Wiki FKKT - User contributions [en]

ELIXIO -Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah

2022-05-10T07:30:01Z

Ajda Godec:

Projekt »ELIXIO- mikrobni konzorcij za proizvodnjo trajnostne arome vijolic« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021, kjer si je skupina prislužila zlato medaljo za svoj projekt. Zasnovala ga je skupina Toulouse_INSA-UPS, ki je želela z uporabo metod sintezne biologije ustvariti trajnosten, okolju prijazen način proizvodnje naravne arome z vonjem po vijolicah.

Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: https://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Description

Avtorica povzetka: Ajda Godec

== Problem ==

Vonj predstavlja med različnimi živalskimi vrstami, tudi med ljudmi, poseben kulturni in socialni fenomen. Prav zaradi tega se molekule, ki sestavljajo mnoge arome, uporabljene v različnih kozmetičnih produktih, predvsem pa bile osnova za razcvet danes ogromne parfumske industrije, ki je leta 2020 dosegla vrednost 32,8 bilijonov ameriških dolarjev, slednja vrednost pa se zdaleč ni končna. Na področju parfumske industrije Francija zavzema pomembno vlogo, ki jo pogosto povezujejo s produkti visoke kvalitete, prestiža in tradicije. Parfume delimo na štiri osnovne olfaktorne skupine, med njimi je tudi cvetlična, ki se nadalje deli v 10 podskupin. Večino teh esenc pridobivamo iz naravnih virov, najpogosteje iz cvetnih listov. Obstaja pa precejšen nabor cvetlic (t.i neme cvetlice), iz katerih je nemogoče pridobiti esenco z industrijsko signifikantnim izkoristkom. V to skupino uvrščamo vijolice, hiacinte, lilije ipd. Zato se v kozmetični in parfumski industriji za posnemanje vonjev teh cvetlic uporabljajo sintetično pridobljene molekule, ki v določenem razmerju dajo želeno vonjavo. Tak način proizvodnje dišavnih molekul je ekološko zelo obremenjujoč, reakcije potekajo pod ostrimi fizikalno-kemijskimi pogoji, izhodiščno molekula pa pogosto predstavlja petrolej. Po drugi strani pa ekstrakcija parfumskega olja iz naravnega materiala zahteva ogromne količine le-tega, uporabo organskih topil ali vode kot topila, in porabo velike količine električne energije. Trg pa kljub temu izkazuje vedno več zanimanja in nudi večjo podporo naravno pridobljenim spojinam. Da bi lahko zadostili tem potrebam in ohranili konkurenčnost vodilna podjetja (npr. Givaudan, International Flavors and Fragrances, Symrise itd) na tem področju kombinirajo uporabo teh metod, vedno bolj pa vključujejo tudi biotehnološke metode pridelave. Vonj po vijolicah opisuje mešanico spojin, med katerimi velja točno določeno razmerje. Najpomembnejše spojine, ki sestavljajo akord so: α- in β-jonon, linalol, v manjši meri pa tudi dihidro-β-jonon. Te molekule uvrščamo v družino terpenov. Akord z bolj zelenimi notami dopolnjujeta (2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol [1,2].

== Cilj ==

Skupina francoskih dodiplomskih študentov se odločila za pripravo mikrobnega konzorcija z indukcijskimi sistemi, s katerimi bodo dosegli proizvodnjo želenega razmerja dveh glavnih tipov spojin (terpeni in aldehidi), ki oblikujejo akord arome vijolic, simbolične cvetlice mesta Tolouse. Vsaka izmed skupin spojin je sintetizirana po ločeni metabolni poti. Tako so kot šasijo uporabili 2 različna organizma (avtotrofni in heterotrofni), v vsakem izmed njih pa bo potekala ločena metabolna pot. Za proizvodnjo terpenov so izbrali kvasovko Saccharomyces cerevisiae, sinteza aldehidov pa bo potekala v cianobakterijah ''Synechococcus elongatus'' UTEX 297 CscB+. Cianobakterija je bila gensko spremenjena z namenom, da izloča v gojišče saharozo, ki služi kot vir ogljika za heterotrofno kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae''. Takšna proizvodnja ustreza kriterijem trajnostnega in okolju prijaznega načina pridobivanja spojin, saj je osnova za sintezo molekul le CO2. Po drugi strani pa so dišave proizvedene tekom biotehnoloških procesov po regulativah EU in ZDA obravnavane kot naravno pridobljene. Glavni cilj skupine je bil ustvariti biotehnološki projekt za industrijsko pridobivanje spojin, zato se idejo obravnavali tudi iz podjetniške perspektive.

== Načrt in izvedba ==

=== SINTEZA TERPENOV V ''S. cerevisiae'' ===

Za šasijo je skupina izbrala dobro okarakteriziran organizem kvasovko ''S. cerevisiae'', saj so vrednosti izkoristkov sinteze in hitrosti metabolične poti terpenov pridobljene iz prejšnjih raziskav industrijsko relevantne. Dodatno prednost so videli tudi v enostavni genski manipulaciji. Ker terpeni niso (α- in β-jonon, linalol, dihidro-β-jonon) naravno prisotni v šasijskem organizmu, je skupina najprej identificirala encime, ki sodelujejo v sintetskih poteh. Uporabljeni geni za encime izvirajo iz različnih rastlinskih vrst, ki so v nadaljevanju navedene ob imen encimov.
Jononi se v rastlinah sintetizirajo iz likopena. Ta se najprej pretvori v ε- oziroma β-karoten (karotenoid cepitvena dioksigenaza 1 – CCD1- ''Osmanthus fragrans'','' Petunia hybrida''), nato po drugi encimski pretvorbi nastane α-jonon (likopen ε-ciklaza -LcyE - ''Latuca sativa'') oziroma β-jonon (likopen β -ciklaza – CrtY- ''Pantoea ananatis''); slednjega po dodatni encimski reakciji nastane dihidro-β-jonon (enoat reduktaza- DBR1- ''Artemisia annua''). Linalol sodi v skupino monoterpenoidov, sintezo katalizira encim linalol sintaza, ki pretvarja geranil difosfat v linalol. Gen za linalol sintazo iz Lavandula angustifolia so uporabili, saj je bil že predhodno uporabljen za sintezo linalola v kvasovkah. Da da bi ujeli časovni okvir projekta so uporabili gensko spremenjen sev (yGPP034 ipENZ011 ipENZ078) kvasovke, ki že proizvaja likopen [1,3].

Na osnovi predhodnih raziskav na ''E.Coli'' so študentje pripravili genske konstrukte za fuzijske proteine (LycE- OfCCD1-in CRTY- PhCCD1) in s tem poskušali rešiti problem kolokalizacije encima (CCD1) in substrata, ki katalizira hitrost določujočo encimsko reakcijo. Vzporedno so pripravili še konstrukt, kjer sta nastala encima CCD1 in CrtY ločena, CCD1 pa je preko peptidnega sidra vstavljen v membrano. Tak pristop se je v prejšnjih raziskavah izkazal za učinkovitega, pri čemer se je povišala sinteza β-jonona.Za sintezo α- in β-jonona so pripravili 3 različne plazmide (pVIOLETTE za sintezo α-jonona z inducibilnim galaktoznim promotorjem PGAL1 , pFRAMBOISE-fused in pFRAMBOISE-notfused za sintezo β-jonona z inducibilnim PTetO7 in rtTA aktivatorjem). Za sintezo linalola in dihidro-β-jonona pa so ustvarili plazmid pFLEUR; gen za enoat reduktaza je pod kontrolo estradiol inducibilnega promotorja PZ3eV, gen za linalol sintazo pa pod kontrolo Cu-inducibilnega promotorja PCUP1 .
S PCR metodo pomnoženi genski konstrukti so bili vstavljeni v integracijske vektorje z uporabo metode In Fusion. Temu je sledila transfekcija v izbran ekspresijski sev. Z metodo PCR na osnovi kolonije kvasovk so preverili uspešnost transfekcije. Temu je sledila nadaljnja izvedba v bioreaktorjih [1,7].

=== SINTEZA ALDEHIDOV V ''S. elongatus '' ===

Skupina je kot avtotrofni šasijski organizem uporabila ''Synechococcus elongatus'' UTEX 2973, zaradi hitre rasti; primerljive z določenimi vrstami kvasovk, učinkovito gensko modifikacijo pa dosežemo z uporabo triparientalne konjugacije ( ''E.Coli'') [1,4].

Znano je, da mnoge cianobakterije ob stresnih pogoju za zmanjšanje osmotskega stresa kopičijo saharozo. ''Synechococcus elongatus'' UTEX 2973 CscB+ je bil gensko spremenjen do te mere, da izraža saharoza/ H+ simporter – CscB+, povišan pa je nivo tudi drugih encimov vključenih v metabolni poti saharoze, kar omogoča izločanje saharoze v odsotnosti stresnih pogojev (visoke konc. NaCl)[1,5].

''Synechococcus elongatus'' je cianobakterija, ki lahko v stresnih pogojih (visoke koncentracije CO2, intenzivna svetloba), proizvaja nenasičene maščobne kisline, ki so osnova za sintezo α-linolejske kisline, ta pa služi kot prekurzor za sintezo aldehidov, prisotnih v akordu vonja vijolic. Sinteza 2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol poteka po lipoksigenazni poti, v kateri sta vključena 2 encima lipoksigenaza (LOX), končno encimsko pretvorbo pa izvede encim hiroksiperoksid liaza (HPL). Zapisa za omenjena encima so vstavili v posebej ustvarjen plazmid pCONCOMBRE, ki omogoča integracijo v gostiteljski genom. Za pripravo plazmida so uporabili gen LOX iz '' Nicotiana benthamiana '' ter HPL iz ''Cucumis melo''. Nadzorovana ekspresija jej bila zagotovljena preko teofilin inducibilnega ribonukleotidnega stikala v povezavi s Ptrc promotorjem [1,6].

Integracija v genom ''Synechococcus elongatus'' je bila dosežena preko izvedbe tristarševske konjugacije z E.Coli, uspešnost integracije je bila preverjena z metodo PCR na osnovi kolonije cianobakterije. Kokultivacija je potekala v bioreaktorjih.

== Rezultati in potencialni prenos v industrijo ==

Rezultati agarozne gelske elektroforeze so pri obeh organizmih potrdili uspešno neodvisno integracijo v genom. Ob indukciji so na petrijevkah dokazali produkcijo jononov in pretvorbo likopena v β-karoten, zgolj prisotnost α-jonona so dodatno potrdili z RP-HPLC analizo. Analiza medija z GC-MS obeh kultur po dosežku stacionarne faze rast, je pokazala le prisotnost α-jonona, β-jonona. Preko testa encimske aktivnosti DBR1 pa so dokazali prisotnost dihidro-β-jonona. Tekom poskusov so prav tako uspeli potrditi, da lahko kvasovke uspevajo v gojišču s saharozo izločeno s strani cianobakterij. Problem potreben optimizacije je predstavljala nezadostna koncentracija saharoze za preživetje kvasovk tekom daljšega časovnem obdobju [1,7].

Izdelava podjetniškega načrta je pokazala, da bi z optimizacijo količine proizvoda za 10-krat lahko dosegli konkurenčni sistem. Okvirna cena produkta se brez optimizacije giblje okoli 4 000 € na 1 kg olja z vonjem po vijolicah[8].

== Viri in literatura ==

[1] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-org https://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Description (Pridobljeno 28.4.2022)

[2] Perfume Market: Industry Trends, Size, Share, Analysis & Forecast 2021-2026 (Pridobljeno 6.7.2021)

[3] Chen X, Shukal S, Zhang C. 2019. Integrating Enzyme and Metabolic Engineering Tools for Enhanced α-Ionone Production. J Agric Food Chem. 67(49):13451–13459. doi:10.1021/acs.jafc.9b00860

[4] Yu J, Liberton M, Cliften P, Head R, Jacobs J, Smith R, Koppenaal D, Brand J, Pakrasi H. 2015. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific reports. 5:8132. doi:10.1038/srep08132

[5] Lin P-C, Zhang F, Pakrasi HB. 2020. Enhanced production of sucrose in the fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Scientific Reports. 10(1):390. doi:10.1038/s41598-019-57319-5.

[6] Nakahira Y, Ogawa A, Asano H, Oyama T, Tozawa Y. 2013. Theophylline-dependent riboswitch as a novel genetic tool for strict regulation of protein expression in Cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942. Plant Cell Physiol. 54(10):1724–1735. doi:10.1093/pcp/pct115.

[7] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-Results orghttps://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Results#a4 (Pridobljeno 28.4.2022)

[8] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-Enterpreneurship orghttps://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/ Entrepreneurship (Pridobljeno 28.4.2022)

ELIXIO -Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah

2022-05-10T07:25:51Z

Ajda Godec:

Projekt »ELIXIO- mikrobni konzorcij za proizvodnjo trajnostne arome vijolic« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021, kjer si je skupina prislužila zlato medaljo za svoj projekt. Zasnovala ga je skupina Toulouse_INSA-UPS, ki je želela z uporabo metod sintezne biologije ustvariti trajnosten, okolju prijazen način proizvodnje naravne arome z vonjem po vijolicah.

Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: https://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Description

Avtorica povzetka: Ajda Godec

== Problem ==

Vonj predstavlja med različnimi živalskimi vrstami, tudi med ljudmi, poseben kulturni in socialni fenomen. Prav zaradi tega se molekule, ki sestavljajo mnoge arome, uporabljene v različnih kozmetičnih produktih, predvsem pa bile osnova za razcvet danes ogromne parfumske industrije, ki je leta 2020 dosegla vrednost 32,8 bilijonov ameriških dolarjev, slednja vrednost pa se zdaleč ni končna. Na področju parfumske industrije Francija zavzema pomembno vlogo, ki jo pogosto povezujejo s produkti visoke kvalitete, prestiža in tradicije. Parfume delimo na štiri osnovne olfaktorne skupine, med njimi je tudi cvetlična, ki se nadalje deli v 10 podskupin. Večino teh esenc pridobivamo iz naravnih virov, najpogosteje iz cvetnih listov. Obstaja pa precejšen nabor cvetlic (t.i neme cvetlice), iz katerih je nemogoče pridobiti esenco z industrijsko signifikantnim izkoristkom. V to skupino uvrščamo vijolice, hiacinte, lilije ipd. Zato se v kozmetični in parfumski industriji za posnemanje vonjev teh cvetlic uporabljajo sintetično pridobljene molekule, ki v določenem razmerju dajo želeno vonjavo. Tak način proizvodnje dišavnih molekul je ekološko zelo obremenjujoč, reakcije potekajo pod ostrimi fizikalno-kemijskimi pogoji, izhodiščno molekula pa pogosto predstavlja petrolej. Po drugi strani pa ekstrakcija parfumskega olja iz naravnega materiala zahteva ogromne količine le-tega, uporabo organskih topil ali vode kot topila, in porabo velike količine električne energije. Trg pa kljub temu izkazuje vedno več zanimanja in nudi večjo podporo naravno pridobljenim spojinam. Da bi lahko zadostili tem potrebam in ohranili konkurenčnost vodilna podjetja (npr. Givaudan, International Flavors and Fragrances, Symrise itd) na tem področju kombinirajo uporabo teh metod, vedno bolj pa vključujejo tudi biotehnološke metode pridelave. Vonj po vijolicah opisuje mešanico spojin, med katerimi velja točno določeno razmerje. Najpomembnejše spojine, ki sestavljajo akord so: α- in β-jonon, linalol, v manjši meri pa tudi dihidro-β-jonon. Te molekule uvrščamo v družino terpenov. Akord z bolj zelenimi notami dopolnjujeta (2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol [1,2].

== Cilj ==

Skupina francoskih dodiplomskih študentov se odločila za pripravo mikrobnega konzorcija z indukcijskimi sistemi, s katerimi bodo dosegli proizvodnjo želenega razmerja dveh glavnih tipov spojin (terpeni in aldehidi), ki oblikujejo akord arome vijolic, simbolične cvetlice mesta Tolouse. Vsaka izmed skupin spojin je sintetizirana po ločeni metabolni poti. Tako so kot šasijo uporabili 2 različna organizma (avtotrofni in heterotrofni), v vsakem izmed njih pa bo potekala ločena metabolna pot. Za proizvodnjo terpenov so izbrali kvasovko Saccharomyces cerevisiae, sinteza aldehidov pa bo potekala v cianobakterijah ''Synechococcus elongatus'' UTEX 297 CscB+. Cianobakterija je bila gensko spremenjena z namenom, da izloča v gojišče saharozo, ki služi kot vir ogljika za heterotrofno kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae''. Takšna proizvodnja ustreza kriterijem trajnostnega in okolju prijaznega načina pridobivanja spojin, saj je osnova za sintezo molekul le CO2. Po drugi strani pa so dišave proizvedene tekom biotehnoloških procesov po regulativah EU in ZDA obravnavane kot naravno pridobljene. Glavni cilj skupine je bil ustvariti biotehnološki projekt za industrijsko pridobivanje spojin, zato se idejo obravnavali tudi iz podjetniške perspektive.

== Načrt in izvedba ==

=== SINTEZA TERPENOV V ''S. cerevisiae'' ===

Za šasijo je skupina izbrala dobro okarakteriziran organizem kvasovko ''S. cerevisiae'', saj so vrednosti izkoristkov sinteze in hitrosti metabolične poti terpenov pridobljene iz prejšnjih raziskav industrijsko relevantne. Dodatno prednost so videli tudi v enostavni genski manipulaciji. Ker terpeni niso (α- in β-jonon, linalol, dihidro-β-jonon) naravno prisotni v šasijskem organizmu, je skupina najprej identificirala encime, ki sodelujejo v sintetskih poteh. Uporabljeni geni za encime izvirajo iz različnih rastlinskih vrst, ki so v nadaljevanju navedene ob imen encimov.
Jononi se v rastlinah sintetizirajo iz likopena. Ta se najprej pretvori v ε- oziroma β-karoten (karotenoid cepitvena dioksigenaza 1 – CCD1- ''Osmanthus fragrans'','' Petunia hybrida''), nato po drugi encimski pretvorbi nastane α-jonon (likopen ε-ciklaza -LcyE - ''Latuca sativa'') oziroma β-jonon (likopen β -ciklaza – CrtY- ''Pantoea ananatis''); slednjega po dodatni encimski reakciji nastane dihidro-β-jonon (enoat reduktaza- DBR1- ''Artemisia annua''). Linalol sodi v skupino monoterpenoidov, sintezo katalizira encim linalol sintaza, ki pretvarja geranil difosfat v linalol. Gen za linalol sintazo iz Lavandula angustifolia so uporabili, saj je bil že predhodno uporabljen za sintezo linalola v kvasovkah. Da da bi ujeli časovni okvir projekta so uporabili gensko spremenjen sev (yGPP034 ipENZ011 ipENZ078) kvasovke, ki že proizvaja likopen [1,3].

Na osnovi predhodnih raziskav na ''E.Coli'' so študentje pripravili genske konstrukte za fuzijske proteine (LycE- OfCCD1-in CRTY- PhCCD1) in s tem poskušali rešiti problem kolokalizacije encima (CCD1) in substrata, ki katalizira hitrost določujočo encimsko reakcijo. Vzporedno so pripravili še konstrukt, kjer sta nastala encima CCD1 in CrtY ločena, CCD1 pa je preko peptidnega sidra vstavljen v membrano. Tak pristop se je v prejšnjih raziskavah izkazal za učinkovitega, pri čemer se je povišala sinteza β-jonona.Za sintezo α- in β-jonona so pripravili 3 različne plazmide (pVIOLETTE za sintezo α-jonona z inducibilnim galaktoznim promotorjem PGAL1 , pFRAMBOISE-fused in pFRAMBOISE-notfused za sintezo β-jonona z inducibilnim PTetO7 in rtTA aktivatorjem). Za sintezo linalola in dihidro-β-jonona pa so ustvarili plazmid pFLEUR; gen za enoat reduktaza je pod kontrolo estradiol inducibilnega promotorja PZ3eV, gen za linalol sintazo pa pod kontrolo Cu-inducibilnega promotorja PCUP1 .
S PCR metodo pomnoženi genski konstrukti so bili vstavljeni v integracijske vektorje z uporabo metode In Fusion. Temu je sledila transfekcija v izbran ekspresijski sev. Z metodo PCR na osnovi kolonije kvasovk so preverili uspešnost transfekcije. Temu je sledila nadaljnja izvedba v bioreaktorjih [1,7].

=== SINTEZA ALDEHIDOV V ''S. elongatus '' ===

Skupina je kot avtotrofni šasijski organizem uporabila ''Synechococcus elongatus'' UTEX 2973, zaradi hitre rasti; primerljive z določenimi vrstami kvasovk, učinkovito gensko modifikacijo pa dosežemo z uporabo triparientalne konjugacije ( ''E.Coli'') [1,4].

Znano je, da mnoge cianobakterije ob stresnih pogoju za zmanjšanje osmotskega stresa kopičijo saharozo. ''Synechococcus elongatus'' UTEX 2973 CscB+ je bil gensko spremenjen do te mere, da izraža saharoza/ H+ simporter – CscB+, povišan pa je nivo tudi drugih encimov vključenih v metabolni poti saharoze, kar omogoča izločanje saharoze v odsotnosti stresnih pogojev (visoke konc. NaCl)[1,5].

''Synechococcus elongatus'' je cianobakterija, ki lahko v stresnih pogojih (visoke koncentracije CO2, intenzivna svetloba), proizvaja nenasičene maščobne kisline, ki so osnova za sintezo α-linolejske kisline, ta pa služi kot prekurzor za sintezo aldehidov, prisotnih v akordu vonja vijolic. Sinteza 2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol poteka po lipoksigenazni poti, v kateri sta vključena 2 encima lipoksigenaza (LOX), končno encimsko pretvorbo pa izvede encim hiroksiperoksid liaza (HPL). Zapisa za omenjena encima so vstavili v posebej ustvarjen plazmid pCONCOMBRE, ki omogoča integracijo v gostiteljski genom. Za pripravo plazmida so uporabili gen LOX iz '' Nicotiana benthamiana '' ter HPL iz ''Cucumis melo''. Nadzorovana ekspresija jej bila zagotovljena preko teofilin inducibilnega ribonukleotidnega stikalamodulatorja v povezavi s Ptrc promotorjem [1,6].

Integracija v genom ''Synechococcus elongatus'' je bila dosežena preko izvedbe tristarševske konjugacije z E.Coli, uspešnost integracije je bila preverjena z metodo PCR na osnovi kolonije cianobakterije. Kokultivacija je potekala v bioreaktorjih.

== Rezultati in potencialni prenos v industrijo ==

Rezultati agarozne gelske elektroforeze so pri obeh organizmih potrdili uspešno neodvisno integracijo v genom. Ob indukciji so na petrijevkah dokazali produkcijo jononov in pretvorbo likopena v β-karoten, zgolj prisotnost α-jonona so dodatno potrdili z RP-HPLC analizo. Analiza medija z GC-MS obeh kultur po dosežku stacionarne faze rast, je pokazala le prisotnost α-jonona, β-jonona. Preko testa encimske aktivnosti DBR1 pa so dokazali prisotnost dihidro-β-jonona. Tekom poskusov so prav tako uspeli potrditi, da lahko kvasovke uspevajo v gojišču s saharozo izločeno s strani cianobakterij. Problem potreben optimizacije je predstavljala nezadostna koncentracija saharoze za preživetje kvasovk tekom daljšega časovnem obdobju [1,7].

Izdelava podjetniškega načrta je pokazala, da bi z optimizacijo količine proizvoda za 10-krat lahko dosegli konkurenčni sistem. Okvirna cena produkta se brez optimizacije giblje okoli 4 000 € na 1 kg olja z vonjem po vijolicah[8].

== Viri in literatura ==

[1] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-org https://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Description (Pridobljeno 28.4.2022)

[2] Perfume Market: Industry Trends, Size, Share, Analysis & Forecast 2021-2026 (Pridobljeno 6.7.2021)

[3] Chen X, Shukal S, Zhang C. 2019. Integrating Enzyme and Metabolic Engineering Tools for Enhanced α-Ionone Production. J Agric Food Chem. 67(49):13451–13459. doi:10.1021/acs.jafc.9b00860

[4] Yu J, Liberton M, Cliften P, Head R, Jacobs J, Smith R, Koppenaal D, Brand J, Pakrasi H. 2015. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific reports. 5:8132. doi:10.1038/srep08132

[5] Lin P-C, Zhang F, Pakrasi HB. 2020. Enhanced production of sucrose in the fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Scientific Reports. 10(1):390. doi:10.1038/s41598-019-57319-5.

[6] Nakahira Y, Ogawa A, Asano H, Oyama T, Tozawa Y. 2013. Theophylline-dependent riboswitch as a novel genetic tool for strict regulation of protein expression in Cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942. Plant Cell Physiol. 54(10):1724–1735. doi:10.1093/pcp/pct115.

[7] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-Results orghttps://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Results#a4 (Pridobljeno 28.4.2022)

[8] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-Enterpreneurship orghttps://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/ Entrepreneurship (Pridobljeno 28.4.2022)

ELIXIO -Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah

2022-05-09T22:16:15Z

Ajda Godec:

Projekt »ELIXIO- mikrobni konzorcij za proizvodnjo trajnostne arome vijolic« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021, kjer si je skupina prislužila zlato medaljo za svoj projekt. Zasnovala ga je skupina Toulouse_INSA-UPS, ki je želela z uporabo metod sintezne biologije ustvariti trajnosten, okolju prijazen način proizvodnje naravne arome z vonjem po vijolicah.

Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: https://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Description

Avtorica povzetka: Ajda Godec

== Problem ==

Vonj predstavlja med različnimi živalskimi vrstami, tudi med ljudmi, poseben kulturni in socialni fenomen. Prav zaradi tega se molekule, ki sestavljajo mnoge arome, uporabljene v različnih kozmetičnih produktih, predvsem pa bile osnova za razcvet danes ogromne parfumske industrije, ki je leta 2020 dosegla vrednost 32,8 bilijonov ameriških dolarjev, slednja vrednost pa se zdaleč ni končna. Na področju parfumske industrije Francija zavzema pomembno vlogo, ki jo pogosto povezujejo s produkti visoke kvalitete, prestiža in tradicije. Parfume delimo na štiri osnovne olfaktorne skupine, med njimi je tudi cvetlična, ki se nadalje deli v 10 podskupin. Večino teh esenc pridobivamo iz naravnih virov, najpogosteje iz cvetnih listov. Obstaja pa precejšen nabor cvetlic (t.i neme cvetlice), iz katerih je nemogoče pridobiti esenco z industrijsko signifikantnim izkoristkom. V to skupino uvrščamo vijolice, hiacinte, lilije ipd. Zato se v kozmetični in parfumski industriji za posnemanje vonjev teh cvetlic uporabljajo sintetično pridobljene molekule, ki v določenem razmerju dajo želeno vonjavo. Tak način proizvodnje dišavnih molekul je ekološko zelo obremenjujoč, reakcije potekajo pod ostrimi fizikalno-kemijskimi pogoji, izhodiščno molekula pa pogosto predstavlja petrolej. Po drugi strani pa ekstrakcija parfumskega olja iz naravnega materiala zahteva ogromne količine le-tega, uporabo organskih topil ali vode kot topila, in porabo velike količine električne energije. Trg pa kljub temu izkazuje vedno več zanimanja in nudi večjo podporo naravno pridobljenim spojinam. Da bi lahko zadostili tem potrebam in ohranili konkurenčnost vodilna podjetja (npr. Givaudan, International Flavors and Fragrances, Symrise itd) na tem področju kombinirajo uporabo teh metod, vedno bolj pa vključujejo tudi biotehnološke metode pridelave. Vonj po vijolicah opisuje mešanico spojin, med katerimi velja točno določeno razmerje. Najpomembnejše spojine, ki sestavljajo akord so: α- in β-jonon, linalol, v manjši meri pa tudi dihidro-β-jonon. Te molekule uvrščamo v družino terpenov. Akord z bolj zelenimi notami dopolnjujeta (2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol [1,2].

== Cilj ==

Skupina francoskih dodiplomskih študentov se odločila za pripravo mikrobnega konzorcija z indukcijskimi sistemi, s katerimi bodo dosegli proizvodnjo želenega razmerja dveh glavnih tipov spojin (terpeni in aldehidi), ki oblikujejo akord arome vijolic, simbolične cvetlice mesta Tolouse. Vsaka izmed skupin spojin je sintetizirana po ločeni metabolni poti. Tako so kot šasijo uporabili 2 različna organizma (avtotrofni in heterotrofni), v vsakem izmed njih pa bo potekala ločena metabolna pot. Za proizvodnjo terpenov so izbrali kvasovko Saccharomyces cerevisiae, sinteza aldehidov pa bo potekala v cianobakterijah ''Synechococcus elongatus'' UTEX 297 CscB+. Cianobakterija je bila gensko spremenjena z namenom, da izloča v gojišče saharozo, ki služi kot vir ogljika za heterotrofno kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae''. Takšna proizvodnja ustreza kriterijem trajnostnega in okolju prijaznega načina pridobivanja spojin, saj je osnova za sintezo molekul le CO2. Po drugi strani pa so dišave proizvedene tekom biotehnoloških procesov po regulativah EU in ZDA obravnavane kot naravno pridobljene. Glavni cilj skupine je bil ustvariti biotehnološki projekt za industrijsko pridobivanje spojin, zato se idejo obravnavali tudi iz podjetniške perspektive.

== Načrt in izvedba ==

=== SINTEZA TERPENOV V ''S. cerevisiae'' ===

Za šasijo je skupina izbrala dobro okarakteriziran organizem kvasovko ''S. cerevisiae'', saj so vrednosti izkoristkov sinteze in hitrosti metabolične poti terpenov pridobljene iz prejšnjih raziskav industrijsko relevantne. Dodatno prednost so videli tudi v enostavni genski manipulaciji. Ker terpeni niso (α- in β-jonon, linalol, dihidro-β-jonon) naravno prisotni v šasijskem organizmu, je skupina najprej identificirala encime, ki sodelujejo v sintetskih poteh. Uporabljeni geni za encime izvirajo iz različnih rastlinskih vrst, ki so v nadaljevanju navedene ob imen encimov.
Jononi se v rastlinah sintetizirajo iz likopena. Ta se najprej pretvori v ε- oziroma β-karoten (karotenoid cepitvena dioksigenaza 1 – CCD1- ''Osmanthus fragrans'','' Petunia hybrida''), nato po drugi encimski pretvorbi nastane α-jonon (likopen ε-ciklaza -LcyE - ''Latuca sativa'') oziroma β-jonon (likopen β -ciklaza – CrtY- ''Pantoea ananatis''); slednjega po dodatni encimski reakciji nastane dihidro-β-jonon (enoat reduktaza- DBR1- ''Artemisia annua''). Linalol sodi v skupino monoterpenoidov, sintezo katalizira encim linalol sintaza, ki pretvarja geranil difosfat v linalol. Gen za linalol sintazo iz Lavandula angustifolia so uporabili, saj je bil že predhodno uporabljen za sintezo linalola v kvasovkah. Da da bi ujeli časovni okvir projekta so uporabili gensko spremenjen sev (yGPP034 ipENZ011 ipENZ078) kvasovke, ki že proizvaja likopen [1,3].

Na osnovi predhodnih raziskav na ''E.Coli'' so študentje pripravili genske konstrukte za fuzijske proteine (LycE- OfCCD1-in CRTY- PhCCD1) in s tem poskušali rešiti problem kolokalizacije encima (CCD1) in substrata, ki katalizira hitrost določujočo encimsko reakcijo. Vzporedno so pripravili še konstrukt, kjer sta nastala encima CCD1 in CrtY ločena, CCD1 pa je preko peptidnega sidra vstavljen v membrano. Tak pristop se je v prejšnjih raziskavah izkazal za učinkovitega, pri čemer se je povišala sinteza β-jonona.Za sintezo α- in β-jonona so pripravili 3 različne plazmide (pVIOLETTE za sintezo α-jonona z inducibilnim galaktoznim promotorjem PGAL1 , pFRAMBOISE-fused in pFRAMBOISE-notfused za sintezo β-jonona z inducibilnim PTetO7 in rtTA aktivatorjem). Za sintezo linalola in dihidro-β-jonona pa so ustvarili plazmid pFLEUR; gen za enoat reduktaza je pod kontrolo estradiol inducibilnega promotorja PZ3eV, gen za linalol sintazo pa pod kontrolo Cu-inducibilnega promotorja PCUP1 .
S PCR metodo pomnoženi genski konstrukti so bili vstavljeni v integracijske vektorje z uporabo metode In Fusion. Temu je sledila transfekcija v izbran ekspresijski sev. Z metodo PCR na osnovi kolonije kvasovk so preverili uspešnost transfekcije. Temu je sledila nadaljnja izvedba v bioreaktorjih [1,7].

=== SINTEZA ALDEHIDOV V ''S. elongatus '' ===

Skupina je kot avtotrofni šasijski organizem uporabila ''Synechococcus elongatus'' UTEX 2973, zaradi hitre rasti; primerljive z določenimi vrstami kvasovk, učinkovito gensko modifikacijo pa dosežemo z uporabo tristarševske konjugacije z ''E.Coli''[1,4].

Znano je, da mnoge cianobakterije ob stresnih pogoju za zmanjšanje osmotskega stresa kopičijo saharozo. ''Synechococcus elongatus'' UTEX 2973 CscB+ je bil gensko spremenjen do te mere, da izraža saharoza/ H+ simporter – CscB+, povišan pa je nivo tudi drugih encimov vključenih v metabolni poti saharoze, kar omogoča izločanje saharoze v odsotnosti stresnih pogojev (visoke konc. NaCl)[1,5].

''Synechococcus elongatus'' je cianobakterija, ki lahko v stresnih pogojih (visoke koncentracije CO2, intenzivna svetloba), proizvaja nenasičene maščobne kisline, ki so osnova za sintezo α-linolejske kisline, ta pa služi kot prekurzor za sintezo aldehidov, prisotnih v akordu vonja vijolic. Sinteza 2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol poteka po lipoksigenazni poti, v kateri sta vključena 2 encima lipoksigenaza (LOX), končno encimsko pretvorbo pa izvede encim hiroksiperoksid liaza (HPL). Zapisa za omenjena encima so vstavili v posebej ustvarjen plazmid pCONCOMBRE, ki omogoča integracijo v gostiteljski genom. Za pripravo plazmida so uporabili gen LOX iz '' Nicotiana benthamiana '' ter HPL iz ''Cucumis melo''. Nadzorovana ekspresija jej bila zagotovljena preko teofilin inducibilnega ribonukleotidnega stikalamodulatorja v povezavi s Ptrc promotorjem [1,6].

Integracija v genom ''Synechococcus elongatus'' je bila dosežena preko izvedbe tristarševske konjugacije z E.Coli, uspešnost integracije je bila preverjena z metodo PCR na osnovi kolonije cianobakterije. Kokultivacija je potekala v bioreaktorjih.

== Rezultati in potencialni prenos v industrijo ==

Rezultati agarozne gelske elektroforeze so pri obeh organizmih potrdili uspešno neodvisno integracijo v genom. Ob indukciji so na petrijevkah dokazali produkcijo jononov in pretvorbo likopena v β-karoten, zgolj prisotnost α-jonona so dodatno potrdili z RP-HPLC analizo. Analiza medija z GC-MS obeh kultur po dosežku stacionarne faze rast, je pokazala le prisotnost α-jonona, β-jonona. Preko testa encimske aktivnosti DBR1 pa so dokazali prisotnost dihidro-β-jonona. Tekom poskusov so prav tako uspeli potrditi, da lahko kvasovke uspevajo v gojišču s saharozo izločeno s strani cianobakterij. Problem potreben optimizacije je predstavljala nezadostna koncentracija saharoze za preživetje kvasovk tekom daljšega časovnem obdobju [1,7].

Izdelava podjetniškega načrta je pokazala, da bi z optimizacijo količine proizvoda za 10-krat lahko dosegli konkurenčni sistem. Okvirna cena produkta se brez optimizacije giblje okoli 4 000 € na 1 kg olja z vonjem po vijolicah[8].

== Viri in literatura ==

[1] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-org https://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Description (Pridobljeno 28.4.2022)

[2] Perfume Market: Industry Trends, Size, Share, Analysis & Forecast 2021-2026 (Pridobljeno 6.7.2021)

[3] Chen X, Shukal S, Zhang C. 2019. Integrating Enzyme and Metabolic Engineering Tools for Enhanced α-Ionone Production. J Agric Food Chem. 67(49):13451–13459. doi:10.1021/acs.jafc.9b00860

[4] Yu J, Liberton M, Cliften P, Head R, Jacobs J, Smith R, Koppenaal D, Brand J, Pakrasi H. 2015. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific reports. 5:8132. doi:10.1038/srep08132

[5] Lin P-C, Zhang F, Pakrasi HB. 2020. Enhanced production of sucrose in the fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Scientific Reports. 10(1):390. doi:10.1038/s41598-019-57319-5.

[6] Nakahira Y, Ogawa A, Asano H, Oyama T, Tozawa Y. 2013. Theophylline-dependent riboswitch as a novel genetic tool for strict regulation of protein expression in Cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942. Plant Cell Physiol. 54(10):1724–1735. doi:10.1093/pcp/pct115.

[7] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-Results orghttps://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Results#a4 (Pridobljeno 28.4.2022)

[8] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-Enterpreneurship orghttps://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/ Entrepreneurship (Pridobljeno 28.4.2022)

ELIXIO -Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah

2022-05-09T20:01:53Z

Ajda Godec:

Projekt »ELIXIO- mikrobni konzorcij za proizvodnjo trajnostne arome vijolic« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021, kjer si je skupina prislužila zlato medaljo za svoj projekt. Zasnovala ga je skupina Toulouse_INSA-UPS, ki je želela z uporabo metod sintezne biologije ustvariti trajnosten, okolju prijazen način proizvodnje naravne arome z vonjem po vijolicah.

Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: https://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Description

Avtorica povzetka: Ajda Godec

== Problem ==

Vonj predstavlja med različnimi živalskimi vrstami, tudi med ljudmi, poseben kulturni in socialni fenomen. Prav zaradi tega se molekule, ki sestavljajo mnoge arome, uporabljene v različnih kozmetičnih produktih, predvsem pa bile osnova za razcvet danes ogromne parfumske industrije, ki je leta 2020 dosegla vrednost 32,8 bilijonov ameriških dolarjev, slednja vrednost pa se zdaleč ni končna. Na področju parfumske industrije Francija zavzema pomembno vlogo, ki jo pogosto povezujejo s produkti visoke kvalitete, prestiža in tradicije. Parfume delimo na štiri osnovne olfaktorne skupine, med njimi je tudi cvetlična, ki se nadalje deli v 10 podskupin. Večino teh esenc pridobivamo iz naravnih virov, najpogosteje iz cvetnih listov. Obstaja pa precejšen nabor cvetlic (t.i neme cvetlice), iz katerih je nemogoče pridobiti esenco z industrijsko signifikantnim izkoristkom. V to skupino uvrščamo vijolice, hiacinte, lilije ipd. Zato se v kozmetični in parfumski industriji za posnemanje vonjev teh cvetlic uporabljajo sintetično pridobljene molekule, ki v določenem razmerju dajo želeno vonjavo. Tak način proizvodnje dišavnih molekul je ekološko zelo obremenjujoč, reakcije potekajo pod ostrimi fizikalno-kemijskimi pogoji, izhodiščno molekula pa pogosto predstavlja petrolej. Po drugi strani pa ekstrakcija parfumskega olja iz naravnega materiala zahteva ogromne količine le-tega, uporabo organskih topil ali vode kot topila, in porabo velike količine električne energije. Trg pa kljub temu izkazuje vedno več zanimanja in nudi večjo podporo naravno pridobljenim spojinam. Da bi lahko zadostili tem potrebam in ohranili konkurenčnost vodilna podjetja (npr. Givaudan, International Flavors and Fragrances, Symrise itd) na tem področju kombinirajo uporabo teh metod, vedno bolj pa vključujejo tudi biotehnološke metode pridelave. Vonj po vijolicah opisuje mešanico spojin, med katerimi velja točno določeno razmerje. Najpomembnejše spojine, ki sestavljajo akord so: α- in β-jonon, linalol, v manjši meri pa tudi dihidro-β-jonon. Te molekule uvrščamo v družino terpenov. Akord z bolj zelenimi notami dopolnjujeta (2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol [1,2].

== Cilj ==

Skupina francoskih študentov se odločila za pripravo mikrobnega konzorcija z indukcijskimi sistemi, s katerimi bodo dosegli proizvodnjo želenega razmerja dveh glavnih tipov spojin (terpeni in aldehidi), ki oblikujejo akord arome vijolic, simbolične cvetlice mesta Tolouse. Vsaka izmed skupin spojin je sintetizirana po ločeni metabolni poti. Tako so kot šasijo uporabili 2 različna organizma (avtotrofni in heterotrofni), v vsakem izmed njih pa bo potekala ločena metabolna pot. Za proizvodnjo terpenov so izbrali kvasovko Saccharomyces cerevisiae, sinteza aldehidov pa bo potekala v cianobakterijah ''Synechococcus elongatus'' UTEX 297 CscB+. Cianobakterija je bila gensko spremenjena z namenom, da izloča v gojišče saharozo, ki služi kot vir ogljika za heterotrofno kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae''. Takšna proizvodnja ustreza kriterijem trajnostnega in okolju prijaznega načina pridobivanja spojin, saj je osnova za sintezo molekul le CO2. Po drugi strani pa so dišave proizvedene tekom biotehnoloških procesov po regulativah EU in ZDA obravnavane kot naravno pridobljene. Glavni cilj skupine je bil ustvariti biotehnološki projekt za industrijsko pridobivanje spojin, zato se idejo obravnavali tudi iz podjetniške perspektive.

== Načrt in izvedba ==

=== SINTEZA TERPENOV V ''S. cerevisiae'' ===

Za šasijo je skupina izbrala dobro okarakteriziran organizem kvasovko ''S. cerevisiae'', saj so vrednosti izkoristkov sinteze in hitrosti metabolične poti terpenov pridobljene iz prejšnjih raziskav industrijsko relevantne. Dodatno prednost so videli tudi v enostavni genski manipulaciji. Ker terpeni niso (α- in β-jonon, linalol, dihidro-β-jonon) naravno prisotni v šasijskem organizmu, je skupina najprej identificirala encime, ki sodelujejo v sintetskih poteh. Uporabljeni geni za encime izvirajo iz različnih rastlinskih vrst, ki so v nadaljevanju navedene ob imen encimov.
Jononi se v rastlinah sintetizirajo iz likopena. Ta se najprej pretvori v ε- oziroma β-karoten (karotenoid cepitvena dioksigenaza 1 – CCD1- ''Osmanthus fragrans'','' Petunia hybrida''), nato po drugi encimski pretvorbi nastane α-jonon (likopen ε-ciklaza -LcyE - ''Latuca sativa'') oziroma β-jonon (likopen β -ciklaza – CrtY- ''Pantoea ananatis''); slednjega po dodatni encimski reakciji nastane dihidro-β-jonon (enoat reduktaza- DBR1- ''Artemisia annua''). Linalol sodi v skupino monoterpenoidov, sintezo katalizira encim linalol sintaza, ki pretvarja geranil difosfat v linalol. Gen za linalol sintazo iz Lavandula angustifolia so uporabili, saj je bil že predhodno uporabljen za sintezo linalola v kvasovkah. Da da bi ujeli časovni okvir projekta so uporabili gensko spremenjen sev (yGPP034 ipENZ011 ipENZ078) kvasovke, ki že proizvaja likopen [1,3].

Na osnovi predhodnih raziskav na ''E.Coli'' so študentje pripravili genske konstrukte za fuzijske proteine (LycE- OfCCD1-in CRTY- PhCCD1) in s tem poskušali rešiti problem kolokalizacije encima (CCD1) in substrata, ki katalizira hitrost določujočo encimsko reakcijo. Vzporedno so pripravili še konstrukt, kjer sta nastala encima CCD1 in CrtY ločena, CCD1 pa je preko peptidnega sidra vstavljen v membrano. Tak pristop se je v prejšnjih raziskavah izkazal za učinkovitega, pri čemer se je povišala sinteza β-jonona.Za sintezo α- in β-jonona so pripravili 3 različne plazmide (pVIOLETTE za sintezo α-jonona z inducibilnim galaktoznim promotorjem PGAL1 , pFRAMBOISE-fused in pFRAMBOISE-notfused za sintezo β-jonona z inducibilnim PTetO7 in rtTA aktivatorjem). Za sintezo linalola in dihidro-β-jonona pa so ustvarili plazmid pFLEUR; gen za enoat reduktaza je pod kontrolo estradiol inducibilnega promotorja PZ3eV, gen za linalol sintazo pa pod kontrolo Cu-inducibilnega promotorja PCUP1 .
S PCR metodo pomnoženi genski konstrukti so bili vstavljeni v integracijske vektorje z uporabo metode In Fusion. Temu je sledila transfekcija v izbran ekspresijski sev. Z metodo PCR na osnovi kolonije kvasovk so preverili uspešnost transfekcije. Temu je sledila nadaljnja izvedba v bioreaktorjih [1,7].

=== SINTEZA ALDEHIDOV V ''S. elongatus '' ===

Skupina je kot avtotrofni šasijski organizem uporabila ''Synechococcus elongatus'' UTEX 2973, zaradi hitre rasti; primerljive z določenimi vrstami kvasovk, učinkovito gensko modifikacijo pa dosežemo z uporabo tristarševske konjugacije z ''E.Coli''[1,4].

Znano je, da mnoge cianobakterije ob stresnih pogoju za zmanjšanje osmotskega stresa kopičijo saharozo. ''Synechococcus elongatus'' UTEX 2973 CscB+ je bil gensko spremenjen do te mere, da izraža saharoza/ H+ simporter – CscB+, povišan pa je nivo tudi drugih encimov vključenih v metabolni poti saharoze, kar omogoča izločanje saharoze v odsotnosti stresnih pogojev (visoke konc. NaCl)[1,5].

''Synechococcus elongatus'' je cianobakterija, ki lahko v stresnih pogojih (visoke koncentracije CO2, intenzivna svetloba), proizvaja nenasičene maščobne kisline, ki so osnova za sintezo α-linolejske kisline, ta pa služi kot prekurzor za sintezo aldehidov, prisotnih v akordu vonja vijolic. Sinteza 2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol poteka po lipoksigenazni poti, v kateri sta vključena 2 encima lipoksigenaza (LOX), končno encimsko pretvorbo pa izvede encim hiroksiperoksid liaza (HPL). Zapisa za omenjena encima so vstavili v posebej ustvarjen plazmid pCONCOMBRE, ki omogoča integracijo v gostiteljski genom. Za pripravo plazmida so uporabili gen LOX iz '' Nicotiana benthamiana '' ter HPL iz ''Cucumis melo''. Nadzorovana ekspresija jej bila zagotovljena preko teofilin inducibilnega ribonukleotidnega stikalamodulatorja v povezavi s Ptrc promotorjem [1,6].

Integracija v genom ''Synechococcus elongatus'' je bila dosežena preko izvedbe tristarševske konjugacije z E.Coli, uspešnost integracije je bila preverjena z metodo PCR na osnovi kolonije cianobakterije. Kokultivacija je potekala v bioreaktorjih.

== Rezultati in potencialni prenos v industrijo ==

Rezultati agarozne gelske elektroforeze so pri obeh organizmih potrdili uspešno neodvisno integracijo v genom. Ob indukciji so na petrijevkah dokazali produkcijo jononov in pretvorbo likopena v β-karoten, zgolj prisotnost α-jonona so dodatno potrdili z RP-HPLC analizo. Analiza medija z GC-MS obeh kultur po dosežku stacionarne faze rast, je pokazala le prisotnost α-jonona, β-jonona. Preko testa encimske aktivnosti DBR1 pa so dokazali prisotnost dihidro-β-jonona. Tekom poskusov so prav tako uspeli potrditi, da lahko kvasovke uspevajo v gojišču s saharozo izločeno s strani cianobakterij. Problem potreben optimizacije je predstavljala nezadostna koncentracija saharoze za preživetje kvasovk tekom daljšega časovnem obdobju [1,7].

Izdelava podjetniškega načrta je pokazala, da bi z optimizacijo količine proizvoda za 10-krat lahko dosegli konkurenčni sistem. Okvirna cena produkta se brez optimizacije giblje okoli 4 000 € na 1 kg olja z vonjem po vijolicah[8].

== Viri in literatura ==

[1] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-org https://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Description (Pridobljeno 28.4.2022)

[2] Perfume Market: Industry Trends, Size, Share, Analysis & Forecast 2021-2026 (Pridobljeno 6.7.2021)

[3] Chen X, Shukal S, Zhang C. 2019. Integrating Enzyme and Metabolic Engineering Tools for Enhanced α-Ionone Production. J Agric Food Chem. 67(49):13451–13459. doi:10.1021/acs.jafc.9b00860

[4] Yu J, Liberton M, Cliften P, Head R, Jacobs J, Smith R, Koppenaal D, Brand J, Pakrasi H. 2015. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific reports. 5:8132. doi:10.1038/srep08132

[5] Lin P-C, Zhang F, Pakrasi HB. 2020. Enhanced production of sucrose in the fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Scientific Reports. 10(1):390. doi:10.1038/s41598-019-57319-5.

[6] Nakahira Y, Ogawa A, Asano H, Oyama T, Tozawa Y. 2013. Theophylline-dependent riboswitch as a novel genetic tool for strict regulation of protein expression in Cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942. Plant Cell Physiol. 54(10):1724–1735. doi:10.1093/pcp/pct115.

[7] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-Results orghttps://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Results#a4 (Pridobljeno 28.4.2022)

[8] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-Enterpreneurship orghttps://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/ Entrepreneurship (Pridobljeno 28.4.2022)

ELIXIO -Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah

2022-05-09T20:01:01Z

Ajda Godec:

Projekt »ELIXIO- mikrobni konzorcij za proizvodnjo trajnostne arome vijolic« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021, kjer si je skupina prislužila zlato medaljo za svoj projekt. Zasnovala ga je skupina Toulouse_INSA-UPS, ki je želela z uporabo metod sintezne biologije ustvariti trajnosten, okolju prijazen način proizvodnje naravne arome z vonjem po vijolicah.

Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: https://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Description

Avtorica povzetka: Ajda Godec

== Problem ==

Vonj predstavlja med različnimi živalskimi vrstami, tudi med ljudmi, poseben kulturni in socialni fenomen. Prav zaradi tega se molekule, ki sestavljajo mnoge arome, uporabljene v različnih kozmetičnih produktih, predvsem pa bile osnova za razcvet danes ogromne parfumske industrije, ki je leta 2020 dosegla vrednost 32,8 bilijonov ameriških dolarjev, slednja vrednost pa se zdaleč ni končna. Na področju parfumske industrije Francija zavzema pomembno vlogo, ki jo pogosto povezujejo s produkti visoke kvalitete, prestiža in tradicije. Parfume delimo na štiri osnovne olfaktorne skupine, med njimi je tudi cvetlična, ki se nadalje deli v 10 podskupin. Večino teh esenc pridobivamo iz naravnih virov, najpogosteje iz cvetnih listov. Obstaja pa precejšen nabor cvetlic (t.i neme cvetlice), iz katerih je nemogoče pridobiti esenco z industrijsko signifikantnim izkoristkom. V to skupino uvrščamo vijolice, hiacinte, lilije ipd. Zato se v kozmetični in parfumski industriji za posnemanje vonjev teh cvetlic uporabljajo sintetično pridobljene molekule, ki v določenem razmerju dajo želeno vonjavo. Tak način proizvodnje dišavnih molekul je ekološko zelo obremenjujoč, reakcije potekajo pod ostrimi fizikalno-kemijskimi pogoji, izhodiščno molekula pa pogosto predstavlja petrolej. Po drugi strani pa ekstrakcija parfumskega olja iz naravnega materiala zahteva ogromne količine le-tega, uporabo organskih topil ali vode kot topila, in porabo velike količine električne energije. Trg pa kljub temu izkazuje vedno več zanimanja in nudi večjo podporo naravno pridobljenim spojinam. Da bi lahko zadostili tem potrebam in ohranili konkurenčnost vodilna podjetja (npr. Givaudan, International Flavors and Fragrances, Symrise itd) na tem področju kombinirajo uporabo teh metod, vedno bolj pa vključujejo tudi biotehnološke metode pridelave. Vonj po vijolicah opisuje mešanico spojin, med katerimi velja točno določeno razmerje. Najpomembnejše spojine, ki sestavljajo akord so: α- in β-jonon, linalol, v manjši meri pa tudi dihidro-β-jonon. Te molekule uvrščamo v družino terpenov. Akord z bolj zelenimi notami dopolnjujeta (2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol [1,2].

== Cilj ==

Skupina francoskih študentov se odločila za pripravo mikrobnega konzorcija z indukcijskimi sistemi, s katerimi bodo dosegli proizvodnjo želenega razmerja dveh glavnih tipov spojin (terpeni in aldehidi), ki oblikujejo akord arome vijolic, simbolične cvetlice mesta Tolouse. Vsaka izmed skupin spojin je sintetizirana po ločeni metabolni poti. Tako so kot šasijo uporabili 2 različna organizma (avtotrofni in heterotrofni), v vsakem izmed njih pa bo potekala ločena metabolna pot. Za proizvodnjo terpenov so izbrali kvasovko Saccharomyces cerevisiae, sinteza aldehidov pa bo potekala v cianobakterijah ''Synechococcus elongatus'' UTEX 297 CscB+. Cianobakterija je bila gensko spremenjena z namenom, da izloča v gojišče saharozo, ki služi kot vir ogljika za heterotrofno kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae''. Takšna proizvodnja ustreza kriterijem trajnostnega in okolju prijaznega načina pridobivanja spojin, saj je osnova za sintezo molekul le CO2. Po drugi strani pa so dišave proizvedene tekom biotehnoloških procesov po regulativah EU in ZDA obravnavane kot naravno pridobljene. Glavni cilj skupine je bil ustvariti biotehnološki projekt za industrijsko pridobivanje spojin, zato se idejo obravnavali tudi iz podjetniške perspektive.

== Načrt in izvedba ==

=== SINTEZA TERPENOV V ''S. cerevisiae'' ===

Za šasijo je skupina izbrala dobro okarakteriziran organizem kvasovko ''S. cerevisiae'', saj so vrednosti izkoristkov sinteze in hitrosti metabolične poti terpenov pridobljene iz prejšnjih raziskav industrijsko relevantne. Dodatno prednost so videli tudi v enostavni genski manipulaciji. Ker terpeni niso (α- in β-jonon, linalol, dihidro-β-jonon) naravno prisotni v šasijskem organizmu, je skupina najprej identificirala encime, ki sodelujejo v sintetskih poteh. Uporabljeni geni za encime izvirajo iz različnih rastlinskih vrst, ki so v nadaljevanju navedene ob imen encimov.
Jononi se v rastlinah sintetizirajo iz likopena. Ta se najprej pretvori v ε- oziroma β-karoten (karotenoid cepitvena dioksigenaza 1 – CCD1- ''Osmanthus fragrans'','' Petunia hybrida''), nato po drugi encimski pretvorbi nastane α-jonon (likopen ε-ciklaza -LcyE - ''Latuca sativa'') oziroma β-jonon (likopen β -ciklaza – CrtY- ''Pantoea ananatis''); slednjega po dodatni encimski reakciji nastane dihidro-β-jonon (enoat reduktaza- DBR1- ''Artemisia annua''). Linalol sodi v skupino monoterpenoidov, sintezo katalizira encim linalol sintaza, ki pretvarja geranil difosfat v linalol. Gen za linalol sintazo iz Lavandula angustifolia so uporabili, saj je bil že predhodno uporabljen za sintezo linalola v kvasovkah. Da da bi ujeli časovni okvir projekta so uporabili gensko spremenjen sev (yGPP034 ipENZ011 ipENZ078) kvasovke, ki že proizvaja likopen [1,3].

Na osnovi predhodnih raziskav na ''E.Coli'' so študentje pripravili genske konstrukte za fuzijske proteine (LycE- OfCCD1-in CRTY- PhCCD1) in s tem poskušali rešiti problem kolokalizacije encima (CCD1) in substrata, ki katalizira hitrost določujočo encimsko reakcijo. Vzporedno so pripravili še konstrukt, kjer sta nastala encima CCD1 in CrtY ločena, CCD1 pa je preko peptidnega sidra vstavljen v membrano. Tak pristop se je v prejšnjih raziskavah izkazal za učinkovitega, pri čemer se je povišala sinteza β-jonona.Za sintezo α- in β-jonona so pripravili 3 različne plazmide (pVIOLETTE za sintezo α-jonona z inducibilnim galaktoznim promotorjem PGAL1 , pFRAMBOISE-fused in pFRAMBOISE-notfused za sintezo β-jonona z inducibilnim PTetO7 in rtTA aktivatorjem). Za sintezo linalola in dihidro-β-jonona pa so ustvarili plazmid pFLEUR; gen za enoat reduktaza je pod kontrolo estradiol inducibilnega promotorja PZ3eV, gen za linalol sintazo pa pod kontrolo Cu-inducibilnega promotorja PCUP1 .
S PCR metodo pomnoženi genski konstrukti so bili vstavljeni v integracijske vektorje z uporabo metode In Fusion. Temu je sledila transfekcija v izbran ekspresijski sev. Z metodo PCR na osnovi kolonije kvasovk so preverili uspešnost transfekcije. Temu je sledila nadaljnja izvedba v bioreaktorjih [1,7].

=== SINTEZA ALDEHIDOV V ''S. elongatus '' ===

Skupina je kot avtotrofni šasijski organizem uporabila ''Synechococcus elongatus'' UTEX 2973, zaradi hitre rasti; primerljive z določenimi vrstami kvasovk, učinkovito gensko modifikacijo pa dosežemo z uporabo tristarševske konjugacije z ''E.Coli''[1,4].

Znano je, da mnoge cianobakterije ob stresnih pogoju za zmanjšanje osmotskega stresa kopičijo saharozo. ''Synechococcus elongatus'' UTEX 2973 CscB+ je bil gensko spremenjen do te mere, da izraža saharoza/ H+ simporter – CscB+, povišan pa je nivo tudi drugih encimov vključenih v metabolni poti saharoze, kar omogoča izločanje saharoze v odsotnosti stresnih pogojev (visoke konc. NaCl)[1,5].

''Synechococcus elongatus'' je cianobakterija, ki lahko v stresnih pogojih (visoke koncentracije ogljikovega dioksida, intenzivna svetloba), proizvaja nenasičene maščobne kisline, ki so osnova za sintezo α-linolejske kisline, ta pa služi kot prekurzor za sintezo aldehidov, prisotnih v akordu vonja vijolic. Sinteza 2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol poteka po lipoksigenazni poti, v kateri sta vključena 2 encima lipoksigenaza (LOX), končno encimsko pretvorbo pa izvede encim hiroksiperoksid liaza (HPL). Zapisa za omenjena encima so vstavili v posebej ustvarjen plazmid pCONCOMBRE, ki omogoča integracijo v gostiteljski genom. Za pripravo plazmida so uporabili gen LOX iz '' Nicotiana benthamiana '' ter HPL iz ''Cucumis melo''. Nadzorovana ekspresija jej bila zagotovljena preko teofilin inducibilnega ribonukleotidnega stikalamodulatorja v povezavi s Ptrc promotorjem [1,6].

Integracija v genom ''Synechococcus elongatus'' je bila dosežena preko izvedbe tristarševske konjugacije z E.Coli, uspešnost integracije je bila preverjena z metodo PCR na osnovi kolonije cianobakterije. Kokultivacija je potekala v bioreaktorjih.

== Rezultati in potencialni prenos v industrijo ==

Rezultati agarozne gelske elektroforeze so pri obeh organizmih potrdili uspešno neodvisno integracijo v genom. Ob indukciji so na petrijevkah dokazali produkcijo jononov in pretvorbo likopena v β-karoten, zgolj prisotnost α-jonona so dodatno potrdili z RP-HPLC analizo. Analiza medija z GC-MS obeh kultur po dosežku stacionarne faze rast, je pokazala le prisotnost α-jonona, β-jonona. Preko testa encimske aktivnosti DBR1 pa so dokazali prisotnost dihidro-β-jonona. Tekom poskusov so prav tako uspeli potrditi, da lahko kvasovke uspevajo v gojišču s saharozo izločeno s strani cianobakterij. Problem potreben optimizacije je predstavljala nezadostna koncentracija saharoze za preživetje kvasovk tekom daljšega časovnem obdobju [1,7].

Izdelava podjetniškega načrta je pokazala, da bi z optimizacijo količine proizvoda za 10-krat lahko dosegli konkurenčni sistem. Okvirna cena produkta se brez optimizacije giblje okoli 4 000 € na 1 kg olja z vonjem po vijolicah[8].

== Viri in literatura ==

[1] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-org https://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Description (Pridobljeno 28.4.2022)

[2] Perfume Market: Industry Trends, Size, Share, Analysis & Forecast 2021-2026 (Pridobljeno 6.7.2021)

[3] Chen X, Shukal S, Zhang C. 2019. Integrating Enzyme and Metabolic Engineering Tools for Enhanced α-Ionone Production. J Agric Food Chem. 67(49):13451–13459. doi:10.1021/acs.jafc.9b00860

[4] Yu J, Liberton M, Cliften P, Head R, Jacobs J, Smith R, Koppenaal D, Brand J, Pakrasi H. 2015. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific reports. 5:8132. doi:10.1038/srep08132

[5] Lin P-C, Zhang F, Pakrasi HB. 2020. Enhanced production of sucrose in the fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Scientific Reports. 10(1):390. doi:10.1038/s41598-019-57319-5.

[6] Nakahira Y, Ogawa A, Asano H, Oyama T, Tozawa Y. 2013. Theophylline-dependent riboswitch as a novel genetic tool for strict regulation of protein expression in Cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942. Plant Cell Physiol. 54(10):1724–1735. doi:10.1093/pcp/pct115.

[7] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-Results orghttps://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Results#a4 (Pridobljeno 28.4.2022)

[8] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-Enterpreneurship orghttps://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/ Entrepreneurship (Pridobljeno 28.4.2022)

ELIXIO -Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah

2022-05-09T20:00:08Z

Ajda Godec:

Projekt »ELIXIO- mikrobni konzorcij za proizvodnjo trajnostne arome vijolic« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021, kjer si je skupina prislužila zlato medaljo za svoj projekt. Zasnovala ga je skupina Toulouse_INSA-UPS, ki je želela z uporabo metod sintezne biologije ustvariti trajnosten, okolju prijazen način proizvodnje naravne arome z vonjem po vijolicah.

Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: https://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Description

Avtorica povzetka: Ajda Godec

== Problem ==

Vonj predstavlja med različnimi živalskimi vrstami, tudi med ljudmi, poseben kulturni in socialni fenomen. Prav zaradi tega se molekule, ki sestavljajo mnoge arome, uporabljene v različnih kozmetičnih produktih, predvsem pa bile osnova za razcvet danes ogromne parfumske industrije, ki je leta 2020 dosegla vrednost 32,8 bilijonov ameriških dolarjev, slednja vrednost pa se zdaleč ni končna. Na področju parfumske industrije Francija zavzema pomembno vlogo, ki jo pogosto povezujejo s produkti visoke kvalitete, prestiža in tradicije. Parfume delimo na štiri osnovne olfaktorne skupine, med njimi je tudi cvetlična, ki se nadalje deli v 10 podskupin. Večino teh esenc pridobivamo iz naravnih virov, najpogosteje iz cvetnih listov. Obstaja pa precejšen nabor cvetlic (t.i neme cvetlice), iz katerih je nemogoče pridobiti esenco z industrijsko signifikantnim izkoristkom. V to skupino uvrščamo vijolice, hiacinte, lilije ipd. Zato se v kozmetični in parfumski industriji za posnemanje vonjev teh cvetlic uporabljajo sintetično pridobljene molekule, ki v določenem razmerju dajo želeno vonjavo. Tak način proizvodnje dišavnih molekul je ekološko zelo obremenjujoč, reakcije potekajo pod ostrimi fizikalno-kemijskimi pogoji, izhodiščno molekula pa pogosto predstavlja petrolej. Po drugi strani pa ekstrakcija parfumskega olja iz naravnega materiala zahteva ogromne količine le-tega, uporabo organskih topil ali vode kot topila, in porabo velike količine električne energije. Trg pa kljub temu izkazuje vedno več zanimanja in nudi večjo podporo naravno pridobljenim spojinam. Da bi lahko zadostili tem potrebam in ohranili konkurenčnost vodilna podjetja (npr. Givaudan, International Flavors and Fragrances, Symrise itd) na tem področju kombinirajo uporabo teh metod, vedno bolj pa vključujejo tudi biotehnološke metode pridelave. Vonj po vijolicah opisuje mešanico spojin, med katerimi velja točno določeno razmerje. Najpomembnejše spojine, ki sestavljajo akord so: α- in β-jonon, linalol, v manjši meri pa tudi dihidro-β-jonon. Te molekule uvrščamo v družino terpenov. Akord z bolj zelenimi notami dopolnjujeta (2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol [1,2].

== Cilj ==

Skupina francoskih študentov se odločila za pripravo mikrobnega konzorcija z indukcijskimi sistemi, s katerimi bodo dosegli proizvodnjo želenega razmerja dveh glavnih tipov spojin (terpeni in aldehidi), ki oblikujejo akord arome vijolic, simbolične cvetlice mesta Tolouse. Vsaka izmed skupin spojin je sintetizirana po ločeni metabolni poti. Tako so kot šasijo uporabili 2 različna organizma (avtotrofni in heterotrofni), v vsakem izmed njih pa bo potekala ločena metabolna pot. Za proizvodnjo terpenov so izbrali kvasovko Saccharomyces cerevisiae, sinteza aldehidov pa bo potekala v cianobakterijah ''Synechococcus elongatus'' UTEX 297 CscB+. Cianobakterija je bila gensko spremenjena z namenom, da izloča v gojišče saharozo, ki služi kot vir ogljika za heterotrofno kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae''. Takšna proizvodnja ustreza kriterijem trajnostnega in okolju prijaznega načina pridobivanja spojin, saj je osnova za sintezo molekul le CO2. Po drugi strani pa so dišave proizvedene tekom biotehnoloških procesov po regulativah EU in ZDA obravnavane kot naravno pridobljene. Glavni cilj skupine je bil ustvariti biotehnološki projekt za industrijsko pridobivanje spojin, zato se idejo obravnavali tudi iz podjetniške perspektive.

== Načrt in izvedba ==

=== SINTEZA TERPENOV V ''S. cerevisiae'' ===

Za šasijo je skupina izbrala dobro okarakteriziran organizem kvasovko ''S. cerevisiae'', saj so vrednosti izkoristkov sinteze in hitrosti metabolične poti terpenov pridobljene iz prejšnjih raziskav industrijsko relevantne. Dodatno prednost so videli tudi v enostavni genski manipulaciji. Ker terpeni niso (α- in β-jonon, linalol, dihidro-β-jonon) naravno prisotni v šasijskem organizmu, je skupina najprej identificirala encime, ki sodelujejo v sintetskih poteh. Uporabljeni geni za encime izvirajo iz različnih rastlinskih vrst, ki so v nadaljevanju navedene ob imen encimov.
Jononi se v rastlinah sintetizirajo iz likopena. Ta se najprej pretvori v ε- oziroma β-karoten (karotenoid cepitvena dioksigenaza 1 – CCD1- ''Osmanthus fragrans'','' Petunia hybrida''), nato po drugi encimski pretvorbi nastane α-jonon (likopen ε-ciklaza -LcyE - ''Latuca sativa'') oziroma β-jonon (likopen β -ciklaza – CrtY- ''Pantoea ananatis''); slednjega po dodatni encimski reakciji nastane dihidro-β-jonon (enoat reduktaza- DBR1- ''Artemisia annua''). Linalol sodi v skupino monoterpenoidov, sintezo katalizira encim linalol sintaza, ki pretvarja geranil difosfat v linalol. Gen za linalol sintazo iz Lavandula angustifolia so uporabili, saj je bil že predhodno uporabljen za sintezo linalola v kvasovkah. Da da bi ujeli časovni okvir projekta so uporabili gensko spremenjen sev (yGPP034 ipENZ011 ipENZ078) kvasovke, ki že proizvaja likopen [1,3].

Na osnovi predhodnih raziskav na ''E.Coli'' so študentje pripravili genske konstrukte za fuzijske proteine (LycE- OfCCD1-in CRTY- PhCCD1) in s tem poskušali rešiti problem kolokalizacije encima (CCD1) in substrata, ki katalizira hitrost določujočo encimsko reakcijo. Vzporedno so pripravili še konstrukt, kjer sta nastala encima CCD1 in CrtY ločena, CCD1 pa je preko peptidnega sidra vstavljen v membrano. Tak pristop se je v prejšnjih raziskavah izkazal za učinkovitega, pri čemer se je povišala sinteza β-jonona.Za sintezo α- in β-jonona so pripravili 3 različne plazmide (pVIOLETTE za sintezo α-jonona z inducibilnim galaktoznim promotorjem PGAL1 , pFRAMBOISE-fused in pFRAMBOISE-notfused za sintezo β-jonona z inducibilnim PTetO7 in rtTA aktivatorjem). Za sintezo linalola in dihidro-β-jonona pa so ustvarili plazmid pFLEUR; gen za enoat reduktaza je pod kontrolo estradiol inducibilnega promotorja PZ3eV, gen za linalol sintazo pa pod kontrolo Cu-inducibilnega promotorja PCUP1 .
S PCR metodo pomnoženi genski konstrukti so bili vstavljeni v integracijske vektorje z uporabo metode In Fusion. Temu je sledila transfekcija v izbran ekspresijski sev. Z metodo PCR na osnovi kolonije kvasovk so preverili uspešnost transfekcije. Temu je sledila nadaljnja izvedba v bioreaktorjih [1,7].

=== SINTEZA ALDEHIDOV V ''S. elongatus '' ===

Skupina je kot avtotrofni šasijski organizem uporabila ''Synechococcus elongatus'' UTEX 2973, zaradi hitre rasti; primerljive z določenimi vrstami kvasovk, učinkovito gensko modifikacijo pa dosežemo z uporabo tristarševske konjugacije z ''E.Coli''[1,4].

Znano je, da mnoge cianobakterije ob stresnih pogoju za zmanjšanje osmotskega stresa kopičijo saharozo. ''Synechococcus elongatus'' UTEX 2973 CscB+ je bil gensko spremenjen do te mere, da izraža saharoza/ H+ simporter – CscB+, povišan pa je nivo tudi drugih encimov vključenih v metabolni poti saharoze, kar omogoča izločanje saharoze v odsotnosti stresnih pogojev (visoke konc. NaCl)[1,5].

''Synechococcus elongatus'' je cianobakterija, ki lahko v stresnih pogojih (visoke koncentracije CO{{sub|2}}, intenzivna svetloba), proizvaja nenasičene maščobne kisline, ki so osnova za sintezo α-linolejske kisline, ta pa služi kot prekurzor za sintezo aldehidov, prisotnih v akordu vonja vijolic. Sinteza 2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol poteka po lipoksigenazni poti, v kateri sta vključena 2 encima lipoksigenaza (LOX), končno encimsko pretvorbo pa izvede encim hiroksiperoksid liaza (HPL). Zapisa za omenjena encima so vstavili v posebej ustvarjen plazmid pCONCOMBRE, ki omogoča integracijo v gostiteljski genom. Za pripravo plazmida so uporabili gen LOX iz '' Nicotiana benthamiana '' ter HPL iz ''Cucumis melo''. Nadzorovana ekspresija jej bila zagotovljena preko teofilin inducibilnega ribonukleotidnega stikalamodulatorja v povezavi s Ptrc promotorjem [1,6].

Integracija v genom ''Synechococcus elongatus'' je bila dosežena preko izvedbe tristarševske konjugacije z E.Coli, uspešnost integracije je bila preverjena z metodo PCR na osnovi kolonije cianobakterije. Kokultivacija je potekala v bioreaktorjih.

== Rezultati in potencialni prenos v industrijo ==

Rezultati agarozne gelske elektroforeze so pri obeh organizmih potrdili uspešno neodvisno integracijo v genom. Ob indukciji so na petrijevkah dokazali produkcijo jononov in pretvorbo likopena v β-karoten, zgolj prisotnost α-jonona so dodatno potrdili z RP-HPLC analizo. Analiza medija z GC-MS obeh kultur po dosežku stacionarne faze rast, je pokazala le prisotnost α-jonona, β-jonona. Preko testa encimske aktivnosti DBR1 pa so dokazali prisotnost dihidro-β-jonona. Tekom poskusov so prav tako uspeli potrditi, da lahko kvasovke uspevajo v gojišču s saharozo izločeno s strani cianobakterij. Problem potreben optimizacije je predstavljala nezadostna koncentracija saharoze za preživetje kvasovk tekom daljšega časovnem obdobju [1,7].

Izdelava podjetniškega načrta je pokazala, da bi z optimizacijo količine proizvoda za 10-krat lahko dosegli konkurenčni sistem. Okvirna cena produkta se brez optimizacije giblje okoli 4 000 € na 1 kg olja z vonjem po vijolicah[8].

== Viri in literatura ==

[1] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-org https://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Description (Pridobljeno 28.4.2022)

[2] Perfume Market: Industry Trends, Size, Share, Analysis & Forecast 2021-2026 (Pridobljeno 6.7.2021)

[3] Chen X, Shukal S, Zhang C. 2019. Integrating Enzyme and Metabolic Engineering Tools for Enhanced α-Ionone Production. J Agric Food Chem. 67(49):13451–13459. doi:10.1021/acs.jafc.9b00860

[4] Yu J, Liberton M, Cliften P, Head R, Jacobs J, Smith R, Koppenaal D, Brand J, Pakrasi H. 2015. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific reports. 5:8132. doi:10.1038/srep08132

[5] Lin P-C, Zhang F, Pakrasi HB. 2020. Enhanced production of sucrose in the fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Scientific Reports. 10(1):390. doi:10.1038/s41598-019-57319-5.

[6] Nakahira Y, Ogawa A, Asano H, Oyama T, Tozawa Y. 2013. Theophylline-dependent riboswitch as a novel genetic tool for strict regulation of protein expression in Cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942. Plant Cell Physiol. 54(10):1724–1735. doi:10.1093/pcp/pct115.

[7] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-Results orghttps://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Results#a4 (Pridobljeno 28.4.2022)

[8] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-Enterpreneurship orghttps://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/ Entrepreneurship (Pridobljeno 28.4.2022)

Seminarji SB 2021/22

2022-05-08T22:02:08Z

Ajda Godec:

V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_E._coli Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inžiniring_in_izkoriščanje_sintetične_alosterije_luciferaze_NanoLuc Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc] (Rebeka Dajčman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularen_RNA_interferenčni_sistem_za_regulacijo_multipleksnih_genov Modularen RNA interferenčni sistem za regulacijo multipleksnih genov] (Marko Pavleković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Označevanje_bioloških_celic_za_zanesljivo_celično_inženirstvo Označevanje bioloških celic za zanesljivo celično inženirstvo] (Neža Blaznik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_biosenzorjem_usmerjen_inžiniring_Cupriavidus_necator_H16_za_avtotrofno_proizvodnjo_manitola Z biosenzorjem usmerjen inžiniring ''Cupriavidus necator'' H16 za avtotrofno proizvodnjo manitola] (Teo Nograšek)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OpenPlast_-_kloroplastni_brezcelični_sistemi_za_hitrejšo_karakterizacijo_genetskih_delov OpenPlast - kloroplastni brezcelični sistemi za hitrejšo karakterizacijo genetskih delov] (Kim Glavič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana PHEAST - ''P. pastoris'' za odstranjevanje metana] (Ana Potočnik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ELIXIO_-Mikrobni_konzorcij_za_vonj_po_vijolicah ELIXIO Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah] (Ajda Godec) 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

ELIXIO -Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah-ELIXIO-

2022-05-08T22:01:10Z

Ajda Godec: ELIXIO -Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah-ELIXIO- moved to ELIXIO -Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah

#REDIRECT [[ELIXIO -Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah]]

ELIXIO -Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah

2022-05-08T22:01:10Z

Ajda Godec: ELIXIO -Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah-ELIXIO- moved to ELIXIO -Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah

Projekt »ELIXIO- mikrobni konzorcij za proizvodnjo trajnostne arome vijolic« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021, kjer si je skupina prislužila zlato medaljo za svoj projekt. Zasnovala ga je skupina Toulouse_INSA-UPS, ki je želela z uporabo metod sintezne biologije ustvariti trajnosten, okolju prijazen način proizvodnje naravne arome z vonjem po vijolicah.

Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: https://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Description

Avtorica povzetka: Ajda Godec

== Problem ==

Vonj predstavlja med različnimi živalskimi vrstami, tudi med ljudmi, poseben kulturni in socialni fenomen. Prav zaradi tega se molekule, ki sestavljajo mnoge arome, uporabljene v različnih kozmetičnih produktih, predvsem pa bile osnova za razcvet danes ogromne parfumske industrije, ki je leta 2020 dosegla vrednost 32,8 bilijonov ameriških dolarjev, slednja vrednost pa se zdaleč ni končna. Na področju parfumske industrije Francija zavzema pomembno vlogo, ki jo pogosto povezujejo s produkti visoke kvalitete, prestiža in tradicije. Parfume delimo na štiri osnovne olfaktorne skupine, med njimi je tudi cvetlična, ki se nadalje deli v 10 podskupin. Večino teh esenc pridobivamo iz naravnih virov, najpogosteje iz cvetnih listov. Obstaja pa precejšen nabor cvetlic (t.i neme cvetlice), iz katerih je nemogoče pridobiti esenco z industrijsko signifikantnim izkoristkom. V to skupino uvrščamo vijolice, hiacinte, lilije ipd. Zato se v kozmetični in parfumski industriji za posnemanje vonjev teh cvetlic uporabljajo sintetično pridobljene molekule, ki v določenem razmerju dajo želeno vonjavo. Tak način proizvodnje dišavnih molekul je ekološko zelo obremenjujoč, reakcije potekajo pod ostrimi fizikalno-kemijskimi pogoji, izhodiščno molekula pa pogosto predstavlja petrolej. Po drugi strani pa ekstrakcija parfumskega olja iz naravnega materiala zahteva ogromne količine le-tega, uporabo organskih topil ali vode kot topila, in porabo velike količine električne energije. Trg pa kljub temu izkazuje vedno več zanimanja in nudi večjo podporo naravno pridobljenim spojinam. Da bi lahko zadostili tem potrebam in ohranili konkurenčnost vodilna podjetja (npr. Givaudan, International Flavors and Fragrances, Symrise itd) na tem področju kombinirajo uporabo teh metod, vedno bolj pa vključujejo tudi biotehnološke metode pridelave. Vonj po vijolicah opisuje mešanico spojin, med katerimi velja točno določeno razmerje. Najpomembnejše spojine, ki sestavljajo akord so: α- in β-jonon, linalol, v manjši meri pa tudi dihidro-β-jonon. Te molekule uvrščamo v družino terpenov. Akord z bolj zelenimi notami dopolnjujeta (2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol [1,2].

== Cilj ==

Skupina francoskih študentov se odločila za pripravo mikrobnega konzorcija z indukcijskimi sistemi, s katerimi bodo dosegli proizvodnjo želenega razmerja dveh glavnih tipov spojin (terpeni in aldehidi), ki oblikujejo akord arome vijolic, simbolične cvetlice mesta Tolouse. Vsaka izmed skupin spojin je sintetizirana po ločeni metabolni poti. Tako so kot šasijo uporabili 2 različna organizma (avtotrofni in heterotrofni), v vsakem izmed njih pa bo potekala ločena metabolna pot. Za proizvodnjo terpenov so izbrali kvasovko Saccharomyces cerevisiae, sinteza aldehidov pa bo potekala v cianobakterijah ''Synechococcus elongatus'' UTEX 297 CscB+. Cianobakterija je bila gensko spremenjena z namenom, da izloča v gojišče saharozo, ki služi kot vir ogljika za heterotrofno kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae''. Takšna proizvodnja ustreza kriterijem trajnostnega in okolju prijaznega načina pridobivanja spojin, saj je osnova za sintezo molekul le CO2. Po drugi strani pa so dišave proizvedene tekom biotehnoloških procesov po regulativah EU in ZDA obravnavane kot naravno pridobljene. Glavni cilj skupine je bil ustvariti biotehnološki projekt za industrijsko pridobivanje spojin, zato se idejo obravnavali tudi iz podjetniške perspektive.

== Načrt in izvedba ==

=== SINTEZA TERPENOV V ''S. cerevisiae'' ===

Za šasijo je skupina izbrala dobro okarakteriziran organizem kvasovko ''S. cerevisiae'', saj so vrednosti izkoristkov sinteze in hitrosti metabolične poti terpenov pridobljene iz prejšnjih raziskav industrijsko relevantne. Dodatno prednost so videli tudi v enostavni genski manipulaciji. Ker terpeni niso (α- in β-jonon, linalol, dihidro-β-jonon) naravno prisotni v šasijskem organizmu, je skupina najprej identificirala encime, ki sodelujejo v sintetskih poteh. Uporabljeni geni za encime izvirajo iz različnih rastlinskih vrst, ki so v nadaljevanju navedene ob imen encimov.
Jononi se v rastlinah sintetizirajo iz likopena. Ta se najprej pretvori v ε- oziroma β-karoten (karotenoid cepitvena dioksigenaza 1 – CCD1- ''Osmanthus fragrans'','' Petunia hybrida''), nato po drugi encimski pretvorbi nastane α-jonon (likopen ε-ciklaza -LcyE - ''Latuca sativa'') oziroma β-jonon (likopen β -ciklaza – CrtY- ''Pantoea ananatis''); slednjega po dodatni encimski reakciji nastane dihidro-β-jonon (enoat reduktaza- DBR1- ''Artemisia annua''). Linalol sodi v skupino monoterpenoidov, sintezo katalizira encim linalol sintaza, ki pretvarja geranil difosfat v linalol. Gen za linalol sintazo iz Lavandula angustifolia so uporabili, saj je bil že predhodno uporabljen za sintezo linalola v kvasovkah. Da da bi ujeli časovni okvir projekta so uporabili gensko spremenjen sev (yGPP034 ipENZ011 ipENZ078) kvasovke, ki že proizvaja likopen [1,3].

Na osnovi predhodnih raziskav na ''E.Coli'' so študentje pripravili genske konstrukte za fuzijske proteine (LycE- OfCCD1-in CRTY- PhCCD1) in s tem poskušali rešiti problem kolokalizacije encima (CCD1) in substrata, ki katalizira hitrost določujočo encimsko reakcijo. Vzporedno so pripravili še konstrukt, kjer sta nastala encima CCD1 in CrtY ločena, CCD1 pa je preko peptidnega sidra vstavljen v membrano. Tak pristop se je v prejšnjih raziskavah izkazal za učinkovitega, pri čemer se je povišala sinteza β-jonona.Za sintezo α- in β-jonona so pripravili 3 različne plazmide (pVIOLETTE za sintezo α-jonona z inducibilnim galaktoznim promotorjem PGAL1 , pFRAMBOISE-fused in pFRAMBOISE-notfused za sintezo β-jonona z inducibilnim PTetO7 in rtTA aktivatorjem). Za sintezo linalola in dihidro-β-jonona pa so ustvarili plazmid pFLEUR; gen za enoat reduktaza je pod kontrolo estradiol inducibilnega promotorja PZ3eV, gen za linalol sintazo pa pod kontrolo Cu-inducibilnega promotorja PCUP1 .
S PCR metodo pomnoženi genski konstrukti so bili vstavljeni v integracijske vektorje z uporabo metode In Fusion. Temu je sledila transfekcija v izbran ekspresijski sev. Z metodo PCR na osnovi kolonije kvasovk so preverili uspešnost transfekcije. Temu je sledila nadaljnja izvedba v bioreaktorjih [1,7].

=== SINTEZA ALDEHIDOV V ''S. elongatus '' ===

Skupina je kot avtotrofni šasijski organizem uporabila ''Synechococcus elongatus'' UTEX 2973, zaradi hitre rasti; primerljive z določenimi vrstami kvasovk, učinkovito gensko modifikacijo pa dosežemo z uporabo tristarševske konjugacije z ''E.Coli''[1,4].

Znano je, da mnoge cianobakterije ob stresnih pogoju za zmanjšanje osmotskega stresa kopičijo saharozo. ''Synechococcus elongatus'' UTEX 2973 CscB+ je bil gensko spremenjen do te mere, da izraža saharoza/ H+ simporter – CscB+, povišan pa je nivo tudi drugih encimov vključenih v metabolni poti saharoze, kar omogoča izločanje saharoze v odsotnosti stresnih pogojev (visoke konc. NaCl)[1,5].

''Synechococcus elongatus'' je cianobakterija, ki lahko v stresnih pogojih (visoke koncentracije CO2 , intenzivna svetloba), proizvaja nenasičene maščobne kisline, ki so osnova za sintezo α-linolejske kisline, ta pa služi kot prekurzor za sintezo aldehidov, prisotnih v akordu vonja vijolic. Sinteza 2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol poteka po lipoksigenazni poti, v kateri sta vključena 2 encima lipoksigenaza (LOX), končno encimsko pretvorbo pa izvede encim hiroksiperoksid liaza (HPL). Zapisa za omenjena encima so vstavili v posebej ustvarjen plazmid pCONCOMBRE, ki omogoča integracijo v gostiteljski genom. Za pripravo plazmida so uporabili gen LOX iz '' Nicotiana benthamiana '' ter HPL iz ''Cucumis melo''. Nadzorovana ekspresija jej bila zagotovljena preko teofilin inducibilnega ribonukleotidnega stikalamodulatorja v povezavi s Ptrc promotorjem [1,6].

Integracija v genom ''Synechococcus elongatus'' je bila dosežena preko izvedbe tristarševske konjugacije z E.Coli, uspešnost integracije je bila preverjena z metodo PCR na osnovi kolonije cianobakterije. Kokultivacija je potekala v bioreaktorjih.

== Rezultati in potencialni prenos v industrijo ==

Rezultati agarozne gelske elektroforeze so pri obeh organizmih potrdili uspešno neodvisno integracijo v genom. Ob indukciji so na petrijevkah dokazali produkcijo jononov in pretvorbo likopena v β-karoten, zgolj prisotnost α-jonona so dodatno potrdili z RP-HPLC analizo. Analiza medija z GC-MS obeh kultur po dosežku stacionarne faze rast, je pokazala le prisotnost α-jonona, β-jonona. Preko testa encimske aktivnosti DBR1 pa so dokazali prisotnost dihidro-β-jonona. Tekom poskusov so prav tako uspeli potrditi, da lahko kvasovke uspevajo v gojišču s saharozo izločeno s strani cianobakterij. Problem potreben optimizacije je predstavljala nezadostna koncentracija saharoze za preživetje kvasovk tekom daljšega časovnem obdobju [1,7].

Izdelava podjetniškega načrta je pokazala, da bi z optimizacijo količine proizvoda za 10-krat lahko dosegli konkurenčni sistem. Okvirna cena produkta se brez optimizacije giblje okoli 4 000 € na 1 kg olja z vonjem po vijolicah[8].

== Viri in literatura ==

[1] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-org https://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Description (Pridobljeno 28.4.2022)

[2] Perfume Market: Industry Trends, Size, Share, Analysis & Forecast 2021-2026 (Pridobljeno 6.7.2021)

[3] Chen X, Shukal S, Zhang C. 2019. Integrating Enzyme and Metabolic Engineering Tools for Enhanced α-Ionone Production. J Agric Food Chem. 67(49):13451–13459. doi:10.1021/acs.jafc.9b00860

[4] Yu J, Liberton M, Cliften P, Head R, Jacobs J, Smith R, Koppenaal D, Brand J, Pakrasi H. 2015. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific reports. 5:8132. doi:10.1038/srep08132

[5] Lin P-C, Zhang F, Pakrasi HB. 2020. Enhanced production of sucrose in the fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Scientific Reports. 10(1):390. doi:10.1038/s41598-019-57319-5.

[6] Nakahira Y, Ogawa A, Asano H, Oyama T, Tozawa Y. 2013. Theophylline-dependent riboswitch as a novel genetic tool for strict regulation of protein expression in Cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942. Plant Cell Physiol. 54(10):1724–1735. doi:10.1093/pcp/pct115.

[7] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-Results orghttps://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Results#a4 (Pridobljeno 28.4.2022)

[8] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-Enterpreneurship orghttps://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/ Entrepreneurship (Pridobljeno 28.4.2022)

Seminarji SB 2021/22

2022-05-08T22:00:16Z

Ajda Godec:

V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_E._coli Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inžiniring_in_izkoriščanje_sintetične_alosterije_luciferaze_NanoLuc Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc] (Rebeka Dajčman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularen_RNA_interferenčni_sistem_za_regulacijo_multipleksnih_genov Modularen RNA interferenčni sistem za regulacijo multipleksnih genov] (Marko Pavleković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Označevanje_bioloških_celic_za_zanesljivo_celično_inženirstvo Označevanje bioloških celic za zanesljivo celično inženirstvo] (Neža Blaznik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_biosenzorjem_usmerjen_inžiniring_Cupriavidus_necator_H16_za_avtotrofno_proizvodnjo_manitola Z biosenzorjem usmerjen inžiniring ''Cupriavidus necator'' H16 za avtotrofno proizvodnjo manitola] (Teo Nograšek)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OpenPlast_-_kloroplastni_brezcelični_sistemi_za_hitrejšo_karakterizacijo_genetskih_delov OpenPlast - kloroplastni brezcelični sistemi za hitrejšo karakterizacijo genetskih delov] (Kim Glavič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana PHEAST - ''P. pastoris'' za odstranjevanje metana] (Ana Potočnik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ELIXIO_-mikrobni_konzorcij_za_vonj_po_vijolicah-ELIXIO Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah] (Ajda Godec) 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Seminarji SB 2021/22

2022-05-08T21:58:43Z

Ajda Godec:

V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_E._coli Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inžiniring_in_izkoriščanje_sintetične_alosterije_luciferaze_NanoLuc Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc] (Rebeka Dajčman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularen_RNA_interferenčni_sistem_za_regulacijo_multipleksnih_genov Modularen RNA interferenčni sistem za regulacijo multipleksnih genov] (Marko Pavleković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Označevanje_bioloških_celic_za_zanesljivo_celično_inženirstvo Označevanje bioloških celic za zanesljivo celično inženirstvo] (Neža Blaznik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_biosenzorjem_usmerjen_inžiniring_Cupriavidus_necator_H16_za_avtotrofno_proizvodnjo_manitola Z biosenzorjem usmerjen inžiniring ''Cupriavidus necator'' H16 za avtotrofno proizvodnjo manitola] (Teo Nograšek)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OpenPlast_-_kloroplastni_brezcelični_sistemi_za_hitrejšo_karakterizacijo_genetskih_delov OpenPlast - kloroplastni brezcelični sistemi za hitrejšo karakterizacijo genetskih delov] (Kim Glavič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana PHEAST - ''P. pastoris'' za odstranjevanje metana] (Ana Potočnik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ELIXIO_-mikrobni_konzorcij_za_vonj_po_vijolicah- Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah] (Ajda Godec) 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

ELIXIO -Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah

2022-05-08T21:58:16Z

Ajda Godec:

Projekt »ELIXIO- mikrobni konzorcij za proizvodnjo trajnostne arome vijolic« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021, kjer si je skupina prislužila zlato medaljo za svoj projekt. Zasnovala ga je skupina Toulouse_INSA-UPS, ki je želela z uporabo metod sintezne biologije ustvariti trajnosten, okolju prijazen način proizvodnje naravne arome z vonjem po vijolicah.

Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: https://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Description

Avtorica povzetka: Ajda Godec

== Problem ==

Vonj predstavlja med različnimi živalskimi vrstami, tudi med ljudmi, poseben kulturni in socialni fenomen. Prav zaradi tega se molekule, ki sestavljajo mnoge arome, uporabljene v različnih kozmetičnih produktih, predvsem pa bile osnova za razcvet danes ogromne parfumske industrije, ki je leta 2020 dosegla vrednost 32,8 bilijonov ameriških dolarjev, slednja vrednost pa se zdaleč ni končna. Na področju parfumske industrije Francija zavzema pomembno vlogo, ki jo pogosto povezujejo s produkti visoke kvalitete, prestiža in tradicije. Parfume delimo na štiri osnovne olfaktorne skupine, med njimi je tudi cvetlična, ki se nadalje deli v 10 podskupin. Večino teh esenc pridobivamo iz naravnih virov, najpogosteje iz cvetnih listov. Obstaja pa precejšen nabor cvetlic (t.i neme cvetlice), iz katerih je nemogoče pridobiti esenco z industrijsko signifikantnim izkoristkom. V to skupino uvrščamo vijolice, hiacinte, lilije ipd. Zato se v kozmetični in parfumski industriji za posnemanje vonjev teh cvetlic uporabljajo sintetično pridobljene molekule, ki v določenem razmerju dajo želeno vonjavo. Tak način proizvodnje dišavnih molekul je ekološko zelo obremenjujoč, reakcije potekajo pod ostrimi fizikalno-kemijskimi pogoji, izhodiščno molekula pa pogosto predstavlja petrolej. Po drugi strani pa ekstrakcija parfumskega olja iz naravnega materiala zahteva ogromne količine le-tega, uporabo organskih topil ali vode kot topila, in porabo velike količine električne energije. Trg pa kljub temu izkazuje vedno več zanimanja in nudi večjo podporo naravno pridobljenim spojinam. Da bi lahko zadostili tem potrebam in ohranili konkurenčnost vodilna podjetja (npr. Givaudan, International Flavors and Fragrances, Symrise itd) na tem področju kombinirajo uporabo teh metod, vedno bolj pa vključujejo tudi biotehnološke metode pridelave. Vonj po vijolicah opisuje mešanico spojin, med katerimi velja točno določeno razmerje. Najpomembnejše spojine, ki sestavljajo akord so: α- in β-jonon, linalol, v manjši meri pa tudi dihidro-β-jonon. Te molekule uvrščamo v družino terpenov. Akord z bolj zelenimi notami dopolnjujeta (2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol [1,2].

== Cilj ==

Skupina francoskih študentov se odločila za pripravo mikrobnega konzorcija z indukcijskimi sistemi, s katerimi bodo dosegli proizvodnjo želenega razmerja dveh glavnih tipov spojin (terpeni in aldehidi), ki oblikujejo akord arome vijolic, simbolične cvetlice mesta Tolouse. Vsaka izmed skupin spojin je sintetizirana po ločeni metabolni poti. Tako so kot šasijo uporabili 2 različna organizma (avtotrofni in heterotrofni), v vsakem izmed njih pa bo potekala ločena metabolna pot. Za proizvodnjo terpenov so izbrali kvasovko Saccharomyces cerevisiae, sinteza aldehidov pa bo potekala v cianobakterijah ''Synechococcus elongatus'' UTEX 297 CscB+. Cianobakterija je bila gensko spremenjena z namenom, da izloča v gojišče saharozo, ki služi kot vir ogljika za heterotrofno kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae''. Takšna proizvodnja ustreza kriterijem trajnostnega in okolju prijaznega načina pridobivanja spojin, saj je osnova za sintezo molekul le CO2. Po drugi strani pa so dišave proizvedene tekom biotehnoloških procesov po regulativah EU in ZDA obravnavane kot naravno pridobljene. Glavni cilj skupine je bil ustvariti biotehnološki projekt za industrijsko pridobivanje spojin, zato se idejo obravnavali tudi iz podjetniške perspektive.

== Načrt in izvedba ==

=== SINTEZA TERPENOV V ''S. cerevisiae'' ===

Za šasijo je skupina izbrala dobro okarakteriziran organizem kvasovko ''S. cerevisiae'', saj so vrednosti izkoristkov sinteze in hitrosti metabolične poti terpenov pridobljene iz prejšnjih raziskav industrijsko relevantne. Dodatno prednost so videli tudi v enostavni genski manipulaciji. Ker terpeni niso (α- in β-jonon, linalol, dihidro-β-jonon) naravno prisotni v šasijskem organizmu, je skupina najprej identificirala encime, ki sodelujejo v sintetskih poteh. Uporabljeni geni za encime izvirajo iz različnih rastlinskih vrst, ki so v nadaljevanju navedene ob imen encimov.
Jononi se v rastlinah sintetizirajo iz likopena. Ta se najprej pretvori v ε- oziroma β-karoten (karotenoid cepitvena dioksigenaza 1 – CCD1- ''Osmanthus fragrans'','' Petunia hybrida''), nato po drugi encimski pretvorbi nastane α-jonon (likopen ε-ciklaza -LcyE - ''Latuca sativa'') oziroma β-jonon (likopen β -ciklaza – CrtY- ''Pantoea ananatis''); slednjega po dodatni encimski reakciji nastane dihidro-β-jonon (enoat reduktaza- DBR1- ''Artemisia annua''). Linalol sodi v skupino monoterpenoidov, sintezo katalizira encim linalol sintaza, ki pretvarja geranil difosfat v linalol. Gen za linalol sintazo iz Lavandula angustifolia so uporabili, saj je bil že predhodno uporabljen za sintezo linalola v kvasovkah. Da da bi ujeli časovni okvir projekta so uporabili gensko spremenjen sev (yGPP034 ipENZ011 ipENZ078) kvasovke, ki že proizvaja likopen [1,3].

Na osnovi predhodnih raziskav na ''E.Coli'' so študentje pripravili genske konstrukte za fuzijske proteine (LycE- OfCCD1-in CRTY- PhCCD1) in s tem poskušali rešiti problem kolokalizacije encima (CCD1) in substrata, ki katalizira hitrost določujočo encimsko reakcijo. Vzporedno so pripravili še konstrukt, kjer sta nastala encima CCD1 in CrtY ločena, CCD1 pa je preko peptidnega sidra vstavljen v membrano. Tak pristop se je v prejšnjih raziskavah izkazal za učinkovitega, pri čemer se je povišala sinteza β-jonona.Za sintezo α- in β-jonona so pripravili 3 različne plazmide (pVIOLETTE za sintezo α-jonona z inducibilnim galaktoznim promotorjem PGAL1 , pFRAMBOISE-fused in pFRAMBOISE-notfused za sintezo β-jonona z inducibilnim PTetO7 in rtTA aktivatorjem). Za sintezo linalola in dihidro-β-jonona pa so ustvarili plazmid pFLEUR; gen za enoat reduktaza je pod kontrolo estradiol inducibilnega promotorja PZ3eV, gen za linalol sintazo pa pod kontrolo Cu-inducibilnega promotorja PCUP1 .
S PCR metodo pomnoženi genski konstrukti so bili vstavljeni v integracijske vektorje z uporabo metode In Fusion. Temu je sledila transfekcija v izbran ekspresijski sev. Z metodo PCR na osnovi kolonije kvasovk so preverili uspešnost transfekcije. Temu je sledila nadaljnja izvedba v bioreaktorjih [1,7].

=== SINTEZA ALDEHIDOV V ''S. elongatus '' ===

Skupina je kot avtotrofni šasijski organizem uporabila ''Synechococcus elongatus'' UTEX 2973, zaradi hitre rasti; primerljive z določenimi vrstami kvasovk, učinkovito gensko modifikacijo pa dosežemo z uporabo tristarševske konjugacije z ''E.Coli''[1,4].

Znano je, da mnoge cianobakterije ob stresnih pogoju za zmanjšanje osmotskega stresa kopičijo saharozo. ''Synechococcus elongatus'' UTEX 2973 CscB+ je bil gensko spremenjen do te mere, da izraža saharoza/ H+ simporter – CscB+, povišan pa je nivo tudi drugih encimov vključenih v metabolni poti saharoze, kar omogoča izločanje saharoze v odsotnosti stresnih pogojev (visoke konc. NaCl)[1,5].

''Synechococcus elongatus'' je cianobakterija, ki lahko v stresnih pogojih (visoke koncentracije CO2 , intenzivna svetloba), proizvaja nenasičene maščobne kisline, ki so osnova za sintezo α-linolejske kisline, ta pa služi kot prekurzor za sintezo aldehidov, prisotnih v akordu vonja vijolic. Sinteza 2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol poteka po lipoksigenazni poti, v kateri sta vključena 2 encima lipoksigenaza (LOX), končno encimsko pretvorbo pa izvede encim hiroksiperoksid liaza (HPL). Zapisa za omenjena encima so vstavili v posebej ustvarjen plazmid pCONCOMBRE, ki omogoča integracijo v gostiteljski genom. Za pripravo plazmida so uporabili gen LOX iz '' Nicotiana benthamiana '' ter HPL iz ''Cucumis melo''. Nadzorovana ekspresija jej bila zagotovljena preko teofilin inducibilnega ribonukleotidnega stikalamodulatorja v povezavi s Ptrc promotorjem [1,6].

Integracija v genom ''Synechococcus elongatus'' je bila dosežena preko izvedbe tristarševske konjugacije z E.Coli, uspešnost integracije je bila preverjena z metodo PCR na osnovi kolonije cianobakterije. Kokultivacija je potekala v bioreaktorjih.

== Rezultati in potencialni prenos v industrijo ==

Rezultati agarozne gelske elektroforeze so pri obeh organizmih potrdili uspešno neodvisno integracijo v genom. Ob indukciji so na petrijevkah dokazali produkcijo jononov in pretvorbo likopena v β-karoten, zgolj prisotnost α-jonona so dodatno potrdili z RP-HPLC analizo. Analiza medija z GC-MS obeh kultur po dosežku stacionarne faze rast, je pokazala le prisotnost α-jonona, β-jonona. Preko testa encimske aktivnosti DBR1 pa so dokazali prisotnost dihidro-β-jonona. Tekom poskusov so prav tako uspeli potrditi, da lahko kvasovke uspevajo v gojišču s saharozo izločeno s strani cianobakterij. Problem potreben optimizacije je predstavljala nezadostna koncentracija saharoze za preživetje kvasovk tekom daljšega časovnem obdobju [1,7].

Izdelava podjetniškega načrta je pokazala, da bi z optimizacijo količine proizvoda za 10-krat lahko dosegli konkurenčni sistem. Okvirna cena produkta se brez optimizacije giblje okoli 4 000 € na 1 kg olja z vonjem po vijolicah[8].

== Viri in literatura ==

[1] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-org https://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Description (Pridobljeno 28.4.2022)

[2] Perfume Market: Industry Trends, Size, Share, Analysis & Forecast 2021-2026 (Pridobljeno 6.7.2021)

[3] Chen X, Shukal S, Zhang C. 2019. Integrating Enzyme and Metabolic Engineering Tools for Enhanced α-Ionone Production. J Agric Food Chem. 67(49):13451–13459. doi:10.1021/acs.jafc.9b00860

[4] Yu J, Liberton M, Cliften P, Head R, Jacobs J, Smith R, Koppenaal D, Brand J, Pakrasi H. 2015. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific reports. 5:8132. doi:10.1038/srep08132

[5] Lin P-C, Zhang F, Pakrasi HB. 2020. Enhanced production of sucrose in the fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Scientific Reports. 10(1):390. doi:10.1038/s41598-019-57319-5.

[6] Nakahira Y, Ogawa A, Asano H, Oyama T, Tozawa Y. 2013. Theophylline-dependent riboswitch as a novel genetic tool for strict regulation of protein expression in Cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942. Plant Cell Physiol. 54(10):1724–1735. doi:10.1093/pcp/pct115.

[7] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-Results orghttps://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Results#a4 (Pridobljeno 28.4.2022)

[8] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-Enterpreneurship orghttps://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/ Entrepreneurship (Pridobljeno 28.4.2022)

ELIXIO -Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah

2022-05-08T21:57:52Z

Ajda Godec:

Projekt »ELIXIO- mikrobni konzorcij za proizvodnjo trajnostne arome vijolic« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021, kjer si je skupina prislužila zlato medaljo za svoj projekt. Zasnovala ga je skupina Toulouse_INSA-UPS, ki je želela z uporabo metod sintezne biologije ustvariti trajnosten, okolju prijazen način proizvodnje naravne arome z vonjem po vijolicah.
Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: https://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Description

Avtorica povzetka: Ajda Godec

== Problem ==

Vonj predstavlja med različnimi živalskimi vrstami, tudi med ljudmi, poseben kulturni in socialni fenomen. Prav zaradi tega se molekule, ki sestavljajo mnoge arome, uporabljene v različnih kozmetičnih produktih, predvsem pa bile osnova za razcvet danes ogromne parfumske industrije, ki je leta 2020 dosegla vrednost 32,8 bilijonov ameriških dolarjev, slednja vrednost pa se zdaleč ni končna. Na področju parfumske industrije Francija zavzema pomembno vlogo, ki jo pogosto povezujejo s produkti visoke kvalitete, prestiža in tradicije. Parfume delimo na štiri osnovne olfaktorne skupine, med njimi je tudi cvetlična, ki se nadalje deli v 10 podskupin. Večino teh esenc pridobivamo iz naravnih virov, najpogosteje iz cvetnih listov. Obstaja pa precejšen nabor cvetlic (t.i neme cvetlice), iz katerih je nemogoče pridobiti esenco z industrijsko signifikantnim izkoristkom. V to skupino uvrščamo vijolice, hiacinte, lilije ipd. Zato se v kozmetični in parfumski industriji za posnemanje vonjev teh cvetlic uporabljajo sintetično pridobljene molekule, ki v določenem razmerju dajo želeno vonjavo. Tak način proizvodnje dišavnih molekul je ekološko zelo obremenjujoč, reakcije potekajo pod ostrimi fizikalno-kemijskimi pogoji, izhodiščno molekula pa pogosto predstavlja petrolej. Po drugi strani pa ekstrakcija parfumskega olja iz naravnega materiala zahteva ogromne količine le-tega, uporabo organskih topil ali vode kot topila, in porabo velike količine električne energije. Trg pa kljub temu izkazuje vedno več zanimanja in nudi večjo podporo naravno pridobljenim spojinam. Da bi lahko zadostili tem potrebam in ohranili konkurenčnost vodilna podjetja (npr. Givaudan, International Flavors and Fragrances, Symrise itd) na tem področju kombinirajo uporabo teh metod, vedno bolj pa vključujejo tudi biotehnološke metode pridelave. Vonj po vijolicah opisuje mešanico spojin, med katerimi velja točno določeno razmerje. Najpomembnejše spojine, ki sestavljajo akord so: α- in β-jonon, linalol, v manjši meri pa tudi dihidro-β-jonon. Te molekule uvrščamo v družino terpenov. Akord z bolj zelenimi notami dopolnjujeta (2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol [1,2].

== Cilj ==

Skupina francoskih študentov se odločila za pripravo mikrobnega konzorcija z indukcijskimi sistemi, s katerimi bodo dosegli proizvodnjo želenega razmerja dveh glavnih tipov spojin (terpeni in aldehidi), ki oblikujejo akord arome vijolic, simbolične cvetlice mesta Tolouse. Vsaka izmed skupin spojin je sintetizirana po ločeni metabolni poti. Tako so kot šasijo uporabili 2 različna organizma (avtotrofni in heterotrofni), v vsakem izmed njih pa bo potekala ločena metabolna pot. Za proizvodnjo terpenov so izbrali kvasovko Saccharomyces cerevisiae, sinteza aldehidov pa bo potekala v cianobakterijah ''Synechococcus elongatus'' UTEX 297 CscB+. Cianobakterija je bila gensko spremenjena z namenom, da izloča v gojišče saharozo, ki služi kot vir ogljika za heterotrofno kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae''. Takšna proizvodnja ustreza kriterijem trajnostnega in okolju prijaznega načina pridobivanja spojin, saj je osnova za sintezo molekul le CO2. Po drugi strani pa so dišave proizvedene tekom biotehnoloških procesov po regulativah EU in ZDA obravnavane kot naravno pridobljene. Glavni cilj skupine je bil ustvariti biotehnološki projekt za industrijsko pridobivanje spojin, zato se idejo obravnavali tudi iz podjetniške perspektive.

== Načrt in izvedba ==

=== SINTEZA TERPENOV V ''S. cerevisiae'' ===

Za šasijo je skupina izbrala dobro okarakteriziran organizem kvasovko ''S. cerevisiae'', saj so vrednosti izkoristkov sinteze in hitrosti metabolične poti terpenov pridobljene iz prejšnjih raziskav industrijsko relevantne. Dodatno prednost so videli tudi v enostavni genski manipulaciji. Ker terpeni niso (α- in β-jonon, linalol, dihidro-β-jonon) naravno prisotni v šasijskem organizmu, je skupina najprej identificirala encime, ki sodelujejo v sintetskih poteh. Uporabljeni geni za encime izvirajo iz različnih rastlinskih vrst, ki so v nadaljevanju navedene ob imen encimov.
Jononi se v rastlinah sintetizirajo iz likopena. Ta se najprej pretvori v ε- oziroma β-karoten (karotenoid cepitvena dioksigenaza 1 – CCD1- ''Osmanthus fragrans'','' Petunia hybrida''), nato po drugi encimski pretvorbi nastane α-jonon (likopen ε-ciklaza -LcyE - ''Latuca sativa'') oziroma β-jonon (likopen β -ciklaza – CrtY- ''Pantoea ananatis''); slednjega po dodatni encimski reakciji nastane dihidro-β-jonon (enoat reduktaza- DBR1- ''Artemisia annua''). Linalol sodi v skupino monoterpenoidov, sintezo katalizira encim linalol sintaza, ki pretvarja geranil difosfat v linalol. Gen za linalol sintazo iz Lavandula angustifolia so uporabili, saj je bil že predhodno uporabljen za sintezo linalola v kvasovkah. Da da bi ujeli časovni okvir projekta so uporabili gensko spremenjen sev (yGPP034 ipENZ011 ipENZ078) kvasovke, ki že proizvaja likopen [1,3].

Na osnovi predhodnih raziskav na ''E.Coli'' so študentje pripravili genske konstrukte za fuzijske proteine (LycE- OfCCD1-in CRTY- PhCCD1) in s tem poskušali rešiti problem kolokalizacije encima (CCD1) in substrata, ki katalizira hitrost določujočo encimsko reakcijo. Vzporedno so pripravili še konstrukt, kjer sta nastala encima CCD1 in CrtY ločena, CCD1 pa je preko peptidnega sidra vstavljen v membrano. Tak pristop se je v prejšnjih raziskavah izkazal za učinkovitega, pri čemer se je povišala sinteza β-jonona.Za sintezo α- in β-jonona so pripravili 3 različne plazmide (pVIOLETTE za sintezo α-jonona z inducibilnim galaktoznim promotorjem PGAL1 , pFRAMBOISE-fused in pFRAMBOISE-notfused za sintezo β-jonona z inducibilnim PTetO7 in rtTA aktivatorjem). Za sintezo linalola in dihidro-β-jonona pa so ustvarili plazmid pFLEUR; gen za enoat reduktaza je pod kontrolo estradiol inducibilnega promotorja PZ3eV, gen za linalol sintazo pa pod kontrolo Cu-inducibilnega promotorja PCUP1 .
S PCR metodo pomnoženi genski konstrukti so bili vstavljeni v integracijske vektorje z uporabo metode In Fusion. Temu je sledila transfekcija v izbran ekspresijski sev. Z metodo PCR na osnovi kolonije kvasovk so preverili uspešnost transfekcije. Temu je sledila nadaljnja izvedba v bioreaktorjih [1,7].

=== SINTEZA ALDEHIDOV V ''S. elongatus '' ===

Skupina je kot avtotrofni šasijski organizem uporabila ''Synechococcus elongatus'' UTEX 2973, zaradi hitre rasti; primerljive z določenimi vrstami kvasovk, učinkovito gensko modifikacijo pa dosežemo z uporabo tristarševske konjugacije z ''E.Coli''[1,4].

Znano je, da mnoge cianobakterije ob stresnih pogoju za zmanjšanje osmotskega stresa kopičijo saharozo. ''Synechococcus elongatus'' UTEX 2973 CscB+ je bil gensko spremenjen do te mere, da izraža saharoza/ H+ simporter – CscB+, povišan pa je nivo tudi drugih encimov vključenih v metabolni poti saharoze, kar omogoča izločanje saharoze v odsotnosti stresnih pogojev (visoke konc. NaCl)[1,5].

''Synechococcus elongatus'' je cianobakterija, ki lahko v stresnih pogojih (visoke koncentracije CO2 , intenzivna svetloba), proizvaja nenasičene maščobne kisline, ki so osnova za sintezo α-linolejske kisline, ta pa služi kot prekurzor za sintezo aldehidov, prisotnih v akordu vonja vijolic. Sinteza 2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol poteka po lipoksigenazni poti, v kateri sta vključena 2 encima lipoksigenaza (LOX), končno encimsko pretvorbo pa izvede encim hiroksiperoksid liaza (HPL). Zapisa za omenjena encima so vstavili v posebej ustvarjen plazmid pCONCOMBRE, ki omogoča integracijo v gostiteljski genom. Za pripravo plazmida so uporabili gen LOX iz '' Nicotiana benthamiana '' ter HPL iz ''Cucumis melo''. Nadzorovana ekspresija jej bila zagotovljena preko teofilin inducibilnega ribonukleotidnega stikalamodulatorja v povezavi s Ptrc promotorjem [1,6].

Integracija v genom ''Synechococcus elongatus'' je bila dosežena preko izvedbe tristarševske konjugacije z E.Coli, uspešnost integracije je bila preverjena z metodo PCR na osnovi kolonije cianobakterije. Kokultivacija je potekala v bioreaktorjih.

== Rezultati in potencialni prenos v industrijo ==

Rezultati agarozne gelske elektroforeze so pri obeh organizmih potrdili uspešno neodvisno integracijo v genom. Ob indukciji so na petrijevkah dokazali produkcijo jononov in pretvorbo likopena v β-karoten, zgolj prisotnost α-jonona so dodatno potrdili z RP-HPLC analizo. Analiza medija z GC-MS obeh kultur po dosežku stacionarne faze rast, je pokazala le prisotnost α-jonona, β-jonona. Preko testa encimske aktivnosti DBR1 pa so dokazali prisotnost dihidro-β-jonona. Tekom poskusov so prav tako uspeli potrditi, da lahko kvasovke uspevajo v gojišču s saharozo izločeno s strani cianobakterij. Problem potreben optimizacije je predstavljala nezadostna koncentracija saharoze za preživetje kvasovk tekom daljšega časovnem obdobju [1,7].

Izdelava podjetniškega načrta je pokazala, da bi z optimizacijo količine proizvoda za 10-krat lahko dosegli konkurenčni sistem. Okvirna cena produkta se brez optimizacije giblje okoli 4 000 € na 1 kg olja z vonjem po vijolicah[8].

== Viri in literatura ==

[1] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-org https://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Description (Pridobljeno 28.4.2022)

[2] Perfume Market: Industry Trends, Size, Share, Analysis & Forecast 2021-2026 (Pridobljeno 6.7.2021)

[3] Chen X, Shukal S, Zhang C. 2019. Integrating Enzyme and Metabolic Engineering Tools for Enhanced α-Ionone Production. J Agric Food Chem. 67(49):13451–13459. doi:10.1021/acs.jafc.9b00860

[4] Yu J, Liberton M, Cliften P, Head R, Jacobs J, Smith R, Koppenaal D, Brand J, Pakrasi H. 2015. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific reports. 5:8132. doi:10.1038/srep08132

[5] Lin P-C, Zhang F, Pakrasi HB. 2020. Enhanced production of sucrose in the fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Scientific Reports. 10(1):390. doi:10.1038/s41598-019-57319-5.

[6] Nakahira Y, Ogawa A, Asano H, Oyama T, Tozawa Y. 2013. Theophylline-dependent riboswitch as a novel genetic tool for strict regulation of protein expression in Cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942. Plant Cell Physiol. 54(10):1724–1735. doi:10.1093/pcp/pct115.

[7] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-Results orghttps://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Results#a4 (Pridobljeno 28.4.2022)

[8] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-Enterpreneurship orghttps://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/ Entrepreneurship (Pridobljeno 28.4.2022)

ELIXIO -Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah

2022-05-08T21:53:29Z

Ajda Godec:

Projekt »ELIXIO- mikrobni konzorcij za proizvodnjo trajnostne arome vijolic« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021, kjer si je skupina prislužila zlato medaljo za svoj projekt. Zasnovala ga je skupina Toulouse_INSA-UPS, ki je želela z uporabo metod sintezne biologije ustvariti trajnosten, okolju prijazen način proizvodnje naravne arome z vonjem po vijolicah.
Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: https://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Description

Avtorica povzetka: Ajda Godec

== Problem ==

Vonj predstavlja med različnimi živalskimi vrstami, tudi med ljudmi, poseben kulturni in socialni fenomen. Prav zaradi tega se molekule, ki sestavljajo mnoge arome, uporabljene v različnih kozmetičnih produktih, predvsem pa bile osnova za razcvet danes ogromne parfumske industrije, ki je leta 2020 dosegla vrednost 32,8 bilijonov ameriških dolarjev, slednja vrednost pa se zdaleč ni končna. Na področju parfumske industrije Francija zavzema pomembno vlogo, ki jo pogosto povezujejo s produkti visoke kvalitete, prestiža in tradicije. Parfume delimo na štiri osnovne olfaktorne skupine, med njimi je tudi cvetlična, ki se nadalje deli v 10 podskupin. Večino teh esenc pridobivamo iz naravnih virov, najpogosteje iz cvetnih listov. Obstaja pa precejšen nabor cvetlic (t.i neme cvetlice), iz katerih je nemogoče pridobiti esenco z industrijsko signifikantnim izkoristkom. V to skupino uvrščamo vijolice, hiacinte, lilije ipd. Zato se v kozmetični in parfumski industriji za posnemanje vonjev teh cvetlic uporabljajo sintetično pridobljene molekule, ki v določenem razmerju dajo želeno vonjavo. Tak način proizvodnje dišavnih molekul je ekološko zelo obremenjujoč, reakcije potekajo pod ostrimi fizikalno-kemijskimi pogoji, izhodiščno molekula pa pogosto predstavlja petrolej. Po drugi strani pa ekstrakcija parfumskega olja iz naravnega materiala zahteva ogromne količine le-tega, uporabo organskih topil ali vode kot topila, in porabo velike količine električne energije. Trg pa kljub temu izkazuje vedno več zanimanja in nudi večjo podporo naravno pridobljenim spojinam. Da bi lahko zadostili tem potrebam in ohranili konkurenčnost vodilna podjetja (npr. Givaudan, International Flavors and Fragrances, Symrise itd) na tem področju kombinirajo uporabo teh metod, vedno bolj pa vključujejo tudi biotehnološke metode pridelave. Vonj po vijolicah opisuje mešanico spojin, med katerimi velja točno določeno razmerje. Najpomembnejše spojine, ki sestavljajo akord so: α- in β-jonon, linalol, v manjši meri pa tudi dihidro-β-jonon. Te molekule uvrščamo v družino terpenov. Akord z bolj zelenimi notami dopolnjujeta (2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol[1,2].

== Cilj ==

Skupina francoskih študentov se odločila za pripravo mikrobnega konzorcija z indukcijskimi sistemi, s katerimi bodo dosegli proizvodnjo želenega razmerja dveh glavnih tipov spojin (terpeni in aldehidi), ki oblikujejo akord arome vijolic, simbolične cvetlice mesta Tolouse. Vsaka izmed skupin spojin je sintetizirana po ločeni metabolni poti. Tako so kot šasijo uporabili 2 različna organizma (avtotrofni in heterotrofni), v vsakem izmed njih pa bo potekala ločena metabolna pot. Za proizvodnjo terpenov so izbrali kvasovko Saccharomyces cerevisiae, sinteza aldehidov pa bo potekala v cianobakterijah ''Synechococcus elongatus'' UTEX 297 CscB+. Cianobakterija je bila gensko spremenjena z namenom, da izloča v gojišče saharozo, ki služi kot vir ogljika za heterotrofno kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae''. Takšna proizvodnja ustreza kriterijem trajnostnega in okolju prijaznega načina pridobivanja spojin, saj je osnova za sintezo molekul le CO2. Po drugi strani pa so dišave proizvedene tekom biotehnoloških procesov po regulativah EU in ZDA obravnavane kot naravno pridobljene. Glavni cilj skupine je bil ustvariti biotehnološki projekt za industrijsko pridobivanje spojin, zato se idejo obravnavali tudi iz podjetniške perspektive.

== Načrt in izvedba ==

=== SINTEZA TERPENOV V ''S. cerevisiae'' ===

Za šasijo je skupina izbrala dobro okarakteriziran organizem kvasovko ''S. cerevisiae'', saj so vrednosti izkoristkov sinteze in hitrosti metabolične poti terpenov pridobljene iz prejšnjih raziskav industrijsko relevantne. Dodatno prednost so videli tudi v enostavni genski manipulaciji. Ker terpeni niso (α- in β-jonon, linalol, dihidro-β-jonon) naravno prisotni v šasijskem organizmu, je skupina najprej identificirala encime, ki sodelujejo v sintetskih poteh. Uporabljeni geni za encime izvirajo iz različnih rastlinskih vrst, ki so v nadaljevanju navedene ob imen encimov.
Jononi se v rastlinah sintetizirajo iz likopena. Ta se najprej pretvori v ε- oziroma β-karoten (karotenoid cepitvena dioksigenaza 1 – CCD1- ''Osmanthus fragrans'','' Petunia hybrida''), nato po drugi encimski pretvorbi nastane α-jonon (likopen ε-ciklaza -LcyE - ''Latuca sativa'') oziroma β-jonon (likopen β -ciklaza – CrtY- ''Pantoea ananatis''); slednjega po dodatni encimski reakciji nastane dihidro-β-jonon (enoat reduktaza- DBR1- ''Artemisia annua''). Linalol sodi v skupino monoterpenoidov, sintezo katalizira encim linalol sintaza, ki pretvarja geranil difosfat v linalol. Gen za linalol sintazo iz Lavandula angustifolia so uporabili, saj je bil že predhodno uporabljen za sintezo linalola v kvasovkah. Da da bi ujeli časovni okvir projekta so uporabili gensko spremenjen sev (yGPP034 ipENZ011 ipENZ078) kvasovke, ki že proizvaja likopen.

Na osnovi predhodnih raziskav na ''E.Coli'' so študentje pripravili genske konstrukte za fuzijske proteine (LycE- OfCCD1-in CRTY- PhCCD1) in s tem poskušali rešiti problem kolokalizacije encima (CCD1) in substrata, ki katalizira hitrost določujočo encimsko reakcijo. Vzporedno so pripravili še konstrukt, kjer sta nastala encima CCD1 in CrtY ločena, CCD1 pa je preko peptidnega sidra vstavljen v membrano. Tak pristop se je v prejšnjih raziskavah izkazal za učinkovitega, pri čemer se je povišala sinteza β-jonona.
Za sintezo α- in β-jonona so pripravili 3 različne plazmide (pVIOLETTE za sintezo α-jonona z inducibilnim galaktoznim promotorjem PGAL1 , pFRAMBOISE-fused in pFRAMBOISE-notfused za sintezo β-jonona z inducibilnim PTetO7 in rtTA aktivatorjem). Za sintezo linalola in dihidro-β-jonona pa so ustvarili plazmid pFLEUR; gen za enoat reduktaza je pod kontrolo estradiol inducibilnega promotorja PZ3eV, gen za linalol sintazo pa pod kontrolo Cu-inducibilnega promotorja PCUP1 .
S PCR metodo pomnoženi genski konstrukti so bili vstavljeni v integracijske vektorje z uporabo metode In Fusion. Temu je sledila transfekcija v izbran ekspresijski sev. Z metodo PCR na osnovi kolonije kvasovk so preverili uspešnost transfekcije. Temu je sledila nadaljnja izvedba v bioreaktorjih.

=== SINTEZA ALDEHIDOV V ''S. elongatus '' ===

Skupina je kot avtotrofni šasijski organizem uporabila ''Synechococcus elongatus'' UTEX 2973, zaradi hitre rasti; primerljive z določenimi vrstami kvasovk, učinkovito gensko modifikacijo pa dosežemo z uporabo tristarševske konjugacije z ''E.Coli''.

Znano je, da mnoge cianobakterije ob stresnih pogoju za zmanjšanje osmotskega stresa kopičijo saharozo. ''Synechococcus elongatus'' UTEX 2973 CscB+ je bil gensko spremenjen do te mere, da izraža saharoza/ H+ simporter – CscB+, povišan pa je nivo tudi drugih encimov vključenih v metabolni poti saharoze, kar omogoča izločanje saharoze v odsotnosti stresnih pogojev (visoke konc. NaCl).

