Wiki FKKT - User contributions [en]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-06T06:26:54Z

Žiga Vičič: /* Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

==Uravnavanje virulenčnih faktorjev kodiranih v profagih z sRNA==

''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. Primer take sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med ''afaABCD'' in ''afaE'' transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za ''afaD'' in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

==Uravnavanje toksinov kodiranih v profagih z sRNA==

Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

==Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu==

Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu ''D''-ksilose (XylR), ter transporterja piruvat kinaze A (PykA) in manoze (ManX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (FliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA ''fliC'', ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

==Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma==

Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval ''dppA'' mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

==Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu==

Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v litični cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja gena ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira cI represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

==Fagni proteini, ki vplivajo na posttranskripcijsko regulacijo v gostiteljski celici==

Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se začnejo povečano prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA helikaze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

==Viri==

<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-06T06:19:04Z

Žiga Vičič: /* Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

==Uravnavanje virulenčnih faktorjev kodiranih v profagih z sRNA==

''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. Primer take sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med ''afaABCD'' in ''afaE'' transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za ''afaD'' in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

==Uravnavanje toksinov kodiranih v profagih z sRNA==

Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

==Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu==

Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu ''D''-ksilose (XylR), ter transporterja piruvat kinaze A (PykA) in manoze (ManX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (FliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA ''fliC'', ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

==Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma==

Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval ''dppA'' mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

==Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu==

Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v litični cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja gena ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

==Fagni proteini, ki vplivajo na posttranskripcijsko regulacijo v gostiteljski celici==

Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se začnejo povečano prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA helikaze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

==Viri==

<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-05T18:45:11Z

Žiga Vičič: /* Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

==Uravnavanje virulenčnih faktorjev kodiranih v profagih z sRNA==

''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. Primer take sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med ''afaABCD'' in ''afaE'' transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za ''afaD'' in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

==Uravnavanje toksinov kodiranih v profagih z sRNA==

Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

==Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu==

Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu ''D''-ksilose (XylR), ter transporterja piruvat kinaze A (PykA) in manoze (ManX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (FliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA ''fliC'', ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

==Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma==

Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval ''dppA'' mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

==Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu==

Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja gena ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

==Fagni proteini, ki vplivajo na posttranskripcijsko regulacijo v gostiteljski celici==

Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se začnejo povečano prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA helikaze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

==Viri==

<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-05T18:44:37Z

Žiga Vičič: /* Fagni proteini, ki vplivajo na posttranskripcijsko regulacijo v gostiteljski celici */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

==Uravnavanje virulenčnih faktorjev kodiranih v profagih z sRNA==

''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. Primer take sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med ''afaABCD'' in ''afaE'' transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za ''afaD'' in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

==Uravnavanje toksinov kodiranih v profagih z sRNA==

Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

==Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu==

Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu ''D''-ksilose (XylR), ter transporterja piruvat kinaze A (PykA) in manoze (ManX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (FliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA ''fliC'', ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

==Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma==

Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval ''dppA'' mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

==Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu==

Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja gena ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavigne, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

==Fagni proteini, ki vplivajo na posttranskripcijsko regulacijo v gostiteljski celici==

Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se začnejo povečano prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA helikaze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

==Viri==

<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-05T14:56:03Z

Žiga Vičič: /* Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

==Uravnavanje virulenčnih faktorjev kodiranih v profagih z sRNA==

''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. Primer take sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med ''afaABCD'' in ''afaE'' transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za ''afaD'' in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

==Uravnavanje toksinov kodiranih v profagih z sRNA==

Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

==Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu==

Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu ''D''-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

==Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma==

Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval ''dpp'' mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

==Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu==

Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja gena ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavigne, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

==Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici==

Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se začnejo povečano prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA helikaze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

==Viri==

<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-05T14:51:29Z

Žiga Vičič: /* Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

==Uravnavanje virulenčnih faktorjev kodiranih v profagih z sRNA==

''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. Primer take sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med ''afaABCD'' in ''afaE'' transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za ''afaD'' in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

==Uravnavanje toksinov kodiranih v profagih z sRNA==

Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

==Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu==

Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu ''D''-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

==Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma==

Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval ''dpp'' mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

==Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu==

Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja gena ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

==Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici==

Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se začnejo povečano prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA helikaze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

==Viri==

<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-05T14:49:30Z

Žiga Vičič: /* Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

==Uravnavanje virulenčnih faktorjev kodiranih v profagih z sRNA==

''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. Primer take sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med ''afaABCD'' in ''afaE'' transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za ''afaD'' in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

==Uravnavanje toksinov kodiranih v profagih z sRNA==

Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

==Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu==

Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu ''D''-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

==Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma==

Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval ''dpp'' mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

==Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu==

Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

==Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici==

Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se začnejo povečano prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA helikaze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

==Viri==

<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-05T11:35:26Z

Žiga Vičič: /* Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

==Uravnavanje virulenčnih faktorjev kodiranih v profagih z sRNA==

''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. Primer take sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med ''afaABCD'' in ''afaE'' transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za ''afaD'' in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

==Uravnavanje toksinov kodiranih v profagih z sRNA==

Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

==Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu==

Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu ''D''-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

==Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma==

Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval ''dpp'' mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

==Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu==

Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

==Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici==

Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se začnejo povečano prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA helikaze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

==Viri==

<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T19:19:08Z

Žiga Vičič:

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

==Uravnavanje virulenčnih faktorjev kodiranih v profagih z sRNA==

''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. Primer take sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med ''afaABCD'' in ''afaE'' transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za ''afaD'' in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

==Uravnavanje toksinov kodiranih v profagih z sRNA==

Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

==Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu==

Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu ''D''-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

==Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma==

Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

==Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu==

Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

==Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici==

Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se začnejo povečano prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA helikaze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

==Viri==

<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T19:14:53Z

Žiga Vičič: /* Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

==Uravnavanje virulenčnih faktorjev kodiranih v profagih z sRNA==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. Primer take sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med ''afaABCD'' in ''afaE'' transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za ''afaD'' in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

==Uravnavanje toksinov kodiranih v profagih z sRNA==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

==Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu ''D''-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

==Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

==Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

==Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se začnejo povečano prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA helikaze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

==Viri==
<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T19:14:32Z

Žiga Vičič: /* Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

==Uravnavanje virulenčnih faktorjev kodiranih v profagih z sRNA==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. Primer take sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med ''afaABCD'' in ''afaE'' transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za ''afaD'' in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

==Uravnavanje toksinov kodiranih v profagih z sRNA==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

==Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu ''D''-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

==Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

==Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

==Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se začnejo povečano prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

==Viri==
<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T19:13:09Z

Žiga Vičič: /* Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

==Uravnavanje virulenčnih faktorjev kodiranih v profagih z sRNA==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. Primer take sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med ''afaABCD'' in ''afaE'' transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za ''afaD'' in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

==Uravnavanje toksinov kodiranih v profagih z sRNA==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

==Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu ''D''-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

==Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

==Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

==Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

==Viri==
<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T19:13:02Z

Žiga Vičič: /* Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

==Uravnavanje virulenčnih faktorjev kodiranih v profagih z sRNA==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. Primer take sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med ''afaABCD'' in ''afaE'' transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za ''afaD'' in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

==Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

==Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu ''D''-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

==Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

==Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

==Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

==Viri==
<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T19:10:33Z

Žiga Vičič: /* Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

==Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. Primer take sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med ''afaABCD'' in ''afaE'' transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za ''afaD'' in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

==Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

==Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu ''D''-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

==Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

==Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

==Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

==Viri==
<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:41:38Z

Žiga Vičič: /* Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

==Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. Primer take sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med ''afaABCD'' in ''afaE'' transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za ''afaD'' in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

==Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

==Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

==Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

==Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

==Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

==Viri==
<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:40:02Z

Žiga Vičič: /* Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

==Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. Primer take sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med ''afaABCD'' in ''afaE'' transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za ''afaD'' in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

==Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

==Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

==Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

==Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

==Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

==Viri==
<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:37:45Z

Žiga Vičič: /* Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

==Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. Primer take sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med ''afaABCD'' in ''afaE'' transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za ''afaD'' in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

==Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

==Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu (kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

==Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

==Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

==Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

==Viri==
<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:37:26Z

Žiga Vičič: /* Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

==Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. Primer take sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med ''afaABCD'' in ''afaE'' transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

==Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

==Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu (kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

==Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

==Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

==Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

==Viri==
<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:37:04Z

Žiga Vičič: /* Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

==Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. Primer take sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

==Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

==Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu (kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

==Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

==Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

==Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

==Viri==
<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:35:52Z

Žiga Vičič:

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

==Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

==Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

==Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu (kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

==Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

==Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

==Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

==Viri==
<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:34:53Z

Žiga Vičič:

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

===Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA===
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

===Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA===
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

===Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu===
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu (kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

===Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma===
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

===Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu===
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

===Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici===
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

===Viri===
<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:32:58Z

Žiga Vičič:

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu (kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Bakteriofagi

2020-05-04T18:27:39Z

Žiga Vičič:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2019/20 obravnavajo različne vidike bakteriofagov, od njihove zgradbe in delovanja, do vloge v okolju in izrabe za zdravljenje. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si oglejte prosojnice v spletni učilnici - 3. teden marca. V okviru posameznih glavnih poglavij lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti (lahko tudi dva, če pa bi kakšno temo na vsak način rad obdelal en sam, mi prej pišite, da se pogovorimo glede vsebine in obsega). Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200-1800 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga 15-20 minut, temu pa bo sledila razprava (pribl. 5 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite le malo splošnega uvoda, ki naj ima za nalogo, da umesti vašo temo v kontekst problematike bakteriofagov.

Predvidena umestitev seminarjev v semestru je razvidna iz spletne učilnice, a zaenkrat ni mogoče zagotovo reči, da ne bo kakšnih sprememb zaradi ukrepov proti širjenju koronavirusa.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. 10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).

Spodnji seznam vključuje povezave do nekaterih preglednih člankov iz zadnjega obdobja, ki jih lahko uporabite za osnovo pri pripravi. Večinoma pa navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili 15-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro en za drugim - predvidoma po 8 na teden), tako da boste osnove hitro osvojili in jih ni treba ponavljati.

Poglavja za seminarje so:

'''STRUKTURA IN DELOVANJE FAGOV''' 
https://www.intechopen.com/books/bacteriophages-perspectives-and-future/bacteriophages-their-structural-organisation-and-function (poglavje, 2019) 
1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov 
2. Struktura kapsid in prokapsid 
3. Struktura konektorjev in repov 
4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6416446/ (pregledni, 2019) 
5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6209105/ (pregledni, 2018) 
6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1879625718300142?via% 
(pregledni, 2018) 
7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1570963919301888?via% 
(pregledni, 2020) 
8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave 

'''INTERAKCIJE in EKOLOGIJA''' 

https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm (pregledni, 2019) 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29523063 
9. Interakcija faga z bakterijo 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X19300031 (pregledni, 2019) 
10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi 

https://www.mdpi.com/2076-0817/8/3/100/htm (pregledni, 2019) 
11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (brez človeka - to je predhodna tema) 

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/08927014.2019.1613525 in https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32125643 
(pregledni, 2019+2020) 
12. Delovanje fagov na heterogene biofilme 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0966842X19300599?via% 
(pregledni, 2019) 
13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom 

https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11274-013-1358-5 (pregledni, 2013) 
14. Cianofagi 

'''UPORABA BAKTERIOFAGOV''' 

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2019.00513/full (pregledni, 2019) 
15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb 
16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh 
17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5371805/ 
(pregledni, 2017 - samo kratko poglavje o uporabi na rastlinah) 
18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0160412019305410 (pregledni, 2019) 
19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti 

https://www.aimspress.com/fileOther/PDF/microbiology/microbiol-05-04- 
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S095816691930093X?via%3Dihub 
(pregledni, 2019 + 2020) 
20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih 

https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm 
in https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166919301296?via%3Dihub 
(pregledni, 2019 + 2020) 
21. Biotehnološka izraba fagov 

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju.
Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.

