Wiki FKKT - User contributions [en]

Seminarji SB 2021/22

2022-05-16T21:39:06Z

Špela Kladnik:

V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_E._coli Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inžiniring_in_izkoriščanje_sintetične_alosterije_luciferaze_NanoLuc Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc] (Rebeka Dajčman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularen_RNA_interferenčni_sistem_za_regulacijo_multipleksnih_genov Modularen RNA interferenčni sistem za regulacijo multipleksnih genov] (Marko Pavleković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Označevanje_bioloških_celic_za_zanesljivo_celično_inženirstvo Označevanje bioloških celic za zanesljivo celično inženirstvo] (Neža Blaznik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_biosenzorjem_usmerjen_inžiniring_Cupriavidus_necator_H16_za_avtotrofno_proizvodnjo_manitola Z biosenzorjem usmerjen inženiring ''Cupriavidus necator'' H16 za avtotrofno proizvodnjo manitola] (Teo Nograšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CelloSelect_%E2%80%93_sinteti%C4%8Dna_celobiozna_presnovna_pot_za_izbor_stabilnih_transgenih_celi%C4%8Dnih_linij_CHO CelloSelect – sintetična celobiozna presnovna pot za izbor stabilnih transgenih celičnih linij CHO] (Nika Vegelj)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hipersensitiven_genetsko_kodiran_fluorescen%C4%8Dni_indikator_%28roGFP2-Prx1%29_za_kontinuirno_merjenje_znotrajceli%C4%8Dnega_H2O2_med_mikro-kultivacijo_celic#Literatura Hipersensitiven genetsko kodiran fluorescenčni indikator (roGFP2-Prx1) za kontinuirno merjenje znotrajceličnega H2O2 med mikro-kultivacijo celic] (Eva Kanalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zasnova_in_karakterizacija_s_salicilno_kislino_induciranega_genskega_ekspresijskega_sistema_za_celice_Jurkat Zasnova in karakterizacija s salicilno kislino induciranega genskega ekspresijskega sistema za celice Jurkat] (Tina Arnšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_sinteti%C4%8Dni_kromosomi_kot_novo_orodje_za_in%C5%BEenirstvo_metabolizma Modularni sintetični kromosomi kot novo orodje za inženirstvo metabolizma] (Špela Kladnik)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OpenPlast_-_kloroplastni_brezcelični_sistemi_za_hitrejšo_karakterizacijo_genetskih_delov OpenPlast - kloroplastni brezcelični sistemi za hitrejšo karakterizacijo genetskih delov] (Kim Glavič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana PHEAST - ''P. pastoris'' za odstranjevanje metana] (Ana Potočnik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ELIXIO_-Mikrobni_konzorcij_za_vonj_po_vijolicah ELIXIO Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah] (Ajda Godec) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Agrobactory_593_-_Modularna_bakterijska_platforma_za_pripravo_biopesticidov Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidev] (Tim Nograšek) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CyaSalt_-_metoda_za_razsoljevanje_morskih_voda] (Michelle Oletič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PRYSM_-_s svetlobo regulirane kvasovke PRYSM_-_s svetlobo regulirane kvasovke] (Nika Malečkar)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Modularni sintetični kromosomi kot novo orodje za inženirstvo metabolizma

2022-05-16T21:35:55Z

Špela Kladnik: New page: == Modularni sintetični kromosomi kot novo orodje za inženirstvo metabolizma == Izhodiščni članek:[https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1096717621001993 Modular, sy...

== Modularni sintetični kromosomi kot novo orodje za inženirstvo metabolizma ==

Izhodiščni članek:[https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1096717621001993 Modular, synthetic chromosomes as new tools for large scale engineering of metabolism]

'''Uvod'''

Za konstruiranje efektivnih in še bolj sposobnih celic se je včasih treba poslužiti intenzivnega genskega inženiringa. S tem se lahko celicam v genski zapis doda zapis za neko funkcijo oziroma se pripiše opravljanje dodatnih funkcij, lahko pa se tudi preoblikuje že obstoječe naravne metabolične poti. Ker so želeli to področje še dodatno raziskati, so naredili študijo o uporabi sintetičnih neokromosomov, z njo pa so dokazali, da je izvedljivo reprogramirati genom s pomočjo modularnih, sintetičnih, specializiranih ''de-novo'' sestavljenih kromosomov. Študijo so izvedli s kvasovkami (''Saccharomyces cerevisiae''). Izdelati so želeli t.i. NeoChrs, s katerimi bi raziskali koncept zamenjave oziroma optimizacije metabolične poti, s tem da bi določene gene reducirali ali pa jih združili. S tem bi se zmanjšalo število potrebnih genov, ki bi jih lahko relokalizirali na en sam kromosomski lokus, povzročili pa bi remodeliranje celotne presnovne poti.[1]

