Wiki FKKT - User contributions [en]

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-05T04:39:40Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul<ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.'' '''100''', 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all ''Escherichia coli'' cell-free transcription-translation system. ''Biochimie.'' '''99''', 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji<ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. ''Front. Bioeng. Biotechnol.'' '''7''', 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti<ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. ''Biotechnol. J.'' '''11''', 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz ''E.coli''<ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. ''FEBS Lett.'' '''291''', 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi ''E.coli''. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology<ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth. Biol.'' '''5''', 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu ''E.coli'' (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek volumna osnovne zmesi predstavlja pufer PGA z dodatki, ki vsebuje komponente, ki so nujne za transkripcijo in translacijo, niso pa del samega ekstrakta iz ''E.coli''. Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo RecBCD, ki se endogeno izraža v ''E.coli'' in je zato prisotna tudi v ekstraktu. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije<ref name=" vir 7" />.

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP<ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov<ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous ''E. Coli'' RNA polymerase and sigma factor 70. ''J. Biol. Eng.'' '''4''', 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz ''E.coli'' (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19)<ref name="vir 3" />,<ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz ''E.coli'', komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP<ref name="vir 7" />. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov<ref name="vir 3" />,<ref name="vir 7" />,<ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. ''BMC Biotechnol.'' '''9''', 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije ''E.coli'' izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE<ref> Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. ''Nat. Rev. Microbiol.'' '''9''', 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat<ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je OmpA, najbolj znana C-končna pa SsrA<ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. ''Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res.'' '''1823''', 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v ''E.coli'', vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisoma za proteina ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP<ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov<ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v ''E.coli'' ne najdemo<ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi ''E.coli'' lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino<ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2<ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi ''E.coli'' so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike<ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-05T04:37:46Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul<ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.'' '''100''', 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all ''Escherichia coli'' cell-free transcription-translation system. ''Biochimie.'' '''99''', 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji<ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. ''Front. Bioeng. Biotechnol.'' '''7''', 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti<ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. ''Biotechnol. J.'' '''11''', 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz ''E.coli''<ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. ''FEBS Lett.'' '''291''', 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi ''E.coli''. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology<ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth. Biol.'' '''5''', 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu ''E.coli'' (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi pa sestavlja pufer PGA z dodatki (vsebuje komponente, ki so nujne za transkripcijo in translacijo, niso pa del samega ekstrakta iz ''E.coli''). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo RecBCD, ki se endogeno izraža v ''E.coli'' in je zato prisotna tudi v ekstraktu. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije<ref name=" vir 7" />.

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP<ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov<ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous ''E. Coli'' RNA polymerase and sigma factor 70. ''J. Biol. Eng.'' '''4''', 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz ''E.coli'' (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19)<ref name="vir 3" />,<ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz ''E.coli'', komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP<ref name="vir 7" />. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov<ref name="vir 3" />,<ref name="vir 7" />,<ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. ''BMC Biotechnol.'' '''9''', 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije ''E.coli'' izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE<ref> Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. ''Nat. Rev. Microbiol.'' '''9''', 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat<ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je OmpA, najbolj znana C-končna pa SsrA<ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. ''Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res.'' '''1823''', 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v ''E.coli'', vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisoma za proteina ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP<ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov<ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v ''E.coli'' ne najdemo<ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi ''E.coli'' lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino<ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2<ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi ''E.coli'' so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike<ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T16:35:23Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul<ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.'' '''100''', 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all ''Escherichia coli'' cell-free transcription-translation system. ''Biochimie.'' '''99''', 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji<ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. ''Front. Bioeng. Biotechnol.'' '''7''', 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti<ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. ''Biotechnol. J.'' '''11''', 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz ''E.coli''<ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. ''FEBS Lett.'' '''291''', 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi ''E.coli''. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology<ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth. Biol.'' '''5''', 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu ''E.coli'' (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo RecBCD, ki se endogeno izraža v ''E.coli'' in je zato prisotna tudi v ekstraktu. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije<ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''količina'''
|-
| style="background: #F8F8FF;" |Hepes
| style="background: #F8F8FF;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ATP, GTP
| style="background: #F8F8FF;" |1,5 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |CTP, UTP
| style="background: #F8F8FF;" |0,9 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |tRNA
| style="background: #F8F8FF;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #F8F8FF;" |koencim A
| style="background: #F8F8FF;" |0,26 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |NAD
| style="background: #F8F8FF;" |0,33 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |cAMP
| style="background: #F8F8FF;" |0,75 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |folinska kislina
| style="background: #F8F8FF;" |0,068 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |spermidin
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #F8F8FF;" |30 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #F8F8FF;" |2 %
|-
| style="background: #F8F8FF;" |IPTG
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP<ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov<ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous ''E. Coli'' RNA polymerase and sigma factor 70. ''J. Biol. Eng.'' '''4''', 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz ''E.coli'' (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19)<ref name="vir 3" />,<ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz ''E.coli'', komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP<ref name="vir 7" />. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov<ref name="vir 3" />,<ref name="vir 7" />,<ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. ''BMC Biotechnol.'' '''9''', 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije ''E.coli'' izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE<ref> Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. ''Nat. Rev. Microbiol.'' '''9''', 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat<ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je OmpA, najbolj znana C-končna pa SsrA<ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. ''Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res.'' '''1823''', 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v ''E.coli'', vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisoma za proteina ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP<ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov<ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v ''E.coli'' ne najdemo<ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi ''E.coli'' lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino<ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2<ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi ''E.coli'' so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike<ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T16:33:48Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul<ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.'' '''100''', 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all ''Escherichia coli'' cell-free transcription-translation system. ''Biochimie'' '''99''', 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji<ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. ''Front. Bioeng. Biotechnol.'' '''7''', 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti<ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. ''Biotechnol. J.'' '''11''', 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz ''E.coli''<ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. ''FEBS Lett.'' '''291''', 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi ''E.coli''. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology<ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth. Biol.'' '''5''', 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu ''E.coli'' (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo RecBCD, ki se endogeno izraža v ''E.coli'' in je zato prisotna tudi v ekstraktu. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije<ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''količina'''
|-
| style="background: #F8F8FF;" |Hepes
| style="background: #F8F8FF;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ATP, GTP
| style="background: #F8F8FF;" |1,5 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |CTP, UTP
| style="background: #F8F8FF;" |0,9 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |tRNA
| style="background: #F8F8FF;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #F8F8FF;" |koencim A
| style="background: #F8F8FF;" |0,26 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |NAD
| style="background: #F8F8FF;" |0,33 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |cAMP
| style="background: #F8F8FF;" |0,75 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |folinska kislina
| style="background: #F8F8FF;" |0,068 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |spermidin
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #F8F8FF;" |30 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #F8F8FF;" |2 %
|-
| style="background: #F8F8FF;" |IPTG
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP<ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov<ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous ''E. Coli'' RNA polymerase and sigma factor 70. ''J. Biol. Eng.'' '''4''', 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz ''E.coli'' (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19)<ref name="vir 3" />,<ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz ''E.coli'', komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP<ref name="vir 7" />. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov<ref name="vir 3" />,<ref name="vir 7" />,<ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. ''BMC Biotechnol.'' '''9''', 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije ''E.coli'' izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE<ref> Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. ''Nat. Rev. Microbiol.'' '''9''', 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat<ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je OmpA, najbolj znana C-končna pa SsrA<ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. ''Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res.'' '''1823''', 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v ''E.coli'', vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisoma za proteina ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP<ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov<ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v ''E.coli'' ne najdemo<ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi ''E.coli'' lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino<ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2<ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi ''E.coli'' so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike<ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T16:27:11Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul<ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.'' '''100''', 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all ''Escherichia coli'' cell-free transcription-translation system. ''Biochimie'' '''99''', 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji<ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. ''Front. Bioeng. Biotechnol.'' '''7''', 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti<ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. ''Biotechnol. J.'' '''11''', 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz ''E.coli''<ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. ''FEBS Lett.'' '''291''', 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi ''E.coli''. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology<ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth. Biol.'' '''5''', 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu ''E.coli'' (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo RecBCD, ki se endogeno izraža v ''E.coli'' in je zato prisotna tudi v ekstraktu. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije<ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''količina'''
|-
| style="background: #F8F8FF;" |Hepes
| style="background: #F8F8FF;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ATP, GTP
| style="background: #F8F8FF;" |1,5 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |CTP, UTP
| style="background: #F8F8FF;" |0,9 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |tRNA
| style="background: #F8F8FF;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #F8F8FF;" |koencim A
| style="background: #F8F8FF;" |0,26 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |NAD
| style="background: #F8F8FF;" |0,33 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |cAMP
| style="background: #F8F8FF;" |0,75 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |folinska kislina
| style="background: #F8F8FF;" |0,068 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |spermidin
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #F8F8FF;" |30 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #F8F8FF;" |2 %
|-
| style="background: #F8F8FF;" |IPTG
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP<ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov<ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous ''E. Coli'' RNA polymerase and sigma factor 70. ''J. Biol. Eng.'' '''4''', 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz ''E.coli'' (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19)<ref name="vir 3" />,<ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz ''E.coli'', komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP<ref name="vir 7" />. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov<ref name="vir 3" />,<ref name="vir 7" />,<ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. ''BMC Biotechnol.'' '''9''', 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije ''E.coli'' izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE<ref> Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. ''Nat. Rev. Microbiol.'' '''9''', 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat<ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je OmpA, najbolj znana C-končna pa SsrA<ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. ''Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res.'' '''1823''', 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v ''E.coli'', vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP<ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov<ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v ''E.coli'' ne najdemo<ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi ''E.coli'' lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino<ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2<ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi ''E.coli'' so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike<ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T16:18:38Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul<ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.'' '''100''', 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all ''Escherichia coli'' cell-free transcription-translation system. ''Biochimie'' '''99''', 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji<ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. ''Front. Bioeng. Biotechnol.'' '''7''', 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti<ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. ''Biotechnol. J.'' '''11''', 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz ''E.coli''<ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. ''FEBS Lett.'' '''291''', 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi ''E.coli''. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology<ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth. Biol.'' '''5''', 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu ''E.coli'' (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo RecBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu ''E.coli''. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije<ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''količina'''
|-
| style="background: #F8F8FF;" |Hepes
| style="background: #F8F8FF;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ATP, GTP
| style="background: #F8F8FF;" |1,5 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |CTP, UTP
| style="background: #F8F8FF;" |0,9 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |tRNA
| style="background: #F8F8FF;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #F8F8FF;" |koencim A
| style="background: #F8F8FF;" |0,26 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |NAD
| style="background: #F8F8FF;" |0,33 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |cAMP
| style="background: #F8F8FF;" |0,75 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |folinska kislina
| style="background: #F8F8FF;" |0,068 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |spermidin
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #F8F8FF;" |30 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #F8F8FF;" |2 %
|-
| style="background: #F8F8FF;" |IPTG
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP<ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov<ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous ''E. Coli'' RNA polymerase and sigma factor 70. ''J. Biol. Eng.'' '''4''', 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz ''E.coli'' (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19)<ref name="vir 3" />,<ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz ''E.coli'', komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP<ref name="vir 7" />. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov<ref name="vir 3" />,<ref name="vir 7" />,<ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. ''BMC Biotechnol.'' '''9''', 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije ''E.coli'' izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE<ref> Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. ''Nat. Rev. Microbiol.'' '''9''', 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat<ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je OmpA, najbolj znana C-končna pa SsrA<ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. ''Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res.'' '''1823''', 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v ''E.coli'', vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP<ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov<ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v ''E.coli'' ne najdemo<ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi ''E.coli'' lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino<ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2<ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi ''E.coli'' so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike<ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T16:15:56Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul<ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.'' '''100''', 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all ''Escherichia coli'' cell-free transcription-translation system. ''Biochimie'' '''99''', 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji<ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. ''Front. Bioeng. Biotechnol.'' '''7''', 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti<ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. ''Biotechnol. J.'' '''11''', 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz ''E.coli''<ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. ''FEBS Lett.'' '''291''', 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi ''E.coli''. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology<ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth. Biol.'' '''5''', 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu ''E.coli'' (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo RecBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu ''E.coli''. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije<ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''količina'''
|-
| style="background: #F8F8FF;" |Hepes
| style="background: #F8F8FF;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ATP, GTP
| style="background: #F8F8FF;" |1,5 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |CTP, UTP
| style="background: #F8F8FF;" |0,9 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |tRNA
| style="background: #F8F8FF;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #F8F8FF;" |koencim A
| style="background: #F8F8FF;" |0,26 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |NAD
| style="background: #F8F8FF;" |0,33 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |cAMP
| style="background: #F8F8FF;" |0,75 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |folinska kislina
| style="background: #F8F8FF;" |0,068 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |spermidin
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #F8F8FF;" |30 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #F8F8FF;" |2 %
|-
| style="background: #F8F8FF;" |IPTG
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP<ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov<ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous ''E. Coli'' RNA polymerase and sigma factor 70. ''J. Biol. Eng.'' '''4''', 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz ''E.coli'' (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19)<ref name="vir 3" />,<ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz ''E.coli'', komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP<ref name="vir 7" />. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov<ref name="vir 3" />,<ref name="vir 7" />,<ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. ''BMC Biotechnol.'' '''9''', 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije ''E.coli'' izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE<ref> Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. ''Nat. Rev. Microbiol.'' '''9''', 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat<ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je OmpA, najbolj znana C-končna pa SsrA<ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. ''Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res.'' '''1823''', 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v ''E.coli'', vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP<ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov<ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v ''E.coli'' ne najdemo<ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi ''E.coli'' lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino<ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2<ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi ''E.coli'' so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike<ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Seminarji SB 2019/20

2020-05-03T16:11:28Z

Ajda.Lenardič:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 

21.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 

22.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinhronizirani_cikli_lize_bakterijskih_celic_za_in_vivo_dostavo_terapevtikov Sinhronizirani cikli lize bakterijskih celic za ''in vivo'' dostavo terapevtikov](Milica Janković) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Antihipertenzivni_probiotik_-_nov_pristop_zni%C5%BEevanja_krvnega_tlaka Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka] (Nika Testen) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_pot_fiksacije_ogljikovega_dioksida Sintezna pot fiksacije ogljikovega dioksida] (Ana Obaha) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 

5.5. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_brezcelično_sintezno_biologijo_na_osnovi_E.coli Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E.coli''] (Ajda Lenardič) 
2 Jelena Štrbac 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_sistema_s_proteinskimi_logi%C4%8Dnimi_vrati_na_povr%C5%A1ini_lipidnih_membran Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran] (Uroš Prešern) 