''Synechococcus elongatus'' je cianobakterija, ki lahko v stresnih pogojih (visoke koncentracije CO2 , intenzivna svetloba), proizvaja nenasičene maščobne kisline, ki so osnova za sintezo α-linolejske kisline, ta pa služi kot prekurzor za sintezo aldehidov, prisotnih v akordu vonja vijolic. Sinteza 2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol poteka po lipoksigenazni poti, v kateri sta vključena 2 encima lipoksigenaza (LOX), končno encimsko pretvorbo pa izvede encim hiroksiperoksid liaza (HPL). Zapisa za omenjena encima so vstavili v posebej ustvarjen plazmid pCONCOMBRE, ki omogoča integracijo v gostiteljski genom. Za pripravo plazmida so uporabili gen LOX iz '' Nicotiana benthamiana '' ter HPL iz ''Cucumis melo''. Nadzorovana ekspresija jej bila zagotovljena preko teofilin inducibilnega ribonukleotidnega stikalamodulatorja v povezavi s Ptrc promotorjem.

Integracija v genom ''Synechococcus elongatus'' je bila dosežena preko izvedbe tristarševske konjugacije z E.Coli, uspešnost integracije je bila preverjena z metodo PCR na osnovi kolonije cianobakterije. Kokultivacija je potekala v bioreaktorjih.

== Rezultati in potencialni prenos v industrijo ==

Rezultati agarozne gelske elektroforeze so pri obeh organizmih potrdili uspešno neodvisno integracijo v genom. Ob indukciji so na petrijevkah dokazali produkcijo jononov in pretvorbo likopena v β-karoten, zgolj prisotnost α-jonona so dodatno potrdili z RP-HPLC analizo. Analiza medija z GC-MS obeh kultur po dosežku stacionarne faze rast, je pokazala le prisotnost α-jonona, β-jonona. Preko testa encimske aktivnosti DBR1 pa so dokazali prisotnost dihidro-β-jonona. Tekom poskusov so prav tako uspeli potrditi, da lahko kvasovke uspevajo v gojišču s saharozo izločeno s strani cianobakterij. Problem potreben optimizacije je predstavljala nezadostna koncentracija saharoze za preživetje kvasovk tekom daljšega časovnem obdobju.

Izdelava podjetniškega načrta je pokazala, da bi z optimizacijo količine proizvoda za 10-krat lahko dosegli konkurenčni sistem. Okvirna cena produkta se brez optimizacije giblje okoli 4 000 € na 1 kg olja z vonjem po vijolicah.

== Viri in literatura ==

[1] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-org https://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Description (Pridobljeno 28.4.2022)

[2] Perfume Market: Industry Trends, Size, Share, Analysis & Forecast 2021-2026 (Pridobljeno 6.7.2021)

[3] Chen X, Shukal S, Zhang C. 2019. Integrating Enzyme and Metabolic Engineering Tools for Enhanced α-Ionone Production. J Agric Food Chem. 67(49):13451–13459. doi:10.1021/acs.jafc.9b00860

[4] Yu J, Liberton M, Cliften P, Head R, Jacobs J, Smith R, Koppenaal D, Brand J, Pakrasi H. 2015. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific reports. 5:8132. doi:10.1038/srep08132

[5] Lin P-C, Zhang F, Pakrasi HB. 2020. Enhanced production of sucrose in the fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Scientific Reports. 10(1):390. doi:10.1038/s41598-019-57319-5.

[6] Nakahira Y, Ogawa A, Asano H, Oyama T, Tozawa Y. 2013. Theophylline-dependent riboswitch as a novel genetic tool for strict regulation of protein expression in Cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942. Plant Cell Physiol. 54(10):1724–1735. doi:10.1093/pcp/pct115.

[7] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-Results orghttps://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Results#a4 (Pridobljeno 28.4.2022)

[8] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-Enterpreneurship orghttps://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/ Entrepreneurship (Pridobljeno 28.4.2022)

ELIXIO -Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah

2022-05-08T21:43:31Z

Ajda Godec: New page: Projekt »ELIXIO- mikrobni konzorcij za proizvodnjo trajnostne arome vijolic« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021, kjer si je skupina prislužila zlato medaljo za svoj projekt. Zasnovala...

Projekt »ELIXIO- mikrobni konzorcij za proizvodnjo trajnostne arome vijolic« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021, kjer si je skupina prislužila zlato medaljo za svoj projekt. Zasnovala ga je skupina Toulouse_INSA-UPS, ki je želela z uporabo metod sintezne biologije ustvariti trajnosten, okolju prijazen način proizvodnje naravne arome z vonjem po vijolicah.
Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: https://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Description

Avtorica povzetka: Ajda Godec

== Problem ==

Vonj predstavlja med različnimi živalskimi vrstami, tudi med ljudmi, poseben kulturni in socialni fenomen. Prav zaradi tega se molekule, ki sestavljajo mnoge arome, uporabljene v različnih kozmetičnih produktih, predvsem pa bile osnova za razcvet danes ogromne parfumske industrije, ki je leta 2020 dosegla vrednost 32,8 bilijonov ameriških dolarjev, slednja vrednost pa se zdaleč ni končna. Na področju parfumske industrije Francija zavzema pomembno vlogo, ki jo pogosto povezujejo s produkti visoke kvalitete, prestiža in tradicije. Parfume delimo na štiri osnovne olfaktorne skupine, med njimi je tudi cvetlična, ki se nadalje deli v 10 podskupin. Večino teh esenc pridobivamo iz naravnih virov, najpogosteje iz cvetnih listov. Obstaja pa precejšen nabor cvetlic (t.i neme cvetlice), iz katerih je nemogoče pridobiti esenco z industrijsko signifikantnim izkoristkom. V to skupino uvrščamo vijolice, hiacinte, lilije ipd. Zato se v kozmetični in parfumski industriji za posnemanje vonjev teh cvetlic uporabljajo sintetično pridobljene molekule, ki v določenem razmerju dajo želeno vonjavo. Tak način proizvodnje dišavnih molekul je ekološko zelo obremenjujoč, reakcije potekajo pod ostrimi fizikalno-kemijskimi pogoji, izhodiščno molekula pa pogosto predstavlja petrolej. Po drugi strani pa ekstrakcija parfumskega olja iz naravnega materiala zahteva ogromne količine le-tega, uporabo organskih topil ali vode kot topila, in porabo velike količine električne energije. Trg pa kljub temu izkazuje vedno več zanimanja in nudi večjo podporo naravno pridobljenim spojinam. Da bi lahko zadostili tem potrebam in ohranili konkurenčnost vodilna podjetja (npr. Givaudan, International Flavors and Fragrances, Symrise itd) na tem področju kombinirajo uporabo teh metod, vedno bolj pa vključujejo tudi biotehnološke metode pridelave. Vonj po vijolicah opisuje mešanico spojin, med katerimi velja točno določeno razmerje. Najpomembnejše spojine, ki sestavljajo akord so: α- in β-jonon, linalol, v manjši meri pa tudi dihidro-β-jonon. Te molekule uvrščamo v družino terpenov. Akord z bolj zelenimi notami dopolnjujeta (2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol[1,2].

== Cilj ==

Skupina francoskih študentov se odločila za pripravo mikrobnega konzorcija z indukcijskimi sistemi, s katerimi bodo dosegli proizvodnjo želenega razmerja dveh glavnih tipov spojin (terpeni in aldehidi), ki oblikujejo akord arome vijolic, simbolične cvetlice mesta Tolouse. Vsaka izmed skupin spojin je sintetizirana po ločeni metabolni poti. Tako so kot šasijo uporabili 2 različna organizma (avtotrofni in heterotrofni), v vsakem izmed njih pa bo potekala ločena metabolna pot. Za proizvodnjo terpenov so izbrali kvasovko Saccharomyces cerevisiae, sinteza aldehidov pa bo potekala v cianobakterijah ''Synechococcus elongatus'' UTEX 297 CscB+. Cianobakterija je bila gensko spremenjena z namenom, da izloča v gojišče saharozo, ki služi kot vir ogljika za heterotrofno kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae''. Takšna proizvodnja ustreza kriterijem trajnostnega in okolju prijaznega načina pridobivanja spojin, saj je osnova za sintezo molekul le CO2. Po drugi strani pa so dišave proizvedene tekom biotehnoloških procesov po regulativah EU in ZDA obravnavane kot naravno pridobljene. Glavni cilj skupine je bil ustvariti biotehnološki projekt za industrijsko pridobivanje spojin, zato se idejo obravnavali tudi iz podjetniške perspektive.

== Načrt in izvedba ==

=== SINTEZA TERPENOV V ''S. cerevisiae'' ===

Za šasijo je skupina izbrala dobro okarakteriziran organizem kvasovko ''S. cerevisiae'', saj so vrednosti izkoristkov sinteze in hitrosti metabolične poti terpenov pridobljene iz prejšnjih raziskav industrijsko relevantne. Dodatno prednost so videli tudi v enostavni genski manipulaciji. Ker terpeni niso (α- in β-jonon, linalol, dihidro-β-jonon) naravno prisotni v šasijskem organizmu, je skupina najprej identificirala encime, ki sodelujejo v sintetskih poteh. Uporabljeni geni za encime izvirajo iz različnih rastlinskih vrst, ki so v nadaljevanju navedene ob imen encimov.
Jononi se v rastlinah sintetizirajo iz likopena. Ta se najprej pretvori v ε- oziroma β-karoten (karotenoid cepitvena dioksigenaza 1 – CCD1- ''Osmanthus fragrans'','' Petunia hybrida''), nato po drugi encimski pretvorbi nastane α-jonon (likopen ε-ciklaza -LcyE - ''Latuca sativa'') oziroma β-jonon (likopen β -ciklaza – CrtY- ''Pantoea ananatis''); slednjega po dodatni encimski reakciji nastane dihidro-β-jonon (enoat reduktaza- DBR1- ''Artemisia annua''). Linalol sodi v skupino monoterpenoidov, sintezo katalizira encim linalol sintaza, ki pretvarja geranil difosfat v linalol. Gen za linalol sintazo iz Lavandula angustifolia so uporabili, saj je bil že predhodno uporabljen za sintezo linalola v kvasovkah. Da da bi ujeli časovni okvir projekta so uporabili gensko spremenjen sev (yGPP034 ipENZ011 ipENZ078) kvasovke, ki že proizvaja likopen.

Na osnovi predhodnih raziskav na ''E.Coli'' so študentje pripravili genske konstrukte za fuzijske proteine (LycE- OfCCD1-in CRTY- PhCCD1) in s tem poskušali rešiti problem kolokalizacije encima (CCD1) in substrata, ki katalizira hitrost določujočo encimsko reakcijo. Vzporedno so pripravili še konstrukt, kjer sta nastala encima CCD1 in CrtY ločena, CCD1 pa je preko peptidnega sidra vstavljen v membrano. Tak pristop se je v prejšnjih raziskavah izkazal za učinkovitega, pri čemer se je povišala sinteza β-jonona.
Za sintezo α- in β-jonona so pripravili 3 različne plazmide (pVIOLETTE za sintezo α-jonona z inducibilnim galaktoznim promotorjem PGAL1 , pFRAMBOISE-fused in pFRAMBOISE-notfused za sintezo β-jonona z inducibilnim PTetO7 in rtTA aktivatorjem). Za sintezo linalola in dihidro-β-jonona pa so ustvarili plazmid pFLEUR; gen za enoat reduktaza je pod kontrolo estradiol inducibilnega promotorja PZ3eV, gen za linalol sintazo pa pod kontrolo Cu-inducibilnega promotorja PCUP1 .
S PCR metodo pomnoženi genski konstrukti so bili vstavljeni v integracijske vektorje z uporabo metode In Fusion. Temu je sledila transfekcija v izbran ekspresijski sev. Z metodo PCR na osnovi kolonije kvasovk so preverili uspešnost transfekcije. Temu je sledila nadaljnja izvedba v bioreaktorjih.

=== SINTEZA ALDEHIDOV V ''S. elongatus '' ===

Skupina je kot avtotrofni šasijski organizem uporabila ''Synechococcus elongatus'' UTEX 2973, zaradi hitre rasti; primerljive z določenimi vrstami kvasovk, učinkovito gensko modifikacijo pa dosežemo z uporabo tristarševske konjugacije z ''E.Coli''.

Znano je, da mnoge cianobakterije ob stresnih pogoju za zmanjšanje osmotskega stresa kopičijo saharozo. ''Synechococcus elongatus'' UTEX 2973 CscB+ je bil gensko spremenjen do te mere, da izraža saharoza/ H+ simporter – CscB+, povišan pa je nivo tudi drugih encimov vključenih v metabolni poti saharoze, kar omogoča izločanje saharoze v odsotnosti stresnih pogojev (visoke konc. NaCl).
''
Synechococcus elongatus'' je cianobakterija, ki lahko v stresnih pogojih (visoke koncentracije CO2 , intenzivna svetloba), proizvaja nenasičene maščobne kisline, ki so osnova za sintezo α-linolejske kisline, ta pa služi kot prekurzor za sintezo aldehidov, prisotnih v akordu vonja vijolic. Sinteza 2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol poteka po lipoksigenazni poti, v kateri sta vključena 2 encima lipoksigenaza (LOX), končno encimsko pretvorbo pa izvede encim hiroksiperoksid liaza (HPL). Zapisa za omenjena encima so vstavili v posebej ustvarjen plazmid pCONCOMBRE, ki omogoča integracijo v gostiteljski genom. Za pripravo plazmida so uporabili gen LOX iz ''Nicotiana benthamiana'' ter HPL iz ''Cucumis melo''. Nadzorovana ekspresija jej bila zagotovljena preko teofilin inducibilnega ribonukleotidnega stikalamodulatorja v povezavi s Ptrc promotorjem.

Integracija v genom ''Synechococcus elongatus'' je bila dosežena preko izvedbe tristarševske konjugacije z E.Coli, uspešnost integracije je bila preverjena z metodo PCR na osnovi kolonije cianobakterije. Kokultivacija je potekala v bioreaktorjih.

== Rezultati in potencialni prenos v industrijo ==

Rezultati agarozne gelske elektroforeze so pri obeh organizmih potrdili uspešno neodvisno integracijo v genom. Ob indukciji so na petrijevkah dokazali produkcijo jononov in pretvorbo likopena v β-karoten, zgolj prisotnost α-jonona so dodatno potrdili z RP-HPLC analizo. Analiza medija z GC-MS obeh kultur po dosežku stacionarne faze rast, je pokazala le prisotnost α-jonona, β-jonona. Preko testa encimske aktivnosti DBR1 pa so dokazali prisotnost dihidro-β-jonona. Tekom poskusov so prav tako uspeli potrditi, da lahko kvasovke uspevajo v gojišču s saharozo izločeno s strani cianobakterij. Problem potreben optimizacije je predstavljala nezadostna koncentracija saharoze za preživetje kvasovk tekom daljšega časovnem obdobju.

Izdelava podjetniškega načrta je pokazala, da bi z optimizacijo količine proizvoda za 10-krat lahko dosegli konkurenčni sistem. Okvirna cena produkta se brez optimizacije giblje okoli 4 000 € na 1 kg olja z vonjem po vijolicah.

== Viri in literatura ==

Seminarji SB 2021/22

2022-05-08T11:38:00Z

Ajda Godec:

V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_E._coli Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inžiniring_in_izkoriščanje_sintetične_alosterije_luciferaze_NanoLuc Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc] (Rebeka Dajčman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularen_RNA_interferenčni_sistem_za_regulacijo_multipleksnih_genov Modularen RNA interferenčni sistem za regulacijo multipleksnih genov] (Marko Pavleković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Označevanje_bioloških_celic_za_zanesljivo_celično_inženirstvo Označevanje bioloških celic za zanesljivo celično inženirstvo] (Neža Blaznik)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OpenPlast_-_kloroplastni_brezcelični_sistemi_za_hitrejšo_karakterizacijo_genetskih_delov OpenPlast - kloroplastni brezcelični sistemi za hitrejšo karakterizacijo genetskih delov] (Kim Glavič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana PHEAST - ''P. pastoris'' za odstranjevanje metana] (Ana Potočnik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ELIXIO_-mikrobni_konzorcij_za_vonj_po_vijolicah-ELIXIO-Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah] (Ajda Godec) 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Seminarji SB 2021/22

2022-05-08T11:35:32Z

Ajda Godec:

V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_E._coli Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inžiniring_in_izkoriščanje_sintetične_alosterije_luciferaze_NanoLuc Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc] (Rebeka Dajčman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularen_RNA_interferenčni_sistem_za_regulacijo_multipleksnih_genov Modularen RNA interferenčni sistem za regulacijo multipleksnih genov] (Marko Pavleković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Označevanje_bioloških_celic_za_zanesljivo_celično_inženirstvo Označevanje bioloških celic za zanesljivo celično inženirstvo] (Neža Blaznik)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OpenPlast_-_kloroplastni_brezcelični_sistemi_za_hitrejšo_karakterizacijo_genetskih_delov OpenPlast - kloroplastni brezcelični sistemi za hitrejšo karakterizacijo genetskih delov] (Kim Glavič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana PHEAST - ''P. pastoris'' za odstranjevanje metana] (Ana Potočnik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ELIXIO_-mikrobni_konzorcij_za_vonj_po_vijolicah-Mikrobni_konzorcij_za_vonj_po_vijolicah] (Ajda Godec) 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Seminarji SB 2021/22

2022-05-08T11:33:54Z

Ajda Godec:

V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_E._coli Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inžiniring_in_izkoriščanje_sintetične_alosterije_luciferaze_NanoLuc Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc] (Rebeka Dajčman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularen_RNA_interferenčni_sistem_za_regulacijo_multipleksnih_genov Modularen RNA interferenčni sistem za regulacijo multipleksnih genov] (Marko Pavleković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Označevanje_bioloških_celic_za_zanesljivo_celično_inženirstvo Označevanje bioloških celic za zanesljivo celično inženirstvo] (Neža Blaznik)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OpenPlast_-_kloroplastni_brezcelični_sistemi_za_hitrejšo_karakterizacijo_genetskih_delov OpenPlast - kloroplastni brezcelični sistemi za hitrejšo karakterizacijo genetskih delov] (Kim Glavič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana PHEAST - ''P. pastoris'' za odstranjevanje metana] (Ana Potočnik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ELIXIO_-mikrobni_konzorcij_za_vonj_po_vijolicah] (Ajda Godec) 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

BNT-seminar

2021-03-09T09:48:09Z

Ajda Godec: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019058 
30019057 
30170131 
30170078 
30170177 
30200324 
30019063 
30170103 
30170002 
30200319 
30200309 
30200320 
30019056 
30200311 
30200306 
30170243 
30019051 
30170141 
30170061 
30019035 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
16.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
13.4.2021 
20.4.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
23.3.2021 
20.4.2020 
6.4.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
11.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Aljaž Bratina 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Martin Špendl 
Tjaša Mlakar 
Sara Laznik 
Martina Lokar 
Doroteja Armič 
Martin Špendl 
Saša Slabe 
Mateja Žvipelj 
Špela Supej 
Urška Fajdiga 
Ernestina Lavrih 
Nika Mikulič Vernik 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Tadej Medved 
Urška Zagorc 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Urška Zagorc 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Jernej Imperl 
Barbara Slapnik 
Urša Lovše 
Mateja Žvipelj 
Neža Pavko 
Almina Tahirović 
Nika Mikulič Vernik 
Urška Fajdiga 
Saša Slabe 
Klementina Polanec 
Tjaša Mlakar 
Ajda Godec 
Jernej Imperl 
Špela Supej 
Aljaž Bratina 
Nina Lukančič 
|-

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev

2019-04-07T22:21:11Z

Ajda Godec: /* STRUKTURA MEMBRANSKEGA RECEPTORJA FhuA */

==UVOD==

Eden izmed načinov obrambe bakterije pred bakteriofagi je proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev. Tako deluje npr. mikrocin J25, katerega primarna naloga je, da zavira rast drugih sevov bakterije iste vrste. Dokazano je bilo, da se tako kot fag T5 veže na membranski receptor FhuA, ki je sicer zadolžen za prenos Fe3+ ionov v bakterijo. Mikrocin J25 z vezavo na receptor FhuA prepreči vezavo faga T5 in vnos DNK faga v ''E. Coli.''

==MOLEKULARNE KOMPONENTNE INFEKCIJE ''E.COLI'' S STRANI FAGA T5 IN ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE==

=== STRUKTURA MEMBRANSKEGA RECEPTORJA FhuA ===
[https://cdn.rcsb.org/images/hd/by/1by3/1by3.0_chimera_tm_350_350.png FhuA] je protein z maso 78.9 kDa, ki se nahaja v zunanji membrani gram-negativnih bakterij kot je E.coli (sev K-12). Njegova primarna funkcija je transport Fe+3 ionov v celico. Receptor FhuA tvorita sodčkasta domena iz 22 antiparalelnih β-trakov, ki so vgrajeni v membrano in N-končna globularna domena, ki se zloži v notranjost sodčka ter zakrije večinski del notranjosti le-tega. N-končna globularna domena je sestavljena iz 4-verižne β-plošče in iz 4 kratkih vijačnic. Globularna domena je vezana tako na sodčkasto domeno kot tudi na hidrofilne zanke usmerjene v zunanji mediju ter je odgovorna za vezavo liganda; hidroksamatnega siderofora – ferikroma, ki veže Fe3+ ione. Razen svoje primarne funkcije, je FhuA tudi receptor za različne fage; T1,T5 in ɸ80 ter za antibiotik albomicin.

=== STRUKTURA FAGA T5 ===

Struktura [https://www.i2bc.paris-saclay.fr/IMG/jpg/imagest5.jpg faga T5]je bila določena z uporabo krio-elektronske mikroskopije. Fag T5 uvrščamo v družino fagov Siphoviridae, za predstavnike katere je značilno, da imajo ikozaedrično oblikovano kapsido; ta vsebuje močno zvito, zgoščeno dvojno verižno DNA in rep. Rep predstavlja multiproteinski skupek, ki služi za prepoznavanje površine bakterijskih celic in za prenos genoma v to gostiteljsko celico. Za to družino fagov je značilno, da v strukturi vsebujejo dolg in nekrčljiv [https://jvi.asm.org/content/jvi/88/2/1162/F7.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1 rep].Fag T5 ima 250 nm dolg rep, ki se konča s tremi L-oblikovanimi fibrilarnimi strukturami, ki so pritrjene na stožčasto podlago in premočrtno centralno fibrilo.

=== ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE IN INTERAKCIJA MED pb5 in FhuA ===

Specifičnost gostiteljske celice pri procesu okužbe s strani fagov družine ''Siphoviridae'' je določena z interakcijo med receptor vezavnim proteinom in specifičnim receptorjem na površini bakterijske celice. Prepoznavanje lahko poteka preko interakcij s saharidnimi ali proteinskimi komponentami receptorja. Ti receptor vezavni proteini se nahajajo na konici centralne fibrile v repu. To interakcijo pogosto zaznamuje dvostopenjski proces; v prvi fazi se fag reverzibilno adsorbira na receptorje z nizko vezavno afiniteto, kasneje pa se ireverzibilno veže na sekundarna mesta v receptorju. Interakcija receptor vezavni protein-receptor sproži konformacijske spremembe v strukturi repa, kar povzroči, da se kapsida odpre, pri tem se razpre zunanja membrana bakterije. Ob tem se DNK faga prenese preko repa skozi bakterijsko ovojnico v notranjost celice. Proces prepoznavanja v primeru faga T5 se prične z reverzibilno vezavo L-oblikovane proteinske niti na O-antigen lipopolisaharidne komponente. Nato se fag ireverzibilno veže na zunanji del ferikromskega transporterja FhuA z receptor vezavnim proteinom pb5.

Različne raziskave ''in vivo'' ter ''in vitro'' predpostavljajo naslednji mehanizem infekcije : v prvi stopnji se fag T5 reverzibilno veže s proteinom pb1 (ta sestavlja del L-oblikovane fibrile) na polimanozni O-antigen in pospeši hitrost vezave pb5 na FhuA. Nato se protein pb2 (del centralne fibrile) veže na površino bakterije. Ta interakcija ne vključuje sodelovanja specifičnih membranskih receptorjev. Centralna premočrtna fibrila se nato usidra v bakterijsko zunanjo membrano, dokler pb5 ne interagira s FhuA. Ta interakcija povzroči sprostitev DNK iz kapside. DNK se nato prenese v notranjost celice preko kanalčka, ki nastane iz proteina pb2. Kanalček sega od zunanje membrane, periplazme do citoplazemske membrane. Tak kanalček zaščiti DNK pred delovanjem periplazemskih nukleaz.

== MIKROCINI ==

Bakterije morajo znotraj svoje niše med seboj tekmovati za vire hranil in prostor. Izdelava “orožja” proti drugim bakterijam je torej zelo pomembna za njihovo preživetje. Ena izmed zelo razširjenih taktik tekmovanja med bakterijami je tvorba bakteriocinov. To so antimikrobni peptidi, ki delujejo kot toksini, saj zavirajo rast podobnih oziroma filogenetsko sorodnih bakterijskih sevov (tako na primer, E. coli izloča mikrocine, ki napadajo le seve E. coli). Sintetizirajo se, ko v okolju primanjkuje hranil in bakterije stradajo. Mikrocini so bakteriocini s kratkim aminokislinskim zaporedjem. Izločajo jih enterobakterije, to so Gram-negativni bacili, ki so v naravi zelo razširjeni, prav tako pa so del črevesne flore (kar pove že ime). Njihov zapis se nahaja na plazmidih. Mikrocine delimo v dva razreda:

* razred I – po translaciji pride do obširnih posttranslacijskih modifikacij, vsebujejo disulfidne mostičke
* razred II – ne prihaja do posttranslacijskih modifikacij

=== STRUKTURA MIKROCINA J25 ===

V prvi razred mikrocinov sodi tudi [https://pubs.rsc.org/en/Content/Image/GA/B708478A mikrocin J25 (MccJ25)]. Sestavljen je iz 21 aminokislinskih ostankov, odlikuje pa ga zanimivo zvitje, ki je sicer med peptidi zelo redko. Sprva je veljalo mnenje, da ima v celoti ciklično strukturo, nedavne raziskave pa so pokazale, da se po translaciji zvije v strukturo, ki spominja na laso. N-konec peptida je v obliki makrolaktamskega obroča, ki ga tvorita aminokislinska ostanka Gly1 in Glu8, pri čemer aminska skupina iz glicina tvori peptidno vez s karboksilno skupino stranske skupine glutamata. Peptid se nato nadaljuje v β-lasnično zanko (dva antiparalelna β-trakova povezana z zanko, ki jo tvorita Val11 in Pro16), ki jo tvorijo aminokislinski ostanki 9-18. C-konec mikrocina (t.i. rep) prehaja skozi obroč, kar je sicer entropijsko zelo neugodno, zato je tako zvitje med peptidi zelo redko. V primeru J25 pa je taka struktura celo zelo stabilna – dva aminokislinska ostanka z aromatskimi stranskimi skupinami, Phe19 in Tyr20, vsak iz ene strani “sidrata” C-konec v makrolaktamski obroč. Ker sta stranski skupini teh ostankov tako veliki, prihaja do steričnega oviranja z obročem, zato rep ne more "pobegniti". Sterična stabilizacija je tako močna, da je J25 odporen celo proti večini proteaz in visokim temperaturam. V močno kislem mediju in ob delovanju endopeptidaz se cepi le β-lasnična zanka, ne pa tudi obroč (rep ostane ujet).

=== DELOVANJE MIKROCINA J25 ===

Mikrocin J25 je toksičen le za rod Salmonella in seve vrste E. coli. Rast celic zavre tako, da preide v celico, kje deluje kot inhibitor RNA-polimeraze. Za inhibicijo je pomemben makrolaktamski obroč, ki kot čep zamaši kanal v polimerazi, ki usmerja ustrezne ribonukleozid trifosfate na aktivno mesto.Za prehod skozi celični membrani Gram-negativnih bakterij J25 izkorišča receptor za železo v zunanji membrani; FhuA in z njim sklopljen kompleks TonB–ExbB–ExbD (na receptorju pravzaprav parazitira). To so pokazali številni eksperimenti, pri katerih so v E. coli z delecijo gena za FhuA vnesli plazmid z zapisom za FhuA iz E. coli ali rodu Salmonella. Bakterije brez receptorja so bile odporne na mikrocin J25, po vnosu plazmida pa so nanj postale občutljive.

Ker je železo slabo topno, prehaja skozi receptor v obliki ferikroma, ki po obliki niti malo ne spominja na mikrocin J25, zatorej vezava mikrocina na receptor ni samoumevna. Kako se torej mikrocin veže na FhuA? Primerjava kristalnih struktur kompleksov FhuA-ferikrom in FhuA-J25 je pokazala, da se oba liganda v receptor vežeta na podobnem mestu. Pri tem ferikrom tvori veliko vodikovih vezi z N-globularno domeno FhuA, ki deluje kot zamašek, MccJ25 pa s to domeno tvori le dve vodikovi vezi. Ta podatek nakazuje na to, da za vezavo na receptor FhuA ni potrebna dobra ohranjenost liganda, kar razloži tudi vezavo MccJ25, čeprav je le-ta po strukturi zelo različen od primarnega liganda.

Opravljene so bile tudi številne raziskave, ki so identificirale ostanke na MccJ25, ki so pomembni za vezavo na receptor. Že sama poravnava strukture nevezanega mikrocina (struktura pridobljena z NMR), s strukturo na receptor vezanega mikrocina (struktura, pridobljena z rentgensko kristalografijo) je pokazala, da pride ob vezavi mikrocina do obširne konformacijske spremembe v predelu β-lasnične zanke, medtem ko ostane struktura laktamskega obroča nespremenjena. Iz tega so sklepali, da je za vezavo najpomembnejša lasnična regija. Raziskava, ki je to potrdila, je temeljila na razgradnji te zanke s termolizinom (cepitev vezi med Val11 in Phe16). Izvedena je bila serija poskusov z bakteriofagom T5, ti pa so opisani v nadaljevanju.

=== POSKUSI O VPLIVIH VEZAVE MIKROCINA J25 NA RECEPTOR FhuA NA VEZAVO FAGA T5 ===

S serijo poskusov z bakteriofagom T5 in mikrocinom MccJ25 (oz. t-MccJ25) so v raziskavi želeli pokazati kako vezava MccJ25 na receptor FhuA vpliva na vezavo faga.
V prvem poskusu so raziskovalci preverjali inhibicijo bakterijske infekcije s fagom T5 v prisotnosti mikrocina. Suspenzijo E. Coli (sev W3110) v eksponentni fazi rasti so prenesli v LB (lysogeny broth) medij. Bakterijam so dodali raztopino MccJ25 ali t-MccJ25 v metanolu in jih nato inkubirali na sobni temperaturi. Dodali so fag T5 in po stresanju in inkubaciji pri 37°C 120 minut z merjenjem absorbance pri 620nm nadzorovali stopnjo lize bakterij. Izvedena sta bila dva kontrolna poskusa in sicer v prisotnosti faga T5 brez mikrocina in pa z mikrocinom brez faga (kontrola rasti).

Rezultati kontrole rasti so pokazali, da MccJ25 in t-MccJ25 v koncentracijah do 10μM sama bistveno ne vplivata na rast bakterij. V odsotnosti MccJ25 je liza bakterij nastopila 50 minut po dodatki faga T5. Dodatek MccJ25 je lizo inhibiral, učinek pa je bil odvisen od koncentracije dodanega mikrocina. Hitrost rasti bakterij je dosegla svojo prvotno vrednost (vrednost brez dodanega faga) ob dodatku 10μM raztopine mikrocina. t-MccJ25 ni inhibiral lize bakterij.

Da bi preverili, če do inhibicije lize pride zaradi kompetitivne adsorpcije mikrocina na bakterijo, so pri drugem poskusu opazovali vpliv mikrocina na adsorpcijo faga T5 na E. Coli. Ponovno so raztopino bakterij v eksponentni fazi rasti prenesli v LB medij in jih inkubirali pri sobi temperaturi z MccJ25 oz. s t-MccJ25. Za kontrolni poskus so raztopini bakterij dodali le topilo brez mikrocina (50% acetonitril). Po prvi inkubaciji so dodali fag T5 in inkubirali še 15 minut. S centrifugiranjem so nato odstranili adsorbirane fage ter določili število neadsorbiranih virusov.
Delež adsorbiranih fagov se je zmanjšal iz 80% pri 0,1μM koncentraciji na 15% pri 5μM koncentraciji MccJ25. t-MccJ25 ni imel vpliva na adsorpcijo faga.

Raziskovalci so želeli dokazati, da je v prisotnosti mikrocina MccJ25 res inhibirana vezava na receptor FhuA. V pufru so 10 minut inkubirali FhuA in mikrocin (MccJ25 (50nM-3,1μM) oz. t-MccJ25 (3,1μM)), prisoten pa je bil še fluorescentni marker za DNA. Po inkubaciji so v vsak vzorec dodali fag T5 in opazovali injekcijo DNA v raztopino. Že v prejšnjih raziskavah je bilo dokazano, da bakteriofag ob vezavi na FhuA receptor injicira DNA v raztopino, zaradi česar lahko ob prisotnosti fluorescentnega markerja merimo fluorescenco.
Rezultati so pokazali, da se z višanjem koncentracije mikrocina MccJ25 fluorescenca manjša. Izračunano je bilo 55% zmanjšanje adsorpcije faga (iz 100% na 45%) pri višanju koncentracije iz 0,1-3,1μM mikrocina. t-MccJ25 ponovno ni imel učinka na injekcijo DNA faga.

Iz vseh eksperimentov lahko sklepamo, da je mikrocin MccJ25 res kompetitivni inhibitor vezave bakteriofaga T5 na receptor FhuA. Prav tako je razvidno, da termična cepitev zanke v strukturi t-MccJ25 bistveno vpliva na interakcijo s FhuA receptorjem.

== VIRI IN LITERATURA ==

*Rebuffat, S. Microcins in action: amazing defence strategies of Enterobacteria, Biochemical Society Transactions, 2012, Vol. 40, part 6 str. 1456 -1462

*Mathavan, I., Zirah, S., Mehmood, S., Choudhury, H. G., Goulard, C., Li, Y.,Beis, K.,Structural basis for hijacking siderophore receptors by antimicrobial lasso peptides. Nature chemical biology,2014, Vol 10 issue 5, 340–342. doi:10.1038/nchembio.1499

* Volkmar Braun, FhuA (TonA), the Career of a Protein, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, June 2009, p. 3431–3436 Vol. 191, No. 11 0021-9193/09/$08.00_0 doi:10.1128/JB.00106-09

* Flayhan, Ali; Wien, Frank; Paternostre, Maïté; Boulanger, Pasc , New insights into pb5, the receptor binding protein of bacteriophage T5
and its interaction with its Escherichia coli receptor FhuA, Biochimie Vol. 94 issue 9 2012 , doi :10.1016_j.biochi.2012.05.021

*Destoumieux-Garzón, Delphine; Duquesne, Sophie; Peduzzi, Jean, The iron–siderophore transporter FhuA is the receptor for the antimicrobial peptide microcin J25: role of the microcin Val11–Pro16 β-hairpin region in the recognition mechanism, Biochemical Journal, Vol. 389 issue 3 2005, doi: 10.1042_bj20042107

*Robin Leatherbarrow, R H Templer, Biophisical chemistry: Membranes and Proteines,Royal Society of Chemistry, 2007, ISBN 1847550258, str.215-219

*Pascale Boulanger, Insights into Bacteriophage T5 Structure from Analysis of Its Morphogenesis Genes and Protein Components, Journal of Virology Dec 2013, Vol.88, issue 2 1162-1174; doi: 10.1128/JVI.02262-13

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev

2019-04-07T19:19:37Z

Ajda Godec:

==UVOD==

Eden izmed načinov obrambe bakterije pred bakteriofagi je proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev. Tako deluje npr. mikrocin J25, katerega primarna naloga je, da zavira rast drugih sevov bakterije iste vrste. Dokazano je bilo, da se tako kot fag T5 veže na membranski receptor FhuA, ki je sicer zadolžen za prenos Fe3+ ionov v bakterijo. Mikrocin J25 z vezavo na receptor FhuA prepreči vezavo faga T5 in vnos DNK faga v ''E. Coli.''

==MOLEKULARNE KOMPONENTNE INFEKCIJE ''E.COLI'' S STRANI FAGA T5 IN ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE==

=== STRUKTURA MEMBRANSKEGA RECEPTORJA FhuA ===
[https://cdn.rcsb.org/images/hd/by/1by3/1by3.0_chimera_tm_350_350.png FhuA] je protein z maso 78.9 kDa, ki se nahaja v zunanji membrani gram-negativnih bakterij kot je E.coli (sev K-12). Njegova primarna funkcija je transport Fe+3 ionov v celico. Receptor FhuA tvorita sodčkasta domena iz 22 antiparalelnih β-trakov, ki so vgrajeni v membrano in N-končna globularna domena, ki se zloži v notranjost sodčka ter zakrije večinski del notranjosti le-tega. N-končna globularna domena je sestavljena iz 4-verižnih β-plošč in iz 4 kratkih vijačnic. Globularna domena je vezana tako na sodčkasto domeno kot tudi na hidrofilne zanke usmerjene v zunanji mediju ter je odgovorna za vezavo liganda; hidroksamatnega siderofora – ferikroma, ki veže Fe3+ ione. Razen svoje primarne funkcije, je FhuA tudi receptor za različne fage; T1,T5 in ɸ80 ter za antibiotik albomicin.

=== STRUKTURA FAGA T5 ===

Struktura [https://www.i2bc.paris-saclay.fr/IMG/jpg/imagest5.jpg faga T5]je bila določena z uporabo krio-elektronske mikroskopije. Fag T5 uvrščamo v družino fagov Siphoviridae, za predstavnike katere je značilno, da imajo ikozaedrično oblikovano kapsido; ta vsebuje močno zvito, zgoščeno dvojno verižno DNA in rep. Rep predstavlja multiproteinski skupek, ki služi za prepoznavanje površine bakterijskih celic in za prenos genoma v to gostiteljsko celico. Za to družino fagov je značilno, da v strukturi vsebujejo dolg in nekrčljiv [https://jvi.asm.org/content/jvi/88/2/1162/F7.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1 rep].Fag T5 ima 250 nm dolg rep, ki se konča s tremi L-oblikovanimi fibrilarnimi strukturami, ki so pritrjene na stožčasto podlago in premočrtno centralno fibrilo.

=== ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE IN INTERAKCIJA MED pb5 in FhuA ===

Specifičnost gostiteljske celice pri procesu okužbe s strani fagov družine ''Siphoviridae'' je določena z interakcijo med receptor vezavnim proteinom in specifičnim receptorjem na površini bakterijske celice. Prepoznavanje lahko poteka preko interakcij s saharidnimi ali proteinskimi komponentami receptorja. Ti receptor vezavni proteini se nahajajo na konici centralne fibrile v repu. To interakcijo pogosto zaznamuje dvostopenjski proces; v prvi fazi se fag reverzibilno adsorbira na receptorje z nizko vezavno afiniteto, kasneje pa se ireverzibilno veže na sekundarna mesta v receptorju. Interakcija receptor vezavni protein-receptor sproži konformacijske spremembe v strukturi repa, kar povzroči, da se kapsida odpre, pri tem se razpre zunanja membrana bakterije. Ob tem se DNK faga prenese preko repa skozi bakterijsko ovojnico v notranjost celice. Proces prepoznavanja v primeru faga T5 se prične z reverzibilno vezavo L-oblikovane proteinske niti na O-antigen lipopolisaharidne komponente. Nato se fag ireverzibilno veže na zunanji del ferikromskega transporterja FhuA z receptor vezavnim proteinom pb5.

Različne raziskave ''in vivo'' ter ''in vitro'' predpostavljajo naslednji mehanizem infekcije : v prvi stopnji se fag T5 reverzibilno veže s proteinom pb1 (ta sestavlja del L-oblikovane fibrile) na polimanozni O-antigen in pospeši hitrost vezave pb5 na FhuA. Nato se protein pb2 (del centralne fibrile) veže na površino bakterije. Ta interakcija ne vključuje sodelovanja specifičnih membranskih receptorjev. Centralna premočrtna fibrila se nato usidra v bakterijsko zunanjo membrano, dokler pb5 ne interagira s FhuA. Ta interakcija povzroči sprostitev DNK iz kapside. DNK se nato prenese v notranjost celice preko kanalčka, ki nastane iz proteina pb2. Kanalček sega od zunanje membrane, periplazme do citoplazemske membrane. Tak kanalček zaščiti DNK pred delovanjem periplazemskih nukleaz.

== MIKROCINI ==

Bakterije morajo znotraj svoje niše med seboj tekmovati za vire hranil in prostor. Izdelava “orožja” proti drugim bakterijam je torej zelo pomembna za njihovo preživetje. Ena izmed zelo razširjenih taktik tekmovanja med bakterijami je tvorba bakteriocinov. To so antimikrobni peptidi, ki delujejo kot toksini, saj zavirajo rast podobnih oziroma filogenetsko sorodnih bakterijskih sevov (tako na primer, E. coli izloča mikrocine, ki napadajo le seve E. coli). Sintetizirajo se, ko v okolju primanjkuje hranil in bakterije stradajo. Mikrocini so bakteriocini s kratkim aminokislinskim zaporedjem. Izločajo jih enterobakterije, to so Gram-negativni bacili, ki so v naravi zelo razširjeni, prav tako pa so del črevesne flore (kar pove že ime). Njihov zapis se nahaja na plazmidih. Mikrocine delimo v dva razreda:

* razred I – po translaciji pride do obširnih posttranslacijskih modifikacij, vsebujejo disulfidne mostičke
* razred II – ne prihaja do posttranslacijskih modifikacij

=== STRUKTURA MIKROCINA J25 ===

V prvi razred mikrocinov sodi tudi [https://pubs.rsc.org/en/Content/Image/GA/B708478A mikrocin J25 (MccJ25)]. Sestavljen je iz 21 aminokislinskih ostankov, odlikuje pa ga zanimivo zvitje, ki je sicer med peptidi zelo redko. Sprva je veljalo mnenje, da ima v celoti ciklično strukturo, nedavne raziskave pa so pokazale, da se po translaciji zvije v strukturo, ki spominja na laso. N-konec peptida je v obliki makrolaktamskega obroča, ki ga tvorita aminokislinska ostanka Gly1 in Glu8, pri čemer aminska skupina iz glicina tvori peptidno vez s karboksilno skupino stranske skupine glutamata. Peptid se nato nadaljuje v β-lasnično zanko (dva antiparalelna β-trakova povezana z zanko, ki jo tvorita Val11 in Pro16), ki jo tvorijo aminokislinski ostanki 9-18. C-konec mikrocina (t.i. rep) prehaja skozi obroč, kar je sicer entropijsko zelo neugodno, zato je tako zvitje med peptidi zelo redko. V primeru J25 pa je taka struktura celo zelo stabilna – dva aminokislinska ostanka z aromatskimi stranskimi skupinami, Phe19 in Tyr20, vsak iz ene strani “sidrata” C-konec v makrolaktamski obroč. Ker sta stranski skupini teh ostankov tako veliki, prihaja do steričnega oviranja z obročem, zato rep ne more "pobegniti". Sterična stabilizacija je tako močna, da je J25 odporen celo proti večini proteaz in visokim temperaturam. V močno kislem mediju in ob delovanju endopeptidaz se cepi le β-lasnična zanka, ne pa tudi obroč (rep ostane ujet).

=== DELOVANJE MIKROCINA J25 ===

Mikrocin J25 je toksičen le za rod Salmonella in seve vrste E. coli. Rast celic zavre tako, da preide v celico, kje deluje kot inhibitor RNA-polimeraze. Za inhibicijo je pomemben makrolaktamski obroč, ki kot čep zamaši kanal v polimerazi, ki usmerja ustrezne ribonukleozid trifosfate na aktivno mesto.Za prehod skozi celični membrani Gram-negativnih bakterij J25 izkorišča receptor za železo v zunanji membrani; FhuA in z njim sklopljen kompleks TonB–ExbB–ExbD (na receptorju pravzaprav parazitira). To so pokazali številni eksperimenti, pri katerih so v E. coli z delecijo gena za FhuA vnesli plazmid z zapisom za FhuA iz E. coli ali rodu Salmonella. Bakterije brez receptorja so bile odporne na mikrocin J25, po vnosu plazmida pa so nanj postale občutljive.

Ker je železo slabo topno, prehaja skozi receptor v obliki ferikroma, ki po obliki niti malo ne spominja na mikrocin J25, zatorej vezava mikrocina na receptor ni samoumevna. Kako se torej mikrocin veže na FhuA? Primerjava kristalnih struktur kompleksov FhuA-ferikrom in FhuA-J25 je pokazala, da se oba liganda v receptor vežeta na podobnem mestu. Pri tem ferikrom tvori veliko vodikovih vezi z N-globularno domeno FhuA, ki deluje kot zamašek, MccJ25 pa s to domeno tvori le dve vodikovi vezi. Ta podatek nakazuje na to, da za vezavo na receptor FhuA ni potrebna dobra ohranjenost liganda, kar razloži tudi vezavo MccJ25, čeprav je le-ta po strukturi zelo različen od primarnega liganda.

Opravljene so bile tudi številne raziskave, ki so identificirale ostanke na MccJ25, ki so pomembni za vezavo na receptor. Že sama poravnava strukture nevezanega mikrocina (struktura pridobljena z NMR), s strukturo na receptor vezanega mikrocina (struktura, pridobljena z rentgensko kristalografijo) je pokazala, da pride ob vezavi mikrocina do obširne konformacijske spremembe v predelu β-lasnične zanke, medtem ko ostane struktura laktamskega obroča nespremenjena. Iz tega so sklepali, da je za vezavo najpomembnejša lasnična regija. Raziskava, ki je to potrdila, je temeljila na razgradnji te zanke s termolizinom (cepitev vezi med Val11 in Phe16). Izvedena je bila serija poskusov z bakteriofagom T5, ti pa so opisani v nadaljevanju.

=== POSKUSI O VPLIVIH VEZAVE MIKROCINA J25 NA RECEPTOR FhuA NA VEZAVO FAGA T5 ===

S serijo poskusov z bakteriofagom T5 in mikrocinom MccJ25 (oz. t-MccJ25) so v raziskavi želeli pokazati kako vezava MccJ25 na receptor FhuA vpliva na vezavo faga.
V prvem poskusu so raziskovalci preverjali inhibicijo bakterijske infekcije s fagom T5 v prisotnosti mikrocina. Suspenzijo E. Coli (sev W3110) v eksponentni fazi rasti so prenesli na medij. Bakterijam so dodali raztopino MccJ25 ali t-MccJ25 v metanolu in jih nato inkubirali na sobni temperaturi. Dodali so fag T5 in po stresanju in inkubaciji pri 37°C 120 minut z merjenjem absorbance pri 620nm nadzorovali stopnjo lize bakterij. Izvedena sta bila dva kontrolna poskusa in sicer v prisotnosti faga T5 brez mikrocina in pa z mikrocinom brez faga (kontrola rasti).

Rezultati kontrole rasti so pokazali, da MccJ25 in t-MccJ25 v koncentracijah do 10μM sama bistveno ne vplivata na rast bakterij. V odsotnosti MccJ25 je liza bakterij nastopila 50 minut po dodatki faga T5. Dodatek MccJ25 je lizo inhibiral, učinek pa je bil odvisen od koncentracije dodanega mikrocina. Hitrost rasti bakterij je dosegla svojo prvotno vrednost (vrednost brez dodanega faga) ob dodatku 10μM raztopine mikrocina. t-MccJ25 ni inhibiral lize bakterij.

Da bi preverili, če do inhibicije lize pride zaradi kompetitivne adsorpcije mikrocina na bakterijo, so pri drugem poskusu opazovali vpliv mikrocina na adsorpcijo faga T5 na E. Coli. Ponovno so raztopino bakterij v eksponentni fazi rasti prenesli na medij in jih inkubirali pri sobi temperaturi z MccJ25 oz. s t-MccJ25. Za kontrolni poskus so raztopini bakterij dodali le topilo brez mikrocina (50% acetonitril). Po prvi inkubaciji so dodali fag T5 in inkubirali še 15 minut. S centrifugiranjem so nato odstranili adsorbirane fage ter določili število neadsorbiranih virusov.
Delež adsorbiranih fagov se je zmanjšal iz 80% pri 0,1μM koncentraciji na 15% pri 5μM koncentraciji MccJ25. t-MccJ25 ni imel vpliva na adsorpcijo faga.

Raziskovalci so želeli dokazati, da je v prisotnosti mikrocina MccJ25 res inhibirana vezava na receptor FhuA. V pufru so 10 minut inkubirali FhuA in mikrocin (MccJ25 (50nM-3,1μM) oz. t-MccJ25 (3,1μM)), prisoten pa je bil še fluorescentni marker za DNA. Po inkubaciji so v vsak vzorec dodali fag T5 in opazovali injekcijo DNA v raztopino. Že v prejšnjih raziskavah je bilo dokazano, da bakteriofag ob vezavi na FhuA receptor injicira DNA v raztopino, zaradi česar lahko ob prisotnosti fluorescentnega markerja merimo fluorescenco.
Rezultati so pokazali, da se z višanjem koncentracije mikrocina MccJ25 fluorescenca manjša. Izračunano je bilo 55% zmanjšanje adsorpcije faga (iz 100% na 45%) pri višanju koncentracije iz 0,1-3,2μM mikrocina. t-MccJ25 ponovno ni imel učinka na injekcijo DNA faga.

Iz vseh eksperimentov lahko sklepamo, da je mikrocin MccJ25 res kompetitivni inhibitor vezave bakteriofaga T5 na receptor FhuA. Prav tako je razvidno, da termična cepitev zanke v strukturi t-MccJ25 bistveno vpliva na interakcijo s FhuA receptorjem.

== VIRI IN LITERATURA ==

*Rebuffat, S. Microcins in action: amazing defence strategies of Enterobacteria, Biochemical Society Transactions, 2012, Vol. 40, part 6 str. 1456 -1462

*Mathavan, I., Zirah, S., Mehmood, S., Choudhury, H. G., Goulard, C., Li, Y.,Beis, K.,Structural basis for hijacking siderophore receptors by antimicrobial lasso peptides. Nature chemical biology,2014, Vol 10 issue 5, 340–342. doi:10.1038/nchembio.1499

* Volkmar Braun, FhuA (TonA), the Career of a Protein, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, June 2009, p. 3431–3436 Vol. 191, No. 11 0021-9193/09/$08.00_0 doi:10.1128/JB.00106-09

* Flayhan, Ali; Wien, Frank; Paternostre, Maïté; Boulanger, Pasc , New insights into pb5, the receptor binding protein of bacteriophage T5
and its interaction with its Escherichia coli receptor FhuA, Biochimie Vol. 94 issue 9 2012 , doi :10.1016_j.biochi.2012.05.021

*Destoumieux-Garzón, Delphine; Duquesne, Sophie; Peduzzi, Jean, The iron–siderophore transporter FhuA is the receptor for the antimicrobial peptide microcin J25: role of the microcin Val11–Pro16 β-hairpin region in the recognition mechanism, Biochemical Journal, Vol. 389 issue 3 2005, doi: 10.1042_bj20042107

*Robin Leatherbarrow, R H Templer, Biophisical chemistry: Membranes and Proteines,Royal Society of Chemistry, 2007, ISBN 1847550258, str.215-219

*Pascale Boulanger, Insights into Bacteriophage T5 Structure from Analysis of Its Morphogenesis Genes and Protein Components, Journal of Virology Dec 2013, Vol.88, issue 2 1162-1174; doi: 10.1128/JVI.02262-13

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev

2019-04-07T18:54:41Z

Ajda Godec: /* STRUKTURA MIKROCINA J25 */

==UVOD==
Eden izmed načinov obrambe bakterije pred bakteriofagi je proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev. Tako deluje npr. mikrocin J25, katerega primarna naloga je, da zavira rast drugih sevov bakterije iste vrste. Dokazano je bilo, da se tako kot fag T5 veže na membranski receptor FhuA, ki je sicer zadolžen za prenos Fe3+ ionov v bakterijo. Mikrocin J25 z vezavo na receptor FhuA prepreči vezavo faga T5 in vnos DNK faga v ''E. Coli.''

==MOLEKULARNE KOMPONENTNE INFEKCIJE ''E.COLI'' S STRANI FAGA T5 IN ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE==

=== STRUKTURA MEMBRANSKEGA RECEPTORJA FhuA ===
[https://cdn.rcsb.org/images/hd/by/1by3/1by3.0_chimera_tm_350_350.png FhuA] je protein z maso 78.9 kDa, ki se nahaja v zunanji membrani gram-negativnih bakterij kot je E.coli (sev K-12). Njegova primarna funkcija je transport Fe+3 ionov v celico. Receptor FhuA tvorita sodčkasta domena iz 22 antiparalelnih β-trakov, ki so vgrajeni v membrano in N-končna globularna domena, ki se zloži v notranjost sodčka ter zakrije večinski del notranjosti le-tega. N-končna globularna domena je sestavljena iz 4-verižnih β-plošč in iz 4 kratkih vijačnic. Globularna domena je vezana tako na sodčkasto domeno kot tudi na hidrofilne zanke usmerjene v zunanji mediju ter je odgovorna za vezavo liganda; hidroksamatnega siderofora – ferikroma, ki veže Fe3+ ione. Razen svoje primarne funkcije, je FhuA tudi receptor za različne fage; T1,T5 in ɸ80 ter za antibiotik albomicin.

=== STRUKTURA FAGA T5 ===

Struktura [https://www.i2bc.paris-saclay.fr/IMG/jpg/imagest5.jpg faga T5]je bila določena z uporabo krio-elektronske mikroskopije. Fag T5 uvrščamo v družino fagov Siphoviridae, za predstavnike katere je značilno, da imajo ikozaedrično oblikovano kapsido; ta vsebuje močno zvito, zgoščeno dvojno verižno DNA in rep. Rep predstavlja multiproteinski skupek, ki služi za prepoznavanje površine bakterijskih celic in za prenos genoma v to gostiteljsko celico. Za to družino fagov je značilno, da v strukturi vsebujejo dolg in nekrčljiv [https://jvi.asm.org/content/jvi/88/2/1162/F7.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1 rep].Fag T5 ima 250 nm dolg rep, ki se konča s tremi L-oblikovanimi fibrilarnimi strukturami, ki so pritrjene na stožčasto podlago in premočrtno centralno fibrilo.

=== ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE IN INTERAKCIJA MED pb5 in FhuA ===

Specifičnost gostiteljske celice pri procesu okužbe s strani fagov družine ''Siphoviridae'' je določena z interakcijo med receptor vezavnim proteinom in specifičnim receptorjem na površini bakterijske celice. Prepoznavanje lahko poteka preko interakcij s saharidnimi ali proteinskimi komponentami receptorja. Ti receptor vezavni proteini se nahajajo na konici centralne fibrile v repu. To interakcijo pogosto zaznamuje dvostopenjski proces; v prvi fazi se fag reverzibilno adsorbira na receptorje z nizko vezavno afiniteto, kasneje pa se ireverzibilno veže na sekundarna mesta v receptorju. Interakcija receptor vezavni protein-receptor sproži konformacijske spremembe v strukturi repa, kar povzroči, da se kapsida odpre, pri tem se razpre zunanja membrana bakterije. Ob tem se DNK faga prenese preko repa skozi bakterijsko ovojnico v notranjost celice. Proces prepoznavanja v primeru faga T5 se prične z reverzibilno vezavo L-oblikovane proteinske niti na O-antigen lipopolisaharidne komponente. Nato se fag ireverzibilno veže na zunanji del ferikromskega transporterja FhuA z receptor vezavnim proteinom pb5.

Različne raziskave ''in vivo'' ter ''in vitro'' predpostavljajo naslednji mehanizem infekcije : v prvi stopnji se fag T5 reverzibilno veže s proteinom pb1 (ta sestavlja del L-oblikovane fibrile) na polimanozni O-antigen in pospeši hitrost vezave pb5 na FhuA. Nato se protein pb2 (del centralne fibrile) veže na površino bakterije. Ta interakcija ne vključuje sodelovanja specifičnih membranskih receptorjev. Centralna premočrtna fibrila se nato usidra v bakterijsko zunanjo membrano, dokler pb5 ne interagira s FhuA. Ta interakcija povzroči sprostitev DNK iz kapside. DNK se nato prenese v notranjost celice preko kanalčka, ki nastane iz proteina pb2. Kanalček sega od zunanje membrane, periplazme do citoplazemske membrane. Tak kanalček zaščiti DNK pred delovanjem periplazemskih nukleaz.

== MIKROCINI ==

Bakterije morajo znotraj svoje niše med seboj tekmovati za vire hranil in prostor. Izdelava “orožja” proti drugim bakterijam je torej zelo pomembna za njihovo preživetje. Ena izmed zelo razširjenih taktik tekmovanja med bakterijami je tvorba bakteriocinov. To so antimikrobni peptidi, ki delujejo kot toksini, saj zavirajo rast podobnih oziroma filogenetsko sorodnih bakterijskih sevov (tako na primer, E. coli izloča mikrocine, ki napadajo le seve E. coli). Sintetizirajo se, ko v okolju primanjkuje hranil in bakterije stradajo. Mikrocini so bakteriocini s kratkim aminokislinskim zaporedjem. Izločajo jih enterobakterije, to so Gram-negativni bacili, ki so v naravi zelo razširjeni, prav tako pa so del črevesne flore (kar pove že ime). Njihov zapis se nahaja na plazmidih. Mikrocine delimo v dva razreda:

* razred I – po translaciji pride do obširnih posttranslacijskih modifikacij, vsebujejo disulfidne mostičke
* razred II – ne prihaja do posttranslacijskih modifikacij

=== STRUKTURA MIKROCINA J25 ===

V prvi razred mikrocinov sodi tudi [https://pubs.rsc.org/en/Content/Image/GA/B708478A mikrocin J25 (MccJ25)]. Sestavljen je iz 21 aminokislinskih ostankov, odlikuje pa ga zanimivo zvitje, ki je sicer med peptidi zelo redko. Sprva je veljalo mnenje, da ima v celoti ciklično strukturo, nedavne raziskave pa so pokazale, da se po translaciji zvije v strukturo, ki spominja na laso. N-konec peptida je v obliki makrolaktamskega obroča, ki ga tvorita aminokislinska ostanka Gly1 in Glu8, pri čemer aminska skupina iz glicina tvori peptidno vez s karboksilno skupino stranske skupine glutamata. Peptid se nato nadaljuje v β-lasnično zanko (dva antiparalelna β-trakova povezana z zanko, ki jo tvorita Val11 in Pro16), ki jo tvorijo aminokislinski ostanki 9-18. C-konec mikrocina (t.i. rep) prehaja skozi obroč, kar je sicer entropijsko zelo neugodno, zato je tako zvitje med peptidi zelo redko. V primeru J25 pa je taka struktura celo zelo stabilna – dva aminokislinska ostanka z aromatskimi stranskimi skupinami, Phe19 in Tyr20, vsak iz ene strani “sidrata” C-konec v makrolaktamski obroč. Ker sta stranski skupini teh ostankov tako veliki, prihaja do steričnega oviranja z obročem, zato rep ne more "pobegniti". Sterična stabilizacija je tako močna, da je J25 odporen celo proti večini proteaz in visokim temperaturam. V močno kislem mediju in ob delovanju endopeptidaz se cepi le β-lasnična zanka, ne pa tudi obroč (rep ostane ujet).

=== DELOVANJE MIKROCINA J25 ===

Mikrocin J25 je toksičen le za rod Salmonella in seve vrste E. coli. Rast celic zavre tako, da preide v celico, kje deluje kot inhibitor RNA-polimeraze. Za inhibicijo je pomemben makrolaktamski obroč, ki kot čep zamaši kanal v polimerazi, ki usmerja ustrezne ribonukleozid trifosfate na aktivno mesto.Za prehod skozi celični membrani Gram-negativnih bakterij J25 izkorišča receptor za železo v zunanji membrani; FhuA in z njim sklopljen kompleks TonB–ExbB–ExbD (na receptorju pravzaprav parazitira). To so pokazali številni eksperimenti, pri katerih so v E. coli z delecijo gena za FhuA vnesli plazmid z zapisom za FhuA iz E. coli ali rodu Salmonella. Bakterije brez receptorja so bile odporne na mikrocin J25, po vnosu plazmida pa so nanj postale občutljive.

Ker je železo slabo topno, prehaja skozi receptor v obliki ferikroma, ki po obliki niti malo ne spominja na mikrocin J25, zatorej vezava mikrocina na receptor ni samoumevna. Kako se torej mikrocin veže na FhuA? Primerjava kristalnih struktur kompleksov FhuA-ferikrom in FhuA-J25 je pokazala, da se oba liganda v receptor vežeta na podobnem mestu. Pri tem ferikrom tvori veliko vodikovih vezi z N-globularno domeno FhuA, ki deluje kot zamašek, MccJ25 pa s to domeno tvori le dve vodikovi vezi. Ta podatek nakazuje na to, da za vezavo na receptor FhuA ni potrebna dobra ohranjenost liganda, kar razloži tudi vezavo MccJ25, čeprav je le-ta po strukturi zelo različen od primarnega liganda.

Opravljene so bile tudi številne raziskave, ki so identificirale ostanke na MccJ25, ki so pomembni za vezavo na receptor. Že sama poravnava strukture nevezanega mikrocina (struktura pridobljena z NMR), s strukturo na receptor vezanega mikrocina (struktura, pridobljena z rentgensko kristalografijo) je pokazala, da pride ob vezavi mikrocina do obširne konformacijske spremembe v predelu β-lasnične zanke, medtem ko ostane struktura laktamskega obroča nespremenjena. Iz tega so sklepali, da je za vezavo najpomembnejša lasnična regija. Raziskava, ki je to potrdila, je temeljila na razgradnji te zanke s termolizinom (cepitev vezi med Val11 in Phe16). Izvedena je bila serija poskusov z bakteriofagom T5, ti pa so opisani v nadaljevanju.