S pomočjo teh sintetiziranih kromosomov so sestavili mikrobno celično tovarno za ''de-novo'' proizvodnjo antocianinov. [1] Tako imenovane mikrobne celične tovarne so združba bakterij in gliv, ki lahko proizvajajo različne naravne produkte, kakor je recimo biodiesel, razna naravna zdravila, karoten in še drugi. Mikroorganizmi so namreč pod določenimi pogoji zelo efektivni, kar se tiče bioprocesiranja raznih snovi. Napredek v genetskih tehnikah in v optimizaciji procesov dandanes vodi k izboljšanju biosintez naravnih proizvodov, kar je koristno pri izboljšanju sestavin s številnimi aplikacijami v živilih, kozmetiki ter v medicini za zdravila. [1] [2]

Mikrobne celične tovarne imajo sicer velik potencial za trajnostno proizvodnjo, ampak so iz ekonomskega vidika bolj potratne kakor zahtevni kemijski procesi. Da bi se izboljšalo učinkovitost glede na stroške, bi bilo potrebno spremeniti proces, s tem pa bi se doseglo boljše izkoristke. To je mogoče doseči samo z genskim inženiringom mikrobnih gostiteljskih celic, kjer je poudarek na transplantaciji novih funkcij in urejanju metabolnih mrež, kamor se te nove funkcije vključi. Sam postopek predstavlja kar velik izziv, sploh pri delu z nekaterimi evkariontskimi celičnimi tovarnami, kjer je nekodirajočega genetskega materiala kar precej.[1]

Zamenjave presnovnih poti bi lahko bile v biotehnoloških reakcijah precejšnje, saj bi s tem omogočale močno reprogramiranje metabolizma celičnih tovarn. Pa vendar bi to pomenilo, da se integrira (vključi) več sto genov na obstoječih kromosomih, kar bi lahko vodilo do genetske nestabilnosti. Ta problem bi se dalo rešiti z uporabo ''de-novo'' sintetičnih kromosomov (NeoChrs), ki bi služili kot “ekspresijska platfoma” za remodeliranje genov. NeoChrs posnemajo naravne kromosome glede mitotske sposobnosti in glede genetskega zapisa, možno je prilagoditi tudi število kopij in neškodljivost za gostitelja, vse to pa se ureja s pomočjo CRISPR/Cas9 metode za urejanje DNA.
V študiji so natančneje raziskovali proces proizvodnje antocianina pelargonidin-3-O-glukozida iz glukoze (P3G), ki je industrijsko in živilsko barvilo. Tega poskusa so se lotili kljub temu, da je bilo dokazano, da je proizvodnja antocianinov v ''S. cerevisiae'', v doslej uporabljenih mikrobnih platformah, neučinkovita. P3G je zelo ustrezna paradigma (vzorec delovanja) za prikaz potenciala neokromosomov v metaboličnem inženiringu. Izdelani so bili neokromosomi v linearni in krožni obliki, ki so vsebovali avtohtone kvasovke, bakterijske in rastlinske gene, potrebne za sintezo P3G. [1]

'''Rezultati'''

Izdelali so kromosome, ki bi omogočili ekspresijo genov iz kvasovk, bakterij in rastlin, potrebnih za produkcijo P3G. Prekurzorja za P3G sintezo v kvasovkah sta L-tirozin in L-fenilalanin. Za de-novo sintezo P3G iz glukoze je pomembna pentoznofosfatna pot (PPP), sinteza citosolnega acetil-CoA in malonil-CoA ter sinteza (aromatskih) aminokislin. Geni, ki kodirajo za encime v teh omenjenih poteh so razpršeni po 16 različnih kromosomih kvasovk. [1]

