v ''E. coli'', ne delujejo dobro v cianobakterijah. Če se osredotočimo samo na povečanje izražanja genov s promotorskim inženiringom, opazimo, da se pri cianobakterijah uporabljajo močni konstitutivni nativni promotorji, sintetični inducibilni promotorji, kemično inducibilni promotorji in okoljsko inducibilni promotorji [5].

Do danes je bilo opisanihh le nekaj močnih konstitutivnih promotorjev, ki pa so pogosto omejeni na samo nekatere vrste in moč izražanja genov niha s cirkadianim ritmom. Sintetični inducibilni promotorji delujejo v različnih vrstah cianobakterij [5]. Kemično inducibilni promotorji, npr. arabinozni inducibilni promotor, so najpogosteje uporabljeni promotorji, vendar pa niso primerni za velike industrijske bioprocese [3], [5]. Uporaba zunanjih kemičnih induktorjev ni zaželena, saj poveča proizvodne stroške in predstavlja tveganje za okolje, na primer zaradi uporabe težkih kovin. Slednji problem lahko rešimo z uporabo promotorjev, na katere vplivajo okoljski oz. fizični signali kot sta npr. kisik in svetloba.

Znanstveniki so ustvarili s temo inducibilni genski ekspresijski sistem, ki temelji na dvokomponentnem sistemu EnvZ/OmpR iz ''E. coli''. Prav tako so izkoristili prisotnost fikobilisoma v cianobakterijah. Ustvarili so na svetlobo občutljiv genski ekspresijski sistem, ki je sestavljen iz senzorja za zeleno svetlobo CcS, efektorskega elementa CcR ter promotor PcpcG2, ki regulira ekspresijo gena za linker cpcG2 fikobilisoma. Na podlagi sistema za preklop iz aerobnega v anaerobni metabolizem (FNR) iz ''E. coli'' so ustvarili prilagojen sistem v sevu Syn6803 cianobakterij. Z uporabo tega sistema in promotorja PFNR o ustvarili genski ekspresijski sistem, ki se odziva na prisotnost kisika [5].

== VPLIV GENSKEGA EKSPRESIJSKEGA SISTEMA CcS/CcR NA EKSPRESIJO BUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST ==

V izbranem članku so avtorji želeli pokazati, da s svetlobo inducibilnim promotorjem lahko pridobimo večjo količino izobutanola in 3-metil-1-butanola in da so posledično bolj ekonomični ter obvladljivi genetski ekspresijski sistemi kot sistemi s kemikalijami inducibilnimi promotorji. Poleg tega so tudi vključili vpliv integracije tega genskega ekspresijskega sistema na rast cianobakterij [3].

Za gostiteljski organizem so izbrali cianobakterijo ''Synechocystis sp.'' PCC 6803. V ''E. coli'' K-12 so pripravili 3 različne konstrukte oz. vektorje z inserti [3].

Kot osnovo so uporabili vektor pKT-GSS. Prvi konstrukt so poimenovali pKT-GSS-KDC-ADH. Gena kdc in adh sta bila vstavljena za promotorjem PcpcG2. Sev PCC 6803 ima integriran sistem CcS/CcR. Ta sistem lahko inducira izražanje eksogenih genov iz promotorja PcpcG2 kot odziv na radiacijo z zeleno svetlobo in zavira izražanje genov kot odziv na radiacijo z rdečo svetlobo. V osnovni vektor so vstavili dva gena, potrebna za proizvodnjo alkoholov, in sicer kdc, ki vsebuje zapis za ketokislinsko dekarboksilazo (KDC) in je pridobljen iz ''L. lactis'', ter slr1192, ki vsbuje zapis za alkoholno dehidrogenazo (ADH) in je pridobljen iz PCC 6803. Uporaba kodonov med sevom ''E. coli'' K-12 in PCC 6803 je podobna, zato ni bila potrebna optimizacija rabe kodonov za gen kdc. Pred zapisoma genov kdc in adh so vstavili sekvenco podobno Shine-Dalgarnovem zapordju iz gena cpcB organizma ''Synechococcus sp.'' PCC 7002. Ekspresija genov kdc in adh je bila inducirana z obsevanjem z zeleno svetlobo. Sinteza izobutanola in 3-metil-1-butanola je bila uspešna [3].

Rast, transkripcija in proizvodnjo izobutanola ter 3-metil-1-butanola so določili z gojenjem celic PCC 6803ΔGSS. To je sev z delecijo genomskega sistema CcaS/CcaR in PcpcG2. V ta sev so vnesli vektor pKT-GSS-KDC-ADH in nato celice obsevali z rdečo in zeleno svetlobo (induktivni pogoji: 520 nm, 660 nm; 60 μmol/m2 s) ali samo z rdečo svetlobo (660 nm, 30 μmol/m2 s). Rdeča svetloba je potrebna za fotosintezo in ni znatno vplivala na ekspresijo genov pod promotorjem PcpcG2. Zaradi slednjega razloga so celice obsevali tako z zeleno kot rdečo svetlobo. Spremembe v intenzivnosti in/ali valovni dolžini svetlobe lahko aktivirajo metabolizem gostitelja, rast celic in bioprodukcijo. Čeprav je bila za indukcijo uporabljena dvakrat večja intenziteta svetlobe, so pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo opazili rahlo zakasnitev rasti celic v primerjavi z obsevanjem z rdečo svetlobo. Zakasnitev v rasti celic so pripisali integraciji genov kdc in adh v genom. Slednje ni znatno vplivalo na produkcijo alkoholov [3].

Opazovali so tudi transkripcijsko aktivnost celic. Pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo so v celicah PCC 6803ΔGSS z pKT-GSS-KDC-ADH opazili petkrat višjo raven transkripcije gena kdc v primerjavi s tisto pri osvetlitvi z rdečo svetlobo pri 4 urah. Slednje ponovno potrdi njihovo domnevo [3].

Titri proizvodnje izobutanola in 3-metil-1-butanola so se povečevali do petega dne pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo ter dosegli 166 mg/L izobutanola in 51 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh. Pri obsevanju z rdečo svetlobo pa je sev PCC 6803ΔGSS z pKT-GSS-KDC-ADH proizvedel samo 19 mg/Lizobutanola in 9 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh [3].

Ustvarili so tudi kontrolni sev. Ta sev je imel zapise za gena kdc in adh pod nadzorom močnega konstitutivnega promotorja Ptrc-core. Koncentracija izobutanola, proizvedena v kontrolnem sevu, je znašala približno 5 mg/L, koncentracija 3-metil-1-butanola pa je bila pod mejo zaznave. V primerjavi s sevom s sistemom CcaS/CcaR je kontrolni sev počasno rastel [3].

Raziskovalci so želeli nadaljnjo povečati proizvodnjo izobutanola in 3-metil-1-butanola, kar je pomenilo, da so morali povečati nivoje izražanja kdc in adh iz PcpcG2. Njihove prejšnje raziskave so pokazale, da je dodatna ekspresija gena ccaR z uporabo konstitutivnega promotorja povečala ekspresijo genov iz PcpcG2, vendar se je povečalo tudi puščanje tega promotorja. Puščanje promotorja in nizko razmerje ON/OFF (indukcija/brez indukcije) sta negativno vplivala na proizvodnjo alkoholov. Da bi se izognili puščanju promotorja, se mora gen ccaR izražati le takrat, kadar celice obsevamo z zeleno svetlobo. Zato so v vektor vnesli dodaten gen ccaR pod promotor PcpcG2 [3].

Vektor pKT-GSS-KDC-ADH-CcaR je bil konstruiran z vstavitvijo dodatnega gena ccaR z zaporedjem podobnim Shine Dalgarnovem (SD) za genom adh v vektorju pKT-GSS-KDC-ADH. S tem vektorjem so transformirali sev PCC 6803ΔGSS. Pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo je sev proizvedel 238 mg/L izobutanola in 75 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh. Pri obsevanju z rdečo svetlobo pa sta se izobutanol in 3-metil-1-butanol pojavila samo v sledovih. Dodatna ekspresija gena ccaR je izboljšala proizvodnjo izobutanola in 3-metil-1-butanola za 1,5-krat oziroma 1,4-krat [3].

== ZAKLJUČEK ==
Rast svetovnega prebivalstva in povečano povpraševanje po fosilnih gorivih sta povzročila potrebo po razvoju trajnostnih virov energije. Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za proizvodnjo trajnostnih biogoriv, saj lahko s fotosintezo pretvarjajo atmosferski CO2 v kemične spojine. Izobutanol je pomemben kot alternativno gorivo, saj ima visoko vsebnost energije in nižji parni tlak kot etanol. V tem kontekstu so znanstveniki razvili s svetlobo inducibilni genski ekspresijski sistem v cianobakteriji Synechocystis sp. PCC 6803 za proizvodnjo izobutanola in 3-metil-1-butanola. Sistem se je izkazal za uspešnega za sintezo teh alkoholov pod vplivom zelene svetlobe.

== Viri ==
[1] T. J. Johnson, J. L. Gibbons, L. Gu, R. Zhou, and W. R. Gibbons, “Molecular genetic improvements of cyanobacteria to enhance the industrial potential of the microbe: A review,” Biotechnol. Prog., vol. 32, no. 6, pp. 1357–1371, 2016, doi: 10.1002/btpr.2358.

[2] R. Miao, X. Liu, E. Englund, P. Lindberg, and P. Lindblad, “Isobutanol production in Synechocystis PCC 6803 using heterologous and endogenous alcohol dehydrogenases,” Metab. Eng. Commun., vol. 5, no. June, pp. 45–53, 2017, doi: 10.1016/j.meteno.2017.07.003.

[3] S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.

[4] S. Kobayashi et al., “Application of an engineered chromatic acclimation sensor for red-light-regulated gene expression in cyanobacteria,” Algal Res., vol. 44, no. October, p. 101691, 2019, doi: 10.1016/j.algal.2019.101691.

[5] A. Satta, L. Esquirol, and B. E. Ebert, “Current Metabolic Engineering Strategies for Photosynthetic Bioproduction in Cyanobacteria,” Microorganisms, vol. 11, no. 2, pp. 1–34, 2023, doi: 10.3390/microorganisms11020455.

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-28T14:46:04Z

Špela Deučman: /* ZAKLJUČEK */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1186/s12934-021-01732-x S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.]

== UVOD ==
Hitra rast svetovnega prebivalstva skupaj z naraščajočim povpraševanjem po fosilnih gorivih in povečanimi emisijami CO2 je povzročila večjo potrebo po razvoju trajnostnih virov energije in kemikalij iz obnovljivih virov. V zadnjih desetletjih je bilo veliko raziskav osredotočenih na prepoznavanje trajnostnih metod za proizvodnjo obnovljivih biogoriv [1], [2].

Izobutanol je pomembna spojina kot alternativno gorivo zaradi visoke vsebnosti energije (98 % vsebnosti energije v bencinu) in nižjega parnega tlaka v primerjavi z etanolom. Poleg tega ima izobutanol nižjo vsebnost O2 in nižjo topnost v vodi kot etanol, kar pomeni, da je mogoče v bencin vmešati več izobutanola, medtem pa imamo še vedno nizko vsebnost O2 v končnem izdelku [2].

Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za sintezo izobutanola zaradi svoje sposobnosti, da s fotosintezo pretvarjajo CO2 neposredno v kemične spojine z dodano vrednostjo. S cianobakterijami lahko proizvajamo etanol, izobutiraldehid, izobutanol, 1-butanol, sukcinat, 2,3-butandiol, terpenoide, klorofile, maščobne kisline, sladkor in aminokisline [3]–[5].

Zmožne so tudi vezati atmosferski dušik in zato zavzemajo pomembno vlogo v dušikovem ciklu. Cianobakterije, ki vežejo N2, so še posebej zanimive za raziskovalce, ki se ukvarjajo z razvojem industrijskih sevov za proizvodnjo »zelenih« kemikalij, kot so limonen, farnezen, linalol in mircen [1].

== SINTEZA IZOBUTANOLA IN 3-METIL-1-IZOBUTANOLA V CIANOBAKTERIJAH ==

Izobutanol in 3-metil-1-butanol sta pomembna alkohola, saj lahko služita kot alternativa bencinu in ju je mogoče sintetizirati po poti biosinteze aminokislin v cianobakterijah. Najpogostejša sintezna pot za biosintezo izobutanola je pot 2-keto kislin, ki si deli prekurzor (α-ketoizovalerat) s sintezno potjo biosinteze L-valina. 3-metil-1-butanol si deli prekurzor (2-ketoizokaproat) s sintezno potjo biosinteze L-levcina [2].

Biosintezna pot izobutanola vsebuje več encimov. Kodirajo jih geni alsS (''Bacillus subtilis''), ilvC (''E. coli''), ilvD (''E. coli''), ketokislinska dekarboksilaza (kdc) (''Lactococcus lactis'') in alkoholna dehidrogenaza (adh) (''E. coli'') [2], [3].

α-ketoizovalerat dekarboksilaza (Kivd oz. kdc) iz ''L. lactis'', ki dekarboksilira α-keto kisline v aldehide, je pomemben encim v poti 2-keto kislin in je bil uporabljen pri ''E. coli'', ''S.cerevisiae'', ''Corynebacterium glutamicum'' in cianobakterijah za proizvodnjo izobutiraldehida in izobutanola. KDC je homotetramer, njegova optimalna aktivnost je bila opažena pri 45 °C (pH 6,5) in ima visoko specifičnost za α-ketoizovalerat. Poleg tega je bil Kivd oz. kdc zasnovan za uporabo večjega substrata za proizvodnjo alkoholov z daljšo verigo. Cianobakterije so pritegnile pozornost raziskovalcev zaradi zmožnosti izvajanja fotosinteze, in posledične porabe atmosferskega CO2, ter nizke potrebe po hranilih, visoke tolerance na različna okolja in nezahtevnega genskega inženiringa [2].

== MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH ==

Večina pristopov sintezne biologije, ki delujejo v heterotrofnih organizmih, kot je ''E. coli'', ni mogoče uporabiti v cianobakterijah. Na primer, promotorji in RBS, ki močno modulirajo izražanje genov v ''E. coli'', ne delujejo dobro v cianobakterijah. Če se osredotočimo samo na povečanje izražanja genov s promotorskim inženiringom, opazimo, da se pri cianobakterijah uporabljajo močni konstitutivni nativni promotorji, sintetični inducibilni promotorji, kemično inducibilni promotorji in okoljsko inducibilni promotorji [5].

Do danes je bilo opisanihh le nekaj močnih konstitutivnih promotorjev, ki pa so pogosto omejeni na samo nekatere vrste in moč izražanja genov niha s cirkadianim ritmom. Sintetični inducibilni promotorji delujejo v različnih vrstah cianobakterij [5]. Kemično inducibilni promotorji, npr. arabinozni inducibilni promotor, so najpogosteje uporabljeni promotorji, vendar pa niso primerni za velike industrijske bioprocese [3], [5]. Uporaba zunanjih kemičnih induktorjev ni zaželena, saj poveča proizvodne stroške in predstavlja tveganje za okolje, na primer zaradi uporabe težkih kovin. Slednji problem lahko rešimo z uporabo promotorjev, na katere vplivajo okoljski oz. fizični signali kot sta npr. kisik in svetloba.

Znanstveniki so ustvarili s temo inducibilni genski ekspresijski sistem, ki temelji na dvokomponentnem sistemu EnvZ/OmpR iz ''E. coli''. Prav tako so izkoristili prisotnost fikobilisoma v cianobakterijah. Ustvarili so na svetlobo občutljiv genski ekspresijski sistem, ki je sestavljen iz senzorja za zeleno svetlobo CcS, efektorskega elementa CcR ter promotor PcpcG2, ki regulira ekspresijo gena za linker cpcG2 fikobilisoma. Na podlagi sistema za preklop iz aerobnega v anaerobni metabolizem (FNR) iz ''E. coli'' so ustvarili prilagojen sistem v sevu Syn6803 cianobakterij. Z uporabo tega sistema in promotorja PFNR o ustvarili genski ekspresijski sistem, ki se odziva na prisotnost kisika [5].

== VPLIV GENSKEGA EKSPRESIJSKEGA SISTEMA CcS/CcR NA EKSPRESIJO BUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST ==

V izbranem članku so avtorji želeli pokazati, da s svetlobo inducibilnim promotorjem lahko pridobimo večjo količino izobutanola in 3-metil-1-butanola in da so posledično bolj ekonomični ter obvladljivi genetski ekspresijski sistemi kot sistemi s kemikalijami inducibilnimi promotorji. Poleg tega so tudi vključili vpliv integracije tega genskega ekspresijskega sistema na rast cianobakterij [3].

Za gostiteljski organizem so izbrali cianobakterijo ''Synechocystis sp.'' PCC 6803. V ''E. coli'' K-12 so pripravili 3 različne konstrukte oz. vektorje z inserti [3].

Kot osnovo so uporabili vektor pKT-GSS. Prvi konstrukt so poimenovali pKT-GSS-KDC-ADH. Gena kdc in adh sta bila vstavljena za promotorjem PcpcG2. Sev PCC 6803 ima integriran sistem CcS/CcR. Ta sistem lahko inducira izražanje eksogenih genov iz promotorja PcpcG2 kot odziv na radiacijo z zeleno svetlobo in zavira izražanje genov kot odziv na radiacijo z rdečo svetlobo. V osnovni vektor so vstavili dva gena, potrebna za proizvodnjo alkoholov, in sicer kdc, ki vsebuje zapis za ketokislinsko dekarboksilazo (KDC) in je pridobljen iz ''L. lactis'', ter slr1192, ki vsbuje zapis za alkoholno dehidrogenazo (ADH) in je pridobljen iz PCC 6803. Uporaba kodonov med sevom ''E. coli'' K-12 in PCC 6803 je podobna, zato ni bila potrebna optimizacija rabe kodonov za gen kdc. Pred zapisoma genov kdc in adh so vstavili sekvenco podobno Shine-Dalgarnovem zapordju iz gena cpcB organizma ''Synechococcus sp.'' PCC 7002. Ekspresija genov kdc in adh je bila inducirana z obsevanjem z zeleno svetlobo. Sinteza izobutanola in 3-metil-1-butanola je bila uspešna [3].

Rast, transkripcija in proizvodnjo izobutanola ter 3-metil-1-butanola so določili z gojenjem celic PCC 6803ΔGSS. To je sev z delecijo genomskega sistema CcaS/CcaR in PcpcG2. V ta sev so vnesli vektor pKT-GSS-KDC-ADH in nato celice obsevali z rdečo in zeleno svetlobo (induktivni pogoji: 520 nm, 660 nm; 60 μmol/m2 s) ali samo z rdečo svetlobo (660 nm, 30 μmol/m2 s). Rdeča svetloba je potrebna za fotosintezo in ni znatno vplivala na ekspresijo genov pod promotorjem PcpcG2. Zaradi slednjega razloga so celice obsevali tako z zeleno kot rdečo svetlobo. Spremembe v intenzivnosti in/ali valovni dolžini svetlobe lahko aktivirajo metabolizem gostitelja, rast celic in bioprodukcijo. Čeprav je bila za indukcijo uporabljena dvakrat večja intenziteta svetlobe, so pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo opazili rahlo zakasnitev rasti celic v primerjavi z obsevanjem z rdečo svetlobo. Zakasnitev v rasti celic so pripisali integraciji genov kdc in adh v genom. Slednje ni znatno vplivalo na produkcijo alkoholov [3].

Opazovali so tudi transkripcijsko aktivnost celic. Pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo so v celicah PCC 6803ΔGSS z pKT-GSS-KDC-ADH opazili petkrat višjo raven transkripcije gena kdc v primerjavi s tisto pri osvetlitvi z rdečo svetlobo pri 4 urah. Slednje ponovno potrdi njihovo domnevo [3].

Titri proizvodnje izobutanola in 3-metil-1-butanola so se povečevali do petega dne pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo ter dosegli 166 mg/L izobutanola in 51 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh. Pri obsevanju z rdečo svetlobo pa je sev PCC 6803ΔGSS z pKT-GSS-KDC-ADH proizvedel samo 19 mg/Lizobutanola in 9 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh [3].

Ustvarili so tudi kontrolni sev. Ta sev je imel zapise za gena kdc in adh pod nadzorom močnega konstitutivnega promotorja Ptrc-core. Koncentracija izobutanola, proizvedena v kontrolnem sevu, je znašala približno 5 mg/L, koncentracija 3-metil-1-butanola pa je bila pod mejo zaznave. V primerjavi s sevom s sistemom CcaS/CcaR je kontrolni sev počasno rastel [3].

Raziskovalci so želeli nadaljnjo povečati proizvodnjo izobutanola in 3-metil-1-butanola, kar je pomenilo, da so morali povečati nivoje izražanja kdc in adh iz PcpcG2. Njihove prejšnje raziskave so pokazale, da je dodatna ekspresija gena ccaR z uporabo konstitutivnega promotorja povečala ekspresijo genov iz PcpcG2, vendar se je povečalo tudi puščanje tega promotorja. Puščanje promotorja in nizko razmerje ON/OFF (indukcija/brez indukcije) sta negativno vplivala na proizvodnjo alkoholov. Da bi se izognili puščanju promotorja, se mora gen ccaR izražati le takrat, kadar celice obsevamo z zeleno svetlobo. Zato so v vektor vnesli dodaten gen ccaR pod promotor PcpcG2 [3].

Vektor pKT-GSS-KDC-ADH-CcaR je bil konstruiran z vstavitvijo dodatnega gena ccaR z zaporedjem podobnim Shine Dalgarnovem (SD) za genom adh v vektorju pKT-GSS-KDC-ADH. S tem vektorjem so transformirali sev PCC 6803ΔGSS. Pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo je sev proizvedel 238 mg/L izobutanola in 75 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh. Pri obsevanju z rdečo svetlobo pa sta se izobutanol in 3-metil-1-butanol pojavila samo v sledovih. Dodatna ekspresija gena ccaR je izboljšala proizvodnjo izobutanola in 3-metil-1-butanola za 1,5-krat oziroma 1,4-krat [3].

== ZAKLJUČEK ==
Rast svetovnega prebivalstva in povečano povpraševanje po fosilnih gorivih sta povzročila potrebo po razvoju trajnostnih virov energije. Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za proizvodnjo trajnostnih biogoriv, saj lahko s fotosintezo pretvarjajo atmosferski CO2 v kemične spojine. Izobutanol je pomemben kot alternativno gorivo, saj ima visoko vsebnost energije in nižji parni tlak kot etanol. V tem kontekstu so znanstveniki razvili s svetlobo inducibilni genski ekspresijski sistem v cianobakteriji Synechocystis sp. PCC 6803 za proizvodnjo izobutanola in 3-metil-1-butanola. Sistem se je izkazal za uspešnega za sintezo teh alkoholov pod vplivom zelene svetlobe.

== Viri ==
[1] T. J. Johnson, J. L. Gibbons, L. Gu, R. Zhou, and W. R. Gibbons, “Molecular genetic improvements of cyanobacteria to enhance the industrial potential of the microbe: A review,” Biotechnol. Prog., vol. 32, no. 6, pp. 1357–1371, 2016, doi: 10.1002/btpr.2358.

[2] R. Miao, X. Liu, E. Englund, P. Lindberg, and P. Lindblad, “Isobutanol production in Synechocystis PCC 6803 using heterologous and endogenous alcohol dehydrogenases,” Metab. Eng. Commun., vol. 5, no. June, pp. 45–53, 2017, doi: 10.1016/j.meteno.2017.07.003.

[3] S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.

[4] S. Kobayashi et al., “Application of an engineered chromatic acclimation sensor for red-light-regulated gene expression in cyanobacteria,” Algal Res., vol. 44, no. October, p. 101691, 2019, doi: 10.1016/j.algal.2019.101691.

[5] A. Satta, L. Esquirol, and B. E. Ebert, “Current Metabolic Engineering Strategies for Photosynthetic Bioproduction in Cyanobacteria,” Microorganisms, vol. 11, no. 2, pp. 1–34, 2023, doi: 10.3390/microorganisms11020455.

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-28T14:39:44Z

Špela Deučman: /* VPLIV GENSKEGA EKSPRESIJSKEGA SISTEMA CcS/CcR NA EKSPRESIJO BUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1186/s12934-021-01732-x S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.]

== UVOD ==
Hitra rast svetovnega prebivalstva skupaj z naraščajočim povpraševanjem po fosilnih gorivih in povečanimi emisijami CO2 je povzročila večjo potrebo po razvoju trajnostnih virov energije in kemikalij iz obnovljivih virov. V zadnjih desetletjih je bilo veliko raziskav osredotočenih na prepoznavanje trajnostnih metod za proizvodnjo obnovljivih biogoriv [1], [2].

Izobutanol je pomembna spojina kot alternativno gorivo zaradi visoke vsebnosti energije (98 % vsebnosti energije v bencinu) in nižjega parnega tlaka v primerjavi z etanolom. Poleg tega ima izobutanol nižjo vsebnost O2 in nižjo topnost v vodi kot etanol, kar pomeni, da je mogoče v bencin vmešati več izobutanola, medtem pa imamo še vedno nizko vsebnost O2 v končnem izdelku [2].

Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za sintezo izobutanola zaradi svoje sposobnosti, da s fotosintezo pretvarjajo CO2 neposredno v kemične spojine z dodano vrednostjo. S cianobakterijami lahko proizvajamo etanol, izobutiraldehid, izobutanol, 1-butanol, sukcinat, 2,3-butandiol, terpenoide, klorofile, maščobne kisline, sladkor in aminokisline [3]–[5].

Zmožne so tudi vezati atmosferski dušik in zato zavzemajo pomembno vlogo v dušikovem ciklu. Cianobakterije, ki vežejo N2, so še posebej zanimive za raziskovalce, ki se ukvarjajo z razvojem industrijskih sevov za proizvodnjo »zelenih« kemikalij, kot so limonen, farnezen, linalol in mircen [1].

== SINTEZA IZOBUTANOLA IN 3-METIL-1-IZOBUTANOLA V CIANOBAKTERIJAH ==

Izobutanol in 3-metil-1-butanol sta pomembna alkohola, saj lahko služita kot alternativa bencinu in ju je mogoče sintetizirati po poti biosinteze aminokislin v cianobakterijah. Najpogostejša sintezna pot za biosintezo izobutanola je pot 2-keto kislin, ki si deli prekurzor (α-ketoizovalerat) s sintezno potjo biosinteze L-valina. 3-metil-1-butanol si deli prekurzor (2-ketoizokaproat) s sintezno potjo biosinteze L-levcina [2].

Biosintezna pot izobutanola vsebuje več encimov. Kodirajo jih geni alsS (''Bacillus subtilis''), ilvC (''E. coli''), ilvD (''E. coli''), ketokislinska dekarboksilaza (kdc) (''Lactococcus lactis'') in alkoholna dehidrogenaza (adh) (''E. coli'') [2], [3].

α-ketoizovalerat dekarboksilaza (Kivd oz. kdc) iz ''L. lactis'', ki dekarboksilira α-keto kisline v aldehide, je pomemben encim v poti 2-keto kislin in je bil uporabljen pri ''E. coli'', ''S.cerevisiae'', ''Corynebacterium glutamicum'' in cianobakterijah za proizvodnjo izobutiraldehida in izobutanola. KDC je homotetramer, njegova optimalna aktivnost je bila opažena pri 45 °C (pH 6,5) in ima visoko specifičnost za α-ketoizovalerat. Poleg tega je bil Kivd oz. kdc zasnovan za uporabo večjega substrata za proizvodnjo alkoholov z daljšo verigo. Cianobakterije so pritegnile pozornost raziskovalcev zaradi zmožnosti izvajanja fotosinteze, in posledične porabe atmosferskega CO2, ter nizke potrebe po hranilih, visoke tolerance na različna okolja in nezahtevnega genskega inženiringa [2].

== MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH ==

Večina pristopov sintezne biologije, ki delujejo v heterotrofnih organizmih, kot je ''E. coli'', ni mogoče uporabiti v cianobakterijah. Na primer, promotorji in RBS, ki močno modulirajo izražanje genov v ''E. coli'', ne delujejo dobro v cianobakterijah. Če se osredotočimo samo na povečanje izražanja genov s promotorskim inženiringom, opazimo, da se pri cianobakterijah uporabljajo močni konstitutivni nativni promotorji, sintetični inducibilni promotorji, kemično inducibilni promotorji in okoljsko inducibilni promotorji [5].

Do danes je bilo opisanihh le nekaj močnih konstitutivnih promotorjev, ki pa so pogosto omejeni na samo nekatere vrste in moč izražanja genov niha s cirkadianim ritmom. Sintetični inducibilni promotorji delujejo v različnih vrstah cianobakterij [5]. Kemično inducibilni promotorji, npr. arabinozni inducibilni promotor, so najpogosteje uporabljeni promotorji, vendar pa niso primerni za velike industrijske bioprocese [3], [5]. Uporaba zunanjih kemičnih induktorjev ni zaželena, saj poveča proizvodne stroške in predstavlja tveganje za okolje, na primer zaradi uporabe težkih kovin. Slednji problem lahko rešimo z uporabo promotorjev, na katere vplivajo okoljski oz. fizični signali kot sta npr. kisik in svetloba.

Znanstveniki so ustvarili s temo inducibilni genski ekspresijski sistem, ki temelji na dvokomponentnem sistemu EnvZ/OmpR iz ''E. coli''. Prav tako so izkoristili prisotnost fikobilisoma v cianobakterijah. Ustvarili so na svetlobo občutljiv genski ekspresijski sistem, ki je sestavljen iz senzorja za zeleno svetlobo CcS, efektorskega elementa CcR ter promotor PcpcG2, ki regulira ekspresijo gena za linker cpcG2 fikobilisoma. Na podlagi sistema za preklop iz aerobnega v anaerobni metabolizem (FNR) iz ''E. coli'' so ustvarili prilagojen sistem v sevu Syn6803 cianobakterij. Z uporabo tega sistema in promotorja PFNR o ustvarili genski ekspresijski sistem, ki se odziva na prisotnost kisika [5].

== VPLIV GENSKEGA EKSPRESIJSKEGA SISTEMA CcS/CcR NA EKSPRESIJO BUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST ==

V izbranem članku so avtorji želeli pokazati, da s svetlobo inducibilnim promotorjem lahko pridobimo večjo količino izobutanola in 3-metil-1-butanola in da so posledično bolj ekonomični ter obvladljivi genetski ekspresijski sistemi kot sistemi s kemikalijami inducibilnimi promotorji. Poleg tega so tudi vključili vpliv integracije tega genskega ekspresijskega sistema na rast cianobakterij [3].

Za gostiteljski organizem so izbrali cianobakterijo ''Synechocystis sp.'' PCC 6803. V ''E. coli'' K-12 so pripravili 3 različne konstrukte oz. vektorje z inserti [3].

Kot osnovo so uporabili vektor pKT-GSS. Prvi konstrukt so poimenovali pKT-GSS-KDC-ADH. Gena kdc in adh sta bila vstavljena za promotorjem PcpcG2. Sev PCC 6803 ima integriran sistem CcS/CcR. Ta sistem lahko inducira izražanje eksogenih genov iz promotorja PcpcG2 kot odziv na radiacijo z zeleno svetlobo in zavira izražanje genov kot odziv na radiacijo z rdečo svetlobo. V osnovni vektor so vstavili dva gena, potrebna za proizvodnjo alkoholov, in sicer kdc, ki vsebuje zapis za ketokislinsko dekarboksilazo (KDC) in je pridobljen iz ''L. lactis'', ter slr1192, ki vsbuje zapis za alkoholno dehidrogenazo (ADH) in je pridobljen iz PCC 6803. Uporaba kodonov med sevom ''E. coli'' K-12 in PCC 6803 je podobna, zato ni bila potrebna optimizacija rabe kodonov za gen kdc. Pred zapisoma genov kdc in adh so vstavili sekvenco podobno Shine-Dalgarnovem zapordju iz gena cpcB organizma ''Synechococcus sp.'' PCC 7002. Ekspresija genov kdc in adh je bila inducirana z obsevanjem z zeleno svetlobo. Sinteza izobutanola in 3-metil-1-butanola je bila uspešna [3].

Rast, transkripcija in proizvodnjo izobutanola ter 3-metil-1-butanola so določili z gojenjem celic PCC 6803ΔGSS. To je sev z delecijo genomskega sistema CcaS/CcaR in PcpcG2. V ta sev so vnesli vektor pKT-GSS-KDC-ADH in nato celice obsevali z rdečo in zeleno svetlobo (induktivni pogoji: 520 nm, 660 nm; 60 μmol/m2 s) ali samo z rdečo svetlobo (660 nm, 30 μmol/m2 s). Rdeča svetloba je potrebna za fotosintezo in ni znatno vplivala na ekspresijo genov pod promotorjem PcpcG2. Zaradi slednjega razloga so celice obsevali tako z zeleno kot rdečo svetlobo. Spremembe v intenzivnosti in/ali valovni dolžini svetlobe lahko aktivirajo metabolizem gostitelja, rast celic in bioprodukcijo. Čeprav je bila za indukcijo uporabljena dvakrat večja intenziteta svetlobe, so pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo opazili rahlo zakasnitev rasti celic v primerjavi z obsevanjem z rdečo svetlobo. Zakasnitev v rasti celic so pripisali integraciji genov kdc in adh v genom. Slednje ni znatno vplivalo na produkcijo alkoholov [3].

Opazovali so tudi transkripcijsko aktivnost celic. Pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo so v celicah PCC 6803ΔGSS z pKT-GSS-KDC-ADH opazili petkrat višjo raven transkripcije gena kdc v primerjavi s tisto pri osvetlitvi z rdečo svetlobo pri 4 urah. Slednje ponovno potrdi njihovo domnevo [3].

Titri proizvodnje izobutanola in 3-metil-1-butanola so se povečevali do petega dne pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo ter dosegli 166 mg/L izobutanola in 51 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh. Pri obsevanju z rdečo svetlobo pa je sev PCC 6803ΔGSS z pKT-GSS-KDC-ADH proizvedel samo 19 mg/Lizobutanola in 9 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh [3].

Ustvarili so tudi kontrolni sev. Ta sev je imel zapise za gena kdc in adh pod nadzorom močnega konstitutivnega promotorja Ptrc-core. Koncentracija izobutanola, proizvedena v kontrolnem sevu, je znašala približno 5 mg/L, koncentracija 3-metil-1-butanola pa je bila pod mejo zaznave. V primerjavi s sevom s sistemom CcaS/CcaR je kontrolni sev počasno rastel [3].

Raziskovalci so želeli nadaljnjo povečati proizvodnjo izobutanola in 3-metil-1-butanola, kar je pomenilo, da so morali povečati nivoje izražanja kdc in adh iz PcpcG2. Njihove prejšnje raziskave so pokazale, da je dodatna ekspresija gena ccaR z uporabo konstitutivnega promotorja povečala ekspresijo genov iz PcpcG2, vendar se je povečalo tudi puščanje tega promotorja. Puščanje promotorja in nizko razmerje ON/OFF (indukcija/brez indukcije) sta negativno vplivala na proizvodnjo alkoholov. Da bi se izognili puščanju promotorja, se mora gen ccaR izražati le takrat, kadar celice obsevamo z zeleno svetlobo. Zato so v vektor vnesli dodaten gen ccaR pod promotor PcpcG2 [3].

Vektor pKT-GSS-KDC-ADH-CcaR je bil konstruiran z vstavitvijo dodatnega gena ccaR z zaporedjem podobnim Shine Dalgarnovem (SD) za genom adh v vektorju pKT-GSS-KDC-ADH. S tem vektorjem so transformirali sev PCC 6803ΔGSS. Pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo je sev proizvedel 238 mg/L izobutanola in 75 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh. Pri obsevanju z rdečo svetlobo pa sta se izobutanol in 3-metil-1-butanol pojavila samo v sledovih. Dodatna ekspresija gena ccaR je izboljšala proizvodnjo izobutanola in 3-metil-1-butanola za 1,5-krat oziroma 1,4-krat [3].

== ZAKLJUČEK ==

== Viri ==
[1] T. J. Johnson, J. L. Gibbons, L. Gu, R. Zhou, and W. R. Gibbons, “Molecular genetic improvements of cyanobacteria to enhance the industrial potential of the microbe: A review,” Biotechnol. Prog., vol. 32, no. 6, pp. 1357–1371, 2016, doi: 10.1002/btpr.2358.

[2] R. Miao, X. Liu, E. Englund, P. Lindberg, and P. Lindblad, “Isobutanol production in Synechocystis PCC 6803 using heterologous and endogenous alcohol dehydrogenases,” Metab. Eng. Commun., vol. 5, no. June, pp. 45–53, 2017, doi: 10.1016/j.meteno.2017.07.003.

[3] S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.

[4] S. Kobayashi et al., “Application of an engineered chromatic acclimation sensor for red-light-regulated gene expression in cyanobacteria,” Algal Res., vol. 44, no. October, p. 101691, 2019, doi: 10.1016/j.algal.2019.101691.

[5] A. Satta, L. Esquirol, and B. E. Ebert, “Current Metabolic Engineering Strategies for Photosynthetic Bioproduction in Cyanobacteria,” Microorganisms, vol. 11, no. 2, pp. 1–34, 2023, doi: 10.3390/microorganisms11020455.

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-22T22:16:00Z

Špela Deučman:

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1186/s12934-021-01732-x S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.]

== UVOD ==
Hitra rast svetovnega prebivalstva skupaj z naraščajočim povpraševanjem po fosilnih gorivih in povečanimi emisijami CO2 je povzročila večjo potrebo po razvoju trajnostnih virov energije in kemikalij iz obnovljivih virov. V zadnjih desetletjih je bilo veliko raziskav osredotočenih na prepoznavanje trajnostnih metod za proizvodnjo obnovljivih biogoriv [1], [2].

Izobutanol je pomembna spojina kot alternativno gorivo zaradi visoke vsebnosti energije (98 % vsebnosti energije v bencinu) in nižjega parnega tlaka v primerjavi z etanolom. Poleg tega ima izobutanol nižjo vsebnost O2 in nižjo topnost v vodi kot etanol, kar pomeni, da je mogoče v bencin vmešati več izobutanola, medtem pa imamo še vedno nizko vsebnost O2 v končnem izdelku [2].

Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za sintezo izobutanola zaradi svoje sposobnosti, da s fotosintezo pretvarjajo CO2 neposredno v kemične spojine z dodano vrednostjo. S cianobakterijami lahko proizvajamo etanol, izobutiraldehid, izobutanol, 1-butanol, sukcinat, 2,3-butandiol, terpenoide, klorofile, maščobne kisline, sladkor in aminokisline [3]–[5].

Zmožne so tudi vezati atmosferski dušik in zato zavzemajo pomembno vlogo v dušikovem ciklu. Cianobakterije, ki vežejo N2, so še posebej zanimive za raziskovalce, ki se ukvarjajo z razvojem industrijskih sevov za proizvodnjo »zelenih« kemikalij, kot so limonen, farnezen, linalol in mircen [1].

== SINTEZA IZOBUTANOLA IN 3-METIL-1-IZOBUTANOLA V CIANOBAKTERIJAH ==

Izobutanol in 3-metil-1-butanol sta pomembna alkohola, saj lahko služita kot alternativa bencinu in ju je mogoče sintetizirati po poti biosinteze aminokislin v cianobakterijah. Najpogostejša sintezna pot za biosintezo izobutanola je pot 2-keto kislin, ki si deli prekurzor (α-ketoizovalerat) s sintezno potjo biosinteze L-valina. 3-metil-1-butanol si deli prekurzor (2-ketoizokaproat) s sintezno potjo biosinteze L-levcina [2].

Biosintezna pot izobutanola vsebuje več encimov. Kodirajo jih geni alsS (''Bacillus subtilis''), ilvC (''E. coli''), ilvD (''E. coli''), ketokislinska dekarboksilaza (kdc) (''Lactococcus lactis'') in alkoholna dehidrogenaza (adh) (''E. coli'') [2], [3].

α-ketoizovalerat dekarboksilaza (Kivd oz. kdc) iz ''L. lactis'', ki dekarboksilira α-keto kisline v aldehide, je pomemben encim v poti 2-keto kislin in je bil uporabljen pri ''E. coli'', ''S.cerevisiae'', ''Corynebacterium glutamicum'' in cianobakterijah za proizvodnjo izobutiraldehida in izobutanola. KDC je homotetramer, njegova optimalna aktivnost je bila opažena pri 45 °C (pH 6,5) in ima visoko specifičnost za α-ketoizovalerat. Poleg tega je bil Kivd oz. kdc zasnovan za uporabo večjega substrata za proizvodnjo alkoholov z daljšo verigo. Cianobakterije so pritegnile pozornost raziskovalcev zaradi zmožnosti izvajanja fotosinteze, in posledične porabe atmosferskega CO2, ter nizke potrebe po hranilih, visoke tolerance na različna okolja in nezahtevnega genskega inženiringa [2].

== MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH ==

Večina pristopov sintezne biologije, ki delujejo v heterotrofnih organizmih, kot je ''E. coli'', ni mogoče uporabiti v cianobakterijah. Na primer, promotorji in RBS, ki močno modulirajo izražanje genov v ''E. coli'', ne delujejo dobro v cianobakterijah. Če se osredotočimo samo na povečanje izražanja genov s promotorskim inženiringom, opazimo, da se pri cianobakterijah uporabljajo močni konstitutivni nativni promotorji, sintetični inducibilni promotorji, kemično inducibilni promotorji in okoljsko inducibilni promotorji [5].

Do danes je bilo opisanihh le nekaj močnih konstitutivnih promotorjev, ki pa so pogosto omejeni na samo nekatere vrste in moč izražanja genov niha s cirkadianim ritmom. Sintetični inducibilni promotorji delujejo v različnih vrstah cianobakterij [5]. Kemično inducibilni promotorji, npr. arabinozni inducibilni promotor, so najpogosteje uporabljeni promotorji, vendar pa niso primerni za velike industrijske bioprocese [3], [5]. Uporaba zunanjih kemičnih induktorjev ni zaželena, saj poveča proizvodne stroške in predstavlja tveganje za okolje, na primer zaradi uporabe težkih kovin. Slednji problem lahko rešimo z uporabo promotorjev, na katere vplivajo okoljski oz. fizični signali kot sta npr. kisik in svetloba.