=== POSKUSI O VPLIVIH VEZAVE MIKROCINA J25 NA RECEPTOR FhuA NA VEZAVO FAGA T5 ===

S serijo poskusov z bakteriofagom T5 in mikrocinom MccJ25 (oz. t-MccJ25) so v raziskavi želeli pokazati kako vezava MccJ25 na receptor FhuA vpliva na vezavo faga.
V prvem poskusu so raziskovalci preverjali inhibicijo bakterijske infekcije s fagom T5 v prisotnosti mikrocina. Suspenzijo E. Coli (sev W3110) v eksponentni fazi rasti so prenesli na medij. Bakterijam so dodali raztopino MccJ25 ali t-MccJ25 v metanolu in jih nato inkubirali na sobni temperaturi. Dodali so fag T5 in po stresanju in inkubaciji pri 37°C 120 minut z merjenjem absorbance pri 620nm nadzorovali stopnjo lize bakterij. Izvedena sta bila dva kontrolna poskusa in sicer v prisotnosti faga T5 brez mikrocina in pa z mikrocinom brez faga (kontrola rasti).

Rezultati kontrole rasti so pokazali, da MccJ25 in t-MccJ25 v koncentracijah do 10μM sama bistveno ne vplivata na rast bakterij. V odsotnosti MccJ25 je liza bakterij nastopila 50 minut po dodatki faga T5. Dodatek MccJ25 je lizo inhibiral, učinek pa je bil odvisen od koncentracije dodanega mikrocina. Hitrost rasti bakterij je dosegla svojo prvotno vrednost (vrednost brez dodanega faga) ob dodatku 10μM raztopine mikrocina. t-MccJ25 ni inhibiral lize bakterij.

Da bi preverili, če do inhibicije lize pride zaradi kompetitivne adsorpcije mikrocina na bakterijo, so pri drugem poskusu opazovali vpliv mikrocina na adsorpcijo faga T5 na E. Coli. Ponovno so raztopino bakterij v eksponentni fazi rasti prenesli na medij in jih inkubirali pri sobi temperaturi z MccJ25 oz. s t-MccJ25. Za kontrolni poskus so raztopini bakterij dodali le topilo brez mikrocina (50% acetonitril). Po prvi inkubaciji so dodali fag T5 in inkubirali še 15 minut. S centrifugiranjem so nato odstranili adsorbirane fage ter določili število neadsorbiranih virusov.
Delež adsorbiranih fagov se je zmanjšal iz 80% pri 0,1μM koncentraciji na 15% pri 5μM koncentraciji MccJ25. t-MccJ25 ni imel vpliva na adsorpcijo faga.

Raziskovalci so želeli dokazati, da je v prisotnosti mikrocina MccJ25 res inhibirana vezava na receptor FhuA. V pufru so 10 minut inkubirali FhuA in mikrocin (MccJ25 (50nM-3,1μM) oz. t-MccJ25 (3,1μM)), prisoten pa je bil še fluorescentni marker za DNA. Po inkubaciji so v vsak vzorec dodali fag T5 in opazovali injekcijo DNA v raztopino. Že v prejšnjih raziskavah je bilo dokazano, da bakteriofag ob vezavi na FhuA receptor injicira DNA v raztopino, zaradi česar lahko ob prisotnosti fluorescentnega markerja merimo fluorescenco.
Rezultati so pokazali, da se z višanjem koncentracije mikrocina MccJ25 fluorescenca manjša. Izračunano je bilo 55% zmanjšanje adsorpcije faga (iz 100% na 45%) pri višanju koncentracije iz 0,1-3,2μM mikrocina. t-MccJ25 ponovno ni imel učinka na injekcijo DNA faga.

Iz vseh eksperimentov lahko sklepamo, da je mikrocin MccJ25 res kompetitivni inhibitor vezave bakteriofaga T5 na receptor FhuA. Prav tako je razvidno, da termična cepitev zanke v strukturi t-MccJ25 bistveno vpliva na interakcijo s FhuA receptorjem.

== VIRI IN LITERATURA ==

*Rebuffat, S. Microcins in action: amazing defence strategies of Enterobacteria, Biochemical Society Transactions, 2012, Vol. 40, part 6 str. 1456 -1462

*Mathavan, I., Zirah, S., Mehmood, S., Choudhury, H. G., Goulard, C., Li, Y.,Beis, K.,Structural basis for hijacking siderophore receptors by antimicrobial lasso peptides. Nature chemical biology,2014, Vol 10 issue 5, 340–342. doi:10.1038/nchembio.1499

* Volkmar Braun, FhuA (TonA), the Career of a Protein, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, June 2009, p. 3431–3436 Vol. 191, No. 11 0021-9193/09/$08.00_0 doi:10.1128/JB.00106-09

* Flayhan, Ali; Wien, Frank; Paternostre, Maïté; Boulanger, Pasc , New insights into pb5, the receptor binding protein of bacteriophage T5
and its interaction with its Escherichia coli receptor FhuA, Biochimie Vol. 94 issue 9 2012 , doi :10.1016_j.biochi.2012.05.021

*Destoumieux-Garzón, Delphine; Duquesne, Sophie; Peduzzi, Jean, The iron–siderophore transporter FhuA is the receptor for the antimicrobial peptide microcin J25: role of the microcin Val11–Pro16 β-hairpin region in the recognition mechanism, Biochemical Journal, Vol. 389 issue 3 2005, doi: 10.1042_bj20042107

*Robin Leatherbarrow, R H Templer, Biophisical chemistry: Membranes and Proteines,Royal Society of Chemistry, 2007, ISBN 1847550258, str.215-219

*Pascale Boulanger, Insights into Bacteriophage T5 Structure from Analysis of Its Morphogenesis Genes and Protein Components, Journal of Virology Dec 2013, Vol.88, issue 2 1162-1174; doi: 10.1128/JVI.02262-13

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Talk:Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev

2019-04-07T18:52:25Z

Ajda Godec:

Ajda Godec:MOLEKULARNE KOMPONENTNE INFEKCIJE E.COLI S STRANI FAGA T5 IN ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE

Liza Ulčakar:MIKROCINI

Luka Gnidovec:UVOD,POSKUSI O VPLIVIH VEZAVE MIKROCINA J25 NA RECEPTOR FhuA NA VEZAVO FAGA T5

Talk:Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev

2019-04-07T18:45:27Z

Ajda Godec: New page: Ajda Godec: MOLEKULARNE KOMPONENTNE INFEKCIJE E.COLI S STRANI FAGA T5 IN ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE Liza Ulčakar: MIKROCINI Luka Gnidovec: POSKUSI O VPLIVIH VEZAVE MIKROCINA J25 NA R...

Ajda Godec: MOLEKULARNE KOMPONENTNE INFEKCIJE E.COLI S STRANI FAGA T5 IN ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE

Liza Ulčakar: MIKROCINI

Luka Gnidovec: POSKUSI O VPLIVIH VEZAVE MIKROCINA J25 NA RECEPTOR FhuA NA VEZAVO FAGA T5

Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev

2019-04-07T18:44:17Z

Ajda Godec: /* POSKUSI O VPLIVIH VEZAVE MIKROCINA J25 NA RECEPTOR RhuA NA VEZAVO FAGA T5 */

==UVOD==
Eden izmed načinov obrambe bakterije pred bakteriofagi je proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev. Tako deluje npr. mikrocin J25, katerega primarna naloga je, da zavira rast drugih sevov bakterije iste vrste. Dokazano je bilo, da se tako kot fag T5 veže na membranski receptor FhuA, ki je sicer zadolžen za prenos Fe3+ ionov v bakterijo. Mikrocin J25 z vezavo na receptor FhuA prepreči vezavo faga T5 in vnos DNK faga v ''E. Coli.''

==MOLEKULARNE KOMPONENTNE INFEKCIJE ''E.COLI'' S STRANI FAGA T5 IN ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE==

=== STRUKTURA MEMBRANSKEGA RECEPTORJA FhuA ===
[https://cdn.rcsb.org/images/hd/by/1by3/1by3.0_chimera_tm_350_350.png FhuA] je protein z maso 78.9 kDa, ki se nahaja v zunanji membrani gram-negativnih bakterij kot je E.coli (sev K-12). Njegova primarna funkcija je transport Fe+3 ionov v celico. Receptor FhuA tvorita sodčkasta domena iz 22 antiparalelnih β-trakov, ki so vgrajeni v membrano in N-končna globularna domena, ki se zloži v notranjost sodčka ter zakrije večinski del notranjosti le-tega. N-končna globularna domena je sestavljena iz 4-verižnih β-plošč in iz 4 kratkih vijačnic. Globularna domena je vezana tako na sodčkasto domeno kot tudi na hidrofilne zanke usmerjene v zunanji mediju ter je odgovorna za vezavo liganda; hidroksamatnega siderofora – ferikroma, ki veže Fe3+ ione. Razen svoje primarne funkcije, je FhuA tudi receptor za različne fage; T1,T5 in ɸ80 ter za antibiotik albomicin.

=== STRUKTURA FAGA T5 ===

Struktura [https://www.i2bc.paris-saclay.fr/IMG/jpg/imagest5.jpg faga T5]je bila določena z uporabo krio-elektronske mikroskopije. Fag T5 uvrščamo v družino fagov Siphoviridae, za predstavnike katere je značilno, da imajo ikozaedrično oblikovano kapsido; ta vsebuje močno zvito, zgoščeno dvojno verižno DNA in rep. Rep predstavlja multiproteinski skupek, ki služi za prepoznavanje površine bakterijskih celic in za prenos genoma v to gostiteljsko celico. Za to družino fagov je značilno, da v strukturi vsebujejo dolg in nekrčljiv [https://jvi.asm.org/content/jvi/88/2/1162/F7.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1 rep].Fag T5 ima 250 nm dolg rep, ki se konča s tremi L-oblikovanimi fibrilarnimi strukturami, ki so pritrjene na stožčasto podlago in premočrtno centralno fibrilo.

=== ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE IN INTERAKCIJA MED pb5 in FhuA ===

Specifičnost gostiteljske celice pri procesu okužbe s strani fagov družine ''Siphoviridae'' je določena z interakcijo med receptor vezavnim proteinom in specifičnim receptorjem na površini bakterijske celice. Prepoznavanje lahko poteka preko interakcij s saharidnimi ali proteinskimi komponentami receptorja. Ti receptor vezavni proteini se nahajajo na konici centralne fibrile v repu. To interakcijo pogosto zaznamuje dvostopenjski proces; v prvi fazi se fag reverzibilno adsorbira na receptorje z nizko vezavno afiniteto, kasneje pa se ireverzibilno veže na sekundarna mesta v receptorju. Interakcija receptor vezavni protein-receptor sproži konformacijske spremembe v strukturi repa, kar povzroči, da se kapsida odpre, pri tem se razpre zunanja membrana bakterije. Ob tem se DNK faga prenese preko repa skozi bakterijsko ovojnico v notranjost celice. Proces prepoznavanja v primeru faga T5 se prične z reverzibilno vezavo L-oblikovane proteinske niti na O-antigen lipopolisaharidne komponente. Nato se fag ireverzibilno veže na zunanji del ferikromskega transporterja FhuA z receptor vezavnim proteinom pb5.

Različne raziskave ''in vivo'' ter ''in vitro'' predpostavljajo naslednji mehanizem infekcije : v prvi stopnji se fag T5 reverzibilno veže s proteinom pb1 (ta sestavlja del L-oblikovane fibrile) na polimanozni O-antigen in pospeši hitrost vezave pb5 na FhuA. Nato se protein pb2 (del centralne fibrile) veže na površino bakterije. Ta interakcija ne vključuje sodelovanja specifičnih membranskih receptorjev. Centralna premočrtna fibrila se nato usidra v bakterijsko zunanjo membrano, dokler pb5 ne interagira s FhuA. Ta interakcija povzroči sprostitev DNK iz kapside. DNK se nato prenese v notranjost celice preko kanalčka, ki nastane iz proteina pb2. Kanalček sega od zunanje membrane, periplazme do citoplazemske membrane. Tak kanalček zaščiti DNK pred delovanjem periplazemskih nukleaz.

== MIKROCINI ==

Bakterije morajo znotraj svoje niše med seboj tekmovati za vire hranil in prostor. Izdelava “orožja” proti drugim bakterijam je torej zelo pomembna za njihovo preživetje. Ena izmed zelo razširjenih taktik tekmovanja med bakterijami je tvorba bakteriocinov. To so antimikrobni peptidi, ki delujejo kot toksini, saj zavirajo rast podobnih oziroma filogenetsko sorodnih bakterijskih sevov (tako na primer, E. coli izloča mikrocine, ki napadajo le seve E. coli). Sintetizirajo se, ko v okolju primanjkuje hranil in bakterije stradajo. Mikrocini so bakteriocini s kratkim aminokislinskim zaporedjem. Izločajo jih enterobakterije, to so Gram-negativni bacili, ki so v naravi zelo razširjeni, prav tako pa so del črevesne flore (kar pove že ime). Njihov zapis se nahaja na plazmidih. Mikrocine delimo v dva razreda:

* razred I – po translaciji pride do obširnih posttranslacijskih modifikacij, vsebujejo disulfidne mostičke
* razred II – ne prihaja do posttranslacijskih modifikacij

=== STRUKTURA MIKROCINA J25 ===

V prvi razred mikrocinov sodi tudi mikrocin J25 (MccJ25). Sestavljen je iz 21 aminokislinskih ostankov, odlikuje pa ga zanimivo zvitje, ki je sicer med peptidi zelo redko. Sprva je veljalo mnenje, da ima v celoti ciklično strukturo, nedavne raziskave pa so pokazale, da se po translaciji zvije v strukturo, ki spominja na laso. N-konec peptida je v obliki makrolaktamskega obroča, ki ga tvorita aminokislinska ostanka Gly1 in Glu8, pri čemer aminska skupina iz glicina tvori peptidno vez s karboksilno skupino stranske skupine glutamata. Peptid se nato nadaljuje v β-lasnično zanko (dva antiparalelna β-trakova povezana z zanko, ki jo tvorita Val11 in Pro16), ki jo tvorijo aminokislinski ostanki 9-18. C-konec mikrocina (t.i. rep) prehaja skozi obroč, kar je sicer entropijsko zelo neugodno, zato je tako zvitje med peptidi zelo redko. V primeru J25 pa je taka struktura celo zelo stabilna – dva aminokislinska ostanka z aromatskimi stranskimi skupinami, Phe19 in Tyr20, vsak iz ene strani “sidrata” C-konec v makrolaktamski obroč. Ker sta stranski skupini teh ostankov tako veliki, prihaja do steričnega oviranja z obročem, zato rep ne more "pobegniti". Sterična stabilizacija je tako močna, da je J25 odporen celo proti večini proteaz in visokim temperaturam. V močno kislem mediju in ob delovanju endopeptidaz se cepi le β-lasnična zanka, ne pa tudi obroč (rep ostane ujet).

=== DELOVANJE MIKROCINA J25 ===

Mikrocin J25 je toksičen le za rod Salmonella in seve vrste E. coli. Rast celic zavre tako, da preide v celico, kje deluje kot inhibitor RNA-polimeraze. Za inhibicijo je pomemben makrolaktamski obroč, ki kot čep zamaši kanal v polimerazi, ki usmerja ustrezne ribonukleozid trifosfate na aktivno mesto.Za prehod skozi celični membrani Gram-negativnih bakterij J25 izkorišča receptor za železo v zunanji membrani; FhuA in z njim sklopljen kompleks TonB–ExbB–ExbD (na receptorju pravzaprav parazitira). To so pokazali številni eksperimenti, pri katerih so v E. coli z delecijo gena za FhuA vnesli plazmid z zapisom za FhuA iz E. coli ali rodu Salmonella. Bakterije brez receptorja so bile odporne na mikrocin J25, po vnosu plazmida pa so nanj postale občutljive.

Ker je železo slabo topno, prehaja skozi receptor v obliki ferikroma, ki po obliki niti malo ne spominja na mikrocin J25, zatorej vezava mikrocina na receptor ni samoumevna. Kako se torej mikrocin veže na FhuA? Primerjava kristalnih struktur kompleksov FhuA-ferikrom in FhuA-J25 je pokazala, da se oba liganda v receptor vežeta na podobnem mestu. Pri tem ferikrom tvori veliko vodikovih vezi z N-globularno domeno FhuA, ki deluje kot zamašek, MccJ25 pa s to domeno tvori le dve vodikovi vezi. Ta podatek nakazuje na to, da za vezavo na receptor FhuA ni potrebna dobra ohranjenost liganda, kar razloži tudi vezavo MccJ25, čeprav je le-ta po strukturi zelo različen od primarnega liganda.

Opravljene so bile tudi številne raziskave, ki so identificirale ostanke na MccJ25, ki so pomembni za vezavo na receptor. Že sama poravnava strukture nevezanega mikrocina (struktura pridobljena z NMR), s strukturo na receptor vezanega mikrocina (struktura, pridobljena z rentgensko kristalografijo) je pokazala, da pride ob vezavi mikrocina do obširne konformacijske spremembe v predelu β-lasnične zanke, medtem ko ostane struktura laktamskega obroča nespremenjena. Iz tega so sklepali, da je za vezavo najpomembnejša lasnična regija. Raziskava, ki je to potrdila, je temeljila na razgradnji te zanke s termolizinom (cepitev vezi med Val11 in Phe16). Izvedena je bila serija poskusov z bakteriofagom T5, ti pa so opisani v nadaljevanju.

=== POSKUSI O VPLIVIH VEZAVE MIKROCINA J25 NA RECEPTOR FhuA NA VEZAVO FAGA T5 ===

S serijo poskusov z bakteriofagom T5 in mikrocinom MccJ25 (oz. t-MccJ25) so v raziskavi želeli pokazati kako vezava MccJ25 na receptor FhuA vpliva na vezavo faga.
V prvem poskusu so raziskovalci preverjali inhibicijo bakterijske infekcije s fagom T5 v prisotnosti mikrocina. Suspenzijo E. Coli (sev W3110) v eksponentni fazi rasti so prenesli na medij. Bakterijam so dodali raztopino MccJ25 ali t-MccJ25 v metanolu in jih nato inkubirali na sobni temperaturi. Dodali so fag T5 in po stresanju in inkubaciji pri 37°C 120 minut z merjenjem absorbance pri 620nm nadzorovali stopnjo lize bakterij. Izvedena sta bila dva kontrolna poskusa in sicer v prisotnosti faga T5 brez mikrocina in pa z mikrocinom brez faga (kontrola rasti).

Rezultati kontrole rasti so pokazali, da MccJ25 in t-MccJ25 v koncentracijah do 10μM sama bistveno ne vplivata na rast bakterij. V odsotnosti MccJ25 je liza bakterij nastopila 50 minut po dodatki faga T5. Dodatek MccJ25 je lizo inhibiral, učinek pa je bil odvisen od koncentracije dodanega mikrocina. Hitrost rasti bakterij je dosegla svojo prvotno vrednost (vrednost brez dodanega faga) ob dodatku 10μM raztopine mikrocina. t-MccJ25 ni inhibiral lize bakterij.

Da bi preverili, če do inhibicije lize pride zaradi kompetitivne adsorpcije mikrocina na bakterijo, so pri drugem poskusu opazovali vpliv mikrocina na adsorpcijo faga T5 na E. Coli. Ponovno so raztopino bakterij v eksponentni fazi rasti prenesli na medij in jih inkubirali pri sobi temperaturi z MccJ25 oz. s t-MccJ25. Za kontrolni poskus so raztopini bakterij dodali le topilo brez mikrocina (50% acetonitril). Po prvi inkubaciji so dodali fag T5 in inkubirali še 15 minut. S centrifugiranjem so nato odstranili adsorbirane fage ter določili število neadsorbiranih virusov.
Delež adsorbiranih fagov se je zmanjšal iz 80% pri 0,1μM koncentraciji na 15% pri 5μM koncentraciji MccJ25. t-MccJ25 ni imel vpliva na adsorpcijo faga.

Raziskovalci so želeli dokazati, da je v prisotnosti mikrocina MccJ25 res inhibirana vezava na receptor FhuA. V pufru so 10 minut inkubirali FhuA in mikrocin (MccJ25 (50nM-3,1μM) oz. t-MccJ25 (3,1μM)), prisoten pa je bil še fluorescentni marker za DNA. Po inkubaciji so v vsak vzorec dodali fag T5 in opazovali injekcijo DNA v raztopino. Že v prejšnjih raziskavah je bilo dokazano, da bakteriofag ob vezavi na FhuA receptor injicira DNA v raztopino, zaradi česar lahko ob prisotnosti fluorescentnega markerja merimo fluorescenco.
Rezultati so pokazali, da se z višanjem koncentracije mikrocina MccJ25 fluorescenca manjša. Izračunano je bilo 55% zmanjšanje adsorpcije faga (iz 100% na 45%) pri višanju koncentracije iz 0,1-3,2μM mikrocina. t-MccJ25 ponovno ni imel učinka na injekcijo DNA faga.

Iz vseh eksperimentov lahko sklepamo, da je mikrocin MccJ25 res kompetitivni inhibitor vezave bakteriofaga T5 na receptor FhuA. Prav tako je razvidno, da termična cepitev zanke v strukturi t-MccJ25 bistveno vpliva na interakcijo s FhuA receptorjem.

== VIRI IN LITERATURA ==

*Rebuffat, S. Microcins in action: amazing defence strategies of Enterobacteria, Biochemical Society Transactions, 2012, Vol. 40, part 6 str. 1456 -1462

*Mathavan, I., Zirah, S., Mehmood, S., Choudhury, H. G., Goulard, C., Li, Y.,Beis, K.,Structural basis for hijacking siderophore receptors by antimicrobial lasso peptides. Nature chemical biology,2014, Vol 10 issue 5, 340–342. doi:10.1038/nchembio.1499

* Volkmar Braun, FhuA (TonA), the Career of a Protein, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, June 2009, p. 3431–3436 Vol. 191, No. 11 0021-9193/09/$08.00_0 doi:10.1128/JB.00106-09

* Flayhan, Ali; Wien, Frank; Paternostre, Maïté; Boulanger, Pasc , New insights into pb5, the receptor binding protein of bacteriophage T5
and its interaction with its Escherichia coli receptor FhuA, Biochimie Vol. 94 issue 9 2012 , doi :10.1016_j.biochi.2012.05.021

*Destoumieux-Garzón, Delphine; Duquesne, Sophie; Peduzzi, Jean, The iron–siderophore transporter FhuA is the receptor for the antimicrobial peptide microcin J25: role of the microcin Val11–Pro16 β-hairpin region in the recognition mechanism, Biochemical Journal, Vol. 389 issue 3 2005, doi: 10.1042_bj20042107

*Robin Leatherbarrow, R H Templer, Biophisical chemistry: Membranes and Proteines,Royal Society of Chemistry, 2007, ISBN 1847550258, str.215-219

*Pascale Boulanger, Insights into Bacteriophage T5 Structure from Analysis of Its Morphogenesis Genes and Protein Components, Journal of Virology Dec 2013, Vol.88, issue 2 1162-1174; doi: 10.1128/JVI.02262-13

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev

2019-04-07T18:37:45Z

Ajda Godec: /* STRUKTURA FAGA T5 */

==UVOD==
Eden izmed načinov obrambe bakterije pred bakteriofagi je proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev. Tako deluje npr. mikrocin J25, katerega primarna naloga je, da zavira rast drugih sevov bakterije iste vrste. Dokazano je bilo, da se tako kot fag T5 veže na membranski receptor FhuA, ki je sicer zadolžen za prenos Fe3+ ionov v bakterijo. Mikrocin J25 z vezavo na receptor FhuA prepreči vezavo faga T5 in vnos DNK faga v ''E. Coli.''

==MOLEKULARNE KOMPONENTNE INFEKCIJE ''E.COLI'' S STRANI FAGA T5 IN ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE==

=== STRUKTURA MEMBRANSKEGA RECEPTORJA FhuA ===
[https://cdn.rcsb.org/images/hd/by/1by3/1by3.0_chimera_tm_350_350.png FhuA] je protein z maso 78.9 kDa, ki se nahaja v zunanji membrani gram-negativnih bakterij kot je E.coli (sev K-12). Njegova primarna funkcija je transport Fe+3 ionov v celico. Receptor FhuA tvorita sodčkasta domena iz 22 antiparalelnih β-trakov, ki so vgrajeni v membrano in N-končna globularna domena, ki se zloži v notranjost sodčka ter zakrije večinski del notranjosti le-tega. N-končna globularna domena je sestavljena iz 4-verižnih β-plošč in iz 4 kratkih vijačnic. Globularna domena je vezana tako na sodčkasto domeno kot tudi na hidrofilne zanke usmerjene v zunanji mediju ter je odgovorna za vezavo liganda; hidroksamatnega siderofora – ferikroma, ki veže Fe3+ ione. Razen svoje primarne funkcije, je FhuA tudi receptor za različne fage; T1,T5 in ɸ80 ter za antibiotik albomicin.

=== STRUKTURA FAGA T5 ===

Struktura [https://www.i2bc.paris-saclay.fr/IMG/jpg/imagest5.jpg faga T5]je bila določena z uporabo krio-elektronske mikroskopije. Fag T5 uvrščamo v družino fagov Siphoviridae, za predstavnike katere je značilno, da imajo ikozaedrično oblikovano kapsido; ta vsebuje močno zvito, zgoščeno dvojno verižno DNA in rep. Rep predstavlja multiproteinski skupek, ki služi za prepoznavanje površine bakterijskih celic in za prenos genoma v to gostiteljsko celico. Za to družino fagov je značilno, da v strukturi vsebujejo dolg in nekrčljiv [https://jvi.asm.org/content/jvi/88/2/1162/F7.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1 rep].Fag T5 ima 250 nm dolg rep, ki se konča s tremi L-oblikovanimi fibrilarnimi strukturami, ki so pritrjene na stožčasto podlago in premočrtno centralno fibrilo.

=== ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE IN INTERAKCIJA MED pb5 in FhuA ===

Specifičnost gostiteljske celice pri procesu okužbe s strani fagov družine ''Siphoviridae'' je določena z interakcijo med receptor vezavnim proteinom in specifičnim receptorjem na površini bakterijske celice. Prepoznavanje lahko poteka preko interakcij s saharidnimi ali proteinskimi komponentami receptorja. Ti receptor vezavni proteini se nahajajo na konici centralne fibrile v repu. To interakcijo pogosto zaznamuje dvostopenjski proces; v prvi fazi se fag reverzibilno adsorbira na receptorje z nizko vezavno afiniteto, kasneje pa se ireverzibilno veže na sekundarna mesta v receptorju. Interakcija receptor vezavni protein-receptor sproži konformacijske spremembe v strukturi repa, kar povzroči, da se kapsida odpre, pri tem se razpre zunanja membrana bakterije. Ob tem se DNK faga prenese preko repa skozi bakterijsko ovojnico v notranjost celice. Proces prepoznavanja v primeru faga T5 se prične z reverzibilno vezavo L-oblikovane proteinske niti na O-antigen lipopolisaharidne komponente. Nato se fag ireverzibilno veže na zunanji del ferikromskega transporterja FhuA z receptor vezavnim proteinom pb5.

Različne raziskave ''in vivo'' ter ''in vitro'' predpostavljajo naslednji mehanizem infekcije : v prvi stopnji se fag T5 reverzibilno veže s proteinom pb1 (ta sestavlja del L-oblikovane fibrile) na polimanozni O-antigen in pospeši hitrost vezave pb5 na FhuA. Nato se protein pb2 (del centralne fibrile) veže na površino bakterije. Ta interakcija ne vključuje sodelovanja specifičnih membranskih receptorjev. Centralna premočrtna fibrila se nato usidra v bakterijsko zunanjo membrano, dokler pb5 ne interagira s FhuA. Ta interakcija povzroči sprostitev DNK iz kapside. DNK se nato prenese v notranjost celice preko kanalčka, ki nastane iz proteina pb2. Kanalček sega od zunanje membrane, periplazme do citoplazemske membrane. Tak kanalček zaščiti DNK pred delovanjem periplazemskih nukleaz.

== MIKROCINI ==

Bakterije morajo znotraj svoje niše med seboj tekmovati za vire hranil in prostor. Izdelava “orožja” proti drugim bakterijam je torej zelo pomembna za njihovo preživetje. Ena izmed zelo razširjenih taktik tekmovanja med bakterijami je tvorba bakteriocinov. To so antimikrobni peptidi, ki delujejo kot toksini, saj zavirajo rast podobnih oziroma filogenetsko sorodnih bakterijskih sevov (tako na primer, E. coli izloča mikrocine, ki napadajo le seve E. coli). Sintetizirajo se, ko v okolju primanjkuje hranil in bakterije stradajo. Mikrocini so bakteriocini s kratkim aminokislinskim zaporedjem. Izločajo jih enterobakterije, to so Gram-negativni bacili, ki so v naravi zelo razširjeni, prav tako pa so del črevesne flore (kar pove že ime). Njihov zapis se nahaja na plazmidih. Mikrocine delimo v dva razreda:

* razred I – po translaciji pride do obširnih posttranslacijskih modifikacij, vsebujejo disulfidne mostičke
* razred II – ne prihaja do posttranslacijskih modifikacij

=== STRUKTURA MIKROCINA J25 ===

V prvi razred mikrocinov sodi tudi mikrocin J25 (MccJ25). Sestavljen je iz 21 aminokislinskih ostankov, odlikuje pa ga zanimivo zvitje, ki je sicer med peptidi zelo redko. Sprva je veljalo mnenje, da ima v celoti ciklično strukturo, nedavne raziskave pa so pokazale, da se po translaciji zvije v strukturo, ki spominja na laso. N-konec peptida je v obliki makrolaktamskega obroča, ki ga tvorita aminokislinska ostanka Gly1 in Glu8, pri čemer aminska skupina iz glicina tvori peptidno vez s karboksilno skupino stranske skupine glutamata. Peptid se nato nadaljuje v β-lasnično zanko (dva antiparalelna β-trakova povezana z zanko, ki jo tvorita Val11 in Pro16), ki jo tvorijo aminokislinski ostanki 9-18. C-konec mikrocina (t.i. rep) prehaja skozi obroč, kar je sicer entropijsko zelo neugodno, zato je tako zvitje med peptidi zelo redko. V primeru J25 pa je taka struktura celo zelo stabilna – dva aminokislinska ostanka z aromatskimi stranskimi skupinami, Phe19 in Tyr20, vsak iz ene strani “sidrata” C-konec v makrolaktamski obroč. Ker sta stranski skupini teh ostankov tako veliki, prihaja do steričnega oviranja z obročem, zato rep ne more "pobegniti". Sterična stabilizacija je tako močna, da je J25 odporen celo proti večini proteaz in visokim temperaturam. V močno kislem mediju in ob delovanju endopeptidaz se cepi le β-lasnična zanka, ne pa tudi obroč (rep ostane ujet).

=== DELOVANJE MIKROCINA J25 ===

Mikrocin J25 je toksičen le za rod Salmonella in seve vrste E. coli. Rast celic zavre tako, da preide v celico, kje deluje kot inhibitor RNA-polimeraze. Za inhibicijo je pomemben makrolaktamski obroč, ki kot čep zamaši kanal v polimerazi, ki usmerja ustrezne ribonukleozid trifosfate na aktivno mesto.Za prehod skozi celični membrani Gram-negativnih bakterij J25 izkorišča receptor za železo v zunanji membrani; FhuA in z njim sklopljen kompleks TonB–ExbB–ExbD (na receptorju pravzaprav parazitira). To so pokazali številni eksperimenti, pri katerih so v E. coli z delecijo gena za FhuA vnesli plazmid z zapisom za FhuA iz E. coli ali rodu Salmonella. Bakterije brez receptorja so bile odporne na mikrocin J25, po vnosu plazmida pa so nanj postale občutljive.

Ker je železo slabo topno, prehaja skozi receptor v obliki ferikroma, ki po obliki niti malo ne spominja na mikrocin J25, zatorej vezava mikrocina na receptor ni samoumevna. Kako se torej mikrocin veže na FhuA? Primerjava kristalnih struktur kompleksov FhuA-ferikrom in FhuA-J25 je pokazala, da se oba liganda v receptor vežeta na podobnem mestu. Pri tem ferikrom tvori veliko vodikovih vezi z N-globularno domeno FhuA, ki deluje kot zamašek, MccJ25 pa s to domeno tvori le dve vodikovi vezi. Ta podatek nakazuje na to, da za vezavo na receptor FhuA ni potrebna dobra ohranjenost liganda, kar razloži tudi vezavo MccJ25, čeprav je le-ta po strukturi zelo različen od primarnega liganda.

Opravljene so bile tudi številne raziskave, ki so identificirale ostanke na MccJ25, ki so pomembni za vezavo na receptor. Že sama poravnava strukture nevezanega mikrocina (struktura pridobljena z NMR), s strukturo na receptor vezanega mikrocina (struktura, pridobljena z rentgensko kristalografijo) je pokazala, da pride ob vezavi mikrocina do obširne konformacijske spremembe v predelu β-lasnične zanke, medtem ko ostane struktura laktamskega obroča nespremenjena. Iz tega so sklepali, da je za vezavo najpomembnejša lasnična regija. Raziskava, ki je to potrdila, je temeljila na razgradnji te zanke s termolizinom (cepitev vezi med Val11 in Phe16). Izvedena je bila serija poskusov z bakteriofagom T5, ti pa so opisani v nadaljevanju.

=== POSKUSI O VPLIVIH VEZAVE MIKROCINA J25 NA RECEPTOR RhuA NA VEZAVO FAGA T5 ===

S serijo poskusov z bakteriofagom T5 in mikrocinom MccJ25 (oz. t-MccJ25) so v raziskavi želeli pokazati kako vezava MccJ25 na receptor FhuA vpliva na vezavo faga.
V prvem poskusu so raziskovalci preverjali inhibicijo bakterijske infekcije s fagom T5 v prisotnosti mikrocina. Suspenzijo E. Coli (sev W3110) v eksponentni fazi rasti so prenesli na medij. Bakterijam so dodali raztopino MccJ25 ali t-MccJ25 v metanolu in jih nato inkubirali na sobni temperaturi. Dodali so fag T5 in po stresanju in inkubaciji pri 37°C 120 minut z merjenjem absorbance pri 620nm nadzorovali stopnjo lize bakterij. Izvedena sta bila dva kontrolna poskusa in sicer v prisotnosti faga T5 brez mikrocina in pa z mikrocinom brez faga (kontrola rasti).

Rezultati kontrole rasti so pokazali, da MccJ25 in t-MccJ25 v koncentracijah do 10μM sama bistveno ne vplivata na rast bakterij. V odsotnosti MccJ25 je liza bakterij nastopila 50 minut po dodatki faga T5. Dodatek MccJ25 je lizo inhibiral, učinek pa je bil odvisen od koncentracije dodanega mikrocina. Hitrost rasti bakterij je dosegla svojo prvotno vrednost (vrednost brez dodanega faga) ob dodatku 10μM raztopine mikrocina. t-MccJ25 ni inhibiral lize bakterij.

Da bi preverili, če do inhibicije lize pride zaradi kompetitivne adsorpcije mikrocina na bakterijo, so pri drugem poskusu opazovali vpliv mikrocina na adsorpcijo faga T5 na E. Coli. Ponovno so raztopino bakterij v eksponentni fazi rasti prenesli na medij in jih inkubirali pri sobi temperaturi z MccJ25 oz. s t-MccJ25. Za kontrolni poskus so raztopini bakterij dodali le topilo brez mikrocina (50% acetonitril). Po prvi inkubaciji so dodali fag T5 in inkubirali še 15 minut. S centrifugiranjem so nato odstranili adsorbirane fage ter določili število neadsorbiranih virusov.
Delež adsorbiranih fagov se je zmanjšal iz 80% pri 0,1μM koncentraciji na 15% pri 5μM koncentraciji MccJ25. t-MccJ25 ni imel vpliva na adsorpcijo faga.

Raziskovalci so želeli dokazati, da je v prisotnosti mikrocina MccJ25 res inhibirana vezava na receptor FhuA. V pufru so 10 minut inkubirali FhuA in mikrocin (MccJ25 (50nM-3,1μM) oz. t-MccJ25 (3,1μM)), prisoten pa je bil še fluorescentni marker za DNA. Po inkubaciji so v vsak vzorec dodali fag T5 in opazovali injekcijo DNA v raztopino. Že v prejšnjih raziskavah je bilo dokazano, da bakteriofag ob vezavi na FhuA receptor injicira DNA v raztopino, zaradi česar lahko ob prisotnosti fluorescentnega markerja merimo fluorescenco.
Rezultati so pokazali, da se z višanjem koncentracije mikrocina MccJ25 fluorescenca manjša. Izračunano je bilo 55% zmanjšanje adsorpcije faga (iz 100% na 45%) pri višanju koncentracije iz 0,1-3,2μM mikrocina. t-MccJ25 ponovno ni imel učinka na injekcijo DNA faga.

Iz vseh eksperimentov lahko sklepamo, da je mikrocin MccJ25 res kompetitivni inhibitor vezave bakteriofaga T5 na receptor FhuA. Prav tako je razvidno, da termična cepitev zanke v strukturi t-MccJ25 bistveno vpliva na interakcijo s FhuA receptorjem.

== VIRI IN LITERATURA ==

*Rebuffat, S. Microcins in action: amazing defence strategies of Enterobacteria, Biochemical Society Transactions, 2012, Vol. 40, part 6 str. 1456 -1462

*Mathavan, I., Zirah, S., Mehmood, S., Choudhury, H. G., Goulard, C., Li, Y.,Beis, K.,Structural basis for hijacking siderophore receptors by antimicrobial lasso peptides. Nature chemical biology,2014, Vol 10 issue 5, 340–342. doi:10.1038/nchembio.1499

* Volkmar Braun, FhuA (TonA), the Career of a Protein, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, June 2009, p. 3431–3436 Vol. 191, No. 11 0021-9193/09/$08.00_0 doi:10.1128/JB.00106-09

* Flayhan, Ali; Wien, Frank; Paternostre, Maïté; Boulanger, Pasc , New insights into pb5, the receptor binding protein of bacteriophage T5
and its interaction with its Escherichia coli receptor FhuA, Biochimie Vol. 94 issue 9 2012 , doi :10.1016_j.biochi.2012.05.021

*Destoumieux-Garzón, Delphine; Duquesne, Sophie; Peduzzi, Jean, The iron–siderophore transporter FhuA is the receptor for the antimicrobial peptide microcin J25: role of the microcin Val11–Pro16 β-hairpin region in the recognition mechanism, Biochemical Journal, Vol. 389 issue 3 2005, doi: 10.1042_bj20042107

*Robin Leatherbarrow, R H Templer, Biophisical chemistry: Membranes and Proteines,Royal Society of Chemistry, 2007, ISBN 1847550258, str.215-219

*Pascale Boulanger, Insights into Bacteriophage T5 Structure from Analysis of Its Morphogenesis Genes and Protein Components, Journal of Virology Dec 2013, Vol.88, issue 2 1162-1174; doi: 10.1128/JVI.02262-13

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev

2019-04-07T18:35:50Z

Ajda Godec: /* STRUKTURA FAGA T5 */

==UVOD==
Eden izmed načinov obrambe bakterije pred bakteriofagi je proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev. Tako deluje npr. mikrocin J25, katerega primarna naloga je, da zavira rast drugih sevov bakterije iste vrste. Dokazano je bilo, da se tako kot fag T5 veže na membranski receptor FhuA, ki je sicer zadolžen za prenos Fe3+ ionov v bakterijo. Mikrocin J25 z vezavo na receptor FhuA prepreči vezavo faga T5 in vnos DNK faga v ''E. Coli.''

==MOLEKULARNE KOMPONENTNE INFEKCIJE ''E.COLI'' S STRANI FAGA T5 IN ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE==

=== STRUKTURA MEMBRANSKEGA RECEPTORJA FhuA ===
[https://cdn.rcsb.org/images/hd/by/1by3/1by3.0_chimera_tm_350_350.png FhuA] je protein z maso 78.9 kDa, ki se nahaja v zunanji membrani gram-negativnih bakterij kot je E.coli (sev K-12). Njegova primarna funkcija je transport Fe+3 ionov v celico. Receptor FhuA tvorita sodčkasta domena iz 22 antiparalelnih β-trakov, ki so vgrajeni v membrano in N-končna globularna domena, ki se zloži v notranjost sodčka ter zakrije večinski del notranjosti le-tega. N-končna globularna domena je sestavljena iz 4-verižnih β-plošč in iz 4 kratkih vijačnic. Globularna domena je vezana tako na sodčkasto domeno kot tudi na hidrofilne zanke usmerjene v zunanji mediju ter je odgovorna za vezavo liganda; hidroksamatnega siderofora – ferikroma, ki veže Fe3+ ione. Razen svoje primarne funkcije, je FhuA tudi receptor za različne fage; T1,T5 in ɸ80 ter za antibiotik albomicin.

=== STRUKTURA FAGA T5 ===

Struktura [https://www.i2bc.paris-saclay.fr/IMG/jpg/imagest5.jpg faga T5]je bila določena z uporabo krio-elektronske mikroskopije. Fag T5 uvrščamo v družino fagov Siphoviridae, za predstavnike katere je značilno, da imajo ikozaedrično oblikovano kapsido; ta vsebuje močno zvito, zgoščeno dvojno verižno DNA in rep. Rep predstavlja multiproteinski skupek, ki služi za prepoznavanje površine bakterijskih celic in za prenos genoma v to gostiteljsko celico. Za to družino fagov je značilno, da v strukturi vsebujejo dolg in nekrčljiv rep. Fag T5 ima 250 nm dolg rep, ki se konča s tremi L-oblikovanimi fibrilarnimi strukturami, ki so pritrjene na stožčasto podlago in premočrtno centralno fibrilo.

=== ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE IN INTERAKCIJA MED pb5 in FhuA ===

Specifičnost gostiteljske celice pri procesu okužbe s strani fagov družine ''Siphoviridae'' je določena z interakcijo med receptor vezavnim proteinom in specifičnim receptorjem na površini bakterijske celice. Prepoznavanje lahko poteka preko interakcij s saharidnimi ali proteinskimi komponentami receptorja. Ti receptor vezavni proteini se nahajajo na konici centralne fibrile v repu. To interakcijo pogosto zaznamuje dvostopenjski proces; v prvi fazi se fag reverzibilno adsorbira na receptorje z nizko vezavno afiniteto, kasneje pa se ireverzibilno veže na sekundarna mesta v receptorju. Interakcija receptor vezavni protein-receptor sproži konformacijske spremembe v strukturi repa, kar povzroči, da se kapsida odpre, pri tem se razpre zunanja membrana bakterije. Ob tem se DNK faga prenese preko repa skozi bakterijsko ovojnico v notranjost celice. Proces prepoznavanja v primeru faga T5 se prične z reverzibilno vezavo L-oblikovane proteinske niti na O-antigen lipopolisaharidne komponente. Nato se fag ireverzibilno veže na zunanji del ferikromskega transporterja FhuA z receptor vezavnim proteinom pb5.

Različne raziskave ''in vivo'' ter ''in vitro'' predpostavljajo naslednji mehanizem infekcije : v prvi stopnji se fag T5 reverzibilno veže s proteinom pb1 (ta sestavlja del L-oblikovane fibrile) na polimanozni O-antigen in pospeši hitrost vezave pb5 na FhuA. Nato se protein pb2 (del centralne fibrile) veže na površino bakterije. Ta interakcija ne vključuje sodelovanja specifičnih membranskih receptorjev. Centralna premočrtna fibrila se nato usidra v bakterijsko zunanjo membrano, dokler pb5 ne interagira s FhuA. Ta interakcija povzroči sprostitev DNK iz kapside. DNK se nato prenese v notranjost celice preko kanalčka, ki nastane iz proteina pb2. Kanalček sega od zunanje membrane, periplazme do citoplazemske membrane. Tak kanalček zaščiti DNK pred delovanjem periplazemskih nukleaz.

== MIKROCINI ==

Bakterije morajo znotraj svoje niše med seboj tekmovati za vire hranil in prostor. Izdelava “orožja” proti drugim bakterijam je torej zelo pomembna za njihovo preživetje. Ena izmed zelo razširjenih taktik tekmovanja med bakterijami je tvorba bakteriocinov. To so antimikrobni peptidi, ki delujejo kot toksini, saj zavirajo rast podobnih oziroma filogenetsko sorodnih bakterijskih sevov (tako na primer, E. coli izloča mikrocine, ki napadajo le seve E. coli). Sintetizirajo se, ko v okolju primanjkuje hranil in bakterije stradajo. Mikrocini so bakteriocini s kratkim aminokislinskim zaporedjem. Izločajo jih enterobakterije, to so Gram-negativni bacili, ki so v naravi zelo razširjeni, prav tako pa so del črevesne flore (kar pove že ime). Njihov zapis se nahaja na plazmidih. Mikrocine delimo v dva razreda:

* razred I – po translaciji pride do obširnih posttranslacijskih modifikacij, vsebujejo disulfidne mostičke
* razred II – ne prihaja do posttranslacijskih modifikacij

=== STRUKTURA MIKROCINA J25 ===

V prvi razred mikrocinov sodi tudi mikrocin J25 (MccJ25). Sestavljen je iz 21 aminokislinskih ostankov, odlikuje pa ga zanimivo zvitje, ki je sicer med peptidi zelo redko. Sprva je veljalo mnenje, da ima v celoti ciklično strukturo, nedavne raziskave pa so pokazale, da se po translaciji zvije v strukturo, ki spominja na laso. N-konec peptida je v obliki makrolaktamskega obroča, ki ga tvorita aminokislinska ostanka Gly1 in Glu8, pri čemer aminska skupina iz glicina tvori peptidno vez s karboksilno skupino stranske skupine glutamata. Peptid se nato nadaljuje v β-lasnično zanko (dva antiparalelna β-trakova povezana z zanko, ki jo tvorita Val11 in Pro16), ki jo tvorijo aminokislinski ostanki 9-18. C-konec mikrocina (t.i. rep) prehaja skozi obroč, kar je sicer entropijsko zelo neugodno, zato je tako zvitje med peptidi zelo redko. V primeru J25 pa je taka struktura celo zelo stabilna – dva aminokislinska ostanka z aromatskimi stranskimi skupinami, Phe19 in Tyr20, vsak iz ene strani “sidrata” C-konec v makrolaktamski obroč. Ker sta stranski skupini teh ostankov tako veliki, prihaja do steričnega oviranja z obročem, zato rep ne more "pobegniti". Sterična stabilizacija je tako močna, da je J25 odporen celo proti večini proteaz in visokim temperaturam. V močno kislem mediju in ob delovanju endopeptidaz se cepi le β-lasnična zanka, ne pa tudi obroč (rep ostane ujet).

=== DELOVANJE MIKROCINA J25 ===

Mikrocin J25 je toksičen le za rod Salmonella in seve vrste E. coli. Rast celic zavre tako, da preide v celico, kje deluje kot inhibitor RNA-polimeraze. Za inhibicijo je pomemben makrolaktamski obroč, ki kot čep zamaši kanal v polimerazi, ki usmerja ustrezne ribonukleozid trifosfate na aktivno mesto.Za prehod skozi celični membrani Gram-negativnih bakterij J25 izkorišča receptor za železo v zunanji membrani; FhuA in z njim sklopljen kompleks TonB–ExbB–ExbD (na receptorju pravzaprav parazitira). To so pokazali številni eksperimenti, pri katerih so v E. coli z delecijo gena za FhuA vnesli plazmid z zapisom za FhuA iz E. coli ali rodu Salmonella. Bakterije brez receptorja so bile odporne na mikrocin J25, po vnosu plazmida pa so nanj postale občutljive.

Ker je železo slabo topno, prehaja skozi receptor v obliki ferikroma, ki po obliki niti malo ne spominja na mikrocin J25, zatorej vezava mikrocina na receptor ni samoumevna. Kako se torej mikrocin veže na FhuA? Primerjava kristalnih struktur kompleksov FhuA-ferikrom in FhuA-J25 je pokazala, da se oba liganda v receptor vežeta na podobnem mestu. Pri tem ferikrom tvori veliko vodikovih vezi z N-globularno domeno FhuA, ki deluje kot zamašek, MccJ25 pa s to domeno tvori le dve vodikovi vezi. Ta podatek nakazuje na to, da za vezavo na receptor FhuA ni potrebna dobra ohranjenost liganda, kar razloži tudi vezavo MccJ25, čeprav je le-ta po strukturi zelo različen od primarnega liganda.

Opravljene so bile tudi številne raziskave, ki so identificirale ostanke na MccJ25, ki so pomembni za vezavo na receptor. Že sama poravnava strukture nevezanega mikrocina (struktura pridobljena z NMR), s strukturo na receptor vezanega mikrocina (struktura, pridobljena z rentgensko kristalografijo) je pokazala, da pride ob vezavi mikrocina do obširne konformacijske spremembe v predelu β-lasnične zanke, medtem ko ostane struktura laktamskega obroča nespremenjena. Iz tega so sklepali, da je za vezavo najpomembnejša lasnična regija. Raziskava, ki je to potrdila, je temeljila na razgradnji te zanke s termolizinom (cepitev vezi med Val11 in Phe16). Izvedena je bila serija poskusov z bakteriofagom T5, ti pa so opisani v nadaljevanju.

=== POSKUSI O VPLIVIH VEZAVE MIKROCINA J25 NA RECEPTOR RhuA NA VEZAVO FAGA T5 ===

S serijo poskusov z bakteriofagom T5 in mikrocinom MccJ25 (oz. t-MccJ25) so v raziskavi želeli pokazati kako vezava MccJ25 na receptor FhuA vpliva na vezavo faga.
V prvem poskusu so raziskovalci preverjali inhibicijo bakterijske infekcije s fagom T5 v prisotnosti mikrocina. Suspenzijo E. Coli (sev W3110) v eksponentni fazi rasti so prenesli na medij. Bakterijam so dodali raztopino MccJ25 ali t-MccJ25 v metanolu in jih nato inkubirali na sobni temperaturi. Dodali so fag T5 in po stresanju in inkubaciji pri 37°C 120 minut z merjenjem absorbance pri 620nm nadzorovali stopnjo lize bakterij. Izvedena sta bila dva kontrolna poskusa in sicer v prisotnosti faga T5 brez mikrocina in pa z mikrocinom brez faga (kontrola rasti).

Rezultati kontrole rasti so pokazali, da MccJ25 in t-MccJ25 v koncentracijah do 10μM sama bistveno ne vplivata na rast bakterij. V odsotnosti MccJ25 je liza bakterij nastopila 50 minut po dodatki faga T5. Dodatek MccJ25 je lizo inhibiral, učinek pa je bil odvisen od koncentracije dodanega mikrocina. Hitrost rasti bakterij je dosegla svojo prvotno vrednost (vrednost brez dodanega faga) ob dodatku 10μM raztopine mikrocina. t-MccJ25 ni inhibiral lize bakterij.

Da bi preverili, če do inhibicije lize pride zaradi kompetitivne adsorpcije mikrocina na bakterijo, so pri drugem poskusu opazovali vpliv mikrocina na adsorpcijo faga T5 na E. Coli. Ponovno so raztopino bakterij v eksponentni fazi rasti prenesli na medij in jih inkubirali pri sobi temperaturi z MccJ25 oz. s t-MccJ25. Za kontrolni poskus so raztopini bakterij dodali le topilo brez mikrocina (50% acetonitril). Po prvi inkubaciji so dodali fag T5 in inkubirali še 15 minut. S centrifugiranjem so nato odstranili adsorbirane fage ter določili število neadsorbiranih virusov.
Delež adsorbiranih fagov se je zmanjšal iz 80% pri 0,1μM koncentraciji na 15% pri 5μM koncentraciji MccJ25. t-MccJ25 ni imel vpliva na adsorpcijo faga.

Raziskovalci so želeli dokazati, da je v prisotnosti mikrocina MccJ25 res inhibirana vezava na receptor FhuA. V pufru so 10 minut inkubirali FhuA in mikrocin (MccJ25 (50nM-3,1μM) oz. t-MccJ25 (3,1μM)), prisoten pa je bil še fluorescentni marker za DNA. Po inkubaciji so v vsak vzorec dodali fag T5 in opazovali injekcijo DNA v raztopino. Že v prejšnjih raziskavah je bilo dokazano, da bakteriofag ob vezavi na FhuA receptor injicira DNA v raztopino, zaradi česar lahko ob prisotnosti fluorescentnega markerja merimo fluorescenco.
Rezultati so pokazali, da se z višanjem koncentracije mikrocina MccJ25 fluorescenca manjša. Izračunano je bilo 55% zmanjšanje adsorpcije faga (iz 100% na 45%) pri višanju koncentracije iz 0,1-3,2μM mikrocina. t-MccJ25 ponovno ni imel učinka na injekcijo DNA faga.

Iz vseh eksperimentov lahko sklepamo, da je mikrocin MccJ25 res kompetitivni inhibitor vezave bakteriofaga T5 na receptor FhuA. Prav tako je razvidno, da termična cepitev zanke v strukturi t-MccJ25 bistveno vpliva na interakcijo s FhuA receptorjem.

== VIRI IN LITERATURA ==

*Rebuffat, S. Microcins in action: amazing defence strategies of Enterobacteria, Biochemical Society Transactions, 2012, Vol. 40, part 6 str. 1456 -1462

*Mathavan, I., Zirah, S., Mehmood, S., Choudhury, H. G., Goulard, C., Li, Y.,Beis, K.,Structural basis for hijacking siderophore receptors by antimicrobial lasso peptides. Nature chemical biology,2014, Vol 10 issue 5, 340–342. doi:10.1038/nchembio.1499

* Volkmar Braun, FhuA (TonA), the Career of a Protein, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, June 2009, p. 3431–3436 Vol. 191, No. 11 0021-9193/09/$08.00_0 doi:10.1128/JB.00106-09

* Flayhan, Ali; Wien, Frank; Paternostre, Maïté; Boulanger, Pasc , New insights into pb5, the receptor binding protein of bacteriophage T5
and its interaction with its Escherichia coli receptor FhuA, Biochimie Vol. 94 issue 9 2012 , doi :10.1016_j.biochi.2012.05.021

*Destoumieux-Garzón, Delphine; Duquesne, Sophie; Peduzzi, Jean, The iron–siderophore transporter FhuA is the receptor for the antimicrobial peptide microcin J25: role of the microcin Val11–Pro16 β-hairpin region in the recognition mechanism, Biochemical Journal, Vol. 389 issue 3 2005, doi: 10.1042_bj20042107

*Robin Leatherbarrow, R H Templer, Biophisical chemistry: Membranes and Proteines,Royal Society of Chemistry, 2007, ISBN 1847550258, str.215-219

*Pascale Boulanger, Insights into Bacteriophage T5 Structure from Analysis of Its Morphogenesis Genes and Protein Components, Journal of Virology Dec 2013, Vol.88, issue 2 1162-1174; doi: 10.1128/JVI.02262-13

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev

2019-04-07T18:35:01Z

Ajda Godec: /* STRUKTURA FAGA T5 */

==UVOD==
Eden izmed načinov obrambe bakterije pred bakteriofagi je proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev. Tako deluje npr. mikrocin J25, katerega primarna naloga je, da zavira rast drugih sevov bakterije iste vrste. Dokazano je bilo, da se tako kot fag T5 veže na membranski receptor FhuA, ki je sicer zadolžen za prenos Fe3+ ionov v bakterijo. Mikrocin J25 z vezavo na receptor FhuA prepreči vezavo faga T5 in vnos DNK faga v ''E. Coli.''

==MOLEKULARNE KOMPONENTNE INFEKCIJE ''E.COLI'' S STRANI FAGA T5 IN ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE==

=== STRUKTURA MEMBRANSKEGA RECEPTORJA FhuA ===
[https://cdn.rcsb.org/images/hd/by/1by3/1by3.0_chimera_tm_350_350.png FhuA] je protein z maso 78.9 kDa, ki se nahaja v zunanji membrani gram-negativnih bakterij kot je E.coli (sev K-12). Njegova primarna funkcija je transport Fe+3 ionov v celico. Receptor FhuA tvorita sodčkasta domena iz 22 antiparalelnih β-trakov, ki so vgrajeni v membrano in N-končna globularna domena, ki se zloži v notranjost sodčka ter zakrije večinski del notranjosti le-tega. N-končna globularna domena je sestavljena iz 4-verižnih β-plošč in iz 4 kratkih vijačnic. Globularna domena je vezana tako na sodčkasto domeno kot tudi na hidrofilne zanke usmerjene v zunanji mediju ter je odgovorna za vezavo liganda; hidroksamatnega siderofora – ferikroma, ki veže Fe3+ ione. Razen svoje primarne funkcije, je FhuA tudi receptor za različne fage; T1,T5 in ɸ80 ter za antibiotik albomicin.

=== STRUKTURA FAGA T5 ===

Struktura [https://www.i2bc.paris-saclay.fr/spip.php?article253&lang=en faga T5]je bila določena z uporabo krio-elektronske mikroskopije. Fag T5 uvrščamo v družino fagov Siphoviridae, za predstavnike katere je značilno, da imajo ikozaedrično oblikovano kapsido; ta vsebuje močno zvito, zgoščeno dvojno verižno DNA in rep. Rep predstavlja multiproteinski skupek, ki služi za prepoznavanje površine bakterijskih celic in za prenos genoma v to gostiteljsko celico. Za to družino fagov je značilno, da v strukturi vsebujejo dolg in nekrčljiv rep. Fag T5 ima 250 nm dolg rep, ki se konča s tremi L-oblikovanimi fibrilarnimi strukturami, ki so pritrjene na stožčasto podlago in premočrtno centralno fibrilo.

=== ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE IN INTERAKCIJA MED pb5 in FhuA ===

Specifičnost gostiteljske celice pri procesu okužbe s strani fagov družine ''Siphoviridae'' je določena z interakcijo med receptor vezavnim proteinom in specifičnim receptorjem na površini bakterijske celice. Prepoznavanje lahko poteka preko interakcij s saharidnimi ali proteinskimi komponentami receptorja. Ti receptor vezavni proteini se nahajajo na konici centralne fibrile v repu. To interakcijo pogosto zaznamuje dvostopenjski proces; v prvi fazi se fag reverzibilno adsorbira na receptorje z nizko vezavno afiniteto, kasneje pa se ireverzibilno veže na sekundarna mesta v receptorju. Interakcija receptor vezavni protein-receptor sproži konformacijske spremembe v strukturi repa, kar povzroči, da se kapsida odpre, pri tem se razpre zunanja membrana bakterije. Ob tem se DNK faga prenese preko repa skozi bakterijsko ovojnico v notranjost celice. Proces prepoznavanja v primeru faga T5 se prične z reverzibilno vezavo L-oblikovane proteinske niti na O-antigen lipopolisaharidne komponente. Nato se fag ireverzibilno veže na zunanji del ferikromskega transporterja FhuA z receptor vezavnim proteinom pb5.

Različne raziskave ''in vivo'' ter ''in vitro'' predpostavljajo naslednji mehanizem infekcije : v prvi stopnji se fag T5 reverzibilno veže s proteinom pb1 (ta sestavlja del L-oblikovane fibrile) na polimanozni O-antigen in pospeši hitrost vezave pb5 na FhuA. Nato se protein pb2 (del centralne fibrile) veže na površino bakterije. Ta interakcija ne vključuje sodelovanja specifičnih membranskih receptorjev. Centralna premočrtna fibrila se nato usidra v bakterijsko zunanjo membrano, dokler pb5 ne interagira s FhuA. Ta interakcija povzroči sprostitev DNK iz kapside. DNK se nato prenese v notranjost celice preko kanalčka, ki nastane iz proteina pb2. Kanalček sega od zunanje membrane, periplazme do citoplazemske membrane. Tak kanalček zaščiti DNK pred delovanjem periplazemskih nukleaz.

== MIKROCINI ==

Bakterije morajo znotraj svoje niše med seboj tekmovati za vire hranil in prostor. Izdelava “orožja” proti drugim bakterijam je torej zelo pomembna za njihovo preživetje. Ena izmed zelo razširjenih taktik tekmovanja med bakterijami je tvorba bakteriocinov. To so antimikrobni peptidi, ki delujejo kot toksini, saj zavirajo rast podobnih oziroma filogenetsko sorodnih bakterijskih sevov (tako na primer, E. coli izloča mikrocine, ki napadajo le seve E. coli). Sintetizirajo se, ko v okolju primanjkuje hranil in bakterije stradajo. Mikrocini so bakteriocini s kratkim aminokislinskim zaporedjem. Izločajo jih enterobakterije, to so Gram-negativni bacili, ki so v naravi zelo razširjeni, prav tako pa so del črevesne flore (kar pove že ime). Njihov zapis se nahaja na plazmidih. Mikrocine delimo v dva razreda:

* razred I – po translaciji pride do obširnih posttranslacijskih modifikacij, vsebujejo disulfidne mostičke
* razred II – ne prihaja do posttranslacijskih modifikacij

=== STRUKTURA MIKROCINA J25 ===

V prvi razred mikrocinov sodi tudi mikrocin J25 (MccJ25). Sestavljen je iz 21 aminokislinskih ostankov, odlikuje pa ga zanimivo zvitje, ki je sicer med peptidi zelo redko. Sprva je veljalo mnenje, da ima v celoti ciklično strukturo, nedavne raziskave pa so pokazale, da se po translaciji zvije v strukturo, ki spominja na laso. N-konec peptida je v obliki makrolaktamskega obroča, ki ga tvorita aminokislinska ostanka Gly1 in Glu8, pri čemer aminska skupina iz glicina tvori peptidno vez s karboksilno skupino stranske skupine glutamata. Peptid se nato nadaljuje v β-lasnično zanko (dva antiparalelna β-trakova povezana z zanko, ki jo tvorita Val11 in Pro16), ki jo tvorijo aminokislinski ostanki 9-18. C-konec mikrocina (t.i. rep) prehaja skozi obroč, kar je sicer entropijsko zelo neugodno, zato je tako zvitje med peptidi zelo redko. V primeru J25 pa je taka struktura celo zelo stabilna – dva aminokislinska ostanka z aromatskimi stranskimi skupinami, Phe19 in Tyr20, vsak iz ene strani “sidrata” C-konec v makrolaktamski obroč. Ker sta stranski skupini teh ostankov tako veliki, prihaja do steričnega oviranja z obročem, zato rep ne more "pobegniti". Sterična stabilizacija je tako močna, da je J25 odporen celo proti večini proteaz in visokim temperaturam. V močno kislem mediju in ob delovanju endopeptidaz se cepi le β-lasnična zanka, ne pa tudi obroč (rep ostane ujet).