6.5. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ALiVE_%E2%80%93_analiza_%C5%BEivih_celic_z_vezikularnim_izvozom ALiVE – analiza živih celic z vezikularnim izvozom] (Sara Korošec) 
2 Peter Škrinjar 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Daljinsko_upravljanje_s_sesalskimi_celicami%2C_na_podlagi_temperaturno_reguliranih_genetskih_stikal_s_svetlobno-toplotnimi_utripi Daljinsko upravljanje s sesalskimi celicami, na podlagi temperaturno reguliranih genetskih stikal s svetlobno-toplotnimi utripi] (Luka Gregorič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacija_na_osnovi_DNA_v_populacijah_sinteticnih_protocelic Komunikacija na osnovi DNA v populacijah sintetičnih protocelic] (Urban Hribar) 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
3 Daria Latysheva 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T15:54:25Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul<ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.'' '''100''', 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all ''Escherichia coli'' cell-free transcription-translation system. ''Biochimie'' '''99''', 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji<ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. ''Front. Bioeng. Biotechnol.'' '''7''', 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti<ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. ''Biotechnol. J.'' '''11''', 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz ''E.coli''<ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. ''FEBS Lett.'' '''291''', 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi ''E.coli''. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology<ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth. Biol.'' '''5''', 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu ''E.coli'' (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo RecBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu ''E.coli''. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije<ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''količina'''
|-
| style="background: #F8F8FF;" |Hepes
| style="background: #F8F8FF;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ATP, GTP
| style="background: #F8F8FF;" |1,5 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |CTP, UTP
| style="background: #F8F8FF;" |0,9 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |tRNA
| style="background: #F8F8FF;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #F8F8FF;" |koencim A
| style="background: #F8F8FF;" |0,26 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |NAD
| style="background: #F8F8FF;" |0,33 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |cAMP
| style="background: #F8F8FF;" |0,75 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |folinska kislina
| style="background: #F8F8FF;" |0,068 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |spermidin
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #F8F8FF;" |30 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #F8F8FF;" |2 %
|-
| style="background: #F8F8FF;" |IPTG
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP<ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov<ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous ''E. Coli'' RNA polymerase and sigma factor 70. ''J. Biol. Eng.'' '''4''', 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz ''E.coli'' (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19)<ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz ''E.coli'', komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP<ref name="vir 7" />. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov<ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />,<ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. ''BMC Biotechnol.'' '''9''', 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije ''E.coli'' izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE<ref> Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. ''Nat. Rev. Microbiol.'' '''9''', 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat<ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je OmpA, najbolj znana C-končna pa SsrA<ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. ''Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res.'' '''1823''', 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v ''E.coli'', vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP<ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov<ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v ''E.coli'' ne najdemo<ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi ''E.coli'' lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino<ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2<ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi ''E.coli'' so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike<ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T15:50:59Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul<ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.'' '''100''', 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all ''Escherichia coli'' cell-free transcription-translation system. ''Biochimie'' '''99''', 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji<ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. ''Front. Bioeng. Biotechnol.'' '''7''', 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti<ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. ''Biotechnol. J.'' '''11''', 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz ''E.coli''<ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. ''FEBS Lett.'' '''291''', 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi ''E.coli''. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology<ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth. Biol.'' '''5''', 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu ''E.coli'' (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo RecBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu ''E.coli''. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije<ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''količina'''
|-
| style="background: #F8F8FF;" |Hepes
| style="background: #F8F8FF;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ATP, GTP
| style="background: #F8F8FF;" |1,5 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |CTP, UTP
| style="background: #F8F8FF;" |0,9 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |tRNA
| style="background: #F8F8FF;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #F8F8FF;" |koencim A
| style="background: #F8F8FF;" |0,26 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |NAD
| style="background: #F8F8FF;" |0,33 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |cAMP
| style="background: #F8F8FF;" |0,75 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |folinska kislina
| style="background: #F8F8FF;" |0,068 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |spermidin
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #F8F8FF;" |30 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #F8F8FF;" |2 %
|-
| style="background: #F8F8FF;" |IPTG
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP<ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov<ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous ''E. Coli'' RNA polymerase and sigma factor 70. ''J. Biol. Eng.'' '''4''', 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz ''E.coli'' (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19)<ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz ''E.coli'', komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP<ref name="vir 7" />. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov<ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />,<ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. ''BMC Biotechnol.'' '''9''', 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije ''E.coli'' izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE<ref> Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. ''Nat. Rev. Microbiol.'' '''9''', 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat<ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA<ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. ''Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res.'' '''1823''', 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v ''E.coli'', vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP<ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov<ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v ''E.coli'' ne najdemo<ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi ''E.coli'' lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino<ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2<ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi ''E.coli'' so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike<ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi E.coli

2020-05-03T15:30:12Z

Ajda.Lenardič: Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi E.coli moved to Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E.coli''

#REDIRECT [[Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E.coli'']]

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T15:30:12Z

Ajda.Lenardič: Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi E.coli moved to Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E.coli''

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul<ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.'' '''100''', 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all ''Escherichia coli'' cell-free transcription-translation system. ''Biochimie'' '''99''', 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji<ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. ''Front. Bioeng. Biotechnol.'' '''7''', 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti<ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. ''Biotechnol. J.'' '''11''', 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz ''E.coli''<ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. ''FEBS Lett.'' '''291''', 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi ''E.coli''. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology<ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth. Biol.'' '''5''', 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu ''E.coli'' (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu ''E.coli''. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije<ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''količina'''
|-
| style="background: #F8F8FF;" |Hepes
| style="background: #F8F8FF;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ATP, GTP
| style="background: #F8F8FF;" |1,5 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |CTP, UTP
| style="background: #F8F8FF;" |0,9 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |tRNA
| style="background: #F8F8FF;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #F8F8FF;" |koencim A
| style="background: #F8F8FF;" |0,26 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |NAD
| style="background: #F8F8FF;" |0,33 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |cAMP
| style="background: #F8F8FF;" |0,75 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |folinska kislina
| style="background: #F8F8FF;" |0,068 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |spermidin
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #F8F8FF;" |30 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #F8F8FF;" |2 %
|-
| style="background: #F8F8FF;" |IPTG
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP<ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov<ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous ''E. Coli'' RNA polymerase and sigma factor 70. ''J. Biol. Eng.'' '''4''', 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz ''E.coli'' (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19)<ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz ''E.coli'', komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP<ref name="vir 7" />. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov<ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />,<ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. ''BMC Biotechnol.'' '''9''', 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije ''E.coli'' izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE<ref> Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. ''Nat. Rev. Microbiol.'' '''9''', 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat<ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA<ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. ''Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res.'' '''1823''', 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v ''E.coli'', vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP<ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov<ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v ''E.coli'' ne najdemo<ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi ''E.coli'' lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino<ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2<ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi ''E.coli'' so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike<ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T15:29:26Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul<ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.'' '''100''', 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all ''Escherichia coli'' cell-free transcription-translation system. ''Biochimie'' '''99''', 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji<ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. ''Front. Bioeng. Biotechnol.'' '''7''', 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti<ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. ''Biotechnol. J.'' '''11''', 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz ''E.coli''<ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. ''FEBS Lett.'' '''291''', 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi ''E.coli''. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology<ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth. Biol.'' '''5''', 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu ''E.coli'' (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu ''E.coli''. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije<ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''količina'''
|-
| style="background: #F8F8FF;" |Hepes
| style="background: #F8F8FF;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ATP, GTP
| style="background: #F8F8FF;" |1,5 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |CTP, UTP
| style="background: #F8F8FF;" |0,9 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |tRNA
| style="background: #F8F8FF;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #F8F8FF;" |koencim A
| style="background: #F8F8FF;" |0,26 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |NAD
| style="background: #F8F8FF;" |0,33 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |cAMP
| style="background: #F8F8FF;" |0,75 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |folinska kislina
| style="background: #F8F8FF;" |0,068 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |spermidin
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #F8F8FF;" |30 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #F8F8FF;" |2 %
|-
| style="background: #F8F8FF;" |IPTG
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP<ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov<ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous ''E. Coli'' RNA polymerase and sigma factor 70. ''J. Biol. Eng.'' '''4''', 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz ''E.coli'' (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19)<ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz ''E.coli'', komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP<ref name="vir 7" />. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov<ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />,<ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. ''BMC Biotechnol.'' '''9''', 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije ''E.coli'' izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE<ref> Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. ''Nat. Rev. Microbiol.'' '''9''', 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat<ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA<ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. ''Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res.'' '''1823''', 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v ''E.coli'', vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP<ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov<ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v ''E.coli'' ne najdemo<ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi ''E.coli'' lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino<ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2<ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi ''E.coli'' so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike<ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T15:28:04Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul<ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.'' '''100''', 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all ''Escherichia coli'' cell-free transcription-translation system. ''Biochimie'' '''99''', 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji<ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. ''Front. Bioeng. Biotechnol.'' '''7''', 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti<ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. ''Biotechnol. J.'' '''11''', 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz ''E.coli''<ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. ''FEBS Lett.'' '''291''', 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi ''E.coli''. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology<ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth. Biol.'' '''5''', 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu ''E.coli'' (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije<ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''količina'''
|-
| style="background: #F8F8FF;" |Hepes
| style="background: #F8F8FF;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ATP, GTP
| style="background: #F8F8FF;" |1,5 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |CTP, UTP
| style="background: #F8F8FF;" |0,9 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |tRNA
| style="background: #F8F8FF;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #F8F8FF;" |koencim A
| style="background: #F8F8FF;" |0,26 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |NAD
| style="background: #F8F8FF;" |0,33 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |cAMP
| style="background: #F8F8FF;" |0,75 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |folinska kislina
| style="background: #F8F8FF;" |0,068 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |spermidin
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #F8F8FF;" |30 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #F8F8FF;" |2 %
|-
| style="background: #F8F8FF;" |IPTG
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP<ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov<ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous ''E. Coli'' RNA polymerase and sigma factor 70. ''J. Biol. Eng.'' '''4''', 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz ''E.coli'' (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19)<ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz ''E.coli'', komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP<ref name="vir 7" />. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov<ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />,<ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. ''BMC Biotechnol.'' '''9''', 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije ''E.coli'' izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE<ref> Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. ''Nat. Rev. Microbiol.'' '''9''', 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat<ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA<ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. ''Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res.'' '''1823''', 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v ''E.coli'', vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP<ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov<ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v ''E.coli'' ne najdemo<ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi ''E.coli'' lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino<ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2<ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi ''E.coli'' so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike<ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T15:27:31Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul<ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.'' '''100''', 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all ''Escherichia coli'' cell-free transcription-translation system. ''Biochimie'' '''99''', 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. ''Front. Bioeng. Biotechnol.'' '''7''', 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti<ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. ''Biotechnol. J.'' '''11''', 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz ''E.coli''<ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. ''FEBS Lett.'' '''291''', 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi ''E.coli''. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology<ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth. Biol.'' '''5''', 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu ''E.coli'' (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije<ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''količina'''
|-
| style="background: #F8F8FF;" |Hepes
| style="background: #F8F8FF;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ATP, GTP
| style="background: #F8F8FF;" |1,5 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |CTP, UTP
| style="background: #F8F8FF;" |0,9 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |tRNA
| style="background: #F8F8FF;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #F8F8FF;" |koencim A
| style="background: #F8F8FF;" |0,26 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |NAD
| style="background: #F8F8FF;" |0,33 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |cAMP
| style="background: #F8F8FF;" |0,75 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |folinska kislina
| style="background: #F8F8FF;" |0,068 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |spermidin
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #F8F8FF;" |30 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #F8F8FF;" |2 %
|-
| style="background: #F8F8FF;" |IPTG
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP<ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov<ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous ''E. Coli'' RNA polymerase and sigma factor 70. ''J. Biol. Eng.'' '''4''', 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz ''E.coli'' (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19)<ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz ''E.coli'', komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP<ref name="vir 7" />. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov<ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />,<ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. ''BMC Biotechnol.'' '''9''', 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije ''E.coli'' izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE<ref> Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. ''Nat. Rev. Microbiol.'' '''9''', 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat<ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA<ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. ''Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res.'' '''1823''', 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v ''E.coli'', vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP<ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov<ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v ''E.coli'' ne najdemo<ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi ''E.coli'' lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino<ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2<ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi ''E.coli'' so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike<ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T15:24:29Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul <ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.'' '''100''', 12672–12677 (2003).</ref>, <ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all ''Escherichia coli'' cell-free transcription-translation system. ''Biochimie'' '''99''', 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. ''Front. Bioeng. Biotechnol.'' '''7''', 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti <ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. ''Biotechnol. J.'' '''11''', 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz ''E.coli'' <ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. ''FEBS Lett.'' '''291''', 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi ''E.coli''. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology <ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth. Biol.'' '''5''', 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu ''E.coli'' (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije <ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''količina'''
|-
| style="background: #F8F8FF;" |Hepes
| style="background: #F8F8FF;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ATP, GTP
| style="background: #F8F8FF;" |1,5 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |CTP, UTP
| style="background: #F8F8FF;" |0,9 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |tRNA
| style="background: #F8F8FF;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #F8F8FF;" |koencim A
| style="background: #F8F8FF;" |0,26 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |NAD
| style="background: #F8F8FF;" |0,33 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |cAMP
| style="background: #F8F8FF;" |0,75 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |folinska kislina
| style="background: #F8F8FF;" |0,068 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |spermidin
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #F8F8FF;" |30 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #F8F8FF;" |2 %
|-
| style="background: #F8F8FF;" |IPTG
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP <ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov <ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous ''E. Coli'' RNA polymerase and sigma factor 70. ''J. Biol. Eng.'' '''4''', 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz ''E.coli'' (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19) <ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz ''E.coli'', komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP <ref name="vir 7" />. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov <ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />, <ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. ''BMC Biotechnol.'' '''9''', 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije ''E.coli'' izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE <ref> Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. ''Nat. Rev. Microbiol.'' '''9''', 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat <ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA <ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. ''Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res.'' '''1823''', 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v ''E.coli'', vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP <ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov <ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v ''E.coli'' ne najdemo <ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi ''E.coli'' lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino <ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2 <ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi ''E.coli'' so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike <ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T15:23:43Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul <ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.'' '''100''', 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all ''Escherichia coli'' cell-free transcription-translation system. ''Biochimie'' '''99''', 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. ''Front. Bioeng. Biotechnol.'' '''7''', 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti <ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. ''Biotechnol. J.'' '''11''', 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz ''E.coli'' <ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. ''FEBS Lett.'' '''291''', 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi ''E.coli''. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology <ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth. Biol.'' '''5''', 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu ''E.coli'' (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije <ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''količina'''
|-
| style="background: #F8F8FF;" |Hepes
| style="background: #F8F8FF;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ATP, GTP
| style="background: #F8F8FF;" |1,5 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |CTP, UTP
| style="background: #F8F8FF;" |0,9 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |tRNA
| style="background: #F8F8FF;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #F8F8FF;" |koencim A
| style="background: #F8F8FF;" |0,26 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |NAD
| style="background: #F8F8FF;" |0,33 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |cAMP
| style="background: #F8F8FF;" |0,75 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |folinska kislina
| style="background: #F8F8FF;" |0,068 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |spermidin
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #F8F8FF;" |30 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #F8F8FF;" |2 %
|-
| style="background: #F8F8FF;" |IPTG
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP <ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov <ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous ''E. Coli'' RNA polymerase and sigma factor 70. ''J. Biol. Eng.'' '''4''', 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz ''E.coli'' (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19) <ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz ''E.coli'', komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP <ref name="vir 7" />. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov <ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />, <ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. ''BMC Biotechnol.'' '''9''', 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije ''E.coli'' izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE <ref> Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. ''Nat. Rev. Microbiol.'' '''9''', 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat <ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA <ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. ''Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res.'' '''1823''', 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v ''E.coli'', vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP <ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov <ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v ''E.coli'' ne najdemo <ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi ''E.coli'' lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino <ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2 <ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi ''E.coli'' so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike <ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T15:22:11Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul <ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.'' '''100''', 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all ''Escherichia coli'' cell-free transcription-translation system. ''Biochimie'' '''99''', 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. ''Front. Bioeng. Biotechnol.'' '''7''', 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti <ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. ''Biotechnol. J.'' '''11''', 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz ''E.coli'' <ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. FEBS Lett. 291, 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi ''E.coli''. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology <ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth. Biol.'' '''5''', 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu ''E.coli'' (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije <ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''količina'''
|-
| style="background: #F8F8FF;" |Hepes
| style="background: #F8F8FF;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ATP, GTP
| style="background: #F8F8FF;" |1,5 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |CTP, UTP
| style="background: #F8F8FF;" |0,9 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |tRNA
| style="background: #F8F8FF;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #F8F8FF;" |koencim A
| style="background: #F8F8FF;" |0,26 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |NAD
| style="background: #F8F8FF;" |0,33 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |cAMP
| style="background: #F8F8FF;" |0,75 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |folinska kislina
| style="background: #F8F8FF;" |0,068 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |spermidin
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #F8F8FF;" |30 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #F8F8FF;" |2 %
|-
| style="background: #F8F8FF;" |IPTG
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP <ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov <ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous ''E. Coli'' RNA polymerase and sigma factor 70. ''J. Biol. Eng.'' '''4''', 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz ''E.coli'' (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19) <ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz ''E.coli'', komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP <ref name="vir 7" />. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov <ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />, <ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. ''BMC Biotechnol.'' '''9''', 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije ''E.coli'' izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE <ref> Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. ''Nat. Rev. Microbiol.'' '''9''', 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat <ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA <ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. ''Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res.'' '''1823''', 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v ''E.coli'', vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP <ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov <ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v ''E.coli'' ne najdemo <ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi ''E.coli'' lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino <ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2 <ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi ''E.coli'' so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike <ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T15:20:51Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul <ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.'' '''100''', 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all ''Escherichia coli'' cell-free transcription-translation system. ''Biochimie'' '''99''', 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. ''Front. Bioeng. Biotechnol.'' '''7''', 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti <ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. ''Biotechnol. J.'' '''11''', 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz ''E.coli'' <ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. FEBS Lett. 291, 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi ''E.coli''. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology <ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth. Biol.'' '''5''', 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu ''E.coli'' (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije <ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''količina'''
|-
| style="background: #F8F8FF;" |Hepes
| style="background: #F8F8FF;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ATP, GTP
| style="background: #F8F8FF;" |1,5 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |CTP, UTP
| style="background: #F8F8FF;" |0,9 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |tRNA
| style="background: #F8F8FF;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #F8F8FF;" |koencim A
| style="background: #F8F8FF;" |0,26 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |NAD
| style="background: #F8F8FF;" |0,33 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |cAMP
| style="background: #F8F8FF;" |0,75 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |folinska kislina
| style="background: #F8F8FF;" |0,068 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |spermidin
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #F8F8FF;" |30 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #F8F8FF;" |2 %
|-
| style="background: #F8F8FF;" |IPTG
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP <ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov <ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous ''E. Coli'' RNA polymerase and sigma factor 70. ''J. Biol. Eng.'' '''4''', 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz ''E.coli'' (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19) <ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz ''E.coli'', komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP <ref name="vir 7" />. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov <ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />, <ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. ''BMC Biotechnol.'' '''9''', 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije ''E.coli'' izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE <ref> Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. ''Nat. Rev. Microbiol.'' '''9''', 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat <ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA <ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. '''1823''', 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v ''E.coli'', vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP <ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov <ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v ''E.coli'' ne najdemo <ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi ''E.coli'' lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino <ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2 <ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi ''E.coli'' so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike <ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T15:19:49Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul <ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.'' '''100''', 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all ''Escherichia coli'' cell-free transcription-translation system. ''Biochimie'' '''99''', 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. ''Front. Bioeng. Biotechnol.'' '''7''', 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti <ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. ''Biotechnol. J.'' '''11''', 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz ''E.coli'' <ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. FEBS Lett. 291, 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi E.coli. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology <ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All ''E. coli'' TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth. Biol.'' '''5''', 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu E.coli (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije <ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''količina'''
|-
| style="background: #F8F8FF;" |Hepes
| style="background: #F8F8FF;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ATP, GTP
| style="background: #F8F8FF;" |1,5 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |CTP, UTP
| style="background: #F8F8FF;" |0,9 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |tRNA
| style="background: #F8F8FF;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #F8F8FF;" |koencim A
| style="background: #F8F8FF;" |0,26 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |NAD
| style="background: #F8F8FF;" |0,33 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |cAMP
| style="background: #F8F8FF;" |0,75 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |folinska kislina
| style="background: #F8F8FF;" |0,068 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |spermidin
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #F8F8FF;" |30 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #F8F8FF;" |2 %
|-
| style="background: #F8F8FF;" |IPTG
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP <ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov <ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous ''E. Coli'' RNA polymerase and sigma factor 70. ''J. Biol. Eng.'' '''4''', 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz ''E.coli'' (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19) <ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz ''E.coli'', komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP <ref name="vir 7" />. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov <ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />, <ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. ''BMC Biotechnol.'' '''9''', 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije ''E.coli'' izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE <ref> Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. ''Nat. Rev. Microbiol.'' '''9''', 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat <ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA <ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. '''1823''', 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v ''E.coli'', vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP <ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov <ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v ''E.coli'' ne najdemo <ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi E.coli lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino <ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2 <ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi ''E.coli'' so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike <ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Seminarji SB 2019/20