Znanstveniki so ustvarili s temo inducibilni genski ekspresijski sistem, ki temelji na dvokomponentnem sistemu EnvZ/OmpR iz ''E. coli''. Prav tako so izkoristili prisotnost fikobilisoma v cianobakterijah. Ustvarili so na svetlobo občutljiv genski ekspresijski sistem, ki je sestavljen iz senzorja za zeleno svetlobo CcS, efektorskega elementa CcR ter promotor PcpcG2, ki regulira ekspresijo gena za linker cpcG2 fikobilisoma. Na podlagi sistema za preklop iz aerobnega v anaerobni metabolizem (FNR) iz ''E. coli'' so ustvarili prilagojen sistem v sevu Syn6803 cianobakterij. Z uporabo tega sistema in promotorja PFNR o ustvarili genski ekspresijski sistem, ki se odziva na prisotnost kisika [5].

== VPLIV GENSKEGA EKSPRESIJSKEGA SISTEMA CcS/CcR NA EKSPRESIJO BUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST ==

V izbranem članku so avtorji želeli pokazati, da s svetlobo inducibilnim promotorjem lahko pridobimo večjo količino izobutanola in 3-metil-1-butanola in da so posledično bolj ekonomični ter obvladljivi genetski ekspresijski sistemi kot sistemi s kemikalijami inducibilnimi promotorji. Poleg tega so tudi vključili vpliv integracije tega genskega ekspresijskega sistema na rast cianobakterij [3].

Za gostiteljski organizem so izbrali cianobakterijo ''Synechocystis sp.'' PCC 6803. V ''E. coli'' K-12 so pripravili 3 različne konstrukte oz. vektorje z inserti [3].

Kot osnovo so uporabili vektor pKT-GSS. Prvi konstrukt so poimenovali pKT-GSS-KDC-ADH. Gena kdc in adh sta bila vstavljena za promotorjem PcpcG2. Sev PCC 6803 ima integriran sistem CcS/CcR. Ta sistem lahko inducira izražanje eksogenih genov iz promotorja PcpcG2 kot odziv na radiacijo z zeleno svetlobo in zavira izražanje genov kot odziv na radiacijo z rdečo svetlobo. V osnovni vektor so vstavili dva gena, potrebna za proizvodnjo alkoholov, in sicer kdc, ki vsebuje zapis za ketokislinsko dekarboksilazo (KDC) in je pridobljen iz ''L. lactis'', ter slr1192, ki vsbuje zapis za alkoholno dehidrogenazo (ADH) in je pridobljen iz PCC 6803. Uporaba kodonov med sevom ''E. coli'' K-12 in PCC 6803 je podobna, zato ni bila potrebna optimizacija rabe kodonov za gen kdc. Pred zapisoma genov kdc in adh so vstavili sekvenco podobno Shine-Dalgarnovem zapordju iz gena cpcB organizma ''Synechococcus sp.'' PCC 7002. Ekspresija genov kdc in adh je bila inducirana z obsevanjem z zeleno svetlobo. Sinteza izobutanola in 3-metil-1-butanola je bila uspešna [3].

Rast, transkripcija in proizvodnjo izobutanola ter 3-metil-1-butanola so določili z gojenjem celic PCC 6803ΔGSS. To je sev z delecijo genomskega sistema CcaS/CcaR in PcpcG2. V ta sev so vnesli vektor pKT-GSS-KDC-ADH in nato celice obsevali z rdečo in zeleno svetlobo (induktivni pogoji: 520 nm, 660 nm; 60 μmol m−2 s−1) ali samo z rdečo svetlobo (660 nm, 30 μmol m−2 s−1). Rdeča svetloba je potrebna za fotosintezo in ni znatno vplivala na ekspresijo genov pod promotorjem PcpcG2. Zaradi slednjega razloga so celice obsevali tako z zeleno kot rdečo svetlobo. Spremembe v intenzivnosti in/ali valovni dolžini svetlobe lahko aktivirajo metabolizem gostitelja, rast celic in bioprodukcijo. Čeprav je bila za indukcijo uporabljena dvakrat večja intenziteta svetlobe, so pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo opazili rahlo zakasnitev rasti celic v primerjavi z obsevanjem z rdečo svetlobo. Zakasnitev v rasti celic so pripisali integraciji genov kdc in adh v genom. Slednje ni znatno vplivalo na produkcijo alkoholov [3].

Opazovali so tudi transkripcijsko aktivnost celic. Pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo so v celicah PCC 6803ΔGSS z pKT-GSSKDC-ADH opazili petkrat višjo raven transkripcije gena kdc v primerjavi s tisto pri osvetlitvi z rdečo svetlobo pri 4 urah. Slednje ponovno potrdi njihovo domnevo [3].

Titri proizvodnje izobutanola in 3-metil-1-butanola so se povečevali do petega dne pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo ter dosegli 166 mg L-1 izobutanola in 51 mg L-1 3-metil-1-butanola v 5 dneh. Pri obsevanju z rdečo svetlobo pa je sev PCC 6803ΔGSS z pKT-GSSKDC-ADH proizvedel samo 19 mg L-1 izobutanola in 9 mg L-1 3-metil-1-butanola v 5 dneh [3].

Ustvarili so tudi kontrolni sev. Ta sev je imel zapise za gena kdc in adh pod nadzorom močnega konstitutivnega promotorja Ptrc-core. Koncentracija izobutanola, proizvedena v kontrolnem sevu, je znašala približno 5 mg L-1, koncentracija 3-metil-1-butanola pa je bila pod mejo zaznave. V primerjavi s sevom s sistemom CcaS/CcaR je kontrolni sev počasno rastel [3].

== ZAKLJUČEK ==

== Viri ==
[1] T. J. Johnson, J. L. Gibbons, L. Gu, R. Zhou, and W. R. Gibbons, “Molecular genetic improvements of cyanobacteria to enhance the industrial potential of the microbe: A review,” Biotechnol. Prog., vol. 32, no. 6, pp. 1357–1371, 2016, doi: 10.1002/btpr.2358.

[2] R. Miao, X. Liu, E. Englund, P. Lindberg, and P. Lindblad, “Isobutanol production in Synechocystis PCC 6803 using heterologous and endogenous alcohol dehydrogenases,” Metab. Eng. Commun., vol. 5, no. June, pp. 45–53, 2017, doi: 10.1016/j.meteno.2017.07.003.

[3] S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.

[4] S. Kobayashi et al., “Application of an engineered chromatic acclimation sensor for red-light-regulated gene expression in cyanobacteria,” Algal Res., vol. 44, no. October, p. 101691, 2019, doi: 10.1016/j.algal.2019.101691.

[5] A. Satta, L. Esquirol, and B. E. Ebert, “Current Metabolic Engineering Strategies for Photosynthetic Bioproduction in Cyanobacteria,” Microorganisms, vol. 11, no. 2, pp. 1–34, 2023, doi: 10.3390/microorganisms11020455.

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-22T22:14:07Z

Špela Deučman: /* VPLIV GENSKEGA EKSPRESIJSKEGA SISTEMA CcS/CcR NA EKSPRESIJO BUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1186/s12934-021-01732-x S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.]

== UVOD ==
Hitra rast svetovnega prebivalstva skupaj z naraščajočim povpraševanjem po fosilnih gorivih in povečanimi emisijami CO2 je povzročila večjo potrebo po razvoju trajnostnih virov energije in kemikalij iz obnovljivih virov. V zadnjih desetletjih je bilo veliko raziskav osredotočenih na prepoznavanje trajnostnih metod za proizvodnjo obnovljivih biogoriv [1], [2].

Izobutanol je pomembna spojina kot alternativno gorivo zaradi visoke vsebnosti energije (98 % vsebnosti energije v bencinu) in nižjega parnega tlaka v primerjavi z etanolom. Poleg tega ima izobutanol nižjo vsebnost O2 in nižjo topnost v vodi kot etanol, kar pomeni, da je mogoče v bencin vmešati več izobutanola, medtem pa imamo še vedno nizko vsebnost O2 v končnem izdelku [2].

Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za sintezo izobutanola zaradi svoje sposobnosti, da s fotosintezo pretvarjajo CO2 neposredno v kemične spojine z dodano vrednostjo. S cianobakterijami lahko proizvajamo etanol, izobutiraldehid, izobutanol, 1-butanol, sukcinat, 2,3-butandiol, terpenoide, klorofile, maščobne kisline, sladkor in aminokisline [3]–[5].

Zmožne so tudi vezati atmosferski dušik in zato zavzemajo pomembno vlogo v dušikovem ciklu. Cianobakterije, ki vežejo N2, so še posebej zanimive za raziskovalce, ki se ukvarjajo z razvojem industrijskih sevov za proizvodnjo »zelenih« kemikalij, kot so limonen, farnezen, linalol in mircen [1].

== SINTEZA IZOBUTANOLA IN 3-METIL-1-IZOBUTANOLA V CIANOBAKTERIJAH ==

Izobutanol in 3-metil-1-butanol sta pomembna alkohola, saj lahko služita kot alternativa bencinu in ju je mogoče sintetizirati po poti biosinteze aminokislin v cianobakterijah. Najpogostejša sintezna pot za biosintezo izobutanola je pot 2-keto kislin, ki si deli prekurzor (α-ketoizovalerat) s sintezno potjo biosinteze L-valina. 3-metil-1-butanol si deli prekurzor (2-ketoizokaproat) s sintezno potjo biosinteze L-levcina [2].

Biosintezna pot izobutanola vsebuje več encimov. Kodirajo jih geni alsS (''Bacillus subtilis''), ilvC (''E. coli''), ilvD (''E. coli''), ketokislinska dekarboksilaza (kdc) (''Lactococcus lactis'') in alkoholna dehidrogenaza (adh) (''E. coli'') [2], [3].

α-ketoizovalerat dekarboksilaza (Kivd oz. kdc) iz ''L. lactis'', ki dekarboksilira α-keto kisline v aldehide, je pomemben encim v poti 2-keto kislin in je bil uporabljen pri ''E. coli'', ''S.cerevisiae'', ''Corynebacterium glutamicum'' in cianobakterijah za proizvodnjo izobutiraldehida in izobutanola. KDC je homotetramer, njegova optimalna aktivnost je bila opažena pri 45 °C (pH 6,5) in ima visoko specifičnost za α-ketoizovalerat. Poleg tega je bil Kivd oz. kdc zasnovan za uporabo večjega substrata za proizvodnjo alkoholov z daljšo verigo. Cianobakterije so pritegnile pozornost raziskovalcev zaradi zmožnosti izvajanja fotosinteze, in posledične porabe atmosferskega CO2, ter nizke potrebe po hranilih, visoke tolerance na različna okolja in nezahtevnega genskega inženiringa [2].

== NAČINI VNOSA DNA V CIANOBAKTERIJE ==

Učinkovit prenos eksogene DNA v cianobakterije lahko dosežemo z uporabo suicidalnih vektorjev za prenos kromosomskih genov. To vključuje integracijo DNA fragmenta v kromosome cianobakterij z dvojno homologno rekombinacijo in transformacijo samopodvajajočih plazmidov [5].
Za ohranjanje spremenjenega genotipa je pomembno, da je mutacija stabilna, kar pomeni, da mora biti v vseh kopijah kromosomov. Ta pogoj popolne segregacije genoma je dolgotrajen, saj je večina cianobakterij poliploidnih [5].
Ugotovljeno je bilo, da sta zmanjšanje koncentracije fosfata in agarja v rastnem mediju ter visoka temperatura ključni parametri za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije. Tekom raziskav so znanstveniki ugotovili, da se proces pospeši, če je v mediju nižja koncentracija fosfatov in nižja koncentracija agarja. Hkrati pa mora biti temperatura višja. Ti parametri so ključni za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije [5].

Samopodvajajoče se plazmide in prenosne plazmide lahko uporabimo kot alternativo za izražanje heterolognih genov. Na ta način se zamudnemu procesu popolne segregacije. Prenosni vektorji, ki se lahko razmnožujejo v E. coli in cianobakterijah, olajšajo kloniranje in vzdrževanje plazmidov. Njihovi glavni pomanjkljivosti pa sta ozek spekter območje gostiteljev in majhno število kopij na celico [5].

Seveda pa še obstaja konjugacija, elektroporacija in »naravna« transformacija.

'''Konjugacija'''

Konjugacija je zelo razširjena in pogosto uporabljena metoda za prenos DNA v cianobakterije. Zanjo je značilna visoka učinkovitost in širok spekter uporabnosti med različnimi vrstami. Pri konjugaciji se uporabita dva različna seva ''E. coli'', in sicer pomožni sev, ki vsebuje konjugativni plazmid (ta nosi mob gene, potrebne za mobilizacijo genetskih elementov) in donorski sev, ki nosi pomožni plazmid, na katerem se nahaja izvor replikacije (oriT), zaporedje, potrebno za konjugacijo, in geni, jih želimo prenesti v cianobakterije. Nekatere vrste potrebujejo dodatne vektorje za optimizacijo učinkovitosti konjugacije [5].

'''Elektroporacija'''

Elektroporacija vključuje uporabo močnega električnega polja, ki ustvari pore v celični membrani cianobakterij. Doslej je bila elektroporacija uspešno uporabljena samo pri nekaterih vrstah cianobakterij. Optimalni pogoji (napetost in trajanje impulza) so vrstno specifični. V nekaterih sevih so elektroporacijo uspešno uporabili za vnost linearnih fragmentov DNA, vendar pa so ti fragmenti izpostavljeni razgradnji z nukleazami. Učinkovitost lahko povečamo z dodajanjem EDTA [5].

'''Naravna transformacija'''

Naravna transformacija opisuje privzem in vzdrževanje eksogene DNA. Pri cianobakterijah retraktilni pilus T4P vzpostavi stik z zunajcelično DNA in z retrakcijo vnese tujo DNA v celico. Znano je, da je več cianobakterij naravno kompetentnih. »Naravno« transformacijo je možno ustvariti tudi z genskim inženiringom. Uvedba gena pilN iz seva Syn7942 v Syn2973 je privedla do pridobitve sposobnosti naravne transformacije, čeprav z nižjo učinkovitostjo kot pri Syn7942. Učinkovitost privzema je odvisna od koncentracije in dolžine DNA, uporabljenega seva cianobakterije in faze rasti. Sposobnost Syn70020s in Syn68030s se drastično zmanjša od eksponentne do stacionarne faze. Opazili so tudi, da ima cirkadiani ritem tudi vlogo pri učinkovitosti transformacije cianobakterij, in sicer geni za pile so prekomerno izraženi v temi ali slabih svetlobnih pogojih. Posledično se s tem poveča tudi kompetentnost cianobakterij v temi [5].

== MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH ==

Večina pristopov sintezne biologije, ki delujejo v heterotrofnih organizmih, kot je ''E. coli'', ni mogoče uporabiti v cianobakterijah. Na primer, promotorji in RBS, ki močno modulirajo izražanje genov v ''E. coli'', ne delujejo dobro v cianobakterijah. Če se osredotočimo samo na povečanje izražanja genov s promotorskim inženiringom, opazimo, da se pri cianobakterijah uporabljajo močni konstitutivni nativni promotorji, sintetični inducibilni promotorji, kemično inducibilni promotorji in okoljsko inducibilni promotorji [5].

Do danes je bilo opisanihh le nekaj močnih konstitutivnih promotorjev, ki pa so pogosto omejeni na samo nekatere vrste in moč izražanja genov niha s cirkadianim ritmom. Sintetični inducibilni promotorji delujejo v različnih vrstah cianobakterij [5]. Kemično inducibilni promotorji, npr. arabinozni inducibilni promotor, so najpogosteje uporabljeni promotorji, vendar pa niso primerni za velike industrijske bioprocese [3], [5]. Uporaba zunanjih kemičnih induktorjev ni zaželena, saj poveča proizvodne stroške in predstavlja tveganje za okolje, na primer zaradi uporabe težkih kovin. Slednji problem lahko rešimo z uporabo promotorjev, na katere vplivajo okoljski oz. fizični signali kot sta npr. kisik in svetloba.

Znanstveniki so ustvarili s temo inducibilni genski ekspresijski sistem, ki temelji na dvokomponentnem sistemu EnvZ/OmpR iz ''E. coli''. Prav tako so izkoristili prisotnost fikobilisoma v cianobakterijah. Ustvarili so na svetlobo občutljiv genski ekspresijski sistem, ki je sestavljen iz senzorja za zeleno svetlobo CcS, efektorskega elementa CcR ter promotor PcpcG2, ki regulira ekspresijo gena za linker cpcG2 fikobilisoma. Na podlagi sistema za preklop iz aerobnega v anaerobni metabolizem (FNR) iz ''E. coli'' so ustvarili prilagojen sistem v sevu Syn6803 cianobakterij. Z uporabo tega sistema in promotorja PFNR o ustvarili genski ekspresijski sistem, ki se odziva na prisotnost kisika [5].

== VPLIV GENSKEGA EKSPRESIJSKEGA SISTEMA CcS/CcR NA EKSPRESIJO BUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST ==

V izbranem članku so avtorji želeli pokazati, da s svetlobo inducibilnim promotorjem lahko pridobimo večjo količino izobutanola in 3-metil-1-butanola in da so posledično bolj ekonomični ter obvladljivi genetski ekspresijski sistemi kot sistemi s kemikalijami inducibilnimi promotorji. Poleg tega so tudi vključili vpliv integracije tega genskega ekspresijskega sistema na rast cianobakterij [3].

Za gostiteljski organizem so izbrali cianobakterijo ''Synechocystis sp.'' PCC 6803. V ''E. coli'' K-12 so pripravili 3 različne konstrukte oz. vektorje z inserti [3].

Kot osnovo so uporabili vektor pKT-GSS. Prvi konstrukt so poimenovali pKT-GSS-KDC-ADH. Gena kdc in adh sta bila vstavljena za promotorjem PcpcG2. Sev PCC 6803 ima integriran sistem CcS/CcR. Ta sistem lahko inducira izražanje eksogenih genov iz promotorja PcpcG2 kot odziv na radiacijo z zeleno svetlobo in zavira izražanje genov kot odziv na radiacijo z rdečo svetlobo. V osnovni vektor so vstavili dva gena, potrebna za proizvodnjo alkoholov, in sicer kdc, ki vsebuje zapis za ketokislinsko dekarboksilazo (KDC) in je pridobljen iz ''L. lactis'', ter slr1192, ki vsbuje zapis za alkoholno dehidrogenazo (ADH) in je pridobljen iz PCC 6803. Uporaba kodonov med sevom ''E. coli'' K-12 in PCC 6803 je podobna, zato ni bila potrebna optimizacija rabe kodonov za gen kdc. Pred zapisoma genov kdc in adh so vstavili sekvenco podobno Shine-Dalgarnovem zapordju iz gena cpcB organizma ''Synechococcus sp.'' PCC 7002. Ekspresija genov kdc in adh je bila inducirana z obsevanjem z zeleno svetlobo. Sinteza izobutanola in 3-metil-1-butanola je bila uspešna [3].

Rast, transkripcija in proizvodnjo izobutanola ter 3-metil-1-butanola so določili z gojenjem celic PCC 6803ΔGSS. To je sev z delecijo genomskega sistema CcaS/CcaR in PcpcG2. V ta sev so vnesli vektor pKT-GSS-KDC-ADH in nato celice obsevali z rdečo in zeleno svetlobo (induktivni pogoji: 520 nm, 660 nm; 60 μmol m−2 s−1) ali samo z rdečo svetlobo (660 nm, 30 μmol m−2 s−1). Rdeča svetloba je potrebna za fotosintezo in ni znatno vplivala na ekspresijo genov pod promotorjem PcpcG2. Zaradi slednjega razloga so celice obsevali tako z zeleno kot rdečo svetlobo. Spremembe v intenzivnosti in/ali valovni dolžini svetlobe lahko aktivirajo metabolizem gostitelja, rast celic in bioprodukcijo. Čeprav je bila za indukcijo uporabljena dvakrat večja intenziteta svetlobe, so pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo opazili rahlo zakasnitev rasti celic v primerjavi z obsevanjem z rdečo svetlobo. Zakasnitev v rasti celic so pripisali integraciji genov kdc in adh v genom. Slednje ni znatno vplivalo na produkcijo alkoholov [3].

Opazovali so tudi transkripcijsko aktivnost celic. Pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo so v celicah PCC 6803ΔGSS z pKT-GSSKDC-ADH opazili petkrat višjo raven transkripcije gena kdc v primerjavi s tisto pri osvetlitvi z rdečo svetlobo pri 4 urah. Slednje ponovno potrdi njihovo domnevo [3].

Titri proizvodnje izobutanola in 3-metil-1-butanola so se povečevali do petega dne pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo ter dosegli 166 mg L-1 izobutanola in 51 mg L-1 3-metil-1-butanola v 5 dneh. Pri obsevanju z rdečo svetlobo pa je sev PCC 6803ΔGSS z pKT-GSSKDC-ADH proizvedel samo 19 mg L-1 izobutanola in 9 mg L-1 3-metil-1-butanola v 5 dneh [3].

Ustvarili so tudi kontrolni sev. Ta sev je imel zapise za gena kdc in adh pod nadzorom močnega konstitutivnega promotorja Ptrc-core. Koncentracija izobutanola, proizvedena v kontrolnem sevu, je znašala približno 5 mg L-1, koncentracija 3-metil-1-butanola pa je bila pod mejo zaznave. V primerjavi s sevom s sistemom CcaS/CcaR je kontrolni sev počasno rastel [3].

== ZAKLJUČEK ==

== Viri ==
[1] T. J. Johnson, J. L. Gibbons, L. Gu, R. Zhou, and W. R. Gibbons, “Molecular genetic improvements of cyanobacteria to enhance the industrial potential of the microbe: A review,” Biotechnol. Prog., vol. 32, no. 6, pp. 1357–1371, 2016, doi: 10.1002/btpr.2358.

[2] R. Miao, X. Liu, E. Englund, P. Lindberg, and P. Lindblad, “Isobutanol production in Synechocystis PCC 6803 using heterologous and endogenous alcohol dehydrogenases,” Metab. Eng. Commun., vol. 5, no. June, pp. 45–53, 2017, doi: 10.1016/j.meteno.2017.07.003.

[3] S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.

[4] S. Kobayashi et al., “Application of an engineered chromatic acclimation sensor for red-light-regulated gene expression in cyanobacteria,” Algal Res., vol. 44, no. October, p. 101691, 2019, doi: 10.1016/j.algal.2019.101691.

[5] A. Satta, L. Esquirol, and B. E. Ebert, “Current Metabolic Engineering Strategies for Photosynthetic Bioproduction in Cyanobacteria,” Microorganisms, vol. 11, no. 2, pp. 1–34, 2023, doi: 10.3390/microorganisms11020455.

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-22T21:51:28Z

Špela Deučman:

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1186/s12934-021-01732-x S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.]

== UVOD ==
Hitra rast svetovnega prebivalstva skupaj z naraščajočim povpraševanjem po fosilnih gorivih in povečanimi emisijami CO2 je povzročila večjo potrebo po razvoju trajnostnih virov energije in kemikalij iz obnovljivih virov. V zadnjih desetletjih je bilo veliko raziskav osredotočenih na prepoznavanje trajnostnih metod za proizvodnjo obnovljivih biogoriv [1], [2].

Izobutanol je pomembna spojina kot alternativno gorivo zaradi visoke vsebnosti energije (98 % vsebnosti energije v bencinu) in nižjega parnega tlaka v primerjavi z etanolom. Poleg tega ima izobutanol nižjo vsebnost O2 in nižjo topnost v vodi kot etanol, kar pomeni, da je mogoče v bencin vmešati več izobutanola, medtem pa imamo še vedno nizko vsebnost O2 v končnem izdelku [2].

Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za sintezo izobutanola zaradi svoje sposobnosti, da s fotosintezo pretvarjajo CO2 neposredno v kemične spojine z dodano vrednostjo. S cianobakterijami lahko proizvajamo etanol, izobutiraldehid, izobutanol, 1-butanol, sukcinat, 2,3-butandiol, terpenoide, klorofile, maščobne kisline, sladkor in aminokisline [3]–[5].

Zmožne so tudi vezati atmosferski dušik in zato zavzemajo pomembno vlogo v dušikovem ciklu. Cianobakterije, ki vežejo N2, so še posebej zanimive za raziskovalce, ki se ukvarjajo z razvojem industrijskih sevov za proizvodnjo »zelenih« kemikalij, kot so limonen, farnezen, linalol in mircen [1].

== SINTEZA IZOBUTANOLA IN 3-METIL-1-IZOBUTANOLA V CIANOBAKTERIJAH ==

Izobutanol in 3-metil-1-butanol sta pomembna alkohola, saj lahko služita kot alternativa bencinu in ju je mogoče sintetizirati po poti biosinteze aminokislin v cianobakterijah. Najpogostejša sintezna pot za biosintezo izobutanola je pot 2-keto kislin, ki si deli prekurzor (α-ketoizovalerat) s sintezno potjo biosinteze L-valina. 3-metil-1-butanol si deli prekurzor (2-ketoizokaproat) s sintezno potjo biosinteze L-levcina [2].

Biosintezna pot izobutanola vsebuje več encimov. Kodirajo jih geni alsS (''Bacillus subtilis''), ilvC (''E. coli''), ilvD (''E. coli''), ketokislinska dekarboksilaza (kdc) (''Lactococcus lactis'') in alkoholna dehidrogenaza (adh) (''E. coli'') [2], [3].

α-ketoizovalerat dekarboksilaza (Kivd oz. kdc) iz ''L. lactis'', ki dekarboksilira α-keto kisline v aldehide, je pomemben encim v poti 2-keto kislin in je bil uporabljen pri ''E. coli'', ''S.cerevisiae'', ''Corynebacterium glutamicum'' in cianobakterijah za proizvodnjo izobutiraldehida in izobutanola. KDC je homotetramer, njegova optimalna aktivnost je bila opažena pri 45 °C (pH 6,5) in ima visoko specifičnost za α-ketoizovalerat. Poleg tega je bil Kivd oz. kdc zasnovan za uporabo večjega substrata za proizvodnjo alkoholov z daljšo verigo. Cianobakterije so pritegnile pozornost raziskovalcev zaradi zmožnosti izvajanja fotosinteze, in posledične porabe atmosferskega CO2, ter nizke potrebe po hranilih, visoke tolerance na različna okolja in nezahtevnega genskega inženiringa [2].

== NAČINI VNOSA DNA V CIANOBAKTERIJE ==

Učinkovit prenos eksogene DNA v cianobakterije lahko dosežemo z uporabo suicidalnih vektorjev za prenos kromosomskih genov. To vključuje integracijo DNA fragmenta v kromosome cianobakterij z dvojno homologno rekombinacijo in transformacijo samopodvajajočih plazmidov [5].
Za ohranjanje spremenjenega genotipa je pomembno, da je mutacija stabilna, kar pomeni, da mora biti v vseh kopijah kromosomov. Ta pogoj popolne segregacije genoma je dolgotrajen, saj je večina cianobakterij poliploidnih [5].
Ugotovljeno je bilo, da sta zmanjšanje koncentracije fosfata in agarja v rastnem mediju ter visoka temperatura ključni parametri za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije. Tekom raziskav so znanstveniki ugotovili, da se proces pospeši, če je v mediju nižja koncentracija fosfatov in nižja koncentracija agarja. Hkrati pa mora biti temperatura višja. Ti parametri so ključni za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije [5].

Samopodvajajoče se plazmide in prenosne plazmide lahko uporabimo kot alternativo za izražanje heterolognih genov. Na ta način se zamudnemu procesu popolne segregacije. Prenosni vektorji, ki se lahko razmnožujejo v E. coli in cianobakterijah, olajšajo kloniranje in vzdrževanje plazmidov. Njihovi glavni pomanjkljivosti pa sta ozek spekter območje gostiteljev in majhno število kopij na celico [5].

Seveda pa še obstaja konjugacija, elektroporacija in »naravna« transformacija.

'''Konjugacija'''

Konjugacija je zelo razširjena in pogosto uporabljena metoda za prenos DNA v cianobakterije. Zanjo je značilna visoka učinkovitost in širok spekter uporabnosti med različnimi vrstami. Pri konjugaciji se uporabita dva različna seva ''E. coli'', in sicer pomožni sev, ki vsebuje konjugativni plazmid (ta nosi mob gene, potrebne za mobilizacijo genetskih elementov) in donorski sev, ki nosi pomožni plazmid, na katerem se nahaja izvor replikacije (oriT), zaporedje, potrebno za konjugacijo, in geni, jih želimo prenesti v cianobakterije. Nekatere vrste potrebujejo dodatne vektorje za optimizacijo učinkovitosti konjugacije [5].

'''Elektroporacija'''

Elektroporacija vključuje uporabo močnega električnega polja, ki ustvari pore v celični membrani cianobakterij. Doslej je bila elektroporacija uspešno uporabljena samo pri nekaterih vrstah cianobakterij. Optimalni pogoji (napetost in trajanje impulza) so vrstno specifični. V nekaterih sevih so elektroporacijo uspešno uporabili za vnost linearnih fragmentov DNA, vendar pa so ti fragmenti izpostavljeni razgradnji z nukleazami. Učinkovitost lahko povečamo z dodajanjem EDTA [5].

'''Naravna transformacija'''

Naravna transformacija opisuje privzem in vzdrževanje eksogene DNA. Pri cianobakterijah retraktilni pilus T4P vzpostavi stik z zunajcelično DNA in z retrakcijo vnese tujo DNA v celico. Znano je, da je več cianobakterij naravno kompetentnih. »Naravno« transformacijo je možno ustvariti tudi z genskim inženiringom. Uvedba gena pilN iz seva Syn7942 v Syn2973 je privedla do pridobitve sposobnosti naravne transformacije, čeprav z nižjo učinkovitostjo kot pri Syn7942. Učinkovitost privzema je odvisna od koncentracije in dolžine DNA, uporabljenega seva cianobakterije in faze rasti. Sposobnost Syn70020s in Syn68030s se drastično zmanjša od eksponentne do stacionarne faze. Opazili so tudi, da ima cirkadiani ritem tudi vlogo pri učinkovitosti transformacije cianobakterij, in sicer geni za pile so prekomerno izraženi v temi ali slabih svetlobnih pogojih. Posledično se s tem poveča tudi kompetentnost cianobakterij v temi [5].

== MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH ==

Večina pristopov sintezne biologije, ki delujejo v heterotrofnih organizmih, kot je ''E. coli'', ni mogoče uporabiti v cianobakterijah. Na primer, promotorji in RBS, ki močno modulirajo izražanje genov v ''E. coli'', ne delujejo dobro v cianobakterijah. Če se osredotočimo samo na povečanje izražanja genov s promotorskim inženiringom, opazimo, da se pri cianobakterijah uporabljajo močni konstitutivni nativni promotorji, sintetični inducibilni promotorji, kemično inducibilni promotorji in okoljsko inducibilni promotorji [5].

Do danes je bilo opisanihh le nekaj močnih konstitutivnih promotorjev, ki pa so pogosto omejeni na samo nekatere vrste in moč izražanja genov niha s cirkadianim ritmom. Sintetični inducibilni promotorji delujejo v različnih vrstah cianobakterij [5]. Kemično inducibilni promotorji, npr. arabinozni inducibilni promotor, so najpogosteje uporabljeni promotorji, vendar pa niso primerni za velike industrijske bioprocese [3], [5]. Uporaba zunanjih kemičnih induktorjev ni zaželena, saj poveča proizvodne stroške in predstavlja tveganje za okolje, na primer zaradi uporabe težkih kovin. Slednji problem lahko rešimo z uporabo promotorjev, na katere vplivajo okoljski oz. fizični signali kot sta npr. kisik in svetloba.

Znanstveniki so ustvarili s temo inducibilni genski ekspresijski sistem, ki temelji na dvokomponentnem sistemu EnvZ/OmpR iz ''E. coli''. Prav tako so izkoristili prisotnost fikobilisoma v cianobakterijah. Ustvarili so na svetlobo občutljiv genski ekspresijski sistem, ki je sestavljen iz senzorja za zeleno svetlobo CcS, efektorskega elementa CcR ter promotor PcpcG2, ki regulira ekspresijo gena za linker cpcG2 fikobilisoma. Na podlagi sistema za preklop iz aerobnega v anaerobni metabolizem (FNR) iz ''E. coli'' so ustvarili prilagojen sistem v sevu Syn6803 cianobakterij. Z uporabo tega sistema in promotorja PFNR o ustvarili genski ekspresijski sistem, ki se odziva na prisotnost kisika [5].

== VPLIV GENSKEGA EKSPRESIJSKEGA SISTEMA CcS/CcR NA EKSPRESIJO BUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST ==

V izbranem članku so avtorji želeli pokazati, da s svetlobo inducibilnim promotorjem lahko pridobimo večjo količino izobutanola in 3-metil-1-butanola in da so posledično bolj ekonomični ter obvladljivi genetski ekspresijski sistemi kot sistemi s kemikalijami inducibilnimi promotorji. Poleg tega so tudi vključili vpliv integracije tega genskega ekspresijskega sistema na rast cianobakterij [3].

Za gostiteljski organizem so izbrali cianobakterijo ''Synechocystis sp.'' PCC 6803. V ''E. coli'' K-12 so pripravili 3 različne konstrukte oz. vektorje z inserti [3].

Kot osnovo so uporabili vektor pKT-GSS. Prvi konstrukt so poimenovali pKT-GSS-KDC-ADH. Gena kdc in adh sta bila vstavljena za promotorjem PcpcG2. Sev PCC 6803 ima integriran sistem CcS/CcR. Ta sistem lahko inducira izražanje eksogenih genov iz promotorja PcpcG2 kot odziv na radiacijo z zeleno svetlobo in zavira izražanje genov kot odziv na radiacijo z rdečo svetlobo. V osnovni vektor so vstavili dva gena, potrebna za proizvodnjo alkoholov, in sicer kdc, ki vsebuje zapis za ketokislinsko dekarboksilazo (KDC) in je pridobljen iz ''L. lactis'', ter slr1192, ki vsbuje zapis za alkoholno dehidrogenazo (ADH) in je pridobljen iz PCC 6803. Uporaba kodonov med sevom ''E. coli'' K-12 in PCC 6803 je podobna, zato ni bila potrebna optimizacija rabe kodonov za gen kdc. Pred zapisoma genov kdc in adh so vstavili sekvenco podobno Shine-Dalgarnovem zapordju iz gena cpcB organizma ''Synechococcus sp.'' PCC 7002. Ekspresija genov kdc in adh je bila inducirana z obsevanjem z zeleno svetlobo. Sinteza izobutanola in 3-metil-1-butanola je bila uspešna [3].

Rast, transkripcija in proizvodnjo izobutanola ter 3-metil-1-butanola so določili z gojenjem celic PCC 6803ΔGSS. To je sev z delecijo genomskega sistema CcaS/CcaR in PcpcG2. V ta sev so vnesli vektor pKT-GSS-KDC-ADH in nato celice obsevali z rdečo in zeleno svetlobo (induktivni pogoji: 520 nm, 660 nm; 60 μmol m−2 s−1) ali samo z rdečo svetlobo (660 nm, 30 μmol m−2 s−1). Rdeča svetloba je potrebna za fotosintezo in ni znatno vplivala na ekspresijo genov pod promotorjem PcpcG2. Zaradi slednjega razloga so celice obsevali tako z zeleno kot rdečo svetlobo. Spremembe v intenzivnosti in/ali valovni dolžini svetlobe lahko aktivirajo metabolizem gostitelja, rast celic in bioprodukcijo. Čeprav je bila za indukcijo uporabljena dvakrat večja intenziteta svetlobe, so pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo opazili rahlo zakasnitev rasti celic v primerjavi z obsevanjem z rdečo svetlobo. Zakasnitev v rasti celic so pripisali integraciji genov kdc in adh v genom. Slednje ni znatno vplivalo na produkcijo alkoholov [3].

== ZAKLJUČEK ==

== Viri ==
[1] T. J. Johnson, J. L. Gibbons, L. Gu, R. Zhou, and W. R. Gibbons, “Molecular genetic improvements of cyanobacteria to enhance the industrial potential of the microbe: A review,” Biotechnol. Prog., vol. 32, no. 6, pp. 1357–1371, 2016, doi: 10.1002/btpr.2358.

[2] R. Miao, X. Liu, E. Englund, P. Lindberg, and P. Lindblad, “Isobutanol production in Synechocystis PCC 6803 using heterologous and endogenous alcohol dehydrogenases,” Metab. Eng. Commun., vol. 5, no. June, pp. 45–53, 2017, doi: 10.1016/j.meteno.2017.07.003.

[3] S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.

[4] S. Kobayashi et al., “Application of an engineered chromatic acclimation sensor for red-light-regulated gene expression in cyanobacteria,” Algal Res., vol. 44, no. October, p. 101691, 2019, doi: 10.1016/j.algal.2019.101691.

[5] A. Satta, L. Esquirol, and B. E. Ebert, “Current Metabolic Engineering Strategies for Photosynthetic Bioproduction in Cyanobacteria,” Microorganisms, vol. 11, no. 2, pp. 1–34, 2023, doi: 10.3390/microorganisms11020455.

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-22T21:50:51Z

Špela Deučman: /* SINTEZA IZOBUTANOLA IN 3-METIL-1-IZOBUTANOLA V CIANOBAKTERIJAH */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1186/s12934-021-01732-x S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.]

== UVOD ==
Hitra rast svetovnega prebivalstva skupaj z naraščajočim povpraševanjem po fosilnih gorivih in povečanimi emisijami CO2 je povzročila večjo potrebo po razvoju trajnostnih virov energije in kemikalij iz obnovljivih virov. V zadnjih desetletjih je bilo veliko raziskav osredotočenih na prepoznavanje trajnostnih metod za proizvodnjo obnovljivih biogoriv [1], [2].

Izobutanol je pomembna spojina kot alternativno gorivo zaradi visoke vsebnosti energije (98 % vsebnosti energije v bencinu) in nižjega parnega tlaka v primerjavi z etanolom. Poleg tega ima izobutanol nižjo vsebnost O2 in nižjo topnost v vodi kot etanol, kar pomeni, da je mogoče v bencin vmešati več izobutanola, medtem pa imamo še vedno nizko vsebnost O2 v končnem izdelku [2].

Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za sintezo izobutanola zaradi svoje sposobnosti, da s fotosintezo pretvarjajo CO2 neposredno v kemične spojine z dodano vrednostjo. S cianobakterijami lahko proizvajamo etanol, izobutiraldehid, izobutanol, 1-butanol, sukcinat, 2,3-butandiol, terpenoide, klorofile, maščobne kisline, sladkor in aminokisline [3]–[5].

Zmožne so tudi vezati atmosferski dušik in zato zavzemajo pomembno vlogo v dušikovem ciklu. Cianobakterije, ki vežejo N2, so še posebej zanimive za raziskovalce, ki se ukvarjajo z razvojem industrijskih sevov za proizvodnjo »zelenih« kemikalij, kot so limonen, farnezen, linalol in mircen [1].

== SINTEZA IZOBUTANOLA IN 3-METIL-1-IZOBUTANOLA V CIANOBAKTERIJAH ==

Izobutanol in 3-metil-1-butanol sta pomembna alkohola, saj lahko služita kot alternativa bencinu in ju je mogoče sintetizirati po poti biosinteze aminokislin v cianobakterijah. Najpogostejša sintezna pot za biosintezo izobutanola je pot 2-keto kislin, ki si deli prekurzor (α-ketoizovalerat) s sintezno potjo biosinteze L-valina. 3-metil-1-butanol si deli prekurzor (2-ketoizokaproat) s sintezno potjo biosinteze L-levcina [2].

Biosintezna pot izobutanola vsebuje več encimov. Kodirajo jih geni alsS (''Bacillus subtilis''), ilvC (''E. coli''), ilvD (''E. coli''), ketokislinska dekarboksilaza (kdc) (''Lactococcus lactis'') in alkoholna dehidrogenaza (adh) (''E. coli'') [2], [3].

α-ketoizovalerat dekarboksilaza (Kivd oz. kdc) iz ''L. lactis'', ki dekarboksilira α-keto kisline v aldehide, je pomemben encim v poti 2-keto kislin in je bil uporabljen pri ''E. coli'', ''S.cerevisiae'', ''Corynebacterium glutamicum'' in cianobakterijah za proizvodnjo izobutiraldehida in izobutanola. KDC je homotetramer, njegova optimalna aktivnost je bila opažena pri 45 °C (pH 6,5) in ima visoko specifičnost za α-ketoizovalerat. Poleg tega je bil Kivd oz. kdc zasnovan za uporabo večjega substrata za proizvodnjo alkoholov z daljšo verigo. Cianobakterije so pritegnile pozornost raziskovalcev zaradi zmožnosti izvajanja fotosinteze, in posledične porabe atmosferskega CO2, ter nizke potrebe po hranilih, visoke tolerance na različna okolja in nezahtevnega genskega inženiringa [2].

== NAČINI VNOSA DNA V CIANOBAKTERIJE ==

Učinkovit prenos eksogene DNA v cianobakterije lahko dosežemo z uporabo suicidalnih vektorjev za prenos kromosomskih genov. To vključuje integracijo DNA fragmenta v kromosome cianobakterij z dvojno homologno rekombinacijo in transformacijo samopodvajajočih plazmidov [5].
Za ohranjanje spremenjenega genotipa je pomembno, da je mutacija stabilna, kar pomeni, da mora biti v vseh kopijah kromosomov. Ta pogoj popolne segregacije genoma je dolgotrajen, saj je večina cianobakterij poliploidnih [5].
Ugotovljeno je bilo, da sta zmanjšanje koncentracije fosfata in agarja v rastnem mediju ter visoka temperatura ključni parametri za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije. Tekom raziskav so znanstveniki ugotovili, da se proces pospeši, če je v mediju nižja koncentracija fosfatov in nižja koncentracija agarja. Hkrati pa mora biti temperatura višja. Ti parametri so ključni za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije [5].