=== DELOVANJE MIKROCINA J25 ===

Mikrocin J25 je toksičen le za rod Salmonella in seve vrste E. coli. Rast celic zavre tako, da preide v celico, kje deluje kot inhibitor RNA-polimeraze. Za inhibicijo je pomemben makrolaktamski obroč, ki kot čep zamaši kanal v polimerazi, ki usmerja ustrezne ribonukleozid trifosfate na aktivno mesto.Za prehod skozi celični membrani Gram-negativnih bakterij J25 izkorišča receptor za železo v zunanji membrani; FhuA in z njim sklopljen kompleks TonB–ExbB–ExbD (na receptorju pravzaprav parazitira). To so pokazali številni eksperimenti, pri katerih so v E. coli z delecijo gena za FhuA vnesli plazmid z zapisom za FhuA iz E. coli ali rodu Salmonella. Bakterije brez receptorja so bile odporne na mikrocin J25, po vnosu plazmida pa so nanj postale občutljive.

Ker je železo slabo topno, prehaja skozi receptor v obliki ferikroma, ki po obliki niti malo ne spominja na mikrocin J25, zatorej vezava mikrocina na receptor ni samoumevna. Kako se torej mikrocin veže na FhuA? Primerjava kristalnih struktur kompleksov FhuA-ferikrom in FhuA-J25 je pokazala, da se oba liganda v receptor vežeta na podobnem mestu. Pri tem ferikrom tvori veliko vodikovih vezi z N-globularno domeno FhuA, ki deluje kot zamašek, MccJ25 pa s to domeno tvori le dve vodikovi vezi. Ta podatek nakazuje na to, da za vezavo na receptor FhuA ni potrebna dobra ohranjenost liganda, kar razloži tudi vezavo MccJ25, čeprav je le-ta po strukturi zelo različen od primarnega liganda.

Opravljene so bile tudi številne raziskave, ki so identificirale ostanke na MccJ25, ki so pomembni za vezavo na receptor. Že sama poravnava strukture nevezanega mikrocina (struktura pridobljena z NMR), s strukturo na receptor vezanega mikrocina (struktura, pridobljena z rentgensko kristalografijo) je pokazala, da pride ob vezavi mikrocina do obširne konformacijske spremembe v predelu β-lasnične zanke, medtem ko ostane struktura laktamskega obroča nespremenjena. Iz tega so sklepali, da je za vezavo najpomembnejša lasnična regija. Raziskava, ki je to potrdila, je temeljila na razgradnji te zanke s termolizinom (cepitev vezi med Val11 in Phe16). Izvedena je bila serija poskusov z bakteriofagom T5, ti pa so opisani v nadaljevanju.

=== POSKUSI O VPLIVIH VEZAVE MIKROCINA J25 NA RECEPTOR RhuA NA VEZAVO FAGA T5 ===

S serijo poskusov z bakteriofagom T5 in mikrocinom MccJ25 (oz. t-MccJ25) so v raziskavi želeli pokazati kako vezava MccJ25 na receptor FhuA vpliva na vezavo faga.
V prvem poskusu so raziskovalci preverjali inhibicijo bakterijske infekcije s fagom T5 v prisotnosti mikrocina. Suspenzijo E. Coli (sev W3110) v eksponentni fazi rasti so prenesli na medij. Bakterijam so dodali raztopino MccJ25 ali t-MccJ25 v metanolu in jih nato inkubirali na sobni temperaturi. Dodali so fag T5 in po stresanju in inkubaciji pri 37°C 120 minut z merjenjem absorbance pri 620nm nadzorovali stopnjo lize bakterij. Izvedena sta bila dva kontrolna poskusa in sicer v prisotnosti faga T5 brez mikrocina in pa z mikrocinom brez faga (kontrola rasti).

Rezultati kontrole rasti so pokazali, da MccJ25 in t-MccJ25 v koncentracijah do 10μM sama bistveno ne vplivata na rast bakterij. V odsotnosti MccJ25 je liza bakterij nastopila 50 minut po dodatki faga T5. Dodatek MccJ25 je lizo inhibiral, učinek pa je bil odvisen od koncentracije dodanega mikrocina. Hitrost rasti bakterij je dosegla svojo prvotno vrednost (vrednost brez dodanega faga) ob dodatku 10μM raztopine mikrocina. t-MccJ25 ni inhibiral lize bakterij.

Da bi preverili, če do inhibicije lize pride zaradi kompetitivne adsorpcije mikrocina na bakterijo, so pri drugem poskusu opazovali vpliv mikrocina na adsorpcijo faga T5 na E. Coli. Ponovno so raztopino bakterij v eksponentni fazi rasti prenesli na medij in jih inkubirali pri sobi temperaturi z MccJ25 oz. s t-MccJ25. Za kontrolni poskus so raztopini bakterij dodali le topilo brez mikrocina (50% acetonitril). Po prvi inkubaciji so dodali fag T5 in inkubirali še 15 minut. S centrifugiranjem so nato odstranili adsorbirane fage ter določili število neadsorbiranih virusov.
Delež adsorbiranih fagov se je zmanjšal iz 80% pri 0,1μM koncentraciji na 15% pri 5μM koncentraciji MccJ25. t-MccJ25 ni imel vpliva na adsorpcijo faga.

Raziskovalci so želeli dokazati, da je v prisotnosti mikrocina MccJ25 res inhibirana vezava na receptor FhuA. V pufru so 10 minut inkubirali FhuA in mikrocin (MccJ25 (50nM-3,1μM) oz. t-MccJ25 (3,1μM)), prisoten pa je bil še fluorescentni marker za DNA. Po inkubaciji so v vsak vzorec dodali fag T5 in opazovali injekcijo DNA v raztopino. Že v prejšnjih raziskavah je bilo dokazano, da bakteriofag ob vezavi na FhuA receptor injicira DNA v raztopino, zaradi česar lahko ob prisotnosti fluorescentnega markerja merimo fluorescenco.
Rezultati so pokazali, da se z višanjem koncentracije mikrocina MccJ25 fluorescenca manjša. Izračunano je bilo 55% zmanjšanje adsorpcije faga (iz 100% na 45%) pri višanju koncentracije iz 0,1-3,2μM mikrocina. t-MccJ25 ponovno ni imel učinka na injekcijo DNA faga.

Iz vseh eksperimentov lahko sklepamo, da je mikrocin MccJ25 res kompetitivni inhibitor vezave bakteriofaga T5 na receptor FhuA. Prav tako je razvidno, da termična cepitev zanke v strukturi t-MccJ25 bistveno vpliva na interakcijo s FhuA receptorjem.

== VIRI IN LITERATURA ==

*Rebuffat, S. Microcins in action: amazing defence strategies of Enterobacteria, Biochemical Society Transactions, 2012, Vol. 40, part 6 str. 1456 -1462

*Mathavan, I., Zirah, S., Mehmood, S., Choudhury, H. G., Goulard, C., Li, Y.,Beis, K.,Structural basis for hijacking siderophore receptors by antimicrobial lasso peptides. Nature chemical biology,2014, Vol 10 issue 5, 340–342. doi:10.1038/nchembio.1499

* Volkmar Braun, FhuA (TonA), the Career of a Protein, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, June 2009, p. 3431–3436 Vol. 191, No. 11 0021-9193/09/$08.00_0 doi:10.1128/JB.00106-09

* Flayhan, Ali; Wien, Frank; Paternostre, Maïté; Boulanger, Pasc , New insights into pb5, the receptor binding protein of bacteriophage T5
and its interaction with its Escherichia coli receptor FhuA, Biochimie Vol. 94 issue 9 2012 , doi :10.1016_j.biochi.2012.05.021

*Destoumieux-Garzón, Delphine; Duquesne, Sophie; Peduzzi, Jean, The iron–siderophore transporter FhuA is the receptor for the antimicrobial peptide microcin J25: role of the microcin Val11–Pro16 β-hairpin region in the recognition mechanism, Biochemical Journal, Vol. 389 issue 3 2005, doi: 10.1042_bj20042107

*Robin Leatherbarrow, R H Templer, Biophisical chemistry: Membranes and Proteines,Royal Society of Chemistry, 2007, ISBN 1847550258, str.215-219

*Pascale Boulanger, Insights into Bacteriophage T5 Structure from Analysis of Its Morphogenesis Genes and Protein Components, Journal of Virology Dec 2013, Vol.88, issue 2 1162-1174; doi: 10.1128/JVI.02262-13

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev

2019-04-07T18:34:03Z

Ajda Godec: /* STRUKTURA MEMBRANSKEGA RECEPTORJA FhuA */

==UVOD==
Eden izmed načinov obrambe bakterije pred bakteriofagi je proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev. Tako deluje npr. mikrocin J25, katerega primarna naloga je, da zavira rast drugih sevov bakterije iste vrste. Dokazano je bilo, da se tako kot fag T5 veže na membranski receptor FhuA, ki je sicer zadolžen za prenos Fe3+ ionov v bakterijo. Mikrocin J25 z vezavo na receptor FhuA prepreči vezavo faga T5 in vnos DNK faga v ''E. Coli.''

==MOLEKULARNE KOMPONENTNE INFEKCIJE ''E.COLI'' S STRANI FAGA T5 IN ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE==

=== STRUKTURA MEMBRANSKEGA RECEPTORJA FhuA ===
[https://cdn.rcsb.org/images/hd/by/1by3/1by3.0_chimera_tm_350_350.png FhuA] je protein z maso 78.9 kDa, ki se nahaja v zunanji membrani gram-negativnih bakterij kot je E.coli (sev K-12). Njegova primarna funkcija je transport Fe+3 ionov v celico. Receptor FhuA tvorita sodčkasta domena iz 22 antiparalelnih β-trakov, ki so vgrajeni v membrano in N-končna globularna domena, ki se zloži v notranjost sodčka ter zakrije večinski del notranjosti le-tega. N-končna globularna domena je sestavljena iz 4-verižnih β-plošč in iz 4 kratkih vijačnic. Globularna domena je vezana tako na sodčkasto domeno kot tudi na hidrofilne zanke usmerjene v zunanji mediju ter je odgovorna za vezavo liganda; hidroksamatnega siderofora – ferikroma, ki veže Fe3+ ione. Razen svoje primarne funkcije, je FhuA tudi receptor za različne fage; T1,T5 in ɸ80 ter za antibiotik albomicin.

=== STRUKTURA FAGA T5 ===

Struktura faga T5 je bila določena z uporabo krio-elektronske mikroskopije. Fag T5 uvrščamo v družino fagov Siphoviridae, za predstavnike katere je značilno, da imajo ikozaedrično oblikovano kapsido; ta vsebuje močno zvito, zgoščeno dvojno verižno DNA in rep. Rep predstavlja multiproteinski skupek, ki služi za prepoznavanje površine bakterijskih celic in za prenos genoma v to gostiteljsko celico. Za to družino fagov je značilno, da v strukturi vsebujejo dolg in nekrčljiv rep. Fag T5 ima 250 nm dolg rep, ki se konča s tremi L-oblikovanimi fibrilarnimi strukturami, ki so pritrjene na stožčasto podlago in premočrtno centralno fibrilo.

=== ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE IN INTERAKCIJA MED pb5 in FhuA ===

Specifičnost gostiteljske celice pri procesu okužbe s strani fagov družine ''Siphoviridae'' je določena z interakcijo med receptor vezavnim proteinom in specifičnim receptorjem na površini bakterijske celice. Prepoznavanje lahko poteka preko interakcij s saharidnimi ali proteinskimi komponentami receptorja. Ti receptor vezavni proteini se nahajajo na konici centralne fibrile v repu. To interakcijo pogosto zaznamuje dvostopenjski proces; v prvi fazi se fag reverzibilno adsorbira na receptorje z nizko vezavno afiniteto, kasneje pa se ireverzibilno veže na sekundarna mesta v receptorju. Interakcija receptor vezavni protein-receptor sproži konformacijske spremembe v strukturi repa, kar povzroči, da se kapsida odpre, pri tem se razpre zunanja membrana bakterije. Ob tem se DNK faga prenese preko repa skozi bakterijsko ovojnico v notranjost celice. Proces prepoznavanja v primeru faga T5 se prične z reverzibilno vezavo L-oblikovane proteinske niti na O-antigen lipopolisaharidne komponente. Nato se fag ireverzibilno veže na zunanji del ferikromskega transporterja FhuA z receptor vezavnim proteinom pb5.

Različne raziskave ''in vivo'' ter ''in vitro'' predpostavljajo naslednji mehanizem infekcije : v prvi stopnji se fag T5 reverzibilno veže s proteinom pb1 (ta sestavlja del L-oblikovane fibrile) na polimanozni O-antigen in pospeši hitrost vezave pb5 na FhuA. Nato se protein pb2 (del centralne fibrile) veže na površino bakterije. Ta interakcija ne vključuje sodelovanja specifičnih membranskih receptorjev. Centralna premočrtna fibrila se nato usidra v bakterijsko zunanjo membrano, dokler pb5 ne interagira s FhuA. Ta interakcija povzroči sprostitev DNK iz kapside. DNK se nato prenese v notranjost celice preko kanalčka, ki nastane iz proteina pb2. Kanalček sega od zunanje membrane, periplazme do citoplazemske membrane. Tak kanalček zaščiti DNK pred delovanjem periplazemskih nukleaz.

== MIKROCINI ==

Bakterije morajo znotraj svoje niše med seboj tekmovati za vire hranil in prostor. Izdelava “orožja” proti drugim bakterijam je torej zelo pomembna za njihovo preživetje. Ena izmed zelo razširjenih taktik tekmovanja med bakterijami je tvorba bakteriocinov. To so antimikrobni peptidi, ki delujejo kot toksini, saj zavirajo rast podobnih oziroma filogenetsko sorodnih bakterijskih sevov (tako na primer, E. coli izloča mikrocine, ki napadajo le seve E. coli). Sintetizirajo se, ko v okolju primanjkuje hranil in bakterije stradajo. Mikrocini so bakteriocini s kratkim aminokislinskim zaporedjem. Izločajo jih enterobakterije, to so Gram-negativni bacili, ki so v naravi zelo razširjeni, prav tako pa so del črevesne flore (kar pove že ime). Njihov zapis se nahaja na plazmidih. Mikrocine delimo v dva razreda:

* razred I – po translaciji pride do obširnih posttranslacijskih modifikacij, vsebujejo disulfidne mostičke
* razred II – ne prihaja do posttranslacijskih modifikacij

=== STRUKTURA MIKROCINA J25 ===

V prvi razred mikrocinov sodi tudi mikrocin J25 (MccJ25). Sestavljen je iz 21 aminokislinskih ostankov, odlikuje pa ga zanimivo zvitje, ki je sicer med peptidi zelo redko. Sprva je veljalo mnenje, da ima v celoti ciklično strukturo, nedavne raziskave pa so pokazale, da se po translaciji zvije v strukturo, ki spominja na laso. N-konec peptida je v obliki makrolaktamskega obroča, ki ga tvorita aminokislinska ostanka Gly1 in Glu8, pri čemer aminska skupina iz glicina tvori peptidno vez s karboksilno skupino stranske skupine glutamata. Peptid se nato nadaljuje v β-lasnično zanko (dva antiparalelna β-trakova povezana z zanko, ki jo tvorita Val11 in Pro16), ki jo tvorijo aminokislinski ostanki 9-18. C-konec mikrocina (t.i. rep) prehaja skozi obroč, kar je sicer entropijsko zelo neugodno, zato je tako zvitje med peptidi zelo redko. V primeru J25 pa je taka struktura celo zelo stabilna – dva aminokislinska ostanka z aromatskimi stranskimi skupinami, Phe19 in Tyr20, vsak iz ene strani “sidrata” C-konec v makrolaktamski obroč. Ker sta stranski skupini teh ostankov tako veliki, prihaja do steričnega oviranja z obročem, zato rep ne more "pobegniti". Sterična stabilizacija je tako močna, da je J25 odporen celo proti večini proteaz in visokim temperaturam. V močno kislem mediju in ob delovanju endopeptidaz se cepi le β-lasnična zanka, ne pa tudi obroč (rep ostane ujet).

=== DELOVANJE MIKROCINA J25 ===

Mikrocin J25 je toksičen le za rod Salmonella in seve vrste E. coli. Rast celic zavre tako, da preide v celico, kje deluje kot inhibitor RNA-polimeraze. Za inhibicijo je pomemben makrolaktamski obroč, ki kot čep zamaši kanal v polimerazi, ki usmerja ustrezne ribonukleozid trifosfate na aktivno mesto.Za prehod skozi celični membrani Gram-negativnih bakterij J25 izkorišča receptor za železo v zunanji membrani; FhuA in z njim sklopljen kompleks TonB–ExbB–ExbD (na receptorju pravzaprav parazitira). To so pokazali številni eksperimenti, pri katerih so v E. coli z delecijo gena za FhuA vnesli plazmid z zapisom za FhuA iz E. coli ali rodu Salmonella. Bakterije brez receptorja so bile odporne na mikrocin J25, po vnosu plazmida pa so nanj postale občutljive.

Ker je železo slabo topno, prehaja skozi receptor v obliki ferikroma, ki po obliki niti malo ne spominja na mikrocin J25, zatorej vezava mikrocina na receptor ni samoumevna. Kako se torej mikrocin veže na FhuA? Primerjava kristalnih struktur kompleksov FhuA-ferikrom in FhuA-J25 je pokazala, da se oba liganda v receptor vežeta na podobnem mestu. Pri tem ferikrom tvori veliko vodikovih vezi z N-globularno domeno FhuA, ki deluje kot zamašek, MccJ25 pa s to domeno tvori le dve vodikovi vezi. Ta podatek nakazuje na to, da za vezavo na receptor FhuA ni potrebna dobra ohranjenost liganda, kar razloži tudi vezavo MccJ25, čeprav je le-ta po strukturi zelo različen od primarnega liganda.

Opravljene so bile tudi številne raziskave, ki so identificirale ostanke na MccJ25, ki so pomembni za vezavo na receptor. Že sama poravnava strukture nevezanega mikrocina (struktura pridobljena z NMR), s strukturo na receptor vezanega mikrocina (struktura, pridobljena z rentgensko kristalografijo) je pokazala, da pride ob vezavi mikrocina do obširne konformacijske spremembe v predelu β-lasnične zanke, medtem ko ostane struktura laktamskega obroča nespremenjena. Iz tega so sklepali, da je za vezavo najpomembnejša lasnična regija. Raziskava, ki je to potrdila, je temeljila na razgradnji te zanke s termolizinom (cepitev vezi med Val11 in Phe16). Izvedena je bila serija poskusov z bakteriofagom T5, ti pa so opisani v nadaljevanju.

=== POSKUSI O VPLIVIH VEZAVE MIKROCINA J25 NA RECEPTOR RhuA NA VEZAVO FAGA T5 ===

S serijo poskusov z bakteriofagom T5 in mikrocinom MccJ25 (oz. t-MccJ25) so v raziskavi želeli pokazati kako vezava MccJ25 na receptor FhuA vpliva na vezavo faga.
V prvem poskusu so raziskovalci preverjali inhibicijo bakterijske infekcije s fagom T5 v prisotnosti mikrocina. Suspenzijo E. Coli (sev W3110) v eksponentni fazi rasti so prenesli na medij. Bakterijam so dodali raztopino MccJ25 ali t-MccJ25 v metanolu in jih nato inkubirali na sobni temperaturi. Dodali so fag T5 in po stresanju in inkubaciji pri 37°C 120 minut z merjenjem absorbance pri 620nm nadzorovali stopnjo lize bakterij. Izvedena sta bila dva kontrolna poskusa in sicer v prisotnosti faga T5 brez mikrocina in pa z mikrocinom brez faga (kontrola rasti).

Rezultati kontrole rasti so pokazali, da MccJ25 in t-MccJ25 v koncentracijah do 10μM sama bistveno ne vplivata na rast bakterij. V odsotnosti MccJ25 je liza bakterij nastopila 50 minut po dodatki faga T5. Dodatek MccJ25 je lizo inhibiral, učinek pa je bil odvisen od koncentracije dodanega mikrocina. Hitrost rasti bakterij je dosegla svojo prvotno vrednost (vrednost brez dodanega faga) ob dodatku 10μM raztopine mikrocina. t-MccJ25 ni inhibiral lize bakterij.

Da bi preverili, če do inhibicije lize pride zaradi kompetitivne adsorpcije mikrocina na bakterijo, so pri drugem poskusu opazovali vpliv mikrocina na adsorpcijo faga T5 na E. Coli. Ponovno so raztopino bakterij v eksponentni fazi rasti prenesli na medij in jih inkubirali pri sobi temperaturi z MccJ25 oz. s t-MccJ25. Za kontrolni poskus so raztopini bakterij dodali le topilo brez mikrocina (50% acetonitril). Po prvi inkubaciji so dodali fag T5 in inkubirali še 15 minut. S centrifugiranjem so nato odstranili adsorbirane fage ter določili število neadsorbiranih virusov.
Delež adsorbiranih fagov se je zmanjšal iz 80% pri 0,1μM koncentraciji na 15% pri 5μM koncentraciji MccJ25. t-MccJ25 ni imel vpliva na adsorpcijo faga.

Raziskovalci so želeli dokazati, da je v prisotnosti mikrocina MccJ25 res inhibirana vezava na receptor FhuA. V pufru so 10 minut inkubirali FhuA in mikrocin (MccJ25 (50nM-3,1μM) oz. t-MccJ25 (3,1μM)), prisoten pa je bil še fluorescentni marker za DNA. Po inkubaciji so v vsak vzorec dodali fag T5 in opazovali injekcijo DNA v raztopino. Že v prejšnjih raziskavah je bilo dokazano, da bakteriofag ob vezavi na FhuA receptor injicira DNA v raztopino, zaradi česar lahko ob prisotnosti fluorescentnega markerja merimo fluorescenco.
Rezultati so pokazali, da se z višanjem koncentracije mikrocina MccJ25 fluorescenca manjša. Izračunano je bilo 55% zmanjšanje adsorpcije faga (iz 100% na 45%) pri višanju koncentracije iz 0,1-3,2μM mikrocina. t-MccJ25 ponovno ni imel učinka na injekcijo DNA faga.

Iz vseh eksperimentov lahko sklepamo, da je mikrocin MccJ25 res kompetitivni inhibitor vezave bakteriofaga T5 na receptor FhuA. Prav tako je razvidno, da termična cepitev zanke v strukturi t-MccJ25 bistveno vpliva na interakcijo s FhuA receptorjem.

== VIRI IN LITERATURA ==

*Rebuffat, S. Microcins in action: amazing defence strategies of Enterobacteria, Biochemical Society Transactions, 2012, Vol. 40, part 6 str. 1456 -1462

*Mathavan, I., Zirah, S., Mehmood, S., Choudhury, H. G., Goulard, C., Li, Y.,Beis, K.,Structural basis for hijacking siderophore receptors by antimicrobial lasso peptides. Nature chemical biology,2014, Vol 10 issue 5, 340–342. doi:10.1038/nchembio.1499

* Volkmar Braun, FhuA (TonA), the Career of a Protein, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, June 2009, p. 3431–3436 Vol. 191, No. 11 0021-9193/09/$08.00_0 doi:10.1128/JB.00106-09

* Flayhan, Ali; Wien, Frank; Paternostre, Maïté; Boulanger, Pasc , New insights into pb5, the receptor binding protein of bacteriophage T5
and its interaction with its Escherichia coli receptor FhuA, Biochimie Vol. 94 issue 9 2012 , doi :10.1016_j.biochi.2012.05.021

*Destoumieux-Garzón, Delphine; Duquesne, Sophie; Peduzzi, Jean, The iron–siderophore transporter FhuA is the receptor for the antimicrobial peptide microcin J25: role of the microcin Val11–Pro16 β-hairpin region in the recognition mechanism, Biochemical Journal, Vol. 389 issue 3 2005, doi: 10.1042_bj20042107

*Robin Leatherbarrow, R H Templer, Biophisical chemistry: Membranes and Proteines,Royal Society of Chemistry, 2007, ISBN 1847550258, str.215-219

*Pascale Boulanger, Insights into Bacteriophage T5 Structure from Analysis of Its Morphogenesis Genes and Protein Components, Journal of Virology Dec 2013, Vol.88, issue 2 1162-1174; doi: 10.1128/JVI.02262-13

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev

2019-04-07T17:20:22Z

Ajda Godec: /* STRUKTURA MEMBRANSKEGA RECEPTORJA FhuA */

==UVOD==
Eden izmed načinov obrambe bakterije pred bakteriofagi je proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev. Tako deluje npr. mikrocin J25, katerega primarna naloga je, da zavira rast drugih sevov bakterije iste vrste. Dokazano je bilo, da se tako kot fag T5 veže na membranski receptor FhuA, ki je sicer zadolžen za prenos Fe+3 ionov v bakterijo. Mikrocin J25 z vezavo na receptor FhuA prepreči vezavo faga T5 in vnos DNK faga v ''E. Coli.''

==MOLEKULARNE KOMPONENTNE INFEKCIJE ''E.COLI'' S STRANI FAGA T5 IN ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE==

=== STRUKTURA MEMBRANSKEGA RECEPTORJA FhuA ===
FhuA je protein z maso 78.9 kDa, ki se nahaja v zunanji membrani gram-negativnih bakterij kot je E.coli (sev K-12). Njegova primarna funkcija je transport Fe+3 ionov v celico. Receptor FhuA tvorita sodčkasta domena iz 22 antiparalelnih β-trakov, ki so vgrajeni v membrano in N-končna globularna domena, ki se zloži v notranjost sodčka ter zakrije večinski del notranjosti le-tega. N-končna globularna domena je sestavljena iz 4-verižnih β-plošč in iz 4 kratkih vijačnic. Globularna domena je vezana tako na sodčkasto domeno kot tudi na hidrofilne zanke usmerjene v zunanji mediju ter je odgovorna za vezavo liganda; hidroksamatnega siderofora – ferikroma, ki veže Fe3+ ione. Razen svoje primarne funkcije, je FhuA tudi receptor za različne fage; T1,T5 in ɸ80 ter za antibiotik albomicin.

=== STRUKTURA FAGA T5 ===

Struktura faga T5 je bila določena z uporabo krio-elektronske mikroskopije. Fag T5 uvrščamo v družino fagov Siphoviridae, za predstavnike katere je značilno, da imajo ikozaedrično oblikovano kapsido; ta vsebuje močno zvito, zgoščeno dvojno verižno DNA in rep. Rep predstavlja multiproteinski skupek, ki služi za prepoznavanje površine bakterijskih celic in za prenos genoma v to gostiteljsko celico. Za to družino fagov je značilno, da v strukturi vsebujejo dolg in nekrčljiv rep. Fag T5 ima 250 nm dolg rep, ki se konča s tremi L-oblikovanimi fibrilarnimi strukturami, ki so pritrjene na stožčasto podlago in premočrtno centralno fibrilo.

=== ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE IN INTERAKCIJA MED pb5 in FhuA ===

Specifičnost gostiteljske celice pri procesu okužbe s strani fagov družine ''Siphoviridae'' je določena z interakcijo med receptor vezavnim proteinom in specifičnim receptorjem na površini bakterijske celice. Prepoznavanje lahko poteka preko interakcij s saharidnimi ali proteinskimi komponentami receptorja. Ti receptor vezavni proteini se nahajajo na konici centralne fibrile v repu. To interakcijo pogosto zaznamuje dvostopenjski proces; v prvi fazi se fag reverzibilno adsorbira na receptorje z nizko vezavno afiniteto, kasneje pa se ireverzibilno veže na sekundarna mesta v receptorju. Interakcija receptor vezavni protein-receptor sproži konformacijske spremembe v strukturi repa, kar povzroči, da se kapsida odpre, pri tem se razpre zunanja membrana bakterije. Ob tem se DNK faga prenese preko repa skozi bakterijsko ovojnico v notranjost celice. Proces prepoznavanja v primeru faga T5 se prične z reverzibilno vezavo L-oblikovane proteinske niti na O-antigen lipopolisaharidne komponente. Nato se fag ireverzibilno veže na zunanji del ferikromskega transporterja FhuA z receptor vezavnim proteinom pb5.

Različne raziskave ''in vivo'' ter ''in vitro'' predpostavljajo naslednji mehanizem infekcije : v prvi stopnji se fag T5 reverzibilno veže s proteinom pb1 (ta sestavlja del L-oblikovane fibrile) na polimanozni O-antigen in pospeši hitrost vezave pb5 na FhuA. Nato se protein pb2 (del centralne fibrile) veže na površino bakterije. Ta interakcija ne vključuje sodelovanja specifičnih membranskih receptorjev. Centralna premočrtna fibrila se nato usidra v bakterijsko zunanjo membrano, dokler pb5 ne interagira s FhuA. Ta interakcija povzroči sprostitev DNK iz kapside. DNK se nato prenese v notranjost celice preko kanalčka, ki nastane iz proteina pb2. Kanalček sega od zunanje membrane, periplazme do citoplazemske membrane. Tak kanalček zaščiti DNK pred delovanjem periplazemskih nukleaz.

== MIKROCINI ==

Bakterije morajo znotraj svoje niše med seboj tekmovati za vire hranil in prostor. Izdelava “orožja” proti drugim bakterijam je torej zelo pomembna za njihovo preživetje. Ena izmed zelo razširjenih taktik tekmovanja med bakterijami je tvorba bakteriocinov. To so antimikrobni peptidi, ki delujejo kot toksini, saj zavirajo rast podobnih oziroma filogenetsko sorodnih bakterijskih sevov (tako na primer, E. coli izloča mikrocine, ki napadajo le seve E. coli). Sintetizirajo se, ko v okolju primanjkuje hranil in bakterije stradajo. Mikrocini so bakteriocini s kratkim aminokislinskim zaporedjem. Izločajo jih enterobakterije, to so Gram-negativni bacili, ki so v naravi zelo razširjeni, prav tako pa so del črevesne flore (kar pove že ime). Njihov zapis se nahaja na plazmidih. Mikrocine delimo v dva razreda:

* razred I – po translaciji pride do obširnih posttranslacijskih modifikacij, vsebujejo disulfidne mostičke
* razred II – ne prihaja do posttranslacijskih modifikacij

=== STRUKTURA MIKROCINA J25 ===

V prvi razred mikrocinov sodi tudi mikrocin J25 (MccJ25). Sestavljen je iz 21 aminokislinskih ostankov, odlikuje pa ga zanimivo zvitje, ki je sicer med peptidi zelo redko. Sprva je veljalo mnenje, da ima v celoti ciklično strukturo, nedavne raziskave pa so pokazale, da se po translaciji zvije v strukturo, ki spominja na laso. N-konec peptida je v obliki makrolaktamskega obroča, ki ga tvorita aminokislinska ostanka Gly1 in Glu8, pri čemer aminska skupina iz glicina tvori peptidno vez s karboksilno skupino stranske skupine glutamata. Peptid se nato nadaljuje v β-lasnično zanko (dva antiparalelna β-trakova povezana z zanko, ki jo tvorita Val11 in Pro16), ki jo tvorijo aminokislinski ostanki 9-18. C-konec mikrocina (t.i. rep) prehaja skozi obroč, kar je sicer entropijsko zelo neugodno, zato je tako zvitje med peptidi zelo redko. V primeru J25 pa je taka struktura celo zelo stabilna – dva aminokislinska ostanka z aromatskimi stranskimi skupinami, Phe19 in Tyr20, vsak iz ene strani “sidrata” C-konec v makrolaktamski obroč. Ker sta stranski skupini teh ostankov tako veliki, prihaja do steričnega oviranja z obročem, zato rep ne more "pobegniti". Sterična stabilizacija je tako močna, da je J25 odporen celo proti večini proteaz in visokim temperaturam. V močno kislem mediju in ob delovanju endopeptidaz se cepi le β-lasnična zanka, ne pa tudi obroč (rep ostane ujet).

=== DELOVANJE MIKROCINA J25 ===

Mikrocin J25 je toksičen le za rod Salmonella in seve vrste E. coli. Rast celic zavre tako, da preide v celico, kje deluje kot inhibitor RNA-polimeraze. Za inhibicijo je pomemben makrolaktamski obroč, ki kot čep zamaši kanal v polimerazi, ki usmerja ustrezne ribonukleozid trifosfate na aktivno mesto.Za prehod skozi celični membrani Gram-negativnih bakterij J25 izkorišča receptor za železo v zunanji membrani; FhuA in z njim sklopljen kompleks TonB–ExbB–ExbD (na receptorju pravzaprav parazitira). To so pokazali številni eksperimenti, pri katerih so v E. coli z delecijo gena za FhuA vnesli plazmid z zapisom za FhuA iz E. coli ali rodu Salmonella. Bakterije brez receptorja so bile odporne na mikrocin J25, po vnosu plazmida pa so nanj postale občutljive.

Ker je železo slabo topno, prehaja skozi receptor v obliki ferikroma, ki po obliki niti malo ne spominja na mikrocin J25, zatorej vezava mikrocina na receptor ni samoumevna. Kako se torej mikrocin veže na FhuA? Primerjava kristalnih struktur kompleksov FhuA-ferikrom in FhuA-J25 je pokazala, da se oba liganda v receptor vežeta na podobnem mestu. Pri tem ferikrom tvori veliko vodikovih vezi z N-globularno domeno FhuA, ki deluje kot zamašek, MccJ25 pa s to domeno tvori le dve vodikovi vezi. Ta podatek nakazuje na to, da za vezavo na receptor FhuA ni potrebna dobra ohranjenost liganda, kar razloži tudi vezavo MccJ25, čeprav je le-ta po strukturi zelo različen od primarnega liganda.

Opravljene so bile tudi številne raziskave, ki so identificirale ostanke na MccJ25, ki so pomembni za vezavo na receptor. Že sama poravnava strukture nevezanega mikrocina (struktura pridobljena z NMR), s strukturo na receptor vezanega mikrocina (struktura, pridobljena z rentgensko kristalografijo) je pokazala, da pride ob vezavi mikrocina do obširne konformacijske spremembe v predelu β-lasnične zanke, medtem ko ostane struktura laktamskega obroča nespremenjena. Iz tega so sklepali, da je za vezavo najpomembnejša lasnična regija. Raziskava, ki je to potrdila, je temeljila na razgradnji te zanke s termolizinom (cepitev vezi med Val11 in Phe16). Izvedena je bila serija poskusov z bakteriofagom T5, ti pa so opisani v nadaljevanju.

=== POSKUSI O VPLIVIH VEZAVE MIKROCINA J25 NA RECEPTOR RhuA NA VEZAVO FAGA T5 ===

S serijo poskusov z bakteriofagom T5 in mikrocinom MccJ25 (oz. t-MccJ25) so v raziskavi želeli pokazati kako vezava MccJ25 na receptor FhuA vpliva na vezavo faga.
V prvem poskusu so raziskovalci preverjali inhibicijo bakterijske infekcije s fagom T5 v prisotnosti mikrocina. Suspenzijo E. Coli (sev W3110) v eksponentni fazi rasti so prenesli na medij. Bakterijam so dodali raztopino MccJ25 ali t-MccJ25 v metanolu in jih nato inkubirali na sobni temperaturi. Dodali so fag T5 in po stresanju in inkubaciji pri 37°C 120 minut z merjenjem absorbance pri 620nm nadzorovali stopnjo lize bakterij. Izvedena sta bila dva kontrolna poskusa in sicer v prisotnosti faga T5 brez mikrocina in pa z mikrocinom brez faga (kontrola rasti).

Rezultati kontrole rasti so pokazali, da MccJ25 in t-MccJ25 v koncentracijah do 10μM sama bistveno ne vplivata na rast bakterij. V odsotnosti MccJ25 je liza bakterij nastopila 50 minut po dodatki faga T5. Dodatek MccJ25 je lizo inhibiral, učinek pa je bil odvisen od koncentracije dodanega mikrocina. Hitrost rasti bakterij je dosegla svojo prvotno vrednost (vrednost brez dodanega faga) ob dodatku 10μM raztopine mikrocina. t-MccJ25 ni inhibiral lize bakterij.

Da bi preverili, če do inhibicije lize pride zaradi kompetitivne adsorpcije mikrocina na bakterijo, so pri drugem poskusu opazovali vpliv mikrocina na adsorpcijo faga T5 na E. Coli. Ponovno so raztopino bakterij v eksponentni fazi rasti prenesli na medij in jih inkubirali pri sobi temperaturi z MccJ25 oz. s t-MccJ25. Za kontrolni poskus so raztopini bakterij dodali le topilo brez mikrocina (50% acetonitril). Po prvi inkubaciji so dodali fag T5 in inkubirali še 15 minut. S centrifugiranjem so nato odstranili adsorbirane fage ter določili število neadsorbiranih virusov.
Delež adsorbiranih fagov se je zmanjšal iz 80% pri 0,1μM koncentraciji na 15% pri 5μM koncentraciji MccJ25. t-MccJ25 ni imel vpliva na adsorpcijo faga.

Raziskovalci so želeli dokazati, da je v prisotnosti mikrocina MccJ25 res inhibirana vezava na receptor FhuA. V pufru so 10 minut inkubirali FhuA in mikrocin (MccJ25 (50nM-3,1μM) oz. t-MccJ25 (3,1μM)), prisoten pa je bil še fluorescentni marker za DNA. Po inkubaciji so v vsak vzorec dodali fag T5 in opazovali injekcijo DNA v raztopino. Že v prejšnjih raziskavah je bilo dokazano, da bakteriofag ob vezavi na FhuA receptor injicira DNA v raztopino, zaradi česar lahko ob prisotnosti fluorescentnega markerja merimo fluorescenco.
Rezultati so pokazali, da se z višanjem koncentracije mikrocina MccJ25 fluorescenca manjša. Izračunano je bilo 55% zmanjšanje adsorpcije faga (iz 100% na 45%) pri višanju koncentracije iz 0,1-3,2μM mikrocina. t-MccJ25 ponovno ni imel učinka na injekcijo DNA faga.

Iz vseh eksperimentov lahko sklepamo, da je mikrocin MccJ25 res kompetitivni inhibitor vezave bakteriofaga T5 na receptor FhuA. Prav tako je razvidno, da termična cepitev zanke v strukturi t-MccJ25 bistveno vpliva na interakcijo s FhuA receptorjem.

== VIRI IN LITERATURA ==

*Rebuffat, S. Microcins in action: amazing defence strategies of Enterobacteria, Biochemical Society Transactions, 2012, Vol. 40, part 6 str. 1456 -1462

*Mathavan, I., Zirah, S., Mehmood, S., Choudhury, H. G., Goulard, C., Li, Y.,Beis, K.,Structural basis for hijacking siderophore receptors by antimicrobial lasso peptides. Nature chemical biology,2014, Vol 10 issue 5, 340–342. doi:10.1038/nchembio.1499

* Volkmar Braun, FhuA (TonA), the Career of a Protein, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, June 2009, p. 3431–3436 Vol. 191, No. 11 0021-9193/09/$08.00_0 doi:10.1128/JB.00106-09

* Flayhan, Ali; Wien, Frank; Paternostre, Maïté; Boulanger, Pasc , New insights into pb5, the receptor binding protein of bacteriophage T5
and its interaction with its Escherichia coli receptor FhuA, Biochimie Vol. 94 issue 9 2012 , doi :10.1016_j.biochi.2012.05.021

*Destoumieux-Garzón, Delphine; Duquesne, Sophie; Peduzzi, Jean, The iron–siderophore transporter FhuA is the receptor for the antimicrobial peptide microcin J25: role of the microcin Val11–Pro16 β-hairpin region in the recognition mechanism, Biochemical Journal, Vol. 389 issue 3 2005, doi: 10.1042_bj20042107

*Robin Leatherbarrow, R H Templer, Biophisical chemistry: Membranes and Proteines,Royal Society of Chemistry, 2007, ISBN 1847550258, str.215-219

*Pascale Boulanger, Insights into Bacteriophage T5 Structure from Analysis of Its Morphogenesis Genes and Protein Components, Journal of Virology Dec 2013, Vol.88, issue 2 1162-1174; doi: 10.1128/JVI.02262-13

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev

2019-04-07T17:17:28Z

Ajda Godec:

==UVOD==
Eden izmed načinov obrambe bakterije pred bakteriofagi je proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev. Tako deluje npr. mikrocin J25, katerega primarna naloga je, da zavira rast drugih sevov bakterije iste vrste. Dokazano je bilo, da se tako kot fag T5 veže na membranski receptor FhuA, ki je sicer zadolžen za prenos Fe+3 ionov v bakterijo. Mikrocin J25 z vezavo na receptor FhuA prepreči vezavo faga T5 in vnos DNK faga v ''E. Coli.''

==MOLEKULARNE KOMPONENTNE INFEKCIJE ''E.COLI'' S STRANI FAGA T5 IN ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE==

=== STRUKTURA MEMBRANSKEGA RECEPTORJA FhuA ===
FhuA je protein z maso 78.9 kDa, ki se nahaja v zunanji membrani gram-negativnih bakterij kot je E.coli (sev K-12). Njegova primarna funkcija je transport Fe+3 ionov v celico. Receptor FhuA tvorita sodčkasta domena iz 22 antiparalelnih β-trakov, ki so vgrajeni v membrano in N-končna globularna domena, ki se zloži v notranjost sodčka ter zakrije večinski del notranjosti le-tega. N-končna globularna domena je sestavljena iz 4-verižnih β-plošč in iz 4 kratkih vijačnic. Globularna domena je vezana tako na sodčkasto domeno kot tudi na hidrofilne zanke usmerjene v zunanji mediju ter je odgovorna za vezavo liganda; hidroksamatnega siderofora – ferikroma, ki veže Fe3+ ione. Razen svoje primarna funkcije, je FhuA tudi receptor za različne fage; T1,T5 in ɸ80 ter za antibiotik albomicin.

=== STRUKTURA FAGA T5 ===

Struktura faga T5 je bila določena z uporabo krio-elektronske mikroskopije. Fag T5 uvrščamo v družino fagov Siphoviridae, za predstavnike katere je značilno, da imajo ikozaedrično oblikovano kapsido; ta vsebuje močno zvito, zgoščeno dvojno verižno DNA in rep. Rep predstavlja multiproteinski skupek, ki služi za prepoznavanje površine bakterijskih celic in za prenos genoma v to gostiteljsko celico. Za to družino fagov je značilno, da v strukturi vsebujejo dolg in nekrčljiv rep. Fag T5 ima 250 nm dolg rep, ki se konča s tremi L-oblikovanimi fibrilarnimi strukturami, ki so pritrjene na stožčasto podlago in premočrtno centralno fibrilo.

=== ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE IN INTERAKCIJA MED pb5 in FhuA ===

Specifičnost gostiteljske celice pri procesu okužbe s strani fagov družine ''Siphoviridae'' je določena z interakcijo med receptor vezavnim proteinom in specifičnim receptorjem na površini bakterijske celice. Prepoznavanje lahko poteka preko interakcij s saharidnimi ali proteinskimi komponentami receptorja. Ti receptor vezavni proteini se nahajajo na konici centralne fibrile v repu. To interakcijo pogosto zaznamuje dvostopenjski proces; v prvi fazi se fag reverzibilno adsorbira na receptorje z nizko vezavno afiniteto, kasneje pa se ireverzibilno veže na sekundarna mesta v receptorju. Interakcija receptor vezavni protein-receptor sproži konformacijske spremembe v strukturi repa, kar povzroči, da se kapsida odpre, pri tem se razpre zunanja membrana bakterije. Ob tem se DNK faga prenese preko repa skozi bakterijsko ovojnico v notranjost celice. Proces prepoznavanja v primeru faga T5 se prične z reverzibilno vezavo L-oblikovane proteinske niti na O-antigen lipopolisaharidne komponente. Nato se fag ireverzibilno veže na zunanji del ferikromskega transporterja FhuA z receptor vezavnim proteinom pb5.

Različne raziskave ''in vivo'' ter ''in vitro'' predpostavljajo naslednji mehanizem infekcije : v prvi stopnji se fag T5 reverzibilno veže s proteinom pb1 (ta sestavlja del L-oblikovane fibrile) na polimanozni O-antigen in pospeši hitrost vezave pb5 na FhuA. Nato se protein pb2 (del centralne fibrile) veže na površino bakterije. Ta interakcija ne vključuje sodelovanja specifičnih membranskih receptorjev. Centralna premočrtna fibrila se nato usidra v bakterijsko zunanjo membrano, dokler pb5 ne interagira s FhuA. Ta interakcija povzroči sprostitev DNK iz kapside. DNK se nato prenese v notranjost celice preko kanalčka, ki nastane iz proteina pb2. Kanalček sega od zunanje membrane, periplazme do citoplazemske membrane. Tak kanalček zaščiti DNK pred delovanjem periplazemskih nukleaz.

== MIKROCINI ==

Bakterije morajo znotraj svoje niše med seboj tekmovati za vire hranil in prostor. Izdelava “orožja” proti drugim bakterijam je torej zelo pomembna za njihovo preživetje. Ena izmed zelo razširjenih taktik tekmovanja med bakterijami je tvorba bakteriocinov. To so antimikrobni peptidi, ki delujejo kot toksini, saj zavirajo rast podobnih oziroma filogenetsko sorodnih bakterijskih sevov (tako na primer, E. coli izloča mikrocine, ki napadajo le seve E. coli). Sintetizirajo se, ko v okolju primanjkuje hranil in bakterije stradajo. Mikrocini so bakteriocini s kratkim aminokislinskim zaporedjem. Izločajo jih enterobakterije, to so Gram-negativni bacili, ki so v naravi zelo razširjeni, prav tako pa so del črevesne flore (kar pove že ime). Njihov zapis se nahaja na plazmidih. Mikrocine delimo v dva razreda:

* razred I – po translaciji pride do obširnih posttranslacijskih modifikacij, vsebujejo disulfidne mostičke
* razred II – ne prihaja do posttranslacijskih modifikacij

=== STRUKTURA MIKROCINA J25 ===

V prvi razred mikrocinov sodi tudi mikrocin J25 (MccJ25). Sestavljen je iz 21 aminokislinskih ostankov, odlikuje pa ga zanimivo zvitje, ki je sicer med peptidi zelo redko. Sprva je veljalo mnenje, da ima v celoti ciklično strukturo, nedavne raziskave pa so pokazale, da se po translaciji zvije v strukturo, ki spominja na laso. N-konec peptida je v obliki makrolaktamskega obroča, ki ga tvorita aminokislinska ostanka Gly1 in Glu8, pri čemer aminska skupina iz glicina tvori peptidno vez s karboksilno skupino stranske skupine glutamata. Peptid se nato nadaljuje v β-lasnično zanko (dva antiparalelna β-trakova povezana z zanko, ki jo tvorita Val11 in Pro16), ki jo tvorijo aminokislinski ostanki 9-18. C-konec mikrocina (t.i. rep) prehaja skozi obroč, kar je sicer entropijsko zelo neugodno, zato je tako zvitje med peptidi zelo redko. V primeru J25 pa je taka struktura celo zelo stabilna – dva aminokislinska ostanka z aromatskimi stranskimi skupinami, Phe19 in Tyr20, vsak iz ene strani “sidrata” C-konec v makrolaktamski obroč. Ker sta stranski skupini teh ostankov tako veliki, prihaja do steričnega oviranja z obročem, zato rep ne more "pobegniti". Sterična stabilizacija je tako močna, da je J25 odporen celo proti večini proteaz in visokim temperaturam. V močno kislem mediju in ob delovanju endopeptidaz se cepi le β-lasnična zanka, ne pa tudi obroč (rep ostane ujet).

=== DELOVANJE MIKROCINA J25 ===

Mikrocin J25 je toksičen le za rod Salmonella in seve vrste E. coli. Rast celic zavre tako, da preide v celico, kje deluje kot inhibitor RNA-polimeraze. Za inhibicijo je pomemben makrolaktamski obroč, ki kot čep zamaši kanal v polimerazi, ki usmerja ustrezne ribonukleozid trifosfate na aktivno mesto.Za prehod skozi celični membrani Gram-negativnih bakterij J25 izkorišča receptor za železo v zunanji membrani; FhuA in z njim sklopljen kompleks TonB–ExbB–ExbD (na receptorju pravzaprav parazitira). To so pokazali številni eksperimenti, pri katerih so v E. coli z delecijo gena za FhuA vnesli plazmid z zapisom za FhuA iz E. coli ali rodu Salmonella. Bakterije brez receptorja so bile odporne na mikrocin J25, po vnosu plazmida pa so nanj postale občutljive.

Ker je železo slabo topno, prehaja skozi receptor v obliki ferikroma, ki po obliki niti malo ne spominja na mikrocin J25, zatorej vezava mikrocina na receptor ni samoumevna. Kako se torej mikrocin veže na FhuA? Primerjava kristalnih struktur kompleksov FhuA-ferikrom in FhuA-J25 je pokazala, da se oba liganda v receptor vežeta na podobnem mestu. Pri tem ferikrom tvori veliko vodikovih vezi z N-globularno domeno FhuA, ki deluje kot zamašek, MccJ25 pa s to domeno tvori le dve vodikovi vezi. Ta podatek nakazuje na to, da za vezavo na receptor FhuA ni potrebna dobra ohranjenost liganda, kar razloži tudi vezavo MccJ25, čeprav je le-ta po strukturi zelo različen od primarnega liganda.

Opravljene so bile tudi številne raziskave, ki so identificirale ostanke na MccJ25, ki so pomembni za vezavo na receptor. Že sama poravnava strukture nevezanega mikrocina (struktura pridobljena z NMR), s strukturo na receptor vezanega mikrocina (struktura, pridobljena z rentgensko kristalografijo) je pokazala, da pride ob vezavi mikrocina do obširne konformacijske spremembe v predelu β-lasnične zanke, medtem ko ostane struktura laktamskega obroča nespremenjena. Iz tega so sklepali, da je za vezavo najpomembnejša lasnična regija. Raziskava, ki je to potrdila, je temeljila na razgradnji te zanke s termolizinom (cepitev vezi med Val11 in Phe16). Izvedena je bila serija poskusov z bakteriofagom T5, ti pa so opisani v nadaljevanju.

=== POSKUSI O VPLIVIH VEZAVE MIKROCINA J25 NA RECEPTOR RhuA NA VEZAVO FAGA T5 ===

S serijo poskusov z bakteriofagom T5 in mikrocinom MccJ25 (oz. t-MccJ25) so v raziskavi želeli pokazati kako vezava MccJ25 na receptor FhuA vpliva na vezavo faga.
V prvem poskusu so raziskovalci preverjali inhibicijo bakterijske infekcije s fagom T5 v prisotnosti mikrocina. Suspenzijo E. Coli (sev W3110) v eksponentni fazi rasti so prenesli na medij. Bakterijam so dodali raztopino MccJ25 ali t-MccJ25 v metanolu in jih nato inkubirali na sobni temperaturi. Dodali so fag T5 in po stresanju in inkubaciji pri 37°C 120 minut z merjenjem absorbance pri 620nm nadzorovali stopnjo lize bakterij. Izvedena sta bila dva kontrolna poskusa in sicer v prisotnosti faga T5 brez mikrocina in pa z mikrocinom brez faga (kontrola rasti).

Rezultati kontrole rasti so pokazali, da MccJ25 in t-MccJ25 v koncentracijah do 10μM sama bistveno ne vplivata na rast bakterij. V odsotnosti MccJ25 je liza bakterij nastopila 50 minut po dodatki faga T5. Dodatek MccJ25 je lizo inhibiral, učinek pa je bil odvisen od koncentracije dodanega mikrocina. Hitrost rasti bakterij je dosegla svojo prvotno vrednost (vrednost brez dodanega faga) ob dodatku 10μM raztopine mikrocina. t-MccJ25 ni inhibiral lize bakterij.

Da bi preverili, če do inhibicije lize pride zaradi kompetitivne adsorpcije mikrocina na bakterijo, so pri drugem poskusu opazovali vpliv mikrocina na adsorpcijo faga T5 na E. Coli. Ponovno so raztopino bakterij v eksponentni fazi rasti prenesli na medij in jih inkubirali pri sobi temperaturi z MccJ25 oz. s t-MccJ25. Za kontrolni poskus so raztopini bakterij dodali le topilo brez mikrocina (50% acetonitril). Po prvi inkubaciji so dodali fag T5 in inkubirali še 15 minut. S centrifugiranjem so nato odstranili adsorbirane fage ter določili število neadsorbiranih virusov.
Delež adsorbiranih fagov se je zmanjšal iz 80% pri 0,1μM koncentraciji na 15% pri 5μM koncentraciji MccJ25. t-MccJ25 ni imel vpliva na adsorpcijo faga.

Raziskovalci so želeli dokazati, da je v prisotnosti mikrocina MccJ25 res inhibirana vezava na receptor FhuA. V pufru so 10 minut inkubirali FhuA in mikrocin (MccJ25 (50nM-3,1μM) oz. t-MccJ25 (3,1μM)), prisoten pa je bil še fluorescentni marker za DNA. Po inkubaciji so v vsak vzorec dodali fag T5 in opazovali injekcijo DNA v raztopino. Že v prejšnjih raziskavah je bilo dokazano, da bakteriofag ob vezavi na FhuA receptor injicira DNA v raztopino, zaradi česar lahko ob prisotnosti fluorescentnega markerja merimo fluorescenco.
Rezultati so pokazali, da se z višanjem koncentracije mikrocina MccJ25 fluorescenca manjša. Izračunano je bilo 55% zmanjšanje adsorpcije faga (iz 100% na 45%) pri višanju koncentracije iz 0,1-3,2μM mikrocina. t-MccJ25 ponovno ni imel učinka na injekcijo DNA faga.

Iz vseh eksperimentov lahko sklepamo, da je mikrocin MccJ25 res kompetitivni inhibitor vezave bakteriofaga T5 na receptor FhuA. Prav tako je razvidno, da termična cepitev zanke v strukturi t-MccJ25 bistveno vpliva na interakcijo s FhuA receptorjem.

== VIRI IN LITERATURA ==

*Rebuffat, S. Microcins in action: amazing defence strategies of Enterobacteria, Biochemical Society Transactions, 2012, Vol. 40, part 6 str. 1456 -1462

*Mathavan, I., Zirah, S., Mehmood, S., Choudhury, H. G., Goulard, C., Li, Y.,Beis, K.,Structural basis for hijacking siderophore receptors by antimicrobial lasso peptides. Nature chemical biology,2014, Vol 10 issue 5, 340–342. doi:10.1038/nchembio.1499

* Volkmar Braun, FhuA (TonA), the Career of a Protein, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, June 2009, p. 3431–3436 Vol. 191, No. 11 0021-9193/09/$08.00_0 doi:10.1128/JB.00106-09

* Flayhan, Ali; Wien, Frank; Paternostre, Maïté; Boulanger, Pasc , New insights into pb5, the receptor binding protein of bacteriophage T5
and its interaction with its Escherichia coli receptor FhuA, Biochimie Vol. 94 issue 9 2012 , doi :10.1016_j.biochi.2012.05.021

*Destoumieux-Garzón, Delphine; Duquesne, Sophie; Peduzzi, Jean, The iron–siderophore transporter FhuA is the receptor for the antimicrobial peptide microcin J25: role of the microcin Val11–Pro16 β-hairpin region in the recognition mechanism, Biochemical Journal, Vol. 389 issue 3 2005, doi: 10.1042_bj20042107

*Robin Leatherbarrow, R H Templer, Biophisical chemistry: Membranes and Proteines,Royal Society of Chemistry, 2007, ISBN 1847550258, str.215-219

*Pascale Boulanger, Insights into Bacteriophage T5 Structure from Analysis of Its Morphogenesis Genes and Protein Components, Journal of Virology Dec 2013, Vol.88, issue 2 1162-1174; doi: 10.1128/JVI.02262-13

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev

2019-04-07T09:24:15Z

Ajda Godec: /* ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE IN INTERAKCIJA MED pb5 in FhuA */

== STRUKTURA MEMBRANSKEGA RECEPTORJA FhuA IN STRUKTURA FAGA T5 ==

FhuA je protein z maso 78.9 kDa, ki se nahaja v zunanji membrani gram-negativnih bakterij kot je E.coli (sev K-12). Njegova primarna funkcija je transport Fe+3 ionov v celico. Receptor FhuA tvorita sodčkasta domena iz 22 antiparalelnih β-trakov, ki so vgrajeni v membrano in N-končna globularna domena, ki se zloži v notranjost sodčka ter zakrije večinski del notranjosti le-tega. N-končna globularna domena je sestavljena iz 4-verižnih β-plošč in iz 4 kratkih vijačnic. Globularna domena je vezana tako na sodčkasto domeno kot tudi na hidrofilne zanke usmerjene v zunanji mediju ter je odgovorna za vezavo liganda; hidroksamatnega siderofora – ferikroma, ki veže Fe3+ ione. Razen svoje primarna funkcije, je FhuA tudi receptor za različne fage; T1,T5 in ɸ80 ter za antibiotik albomicin.

Struktura faga T5 je bila določena z uporabo krio-elektronske mikroskopije. Fag T5 uvrščamo v družino fagov Siphoviridae, za predstavnike katere je značilno, da imajo ikozaedrično oblikovano kapsido; ta vsebuje močno zvito, zgoščeno dvojno verižno DNA in rep. Rep predstavlja multiproteinski skupek, ki služi za prepoznavanje površine bakterijskih celic in za prenos genoma v to gostiteljsko celico. Za to družino fagov je značilno, da v strukturi vsebujejo dolg in nekrčljiv rep. Fag T5 ima 250 nm dolg rep, ki se konča s tremi L-oblikovanimi fibrilarnimi strukturami, ki so pritrjene na stožčasto podlago in premočrtno centralno fibrilo.

== ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE IN INTERAKCIJA MED pb5 in FhuA ==

Specifičnost gostiteljske celice pri procesu okužbe s strani fagov družine ''Siphoviridae'' je določena z interakcijo med receptor vezavnim proteinom in specifičnim receptorjem na površini bakterijske celice. Prepoznavanje lahko poteka preko interakcij s saharidnimi ali proteinskimi komponentami receptorja. Ti receptor vezavni proteini se nahajajo na konici centralne fibrile v repu. To interakcijo pogosto zaznamuje dvostopenjski proces; v prvi fazi se fag reverzibilno adsorbira na receptorje z nizko vezavno afiniteto, kasneje pa se ireverzibilno veže na sekundarna mesta v receptorju. Interakcija receptor vezavni protein-receptor sproži konformacijske spremembe v strukturi repa, kar povzroči, da se kapsida odpre, pri tem se razpre zunanja membrana bakterije. Ob tem se DNK faga prenese preko repa skozi bakterijsko ovojnico v notranjost celice. Proces prepoznavanja v primeru faga T5 se prične z reverzibilno vezavo L-oblikovane proteinske niti na O-antigen lipopolisaharidne komponente. Nato se fag ireverzibilno veže na zunanji del ferikromskega transporterja FhuA z receptor vezavnim proteinom pb5.

Različne raziskave ''in vivo'' ter ''in vitro'' predpostavljajo naslednji mehanizem infekcije : v prvi stopnji se fag T5 reverzibilno veže s proteinom pb1 (ta sestavlja del L-oblikovane fibrile) na polimanozni O-antigen in pospeši hitrost vezave pb5 na FhuA. Nato se protein pb2 (del centralne fibrile) veže na površino bakterije. Ta interakcija ne vključuje sodelovanja specifičnih membranskih receptorjev. Centralna premočrtna fibrila se nato usidra v bakterijsko zunanjo membrano, dokler pb5 ne interagira s FhuA. Ta interakcija povzroči sprostitev DNK iz kapside. DNK se nato prenese v notranjost celice preko kanalčka, ki nastane iz proteina pb2. Kanalček sega od zunanje membrane, periplazme do citoplazemske membrane. Tak kanalček zaščiti DNK pred delovanjem periplazemskih nukleaz.

== MIKROCINI ==

Bakterije morajo znotraj svoje niše med seboj tekmovati za vire hranil in prostor. Izdelava “orožja” proti drugim bakterijam je torej zelo pomembna za njihovo preživetje. Ena izmed zelo razširjenih taktik tekmovanja med bakterijami je tvorba bakteriocinov. To so antimikrobni peptidi, ki delujejo kot toksini, saj zavirajo rast podobnih oziroma filogenetsko sorodnih bakterijskih sevov (tako na primer, E. coli izloča mikrocine, ki napadajo le seve E. coli). Sintetizirajo se, ko v okolju primanjkuje hranil in bakterije stradajo. Mikrocini so bakteriocini s kratkim aminokislinskim zaporedjem. Izločajo jih enterobakterije, to so Gram-negativni bacili, ki so v naravi zelo razširjeni, prav tako pa so del črevesne flore (kar pove že ime). Njihov zapis se nahaja na plazmidih. Mikrocine delimo v dva razreda:

* razred I – po translaciji pride do obširnih posttranslacijskih modifikacij, vsebujejo disulfidne mostičke
* razred II – ne prihaja do posttranslacijskih modifikacij

== STRUKTURA MIKROCINA J25 ==

V prvi razred mikrocinov sodi tudi mikrocin J25 (MccJ25). Sestavljen je iz 21 aminokislinskih ostankov, odlikuje pa ga zanimivo zvitje, ki je sicer med peptidi zelo redko. Sprva je veljalo mnenje, da ima v celoti ciklično strukturo, nedavne raziskave pa so pokazale, da se po translaciji zvije v strukturo, ki spominja na laso. N-konec peptida je v obliki makrolaktamskega obroča, ki ga tvorita aminokislinska ostanka Gly1 in Glu8, pri čemer aminska skupina iz glicina tvori peptidno vez s karboksilno skupino stranske skupine glutamata. Peptid se nato nadaljuje v β-lasnično zanko (dva antiparalelna β-trakova povezana z zanko, ki jo tvorita Val11 in Pro16), ki jo tvorijo aminokislinski ostanki 9-18. C-konec mikrocina (t.i. rep) prehaja skozi obroč, kar je sicer entropijsko zelo neugodno, zato je tako zvitje med peptidi zelo redko. V primeru J25 pa je taka struktura celo zelo stabilna – dva aminokislinska ostanka z aromatskimi stranskimi skupinami, Phe19 in Tyr20, vsak iz ene strani “sidrata” C-konec v makrolaktamski obroč. Ker sta stranski skupini teh ostankov tako veliki, prihaja do steričnega oviranja z obročem, zato rep ne more "pobegniti". Sterična stabilizacija je tako močna, da je J25 odporen celo proti večini proteaz in visokim temperaturam. V močno kislem mediju in ob delovanju endopeptidaz se cepi le β-lasnična zanka, ne pa tudi obroč (rep ostane ujet).