2020-05-03T15:06:49Z

Ajda.Lenardič:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 

21.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 

22.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinhronizirani_cikli_lize_bakterijskih_celic_za_in_vivo_dostavo_terapevtikov Sinhronizirani cikli lize bakterijskih celic za ''in vivo'' dostavo terapevtikov](Milica Janković) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Antihipertenzivni_probiotik_-_nov_pristop_zni%C5%BEevanja_krvnega_tlaka Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka] (Nika Testen) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_pot_fiksacije_ogljikovega_dioksida Sintezna pot fiksacije ogljikovega dioksida] (Ana Obaha) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 

5.5. 
1 [[Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi E.coli]] (Ajda Lenardič) 
2 Jelena Štrbac 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_sistema_s_proteinskimi_logi%C4%8Dnimi_vrati_na_povr%C5%A1ini_lipidnih_membran Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran] (Uroš Prešern) 

6.5. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ALiVE_%E2%80%93_analiza_%C5%BEivih_celic_z_vezikularnim_izvozom ALiVE – analiza živih celic z vezikularnim izvozom] (Sara Korošec) 
2 Peter Škrinjar 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Daljinsko_upravljanje_s_sesalskimi_celicami%2C_na_podlagi_temperaturno_reguliranih_genetskih_stikal_s_svetlobno-toplotnimi_utripi Daljinsko upravljanje s sesalskimi celicami, na podlagi temperaturno reguliranih genetskih stikal s svetlobno-toplotnimi utripi] (Luka Gregorič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacija_na_osnovi_DNA_v_populacijah_sinteticnih_protocelic Komunikacija na osnovi DNA v populacijah sintetičnih protocelic] (Urban Hribar) 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
3 Daria Latysheva 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Seminarji SB 2019/20

2020-05-03T15:06:21Z

Ajda.Lenardič:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 

21.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 

22.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinhronizirani_cikli_lize_bakterijskih_celic_za_in_vivo_dostavo_terapevtikov Sinhronizirani cikli lize bakterijskih celic za ''in vivo'' dostavo terapevtikov](Milica Janković) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Antihipertenzivni_probiotik_-_nov_pristop_zni%C5%BEevanja_krvnega_tlaka Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka] (Nika Testen) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_pot_fiksacije_ogljikovega_dioksida Sintezna pot fiksacije ogljikovega dioksida] (Ana Obaha) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 

5.5. 
1 [[Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E.coli'']] (Ajda Lenardič) 
2 Jelena Štrbac 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_sistema_s_proteinskimi_logi%C4%8Dnimi_vrati_na_povr%C5%A1ini_lipidnih_membran Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran] (Uroš Prešern) 

6.5. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ALiVE_%E2%80%93_analiza_%C5%BEivih_celic_z_vezikularnim_izvozom ALiVE – analiza živih celic z vezikularnim izvozom] (Sara Korošec) 
2 Peter Škrinjar 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Daljinsko_upravljanje_s_sesalskimi_celicami%2C_na_podlagi_temperaturno_reguliranih_genetskih_stikal_s_svetlobno-toplotnimi_utripi Daljinsko upravljanje s sesalskimi celicami, na podlagi temperaturno reguliranih genetskih stikal s svetlobno-toplotnimi utripi] (Luka Gregorič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacija_na_osnovi_DNA_v_populacijah_sinteticnih_protocelic Komunikacija na osnovi DNA v populacijah sintetičnih protocelic] (Urban Hribar) 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
3 Daria Latysheva 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Seminarji SB 2019/20

2020-05-03T15:05:53Z

Ajda.Lenardič:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 

21.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 

22.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinhronizirani_cikli_lize_bakterijskih_celic_za_in_vivo_dostavo_terapevtikov Sinhronizirani cikli lize bakterijskih celic za ''in vivo'' dostavo terapevtikov](Milica Janković) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Antihipertenzivni_probiotik_-_nov_pristop_zni%C5%BEevanja_krvnega_tlaka Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka] (Nika Testen) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_pot_fiksacije_ogljikovega_dioksida Sintezna pot fiksacije ogljikovega dioksida] (Ana Obaha) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 

5.5. 
1 [[[Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E.coli'']]] (Ajda Lenardič) 
2 Jelena Štrbac 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_sistema_s_proteinskimi_logi%C4%8Dnimi_vrati_na_povr%C5%A1ini_lipidnih_membran Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran] (Uroš Prešern) 