Samopodvajajoče se plazmide in prenosne plazmide lahko uporabimo kot alternativo za izražanje heterolognih genov. Na ta način se zamudnemu procesu popolne segregacije. Prenosni vektorji, ki se lahko razmnožujejo v E. coli in cianobakterijah, olajšajo kloniranje in vzdrževanje plazmidov. Njihovi glavni pomanjkljivosti pa sta ozek spekter območje gostiteljev in majhno število kopij na celico [5].

Seveda pa še obstaja konjugacija, elektroporacija in »naravna« transformacija.

'''Konjugacija'''

Konjugacija je zelo razširjena in pogosto uporabljena metoda za prenos DNA v cianobakterije. Zanjo je značilna visoka učinkovitost in širok spekter uporabnosti med različnimi vrstami. Pri konjugaciji se uporabita dva različna seva ''E. coli'', in sicer pomožni sev, ki vsebuje konjugativni plazmid (ta nosi mob gene, potrebne za mobilizacijo genetskih elementov) in donorski sev, ki nosi pomožni plazmid, na katerem se nahaja izvor replikacije (oriT), zaporedje, potrebno za konjugacijo, in geni, jih želimo prenesti v cianobakterije. Nekatere vrste potrebujejo dodatne vektorje za optimizacijo učinkovitosti konjugacije [5].

'''Elektroporacija'''

Elektroporacija vključuje uporabo močnega električnega polja, ki ustvari pore v celični membrani cianobakterij. Doslej je bila elektroporacija uspešno uporabljena samo pri nekaterih vrstah cianobakterij. Optimalni pogoji (napetost in trajanje impulza) so vrstno specifični. V nekaterih sevih so elektroporacijo uspešno uporabili za vnost linearnih fragmentov DNA, vendar pa so ti fragmenti izpostavljeni razgradnji z nukleazami. Učinkovitost lahko povečamo z dodajanjem EDTA [5].

'''Naravna transformacija'''

Naravna transformacija opisuje privzem in vzdrževanje eksogene DNA. Pri cianobakterijah retraktilni pilus T4P vzpostavi stik z zunajcelično DNA in z retrakcijo vnese tujo DNA v celico. Znano je, da je več cianobakterij naravno kompetentnih. »Naravno« transformacijo je možno ustvariti tudi z genskim inženiringom. Uvedba gena pilN iz seva Syn7942 v Syn2973 je privedla do pridobitve sposobnosti naravne transformacije, čeprav z nižjo učinkovitostjo kot pri Syn7942. Učinkovitost privzema je odvisna od koncentracije in dolžine DNA, uporabljenega seva cianobakterije in faze rasti. Sposobnost Syn70020s in Syn68030s se drastično zmanjša od eksponentne do stacionarne faze. Opazili so tudi, da ima cirkadiani ritem tudi vlogo pri učinkovitosti transformacije cianobakterij, in sicer geni za pile so prekomerno izraženi v temi ali slabih svetlobnih pogojih. Posledično se s tem poveča tudi kompetentnost cianobakterij v temi [5].

== MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH ==

Večina pristopov sintezne biologije, ki delujejo v heterotrofnih organizmih, kot je ''E. coli'', ni mogoče uporabiti v cianobakterijah. Na primer, promotorji in RBS, ki močno modulirajo izražanje genov v ''E. coli'', ne delujejo dobro v cianobakterijah. Če se osredotočimo samo na povečanje izražanja genov s promotorskim inženiringom, opazimo, da se pri cianobakterijah uporabljajo močni konstitutivni nativni promotorji, sintetični inducibilni promotorji, kemično inducibilni promotorji in okoljsko inducibilni promotorji [5].

Do danes je bilo opisanihh le nekaj močnih konstitutivnih promotorjev, ki pa so pogosto omejeni na samo nekatere vrste in moč izražanja genov niha s cirkadianim ritmom. Sintetični inducibilni promotorji delujejo v različnih vrstah cianobakterij [5]. Kemično inducibilni promotorji, npr. arabinozni inducibilni promotor, so najpogosteje uporabljeni promotorji, vendar pa niso primerni za velike industrijske bioprocese [3], [5]. Uporaba zunanjih kemičnih induktorjev ni zaželena, saj poveča proizvodne stroške in predstavlja tveganje za okolje, na primer zaradi uporabe težkih kovin. Slednji problem lahko rešimo z uporabo promotorjev, na katere vplivajo okoljski oz. fizični signali kot sta npr. kisik in svetloba.

Znanstveniki so ustvarili s temo inducibilni genski ekspresijski sistem, ki temelji na dvokomponentnem sistemu EnvZ/OmpR iz ''E. coli''. Prav tako so izkoristili prisotnost fikobilisoma v cianobakterijah. Ustvarili so na svetlobo občutljiv genski ekspresijski sistem, ki je sestavljen iz senzorja za zeleno svetlobo CcS, efektorskega elementa CcR ter promotor PcpcG2, ki regulira ekspresijo gena za linker cpcG2 fikobilisoma. Na podlagi sistema za preklop iz aerobnega v anaerobni metabolizem (FNR) iz ''E. coli'' so ustvarili prilagojen sistem v sevu Syn6803 cianobakterij. Z uporabo tega sistema in promotorja PFNR o ustvarili genski ekspresijski sistem, ki se odziva na prisotnost kisika [5].

== VPLIV GENSKEGA EKSPRESIJSKEGA SISTEMA CcS/CcR NA EKSPRESIJO BUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST ==

V izbranem članku so avtorji želeli pokazati, da s svetlobo inducibilnim promotorjem lahko pridobimo večjo količino izobutanola in 3-metil-1-butanola in da so posledično bolj ekonomični ter obvladljivi genetski ekspresijski sistemi kot sistemi s kemikalijami inducibilnimi promotorji. Poleg tega so tudi vključili vpliv integracije tega genskega ekspresijskega sistema na rast cianobakterij [3].

Za gostiteljski organizem so izbrali cianobakterijo ''Synechocystis sp.'' PCC 6803. V ''E. coli'' K-12 so pripravili 3 različne konstrukte oz. vektorje z inserti [3].

Kot osnovo so uporabili vektor pKT-GSS. Prvi konstrukt so poimenovali pKT-GSS-KDC-ADH. Gena kdc in adh sta bila vstavljena za promotorjem PcpcG2. Sev PCC 6803 ima integriran sistem CcS/CcR. Ta sistem lahko inducira izražanje eksogenih genov iz promotorja PcpcG2 kot odziv na radiacijo z zeleno svetlobo in zavira izražanje genov kot odziv na radiacijo z rdečo svetlobo. V osnovni vektor so vstavili dva gena, potrebna za proizvodnjo alkoholov, in sicer kdc, ki vsebuje zapis za ketokislinsko dekarboksilazo (KDC) in je pridobljen iz ''L. lactis'', ter slr1192, ki vsbuje zapis za alkoholno dehidrogenazo (ADH) in je pridobljen iz PCC 6803. Uporaba kodonov med sevom ''E. coli'' K-12 in PCC 6803 je podobna, zato ni bila potrebna optimizacija rabe kodonov za gen kdc. Pred zapisoma genov kdc in adh so vstavili sekvenco podobno Shine-Dalgarnovem zapordju iz gena cpcB organizma ''Synechococcus sp.'' PCC 7002. Ekspresija genov kdc in adh je bila inducirana z obsevanjem z zeleno svetlobo. Sinteza izobutanola in 3-metil-1-butanola je bila uspešna [3].

Rast, transkripcija in proizvodnjo izobutanola ter 3-metil-1-butanola so določili z gojenjem celic PCC 6803ΔGSS. To je sev z delecijo genomskega sistema CcaS/CcaR in PcpcG2. V ta sev so vnesli vektor pKT-GSS-KDC-ADH in nato celice obsevali z rdečo in zeleno svetlobo (induktivni pogoji: 520 nm, 660 nm; 60 μmol m−2 s−1) ali samo z rdečo svetlobo (660 nm, 30 μmol m−2 s−1). Rdeča svetloba je potrebna za fotosintezo in ni znatno vplivala na ekspresijo genov pod promotorjem PcpcG2. Zaradi slednjega razloga so celice obsevali tako z zeleno kot rdečo svetlobo. Spremembe v intenzivnosti in/ali valovni dolžini svetlobe lahko aktivirajo metabolizem gostitelja, rast celic in bioprodukcijo. Čeprav je bila za indukcijo uporabljena dvakrat večja intenziteta svetlobe, so pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo opazili rahlo zakasnitev rasti celic v primerjavi z obsevanjem z rdečo svetlobo. Zakasnitev v rasti celic so pripisali integraciji genov kdc in adh v genom. Slednje ni znatno vplivalo na produkcijo alkoholov [3].

== ZAKLJUČEK ==

== Viri ==
[1] T. J. Johnson, J. L. Gibbons, L. Gu, R. Zhou, and W. R. Gibbons, “Molecular genetic improvements of cyanobacteria to enhance the industrial potential of the microbe: A review,” Biotechnol. Prog., vol. 32, no. 6, pp. 1357–1371, 2016, doi: 10.1002/btpr.2358.

[2] R. Miao, X. Liu, E. Englund, P. Lindberg, and P. Lindblad, “Isobutanol production in Synechocystis PCC 6803 using heterologous and endogenous alcohol dehydrogenases,” Metab. Eng. Commun., vol. 5, no. June, pp. 45–53, 2017, doi: 10.1016/j.meteno.2017.07.003.

[3] S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.

[4] S. Kobayashi et al., “Application of an engineered chromatic acclimation sensor for red-light-regulated gene expression in cyanobacteria,” Algal Res., vol. 44, no. October, p. 101691, 2019, doi: 10.1016/j.algal.2019.101691.

[5] A. Satta, L. Esquirol, and B. E. Ebert, “Current Metabolic Engineering Strategies for Photosynthetic Bioproduction in Cyanobacteria,” Microorganisms, vol. 11, no. 2, pp. 1–34, 2023, doi: 10.3390/microorganisms11020455.

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-22T21:23:09Z

Špela Deučman: /* VPLIV INTEGRACIJE SISTEMA, INDUCIBILNEGA Z ZELENO SVETLOBO, NA EKSPRESIJO BUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1186/s12934-021-01732-x S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.]

== UVOD ==
Hitra rast svetovnega prebivalstva skupaj z naraščajočim povpraševanjem po fosilnih gorivih in povečanimi emisijami CO2 je povzročila večjo potrebo po razvoju trajnostnih virov energije in kemikalij iz obnovljivih virov. V zadnjih desetletjih je bilo veliko raziskav osredotočenih na prepoznavanje trajnostnih metod za proizvodnjo obnovljivih biogoriv [1], [2].

Izobutanol je pomembna spojina kot alternativno gorivo zaradi visoke vsebnosti energije (98 % vsebnosti energije v bencinu) in nižjega parnega tlaka v primerjavi z etanolom. Poleg tega ima izobutanol nižjo vsebnost O2 in nižjo topnost v vodi kot etanol, kar pomeni, da je mogoče v bencin vmešati več izobutanola, medtem pa imamo še vedno nizko vsebnost O2 v končnem izdelku [2].

Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za sintezo izobutanola zaradi svoje sposobnosti, da s fotosintezo pretvarjajo CO2 neposredno v kemične spojine z dodano vrednostjo. S cianobakterijami lahko proizvajamo etanol, izobutiraldehid, izobutanol, 1-butanol, sukcinat, 2,3-butandiol, terpenoide, klorofile, maščobne kisline, sladkor in aminokisline [3]–[5].

Zmožne so tudi vezati atmosferski dušik in zato zavzemajo pomembno vlogo v dušikovem ciklu. Cianobakterije, ki vežejo N2, so še posebej zanimive za raziskovalce, ki se ukvarjajo z razvojem industrijskih sevov za proizvodnjo »zelenih« kemikalij, kot so limonen, farnezen, linalol in mircen [1].

== SINTEZA IZOBUTANOLA IN 3-METIL-1-IZOBUTANOLA V CIANOBAKTERIJAH ==

Najpogostejša sintezna pot za biosintezo izobutanola je pot 2-keto kislin, ki si deli prekurzor (α-ketoizovalerat) s sintezno potjo biosinteze L-valina. α-ketoizovalerat dekarboksilaza (Kivd) iz ''Lactococcus lactis'', ki dekarboksilira α-keto kisline v aldehide, je pomemben encim v poti 2-keto kislin in je bil uporabljen pri ''Escherichia coli'', ''Saccharomyces cerevisiae'', ''Corynebacterium glutamicum'' in cianobakterije za proizvodnjo izobutiraldehida in izobutanola. Kivd je homotetramer, njegova optimalna aktivnost je bila opažena pri 45 °C (pH 6,5) in ima visoko specifičnost za α-ketoizovalerat. Poleg tega je bil Kivd zasnovan za uporabo večjega substrata za proizvodnjo alkoholov z daljšo verigo. Cianobakterije so pritegnile pozornost raziskovalcev zaradi zmožnosti izvajanja fotosinteze, in posledične porabe atmosferskega CO2, ter nizke potrebe po hranilih, visoke tolerance na različna okolja in nezahtevnega genskega inženiringa [2].

== NAČINI VNOSA DNA V CIANOBAKTERIJE ==

Učinkovit prenos eksogene DNA v cianobakterije lahko dosežemo z uporabo suicidalnih vektorjev za prenos kromosomskih genov. To vključuje integracijo DNA fragmenta v kromosome cianobakterij z dvojno homologno rekombinacijo in transformacijo samopodvajajočih plazmidov [5].
Za ohranjanje spremenjenega genotipa je pomembno, da je mutacija stabilna, kar pomeni, da mora biti v vseh kopijah kromosomov. Ta pogoj popolne segregacije genoma je dolgotrajen, saj je večina cianobakterij poliploidnih [5].
Ugotovljeno je bilo, da sta zmanjšanje koncentracije fosfata in agarja v rastnem mediju ter visoka temperatura ključni parametri za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije. Tekom raziskav so znanstveniki ugotovili, da se proces pospeši, če je v mediju nižja koncentracija fosfatov in nižja koncentracija agarja. Hkrati pa mora biti temperatura višja. Ti parametri so ključni za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije [5].

Samopodvajajoče se plazmide in prenosne plazmide lahko uporabimo kot alternativo za izražanje heterolognih genov. Na ta način se zamudnemu procesu popolne segregacije. Prenosni vektorji, ki se lahko razmnožujejo v E. coli in cianobakterijah, olajšajo kloniranje in vzdrževanje plazmidov. Njihovi glavni pomanjkljivosti pa sta ozek spekter območje gostiteljev in majhno število kopij na celico [5].

Seveda pa še obstaja konjugacija, elektroporacija in »naravna« transformacija.

'''Konjugacija'''

Konjugacija je zelo razširjena in pogosto uporabljena metoda za prenos DNA v cianobakterije. Zanjo je značilna visoka učinkovitost in širok spekter uporabnosti med različnimi vrstami. Pri konjugaciji se uporabita dva različna seva ''E. coli'', in sicer pomožni sev, ki vsebuje konjugativni plazmid (ta nosi mob gene, potrebne za mobilizacijo genetskih elementov) in donorski sev, ki nosi pomožni plazmid, na katerem se nahaja izvor replikacije (oriT), zaporedje, potrebno za konjugacijo, in geni, jih želimo prenesti v cianobakterije. Nekatere vrste potrebujejo dodatne vektorje za optimizacijo učinkovitosti konjugacije [5].

'''Elektroporacija'''

Elektroporacija vključuje uporabo močnega električnega polja, ki ustvari pore v celični membrani cianobakterij. Doslej je bila elektroporacija uspešno uporabljena samo pri nekaterih vrstah cianobakterij. Optimalni pogoji (napetost in trajanje impulza) so vrstno specifični. V nekaterih sevih so elektroporacijo uspešno uporabili za vnost linearnih fragmentov DNA, vendar pa so ti fragmenti izpostavljeni razgradnji z nukleazami. Učinkovitost lahko povečamo z dodajanjem EDTA [5].

'''Naravna transformacija'''

Naravna transformacija opisuje privzem in vzdrževanje eksogene DNA. Pri cianobakterijah retraktilni pilus T4P vzpostavi stik z zunajcelično DNA in z retrakcijo vnese tujo DNA v celico. Znano je, da je več cianobakterij naravno kompetentnih. »Naravno« transformacijo je možno ustvariti tudi z genskim inženiringom. Uvedba gena pilN iz seva Syn7942 v Syn2973 je privedla do pridobitve sposobnosti naravne transformacije, čeprav z nižjo učinkovitostjo kot pri Syn7942. Učinkovitost privzema je odvisna od koncentracije in dolžine DNA, uporabljenega seva cianobakterije in faze rasti. Sposobnost Syn70020s in Syn68030s se drastično zmanjša od eksponentne do stacionarne faze. Opazili so tudi, da ima cirkadiani ritem tudi vlogo pri učinkovitosti transformacije cianobakterij, in sicer geni za pile so prekomerno izraženi v temi ali slabih svetlobnih pogojih. Posledično se s tem poveča tudi kompetentnost cianobakterij v temi [5].

== MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH ==

Večina pristopov sintezne biologije, ki delujejo v heterotrofnih organizmih, kot je ''E. coli'', ni mogoče uporabiti v cianobakterijah. Na primer, promotorji in RBS, ki močno modulirajo izražanje genov v ''E. coli'', ne delujejo dobro v cianobakterijah. Če se osredotočimo samo na povečanje izražanja genov s promotorskim inženiringom, opazimo, da se pri cianobakterijah uporabljajo močni konstitutivni nativni promotorji, sintetični inducibilni promotorji, kemično inducibilni promotorji in okoljsko inducibilni promotorji [5].

Do danes je bilo opisanihh le nekaj močnih konstitutivnih promotorjev, ki pa so pogosto omejeni na samo nekatere vrste in moč izražanja genov niha s cirkadianim ritmom. Sintetični inducibilni promotorji delujejo v različnih vrstah cianobakterij [5]. Kemično inducibilni promotorji, npr. arabinozni inducibilni promotor, so najpogosteje uporabljeni promotorji, vendar pa niso primerni za velike industrijske bioprocese [3], [5]. Uporaba zunanjih kemičnih induktorjev ni zaželena, saj poveča proizvodne stroške in predstavlja tveganje za okolje, na primer zaradi uporabe težkih kovin. Slednji problem lahko rešimo z uporabo promotorjev, na katere vplivajo okoljski oz. fizični signali kot sta npr. kisik in svetloba.

Znanstveniki so ustvarili s temo inducibilni genski ekspresijski sistem, ki temelji na dvokomponentnem sistemu EnvZ/OmpR iz ''E. coli''. Prav tako so izkoristili prisotnost fikobilisoma v cianobakterijah. Ustvarili so na svetlobo občutljiv genski ekspresijski sistem, ki je sestavljen iz senzorja za zeleno svetlobo CcS, efektorskega elementa CcR ter promotor PcpcG2, ki regulira ekspresijo gena za linker cpcG2 fikobilisoma. Na podlagi sistema za preklop iz aerobnega v anaerobni metabolizem (FNR) iz ''E. coli'' so ustvarili prilagojen sistem v sevu Syn6803 cianobakterij. Z uporabo tega sistema in promotorja PFNR o ustvarili genski ekspresijski sistem, ki se odziva na prisotnost kisika [5].

== VPLIV GENSKEGA EKSPRESIJSKEGA SISTEMA CcS/CcR NA EKSPRESIJO BUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST ==

V izbranem članku so avtorji želeli pokazati, da s svetlobo inducibilnim promotorjem lahko pridobimo večjo količino izobutanola in 3-metil-1-butanola in da so posledično bolj ekonomični ter obvladljivi genetski ekspresijski sistemi kot sistemi s kemikalijami inducibilnimi promotorji. Poleg tega so tudi vključili vpliv integracije tega genskega ekspresijskega sistema na rast cianobakterij [3].

Za gostiteljski organizem so izbrali cianobakterijo ''Synechocystis sp.'' PCC 6803. V ''E. coli'' K-12 so pripravili 3 različne konstrukte oz. vektorje z inserti [3].

Kot osnovo so uporabili vektor pKT-GSS. Prvi konstrukt so poimenovali pKT-GSS-KDC-ADH. Gena kdc in adh sta bila vstavljena za promotorjem PcpcG2. Sev PCC 6803 ima integriran sistem CcS/CcR. Ta sistem lahko inducira izražanje eksogenih genov iz promotorja PcpcG2 kot odziv na radiacijo z zeleno svetlobo in zavira izražanje genov kot odziv na radiacijo z rdečo svetlobo. V osnovni vektor so vstavili dva gena, potrebna za proizvodnjo alkoholov, in sicer kdc, ki vsebuje zapis za ketokislinsko dekarboksilazo (KDC) in je pridobljen iz ''L. lactis'', ter slr1192, ki vsbuje zapis za alkoholno dehidrogenazo (ADH) in je pridobljen iz PCC 6803. Uporaba kodonov med sevom ''E. coli'' K-12 in PCC 6803 je podobna, zato ni bila potrebna optimizacija rabe kodonov za gen kdc. Pred zapisoma genov kdc in adh so vstavili sekvenco podobno Shine-Dalgarnovem zapordju iz gena cpcB organizma ''Synechococcus sp.'' PCC 7002. Ekspresija genov kdc in adh je bila inducirana z obsevanjem z zeleno svetlobo. Sinteza izobutanola in 3-metil-1-butanola je bila uspešna [3].

Rast, transkripcija in proizvodnjo izobutanola ter 3-metil-1-butanola so določili z gojenjem celic PCC 6803ΔGSS. To je sev z delecijo genomskega sistema CcaS/CcaR in PcpcG2. V ta sev so vnesli vektor pKT-GSS-KDC-ADH in nato celice obsevali z rdečo in zeleno svetlobo (induktivni pogoji: 520 nm, 660 nm; 60 μmol m−2 s−1) ali samo z rdečo svetlobo (660 nm, 30 μmol m−2 s−1). Rdeča svetloba je potrebna za fotosintezo in ni znatno vplivala na ekspresijo genov pod promotorjem PcpcG2. Zaradi slednjega razloga so celice obsevali tako z zeleno kot rdečo svetlobo. Spremembe v intenzivnosti in/ali valovni dolžini svetlobe lahko aktivirajo metabolizem gostitelja, rast celic in bioprodukcijo. Čeprav je bila za indukcijo uporabljena dvakrat večja intenziteta svetlobe, so pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo opazili rahlo zakasnitev rasti celic v primerjavi z obsevanjem z rdečo svetlobo. Zakasnitev v rasti celic so pripisali integraciji genov kdc in adh v genom. Slednje ni znatno vplivalo na produkcijo alkoholov [3].

== ZAKLJUČEK ==

== Viri ==
[1] T. J. Johnson, J. L. Gibbons, L. Gu, R. Zhou, and W. R. Gibbons, “Molecular genetic improvements of cyanobacteria to enhance the industrial potential of the microbe: A review,” Biotechnol. Prog., vol. 32, no. 6, pp. 1357–1371, 2016, doi: 10.1002/btpr.2358.

[2] R. Miao, X. Liu, E. Englund, P. Lindberg, and P. Lindblad, “Isobutanol production in Synechocystis PCC 6803 using heterologous and endogenous alcohol dehydrogenases,” Metab. Eng. Commun., vol. 5, no. June, pp. 45–53, 2017, doi: 10.1016/j.meteno.2017.07.003.

[3] S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.

[4] S. Kobayashi et al., “Application of an engineered chromatic acclimation sensor for red-light-regulated gene expression in cyanobacteria,” Algal Res., vol. 44, no. October, p. 101691, 2019, doi: 10.1016/j.algal.2019.101691.

[5] A. Satta, L. Esquirol, and B. E. Ebert, “Current Metabolic Engineering Strategies for Photosynthetic Bioproduction in Cyanobacteria,” Microorganisms, vol. 11, no. 2, pp. 1–34, 2023, doi: 10.3390/microorganisms11020455.

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-22T21:13:27Z

Špela Deučman: /* VPLIV INTEGRACIJE SISTEMA, INDUCIBILNEGA Z ZELENO SVETLOBO, NA EKSPRESIJO BUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1186/s12934-021-01732-x S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.]

== UVOD ==
Hitra rast svetovnega prebivalstva skupaj z naraščajočim povpraševanjem po fosilnih gorivih in povečanimi emisijami CO2 je povzročila večjo potrebo po razvoju trajnostnih virov energije in kemikalij iz obnovljivih virov. V zadnjih desetletjih je bilo veliko raziskav osredotočenih na prepoznavanje trajnostnih metod za proizvodnjo obnovljivih biogoriv [1], [2].

Izobutanol je pomembna spojina kot alternativno gorivo zaradi visoke vsebnosti energije (98 % vsebnosti energije v bencinu) in nižjega parnega tlaka v primerjavi z etanolom. Poleg tega ima izobutanol nižjo vsebnost O2 in nižjo topnost v vodi kot etanol, kar pomeni, da je mogoče v bencin vmešati več izobutanola, medtem pa imamo še vedno nizko vsebnost O2 v končnem izdelku [2].

Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za sintezo izobutanola zaradi svoje sposobnosti, da s fotosintezo pretvarjajo CO2 neposredno v kemične spojine z dodano vrednostjo. S cianobakterijami lahko proizvajamo etanol, izobutiraldehid, izobutanol, 1-butanol, sukcinat, 2,3-butandiol, terpenoide, klorofile, maščobne kisline, sladkor in aminokisline [3]–[5].

Zmožne so tudi vezati atmosferski dušik in zato zavzemajo pomembno vlogo v dušikovem ciklu. Cianobakterije, ki vežejo N2, so še posebej zanimive za raziskovalce, ki se ukvarjajo z razvojem industrijskih sevov za proizvodnjo »zelenih« kemikalij, kot so limonen, farnezen, linalol in mircen [1].

== SINTEZA IZOBUTANOLA IN 3-METIL-1-IZOBUTANOLA V CIANOBAKTERIJAH ==

Najpogostejša sintezna pot za biosintezo izobutanola je pot 2-keto kislin, ki si deli prekurzor (α-ketoizovalerat) s sintezno potjo biosinteze L-valina. α-ketoizovalerat dekarboksilaza (Kivd) iz ''Lactococcus lactis'', ki dekarboksilira α-keto kisline v aldehide, je pomemben encim v poti 2-keto kislin in je bil uporabljen pri ''Escherichia coli'', ''Saccharomyces cerevisiae'', ''Corynebacterium glutamicum'' in cianobakterije za proizvodnjo izobutiraldehida in izobutanola. Kivd je homotetramer, njegova optimalna aktivnost je bila opažena pri 45 °C (pH 6,5) in ima visoko specifičnost za α-ketoizovalerat. Poleg tega je bil Kivd zasnovan za uporabo večjega substrata za proizvodnjo alkoholov z daljšo verigo. Cianobakterije so pritegnile pozornost raziskovalcev zaradi zmožnosti izvajanja fotosinteze, in posledične porabe atmosferskega CO2, ter nizke potrebe po hranilih, visoke tolerance na različna okolja in nezahtevnega genskega inženiringa [2].

== NAČINI VNOSA DNA V CIANOBAKTERIJE ==

Učinkovit prenos eksogene DNA v cianobakterije lahko dosežemo z uporabo suicidalnih vektorjev za prenos kromosomskih genov. To vključuje integracijo DNA fragmenta v kromosome cianobakterij z dvojno homologno rekombinacijo in transformacijo samopodvajajočih plazmidov [5].
Za ohranjanje spremenjenega genotipa je pomembno, da je mutacija stabilna, kar pomeni, da mora biti v vseh kopijah kromosomov. Ta pogoj popolne segregacije genoma je dolgotrajen, saj je večina cianobakterij poliploidnih [5].
Ugotovljeno je bilo, da sta zmanjšanje koncentracije fosfata in agarja v rastnem mediju ter visoka temperatura ključni parametri za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije. Tekom raziskav so znanstveniki ugotovili, da se proces pospeši, če je v mediju nižja koncentracija fosfatov in nižja koncentracija agarja. Hkrati pa mora biti temperatura višja. Ti parametri so ključni za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije [5].

Samopodvajajoče se plazmide in prenosne plazmide lahko uporabimo kot alternativo za izražanje heterolognih genov. Na ta način se zamudnemu procesu popolne segregacije. Prenosni vektorji, ki se lahko razmnožujejo v E. coli in cianobakterijah, olajšajo kloniranje in vzdrževanje plazmidov. Njihovi glavni pomanjkljivosti pa sta ozek spekter območje gostiteljev in majhno število kopij na celico [5].

Seveda pa še obstaja konjugacija, elektroporacija in »naravna« transformacija.

'''Konjugacija'''

Konjugacija je zelo razširjena in pogosto uporabljena metoda za prenos DNA v cianobakterije. Zanjo je značilna visoka učinkovitost in širok spekter uporabnosti med različnimi vrstami. Pri konjugaciji se uporabita dva različna seva ''E. coli'', in sicer pomožni sev, ki vsebuje konjugativni plazmid (ta nosi mob gene, potrebne za mobilizacijo genetskih elementov) in donorski sev, ki nosi pomožni plazmid, na katerem se nahaja izvor replikacije (oriT), zaporedje, potrebno za konjugacijo, in geni, jih želimo prenesti v cianobakterije. Nekatere vrste potrebujejo dodatne vektorje za optimizacijo učinkovitosti konjugacije [5].

'''Elektroporacija'''

Elektroporacija vključuje uporabo močnega električnega polja, ki ustvari pore v celični membrani cianobakterij. Doslej je bila elektroporacija uspešno uporabljena samo pri nekaterih vrstah cianobakterij. Optimalni pogoji (napetost in trajanje impulza) so vrstno specifični. V nekaterih sevih so elektroporacijo uspešno uporabili za vnost linearnih fragmentov DNA, vendar pa so ti fragmenti izpostavljeni razgradnji z nukleazami. Učinkovitost lahko povečamo z dodajanjem EDTA [5].

'''Naravna transformacija'''

Naravna transformacija opisuje privzem in vzdrževanje eksogene DNA. Pri cianobakterijah retraktilni pilus T4P vzpostavi stik z zunajcelično DNA in z retrakcijo vnese tujo DNA v celico. Znano je, da je več cianobakterij naravno kompetentnih. »Naravno« transformacijo je možno ustvariti tudi z genskim inženiringom. Uvedba gena pilN iz seva Syn7942 v Syn2973 je privedla do pridobitve sposobnosti naravne transformacije, čeprav z nižjo učinkovitostjo kot pri Syn7942. Učinkovitost privzema je odvisna od koncentracije in dolžine DNA, uporabljenega seva cianobakterije in faze rasti. Sposobnost Syn70020s in Syn68030s se drastično zmanjša od eksponentne do stacionarne faze. Opazili so tudi, da ima cirkadiani ritem tudi vlogo pri učinkovitosti transformacije cianobakterij, in sicer geni za pile so prekomerno izraženi v temi ali slabih svetlobnih pogojih. Posledično se s tem poveča tudi kompetentnost cianobakterij v temi [5].

== MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH ==

Večina pristopov sintezne biologije, ki delujejo v heterotrofnih organizmih, kot je ''E. coli'', ni mogoče uporabiti v cianobakterijah. Na primer, promotorji in RBS, ki močno modulirajo izražanje genov v ''E. coli'', ne delujejo dobro v cianobakterijah. Če se osredotočimo samo na povečanje izražanja genov s promotorskim inženiringom, opazimo, da se pri cianobakterijah uporabljajo močni konstitutivni nativni promotorji, sintetični inducibilni promotorji, kemično inducibilni promotorji in okoljsko inducibilni promotorji [5].

Do danes je bilo opisanihh le nekaj močnih konstitutivnih promotorjev, ki pa so pogosto omejeni na samo nekatere vrste in moč izražanja genov niha s cirkadianim ritmom. Sintetični inducibilni promotorji delujejo v različnih vrstah cianobakterij [5]. Kemično inducibilni promotorji, npr. arabinozni inducibilni promotor, so najpogosteje uporabljeni promotorji, vendar pa niso primerni za velike industrijske bioprocese [3], [5]. Uporaba zunanjih kemičnih induktorjev ni zaželena, saj poveča proizvodne stroške in predstavlja tveganje za okolje, na primer zaradi uporabe težkih kovin. Slednji problem lahko rešimo z uporabo promotorjev, na katere vplivajo okoljski oz. fizični signali kot sta npr. kisik in svetloba.

Znanstveniki so ustvarili s temo inducibilni genski ekspresijski sistem, ki temelji na dvokomponentnem sistemu EnvZ/OmpR iz ''E. coli''. Prav tako so izkoristili prisotnost fikobilisoma v cianobakterijah. Ustvarili so na svetlobo občutljiv genski ekspresijski sistem, ki je sestavljen iz senzorja za zeleno svetlobo CcS, efektorskega elementa CcR ter promotor PcpcG2, ki regulira ekspresijo gena za linker cpcG2 fikobilisoma. Na podlagi sistema za preklop iz aerobnega v anaerobni metabolizem (FNR) iz ''E. coli'' so ustvarili prilagojen sistem v sevu Syn6803 cianobakterij. Z uporabo tega sistema in promotorja PFNR o ustvarili genski ekspresijski sistem, ki se odziva na prisotnost kisika [5].

== VPLIV INTEGRACIJE SISTEMA, INDUCIBILNEGA Z ZELENO SVETLOBO, NA EKSPRESIJO BUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST ==

V izbranem članku so avtorji želeli pokazati, da s svetlobo inducibilnim promotorjem lahko pridobimo večjo količino izobutanola in 3-metil-1-butanola in da so posledično bolj ekonomični ter obvladljivi genetski ekspresijski sistemi kot sistemi s kemikalijami inducibilnimi promotorji. Poleg tega so tudi vključili vpliv integracije tega genskega ekspresijskega sistema na rast cianobakterij [3].

Za gostiteljski organizem so izbrali cianobakterijo ''Synechocystis sp.'' PCC 6803. V ''E. coli'' K-12 so pripravili 3 različne konstrukte oz. vektorje z inserti [3].

Kot osnovo so uporabili vektor pKT-GSS. Prvi konstrukt so poimenovali pKT-GSS-KDC-ADH. Gena kdc in adh sta bila vstavljena za promotorjem PcpcG2. Sev PCC 6803 ima integriran sistem CcS/CcR. Ta sistem lahko inducira izražanje eksogenih genov iz promotorja PcpcG2 kot odziv na radiacijo z zeleno svetlobo in zavira izražanje genov kot odziv na radiacijo z rdečo svetlobo. V osnovni vektor so vstavili dva gena, potrebna za proizvodnjo alkoholov, in sicer kdc, ki vsebuje zapis za ketokislinsko dekarboksilazo (KDC) in je pridobljen iz ''L. lactis'', ter slr1192, ki vsbuje zapis za alkoholno dehidrogenazo (ADH) in je pridobljen iz PCC 6803. Uporaba kodonov med sevom ''E. coli'' K-12 in PCC 6803 je podobna, zato ni bila potrebna optimizacija rabe kodonov za gen kdc. Pred zapisoma genov kdc in adh so vstavili sekvenco podobno Shine-Dalgarnovem zapordju iz gena cpcB organizma ''Synechococcus sp.'' PCC 7002. Ekspresija genov kdc in adh je bila inducirana z obsevanjem z zeleno svetlobo. Sinteza izobutanola in 3-metil-1-butanola je bila uspešna [3].

Rast, transkripcija in proizvodnjo izobutanola ter 3-metil-1-butanola so določili z gojenjem celic PCC 6803ΔGSS. To je sev z delecijo genomskega sistema CcaS/CcaR in PcpcG2. V ta sev so vnesli vektor pKT-GSS-KDC-ADH in nato celice obsevali z rdečo in zeleno svetlobo (induktivni pogoji: 520 nm, 660 nm; 60 μmol m−2 s−1) ali samo z rdečo svetlobo (660 nm, 30 μmol m−2 s−1). Rdeča svetloba je potrebna za fotosintezo in ni znatno vplivala na ekspresijo genov pod promotorjem PcpcG2. Zaradi slednjega razloga so celice obsevali tako z zeleno kot rdečo svetlobo. Spremembe v intenzivnosti in/ali valovni dolžini svetlobe lahko aktivirajo metabolizem gostitelja, rast celic in bioprodukcijo. Čeprav je bila za indukcijo uporabljena dvakrat večja intenziteta svetlobe, so pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo opazili rahlo zakasnitev rasti celic v primerjavi z obsevanjem z rdečo svetlobo. Zakasnitev v rasti celic so pripisali integraciji genov kdc in adh v genom. Slednje ni znatno vplivalo na produkcijo alkoholov [3].

== ZAKLJUČEK ==

== Viri ==
[1] T. J. Johnson, J. L. Gibbons, L. Gu, R. Zhou, and W. R. Gibbons, “Molecular genetic improvements of cyanobacteria to enhance the industrial potential of the microbe: A review,” Biotechnol. Prog., vol. 32, no. 6, pp. 1357–1371, 2016, doi: 10.1002/btpr.2358.

[2] R. Miao, X. Liu, E. Englund, P. Lindberg, and P. Lindblad, “Isobutanol production in Synechocystis PCC 6803 using heterologous and endogenous alcohol dehydrogenases,” Metab. Eng. Commun., vol. 5, no. June, pp. 45–53, 2017, doi: 10.1016/j.meteno.2017.07.003.

[3] S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.

[4] S. Kobayashi et al., “Application of an engineered chromatic acclimation sensor for red-light-regulated gene expression in cyanobacteria,” Algal Res., vol. 44, no. October, p. 101691, 2019, doi: 10.1016/j.algal.2019.101691.

[5] A. Satta, L. Esquirol, and B. E. Ebert, “Current Metabolic Engineering Strategies for Photosynthetic Bioproduction in Cyanobacteria,” Microorganisms, vol. 11, no. 2, pp. 1–34, 2023, doi: 10.3390/microorganisms11020455.

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-22T21:08:47Z

Špela Deučman: /* VPLIV INTEGRACIJE SISTEMA, INDUCIBILNEGA Z ZELENO SVETLOBO, NA EKSPRESIJO BUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1186/s12934-021-01732-x S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.]

== UVOD ==
Hitra rast svetovnega prebivalstva skupaj z naraščajočim povpraševanjem po fosilnih gorivih in povečanimi emisijami CO2 je povzročila večjo potrebo po razvoju trajnostnih virov energije in kemikalij iz obnovljivih virov. V zadnjih desetletjih je bilo veliko raziskav osredotočenih na prepoznavanje trajnostnih metod za proizvodnjo obnovljivih biogoriv [1], [2].

Izobutanol je pomembna spojina kot alternativno gorivo zaradi visoke vsebnosti energije (98 % vsebnosti energije v bencinu) in nižjega parnega tlaka v primerjavi z etanolom. Poleg tega ima izobutanol nižjo vsebnost O2 in nižjo topnost v vodi kot etanol, kar pomeni, da je mogoče v bencin vmešati več izobutanola, medtem pa imamo še vedno nizko vsebnost O2 v končnem izdelku [2].

Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za sintezo izobutanola zaradi svoje sposobnosti, da s fotosintezo pretvarjajo CO2 neposredno v kemične spojine z dodano vrednostjo. S cianobakterijami lahko proizvajamo etanol, izobutiraldehid, izobutanol, 1-butanol, sukcinat, 2,3-butandiol, terpenoide, klorofile, maščobne kisline, sladkor in aminokisline [3]–[5].

Zmožne so tudi vezati atmosferski dušik in zato zavzemajo pomembno vlogo v dušikovem ciklu. Cianobakterije, ki vežejo N2, so še posebej zanimive za raziskovalce, ki se ukvarjajo z razvojem industrijskih sevov za proizvodnjo »zelenih« kemikalij, kot so limonen, farnezen, linalol in mircen [1].

== SINTEZA IZOBUTANOLA IN 3-METIL-1-IZOBUTANOLA V CIANOBAKTERIJAH ==

Najpogostejša sintezna pot za biosintezo izobutanola je pot 2-keto kislin, ki si deli prekurzor (α-ketoizovalerat) s sintezno potjo biosinteze L-valina. α-ketoizovalerat dekarboksilaza (Kivd) iz ''Lactococcus lactis'', ki dekarboksilira α-keto kisline v aldehide, je pomemben encim v poti 2-keto kislin in je bil uporabljen pri ''Escherichia coli'', ''Saccharomyces cerevisiae'', ''Corynebacterium glutamicum'' in cianobakterije za proizvodnjo izobutiraldehida in izobutanola. Kivd je homotetramer, njegova optimalna aktivnost je bila opažena pri 45 °C (pH 6,5) in ima visoko specifičnost za α-ketoizovalerat. Poleg tega je bil Kivd zasnovan za uporabo večjega substrata za proizvodnjo alkoholov z daljšo verigo. Cianobakterije so pritegnile pozornost raziskovalcev zaradi zmožnosti izvajanja fotosinteze, in posledične porabe atmosferskega CO2, ter nizke potrebe po hranilih, visoke tolerance na različna okolja in nezahtevnega genskega inženiringa [2].

== NAČINI VNOSA DNA V CIANOBAKTERIJE ==

Učinkovit prenos eksogene DNA v cianobakterije lahko dosežemo z uporabo suicidalnih vektorjev za prenos kromosomskih genov. To vključuje integracijo DNA fragmenta v kromosome cianobakterij z dvojno homologno rekombinacijo in transformacijo samopodvajajočih plazmidov [5].
Za ohranjanje spremenjenega genotipa je pomembno, da je mutacija stabilna, kar pomeni, da mora biti v vseh kopijah kromosomov. Ta pogoj popolne segregacije genoma je dolgotrajen, saj je večina cianobakterij poliploidnih [5].
Ugotovljeno je bilo, da sta zmanjšanje koncentracije fosfata in agarja v rastnem mediju ter visoka temperatura ključni parametri za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije. Tekom raziskav so znanstveniki ugotovili, da se proces pospeši, če je v mediju nižja koncentracija fosfatov in nižja koncentracija agarja. Hkrati pa mora biti temperatura višja. Ti parametri so ključni za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije [5].