== DELOVANJE MIKROCINA J25 ==

Mikrocin J25 je toksičen le za rod Salmonella in seve vrste E. coli. Rast celic zavre tako, da preide v celico, kje deluje kot inhibitor RNA-polimeraze. Za inhibicijo je pomemben makrolaktamski obroč, ki kot čep zamaši kanal v polimerazi, ki usmerja ustrezne ribonukleozid trifosfate na aktivno mesto.Za prehod skozi celični membrani Gram-negativnih bakterij J25 izkorišča receptor za železo v zunanji membrani; FhuA in z njim sklopljen kompleks TonB–ExbB–ExbD (na receptorju pravzaprav parazitira). To so pokazali številni eksperimenti, pri katerih so v E. coli z delecijo gena za FhuA vnesli plazmid z zapisom za FhuA iz E. coli ali rodu Salmonella. Bakterije brez receptorja so bile odporne na mikrocin J25, po vnosu plazmida pa so nanj postale občutljive.

Ker je železo slabo topno, prehaja skozi receptor v obliki ferikroma, ki po obliki niti malo ne spominja na mikrocin J25, zatorej vezava mikrocina na receptor ni samoumevna. Kako se torej mikrocin veže na FhuA? Primerjava kristalnih struktur kompleksov FhuA-ferikrom in FhuA-J25 je pokazala, da se oba liganda v receptor vežeta na podobnem mestu. Pri tem ferikrom tvori veliko vodikovih vezi z N-globularno domeno FhuA, ki deluje kot zamašek, MccJ25 pa s to domeno tvori le dve vodikovi vezi. Ta podatek nakazuje na to, da za vezavo na receptor FhuA ni potrebna dobra ohranjenost liganda, kar razloži tudi vezavo MccJ25, čeprav je le-ta po strukturi zelo različen od primarnega liganda.

Opravljene so bile tudi številne raziskave, ki so identificirale ostanke na MccJ25, ki so pomembni za vezavo na receptor. Že sama poravnava strukture nevezanega mikrocina (struktura pridobljena z NMR), s strukturo na receptor vezanega mikrocina (struktura, pridobljena z rentgensko kristalografijo) je pokazala, da pride ob vezavi mikrocina do obširne konformacijske spremembe v predelu β-lasnične zanke, medtem ko ostane struktura laktamskega obroča nespremenjena. Iz tega so sklepali, da je za vezavo najpomembnejša lasnična regija. Raziskava, ki je to potrdila, je temeljila na razgradnji te zanke s termolizinom (cepitev vezi med Val11 in Phe16). Izvedena je bila serija poskusov z bakteriofagom T5, ti pa so opisani v nadaljevanju.

== POSKUSI O VPLIVIH VEZAVE MIKROCINA J25 NA RECEPTOR RhuA NA VEZAVO FAGA T5 ==

S serijo poskusov z bakteriofagom T5 in mikrocinom MccJ25 (oz. t-MccJ25) so v raziskavi želeli pokazati kako vezava MccJ25 na receptor FhuA vpliva na vezavo faga.
V prvem poskusu so raziskovalci preverjali inhibicijo bakterijske infekcije s fagom T5 v prisotnosti mikrocina. Suspenzijo E. Coli (sev W3110) v eksponentni fazi rasti so prenesli na medij. Bakterijam so dodali raztopino MccJ25 ali t-MccJ25 v metanolu in jih nato inkubirali na sobni temperaturi. Dodali so fag T5 in po stresanju in inkubaciji pri 37°C 120 minut z merjenjem absorbance pri 620nm nadzorovali stopnjo lize bakterij. Izvedena sta bila dva kontrolna poskusa in sicer v prisotnosti faga T5 brez mikrocina in pa z mikrocinom brez faga (kontrola rasti).

Rezultati kontrole rasti so pokazali, da MccJ25 in t-MccJ25 v koncentracijah do 10μM sama bistveno ne vplivata na rast bakterij. V odsotnosti MccJ25 je liza bakterij nastopila 50 minut po dodatki faga T5. Dodatek MccJ25 je lizo inhibiral, učinek pa je bil odvisen od koncentracije dodanega mikrocina. Hitrost rasti bakterij je dosegla svojo prvotno vrednost (vrednost brez dodanega faga) ob dodatku 10μM raztopine mikrocina. t-MccJ25 ni inhibiral lize bakterij.

Da bi preverili, če do inhibicije lize pride zaradi kompetitivne adsorpcije mikrocina na bakterijo, so pri drugem poskusu opazovali vpliv mikrocina na adsorpcijo faga T5 na E. Coli. Ponovno so raztopino bakterij v eksponentni fazi rasti prenesli na medij in jih inkubirali pri sobi temperaturi z MccJ25 oz. s t-MccJ25. Za kontrolni poskus so raztopini bakterij dodali le topilo brez mikrocina (50% acetonitril). Po prvi inkubaciji so dodali fag T5 in inkubirali še 15 minut. S centrifugiranjem so nato odstranili adsorbirane fage ter določili število neadsorbiranih virusov.
Delež adsorbiranih fagov se je zmanjšal iz 80% pri 0,1μM koncentraciji na 15% pri 5μM koncentraciji MccJ25. t-MccJ25 ni imel vpliva na adsorpcijo faga.

Raziskovalci so želeli dokazati, da je v prisotnosti mikrocina MccJ25 res inhibirana vezava na receptor FhuA. V pufru so 10 minut inkubirali FhuA in mikrocin (MccJ25 (50nM-3,1μM) oz. t-MccJ25 (3,1μM)), prisoten pa je bil še fluorescentni marker za DNA. Po inkubaciji so v vsak vzorec dodali fag T5 in opazovali injekcijo DNA v raztopino. Že v prejšnjih raziskavah je bilo dokazano, da bakteriofag ob vezavi na FhuA receptor injicira DNA v raztopino, zaradi česar lahko ob prisotnosti fluorescentnega markerja merimo fluorescenco.
Rezultati so pokazali, da se z višanjem koncentracije mikrocina MccJ25 fluorescenca manjša. Izračunano je bilo 55% zmanjšanje adsorpcije faga (iz 100% na 45%) pri višanju koncentracije iz 0,1-3,2μM mikrocina. t-MccJ25 ponovno ni imel učinka na injekcijo DNA faga.

Iz vseh eksperimentov lahko sklepamo, da je mikrocin MccJ25 res kompetitivni inhibitor vezave bakteriofaga T5 na receptor FhuA. Prav tako je razvidno, da termična cepitev zanke v strukturi t-MccJ25 bistveno vpliva na interakcijo s FhuA receptorjem.

== VIRI IN LITERATURA ==

* Rebuffat, S. Microcins in action: amazing defence strategies of Enterobacteria, Biochemical Society Transactions, 2012, Vol. 40, part 6 str. 1456 -1462

*Mathavan, I., Zirah, S., Mehmood, S., Choudhury, H. G., Goulard, C., Li, Y.,Beis, K.,Structural basis for hijacking siderophore receptors by antimicrobial lasso peptides. Nature chemical biology,2014, Vol 10 issue 5, 340–342. doi:10.1038/nchembio.1499

* Volkmar Braun, FhuA (TonA), the Career of a Protein, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, June 2009, p. 3431–3436 Vol. 191, No. 11 0021-9193/09/$08.00_0 doi:10.1128/JB.00106-09

* Flayhan, Ali; Wien, Frank; Paternostre, Maïté; Boulanger, Pasc , New insights into pb5, the receptor binding protein of bacteriop, Biochimie Vol. 94 issue 9 2012 , doi :10.1016_j.biochi.2012.05.021

* Destoumieux-Garzón, Delphine; Duquesne, Sophie; Peduzzi, Jean, The iron–siderophore transporter FhuA is the receptor for the antimicrobial peptide microcin J25: role of the microcin Val11–Pro16 β-hairpin region in the recognition mechanism, Biochemical Journal, Vol. 389 issue 3 2005, doi: 10.1042_bj20042107

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-04-06T22:14:42Z

Ajda Godec:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315 pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Blokiranje_receptorjev_za_fage Blokiranje receptorjev za fage] (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa Proizvodnja zunajceličnega matriksa] (Patricija Miklavc, Benjamin Malovrh, Vid Modic) 
3. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_kompetitivnih_inhibitorjev Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev] (Ajda Godec,Liza Ulčakar,Luka Gnidovec) 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz (Alen Šadl, Bor Klančnik, Andrej Špenko) 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme (Nika Boštic, Tadej Medved, Sonja Gabrijelčič) 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) (Eva Gartner, Neža Blaznik, Tina Zavodnik ) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mateja Špegel, Špela Friškovec Vončina, Anja Truden) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, Anja Tavčar) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Jernej Imperl, Klementina Polanec, Gašper Anton Komatar) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pavleković, Valeriya Musina) 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom (Sanja Stanković, Karin Dobravc Škof, Neža Žerjav ) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-04-06T22:13:00Z

Ajda Godec:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315 pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Blokiranje_receptorjev_za_fage Blokiranje receptorjev za fage] (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa Proizvodnja zunajceličnega matriksa] (Patricija Miklavc, Benjamin Malovrh, Vid Modic) 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_kompetitivnih_inhibitorjev] (Ajda Godec,Liza Ulčakar,Luka Gnidovec) 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz (Alen Šadl, Bor Klančnik, Andrej Špenko) 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme (Nika Boštic, Tadej Medved, Sonja Gabrijelčič) 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) (Eva Gartner, Neža Blaznik, Tina Zavodnik ) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mateja Špegel, Špela Friškovec Vončina, Anja Truden) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, Anja Tavčar) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Jernej Imperl, Klementina Polanec, Gašper Anton Komatar) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pavleković, Valeriya Musina) 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom (Sanja Stanković, Karin Dobravc Škof, Neža Žerjav ) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-04-06T22:11:18Z

Ajda Godec:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315 pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Blokiranje_receptorjev_za_fage Blokiranje receptorjev za fage] (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa Proizvodnja zunajceličnega matriksa] (Patricija Miklavc, Benjamin Malovrh, Vid Modic) 
3. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_kompetitivnih_inhibitorjev] (Ajda Godec,Liza Ulčakar,Luka Gnidovec) 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz (Alen Šadl, Bor Klančnik, Andrej Špenko) 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme (Nika Boštic, Tadej Medved, Sonja Gabrijelčič) 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) (Eva Gartner, Neža Blaznik, Tina Zavodnik ) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mateja Špegel, Špela Friškovec Vončina, Anja Truden) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, Anja Tavčar) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Jernej Imperl, Klementina Polanec, Gašper Anton Komatar) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pavleković, Valeriya Musina) 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom (Sanja Stanković, Karin Dobravc Škof, Neža Žerjav ) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev

2019-04-06T22:10:03Z

Ajda Godec:

== STRUKTURA MEMBRANSKEGA RECEPTORJA FhuA IN STRUKTURA FAGA T5 ==

FhuA je protein z maso 78.9 kDa, ki se nahaja v zunanji membrani gram-negativnih bakterij kot je E.coli (sev K-12). Njegova primarna funkcija je transport Fe+3 ionov v celico. Receptor FhuA tvori sodčkasta domena iz 22 antiparalelnih β-trakov, ki so vgrajeni v membrano in iz N-končne globularne domene, ki se zloži v notranjost sodčka ter zakrije večinski del notranjosti le-tega. N-končna globularna domena je sestavljena iz 4-verižnih β-plošč in iz 4 kratkih vijačnic. Globularna domena je vezana tako na sodčkasto domeno kot tudi na hidrofilne zanke usmerjene v zunanji mediju ter je odgovorna za vezavo liganda; hidroksamatnega siderofora – ferikroma, ki veže Fe3+ ione. Razen svoje primarna funkcije, je FhuA tudi receptor za različne fage; T1,T5 in ɸ80 ter za antibiotik albomicin.

Struktura faga T5 je bila določena z uporabo krio-elektronske mikroskopije. Fag T5 uvrščamo v družino fagov Siphoviridae, za predstavnike katere je značilno, da imajo ikozaedrično oblikovano kapsido; ta vsebuje močno zvito, zgoščeno dvojno verižno DNK in rep. Rep predstavlja multiproteinski skupek, ki služi za prepoznavanje površine bakterijskih celic in za prenos genoma v to gostiteljsko celico. Za to družino fagov je značilno, da v strukturi vsebujejo dolg in nekrčljiv rep. Fag T5 ima 250 nm dolg rep, ki se konča s tremi L-oblikovanimi fibrilarnimi strukturami, ki so pritrjene na stožčasto podlago in premočrtno centralno fibrilo.

== ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE IN INTERAKCIJA MED pb5 in FhuA ==

Specifičnost gostiteljske celice pri procesu okužbe s strani fagov družine Siphoviridae je določena z interakcijo med receptor vezavnim proteinom in specifičnim receptorjem na površini bakterijske celice. Prepoznavanje lahko poteka preko interakcij s saharidnimi ali proteinskimi komponentami receptorja. Ti receptor vezavni proteini se nahajajo na konici centralne fibrile v repu. To interakcijo pogosto zaznamuje dvostopenjski proces; v prvi fazi se fag reverzibilno adsorbira na receptorje z nizko vezavno afiniteto, kasneje pa se ireverzibilno veže na sekundarna mesta v receptorju. Interakcija receptor vezavni protein-receptor sproži konformacijske spremembe v strukturi repa, kar povzroči, da se kapsida odpre, pri tem se razpre zunanja membrana bakterije. Ob tem se DNK faga prenese preko repa skozi bakterijsko ovojnico v notranjost celice. Proces prepoznavanja v primeru faga T5 se prične z reverzibilno vezavo L-oblikovane proteinske niti na O-antigen lipopolisaharidne komponente. Nato se fag ireverzibilno veže na zunanji del ferikromskega transporterja FhuA z receptor vezavnim proteinom pb5.

Različne raziskave ''in vivo'' ter ''in vitro'' predpostavljajo naslednji mehanizem infekcije : v prvi stopnji se fag T5 reverzibilno veže s proteinom pb1 (ta sestavlja del L-oblikovane fibrile) na polimanozni O-antigen in pospeši hitrost vezave pb5 na FhuA. Nato protein pb2 (del centralne fibrile) se veže na površino bakterije. Ta interakcija ne vključuje sodelovanja specifičnih membranskih receptorjev. Centralna premočrtna fibrila se nato usidra v bakterijsko zunanjo membrano, dokler pb5 ne interagira s FhuA. Ta interakcija povzroči sprostitev DNK iz kapside. DNK se nato prenese v notranjost celice preko kanalčka, ki nastane iz proteina pb2. Kanalček sega od zunanje membrane, periplazme do citoplazemske membrane. Tak kanalček zaščiti DNK pred delovanjem periplazemskih nukleaz.

== MIKROCINI ==

Bakterije morajo znotraj svoje niše med seboj tekmovati za vire hranil in prostor. Izdelava “orožja” proti drugim bakterijam je torej zelo pomembna za njihovo preživetje. Ena izmed zelo razširjenih taktik tekmovanja med bakterijami je tvorba bakteriocinov. To so antimikrobni peptidi, ki delujejo kot toksini, saj zavirajo rast podobnih oziroma filogenetsko sorodnih bakterijskih sevov (tako na primer, E. coli izloča mikrocine, ki napadajo le seve E. coli). Sintetizirajo se, ko v okolju primanjkuje hranil in bakterije stradajo. Mikrocini so bakteriocini s kratkim aminokislinskim zaporedjem. Izločajo jih enterobakterije, to so Gram-negativni bacili, ki so v naravi zelo razširjeni, prav tako pa so del črevesne flore (kar pove že ime). Njihov zapis se nahaja na plazmidih. Mikrocine delimo v dva razreda:

* razred I – po translaciji pride do obširnih posttranslacijskih modifikacij, vsebujejo disulfidne mostičke
* razred II – ne prihaja do posttranslacijskih modifikacij

== STRUKTURA MIKROCINA J25 ==

V prvi razred mikrocinov sodi tudi mikrocin J25 (MccJ25). Sestavljen je iz 21 aminokislinskih ostankov, odlikuje pa ga zanimivo zvitje, ki je sicer med peptidi zelo redko. Sprva je veljalo mnenje, da ima v celoti ciklično strukturo, nedavne raziskave pa so pokazale, da se po translaciji zvije v strukturo, ki spominja na laso. N-konec peptida je v obliki makrolaktamskega obroča, ki ga tvorita aminokislinska ostanka Gly1 in Glu8, pri čemer aminska skupina iz glicina tvori peptidno vez s karboksilno skupino stranske skupine glutamata. Peptid se nato nadaljuje v β-lasnično zanko (dva antiparalelna β-trakova povezana z zanko, ki jo tvorita Val11 in Pro16), ki jo tvorijo aminokislinski ostanki 9-18. C-konec mikrocina (t.i. rep) prehaja skozi obroč, kar je sicer entropijsko zelo neugodno, zato je tako zvitje med peptidi zelo redko. V primeru J25 pa je taka struktura celo zelo stabilna – dva aminokislinska ostanka z aromatskimi stranskimi skupinami, Phe19 in Tyr20, vsak iz ene strani “sidrata” C-konec v makrolaktamski obroč. Ker sta stranski skupini teh ostankov tako veliki, prihaja do steričnega oviranja z obročem, zato rep ne more "pobegniti". Sterična stabilizacija je tako močna, da je J25 odporen celo proti večini proteaz in visokim temperaturam. V močno kislem mediju in ob delovanju endopeptidaz se cepi le β-lasnična zanka, ne pa tudi obroč (rep ostane ujet).

== DELOVANJE MIKROCINA J25 ==

Mikrocin J25 je toksičen le za rod Salmonella in seve vrste E. coli. Rast celic zavre tako, da preide v celico, kje deluje kot inhibitor RNA-polimeraze. Za inhibicijo je pomemben makrolaktamski obroč, ki kot čep zamaši kanal v polimerazi, ki usmerja ustrezne ribonukleozid trifosfate na aktivno mesto.Za prehod skozi celični membrani Gram-negativnih bakterij J25 izkorišča receptor za železo v zunanji membrani; FhuA in z njim sklopljen kompleks TonB–ExbB–ExbD (na receptorju pravzaprav parazitira). To so pokazali številni eksperimenti, pri katerih so v E. coli z delecijo gena za FhuA vnesli plazmid z zapisom za FhuA iz E. coli ali rodu Salmonella. Bakterije brez receptorja so bile odporne na mikrocin J25, po vnosu plazmida pa so nanj postale občutljive.

Ker je železo slabo topno, prehaja skozi receptor v obliki ferikroma, ki po obliki niti malo ne spominja na mikrocin J25, zatorej vezava mikrocina na receptor ni samoumevna. Kako se torej mikrocin veže na FhuA? Primerjava kristalnih struktur kompleksov FhuA-ferikrom in FhuA-J25 je pokazala, da se oba liganda v receptor vežeta na podobnem mestu. Pri tem ferikrom tvori veliko vodikovih vezi z N-globularno domeno FhuA, ki deluje kot zamašek, MccJ25 pa s to domeno tvori le dve vodikovi vezi. Ta podatek nakazuje na to, da za vezavo na receptor FhuA ni potrebna dobra ohranjenost liganda, kar razloži tudi vezavo MccJ25, čeprav je le-ta po strukturi zelo različen od primarnega liganda.

Opravljene so bile tudi številne raziskave, ki so identificirale ostanke na MccJ25, ki so pomembni za vezavo na receptor. Že sama poravnava strukture nevezanega mikrocina (struktura pridobljena z NMR), s strukturo na receptor vezanega mikrocina (struktura, pridobljena z rentgensko kristalografijo) je pokazala, da pride ob vezavi mikrocina do obširne konformacijske spremembe v predelu β-lasnične zanke, medtem ko ostane struktura laktamskega obroča nespremenjena. Iz tega so sklepali, da je za vezavo najpomembnejša lasnična regija. Raziskava, ki je to potrdila, je temeljila na razgradnji te zanke s termolizinom (cepitev vezi med Val11 in Phe16). Izvedena je bila serija poskusov z bakteriofagom T5, ti pa so opisani v nadaljevanju.

== POSKUSI O VPLIVIH VEZAVE MIKROCINA J25 NA RECEPTOR RhuA NA VEZAVO FAGA T5 ==

S serijo poskusov z bakteriofagom T5 in mikrocinom MccJ25 (oz. t-MccJ25) so v raziskavi želeli dokazati vpliv vezave MccJ25 na receptor FhuA na vezavo faga.V prvem poskusu so raziskovalci preverjali inhibicijo bakterijske infekcije s fagom T5 v prisotnosti mikrocina. Suspenzijo E. Coli (sev W3110) v eksponentni fazi rasti so prenesli na medij. Bakterijam so dodali raztopino MccJ25 ali t-MccJ25 v metanolu in jih nato inkubirali na sobni temperaturi. Dodali so fag T5 in po stresanju in inkubaciji pri 37°C 120 minut z merjenjem absorbance pri 620 nm nadzorovali stopnjo lize bakterij. Izvedena sta bila dva kontrolna poskusa in sicer v prisotnosti faga T5 brez mikrocina in pa z mikrocinom brez faga (kontrola rasti).Rezultati kontrole rasti so pokazali, da MccJ25 in t-MccJ25 v koncentracijah do 10μM sama bistveno ne vplivata na rast bakterij. V odsotnosti MccJ25 je liza bakterij nastopila 50 minut po dodatki faga T5. Dodatek MccJ25 je lizo inhibiral, učinek pa je bil odvisen od koncentracije dodanega mikrocina. Hitrost rasti bakterij je dosegla svojo prvotno vrednost (vrednost brez dodanega faga) ob dodatku 10μM raztopine mikrocina. t-MccJ25 ni inhibiral lize bakterij.

Da bi preverili, če do inhibicije lize pride zaradi kompetitivne adsorpcije mikrocina na bakterijo, so pri drugem poskusu opazovali vpliv mikrocina na adsorpcijo faga T5 na E. Coli. Ponovno so raztopino bakterij v eksponentni fazi rasti prenesli na medij in jih inkubirali pri sobi temperaturi z MccJ25 oz. s t-MccJ25. Za kontrolni poskus so raztopini bakterij dodali le topilo brez mikrocina (50% acetonitril). Po prvi inkubaciji so dodali fag T5 in inkubirali še 15 minut. S centrifugiranjem so nato odstranili adsorbirane fage ter določili število neadsorbiranih virusov. Delež adsorbiranih fagov se je zmanjšal iz 80% pri 0,1μM koncentraciji na 15% pri 5μM koncentraciji MccJ25. t-Mccj25 ni imel vpliva na adsorpcijo faga.

Da bi dokazali, da je v prisotnosti mikrocina MccJ25 res inhibirana vezava na receptor FhuA so v pufru 10 minut inkubirali FhuA in mikrocin [MccJ25 (50nM-3,1μM) oz. t-Mccj25 (3,1μM)], prisoten pa je bil še fluorescentni markerjem za DNA. Po inkubaciji so v vsak vzorec dodali fag T5 in opazovali injekcijo DNA v raztopino. Že v prejšnjih raziskavah je bilo dokazano, da bakteriofag ob vezavi na FhuA receptor injicira DNA v raztopino, zaradi česar lahko ob prisotnosti fluorescentnega markerja merimo fluorescenco.
Rezultati so pokazali, da se z višanjem koncentracije mikrocina MccJ25 fluorescenca manjša. Izračunano je bilo 55% zmanjšanje adsorpcije faga (iz 100% na 45%) pri višanju koncentracije iz 0,1-3,2μM mikrocina. t-MccJ25 ponovno ni imel učinka na injekcijo DNK faga.
Iz vseh eksperimentov lahko sklepamo, da je mikrocin MccJ25 res kompetitivni inhibitor receptorja FhuA in tekmuje za vezavno mesto z bakteriofagom T5. Prav tako je razvidno, da termična cepitev zanke v strukturi t-MccJ25 bistveno vpliva na interakcijo s FhuA receptorjem.

== VIRI IN LITERATURA ==

* Rebuffat, S. Microcins in action: amazing defence strategies of Enterobacteria, Biochemical Society Transactions, 2012, Vol. 40, part 6 str. 1456 -1462

*Mathavan, I., Zirah, S., Mehmood, S., Choudhury, H. G., Goulard, C., Li, Y.,Beis, K.,Structural basis for hijacking siderophore receptors by antimicrobial lasso peptides. Nature chemical biology,2014, Vol 10 issue 5, 340–342. doi:10.1038/nchembio.1499

* Volkmar Braun, FhuA (TonA), the Career of a Protein, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, June 2009, p. 3431–3436 Vol. 191, No. 11 0021-9193/09/$08.00_0 doi:10.1128/JB.00106-09

* Flayhan, Ali; Wien, Frank; Paternostre, Maïté; Boulanger, Pasc , New insights into pb5, the receptor binding protein of bacteriop, Biochimie Vol. 94 issue 9 2012 , doi :10.1016_j.biochi.2012.05.021

* Destoumieux-Garzón, Delphine; Duquesne, Sophie; Peduzzi, Jean, The iron–siderophore transporter FhuA is the receptor for the antimicrobial peptide microcin J25: role of the microcin Val11–Pro16 β-hairpin region in the recognition mechanism, Biochemical Journal, Vol. 389 issue 3 2005, doi: 10.1042_bj20042107

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev

2019-04-06T22:08:21Z

Ajda Godec: /* ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJA IN INTERAKCIJA MED pb5 in FhuA */

== STRUKTURA MEMBRANSKEGA RECEPTORJA FhuA IN STRUKTURA FAGA T5 ==

FhuA je protein z maso 78.9 kDa, ki se nahaja v zunanji membrani gram-negativnih bakterij kot je E.coli (sev K-12). Njegova primarna funkcija je transport Fe+3 ionov v celico. Receptor FhuA tvori sodčkasta domena iz 22 antiparalelnih β-trakov, ki so vgrajeni v membrano in iz N-končne globularne domene, ki se zloži v notranjost sodčka ter zakrije večinski del notranjosti le-tega. N-končna globularna domena je sestavljena iz 4-verižnih β-plošč in iz 4 kratkih vijačnic. Globularna domena je vezana tako na sodčkasto domeno kot tudi na hidrofilne zanke usmerjene v zunanji mediju ter je odgovorna za vezavo liganda; hidroksamatnega siderofora – ferikroma, ki veže Fe3+ ione. Razen svoje primarna funkcije, je FhuA tudi receptor za različne fage; T1,T5 in ɸ80 ter za antibiotik albomicin.

Struktura faga T5 je bila določena z uporabo krio-elektronske mikroskopije. Fag T5 uvrščamo v družino fagov Siphoviridae, za predstavnike katere je značilno, da imajo ikozaedrično oblikovano kapsido; ta vsebuje močno zvito, zgoščeno dvojno verižno DNK in rep. Rep predstavlja multiproteinski skupek, ki služi za prepoznavanje površine bakterijskih celic in za prenos genoma v to gostiteljsko celico. Za to družino fagov je značilno, da v strukturi vsebujejo dolg in nekrčljiv rep. Fag T5 ima 250 nm dolg rep, ki se konča s tremi L-oblikovanimi fibrilarnimi strukturami, ki so pritrjene na stožčasto podlago in premočrtno centralno fibrilo.

== ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE IN INTERAKCIJA MED pb5 in FhuA ==

Specifičnost gostiteljske celice pri procesu okužbe s strani fagov družine Siphoviridae je določena z interakcijo med receptor vezavnim proteinom in specifičnim receptorjem na površini bakterijske celice. Prepoznavanje lahko poteka preko interakcij s saharidnimi ali proteinskimi komponentami receptorja. Ti receptor vezavni proteini se nahajajo na konici centralne fibrile v repu. To interakcijo pogosto zaznamuje dvostopenjski proces; v prvi fazi se fag reverzibilno adsorbira na receptorje z nizko vezavno afiniteto, kasneje pa se ireverzibilno veže na sekundarna mesta v receptorju. Interakcija receptor vezavni protein-receptor sproži konformacijske spremembe v strukturi repa, kar povzroči, da se kapsida odpre, pri tem se razpre zunanja membrana bakterije. Ob tem se DNK faga prenese preko repa skozi bakterijsko ovojnico v notranjost celice. Proces prepoznavanja v primeru faga T5 se prične z reverzibilno vezavo L-oblikovane proteinske niti na O-antigen lipopolisaharidne komponente. Nato se fag ireverzibilno veže na zunanji del ferikromskega transporterja FhuA z receptor vezavnim proteinom pb5.

Različne raziskave ''in vivo'' ter ''in vitro'' predpostavljajo naslednji mehanizem infekcije : v prvi stopnji se fag T5 reverzibilno veže s proteinom pb1 (ta sestavlja del L-oblikovane fibrile) na polimanozni O-antigen in pospeši hitrost vezave pb5 na FhuA. Nato protein pb2 (del centralne fibrile) se veže na površino bakterije. Ta interakcija ne vključuje sodelovanja specifičnih membranskih receptorjev. Centralna premočrtna fibrila se nato usidra v bakterijsko zunanjo membrano, dokler pb5 ne interagira s FhuA. Ta interakcija povzroči sprostitev DNK iz kapside. DNK se nato prenese v notranjost celice preko kanalčka, ki nastane iz proteina pb2. Kanalček sega od zunanje membrane, periplazme do citoplazemske membrane. Tak kanalček zaščiti DNK pred delovanjem periplazemskih nukleaz.

== MIKROCINI ==

Bakterije morajo znotraj svoje niše med seboj tekmovati za vire hranil in prostor. Izdelava “orožja” proti drugim bakterijam je torej zelo pomembna za njihovo preživetje. Ena izmed zelo razširjenih taktik tekmovanja med bakterijami je tvorba bakteriocinov. To so antimikrobni peptidi, ki delujejo kot toksini, saj zavirajo rast podobnih oziroma filogenetsko sorodnih bakterijskih sevov (tako na primer, E. coli izloča mikrocine, ki napadajo le seve E. coli). Sintetizirajo se, ko v okolju primanjkuje hranil in bakterije stradajo. Mikrocini so bakteriocini s kratkim aminokislinskim zaporedjem. Izločajo jih enterobakterije, to so Gram-negativni bacili, ki so v naravi zelo razširjeni, prav tako pa so del črevesne flore (kar pove že ime). Njihov zapis se nahaja na plazmidih. Mikrocine delimo v dva razreda:

* razred I – po translaciji pride do obširnih posttranslacijskih modifikacij, vsebujejo disulfidne mostičke
* razred II – ne prihaja do posttranslacijskih modifikacij

== STRUKTURA MIKROCINA J25 ==

V prvi razred mikrocinov sodi tudi mikrocin J25 (MccJ25). Sestavljen je iz 21 aminokislinskih ostankov, odlikuje pa ga zanimivo zvitje, ki je sicer med peptidi zelo redko. Sprva je veljalo mnenje, da ima v celoti ciklično strukturo, nedavne raziskave pa so pokazale, da se po translaciji zvije v strukturo, ki spominja na laso. N-konec peptida je v obliki makrolaktamskega obroča, ki ga tvorita aminokislinska ostanka Gly1 in Glu8, pri čemer aminska skupina iz glicina tvori peptidno vez s karboksilno skupino stranske skupine glutamata. Peptid se nato nadaljuje v β-lasnično zanko (dva antiparalelna β-trakova povezana z zanko, ki jo tvorita Val11 in Pro16), ki jo tvorijo aminokislinski ostanki 9-18. C-konec mikrocina (t.i. rep) prehaja skozi obroč, kar je sicer entropijsko zelo neugodno, zato je tako zvitje med peptidi zelo redko. V primeru J25 pa je taka struktura celo zelo stabilna – dva aminokislinska ostanka z aromatskimi stranskimi skupinami, Phe19 in Tyr20, vsak iz ene strani “sidrata” C-konec v makrolaktamski obroč. Ker sta stranski skupini teh ostankov tako veliki, prihaja do steričnega oviranja z obročem, zato rep ne more "pobegniti". Sterična stabilizacija je tako močna, da je J25 odporen celo proti večini proteaz in visokim temperaturam. V močno kislem mediju in ob delovanju endopeptidaz se cepi le β-lasnična zanka, ne pa tudi obroč (rep ostane ujet).

== DELOVANJE MIKROCINA J25 ==

Mikrocin J25 je toksičen le za rod Salmonella in seve vrste E. coli. Rast celic zavre tako, da preide v celico, kje deluje kot inhibitor RNA-polimeraze. Za inhibicijo je pomemben makrolaktamski obroč, ki kot čep zamaši kanal v polimerazi, ki usmerja ustrezne ribonukleozid trifosfate na aktivno mesto.Za prehod skozi celični membrani Gram-negativnih bakterij J25 izkorišča receptor za železo v zunanji membrani; FhuA in z njim sklopljen kompleks TonB–ExbB–ExbD (na receptorju pravzaprav parazitira). To so pokazali številni eksperimenti, pri katerih so v E. coli z delecijo gena za FhuA vnesli plazmid z zapisom za FhuA iz E. coli ali rodu Salmonella. Bakterije brez receptorja so bile odporne na mikrocin J25, po vnosu plazmida pa so nanj postale občutljive.

Ker je železo slabo topno, prehaja skozi receptor v obliki ferikroma, ki po obliki niti malo ne spominja na mikrocin J25, zatorej vezava mikrocina na receptor ni samoumevna. Kako se torej mikrocin veže na FhuA? Primerjava kristalnih struktur kompleksov FhuA-ferikrom in FhuA-J25 je pokazala, da se oba liganda v receptor vežeta na podobnem mestu. Pri tem ferikrom tvori veliko vodikovih vezi z N-globularno domeno FhuA, ki deluje kot zamašek, MccJ25 pa s to domeno tvori le dve vodikovi vezi. Ta podatek nakazuje na to, da za vezavo na receptor FhuA ni potrebna dobra ohranjenost liganda, kar razloži tudi vezavo MccJ25, čeprav je le-ta po strukturi zelo različen od primarnega liganda.

Opravljene so bile tudi številne raziskave, ki so identificirale ostanke na MccJ25, ki so pomembni za vezavo na receptor. Že sama poravnava strukture nevezanega mikrocina (struktura pridobljena z NMR), s strukturo na receptor vezanega mikrocina (struktura, pridobljena z rentgensko kristalografijo) je pokazala, da pride ob vezavi mikrocina do obširne konformacijske spremembe v predelu β-lasnične zanke, medtem ko ostane struktura laktamskega obroča nespremenjena. Iz tega so sklepali, da je za vezavo najpomembnejša lasnična regija. Raziskava, ki je to potrdila, je temeljila na razgradnji te zanke s termolizinom (cepitev vezi med Val11 in Phe16). Izvedena je bila serija poskusov z bakteriofagom T5, ti pa so opisani v nadaljevanju.

== POSKUSI O VPLIVIH VEZAVE MIKROCINA J25 NA RECEPTOR RhuA NA VEZAVO FAGA T5 ==

S serijo poskusov z bakteriofagom T5 in mikrocinom MccJ25 (oz. t-MccJ25) so v raziskavi želeli dokazati vpliv vezave MccJ25 na receptor FhuA na vezavo faga.V prvem poskusu so raziskovalci preverjali inhibicijo bakterijske infekcije s fagom T5 v prisotnosti mikrocina. Suspenzijo E. Coli (sev W3110) v eksponentni fazi rasti so prenesli na medij. Bakterijam so dodali raztopino MccJ25 ali t-MccJ25 v metanolu in jih nato inkubirali na sobni temperaturi. Dodali so fag T5 in po stresanju in inkubaciji pri 37°C 120 minut z merjenjem absorbance pri 620 nm nadzorovali stopnjo lize bakterij. Izvedena sta bila dva kontrolna poskusa in sicer v prisotnosti faga T5 brez mikrocina in pa z mikrocinom brez faga (kontrola rasti).Rezultati kontrole rasti so pokazali, da MccJ25 in t-MccJ25 v koncentracijah do 10μM sama bistveno ne vplivata na rast bakterij. V odsotnosti MccJ25 je liza bakterij nastopila 50 minut po dodatki faga T5. Dodatek MccJ25 je lizo inhibiral, učinek pa je bil odvisen od koncentracije dodanega mikrocina. Hitrost rasti bakterij je dosegla svojo prvotno vrednost (vrednost brez dodanega faga) ob dodatku 10μM raztopine mikrocina. t-MccJ25 ni inhibiral lize bakterij.

Da bi preverili, če do inhibicije lize pride zaradi kompetitivne adsorpcije mikrocina na bakterijo, so pri drugem poskusu opazovali vpliv mikrocina na adsorpcijo faga T5 na E. Coli. Ponovno so raztopino bakterij v eksponentni fazi rasti prenesli na medij in jih inkubirali pri sobi temperaturi z MccJ25 oz. s t-MccJ25. Za kontrolni poskus so raztopini bakterij dodali le topilo brez mikrocina (50% acetonitril). Po prvi inkubaciji so dodali fag T5 in inkubirali še 15 minut. S centrifugiranjem so nato odstranili adsorbirane fage ter določili število neadsorbiranih virusov. Delež adsorbiranih fagov se je zmanjšal iz 80% pri 0,1μM koncentraciji na 15% pri 5μM koncentraciji MccJ25. t-Mccj25 ni imel vpliva na adsorpcijo faga.

Da bi dokazali, da je v prisotnosti mikrocina MccJ25 res inhibirana vezava na receptor FhuA so v pufru 10 minut inkubirali FhuA in mikrocin [MccJ25 (50nM-3,1μM) oz. t-Mccj25 (3,1μM)], prisoten pa je bil še fluorescentni markerjem za DNA. Po inkubaciji so v vsak vzorec dodali fag T5 in opazovali injekcijo DNA v raztopino. Že v prejšnjih raziskavah je bilo dokazano, da bakteriofag ob vezavi na FhuA receptor injicira DNA v raztopino, zaradi česar lahko ob prisotnosti fluorescentnega markerja merimo fluorescenco.
Rezultati so pokazali, da se z višanjem koncentracije mikrocina MccJ25 fluorescenca manjša. Izračunano je bilo 55% zmanjšanje adsorpcije faga (iz 100% na 45%) pri višanju koncentracije iz 0,1-3,2μM mikrocina. t-MccJ25 ponovno ni imel učinka na injekcijo DNK faga.
Iz vseh eksperimentov lahko sklepamo, da je mikrocin MccJ25 res kompetitivni inhibitor receptorja FhuA in tekmuje za vezavno mesto z bakteriofagom T5. Prav tako je razvidno, da termična cepitev zanke v strukturi t-MccJ25 bistveno vpliva na interakcijo s FhuA receptorjem.

== VIRI IN LITERATURA ==

* Rebuffat, S. Microcins in action: amazing defence strategies of Enterobacteria, Biochemical Society Transactions, 2012, Vol. 40, part 6 str. 1456 -1462

*Mathavan, I., Zirah, S., Mehmood, S., Choudhury, H. G., Goulard, C., Li, Y.,Beis, K.,Structural basis for hijacking siderophore receptors by antimicrobial lasso peptides. Nature chemical biology,2014, Vol 10 issue 5, 340–342. doi:10.1038/nchembio.1499

* Volkmar Braun, FhuA (TonA), the Career of a Protein, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, June 2009, p. 3431–3436 Vol. 191, No. 11 0021-9193/09/$08.00_0 doi:10.1128/JB.00106-09

* Flayhan, Ali; Wien, Frank; Paternostre, Maïté; Boulanger, Pasc , New insights into pb5, the receptor binding protein of bacteriop, Biochimie Vol. 94 issue 9 2012 , doi :10.1016_j.biochi.2012.05.021

* Destoumieux-Garzón, Delphine; Duquesne, Sophie; Peduzzi, Jean, The iron–siderophore transporter FhuA is the receptor for the antimicrobial peptide microcin J25: role of the microcin Val11–Pro16 β-hairpin region in the recognition mechanism, Biochemical Journal, Vol. 389 issue 3 2005, doi: 10.1042_bj20042107

Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev

2019-04-06T22:07:43Z

Ajda Godec: New page: == STRUKTURA MEMBRANSKEGA RECEPTORJA FhuA IN STRUKTURA FAGA T5 == FhuA je protein z maso 78.9 kDa, ki se nahaja v zunanji membrani gram-negativnih bakterij kot je E.coli (sev K-12). Njeg...

== STRUKTURA MEMBRANSKEGA RECEPTORJA FhuA IN STRUKTURA FAGA T5 ==

FhuA je protein z maso 78.9 kDa, ki se nahaja v zunanji membrani gram-negativnih bakterij kot je E.coli (sev K-12). Njegova primarna funkcija je transport Fe+3 ionov v celico. Receptor FhuA tvori sodčkasta domena iz 22 antiparalelnih β-trakov, ki so vgrajeni v membrano in iz N-končne globularne domene, ki se zloži v notranjost sodčka ter zakrije večinski del notranjosti le-tega. N-končna globularna domena je sestavljena iz 4-verižnih β-plošč in iz 4 kratkih vijačnic. Globularna domena je vezana tako na sodčkasto domeno kot tudi na hidrofilne zanke usmerjene v zunanji mediju ter je odgovorna za vezavo liganda; hidroksamatnega siderofora – ferikroma, ki veže Fe3+ ione. Razen svoje primarna funkcije, je FhuA tudi receptor za različne fage; T1,T5 in ɸ80 ter za antibiotik albomicin.

Struktura faga T5 je bila določena z uporabo krio-elektronske mikroskopije. Fag T5 uvrščamo v družino fagov Siphoviridae, za predstavnike katere je značilno, da imajo ikozaedrično oblikovano kapsido; ta vsebuje močno zvito, zgoščeno dvojno verižno DNK in rep. Rep predstavlja multiproteinski skupek, ki služi za prepoznavanje površine bakterijskih celic in za prenos genoma v to gostiteljsko celico. Za to družino fagov je značilno, da v strukturi vsebujejo dolg in nekrčljiv rep. Fag T5 ima 250 nm dolg rep, ki se konča s tremi L-oblikovanimi fibrilarnimi strukturami, ki so pritrjene na stožčasto podlago in premočrtno centralno fibrilo.

== ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJA IN INTERAKCIJA MED pb5 in FhuA ==

Specifičnost gostiteljske celice pri procesu okužbe s strani fagov družine Siphoviridae je določena z interakcijo med receptor vezavnim proteinom in specifičnim receptorjem na površini bakterijske celice. Prepoznavanje lahko poteka preko interakcij s saharidnimi ali proteinskimi komponentami receptorja. Ti receptor vezavni proteini se nahajajo na konici centralne fibrile v repu. To interakcijo pogosto zaznamuje dvostopenjski proces; v prvi fazi se fag reverzibilno adsorbira na receptorje z nizko vezavno afiniteto, kasneje pa se ireverzibilno veže na sekundarna mesta v receptorju. Interakcija receptor vezavni protein-receptor sproži konformacijske spremembe v strukturi repa, kar povzroči, da se kapsida odpre, pri tem se razpre zunanja membrana bakterije. Ob tem se DNK faga prenese preko repa skozi bakterijsko ovojnico v notranjost celice. Proces prepoznavanja v primeru faga T5 se prične z reverzibilno vezavo L-oblikovane proteinske niti na O-antigen lipopolisaharidne komponente. Nato se fag ireverzibilno veže na zunanji del ferikromskega transporterja FhuA z receptor vezavnim proteinom pb5.

Različne raziskave ''in vivo'' ter ''in vitro'' predpostavljajo naslednji mehanizem infekcije : v prvi stopnji se fag T5 reverzibilno veže s proteinom pb1 (ta sestavlja del L-oblikovane fibrile) na polimanozni O-antigen in pospeši hitrost vezave pb5 na FhuA. Nato protein pb2 (del centralne fibrile) se veže na površino bakterije. Ta interakcija ne vključuje sodelovanja specifičnih membranskih receptorjev. Centralna premočrtna fibrila se nato usidra v bakterijsko zunanjo membrano, dokler pb5 ne interagira s FhuA. Ta interakcija povzroči sprostitev DNK iz kapside. DNK se nato prenese v notranjost celice preko kanalčka, ki nastane iz proteina pb2. Kanalček sega od zunanje membrane, periplazme do citoplazemske membrane. Tak kanalček zaščiti DNK pred delovanjem periplazemskih nukleaz.

== MIKROCINI ==

Bakterije morajo znotraj svoje niše med seboj tekmovati za vire hranil in prostor. Izdelava “orožja” proti drugim bakterijam je torej zelo pomembna za njihovo preživetje. Ena izmed zelo razširjenih taktik tekmovanja med bakterijami je tvorba bakteriocinov. To so antimikrobni peptidi, ki delujejo kot toksini, saj zavirajo rast podobnih oziroma filogenetsko sorodnih bakterijskih sevov (tako na primer, E. coli izloča mikrocine, ki napadajo le seve E. coli). Sintetizirajo se, ko v okolju primanjkuje hranil in bakterije stradajo. Mikrocini so bakteriocini s kratkim aminokislinskim zaporedjem. Izločajo jih enterobakterije, to so Gram-negativni bacili, ki so v naravi zelo razširjeni, prav tako pa so del črevesne flore (kar pove že ime). Njihov zapis se nahaja na plazmidih. Mikrocine delimo v dva razreda:

* razred I – po translaciji pride do obširnih posttranslacijskih modifikacij, vsebujejo disulfidne mostičke
* razred II – ne prihaja do posttranslacijskih modifikacij

== STRUKTURA MIKROCINA J25 ==

V prvi razred mikrocinov sodi tudi mikrocin J25 (MccJ25). Sestavljen je iz 21 aminokislinskih ostankov, odlikuje pa ga zanimivo zvitje, ki je sicer med peptidi zelo redko. Sprva je veljalo mnenje, da ima v celoti ciklično strukturo, nedavne raziskave pa so pokazale, da se po translaciji zvije v strukturo, ki spominja na laso. N-konec peptida je v obliki makrolaktamskega obroča, ki ga tvorita aminokislinska ostanka Gly1 in Glu8, pri čemer aminska skupina iz glicina tvori peptidno vez s karboksilno skupino stranske skupine glutamata. Peptid se nato nadaljuje v β-lasnično zanko (dva antiparalelna β-trakova povezana z zanko, ki jo tvorita Val11 in Pro16), ki jo tvorijo aminokislinski ostanki 9-18. C-konec mikrocina (t.i. rep) prehaja skozi obroč, kar je sicer entropijsko zelo neugodno, zato je tako zvitje med peptidi zelo redko. V primeru J25 pa je taka struktura celo zelo stabilna – dva aminokislinska ostanka z aromatskimi stranskimi skupinami, Phe19 in Tyr20, vsak iz ene strani “sidrata” C-konec v makrolaktamski obroč. Ker sta stranski skupini teh ostankov tako veliki, prihaja do steričnega oviranja z obročem, zato rep ne more "pobegniti". Sterična stabilizacija je tako močna, da je J25 odporen celo proti večini proteaz in visokim temperaturam. V močno kislem mediju in ob delovanju endopeptidaz se cepi le β-lasnična zanka, ne pa tudi obroč (rep ostane ujet).

== DELOVANJE MIKROCINA J25 ==

Mikrocin J25 je toksičen le za rod Salmonella in seve vrste E. coli. Rast celic zavre tako, da preide v celico, kje deluje kot inhibitor RNA-polimeraze. Za inhibicijo je pomemben makrolaktamski obroč, ki kot čep zamaši kanal v polimerazi, ki usmerja ustrezne ribonukleozid trifosfate na aktivno mesto.Za prehod skozi celični membrani Gram-negativnih bakterij J25 izkorišča receptor za železo v zunanji membrani; FhuA in z njim sklopljen kompleks TonB–ExbB–ExbD (na receptorju pravzaprav parazitira). To so pokazali številni eksperimenti, pri katerih so v E. coli z delecijo gena za FhuA vnesli plazmid z zapisom za FhuA iz E. coli ali rodu Salmonella. Bakterije brez receptorja so bile odporne na mikrocin J25, po vnosu plazmida pa so nanj postale občutljive.

Ker je železo slabo topno, prehaja skozi receptor v obliki ferikroma, ki po obliki niti malo ne spominja na mikrocin J25, zatorej vezava mikrocina na receptor ni samoumevna. Kako se torej mikrocin veže na FhuA? Primerjava kristalnih struktur kompleksov FhuA-ferikrom in FhuA-J25 je pokazala, da se oba liganda v receptor vežeta na podobnem mestu. Pri tem ferikrom tvori veliko vodikovih vezi z N-globularno domeno FhuA, ki deluje kot zamašek, MccJ25 pa s to domeno tvori le dve vodikovi vezi. Ta podatek nakazuje na to, da za vezavo na receptor FhuA ni potrebna dobra ohranjenost liganda, kar razloži tudi vezavo MccJ25, čeprav je le-ta po strukturi zelo različen od primarnega liganda.

Opravljene so bile tudi številne raziskave, ki so identificirale ostanke na MccJ25, ki so pomembni za vezavo na receptor. Že sama poravnava strukture nevezanega mikrocina (struktura pridobljena z NMR), s strukturo na receptor vezanega mikrocina (struktura, pridobljena z rentgensko kristalografijo) je pokazala, da pride ob vezavi mikrocina do obširne konformacijske spremembe v predelu β-lasnične zanke, medtem ko ostane struktura laktamskega obroča nespremenjena. Iz tega so sklepali, da je za vezavo najpomembnejša lasnična regija. Raziskava, ki je to potrdila, je temeljila na razgradnji te zanke s termolizinom (cepitev vezi med Val11 in Phe16). Izvedena je bila serija poskusov z bakteriofagom T5, ti pa so opisani v nadaljevanju.

== POSKUSI O VPLIVIH VEZAVE MIKROCINA J25 NA RECEPTOR RhuA NA VEZAVO FAGA T5 ==

S serijo poskusov z bakteriofagom T5 in mikrocinom MccJ25 (oz. t-MccJ25) so v raziskavi želeli dokazati vpliv vezave MccJ25 na receptor FhuA na vezavo faga.V prvem poskusu so raziskovalci preverjali inhibicijo bakterijske infekcije s fagom T5 v prisotnosti mikrocina. Suspenzijo E. Coli (sev W3110) v eksponentni fazi rasti so prenesli na medij. Bakterijam so dodali raztopino MccJ25 ali t-MccJ25 v metanolu in jih nato inkubirali na sobni temperaturi. Dodali so fag T5 in po stresanju in inkubaciji pri 37°C 120 minut z merjenjem absorbance pri 620 nm nadzorovali stopnjo lize bakterij. Izvedena sta bila dva kontrolna poskusa in sicer v prisotnosti faga T5 brez mikrocina in pa z mikrocinom brez faga (kontrola rasti).Rezultati kontrole rasti so pokazali, da MccJ25 in t-MccJ25 v koncentracijah do 10μM sama bistveno ne vplivata na rast bakterij. V odsotnosti MccJ25 je liza bakterij nastopila 50 minut po dodatki faga T5. Dodatek MccJ25 je lizo inhibiral, učinek pa je bil odvisen od koncentracije dodanega mikrocina. Hitrost rasti bakterij je dosegla svojo prvotno vrednost (vrednost brez dodanega faga) ob dodatku 10μM raztopine mikrocina. t-MccJ25 ni inhibiral lize bakterij.

Da bi preverili, če do inhibicije lize pride zaradi kompetitivne adsorpcije mikrocina na bakterijo, so pri drugem poskusu opazovali vpliv mikrocina na adsorpcijo faga T5 na E. Coli. Ponovno so raztopino bakterij v eksponentni fazi rasti prenesli na medij in jih inkubirali pri sobi temperaturi z MccJ25 oz. s t-MccJ25. Za kontrolni poskus so raztopini bakterij dodali le topilo brez mikrocina (50% acetonitril). Po prvi inkubaciji so dodali fag T5 in inkubirali še 15 minut. S centrifugiranjem so nato odstranili adsorbirane fage ter določili število neadsorbiranih virusov. Delež adsorbiranih fagov se je zmanjšal iz 80% pri 0,1μM koncentraciji na 15% pri 5μM koncentraciji MccJ25. t-Mccj25 ni imel vpliva na adsorpcijo faga.

Da bi dokazali, da je v prisotnosti mikrocina MccJ25 res inhibirana vezava na receptor FhuA so v pufru 10 minut inkubirali FhuA in mikrocin [MccJ25 (50nM-3,1μM) oz. t-Mccj25 (3,1μM)], prisoten pa je bil še fluorescentni markerjem za DNA. Po inkubaciji so v vsak vzorec dodali fag T5 in opazovali injekcijo DNA v raztopino. Že v prejšnjih raziskavah je bilo dokazano, da bakteriofag ob vezavi na FhuA receptor injicira DNA v raztopino, zaradi česar lahko ob prisotnosti fluorescentnega markerja merimo fluorescenco.
Rezultati so pokazali, da se z višanjem koncentracije mikrocina MccJ25 fluorescenca manjša. Izračunano je bilo 55% zmanjšanje adsorpcije faga (iz 100% na 45%) pri višanju koncentracije iz 0,1-3,2μM mikrocina. t-MccJ25 ponovno ni imel učinka na injekcijo DNK faga.
Iz vseh eksperimentov lahko sklepamo, da je mikrocin MccJ25 res kompetitivni inhibitor receptorja FhuA in tekmuje za vezavno mesto z bakteriofagom T5. Prav tako je razvidno, da termična cepitev zanke v strukturi t-MccJ25 bistveno vpliva na interakcijo s FhuA receptorjem.

== VIRI IN LITERATURA ==

* Rebuffat, S. Microcins in action: amazing defence strategies of Enterobacteria, Biochemical Society Transactions, 2012, Vol. 40, part 6 str. 1456 -1462

*Mathavan, I., Zirah, S., Mehmood, S., Choudhury, H. G., Goulard, C., Li, Y.,Beis, K.,Structural basis for hijacking siderophore receptors by antimicrobial lasso peptides. Nature chemical biology,2014, Vol 10 issue 5, 340–342. doi:10.1038/nchembio.1499

* Volkmar Braun, FhuA (TonA), the Career of a Protein, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, June 2009, p. 3431–3436 Vol. 191, No. 11 0021-9193/09/$08.00_0 doi:10.1128/JB.00106-09

* Flayhan, Ali; Wien, Frank; Paternostre, Maïté; Boulanger, Pasc , New insights into pb5, the receptor binding protein of bacteriop, Biochimie Vol. 94 issue 9 2012 , doi :10.1016_j.biochi.2012.05.021

* Destoumieux-Garzón, Delphine; Duquesne, Sophie; Peduzzi, Jean, The iron–siderophore transporter FhuA is the receptor for the antimicrobial peptide microcin J25: role of the microcin Val11–Pro16 β-hairpin region in the recognition mechanism, Biochemical Journal, Vol. 389 issue 3 2005, doi: 10.1042_bj20042107

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-03-08T19:49:20Z

Ajda Godec:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315|pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so (seznam v pripravi):

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. Blokiranje receptorjev za fage (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa (Patricija Miklavc, Benjamin Malovrh) 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev (Ajda Godec,Liza Ulčakar,Luka Gnidovec) 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme (Nika Boštic, Tadej Medved) 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, Anja Tavčar) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Jernej Imperl, Klementina Polanec, ) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pacleković, Valeriya Musina) 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom (Sanja Stanković, ) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

BIO2 Povzetki seminarjev 2018

2018-12-18T12:31:50Z

Ajda Godec: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2018/2019 */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2018/2019 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2018 stran]

===Karmen Mlinar: Signalizacija in odzivi na abiotski stres pri rastlinah===
Rastline živijo v stalno spreminjajočem se okolju, ki je pogosto neugodno in stresno za njihovo rast in razvoj. Primer abiotskega stresa so suša, ekstremne temperature, slanost tal, pomanjkanje hranil v prsti ipd. Rastline lahko stres preživijo tako, da se mu prilagodijo ali pa izognejo. V nasprotnem primeru so obsojene na smrt. Identificiranih je le malo senzorjev, ki zaznavajo stres. Pri signalizaciji odzivov na stresna okolja pogosto sodeluje družina kinaz SnRK, ki zaznajo spremembe v energijskem statusu rastline, ki jih povzroči stres. Znane so tri poddružine SnRKs: SnRK1s, SnRK2s, ki sodelujejo pri osmotskem stresu in ABA signalizaciji, in SnRK3s, ki so ključni regulatorji ionske homeostaze pri spopadanju s solnim stresom. Pri ionskem stresu pogosto problem predstavlja Na+. Pri njegovi signalizaciji je ključna SOS signalna pot. Signalizacija temperaturnega stresa se začne s spremembami v fluidnosti membrane, kar zaznajo integralni membranski proteini. Pri signalizaciji pogosto sodelujejo tudi MAPKs, CPKs in stresni hormon ABA, pomembno vlogo pa nosijo sekundarni sporočevalci kot sta kalcij in ROS. Vse to stremi k vzpostavitvi ionske in vodne homeostaze ter celične stabilnosti v stresnem okolju. Z razumevanjem signalizacije stresa in odzivov, ki sledijo, bomo lahko izboljšali odpornost pridelkov na stres in s tem zagotovili kmetijsko stabilnost in preskrbo s hrano za rastoče svetovno prebivalstvo.

===Aljaž Bratina: Pomen različnih signalnih poti pri staranju===
Staranje je postopna izguba fiziološke integritete in vodi v prizadeto funkcionalnost ter povečano možnost za smrt. Hitremu staranju nasprotna je dolgoživost, to je stanje, v katerem organizem ne izgublja funkcionalnosti ali jo izgublja počasneje. Staranje lahko opredelimo z devetimi splošnimi lastnostmi, ki jih opazimo v večini organizmov. Pri preučevanju staranja opazujemo organizem C. elegans, ki lahko med razvojem v primeru neugodnih razmer razvije stanje dauer, v katerem je razvoj ustavljen in je tako organizem sposoben preživeti dalj časa. Pri regulaciji staranja in dolgoživosti so pomembne mnoge celične signalne poti, kot del njih pa predvsem jedrni receptorji, ki uravnavajo prepisovanje genov, ki imajo vpliv na hitrost staranja oz. vzdrževanje dolgoživosti. V seminarski nalogi so opisane štiri pomembne signalne poti in njihov vpliv na staranje. Pri prvi je pomemben jedrni receptor DAF-12, ki za svoje delovanje potrebuje steroid DA. Neugodne razmere ga deaktivirajo, kar vodi v razvoj stanja dauer. Na dolgoživost pozitivno vpliva tudi aktiviran kompleks NSBP-1 in jedrnega receptorja DAF-16, ki sta del signalne poti IIS. To pot regulira tudi količina holesterola v celici. Dolgoživost povzročajo tudi prekinitveni post, pri katerem se aktivira jedrni receptor AP-1, pa tudi odstranitev zarodnih celic, ki poleg prej omenjene DAF-12 in DAF-16 aktivira tudi nekatere druge receptorje, npr. NHR-80 in NH3-49.

===Eva Gartner: Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi===
Wnt signalizacija zajema skupino signalnih poti, ki jih regulirajo wnt proteini. Ti se vežejo na posebne receptorje v membrani celice, preko katerih se signal prenese v notranjost. Wnt signalizacijo sestavljajo tri glavne signalizacijske poti: kanonična wnt pot, ki vključuje protein β-katenin, nekanonična (PCP) pot in nekanonična pot, ki sodeluje pri regulaciji kalcija. Vse poti se začnejo z vezavo wnt-liganda na transmembranske Fz receptorje in prenosom signala do znotrajceličnega proteina Dsh. Od tu naprej se poti razcepijo vsaka v svojo smer. Wnt signalizacija sodeluje v mnogih procesih, potrebnih za normalen razvoj organizma, kot so npr. razmnoževanje, specializacija in migracije celic. Prisotnost regulacije z wnt signalizacijo so odkrili tudi pri srčni fibrozi in z njo povezanih boleznih in poškodbah srca. V zdravih celicah wnt signalizacija navadno ni prisotna. Izraz fibroza se nanaša na povečanje količine zunajceličnega matriksa, zaradi česar postane srčna mišica otrdela in krčenje manj intenzivno. Pride do prekomerne namnožitve fibroblastov in diferenciacije v miofibroblaste, ki so fenotipsko med fibroblasti in mišičnimi celicami. Kljub številnim raziskavam, ki dokazujejo vpletenost wnt signalizacije v razvoju fibroze, natančni mehanizmi vseh signalnih poti še vedno niso znani. Potrebne so še nadaljnje raziskave za razumevanje zapletene celične komunikacije in odkritje novih terapevtskih možnosti.

===Neža Žerjav: Vloga kaspaz pri celični smrti===
Kaspaze so cisteinske peptidaze, ki sodelujejo v signalnih poteh celične smrti. Poznamo več vrst celične smrti, med njii tudi apoptozo, nekrozo, nekroptozo in piroptozo. Vloga kaspaz pri apoptozi je dobro znana, so adapterski proteini ali pa aktivno sodelujejo pri postopni razgradnji celice, saj sprožijo nastajanje apoptotskih veziklov in fagocitozo celice. Nekrozo označujemo kot neprogramirano celično smrt, vendar to za nekroptozo, ki ji pravimo tudi programirana nekroza, ne drži. Slednja je namreč v celici konkurenčna apoptozi, preko kaspaz sta recipročno regulirani. Nekroptozo kaspaze zavirajo, saj inhibirajo kompleks RIPK1/RIPK3, ki z aktivacijo proteina MLKL povzroči razlitje celične vsebine, značilno za nekrozo. Kaspaze sodelujejo tudi pri piroptozi, ki je posledica stresnih dejavnikov iz okolice – poškodb, patogenih organizmov ali njihovih toksinov. Kaspaze pri piroptozi povzročijo aktivacijo gasdermina D, ki sproži celično lizo, in vnetni odziv. Poznavanje delovanja kaspaz nam omogoča tako vpogled v razvoj in mehanizem vzdrževanja homeostaze organizmov, kakor tudi razumevanje patoloških procesov, na primer multiple in amiotrofične lateralne skleroze, ishemične bolezni srca ter vnetnih odzivov zaradi okužb.