6.5. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ALiVE_%E2%80%93_analiza_%C5%BEivih_celic_z_vezikularnim_izvozom ALiVE – analiza živih celic z vezikularnim izvozom] (Sara Korošec) 
2 Peter Škrinjar 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Daljinsko_upravljanje_s_sesalskimi_celicami%2C_na_podlagi_temperaturno_reguliranih_genetskih_stikal_s_svetlobno-toplotnimi_utripi Daljinsko upravljanje s sesalskimi celicami, na podlagi temperaturno reguliranih genetskih stikal s svetlobno-toplotnimi utripi] (Luka Gregorič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacija_na_osnovi_DNA_v_populacijah_sinteticnih_protocelic Komunikacija na osnovi DNA v populacijah sintetičnih protocelic] (Urban Hribar) 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
3 Daria Latysheva 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T15:03:51Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul <ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Front. Bioeng. Biotechnol. 7, 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti <ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnol. J. 11, 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz E.coli <ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. FEBS Lett. 291, 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi E.coli. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology <ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu E.coli (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije <ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #E6E6FA;"|'''količina'''
|-
| style="background: #F8F8FF;" |Hepes
| style="background: #F8F8FF;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ATP, GTP
| style="background: #F8F8FF;" |1,5 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |CTP, UTP
| style="background: #F8F8FF;" |0,9 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |tRNA
| style="background: #F8F8FF;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #F8F8FF;" |koencim A
| style="background: #F8F8FF;" |0,26 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |NAD
| style="background: #F8F8FF;" |0,33 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |cAMP
| style="background: #F8F8FF;" |0,75 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |folinska kislina
| style="background: #F8F8FF;" |0,068 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |spermidin
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #F8F8FF;" |30 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #F8F8FF;" |2 %
|-
| style="background: #F8F8FF;" |IPTG
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP <ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov <ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4, 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz E.coli (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19) <ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz E.coli, komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP <ref name="vir 7" />. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov <ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />, <ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnol. 9, 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije E.coli izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE <ref>Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779-790. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat <ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA <ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1823, 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v E.coli, vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP <ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov <ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v E.coli ne najdemo <ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi E.coli lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino <ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2 <ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi E.coli so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike <ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T15:02:50Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul <ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Front. Bioeng. Biotechnol. 7, 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti <ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnol. J. 11, 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz E.coli <ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. FEBS Lett. 291, 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi E.coli. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology <ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu E.coli (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije <ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #B0C4DE;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #B0C4DE;"|'''količina'''
|-
| style="background: #F8F8FF;" |Hepes
| style="background: #F8F8FF;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ATP, GTP
| style="background: #F8F8FF;" |1,5 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |CTP, UTP
| style="background: #F8F8FF;" |0,9 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |tRNA
| style="background: #F8F8FF;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #F8F8FF;" |koencim A
| style="background: #F8F8FF;" |0,26 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |NAD
| style="background: #F8F8FF;" |0,33 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |cAMP
| style="background: #F8F8FF;" |0,75 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |folinska kislina
| style="background: #F8F8FF;" |0,068 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |spermidin
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #F8F8FF;" |30 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|-
| style="background: #F8F8FF;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #F8F8FF;" |2 %
|-
| style="background: #F8F8FF;" |IPTG
| style="background: #F8F8FF;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP <ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov <ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4, 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz E.coli (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19) <ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz E.coli, komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP <ref name="vir 7" />. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov <ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />, <ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnol. 9, 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije E.coli izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE <ref>Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779-790. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat <ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA <ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1823, 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v E.coli, vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP <ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov <ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v E.coli ne najdemo <ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi E.coli lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino <ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2 <ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi E.coli so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike <ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T14:55:02Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul <ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Front. Bioeng. Biotechnol. 7, 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti <ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnol. J. 11, 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz E.coli <ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. FEBS Lett. 291, 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi E.coli. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology <ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu E.coli (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije <ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #8A2BE2;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #8A2BE2;"|'''količina'''
|-
| style="background: #E6E6FA;" |Hepes
| style="background: #E6E6FA;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ATP, GTP
| style="background: #E6E6FA;" |1,5 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |CTP, UTP
| style="background: #E6E6FA;" |0,9 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |tRNA
| style="background: #E6E6FA;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #E6E6FA;" |koencim A
| style="background: #E6E6FA;" |0,26 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |NAD
| style="background: #E6E6FA;" |0,33 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |cAMP
| style="background: #E6E6FA;" |0,75 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |folinska kislina
| style="background: #E6E6FA;" |0,068 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |spermidin
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #E6E6FA;" |30 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #E6E6FA;" |2 %
|-
| style="background: #E6E6FA;" |IPTG
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP <ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov <ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4, 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz E.coli (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19) <ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz E.coli, komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP <ref name="vir 7" />. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov <ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />, <ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnol. 9, 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije E.coli izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE <ref>Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779-790. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat <ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA <ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1823, 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v E.coli, vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP <ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov <ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v E.coli ne najdemo <ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi E.coli lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino <ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2 <ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi E.coli so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike <ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T14:53:47Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul <ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Front. Bioeng. Biotechnol. 7, 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti <ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnol. J. 11, 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz E.coli <ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. FEBS Lett. 291, 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi E.coli. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology <ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu E.coli (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije <ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #8A2BE2;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #8A2BE2;"|'''količina'''
|-
| style="background: #E6E6FA;" |Hepes
| style="background: #E6E6FA;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ATP, GTP
| style="background: #E6E6FA;" |1,5 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |CTP, UTP
| style="background: #E6E6FA;" |0,9 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |tRNA
| style="background: #E6E6FA;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #E6E6FA;" |koencim A
| style="background: #E6E6FA;" |0,26 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |NAD
| style="background: #E6E6FA;" |0,33 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |cAMP
| style="background: #E6E6FA;" |0,75 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |folinska kislina
| style="background: #E6E6FA;" |0,068 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |spermidin
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #E6E6FA;" |30 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #E6E6FA;" |2 %
|-
| style="background: #E6E6FA;" |IPTG
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP <ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov <ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4, 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz E.coli (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19) <ref>Caschera, F. & Noireaux, <ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz E.coli, komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP <ref name="vir 7" />. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov <ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />, <ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnol. 9, 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije E.coli izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE <ref>Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779-790. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat <ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA <ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1823, 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v E.coli, vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP <ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov <ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v E.coli ne najdemo <ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi E.coli lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino <ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2 <ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi E.coli so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike <ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T14:52:37Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul <ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Front. Bioeng. Biotechnol. 7, 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti <ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnol. J. 11, 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz E.coli <ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. FEBS Lett. 291, 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi E.coli. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology <ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu E.coli (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije <ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #8A2BE2;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #8A2BE2;"|'''količina'''
|-
| style="background: #E6E6FA;" |Hepes
| style="background: #E6E6FA;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ATP, GTP
| style="background: #E6E6FA;" |1,5 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |CTP, UTP
| style="background: #E6E6FA;" |0,9 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |tRNA
| style="background: #E6E6FA;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #E6E6FA;" |koencim A
| style="background: #E6E6FA;" |0,26 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |NAD
| style="background: #E6E6FA;" |0,33 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |cAMP
| style="background: #E6E6FA;" |0,75 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |folinska kislina
| style="background: #E6E6FA;" |0,068 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |spermidin
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #E6E6FA;" |30 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #E6E6FA;" |2 %
|-
| style="background: #E6E6FA;" |IPTG
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP <ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov <ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4, 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz E.coli (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19) <ref>Caschera, F. & Noireaux, <ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz E.coli, komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP [7]. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov <ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />, <ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnol. 9, 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije E.coli izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE <ref>Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779-790. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat <ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA <ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1823, 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v E.coli, vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP <ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov <ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v E.coli ne najdemo <ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi E.coli lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino <ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2 <ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi E.coli so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike <ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T14:50:20Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul <ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Front. Bioeng. Biotechnol. 7, 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti <ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnol. J. 11, 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz E.coli <ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. FEBS Lett. 291, 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi E.coli. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology <ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu E.coli (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije <ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #8A2BE2;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #8A2BE2;"|'''količina'''
|-
| style="background: #E6E6FA;" |Hepes
| style="background: #E6E6FA;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ATP, GTP
| style="background: #E6E6FA;" |1,5 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |CTP, UTP
| style="background: #E6E6FA;" |0,9 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |tRNA
| style="background: #E6E6FA;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #E6E6FA;" |koencim A
| style="background: #E6E6FA;" |0,26 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |NAD
| style="background: #E6E6FA;" |0,33 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |cAMP
| style="background: #E6E6FA;" |0,75 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |folinska kislina
| style="background: #E6E6FA;" |0,068 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |spermidin
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #E6E6FA;" |30 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #E6E6FA;" |2 %
|-
| style="background: #E6E6FA;" |IPTG
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP <ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov <ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4, 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz E.coli (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19) <ref>Caschera, F. & Noireaux, <ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz E.coli, komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP [7]. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref name="vir 7" />, <ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnol. 9, 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije E.coli izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE <ref>Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779-790. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat <ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA <ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1823, 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v E.coli, vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP <ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov <ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v E.coli ne najdemo <ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi E.coli lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino <ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2 <ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi E.coli so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike <ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T14:46:30Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul <ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Front. Bioeng. Biotechnol. 7, 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti <ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnol. J. 11, 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz E.coli <ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. FEBS Lett. 291, 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi E.coli. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology <ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu E.coli (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije <ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #8A2BE2;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #8A2BE2;"|'''količina'''
|-
| style="background: #E6E6FA;" |Hepes
| style="background: #E6E6FA;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ATP, GTP
| style="background: #E6E6FA;" |1,5 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |CTP, UTP
| style="background: #E6E6FA;" |0,9 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |tRNA
| style="background: #E6E6FA;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #E6E6FA;" |koencim A
| style="background: #E6E6FA;" |0,26 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |NAD
| style="background: #E6E6FA;" |0,33 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |cAMP
| style="background: #E6E6FA;" |0,75 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |folinska kislina
| style="background: #E6E6FA;" |0,068 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |spermidin
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #E6E6FA;" |30 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #E6E6FA;" |2 %
|-
| style="background: #E6E6FA;" |IPTG
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP <ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov <ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4, 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz E.coli (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19) <ref>Caschera, F. & Noireaux, <ref name="vir 3" />, <ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz E.coli, komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP [7]. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref name="vir 7" />, <ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnol. 9, 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije E.coli izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE <ref>Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779-790. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat <ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA <ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1823, 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v E.coli, vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP <ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov <ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v E.coli ne najdemo <ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi E.coli lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino <ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2 <ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi E.coli so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike <ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T14:44:21Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul <ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 12672–12677 (2003).</ref>,<ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Front. Bioeng. Biotechnol. 7, 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti <ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnol. J. 11, 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz E.coli <ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. FEBS Lett. 291, 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi E.coli. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology <ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu E.coli (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije <ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #8A2BE2;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #8A2BE2;"|'''količina'''
|-
| style="background: #E6E6FA;" |Hepes
| style="background: #E6E6FA;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ATP, GTP
| style="background: #E6E6FA;" |1,5 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |CTP, UTP
| style="background: #E6E6FA;" |0,9 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |tRNA
| style="background: #E6E6FA;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #E6E6FA;" |koencim A
| style="background: #E6E6FA;" |0,26 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |NAD
| style="background: #E6E6FA;" |0,33 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |cAMP
| style="background: #E6E6FA;" |0,75 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |folinska kislina
| style="background: #E6E6FA;" |0,068 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |spermidin
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #E6E6FA;" |30 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #E6E6FA;" |2 %
|-
| style="background: #E6E6FA;" |IPTG
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP <ref name="vir 7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov <ref name="vir 7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4, 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz E.coli (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19) <ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref name="vir 7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz E.coli, komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP [7]. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref name="vir 7" />, <ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnol. 9, 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije E.coli izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE <ref>Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779-790. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat <ref name="vir 7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA <ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1823, 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v E.coli, vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP <ref name="vir 7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov <ref name="vir 7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v E.coli ne najdemo <ref name="vir 7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi E.coli lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino <ref name="vir 7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2 <ref name="vir 7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi E.coli so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike <ref name="vir 7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T14:43:02Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul <ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 12672–12677 (2003).</ref>,<ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Front. Bioeng. Biotechnol. 7, 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti <ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnol. J. 11, 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz E.coli <ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. FEBS Lett. 291, 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi E.coli. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology <ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu E.coli (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije <ref name=" vir 7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #8A2BE2;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #8A2BE2;"|'''količina'''
|-
| style="background: #E6E6FA;" |Hepes
| style="background: #E6E6FA;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ATP, GTP
| style="background: #E6E6FA;" |1,5 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |CTP, UTP
| style="background: #E6E6FA;" |0,9 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |tRNA
| style="background: #E6E6FA;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #E6E6FA;" |koencim A
| style="background: #E6E6FA;" |0,26 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |NAD
| style="background: #E6E6FA;" |0,33 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |cAMP
| style="background: #E6E6FA;" |0,75 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |folinska kislina
| style="background: #E6E6FA;" |0,068 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |spermidin
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #E6E6FA;" |30 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #E6E6FA;" |2 %
|-
| style="background: #E6E6FA;" |IPTG
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP <ref name="7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov <ref name="7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4, 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz E.coli (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19) <ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref name="7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz E.coli, komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP [7]. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref name="7" />, <ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnol. 9, 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije E.coli izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE <ref>Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779-790. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat <ref name="7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA <ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1823, 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v E.coli, vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP <ref name="7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov <ref name="7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v E.coli ne najdemo <ref name="7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi E.coli lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino <ref name="7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2 <ref name="7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi E.coli so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike <ref name="7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T14:41:26Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul <ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 12672–12677 (2003).</ref>,<ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Front. Bioeng. Biotechnol. 7, 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti <ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnol. J. 11, 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz E.coli <ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. FEBS Lett. 291, 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi E.coli. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology <ref name="7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu E.coli (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije <ref name="7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #8A2BE2;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #8A2BE2;"|'''količina'''
|-
| style="background: #E6E6FA;" |Hepes
| style="background: #E6E6FA;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ATP, GTP
| style="background: #E6E6FA;" |1,5 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |CTP, UTP
| style="background: #E6E6FA;" |0,9 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |tRNA
| style="background: #E6E6FA;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #E6E6FA;" |koencim A
| style="background: #E6E6FA;" |0,26 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |NAD
| style="background: #E6E6FA;" |0,33 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |cAMP
| style="background: #E6E6FA;" |0,75 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |folinska kislina
| style="background: #E6E6FA;" |0,068 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |spermidin
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #E6E6FA;" |30 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #E6E6FA;" |2 %
|-
| style="background: #E6E6FA;" |IPTG
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP <ref name="7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov <ref name="7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4, 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz E.coli (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19) <ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref name="7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz E.coli, komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP [7]. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref name="7" />, <ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnol. 9, 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije E.coli izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE <ref>Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779-790. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat <ref name="7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA <ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1823, 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v E.coli, vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP <ref name="7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov <ref name="7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v E.coli ne najdemo <ref name="7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi E.coli lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino <ref name="7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2 <ref name="7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi E.coli so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike <ref name="7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T14:40:30Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul <ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 12672–12677 (2003).</ref>,<ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Front. Bioeng. Biotechnol. 7, 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti <ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnol. J. 11, 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz E.coli <ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. FEBS Lett. 291, 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi E.coli. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology <ref name="">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu E.coli (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije <ref name="7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #8A2BE2;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #8A2BE2;"|'''količina'''
|-
| style="background: #E6E6FA;" |Hepes
| style="background: #E6E6FA;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ATP, GTP
| style="background: #E6E6FA;" |1,5 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |CTP, UTP
| style="background: #E6E6FA;" |0,9 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |tRNA
| style="background: #E6E6FA;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #E6E6FA;" |koencim A
| style="background: #E6E6FA;" |0,26 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |NAD
| style="background: #E6E6FA;" |0,33 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |cAMP
| style="background: #E6E6FA;" |0,75 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |folinska kislina
| style="background: #E6E6FA;" |0,068 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |spermidin
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #E6E6FA;" |30 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #E6E6FA;" |2 %
|-
| style="background: #E6E6FA;" |IPTG
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP <ref name="7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov <ref name="7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4, 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz E.coli (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19) <ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref name="7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz E.coli, komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP [7]. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref name="7" />, <ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnol. 9, 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije E.coli izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE <ref>Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779-790. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat <ref name="7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA <ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1823, 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v E.coli, vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP <ref name="7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov <ref name="7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v E.coli ne najdemo <ref name="7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi E.coli lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino <ref name="7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2 <ref name="7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi E.coli so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike <ref name="7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T14:37:38Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul <ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 12672–12677 (2003).</ref>,<ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Front. Bioeng. Biotechnol. 7, 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti <ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnol. J. 11, 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz E.coli <ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. FEBS Lett. 291, 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi E.coli. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology <refref name="7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu E.coli (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije <ref name="7" />.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #8A2BE2;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #8A2BE2;"|'''količina'''
|-
| style="background: #E6E6FA;" |Hepes
| style="background: #E6E6FA;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ATP, GTP
| style="background: #E6E6FA;" |1,5 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |CTP, UTP
| style="background: #E6E6FA;" |0,9 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |tRNA
| style="background: #E6E6FA;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #E6E6FA;" |koencim A
| style="background: #E6E6FA;" |0,26 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |NAD
| style="background: #E6E6FA;" |0,33 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |cAMP
| style="background: #E6E6FA;" |0,75 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |folinska kislina
| style="background: #E6E6FA;" |0,068 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |spermidin
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #E6E6FA;" |30 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #E6E6FA;" |2 %
|-
| style="background: #E6E6FA;" |IPTG
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP <ref name="7" />.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov <ref name="7" />.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4, 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz E.coli (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19) <ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref name="7" />.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz E.coli, komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP [7]. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref name="7" />, <ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnol. 9, 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije E.coli izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE <ref>Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779-790. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat <ref name="7" />.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA <ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1823, 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v E.coli, vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP <ref name="7" />.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov <ref name="7" />.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v E.coli ne najdemo <ref name="7" />.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi E.coli lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino <ref name="7" />.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2 <ref name="7" />.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi E.coli so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike <ref name="7" />.

== '''Viri''' ==
<references/>

Seminarji SB 2019/20

2020-05-03T14:28:43Z

Ajda.Lenardič:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 

21.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 

22.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinhronizirani_cikli_lize_bakterijskih_celic_za_in_vivo_dostavo_terapevtikov Sinhronizirani cikli lize bakterijskih celic za ''in vivo'' dostavo terapevtikov](Milica Janković) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Antihipertenzivni_probiotik_-_nov_pristop_zni%C5%BEevanja_krvnega_tlaka Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka] (Nika Testen) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_pot_fiksacije_ogljikovega_dioksida Sintezna pot fiksacije ogljikovega dioksida] (Ana Obaha) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 

5.5. 
1 [[Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi E.coli]] (Ajda Lenardič) 
2 Jelena Štrbac 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_sistema_s_proteinskimi_logi%C4%8Dnimi_vrati_na_povr%C5%A1ini_lipidnih_membran Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran] (Uroš Prešern) 

6.5. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ALiVE_%E2%80%93_analiza_%C5%BEivih_celic_z_vezikularnim_izvozom ALiVE – analiza živih celic z vezikularnim izvozom] (Sara Korošec) 
2 Peter Škrinjar 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Daljinsko_upravljanje_s_sesalskimi_celicami%2C_na_podlagi_temperaturno_reguliranih_genetskih_stikal_s_svetlobno-toplotnimi_utripi Daljinsko upravljanje s sesalskimi celicami, na podlagi temperaturno reguliranih genetskih stikal s svetlobno-toplotnimi utripi] (Luka Gregorič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacija_na_osnovi_DNA_v_populacijah_sinteticnih_protocelic Komunikacija na osnovi DNA v populacijah sintetičnih protocelic] (Urban Hribar) 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
3 Daria Latysheva 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Seminarji SB 2019/20

2020-05-03T14:28:10Z

Ajda.Lenardič:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 

21.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 

22.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinhronizirani_cikli_lize_bakterijskih_celic_za_in_vivo_dostavo_terapevtikov Sinhronizirani cikli lize bakterijskih celic za ''in vivo'' dostavo terapevtikov](Milica Janković) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Antihipertenzivni_probiotik_-_nov_pristop_zni%C5%BEevanja_krvnega_tlaka Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka] (Nika Testen) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_pot_fiksacije_ogljikovega_dioksida Sintezna pot fiksacije ogljikovega dioksida] (Ana Obaha) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 

5.5. 
1 [[Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E.coli'']] (Ajda Lenardič) 
2 Jelena Štrbac 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_sistema_s_proteinskimi_logi%C4%8Dnimi_vrati_na_povr%C5%A1ini_lipidnih_membran Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran] (Uroš Prešern) 

6.5. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ALiVE_%E2%80%93_analiza_%C5%BEivih_celic_z_vezikularnim_izvozom ALiVE – analiza živih celic z vezikularnim izvozom] (Sara Korošec) 
2 Peter Škrinjar 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Daljinsko_upravljanje_s_sesalskimi_celicami%2C_na_podlagi_temperaturno_reguliranih_genetskih_stikal_s_svetlobno-toplotnimi_utripi Daljinsko upravljanje s sesalskimi celicami, na podlagi temperaturno reguliranih genetskih stikal s svetlobno-toplotnimi utripi] (Luka Gregorič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacija_na_osnovi_DNA_v_populacijah_sinteticnih_protocelic Komunikacija na osnovi DNA v populacijah sintetičnih protocelic] (Urban Hribar) 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
3 Daria Latysheva 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T14:26:50Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul <ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 12672–12677 (2003).</ref>,<ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Front. Bioeng. Biotechnol. 7, 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti <ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnol. J. 11, 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz E.coli <ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. FEBS Lett. 291, 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi E.coli. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology <ref>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu E.coli (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 120px; background: #8A2BE2;"|'''reagent'''
! style="width: 120px; background: #8A2BE2;"|'''količina'''
|-
| style="background: #E6E6FA;" |Hepes
| style="background: #E6E6FA;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ATP, GTP
| style="background: #E6E6FA;" |1,5 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |CTP, UTP
| style="background: #E6E6FA;" |0,9 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |tRNA
| style="background: #E6E6FA;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #E6E6FA;" |koencim A
| style="background: #E6E6FA;" |0,26 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |NAD
| style="background: #E6E6FA;" |0,33 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |cAMP
| style="background: #E6E6FA;" |0,75 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |folinska kislina
| style="background: #E6E6FA;" |0,068 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |spermidin
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #E6E6FA;" |30 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #E6E6FA;" |2 %
|-
| style="background: #E6E6FA;" |IPTG
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4, 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz E.coli (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19) <ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz E.coli, komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP [7]. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>, <ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnol. 9, 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije E.coli izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE <ref>Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779-790. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA <ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1823, 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v E.coli, vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v E.coli ne najdemo <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi E.coli lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2 <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi E.coli so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T14:26:21Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul <ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 12672–12677 (2003).</ref>,<ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Front. Bioeng. Biotechnol. 7, 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti <ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnol. J. 11, 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz E.coli <ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. FEBS Lett. 291, 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi E.coli. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology <ref>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu E.coli (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 130px; background: #8A2BE2;"|'''reagent'''
! style="width: 90px; background: #8A2BE2;"|'''količina'''
|-
| style="background: #E6E6FA;" |Hepes
| style="background: #E6E6FA;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ATP, GTP
| style="background: #E6E6FA;" |1,5 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |CTP, UTP
| style="background: #E6E6FA;" |0,9 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |tRNA
| style="background: #E6E6FA;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #E6E6FA;" |koencim A
| style="background: #E6E6FA;" |0,26 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |NAD
| style="background: #E6E6FA;" |0,33 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |cAMP
| style="background: #E6E6FA;" |0,75 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |folinska kislina
| style="background: #E6E6FA;" |0,068 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |spermidin
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #E6E6FA;" |30 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #E6E6FA;" |2 %
|-
| style="background: #E6E6FA;" |IPTG
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4, 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz E.coli (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19) <ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz E.coli, komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP [7]. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>, <ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnol. 9, 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije E.coli izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE <ref>Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779-790. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA <ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1823, 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v E.coli, vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v E.coli ne najdemo <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi E.coli lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2 <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi E.coli so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T14:25:52Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul <ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 12672–12677 (2003).</ref>,<ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Front. Bioeng. Biotechnol. 7, 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti <ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnol. J. 11, 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz E.coli <ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. FEBS Lett. 291, 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi E.coli. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology <ref>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu E.coli (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 130px; background: #8A2BE2;"|'''reagent'''
! style="width: 90px; background: #8A2BE2;"|'''količina'''
|-
| style="background: #E6E6FA;" |Hepes
| style="background: #E6E6FA;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ATP, GTP
| style="background: #E6E6FA;" |1,5 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |CTP, UTP
| style="background: #E6E6FA;" |0,9 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |tRNA
| style="background: #E6E6FA;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #E6E6FA;" |koencim A
| style="background: #E6E6FA;" |0,26 mM
|-
| style="background: #FFFFFF;" |NAD
| style="background: #FFFFFF;" |0,33 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |cAMP
| style="background: #E6E6FA;" |0,75 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |folinska kislina
| style="background: #E6E6FA;" |0,068 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |spermidin
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #E6E6FA;" |30 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #E6E6FA;" |2 %
|-
| style="background: #E6E6FA;" |IPTG
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4, 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz E.coli (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19) <ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz E.coli, komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP [7]. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>, <ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnol. 9, 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije E.coli izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE <ref>Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779-790. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA <ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1823, 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v E.coli, vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v E.coli ne najdemo <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi E.coli lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2 <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi E.coli so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T14:25:33Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul <ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 12672–12677 (2003).</ref>,<ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Front. Bioeng. Biotechnol. 7, 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti <ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnol. J. 11, 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz E.coli <ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. FEBS Lett. 291, 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi E.coli. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology <ref>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu E.coli (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 130px; background: #8A2BE2;"|'''reagent'''
! style="width: 90px; background: #8A2BE2;"|'''količina'''
|-
| style="background: #E6E6FA;" |Hepes
| style="background: #E6E6FA;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ATP, GTP
| style="background: #E6E6FA;" |1,5 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |CTP, UTP
| style="background: #E6E6FA;" |0,9 mM
|-
| style="background: #FFFFFF;" |tRNA
| style="background: #FFFFFF;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #E6E6FA;" |koencim A
| style="background: #E6E6FA;" |0,26 mM
|-
| style="background: #FFFFFF;" |NAD
| style="background: #FFFFFF;" |0,33 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |cAMP
| style="background: #E6E6FA;" |0,75 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |folinska kislina
| style="background: #E6E6FA;" |0,068 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |spermidin
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #E6E6FA;" |30 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|-
| style="background: #E6E6FA;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #E6E6FA;" |2 %
|-
| style="background: #E6E6FA;" |IPTG
| style="background: #E6E6FA;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4, 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz E.coli (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19) <ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz E.coli, komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP [7]. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>, <ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnol. 9, 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije E.coli izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE <ref>Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779-790. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA <ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1823, 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v E.coli, vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v E.coli ne najdemo <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi E.coli lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2 <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi E.coli so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T14:20:45Z