Samopodvajajoče se plazmide in prenosne plazmide lahko uporabimo kot alternativo za izražanje heterolognih genov. Na ta način se zamudnemu procesu popolne segregacije. Prenosni vektorji, ki se lahko razmnožujejo v E. coli in cianobakterijah, olajšajo kloniranje in vzdrževanje plazmidov. Njihovi glavni pomanjkljivosti pa sta ozek spekter območje gostiteljev in majhno število kopij na celico [5].

Seveda pa še obstaja konjugacija, elektroporacija in »naravna« transformacija.

'''Konjugacija'''

Konjugacija je zelo razširjena in pogosto uporabljena metoda za prenos DNA v cianobakterije. Zanjo je značilna visoka učinkovitost in širok spekter uporabnosti med različnimi vrstami. Pri konjugaciji se uporabita dva različna seva ''E. coli'', in sicer pomožni sev, ki vsebuje konjugativni plazmid (ta nosi mob gene, potrebne za mobilizacijo genetskih elementov) in donorski sev, ki nosi pomožni plazmid, na katerem se nahaja izvor replikacije (oriT), zaporedje, potrebno za konjugacijo, in geni, jih želimo prenesti v cianobakterije. Nekatere vrste potrebujejo dodatne vektorje za optimizacijo učinkovitosti konjugacije [5].

'''Elektroporacija'''

Elektroporacija vključuje uporabo močnega električnega polja, ki ustvari pore v celični membrani cianobakterij. Doslej je bila elektroporacija uspešno uporabljena samo pri nekaterih vrstah cianobakterij. Optimalni pogoji (napetost in trajanje impulza) so vrstno specifični. V nekaterih sevih so elektroporacijo uspešno uporabili za vnost linearnih fragmentov DNA, vendar pa so ti fragmenti izpostavljeni razgradnji z nukleazami. Učinkovitost lahko povečamo z dodajanjem EDTA [5].

'''Naravna transformacija'''

Naravna transformacija opisuje privzem in vzdrževanje eksogene DNA. Pri cianobakterijah retraktilni pilus T4P vzpostavi stik z zunajcelično DNA in z retrakcijo vnese tujo DNA v celico. Znano je, da je več cianobakterij naravno kompetentnih. »Naravno« transformacijo je možno ustvariti tudi z genskim inženiringom. Uvedba gena pilN iz seva Syn7942 v Syn2973 je privedla do pridobitve sposobnosti naravne transformacije, čeprav z nižjo učinkovitostjo kot pri Syn7942. Učinkovitost privzema je odvisna od koncentracije in dolžine DNA, uporabljenega seva cianobakterije in faze rasti. Sposobnost Syn70020s in Syn68030s se drastično zmanjša od eksponentne do stacionarne faze. Opazili so tudi, da ima cirkadiani ritem tudi vlogo pri učinkovitosti transformacije cianobakterij, in sicer geni za pile so prekomerno izraženi v temi ali slabih svetlobnih pogojih. Posledično se s tem poveča tudi kompetentnost cianobakterij v temi [5].

== MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH ==

Večina pristopov sintezne biologije, ki delujejo v heterotrofnih organizmih, kot je ''E. coli'', ni mogoče uporabiti v cianobakterijah. Na primer, promotorji in RBS, ki močno modulirajo izražanje genov v ''E. coli'', ne delujejo dobro v cianobakterijah. Če se osredotočimo samo na povečanje izražanja genov s promotorskim inženiringom, opazimo, da se pri cianobakterijah uporabljajo močni konstitutivni nativni promotorji, sintetični inducibilni promotorji, kemično inducibilni promotorji in okoljsko inducibilni promotorji [5].

Do danes je bilo opisanihh le nekaj močnih konstitutivnih promotorjev, ki pa so pogosto omejeni na samo nekatere vrste in moč izražanja genov niha s cirkadianim ritmom. Sintetični inducibilni promotorji delujejo v različnih vrstah cianobakterij [5]. Kemično inducibilni promotorji, npr. arabinozni inducibilni promotor, so najpogosteje uporabljeni promotorji, vendar pa niso primerni za velike industrijske bioprocese [3], [5]. Uporaba zunanjih kemičnih induktorjev ni zaželena, saj poveča proizvodne stroške in predstavlja tveganje za okolje, na primer zaradi uporabe težkih kovin. Slednji problem lahko rešimo z uporabo promotorjev, na katere vplivajo okoljski oz. fizični signali kot sta npr. kisik in svetloba.

Znanstveniki so ustvarili s temo inducibilni genski ekspresijski sistem, ki temelji na dvokomponentnem sistemu EnvZ/OmpR iz ''E. coli''. Prav tako so izkoristili prisotnost fikobilisoma v cianobakterijah. Ustvarili so na svetlobo občutljiv genski ekspresijski sistem, ki je sestavljen iz senzorja za zeleno svetlobo CcS, efektorskega elementa CcR ter promotor PcpcG2, ki regulira ekspresijo gena za linker cpcG2 fikobilisoma. Na podlagi sistema za preklop iz aerobnega v anaerobni metabolizem (FNR) iz ''E. coli'' so ustvarili prilagojen sistem v sevu Syn6803 cianobakterij. Z uporabo tega sistema in promotorja PFNR o ustvarili genski ekspresijski sistem, ki se odziva na prisotnost kisika [5].

== VPLIV INTEGRACIJE SISTEMA, INDUCIBILNEGA Z ZELENO SVETLOBO, NA EKSPRESIJO BUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST ==

V izbranem članku so avtorji želeli pokazati, da s svetlobo inducibilnim promotorjem lahko pridobimo večjo količino izobutanola in 3-metil-1-butanola in da so posledično bolj ekonomični ter obvladljivi genetski ekspresijski sistemi kot sistemi s kemikalijami inducibilnimi promotorji. Poleg tega so tudi vključili vpliv integracije tega genskega ekspresijskega sistema na rast cianobakterij [3].

Za gostiteljski organizem so izbrali cianobakterijo Synechocystis sp. PCC 6803. V E. coli K-12 so pripravili 3 različne konstrukte oz. vektorje z inserti [3].

Kot osnovo so uporabili vektor pKT-GSS. Prvi konstrukt so poimenovali pKT-GSS-KDC-ADH. Gena kdc in adh sta bila vstavlljena za promotorjem PcpcG2. Sev PCC 6803 ima integriran sistem CcS/CcR. Ta sistem lahko inducira izražanje eksogenih genov iz promotorja PcpcG2 kot odziv na radiacijo z zeleno svetlobo in zavira izražanje genov kot odziv na radiacijo z rdečo svetlobo. V osnovni vektor so vstavili dva gena, potrebnih za proizvodnjo alkoholov, in sicer kdc, ki vsebuje zapis za ketokislinsko dekarboksilazo (KDC) in je pridobljen iz L. lactis, ter slr1192, ki vsbuje zapis za alkoholno dehidrogenazo (ADH) in je pridobljen iz PCC 6803. Uporaba kodonov med sevom E. coli K-12 in PCC 6803 je podobna, zato ni bila potrebna optimizacija rabe kodonov za gen kdc. Pred zapisoma genov kdc in adh so vstavili sekvenco podobno Shine-Dalgarnovem zapordju iz gena cpcB organizma Synechococcus sp. PCC 7002. Ekspresija genov kdc in adh je bila inducirana z obsevanjem z zeleno svetlobo. Sinteza izobutanola in 3-metil-1-butanola je bila uspešna [3].

Rast, transkripcija in proizvodnjo izobutanola ter 3-metil-1-butanola so določili z gojenjem celic PCC 6803ΔGSS. To je sev z delecijo genoskega sistema CcaS/CcaR in PcpcG2. V ta sev so vnesli vektor pKT-GSS-KDC-ADH in nato celice obsevali z rdečo in zeleno svetlobo (induktivni pogoji: 520 nm, 660 nm; 60 μmol m−2 s−1) ali samo z rdečo svetlobo (660 nm, 30 μmol m−2 s−1). Rdeča svetloba je potrebna za fotosintezo in ni znatno vplivala na ekspresijo genov pod promotorjem PcpcG2. Zaradi slednjega razloga so celice obsevali tako z zeleno kot rdečo svetlobo. Spremembe v intenzivnosti in/ali valovni dolžini svetlobe lahko aktivirajo metabolizem gostitelja, rast celic in bioprodukcijo. Čeprav je bila za indukcijo uporabljena dvakrat večja intenziteta svetlobe, so pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo opazili rahlo zakasnitev rasti celic v primerjavi z obsevanjem z rdečo svetlobo. Zakasnitev v rasti celic so pripisali integraciji genov kdc in adh v genom. Slednje ni znatno vplivalo na produkcijo alkoholov [3].

== ZAKLJUČEK ==

== Viri ==
[1] T. J. Johnson, J. L. Gibbons, L. Gu, R. Zhou, and W. R. Gibbons, “Molecular genetic improvements of cyanobacteria to enhance the industrial potential of the microbe: A review,” Biotechnol. Prog., vol. 32, no. 6, pp. 1357–1371, 2016, doi: 10.1002/btpr.2358.

[2] R. Miao, X. Liu, E. Englund, P. Lindberg, and P. Lindblad, “Isobutanol production in Synechocystis PCC 6803 using heterologous and endogenous alcohol dehydrogenases,” Metab. Eng. Commun., vol. 5, no. June, pp. 45–53, 2017, doi: 10.1016/j.meteno.2017.07.003.

[3] S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.

[4] S. Kobayashi et al., “Application of an engineered chromatic acclimation sensor for red-light-regulated gene expression in cyanobacteria,” Algal Res., vol. 44, no. October, p. 101691, 2019, doi: 10.1016/j.algal.2019.101691.

[5] A. Satta, L. Esquirol, and B. E. Ebert, “Current Metabolic Engineering Strategies for Photosynthetic Bioproduction in Cyanobacteria,” Microorganisms, vol. 11, no. 2, pp. 1–34, 2023, doi: 10.3390/microorganisms11020455.

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-22T21:07:06Z

Špela Deučman: /* MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1186/s12934-021-01732-x S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.]

== UVOD ==
Hitra rast svetovnega prebivalstva skupaj z naraščajočim povpraševanjem po fosilnih gorivih in povečanimi emisijami CO2 je povzročila večjo potrebo po razvoju trajnostnih virov energije in kemikalij iz obnovljivih virov. V zadnjih desetletjih je bilo veliko raziskav osredotočenih na prepoznavanje trajnostnih metod za proizvodnjo obnovljivih biogoriv [1], [2].

Izobutanol je pomembna spojina kot alternativno gorivo zaradi visoke vsebnosti energije (98 % vsebnosti energije v bencinu) in nižjega parnega tlaka v primerjavi z etanolom. Poleg tega ima izobutanol nižjo vsebnost O2 in nižjo topnost v vodi kot etanol, kar pomeni, da je mogoče v bencin vmešati več izobutanola, medtem pa imamo še vedno nizko vsebnost O2 v končnem izdelku [2].

Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za sintezo izobutanola zaradi svoje sposobnosti, da s fotosintezo pretvarjajo CO2 neposredno v kemične spojine z dodano vrednostjo. S cianobakterijami lahko proizvajamo etanol, izobutiraldehid, izobutanol, 1-butanol, sukcinat, 2,3-butandiol, terpenoide, klorofile, maščobne kisline, sladkor in aminokisline [3]–[5].

Zmožne so tudi vezati atmosferski dušik in zato zavzemajo pomembno vlogo v dušikovem ciklu. Cianobakterije, ki vežejo N2, so še posebej zanimive za raziskovalce, ki se ukvarjajo z razvojem industrijskih sevov za proizvodnjo »zelenih« kemikalij, kot so limonen, farnezen, linalol in mircen [1].

== SINTEZA IZOBUTANOLA IN 3-METIL-1-IZOBUTANOLA V CIANOBAKTERIJAH ==

Najpogostejša sintezna pot za biosintezo izobutanola je pot 2-keto kislin, ki si deli prekurzor (α-ketoizovalerat) s sintezno potjo biosinteze L-valina. α-ketoizovalerat dekarboksilaza (Kivd) iz ''Lactococcus lactis'', ki dekarboksilira α-keto kisline v aldehide, je pomemben encim v poti 2-keto kislin in je bil uporabljen pri ''Escherichia coli'', ''Saccharomyces cerevisiae'', ''Corynebacterium glutamicum'' in cianobakterije za proizvodnjo izobutiraldehida in izobutanola. Kivd je homotetramer, njegova optimalna aktivnost je bila opažena pri 45 °C (pH 6,5) in ima visoko specifičnost za α-ketoizovalerat. Poleg tega je bil Kivd zasnovan za uporabo večjega substrata za proizvodnjo alkoholov z daljšo verigo. Cianobakterije so pritegnile pozornost raziskovalcev zaradi zmožnosti izvajanja fotosinteze, in posledične porabe atmosferskega CO2, ter nizke potrebe po hranilih, visoke tolerance na različna okolja in nezahtevnega genskega inženiringa [2].

== NAČINI VNOSA DNA V CIANOBAKTERIJE ==

Učinkovit prenos eksogene DNA v cianobakterije lahko dosežemo z uporabo suicidalnih vektorjev za prenos kromosomskih genov. To vključuje integracijo DNA fragmenta v kromosome cianobakterij z dvojno homologno rekombinacijo in transformacijo samopodvajajočih plazmidov [5].
Za ohranjanje spremenjenega genotipa je pomembno, da je mutacija stabilna, kar pomeni, da mora biti v vseh kopijah kromosomov. Ta pogoj popolne segregacije genoma je dolgotrajen, saj je večina cianobakterij poliploidnih [5].
Ugotovljeno je bilo, da sta zmanjšanje koncentracije fosfata in agarja v rastnem mediju ter visoka temperatura ključni parametri za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije. Tekom raziskav so znanstveniki ugotovili, da se proces pospeši, če je v mediju nižja koncentracija fosfatov in nižja koncentracija agarja. Hkrati pa mora biti temperatura višja. Ti parametri so ključni za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije [5].

Samopodvajajoče se plazmide in prenosne plazmide lahko uporabimo kot alternativo za izražanje heterolognih genov. Na ta način se zamudnemu procesu popolne segregacije. Prenosni vektorji, ki se lahko razmnožujejo v E. coli in cianobakterijah, olajšajo kloniranje in vzdrževanje plazmidov. Njihovi glavni pomanjkljivosti pa sta ozek spekter območje gostiteljev in majhno število kopij na celico [5].

Seveda pa še obstaja konjugacija, elektroporacija in »naravna« transformacija.

'''Konjugacija'''

Konjugacija je zelo razširjena in pogosto uporabljena metoda za prenos DNA v cianobakterije. Zanjo je značilna visoka učinkovitost in širok spekter uporabnosti med različnimi vrstami. Pri konjugaciji se uporabita dva različna seva ''E. coli'', in sicer pomožni sev, ki vsebuje konjugativni plazmid (ta nosi mob gene, potrebne za mobilizacijo genetskih elementov) in donorski sev, ki nosi pomožni plazmid, na katerem se nahaja izvor replikacije (oriT), zaporedje, potrebno za konjugacijo, in geni, jih želimo prenesti v cianobakterije. Nekatere vrste potrebujejo dodatne vektorje za optimizacijo učinkovitosti konjugacije [5].

'''Elektroporacija'''

Elektroporacija vključuje uporabo močnega električnega polja, ki ustvari pore v celični membrani cianobakterij. Doslej je bila elektroporacija uspešno uporabljena samo pri nekaterih vrstah cianobakterij. Optimalni pogoji (napetost in trajanje impulza) so vrstno specifični. V nekaterih sevih so elektroporacijo uspešno uporabili za vnost linearnih fragmentov DNA, vendar pa so ti fragmenti izpostavljeni razgradnji z nukleazami. Učinkovitost lahko povečamo z dodajanjem EDTA [5].

'''Naravna transformacija'''

Naravna transformacija opisuje privzem in vzdrževanje eksogene DNA. Pri cianobakterijah retraktilni pilus T4P vzpostavi stik z zunajcelično DNA in z retrakcijo vnese tujo DNA v celico. Znano je, da je več cianobakterij naravno kompetentnih. »Naravno« transformacijo je možno ustvariti tudi z genskim inženiringom. Uvedba gena pilN iz seva Syn7942 v Syn2973 je privedla do pridobitve sposobnosti naravne transformacije, čeprav z nižjo učinkovitostjo kot pri Syn7942. Učinkovitost privzema je odvisna od koncentracije in dolžine DNA, uporabljenega seva cianobakterije in faze rasti. Sposobnost Syn70020s in Syn68030s se drastično zmanjša od eksponentne do stacionarne faze. Opazili so tudi, da ima cirkadiani ritem tudi vlogo pri učinkovitosti transformacije cianobakterij, in sicer geni za pile so prekomerno izraženi v temi ali slabih svetlobnih pogojih. Posledično se s tem poveča tudi kompetentnost cianobakterij v temi [5].

== MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH ==

Večina pristopov sintezne biologije, ki delujejo v heterotrofnih organizmih, kot je ''E. coli'', ni mogoče uporabiti v cianobakterijah. Na primer, promotorji in RBS, ki močno modulirajo izražanje genov v ''E. coli'', ne delujejo dobro v cianobakterijah. Če se osredotočimo samo na povečanje izražanja genov s promotorskim inženiringom, opazimo, da se pri cianobakterijah uporabljajo močni konstitutivni nativni promotorji, sintetični inducibilni promotorji, kemično inducibilni promotorji in okoljsko inducibilni promotorji [5].

Do danes je bilo opisanihh le nekaj močnih konstitutivnih promotorjev, ki pa so pogosto omejeni na samo nekatere vrste in moč izražanja genov niha s cirkadianim ritmom. Sintetični inducibilni promotorji delujejo v različnih vrstah cianobakterij [5]. Kemično inducibilni promotorji, npr. arabinozni inducibilni promotor, so najpogosteje uporabljeni promotorji, vendar pa niso primerni za velike industrijske bioprocese [3], [5]. Uporaba zunanjih kemičnih induktorjev ni zaželena, saj poveča proizvodne stroške in predstavlja tveganje za okolje, na primer zaradi uporabe težkih kovin. Slednji problem lahko rešimo z uporabo promotorjev, na katere vplivajo okoljski oz. fizični signali kot sta npr. kisik in svetloba.

Znanstveniki so ustvarili s temo inducibilni genski ekspresijski sistem, ki temelji na dvokomponentnem sistemu EnvZ/OmpR iz ''E. coli''. Prav tako so izkoristili prisotnost fikobilisoma v cianobakterijah. Ustvarili so na svetlobo občutljiv genski ekspresijski sistem, ki je sestavljen iz senzorja za zeleno svetlobo CcS, efektorskega elementa CcR ter promotor PcpcG2, ki regulira ekspresijo gena za linker cpcG2 fikobilisoma. Na podlagi sistema za preklop iz aerobnega v anaerobni metabolizem (FNR) iz ''E. coli'' so ustvarili prilagojen sistem v sevu Syn6803 cianobakterij. Z uporabo tega sistema in promotorja PFNR o ustvarili genski ekspresijski sistem, ki se odziva na prisotnost kisika [5].

== VPLIV INTEGRACIJE SISTEMA, INDUCIBILNEGA Z ZELENO SVETLOBO, NA EKSPRESIJO BUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST ==

V izbranem članku so avtorji želeli pokazati, da s svetlobo inducibilnim promotorjem lahko pridobimo večjo količino izobutanola in 3-metil-1-butanola in da so posledično bolj ekonomični ter obvladljivi genetski ekspresijski sistemi kot sistemi s kemikalijami inducibilnimi promotorji. Poleg tega so tudi vključili vpliv integracije tega genskega ekspresijskega sistema na rast cianobakterij.

Za gostiteljski organizem so izbrali cianobakterijo ''Synechocystis sp.'' PCC 6803. Pripravili so 3 različne konstrukte oz. vektorje s konstrukti.

== ZAKLJUČEK ==

== Viri ==
[1] T. J. Johnson, J. L. Gibbons, L. Gu, R. Zhou, and W. R. Gibbons, “Molecular genetic improvements of cyanobacteria to enhance the industrial potential of the microbe: A review,” Biotechnol. Prog., vol. 32, no. 6, pp. 1357–1371, 2016, doi: 10.1002/btpr.2358.

[2] R. Miao, X. Liu, E. Englund, P. Lindberg, and P. Lindblad, “Isobutanol production in Synechocystis PCC 6803 using heterologous and endogenous alcohol dehydrogenases,” Metab. Eng. Commun., vol. 5, no. June, pp. 45–53, 2017, doi: 10.1016/j.meteno.2017.07.003.

[3] S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.

[4] S. Kobayashi et al., “Application of an engineered chromatic acclimation sensor for red-light-regulated gene expression in cyanobacteria,” Algal Res., vol. 44, no. October, p. 101691, 2019, doi: 10.1016/j.algal.2019.101691.

[5] A. Satta, L. Esquirol, and B. E. Ebert, “Current Metabolic Engineering Strategies for Photosynthetic Bioproduction in Cyanobacteria,” Microorganisms, vol. 11, no. 2, pp. 1–34, 2023, doi: 10.3390/microorganisms11020455.

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-22T20:07:36Z

Špela Deučman: /* MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1186/s12934-021-01732-x S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.]

== UVOD ==
Hitra rast svetovnega prebivalstva skupaj z naraščajočim povpraševanjem po fosilnih gorivih in povečanimi emisijami CO2 je povzročila večjo potrebo po razvoju trajnostnih virov energije in kemikalij iz obnovljivih virov. V zadnjih desetletjih je bilo veliko raziskav osredotočenih na prepoznavanje trajnostnih metod za proizvodnjo obnovljivih biogoriv [1], [2].

Izobutanol je pomembna spojina kot alternativno gorivo zaradi visoke vsebnosti energije (98 % vsebnosti energije v bencinu) in nižjega parnega tlaka v primerjavi z etanolom. Poleg tega ima izobutanol nižjo vsebnost O2 in nižjo topnost v vodi kot etanol, kar pomeni, da je mogoče v bencin vmešati več izobutanola, medtem pa imamo še vedno nizko vsebnost O2 v končnem izdelku [2].

Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za sintezo izobutanola zaradi svoje sposobnosti, da s fotosintezo pretvarjajo CO2 neposredno v kemične spojine z dodano vrednostjo. S cianobakterijami lahko proizvajamo etanol, izobutiraldehid, izobutanol, 1-butanol, sukcinat, 2,3-butandiol, terpenoide, klorofile, maščobne kisline, sladkor in aminokisline [3]–[5].

Zmožne so tudi vezati atmosferski dušik in zato zavzemajo pomembno vlogo v dušikovem ciklu. Cianobakterije, ki vežejo N2, so še posebej zanimive za raziskovalce, ki se ukvarjajo z razvojem industrijskih sevov za proizvodnjo »zelenih« kemikalij, kot so limonen, farnezen, linalol in mircen [1].

== SINTEZA IZOBUTANOLA IN 3-METIL-1-IZOBUTANOLA V CIANOBAKTERIJAH ==

Najpogostejša sintezna pot za biosintezo izobutanola je pot 2-keto kislin, ki si deli prekurzor (α-ketoizovalerat) s sintezno potjo biosinteze L-valina. α-ketoizovalerat dekarboksilaza (Kivd) iz ''Lactococcus lactis'', ki dekarboksilira α-keto kisline v aldehide, je pomemben encim v poti 2-keto kislin in je bil uporabljen pri ''Escherichia coli'', ''Saccharomyces cerevisiae'', ''Corynebacterium glutamicum'' in cianobakterije za proizvodnjo izobutiraldehida in izobutanola. Kivd je homotetramer, njegova optimalna aktivnost je bila opažena pri 45 °C (pH 6,5) in ima visoko specifičnost za α-ketoizovalerat. Poleg tega je bil Kivd zasnovan za uporabo večjega substrata za proizvodnjo alkoholov z daljšo verigo. Cianobakterije so pritegnile pozornost raziskovalcev zaradi zmožnosti izvajanja fotosinteze, in posledične porabe atmosferskega CO2, ter nizke potrebe po hranilih, visoke tolerance na različna okolja in nezahtevnega genskega inženiringa [2].

== NAČINI VNOSA DNA V CIANOBAKTERIJE ==

Učinkovit prenos eksogene DNA v cianobakterije lahko dosežemo z uporabo suicidalnih vektorjev za prenos kromosomskih genov. To vključuje integracijo DNA fragmenta v kromosome cianobakterij z dvojno homologno rekombinacijo in transformacijo samopodvajajočih plazmidov [5].
Za ohranjanje spremenjenega genotipa je pomembno, da je mutacija stabilna, kar pomeni, da mora biti v vseh kopijah kromosomov. Ta pogoj popolne segregacije genoma je dolgotrajen, saj je večina cianobakterij poliploidnih [5].
Ugotovljeno je bilo, da sta zmanjšanje koncentracije fosfata in agarja v rastnem mediju ter visoka temperatura ključni parametri za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije. Tekom raziskav so znanstveniki ugotovili, da se proces pospeši, če je v mediju nižja koncentracija fosfatov in nižja koncentracija agarja. Hkrati pa mora biti temperatura višja. Ti parametri so ključni za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije [5].

Samopodvajajoče se plazmide in prenosne plazmide lahko uporabimo kot alternativo za izražanje heterolognih genov. Na ta način se zamudnemu procesu popolne segregacije. Prenosni vektorji, ki se lahko razmnožujejo v E. coli in cianobakterijah, olajšajo kloniranje in vzdrževanje plazmidov. Njihovi glavni pomanjkljivosti pa sta ozek spekter območje gostiteljev in majhno število kopij na celico [5].

Seveda pa še obstaja konjugacija, elektroporacija in »naravna« transformacija.

'''Konjugacija'''

Konjugacija je zelo razširjena in pogosto uporabljena metoda za prenos DNA v cianobakterije. Zanjo je značilna visoka učinkovitost in širok spekter uporabnosti med različnimi vrstami. Pri konjugaciji se uporabita dva različna seva ''E. coli'', in sicer pomožni sev, ki vsebuje konjugativni plazmid (ta nosi mob gene, potrebne za mobilizacijo genetskih elementov) in donorski sev, ki nosi pomožni plazmid, na katerem se nahaja izvor replikacije (oriT), zaporedje, potrebno za konjugacijo, in geni, jih želimo prenesti v cianobakterije. Nekatere vrste potrebujejo dodatne vektorje za optimizacijo učinkovitosti konjugacije [5].

'''Elektroporacija'''

Elektroporacija vključuje uporabo močnega električnega polja, ki ustvari pore v celični membrani cianobakterij. Doslej je bila elektroporacija uspešno uporabljena samo pri nekaterih vrstah cianobakterij. Optimalni pogoji (napetost in trajanje impulza) so vrstno specifični. V nekaterih sevih so elektroporacijo uspešno uporabili za vnost linearnih fragmentov DNA, vendar pa so ti fragmenti izpostavljeni razgradnji z nukleazami. Učinkovitost lahko povečamo z dodajanjem EDTA [5].

'''Naravna transformacija'''

Naravna transformacija opisuje privzem in vzdrževanje eksogene DNA. Pri cianobakterijah retraktilni pilus T4P vzpostavi stik z zunajcelično DNA in z retrakcijo vnese tujo DNA v celico. Znano je, da je več cianobakterij naravno kompetentnih. »Naravno« transformacijo je možno ustvariti tudi z genskim inženiringom. Uvedba gena pilN iz seva Syn7942 v Syn2973 je privedla do pridobitve sposobnosti naravne transformacije, čeprav z nižjo učinkovitostjo kot pri Syn7942. Učinkovitost privzema je odvisna od koncentracije in dolžine DNA, uporabljenega seva cianobakterije in faze rasti. Sposobnost Syn70020s in Syn68030s se drastično zmanjša od eksponentne do stacionarne faze. Opazili so tudi, da ima cirkadiani ritem tudi vlogo pri učinkovitosti transformacije cianobakterij, in sicer geni za pile so prekomerno izraženi v temi ali slabih svetlobnih pogojih. Posledično se s tem poveča tudi kompetentnost cianobakterij v temi [5].

== MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH ==

Večina pristopov sintezne biologije, ki delujejo v heterotrofnih organizmih, kot je ''E. coli'', ni mogoče uporabiti v cianobakterijah. Na primer, promotorji in RBS, ki močno modulirajo izražanje genov v ''E. coli'', ne delujejo dobro v cianobakterijah. Če se osredotočimo samo na povečanje izražanja genov s promotorskim inženiringom, opazimo, da se pri cianobakterijah uporabljajo močni konstitutivni nativni promotorji, sintetični inducibilni promotorji, kemično inducibilni promotorji in okoljsko inducibilni promotorji [5].

Do danes je bilo opisanihh le nekaj močnih konstitutivnih promotorjev, ki pa so pogosto omejeni na samo nekatere vrste in moč izražanja genov niha s cirkadianim ritmom. Sintetični inducibilimi promotorji delujejo v različnih vrstah cianobakterij [5]. Kemično inducibilni promotorji, npr. arabinozni inducibilni promotor, so najpogosteje uporabljeni promotorji, vendar pa niso primerni za velike industrijske bioprocese [3], [5]. Uporaba zunanjih kemičnih induktorjev ni zaželena, saj poveča proizvodne stroške in predstavlja tveganje za okolje, na primer zaradi uporabe težkih kovin. Slednji problem lahko rešimo z uporabo promotorjev, na katere vplivajo okoljski oz. fizični signali kot sta npr. kisik in svetloba.

Znanstveniki so ustvarili s temo inducibilni genski ekspresijski sitem, ki temelji na dvokomponentnem sistemu EnvZ/OmpR iz ''E. coli''. Prav tako so izkoristili prisotnost fikobilisoma v cianobakterijah. Ustvarili so na svetlobo občutljiv genski ekspresijski sistem, ki je sestavljen iz senzorja za zeleno svetlobo CcS, efektorskega elementa CcR ter promotor PcpcG2, ki regulira ekspresijo gena za linker cpcG2 fikobilisoma. Na podlagi sistema za preklop iz aerobnega v anaerobni metabolizem (FNR) iz ''E. coli'' so ustvarili prilagojen sistem v sevu Syn6803 cianobakterij. Z uporabo tega sistema in promotorja PFNR o ustvarili genski ekspresijski sistem, ki se odziva na prisotnost kisika [5].

== VPLIV INTEGRACIJE SISTEMA, INDUCIBILNEGA Z ZELENO SVETLOBO, NA EKSPRESIJO BUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST ==

V izbranem članku so avtorji želeli pokazati, da s svetlobo inducibilnim promotorjem lahko pridobimo večjo količino izobutanola in 3-metil-1-butanola in da so posledično bolj ekonomični ter obvladljivi genetski ekspresijski sistemi kot sistemi s kemikalijami inducibilnimi promotorji. Poleg tega so tudi vključili vpliv integracije tega genskega ekspresijskega sistema na rast cianobakterij.

Za gostiteljski organizem so izbrali cianobakterijo ''Synechocystis sp.'' PCC 6803. Pripravili so 3 različne konstrukte oz. vektorje s konstrukti.

== ZAKLJUČEK ==

== Viri ==
[1] T. J. Johnson, J. L. Gibbons, L. Gu, R. Zhou, and W. R. Gibbons, “Molecular genetic improvements of cyanobacteria to enhance the industrial potential of the microbe: A review,” Biotechnol. Prog., vol. 32, no. 6, pp. 1357–1371, 2016, doi: 10.1002/btpr.2358.

[2] R. Miao, X. Liu, E. Englund, P. Lindberg, and P. Lindblad, “Isobutanol production in Synechocystis PCC 6803 using heterologous and endogenous alcohol dehydrogenases,” Metab. Eng. Commun., vol. 5, no. June, pp. 45–53, 2017, doi: 10.1016/j.meteno.2017.07.003.

[3] S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.

[4] S. Kobayashi et al., “Application of an engineered chromatic acclimation sensor for red-light-regulated gene expression in cyanobacteria,” Algal Res., vol. 44, no. October, p. 101691, 2019, doi: 10.1016/j.algal.2019.101691.

[5] A. Satta, L. Esquirol, and B. E. Ebert, “Current Metabolic Engineering Strategies for Photosynthetic Bioproduction in Cyanobacteria,” Microorganisms, vol. 11, no. 2, pp. 1–34, 2023, doi: 10.3390/microorganisms11020455.

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-22T20:06:21Z

Špela Deučman: /* UVOD */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1186/s12934-021-01732-x S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.]

== UVOD ==
Hitra rast svetovnega prebivalstva skupaj z naraščajočim povpraševanjem po fosilnih gorivih in povečanimi emisijami CO2 je povzročila večjo potrebo po razvoju trajnostnih virov energije in kemikalij iz obnovljivih virov. V zadnjih desetletjih je bilo veliko raziskav osredotočenih na prepoznavanje trajnostnih metod za proizvodnjo obnovljivih biogoriv [1], [2].

Izobutanol je pomembna spojina kot alternativno gorivo zaradi visoke vsebnosti energije (98 % vsebnosti energije v bencinu) in nižjega parnega tlaka v primerjavi z etanolom. Poleg tega ima izobutanol nižjo vsebnost O2 in nižjo topnost v vodi kot etanol, kar pomeni, da je mogoče v bencin vmešati več izobutanola, medtem pa imamo še vedno nizko vsebnost O2 v končnem izdelku [2].

Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za sintezo izobutanola zaradi svoje sposobnosti, da s fotosintezo pretvarjajo CO2 neposredno v kemične spojine z dodano vrednostjo. S cianobakterijami lahko proizvajamo etanol, izobutiraldehid, izobutanol, 1-butanol, sukcinat, 2,3-butandiol, terpenoide, klorofile, maščobne kisline, sladkor in aminokisline [3]–[5].

Zmožne so tudi vezati atmosferski dušik in zato zavzemajo pomembno vlogo v dušikovem ciklu. Cianobakterije, ki vežejo N2, so še posebej zanimive za raziskovalce, ki se ukvarjajo z razvojem industrijskih sevov za proizvodnjo »zelenih« kemikalij, kot so limonen, farnezen, linalol in mircen [1].

== SINTEZA IZOBUTANOLA IN 3-METIL-1-IZOBUTANOLA V CIANOBAKTERIJAH ==

Najpogostejša sintezna pot za biosintezo izobutanola je pot 2-keto kislin, ki si deli prekurzor (α-ketoizovalerat) s sintezno potjo biosinteze L-valina. α-ketoizovalerat dekarboksilaza (Kivd) iz ''Lactococcus lactis'', ki dekarboksilira α-keto kisline v aldehide, je pomemben encim v poti 2-keto kislin in je bil uporabljen pri ''Escherichia coli'', ''Saccharomyces cerevisiae'', ''Corynebacterium glutamicum'' in cianobakterije za proizvodnjo izobutiraldehida in izobutanola. Kivd je homotetramer, njegova optimalna aktivnost je bila opažena pri 45 °C (pH 6,5) in ima visoko specifičnost za α-ketoizovalerat. Poleg tega je bil Kivd zasnovan za uporabo večjega substrata za proizvodnjo alkoholov z daljšo verigo. Cianobakterije so pritegnile pozornost raziskovalcev zaradi zmožnosti izvajanja fotosinteze, in posledične porabe atmosferskega CO2, ter nizke potrebe po hranilih, visoke tolerance na različna okolja in nezahtevnega genskega inženiringa [2].

== NAČINI VNOSA DNA V CIANOBAKTERIJE ==

Učinkovit prenos eksogene DNA v cianobakterije lahko dosežemo z uporabo suicidalnih vektorjev za prenos kromosomskih genov. To vključuje integracijo DNA fragmenta v kromosome cianobakterij z dvojno homologno rekombinacijo in transformacijo samopodvajajočih plazmidov [5].
Za ohranjanje spremenjenega genotipa je pomembno, da je mutacija stabilna, kar pomeni, da mora biti v vseh kopijah kromosomov. Ta pogoj popolne segregacije genoma je dolgotrajen, saj je večina cianobakterij poliploidnih [5].
Ugotovljeno je bilo, da sta zmanjšanje koncentracije fosfata in agarja v rastnem mediju ter visoka temperatura ključni parametri za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije. Tekom raziskav so znanstveniki ugotovili, da se proces pospeši, če je v mediju nižja koncentracija fosfatov in nižja koncentracija agarja. Hkrati pa mora biti temperatura višja. Ti parametri so ključni za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije [5].

Samopodvajajoče se plazmide in prenosne plazmide lahko uporabimo kot alternativo za izražanje heterolognih genov. Na ta način se zamudnemu procesu popolne segregacije. Prenosni vektorji, ki se lahko razmnožujejo v E. coli in cianobakterijah, olajšajo kloniranje in vzdrževanje plazmidov. Njihovi glavni pomanjkljivosti pa sta ozek spekter območje gostiteljev in majhno število kopij na celico [5].

Seveda pa še obstaja konjugacija, elektroporacija in »naravna« transformacija.

'''Konjugacija'''

Konjugacija je zelo razširjena in pogosto uporabljena metoda za prenos DNA v cianobakterije. Zanjo je značilna visoka učinkovitost in širok spekter uporabnosti med različnimi vrstami. Pri konjugaciji se uporabita dva različna seva ''E. coli'', in sicer pomožni sev, ki vsebuje konjugativni plazmid (ta nosi mob gene, potrebne za mobilizacijo genetskih elementov) in donorski sev, ki nosi pomožni plazmid, na katerem se nahaja izvor replikacije (oriT), zaporedje, potrebno za konjugacijo, in geni, jih želimo prenesti v cianobakterije. Nekatere vrste potrebujejo dodatne vektorje za optimizacijo učinkovitosti konjugacije [5].

'''Elektroporacija'''

Elektroporacija vključuje uporabo močnega električnega polja, ki ustvari pore v celični membrani cianobakterij. Doslej je bila elektroporacija uspešno uporabljena samo pri nekaterih vrstah cianobakterij. Optimalni pogoji (napetost in trajanje impulza) so vrstno specifični. V nekaterih sevih so elektroporacijo uspešno uporabili za vnost linearnih fragmentov DNA, vendar pa so ti fragmenti izpostavljeni razgradnji z nukleazami. Učinkovitost lahko povečamo z dodajanjem EDTA [5].

'''Naravna transformacija'''

Naravna transformacija opisuje privzem in vzdrževanje eksogene DNA. Pri cianobakterijah retraktilni pilus T4P vzpostavi stik z zunajcelično DNA in z retrakcijo vnese tujo DNA v celico. Znano je, da je več cianobakterij naravno kompetentnih. »Naravno« transformacijo je možno ustvariti tudi z genskim inženiringom. Uvedba gena pilN iz seva Syn7942 v Syn2973 je privedla do pridobitve sposobnosti naravne transformacije, čeprav z nižjo učinkovitostjo kot pri Syn7942. Učinkovitost privzema je odvisna od koncentracije in dolžine DNA, uporabljenega seva cianobakterije in faze rasti. Sposobnost Syn70020s in Syn68030s se drastično zmanjša od eksponentne do stacionarne faze. Opazili so tudi, da ima cirkadiani ritem tudi vlogo pri učinkovitosti transformacije cianobakterij, in sicer geni za pile so prekomerno izraženi v temi ali slabih svetlobnih pogojih. Posledično se s tem poveča tudi kompetentnost cianobakterij v temi [5].

== MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH ==

Večina pristopov sintezne biologije, ki delujejo v heterotrofnih organizmih, kot je ''E. coli'', ni mogoče uporabiti v cianobakterijah. Na primer, promotorji in RBS, ki močno modulirajo izražanje genov v ''E. coli'', ne delujejo dobro v cianobakterijah. Če se osredotočimo samo na povečanje izražanja genov s promotorskim inženiringom, opazimo, da se pri cianobakterijah uporabljajo močni konstitutivni nativni promotorji, sintetični inducibilni promotorji, kemično inducibilni promotorji in okoljsko inducibilni promotorji [5].

Do danes je bilo opisanihh le nekaj močnih konstitutivnih promotorjev, ki pa so pogosto omejeni na samo nekatere vrste in moč izražanja genov niha s cirkadianim ritmom. Sintetični inducibilimi promotorji delujejo v različnih vrstah cianobakterij [5]. Kemično inducibilni promotorji, npr. arabinozni inducibilni promotor, so najpogosteje uporabljeni promotorji, vendar pa niso primerni za velike industrijske bioprocese [3], [5]. Uporaba zunanjih kemičnih induktorjev ni zaželena, saj poveča proizvodne stroške in predstavlja tveganje za okolje, na primer zaradi uporabe težkih kovin. Slednji problem lahko rešimo z uporabo promotorjev, na katere vplivajo okoljski oz. fizični signali kot sta npr. kisik in svetloba.

Znanstveniki so ustvarili s temo inducibilni genski ekspresijski sitem, ki temelji na dvokomponentnem sistemu EnvZ/OmpR iz ''E. coli''. Prav tako so izkoristili prisotnost fikobilisoma v cianobakterijah. Ustvarili so na svetlobo občutljiv genski ekspresijski sistem, ki je sestavljen iz senzorja za zeleno svetlobo CcS, efektorskega elementa CcR ter promotor PcpcG2, ki regulira ekspresijo gena za linker cpcG2 fikobilisoma. Na podlagi sistema za preklop iz aerobnega v anaerobni metabolizem (FNR) iz ''E. coli'' so ustvarili prilagojen sistem v sevu Syn6803 cianobakterij. Z uporabo tega sistema in promotorja PFNR o ustvarili genski ekspresijski sistem, ki se odziva na prisotnost kisika [5].