Uporabljen sev, SwYG, ima samo en lokus, minimizirano pot glikolize in fermentacije (13 genov, vključenih v pretvorbo glukoze v etanol). Ta sev je bil potem preoblikovan z redukcijo PPP poti (odstranjeni 4 paralogi), cilj je bil da bi se spremenilo lokacijo genov, ki zapisujejo za glikolizo, fermentacijo etanola in PPP iz nativnih kromosomov na NeoChrs. ''S. cerevisiae'' ima precej strogo regulirano biosintezo aminokislin, zato so za večjo sintezo Tyr in Phe za sintezo P3G potrebne celotne poti za sintezo aminokislin iz ''E. Coli'' (10 genov). Pri proizvodnji flavonoidov so neželeni stranski produkti fuzelni alkoholi in kisline, zato je treba odstraniti 2-oksokislinske dekarboksilaze, ki so odgovorne za proizvodnjo teh stranskih produktov.[1]

Če povzamemo, so sintetizirali NeoChrs za sintezo P3G, ti sintetični kromosomi pa so bili mišljeni kot ekspresijska platforma za glikolitične, fermentativne in pentoznofosfatne poti (20 genov), tudi za biosintezo aminokislin (10 genov) in vključenih je bilo 11 genov iz rastlin, ki imajo vlogo pri sintezi P3G iz Tyr in Phe. Homologija sintetičnih kromosomov NeoChr je bila omejena na minimum, da bi se preprečilo neželene rekombinacije. Pri sintezi NeoChr so morali paziti še na prostorsko organiziranost. Geni za glikolizo, PPP, fermentacijo in sintezo aromatskih aminokislin so bili združeni. Transkripcijske enote so bile od teh ločene z 5kb dolgimi nekodirajočimi fragmenti DNA iz ''E. Coli'', da ni prišlo do utišanja genov.[1]

NeoChr so sestavili v dveh korakih. V prvem koraku so sintetizirali 100kb velike krožne kromosome in linearne kromosome, v drugem koraku pa so bili integrirani geni za sintezo antacianinov iz rastlin. Vzeli so 11 antocianinskih genov iz Arabidopsis thaliana ter Rhodo bacter capsulaus in jih integrirali v neokromosome. [1]

Na koncu so naredili več sevov (označeni z IFMXXX; XXX so bile številke), katerih učinkovitost so preverjali v prezračenih bioreaktorjih z nadzorovanim pH. Pri končnih analizah so primerjali seve IMF41, IMF42 in IMF48. Pri sevu IMF41 so sintetizirali krožni kromosom, IMF42 je bil linearni, pri sevu IMF48 pa so že uredili DNA s pomočjo CRISPR/Cas9. Ta sev je imel 8 dodatnih kopij gena coAtCHS3 in okvarjen coAtANS. Struktura NeoChrs v IMF41 in IMF42 ni vplivala niti na fiziologijo kvasovk, niti na tvorbo flavonoidov, oba imata samo eno kopijo coAtCHS3 in okrnjen coAtANS. IMF48 je bil boljši, proizvedel je 14-krat več flovonoidov, precej večja je bila tudi proizvodnja metabolitov za AtANS (truncated anthocyanidin synthase AtAns). IFM48 je proizvedel zunajcelični P3G, medtem ko ga IFM41 in IFM42 nista. Pri IFM48 je bil delež flavonoidov v aromatskih spojinah 15%, pri IFM41 in IFM42 pa samo 2%. [1]

'''Zaključek'''

Predstavljena študija prikazuje, da je potencial ''S. cerevisiae'' za hitrejše in intenzivnejše remodeliranje genoma, preko sintetiziranih kromosomov, dober. Sinteza specializiranih kromosomov je dokaj enostavna in hitra. NeoChr kromosomi dobro posnemajo naravne kromosome (oziroma so dovolj podobni in ustrezni), kar se tiče replikacije in segregacije. Njihovo vzdrževanje je enostavno, prav tako pa niso toksični za gostiteljski organizem, zato bi bili uporabni v genskem inženiringu.[1]

Te modifikacije so omogočile sintezo antocianinov iz glukoze, kar je tudi prvič, da se je P3G sintetiziral zunajcelično (prvi zapis o produkciji zunajceličnega P3G) v kvasovkah. NeoChrs niso samo služili konstrukciji seva in remodeliranju genoma, ampak so tudi preprečili interference z naravnimi/nativnimi kromosomi. [1]