Ajda.Lenardič:

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul <ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 12672–12677 (2003).</ref>,<ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Front. Bioeng. Biotechnol. 7, 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti <ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnol. J. 11, 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz E.coli <ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. FEBS Lett. 291, 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi E.coli. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology <ref>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu E.coli (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 130px; background: #800080;"|'''reagent'''
! style="width: 90px; background: #800080;"|'''količina'''
|-
| style="background: #FFFFFF;" |Hepes
| style="background: #FFFFFF;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #FFFFFF;" |ATP, GTP
| style="background: #FFFFFF;" |1,5 mM
|-
| style="background: #FFFFFF;" |CTP, UTP
| style="background: #FFFFFF;" |0,9 mM
|-
| style="background: #FFFFFF;" |tRNA
| style="background: #FFFFFF;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #FFFFFF;" |koencim A
| style="background: #FFFFFF;" |0,26 mM
|-
| style="background: #FFFFFF;" |NAD
| style="background: #FFFFFF;" |0,33 mM
|-
| style="background: #FFFFFF;" |cAMP
| style="background: #FFFFFF;" |0,75 mM
|-
| style="background: #FFFFFF;" |folinska kislina
| style="background: #FFFFFF;" |0,068 mM
|-
| style="background: #FFFFFF;" |spermidin
| style="background: #FFFFFF;" |1 mM
|-
| style="background: #FFFFFF;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #FFFFFF;" |30 mM
|-
| style="background: #FFFFFF;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #FFFFFF;" |1 mM
|-
| style="background: #FFFFFF;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #FFFFFF;" |2 %
|-
| style="background: #FFFFFF;" |IPTG
| style="background: #FFFFFF;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4, 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz E.coli (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19) <ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz E.coli, komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP [7]. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>, <ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnol. 9, 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije E.coli izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE <ref>Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779-790. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA <ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1823, 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v E.coli, vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v E.coli ne najdemo <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi E.coli lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2 <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi E.coli so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

== '''Viri''' ==
<references/>

Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''

2020-05-03T14:12:44Z

Ajda.Lenardič: New page: ''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthe...

''Povzeto po:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5b00296 Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ''ACS Synth Biol.'' '''5''', 344-355 (2016).]

Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul <ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 12672–12677 (2003).</ref>,<ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji <ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Front. Bioeng. Biotechnol. 7, 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti <ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnol. J. 11, 274–281 (2016).</ref>.

V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz E.coli <ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. FEBS Lett. 291, 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi E.coli. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology <ref>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Opis sistema'''==
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu E.coli (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo recBCD, ki je endogeno prisotna v ekstraktu E.coli. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Sestava pufra PGA. .
! style="width: 90px; background: #B3C88A;"|'''reagent'''
! style="width: 90px; background: #B3C88A;"|'''količina'''
|-
| style="background: #FCFCFC;" |Hepes
| style="background: #FCFCFC;" |50 mM , pH 8
|-
| style="background: #FCFCFC;" |ATP, GTP
| style="background: #FCFCFC;" |1,5 mM
|-
| style="background: #FCFCFC;" |CTP, UTP
| style="background: #FCFCFC;" |0,9 mM
|-
| style="background: #FCFCFC;" |tRNA
| style="background: #FCFCFC;" |0,2 mg/ml
|-
| style="background: #FCFCFC;" |koencim A
| style="background: #FCFCFC;" |0,26 mM
|-
| style="background: #FCFCFC;" |NAD
| style="background: #FCFCFC;" |0,33 mM
|-
| style="background: #FCFCFC;" |cAMP
| style="background: #FCFCFC;" |0,75 mM
|-
| style="background: #FCFCFC;" |folinska kislina
| style="background: #FCFCFC;" |0,068 mM
|-
| style="background: #FCFCFC;" |spermidin
| style="background: #FCFCFC;" |1 mM
|-
| style="background: #FCFCFC;" |3-fosfoglicerat
| style="background: #FCFCFC;" |30 mM
|-
| style="background: #FCFCFC;" |ditiotreitol (DTT)
| style="background: #FCFCFC;" |1 mM
|-
| style="background: #FCFCFC;" |polietilenglikol 8000 (PEG800)
| style="background: #FCFCFC;" |2 %
|-
| style="background: #FCFCFC;" |IPTG
| style="background: #FCFCFC;" |1 mM
|}

Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Transkripcija===
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4, 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz E.coli (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19) <ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Translacija===
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz E.coli, komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP [7]. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov ref>Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 99, 162–168 (2014).</ref>, <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>, <ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnol. 9, 1–8 (2009).</ref>.

===Razgradnja mRNA===
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije E.coli izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE <ref>Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779-790. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Razgradnja proteinov===
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je ompA, najbolj znana C-končna pa ssrA <ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1823, 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v E.coli, vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisom za podenoti ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Možnosti uporabe sistema'''==
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Sestavljanje genetskih vezij===
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v E.coli ne najdemo <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Priprava minimalnih celičnih sistemov===
Da brezcelični sistem na osnovi E.coli lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

===Proizvodnja bakteriofagov===
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2 <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

=='''Zaključek'''==
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi E.coli so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike <ref> Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.

== '''Viri''' ==
<references/>

Seminarji SB 2019/20

2020-05-03T12:20:27Z

Ajda.Lenardič:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 

21.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 

22.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinhronizirani_cikli_lize_bakterijskih_celic_za_in_vivo_dostavo_terapevtikov Sinhronizirani cikli lize bakterijskih celic za ''in vivo'' dostavo terapevtikov](Milica Janković) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Antihipertenzivni_probiotik_-_nov_pristop_zni%C5%BEevanja_krvnega_tlaka Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka] (Nika Testen) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_pot_fiksacije_ogljikovega_dioksida Sintezna pot fiksacije ogljikovega dioksida] (Ana Obaha) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 

5.5. 
1 [[Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi E.coli]] (Ajda Lenardič) 
2 Jelena Štrbac 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_sistema_s_proteinskimi_logi%C4%8Dnimi_vrati_na_povr%C5%A1ini_lipidnih_membran Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran] (Uroš Prešern) 

6.5. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ALiVE_%E2%80%93_analiza_%C5%BEivih_celic_z_vezikularnim_izvozom ALiVE – analiza živih celic z vezikularnim izvozom] (Sara Korošec) 
2 Peter Škrinjar 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Daljinsko_upravljanje_s_sesalskimi_celicami%2C_na_podlagi_temperaturno_reguliranih_genetskih_stikal_s_svetlobno-toplotnimi_utripi Daljinsko upravljanje s sesalskimi celicami, na podlagi temperaturno reguliranih genetskih stikal s svetlobno-toplotnimi utripi] (Luka Gregorič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacija_na_osnovi_DNA_v_populacijah_sinteticnih_protocelic Komunikacija na osnovi DNA v populacijah sintetičnih protocelic] (Urban Hribar) 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
3 Daria Latysheva 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Mehanizem delovanja betalaktamov in glikopeptidov

2017-05-14T20:31:27Z

Ajda.Lenardič:

== Sinteza bakterijske celične stene ==

Celična stena daje bakterijski celici trdnost in ščiti celično membrano pred poškodbami zaradi celičnega turgorja. V glavnem jo sestavlja polimer peptidoglikan, ki mu pravimo tudi murein. Po Gramu negativne bakterije imajo dve celični membrani, med katerima se v periplazemskem prostoru nahaja celična stena. Ta je široka od 7 nm do 8 nm in je sestavljena le iz nekaj plasti peptidoglikana. Po Gramu pozitivne bakterije nimajo dodatne zunanje celične membrane, celična stena, ki obdaja njihovo plazmalemo, pa je bolj debela. V širino meri od 20 nm do 80 nm, gradi pa jo lahko do 40 plasti peptidoglikana.

Peptidoglikan je zgrajen iz vzporednih sladkornih verig, povezanih preko oligopeptidov. V sladkornem ogrodju so izmenjujoče nanizani ostanki N-acetilglukozamina (NAG) in N-acetilmuraminske kisline (NAM), ki so povezani z β(1 → 4) glikozidno vezjo. Na D-laktilno skupino vsakega ostanka NAM je vezan tetrapeptid. Aminokisline v tem peptidu si sledijo po zaporedju: L-alanin, D-glutamin, 2,6-diaminopimelinska kislina (DAP) in D-alanin pri po Gramu negativnih bakterijah, pri po Gramu pozitivnih bakterijah pa je na tretjem mestu namesto DAP L-lizin. Pri po Gramu pozitivnih bakterijah ta povezava ni direktna, ampak poteka preko peptidnih mostičkov, ki so ponavadi sestavljeni iz petih zaporednih glicinskih ostankov.

Pri sintezi celične stene se sestavni elementi peptidoglikana izgradijo v citosolu, nato pa se prenesejo v periplazmo, kjer se povežejo med seboj. Na začetku se na molekulo NAM postopoma pripne 5 aminokislinskih ostankov. Prvi štirje si sledijo po prej navedenem zaporedju, kot peti pa je pripet še en dodaten D-alanin. Nastala molekula se nato preko NAM pripne na lipid C55-izoprenil pirofosfat, imenovan tudi baktrofenil, ki se nahaja v proti citosolu usmerjeni polovici celične membrane. Z NAM se v naslednjem koraku poveže NAG, na peptidni del pa se lahko doda še povezovalni glicinski mostiček. Celotna molekula se sedaj iz notranje polovice lipidnega dvosloja ob pomoči flipaze FtsW prestavi v zunanjo polovico, tako da sladkorno-peptidni del gleda v periplazemski prostor.
V periplazmi poteka povezovanje peptidoglikanskih enot s pomočjo transglikozilaz in transpeptidaz, ki jih z nadpomenko imenujemo penicilin-vezavni proteini (PBP). Transglikozilaza prepozna na lipidno komponento vezan peptidoglikanski prekurzor in poveže četrti C-atom ostanka NAG na prekurzorju s prvim C-atomom NAM, ki se nahaja na koncu izgrajujoče peptidoglikanske verige. Pri tem nastane β(1 → 4) vez, baktrofenil pa se odcepi in prenese nazaj v notranjo polovico fosfolipidnega dvosloja, kjer je pripravljen na sprejem novega prekurzorja. Sedaj se morajo oligopeptidi še prečno povezati, kar katalizira transpeptidaza. Encim odcepi končni D-alanin s pentapeptida na prekurzorju in D-alanin na preostalem tetrapeptidu poveže s tretjim aminokislinskim ostankom v sosednjem tetrapeptidu, bodisi direktno, bodisi preko vmesnega glicinskega mostička.

Bakterije lahko lastno celično steno tudi razgrajujejo. Pri tem sodelujejo avtolizini, ki so potrebni za obnavljanje in spreminjanje oblike celične stene, ter regulacijo njene rasti. Procesa izgrajevanja in razgrajevanja sta uravnotežena, ob določenih pogojih pa avtolizini sprožijo intenzivnejšo razgradnjo stene, ki vodi v celično lizo. Ta je lahko tudi posledica delovanja antibiotikov.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

== Delovanje glikopeptidnih antibiotikov ==
Glikopeptidi so glikozilirani neribosomski peptidi, ki delujejo kot sterični inhibitorji zorenja peptidoglikanov grampozitivnih bakterij. Inhibirajo lahko delovanje dveh encimov, in sicer transglikozilaze in transpeptidaze. Ta inhibicija ne poteka preko vezave na encim, pač pa se glikopeptidi namesto tega vežejo na substrat omenjenih encimov, peptidoglikan, natančneje na njihov oligopeptidni del. Vezani glikopeptidi predstavljajo sterično oviro in encimoma preprečujejo dostop do peptidoglikana. Na ta način preprečujejo ustrezno povezovanje peptidoglikana. Posledično je inhibirana rast, smrt pa po navadi povzroči povečan tlak, ki nastane zaradi nezadostno povezanega peptidoglikana. Pride do osmotske lize. [[slika: http://4.bp.blogspot.com/-aMRnL9j_6ZY/UfVm0sjiUYI/AAAAAAAAA50/nvP133cuItU/s1600/transpeptidase-07.png ]]

Inhibicija preko vezave na substrat je mogoča zaradi posebne strukture glikopeptidov. Sestavljeni so iz osrednjega heptapeptida, ki ga tvorijo pretežno aromatske aminokisline. Na heptapeptidno ogrodje so vezane različne skupine, najpogosteje sladkorni ostanki, kloridni atomi in lipidne verige. Število aromatskih aminokislin v heptapetidu se med posameznimi glikopeptidi lahko razlikuje. V precej poznanem peptidnem antibiotiku, vankomicinu, je aromatskih aminokslin 5, medtem ko jih je v teikoplaninu 7. Aromatske aminokisline v osrednjem peptidu so oksidativno prečno povezane. Prečne povezave tvorijo posebno strukturno konformacijo, »čeljust«, v katero se vežejo peptidni deli peptidoglikana. [[slika: https://www.researchgate.net/figure/50893040_fig6_Figure-1-Chemical-structures-of-Type-I-1-vancomycin-2-balhimycin-and-Type-IV-3 ]]