== VPLIV INTEGRACIJE SISTEMA, INDUCIBILNEGA Z ZELENO SVETLOBO, NA EKSPRESIJO BUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST ==

V izbranem članku so avtorji želeli pokazati, da s svetlobo inducibilnim promotorjem lahko pridobimo večjo količino izobutanola in 3-metil-1-butanola in da so posledično bolj ekonomični ter obvladljivi genetski ekspresijski sistemi kot sistemi s kemikalijami inducibilnimi promotorji. Poleg tega so tudi vključili vpliv integracije tega genskega ekspresijskega sistema na rast cianobakterij.

Za gostiteljski organizem so izbrali cianobakterijo ''Synechocystis sp.'' PCC 6803. Pripravili so 3 različne konstrukte oz. vektorje s konstrukti.

== ZAKLJUČEK ==

== Viri ==
[1] T. J. Johnson, J. L. Gibbons, L. Gu, R. Zhou, and W. R. Gibbons, “Molecular genetic improvements of cyanobacteria to enhance the industrial potential of the microbe: A review,” Biotechnol. Prog., vol. 32, no. 6, pp. 1357–1371, 2016, doi: 10.1002/btpr.2358.

[2] R. Miao, X. Liu, E. Englund, P. Lindberg, and P. Lindblad, “Isobutanol production in Synechocystis PCC 6803 using heterologous and endogenous alcohol dehydrogenases,” Metab. Eng. Commun., vol. 5, no. June, pp. 45–53, 2017, doi: 10.1016/j.meteno.2017.07.003.

[3] S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.

[4] S. Kobayashi et al., “Application of an engineered chromatic acclimation sensor for red-light-regulated gene expression in cyanobacteria,” Algal Res., vol. 44, no. October, p. 101691, 2019, doi: 10.1016/j.algal.2019.101691.

[5] A. Satta, L. Esquirol, and B. E. Ebert, “Current Metabolic Engineering Strategies for Photosynthetic Bioproduction in Cyanobacteria,” Microorganisms, vol. 11, no. 2, pp. 1–34, 2023, doi: 10.3390/microorganisms11020455.

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-22T20:02:08Z

Špela Deučman: /* MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1186/s12934-021-01732-x S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.]

== UVOD ==
Hitra rast svetovnega prebivalstva skupaj z naraščajočim povpraševanjem po fosilnih gorivih in povečanimi emisijami CO2 je povzročila večjo potrebo po razvoju trajnostnih virov energije in kemikalij iz obnovljivih virov. V zadnjih desetletjih je bilo veliko raziskav osredotočenih na prepoznavanje trajnostnih metod za proizvodnjo obnovljivih biogoriv [1], [2].

Izobutanol je pomembna spojina kot alternativno gorivo zaradi visoke vsebnosti energije (98 % vsebnosti energije v bencinu) in nižjega parnega tlaka v primerjavi z etanolom. Poleg tega ima izobutanol nižjo vsebnost O2 in nižjo topnost v vodi kot etanol, kar pomeni, da je mogoče v bencin vmešati več izobutanola, medtem pa imamo še vedno nizko vsebnost O2 v končnem izdelku [2].

Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za sintezo izobutanola zaradi svoje sposobnosti, da s fotosintezo pretvarjajo CO2 neposredno v kemične spojine z dodano vrednostjo. S cianobakterijami lahko proizvajamo etanol, izobutiraldehid, izobutanol, 1-butanol, sukcinat, 2,3-butandiol, terpenoide, klorofile, maščobne kisline, sladkor in aminokisline [3]–[5].

Zmožne so tudi vezati atmosferski dušik in zato zavzemajo pomembno vlogo v dušikovem ciklu. Cianobakterije, ki vežejo N2, so še posebej zanimive za raziskovalce, ki se ukvarjajo z razvojem industrijskih sevov za proizvodnjo »zelenih« kemikalij, kot so limonen, farnezen, linalol in mircen [1].

== SINTEZA IZOBUTANOLA IN 3-METIL-1-IZOBUTANOLA V CIANOBAKTERIJAH ==

Najpogostejša sintezna pot za biosintezo izobutanola je pot 2-keto kislin, ki si deli prekurzor (α-ketoizovalerat) s sintezno potjo biosinteze L-valina. α-ketoizovalerat dekarboksilaza (Kivd) iz ''Lactococcus lactis'', ki dekarboksilira α-keto kisline v aldehide, je pomemben encim v poti 2-keto kislin in je bil uporabljen pri ''Escherichia coli'', ''Saccharomyces cerevisiae'', ''Corynebacterium glutamicum'' in cianobakterije za proizvodnjo izobutiraldehida in izobutanola. Kivd je homotetramer, njegova optimalna aktivnost je bila opažena pri 45 °C (pH 6,5) in ima visoko specifičnost za α-ketoizovalerat. Poleg tega je bil Kivd zasnovan za uporabo večjega substrata za proizvodnjo alkoholov z daljšo verigo. Cianobakterije so pritegnile pozornost raziskovalcev zaradi zmožnosti izvajanja fotosinteze, in posledične porabe atmosferskega CO2, ter nizke potrebe po hranilih, visoke tolerance na različna okolja in nezahtevnega genskega inženiringa [2].

== NAČINI VNOSA DNA V CIANOBAKTERIJE ==

Učinkovit prenos eksogene DNA v cianobakterije lahko dosežemo z uporabo suicidalnih vektorjev za prenos kromosomskih genov. To vključuje integracijo DNA fragmenta v kromosome cianobakterij z dvojno homologno rekombinacijo in transformacijo samopodvajajočih plazmidov [5].
Za ohranjanje spremenjenega genotipa je pomembno, da je mutacija stabilna, kar pomeni, da mora biti v vseh kopijah kromosomov. Ta pogoj popolne segregacije genoma je dolgotrajen, saj je večina cianobakterij poliploidnih [5].
Ugotovljeno je bilo, da sta zmanjšanje koncentracije fosfata in agarja v rastnem mediju ter visoka temperatura ključni parametri za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije. Tekom raziskav so znanstveniki ugotovili, da se proces pospeši, če je v mediju nižja koncentracija fosfatov in nižja koncentracija agarja. Hkrati pa mora biti temperatura višja. Ti parametri so ključni za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije [5].

Samopodvajajoče se plazmide in prenosne plazmide lahko uporabimo kot alternativo za izražanje heterolognih genov. Na ta način se zamudnemu procesu popolne segregacije. Prenosni vektorji, ki se lahko razmnožujejo v E. coli in cianobakterijah, olajšajo kloniranje in vzdrževanje plazmidov. Njihovi glavni pomanjkljivosti pa sta ozek spekter območje gostiteljev in majhno število kopij na celico [5].

Seveda pa še obstaja konjugacija, elektroporacija in »naravna« transformacija.

'''Konjugacija'''

Konjugacija je zelo razširjena in pogosto uporabljena metoda za prenos DNA v cianobakterije. Zanjo je značilna visoka učinkovitost in širok spekter uporabnosti med različnimi vrstami. Pri konjugaciji se uporabita dva različna seva ''E. coli'', in sicer pomožni sev, ki vsebuje konjugativni plazmid (ta nosi mob gene, potrebne za mobilizacijo genetskih elementov) in donorski sev, ki nosi pomožni plazmid, na katerem se nahaja izvor replikacije (oriT), zaporedje, potrebno za konjugacijo, in geni, jih želimo prenesti v cianobakterije. Nekatere vrste potrebujejo dodatne vektorje za optimizacijo učinkovitosti konjugacije [5].

'''Elektroporacija'''

Elektroporacija vključuje uporabo močnega električnega polja, ki ustvari pore v celični membrani cianobakterij. Doslej je bila elektroporacija uspešno uporabljena samo pri nekaterih vrstah cianobakterij. Optimalni pogoji (napetost in trajanje impulza) so vrstno specifični. V nekaterih sevih so elektroporacijo uspešno uporabili za vnost linearnih fragmentov DNA, vendar pa so ti fragmenti izpostavljeni razgradnji z nukleazami. Učinkovitost lahko povečamo z dodajanjem EDTA [5].

'''Naravna transformacija'''

Naravna transformacija opisuje privzem in vzdrževanje eksogene DNA. Pri cianobakterijah retraktilni pilus T4P vzpostavi stik z zunajcelično DNA in z retrakcijo vnese tujo DNA v celico. Znano je, da je več cianobakterij naravno kompetentnih. »Naravno« transformacijo je možno ustvariti tudi z genskim inženiringom. Uvedba gena pilN iz seva Syn7942 v Syn2973 je privedla do pridobitve sposobnosti naravne transformacije, čeprav z nižjo učinkovitostjo kot pri Syn7942. Učinkovitost privzema je odvisna od koncentracije in dolžine DNA, uporabljenega seva cianobakterije in faze rasti. Sposobnost Syn70020s in Syn68030s se drastično zmanjša od eksponentne do stacionarne faze. Opazili so tudi, da ima cirkadiani ritem tudi vlogo pri učinkovitosti transformacije cianobakterij, in sicer geni za pile so prekomerno izraženi v temi ali slabih svetlobnih pogojih. Posledično se s tem poveča tudi kompetentnost cianobakterij v temi [5].

== MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH ==

Večina pristopov sintezne biologije, ki delujejo v heterotrofnih organizmih, kot je ''E. coli'', ni mogoče uporabiti v cianobakterijah. Na primer, promotorji in RBS, ki močno modulirajo izražanje genov v ''E. coli'', ne delujejo dobro v cianobakterijah. Če se osredotočimo samo na povečanje izražanja genov s promotorskim inženiringom, opazimo, da se pri cianobakterijah uporabljajo močni konstitutivni nativni promotorji, sintetični inducibilni promotorji, kemično inducibilni promotorji in okoljsko inducibilni promotorji [5].

Do danes je bilo opisanihh le nekaj močnih konstitutivnih promotorjev, ki pa so pogosto omejeni na samo nekatere vrste in moč izražanja genov niha s cirkadianim ritmom. Sintetični inducibilimi promotorji delujejo v različnih vrstah cianobakterij [5]. Kemično inducibilni promotorji, npr. arabinozni inducibilni promotor, so najpogosteje uporabljeni promotorji, vendar pa niso primerni za velike industrijske bioprocese [3], [5]. Uporaba zunanjih kemičnih induktorjev ni zaželena, saj poveča proizvodne stroške in predstavlja tveganje za okolje, na primer zaradi uporabe težkih kovin. Slednji problem lahko rešimo z uporabo promotorjev, na katere vplivajo okoljski oz. fizični signali kot sta npr. kisik in svetloba.

Znanstveniki so ustvarili s temo inducibilni genski ekspresijski sitem, ki temelji na dvokomponentnem sistemu EnvZ/OmpR iz ''E. coli''. Prav tako so izkoristili prisotnost fikobilisoma v cianobakterijah. Ustvarili so na svetlobo občutljiv genski ekspresijski sistem, ki je sestavljen iz senzorja za zeleno svetlobo CcS, efektorskega elementa CcR ter promotor PcpcG2, ki regulira ekspresijo gena za linker cpcG2 fikobilisoma. Na podlagi sistema za preklop iz aerobnega v anaerobni metabolizem (FNR) iz ''E. coli'' so ustvarili prilagojen sistem v sevu Syn6803 cianobakterij. Z uporabo tega sistema in promotorja PFNR o ustvarili genski ekspresijski sistem, ki se odziva na prisotnost kisika [5].

== VPLIV INTEGRACIJE SISTEMA, INDUCIBILNEGA Z ZELENO SVETLOBO, NA EKSPRESIJO BUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST ==

V izbranem članku so avtorji želeli pokazati, da s svetlobo inducibilnim promotorjem lahko pridobimo večjo količino izobutanola in 3-metil-1-butanola in da so posledično bolj ekonomični ter obvladljivi genetski ekspresijski sistemi kot sistemi s kemikalijami inducibilnimi promotorji. Poleg tega so tudi vključili vpliv integracije tega genskega ekspresijskega sistema na rast cianobakterij.

Za gostiteljski organizem so izbrali cianobakterijo ''Synechocystis sp.'' PCC 6803. Pripravili so 3 različne konstrukte oz. vektorje s konstrukti.

== ZAKLJUČEK ==

== Viri ==
[1] T. J. Johnson, J. L. Gibbons, L. Gu, R. Zhou, and W. R. Gibbons, “Molecular genetic improvements of cyanobacteria to enhance the industrial potential of the microbe: A review,” Biotechnol. Prog., vol. 32, no. 6, pp. 1357–1371, 2016, doi: 10.1002/btpr.2358.

[2] R. Miao, X. Liu, E. Englund, P. Lindberg, and P. Lindblad, “Isobutanol production in Synechocystis PCC 6803 using heterologous and endogenous alcohol dehydrogenases,” Metab. Eng. Commun., vol. 5, no. June, pp. 45–53, 2017, doi: 10.1016/j.meteno.2017.07.003.

[3] S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.

[4] S. Kobayashi et al., “Application of an engineered chromatic acclimation sensor for red-light-regulated gene expression in cyanobacteria,” Algal Res., vol. 44, no. October, p. 101691, 2019, doi: 10.1016/j.algal.2019.101691.

[5] A. Satta, L. Esquirol, and B. E. Ebert, “Current Metabolic Engineering Strategies for Photosynthetic Bioproduction in Cyanobacteria,” Microorganisms, vol. 11, no. 2, pp. 1–34, 2023, doi: 10.3390/microorganisms11020455.

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-22T19:58:33Z

Špela Deučman: /* VPLIV INTEGRACIJE SISTEMA, INDUCIBILNEGA Z ZELENO SVETLOBO, NA EKSPRESIJO BUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1186/s12934-021-01732-x S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.]

== UVOD ==
Hitra rast svetovnega prebivalstva skupaj z naraščajočim povpraševanjem po fosilnih gorivih in povečanimi emisijami CO2 je povzročila večjo potrebo po razvoju trajnostnih virov energije in kemikalij iz obnovljivih virov. V zadnjih desetletjih je bilo veliko raziskav osredotočenih na prepoznavanje trajnostnih metod za proizvodnjo obnovljivih biogoriv [1], [2].

Izobutanol je pomembna spojina kot alternativno gorivo zaradi visoke vsebnosti energije (98 % vsebnosti energije v bencinu) in nižjega parnega tlaka v primerjavi z etanolom. Poleg tega ima izobutanol nižjo vsebnost O2 in nižjo topnost v vodi kot etanol, kar pomeni, da je mogoče v bencin vmešati več izobutanola, medtem pa imamo še vedno nizko vsebnost O2 v končnem izdelku [2].

Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za sintezo izobutanola zaradi svoje sposobnosti, da s fotosintezo pretvarjajo CO2 neposredno v kemične spojine z dodano vrednostjo. S cianobakterijami lahko proizvajamo etanol, izobutiraldehid, izobutanol, 1-butanol, sukcinat, 2,3-butandiol, terpenoide, klorofile, maščobne kisline, sladkor in aminokisline [3]–[5].

Zmožne so tudi vezati atmosferski dušik in zato zavzemajo pomembno vlogo v dušikovem ciklu. Cianobakterije, ki vežejo N2, so še posebej zanimive za raziskovalce, ki se ukvarjajo z razvojem industrijskih sevov za proizvodnjo »zelenih« kemikalij, kot so limonen, farnezen, linalol in mircen [1].

== SINTEZA IZOBUTANOLA IN 3-METIL-1-IZOBUTANOLA V CIANOBAKTERIJAH ==

Najpogostejša sintezna pot za biosintezo izobutanola je pot 2-keto kislin, ki si deli prekurzor (α-ketoizovalerat) s sintezno potjo biosinteze L-valina. α-ketoizovalerat dekarboksilaza (Kivd) iz ''Lactococcus lactis'', ki dekarboksilira α-keto kisline v aldehide, je pomemben encim v poti 2-keto kislin in je bil uporabljen pri ''Escherichia coli'', ''Saccharomyces cerevisiae'', ''Corynebacterium glutamicum'' in cianobakterije za proizvodnjo izobutiraldehida in izobutanola. Kivd je homotetramer, njegova optimalna aktivnost je bila opažena pri 45 °C (pH 6,5) in ima visoko specifičnost za α-ketoizovalerat. Poleg tega je bil Kivd zasnovan za uporabo večjega substrata za proizvodnjo alkoholov z daljšo verigo. Cianobakterije so pritegnile pozornost raziskovalcev zaradi zmožnosti izvajanja fotosinteze, in posledične porabe atmosferskega CO2, ter nizke potrebe po hranilih, visoke tolerance na različna okolja in nezahtevnega genskega inženiringa [2].

== NAČINI VNOSA DNA V CIANOBAKTERIJE ==

Učinkovit prenos eksogene DNA v cianobakterije lahko dosežemo z uporabo suicidalnih vektorjev za prenos kromosomskih genov. To vključuje integracijo DNA fragmenta v kromosome cianobakterij z dvojno homologno rekombinacijo in transformacijo samopodvajajočih plazmidov [5].
Za ohranjanje spremenjenega genotipa je pomembno, da je mutacija stabilna, kar pomeni, da mora biti v vseh kopijah kromosomov. Ta pogoj popolne segregacije genoma je dolgotrajen, saj je večina cianobakterij poliploidnih [5].
Ugotovljeno je bilo, da sta zmanjšanje koncentracije fosfata in agarja v rastnem mediju ter visoka temperatura ključni parametri za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije. Tekom raziskav so znanstveniki ugotovili, da se proces pospeši, če je v mediju nižja koncentracija fosfatov in nižja koncentracija agarja. Hkrati pa mora biti temperatura višja. Ti parametri so ključni za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije [5].

Samopodvajajoče se plazmide in prenosne plazmide lahko uporabimo kot alternativo za izražanje heterolognih genov. Na ta način se zamudnemu procesu popolne segregacije. Prenosni vektorji, ki se lahko razmnožujejo v E. coli in cianobakterijah, olajšajo kloniranje in vzdrževanje plazmidov. Njihovi glavni pomanjkljivosti pa sta ozek spekter območje gostiteljev in majhno število kopij na celico [5].

Seveda pa še obstaja konjugacija, elektroporacija in »naravna« transformacija.

'''Konjugacija'''

Konjugacija je zelo razširjena in pogosto uporabljena metoda za prenos DNA v cianobakterije. Zanjo je značilna visoka učinkovitost in širok spekter uporabnosti med različnimi vrstami. Pri konjugaciji se uporabita dva različna seva ''E. coli'', in sicer pomožni sev, ki vsebuje konjugativni plazmid (ta nosi mob gene, potrebne za mobilizacijo genetskih elementov) in donorski sev, ki nosi pomožni plazmid, na katerem se nahaja izvor replikacije (oriT), zaporedje, potrebno za konjugacijo, in geni, jih želimo prenesti v cianobakterije. Nekatere vrste potrebujejo dodatne vektorje za optimizacijo učinkovitosti konjugacije [5].

'''Elektroporacija'''

Elektroporacija vključuje uporabo močnega električnega polja, ki ustvari pore v celični membrani cianobakterij. Doslej je bila elektroporacija uspešno uporabljena samo pri nekaterih vrstah cianobakterij. Optimalni pogoji (napetost in trajanje impulza) so vrstno specifični. V nekaterih sevih so elektroporacijo uspešno uporabili za vnost linearnih fragmentov DNA, vendar pa so ti fragmenti izpostavljeni razgradnji z nukleazami. Učinkovitost lahko povečamo z dodajanjem EDTA [5].

'''Naravna transformacija'''

Naravna transformacija opisuje privzem in vzdrževanje eksogene DNA. Pri cianobakterijah retraktilni pilus T4P vzpostavi stik z zunajcelično DNA in z retrakcijo vnese tujo DNA v celico. Znano je, da je več cianobakterij naravno kompetentnih. »Naravno« transformacijo je možno ustvariti tudi z genskim inženiringom. Uvedba gena pilN iz seva Syn7942 v Syn2973 je privedla do pridobitve sposobnosti naravne transformacije, čeprav z nižjo učinkovitostjo kot pri Syn7942. Učinkovitost privzema je odvisna od koncentracije in dolžine DNA, uporabljenega seva cianobakterije in faze rasti. Sposobnost Syn70020s in Syn68030s se drastično zmanjša od eksponentne do stacionarne faze. Opazili so tudi, da ima cirkadiani ritem tudi vlogo pri učinkovitosti transformacije cianobakterij, in sicer geni za pile so prekomerno izraženi v temi ali slabih svetlobnih pogojih. Posledično se s tem poveča tudi kompetentnost cianobakterij v temi [5].

== MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH ==

Večina pristopov sintezne biologije, ki delujejo v heterotrofnih organizmih, kot je ''E. coli'', ni mogoče uporabiti v cianobakterijah. Na primer, promotorji in RBS, ki močno modulirajo izražanje genov v ''E. coli'', ne delujejo dobro v cianobakterijah. Če se osredotočimo samo na povečanje izražanja genov s promotorskim inženiringom, opazimo, da se pri cianobakterijah uporabljajo močni konstitutivni nativni promotorji, sintetični inducibilni promotorji, kemično inducibilni promotorji in okoljsko inducibilni promotorji. Do danes je bilo opisanihh le nekaj močnih konstitutivnih promotorjev, ki pa so pogosto omejeni na samo nekatere vrste in moč izražanja genov niha s cirkadianim ritmom. Sintetični inducibilimi promotorji delujejo v različnih vrstah cianobakterij [5]. Kemično inducibilni promotorji, npr. arabinozni inducibilni promotor, so najpogosteje uporabljeni promotorji, vendar pa niso primerni za velike industrijske bioprocese [3], [5]. Uporaba zunanjih kemičnih induktorjev ni zaželena, saj poveča proizvodne stroške in predstavlja tveganje za okolje, na primer zaradi uporabe težkih kovin. Slednji problem lahko rešimo z uporabo promotorjev, na katere vplivajo okoljski oz. fizični signali kot sta npr. kisik in svetloba. Znanstveniki so ustvarili s temo inducibilni genski ekspresijski sitem, ki temelji na dvokomponentnem sistemu EnvZ/OmpR iz ''E. coli''. Prav tako so izkoristili prisotnost fikobilisoma v cianobakterijah. Ustvarili so na svetlobo občutljiv genski ekspresijski sistem, ki je sestavljen iz senzorja za zeleno svetlobo CcS, efektorskega elementa CcR ter promotor PcpcG2, ki regulira ekspresijo gena za linker cpcG2 fikobilisoma. Na podlagi sistema za preklop iz aerobnega v anaerobni metabolizem (FNR) iz ''E. coli'' so ustvarili prilagojen sistem v sevu Syn6803 cianobakterij. Z uporabo tega sistema in promotorja PFNR o ustvarili genski ekspresijski sistem, ki se odziva na prisotnost kisika [5].

== VPLIV INTEGRACIJE SISTEMA, INDUCIBILNEGA Z ZELENO SVETLOBO, NA EKSPRESIJO BUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST ==

V izbranem članku so avtorji želeli pokazati, da s svetlobo inducibilnim promotorjem lahko pridobimo večjo količino izobutanola in 3-metil-1-butanola in da so posledično bolj ekonomični ter obvladljivi genetski ekspresijski sistemi kot sistemi s kemikalijami inducibilnimi promotorji. Poleg tega so tudi vključili vpliv integracije tega genskega ekspresijskega sistema na rast cianobakterij.

Za gostiteljski organizem so izbrali cianobakterijo ''Synechocystis sp.'' PCC 6803. Pripravili so 3 različne konstrukte oz. vektorje s konstrukti.

== ZAKLJUČEK ==

== Viri ==
[1] T. J. Johnson, J. L. Gibbons, L. Gu, R. Zhou, and W. R. Gibbons, “Molecular genetic improvements of cyanobacteria to enhance the industrial potential of the microbe: A review,” Biotechnol. Prog., vol. 32, no. 6, pp. 1357–1371, 2016, doi: 10.1002/btpr.2358.

[2] R. Miao, X. Liu, E. Englund, P. Lindberg, and P. Lindblad, “Isobutanol production in Synechocystis PCC 6803 using heterologous and endogenous alcohol dehydrogenases,” Metab. Eng. Commun., vol. 5, no. June, pp. 45–53, 2017, doi: 10.1016/j.meteno.2017.07.003.

[3] S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.

[4] S. Kobayashi et al., “Application of an engineered chromatic acclimation sensor for red-light-regulated gene expression in cyanobacteria,” Algal Res., vol. 44, no. October, p. 101691, 2019, doi: 10.1016/j.algal.2019.101691.

[5] A. Satta, L. Esquirol, and B. E. Ebert, “Current Metabolic Engineering Strategies for Photosynthetic Bioproduction in Cyanobacteria,” Microorganisms, vol. 11, no. 2, pp. 1–34, 2023, doi: 10.3390/microorganisms11020455.

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-22T19:56:28Z

Špela Deučman:

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-21T22:46:50Z

Špela Deučman:

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-21T22:39:36Z

Špela Deučman:

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-21T22:32:00Z

Špela Deučman:

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-21T21:55:38Z

Špela Deučman:

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-21T20:45:41Z

Špela Deučman:

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-21T20:45:11Z

Špela Deučman:

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-21T20:43:30Z

Špela Deučman:

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-21T09:42:35Z

Špela Deučman:

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-21T09:39:40Z

Špela Deučman:

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-21T09:37:23Z

Špela Deučman:

Povzeto po članku: [S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.

Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., & Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codon suppression. Proceedings of the National Academy of Sciences, 120(8), e2219758120. https://doi.org/10.1073/pnas.2219758120]

== Uvod ==

== ==

''''''

== ==

''''''

''''''

== ==

''''''

''''''

== ==

== Povzetek ==

== Viri ==
[1]

[2]

[3]

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-21T09:34:23Z

Špela Deučman: Replacing page with 'Povzeto po članku: [Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., & Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codo...'

S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

2023-05-21T09:32:14Z

Špela Deučman: New page: Povzeto po članku: [Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., & Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codon suppressio...

Povzeto po članku: [Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., & Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codon suppression. Proceedings of the National Academy of Sciences, 120(8), e2219758120. https://doi.org/10.1073/pnas.2219758120]

== Uvod ==

Razcepljena ortogonalna aminoacil-tRNA sintetaza (o-aaRS) je bila dizajnirana in ustvarjena za kontrolo translacije v bakterijskih (E. coli) in sesalskih celicah (HEK23). Njihova vloga je supresija stop kodonov v prisotnosti majhnih molekul rapamicina in abscisne kisline, kar je omogočeno preko kemično inducirane dimerizacije. V odsotnosti o-aaRS je stop kodon supresija izključena, torej je translacija inhibirana. V članku so uporabili takšno o-aaRS, ki prepozna nekanonične oz. nenaravne aminokisline [2] kot substrat. Če dodamo ncAA in o-aaRS, potem bo aminoacil-tRNA sintetaza vezala ncAA na supresorsko tRNA in to bo omogočilo translacijo tarčnega gena. V članku so uporabili pirolizil-tRNA sintetazo (PylRS) in tirozil-tRNA sintetazo [1].

== Načrtovanje in validacija split tRNA sintetaz ==

'''Pirolizil-tRNA sintetaza (PylRS)'''

Za sintezo razcepljene o-aaRS na podlagi PylRS so uporabili PyRS iz arheona ''Ca''. Methanomethylophilus alvus, ki je prepoznala nekanonično aminokislino meta-iodo-L-fenilalanin (mIF) kot substrat. S pomočjo kristalne strukture so določili 7 potencialnih cepitvenih mest, ki so dala N (PylRSN) in C (PylRSC) fragment. Naredili so fuzijo s peptidoma SYNZIP17 (N fragment) in SYNZIP18 (C fragment). Za preverjanje aktivnosti razpolovljene PylRS so fuzijske SYNZIP fragmente soizražali s pirolizin tRNA (tRNAPyl) in zelenim fluorescenčnim proteinom, ki je znotraj odprtega bralnega okvirja vseboval stop kodon TAG na poziciji 2 (sfGFP-2TAG). SfGFP (superfolder GFP [3]) produkcija je pričakovana samo takrat, ko lahko razpolovljena PylRS aminoacilira tRNAPyl z nekanonično aminokislino mIF. SfGFP fluorescenco so merili posledično tako, da so celice gojili v prisotnosti in odsotnosti mIF. Rezultati so pokazali, da je bila produkcija sfGFP v celicah, ki so rastle v prisotnosti mIF drastično večjo od celic, kjer ni bilo dodanih ncAA. To so opazili pri petih od sedmih razpolovljenih variant PylRS – Q23, D112, D137, R137, D195. Najaktivnejši razpolovljeni PylRS varianti sta bili tisti, kjer smo razcepili encim na mestih Q23in D137. Pri variantah Q23 in D137 so ugotovili, da je fluorescenca največja pri celicah, ki izražajo fuzijske proteine iz PylRS in SYNZIP peptidov. Nobene fluorescence niso zaznali, če sta bila oba peptida SYNZIP deletirana. Za potrditev teh rezultatov so naredili naslednji eksperiment v E. coli. Ta je simultano izražala SYNZIP-fuzijske PylRS fragmente skupaj z reporterskim genom CmR-112TAG. Celice so nato rastle na mediju z mIF in različnimi koncentracijami kloramfenikola. Celice, ki so izražale PylRS varianto Q23 so lahko rastle na kloramfenikolu z samo N fragmentom (fuzija s SYNZIP peptidom), medtem ko so celice z varianto D137 rastle samo v prisotnosti obeh fragmentov [1].

'''Tirozil-tRNA sintetaza (TyrRS)'''

Raziskovalci so uporabili tirozil-tRNA iz ''Methanocaldococcus jannaschii'' (MjTyrRS). Določili so 5 potencialnih mest, kjer so lahko cepili encim, da so dobili N (TyrRSN) in C (TyrRSC) terminalni fragment. Naredili so fuzijski protein s SYNZIP17 in SYNZIP18 peptidom. Za ncAA substrat so uporabili para-iodo-L-fenilalaninom (pIF). Aktivnost encima so preverjali s sfGFP, ki je izrazito povečana pri celicah, katerim so dodali pIF. Za normalno delovanje TyrRS so morale celice izražati tako N kot tudi C terminalni fragment. Najaktivnejši varianti MjTyrRS sta bili tisti, ki sta bili cepljeni na mestih K99 in N268.
Za potrditev, da je aktivnost razcepljenega encima odvisna od interakcije peptidov SYNZIP, so merili aktivnost MjTyrRS z in brez fuzije s SYNZIP. Za varianto K99 nista bila ne SYNZIP17 ne SYNZIP18 potrebna za normalno aktivnost. Pri N268 varianti pa je bila sfGFP produkcija opazna samo tam, kjer sta bila tako TyrRSN kot tudi TyrRSC fuzijsko povezana s SYNZIP. To je pomenilo, da je interakcija SYNZIP ključna za vzpostavitev aktivnosti MjTyrRS [1].

== Detekcija terapevtsko relevantnih PPI-jev z razcepljeno PylRS ==

Cilj je bil detekcija PPI-jev med pomembnimi terapevtskimi tarčami v bakterijah in človeških celicah. Ker MjTyrRS ni ortogonalna v evkariontih, so se osredotočili na razcepljeno PylRS [1].

'''APOPTOZA'''

V tem članku so se raziskovalci odločili, da bodo poskusili detektirati interakcije med BH3 domeno proapoptotičnega proteina tBID in antipoptotičnimi proteini Mcl-1 in Bcl-2 (vežeta na tBID in preprečita apoptozo). Klonirali so PylRSN kot fuzijo z Mcl-1 ali Bcl-2 ter PylRSc kot fuzijo z BH3 domeno (tBID) ali z kontrolnim peptidom (Dead BID). Te fuzijske proteine so nato izrazili skupaj z tRNAPyl in sfGFP-2TAG reporterjem. Nato so merili sfGFP fluorescenco z in brez mIF. Rezultati so pokazali, da nastaja sfGFP, če se izražajo fuzijski protein tBID-PylRSC in Mcl-1 ali Bcl-2. Fluorescenco so zaznali samo v primeru, ko so dodali mIF [1].

'''SARS-COV-2'''

V članku so želeli detektirati interakcijo med HR1 (heptad repeat 1) in HR2 (heptad repeat 2) motiva spike (S) proteina SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2) virusa. HR1 in HR2 med seboj interagirata in omogočita membransko fuzijo virusa in gostiteljeve membrane. Za detekcijo interakcije HR1 in HR2 s pomočjo PylRS, so v članku dizajnirali 5 helični kompleks (5-HB) sestavljen iz 2 HR2 heliksov in 3 HR1 heliksov z vmesnim linkerjem, ki ima izpostavljeno hidrofobno zanko, kamor se HR2 heliks lahko veže. Ko so se s 5-HB in HR2 spojeni PylRS fragmenti istočasno izrazili in če so dodali tRNAPyl in sfGFP-2TAG, so opazili sfGFP fluorescenco ob prisotnosti mIF. Te niso zaznali, če je manjkal HR2 ali 5-HB del [2].

== Uporaba razpolovljenih aaRS in majhnih molekul kot induktorjev za supresijo stop kodonov ==

'''Z RAP induciran dimerizacijski sistem'''

Raziskovalci so N- in C-fragment MjTyrRS spojili s FKBP in FRB proteini, ki so del rapamicin (RAP)-induciranega dimerizacijskega sistema. V tem sistemu receptorja FKBP in FBR tvorita stabilen dimer le v prisotnosti liganda RAP (rapamicina). V celicah E. coli so izrazili sočasno fuzijska proteina TyrRSN-FBR in TyrRSC-FKBP, tRNATyr, sfGFP-2TAG. Nato so spremljali nastanek sfGFP v prisotnosti in odsotnosti RAP in substrata za MjTyrRS pIF. Ko sta bila prisotna tako pIF kot tudi RAP, je bila fluorescenca sfGFP več kot 2x večja kot v celicah, ki smo jim dodali samo RAP oz. samo pIF. Z večanjem koncentracije RAP se je večala fluorescenca [1].

'''Z ABA induciran dimerizacijski sistem'''

ABA oz. abscisna kislina je rastlinski hormon, ki povzroči dimerizacijo ABI in PYL proteinov. Naredili so fuzijski protein ABI in PylRSN ter PYL in PylRSC. Reporter je bil sfGFP-2TAG. Močna produkcija sfGFP je bila v celicah, ki so rastle v mediju z ABA in mIF (substrat PylRS). Tako so sklepali, da lahko ABA učinkovito aktivira PylRS in tako inducira stop kodon supresijo. Sledil je eksperiment v E. coli, kjer so izrazili sočasno ABI- in PYL-PylRS fuzijske proteine, tRNAPyl in CmR-112TAG reporterski gen. Celice so rastle samo tam, kjer je ABA bila dodana. Takšne razpolovljene o-aaRS lahko služijo kot AND vrata, kjer imamo dva inputa (RAP in pIF ali ABA in mIF), da dobimo željen output (read-through čez stop kodon) [1].

== Kontrola genskega izražanja v sesalskih celicah ==

Najprej so želeli optimizirati aktivnost PylRS v ABA-induciranem sistemu tako, da so optimizirali linkerje med PylRS fragmenti in ABI/PYL proteini. Naredili so 7 fuzijskih proteinov, kjer so bili PylRS fragmenti povezani z ABI in PYL preko fleksibilnega linkerja v obliki G(GSG)nG. N je bil od 0 do 6. Aktivnost PylRS so preverili s sfGFP fluorescenco. Ugotovili so, da je daljši linker omogočil večjo aktivnost PylRS in s tem večjo fluorescenco, vendar pa je z daljšim linkerjem postala PylRS bolj nespecifična, torej do stop kodon supresije je prišlo tudi takrat, ko ni bilo dodanih ncAA. Raziskovalci so na podlagi tega izbrali linker n=4 kot optimizirano varianto [1].

Optimizirano varianto so uporabili v HEK293 celicah za predstavitev ABA-inducirane stop kodon supresije. Naredili so fuzijski konstrukt iz PylRSN-ABI in PYL-PylRSC fragmenta, ki so ju povezali s T2A peptidom. Fuzijski gen so izrazili skupaj z tRNAPyl in reporterskim genom (SEAP-41TAG).
HEK291 celice so gojili v mediju s PylRS substratom Nε-boc-L-lizin (BocK) in različnimi koncentracijami ABA. Ugotovili so, da se je SEAP aktivnost povečala za več kot 10x, če so celice gojili v mediju, ki je vseboval tako BocK kot tudi ABA kot pa če so celice gojili v mediju, ki je vseboval eno izmed teh dveh stvari. Če ni bilo ABA ali BocK, je bila SEAP ekspresija podobna intenziteti ozadja. Split PylRS deluje kot AND vrata za sesalske celice, saj imamo dva inputa (ABA in BocK), ki generirata en output (stop kodon supresija) [1].

== Povzetek ==

== Viri ==
[1]

[2]

[3]

Seminarji SB 2022/23

2023-05-21T09:28:35Z

Špela Deučman:

V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_tumor_ciljajočih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_dušikov(II)_oksid Priprava tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljeni_ribocim%2C_ki_signale_nativnih_RNA_pove%C5%BEe_z_ortogonalnimi_proteinskimi_izhodnimi_signali Razcepljeni ribocim, ki signale nativnih RNA poveže z ortogonalnimi proteinskimi izhodnimi signali] (Ajda Beltram)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_nadzor_%C5%A1tevila_plazmidov_v_celici_%28Tulip%29 Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)] (Gregor Strniša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Skupnostna_znanost_je_na%C4%8Drtovala_ribosome_s_koristnimi_fenotipi Skupnostna znanost je načrtovala ribosome s koristnimi fenotipi] (Tanja Gošnjak)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pristop_sintezne_biologije_za_načrtovanje_kandidata_za_cepivo_proti_delta_različici_SARSCoV2_je_razkril_prekinitev_favoriziranega_para_kodonov_kot_boljšo_strategijo_pred_uporabo_redkih_kodonov Pristop sintezne biologije za načrtovanje kandidata za cepivo proti delta različici SARS-CoV-2 je razkril prekinitev favoriziranega para kodonov kot boljšo strategijo pred uporabo redkih kodonov] (Stefanija Ivanova)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Dvosmerni_hibridni_eritritol_–_inducibilni_promotor_za_sintezno_biologijo_v_Yarrowia_lipolytica Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v ''Yarrowia lipolytica''] (Maša Andoljšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Utišanje_izražanja_genov_s_strukturo_definirano_zankasto_strukturo_male_nekodirajoče_RNA_s_programiranimi_regulatornimi_aktivnostmi Utišanje izražanja genov s strukturno definirano zankasto strukturo male nekodirajoče RNA s programiranimi regulatornimi aktivnostmi] (Nika Bedrač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izbolj%C5%A1anje_evolucijske_stabilnosti_obremenjujo%C4%8Dih_in_toksi%C4%8Dnih_funkcij_v_E.coli_z_diferenciacijskim_genetskim_vezjem_posredovanim_z_integrazo Izboljšanje evolucijske stabilnosti obremenjujočih in toksičnih funkcij v E.coli z diferenciacijskim genetskim vezjem posredovanim z integrazo] (Nika Banovšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_sintetična_mala_RNA%2C_ki_promovira_prekomerno_izražanje_proteinov_v_brezceličnem_sistemu Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brez-celičnem sistemu] (Ana Godeša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_kontrolo_hitrosti_rasti_celic%2C_ki_zmanj%C5%A1uje_breme_aktivacije_genov Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov] (Neža Ribnikar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biohibridne_membrane_za_odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_iz_vode Biohibridne membrane za odstranjevanje težkih kovin iz vode] (Tadej Uršič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_CIVT-SELEX_za_izbiro_aptamerov_kot_genskih_delov_za_regulacijo_genetskih_vezij_v_brezceličnem_sistemu Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu] (Klemen Kunej)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_Cyborg_bakterij_preko_intracelularne_hidrogelacije Inženiring Cyborg bakterij preko intracelularne hidrogelacije] (Eva Oven)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezovanje_celi%C4%8Dne_komunikacije_z_optogenetiko:_implementacija_svetlobno_inducibilnega_medceli%C4%8Dnega_sistema_v_kvasovkah Povezovanje celične komunikacije z optogenetiko: implementacija svetlobno inducibilnega medceličnega sistema v kvasovkah] (Nika Perko)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_sinteti%C4%8Dni_biomolekulski_kondenzati_za_nadzor_celi%C4%8Dnih_procesov Programabilni sintetični biomolekulski kondenzati za nadzor celičnih procesov] (Anja Konjc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljena_%28split%29_aminoacil-tRNA_sintetaza_za_indukcijo_supresije_stop_kodona Razcepljena (split) aminoacil-tRNA sintetaza za indukcijo supresije stop kodona] (Špela Štor)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/S_svetlobo_inducirana_produkcija_izobutanola_in_3-metil-1-butanola_z_modificiranimi_cianobakterijami S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami] (Špela Katarina Deučman)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NETLANTIS NETLANTIS] (Maša Gabrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BINANOX BINANOX] (Vivian Nemanič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CoBiota CoBiota] (Petra Sintič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sporadicate Sporadicate] (Gašper Možina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FISHERLY FISHERLY] (Lucija Pišek)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].