V svoji trenutni zasnovi so neokromosomi zelo uporabni (neškodljivi za gostitelja, nosijo veliko informacij na krajšem zaporedju), se pa še vedno poraja vprašanje kakšen bi bil optimalen načrt za sintezo neokromosomov. ''In vivo'' lahko pride do neželene homologne rekombinacije, čeprav so bili NeoChr pri testiranju stabilni. V tej študiji so zato tudi testirali, da bi naredili DNA dele kar se da “homology-free” (težko, saj je malo, omejeno število močnih, konstitutivnih promotorjev), zato so implementirali promotorje sorodnih vrst '' S. cerevisiae''. Homologija je bila kljub temu še vedno približno 75%, tako da bi v prihodnosti lahko poskusili z uporabo promotorjev, ki niso sorodni. [1]

Sintetizirani neokromosomi bi bili torej uporabni za optimizacijo procesov v mikrobnih celičnih tovarnah, saj bi bili specializirani in bi lahko targetirali točno določene metabolične poti. [1]

'''Literatura'''

[1] E. D. Postma, E. J. Hassing, V. Mangkusaputra, J. Geelhoed, P. de la Torre, M. van den Broek, C. Mooiman, M. Pabst, J. M. Daran, P. Daran-Lapujade: Modular, Synthetic Chromosomes as New Tools for Large Scale Engineering of Metabolism. Metab. Eng. 2022, 72, 1–13.

[2] M. H. Hussain, M. Z. Mohsin, W. Q. Zaman, J. Yu, X. Zhao, Y. Wei, Y. Zhuang, A. Mohsin, M. Guo: Multiscale Engineering of Microbial Cell Factories: A Step Forward towards Sustainable Natural Products Industry. Synth. Syst. Biotechnol. 2022, 7, 586–601.

Talk:Seminarji SB 2021/22

2022-05-16T21:27:20Z

Špela Kladnik: Removing all content from page

Talk:Seminarji SB 2021/22

2022-05-16T21:21:47Z

Špela Kladnik: New page: == '''Modularni sintetični kromosomi kot novo orodje za inženirstvo metabolizma''' == Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1096717621001993 Mod...

== '''Modularni sintetični kromosomi kot novo orodje za inženirstvo metabolizma''' ==

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1096717621001993 Modular, synthetic chromosomes as new tools for large scale engineering of metabolism]

'''Uvod'''

Za konstruiranje efektivnih in še bolj sposobnih celic se je včasih treba poslužiti intenzivnega genskega inženiringa. S tem se lahko celicam v genski zapis doda zapis za neko funkcijo oziroma se pripiše opravljanje dodatnih funkcij, lahko pa se tudi preoblikuje že obstoječe naravne metabolične poti. Ker so želeli to področje še dodatno raziskati, so naredili študijo o uporabi sintetičnih neokromosomov, z njo pa so dokazali, da je izvedljivo reprogramirati genom s pomočjo modularnih, sintetičnih, specializiranih ''de-novo''-sestavljenih kromosomov. Študijo so izvedli s kvasovkami (''Saccharomyces cerevisiae''). Izdelati so želeli t.i. NeoChrs, s katerimi bi raziskali koncept zamenjave oziroma optimizacije metabolične poti, s tem da bi določene gene reducirali ali pa jih združili. S tem bi se zmanjšalo število potrebnih genov, ki bi jih lahko relokalizirali na en sam kromosomski lokus, povzročili pa bi remodeliranje celotne presnovne poti.[1]

S pomočjo teh sintetiziranih kromosomov so sestavili mikrobno celično tovarno za ''de-novo'' proizvodnjo antocianinov. [1] Tako imenovane mikrobne celične tovarne so združba bakterij in gliv, ki lahko proizvajajo različne naravne produkte, kakor je recimo biodiesel, razna naravna zdravila, karoten in še drugi. Mikroorganizmi so namreč pod določenimi pogoji zelo efektivni, kar se tiče bioprocesiranja raznih snovi. Napredek v genetskih tehnikah in v optimizaciji procesov dandanes vodi k izboljšanju biosintez naravnih proizvodov, kar je koristno pri izboljšanju sestavin s številnimi aplikacijami v živilih, kozmetiki ter v medicini za zdravila. [1] [2]