Glikopeptidi se s čeljustmi vežejo na C-konce peptidoglikana, ki so ključni za tvorbo kompleksa transglikozilaza-peptidoglikan ali transpeptidaza-peptidoglikan. V splošnem glikopeptidi prepoznajo skupine aminokislin s stereokemijsko konformacijo -L-D-D, najmanjša enota, na katero se lahko vežejo, pa je -D-ala-D-ala. Za C-konce nastajajoče konce peptidoglikana, je značilno zaporedje L-lys-D-ala-D-ala, preko katerega transglikozilaza poveže dve peptidoglikanski enoti, transpeptidaza pa preko njega nove peptide vgrajuje v celično steno. Glikopeptidi z zaporedjem –D-ala-D-ala v peptidnem delu peptidoglikana tvorijo vodikove vezi in se na ta način, kljub svoji siceršnji rigidnosti, ovijejo okoli peptidoglikana, kar preprečuje vezavo encimov. Vodikove vezi po navadi nastanejo med C-končno karboksilno skupino motiva -D-ala-D-ala in amidnimi skupinami aminokislin iz heptapeptidnega ogrodja glikopeptidov. Mogoč je tudi nastanek vodikove vezi med aminsko skupino končnega alanina v motivu –D-ala-D-ala in kisikom karbonilne skupine osrednjega peptida. [[slika: http://offset.peczuh.uconn.edu/wp-content/uploads/sites/240/2015/08/b100912p-f2.gif. ]]

Večina glikopeptidnih antibiotikov lahko preko tvorbe vodikovih vezi tudi homodimerizira. Takšna homodimerizacija je skoraj vedno, izjema je le rizocitin, kooperativna z vezavo na zaporedje -D-ala-D-ala. Kooperativnost naj bi bila posledica tega, da vezava peptidoglikana v strukturo glikopeptida uvede simetrijo, ki omogoči tvorbo več intramolekularnih vezi. Slednje spremenijo konformacijo glikopeptida tako, da tesneje ovije peptid in tvori nove vezi. Dimerizacija predstavlja tudi večjo sterično oviro za transpeptidazo in transglikozilazo. Glikopeptidni antibiotiki, ki imajo večjo tandenco za dimerizacijo, so načeloma učinkovitejši.
Teikoplanin je najbolj znan antibiotik iz družine glikopeptidov, ki ne tvori homodimerov. Kljub temu je njegovo delovanje zelo učinkovito, saj vsebuje dodatno vezano N-subsituirano maščobnokislinsko stransko verigo. Ta je vezana preko glukozaminskega ostanka, ki je vezan na 4. aminokislino osrednjega heptapeptida. Iz tega je jasno razvidno, da na učinkovitost antibiotika vplivajo tudi njegove stranske skupine. Hidrofobne stranske verige v splošnem omogočajo boljšo lokalizacijo in sidranje antibiotika na tarčno mesto, še pomembneje pa je, da omogočajo precej močne intramolekularne interakcije, katerih vpliv je pojasnjen nekoliko višje v besedilu. [[slika: http://www.hull.ac.uk/php/chsanb/LMWeb/Image84.gif ]]
Rezistentne bakterije se učinku gikopeptidov lahko izognejo tako, da namesto zadnjega D-alanina v oligopeptide vgrajujejo D-laktat. Na takšne oligopeptide se glikopeptidi ne vežejo.

== Viri ==
*Kang H-K, Park Y. Glycopeptide Antibiotics: Structure and Mechanisms of Action. J Bacteriol Virol. 2015;45(2):67-78. http://synapse.koreamed.org/DOIx.php?id=10.4167%2Fjbv.2015.45.2.67.

*Höltje, J. V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181–203 (1998).

Mehanizem delovanja betalaktamov in glikopeptidov

2017-05-14T19:22:04Z

Ajda.Lenardič:

== Sinteza bakterijske celične stene ==

Celična stena daje bakterijski celici trdnost in ščiti celično membrano pred poškodbami zaradi celičnega turgorja. V glavnem jo sestavlja polimer peptidoglikan, ki mu pravimo tudi murein. Po Gramu negativne bakterije imajo dve celični membrani, med katerima se v periplazemskem prostoru nahaja celična stena. Ta je široka od 7 nm do 8 nm in je sestavljena le iz nekaj plasti peptidoglikana. Po Gramu pozitivne bakterije nimajo dodatne zunanje celične membrane, celična stena, ki obdaja njihovo plazmalemo, pa je bolj debela. V širino meri od 20 nm do 80 nm, gradi pa jo lahko do 40 plasti peptidoglikana.

Peptidoglikan je zgrajen iz vzporednih sladkornih verig, povezanih preko oligopeptidov. V sladkornem ogrodju so izmenjujoče nanizani ostanki N-acetilglukozamina (NAG) in N-acetilmuraminske kisline (NAM), ki so povezani z β(1 → 4) glikozidno vezjo. Na D-laktilno skupino vsakega ostanka NAM je vezan tetrapeptid. Aminokisline v tem peptidu si sledijo po zaporedju: L-alanin, D-glutamin, 2,6-diaminopimelinska kislina (DAP) in D-alanin pri po Gramu negativnih bakterijah, pri po Gramu pozitivnih bakterijah pa je na tretjem mestu namesto DAP L-lizin. Pri po Gramu pozitivnih bakterijah ta povezava ni direktna, ampak poteka preko peptidnih mostičkov, ki so ponavadi sestavljeni iz petih zaporednih glicinskih ostankov.

Pri sintezi celične stene se sestavni elementi peptidoglikana izgradijo v citosolu, nato pa se prenesejo v periplazmo, kjer se povežejo med seboj. Na začetku se na molekulo NAM postopoma pripne 5 aminokislinskih ostankov. Prvi štirje si sledijo po prej navedenem zaporedju, kot peti pa je pripet še en dodaten D-alanin. Nastala molekula se nato preko NAM pripne na lipid C55-izoprenil pirofosfat, imenovan tudi baktrofenil, ki se nahaja v proti citosolu usmerjeni polovici celične membrane. Z NAM se v naslednjem koraku poveže NAG, na peptidni del pa se lahko doda še povezovalni glicinski mostiček. Celotna molekula se sedaj iz notranje polovice lipidnega dvosloja ob pomoči flipaze FtsW prestavi v zunanjo polovico, tako da sladkorno-peptidni del gleda v periplazemski prostor.
V periplazmi poteka povezovanje peptidoglikanskih enot s pomočjo transglikozilaz in transpeptidaz, ki jih z nadpomenko imenujemo penicilin-vezavni proteini (PBP). Transglikozilaza prepozna na lipidno komponento vezan peptidoglikanski prekurzor in poveže četrti C-atom ostanka NAG na prekurzorju s prvim C-atomom NAM, ki se nahaja na koncu izgrajujoče peptidoglikanske verige. Pri tem nastane β(1 → 4) vez, baktrofenil pa se odcepi in prenese nazaj v notranjo polovico fosfolipidnega dvosloja, kjer je pripravljen na sprejem novega prekurzorja. Sedaj se morajo oligopeptidi še prečno povezati, kar katalizira transpeptidaza. Encim odcepi končni D-alanin s pentapeptida na prekurzorju in D-alanin na preostalem tetrapeptidu poveže s tretjim aminokislinskim ostankom v sosednjem tetrapeptidu, bodisi direktno, bodisi preko vmesnega glicinskega mostička.

Bakterije lahko lastno celično steno tudi razgrajujejo. Pri tem sodelujejo avtolizini, ki so potrebni za obnavljanje in spreminjanje oblike celične stene, ter regulacijo njene rasti. Procesa izgrajevanja in razgrajevanja sta uravnotežena, ob določenih pogojih pa avtolizini sprožijo intenzivnejšo razgradnjo stene, ki vodi v celično lizo. Ta je lahko tudi posledica delovanja antibiotikov.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

== Delovanje glikopeptidnih antibiotikov ==
Glikopeptidi so glikozilirani neribosomski peptidi, ki delujejo kot sterični inhibitorji zorenja peptidoglikanov grampozitivnih bakterij. Inhibirajo lahko delovanje dveh encimov, in sicer transglikozilaze in transpeptidaze. Ta inhibicija ne poteka preko vezave na encim, pač pa se glikopeptidi namesto tega vežejo na substrat omenjenih encimov, peptidoglikan, natančneje na njihov oligopeptidni del. Vezani glikopeptidi predstavljajo sterično oviro in encimoma preprečujejo dostop do peptidoglikana. Na ta način preprečujejo ustrezno povezovanje peptidoglikana. Posledično je inhibirana rast, smrt pa po navadi povzroči povečan tlak, ki nastane zaradi nezadostno povezanega peptidoglikana. Pride do osmotske lize. [[slika: http://4.bp.blogspot.com/-aMRnL9j_6ZY/UfVm0sjiUYI/AAAAAAAAA50/nvP133cuItU/s1600/transpeptidase-07.png ]]

Inhibicija preko vezave na substrat je mogoča zaradi posebne strukture glikopeptidov. Sestavljeni so iz osrednjega heptapeptida, ki ga tvorijo pretežno aromatske aminokisline. Na heptapeptidno ogrodje so vezane različne skupine, najpogosteje sladkorni ostanki, kloridni atomi in lipidne verige. Število aromatskih aminokislin v heptapetidu se med posameznimi glikopeptidi lahko razlikuje. V precej poznanem peptidnem antibiotiku, vankomicinu, je aromatskih aminokslin 5, medtem ko jih je v teikoplaninu 7. Aromatske aminokisline v osrednjem peptidu so oksidativno prečno povezane. Prečne povezave tvorijo posebno strukturno konformacijo, »čeljust«, v katero se vežejo peptidni deli peptidoglikana. [[slika: https://www.researchgate.net/figure/50893040_fig6_Figure-1-Chemical-structures-of-Type-I-1-vancomycin-2-balhimycin-and-Type-IV-3 ]]

Glikopeptidi se s čeljustmi vežejo na C-konce peptidoglikana, ki so ključni za tvorbo kompleksa transglikozilaza-peptidoglikan ali transpeptidaza-peptidoglikan. V splošnem glikopeptidi prepoznajo skupine aminokislin s stereokemijsko konformacijo -L-D-D, najmanjša enota, na katero se lahko vežejo, pa je -D-ala-D-ala. Za C-konce nastajajoče konce peptidoglikana, je značilno zaporedje L-lys-D-ala-D-ala, preko katerega transglikozilaza poveže dve peptidoglikanski enoti, transpeptidaza pa preko njega nove peptide vgrajuje v celično steno. Glikopeptidi z zaporedjem –D-ala-D-ala v peptidnem delu peptidoglikana tvorijo vodikove vezi in se na ta način, kljub svoji siceršnji rigidnosti, ovijejo okoli peptidoglikana, kar preprečuje vezavo encimov. Vodikove vezi po navadi nastanejo med C-končno karboksilno skupino motiva -D-ala-D-ala in amidnimi skupinami aminokislin iz heptapeptidnega ogrodja glikopeptidov. Mogoč je tudi nastanek vodikove vezi med aminsko skupino končnega alanina v motivu –D-ala-D-ala in kisikom karbonilne skupine osrednjega peptida. [[slika: http://offset.peczuh.uconn.edu/wp-content/uploads/sites/240/2015/08/b100912p-f2.gif. ]]

Večina glikopeptidnih antibiotikov lahko preko tvorbe vodikovih vezi tudi homodimerizira. Takšna homodimerizacija je skoraj vedno, izjema je le rizocitin, kooperativna z vezavo na zaporedje -D-ala-D-ala. Kooperativnost naj bi bila posledica tega, da vezava peptidoglikana v strukturo glikopeptida uvede simetrijo, ki omogoči tvorbo več intramolekularnih vezi. Slednje spremenijo konformacijo glikopeptida tako, da tesneje ovije peptid in tvori nove vezi. Dimerizacija predstavlja tudi večjo sterično oviro za transpeptidazo in transglikozilazo. Glikopeptidni antibiotiki, ki imajo večjo tandenco za dimerizacijo, so načeloma učinkovitejši.
Teikoplanin je najbolj znan antibiotik iz družine glikopeptidov, ki ne tvori homodimerov. Kljub temu je njegovo delovanje zelo učinkovito, saj vsebuje dodatno vezano N-subsituirano maščobnokislinsko stransko verigo. Ta je vezana preko glukozaminskega ostanka, ki je vezan na 4. aminokislino osrednjega heptapeptida. Iz tega je jasno razvidno, da na učinkovitost antibiotika vplivajo tudi njegove stranske skupine. Hidrofobne stranske verige v splošnem omogočajo boljšo lokalizacijo in sidranje antibiotika na tarčno mesto, še pomembneje pa je, da omogočajo precej močne intramolekularne interakcije, katerih vpliv je pojasnjen nekoliko višje v besedilu. [[slika: http://www.hull.ac.uk/php/chsanb/LMWeb/Image84.gif ]]
Rezistentne bakterije se učinku gikopeptidov lahko izognejo tako, da namesto zadnjega D-alanina v oligopeptide vgrajujejo D-laktat. Na takšne oligopeptide se glikopeptidi ne vežejo.

== Viri ==
Kang H-K, Park Y. Glycopeptide Antibiotics: Structure and Mechanisms of Action. J Bacteriol Virol. 2015;45(2):67-78. http://synapse.koreamed.org/DOIx.php?id=10.4167%2Fjbv.2015.45.2.67.

Mehanizem delovanja betalaktamov in glikopeptidov

2017-05-14T18:07:58Z

Ajda.Lenardič:

== Sinteza bakterijske celične stene ==

Celična stena daje bakterijski celici trdnost in ščiti celično membrano pred poškodbami zaradi celičnega turgorja. V glavnem jo sestavlja polimer peptidoglikan, ki mu pravimo tudi murein. Po Gramu negativne bakterije imajo dve celični membrani, med katerima se v periplazemskem prostoru nahaja celična stena. Ta je široka od 7 nm do 8 nm in je sestavljena le iz nekaj plasti peptidoglikana. Po Gramu pozitivne bakterije nimajo dodatne zunanje celične membrane, celična stena, ki obdaja njihovo plazmalemo, pa je bolj debela. V širino meri od 20 nm do 80 nm, gradi pa jo lahko do 40 plasti peptidoglikana.

Peptidoglikan je zgrajen iz vzporednih sladkornih verig, povezanih preko oligopeptidov. V sladkornem ogrodju so izmenjujoče nanizani ostanki N-acetilglukozamina (NAG) in N-acetilmuraminske kisline (NAM), ki so povezani z β(1 → 4) glikozidno vezjo. Na D-laktilno skupino vsakega ostanka NAM je vezan tetrapeptid. Aminokisline v tem peptidu si sledijo po zaporedju: L-alanin, D-glutamin, 2,6-diaminopimelinska kislina (DAP) in D-alanin pri po Gramu negativnih bakterijah, pri po Gramu pozitivnih bakterijah pa je na tretjem mestu namesto DAP L-lizin. Pri po Gramu pozitivnih bakterijah ta povezava ni direktna, ampak poteka preko peptidnih mostičkov, ki so ponavadi sestavljeni iz petih zaporednih glicinskih ostankov.