0. Analiza bakteriofagov v smrekovem gozdu (Jana Dolenc, Tilen Deželak, Sonja Mavrič) 

1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov 
2. Struktura kapsid in prokapsid 
3. Struktura konektorjev in repov 
4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov 
5. [[Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda]] (Kim Glavič, Nastja Feguš, Nina Varda) 
6. [[Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni]] (Žiga Vičič, Dunia Sahir, Maja Globočnik) 
7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina (Anja Konjc, Tina Logonder, Manca Osolin) 
8. [[Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave]] (Tina Arnšek, Ana Babnik, Greta Junger) 
9. Interakcija faga z bakterijo (Anastasija Nechevska, Marjeta Milostnik, Ana Vičič) 
10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi (Michelle Oletič, Nika Vegelj, Rebeka Dajčman) 
11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (Lena Trnovec, Maja Kolar, Liza Praznik) 
12. Delovanje fagov na heterogene biofilme 
13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom (Žan Fortuna, Tevž Levstek, Lara Drinovec) 
14. Cianofagi (Timotej Zgonik, ) 
15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb (Maša Gabrič, Maša Andoljšek, Vivian Nemanič) 
16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh(Tim Nograšek, Jure Povšin, Sašo Jakob) 
17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje (Maja Mahorič, Ana Potočnik, Maja Trifkovič) 
18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin (Tanja Janko, Špela Šubelj in Matic Krivec) 
19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti 
20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih (Tadej Uršič, Teo Nograšek, Oskar Nemec) 
21. Biotehnološka izraba fagov 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:27:02Z

Žiga Vičič:

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu (kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:23:52Z

Žiga Vičič: /* Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu (kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:23:32Z

Žiga Vičič: /* Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu (kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. ''5'''-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Talk:Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:23:01Z

Žiga Vičič: New page: Pri pisanju celotnega teksta smo sodelovali: Maja Globočnik, Dunia Sahir in Žiga Vičič.

Pri pisanju celotnega teksta smo sodelovali: Maja Globočnik, Dunia Sahir in Žiga Vičič.

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:21:04Z

Žiga Vičič: /* Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu (kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''' 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. ''5'''-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:20:27Z

Žiga Vičič: /* Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu (kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' ''114'' 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. ''5'''-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:16:38Z

Žiga Vičič: /* Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu
(kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. ''5'''-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:16:25Z

Žiga Vičič: /* Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu
(kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. ''5'''-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''. <ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:07:52Z

Žiga Vičič: /* Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu
(kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. ''5'''-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''.

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:06:25Z

Žiga Vičič: /* Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja nusG, kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu
(kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. ''5'''-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja ''cI''.

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:03:53Z

Žiga Vičič: /* Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja nusG, kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu
(kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. ''5'''-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira cI represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja cI.

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:03:27Z

Žiga Vičič: /* Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja nusG, kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu
(kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. ''5'''-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za Lc in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira cI represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja cI.

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:02:32Z

Žiga Vičič: /* Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja nusG, kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu
(kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za Lc in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira cI represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja cI.

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:02:03Z

Žiga Vičič: /* Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja nusG, kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu
(kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za Lc in ki so mu pripisali ime ipeX. Potrdili so, da se ipeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira cI represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja cI.

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:01:47Z

Žiga Vičič: /* Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja nusG, kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu
(kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za Lc in ki so mu pripisali ime ipeX. Potrdili so, da se ipeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikro-RNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira cI represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja cI.

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:01:22Z

Žiga Vičič: /* Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja nusG, kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu
(kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za Lc in ki so mu pripisali ime ipeX. Potrdili so, da se ipeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in vb_24B_43. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikro-RNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira cI represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja cI.

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:01:02Z

Žiga Vičič: /* Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja nusG, kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu
(kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za Lc in ki so mu pripisali ime ipeX. Potrdili so, da se ipeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in vb_24B_43. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikro-RNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov d_ant. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira cI represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja cI.