Seminarji SB 2022/23

2023-05-21T09:26:44Z

Špela Deučman:

V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_tumor_ciljajočih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_dušikov(II)_oksid Priprava tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljeni_ribocim%2C_ki_signale_nativnih_RNA_pove%C5%BEe_z_ortogonalnimi_proteinskimi_izhodnimi_signali Razcepljeni ribocim, ki signale nativnih RNA poveže z ortogonalnimi proteinskimi izhodnimi signali] (Ajda Beltram)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_nadzor_%C5%A1tevila_plazmidov_v_celici_%28Tulip%29 Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)] (Gregor Strniša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Skupnostna_znanost_je_na%C4%8Drtovala_ribosome_s_koristnimi_fenotipi Skupnostna znanost je načrtovala ribosome s koristnimi fenotipi] (Tanja Gošnjak)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pristop_sintezne_biologije_za_načrtovanje_kandidata_za_cepivo_proti_delta_različici_SARSCoV2_je_razkril_prekinitev_favoriziranega_para_kodonov_kot_boljšo_strategijo_pred_uporabo_redkih_kodonov Pristop sintezne biologije za načrtovanje kandidata za cepivo proti delta različici SARS-CoV-2 je razkril prekinitev favoriziranega para kodonov kot boljšo strategijo pred uporabo redkih kodonov] (Stefanija Ivanova)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Dvosmerni_hibridni_eritritol_–_inducibilni_promotor_za_sintezno_biologijo_v_Yarrowia_lipolytica Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v ''Yarrowia lipolytica''] (Maša Andoljšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Utišanje_izražanja_genov_s_strukturo_definirano_zankasto_strukturo_male_nekodirajoče_RNA_s_programiranimi_regulatornimi_aktivnostmi Utišanje izražanja genov s strukturno definirano zankasto strukturo male nekodirajoče RNA s programiranimi regulatornimi aktivnostmi] (Nika Bedrač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izbolj%C5%A1anje_evolucijske_stabilnosti_obremenjujo%C4%8Dih_in_toksi%C4%8Dnih_funkcij_v_E.coli_z_diferenciacijskim_genetskim_vezjem_posredovanim_z_integrazo Izboljšanje evolucijske stabilnosti obremenjujočih in toksičnih funkcij v E.coli z diferenciacijskim genetskim vezjem posredovanim z integrazo] (Nika Banovšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_sintetična_mala_RNA%2C_ki_promovira_prekomerno_izražanje_proteinov_v_brezceličnem_sistemu Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brez-celičnem sistemu] (Ana Godeša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_kontrolo_hitrosti_rasti_celic%2C_ki_zmanj%C5%A1uje_breme_aktivacije_genov Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov] (Neža Ribnikar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biohibridne_membrane_za_odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_iz_vode Biohibridne membrane za odstranjevanje težkih kovin iz vode] (Tadej Uršič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_CIVT-SELEX_za_izbiro_aptamerov_kot_genskih_delov_za_regulacijo_genetskih_vezij_v_brezceličnem_sistemu Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu] (Klemen Kunej)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_Cyborg_bakterij_preko_intracelularne_hidrogelacije Inženiring Cyborg bakterij preko intracelularne hidrogelacije] (Eva Oven)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezovanje_celi%C4%8Dne_komunikacije_z_optogenetiko:_implementacija_svetlobno_inducibilnega_medceli%C4%8Dnega_sistema_v_kvasovkah Povezovanje celične komunikacije z optogenetiko: implementacija svetlobno inducibilnega medceličnega sistema v kvasovkah] (Nika Perko)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_sinteti%C4%8Dni_biomolekulski_kondenzati_za_nadzor_celi%C4%8Dnih_procesov Programabilni sintetični biomolekulski kondenzati za nadzor celičnih procesov] (Anja Konjc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljena_%28split%29_aminoacil-tRNA_sintetaza_za_indukcijo_supresije_stop_kodona Razcepljena (split) aminoacil-tRNA sintetaza za indukcijo supresije stop kodona] (Špela Štor)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/S_svetlobo_inducirana_produkcija_izobutanola_in_3-metil-1-butanola_z_modificiranimi_cianobakterijami] (Špela Katarina Deučman)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NETLANTIS NETLANTIS] (Maša Gabrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BINANOX BINANOX] (Vivian Nemanič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CoBiota CoBiota] (Petra Sintič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sporadicate Sporadicate] (Gašper Možina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FISHERLY FISHERLY] (Lucija Pišek)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].

Seminarji SB 2022/23

2023-05-21T09:24:21Z

Špela Deučman:

V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_tumor_ciljajočih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_dušikov(II)_oksid Priprava tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljeni_ribocim%2C_ki_signale_nativnih_RNA_pove%C5%BEe_z_ortogonalnimi_proteinskimi_izhodnimi_signali Razcepljeni ribocim, ki signale nativnih RNA poveže z ortogonalnimi proteinskimi izhodnimi signali] (Ajda Beltram)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_nadzor_%C5%A1tevila_plazmidov_v_celici_%28Tulip%29 Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)] (Gregor Strniša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Skupnostna_znanost_je_na%C4%8Drtovala_ribosome_s_koristnimi_fenotipi Skupnostna znanost je načrtovala ribosome s koristnimi fenotipi] (Tanja Gošnjak)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pristop_sintezne_biologije_za_načrtovanje_kandidata_za_cepivo_proti_delta_različici_SARSCoV2_je_razkril_prekinitev_favoriziranega_para_kodonov_kot_boljšo_strategijo_pred_uporabo_redkih_kodonov Pristop sintezne biologije za načrtovanje kandidata za cepivo proti delta različici SARS-CoV-2 je razkril prekinitev favoriziranega para kodonov kot boljšo strategijo pred uporabo redkih kodonov] (Stefanija Ivanova)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Dvosmerni_hibridni_eritritol_–_inducibilni_promotor_za_sintezno_biologijo_v_Yarrowia_lipolytica Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v ''Yarrowia lipolytica''] (Maša Andoljšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Utišanje_izražanja_genov_s_strukturo_definirano_zankasto_strukturo_male_nekodirajoče_RNA_s_programiranimi_regulatornimi_aktivnostmi Utišanje izražanja genov s strukturno definirano zankasto strukturo male nekodirajoče RNA s programiranimi regulatornimi aktivnostmi] (Nika Bedrač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izbolj%C5%A1anje_evolucijske_stabilnosti_obremenjujo%C4%8Dih_in_toksi%C4%8Dnih_funkcij_v_E.coli_z_diferenciacijskim_genetskim_vezjem_posredovanim_z_integrazo Izboljšanje evolucijske stabilnosti obremenjujočih in toksičnih funkcij v E.coli z diferenciacijskim genetskim vezjem posredovanim z integrazo] (Nika Banovšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_sintetična_mala_RNA%2C_ki_promovira_prekomerno_izražanje_proteinov_v_brezceličnem_sistemu Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brez-celičnem sistemu] (Ana Godeša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_kontrolo_hitrosti_rasti_celic%2C_ki_zmanj%C5%A1uje_breme_aktivacije_genov Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov] (Neža Ribnikar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biohibridne_membrane_za_odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_iz_vode Biohibridne membrane za odstranjevanje težkih kovin iz vode] (Tadej Uršič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_CIVT-SELEX_za_izbiro_aptamerov_kot_genskih_delov_za_regulacijo_genetskih_vezij_v_brezceličnem_sistemu Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu] (Klemen Kunej)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_Cyborg_bakterij_preko_intracelularne_hidrogelacije Inženiring Cyborg bakterij preko intracelularne hidrogelacije] (Eva Oven)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezovanje_celi%C4%8Dne_komunikacije_z_optogenetiko:_implementacija_svetlobno_inducibilnega_medceli%C4%8Dnega_sistema_v_kvasovkah Povezovanje celične komunikacije z optogenetiko: implementacija svetlobno inducibilnega medceličnega sistema v kvasovkah] (Nika Perko)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_sinteti%C4%8Dni_biomolekulski_kondenzati_za_nadzor_celi%C4%8Dnih_procesov Programabilni sintetični biomolekulski kondenzati za nadzor celičnih procesov] (Anja Konjc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljena_%28split%29_aminoacil-tRNA_sintetaza_za_indukcijo_supresije_stop_kodona Razcepljena (split) aminoacil-tRNA sintetaza za indukcijo supresije stop kodona] (Špela Štor)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/] (Špela Katarina Deučman)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NETLANTIS NETLANTIS] (Maša Gabrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BINANOX BINANOX] (Vivian Nemanič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CoBiota CoBiota] (Petra Sintič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sporadicate Sporadicate] (Gašper Možina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FISHERLY FISHERLY] (Lucija Pišek)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].

Talk:Protivirusna zdravila

2018-05-07T20:12:17Z

Špela Deučman: New page: Polona Skrt: Zgodovina in razvoj zdravil, virocidi, virostatiki Tina Turel: Imunomodulatorji, Rezistenca

Polona Skrt: Zgodovina in razvoj zdravil, virocidi, virostatiki

Tina Turel: Imunomodulatorji, Rezistenca

Protivirusna zdravila

2018-05-07T20:05:28Z

Špela Deučman: New page: ==Protivirusna zdravila== ==1. Zgodovina in razvoj zdravil== Razvoj zdravil se je začel v 60. letih, kot odgovor na epidemije, ki so tvegale ogromno število smrtnih žrtev po vsem svetu...

==Protivirusna zdravila==

==1. Zgodovina in razvoj zdravil==
Razvoj zdravil se je začel v 60. letih, kot odgovor na epidemije, ki so tvegale ogromno število smrtnih žrtev po vsem svetu. Na začetku razvoja zdravil je raziskovanje učinkovin potekalo naključno. Niso se osredotočali na specifične mehanizme delovanja virusov, ampak so testirali naključne spojine in naravne produkte za njihovo sposobnost inhibicije replikacije virusov.
Trenutno je protivirusnih zdravil je zelo malo in skoraj vsa so virusno specifična. Način replikacije virusa zahteva delovanje zdravil na sisteme v celici, ki jih potrebuje tudi sam organizem za delovanje, zato so zelo pogosti stranski učinki. Prav tako je za ustrezno delovanje zdravila pomembno, da je dovolj močno, da v celoti ustavi replikacijo. V nasprotnem primeru se pogosto razvijejo odporni mutantski virusi.

==2. Virocidi==
Točni mehanizmi delovanja virocidov oz. dezinfekcijskih sredstev niso znani, saj so specifični glede na posamezen virus in učinkovino. Tudi najmanjše razlike v zgradbi virusov lahko ključno vplivajo na njihovo odpornost. Virocidi delujejo tako, da povzročijo ireverzibilno deaktivacijo virusa s kemijsko poškodbo. Napadejo eno ali več ključnih funkcij v replikaciji virusa; najpogosteje prepoznavanje in pripenjanje virusa ter povzročijo poškodbe genoma. Nekateri tudi preprečijo injeciranje virusnega genoma v gostiteljsko celico.
Virocidi so lahko detergenti, močne kisine, nanodelci kovin, UV svetloba in visoka temperatura. Zelo pomembni so tudi močni oksidanti; npr. O2 in ClO2, ki preprečujeta povezavo virusa z gostiteljsko celico. Prosti klor povzroča poškodbe na genomu in v zgradbi virusa ter onemogoči vnos in replikacijo genoma. UV svetloba deluje prek inibicije replikacije genoma in hkrati preprečuje vnos genoma v celico.
Virocidi delujejo dokaj nespecifično, vseeno pa je kvaliteta delovanja odvisna od prisotnosti lipidne ovojnice in velikosti virusa. Najbolj občutljivi na dezinfekcijska sredstva so virusi iz skupine, ki jih sestavljajo lipidi. Najbolj odporni pa so majhni virusi brez lipidov.
Dezinfekcijska sredstva so pomembna za preprečevanje izbruha ali okoljskega širjenja okužb prek vode in hrane, uporabljajo jih tudi v proizvodnji cepiv.
==3. Virostatiki==
Virostatiki so zdravila, ki se uporabljajo za zdravljenje specifičnih virusnih okužb. Podobno kot virocidi napadajo različne točke gostiteljevega mehanizma, ki omogoča razvoj virusa. Veliko zdravil je nukleozidov ali nukleozidnih analogov. Pri zdravljenju s katerimikoli zdravili je pogost razvoj odpornih mutantskih virusov, zato se predvsem pri zdravljenju okužbe z virusom HIV poslužujejo kombinacij različnih zdravil. Vsa protivirusna zdravila so bolj ali manj toksična za gostitelja, zato zdravljenje pogosto spremljajo hudi neželeni stranski učinki.

VIRUS HERPESA
Doživljenjsko bivana v gostitelju in morfološko spreminja celice ter napada tkiva ektodermalnega izvora.
Pogosta zdravila za zdravljenje so aciklovir (Virolex), iodoksiuridin, cidofovir, itd.

Aciklovir je derivat gvanina. Po privzemu v celico se fosforilira in inhibira DNA polimerazo kot zaključevalec verige. Prvo fosforilacijo katalizira v virusu kodiran encim timidin kinaza.

Iodoksiuridin je nukleozidni timidinski analog. Po fosforilaciji v celici se vgradi v virusno DNA in jo naredi manj obstojno. Inhibira timidinsko kinazo in DNA polimerazo. Vgrajuje se tudi v celično DNA.

Cidofovir je nukleozidni citozinski analog. Inhibira sintezo DNA s tem, da upočasni ali ustavi elongacijo verige. Je učinkovito zdravilo, vendar povzroči nepopravljivo okvaro ledvic.

VIRUS INFLUENCE
Povzroča gripo, ki ima majhno smrtnost.
Zdravila, ki so pogosto v uporabi so amantadin, zanamivir, oseltamivir (Tamiflu), itd..

Amantadin (Symetrel) inhibira replikacijo virusa influence A. Vpliv na slačenje in sestavljanje virusa. Interagira z virusnim M2 proteinom (ionski kanalček) ter tako blokira vstop protonov v virion, ki so potrebni za ustvaritev primerno kislega okolja za slačenje ovojnice.

Zanamivir in oseltamivir imitirata naravni ligand (sialično kislino) ter tako inhibirata nevraminidazo, ki je odgovorna za cepitev N-acetilneuraminske (sialične) kisline z virusnega receptorja, da se novi virusi lahko izpustijo z okužene celice. Tako ostanejo virusi ujeti na celici.

VIRUS HEPATITISA
Zdravljenje okužb z različnimi oblikami hapatitisa poteka z interferonom-α-2b, lamivudinom, adefovirom, ribavirinom, itd.

Ribavirin je gvanozinski analog. V obliki trifosfata inhibira replikacijo DNA in RNA virusov prek inhibicije mRNA polimeraze in z onemogočanjem sinteze oligonukleotidnega primerja pomembnega za transkripcijo genoma.

HIV
Za zdravljenje okužb virusa HIV obstaja največ zdravil, ki delujejo kot inhibitorji reverzne transkriptaze, inhibitorji proteaz in inhibitorji fuzije.

• Nukleozidni inhibitorji reverzne transkriptaze
NIRV so timidinski analogi. Vgradijo se v rastočo verigo DNA in delujejo kot zaključevalci verige.
Primera zdravil v uporabi sta zidovudin in didanozin (Videx).

Zidovudin (AZT) se po vstopu v celico fosforilira do AZT 5'-trifosfata. Po odcepitvi PPi (difosfatne) skupine, se vgradi na 3'-konec nastajajoče DNA in prekine transkripcijo, saj N3-skupina onemogoči nastanek nove fosfodiesterske vezi.

• Nenukleozidni inhibitorji reverzne transkriptaze
Delujejo kot nekompetitivni alosterični zaviralci reverzne transkriptaze in se uporabljajo v kombinaciji z drugimi zdravili.
K NNIRT spadajo med drugimi nevirapine, amprenavir in efavirenz.

Nevirapine se veže v hidrofoben žep 10A stran od aktivnega mesta reverzne transkriptaze, kar alosterično inhibira encim.

• Inhibitorji proteaz
HIV proteaze so ključne za reprodukcijo virusa.

Primer zdravila, ki spada v to skupino je saquinavir. Ta inhibira HIV-1 in HIV-2 proteaze. Veže se v aktivno mesto encima in inhibira cepitev proteinov.

• Druga zdravila: inhibitorji fuzije, inhibitorji vstopa.
Enfuvirtide je 36 aminokislin dolg peptid, ki deluje proti virusu HIV-1. Veže se na pomemben virusni protein za združitev s celico in prepreči tvorbo membranske pore za vstop kapside virusa.

==4. Imunomodulatorji==
Imunomodulatorji so protivirusna sredstva, ki vplivajo na izboljšanje odziva gostitelja na vstop virusov. Ta protivirusna zdravila ne napadajo neposredno specifičen patogen, ampak globalno spodbujajo imunski odziv gostitelja. Imunomodulatorsko funkcijo imajo interferoni (IFN). IFN so proteini, ki jih proizvajajo telesne celice kot obrambni odziv na viruse. Prav tako lahko telo zaščitijo proti bakterijam in parazitskim okužbam, zavirajo delitev celic in spodbujajo ali zavirajo njihovo diferenciacijo. Interferoni spadajo v skupino citokinov, majhnih proteinov, ki sodelujejo pri medcelični signalizaciji. So posledica patogene stimulacije na celico. Spodbujena okužena celica in tiste ob njej proizvajajo beljakovine, ki preprečijo, da bi se virusi razmnoževali znotraj teh celic. Tako se zavira nadaljnje razvijanje virusa in s tem okužba.
V virusno stimulirani celici se interferonski geni aktivirajo pod vplivom molekul RNA, ki se pojavijo kot vmesna stopnja pri razmnoževanju virusov. IFN se po sintezi izločijo iz celice in se vežejo na receptorje sosednjih celic. Vezava IFN na receptorje pa sproži proizvodnjo protivirusnih beljakovin. Oligoadenilatna polimeraza in beljakovinska kinaza P1 sta najpomembnejši proizvedeni beljakovini. Prva izdeluje kratke verige adenilatov, ki aktivirajo endoribonukleazo L. ta encim povzroča razgradnjo virusne mRNA. Druga pa fosforilira robosomske beljakovine in onemogoči translacijo virusne mRNA. Metilaze, fosfofiestraze, beljakovina Mx in glikoziltransferaze pa ovirajo glikoziliranje virusnih beljakovin. IFN tudi povečajo aktivnost beljakovine p53, ki spodbuja apoptozo okuženih celic.

==5. Rezistenca==
Rezistenca virusa pomeni, da protivirusna zdravila, ki so včasih ta virus izničila oziroma zatrla ne delujejo več. Največkrat je to posledica mutacij v virusnem genomu. Odporni virusi so problem predvsem za imunsko oslabljene ljudi, vendar pa so razvoj in prenos takih mutantov prisotni tudi pri imunokompetentnih ljudeh. Ker zdravniki vedno bolj predpisujejo protivirusna zdravila, se število mutantov veča. Mutacije lahko spremenijo virusno patogenost, prenosljivost in genetsko stabilnost. Genetsko spremenjeni virusi so najbolj pogosti pri ljudeh z oslabljenih imunskim sistemom, saj je v takem primeru virusni obrambni sistem nedotaknjen, imunosupresija pa izboljša priložnost za replikacijo virusov. Take okoliščine pa so idealne za nastanek mutantov, še posebej, če so protivirusna zdravila neprekinjeno prisotna. Okoliščine, ki dajejo prednost naravnemu izboru virusov odpornih na protivirusna zdravila so: visoka virusna replikativna obremenitev, visoke intrizična stopnja mutacije in daljše izpostavljenost protivirusnim zdravilom. Posledice takih mutantov so, da se učinki protivirusnih zdravil zmanjšajo ali celo popolnoma izzvenijo, kar povzroči nezmožnost zatiranja ali izkoreninjenja virusov v gostitelju.

==6. Viri==
*Actor, J. K., & Actor, J. K. (2012). Basic Virology. In Elsevier’s Integrated Review Immunology and Microbiology (pp. 121–128). Elsevier.
*De Clercq, E. (2004). Antiviral drugs in current clinical use. Journal pf Clinical Virology (pp.115-133)
*Springman, R., Keller, T., Molineux, I. J., and J. J. Bull. (2012). Evolution at a High Imposed Mutation Rate: Adaptation Obscures the Load in Phage T7. Genetics (pp. 221-232)

Molekularna biologija virusov

2018-05-07T19:59:39Z

Špela Deučman:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2017/18 obravnavajo področje virusov, saj v naslednjem letu ne boste imeli možnosti vpisa izbirnega predmeta Virologija. Tematika je razdeljena na 16 poglavij. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu.

Vsako temo obdelata praviloma dva študenta, nekatere teme pa omogočajo tudi razdelitev snovi na tri dele (to je označeno na prvem seznamu). Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ne več kot 1500 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili.
Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov!

Predstavitve seminarjev po datumih so razvidne iz spletne učilnice.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev sta običajno dve vprašanji od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

1. Herpesvirusi in sorodni dsDNA-virusi (lahko 3) 
2. Parvovirusi in sorodni ssDNA-virusi 
3. Reovirusi in drugi dsRNA-virusi 
4. Pikornavirusi in drugi RNA(+)-virusi 
5. Rabdovirusi in drugi RNA(-)-virusi 
6. Retrovirusi (lahko 3) 
7. Hepadnavirusi in kavlimovirusi (DNA-virusi z reverzno transkripcijo) 
8. Nitasti fagi 
9. Ikozaedrični fagi (lahko 3) 
10. Viroidi in satelitski virusi 
11. Evolucija virusov 
12. Diagnostika virusnih okužb 
13. Rastlinski virusi (lahko 3) 
14. Protivirusna zdravila (lahko 3) 
15. Protivirusna cepiva 
16. Virusi in rak 
17. Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. Herpesvirusi in sorodni dsDNA-virusi (Ines Medved, Veronika Razpotnik, Andrej Ivanovski) 
2. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Parvovirusi_in_sorodni_ssDNA-virusi Parvovirusi in sorodni ssDNA-virusi] (Milica Jankovic, Andrej Race) 
3. [[Reovirusi in drugi dsRNA-virusi]](Anže Jenko, Ana Maklin) 
4. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pikorna_virusi_in_drugi_RNA(+)_virusi Pikornavirusi in drugi RNA(+)-virusi] (Tanja Zupan, Ajda Krč) 
5. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rabdovirusi_in_drugi_RNA(-)-virusi Rabdovirusi in drugi RNA(-)-virusi] (Anja Černe, Špela Deučman) 
6. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Retrovirusi Retrovirusi] (Katja Doberšek, Špela Supej, Barbara Slapnik) 
7. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hepadnavirusi_in_kavlimovirusi_%28DNA-virusi_z_reverzno_transkripcijo%29 Hepadnavirusi in kavlimovirusi (DNA-virusi z reverzno transkripcijo)] (Nika Zaveršek, Nika Goršek) 
8. Nitasti fagi () 
9. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Ikozaedri%C4%8Dni_fagi&oldid=14142 Ikozaedrični fagi] (Urban Hribar, Luka Gregorič, Luka Fratina) 
10. [[Viroidi in satelitski virusi]] (Lea Knez, Patrik Levačić) 
11. Evolucija virusov () 
12. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Diagnostika_virusnih_oku%C5%BEb Diagnostika virusnih okužb] (Samo Purič, Peter Škrinjar) 
13. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rastlinski_virusi Rastlinski virusi] (Katja Dolenc, Martin Špendl) 
14. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Protivirusna_zdravila Protivirusna zdravila] (Tina Turel, Maja Vrabec, Polona Skrt) 
15. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Protivirusna_cepiva Protivirusna cepiva] (Daria Latysheva, Jerneja Nimac) 
16. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Virusi_in_rak Virusi in rak] (Ana Obaha, Lija Srnovršnik) 
17. Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju (Andreja Habič, Uroš Prešern)

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, ki vsebuje povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 
Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Rabdovirusi in drugi RNA(-)-virusi

2018-04-16T17:11:15Z

Špela Deučman:

==1 ssRNA NEGATIVNI VIRUSI – SPLOŠEN OPIS==
RNA negativni virusi (v nadaljevanju RNA(-)) so virusi, pri katerih ima vlogo genetskega materiala enoverižna molekula RNA negativne polarnosti. Najbolj znani predstavniki te skupine virusov so rabies virus, Marburg virus, Ebola virus, vezikularni stomatitis virus, virus ošpic, virus hepatitisa D... Njihov genom je lahko samostojna molekula RNA (nesegmentirani genom) ali skupek molekul RNA (segmentiran genom). Negativna virusna RNA je komplementarna mRNA, zato se mora najprej prepisati v pozitivno RNA, da lahko poteče translacija. Prepis negativne RNA v komplementarno mRNA opravlja RNA polimeraza.
==1.1 RABDOVIRUSI==
Rabdovirusi (družina Rhadboviridae) so negativnoverižni RNA virusi z ovojnico in pripadajo redu Mononegavirales, ki vključujejo poleg družine Rhabdoviridae tudi družine Bornaviridae, Filoviridae in Paramyxoviridae. RNA ima na 3'- koncu prosto hidroksilno skupino, na 5'- koncu pa trifosfat. Vsi rabdovirusi imajo 5 strukturnih genov v zaporedju 3'-N-P-M-G-L-5'. Vsaka od teh sekvenc je ločena od sosednjih sekvenc z kratko, močno zvito regijo, ki ima pomembno vlogo pri transkripciji.
==1.2 RABDOVIRUSI IN RASTLINE==
Poznamo 2 roda rastlinskih rabdovirusov (nukleorabdovirusi in citorabdovirusi). Celico okužijo tako, da tvorijo velike vezikle v jedrih celic. V nekaterih primerih se virusi nalagajo v perinuklearnem prostoru (obdajajo jedro). Virus se mora premikati iz celice v celico preko plazmodezmatalnih kanalov v floemsko celico. Ker plazmodezme navadno preprečujejo premikanje makromolekul, se virusi premikajo k sosednjim celicam preko mehanizmov, ki zvišujejo prepustnostno kapaciteto plazmodezem.
==2 STRUKTURA==
Za raziskovanje vijačnih živalskih in človeških virusov je bilo veliko zanimanja, saj ti vključujejo pomembne človeške patogene. Virusni genom asociira z nukleoproteinom N, virusno polimerazo L (od RNA odvisna polimeraza RNA) in fosfoproteinom P ter tako tvori RNP (ribonukleoproteinski kompleks). Ta kompleks je obdan s proteinom M. Nukleokapsida je ovita z lipidnim dvoslojem, ki vsebuje glikoprotein G.
Glikoprotein G je membranski glikoprotein tipa I. Za oba VSV in RV je bilo dokazano, da G oblikuje trimere na površini lipidnega dvosloja. Dokazano je, da lahko G obstaja v vsaj treh različnih konformacijskih stanjih, ki so odvisne od pH ter so reverzibilne. Polipeptidna veriga G se zvije v štiri različne domene. Glavna antigenska mesta se nahajajo na domenah I in III.
==2.1 VIRUSNI PROTEINI==
Protein M je glavna strukturna komponenta, ki daje virusu trdnost in stabilizira njegovo zgradbo. Nukleoprotein N ščiti virusno RNA pred degradacijo z encimom RNAzo. Polimeraza L je tesno povezana z nukleoproteinom N in molekulo RNA ter deluje kot RNA-transkriptaza za tvorbo mRNA molekul. [3] Fosfoprotein P deluje kot kofaktor za virusno polimerazo.
==3 VSTOP V CELICO==
Različne družine teh virusov napadejo različne gostitelje. Virus se mora najprej zliti s plazmalemo. Zlivanje je odvisno od proteinov na virusni ovojnici in od receptorjev na gostiteljski celici. Proteini na virusni ovojnici prepoznajo receptorje na gostitelju, kar sproži endocitozo virusa. Vezikli pripeljejo virione do endosomov, v katerih zapakirani virusi potujejo po citosolu. S pomočjo zlitvenega peptide se membrani endosoma in vezikla zlijeta, tvori se fuzijska pora, virus se sprosti v citosol.
==3.1 VIRUS GRIPE==
Protein hemagglutinin (HA) prepozna terminalno α-sialično kislino (receptorska molekula). Virusi gripe vstopajo s klatrinsko-posredovano endocitozo ali z vezikli, ki so podobni fagocitom. Ti vezikli pripeljejo virione do endosomov. V endosomu zapakirani virus potuje po citosolu in blizu jedra se razmere v endosomu zakisajo, kar sproži konformacijske spremembe v HA; tako se vstavi zlitveni peptid v membrano gostitelja. Tvori se fuzijska pora, ki omogoča izpust genomskih segmentov virusa gripe.
==3.2 RABDOVIRUSI==
Adsorpcija rabdovirusov na gostitelja je posredovana z vezavo G proteinov na receptorje na celični površini. Glikoprotein G tvori jamico, ki je pravokotna na virusno ovojnico. Virioni pridejo v endosome s klatrini posredovano endocitozo ali v obliki makropinosomov. Regijo, ki je ključna za olajšano zlitje, imenujemo p2-podoben peptid. Endosomi ob pomoči mikrotubulov transportirajo virione, sledi od pH odvisno zlitje veziklov in tako nastanejo iz zgodnjega endosoma multivezikularni endosomi. Nato se virus zaradi pH ponovno zlije z membrano in odcepi iz endosomalnega vezikla. Sledi »back-fusion« veziklov (zopet zlivanje membran; tokrat se membrana vezikla z virusov zlije z mejo endosomalne membrane).
Ko je RNP izpuščen, se genom RNA začne prepisovati z virusno transkriptazo. Na koncu sta transkripcija in replikacija inhibirani, RNP postane intenzivno kondenzirana in transportirana do plazmaleme. Tako se začne odcepljanje, ki zahteva specifične interakcije med ovojnico, ki vsebuje G protein, matriksom in nukleokapsido.
==4 REPLIKACIJA, TRANSKRIPCIJA, TRANSLACIJA==
==4.1 REPLIKACIJA==
Replikacija se začne s prepisovanjem mRNA iz genomske RNA s pomočjo RNA polimeraze. Podvajanje je asimetrično in običajno se proizvede 5- do 10-kratni molski presežek genomske RNA kot antigenomske RNA. Med sintezo leader RNA se zgodi regulativna odločitev, ki narekuje, ali bo RNA polimeraza zaključila transkripcijo leader RNA in začela transkripcijo mRNA ali pa bo začela replikacijo in prezrla vse stop signale in namesto tega sintetiziral celotno antigenomsko RNA (pozitivne polarnosti). Za začetek replikacije je potrebna stalno sinteza proteinov, da se zagotovi vir topnih N proteinov, potrebnih za inkapsidacija nastajajoče RNA. To je pripeljalo do ugotovitve, da je aktivnost RNA polimeraze regulirana z razpoložljivostjo proteina N.
==4.2 TRANSKRIPCIJA==
Pri transkripciji genoma, RNA polimeraza prepiše 5 subgenomskih mRNA. Genom vsebuje le en promotor, ki se nahaja na 3' koncu. Na poti naleti na start-stop signale na mejnih območjih med (petimi) geni. Stop-start transkripcija omogoči nastanek večje količine mRNA, ki kodira strukturne proteine oz. RNA, ki kodira gene bolj na začetku 3' konca. Gradient poteka v smeri N > P > M > G > L. Prepisana mRNA ima kapico na 5' koncu in je poliadenilirana na 3' koncu in so večinma monocistronske.
==4.3 TRANSLACIJA==
mRNA se prevaja na prostih ribosomih v citoplazmi gostiteljske celice. mRNA, ki kodira glikoprotein G pa se prevaja na ribosomih na endoplazemskem retikulumu in kasneje sledi glikozilacija (razvejani oligosaharidi). Celični šaperoni sodelujejo pri transportu M proteina na celično membrano in transportu glikoproteina G v Golgijev aparat ter na celično membrano.
==5 PREDSTAVNIKI ssRNA NEGATIVNIH VIRUSOV==
==5.1 VIRUS OŠPIC==
Virus ošpic je velik ssRNA virus, ki spada v družino Paramyxovirus in rod Morbillivirus. Ta vrsta virusa je sestavljena iz lipoproteinske ovojnice in helikalne nukleokapside. Ključni so hemagglutinin (pritrditev virusa na membrano celice), fuzijski protein (prepušča fuzijo virusov s celično površino) ter M-protein (odcepljanje virusnih delcev).
Virus vstopi v gostitelja preko respiratornih poti in vpliva na respiratorni epitelij in na imunske celice. Veže se na receptorje SLAM (ki jih izražajo imunske celice), CD46 (ki jih izražajo epitelijske celice) in domnevno tudi na receptorje, ki prenašajo okužbo, če ni receptorjev SLAM in CD46.
==5.2 VIRUS EBOLA==
Ebola virus je z ovojnico obdan virus. RNP kompleksi virusa Ebole so sestavljeni iz genomske RNA molekule in štirih z virionom združenih strukturnih proteinov NP (nukleoprotein), VP35 (od RNA odvisen RNA polimerazni kofaktor), VP30 (transkripcijski aktivator) in L (od RNA-odvisna RNA polimeraza).
Virus ebole vstopi v gostiteljsko celico z makropinocitozo ali s klatrini-posredovano endocitozo. Za vstop v celico so potrebni holesterolni transporter ter virusni glikoproteini. Receptorji na celični površini vežejo virusne delce preko interakcij z virusnim fosfatidilserinom ali virusnimi glikoprotein glikani. Virus vstopi v gostitelja preko zlitja plazmaleme z virusom. Proteaze razgradijo virusne glikoproteine med prenosom skozi endosom, pri čemer izpostavijo za receptor vezavno domeno. Ta domena interagira z NPC1 v poznem endosomu ali lizosomu. Z vezavo glikoproteina se sproži fuzijska zanka, virusna in gostiteljska membrana se zlijeta, sledi sprostitev virusnega nukleoproteina v citoplazmo in začetek virusne replikacije.
==5.3 VIRUS STEKLINE==
Virus stekline ima cilindrično morfologijo in sodi v rod Lyssavirus iz družine Rhabdoviridae. Virusni genom predstavlja enoverižna RNA negativne polarnosti. Genetska informacija je močno pakirana in zvita z N in M. Geni kodirajo nukleoprotein (N), fosfoprotein (P), matriksni protein (M), glikoprotein (G) in virusno RNA polimerazo (L).
Lipidi v ovojnici, izvirajo izključno iz membrane gostiteljske celice.
Način replikacije, transkripcije in translacije je enak kot pri večini ssRNA virusov negativne polarnosti.
Zaporedje dogodkov v življenjskem ciklusu RABV lahko razdelimo na tri faze. Prva ali zgodnja faza vključuje vezavo virusov na receptorje (npr. acetilholinski receptorji v motorični ploščici, N-CAM in nevtropinski receptor) in vstop v celico. Druga ali srednja faza vključuje transkripcijo in replikacijo, tretja ali pozna faza pa vključuje sestavljanje virusa in sprostitev iz okužene celice.
Postopek sestavljanja virusa se začne v srednji fazi življenjskega cikla z inkapsidacijo RNA. Sestava RNP in virionov se nadaljuje v pozno fazo življenjskega cikla, dokler celice ostanejo metabolično aktivne. V zrelih virusih, ki se ločijo od ceične membrane se M nahaja med lipidnim dvoslojem in vijačno zvitim RNP. V zadnji fazi novi RABV pridobijo lipidni dvosloj in se odcepijo od celične membrane.
==5.4 VIRUS VEZIKULARNEGA STOMATITISA==
Virus vezikularnega stomatitisa (VSV) ima cilindrično morfologijo in sodi v rod Vezikulovirusov iz družine Rhabdoviridae. Genom virusa, tako kot pri vseh rabdovirusih, predstavlja neprekinjena, enoverižna RNA negativne polarnosti. V večjih količinah so prisotni glikoprotein (G), ki je pripet na fosfolipidni dvosloj, matriksni protein (M), ki prekriva notranjo površino dvosloja, in nukleoprotein (N).
Način replikacije, transkripcije in translacije je enak kot pri večini ssRNA virusov negativne polarnosti.
Okužba z VSV se začne z vezavo virusnega G proteina na receptorje na plazemski membrani in vstopa v celico z receptorsko posredovano endocitozo. Življenjski cikel se nato nadaljuje s transkripcijo in translacijo virusnih mRNA.
V zadnji fazi pride do odcepljanja novo nastalih virusov iz celice. Pri tem procesu mora prit do specifičnih interakcij med tremi glavnimi komponentami virusa: lipidnim dvoslojem, ki vsebuje G protein, matriksnim proteinom in RNP. Do brstenja lahko pride le skozi regije plazemske membrane, ki so bogate z G proteinom.
==6 GENETSKI INŽENIRING RNA(-) VIRUSOV IN RABDOVIRUSOV==
Z metodami imenovanimi reverzni genetski sistemi je mogoče genetsko modificirati rabdoviruse. Slednje so omogočile uporabo virusov v biomedicinske namene kot so izdelava cepiv, genska terapija in onkolitska viroterapija. Način izražanja genov rabdovirusov, visoka genetska stabilnost in nagnjenost k toleranci sprememb v ovojnici virusa so lastnosti, zaradi katerih so rabdovirusi tako zanimivi kot vektorji.
==VIRI==
*F. Weber, V. Wagner, S. B. Rasmussen, R. Hartmann, S. R. Paludan. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of virology, 2006, 80, 10, 5059-5064.
*B. He, Overview of negative strand RNA viruses. USA: World scientific, 2011.
*K. K. Conzelmann. Nonsegmented negative-strand RNA viruses: genetics and manipulation of viral genomes. Annual review of genetics, 1998, 32, 132-162.
*M. Marsh, A. P. Matthews. Entry of animal viruses into cells. Reviews in medical virology, 1993, 3, 173-185.
*M. Luo. Influenza virus entry. Viral molecular machines, 2011, 726, 201-221.
*Amidiouni, H., Rhaffouli, H. E. Ebola virus and other Filoviruses: an overview. Journal of coastal life medicine, 2015, 9, 18-26
*P. Ascenzi, A. Bocedi, J. Heptonstall, M. R. Capobianchi, A. Di Caro, E. M. Martino Bolognesi, G. Ippolito. Ebolavirus and Marburgvirus: insight the Filoviridae family. Molecular aspects of medicine, 2008, 29, 151-185.
*S. M. Tank, W. Maury. Ebola virus entry: a curious and complex series of events. Plos pathogens, 2015, 11,4.
*S. Delpeut, R. S. Noyce, R. Siu, C. D. Richardson. Host factors and measles virus replication. Science direct, 2012, 2, 767-777.
*H. Y. Naim. Measles virus. Human vaccines & immunotherapeutics, 2015, 11, 1, 21-26.
*J. R. Stalkup, A review of measles virus. Dermatologic clinics, 2002, 20, 2, 209-215.
*O. Jackson, R. G. Dietzgen, M. M. Goodin, J. N. Bragg and M. Deng. Biology of plant rhabdoviruses. Annual reviews, 2005, 43, 623-660.
*K.K. Conzelmann. Nonsegmented negative-strand RNA viruses – genetics and manipulation of viral genomes. Annual reviews genetics, 1998, 32, 123-162.
*Regan, A. D. And Whittaker, G., R. Entry of rhabdoviruses into animal cells. Advances in experimental medicine and biology, 2013, 790, 166-177.
*U. B. R. Balasuriya et al. Fenner's veterinary virology (fifth edition). USA: Academic press, 2017.
*Kuzmin, L., V., Novella, L., S., Dietzgen, R., G., Padhi, A. And Kupprecht, C., E. The rhabdoviruses: biodiversity, phylogenetics and evolution. Infect genetics evolution, 2009, 4, 541-553.
*Albertini and Y. Gaudin. Negative strand RNA virus. USA: World scientific publishing, 2011.
*W. H. Wunner, K. K. Conzelmann. Rabies virus. USA: Academic press, 2013.
*Z. F. Fu. The world of rhabdoviruses. USA: Springer science & business media, 2006.
*Strauss, E., Strauss, J., Robinson, W., Palmer, E., Marion, P. and Estes, M. Replication strategies of the single stranded RNA viruses of Eukaryotes. Heidelberg: Springer-Verlag, 1983.

*Ludwig, A. and Hengel, H. (2009). Vesicular Stomatitis Virus Infection.

*Maclachlan, N., Dubovi, E. and Fenner, F. (2017). Fenner's veterinary virology. London: Elsevier.