Pri sintezi celične stene se sestavni elementi peptidoglikana izgradijo v citosolu, nato pa se prenesejo v periplazmo, kjer se povežejo med seboj. Na začetku se na molekulo NAM postopoma pripne 5 aminokislinskih ostankov. Prvi štirje si sledijo po prej navedenem zaporedju, kot peti pa je pripet še en dodaten D-alanin. Nastala molekula se nato preko NAM pripne na lipid C55-izoprenil pirofosfat, imenovan tudi baktrofenil, ki se nahaja v proti citosolu usmerjeni polovici celične membrane. Z NAM se v naslednjem koraku poveže NAG, na peptidni del pa se lahko doda še povezovalni glicinski mostiček. Celotna molekula se sedaj iz notranje polovice lipidnega dvosloja ob pomoči flipaze FtsW prestavi v zunanjo polovico, tako da sladkorno-peptidni del gleda v periplazemski prostor.
V periplazmi poteka povezovanje peptidoglikanskih enot s pomočjo transglikozilaz in transpeptidaz, ki jih z nadpomenko imenujemo penicilin-vezavni proteini (PBP). Transglikozilaza prepozna na lipidno komponento vezan peptidoglikanski prekurzor in poveže četrti C-atom ostanka NAG na prekurzorju s prvim C-atomom NAM, ki se nahaja na koncu izgrajujoče peptidoglikanske verige. Pri tem nastane β(1 → 4) vez, baktrofenil pa se odcepi in prenese nazaj v notranjo polovico fosfolipidnega dvosloja, kjer je pripravljen na sprejem novega prekurzorja. Sedaj se morajo oligopeptidi še prečno povezati, kar katalizira transpeptidaza. Encim odcepi končni D-alanin s pentapeptida na prekurzorju in D-alanin na preostalem tetrapeptidu poveže s tretjim aminokislinskim ostankom v sosednjem tetrapeptidu, bodisi direktno, bodisi preko vmesnega glicinskega mostička.

Bakterije lahko lastno celično steno tudi razgrajujejo. Pri tem sodelujejo avtolizini, ki so potrebni za obnavljanje in spreminjanje oblike celične stene, ter regulacijo njene rasti. Procesa izgrajevanja in razgrajevanja sta uravnotežena, ob določenih pogojih pa avtolizini sprožijo intenzivnejšo razgradnjo stene, ki vodi v celično lizo. Ta je lahko tudi posledica delovanja antibiotikov.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

== Delovanje glikopeptidnih antibiotikov ==
Glikopeptidi so glikozilirani neribosomski peptidi, ki delujejo kot sterični inhibitorji zorenja peptidoglikanov grampozitivnih bakterij. Inhibirajo lahko delovanje dveh encimov, in sicer transglikozilaze in transpeptidaze. Ta inhibicija ne poteka preko vezave na encim, pač pa se glikopeptidi namesto tega vežejo na substrat omenjenih encimov, peptidoglikan, natančneje na njihov oligopeptidni del. Vezani glikopeptidi predstavljajo sterično oviro in encimoma preprečujejo dostop do peptidoglikana. Na ta način preprečujejo ustrezno povezovanje peptidoglikana. Posledično je inhibirana rast, smrt pa po navadi povzroči povečan tlak, ki nastane zaradi nezadostno povezanega peptidoglikana. Pride do osmotske lize. [[slika: http://4.bp.blogspot.com/-aMRnL9j_6ZY/UfVm0sjiUYI/AAAAAAAAA50/nvP133cuItU/s1600/transpeptidase-07.png ]]

Inhibicija preko vezave na substrat je mogoča zaradi posebne strukture glikopeptidov. Sestavljeni so iz osrednjega heptapeptida, ki ga tvorijo pretežno aromatske aminokisline. Na heptapeptidno ogrodje so vezane različne skupine, najpogosteje sladkorni ostanki, kloridni atomi in lipidne verige. Število aromatskih aminokislin v heptapetidu se med posameznimi glikopeptidi lahko razlikuje. V precej poznanem peptidnem antibiotiku, vankomicinu, je aromatskih aminokslin 5, medtem ko jih je v teikoplaninu 7. Aromatske aminokisline v osrednjem peptidu so oksidativno prečno povezane. Prečne povezave tvorijo posebno strukturno konformacijo, »čeljust«, v katero se vežejo peptidni deli peptidoglikana. [[slika: https://www.researchgate.net/figure/50893040_fig6_Figure-1-Chemical-structures-of-Type-I-1-vancomycin-2-balhimycin-and-Type-IV-3 ]]

Glikopeptidi se s čeljustmi vežejo na C-konce peptidoglikana, ki so ključni za tvorbo kompleksa transglikozilaza-peptidoglikan ali transpeptidaza-peptidoglikan. V splošnem glikopeptidi prepoznajo skupine aminokislin s stereokemijsko konformacijo -L-D-D, najmanjša enota, na katero se lahko vežejo, pa je -D-ala-D-ala. Za C-konce nastajajoče konce peptidoglikana, je značilno zaporedje L-lys-D-ala-D-ala, preko katerega transglikozilaza poveže dve peptidoglikanski enoti, transpeptidaza pa preko njega nove peptide vgrajuje v celično steno. Glikopeptidi z zaporedjem –D-ala-D-ala v peptidnem delu peptidoglikana tvorijo vodikove vezi in se na ta način, kljub svoji siceršnji rigidnosti, ovijejo okoli peptidoglikana, kar preprečuje vezavo encimov. Vodikove vezi po navadi nastanejo med C-končno karboksilno skupino motiva -D-ala-D-ala in amidnimi skupinami aminokislin iz heptapeptidnega ogrodja glikopeptidov. Mogoč je tudi nastanek vodikove vezi med aminsko skupino končnega alanina v motivu –D-ala-D-ala in kisikom karbonilne skupine osrednjega peptida. [[slika: http://offset.peczuh.uconn.edu/wp-content/uploads/sites/240/2015/08/b100912p-f2.gif. ]]

Večina glikopeptidnih antibiotikov lahko preko tvorbe vodikovih vezi tudi homodimerizira. Takšna homodimerizacija je skoraj vedno, izjema je le rizocitin, kooperativna z vezavo na zaporedje -D-ala-D-ala. Kooperativnost naj bi bila posledica tega, da vezava peptidoglikana v strukturo glikopeptida uvede simetrijo, ki omogoči tvorbo več intramolekularnih vodikovih vezi. Slednje spremenijo konformacijo glikopeptida tako, da tesneje ovije peptid in tvori nove vezi. Dimerizacija predstavlja tudi večjo sterično oviro za transpeptidazo in transglikozilazo. Glikopeptidni antibiotiki, ki imajo večjo tandenco za dimerizacijo, so načeloma učinkovitejši.
Teikoplanin je najbolj znan antibiotik iz družine glikopeptidov, ki ne tvori homodimerov. Kljub temu je njegovo delovanje zelo učinkovito, saj vsebuje dodatno vezano N-subsituirano maščobnokislinsko stransko verigo. Ta je vezana preko glukozaminskega ostanka, ki je vezan na 4. aminokislino osrednjega heptapeptida. Iz tega je jasno razvidno, da na učinkovitost antibiotika vplivajo tudi njegove stranske skupine. Hidrofobne stranske verige v splošnem omogočajo boljšo lokalizacijo in sidranje antibiotika na tarčno mesto, še pomembneje pa je, da omogočajo precej močne intramolekularne interakcije, katerih vpliv je pojasnjen nekoliko višje v besedilu. [[slika: http://www.hull.ac.uk/php/chsanb/LMWeb/Image84.gif ]]
Rezistentne bakterije se učinku gikopeptidov lahko izognejo tako, da namesto zadnjega D-alanina v oligopeptide vgrajujejo D-laktat. Na takšne oligopeptide se glikopeptidi ne vežejo.

== Viri ==
Kang H-K, Park Y. Glycopeptide Antibiotics: Structure and Mechanisms of Action. J Bacteriol Virol. 2015;45(2):67-78. http://synapse.koreamed.org/DOIx.php?id=10.4167%2Fjbv.2015.45.2.67.

Mehanizem delovanja betalaktamov in glikopeptidov

2017-05-14T17:57:39Z

Ajda.Lenardič:

== Sinteza bakterijske celične stene ==

Celična stena daje bakterijski celici trdnost in ščiti celično membrano pred poškodbami zaradi celičnega turgorja. V glavnem jo sestavlja polimer peptidoglikan, ki mu pravimo tudi murein. Po Gramu negativne bakterije imajo dve celični membrani, med katerima se v periplazemskem prostoru nahaja celična stena. Ta je široka od 7 nm do 8 nm in je sestavljena le iz nekaj plasti peptidoglikana. Po Gramu pozitivne bakterije nimajo dodatne zunanje celične membrane, celična stena, ki obdaja njihovo plazmalemo, pa je bolj debela. V širino meri od 20 nm do 80 nm, gradi pa jo lahko do 40 plasti peptidoglikana.

Peptidoglikan je zgrajen iz vzporednih sladkornih verig, povezanih preko oligopeptidov. V sladkornem ogrodju so izmenjujoče nanizani ostanki N-acetilglukozamina (NAG) in N-acetilmuraminske kisline (NAM), ki so povezani z β(1 → 4) glikozidno vezjo. Na D-laktilno skupino vsakega ostanka NAM je vezan tetrapeptid. Aminokisline v tem peptidu si sledijo po zaporedju: L-alanin, D-glutamin, 2,6-diaminopimelinska kislina (DAP) in D-alanin pri po Gramu negativnih bakterijah, pri po Gramu pozitivnih bakterijah pa je na tretjem mestu namesto DAP L-lizin. Pri po Gramu pozitivnih bakterijah ta povezava ni direktna, ampak poteka preko peptidnih mostičkov, ki so ponavadi sestavljeni iz petih zaporednih glicinskih ostankov.

Pri sintezi celične stene se sestavni elementi peptidoglikana izgradijo v citosolu, nato pa se prenesejo v periplazmo, kjer se povežejo med seboj. Na začetku se na molekulo NAM postopoma pripne 5 aminokislinskih ostankov. Prvi štirje si sledijo po prej navedenem zaporedju, kot peti pa je pripet še en dodaten D-alanin. Nastala molekula se nato preko NAM pripne na lipid C55-izoprenil pirofosfat, imenovan tudi baktrofenil, ki se nahaja v proti citosolu usmerjeni polovici celične membrane. Z NAM se v naslednjem koraku poveže NAG, na peptidni del pa se lahko doda še povezovalni glicinski mostiček. Celotna molekula se sedaj iz notranje polovice lipidnega dvosloja ob pomoči flipaze FtsW prestavi v zunanjo polovico, tako da sladkorno-peptidni del gleda v periplazemski prostor.
V periplazmi poteka povezovanje peptidoglikanskih enot s pomočjo transglikozilaz in transpeptidaz, ki jih z nadpomenko imenujemo penicilin-vezavni proteini (PBP). Transglikozilaza prepozna na lipidno komponento vezan peptidoglikanski prekurzor in poveže četrti C-atom ostanka NAG na prekurzorju s prvim C-atomom NAM, ki se nahaja na koncu izgrajujoče peptidoglikanske verige. Pri tem nastane β(1 → 4) vez, baktrofenil pa se odcepi in prenese nazaj v notranjo polovico fosfolipidnega dvosloja, kjer je pripravljen na sprejem novega prekurzorja. Sedaj se morajo oligopeptidi še prečno povezati, kar katalizira transpeptidaza. Encim odcepi končni D-alanin s pentapeptida na prekurzorju in D-alanin na preostalem tetrapeptidu poveže s tretjim aminokislinskim ostankom v sosednjem tetrapeptidu, bodisi direktno, bodisi preko vmesnega glicinskega mostička.

Bakterije lahko lastno celično steno tudi razgrajujejo. Pri tem sodelujejo avtolizini, ki so potrebni za obnavljanje in spreminjanje oblike celične stene, ter regulacijo njene rasti. Procesa izgrajevanja in razgrajevanja sta uravnotežena, ob določenih pogojih pa avtolizini sprožijo intenzivnejšo razgradnjo stene, ki vodi v celično lizo. Ta je lahko tudi posledica delovanja antibiotikov.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

== Delovanje glikopeptidnih antibiotikov ==
Glikopeptidi so glikozilirani neribosomski peptidi, ki delujejo kot sterični inhibitorji zorenja peptidoglikanov grampozitivnih bakterij. Inhibirajo lahko delovanje dveh encimov, in sicer transglikozilaze in transpeptidaze. Ta inhibicija ne poteka preko vezave na encim, pač pa se glikopeptidi namesto tega vežejo na substrat omenjenih encimov, peptidoglikan, natančneje na njihov oligopeptidni del. Vezani glikopeptidi predstavljajo sterično oviro in encimoma preprečujejo dostop do peptidoglikana. Na ta način preprečujejo ustrezno povezovanje peptidoglikana. Posledično je inhibirana rast, smrt pa po navadi povzroči povečan tlak, ki nastane zaradi nezadostno povezanega peptidoglikana. Pride do osmotske lize. [[slika: http://4.bp.blogspot.com/-aMRnL9j_6ZY/UfVm0sjiUYI/AAAAAAAAA50/nvP133cuItU/s1600/transpeptidase-07.png ]]

Inhibicija preko vezave na substrat je mogoča zaradi posebne strukture glikopeptidov. Sestavljeni so iz osrednjega heptapeptida, ki ga tvorijo pretežno aromatske aminokisline. Na heptapeptidno ogrodje so vezane različne skupine, najpogosteje sladkorni ostanki, kloridni atomi in lipidne verige. Število aromatskih aminokislin v heptapetidu se med posameznimi glikopeptidi lahko razlikuje. V precej poznanem peptidnem antibiotiku, vankomicinu, je aromatskih aminokslin 5, medtem ko jih je v teikoplaninu 7. Aromatske aminokisline v osrednjem peptidu so oksidativno prečno povezane. Prečne povezave tvorijo posebno strukturno konformacijo, »čeljust«, v katero se vežejo peptidni deli peptidoglikana. [[slika: https://www.researchgate.net/figure/50893040_fig6_Figure-1-Chemical-structures-of-Type-I-1-vancomycin-2-balhimycin-and-Type-IV-3 ]]

Glikopeptidi se s čeljustmi vežejo na C-konce peptidoglikana, ki so ključni za tvorbo kompleksa transglikozilaza-peptidoglikan ali transpeptidaza-peptidoglikan. V splošnem glikopeptidi prepoznajo skupine aminokislin s stereokemijsko konformacijo -L-D-D, najmanjša enota, na katero se lahko vežejo, pa je -D-ala-D-ala. Za C-konce nastajajoče konce peptidoglikana, je značilno zaporedje L-lys-D-ala-D-ala, preko katerega transglikozilaza poveže dve peptidoglikanski enoti, transpeptidaza pa preko njega nove peptide vgrajuje v celično steno. Glikopeptidi z zaporedjem –D-ala-D-ala v peptidnem delu peptidoglikana tvorijo vodikove vezi in se na ta način, kljub svoji siceršnji rigidnosti, ovijejo okoli peptidoglikana, kar preprečuje vezavo encimov. Vodikove vezi po navadi nastanejo med C-končno karboksilno skupino motiva -D-ala-D-ala in amidnimi skupinami aminokislin iz heptapeptidnega ogrodja glikopeptidov. Mogoč je tudi nastanek vodikove vezi med aminsko skupino končnega alanina v motivu –D-ala-D-ala in kisikom karbonilne skupine osrednjega peptida. [[slika: http://offset.peczuh.uconn.edu/wp-content/uploads/sites/240/2015/08/b100912p-f2.gif. ]]

Večina glikopeptidnih antibiotikov lahko preko tvorbe vodikovih vezi tudi homodimerizira. Takšna homodimerizacija je skoraj vedno, izjema je le rizocitin, kooperativna z vezavo na zaporedje -D-ala-D-ala. Kooperativnost naj bi bila posledica tega, da vezava peptidoglikana v strukturo glikopeptida uvede simetrijo, ki omogoči tvorbo več intramolekularnih vodikovih vezi. Slednje spremenijo konformacijo glikopeptida tako, da tesneje ovije peptid in tvori nove vezi. Dimerizacija predstavlja tudi večjo sterično oviro za transpeptidazo in transglikozilazo. Glikopeptidni antibiotiki, ki imajo večjo tandenco za dimerizacijo, so načeloma učinkovitejši.
Teikoplanin je najbolj znan antibiotik iz družine glikopeptidov, ki ne tvori homodimerov. Kljub temu je njegovo delovanje zelo učinkovito, saj vsebuje dodatno vezano N-subsituirano maščobnokislinsko stransko verigo. Ta je vezana preko glukozaminskega ostanka, ki je vezan na 4. aminokislino osrednjega heptapeptida. Iz tega je jasno razvidno, da na učinkovitost antibiotika vplivajo tudi njegove stranske skupine. Hidrofobne stranske verige v splošnem omogočajo boljšo lokalizacijo in sidranje antibiotika na tarčno mesto, še pomembneje pa je, da omogočajo precej močne intramolekularne interakcije, katerih vpliv je pojasnjen nekoliko višje v besedilu. [[slika: http://www.hull.ac.uk/php/chsanb/LMWeb/Image84.gif ]]
Rezistentne bakterije se učinku gikopeptidov lahko izognejo tako, da namesto zadnjega D-alanina v oligopeptide vgrajujejo D-laktat. Na takšne oligopeptide se glikopeptidi ne vežejo.