===Meta Kodrič: Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze===
Svetloba je za rastline eden od najpomembnejših okoljskih signalov, ki vplivajo na rast in razvoj. V odvisnosti od intenzitete in valovne dolžine svetlobe se pri rastlinah pojavljata dva kontrastna razvojna procesa. Fotomorfogeneza je osnovna oblika rasti, saj rastlinam omogoča razvoj v avtotrofne organizme, sposobne opravljati fotosintezo, skotomorfogeneza pa je le zavrta oblika fotomorfogeneze, ki se odvija v temi. Potek teh dveh procesov rastline uravnavajo pod vplivom svetlobnega signala v svetlobni signalni poti. V njej sodelujejo fotoreceptorji ter pozitivni in negativni regulatorji fotomorfogeneze. V temi se fotoreceptor fitokrom nahaja v biološko neaktivni obliki v citosolu rastlinske celice. Negativni regulatorji se tako lahko v jedru prosto vežejo na druge molekule. Transkripcijski faktorji PIF se v obliki dimerov vežejo na promotorske regije na molekuli DNA in s tem preprečijo prepisovanje genov za fotomorfogenezo. Proteini COP/DET/FUS delujejo kot E3 ligaze pozitivnih regulatorjev HY5, HFR1, LAF1 in tako sodelujejo pri njihovi razgradnji. Z vzajemnim delovanjem tako negativni regulatorji zatirajo potek fotomorfogeneze. Na svetlobi se fitokrom konformacijsko spremeni in preide v jedro. Tam v sodelovanju z drugimi molekulami inhibira negativne regulatorje, bodisi s preprečitvijo njihovega encimskega delovanja, bodisi s sodelovanjem pri njihovi razgradnji. Posledično lahko postanejo aktivni pozitivni regulatorji, ki se vežejo poleg promotorskih regij na DNA in tako aktivirajo prepisovanje genov za fotomorfogenezo.

===Tina Zavodnik: Mehanična transdukcija in proteini Piezo===
Praktično vsi organizmi so občutljivi na mehanske dražljaje. Fizične sile regulirajo številne fiziološke procese, nezadostni oz. napačni odzivi nanje pa lahko vodijo do številnih okvar ali bolezni. Naše zaznavanje teh dražljajev in njihova pretvorba v biokemijske informacije, imenovana tudi mehanotransdukcija, sta torej ključna za dojemanje sveta okoli nas in odzivanje nanj. To nam omogočajo čutila, navadno sestavljena iz čutilne celice ali receptorja in senzoričnega nevrona. Zaradi obstoja mnogo različnih vrst in intenzitet dražljajev so se tudi čutnice in senzorični nevroni specializirali v zaznavanje vsakega od stimulusov. Merklovi živčni končiči so mehanski receptorji, sposobni zaznavati nežen pritisk na koži. To pa jim omogočajo posebni ionski kanalčki, imenovani proteini Piezo. Nežen dotik na površini kože sproži prenos mehaničnega dražljaja do Merklovih živčnih končičev, kjer se aktivira kanalček Piezo2 v Merklovi celici. Aktivacija kanalčka omogoči prehod kalcijevih in natrijevih ionov v notranjost celice. Merklova celica se depolarizira in sproži akcijski potencial v pripadajočem aferentnem nevronu. Mehanični dražljaj pa aktivira tudi kanalčke Piezo2 v membrani SA1 aferentnega nevrona in s tem sproži dodatno vzpostavitev akcijskega potenciala. Pred kratkim je bila odkrita struktura proteina Piezo, kar pa še vedno ne razkriva natančnega mehanizma aktivacije ionskega kanalčka zaradi mehanskega dražljaja. Najverjetneje se zaradi mehanskega dražljaja spremeni konformacija proteina Piezo. Kanalček se odpre in ioni lahko pod vplivom koncentracijskega gradienta prehajajo skozi membrano.

===Doroteja Armič: Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze===
PFK-2/FBPaza-2 (fosfofruktokinaza-2/fruktoza-2,6-bisfosfataza) je eden izmed encimov, ki sodelujejo pri regulaciji metabolizma glukoze v evkariontih. Je bifunkcionalen encim, ki uravnava, ali bo v celici potekala glikoliza ali glukoneogeneza. Za to je odgovoren posredno, saj regulira količino alosteričnega efektorja encimov PFK-1 in FBPaza-1 – fruktoze-2,6-bisfosfata. En encim ima dve katalitični domeni. Kinazna domena katalizira sintezo, bisfosfatazna domena pa razgradnjo fruktoze-2,6-bisfosfata. Delovanje encima je regulirano na nivoju posttranslacijske modifikacije, in sicer s fosforilacijo/defosforilacijo. Pri sesalcih obstajajo štirje različni izocimi, vsakega kodira drug gen. Ti izocimi so jetrni, srčni, možganski in izocim testisov. Vsak izocim pa ima več izooblik, ki nastanejo z alternativnim spajanjem eksonov. Izooblike se razlikujejo v regulatornih regijah. Fosforilirajo in defosforilirajo jih drugačne kinaze, nekatere izooblike pa fosforilacijskih mest sploh nimajo. Encim PFK-2/FBPaza-2 je nastal s fuzijo dveh genov. Encim se je razvil tako, da je funkcionalen samo, če sta prisotni obe domeni. Tudi pri tripanosomatidih in kvasovkah, kjer je encim monofunkcionalen, je zato še vedno zapis za obe domeni. V razvoju je prišlo do različnih izooblik v različnih tkivih oziroma organizmih zaradi drugačnih potreb za metabolizem glukoze. Ker PFK-2/FBPaza uravnava glikolizo in glukoneogenezo, bi lahko tarčno reguliranje encima postalo nov način zdravljenja diabetesa.

===Martina Lokar: Biotinilacija proteinov ===
Biotin je pomemben encimski kofaktor, saj olajša prenos karboksilne skupine med metaboliti pri karboksilaciji, dekarboksilaciji in transkarboksilaciji. Biotin protein ligaza (BPL) ga v procesu biotinilacije veže na tarčni biotin-odvisen encim. Biotinilacija je dvostopenjski proces, pri katerem pride v prvem koraku do ligacije biotina in ATP ter nastanka intermediata biotinil-AMP. V drugem koraku se biotin iz biotinil-AMP veže na tarčni encim in pride do sprostitve molekule AMP. Ker je biotin v naravi redek, organizmi natančno uravnavajo njegovo porabo. Evkarionti so nezmožni sami sintetizirati biotin, zato ga pridobivajo iz okolja. Zadostno količino ohranjajo v biotinskem ciklu z reciklacijo biotina iz biotin-odvisnih encimov. Pri metaboličnih procesih sesalcev sodeluje pet biotin-odvisnih karboksilaz, ki so v splošnem zgrajene iz treh domen: domene BC, domene CT in domene BCCD. Biotin je kovalentno vezan na lizinski ostanek v domeni BCCD in se preko modela zibajoče roke ali modela zibajoče domene med katalizo translocira iz domene BC v domeno CT. Karboksilaze katalizirajo reakcijo prenosa karboksilne skupine na substrat v dveh korakih. Najprej se v domeni BC karboksilna skupina veže na biotin. Slednji se nato premakne v domeno CT, kjer se karboksilna skupina iz biotina prenese na substrat. Če telo ni sposobno uravnavati in izkoriščati zaloge biotina, človek oboli za boleznijo MCD.

===Lara Drinovec: AMPK in avtofagija pri glukoznem/glikogenem metabolizmu===
Glukozni/glikogeni metabolizem je primarna metabolična pot, ki je uravnavana na najrazličnejših nivojih, glede na potrebe celice. Znano je, da raven glukoze v krvi uravnavata dva hormona: inzulin, ki omogoča prevzem glukoze v celico in glukagon z nasprotno učinkovitostjo. Metabolni regulator, ki deluje od inzulina neodvisno in se odziva na krčenje mišic, je AMPK (AMP-aktivirana protein kinaza). Aktivira jo lahko AMP, tako da se veže na vezavno mesto na eni izmed treh podenot AMPK. Spremembo koncentracije AMP lahko AMPK zazna hitreje kot spremembo koncentracije ATP. Aktivirana AMPK inhibira anabolne poti in aktivira katabolne procese, ter tako vzdržuje energijsko homoestazo v aktivnih celicah. Pomembno vlogo pri vzdrževanju nivoja glukoze v celici igra tudi avtofagija, ki povzroči razgradnjo hranilnih snovi, kot so glikogen in lipidne kapljice, s tem zagotovi celici zadostno količino glukoze, in tako deluje kot nadomesten proces za glukoneogenezo. Tudi ta proces je v celicah uravnavan, in sicer z različnimi signalnimi molekulami. Mnogo bolezni, kot sta na primer diabetes in rak, sta tesno povezani z nefunkcionalnostjo nekaterih metaboličnih senzorjev ali avtofagije, zato je razumevanje njihovih funkcionalnih interakcij osnova za nove terapevtske možnosti.

=== Tina Kolenc Milavec: Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule pri vnetnem in protivnetnem odgovoru===
Intermediati Krebsovega cikla imajo v celici pomembno vlogo, saj ne služijo le kot vmesni produkti v procesu nastanka molekul ATP, temveč tudi kot prekurzorji za sintezo drugih biološko pomembnih molekul ter kot signalne molekule v številnih metaboličnih poteh. Ko se na tolične receptorje (TLR4) na površini makrofaga vežejo s patogeni povezani molekulski vzorci, pride v celici do preklopa metabolizma z oksidativne fosforilacije na glikolizo za namene pridobivanja energije v obliki ATP, kar neposredno vpliva na vnetno stanje v celici. Krebsov cikel, ki sedaj nima več vloge zagotavljanja energije celici, se prekine na dveh mestih: za sukcinatom ter pri izocitrat dehidrogenazi, kar omogoči, da intermediati citratnega cikla delujejo kot signalne molekule. Pri vnetnem odzivu organizma na patogene sta zelo pomembna sukcinat in citrat. Prvi povzroči povišanje koncentracije Hif1α v celici ter nastanek reaktivnih kisikovih spojin (ROS) zaradi vzvratnega elektronskega transporta, citrat pa deluje kot substrat za verigo reakcij, ki prav tako vodijo do nastanka ROS. Pri ponovni vzpostavitvi normalnih razmer v celici po uspešni odstranitvi patogenov pa ima pomembno vlogo itakonat - molekula, ki nastane iz cis-akonitata. Ta vpliva na tri pomembne molekule (sukcinat dehidrogenazo, Nrf2 ter ATF3), ki sprožijo vsaka svojo kaskado reakcij protivnetnega odgovora.

===Valeriya Musina: Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na celične procese===
Krebsov cikel je bil oblikovan osedemdeset let nazaj, vloge njegovih inermediatov, zlasti sukcinata in fumarata, pa so bile odkrite nedavno. V zadnjem času so bile narejene številne raziskave človeških bolezni, zlasti niza specifičnih vrst raka, ki so razkrile pomembne vloge intermediatov Krebsovega cikla pri metilaciji genov in s tem pri preoblikovanju celic. Intermediati Krebsovega cikla lahko delujejo kot primarni substrati, signalne molekule ali sodelujejo pri posttranslacijskih modifikacijah. Vedno več dokazov kaže, da ima epigenetika pomembno vlogo pri regulaciji dobe zdravja, in je vključena v proces staranja. 2-oksoglutarat (α-ketoglutarat) je ključni metabolit v Krebsovem ciklu, vendar je tudi obvezen substrat za 2-oksoglutarat odvisne dioksigenaze (2-OGDO). Družina encimov 2-OGDO vključuje glavne encime za demetilacijo DNA in histonov, encime Ten-Eleven translocation (TETs) in encime z domeno Jumonji C (JmjC). Poleg tega lahko člani družine 2-OGDO regulirajo sintezo kolagena in odzive na hipoksično okolje tudi na neepigenetski način. 2-oksoglutarat je substrat 2-oksoglutarat dehidrogenaz (2-OGDH), zato lahko motnje v funkciji 2-OGDH v Krebsovem ciklu povzročijo globalne degenerativne spremembe v strukturi kromatina. Sukcinat in fumarat močna inhibitorja 2-OGDO encimov, zato ravnotežje reakcij v Krebsovem ciklu lahko vpliva na raven metilacije DNA in histonov ter tako nadzira izražanje genov.

===Marko Pavleković: Vloga sukcinata kot ligand z G proteini vezanega receptorja GPR91===
Znano je, da je cikel citronske kisline osrednjega pomena za presnovo celic in energetsko homeostazo. Vendar marsikateri intermediat cikla igra vlogo tudi v drugih procesih v telesu. Na primer sukcinat deluje kot ekstracelularni ligand z vezavo na z G proteinom vezan receptor, znan kot GPR91, izražen v ledvicah, jetrih, srcu, retinalnih celicah in morda v številnih drugih tkivih, kar vodi do širokega nabora fizioloških in patoloških učinkov. V normalnih pogojih se sukcinata ne sintetizira dovolj, da bi lahko aktiviral GPR91, šele v pogojih kot so ishemija, diabetes in hipoksija, sukcinata nastane dovolj. Ker pa sukcinat nastaja v matriksu mitohondrija mora na poti do receptorja, ki se nahaja na zunanji strani celic, prečkati še tri membrane. Skozi GPR91 je sukcinat vključen v funkcije, kot so uravnavanje krvnega tlaka, zaviranje lipolize v belem maščobnem tkivu, razvoj vaskularizacije mrežnice, srčna hipertrofija in aktivacija zvezdastih jetrnih celic z ishemičnimi hepatociti. Zaradi tega je sukcinatni receptor obetajoč cilj za zdravila za preprečevanje teh neželenih patoloških učinkov. Nedavni razvoj antagonistov, specifičnih za SUCNR1, odpira nove možnosti za raziskave v modelih za te motnje in lahko sčasoma zagotovi nove možnosti za zdravljenje bolnikov.

===Klementina Polanec: Sirtuini kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin===
Sirtuini so družina visoko ohranjenih proteinov (SIRT1-SIRT7 pri sesalcih), ki imajo regulatorno vlogo v metabolizmu in staranju. Delujejo kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin v odgovor na številne strese za celico, kot so omejitev kalorij, postenje, mraz. Ker se zniža nivo ATP v celici in je glukoze premalo, se poveča razgradnja glikogena, hkrati pa se pospeši oksidacija maščobnih kislin v mišicah in jetrih. Do nedavnega je veljajo prepričanje, da je aktivnost sirtuinov odvisna le od koncentracije NAD+ v celici. Raziskovalci so pred kratkim dokazali, da se lahko SIRT1 aktivira tudi s fosforilacijo, ki jo izvede protein kinaza A (PKA). Ko so sirtuini aktivirani, delujejo v glavnem kot deacetilaze številnih encimov, s čimer jih aktivirajo. SIRT1 tako deacetilira PGC1α, ki pospeši izražanje tarčnih genov, ki so povezani z oksidacijo maščobnih kislin. SIRT3 pa odvisno od koncentracije NAD+ deacetilira in s tem aktivira LCAD (long-chain acyl-CoA dehydrogenase). To je pri miših ključen encim, ki sodeluje v oksidaciji dolgoverižnih maščobnih kislin. S pospešeno oksidacijo celica dvigne nivo ATP in ponovno vzpostavi homeostazo. Sirtuini so zato lahko potencialna tarča za zdravljenje motenj v oksidaciji maščobnih kislin ter tudi za preprečevanje prekomerne teže oziroma debelosti.

===Tadej Medved: Vpliv oksidacije maščobnih kislin na usodo celic===
Usodo celic, tj. končne lastnosti, ki jih bo celica izražala po razvoju in diferenciaciji, določajo številni procesi. Mednje spada tudi metabolična β-oksidacija maščobnih kislin. Izkaže se, da je količina acetil-CoA, pridobljena preko oksidacije maščobnih kislin, pogosto odločilni dejavnik za izražanje lastnosti določenih tipov celic; do sedaj je bil ta vpliv raziskan v endotelijskih celicah limfnih žil in srca ter v limfocitih T. Ključna regulacija oksidacije MK se prične pri izražanju encima CPT1, ki omogoča transport maščobnih kislin v mitohondrij. V srčnem endoteliju vpliva ta proces na pretvorbo endotelijskih celic v mezenhimske, in sicer zaradi TGF-β signalizacije, ki z inhibicijo metabolizma MK sproži spremembe celičnih lastnosti v mezenhimske. V endoteliju limfnih žil je oksidacija MK pomembna za vršenje limfangiogeneze, tj. tvorbe novih limfnih žil s proliferacijo in diferenciacijo obstoječih limfnih endotelijskih celic. Ta proces je odvisen od signalov VEGF-C in PROX1; slednji poveča izražanje CPT1 in pripravi celico do migracije in proliferacije. Količina acetil-CoA je relevanten dejavnik za diferenciacijo in dolgoživost spominskih T celic, povezana pa je preko aktivacije AMPK s signalno molekulo TRAF6. V T celicah na sploh pa močno učinkuje PD-1, ki pospeši tako hidrolizo MK kot tudi njihovo oksidacijo in omogoča preživetje teh celic v pogojih, kjer niso sposobne sprejemanja drugih hranilnih snovi, kot je glukoza.

===Rebeka Dajčman: Metabolizen, signalizacija in farmakološka funkcija ketonskih teles===
ketonska telesa nastanejo kot stranski produk pri presnovi maščobnih kislin. mednje sodijo acetoacetat, aceton in najobstojnejši beta hidroksibutirat. njihova sinteza se poveča, ko telesu primanjkuje ogljikovih hidratov. to je med stradanjem, po športni aktivnosti, med nosečnostjo ali med ketonsko dieto. v seminarski nalogi bom predstavila metabolično bot ketonskih teles. od sinteze v jetrih do njihovega transporta v ostala tkiva. to so predvsem skeletne mišice, srce in možgani ter njihovo oksidacijo nazaj v acetil-CoA. sinteza ketonskih teles je regulirana s transkripcijsko in post-translacijsko regulacijo. pri tem gre predvsem za regulacijo encimov, ki sodelujejo v sintezi in razgradnji teles. ketonska telesa pa imajo vlogo regulacije dveh membranskih receptorje ali histonske deacetilaze. ketonska telesa se že desetletja uporabljajo v zdravljenju nevrodegenerativnih bolezni in v tej smeri tudi tečejo prihodnje raziskave

===Sumeja Kudelić: Transsulfuracijska pot kot obrambni mehanizem celic pri oksidativnem stresu===
Transsulfuracijska pot, kot novo raziskovalno področje nam podarja veliko pozitivnih načinov v boju proti oksidativnemu stresu. Oksidativni stres, kot negativni dejavnik celic s svojimi reaktivnimi kisikovim zvrsti, poškoduje različne celične organele, kar vodi do celične smrti. Pri transsulfuraciji poti je ugotovljeno, da bistveni pomen ima cistein y-liaza, ki je biosintetični encim cisteina. Pri razgradnji cisteina lahko pridobimo vodikov sulfid (H2S), ki je v zelo majhnih koncentracijah pomemben signalizator celice. Več mehanizmov pozitivnega delovanja transsulfuracije poti (posredne ali neposredne) je raziskano, te so prišli do rezultatov, ki bi lahko pomagali pri izboljšanem terapevtskem zdravljenju nevrodegenerativnih bolezni, ki so povezane z metabolizmom aminokislin. Važno je iztakniti, da s pomočjo tega mehanizma ali z njeno inhibicijo bi tudi vplivali na bakterijsko smrt. Saj se pri bakterijah razvila obrambna stimulacija transsulfuracijske poti, pri čemer so bakterije postale 'imune' na antibiotike. Vodikov sulfid kot pomemben dejavnik transsulfuracijske poti vpliva na to, da veže proste ione, ki bi lahko v oksidativnih pogojih (H2O2) reagirali s to spojino. Kot posledica reakcije nastanejo prosti kisikovi radikali, ki poškodujejo celične organele. Nevrodegenerativne bolezni uporabljajo transsulfuracijsko pot kod pomemben vir aminokislin in tudi s tem preprečujejo, da so njihove celice izpostavljene oksidativnemu stresu.

===Matija Ruparčič: Ureaze in njihova vloga v živih bitjih===
Ureaze so metaloencimi, ki katalizirajo hidrolizo uree oziroma sečnine. Pri tem nastaneta dve molekuli amoniaka ter ena molekula ogljikovega dioksida. Najdemo jih v veliko organizmih kot so rastline, glive in bakterije. Le živali jih nimajo, saj se pri njih sečnina tvori kot odpadni produkt. Strukturno se razlikujejo glede na vrsto organizma, zapis za njihove sestavne dele pa se skriva v velikem številu genov. Za organizme, ki jih vsebujejo, predstavljajo ključen faktor za življenje. S pomočjo njih lahko bakterije ''Helicobacter pylori'' preživijo v ekstremno kislih razmerah želodca, bakterijam ''Proteus mirabilis'' omogočajo tvorbo zaščitnih biofilmov, rastlinam pa zagotavljajo bogat vir dušika in jim pomagajo pri katabolizmu arginina. Pred kratkim pa so odkrili, da imajo poleg tega ureaze še druge naloge, ki niso povezane z njihovo katalitično sposobnostjo. Med te štejemo vlogo medcelične komunikacije pri lišajih, obramba pred oksidativnim stresom kot odgovor imunskega sistema in še veliko več. Poznamo jih sicer že skoraj 150 let, vendar o njih vemo še vedno relativno malo. Motivacija za njihovo preučevanje pa je velika, saj nam lahko pomagajo k napredkom na raznih področjih kot sta medicina in agronomija.
===Maks Kumek: Vloga metabolizma arginina v celični regulaciji in erekcija===
Izmed vseh intermediatov ureinega ciklusa je pravzagotovo arginin najbolj prepleten v razne regulacijske sisteme celice. Metabolične poti arginina so kompleksne in se mnogokrat prepletajo med seboj. Sinteza arginina poteka v različnih predelih telesa v ti. črevesno renalni osi. Pretvorba glutamina vse do citrulina poteka v celicah tankega črevesja. Citrulin se izloči v krvni obtok in potuje do ledvic, kjer se nadaljnjo sintetizira do argenina. Regulacija nastajanja produktov je tesno povezana z transportnimi regulatorji družine SLC7 ( CAT 1, CAT-2A, y+LAT, b0,+, CAT-2B) . Regulacija transporterjev ne poteka le na transkripcijskem nivoju temveč tudi na posttranslacijskem nivoju (npr. spermin). Kompleksnost s poglabljanjem le narašča.Vrste encimov, pri katerih igra arginin vlogo substrata so: arginaza, NOS (ang. nitric oxide synthase), arginin dekarboksilaza (ADC), arginin:glicil amidinotransferaza. Posebno pomembnost ima NOS,ki so trije izocimi: iNOS, nNOS, eNOS. Ti trije encimi so prostorsko in regulacijsko ločeni med seboj, vendar pa je moč tudi pri njih zapaziti prepletanje delovanja v procesu, kot je erekcija.Razumevanje vloge metaboličnih produktov arginina v celic pomaga razumeti širšo sliko imunološkega odziva, preprečevanje bolezenskih stanj (npr. impotence) in konec koncev pomaga tudi pri razumevanju lastnega telesa.

===Anže Šumah: Delovanje proteina termogenina in njegov pomen pri termogenezi===
Ohranjanje stalne telesne temperature je za toplokrvne organizme življenjskega pomena. Eden izmed mehanizmov termoregulacije je termogeneza – proizvodnja toplote. Pri sesalcih se je razvilo posebno tkivo, katerega osnovna naloga je termogeneza. To je rjavo maščobno tkivo, ki je pomembno predvsem za majhne sesalce, pri ljudeh pa se v večji meri pojavlja pri novorojenčkih. V notranji membrani mitohondrijev tega tkiva se nahaja protein termogenin, imenovan tudi UCP1, ki energijo protonskega gradienta, nastalega pri dihalni verigi, porabi za proizvodnjo toplote, namesto da bi se le-ta porabila za sintezo ATP. Glavni regulatorji termogenina so proste maščobne kisline in purinski nukleotidi, pri čemer delujejo prve kot aktivatorji, slednji pa kot inhibitorji. Sam mehanizem prenosa protonov iz medmembranskega prostora v matriks še ni popolnoma jasen, sta se pa uveljavila dva modela. Prvi predpostavlja, da deluje termogenin kot simporter maščobnih kislin in protonov. Drugi model pa ugotavlja, da je termogenin uniporter za maščobne kisline, katere prenaša v medmembranski prostor. Tam se protoni vežejo na njih in lahko tako skupaj difundirajo skozi membrano. Ker številni znanstveniki menijo, da bi lahko uporabili izsledke o delovanja in regulacije termogenina v boju proti debelosti in z njo povezanih bolezni, je pomembno, da se raziskave na tem področju nadaljujejo.

===Liza Praznik: Dinamična strukture mitohondrija za opravljanje raznolikih funkcij===
Sposobnost opravljanja raznolikih funkcij mitohondrija je posledica dveh prilagodljivih membran znotraj njega. Tvorita dinamičen organel s sposobnostjo nenehnega spreminjanja svoje oblike. Za to so zadolženi proteini MTC (mitochondria shaping proteins), ki so zasidrani v obeh membranah, od koder skrbijo za pravilno urejenost mitohondrija, primer takšnih proteinov je OPA1, MTF1 in MTF2, Drp1 ter proteinski kompleks MICOS. Najzaznavnejše so spremembe v mitohondrijskih kristah, ki jih tvori notranja membrana. Gre za kompartment, bogat s proteini, preko katerega je regulirana struktura mitohondrija. Ta organel se deli neodvisno od celice, v kateri se nahaja, razvil je lasten življenski cikel mitohondrija. Gre za nenehne procese fuzije (spajanje) in fizije (cepitve), preko katerih mitohondrij uravnava število organelov, hkrati pa izloča in razgradi tiste dele, ki delujejo nepravilno oziroma so poškodovani. S tem istim mehanizmom se odzove tudi na različno količino hranil, ki je celici na voljo. V presežkih razpade na krajše fragmente, v primankljaju pa tvori podaljšano obliko z večjo gostoto krist, v katerih pospešeno nastaja ATP. Takšno obliko tvori tudi kot odgovor na avtofagijo in se zato ne razgradi, temveč preskrbi celico z energijo. Pomemben je odgovor mitohondrija na apoptozo, signal zanjo povzroči spremembe v delovanju proteinov, OPA1 se razpre in citokrom c se iz krist je preko kanalčkov sprosti v citosol.

===Barbara Jaklič: Vloga proton-črpajočega rodopsina pri fotofosforilaciji in drugih procesih odvisnih od protonske gonilne sile===
Poznamo več vrst rodopsinskih kompleksov: signalni pretvorniki, ionske črpalke in protonske črpalke. Slednje sestavlja 7 transmembranskih alfa vijačnic, z vmesnimi kratkimi zankami. V sredini je na aspartatni kislinski ostanek s svojim N-koncem vezana molekula retinala. Retinal je večinoma edini pigment v proton črpajočih rodopsinih (PPR), njegova vijolična barva se odraža v barvi celotnega kompleksa. Retinal je tudi ključnega pomena za delovanje PPR, saj absorpcija fotonov povzroči njegovo konformacijsko spremembo in s tem črpanje protonov skozi membrano. V eni od vrst PPR imenovani ksantorodopsini so prisotni antenski pigmenti keto-karotenoidi, ki razširijo absorpcijski spekter, saj je v osnovi omejen na ozek pas zeleno-modre vidne svetlobe. Potencialna uporaba PPR v genskem inženiringu je usmerjena predvsem v heterologno ekspresijo v gostiteljskih celicah, s katero lahko v heterotrofne organizme uvedemo avtotrofijo ali pa PPR izrazimo le kot dodaten vir črpanja protonov, saj so številni metabolični procesi odvisni prav od protonske gonilne sile. Rodopsinski proton-črpajoči kompleksi so dokazano manj učinkoviti za ustvarjanje protonskega gradienta kot klorofilni, ker lahko v enem fotociklu prečrpajo največ en proton, vendar je njihova heterologna ekspresija bolj preprosta, ker jih poleg genov za sam rodopsin kodira samo 5 dodatnih genov za biosintezo retinala.

===Gašper Anton Komatar: Telesna aktivnost poveča učinkovitost mitohondrijskega sistema in zviša raven telesne energije===
Človek, kot heterotrofen organizem, mora energijo za delovanje dobiti iz energijsko bogatih molekul, ki jih je nekoč pridelal avtotrof. Zaužito hrano prebavi in transportira v celice, kjer sledi zaključek katabolizma. Metabolni poti glukoze in maščobnih kislin, kot glavnih virov energije za človeka, se združita v mitohondriju v krebsovem ciklu in zaključita z dihalno verigo. Tam proizvede večino kemijske energije za uravnavanje procesovp, potrebnih organizmu. Pri tem je zanimivo, da povprečen človek naše predebele družbe zaužije več energijsko bogatih hranil, kot jih porabi, a je kljub temu večino časa utrujen, brez energije... Kaj v metabolizmu snovi gre torej narobe, da se kljub presežku energije shranjene v našem telesu tako počutimo? Kako je možno, da sedeč človek, ki se počuti, kot da je popolnoma brez energije, v naslednjem hipu teče na avtobus? Znanstveniki so ugotovili, da se ob daljši fizični neaktivnosti učinkovitost mitohondrijev drastično zmanjša in v obdobju povečane aktivnosti izboljša. Vzrok je v tem, da telo med aktivnostjo potrebuje več energije kot ponavadi. Zato pospeši razgradnjo poškodovanih, neefektivnih mitohondrijev, pospeši mitohondrijske biosintetske poti ter njihovo fuzijo in sistem mitohondrijev po taki spremembi je bolj efektiven. Še bolj zanimivo je, da se telo prilagodi redni telesni aktivnosti in tudi v mirovanju proizvaja več energije.

===Lara Hrvatin: Mehanizmi koncentriranja ogljika===
Ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaza/oksigenaza ali krajše Rubisco je ključnega pomena za fiksacijo ogljikovega dioksida v energetsko bogate molekule. Kot bifunkcionalen encim lahko katalizira karboksilacijo ali oksidacijo ribuloze-1,5-bisfosfata. V primeru, da deluje kot oksigenaza, pride do sprostitve CO2 ob porabi O2 in sončne energije pri procesu fotorespiracije. V naravi so se razvili različni mehanizmi koncenrtiranja ogljika v bližini Rubisca kot odgovor na neugodne razmere. Najdemo jih pri rastlinah, ki naseljujejo topla in suha področja, saj je tam povečana oksigenazna aktivnost Rubisca. Med slednje spadajo C4 rastline, ki fiksirajo ogljikov dioksid v obliki bikarbonata v oksaloacetat. Razvile iz ''navadnih'' C3 rastlin, ki fiksirajo ogljikov dioksid v 3-fosfoglicerat. Mehanizmi koncentriranja ogljika so prisotni tudi pri algah in cianobakterijah, ki imajo kot vodni organizmi na razpolago več bikarbonata kot ogljikovega dioksida. Alge in cianobakterije imajo na membranah različne transporteje anorgaskega ogljika, ki črpajo bikarbonat, tega pa karbonske anhidraze pretvorijo v ogljikov dioksid v bližini Rubisca. Vse cianobakterije imajo tudi karboksisome in nekatere alge piranoide. Karboksisomi in piranoidi so mikrokompartmenti, v katerih je zbran Rubisco skupaj s karbonskimi anhidrazami. Zmanjšanje oksigenazne aktivnosti Rubisca (oziroma izgub pri fotorespiraciji) v rastlinah pomembnih za poljedelstvo je v zanimanju raziskovalcev že desetletja. Ena od potencialnih strategij, kako to uspeti, je vpeljava mehanizmov koncentriranja ogljika, ki bi povečali karboksilazno aktivnost Rubisca.

===Sonja Gabrijelčič - Biosinteza bakterijske celuloze===
Od vseh bioloških polimerov je na svetu največ celuloze. Organizme, ki jo sintetizirajo, najdemo v skoraj vseh kraljestvih živega. Celuloza je sestavljena iz monomernih enot D-glukoze, povezanih z acetalnimi vezmi med C1 in C4 glukopiranoznega obroča in stabiliziranih z vodikovimi vezmi. Bakterijsko celulozo odlikuje visoka kemijska čistost in kristaliničnost (ko opazujemo celulozo, urejeno v mikrofibrile, in ne amorfne oblike). Poleg tega je tudi lahka, močna, odporna in ima dobre absorpcijske sposobnosti. Biosinteza poteka v nekaj korakih – najprej iz D-glukoze dobimo UDP-glukozo, ki jo nato polimerizira encim celulozna sintaza (CeS). Osrednji katalitični del CeS je močno ohranjen, praktično enako strukturo najdemo v bakterijah in rastlinah. Je integralni membranski encim, ki katalizira reakcijo glikoziltransferaze – prenese glukozno enoto z UDP-glukoze na nastajajoči glukozni polimer. Obenem del katalitične domene tvori tudi transmembranski kanalček, saj sinteza poteka v celici, produkt pa mora celica premakniti v ekstracelular. Dodajanje novih enot na polimerno verigo je procesivno, torej potekajo reakcije polimerizacije ena za drugo, ne da bi se vmes substrat odpel. Ecim mora zato po vsaki opravljeni katalizi podaljšani polimer premakniti za eno enoto ven iz celice – nazadnje dodano glukozno enoto mora postaviti tako, da je na mestu akceptorja in se nanjo v naslednji reakciji lahko doda nova glukozna enota. Aktivnost CeS nadzoruje majhna regulatorna molekula ciklični digvanilat (c-di-GMP), ki je alosterični aktivator tega encima.

===Anastasija Nechevska: Biosynthesis of bacterial peptidoglycan and inhibition by β-lactam antibiotics===
The peptidoglycan biosynthetic pathway is one of the most studied anabolic pathways today. Many years of scientific research have led humans to not only better understanding of how the bacterial cell wall enzymes act, but also discovering the main structures and functions of many proteins and complexes involved in this process. Considering that nowdays we find ourselves in an inescapable and ongoing battle with pathogenic bacteria that constantly evolve, it is therefore almost necessary to understand the biochemistry of bacterial cell in order to protect ourselves from diseases caused by them. Here is an overview of how β—lactam antibiotics, as most widely used group of antibiotics act on inhibiting cell wall biosynthesis in the bacterial organism, in order for us to better understand how are treated the most of bacterial infections. Constant update and furthermore research of this biosynthetic pathway where bacteria orchestrate the building and maintenance of their protective sacculus, leads hope of inventing new effective antibiotic strategies that will reduce the rate of today’s global health problem of antibiotic resistance.

===Maja Škof: Sinteza sfingolipidov===
Sfingolipidi so kompleksna in številčna družina membranskih lipidov, ki so pomembna komponenta plazmaleme, sodelujejo pa tudi kot signalne molekule ali receptorji. Njihovo zgradbo razdelimo na tri glavne komponente: sfingozin ali eden njegovih derivatov, maščobna kislina in polarna molekula. Glede na vrsto polarne molekule jih razvrstimo v eno od treh skupin- sfingomieline, glikosfingolipide in gangliozide. Prva stopnja v sintezi tipičnih sfingolipidov je kondenzacija palmitoil-CoA in serina s sledečo redukcijo, pri čemer nastane molekula sfinganin. Sledita vezava maščobne kisline in desaturacija; nastane ceramid, ki predstavlja nekakšno središče pri metabolizmu sfingolipidov. Dejansko gre za skupino molekul, ki se med seboj razlikujejo v dolžini in nasičenosti maščobne kisline. Do te točke sinteza poteka v ER, nato se ceramidi transportirajo v Golgijev aparat, kjer se nanje vežejo polarne molekule. Z vezavo fosfoholina ali fosfoetanolamina nastanejo sfingomielini, z vezavo ene ali več sladkornih komponent glikosfingolipidi, če pa se na ceramid veže oligosaharid z eno ali več sialično kislino, je nastal gangliozid. Večina reakcij pri sintezi sfingolipidov lahko teče tudi v nasprotno smer- z razgradnjo kompleksnejših sfingolipidov se tvori ceramid, ki se lahko porabi za sintezo drugih sfingolipidov, ki jih celica bolj potrebuje.

===Liza Ulčakar: Vloga interakcij med lipidnimi kapljicami in organeli v celici===
Lipidne kapljice so intracelularne strukture, prisotne v vseh evkariontih. Sestavljene so iz hidrofobnega jedra in fosfolipidnega monosloja. Zaradi te edinstvene strukture imajo tudi zelo specifičen proteom, saj se niso zmožni vsi proteini vsidrati v monosloj. Kapljice se preko stikov z drugimi organeli aktivno vključujejo v metabolizem celice. Z ER tvorijo lipidne mostičke, preko katerih ER daruje nekatere proteine kapljici. najbolj znan protein na stiku je seipin, ki nadzira rast kapljic, izbirno kontrolira transport proteinov po mostičkih ter utrjuje mostiček. Lipidni mostički naj bi bili biosintetski ostanki tvorbe lipidnih kapljic, lahko pa se tvorijo tudi de nuovo, s pomočjo kompleksa ARF1/COPI. Interakcija kapljic z vakuolo (v kvasu) oz lizosomom (pri sesalcih) je pomembna, ko celici primanjuje hranil. V kvasu poteka mikrolipofagija, pri kateri se kapljice zlijejo z vakuolo, ki hidrolizira lipide, v sesalcih pa poteka makrolipofagija, pri kateri se tvori avtofagosom, ki se nato združi z lizosomom. Ko celici primanjkuje glukoze, tvorijo kapljice direktne stike z mitohondriji. Najprej se morata organela "najti", pri tem pa jima pomaga AMPK. V kvasu poteka beta oksidacije samo v peroksisomih. Ti s kapljicami tvorijo lipidna mostičke, preko katerih z notranjim slojem membrane vdrejo v notranjost kapljice. Znanje o interakcijah lipidnih kapljic z drugimi organeli je pomembno pri razumevanju nekaterih patoloških stanj, kot so diabetes, lipodistrofija, debelost in drugi.

===Ajda Godec: Biosinteza levkotriena B4 ===
Levkotrieni sodijo v družino biološko aktivnih molekul, ki se nahajajo v celicah, sodelujočih predvsem pri odzivu na imunološki stimulus (levkociti, makrofagi, tkivni bazofilci). Odgovorni so za vrsto bioloških pojavov, kot so npr. krčenje bronhialnega gladkega mišičevja, stimulacija vaskularne permeabilnosti (prepustnosti), aktivacija in usmerjen transport levkocitov do tarčnih celic. Po kemijski zgradbi sodijo med eikozanoide. Levkotrien B4 - LTB4 se sintetizira v belih krvničkah, predvsem v monocitih in nevtrofilcih, kot produkt encimsko katalizirane reakcije encima LTA4H in molekule LTA4 (levkotriena A4). Celotna biosintezna pot LTB4 vključuje kot primarni prekurzor arahidonsko kislino, ki se pod vplivom delovanja fosfolipaze A2 odcepi iz fosfolipidne membrane. Molekula arahidonske kisline se v teku 3 encimsko kataliziranih reakcij, s strani 3 različnih encimov, in sicer 5-LOX, ( 5-lipokisgenaza ), in ogrodnega FLAP proteina (5-lipoksigenazno aktivirajočega proteina) ter bifunkiconalnega encima LTA4H (levkotiren A4 hidrolaza/ aminopeptidaza) pretvori v molekulo LTB4. Glavna funkcija levkotriena B4 je aktivacija sinteze celic vnetnega odziva (nevtrofilcev) in molekul (citokinov) in jih transport nevtrofilcev do tarčnih. Pri alergijskem renitisu povzroči aktivacijo nevtrofilcev. Vendar pa lahko hiperprodukcija levkotrien B4 vodi do mnogih kroničnih bolezni in sindromov, kot so: artritis, kardiovaskularne bolezni, nekatere vrste rakavega obolenja, metaboličnih motenj.

BIO2 Seminar 2018

2018-12-09T23:18:57Z

Ajda Godec: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Eva Gartner || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Eva_Gartner:_Wnt_signalizacija_in_njena_vloga_pri_sr.C4.8Dni_fibrozi Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi] || Anamarija Agnič || Anastasija Nechevska || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Aljaž Bratina || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Alja.C5.BE_Bratina:_Pomen_razli.C4.8Dnih_signalnih_poti_pri_staranju Pomen različnih signalnih poti pri staranju]|| Lara Drinovec || Liza Ulčakar || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Karmen Mlinar || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Karmen_Mlinar:_Signalizacija_in_odzivi_na_abiotski_stres_pri_rastlinah Signalizacija in odzivi na abiotski stres v rastlinah] || Luka Gnidovec || Maja Škof || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Tina Zavodnik || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Zavodnik:_Mehani.C4.8Dna_transdukcija_in_proteini_Piezo Mehanična transdukcija in proteini Piezo] || Jernej Imperl || Ajda Godec || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Meta Kodrič || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Meta_Kodri.C4.8D:_Svetlobne_signalne_poti_za_uravnavanje_fotomorfogeneze Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze] || Laura Gašperšič || Neža Blaznik || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Neža Žerjav || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Ne.C5.BEa_.C5.BDerjav:_Vloga_kaspaz_pri_celi.C4.8Dni_smrti Vloga kaspaz pri celični smrti] || Nika Boštic || Urša Štrancar || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Doroteja Armič || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Doroteja_Armi.C4.8D:_Bifunkcionalen_encim_PFK-2.2FFBPaza-2_in_njegova_vloga_v_metabolizmu_glukoze Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze] || Eva Gartner || Anamarija Agnič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Lara Drinovec || 14-15 || AMPK in avtofagija pri glukoznem/glikogenem metabolizmu || Aljaž Bratina || Barbara Jaklič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Martina Lokar || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Martina_Lokar:_Biotinilacija_proteinov Biotinilacija proteinov]|| Karmen Mlinar || Luka Gnidovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Marko Pavleković || 16 || Vloga sukcinata kot ligand z G proteini vezanega receptorja GPR91 || Tina Zavodnik || Jernej Imperl || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Valeriya Musina || 16 || Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na celične procese || Meta Kodrič || Laura Gašperšič || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Tina Kolenc Milavec || 16 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Kolenc_Milavec:_Intermediati_Krebsovega_cikla_kot_signalne_molekule_pri_vnetnem_in_protivnetnem_odgovoru Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule pri vnetnem in protivnetnem odgovoru]|| Neža Žerjav || Nika Boštic || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Andrej Špenko || 17 || Regulacija oksidacije maščobnih kislin v skeletnih mišicah || Doroteja Armič || Eva Gartner || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Tadej Medved || 17 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tadej_Medved:_Vpliv_oksidacije_ma.C5.A1.C4.8Dobnih_kislin_na_usodo_celic Vpliv oksidacije maščobnih kislin na usodo celic] || Sanja Stanković || Aljaž Bratina || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Klementina Polanec || 17 || Sirtuini kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin || Martina Lokar || Karmen Mlinar || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Rebeka Dajčman || 17 || Ketonska telesa kot signalni metaboliti || Marko Pavleković || Tina Zavodnik || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Sumeja Kudelić || 18 || Transsulfuracijska pot kot obrambni mehanizem celic pri oksidativnem stresu || Valeriya Musina || Meta Kodrič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Matija Ruparčič || 18 || Ureaze in njihova vloga v živih bitjih || Tina Kolenc Milavec || Neža Žerjav || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Maks Kumek || 18 || Vloga metabolizma arginina v celični regulaciji in erekcija || Andrej Špenko || Doroteja Armič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Anže Šumah || 19 || Delovanje proteina termogenina in njegov pomen pri termogenezi || Tadej Medved || Sanja Stanković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Barbara Jaklič || 19 || Vloga proton-črpajočega rodopsina pri fotofosforilaciji in drugih procesih odvisnih od protonske gonilne sile || Klementina Polanec || Martina Lokar || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Gašper Anton Komatar || 19 || Telesna aktivnost poveča učinkovitost mitohondrijskega sistema in zviša raven telesne energije || Rebeka Dajčman || Marko Pavleković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Praznik Liza || 19 || Dinamična struktura mitohondrija za opravljanje raznolikih funkcij || Sumeja Kudelić || Valeriya Musina || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Lara Hrvatin || 20 || Mehanizmi koncentriranja ogljika || Matija Ruparčič || Tina Kolenc Milavec || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Sonja Gabrijelčič || 20 || Biosinteza bakterijske celuloze || Maks Kumek || Andrej Špenko || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Anastasija Nechevska || 20 || Biosynthesis of bacterial peptidoglycan and inhibition by β-lactam antibiotics || Anže Šumah || Tadej Medved || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Liza Ulčakar || 21 || Vloga interakcij med lipidnimi kapljicami in organeli pri homeostazi lipidov|| Barbara Jaklič || Klementina Polanec || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Maja Škof || 21 || Sinteza sfingolipidov || Gašper Anton Komatar || Rebeka Dajčman || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Ajda Godec || 21 || Biosinteza levkotriena B4 || Praznik Liza || Sumeja Kudelić || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Neža Blaznik || 22 || moj naslov || Lara Hrvatin || Matija Ruparčič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Urša Štrancar || 22 || moj naslov || Sonja Gabrijelčič || Maks Kumek || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Anamarija Agnič || 22 || moj naslov || Anastasija Nechevska || Anže Šumah || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Sanja Stanković || 23 || moj naslov || Liza Ulčakar || Lara Drinovec|| 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Luka Gnidovec || 23 || moj naslov || Maja Škof || Gašper Anton Komatar || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Jernej Imperl || 23 || moj naslov || Ajda Godec || Praznik Liza || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Laura Gašperšič || 23 || moj naslov || Neža Blaznik || Lara Hrvatin || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Nika Boštic || 23 || moj naslov || Urša Štrancar || Sonja Gabrijelčič || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2018|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Seminar 2018

2018-11-13T14:53:09Z

Ajda Godec: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Eva Gartner || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Eva_Gartner:_Wnt_signalizacija_in_njena_vloga_pri_sr.C4.8Dni_fibrozi Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi] || Anamarija Agnič || Anastasija Nechevska || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Aljaž Bratina || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Alja.C5.BE_Bratina:_Pomen_razli.C4.8Dnih_signalnih_poti_pri_staranju Pomen različnih signalnih poti pri staranju]|| Lara Drinovec || Liza Ulčakar || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Karmen Mlinar || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Karmen_Mlinar:_Signalizacija_in_odzivi_na_abiotski_stres_pri_rastlinah Signalizacija in odzivi na abiotski stres v rastlinah] || Luka Gnidovec || Maja Škof || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Tina Zavodnik || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Zavodnik:_Mehani.C4.8Dna_transdukcija_in_proteini_Piezo Mehanična transdukcija in proteini Piezo] || Jernej Imperl || Ajda Godec || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Meta Kodrič || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Meta_Kodri.C4.8D:_Svetlobne_signalne_poti_za_uravnavanje_fotomorfogeneze Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze] || Laura Gašperšič || Neža Blaznik || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Neža Žerjav || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Ne.C5.BEa_.C5.BDerjav:_Vloga_kaspaz_pri_celi.C4.8Dni_smrti Vloga kaspaz pri celični smrti] || Nika Boštic || Urša Štrancar || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Doroteja Armič || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Doroteja_Armi.C4.8D:_Bifunkcionalen_encim_PFK-2.2FFBPaza-2_in_njegova_vloga_v_metabolizmu_glukoze Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze] || Eva Gartner || Anamarija Agnič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Lara Drinovec || 14-15 || AMPK in avtofagija pri glukoznem/glikogenem metabolizmu || Aljaž Bratina || Barbara Jaklič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Martina Lokar || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Martina_Lokar:_Biotinilacija_proteinov Biotinilacija proteinov]|| Karmen Mlinar || Luka Gnidovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Marko Pavleković || 16 || Vloga sukcinata kot ligand z G proteini vezanega receptorja GPR91 || Tina Zavodnik || Jernej Imperl || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Valeriya Musina || 16 || Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na celične procese || Meta Kodrič || Laura Gašperšič || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Tina Kolenc Milavec || 16 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Kolenc_Milavec:_Intermediati_Krebsovega_cikla_kot_signalne_molekule_pri_vnetnem_in_protivnetnem_odgovoru Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule pri vnetnem in protivnetnem odgovoru]|| Neža Žerjav || Nika Boštic || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Andrej Špenko || 17 || Regulacija oksidacije maščobnih kislin v skeletnih mišicah || Doroteja Armič || Eva Gartner || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Tadej Medved || 17 || Vpliv oksidacije maščobnih kislin na usodo celic || Sanja Stanković || Aljaž Bratina || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Klementina Polanec || 17 || moj naslov || Martina Lokar || Karmen Mlinar || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Rebeka Dajčman || 17 || Ketonska telesa kot signalni metaboliti || Marko Pavleković || Tina Zavodnik || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Sumeja Kudelić || 18 || Vpliv cistationin γ-liaze in ATF4 pri Huntingtonovi bolezni|| Valeriya Musina || Meta Kodrič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Matija Ruparčič || 18 || moj naslov || Tina Kolenc Milavec || Neža Žerjav || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Maks Kumek || 18 || moj naslov || Andrej Špenko || Doroteja Armič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Anže Šumah || 19 || moj naslov || Tadej Medved || Sanja Stanković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Barbara Jaklič || 19 || moj naslov || Klementina Polanec || Martina Lokar || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Gašper Anton Komatar || 19 || Kako športna vadba pospeši biosintezo mitohondrijev in vpliva na zdravje || Rebeka Dajčman || Marko Pavleković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Praznik Liza || 19 || moj naslov || Sumeja Kudelić || Valeriya Musina || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Lara Hrvatin || 20 || Fotorespiracija in načini izboljšanja fotosinteze || Matija Ruparčič || Tina Kolenc Milavec || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Sonja Gabrijelčič || 20 || moj naslov || Maks Kumek || Andrej Špenko || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Anastasija Nechevska || 20 || moj naslov || Anže Šumah || Tadej Medved || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Liza Ulčakar || 21 || Vloga interakcij med lipidnimi kapljicami in organeli pri homeostazi lipidov|| Barbara Jaklič || Klementina Polanec || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Maja Škof || 21 || moj naslov || Gašper Anton Komatar || Rebeka Dajčman || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Ajda Godec || 21 || Biosinteza leukotriena B4 || Praznik Liza || Sumeja Kudelić || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Neža Blaznik || 22 || moj naslov || Lara Hrvatin || Matija Ruparčič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Urša Štrancar || 22 || moj naslov || Sonja Gabrijelčič || Maks Kumek || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Anamarija Agnič || 22 || moj naslov || Anastasija Nechevska || Anže Šumah || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Sanja Stanković || 23 || moj naslov || Liza Ulčakar || Lara Drinovec|| 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Luka Gnidovec || 23 || moj naslov || Maja Škof || Gašper Anton Komatar || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Jernej Imperl || 23 || moj naslov || Ajda Godec || Praznik Liza || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Laura Gašperšič || 23 || moj naslov || Neža Blaznik || Lara Hrvatin || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Nika Boštic || 23 || moj naslov || Urša Štrancar || Sonja Gabrijelčič || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2018|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Seminar 2018

2018-11-13T14:52:16Z

Ajda Godec: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Eva Gartner || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Eva_Gartner:_Wnt_signalizacija_in_njena_vloga_pri_sr.C4.8Dni_fibrozi Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi] || Anamarija Agnič || Anastasija Nechevska || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Aljaž Bratina || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Alja.C5.BE_Bratina:_Pomen_razli.C4.8Dnih_signalnih_poti_pri_staranju Pomen različnih signalnih poti pri staranju]|| Lara Drinovec || Liza Ulčakar || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Karmen Mlinar || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Karmen_Mlinar:_Signalizacija_in_odzivi_na_abiotski_stres_pri_rastlinah Signalizacija in odzivi na abiotski stres v rastlinah] || Luka Gnidovec || Maja Škof || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Tina Zavodnik || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Zavodnik:_Mehani.C4.8Dna_transdukcija_in_proteini_Piezo Mehanična transdukcija in proteini Piezo] || Jernej Imperl || Ajda Godec || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Meta Kodrič || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Meta_Kodri.C4.8D:_Svetlobne_signalne_poti_za_uravnavanje_fotomorfogeneze Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze] || Laura Gašperšič || Neža Blaznik || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Neža Žerjav || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Ne.C5.BEa_.C5.BDerjav:_Vloga_kaspaz_pri_celi.C4.8Dni_smrti Vloga kaspaz pri celični smrti] || Nika Boštic || Urša Štrancar || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Doroteja Armič || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Doroteja_Armi.C4.8D:_Bifunkcionalen_encim_PFK-2.2FFBPaza-2_in_njegova_vloga_v_metabolizmu_glukoze Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze] || Eva Gartner || Anamarija Agnič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Lara Drinovec || 14-15 || AMPK in avtofagija pri glukoznem/glikogenem metabolizmu || Aljaž Bratina || Barbara Jaklič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Martina Lokar || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Martina_Lokar:_Biotinilacija_proteinov Biotinilacija proteinov]|| Karmen Mlinar || Luka Gnidovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Marko Pavleković || 16 || Vloga sukcinata kot ligand z G proteini vezanega receptorja GPR91 || Tina Zavodnik || Jernej Imperl || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Valeriya Musina || 16 || Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na celične procese || Meta Kodrič || Laura Gašperšič || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Tina Kolenc Milavec || 16 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Kolenc_Milavec:_Intermediati_Krebsovega_cikla_kot_signalne_molekule_pri_vnetnem_in_protivnetnem_odgovoru Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule pri vnetnem in protivnetnem odgovoru]|| Neža Žerjav || Nika Boštic || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Andrej Špenko || 17 || Regulacija oksidacije maščobnih kislin v skeletnih mišicah || Doroteja Armič || Eva Gartner || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Tadej Medved || 17 || Vpliv oksidacije maščobnih kislin na usodo celic || Sanja Stanković || Aljaž Bratina || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Klementina Polanec || 17 || moj naslov || Martina Lokar || Karmen Mlinar || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Rebeka Dajčman || 17 || Ketonska telesa kot signalni metaboliti || Marko Pavleković || Tina Zavodnik || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Sumeja Kudelić || 18 || Vpliv cistationin γ-liaze in ATF4 pri Huntingtonovi bolezni|| Valeriya Musina || Meta Kodrič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Matija Ruparčič || 18 || moj naslov || Tina Kolenc Milavec || Neža Žerjav || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Maks Kumek || 18 || moj naslov || Andrej Špenko || Doroteja Armič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Anže Šumah || 19 || moj naslov || Tadej Medved || Sanja Stanković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Barbara Jaklič || 19 || moj naslov || Klementina Polanec || Martina Lokar || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Gašper Anton Komatar || 19 || Kako športna vadba pospeši biosintezo mitohondrijev in vpliva na zdravje || Rebeka Dajčman || Marko Pavleković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Praznik Liza || 19 || moj naslov || Sumeja Kudelić || Valeriya Musina || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Lara Hrvatin || 20 || Fotorespiracija in načini izboljšanja fotosinteze || Matija Ruparčič || Tina Kolenc Milavec || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Sonja Gabrijelčič || 20 || moj naslov || Maks Kumek || Andrej Špenko || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Anastasija Nechevska || 20 || moj naslov || Anže Šumah || Tadej Medved || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Liza Ulčakar || 21 || Vloga interakcij med lipidnimi kapljicami in organeli pri homeostazi lipidov|| Barbara Jaklič || Klementina Polanec || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Maja Škof || 21 || moj naslov || Gašper Anton Komatar || Rebeka Dajčman || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Ajda Godec || 21 || Biosinteza leuktoriena B4 || Praznik Liza || Sumeja Kudelić || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Neža Blaznik || 22 || moj naslov || Lara Hrvatin || Matija Ruparčič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Urša Štrancar || 22 || moj naslov || Sonja Gabrijelčič || Maks Kumek || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Anamarija Agnič || 22 || moj naslov || Anastasija Nechevska || Anže Šumah || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Sanja Stanković || 23 || moj naslov || Liza Ulčakar || Lara Drinovec|| 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Luka Gnidovec || 23 || moj naslov || Maja Škof || Gašper Anton Komatar || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Jernej Imperl || 23 || moj naslov || Ajda Godec || Praznik Liza || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Laura Gašperšič || 23 || moj naslov || Neža Blaznik || Lara Hrvatin || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Nika Boštic || 23 || moj naslov || Urša Štrancar || Sonja Gabrijelčič || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2018|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2017 Povzetki seminarjev

2017-05-29T08:13:34Z

Ajda Godec: /* Ana Scott: Naslov seminarja */

[[TBK2017-seminar|Nazaj na osnovno stran]]
===Ana Scott: Naslov seminarja===
Tekst ....

'''Patrik Levaćić: Prehrambni aditivi v sladkarijah ter žvečilnih gumijih lahko spremenijo funkcionanlnost in strukturo prebavnih celic'''

Vnos nano delcev titanovega dioksida (TiO2) preko prehrambenih izdelkov kot so sladkarije ter žvečilni gumiji je praktično nemogoče. Prebavni trakt služi kot pomembna meja med telesom in zunanjim okoljem. Cilj raziskave je bilo opazovanje posledic vnosa 30 nano meterskih delcev titanovega dioksida preko modela celične strukture tankega črevesja ter določitev kako akutna ter kronična izpostavljenost takim delcem lahko vpliva na funkcionalnost in strukturo celice. Postopek prepoznavanja TiO2 delcev je zelo kompleksen, navadno se uporablja Ramanova spektroskopija, ki izkorišča lastnosti molekule kot so vibracijska ter rotacijska stanja, s tem pa dobimo tako imenovani ''finger-print'' molekule, saj ima vsaka molekula svoje lastnosti in se po njih loči od drugih molekul. Rezultati raziskave so potrdili, da čeprav akutna izpostavljenost ni pustila resnejših posledic na celični strukturi, ima kronična izpostavljenost kar nekaj posledic na celičnem nivoju. Spremeni se funkcionalnost celice, nivo delovanja membranskih encimov vpade, spremeni se prav tako tudi struktura, saj se zmanjša sposobnost vsrkavanja nutrientov preko mikrovilov.

'''Tina Turel: Povezanost retrovirusov z razvojem možganov'''

Možgani človeka so bistveno bolj razviti od možganov drugih sesalcev in zato veliko težji za raziskovanje in razumevanje. Številne raziskave so dokazale, da bi transportni elementi (TE-ji), ki so še pred nekaj leti veljali za neuporaben del DNA, tako imenovan »junk DNK«, lahko bili odgovorni za današnjo stopnjo razvitosti človeških možganov.
Retrovirusi so posebna skupina virusov. Nekateri veljajo za škodljive (HIV), drugi pa so povsem neškodljivi. V našem DNA je več kot 1000 različnih retrovirusov. V raziskavi, ki jo je vodil Johan Jakobsson in se je odvijala v Lundu, so dokazovali pomembno vlogo ERV-ja, endogenega retrovirusa v razvoju človeških možganov. Želeli so pokazati, da nekaj tisoč ERV-jev, mnogi so primarno specifični, delujejo kot priklopna podlaga za epigenetske represorsko beljakovino TRIM28, ki vzpostavi lokalni hetero kromatin okoli ERV-jev. Retrovirusi lahko pri vsakem človeku reagirajo drugače, saj so tak tip genetskega materiala, da se lahko nahajajo v katerem koli delu v genomu. Različna izražanja ERV-ja pa bi bila lahko tudi razlog za možganske okvare, ki povzročijo bolezni, kot so ALS, shizofrenija in bipolarna motnja .

'''Nina Mezgec Mrzlikar: Regulacija gena DISC-1 kot potencialnega zdravila za shizofrenijo'''

Shizofrenija je duševna motnja, ki se razvije v zgodnjem odraslem obdobju. DISC-1 (Disrupted-In-Schizophrenia-1) je protein, kodiran z genom DISC-1 in je močno izražen v možganskem hipokampusu. Sodeluje pri razvoju aksonov in povezovanju celic. Caveolin-1 je ogrodni protein bistven pri regulaciji receptorjev na membranah in spodbuja razvoj novih povezav med živčnimi celicami. V tej raziskavi so znanstveniki proučevali vpliv proteina Cav-1 na izražanje gena DISC-1 v živčnih celicah. Ugotovljeno je bilo, da prekomerno izražen gen Cav-1 povzroči večje izražanje gena DISC-1 in drugih sinaptičnih proteinov, ki so potrebni za prenos živčnega signala. V miših, katerim so iz hipokampusa odstranili Cav-1 je posledično prišlo do manjšega izražanja DISC-1 in hkrati drugih sinaptičnih proteinov. Izguba Cav-1 torej zmanjšuje aktivnost sinaps, kar pa je vzrok za številne nevrodegenerativne bolezni, kot je tudi shizofrenija. Ugotovitve kažejo na pomembno vlogo proteina Caveolin-1 v celicah, saj vzdržuje pravilno delovanje receptorjev in s tem prenos živčnega signala.

'''Sonja Gabrijelčič: Ribosomske mutacije spodbujajo razvoj odpornosti proti antibiotikom v okolju z več zdravilnimi učinkovinami'''

Odpornost bakterij na antibiotike je v porastu po vsem svetu. Pojavlja se tako v državah v razvoju, kjer je predvsem posledica nekvalitetnih antibiotikov, kot v najrazvitejših državah sveta, kjer se pojavlja več in več patogenov, ki lahko preživijo v okolju z več zdravilnimi učinkovinami oziroma antibiotiki. Bakterije lahko pridobijo odpornost ali z izmenjavo mobilnih genetskih elementov ali z mutacijo genetskega materiala, ki je že v celici. V raziskavi, ki jo opisuje članek, so raziskovalci želeli opazovati slednje, zato so izmed bakterij, ki so lahko sočasno odporne na več antibiotikov, izbrali Mycobacterium smegmatis, sorodnico bakterije, ki povzroča tuberkulozo, in eno od predstavnic skupine bakterij, pri kateri do izmenjevanja plazmidov praktično ne pride. Klasificirali so tipe mutacij, do katerih je prišlo, in se osredotočili predvsem na mutacije, ki so se zgodile na mestih genoma, kjer se kodirajo proteini, ki so sestavni deli ribosomov. Ugotovili so, da so taki mutanti odporni na antibiotike z različnimi mehanizmi delovanja, ki jim niso bili še nikoli izpostavljeni, na antibiotike širokega spektra in poleg tega tudi na nekatere druge mehanske strese na membrane.