*U. B. R. Balasuriya et al. Fenner's veterinary virology (fifth edition). USA: Academic press, 2017.
*R. G. Dietzgen, I. V. Kuzmin. Rhabdoviruses: Molecular Taxonomy, Evolution, Genomics, Ecology, Host-Vector Interactions, Cytopathology and Control Norfolk: Caister Academic Press, 2012.
*J. C. Brown, W. W. Newcomb, G. W. Wertz. Helical virus structure: tje case of the rhabdovirus bullet. Viruses, 2010, 2, 4, 995-1001.
*Albertini, Y. Gaudin. Negative strand RNA virus. USA: World scientific, 2011.
*U. B. R. Balasuriya et al. Fenner's veterinary virology (fifth edition). USA: Academic press, 2017. (slika stran 31)
*S. P. Whelan, J. N. Barr, Wertz G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current topics in microbiology and immunology, 2004, 283, 61-119.
*M. Lafon. Rabies virus receptors. Journal of neurovirology, 2005, 11, 82-87.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Talk:Rabdovirusi in drugi RNA(-)-virusi

2018-04-16T17:10:30Z

Špela Deučman:

Anja Černe: ssRNA NEGATIVNI VIRUSI – SPLOŠEN OPIS, RABDOVIRUSI - SPLOŠEN OPIS, VIRUSNI PROTEINI, RABDOVIRUSI IN RASTLINE, VSTOP V CELICO (virus gripe, RNA(-) virusi in rabdovirusi), VIRUS OŠPIC, VIRUS EBOLA

Špela Deučman: STRUKTURA RNA(-) VIRUSA IN RABDOVIRUSA, VIRUSNI PROTEINI, REPLIKACIJA, TRANSKRIPCIJA in TRANSLACIJA RNA(-) VIRUSOV IN RABDOVIRUSOV, VIRUS STEKLINE, VIRUS VEZIKULARNEGA STOMATITISA, GENETSKI INŽENIRING RNA(-) VIRUSOV IN RABDOVIRUSOV

Talk:Rabdovirusi in drugi RNA(-)-virusi

2018-04-16T17:02:00Z

Špela Deučman: New page: Anja Černe: Špela Deučman:

Anja Černe:

Špela Deučman:

Rabdovirusi in drugi RNA(-)-virusi

2018-04-16T15:55:14Z

Špela Deučman:

==1 SsRNA NEGATIVNI VIRUSI – SPLOŠEN OPIS==
RNA negativni virusi (v nadaljevanju RNA(-)) so virusi, pri katerih ima vlogo genetskega materiala enoverižna molekula RNA negativne polarnosti. Najbolj znani predstavniki te skupine virusov so rabies virus, Marburg virus, Ebola virus, vezikularni stomatitis virus, virus ošpic, virus hepatitisa D... Njihov genom je lahko samostojna molekula RNA (nesegmentirani genom) ali skupek molekul RNA (segmentiran genom). Negativna virusna RNA je komplementarna mRNA, zato se mora najprej prepisati v pozitivno RNA, da lahko poteče translacija. Prepis negativne RNA v komplementarno mRNA opravlja RNA polimeraza.
==1.1 RABDOVIRUSI==
Rabdovirusi (družina Rhadboviridae) so negativnoverižni RNA virusi z ovojnico in pripadajo redu Mononegavirales, ki vključujejo poleg družine Rhabdoviridae tudi družine Bornaviridae, Filoviridae in Paramyxoviridae. RNA ima na 3'- koncu prosto hidroksilno skupino, na 5'- koncu pa trifosfat. Vsi rabdovirusi imajo 5 strukturnih genov v zaporedju 3'-N-P-M-G-L-5'. Vsaka od teh sekvenc je ločena od sosednjih sekvenc z kratko, močno zvito regijo, ki ima pomembno vlogo pri transkripciji.
==1.2 RABDOVIRUSI IN RASTLINE==
Poznamo 2 roda rastlinskih rabdovirusov (nukleorabdovirusi in citorabdovirusi). Celico okužijo tako, da tvorijo velike vezikle v jedrih celic. V nekaterih primerih se virusi nalagajo v perinuklearnem prostoru (obdajajo jedro). Virus se mora premikati iz celice v celico preko plazmodezmatalnih kanalov v floemsko celico. Ker plazmodezme navadno preprečujejo premikanje makromolekul, se virusi premikajo k sosednjim celicam preko mehanizmov, ki zvišujejo prepustnostno kapaciteto plazmodezem.
==2 STRUKTURA==
Za raziskovanje vijačnih živalskih in človeških virusov je bilo veliko zanimanja, saj ti vključujejo pomembne človeške patogene. Virusni genom asociira z nukleoproteinom N, virusno polimerazo L (od RNA odvisna polimeraza RNA) in fosfoproteinom P ter tako tvori RNP (ribonukleoproteinski kompleks). Ta kompleks je obdan s proteinom M. Nukleokapsida je ovita z lipidnim dvoslojem, ki vsebuje glikoprotein G.
Glikoprotein G je membranski glikoprotein tipa I. Za oba VSV in RV je bilo dokazano, da G oblikuje trimere na površini lipidnega dvosloja. Dokazano je, da lahko G obstaja v vsaj treh različnih konformacijskih stanjih, ki so odvisne od pH ter so reverzibilne. Polipeptidna veriga G se zvije v štiri različne domene. Glavna antigenska mesta se nahajajo na domenah I in III.
==2.1 VIRUSNI PROTEINI==
Protein M je glavna strukturna komponenta, ki daje virusu trdnost in stabilizira njegovo zgradbo. Nukleoprotein N ščiti virusno RNA pred degradacijo z encimom RNAzo. Polimeraza L je tesno povezana z nukleoproteinom N in molekulo RNA ter deluje kot RNA-transkriptaza za tvorbo mRNA molekul. [3] Fosfoprotein P deluje kot kofaktor za virusno polimerazo.
==3 VSTOP V CELICO==
Različne družine teh virusov napadejo različne gostitelje. Virus se mora najprej zliti s plazmalemo. Zlivanje je odvisno od proteinov na virusni ovojnici in od receptorjev na gostiteljski celici. Proteini na virusni ovojnici prepoznajo receptorje na gostitelju, kar sproži endocitozo virusa. Vezikli pripeljejo virione do endosomov, v katerih zapakirani virusi potujejo po citosolu. S pomočjo zlitvenega peptide se membrani endosoma in vezikla zlijeta, tvori se fuzijska pora, virus se sprosti v citosol.
==3.1 VIRUS GRIPE==
Protein hemagglutinin (HA) prepozna terminalno α-sialično kislino (receptorska molekula). Virusi gripe vstopajo s klatrinsko-posredovano endocitozo ali z vezikli, ki so podobni fagocitom. Ti vezikli pripeljejo virione do endosomov. V endosomu zapakirani virus potuje po citosolu in blizu jedra se razmere v endosomu zakisajo, kar sproži konformacijske spremembe v HA; tako se vstavi zlitveni peptid v membrano gostitelja. Tvori se fuzijska pora, ki omogoča izpust genomskih segmentov virusa gripe.
==3.2 RABDOVIRUSI==
Adsorpcija rabdovirusov na gostitelja je posredovana z vezavo G proteinov na receptorje na celični površini. Glikoprotein G tvori jamico, ki je pravokotna na virusno ovojnico. Virioni pridejo v endosome s klatrini posredovano endocitozo ali v obliki makropinosomov. Regijo, ki je ključna za olajšano zlitje, imenujemo p2-podoben peptid. Endosomi ob pomoči mikrotubulov transportirajo virione, sledi od pH odvisno zlitje veziklov in tako nastanejo iz zgodnjega endosoma multivezikularni endosomi. Nato se virus zaradi pH ponovno zlije z membrano in odcepi iz endosomalnega vezikla. Sledi »back-fusion« veziklov (zopet zlivanje membran; tokrat se membrana vezikla z virusov zlije z mejo endosomalne membrane).
Ko je RNP izpuščen, se genom RNA začne prepisovati z virusno transkriptazo. Na koncu sta transkripcija in replikacija inhibirani, RNP postane intenzivno kondenzirana in transportirana do plazmaleme. Tako se začne odcepljanje, ki zahteva specifične interakcije med ovojnico, ki vsebuje G protein, matriksom in nukleokapsido.
==4 REPLIKACIJA, TRANSKRIPCIJA, TRANSLACIJA==
==4.1 REPLIKACIJA==
Replikacija se začne s prepisovanjem mRNA iz genomske RNA s pomočjo RNA polimeraze. Podvajanje je asimetrično in običajno se proizvede 5- do 10-kratni molski presežek genomske RNA kot antigenomske RNA. Med sintezo leader RNA se zgodi regulativna odločitev, ki narekuje, ali bo RNA polimeraza zaključila transkripcijo leader RNA in začela transkripcijo mRNA ali pa bo začela replikacijo in prezrla vse stop signale in namesto tega sintetiziral celotno antigenomsko RNA (pozitivne polarnosti). Za začetek replikacije je potrebna stalno sinteza proteinov, da se zagotovi vir topnih N proteinov, potrebnih za inkapsidacija nastajajoče RNA. To je pripeljalo do ugotovitve, da je aktivnost RNA polimeraze regulirana z razpoložljivostjo proteina N.
==4.2 TRANSKRIPCIJA==
Pri transkripciji genoma, RNA polimeraza prepiše 5 subgenomskih mRNA. Genom vsebuje le en promotor, ki se nahaja na 3' koncu. Na poti naleti na start-stop signale na mejnih območjih med (petimi) geni. Stop-start transkripcija omogoči nastanek večje količine mRNA, ki kodira strukturne proteine oz. RNA, ki kodira gene bolj na začetku 3' konca. Gradient poteka v smeri N > P > M > G > L. Prepisana mRNA ima kapico na 5' koncu in je poliadenilirana na 3' koncu in so večinma monocistronske.
==4.3 TRANSLACIJA==
mRNA se prevaja na prostih ribosomih v citoplazmi gostiteljske celice. mRNA, ki kodira glikoprotein G pa se prevaja na ribosomih na endoplazemskem retikulumu in kasneje sledi glikozilacija (razvejani oligosaharidi). Celični šaperoni sodelujejo pri transportu M proteina na celično membrano in transportu glikoproteina G v Golgijev aparat ter na celično membrano.
==5 PREDSTAVNIKI ssRNA NEGATIVNIH VIRUSOV==
==5.1 VIRUS OŠPIC==
Virus ošpic je velik ssRNA virus, ki spada v družino Paramyxovirus in rod Morbillivirus. Ta vrsta virusa je sestavljena iz lipoproteinske ovojnice in helikalne nukleokapside. Ključni so hemagglutinin (pritrditev virusa na membrano celice), fuzijski protein (prepušča fuzijo virusov s celično površino) ter M-protein (odcepljanje virusnih delcev).
Virus vstopi v gostitelja preko respiratornih poti in vpliva na respiratorni epitelij in na imunske celice. Veže se na receptorje SLAM (ki jih izražajo imunske celice), CD46 (ki jih izražajo epitelijske celice) in domnevno tudi na receptorje, ki prenašajo okužbo, če ni receptorjev SLAM in CD46.
==5.2 VIRUS EBOLA==
Ebola virus je z ovojnico obdan virus. RNP kompleksi virusa Ebole so sestavljeni iz genomske RNA molekule in štirih z virionom združenih strukturnih proteinov NP (nukleoprotein), VP35 (od RNA odvisen RNA polimerazni kofaktor), VP30 (transkripcijski aktivator) in L (od RNA-odvisna RNA polimeraza).
Virus ebole vstopi v gostiteljsko celico z makropinocitozo ali s klatrini-posredovano endocitozo. Za vstop v celico so potrebni holesterolni transporter ter virusni glikoproteini. Receptorji na celični površini vežejo virusne delce preko interakcij z virusnim fosfatidilserinom ali virusnimi glikoprotein glikani. Virus vstopi v gostitelja preko zlitja plazmaleme z virusom. Proteaze razgradijo virusne glikoproteine med prenosom skozi endosom, pri čemer izpostavijo za receptor vezavno domeno. Ta domena interagira z NPC1 v poznem endosomu ali lizosomu. Z vezavo glikoproteina se sproži fuzijska zanka, virusna in gostiteljska membrana se zlijeta, sledi sprostitev virusnega nukleoproteina v citoplazmo in začetek virusne replikacije.
==5.3 VIRUS STEKLINE==
Virus stekline ima cilindrično morfologijo in sodi v rod Lyssavirus iz družine Rhabdoviridae. Virusni genom predstavlja enoverižna RNA negativne polarnosti. Genetska informacija je močno pakirana in zvita z N in M. Geni kodirajo nukleoprotein (N), fosfoprotein (P), matriksni protein (M), glikoprotein (G) in virusno RNA polimerazo (L).
Lipidi v ovojnici, izvirajo izključno iz membrane gostiteljske celice.
Način replikacije, transkripcije in translacije je enak kot pri večini ssRNA virusov negativne polarnosti.
Zaporedje dogodkov v življenjskem ciklusu RABV lahko razdelimo na tri faze. Prva ali zgodnja faza vključuje vezavo virusov na receptorje (npr. acetilholinski receptorji v motorični ploščici, N-CAM in nevtropinski receptor) in vstop v celico. Druga ali srednja faza vključuje transkripcijo in replikacijo, tretja ali pozna faza pa vključuje sestavljanje virusa in sprostitev iz okužene celice.
Postopek sestavljanja virusa se začne v srednji fazi življenjskega cikla z inkapsidacijo RNA. Sestava RNP in virionov se nadaljuje v pozno fazo življenjskega cikla, dokler celice ostanejo metabolično aktivne. V zrelih virusih, ki se ločijo od ceične membrane se M nahaja med lipidnim dvoslojem in vijačno zvitim RNP. V zadnji fazi novi RABV pridobijo lipidni dvosloj in se odcepijo od celične membrane.
==5.4 VIRUS VEZIKULARNEGA STOMATITISA==
Virus vezikularnega stomatitisa (VSV) ima cilindrično morfologijo in sodi v rod Vezikulovirusov iz družine Rhabdoviridae. Genom virusa, tako kot pri vseh rabdovirusih, predstavlja neprekinjena, enoverižna RNA negativne polarnosti. V večjih količinah so prisotni glikoprotein (G), ki je pripet na fosfolipidni dvosloj, matriksni protein (M), ki prekriva notranjo površino dvosloja, in nukleoprotein (N).
Način replikacije, transkripcije in translacije je enak kot pri večini ssRNA virusov negativne polarnosti.
Okužba z VSV se začne z vezavo virusnega G proteina na receptorje na plazemski membrani in vstopa v celico z receptorsko posredovano endocitozo. Življenjski cikel se nato nadaljuje s transkripcijo in translacijo virusnih mRNA.
V zadnji fazi pride do odcepljanja novo nastalih virusov iz celice. Pri tem procesu mora prit do specifičnih interakcij med tremi glavnimi komponentami virusa: lipidnim dvoslojem, ki vsebuje G protein, matriksnim proteinom in RNP. Do brstenja lahko pride le skozi regije plazemske membrane, ki so bogate z G proteinom.
==6 GENETSKI INŽENIRING RNA(-) VIRUSOV IN RABDOVIRUSOV==
Z metodami imenovanimi reverzni genetski sistemi je mogoče genetsko modificirati rabdoviruse. Slednje so omogočile uporabo virusov v biomedicinske namene kot so izdelava cepiv, genska terapija in onkolitska viroterapija. Način izražanja genov rabdovirusov, visoka genetska stabilnost in nagnjenost k toleranci sprememb v ovojnici virusa so lastnosti, zaradi katerih so rabdovirusi tako zanimivi kot vektorji.

Molekularna biologija virusov

2018-03-15T20:25:49Z

Špela Deučman:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2017/18 obravnavajo področje virusov, saj v naslednjem letu ne boste imeli možnosti vpisa izbirnega predmeta Virologija. Tematika je razdeljena na 16 poglavij. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu.

Vsako temo obdelata praviloma dva študenta, nekatere teme pa omogočajo tudi razdelitev snovi na tri dele (to je označeno na prvem seznamu). Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ne več kot 1500 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili.
Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov!

Predstavitve seminarjev po datumih so razvidne iz spletne učilnice.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev sta običajno dve vprašanji od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

1. Herpesvirusi in sorodni dsDNA-virusi (lahko 3) 
2. Parvovirusi in sorodni ssDNA-virusi 
3. Reovirusi in drugi dsRNA-virusi 
4. Pikornavirusi in drugi RNA(+)-virusi 
5. Rabdovirusi in drugi RNA(-)-virusi 
6. Retrovirusi (lahko 3) 
7. Hepadnavirusi in kavlimovirusi (DNA-virusi z reverzno transkripcijo) 
8. Nitasti fagi 
9. Ikozaedrični fagi (lahko 3) 
10. Viroidi in satelitski virusi 
11. Evolucija virusov 
12. Virusi in rak 
13. Rastlinski virusi (lahko 3) 
14. Protivirusna zdravila (lahko 3) 
15. Protivirusna cepiva 
16. Diagnostika virusnih okužb 

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. Herpesvirusi in sorodni dsDNA-virusi (Ines Medved, Veronika Razpotnik) 
2. Parvovirusi in sorodni ssDNA-virusi (Milica Jankovic) 
3. Reovirusi in drugi dsRNA-virusi (Anže Jenko, Ana Maklin) 
4. Pikornavirusi in drugi RNA(+)-virusi 
5. Rabdovirusi in drugi RNA(-)-virusi (Anja Černe, Špela Deučman) 
6. Retrovirusi (Katja Doberšek, Špela Supej, Barbara Slapnik) 
7. Hepadnavirusi in kavlimovirusi (DNA-virusi z reverzno transkripcijo) (Nika Zaveršek, Nika Goršek) 
8. Nitasti fagi 
9. Ikozaedrični fagi 
10. Viroidi in satelitski virusi(Ivanovski) 
11. Evolucija virusov 
12. Virusi in rak (Ana Obaha, Lija Srnovršnik) 
13. Rastlinski virusi (Katja Dolenc, Martin Špendl) 
14. Protivirusna zdravila (Tina Turel, Maja Vrabec) 
15. Protivirusna cepiva (Daria Latysheva, Jerneja Nimac) 
16. Diagnostika virusnih okužb 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, ki vsebuje povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]
Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

BIO2 Povzetki seminarjev 2017

2017-12-11T17:21:43Z

Špela Deučman: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2017/2018 */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2017/2018 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2017 stran]

=== Luka Gregorič: Pozitivne vloge negativnih regulatorjev ===

Pri preučevanju regulacije sistemov v celici, so negativni regulatorji bolj temen, neraziskan del celotnega procesa, čeprav enako pomemben. Brez njih se lahko v celici začenja nenadzorovano deljenje in posledično rakavost tkiva, ali pa se nam poveča možnost hujšega obolenja. V živčnem sistemu lahko brez GPR-jev poteče prekomerna mielinizacija aksonov, ki pomenijo veliko zmanjšanje vseh kognitivnih sposobnosti organizma in posledično tudi manjšo zmožnost prilagajanja. V mišičnem tkivu, pa lahko pomanjkanje ali slabše delovanje negativnih regulatorjev naredi tkiva manj eksplozivna in povzroči hitrejše staranje, zaradi razlik med tkivi tipa 1 in tipa 2. V najhujšem primeru pa nam pomanjkanje negativnih regulatorjev celo povzroči mišično atofijo, medtem ko nam bi boljše poznavanje prav njih lahko omogočilo, da obdržimo mlade mišice čez celo življenje. Hitrost celotnega delovanja negativnih regulatorjev pa ni odvisna od moči signala, saj signal v zelo majhnem času lahko spravijo na prvotno raven, ne glede na to, kdaj se je ta signal začel. Visoka odzivnost signalov pa tudi pomaga telesu, ko se rabi hitro odzvati na različne dražljaje. Najhitrejše to naredi tako, da je signal vedno aktiviran in se izklopi le ob primeru, da se je potrebno hitro odzvati.

=== Ines Medved: Vohalni receptorji v epidermisu ===
Primarna vloga vohalnih receptorjev je zaznava vonja, ki je zelo pomembna. Poleg zaznave vonja pa imajo receptorji za vonj tudi druge funkcije. Ti receptorji se nahajajo v tkivih, ki niso povezana z vohalno nalogo. Nahajajo se skoraj po celotnem telesu npr. v ledvicah, možganih, srcu, koži, v krvi … V epidermisu so našli dva takšna receptorja, in sicer receptorja OR2AT4 in OR51E2. Kljub podobnemu mehanizmu delovanja se po funkciji zelo razlikujeta. OR2AT4 ob stimulaciji z agonistom poveča celično proliferacijo, vpliva na migracijo celic in sodeluje pri reepitalizaciji v procesu celjenja ran. Ugotovili so, da sodeluje tudi pri zaprtju rane. Za razliko od OR2AT4 receptor OR51E2 zmanjša celično proliferacijo, sodeluje pa v melanogenezi, dendritogenezi in pri celični diferenciaciji. Vohalni receptor OR51E2 ima vlogo tudi v rakavih celicah prostate. Receptorja sta zelo specifična. Vohalni receptor OR2AT4 stimulira le sandanol in brahmanol, OR51E2 pa β-ionon. Za oba receptorja so našli tudi antagoniste, ki blokirajo Ca2+ signal. Za OR2AT4 so odkrili dva antagonista oksifenilon in fenirat, za receptor OR51E2 pa α-ionon. Kljub podobni lokaciji in mehanizmom se receptorja zelo razlikujeta. Medtem ko bi se OR2AT4 lahko uporabljal pri zdravljenju oziroma celjenju rane, bi bil lahko receptor OR51E2 potencialni pokazatelj za rakave celice.

===Daria Latysheva: The role of intrinsically disordered proteins in signalling pathways and regulation ===

Intrinsically disordered proteins (IDPs) are proteins, which do not have a defined three – dimensional structure, yet are completely functional. Found mostly in eukaryotic cells, they play an important role in biosignalling and regulation of a cell. Undergoing coupled folding and binding, IDPs’ recognition elements are cable of taking over the structures of different targets. Since IDPs have multiple interaction motifs, they often serve as signalling centres, thus contributing to the dynamic assembly of complex molecules and varied signalling pathways. Undergoing post – translational modifications, these proteins also add complexity to the regulatory networks and can change the original output of the crosswalk. IDPs are also an important component of higher - order signalling assemblies, enabling the formation of reversible complexes. Being an attractive field of the research, IDPs were not yet studied completely and there is still much to be understood about the structure, functions and the location of IDPs in the cell. Experimental and computational techniques are being developed to identify and characterise disordered regions in proteins in order to emphasize the prevalent role of IDPs in cellular signalling and regulation.

===Polona Skrt: Mehanizem zaznavanja okusa maščobe ===

Okus je pomembna zaznavna zmožnost, saj nas usmerja pri uživanju hranilne in prebavljive hrane ter nas ščiti pred strupi in ostalimi nevarnimi snovmi. Čutne celice se nahajajo v brbončicah v ustni votlini, na jeziku in v grlu. V brbončicah se nahaja okoli 100 celic, ki jih delimo v 3 skupine. Prvi tip so celice podobne glia celicam, ki se ovijejo okoli ostalih celic in jim nudijo oporo ter preprečujejo nekontrolirano širjenje živčnih prenašalcev. Naslednji tip so t.i. receptorske celice, ki zaznavajo sladko, grenko in umami ter sproščajo nevrotransmiterje, ki signal prenesejo do živčevja. Tretji tip celic so predsinaptične celice, ki se odzivajo predvsem na kisel okus. Njihova posebnost je, da se prek sinaps direktno povezujejo z živčnim vlakni. Pri signalizaciji okusov so zelo pomembni z G-proteini povezani receptorji, ki omogočajo zaznavanje sladkega, grenkega in umami okusa ter ionski kanalčki, ki prenašajo informacijo o kislem in slanem okusu. Ne dolgo nazaj so znanstveniki, k prej omenjenim petim osnovnim okusom, dodali še šestega – okus po maščobi. Signalizacija najverjetneje poteka preko receptorja CD36, možni pa so še GPR120 in GPR40 ter DRK kanalčki. Mehanizem je še dokaj neraziskan, predpostavljajo pa sodelovanje med več receptorji.

===Peter Škrinjar: Receptorji za okus in njihova povezava z debelostjo ===

Okus je eden izmed petih osnovnih čutov, katerega naloga je prepoznavanje hranil in preprečevanje vnosa telesu nevarnih snovi. Pri tem mu pomagajo receptorji za okus. Te se razlikujejo za vseh pet osnovnih okusov – grenko, sladko in umami zaznamo s pomočjo GPCR-jev, slano in kislo pa s pomočjo ionskih kanalčkov. Raziskave še potekajo glede receptorjev za maščobnokislinski okus. Poleg receptorjev v ustih pa poznamo tudi receptorje za okus v prebavni cevi. Tam so te pomembni predvsem v enteroendokrinih celicah, kjer ob prisotnosti različnih ligandov sprožijo izločanje različnih peptidnih hormonov (GLP-1, CCK, PYY itd.). Te nato stimulirajo vagusni živec, ki prenese informacijo do možganov, ki se primerno odzovejo (npr. ob prisotnosti sladkorjev se v prebavni cevi izloča GLP-1, ki sproži izločanje inzulina iz trebušne slinavke). Receptorje za okus lahko povežemo tudi z debelostjo. Genetske razlike pri receptorjih za maščobnokislinski okus (predvsem CD36, ki je najbolj raziskan) lahko povzročijo slabše zaznavanje maščobnih kislin, kar bi nato vodilo do debelosti. To povezavo je sicer potrebno še dokazati. Podobno bi lahko predvidevali za maščobnokislinske receptorje v prebavnem traktu. Kot alternativa za zdravljenje debelosti se je pojavila hipoteza o zdravljenju preko receptorjev za okus na adipocitah brez α-gustducina, na katere imajo grenke komponente inhibicijski učinek.

===Milica Janković: Jedrni receptorji: Karakteristike in regulacija receptorjev ter identifikacija ligandov===

Jedrni receptorji so proteini prisotni v celicah, ki prenašajo signale svojih ligandov. Naddružino jedrnih receptorjev sestavlja 48 transkripcijskih faktorjev (pri ljudeh). Aktivirajo se po vezavi liganda in vključujejo receptorje za steroidne hormone, lipofilne vitamine, ščitnične hormone in retinoinsko kislino. Receptor- ligandni kompleks se veže na specifično področje na DNA, katero imenujemo hormonski responsni element (HRE). Jedrni receptorji so transkripcijski faktorji, ker delujejo direktno v jedru in spreminjajo ekspresijo genov ter na ta način vplivajo na razvoj, diferencijacijo in homeostazo in metabolizem. Obstajajo štirje tipi nuklearnih receptorjev, ki se razlikujejo po signalnih poteh.Zavzemajo tudi različne konformacije, ki so povzročene z vezavo agonista, oziroma antagonista. Morda najbolj revolucionarna ugotovitev, je bilo presenetljivo odkritje, da obstajajo številni receptorji, kateri so povezani na majhne molekulske ligande. Ker ti ligandi niso znani, receptorji so poimenovani siroti (orphans) receptorji. Vprašanje je bilo, kako bi lahko prišli do odkritja tistih ligandov? Vsi jedrni receptorji imajo podobno strukturo, na podlagi česa je bilo lahko narediti vrsto testov za identifikacijo ligandov.
Ker se pa vežejo na majhne molekule, predstavljajo zanimive terapevtske cilje. Bi bili bogat vir za razvoj sintetičnih majhnih molekul kot ligandov.

===Tina Turel: Vpliv mikroorganizmov na presnovo glukoze===

V biomedicini je v zadnjih letih prišlo do odkritja, da črevesna mikroflora sodeluje v različnih metabolnih procesih. Mikroorganizmi v črevesju komunicirajo z gostiteljem preko TLR-jev. TLR so receptorji v prirojenem imunskem sistemu, ki zaznajo določeno patogeno zaporedje in aktivirajo imunski odziv oziroma omogočajo komunikacijo med črevesno mikrofloro in gostiteljem. Prav tako pa lahko TLR-ji pa omogočijo, da v različnih metabolnih procesih lahko sodelujejo tudi mikroorganizmi. V študiji so se znanstveniki usmerili v določitev vseh členov, ki vplivajo na presnovo glukoze. Presnova glukoze je univerzalni postopek, ki je prisoten v vseh vretenčarjih in tudi v nekaterih nevretenčarjih. Študija je odkrila manjkajočo povezavo med IFNɣ in presnovo glukoze in sicer A. muciniphilo, ključni mikroorganizem, ki je odgovoren za izboljšanje tolerance na glukozo. Potrdili so, da bakterija lahko izboljša toleranco glukoze v različnih gostiteljih. Irgm1 so določili kot glavnega posrednik med IFNɣ in A. muciniphilo. Dejstvo je, da je A. muciniphila prisotna tudi v človeški mikroflori, zato so znanstveniki opravili poskuse tudi na prostovoljcih. Izkazalo se je, da je postopek in pa vpliv določenih komponent na presnovo in toleranco glukoze enak kot pri miših. Raziskava pa ponuja novo pot v zdravljenju metabolnih bolezni in sicer reguliranje ravni A. muciniphile.

===Ana Maklin: Vloga PGP in PHO13 v metabolizmu===

PGP in njegov ortolog PHO13 v kvasovkah sta bila predmet številnih raziskav. Njune funkcije so zelo raznolike, jasno pa je, da s svojo fosfatazno aktivnostjo ter drugimi lastnostmi pomembno vplivata tudi na metabolizem. Zaradi stranske aktivnosti nekaterih encimov v metabolnih procesi, nastajajo tudi produkti, ki lahko ovirajo normalno delovanje celic. Evolucijsko gledano, so organizmi torej morali ustvariti popravljalni sistem, ki prepreči nadaljnje posledice teh napak. Naloga PGP in PHO13 je, da s svojo aktivnostjo pretvorita neželjene produkte, ki nastajajo zaradi stranske aktivnosti encimov, v druge, ki niso škodljivi. V metabolizmu glukoze, zaradi stranske aktivnosti gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze in piruvat kinaze nastajata 4-fosfoeritronat in 2-fosfolaktat. Prvi je inhibitor 6-fosfoglukonat dehidrogenaze, drugi pa fosfofruktokinaze-1. Inhibicija teh dveh encimov bi brez PGP in PHO13 povzročila moteno glikolizo in pentoza fosftno pot. PHO13 oziroma njegova odsotno v celicah ima pomembo vlogo tudi pri pretvorbi rastlinske biomase v etanol. Ker uporaba etanola iz biomase kot vir obnovljive energije postaja vedno bolj razširjena, je PHO13 postal pomemben predmet za napredek v metabolnem inženirstvu. Deaktivacija PHO13 v kvasovkah z izraženimi XR/XDH/XK namreč preprečuje defosforilacijo ksiluloze 5-fosfata, kar omogoča nadaljevanje metabolnih procesov potrebnih za nastanek etanola, izboljša toleranco na običajne inhibitorje fermentacije (šibke kisline, produkti razgradnje sladkorjev) ter povzroči pospešeno transkripcijo genov, vključenih v pentozo fosfatno pot (naprimer TAL1,ki kodira protein transaldolazo, enega ključnih encimov pri neoksidativni pentoza fosfatni poti).

===Barbara Slapnik: Regulacija metabolizma glukoze v sesalskih celičnih kulturah===

Regulacija metabolizma glukoze je iz vidika celičnih kultur zelo pomembna, saj vpliva na celično rast in produktivnost celic. Boljše poznavanje regulacije metabolizma nam omogoča njegovo kontroliranje in s tem možnost za povečanje produktivnosti celic v celičnih kulturah. Regulacija metabolizma glukoze v celici poteka v več stopnjah. Pretok omejujejo intermediati, ki vstopajo še v druge metabolne poti. Zelo pomembna stopnja je regulacija z encimi. Glavni encimi, ki regulirajo glikolizo so heksokinaza, fosfofruktokinaza in piruvat kinaza. Poznamo več izooblik encimov, ki se razlikujejo po delovanju in afiniteti do substratov. Regulacija metabolizma glukoze poteka tudi na nivoju celične signalizacije. Protein kinaza B, ki ga imenujemo tudi Akt je odvisen od prisotnosti inzulina. Akt vpliva na izražanje glukoznega prenašalca 1 in delovanje heksokinaze ter fosfofruktokinaze. AMP kinaza je ključna za aktivacijo katabolnih poti in inhibicijo anabolnih poti. c-Myc je transkripcijski faktor, ki vpliva na izražanje glukoznega prenašalca 1 in delovanje fosfofruktokinaze, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze, fosfoglicerat kinaze in enolaze. p53 je transkripcijski faktor, ki zmanjša transkripcijo glukoznega prenašalca 1 in 3 ter aktivnost fosfoglicerat mutaze. Razumevanje regulacije metabolizma glukoze nam omogoča boljšo celično rast v bioreaktorjih.

===Ajda Krč: Spremembe v delovanju Krebsovega cikla in sposobnost prilagajanja parazitov na razmere v okolju===

Preučevanje parazitov, predvsem njihovega življenjskega kroga ter biokemijskih procesov, ki skrbijo za njihovo rast in razvoj, je pomembno predvsem z vidika preprečevanja bolezni, ki jih povzročajo s svojim zajedanjem v gostiteljskih organizmih. Paraziti iz debla Apicomplexa, v katerega spadata tudi Plasmodium falciparum in Toxoplasma gondii imajo značilen organel, t.i. apikoplast, s katerim prodrejo v gostiteljsko celico. Plasmodium falciparum spada v družino plazmodijev, zajedavcev eritrocitov, ki povzročajo malarijo, Toxoplazma gondii pa je glavni krivec za pojav toksoplazmoze. Življenjski krog teh parazitov se običajno deli na spolno in nespolno fazo razmnoževanja. Obe fazi spremljajo določeni procesi, ki pomagajo organizmom preživeti v najrazličnejših okoljih. Med mehanizme, ki sodelujejo pri preživetju, gotovo spada tudi ogljikov metabolizem, ki vključuje procese glikolize, glutaminolize, reakcije v Krebsovem ciklu ter elektronsko prenašalno verigo. V seminarski nalogi so opisane nekatere spremembe in prilagoditve določenih encimov Krebsovega cikla na okolje, v katerem se organizem nahaja, ter anaplerotične poti, v katere je Krebsov cikel parazitov vpleten. Prav tako so razložene nekatere alternativne poti, po katerih paraziti pridejo do potrebne energije (reakcije glutaminolize) glede na fazo v njihovem razvoju.

===Urban Hribar: Metabolizem polariziranih makrofagov===

Makrofagi lahko spremenijo svoje delovanje kot odziv na zunanje dejavnike za opravljanje različnih nalog. Temu procesu pravimo aktivacija oziroma polarizacija makrofagov. Makrofagi se lahko palarizirajo v makrofage tipa M1 (klasično aktivirani) in tipa M2 (alternativno aktivirani). Makrofagi M1 so pomembni v boju proti okužbam mikrobov in so znani kot makrofagi, ki promovirajo vnetja. Proizvajajo tudi dušikov oksid (NO) in vnetostne citokinine. Na dolgi rok lahko makrofagi M1 in njihovi produkti škodujejo tkivu lastnega oganizma. Zato makrofagi tipa M2 zavirajo vnetja in so odgovorni za popravilo tkiva. Pri funkcijah teh makrofagov imajo pomembno vlogo tudi spremenjeni metabolizmi polariziranih makrofagov. Makrofagi M1 imajo pospešeno delovanje glikolize ter zmanjšano aktivnost oksidativne fosforilacije. Z pospešeno glikolizo ter laktatno fermentacijo makrofagi proizvajajo večino svojih zalog ATP. Poleg tega ima tudi prekinjen krebsov cikel na dveh mestih. Prvo mesto je pri reakciji izocitrata v alfa-ketoglutarat, drugo mesto pa pri reakciji sukcinata v fumarat. Prekinitve v ciklu vodijo do kopičenja intermediatov, ki pa se uporabljajo za sintezo NO, prostgladinov in vnetnosnih citokinov. Hkrati je krebsov cikel makrofagov M1 povezan z ciklom sečnine, ki lahko proizvaja NO. Posebnost makrofagov M1 je tudi da v mitohondrijih proizvajajo povečane količine reaktivnih kisikovih zvrst (ROS). Te se tudi uporabljajo za boj proti bakterijam in proizvodnjo vnetnostnih citokinov.

===Urška Zagorc: Salmonela in citratni cikel===

Zastrupitev z bakterijo salmonelo spada med najpogostejše zastrupitve s hrano. Bakterija lahko živi v različnih okoljih, saj zna zelo dobro prilagoditi svoj metabolizem in se hkrati tudi izmakniti naravnemu imunskemu sistemu. Za to poskrbijo številni encimi citratnega cikla v salmoneli. Encimi akonitaza, izocitrat dehidrogenaza in izocitrat liaza inhibirajo delovanje inflamasoma NLRP3. Inflamasom je receptor imunskega sistema in aktivira kaspaze, ki vodijo v celično smrt. Z inhibiranim delovanjem teh inflamasomov posledično ne pride do celične smrti škodljivih celic. Tudi citrat in citratni cikel imata pri ohranjanju bakterije salmonele svojo vlogo. Citrat, na primer, je povezan v kompleks z železom. Ob izpostavljenosti dušikovemu oksidu, ki ima velik vpliv na celoten ogljikov metabolizem, se citrat porablja. Zmanjša se količina železa v celici, ki je bila prej v ravnotežju, hkrati pa se zmanjša tudi rast salmonele. Citratni cikel pa ni edini način, ki ga uporablja bakterija salmonela za svoje preživetje. Razvila je namreč mnogo poti, po katerih se lahko izogne oviram gostitelja. Ta se poleg inflamasomov bori s salmoneli strupenimi snovmi, kot je dušikov oksid, a tudi za to je bakterija že našla rešitev.

===Lija Srnovršnik: Hepatična oksidacija maščobnih kislin med stradanjem===

Jetra so ključna pri uravnavanju ravnotežja energije v celotnem telesu.
Da bi razumeli vlogo hepatične β-oksidacije maščobnih kislin med obdobjem stradanja, so vzredili miši z izločenim genom za delovanje karnitin acil-transferaze 2 v jetrih (Cpt2L-⁄- miši). Ta encim katalizira obvezen korak v mitohondrijski dolgoverižni β-oksidaciji maščobnih kislin. Karnitin acil-transferaza 2 namreč sodeluje pri prenosu maščobnih kislin v notranjost mitohondrija in brez nje β-oksidacija ne more potekati. Miši so stradali 24 ur, kar je povzročilo nalaganje maščobe na jetra in povišano raven lipidov v krvi, vendar pa odsotnost ketonskih telesc, medtem ko je raven glukoze ostala normalna. Če med stradanjem, hepatična oksidacija ne poteka, se inducirajo PPARα tarčni geni v jetrih. Sistemska homeostaza energije je bila večinoma vzdrževana v stradajočih Cpt2L-⁄- miših z adaptacijami v hepatični in sistemski ekspresiji genov za oksidacijo, na kar so vplivali PPARα tarčni geni, ki vključujejo prokatabolične hepatokine Fgf21, Gdf15 and Igfbp1.
Da bi primerjali rezultate, so Cpt2L-⁄- miši hranili s ketonsko dieto, prišlo je do hude lipolize ter posledično hepatomegalije (povečanja jeter), poškodb samega organa in posledično smrti. Opazili so popolno odsotnost zalog triacilglicerolov v adipocitih. Ti podatki kažejo, da hepatična oksidacija maščobnih kislin ni nujno potrebna za preživetje med pomanjkanjem hrane, vendar je ključna za omejitev lipolize v adipocitih ter regulacijo nadomestnega katabolizma, ko je glukoza omejena.

===Patrik Levačić: Ceramidi in njihova povezava z debelostjo===
V modernem svetu je debelost vse večji problem, če ne celo eden glavnih krivcev za bolezni, ki so povezane s prekomerno cirkulacijo lipidov v krvi, kot je npr. ateroskleroza ipd. Tekom debelosti je prisotnega več sladkorja v obliki glukoze, lipidov ter vnetji. Ker je presežek lipidov, natančneje maščobnih kislin v obtoku, so to primerni pogoji za tvorbo ceramidov, ki so sicer še sestavljeni iz sfingozina, ki se preko aminske skupine poveže z maščobno kislino. Ceramidi se eni glavnih krivcev za znižano stopnjo oksidacije maščobnih kislin, to pripomore k nalaganju maščobnega tkiva na organe ter v adipocitno tkivo, a žal lahko tudi adipocitno tkivo raste do neke mere, ko doseže maksimalno velikost posatne to tkivo nefunkcionalno in ne more več shranjevati lipidov. Rezultat je prekomerna cirkulacija lipidov v krvi. V seminarju je največ govora o dveh specifičnih ceramidih, ceramid C16:0 ter ceramid C18:0, ki sta v raziskavah imela vlogo negativnega regulatorja metabolizma lipidov ter slodkorjev. Kakršnekoli motnje metabolizma pa se odražajo v obliki vnetji, slabši funkcionalnosti celic, samih organelov v notranjosti celice ter kroničnih obolenj kot so npr. sladkorna bolezen. Za boj proti debelosti je večina študij ugotovila, da s povišanim procentom oksidiranih maščobnih kislin dosežemo zmanjšanje deleža prostih maščobnih kislin ter blokiramo tvorbo novih ceramidov.

===Jerneja Nimac: Ketonska telesca kot signalni metaboliti===

Nove raziskave na področju ketonskih telesc kažejo, da ta niso le pasivni prenašalci energije, ampak tudi pomembni signalni metaboliti. Najpomembnejši med njimi je β-hidroksibutirat (BHB). Signalne vloge, ki mu jih pripisujejo so inhibicija histonske deacetilaze razreda I (HDAC), aktivacija z G-proteinom sklopljenega receptorja HCAR2 in inhibicija prav tako z G-proteinom sklopljenega receptorja FFAR3. Ko BHB inhibira HDAC se poveča izražanje genov, ki zmanjšajo oksidativni stres, poleg tega pa naj bi ta inhibicija izboljšala občutljivost na inzulin. Antilipolitični učinek receptorja HCAR2 inhibira hormonsko odzivno triglicerid lipazo, kar ustvari negativno povratno zanko in zaustavitev ketogeneze. Vpliv BHB na receptor FFAR3 pa še ni popolnoma raziskan. Predpostavljajo, da BHB vpliva na FFAR3 v odvisnosti od pogojev, torej G-proteina in koncentracije BHB, je pa ena od raziskav pokazala, da molekula BHB z vezavo na FFAR3 inhibira od napetosti odvisne kalcijeve kanalčke. Molekula BHB se veže tudi na inflamasom NLRP3 in z njegovo inhibicijo prepreči izstop K+. Poleg ketonskega telesca BHB pa ima nekaj signalnih funkcij tudi acetoacetat. Slednji skupaj z molekulo BHB regulira vezikularni transporter glutamata (VGLUT2), in sicer tako da inhibira od Cl- odvisni vnos glutamata. Signalna funkcija ketonskih telesc v celici pa sproži odzive, ki naj bi pripomogli k zaviranju epilepsije, demence, raka in vplivali na staranje.

===Nika Mikulič Vernik: Hiperamoniemija in metode zdravljenja===

Amonijak se v telesu porablja v anabolizmu aminokislin, sintezi proteinov in zagotavljanju pH vrednosti. Kadar ga je v krvni plazmi preveč, ga mora telo detoksicirati in izločiti, za kar skrbi cikel uree v jetrnih celicah. Preostanek amonijaka odstrani glutamin sintetaza, ki iz glutamata tvori glutamin. Če je amonijaka v krvi preveč, to stanje imenujemo hiperamoniemija. Za razvoj te bolezni poznamo več vzrokov, glede na njih pa ločimo primarno (okvare encimov ali transporterjev, ki delujejo v ciklu uree) in sekundarno hiperamoniemijo (inhibicija cikla uree).
Ker ima amonijev ion NH4+ podoben atomski radij kot K+, lahko membrane prehaja na enak način. Preide lahko tudi krvno možgansko bariero, kar povzroča nevrološke težave, kot so zatekanje astrocitov, povečana permeabilnost krvno možganske bariere, cerebralni edem (zatekanje možganov) in hepatična encefalopatija, kar lahko vodi v komo in celo smrt.
Zdravila za zdravljenje hiperamoniemije imajo dva možna načina delovanja; 1) zmanjšanje nastanka in absorpcije amonijaka (zmanjševanje števila bakterij, ki proizvajajo ureaze, ali zmanjševanje degradacije glutamina in glicina); 2) izboljšanje sistemov za detoksikacijo in izločanje. Zraven tega se uporabljajo tudi razne dialize, genske in celične terapije ter kirurški posegi.