Mikrobne celične tovarne imajo sicer velik potencial za trajnostno proizvodnjo, ampak so iz ekonomskega vidika bolj potratne kakor zahtevni kemijski procesi. Da bi se izboljšalo učinkovitost glede na stroške, bi bilo potrebno spremeniti proces, s tem pa bi se doseglo boljše izkoristke. To je mogoče doseči samo z genskim inženiringom mikrobnih gostiteljskih celic, kjer je poudarek na transplantaciji novih funkcij in urejanju metabolnih mrež, kamor se te nove funkcije vključi. Sam postopek predstavlja kar velik izziv, sploh pri delu z nekaterimi evkariontskimi celičnimi tovarnami, kjer je nekodirajočega genetskega materiala kar precej.[1]

Zamenjave presnovnih poti bi lahko bile v biotehnoloških reakcijah precejšnje, saj bi s tem omogočale močno reprogramiranje metabolizma celičnih tovarn. Pa vendar bi to pomenilo, da se integrira (vključi) več sto genov na obstoječih kromosomih, kar bi lahko vodilo do genetske nestabilnosti. Ta problem bi se dalo rešiti z uporabo ''de-novo'' sintetičnih kromosomov (NeoChrs), ki bi služili kot “ekspresijska platfoma” za remodeliranje genov. NeoChrs posnemajo naravne kromosome glede mitotske sposobnosti in glede genetskega zapisa, možno je prilagoditi tudi število kopij in neškodljivost za gostitelja, vse to pa se ureja s pomočjo CRISPR/Cas9 metode za urejanje DNA.
V študiji so natančneje raziskovali proces proizvodnje antocianina pelargonidin-3-O-glukozida iz glukoze (P3G), ki je industrijsko in živilsko barvilo. Tega poskusa so se lotili kljub temu, da je bilo dokazano, da je proizvodnja antocianinov v ''S. cerevisiae'', v doslej uporabljenih mikrobnih platformah, neučinkovita. P3G je zelo ustrezna paradigma (vzorec delovanja) za prikaz potenciala neokromosomov v metaboličnem inženiringu. Izdelani so bili neokromosomi v linearni in krožni obliki, ki so vsebovali avtohtone kvasovke, bakterijske in rastlinske gene, potrebne za sintezo P3G. [1]

'''Rezultati'''

Izdelali so kromosome, ki bi omogočili ekspresijo genov iz kvasovk, bakterij in rastlin, potrebnih za produkcijo P3G. Prekurzorja za P3G sintezo v kvasovkah sta L-tirozin in L-fenilalanin. Za ''de-novo'' sintezo P3G iz glukoze je pomembna pentoznofosfatna pot (PPP), sinteza citosolnega acetil-CoA in malonil-CoA ter sinteza (aromatskih) aminokislin. Geni, ki kodirajo za encime v teh omenjenih poteh so razpršeni po 16 različnih kromosomih kvasovk. [1]

Uporabljen sev, SwYG, ima samo en lokus, minimizirano pot glikolize in fermentacije (13 genov, vključenih v pretvorbo glukoze v etanol). Ta sev je bil potem preoblikovan z redukcijo PPP poti (odstranjeni 4 paralogi), cilj je bil da bi se spremenilo lokacijo genov, ki zapisujejo za glikolizo, fermentacijo etanola in PPP iz nativnih kromosomov na NeoChrs. ''S. cerevisiae'' ima precej strogo regulirano biosintezo aminokislin, zato so za večjo sintezo Tyr in Phe za sintezo P3G potrebne celotne poti za sintezo aminokislin iz ''E. Coli'' (10 genov). Pri proizvodnji flavonoidov so neželeni stranski produkti fuzelni alkoholi in kisline, zato je treba odstraniti 2-oksokislinske dekarboksilaze, ki so odgovorne za proizvodnjo teh stranskih produktov.[1]

Če povzamemo, so sintetizirali NeoChrs za sintezo P3G, ti sintetični kromosomi pa so bili mišljeni kot ekspresijska platforma za glikolitične, fermentativne in pentoznofosfatne poti (20 genov), tudi za biosintezo aminokislin (10 genov) in vključenih je bilo 11 genov iz rastlin, ki imajo vlogo pri sintezi P3G iz Tyr in Phe. Homologija sintetičnih kromosomov NeoChr je bila omejena na minimum, da bi se preprečilo neželene rekombinacije. Pri sintezi NeoChr so morali paziti še na prostorsko organiziranost. Geni za glikolizo, PPP, fermentacijo in sintezo aromatskih aminokislin so bili združeni. Transkripcijske enote so bile od teh ločene z 5kb dolgimi nekodirajočimi fragmenti DNA iz ''E. Coli'', da ni prišlo do utišanja genov.[1]