'''Daria Latysheva: Mehanski raztezek sproži hitro delitev epitelijskih celic'''

Mehansko aktivni kanalčki so membranski proteini, ki so neposredno odvisni od sile in pretvarjajo mehanske držljaje v električne oz. biokemijske signale. Piezo1 je mehansko aktiven ionski kanalček, ki spodbuja celično smrt v predelih z visoko gostoto celic. V raziskavi so ugotovili, da kotrolira tudi mitotsko delitev. Raziskali so mehanizem delovanja Piezo1 v procesu celične delitve. Pri nizki gostoti celic oz. kjer so celice raztegnjene se Piezo1 lokalizira na celični membrani ter se odpre; posledično sproži influks kalcija v celico. ERK1 se aktivira zaradi povečane koncentracije Ca2+ ionov, kar vpliva na aktivnost ciklina B v G2 fazi mitotske delitve in povzroči proliferacijo. Način, na kateri Piezo1 aktivira dva nasprotna procesa je odvisen od lokacije in načina aktivacije kanalčka. V predelih z nizko gostoto celic se Piezo1 lokalizira na celični membrani ter hitro aktivira celično delitev. Če so celice razporejene tesno druga ob drugi, se Piezo1 oblikuje v velike citiplazemske agregate in spodbuja celično smrt. Zaradi sposobnosti zaznave mehanskega raztezka ter prevelike in premajhne gostote celic Piezo 1 deluje kot homeostatski senzor in kontrolira število epitelijskih celic.

'''Nika Goršek: Nove študije razkrivajo delovanje molekulske črpalke, ki izloča zdravila proti raku'''

MRP1 ali »Multidrug resistance protein« je protein, ki spada v družino ABC-transporterjev. Pomemben je pri reguliranju redoks homeostaze, vnetij in sekrecije hormonov. Znano je tudi, da ima pomembno vlogo pri odpornosti na zdravila in njihovem črpanju iz celic. V raziskavi na univerzi Rockefeller so z uporabo elektronske kriomikroskopije določili njegovo zgradbo. Sestavljajo ga štirje glavni deli: dva transmembranska dela, ki tvorita telo transporterja, dva dela, ki vežeta ATP, motiv v obliki lase in N-terminalni transmembranski del. Čeprav ima MRP1 dva dela, ki bi lahko vezala ATP, pa tega veže le en, saj pri drugem delu pride do drugačnega zaporedja aminokislin. V raziskavah so dokazali, da mutacije določenih delov proteina vodijo v bolezenska stanja in da bi sprememba le ene aminokisline v zaporedju vplivala na aktivnost proteina. MRP1 ima le eno dvojno vezavno mesto, ki je pozitivno nabito. Pestrost substratov je zaradi takega vezavnega mesta veliko večja, kot pri nekaterih drugih znanih proteinih. Prenaša lahko organske, amfipatične in aninonske molekule, na primer zdravila proti raku, opijate, antidepresive in tudi nekatere za življenje pomembne snovi (hormoni in protivnetne molekule). Ob vezavi substrata se oblika proteina MRP1 spremeni, aktivnost pa se poveča. Po končanem transportu pa protein preide nazaj v prvotno, neaktivno obliko.

'''Dragana Savković: Stopnja preživetja evkariontskih celic po elektroforezni nanoinjekciji'''

Znotrajcelična dostava makromolekul je pomemben korak za terapevtske in raziskovalne namene. Za uvajanje tujih molekul v citoplazmo živih celic uporabljale so se metode, katere so se v večini primerov uporabljale za veliko število celic v kulturi in je splošno znano, da veliko število teh celic (do 50%) ne preživi ta proces. Da bi rešili ta problem, razvili so alternativno metodo znotrajcelične dobave, oziroma znotrajcelično elektroforezno nanoinjekcijo. V raziskavi so primerjali stopnjo preživetja celic injiciranih z pipeto s premerom 100 nm in pipeto s premerom 500 nm. Ugotovili so, da je stopnja preživetja z uporabo 100 nm pipeto veliko večja kot s 500 nm pipeto in tudi da ostale preživele celice kažejo bolj naraven cikel celic.

'''Urška Zagorc: Proteini, zgodnje opozorilo sladkorne bolezni tipa 1'''

Sladkorna bolezen tipa 1, ki je značilna predvsem za otroke in mladostnike, je posledica motnje v imunskem sistemu. Organizem uniči lastne celice v trebušni slinavki, ki proizvajajo inzulin. Ta omogoča glukozi iz hrane vstop v celico, s čimer celica dobi hrano in energijo. V raziskavi nemškega raziskovalnega centra za zdravje in okolje Helmholtz Zentrum München so sodelovali otroci, katerih ožji družinski član ima diabetes tipa 1 in otroci brez dednih dispozicij. Analizirali so krvne vzorce otrok z avto-protitelesi ter jih primerjala z vzorci otrok, ki ne kažejo znakov bolezni niti nimajo protiteles.Identificirali so 41 peptidov iz 26 proteinov, ki se razlikujejo v krvnih vzorcih tistih otrok s protitelesi in tistih brez. Glede na koncentracijo peptidov v treh proteinih (hepatocitni rastni faktor HGF, istem komplementa H in ceruloplazmin) in glede na starost otroka, so dosegli tudi boljšo oceno hitrosti razvoja bolezni. Večja koncentracija sistema komplementa H in hepatocitnega rastnega faktorja ter nižja koncentracija ceruloplazmina pri tem nižji starosti bolnika, pomenijo hitrejši napredek bolezni. Identificirani proteini nam pokažejo bolj natančno oceno stopnje pred pojavom simptomov. Zaradi njih je možno tudi ugotoviti ali ima bolnik s protitelesi, večjo ali manjšo možnost za razvoj sladkorne bolezni tipa 1 in kako hitro se bo bolezen razvila.

'''Anja Černe: Uporaba askorbata pri zdravljenju raka'''

Če askorbat vnesemo v organizem v manjših koncentracijah ima antioksidativne učinke, medtem ko se pri vnosu v večjih koncentracijah obnaša kot prooksidant. Farmakološko koncentriran askorbat povzroča tok izvenceličnega H2O2 v celico in vse celice, tako zdrave kot rakave, encimsko razgrajujejo H2O2, ki je zanje toksičen. Glavni encimi, ki razgrajujejo H2O2 pri velikih količinah so katalaze. Ker pa je katalaz v rakavih celicah malo, so rakave celice bolj dovzetne škodljive učinke, zato je askorbat zanje selektivno toksičen. Katalazna aktivnost v rakavih celicah lahko napove, kako se bo tumor odzval na terapijo z askorbatom. Pri nekaterih vrstah tkiv je rast tumorjev bolj upočasnjena, pri drugih manj (odvisnost od količine katalaz, ki jih tkivo vsebuje). Število aktivnih katalaznih monomerov na celico in ED50 (koločina snovi, ki učinkuje pri 50% osebkih) sta sorazmerna s konstanto celične razgradnje H2O2. Radikali, ki nastanejo pri reakciji med ionom kovine in H2O2, poškodujejo DNA, v kolikšni meri se to zgodi pa je odvisno od količine askorbata.

'''Jerneja Nimac: S CRISPR/Cas9 nad X-vezavno kronično granulomatozno bolezen'''

Kronična granulomatozna bolezen je dedna bolezen imunskega sistema, ki nastane zaradi mutacije v genu CYBB, ki kodira gp91phox. Slednji je katalitični center NADPH oksidaze 2 (NOX2), ki ima pomembno vlogo pri obrambi organizma pred okužbami. Mutacije v genu CYBB na kromosomu Xp21.1 pa so odgovorne za X-vezavno obliko kronične granulomatozne bolezni. Za popravljanje takšne monogenske mutacije so v raziskavi uporabili sistem CRISPR/Cas9. Ta sistem so za obrambo pred virusnimi okužbami razvile bakterije in arheje, gre pa za poseben od RNA odvisen sistem pridobljene imunosti, ki specifično prepozna in reže tujo tarčno DNA. V raziskavi so skušali s sistemom CRISPR/Cas9 popraviti mutacijo C676T na eksonu 7 gena CYBB. Z DHR testi so ugotovili, da s CRISPR/Cas9 popravljene mieloične celice obnovijo aktivnost NOX2 in ponovno izražajo protein gp91phox. S spreminjanjem količine ssODN pa so dokazali, da je stopnja popravljenih genov večja, če je količina ssODN večja, delež indelov pa se zmanjša. Prav tako so potrdili uspešno presaditev s CRISPR/Cas9 popravljenih krvotvornih matičnih in predniških celic in njihovo diferenciacijo v nepoškodovane mieloične in limfocitne celice v NSG miših v obdobju petih mesecev.

'''Barbara Slapnik: Holesterol v celični membrani'''

Holesterol je razporejen po celični membrani. Pomemben je za vzdrževanje membranske fluidnosti, membrano naredi bolj togo in manj prepustno. Njegova porazdelitev med zunanjim in notranjim fosfolipidnim slojem pa ni enakomerna. V raziskavi so razvili dopolnilne senzorje, ki omogočajo vpogled holesterola v obeh slojih sočasno in določili njegovo točno koncentracijo. Ugotovili so, da je koncentracija holesterola v zunanjem sloju celične membrane znatno višja kot koncentracija v notranjem sloju. Visoka koncentracija holesterola v zunanjem sloju celične membrane zmanjša njeno prepustnost, medtem ko nizka koncentracija holesterola v notranjem sloju omogoča celično sporočanje. Rezultati prikazujejo pomen transbilarne asimetrije holesterola v celični membrani in njegovo prerazporeditev za celično homeostazo, rast in razmnoževanje. Podajajo tudi povezavo med holesterolom v notranjem sloju celične membrane in rakom. Določili so točno koncentracijo holesterola, kar jim omogoča boljšo diagnostiko in zdravljenje raka, vendar so za to potrebne še nadaljnje raziskave. Rezultati prav tako predstavljajo osnovo za nadaljnje študije transbilarne dinamike in funkcij holesterola in drugih lipidov v celici.

'''Nadja Škafar: Dostava protitumorskih zdravil s pomočjo makrofagov in biorazgradljivih nanodelcev'''

Nanotehnologija igra pomembno vlogo v moderni medicini, še posebej na področju zdravljenja bolezni s tarčno dostavo zdravil. Glavna prednost nanodostavnih sistemov (NS) pred danes uveljavljenimi metodami zdravljenja raka je selektivna dostava protitumorskih učinkovin tumorskim celicam, kar zmanjša možnost pojava neželenih stranskih učinkov, s tem pa se bolniku omogoči boljša kakovost življenja med in po zdravljenju. Dosedanje raziskave na področju NS so temeljile na injiciranju nanodelcev v krvni obtok. Ker pa ob vnosu nanodelcev v telo prihaja do medsebojnega delovanja NS s celicami imunskega sistema, jih te, še preden lahko nanodelci dostavijo zdravila do željenega mesta, odstranijo s fagocitozo. Raziskovalca Jian Yang in Cheng Dong sta zato s svojo ekipo skušala razviti novo tehniko NS, ki problematiko reakcij med NS in makrofagi v bioloških sistemih odpravi tako, da makrofage uporablja kot nosilce nanodelcev do tumorskih celic. Rezultati so pokazali, da so lahko makrofagi uspešni nosilci nanodelcev ter da bi lahko bili NS takšnega tipa v prihodnosti uspešna metoda za zdravljenje številnih bolezni.

'''Špela Deučman: Raziskovanje vzrokov kronične zavrnitve presajenih pljuč'''

Pri presajenih organih je največja skrb zavrnitev, ki je lahko akutna ali kronična. Pri slednji presadek sčasoma izgubi funkcijo in odmre, kar lahko povzroči smrt prejemnika. Stopnja preživetja presaditve pljuč je nižja od vseh ostalih presaditev organov. Pri 50% pacientov se pojavi obliterantni bronhiolitis oz. BOS, ki je glavni razlog kronične zavrnitve pljuč. Namen raziskave je bil odkriti signalno pot med NFAT1 (transkripcijski faktor), β-cateninom (koregulator transkripcije), ATX (eksoencim) in LPA1 (receptor) oz. LPA (sporočevalec) ter predlagati potencialno terapevtsko vlogo LPA1 antagonistov ter ATX inhibitorjev z namenom, da bi preprečili BOS. Odkrili so pozitivno korelacijo ekspresije med β-cateninom in kolagenom I. Ker LPA prepreči razgradnjo aktivnega β-catenina in ker je za nastanek LPA odgovoren ATX, so raziskali mehanizme reguliranja ekspresije ATX. Ugotovili so, da ekspresijo ATX regulira transkripcijski faktor NFAT1. Znano je, da LPA povečuje znotrajcelično koncentracijo prostih Ca2+ ionov, ti pa so povezani z aktivacijo in jedrsko translokacijo NFAT1. To pomeni, da LPA regulira ekspresijo NFAT1 in posledično tudi ATX. Pri raziskovanju na miših so uporabili LPA1 antagoniste in ATX inhibitorje, ki so vidno zmanjšali napredek BOS.

'''Anže Jenko: Koriščenje kemiluminiscence dioksietanovih sond za prikazovanje celice'''

Kemiluminiscenčne sonde veljajo za eno izmed najbolj občutljivih diagnostičnih metod pri določanju encimske aktivnosti in koncentracije analita, kar v praktičnem življenju denimo koristi forenzikom. Ker pa je splošno uveljavljen princip koriščenje kemiluminiscence slabo dodelan in privede do velikih energetskih izgub. Raziskovalci so tako v sami raziskavi preizkušali kemiluminiscenčne in fluorescenčne lastnosti različnih derivatov Schaapovega adamatiliden-dioksetana, na katerega so vezali različne substituente, ki pa so imeli znaten vpliv. Na ta način so želeli ustvariti enokomponentni sistem, z visoko intenziteto izseva, ki pa je tudi primeren v fizioloških razmerah. To jim je na koncu tudi uspelo. Na najbolj ustrezni izmed sintetiziranih sond, so hidroksilno skupino na benzenovem obroču ''zamaskirali'' z drugačnimi zaščitnimi skupinami. Vsaka izmed teh skupin pa je bila občutljiva na različne molekule (denimo beta-galaktoza na encim beta-galaktozidaza), reakcija s katerimi je povzročila destabilizacijo - vzbujeno stanje sonde in posledično kemiluminiscenco. Ta mehanizem je pokazal visoko mero selektivnosti, zato so ga lahko praktično koristili pri mikroskopskem prikazovanju celic. Pri celicah z genom za prekomerno izražanje beta-galaktozidaze je z uporabo relavantne sonde (ustrezna zaščitna skupina) prišlo do obarvanja, pri takšni, kjer pa tega encima ni bilo prisotnega, pa do obarvanja ni prišlo.

'''Jana Kotnik: Sintetični membranski receptorji'''

Znanstveniki na Univerzi Bristol so našli način za posnemanje sporazumevanja celic z okolico. Ustvarili so sintetični receptor, ki se odziva na kemične signale podobno kot njegova naravna ekvivalenta. Vsadijo se v membrano in so sposobni vezave določenih ligandov. Receptor je sestavljen iz 3 delov: Vezavnega žepka konstruiranega iz kationskega kovinskega kompleksa, hidrofobne oligomerne vijačnice (jedro receptorja) in sonde s pirensko fluorescenco. V raziskavi so na podlagi sevanja sonde preučevali vpliv kiralnih ligandov na receptor in njegovo obliko v topilu ter v umetnih membranah veziklov. Umetni receptorji ponujajo redko možnost primerjanja obnašanja (oblike) molekul v raztopini in v membrani ter priložnost raziskovanja učinka membrane na razporeditvene preference in vezave ligandov. Kontroliranje prenašanja biokemijskih informacij čez fosfolipidni dvosloj predstavlja veliko priložnost za razvoj sintezne biologije - predstavljamo si lahko npr. umetne celice, s katerimi bi z nadzorovanjem receptorjev v membranah proizvajali koristne materiale ali zdravila.

'''Andrej Špenko: Nova tehnika za regeneracijo kostnega tkiva'''

Ruski znanstveniki so odkrili učinkovit način za izdelavo mineraliziranih vlaken, ki so mehansko odporna in hkrati celicam nudijo ugodne pogoje za preživetje. Vlakna, ki so bila narejena z elektrostatskim sukanjem, da so čim bolj posnemala človeški matriks, so potopili v raztopino Na2CO3 in CaCl2. Na vlaknih so se je tako formirali kristali CaCO3, katerih oblika pa je bila zelo odvisna od pogojev, v katerih so nastali. Pri nadaljnjih poskusih so raztopine z ogrodjem obdelali z ultrazvočnim valovanjem, da so ioni prodrli tudi v spodnje sloje ter v sredino vlaken. Ugotovili so, da se s pomočjo ultrazvočnega obdelovanja v prvih 30 sekundah formira vaterit, nestabilna oblika kristalov CaCO3, ki vlakna v nekaj kratkih ponovitvah popolnoma obda. Pri kasnejših ponovitvah pa se formira kalcit, ki pa je bolj pravilen in mehansko odporen kot vaterit. Če bi vlakna pustili v raztopini za daljše časovno obdobje, bi imel kalcit čas, da se formira. To bi pomenilo manjšo mehansko obstojnost, saj bi se na vlaknih raje formirali pravilni kristali, kot pa da bi vlakna obdali in tako pripravili enakomeren sloj okoli vlaken, na katere bi se kasneje zlagali dodatni kristali. Znanstveniki so v dokončana vlakna položili človeške kožne celice in po treh dneh so testi pokazali, da je sposobnost preživetja celic skoraj enaka tisti, v kontroli.

'''Ana Maklin: Termična stabilnost proteinov'''

Temperatura ima velik vpliv na fiziologijo celice. Organizmi rastejo najbolj optimalno le v omejenih temperaturnih razsežnostih. Občutljivost na temperaturo je v veliki meri posledica vpliva temperature na strukturo in funkcijo proteinov. Leuenberg et al. so opazovali termično stabilnost proteinov, z uporabo postopka LiS-MS, ki omogoča preučevanje proteinov neposredno v celičnem matriksu. Postopek so uporabili na ''Escherichia coli'', ''Saccharomyces cerevisiae'', ''Thermus thermophilus'' in človeških celicah, pridobili pa so podatke za več kot 8000 proteinov. Med raziskavo so prišli med drugim do naslednjih spoznanj: (i) do temperaturno sprožene celične smrti pride zaradi izgube določenih proteinov s ključnimi funkcijami, (ii) stabilnost nekaterih proteinov je posledica evolucijskega ohranjanja, (iii) dolžina proteinov in njihova termična stabilnost sta v obratnem sorazmerju, (iv) proteini, manj podvrženi termični agregaciji, so stabilnejši, (v) stabilni proteini imajo več beta ploskev, nestabilni pa alfa vijačnic.

'''Luka Gregorič: Merjenje količine urina v plavalnih bazenih s pomočjo merjenja koncentracije umetnih sladil'''

Uriniranje v bazene povzroča precej preglavic veliko lastnikom bazenov in tudi njihovim obiskovalcem. Zato se raziskovalci že dolgo trudijo ugotoviti učinkovit način s katerim bi lahko nadzirali koncentracijo urina v bazenih, da bi lahko se tudi lažje in bolj učinkovito spopadli z razkuževanjem le tega. Zato so začeli meriti vsebnost umetnega sladila ACE (acetilsulfam-K), ki se pojavlja v človeškem urinu in je zelo odporen na zunanje dejavnike (na velike spremembe pH in temperature). Hkrati pa je njegove koncentracije v podtalnici relativno malo, tako da velika odstopanja le tega ne moremo pripisati zunanjim dejavnikom. Koncentracija ACE v urinu je 4000 μg/L. Testirali so 21 različnih bazenov in 8 vročih vrelcev v Kanadi. Zbiranje vzorcev je trajalo 3 tedne. Testirali so jih skupaj z praznim vzorcem in ugotovili, da ima voda v bazenih in vročih vrelcih veliko večjo koncentracijo ACE kot prazen vzorec (ki je imel koncentracijo 0 ng/L) in podtalnica (10 ng/L). Te koncentracije so imele razpon vse od najmanjših vrednostih 50 ng/L do 7100 ng/L v vročih vrelcih. Ker v bazenih ni nobenega drugega očitnega vira ACE kot človeški urin so zaključili, da je v tistih bazenih, ki vsebujejo več ACE, tudi koncentracija urina večja.

'''Andrej Race: Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency'''

NADPH is an important molecule for cells biosythesis and detoxification of H2O2,because of its reductive power. Glucose-6-phosphate (G6PD) is one of the enzymes that is responsible for its production in the pentose phosphate pathway. The lacking of this protein can create problems for some blood cells, like erythrocytes. Erythrocytes do not have any other way of making this essential cofactor, so this deficiency may lead to their destruction and disease called favism. The distribution of this disease is remarkably similar to distribution of malaria, leading to a research that found out that parasitized erythrocytes in G6PD deficient person are more likeliy to get phagocytised by white blood cells and with that better chance of defending against this disease. The other type of cells that are affeceted by this deficiency are granulocytes, they require NADPH for chain of reactions that lead to formation of neutrophil extracellular trap, protection against bacteria and fungi. This lead to a conclusion that severe G6PD deficient people should be treated with antibiotics and antimycotics.

'''Bogatinova Emilija: NO3-anioni lahko delujejo kot Lewisovo kislino v tvrdnem stanju'''

Anioni kot so NO3 so tipični elektron donatorji. Vender izračuni napovedujejo da, je poraudelitev naboja NO3 je anizotropen in minimalen na dušiku. Tukaj so pokazali da ko je naboj nitrata v zadosni meri ovira odmevalo čež večjih obročjih, ki lahko stapijo v interakcijo z elektronskimi bogatimi partnerji. Ankete o Cambridge strukturnih Database in Protein Data Bank kažejo geometrijske nastavitve nekaterih kisika in žvepla, ki vsebuje subjektov okrog anioni nitrata, ki so v skladu s tem "π-lujenj lepljenje". Izračuni pokažejo donor-akceptor orbitalne interakcije, ki potrjujejo kontraintuitivnim Lewisova π-kislost nitrata.

'''Zaveršek Nika: BAKTERIJE LAHKO S POMOČJO SINTETIZIRANIH ŽELEZOVIH MOLEKUL POSTANEJO ELEKTRIČNI GENERATORJI'''
Bakterije in še nekateri ostali mikroorganizmi so samoobnovljivi 'nanoreaktorji', ki živijo povsod na Zemeljskem površju. Če bi ti organizmi lahko anodam oddali električno energijo, bi bil to nov način pridobivanja tako imenovane čiste energije. Problem je, da veliko organizmov ne more oddati električne energije, ki nastane pri njihovem metabolizmu, elektrodi.[1] Zanimivo pa se je vprašati, kako je sploh možno, da bi bakterije lahko oddale elektrone glede na to, da elektrode niso prisotne v naravnem okolju teh bakterij. Ena izmed teorij je, da so nekatere bakterije zmožne oddajanja elektronov elektrodi zato, ker v naravi elektrone lahko oddajo nekaterim netopnim mineralom. poleg tega, da bakterije lahko oddajajo elektrone, jih lahko tudi sprejemajo in jih uporabijo, da optimizirajo svoj metabolizem. Električni tok nastaja pri bakterijskem metabolizmu, ki poteka po principu redoks reakcij, iz organskih goriv. To lastnost bakterij bi lahko uporablili za nižje stroške ćiščenja vode, saj bi bakterije razgradile ogranske snovi, ki so v vodi, poleg tega pa bi proizvedle elektriko.

'''Zupan Tanja: Razlike v funkcionalni povezavi možganov v mirujočem stanju med športniki in ne športniki
Strokovnjaki na področju finih motoričnih sposobnosti, ki so povezane s spremembami v strukturi možganov so preučevali razliko v funkciji in povezljivosti možganov športnikov in ne športnikov v stanju mirovanja (v stanju mirovanja, v naših možganih delujejo tri povezave, ki so povezane z motoričnimi funkcijami: DMN (default mode network), FPN (frontoparietal network) in MN (motor network)) s pomočjo magnetne resonance. Pri raziskavi je sodelovalo dvaindvajset zdravih odraslih moškega spola med 18-25 let. Od tega 11 športnikov in 11 ne športnikov, ki pa se po starosti ujemajo s športniki. Rezultati so pokazali, da ukvarjanje z visoko aerobično vadbo v mladosti vpliva na razlike, ki nastanejo v povezovanju možganov, ki so opazne v stanju mirovanja. Posledice gibanja niso opazne le pri motoričnih sposobnostih ampak tudi pri delovanju izvršilnih funkcij, prostorski orientaciji in pri spominskih sposobnostih. Razlike v povezovanju se lahko pojavijo kot odziv na kognitivne zahteve teka na dolge razdalje v kombinaciji z aerobno vadbo. Poleg tega pa lahko kognitivne zahteve pri visoki intenzivni vzdržljivi vadbi privedejo tudi do razlik pri opravljanju dejavnosti, ki pa niso povezane s športom. V prihodnjih raziskavah na tem področju bodo v raziskovanje vključili tudi rekreativne športnike in ženske, ki v to raziskavo niso bili vključeni.

'''Mikulič Vernik Nika: ONKOLITIČNI VIRUSI, KI SELEKTIVNO NAPADAJO RAKASTE CELICE'''

Onkolitični virusi lahko s svojimi replikacijami znotraj gostiteljskih celic uničijo tumorska tkiva. Da bi izboljšali to njihovo sposobnost, znanstveniki neprestano razvijajo nove, močnejše viruse, ki pa s svojo močjo postajajo zmeraj bolj toksični. Zaradi tega narašča potreba po razvoju visoko specifičnih virusov, ki bi napadali zgolj tumorska tkiva, zdrava pa bi pustili nepoškodovana. Raziskovalci so določili optimalno sekvenco proteinov na 3'-UTR virusne mRNA, potrebno za onkoselektivnost virusov. Izdelali so adenovirus AdCPE s to sekvenco in primerjali njegovo učinkovitost pri uničevanju tumorskega tkiva z učinkovitostjo divjega tipa virusa ''in vitro'' in ''in vivo''. Primerjali so tudi vpliv virusa na normalno tkivo in prišli do zaključkov; 1) Virus AdCPE ni nič manj učinkovit pri uničevanju tumorskega tkiva kot divji tip virusa; 2) AdCPE je dosti manj toksičen od divjega tipa virusa.

'''Martin Špendl: NANOGRAFEN-RENIJEV KOMPLEKS ZA SELEKTIVNO REDUKCIJO OGLJIKOVEGA DIOKSIDA

Pereč problem razvitega sveta postajajo emisije CO2, ki so stranski produkt uporabe fosilnih goriv. Problem pridobivanja energije iz obnovljivih virov pa je ta, da so izkoristki zelo nizki oz. pridobljene energije ne moremo shraniti. Eden od načinov pridobivanja energije iz sonca ter hkratno odstranjevanje CO2 iz ozračja je omogočeno s selektivno redukcijo in z uporabo nanografen-renijevega kompleksa kot elektrokatalizator in fotokatalizator. Ko je molekula izpostavljena sončni svetlobi, lahko reducira CO2 v CO, ki služi kot zaloga energije in je komponenta sintetičnega plina (ang. syngas) skupaj z vodikom. Mešanico plinov se uporablja v gorilnih celicah, ki kemično energijo pretvorijo v električno energijo z zelo visokim izkoristkom in relativno malo emisijami. V primeru mešanice ogljikovega oksida in vodika je stranski produkt le CO2, ki je bil pridobljen iz zraka[2].
Dosedanji katalizatorji redukcije ogljikovega dioksida niso dosegali dovolj visokega izkoristka, da bi se metode začele uporabljati na industrijskem nivoju. Zato so znanstveniki začeli proučevati molekularne katalizatorje, saj lahko le-te usmerijo reakcijo preko več elektronov in s tem dosežejo višje izkoristke ter večjo selektivnost katalizirane reakcije. Kljub temu ostaja neznanka kako zmanjšati razliko v potencialih med redukcijskim potencialom katalizatorja ter same reakcije.

'''Ines Medved: KAKO ZMANJŠAN VNOS KALORIJ VPLIVA NA PROCES STARANJA
Mnoge raziskave so pokazale, da zmanjšan vnos kalorij upočasni proces staranja in preprečuje mnoge bolezni kot so diabetes, hipertenzija, rak … Daljša življenjska doba je povezana s celično homeostazo, zmanjšano celično rastjo in stopnjo sinteze proteinov. Ker se proteini sintetizirajo na ribosomih, morajo ti dobro delovati. Njihovo delovanje nadzoruje RQC (ang. Ribosome quality control complex). Raziskovalci so ugotovili, da se je celična rast miši, ki so bile na dieti z malo kalorij, zmanjšala za 25 %, prav tako se je zmanjšala tudi respiratorna kapaciteta jeter. Po desetih tednih privajanja na dieto so iz meritev ugotovili, da so bili proteini v homeostazi, zato so lahko izračunali hitrost zamenjave proteinov. Proteine so razdelili v tri skupine, in sicer v statične, v tiste, ki se hitro izmenjujejo in nastajajo počasi ali pa hitro, ter v proteine, ki 'skačejo' med prvo in drugo skupino. S polisomsko analizo so ugotovili, da je bilo v miših, ki so bile na dieti z malo kalorij, število aktivnih ribosomov manjše.

'''Uroš Prešern: Nukleaza, ki povzroči partanatos oziroma od PARP-1 odvisno celično smrt'''

Partanatos je ena izmed vrst celične smrti, ki nastopi zaradi prevelike aktivnosti poli(ADP-riboza) polimeraze 1 (PARP-1) v jedru. Pogost je v primeru možganske kapi, infarkta in nevrodegenerativnih boleznih, zaradi česar bi boljše poznavanje samega procesa omogočilo razvoj novih načinov zdravljenja teh obolenj. V predhodnih raziskavah so ugotovili, da partanatos nastopi, ko molekule poli-ADP-riboze, ki jih PARP-1 sintetizira, preidejo iz jedra v citosol, kjer aktivirajo premestitev indukcijskega faktorja apoptoze (AIF) iz mitohondrijev v jedro. Temu sledi razrez DNA. Nukleaza, ki povzroči razrez DNA, je bila do nedavnega manjkajoči člen v partanatosu. Skupini raziskovalcev je uspelo odkriti, da je iskana nukleaza inhibitorni dejavnik migracije makrofagov (MIF). Pokazali so, da se med partanatosom MIF veže na AIF in se skupaj z njim premesti v jedro, kjer povzroči fragmentacijo DNA. Inhibicija nukleazne aktivnosti MIF se je v modelu možganske kapi pri miših odrazila v 75-odstotnem zmanjšanju volumna prizadetega tkiva, pospešeno pa je bilo tudi okrevanje. Rezultati raziskave odpirajo potencialne možnosti za zdravljenje akutnih in kroničnih nevroloških bolezni, v katerih nastopi partanatos.

'''Urban Hribar: Modifikacija encimov FAS in biogoriva'''

Z modifikacijo encimskih kompleksov glivični FAS (fatty acid synthases) tipa 1 lahko razširimo spekter njihovih produktov. FAS komplekse sestavlja 7 kataliznih podenot in ene podenote nosilnega proteina ACP (acyl carrier protein). FAS kvasovk Rhodosporidium toruloides (RtFAS) in Aplanochytrium kerguelense (AkFAS) imajo podvojene ACP podenote. Če eno od teh podenot odstranimo to ne vpliva na delovanje encima. V teh encimih lahko zato nadomestimo eno od ACP podenot z drugim encimom kot naprimer sTE (short-chain thioesterase). Encim sTE hidrolizira acil-ACP/CoA v kratke in srednje dolge maščobne kisline (short/medium-chain fatty acids - S/MCFAs). Če celice kvasovk kot naprimer S. cerevisiae izražajo AkFAS ali RtFAS, ki imajo eno od ACP skupin zamenjano z sTE, proizvedejo 5-13 krat večjo količino izvenceličnih S/MFAs. Podobno lahko v FAS S. cerevisiae (ScFAS) dodamo encim Mks2. Ta encim bi spremenil reakcijski mehanizem ScFAS, tako da bi ta proizvajal večje količine metilih ketonov. Po pričakovanjih celice, ki izražajo modificirani ScFAS proizvedejo 10 krat več metilnih ketonov kot celice, ki so izražale naravni ScFAS. Hkrati pa celice z modificiranim encimom proizvajajo manj specifičnih maščobnih kislin. S temi metodami lahko nadziramo katere produkte lahko pridobivamo z glivičnimi celičnimi tovarnami, kar bi lahko tudi privedlo do velikih napredkov v proizvodnji biogoriv.

'''Lea Knez: Hemoglobin Kirklareli'''

Mutacije hemoglobina lahko povzročijo širok spekter fenotipičnih različic proteina, nekatere lahko vodijo do nestabilnega kompleksa in razgradnje rdečih krvničk. Mutacijo Kirklareli so odkrili pri 23-letni pacientki, ki so ji diagnosticirali anemijo, enako mutacijo pa je imel tudi oče, zato so jo poimenovali po Turškem mestu v katerem je odraščal. Oba imata v α podenoti na poziciji 58 zamenjan histidin za levcin, presenetljivo pa oče ni anemičen, je pa kadilec z visokim deležem HbCO v krvi. Mutirana α podenota avtooksidira 8x in izgublja hem 200x hitreje kot navadna α apodenota v zdravem hemoglobinu, saj levcin ni več sposoben tvoriti vodikove vezi s kisikom. Posledično se protein denaturira zelo hitro in ni več zmožen opravljati svoje funkcije. Mutirana alfa podenota ima pa 80.000x večjo afiniteto za CO kot za O₂, kar povzroča hitro in obstojno vezavo med hemoglobinom in CO, ta kompleks pa celoten protein stabilizira in prepreči avtooksidacijo, zato tudi oče, ki kadi, nima anemije.

'''Špela Supej: Nov način kontroliranja celične biologije s pomočjo svetlobe'''

Optogenetika je biološka tehnika, ki uporablja svetlobo za kontroliranje celičnih procesov v živih tkivih, tipično v nevronih. Proteinom se ob absorpciji vidne svetlobe spremeni aktivnost, kar se uporablja za nadzorovanje celične fiziologije. Raziskava, s pomočjo katere so znanstveniki odkrili nov način kontroliranja celične biologije s pomočjo svetlobe, je potekala leta 2017 na Univerzi v Alberti. Glavni protein, imenovan fotocepitveni protein (ang. photocleavable protein) ali PhoCl, ob izpostavitvi svetlobi razpade na dva dela in tako omogoča opazovanje in raziskovanje aktivnosti znotraj celice na načine, ki prej niso bili mogoči. PhoCl je torej novo optogenetsko orodje, ki »ujame« proteine v neaktivnem stanju s kovalentno vezjo, kjer edini način aktivacije predstavlja ireverzibilen fotoodcep. Vsa ostala orodja, ki so bila do sedaj odkrita, uporabljajo reverzibilen odcep in za aktivnost proteinov zahtevajo konstanto osvetlitev, kar lahko vodi do fototoksičnosti. Prednost sistemov PhoCl je ravno to, da ko svetloba povzroči aktivacijo proteinov, ti ostanejo aktivni tako dolgo, dokler niso uničeni v normalnih procesih v celici.

'''Anja Tavčar: Selenomabi - obstojna in učinkovita protitelesa, konjugirana s citostatiki'''

Protitelesa, konjugirana s citostatiki (ang. antibody-drug conjugates oz. ADC), predstavljajo eno najbolj obetavnih področji pri boju z rakom, saj omogočajo razvoj za zdravljenje ključnih lastnosti : velika stabilnost, učinkovitost ter specifičnost delovanja (izključno na rakave celice) oz. minimalna toksičnost za zdrave celice v organizmu. S konjugacijo protiteles na točno izbranih mestih so znanstveniki razvili novo generacijo ADCjev, ki izkoriščajo visoko in zelo specifično reaktivnost aminokisline selenocistein (Sec), na katero so preko jodoacetamidnega veznega člena konjugirali citostatik. Kompleks se je v in vitro ter in vivo raziskavah na celicah raka na prsih ter limfocitih B izkazal za izjemno stabilnega in učinkovitega, zaradi izjemne selektivnosti pri delovanju pa odpira številne možnosti za prenos v klinično rabo.

'''Maja Vrabec: Komunikacija med virusi usmerja odločitev za litični ali lizogeni cikel'''

Fag phi3t spada v skupino fagov, ki lahko okužijo bakterijo preko litičnega ali lizogenega cikla. Odločitev med litičnim in lizogenim ciklom usmerjajo trije geni: AimR, AimP in AimX. Ob začetku okužbe kulture bakterij ''Bacillus subtilis'' v gojenem mediju (ta vsebuje proteine, ki se sproščajo ob okužbi bakterij s fagi) fag phi3t izrazi gena AimR in AimP. AimR kot dimer, vezan na fagov DNK, aktivira ekspresijo AimX, ki promovira litični cikel, zato je v začetku okužbe precej izrazita liza bakterijskih celic. Istočasno se izrazi tudi AimP, ki se izloči v medij, kjer ga zunajcelične proteaze predelajo v zrel komunikacijski peptid, imenovan ''arbitrium'' (v primeru phi3t je to SAIRGA). Po nekaj ciklih okužbe se v mediju koncentracija peptida občutno poveča in ko fag napade še neokuženo bakterijo, je koncentracija peptida v bakterijski celici, kamor pride s transporterjem OPP, dovolj velika, da veže AimR in tako povzroči disociacijo le-tega z vezavnega mesta v fagovem DNK. Ob vezavi se AimR pretvori iz aktivnega dimera v neaktiven monomer, s čimer utiša ekspresijo AimX in s tem promovira lizogenijo, zato po nekaj ciklih okužbe delež lizogeniranih bakterij močno naraste.

'''Luka Fratina: Visokoresolucijsko 3D slikanje živih celic s fononi podoptičnih valovnih dolžin'''

Opazovanje živih celic je pomembno za študijo struktur in funkcij celice. Biološko pomembne strukturne informacije, ki jih želimo gledati v živh celicah, ležijo izven dosega svetlobnih mikroskopov. Ti so omejeni na valovne dolžine vidne svetlobe (Rayleighova limita), saj lahko fotoni v celici povzročijo nastanek reaktivnega kisika ali pa direktno poškodujejo DNA, kar lahko povzroči nenormalno delovanje celice, redkeje pa tudi celično smrt. Za višje resolucije bi potrebovali fotone z krajšo valovno dolžino, kar pa bi še povečalo poškodbe celic. Obstajajo tehnike, kot sta STED in STORM, ki dosegajo višje resolucije, pri tem se uporabljajo visokofotonske doze in fluorestenčni označevalci, ki pa lahko poškodujejo žive preparate. Opazovanje individualne celice z mehanskim kontrastom daje primerljive rezultate kot svetlobna mikroskopija. Dosedanje metode niso kompatibilne z živimi vzorci. Te metode pogoste potrebujejo težke pogoje za celice in so lahko uničevalne. Žive celice bi lahko opazovali pod Rayleighovo limito z fononi podoptičnih valovnih dolžin.

'''Ajda Krč: Ubikvitin-protein ligaza CHIP z regulacijo razpada inzulinskega receptorja in proteostaze razkriva možne razloge za staranje organizma'''

Ubikvitin je majhen regulatorni protein ki v procesu ubikvitinacije označuje proteine in druge makromolekule za razgradnjo. V procesu ubikvitinacije sodelujejo številni encimi, eden glavnih pri človeku pa je t.i. ubikvitin-protein ligaza CHIP, ki kot zadnji v vrsti pritrdi ubikvitin na lizinski ostanek proteina. V primeru razgradnje inzulinskega receptorja (IR), katerega signalizacija je povezana z procesi staranja (tem močnejše je delovanje receptorja, hitreje se organizem stara, krajšo življenjsko dobo ima), so raziskovalci ugotovili, da CHIP receptor raje večkrat monoubikvinira (doda to en sam ubikvitin na posamezne lizinske ostanke na receptorju) kot pa da receptor označi s poliubikvitinsko verigo. Če pa se v celici vzpostavi proteotoksično stanje, ki vodi v agregate poškodovanih in zato škodljivih proteinov, se CHIP raje 'odloči' za posredovanje in zato opusti svojo primarno vlogo ubikvitinacije IR. Ker se CHIP v takih primerih dodatno ne sintetizira, se IR stabilizira v membrani, kar povzroči staranje organizma. Tekmovanje med proteostazo in dolgoživostjo je gledano iz evolucijske plati smiselno, saj telo najprej skuša zavarovati svoj genom oz. proteom, pa čeprav za ceno staranja.

'''Vesna Dimitrovski: Sintetična pajkova svila'''

Skupina znanstvenikov iz univerze v Nottinghamu je razvila protein 4RepCT3Aha, ki se lahko sam povezuje v vlakna oz. svilo in ga lahko z azid-alkin cikloadicijo, katalizirano z bakrom spojimo z različnimi organskimi ligandi. Pri izdelavi 4RepCT3Aha proteina so uporabili rekombinanten 4RepCT protein. Ta ima na C- terminalni domeni tri metionine, ki so jih zamenjali s tremi L-Azidohomoalanini (L-Aha). Azidne stranske skupine L-Aha dovoljujejo vezavo z razičnimi molekulalmi. V raziskavi so 4RepCT3Aha protein uspešno povezali z dvema flourescenčnima barviloma (FAM alkin in Alexa Fluor 594 alkin) preko azid-alkin cikloadicija katelizirane z bakrom. Z barviloma so lahko povezali protein, preden se je povezal v vlakna, in že nastala vlakna. Dokazali so, da vezava proteina z barviloma ni imela vpliva na nastanek vlaken. Sestavljena 4RepCT3Aha vlakna so povezali z antibiotikom levofloksacinom preko glicerol-estrske kovalentne vezi, ki jo tvorita povezovalec glicid propargil eter in antibiotik. Antimikrobno aktivnost vlaken so testirali proti E. coli bakterijam. Levofloksacin funkcionalna vlakna so preprečila rast bakterij in so antibiotik oddajala v okolje tudi po 120 urah inkubacije. Na počasno prekinitev glicerol-estrske vezi je vplivala kislost okolja. Tako so ustvarili biokompatibilno, mono- ali multi- funkcionalno sintetično pajkovo svilo, ki obeta veliko uspeha v biomedicini.

'''Katja Doberšek: Sindrom kimanja kot avtoimuna reakcija na parazita Onchocerca volvulus

Sindrom kimanja ali Nodding syndrome je bolezen živčnega sistema, ki se pojavlja predvsem v državah srednje Afrike (Tanzanija, Južni Sudan, Uganda) in prizadene predvsem otroke. Že nekaj časa so znanstveniki bolezen povezovali s črno muho, domnevno prenašalko parazitskega črva Onchocerca volvulus, ki povzroča rečno slepoto ali Roblesovo bolezen. National Institutes of Health so izvedli raziskavo, v kateri so dokazali povezavo med parazitom in pojavom sindroma kimanja. Ob okužbi s parazitom človeško telo namreč tvori protitelesa za parazitske proteine, za katere so ugotovili, da lahko delujejo uničevalno tudi proti nekaterim proteinom v centralnem živčnem sistemu in mišicah. Posledice tega se kažejo kot sindrom kimanja. Rezultati so odprli novo področje raziskovanja in iskanja novih načinov zdravljenja te bolezni.

'''Andreja Habič: Odsotnost Efr3a v možganskih celicah spodbudi nevrogenezo v odraslem hipokampusu preko BDNF signalne poti'''

Efr3a je periferni membranski protein, katerega molekularni mehanizmi delovanja so še slabo pojasnjeni. Znana sta njegova vpliv na GPCR-je (transmembranske receptorje, pomembne za prenos zunajceličnih signalov v celico) in posredna vključenost v proces mielinizacije živčnih celic. Redke mutacije Efr3a so bile odkrite pri osebah z avtističnimi motnjami; homolog Efr3a, transmembranska lipaza RBO, ima pomembno vlogo v procesu nevrogeneze (tj. tvorbi novih nevronov v odraslih možganih). Raziskovalci so se lotili preiskovanja vpliva specifične delecije Efr3a v možganskih celicah. Odkrili so, da le-ta na proliferacijo in končno diferenciacijo celic, ki sicer poteka počasneje, ne vpliva. Prav tako sta od Efr3a neodvisni celična specializacija in dendritska morfologija. Na proces apoptoze delujeta zaviralno tako delecija kot utišanje gena. Količine rastnega faktorja možganskega izvora (BDNF), njegovega receptorja TrkB in kinaz Akt in MAPK so ob odsotnosti Efr3a znatno večje. To je pomembno odkritje, ki nakazuje na vpletenost Efr3a v BDNF-TrkB signalno pot (Akt in MAPK sta dva izmed glavnih navzdolnjih efektorjev te poti). Znižani nivoji BDNF-ja so značilni za številne nevrodegenerativne in nevropsihiatrične bolezni; na osnovi zviševanja izražanja BDNF delujejo številni antidepresivi. Ker bi razumevanje mehanizmov delovanja Efr3a lahko imelo praktično vrednost, so potrebne nadaljnje raziskave.

'''Milica Janković: Potencijalna terapija za ozdravitev Huntingtonove bolezni'''

Huntingtonova bolezen (HD) je progresivna, nevrodegenerativna bolezen, ki vpliva na mišično koordinacijo in kognitivne funkcije. HD je povzročena s ponavljanjem CAG zaporedja (polyQ) na N koncu proteina huntingtin (HTT). Večje kot je število ponovitev, prej se bo pojavila bolezen. Prejšnje raziskave so pokazale da fosforilacija na S421 mestu vničuje toksičnost mutiranega huntingtin proteina (mHTT), ampak je še neznano, ali fosforilacija na S421 vpliva na toksičnost mHTT in vivo. Zaradi tega so se raziskovalci lotili preiskovanja vloge fosforilacije na S421 mestu na miših in so ugotovili da posnemanje fosforilacije skoraj popolnoma izboljša ali celo vniči simptome huntingtonove bolezni. Takšni rezultati so pokazali da je S421 potencijalna terapija za ozdravitev Huntingtonove bolezni.

'''Ajda Godec: Molekularna podlaga za širok spekter izbire substratov peptid preniltransferaze '''

Zdravila proteinske zasnove se uporabljajo pri zdravljenju različnih vrst bolezni, od raka, bolezni srca in ožilja do revmatskega artritisa. Pomanjkljivost peptidne zasnove zdravil je nezmožnost prehajanja skozi krvno-možgansko pregrado. Ena izmed modifikacij proteinov, s katero bi povečali efektivnost tako zasnovanih zdravil, je tudi prenilacija. To je vezava hidrofobne molekule na protein običajno je to prenil (3-metill-but-2-en-1-il). Cianobaktini predstavljajo skupino ribosomsko sintetiziranih in post-translacijsko spremenjenih peptidov. Zelo pomembna podskupina »cianobaktinov«(ang. cianobaktins) je podvržena prenilaciji na serinskem, treoinskem, tirozinskem ostanku. Cianobakterijski encim preniltransferaza katalizira reakcije s širokim naborom substratov, pri tem pa ni mogoče opaziti posebej prepoznavnega motiva ali preferenčne regioselektivnosti. Raziskovalci oddelka za biokemijo univerze Illinois v Urbani, so odkrili vzrok za široko izbiro substratov, sicer nekarakterizirane TruF - skupine proteinov. Določena je bila struktura encima PagF, ki povzroča prenilacijo na Tyr, v kombinaciji z izoprenoidnim donorskim analogom in v kombinaciji z acikličnimi ali kompleksnejšimi peptidnimi substrati. Na podlagi rezultatov kinetike, rentgenske difrakcijske metode, s katero so določili strukturo in z uporabo metod računalniškega modeliranja so ugotovili strukturo encima PagF, s primerjavo strukture s homologi so ugotovili, kako razlike v strukturi vplivajo na vezavo substratov, določili encimu PagF preferenco do vezave cikličnih in večjih substratov in dokazali morebiten vpliv steričnih ovir na večkratno prenilacijo substrata.

TBK2017-seminar

2017-05-23T21:35:10Z

Ajda Godec: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||12.12.||12.12.||12.12.||r1||r2||r3
|-
| Nina Mezgec Mrzlikar || Regulacija gena DISC-1 kot potencialnega zdravila za shizofrenijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170105144339.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar || Emilija Bogatinova
|-
| Tina Turel || Povezanost retrovirusov z razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170112110840.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Katja Doberšek || Uroš Prešern || Nika Zaveršek
|-
| Sonja Gabrijelčič || Ribosomske mutacije spodbujajo razvoj odpornosti proti antibiotikom v okolju z več zdravilnimi učinkovinami ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170221110808.htm https://elifesciences.org/content/6/e20420 || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Mariša Cvitanič || Špela Supej || Tanja Zupan
|-
| Patrik Levačić || Prehrambni aditivi v sladkarijah ter žvečilnih gumijih lahko spremenijo funkcionalnost in strukturo prebavnih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170217012450.htm|| 28.02. || 03.03. || 06.03. || Ajda Krč || Lea Knez || Andrej Race
|-
| Nika Goršek ||Nove študije razkrivajo delovanje molekulske črpalke, ki izloča zdravila proti raku || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170224160629.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Adela Šajn || Maja Jankovič || Urška Košir
|-
| Dragana Savković || Stopnja preživetja evkariotskih celic po elektroforezni nano-injekciji || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301105437.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Milica Janković || Luka Fratina || Martin Špendl
|-
| Hana Hiršman || || || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Ajda Godec || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik
|-
| Daria Latysheva || Mehanski raztezek sproži hitro delitev epitelijskih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170215131543.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Andreja Habič || Maja Vrabec || Ines Medved
|-
| Urška Zagorc || Proteini, zgodnje opozorilo sladkorne bolezni tipa 1 || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/11/161107112428.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar
|-
| Anja Černe || Učinek farmakološkega askorbata na rakave celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170109134014.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Tina Turel || Katja Doberšek || Uroš Prešern
|-
| Barbara Slapnik ||Holesterol v celični membrani || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170117163039.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič || Špela Supej
|-
| Jerneja Nimac || S CRISPR/Cas9 nad x-vezavno obliko kronične granulomatozne bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170112110734.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Patrik Levačić || Ajda Krč || Lea Knez
|-
| Gašper Anton Komatar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170309132308.htm || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Nika Goršek || Adela Šajn || Maja Jankovič
|-
| Nadja Škafar ||Dostava protitumorskih zdravil s pomočjo makrofagov in biorazgradljivih nanodelcev||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170104154408.htm|| 21.03. || 24.03. || 27.03. || Dragana Savković || Milica Janković || Luka Fratina
|-
| Anže Jenko || Koriščenje kemiluminiscence dioksietanovih sond za prikazovanje celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170308081051.htm || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Hana Hiršman || Ajda Godec || Anja Tavčar
|-
| Špela Deučman || Raziskovanje vzrokov kronične zavrnitve presajenih pljuč || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301105426.htm || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Daria Latysheva || Andreja Habič || Maja Vrabec
|-
| Luka Gregorič || Merjenje količine urina v plavalnih bazenih s pomočjo merjenja koncentracije umetnih sladil || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301084913.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski
|-
| Jana Kotnik || Sintetični membranski receptorji || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170306114231.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Anja Černe || Tina Turel || Katja Doberšek
|-
| Andrej Špenko || Nova tehnika za boljšo regeneracijo kostnega tkiva || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/12/161220093946.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič
|-
| Ana Maklin || Termična stabilnost proteinov || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170228131046.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Jerneja Nimac || Patrik Levačić || Ajda Krč
|-
| Emilija Bogatinova ||NO3-anioni lahko delujejo kot Lewisovo kislino v tvrdnem stanju || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170222131802.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek || Adela Šajn
|-
| Nika Zaveršek || Bakterije lahko s pomočjo posebnih sintetičnih molekul spremenimo v električne generatorje || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170209133509.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Nadja Škafar || Dragana Savković || Milica Janković
|-
| Tanja Zupan || Razlike v funkcionalni povezavi možganov v mirujočem stanju med športniki in ne športniki ||https://www.sciencedaily.com/releases/2016/12/161214151637.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Anže Jenko || Hana Hiršman || Ajda Godec
|-
| Andrej Race || Deficit Glukoze-6-fosfat-dehidrogenaze || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/07/160726094319.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Špela Deučman || Daria Latysheva || Andreja Habič
|-
| Urška Košir || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Luka Gregorič || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar
|-
| Martin Špendl || Nanografen-renijev kompleks za selektivno redukcijo ogljikovega dioksida ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170308135342.htm || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Jana Kotnik || Anja Černe || Tina Turel
|-
| Nika Mikulič Vernik || Onkolitični virusi, ki selektivno napadajo rakaste celice ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170316112147.htm || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Andrej Špenko || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič
|-
| Ines Medved ||Kako lahko z zmanjšanim vnosom hrane upočasnimo proces staranja ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170213151306.htm || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Ana Maklin || Jerneja Nimac || Patrik Levačić
|-
| Urban Hribar || Manipulacija encimov FAS in biogoriva ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170309120519.htm || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek
|-
| Uroš Prešern ||Nukleaza, ki povzroči partanatos oziroma od PARP-1 odvisno celično smrt || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/10/161006143602.htm || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Nika Zaveršek || Nadja Škafar || Dragana Savković
|-
| Špela Supej || Nov način kontroliranja celične biologije s pomočjo svetlobe ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170315125623.htm|| 02.05. || 05.05. || 08.05. || Tanja Zupan || Anže Jenko || Hana Hiršman
|-
| Lea Knez || Hemoglobin Kirklareli ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170217012518.htm || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Andrej Race || Špela Deučman || Daria Latysheva
|-
| Maja Jankovič || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Urška Košir || Luka Gregorič || Urška Zagorc
|-
| Luka Fratina || Visokoresolucijsko 3D slikanje živih celic s fononi podoptičnih valovnih dolžin || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/12/161221111327.htm || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Martin Špendl || Jana Kotnik || Anja Černe
|-
| Anja Tavčar || Selenomabi - obstojna in učinkovita protitelesa, konjugirana s citostatiki|| https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170316151821.htm || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko || Barbara Slapnik
|-
| Maja Vrabec ||Komunikacija med virusi usmerja odločitev za litični ali lizogeni cikel|| https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170119163345.htm || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Ines Medved || Ana Maklin || Jerneja Nimac
|-
| Vesna Dimitrovski || Sintetična pajkova svila||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170104103533.htm || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Urban Hribar || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar
|-
| Katja Doberšek || Sindrom kimanja kot avtoimuna reakcija na parazita Onchocerca volvulus ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170215145949.htm || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Uroš Prešern || Nika Zaveršek || Nadja Škafar
|-
| Mariša Cvitanič || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Špela Supej || Tanja Zupan || Anže Jenko
|-
| Ajda Krč ||Ubikvitin-protein ligaza CHIP z regulacijo razpada inzulinskega receptorja in proteostaze razkriva možne razloge za staranje organizma ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/04/170421103731.htm || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Lea Knez || Andrej Race || Špela Deučman
|-
| Adela Šajn || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Jankovič || Urška Košir || Luka Gregorič
|-
| Milica Janković || Potencialna terapija za ozdravitev Huntingtonove bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/08/160816151900.htm || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Luka Fratina || Martin Špendl || Jana Kotnik
|-
| Ajda Godec || Molekularna podlaga za širok spekter izbire substratov peptid preniltransferaze ||https://www.sciencedaily.com/releases/2016/11/161121174639.htm || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko
|-
| Andreja Habič || Odsotnost Efr3a v možganskih celicah spodbudi nevrogenezo v odraslem hipokampusu preko BDNF signalne poti || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/05/170511113516.htm || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Vrabec || Ines Medved || Ana Maklin
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete v PubMed povezavi [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ tukaj]
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2017_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2017_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2017_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2017_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2017_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).'''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2017-seminar

2017-04-30T17:03:06Z

Ajda Godec: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||12.12.||12.12.||12.12.||r1||r2||r3
|-
| Nina Mezgec Mrzlikar || Regulacija gena DISC-1 kot potencialnega zdravila za shizofrenijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170105144339.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar || Emilija Bogatinova
|-
| Tina Turel || Povezanost retrovirusov z razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170112110840.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Katja Doberšek || Uroš Prešern || Nika Zaveršek
|-
| Sonja Gabrijelčič || Ribosomske mutacije spodbujajo razvoj odpornosti proti antibiotikom v okolju z več zdravilnimi učinkovinami ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170221110808.htm https://elifesciences.org/content/6/e20420 || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Mariša Cvitanič || Špela Supej || Tanja Zupan
|-
| Patrik Levačić || Prehrambni aditivi v sladkarijah ter žvečilnih gumijih lahko spremenijo funkcionalnost in strukturo prebavnih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170217012450.htm|| 28.02. || 03.03. || 06.03. || Ajda Krč || Lea Knez || Andrej Race
|-
| Nika Goršek ||Nove študije razkrivajo delovanje molekulske črpalke, ki izloča zdravila proti raku || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170224160629.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Adela Šajn || Maja Jankovič || Urška Košir
|-
| Dragana Savković || Stopnja preživetja evkariotskih celic po elektroforezni nano-injekciji || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301105437.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Milica Janković || Luka Fratina || Martin Špendl
|-
| Hana Hiršman || || || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Ajda Godec || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik
|-
| Daria Latysheva || Mehanski raztezek sproži hitro delitev epitelijskih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170215131543.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Andreja Habič || Maja Vrabec || Ines Medved
|-
| Urška Zagorc || Proteini, zgodnje opozorilo sladkorne bolezni tipa 1 || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/11/161107112428.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar
|-
| Anja Černe || Učinek farmakološkega askorbata na rakave celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170109134014.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Tina Turel || Katja Doberšek || Uroš Prešern
|-
| Barbara Slapnik ||Holesterol v celični membrani || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170117163039.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič || Špela Supej
|-
| Jerneja Nimac || S CRISPR/Cas9 nad x-vezavno obliko kronične granulomatozne bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170112110734.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Patrik Levačić || Ajda Krč || Lea Knez
|-
| Gašper Anton Komatar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170309132308.htm || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Nika Goršek || Adela Šajn || Maja Jankovič
|-
| Nadja Škafar ||Dostava protitumorskih zdravil s pomočjo makrofagov in biorazgradljivih nanodelcev||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170104154408.htm|| 21.03. || 24.03. || 27.03. || Dragana Savković || Milica Janković || Luka Fratina
|-
| Anže Jenko || Koriščenje kemiluminiscence dioksietanovih sond za prikazovanje celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170308081051.htm || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Hana Hiršman || Ajda Godec || Anja Tavčar
|-
| Špela Deučman || Raziskovanje vzrokov kronične zavrnitve presajenih pljuč || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301105426.htm || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Daria Latysheva || Andreja Habič || Maja Vrabec
|-
| Luka Gregorič || Merjenje količine urina v plavalnih bazenih s pomočjo merjenja koncentracije umetnih sladil || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301084913.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski
|-
| Jana Kotnik || Sintetični membranski receptorji || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170306114231.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Anja Černe || Tina Turel || Katja Doberšek
|-
| Andrej Špenko || Nova tehnika za boljšo regeneracijo kostnega tkiva || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/12/161220093946.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič
|-
| Ana Maklin || Termična stabilnost proteinov || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170228131046.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Jerneja Nimac || Patrik Levačić || Ajda Krč
|-
| Emilija Bogatinova ||NO3-anioni lahko delujejo kot Lewisovo kislino v tvrdnem stanju || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170222131802.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek || Adela Šajn
|-
| Nika Zaveršek || Bakterije lahko s pomočjo posebnih sintetičnih molekul spremenimo v električne generatorje || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170209133509.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Nadja Škafar || Dragana Savković || Milica Janković
|-
| Tanja Zupan || Razlike v funkcionalni povezavi možganov v mirujočem stanju med športniki in ne športniki ||https://www.sciencedaily.com/releases/2016/12/161214151637.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Anže Jenko || Hana Hiršman || Ajda Godec
|-
| Andrej Race || Deficit Glukoze-6-fosfat-dehidrogenaze || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/07/160726094319.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Špela Deučman || Daria Latysheva || Andreja Habič
|-
| Urška Košir || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Luka Gregorič || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar
|-
| Martin Špendl || Nanografen-renijev kompleks za selektivno redukcijo ogljikovega dioksida ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170308135342.htm || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Jana Kotnik || Anja Černe || Tina Turel
|-
| Nika Mikulič Vernik || Onkolitični virusi, ki selektivno napadajo rakaste celice ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170316112147.htm || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Andrej Špenko || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič
|-
| Ines Medved ||Kako lahko z zmanjšanim vnosom hrane upočasnimo proces staranja ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170213151306.htm || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Ana Maklin || Jerneja Nimac || Patrik Levačić
|-
| Urban Hribar || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170309120519.htm || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek
|-
| Uroš Prešern ||Nukleaza, ki povzroči partanatos oziroma od PARP-1 odvisno celično smrt || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/10/161006143602.htm || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Nika Zaveršek || Nadja Škafar || Dragana Savković
|-
| Špela Supej || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170315125623.htm|| 02.05. || 05.05. || 08.05. || Tanja Zupan || Anže Jenko || Hana Hiršman
|-
| Lea Knez || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170217012518.htm || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Andrej Race || Špela Deučman || Daria Latysheva
|-
| Maja Jankovič || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Urška Košir || Luka Gregorič || Urška Zagorc
|-
| Luka Fratina || || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/12/161221111327.htm || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Martin Špendl || Jana Kotnik || Anja Černe
|-
| Anja Tavčar || Selenomabi - obstojna in učinkovita protitelesa, konjugirana s citostatiki|| https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170316151821.htm || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko || Barbara Slapnik
|-
| Maja Vrabec || || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170119163345.htm || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Ines Medved || Ana Maklin || Jerneja Nimac
|-
| Vesna Dimitrovski || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Urban Hribar || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar
|-
| Katja Doberšek || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170215145949.htm || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Uroš Prešern || Nika Zaveršek || Nadja Škafar
|-
| Mariša Cvitanič || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Špela Supej || Tanja Zupan || Anže Jenko
|-
| Ajda Krč || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Lea Knez || Andrej Race || Špela Deučman
|-
| Adela Šajn || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Jankovič || Urška Košir || Luka Gregorič
|-
| Milica Janković || || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/08/160816151900.htm || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Luka Fratina || Martin Špendl || Jana Kotnik
|-
| Ajda Godec || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2016/11/161121174639.htm || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko
|-
| Andreja Habič || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Vrabec || Ines Medved || Ana Maklin
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete v PubMed povezavi [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ tukaj]
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2017_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2017_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2017_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2017_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2017_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).'''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.