===Tanja Zupan: Presnovne bolezni aminokislin===

Bolezen javorjevega sirupa (MSUD), fenilketonurija (PKU), hiperamoniemija (HA), citrulinemija (CTLN), tirozinemija, cistinoza in Hartnupova bolezen so presnovne bolezni aminokislin, ki se dedujejo avtosomno recesivno. Bolezen javorjevega sirupa se pojavi zaradi nedelovanje encima BCKDH (ang. »branched-chain α-ketoacid dehydrogenase complex«), zato se v urinu poveča koncentracija α-ketokislin, ki dajejo urinu značilen vonj po javorjevm sirupu. Nedelovanje encima fenilalanin hidroksilaza (PAH), ki sodeluje pri presnovi fenilalanina v tirozin pa povzroči fenilketonurijo. Tirozinemija je posledica pomanjkanja oz. nedelovanje encimov v metabolni poti tirozina, delimo jo na tri tipe: tirozinemija tipa I (pomanjkanje encima fumarilacetoacetate (FAH), ki katalizira razgradnjo fumarilacetoacetata v acetoacetat in fumarat), tirozinemija tipa II (pomanjkanje encima tirozin aminotrasnferaze (TAT) v jetrih, ki tirozin pretvori v p-hidroksilfenilpiruvat), tirozinemija tipa III (pomanjkanje p-hidroksifenilpiruvat dioksigenaza). Cistinoza pa je bolezen, ki je posledica okvarjenega transporta cistina iz lizosomov v citoplazmo, pri čemer se cistin kopiči v celicah in jih poškoduje zaradi tvorbe kristalov. Hiperamoniemija in citrulinemija sta bolezni, ki ju povzroči nedelovanje encimov v ciklu sečnine. Za hiperamoniemijo je značilna zvišana koncentracija amoniaka v krvi zaradi pomanjkanja encima ornitin transkarbamilaze (OTC). Citrulinemijo delimo na dva tipa, citrulinemijo tipa I ali klasično citrulinemijo, pri kateri gre za pomanjaknja argininosukcinata, ter citrulinemijo tipa II, kjer gre za pomanjkanje citronov. Bolezni zdravimo oz. omejimo njene posledice s strogo vseživljenjsko dieto, pri kateri omejimo vnos določene aminokisline v organizem.

===Anja Tavčar: Regulacija imunskega odziva z metabolizmom L-arginina===
L-arginin je pri človeku ena od pogojno esencialnih aminokislin, kar pomeni, da ga moramo v primerih, ko potreba po njem presega zmožnosti lastne produkcije, vnašati s hrano. Njegov metabolizem poteka v tako imenovanih mieloidnih celicah zaviralkah (MSC), in sicer s pomočjo encima arginaze (ARG, nastajata urea in L-ornitin) ali NO-sintaze (NOS, nastajata NO in L-citrulin). Obe vrsti encimov za svoje delovanje nujno potrebujeta kofaktorje, da pa do aktivnosti sploh pride, mora mieloidna celica prejeti signal iz okolice. Običajno gre za vezavo katerega od številnih citokinov, ki služijo kot signalne molekule med različnimi elementi imunskega sistema. Pri razumevanju uravnavanja oz. usklajevanja delovanja ARG in NOS ostaja še kar nekaj nerazrešenih vprašanj in problematik, vendar lahko kljub temu potrdimo, da je njuna združena aktivnost pomemben supresor T celic ter hkrati odličen označevalec mieloidnih celic zaviralk, ki so razširjene po celem telesu. Z regulacijo aktivnosti teh dveh encimov celice vplivajo na delovanje okoliških limfocitov T in tako inhibirajo njihovo pretirano izražanje ter poliferacijo po odstranitvi patogena iz sistema, ki bi sicer privedla do akumulacije T celic. V primeru, da do tega zaviranja ne pride, govorimo o avtoimunskih boleznih, kjer zaradi predolge izpostavljenosti citotksičnim limfocitom, prihaja do okvar, ki vodijo v napadanje telesu lastnih celic ter nastanka tumorjev.

===Maja Vrabec: Poškodbe mitohondrijske DNA in popravljalni mehanizmi===
V mitohondrijski DNA se mutacije kopičijo bistveno hitreje in v večji meri kot v jedrni DNA. Zaradi sproščanja reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) iz dihalne verige v mitohondrijih in omejenega nabora mehanizmov odstranjevanja oziroma pretvarjanja le-teh v manj škodljive kompomnente, je oksidativno okolje mitohondrijske DNA dolgo časa veljalo za glavni razlog večjega števila mutacij. Pred nekaj leti pa je bilo dokazano, da so glavni razlog za kopičenje mutacij v mitohondrijski DNA napake v replikaciji, kar vključuje neustrezno delovanje mitohondrijske DNA polimeraze POLG ter nesorazmernosti in modifikacije v zalogah deoksi nukleotidov tri-fosfat, ki so namenjeni za vključitev v novonastajajoče verige. Mitohondrijska DNA ima bistveno manjši nabor popravljalnih mehanizmov kot jedrna DNA, zaradi česar veliko mutacij ostane nepopravljenih in se kopičijo. Poleg tega ima določen vpliv na količino mutacij v DNA tudi okolje in razne škodljive komponente v njem, ki največkrat preko tvorbe aduktov z mtDNA močno ovirajo ali onemogočajo delovanje mitohondrijske DNA polimeraze med replikacijo in transkripcijo. Najpogostejše mutacije v mitohondrijski DNA so zamenjava enega nukleotida in vstavitev oziroma odstranitev posamezne baze. Določen delež mutacij je prisoten načeloma v vseh mitohondrijskih genomih, posledice za funkcionalnost celotnega mitohondrija in celice se začnejo kazati šele, ko količina mutacij doseže nek določen nivo, ki je odvisen od tipa celic.

===Anja Černe: Vpliv mitohondrijskega stresa na staranje===
Mitohondrij je glavni določevalec aktivnosti HSR (odgovor na stres), vzdrževanja proteostaze in življenske dobe. Glavni člen pri HSR je transkripcijski faktor HSF-1 (heat-shock factor 1). V začetku reproduktivne dobe se aktivnost HSR zmanjša v prid razmnoževanju. Inhibicijo HSR spodbudi povišana histonska metilacija histona H3K27 na delih kromosoma, kjer je lociran gen za stres. Preko blagega mitohondrijskega stresa lahko v celicah zmanjšamo represijo HSR ter upočasnimo proces staranja. Induciran stres mora biti v omejen. Motnje v mitohondriju lahko sprožimo s kemikalijami (inhibicija kompleksov I in III), infekcijo s patogenimi bakterijami ali preko neravnovesij v mitohondrijski DNA. Celica se na stres odzove z odgovorom UPRmt, s katerim obnovi proteostazo (proteinska homeostaza). Kadar pride do kolapsa proteostaze (stanje, v katerem šaperoni ne zmorejo dovolj učinkovito oz. hitro popravljati nepravilno zvite proteine), se sproži mitohondrijski odgovor na nezvite proteine - UPRmt. Tovrsten odgovor se začne z delovanjem protease CLPP-1, ki razgradi moteče proteine na kratke peptide in le-te transporter HAF-1 izvozi iz matriksa. Peptidi nato aktivirajo transkripcijski faktor AFTS-1, ki se v jedru veže na promotorje genov za mitohondrijske šaperone. V mitohondriju je zelo pomembna regulacija aktivacije kompleksa I; pretirana inhibicija ima lahko usodne učinke (npr. pomanjkanje testosterona znatno zniža aktivnost kompleksa I), medtem ko blago utišanje lahko doprinese k upočasnjevanju staranja (npr. rotenon inhibira kompleks I, kar spodbuja UPRmt).

===Špela Deučman: Vloga reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) pri celični signalizaciji===
Pri mnogih celičnih procesih nastaja superoksid oz. radikali, ki se kasneje s kisikom združijo v superoksid. Te spojine, imenovane reaktivne kisikove zvrsti (ROS), nastajajo predvsem v mitohondrijih, peroksisomih, endoplazemskem retikulumu in na kompleksih NADPH oksidaze. Zaradi njihove velike reaktivnost so znanstveniki dolgo časa menili, da so to nezaželene molekule, ki povzročajo poškodbe lipidov, proteinov in DNA. V zadnjih dveh desetletjih pa so ugotovili, da imajo pomembno vlogo v homeostazi in kot posredniki intraceličnega signaliziranja. Regulacija ROS z encimi in antioksidanti je ključnega pomena, saj preprečuje poškodbe celičnih struktur in celično smrt hkrati pa vzdržuje dovolj veliko koncentracijo za namene signalizacije. Organizmi so razvili več mehanizmov in najpogostejši med njimi je mehanizem imenovan »redox relay«, pri katerem H2O2 oksidira cisteinske ostanke proteinov kot so PRXs in GPXs. Pri kvasovkah H2O2 oksidira Orp1, ki v nadaljevanju oksidira Yap1. Pri tako imenovanem »floodgate« mehanizemu nastaja H2O2, ki regulira sintezo kortikosterona (pri miših) z negativno povratno zanko, kar omogoča akumulacijo H2O2 ter nadaljnjo signalizacijo. Pri signalizaciji z drugimi rastnimi faktorji prav tako nastaja in se akumulira H2O2, vendar se PRX začasno inaktivira s fosforilacijo. Pri hipoksičnih pogojih se PRX1 oksidira in s tem preprečuje oksidacijo (inaktivacijo) AMPK. Pri interakciji ASK1 in TRX slednji deluje kot nosilec in negativni regulator ASK1. Ob oksidaciji TRX z H2O2 ASK1 oddisociira in tako postane aktiven.

BIO2 Seminar 2017

2017-12-01T17:33:49Z

Špela Deučman: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Ines Medved || 12 || Receptorji za vonj v epidermisu || Špela Supej || Lea Knez || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Luka Gregorič || 12 || Pozitivne vloge negativnih regulatorjev || Uroš Prešern || Katja Doberšek || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Daria Latysheva || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2017#Daria_Latysheva:_The_role_of_intrinsically_disordered_proteins_in_signalling_pathways_and_regulation The role of intrinsically disordered proteins in signallng pathways and regulation] || Luka Fratina || Martin Špendl || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Polona Skrt || 12 || Mehanizem zaznavanja okusa maščobe || Andreja Habič || Ajda Galič || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Peter Škrinjar || 12 || Receptorji za okus in njihova povezava z debelostjo || Andrej Race || Nika Zaveršek || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Milica Janković || 12 || Nuklearni receptorji: Karakteristike in regulacija receptorjev ter identifikacija ligandov || Anže Jenko || Nika Goršek || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Tina Turel || 14-15 || Vpliv mikroorganizmov na presnovo glukoze || Ines Medved || Špela Supej || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Barbara Slapnik || 14-15 || Regulacija metabolizma glukoze v celičnih kulturah|| Luka Gregorič || Uroš Prešern || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Ana Maklin || 14-15 || Vloga PGP in PHO13 v metabolizmu || Daria Latysheva || Luka Fratina || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Ajda Krč || 16 || Spremembe v delovanju Krebsovega cikla in sposobnost prilagajanja parazitov na razmere v okolju || Polona Skrt || Andreja Habič || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Urban Hribar || 16 || Metabolizem polariziranih makrofagov || Peter Škrinjar || Andrej Race || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Urška Zagorc || 16 || Salmonela in citratni cikel || Milica Janković || Anže Jenko || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Patrik Levačić || 17 || Ceramidi in njihova povezava z debelostjo || Tina Turel || Ines Medved || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Jerneja Nimac || 17 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2017#Jerneja_Nimac:_Ketonska_telesca_kot_signalni_metaboliti Ketonska telesca kot signalni metaboliti] || Barbara Slapnik || Luka Gregorič || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Lija Srnovršnik || 17 || Hepatična oksidacija maščobnih kislin med stradanjem || Ana Maklin || Daria Latysheva || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Nika Mikulič || 18 || Hiperamoniemija in metode zdravljenja || Ajda Krč || Polona Skrt || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Tanja Zupan || 18 || Presnovne bolezni aminokislin || Urban Hribar || Peter Škrinjar || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Anja Tavčar || 18 || Regulacija imunskega odziva z metabolizmom l-arginina || Urška Zagorc || Milica Janković || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Maja Vrabec || 19 || Poškodbe mitohondrijske DNA in popravljalni mehanizmi || Patrik Levačić || Tina Turel || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Špela Deučman || 19 || Vloga reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) pri celični signalizaciji || Jerneja Nimac || Barbara Slapnik || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Anja Černe || 19 || Mitohondrijski stres obnavlja odgovor na toplotni šok in preprečuje padec proteostaze med staranjem || Lija Srnovršnik || Ana Maklin || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Lea Knez || 20 || Ogljikovi hidrati kot signalne molekule v rastlinah || Nika Mikulič || Ajda Krč || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Katja Doberšek || 20 || Regulacija sinteze celuloze v odvisnosti od zunajceličnih dejavnikov || Tanja Zupan || Urban Hribar || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Martin Špendl || 20 || || Anja Tavčar || Urška Zagorc || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Ajda Galič || 21 || || Katja Dolenc || Patrik Levačić || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Nika Zaveršek || 21 || || Špela Deučman || Jerneja Nimac || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Nika Goršek || 21 || || Anja Černe || Lija Srnovršnik || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Špela Supej || 22 || || Lea Knez || Katja Dolenc|| 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Uroš Prešern || 22 || || Katja Doberšek || Tanja Zupan || 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Luka Fratina || 22 || || Martin Špendl || Anja Tavčar || 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Andreja Habič || 23 || || Ajda Galič || Maja Vrabec || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Andrej Race || 23 || || Nika Zaveršek || Špela Deučman || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Anže Jenko || 23 || || Nika Goršek || Anja Černe || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Katja Dolenc || 23 || || Maja Vrabec || Nika Mikulič || 20/01/17 || 22/01/17 || 24/01/17
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2017|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Seminar 2017

2017-11-25T18:42:27Z

Špela Deučman: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Ines Medved || 12 || Receptorji za vonj v epidermisu || Špela Supej || Lea Knez || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Luka Gregorič || 12 || Pozitivne vloge negativnih regulatorjev || Uroš Prešern || Katja Doberšek || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Daria Latysheva || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2017#Daria_Latysheva:_The_role_of_intrinsically_disordered_proteins_in_signalling_pathways_and_regulation The role of intrinsically disordered proteins in signallng pathways and regulation] || Luka Fratina || Martin Špendl || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Polona Skrt || 12 || Mehanizem zaznavanja okusa maščobe || Andreja Habič || Ajda Galič || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Peter Škrinjar || 12 || Receptorji za okus in njihova povezava z debelostjo || Andrej Race || Nika Zaveršek || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Milica Janković || 12 || Nuklearni receptorji: Karakteristike in regulacija receptorjev ter identifikacija ligandov || Anže Jenko || Nika Goršek || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Tina Turel || 14-15 || Vpliv mikroorganizmov na presnovo glukoze || Ines Medved || Špela Supej || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Barbara Slapnik || 14-15 || Regulacija metabolizma glukoze v celičnih kulturah|| Luka Gregorič || Uroš Prešern || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Ana Maklin || 14-15 || Vloga PGP in PHO13 v metabolizmu || Daria Latysheva || Luka Fratina || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Ajda Krč || 16 || Spremembe v delovanju Krebsovega cikla in sposobnost prilagajanja parazitov na razmere v okolju || Polona Skrt || Andreja Habič || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Urban Hribar || 16 || Metabolizem polariziranih makrofagov || Peter Škrinjar || Andrej Race || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Urška Zagorc || 16 || Salmonela in citratni cikel || Milica Janković || Anže Jenko || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Patrik Levačić || 17 || Ceramidi in njihova povezava z debelostjo || Tina Turel || Ines Medved || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Jerneja Nimac || 17 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2017#Jerneja_Nimac:_Ketonska_telesca_kot_signalni_metaboliti Ketonska telesca kot signalni metaboliti] || Barbara Slapnik || Luka Gregorič || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Lija Srnovršnik || 17 || Hepatična oksidacija maščobnih kislin med stradanjem || Ana Maklin || Daria Latysheva || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Nika Mikulič || 18 || Izboljšave na področju zdravljenja hiperamonemije || Ajda Krč || Polona Skrt || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Tanja Zupan || 18 || Presnovne bolezni aminokislin || Urban Hribar || Peter Škrinjar || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Anja Tavčar || 18 || Regulacija imunskega odziva z metabolizmom l-argenina || Urška Zagorc || Milica Janković || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Maja Vrabec || 19 || Poškodbe mitohondrijske DNA in njihov vpliv na izražanje mitohondrijskih genov || Patrik Levačić || Tina Turel || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Špela Deučman || 19 || Vloga reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) pri celičnem signaliziranju || Jerneja Nimac || Barbara Slapnik || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Anja Černe || 19 || Mitohondrijski stres obnavlja odgovor na toplotni šok in preprečuje padec proteostaze med staranjem || Lija Srnovršnik || Ana Maklin || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Lea Knez || 20 || Ogljikovi hidrati kot signalne molekule v rastlinah || Nika Mikulič || Ajda Krč || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Katja Doberšek || 20 || || Tanja Zupan || Urban Hribar || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Martin Špendl || 20 || || Anja Tavčar || Urška Zagorc || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Ajda Galič || 21 || || Maja Vrabec || Patrik Levačić || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Nika Zaveršek || 21 || || Špela Deučman || Jerneja Nimac || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Nika Goršek || 21 || || Anja Černe || Lija Srnovršnik || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Špela Supej || 22 || || Lea Knez || Nika Mikulič || 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Uroš Prešern || 22 || || Katja Doberšek || Tanja Zupan || 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Luka Fratina || 22 || || Martin Špendl || Anja Tavčar || 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Andreja Habič || 23 || || Ajda Galič || Maja Vrabec || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Andrej Race || 23 || || Nika Zaveršek || Špela Deučman || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Anže Jenko || 23 || || Nika Goršek || Anja Černe || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Katja Dolenc || 23 || || ? || ? || 20/01/17 || 22/01/17 || 24/01/17
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2017|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2017 Povzetki seminarjev

2017-03-21T21:56:36Z

Špela Deučman: /* Ana Scott: Naslov seminarja */

[[TBK2017-seminar|Nazaj na osnovno stran]]
===Ana Scott: Naslov seminarja===
Tekst ....

'''Patrik Levaćić: Prehrambni aditivi v sladkarijah ter žvečilnih gumijih lahko spremenijo funkcionanlnost in strukturo prebavnih celic'''

Vnos nano delcev titanovega dioksida (TiO2) preko prehrambenih izdelkov kot so sladkarije ter žvečilni gumiji je praktično nemogoče. Prebavni trakt služi kot pomembna meja med telesom in zunanjim okoljem. Cilj raziskave je bilo opazovanje posledic vnosa 30 nano meterskih delcev titanovega dioksida preko modela celične strukture tankega črevesja ter določitev kako akutna ter kronična izpostavljenost takim delcem lahko vpliva na funkcionalnost in strukturo celice. Postopek prepoznavanja TiO2 delcev je zelo kompleksen, navadno se uporablja Ramanova spektroskopija, ki izkorišča lastnosti molekule kot so vibracijska ter rotacijska stanja, s tem pa dobimo tako imenovani ''finger-print'' molekule, saj ima vsaka molekula svoje lastnosti in se po njih loči od drugih molekul. Rezultati raziskave so potrdili, da čeprav akutna izpostavljenost ni pustila resnejših posledic na celični strukturi, ima kronična izpostavljenost kar nekaj posledic na celičnem nivoju. Spremeni se funkcionalnost celice, nivo delovanja membranskih encimov vpade, spremeni se prav tako tudi struktura, saj se zmanjša sposobnost vsrkavanja nutrientov preko mikrovilov.

'''Tina Turel: Povezanost retrovirusov z razvojem možganov'''

Možgani človeka so bistveno bolj razviti od možganov drugih sesalcev in zato veliko težji za raziskovanje in razumevanje. Številne raziskave so dokazale, da bi transportni elementi (TE-ji), ki so še pred nekaj leti veljali za neuporaben del DNA, tako imenovan »junk DNK«, lahko bili odgovorni za današnjo stopnjo razvitosti človeških možganov.
Retrovirusi so posebna skupina virusov. Nekateri veljajo za škodljive (HIV), drugi pa so povsem neškodljivi. V našem DNA je več kot 1000 različnih retrovirusov. V raziskavi, ki jo je vodil Johan Jakobsson in se je odvijala v Lundu, so dokazovali pomembno vlogo ERV-ja, endogenega retrovirusa v razvoju človeških možganov. Želeli so pokazati, da nekaj tisoč ERV-jev, mnogi so primarno specifični, delujejo kot priklopna podlaga za epigenetske represorsko beljakovino TRIM28, ki vzpostavi lokalni hetero kromatin okoli ERV-jev. Retrovirusi lahko pri vsakem človeku reagirajo drugače, saj so tak tip genetskega materiala, da se lahko nahajajo v katerem koli delu v genomu. Različna izražanja ERV-ja pa bi bila lahko tudi razlog za možganske okvare, ki povzročijo bolezni, kot so ALS, shizofrenija in bipolarna motnja .

'''Nina Mezgec Mrzlikar: Regulacija gena DISC-1 kot potencialnega zdravila za shizofrenijo'''

Shizofrenija je duševna motnja, ki se razvije v zgodnjem odraslem obdobju. DISC-1 (Disrupted-In-Schizophrenia-1) je protein, kodiran z genom DISC-1 in je močno izražen v možganskem hipokampusu. Sodeluje pri razvoju aksonov in povezovanju celic. Caveolin-1 je ogrodni protein bistven pri regulaciji receptorjev na membranah in spodbuja razvoj novih povezav med živčnimi celicami. V tej raziskavi so znanstveniki proučevali vpliv proteina Cav-1 na izražanje gena DISC-1 v živčnih celicah. Ugotovljeno je bilo, da prekomerno izražen gen Cav-1 povzroči večje izražanje gena DISC-1 in drugih sinaptičnih proteinov, ki so potrebni za prenos živčnega signala. V miših, katerim so iz hipokampusa odstranili Cav-1 je posledično prišlo do manjšega izražanja DISC-1 in hkrati drugih sinaptičnih proteinov. Izguba Cav-1 torej zmanjšuje aktivnost sinaps, kar pa je vzrok za številne nevrodegenerativne bolezni, kot je tudi shizofrenija. Ugotovitve kažejo na pomembno vlogo proteina Caveolin-1 v celicah, saj vzdržuje pravilno delovanje receptorjev in s tem prenos živčnega signala.

'''Sonja Gabrijelčič: Ribosomske mutacije spodbujajo razvoj odpornosti proti antibiotikom v okolju z več zdravilnimi učinkovinami'''

Odpornost bakterij na antibiotike je v porastu po vsem svetu. Pojavlja se tako v državah v razvoju, kjer je predvsem posledica nekvalitetnih antibiotikov, kot v najrazvitejših državah sveta, kjer se pojavlja več in več patogenov, ki lahko preživijo v okolju z več zdravilnimi učinkovinami oziroma antibiotiki. Bakterije lahko pridobijo odpornost ali z izmenjavo mobilnih genetskih elementov ali z mutacijo genetskega materiala, ki je že v celici. V raziskavi, ki jo opisuje članek, so raziskovalci želeli opazovati slednje, zato so izmed bakterij, ki so lahko sočasno odporne na več antibiotikov, izbrali Mycobacterium smegmatis, sorodnico bakterije, ki povzroča tuberkulozo, in eno od predstavnic skupine bakterij, pri kateri do izmenjevanja plazmidov praktično ne pride. Klasificirali so tipe mutacij, do katerih je prišlo, in se osredotočili predvsem na mutacije, ki so se zgodile na mestih genoma, kjer se kodirajo proteini, ki so sestavni deli ribosomov. Ugotovili so, da so taki mutanti odporni na antibiotike z različnimi mehanizmi delovanja, ki jim niso bili še nikoli izpostavljeni, na antibiotike širokega spektra in poleg tega tudi na nekatere druge mehanske strese na membrane.

'''Daria Latysheva: Mehanski raztezek sproži hitro delitev epitelijskih celic'''

Mehansko aktivni kanalčki so membranski proteini, ki so neposredno odvisni od sile in pretvarjajo mehanske držljaje v električne oz. biokemijske signale. Piezo1 je mehansko aktiven ionski kanalček, ki spodbuja celično smrt v predelih z visoko gostoto celic. V raziskavi so ugotovili, da kotrolira tudi mitotsko delitev. Raziskali so mehanizem delovanja Piezo1 v procesu celične delitve. Pri nizki gostoti celic oz. kjer so celice raztegnjene se Piezo1 lokalizira na celični membrani ter se odpre; posledično sproži influks kalcija v celico. ERK1 se aktivira zaradi povečane koncentracije Ca2+ ionov, kar vpliva na aktivnost ciklina B v G2 fazi mitotske delitve in povzroči proliferacijo. Način, na kateri Piezo1 aktivira dva nasprotna procesa je odvisen od lokacije in načina aktivacije kanalčka. V predelih z nizko gostoto celic se Piezo1 lokalizira na celični membrani ter hitro aktivira celično delitev. Če so celice razporejene tesno druga ob drugi, se Piezo1 oblikuje v velike citiplazemske agregate in spodbuja celično smrt. Zaradi sposobnosti zaznave mehanskega raztezka ter prevelike in premajhne gostote celic Piezo 1 deluje kot homeostatski senzor in kontrolira število epitelijskih celic.

'''Nika Goršek: Nove študije razkrivajo delovanje molekulske črpalke, ki izloča zdravila proti raku'''

MRP1 ali »Multidrug resistance protein« je protein, ki spada v družino ABC-transporterjev. Pomemben je pri reguliranju redoks homeostaze, vnetij in sekrecije hormonov. Znano je tudi, da ima pomembno vlogo pri odpornosti na zdravila in njihovem črpanju iz celic. V raziskavi na univerzi Rockefeller so z uporabo elektronske kriomikroskopije določili njegovo zgradbo. Sestavljajo ga štirje glavni deli: dva transmembranska dela, ki tvorita telo transporterja, dva dela, ki vežeta ATP, motiv v obliki lase in N-terminalni transmembranski del. Čeprav ima MRP1 dva dela, ki bi lahko vezala ATP, pa tega veže le en, saj pri drugem delu pride do drugačnega zaporedja aminokislin. V raziskavah so dokazali, da mutacije določenih delov proteina vodijo v bolezenska stanja in da bi sprememba le ene aminokisline v zaporedju vplivala na aktivnost proteina. MRP1 ima le eno dvojno vezavno mesto, ki je pozitivno nabito. Pestrost substratov je zaradi takega vezavnega mesta veliko večja, kot pri nekaterih drugih znanih proteinih. Prenaša lahko organske, amfipatične in aninonske molekule, na primer zdravila proti raku, opijate, antidepresive in tudi nekatere za življenje pomembne snovi (hormoni in protivnetne molekule). Ob vezavi substrata se oblika proteina MRP1 spremeni, aktivnost pa se poveča. Po končanem transportu pa protein preide nazaj v prvotno, neaktivno obliko.

'''Dragana Savković: Stopnja preživetja evkariontskih celic po elektroforezni nanoinjekciji'''

Znotrajcelična dostava makromolekul je pomemben korak za terapevtske in raziskovalne namene. Za uvajanje tujih molekul v citoplazmo živih celic uporabljale so se metode, katere so se v večini primerov uporabljale za veliko število celic v kulturi in je splošno znano, da veliko število teh celic (do 50%) ne preživi ta proces. Da bi rešili ta problem, razvili so alternativno metodo znotrajcelične dobave, oziroma znotrajcelično elektroforezno nanoinjekcijo. V raziskavi so primerjali stopnjo preživetja celic injiciranih z pipeto s premerom 100 nm in pipeto s premerom 500 nm. Ugotovili so, da je stopnja preživetja z uporabo 100 nm pipeto veliko večja kot s 500 nm pipeto in tudi da ostale preživele celice kažejo bolj naraven cikel celic.

'''Urška Zagorc: Proteini, zgodnje opozorilo sladkorne bolezni tipa 1'''

Sladkorna bolezen tipa 1, ki je značilna predvsem za otroke in mladostnike, je posledica motnje v imunskem sistemu. Organizem uniči lastne celice v trebušni slinavki, ki proizvajajo inzulin. Ta omogoča glukozi iz hrane vstop v celico, s čimer celica dobi hrano in energijo. V raziskavi nemškega raziskovalnega centra za zdravje in okolje Helmholtz Zentrum München so sodelovali otroci, katerih ožji družinski član ima diabetes tipa 1 in otroci brez dednih dispozicij. Analizirali so krvne vzorce otrok z avto-protitelesi ter jih primerjala z vzorci otrok, ki ne kažejo znakov bolezni niti nimajo protiteles.Identificirali so 41 peptidov iz 26 proteinov, ki se razlikujejo v krvnih vzorcih tistih otrok s protitelesi in tistih brez. Glede na koncentracijo peptidov v treh proteinih (hepatocitni rastni faktor HGF, istem komplementa H in ceruloplazmin) in glede na starost otroka, so dosegli tudi boljšo oceno hitrosti razvoja bolezni. Večja koncentracija sistema komplementa H in hepatocitnega rastnega faktorja ter nižja koncentracija ceruloplazmina pri tem nižji starosti bolnika, pomenijo hitrejši napredek bolezni. Identificirani proteini nam pokažejo bolj natančno oceno stopnje pred pojavom simptomov. Zaradi njih je možno tudi ugotoviti ali ima bolnik s protitelesi, večjo ali manjšo možnost za razvoj sladkorne bolezni tipa 1 in kako hitro se bo bolezen razvila.

'''Anja Černe: Uporaba askorbata pri zdravljenju raka'''

Če askorbat vnesemo v organizem v manjših koncentracijah ima antioksidativne učinke, medtem ko se pri vnosu v večjih koncentracijah obnaša kot prooksidant. Farmakološko koncentriran askorbat povzroča tok izvenceličnega H2O2 v celico in vse celice, tako zdrave kot rakave, encimsko razgrajujejo H2O2, ki je zanje toksičen. Glavni encimi, ki razgrajujejo H2O2 pri velikih količinah so katalaze. Ker pa je katalaz v rakavih celicah malo, so rakave celice bolj dovzetne škodljive učinke, zato je askorbat zanje selektivno toksičen. Katalazna aktivnost v rakavih celicah lahko napove, kako se bo tumor odzval na terapijo z askorbatom. Pri nekaterih vrstah tkiv je rast tumorjev bolj upočasnjena, pri drugih manj (odvisnost od količine katalaz, ki jih tkivo vsebuje). Število aktivnih katalaznih monomerov na celico in ED50 (koločina snovi, ki učinkuje pri 50% osebkih) sta sorazmerna s konstanto celične razgradnje H2O2. Radikali, ki nastanejo pri reakciji med ionom kovine in H2O2, poškodujejo DNA, v kolikšni meri se to zgodi pa je odvisno od količine askorbata.

'''Jerneja Nimac: S CRISPR/Cas9 nad X-vezavno kronično granulomatozno bolezen'''

Kronična granulomatozna bolezen je dedna bolezen imunskega sistema, ki nastane zaradi mutacije v genu CYBB, ki kodira gp91phox. Slednji je katalitični center NADPH oksidaze 2 (NOX2), ki ima pomembno vlogo pri obrambi organizma pred okužbami. Mutacije v genu CYBB na kromosomu Xp21.1 pa so odgovorne za X-vezavno obliko kronične granulomatozne bolezni. Za popravljanje takšne monogenske mutacije so v raziskavi uporabili sistem CRISPR/Cas9. Ta sistem so za obrambo pred virusnimi okužbami razvile bakterije in arheje, gre pa za poseben od RNA odvisen sistem pridobljene imunosti, ki specifično prepozna in reže tujo tarčno DNA. V raziskavi so skušali s sistemom CRISPR/Cas9 popraviti mutacijo C676T na eksonu 7 gena CYBB. Z DHR testi so ugotovili, da s CRISPR/Cas9 popravljene mieloične celice obnovijo aktivnost NOX2 in ponovno izražajo protein gp91phox. S spreminjanjem količine ssODN pa so dokazali, da je stopnja popravljenih genov večja, če je količina ssODN večja, delež indelov pa se zmanjša. Prav tako so potrdili uspešno presaditev s CRISPR/Cas9 popravljenih krvotvornih matičnih in predniških celic in njihovo diferenciacijo v nepoškodovane mieloične in limfocitne celice v NSG miših v obdobju petih mesecev.

'''Barbara Slapnik: Holesterol v celični membrani'''

Holesterol je razporejen po celični membrani. Pomemben je za vzdrževanje membranske fluidnosti, membrano naredi bolj togo in manj prepustno. Njegova porazdelitev med zunanjim in notranjim fosfolipidnim slojem pa ni enakomerna. V raziskavi so razvili dopolnilne senzorje, ki omogočajo vpogled holesterola v obeh slojih sočasno in določili njegovo točno koncentracijo. Ugotovili so, da je koncentracija holesterola v zunanjem sloju celične membrane znatno višja kot koncentracija v notranjem sloju. Visoka koncentracija holesterola v zunanjem sloju celične membrane zmanjša njeno prepustnost, medtem ko nizka koncentracija holesterola v notranjem sloju omogoča celično sporočanje. Rezultati prikazujejo pomen transbilarne asimetrije holesterola v celični membrani in njegovo prerazporeditev za celično homeostazo, rast in razmnoževanje. Podajajo tudi povezavo med holesterolom v notranjem sloju celične membrane in rakom. Določili so točno koncentracijo holesterola, kar jim omogoča boljšo diagnostiko in zdravljenje raka, vendar so za to potrebne še nadaljnje raziskave. Rezultati prav tako predstavljajo osnovo za nadaljnje študije transbilarne dinamike in funkcij holesterola in drugih lipidov v celici.

'''Nadja Škafar: Dostava protitumorskih zdravil s pomočjo makrofagov in biorazgradljivih nanodelcev'''

Nanotehnologija igra pomembno vlogo v moderni medicini, še posebej na področju zdravljenja bolezni s tarčno dostavo zdravil. Glavna prednost nanodostavnih sistemov (NS) pred danes uveljavljenimi metodami zdravljenja raka je selektivna dostava protitumorskih učinkovin tumorskim celicam, kar zmanjša možnost pojava neželenih stranskih učinkov, s tem pa se bolniku omogoči boljša kakovost življenja med in po zdravljenju. Dosedanje raziskave na področju NS so temeljile na injiciranju nanodelcev v krvni obtok. Ker pa ob vnosu nanodelcev v telo prihaja do medsebojnega delovanja NS s celicami imunskega sistema, jih te, še preden lahko nanodelci dostavijo zdravila do željenega mesta, odstranijo s fagocitozo. Raziskovalca Jian Yang in Cheng Dong sta zato s svojo ekipo skušala razviti novo tehniko NS, ki problematiko reakcij med NS in makrofagi v bioloških sistemih odpravi tako, da makrofage uporablja kot nosilce nanodelcev do tumorskih celic. Rezultati so pokazali, da so lahko makrofagi uspešni nosilci nanodelcev ter da bi lahko bili NS takšnega tipa v prihodnosti uspešna metoda za zdravljenje številnih bolezni.

'''Špela Deučman: Raziskovanje vzrokov kronične zavrnitve presajenih pljuč'''

Pri presajenih organih je največja skrb zavrnitev, ki je lahko akutna ali kronična. Pri slednji presadek sčasoma izgubi funkcijo in odmre, kar lahko povzroči smrt prejemnika. Stopnja preživetja presaditve pljuč je nižja od vseh ostalih presaditev organov. Pri 50% pacientov se pojavi obliterantni bronhiolitis oz. BOS, ki je glavni razlog kronične zavrnitve pljuč. Namen raziskave je bil odkriti signalno pot med NFAT1 (transkripcijski faktor), β-cateninom (koregulator transkripcije), ATX (eksoencim) in LPA1 (receptor) oz. LPA (sporočevalec) ter predlagati potencialno terapevtsko vlogo LPA1 antagonistov ter ATX inhibitorjev z namenom, da bi preprečili BOS. Odkrili so pozitivno korelacijo ekspresije med β-cateninom in kolagenom I. Ker LPA prepreči razgradnjo aktivnega β-catenina in ker je za nastanek LPA odgovoren ATX, so raziskali mehanizme reguliranja ekspresije ATX. Ugotovili so, da ekspresijo ATX regulira transkripcijski faktor NFAT1. Znano je, da LPA povečuje znotrajcelično koncentracijo prostih Ca2+ ionov, ti pa so povezani z aktivacijo in jedrsko translokacijo NFAT1. To pomeni, da LPA regulira ekspresijo NFAT1 in posledično tudi ATX. Pri raziskovanju na miših so uporabili LPA1 antagoniste in ATX inhibitorje, ki so vidno zmanjšali napredek BOS.

TBK2017-seminar

2017-03-01T20:54:53Z

Špela Deučman: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||12.12.||12.12.||12.12.||r1||r2||r3
|-
| Nina Mezgec Mrzlikar || Regulacija gena DISC-1 kot potencialnega zdravila za shizofrenijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170105144339.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar || Emilija Bogatinova
|-
| Tina Turel || Povezanost retrovirusov z razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170112110840.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Katja Doberšek || Uroš Prešern || Nika Zaveršek
|-
| Sonja Gabrijelčič || Ribosomske mutacije spodbujajo razvoj odpornosti proti antibiotikom v okolju z več zdravilnimi učinkovinami ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170221110808.htm https://elifesciences.org/content/6/e20420 || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Mariša Cvitanič || Špela Supej || Tanja Zupan
|-
| Patrik Levačić || Prehrambni aditivi v sladkarijah ter žvečilnih gumijih lahko spremenijo funkcionalnost in strukturo prebavnih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170217012450.htm|| 28.02. || 03.03. || 06.03. || Ajda Krč || Lea Knez || Andrej Race
|-
| Nika Goršek ||Nove študije razkrivajo delovanje molekulske črpalke, ki izloča zdravila proti raku || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170224160629.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Adela Šajn || Maja Jankovič || Urška Košir
|-
| Dragana Savković || || || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Milica Janković || Luka Fratina || Martin Špendl
|-
| Hana Hiršman || || || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Ajda Godec || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik
|-
| Daria Latysheva || Mehanski raztezek sproži hitro delitev epitelijskih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170215131543.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Andreja Habič || Maja Vrabec || Ines Medved
|-
| Urška Zagorc || || || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar
|-
| Anja Černe || Presnova vodikovega peroksida in učinek farmakološkega askorbata na rakave celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170109134014.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Tina Turel || Katja Doberšek || Uroš Prešern
|-
| Barbara Slapnik || || || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič || Špela Supej
|-
| Jerneja Nimac || || || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Patrik Levačić || Ajda Krč || Lea Knez
|-
| Gašper Anton Komatar || || || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Nika Goršek || Adela Šajn || Maja Jankovič
|-
| Nadja Škafar || || || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Dragana Savković || Milica Janković || Luka Fratina
|-
| Anže Jenko || || || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Hana Hiršman || Ajda Godec || Anja Tavčar
|-
| Špela Deučman || Raziskovanje vzrokov kronične zavrnitve presajenih pljuč || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301105426.htm || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Daria Latysheva || Andreja Habič || Maja Vrabec
|-
| Luka Gregorič || || || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski
|-
| Jana Kotnik || || || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Anja Černe || Tina Turel || Katja Doberšek
|-
| Andrej Špenko || || || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič
|-
| Ana Maklin || || || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Jerneja Nimac || Patrik Levačić || Ajda Krč
|-
| Emilija Bogatinova || || || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek || Adela Šajn
|-
| Nika Zaveršek || || || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Nadja Škafar || Dragana Savković || Milica Janković
|-
| Tanja Zupan || || || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Anže Jenko || Hana Hiršman || Ajda Godec
|-
| Andrej Race || || || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Špela Deučman || Daria Latysheva || Andreja Habič
|-
| Urška Košir || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Luka Gregorič || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar
|-
| Martin Špendl || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Jana Kotnik || Anja Černe || Tina Turel
|-
| Nika Mikulič Vernik || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Andrej Špenko || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič
|-
| Ines Medved ||Kako lahko z zmanjšanim vnosom hrane upočasnimo proces staranja ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170213151306.htm || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Ana Maklin || Jerneja Nimac || Patrik Levačić
|-
| Urban Hribar || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek
|-
| Uroš Prešern || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Nika Zaveršek || Nadja Škafar || Dragana Savković
|-
| Špela Supej || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Tanja Zupan || Anže Jenko || Hana Hiršman
|-
| Lea Knez || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Andrej Race || Špela Deučman || Daria Latysheva
|-
| Maja Jankovič || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Urška Košir || Luka Gregorič || Urška Zagorc
|-
| Luka Fratina || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Martin Špendl || Jana Kotnik || Anja Černe
|-
| Anja Tavčar || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko || Barbara Slapnik
|-
| Maja Vrabec || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Ines Medved || Ana Maklin || Jerneja Nimac
|-
| Vesna Dimitrovski || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Urban Hribar || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar
|-
| Katja Doberšek || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Uroš Prešern || Nika Zaveršek || Nadja Škafar
|-
| Mariša Cvitanič || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Špela Supej || Tanja Zupan || Anže Jenko
|-
| Ajda Krč || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Lea Knez || Andrej Race || Špela Deučman
|-
| Adela Šajn || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Jankovič || Urška Košir || Luka Gregorič
|-
| Milica Janković || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Luka Fratina || Martin Špendl || Jana Kotnik
|-
| Ajda Godec || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko
|-
| Andreja Habič || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Vrabec || Ines Medved || Ana Maklin
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete v PubMed povezavi [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ tukaj]
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2017_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2017_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2017_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2017_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2017_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).'''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.