NeoChr so sestavili v dveh korakih. V prvem koraku so sintetizirali 100kb velike krožne kromosome in linearne kromosome, v drugem koraku pa so bili integrirani geni za sintezo antacianinov iz rastlin. Vzeli so 11 antocianinskih genov iz ''Arabidopsis thaliana'' ter ''Rhodo bacter capsulaus'' in jih integrirali v neokromosome. [1]

Na koncu so naredili več sevov (označeni z IFMXXX; XXX so bile številke), katerih učinkovitost so preverjali v prezračenih bioreaktorjih z nadzorovanim pH. Pri končnih analizah so primerjali seve IMF41, IMF42 in IMF48. Pri sevu IMF41 so sintetizirali krožni kromosom, IMF42 je bil linearni, pri sevu IMF48 pa so že uredili DNA s pomočjo CRISPR/Cas9. Ta sev je imel 8 dodatnih kopij gena coAtCHS3 in okvarjen coAtANS. Struktura NeoChrs v IMF41 in IMF42 ni vplivala niti na fiziologijo kvasovk, niti na tvorbo flavonoidov, oba imata samo eno kopijo coAtCHS3 in okrnjen coAtANS. IMF48 je bil boljši, proizvedel je 14-krat več flavonoidov, precej večja je bila tudi proizvodnja metabolitov za AtANS (truncated anthocyanidin synthase AtAns). IFM48 je proizvedel zunajcelični P3G, medtem ko ga IFM41 in IFM42 nista. Pri IFM48 je bil delež flavonoidov v aromatskih spojinah 15%, pri IFM41 in IFM42 pa samo 2%. [1]

'''Zaključek'''

Predstavljena študija prikazuje, da je potencial ''S. cerevisiae'' za hitrejše in intenzivnejše remodeliranje genoma, preko sintetiziranih kromosomov, dober. Sinteza specializiranih kromosomov je dokaj enostavna in hitra. NeoChr kromosomi dobro posnemajo naravne kromosome (oziroma so dovolj podobni in ustrezni), kar se tiče replikacije in segregacije. Njihovo vzdrževanje je enostavno, prav tako pa niso toksični za gostiteljski organizem, zato bi bili uporabni v genskem inženiringu.[1]

Te modifikacije so omogočile sintezo antocianinov iz glukoze, kar je tudi prvič, da se je P3G sintetiziral zunajcelično (prvi zapis o produkciji zunajceličnega P3G) v kvasovkah. NeoChrs niso samo služili konstrukciji seva in remodeliranju genoma, ampak so tudi preprečili interference z naravnimi/nativnimi kromosomi. [1]

V svoji trenutni zasnovi so neokromosomi zelo uporabni (neškodljivi za gostitelja, nosijo veliko informacij na krajšem zaporedju), se pa še vedno poraja vprašanje kakšen bi bil optimalen načrt za sintezo neokromosomov. ''In vivo'' lahko pride do neželene homologne rekombinacije, čeprav so bili NeoChr pri testiranju stabilni. V tej študiji so zato tudi testirali, da bi naredili DNA dele kar se da “homology-free” (težko, saj je malo, omejeno število močnih, konstitutivnih promotorjev), zato so implementirali promotorje sorodnih vrst ''S. cerevisiae''. Homologija je bila kljub temu še vedno približno 75%, tako da bi v prihodnosti lahko poskusili z uporabo promotorjev, ki niso sorodni. [1]

Sintetizirani neokromosomi bi bili torej uporabni za optimizacijo procesov v mikrobnih celičnih tovarnah, saj bi bili specializirani in bi lahko targetirali točno določene metabolične poti. [1]

'''Literatura'''

[1] E. D. Postma, E. J. Hassing, V. Mangkusaputra, J. Geelhoed, P. de la Torre, M. van den Broek, C. Mooiman, M. Pabst, J. M. Daran, P. Daran-Lapujade: Modular, Synthetic Chromosomes as New Tools for Large Scale Engineering of Metabolism. Metab. Eng. 2022, 72, 1–13.

[2] M. H. Hussain, M. Z. Mohsin, W. Q. Zaman, J. Yu, X. Zhao, Y. Wei, Y. Zhuang, A. Mohsin, M. Guo: Multiscale Engineering of Microbial Cell Factories: A Step Forward towards Sustainable Natural Products Industry. Synth. Syst. Biotechnol. 2022, 7, 586–601.