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:00:35Z

Žiga Vičič: /* Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja nusG, kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu
(kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5' konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za Lc in ki so mu pripisali ime ipeX. Potrdili so, da se ipeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in vb_24B_43. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikro-RNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov d_ant. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira cI represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja cI.

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T18:00:19Z

Žiga Vičič: /* Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja nusG, kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E.coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu
(kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E.coli'', stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5' konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za Lc in ki so mu pripisali ime ipeX. Potrdili so, da se ipeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in vb_24B_43. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikro-RNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov d_ant. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira cI represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja cI.

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T17:59:56Z

Žiga Vičič: /* Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja nusG, kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E.coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu
(kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični E.coli, stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5' konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za Lc in ki so mu pripisali ime ipeX. Potrdili so, da se ipeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in vb_24B_43. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikro-RNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov d_ant. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira cI represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja cI.

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T17:59:39Z

Žiga Vičič: /* Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja nusG, kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E.coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu
(kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični E.coli, stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E.Coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5' konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za Lc in ki so mu pripisali ime ipeX. Potrdili so, da se ipeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in vb_24B_43. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikro-RNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov d_ant. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira cI represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja cI.

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T17:59:24Z

Žiga Vičič: /* Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja nusG, kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E.coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu
(kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. Coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični E.coli, stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E.Coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5' konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za Lc in ki so mu pripisali ime ipeX. Potrdili so, da se ipeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in vb_24B_43. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikro-RNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov d_ant. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira cI represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja cI.

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T17:57:56Z

Žiga Vičič: /* Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja nusG, kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s cis-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E.coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu
(kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. Coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični E.coli, stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E.Coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5' konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za Lc in ki so mu pripisali ime ipeX. Potrdili so, da se ipeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in vb_24B_43. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikro-RNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov d_ant. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira cI represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja cI.

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T17:57:33Z

Žiga Vičič: /* Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σS. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σS faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja nusG, kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s cis-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E.coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu
(kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. Coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični E.coli, stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E.Coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5' konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za Lc in ki so mu pripisali ime ipeX. Potrdili so, da se ipeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in vb_24B_43. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikro-RNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov d_ant. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira cI represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja cI.

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T17:52:08Z

Žiga Vičič:

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σS. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σS faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja nusG, kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s cis-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E.coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu
(kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. Coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični E.coli, stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E.Coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5' konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za Lc in ki so mu pripisali ime ipeX. Potrdili so, da se ipeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in vb_24B_43. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikro-RNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov d_ant. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira cI represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja cI.

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T17:47:21Z

Žiga Vičič:

''Povzeto po:'' [https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1128/9781683670247.ch29 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σS. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σS faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja nusG, kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s cis-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E.coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu
(kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. Coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični E.coli, stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E.Coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5' konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za Lc in ki so mu pripisali ime ipeX. Potrdili so, da se ipeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in vb_24B_43. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikro-RNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov d_ant. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira cI represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja cI.

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavinge, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-04T17:18:05Z

Žiga Vičič:

''Povzeto po:'' [https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1128/9781683670247.ch29 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna refulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

=='''Uravnavanje virulenčnih faktorjev, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σS. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σS faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. En tak sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

=='''Uravnavanje toksinov, kodiranih v profagih, z sRNA'''==
Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja nusG, kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s cis-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

=='''Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu'''==
Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E.coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu
(kompleks, ki razgradi odslužene mRNA) v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. Coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (xylR), ter transporterja piruvat kinaze A (pykA) in manoze (manX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični E.coli, stimulira izražanje flagelina (fliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E.Coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

=='''Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma'''==
Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5' konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

=='''Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu'''==
Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za Lc in ki so mu pripisali ime ipeX. Potrdili so, da se ipeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in vb_24B_43. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikro-RNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja genov d_ant. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira cI represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov pod kontrolo promotorja cI.

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.

=='''Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici'''==
Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se povečano začnejo prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA heliakze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

=='''Viri'''==
<references/>