Mehanizem delovanja betalaktamov in glikopeptidov

2017-05-14T17:57:00Z

Ajda.Lenardič:

== Sinteza bakterijske celične stene ==

Celična stena daje bakterijski celici trdnost in ščiti celično membrano pred poškodbami zaradi celičnega turgorja. V glavnem jo sestavlja polimer peptidoglikan, ki mu pravimo tudi murein. Po Gramu negativne bakterije imajo dve celični membrani, med katerima se v periplazemskem prostoru nahaja celična stena. Ta je široka od 7 nm do 8 nm in je sestavljena le iz nekaj plasti peptidoglikana. Po Gramu pozitivne bakterije nimajo dodatne zunanje celične membrane, celična stena, ki obdaja njihovo plazmalemo, pa je bolj debela. V širino meri od 20 nm do 80 nm, gradi pa jo lahko do 40 plasti peptidoglikana.

Peptidoglikan je zgrajen iz vzporednih sladkornih verig, povezanih preko oligopeptidov. V sladkornem ogrodju so izmenjujoče nanizani ostanki N-acetilglukozamina (NAG) in N-acetilmuraminske kisline (NAM), ki so povezani z β(1 → 4) glikozidno vezjo. Na D-laktilno skupino vsakega ostanka NAM je vezan tetrapeptid. Aminokisline v tem peptidu si sledijo po zaporedju: L-alanin, D-glutamin, 2,6-diaminopimelinska kislina (DAP) in D-alanin pri po Gramu negativnih bakterijah, pri po Gramu pozitivnih bakterijah pa je na tretjem mestu namesto DAP L-lizin. Pri po Gramu pozitivnih bakterijah ta povezava ni direktna, ampak poteka preko peptidnih mostičkov, ki so ponavadi sestavljeni iz petih zaporednih glicinskih ostankov.

Pri sintezi celične stene se sestavni elementi peptidoglikana izgradijo v citosolu, nato pa se prenesejo v periplazmo, kjer se povežejo med seboj. Na začetku se na molekulo NAM postopoma pripne 5 aminokislinskih ostankov. Prvi štirje si sledijo po prej navedenem zaporedju, kot peti pa je pripet še en dodaten D-alanin. Nastala molekula se nato preko NAM pripne na lipid C55-izoprenil pirofosfat, imenovan tudi baktrofenil, ki se nahaja v proti citosolu usmerjeni polovici celične membrane. Z NAM se v naslednjem koraku poveže NAG, na peptidni del pa se lahko doda še povezovalni glicinski mostiček. Celotna molekula se sedaj iz notranje polovice lipidnega dvosloja ob pomoči flipaze FtsW prestavi v zunanjo polovico, tako da sladkorno-peptidni del gleda v periplazemski prostor.
V periplazmi poteka povezovanje peptidoglikanskih enot s pomočjo transglikozilaz in transpeptidaz, ki jih z nadpomenko imenujemo penicilin-vezavni proteini (PBP). Transglikozilaza prepozna na lipidno komponento vezan peptidoglikanski prekurzor in poveže četrti C-atom ostanka NAG na prekurzorju s prvim C-atomom NAM, ki se nahaja na koncu izgrajujoče peptidoglikanske verige. Pri tem nastane β(1 → 4) vez, baktrofenil pa se odcepi in prenese nazaj v notranjo polovico fosfolipidnega dvosloja, kjer je pripravljen na sprejem novega prekurzorja. Sedaj se morajo oligopeptidi še prečno povezati, kar katalizira transpeptidaza. Encim odcepi končni D-alanin s pentapeptida na prekurzorju in D-alanin na preostalem tetrapeptidu poveže s tretjim aminokislinskim ostankom v sosednjem tetrapeptidu, bodisi direktno, bodisi preko vmesnega glicinskega mostička.

Bakterije lahko lastno celično steno tudi razgrajujejo. Pri tem sodelujejo avtolizini, ki so potrebni za obnavljanje in spreminjanje oblike celične stene, ter regulacijo njene rasti. Procesa izgrajevanja in razgrajevanja sta uravnotežena, ob določenih pogojih pa avtolizini sprožijo intenzivnejšo razgradnjo stene, ki vodi v celično lizo. Ta je lahko tudi posledica delovanja antibiotikov.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

== Delovanje glikopeptidnih antibiotikov ==
Glikopeptidi so glikozilirani neribosomski peptidi, ki delujejo kot sterični inhibitorji zorenja peptidoglikanov grampozitivnih bakterij. Inhibirajo lahko delovanje dveh encimov, in sicer transglikozilaze in transpeptidaze. Ta inhibicija ne poteka preko vezave na encim, pač pa se glikopeptidi namesto tega vežejo na substrat omenjenih encimov, peptidoglikan, natančneje na njihov oligopeptidni del. Vezani glikopeptidi predstavljajo sterično oviro in encimoma preprečujejo dostop do peptidoglikana. Na ta način preprečujejo ustrezno povezovanje peptidoglikana. Posledično je inhibirana rast, smrt pa po navadi povzroči povečan tlak, ki nastane zaradi nezadostno povezanega peptidoglikana. Pride do osmotske lize. [[slika: http://4.bp.blogspot.com/-aMRnL9j_6ZY/UfVm0sjiUYI/AAAAAAAAA50/nvP133cuItU/s1600/transpeptidase-07.png ]]

Inhibicija preko vezave na substrat je mogoča zaradi posebne strukture glikopeptidov. Sestavljeni so iz osrednjega heptapeptida, ki ga tvorijo pretežno aromatske aminokisline. Na heptapeptidno ogrodje so vezane različne skupine, najpogosteje sladkorni ostanki, kloridni atomi in lipidne verige. Število aromatskih aminokislin v heptapetidu se med posameznimi glikopeptidi lahko razlikuje. V precej poznanem peptidnem antibiotiku, vankomicinu, je aromatskih aminokslin 5, medtem ko jih je v teikoplaninu 7. Aromatske aminokisline v osrednjem peptidu so oksidativno prečno povezane. Prečne povezave tvorijo posebno strukturno konformacijo, »čeljust«, v katero se vežejo peptidni deli peptidoglikana. [[slika: https://www.researchgate.net/figure/50893040_fig6_Figure-1-Chemical-structures-of-Type-I-1-vancomycin-2-balhimycin-and-Type-IV-3 ]]
[[Media:http://www.hull.ac.uk/php/chsanb/LMWeb/Image84.gif]]
Glikopeptidi se s čeljustmi vežejo na C-konce peptidoglikana, ki so ključni za tvorbo kompleksa transglikozilaza-peptidoglikan ali transpeptidaza-peptidoglikan. V splošnem glikopeptidi prepoznajo skupine aminokislin s stereokemijsko konformacijo -L-D-D, najmanjša enota, na katero se lahko vežejo, pa je -D-ala-D-ala. Za C-konce nastajajoče konce peptidoglikana, je značilno zaporedje L-lys-D-ala-D-ala, preko katerega transglikozilaza poveže dve peptidoglikanski enoti, transpeptidaza pa preko njega nove peptide vgrajuje v celično steno. Glikopeptidi z zaporedjem –D-ala-D-ala v peptidnem delu peptidoglikana tvorijo vodikove vezi in se na ta način, kljub svoji siceršnji rigidnosti, ovijejo okoli peptidoglikana, kar preprečuje vezavo encimov. Vodikove vezi po navadi nastanejo med C-končno karboksilno skupino motiva -D-ala-D-ala in amidnimi skupinami aminokislin iz heptapeptidnega ogrodja glikopeptidov. Mogoč je tudi nastanek vodikove vezi med aminsko skupino končnega alanina v motivu –D-ala-D-ala in kisikom karbonilne skupine osrednjega peptida. [[slika: http://offset.peczuh.uconn.edu/wp-content/uploads/sites/240/2015/08/b100912p-f2.gif. ]]

Večina glikopeptidnih antibiotikov lahko preko tvorbe vodikovih vezi tudi homodimerizira. Takšna homodimerizacija je skoraj vedno, izjema je le rizocitin, kooperativna z vezavo na zaporedje -D-ala-D-ala. Kooperativnost naj bi bila posledica tega, da vezava peptidoglikana v strukturo glikopeptida uvede simetrijo, ki omogoči tvorbo več intramolekularnih vodikovih vezi. Slednje spremenijo konformacijo glikopeptida tako, da tesneje ovije peptid in tvori nove vezi. Dimerizacija predstavlja tudi večjo sterično oviro za transpeptidazo in transglikozilazo. Glikopeptidni antibiotiki, ki imajo večjo tandenco za dimerizacijo, so načeloma učinkovitejši.
Teikoplanin je najbolj znan antibiotik iz družine glikopeptidov, ki ne tvori homodimerov. Kljub temu je njegovo delovanje zelo učinkovito, saj vsebuje dodatno vezano N-subsituirano maščobnokislinsko stransko verigo. Ta je vezana preko glukozaminskega ostanka, ki je vezan na 4. aminokislino osrednjega heptapeptida. Iz tega je jasno razvidno, da na učinkovitost antibiotika vplivajo tudi njegove stranske skupine. Hidrofobne stranske verige v splošnem omogočajo boljšo lokalizacijo in sidranje antibiotika na tarčno mesto, še pomembneje pa je, da omogočajo precej močne intramolekularne interakcije, katerih vpliv je pojasnjen nekoliko višje v besedilu. [[slika: http://www.hull.ac.uk/php/chsanb/LMWeb/Image84.gif ]]
Rezistentne bakterije se učinku gikopeptidov lahko izognejo tako, da namesto zadnjega D-alanina v oligopeptide vgrajujejo D-laktat. Na takšne oligopeptide se glikopeptidi ne vežejo.

Mehanizem delovanja betalaktamov in glikopeptidov

2017-05-14T17:54:22Z

Ajda.Lenardič:

== Sinteza bakterijske celične stene ==

Celična stena daje bakterijski celici trdnost in ščiti celično membrano pred poškodbami zaradi celičnega turgorja. V glavnem jo sestavlja polimer peptidoglikan, ki mu pravimo tudi murein. Po Gramu negativne bakterije imajo dve celični membrani, med katerima se v periplazemskem prostoru nahaja celična stena. Ta je široka od 7 nm do 8 nm in je sestavljena le iz nekaj plasti peptidoglikana. Po Gramu pozitivne bakterije nimajo dodatne zunanje celične membrane, celična stena, ki obdaja njihovo plazmalemo, pa je bolj debela. V širino meri od 20 nm do 80 nm, gradi pa jo lahko do 40 plasti peptidoglikana.

Peptidoglikan je zgrajen iz vzporednih sladkornih verig, povezanih preko oligopeptidov. V sladkornem ogrodju so izmenjujoče nanizani ostanki N-acetilglukozamina (NAG) in N-acetilmuraminske kisline (NAM), ki so povezani z β(1 → 4) glikozidno vezjo. Na D-laktilno skupino vsakega ostanka NAM je vezan tetrapeptid. Aminokisline v tem peptidu si sledijo po zaporedju: L-alanin, D-glutamin, 2,6-diaminopimelinska kislina (DAP) in D-alanin pri po Gramu negativnih bakterijah, pri po Gramu pozitivnih bakterijah pa je na tretjem mestu namesto DAP L-lizin. Pri po Gramu pozitivnih bakterijah ta povezava ni direktna, ampak poteka preko peptidnih mostičkov, ki so ponavadi sestavljeni iz petih zaporednih glicinskih ostankov.

Pri sintezi celične stene se sestavni elementi peptidoglikana izgradijo v citosolu, nato pa se prenesejo v periplazmo, kjer se povežejo med seboj. Na začetku se na molekulo NAM postopoma pripne 5 aminokislinskih ostankov. Prvi štirje si sledijo po prej navedenem zaporedju, kot peti pa je pripet še en dodaten D-alanin. Nastala molekula se nato preko NAM pripne na lipid C55-izoprenil pirofosfat, imenovan tudi baktrofenil, ki se nahaja v proti citosolu usmerjeni polovici celične membrane. Z NAM se v naslednjem koraku poveže NAG, na peptidni del pa se lahko doda še povezovalni glicinski mostiček. Celotna molekula se sedaj iz notranje polovice lipidnega dvosloja ob pomoči flipaze FtsW prestavi v zunanjo polovico, tako da sladkorno-peptidni del gleda v periplazemski prostor.
V periplazmi poteka povezovanje peptidoglikanskih enot s pomočjo transglikozilaz in transpeptidaz, ki jih z nadpomenko imenujemo penicilin-vezavni proteini (PBP). Transglikozilaza prepozna na lipidno komponento vezan peptidoglikanski prekurzor in poveže četrti C-atom ostanka NAG na prekurzorju s prvim C-atomom NAM, ki se nahaja na koncu izgrajujoče peptidoglikanske verige. Pri tem nastane β(1 → 4) vez, baktrofenil pa se odcepi in prenese nazaj v notranjo polovico fosfolipidnega dvosloja, kjer je pripravljen na sprejem novega prekurzorja. Sedaj se morajo oligopeptidi še prečno povezati, kar katalizira transpeptidaza. Encim odcepi končni D-alanin s pentapeptida na prekurzorju in D-alanin na preostalem tetrapeptidu poveže s tretjim aminokislinskim ostankom v sosednjem tetrapeptidu, bodisi direktno, bodisi preko vmesnega glicinskega mostička.

Bakterije lahko lastno celično steno tudi razgrajujejo. Pri tem sodelujejo avtolizini, ki so potrebni za obnavljanje in spreminjanje oblike celične stene, ter regulacijo njene rasti. Procesa izgrajevanja in razgrajevanja sta uravnotežena, ob določenih pogojih pa avtolizini sprožijo intenzivnejšo razgradnjo stene, ki vodi v celično lizo. Ta je lahko tudi posledica delovanja antibiotikov.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

== Delovanje glikopeptidnih antibiotikov ==
Glikopeptidi so glikozilirani neribosomski peptidi, ki delujejo kot sterični inhibitorji zorenja peptidoglikanov grampozitivnih bakterij. Inhibirajo lahko delovanje dveh encimov, in sicer transglikozilaze in transpeptidaze. Ta inhibicija ne poteka preko vezave na encim, pač pa se glikopeptidi namesto tega vežejo na substrat omenjenih encimov, peptidoglikan, natančneje na njihov oligopeptidni del. Vezani glikopeptidi predstavljajo sterično oviro in encimoma preprečujejo dostop do peptidoglikana. Na ta način preprečujejo ustrezno povezovanje peptidoglikana. Posledično je inhibirana rast, smrt pa po navadi povzroči povečan tlak, ki nastane zaradi nezadostno povezanega peptidoglikana. Pride do osmotske lize. [[slika: http://4.bp.blogspot.com/-aMRnL9j_6ZY/UfVm0sjiUYI/AAAAAAAAA50/nvP133cuItU/s1600/transpeptidase-07.png ]]

Inhibicija preko vezave na substrat je mogoča zaradi posebne strukture glikopeptidov. Sestavljeni so iz osrednjega heptapeptida, ki ga tvorijo pretežno aromatske aminokisline. Na heptapeptidno ogrodje so vezane različne skupine, najpogosteje sladkorni ostanki, kloridni atomi in lipidne verige. Število aromatskih aminokislin v heptapetidu se med posameznimi glikopeptidi lahko razlikuje. V precej poznanem peptidnem antibiotiku, vankomicinu, je aromatskih aminokslin 5, medtem ko jih je v teikoplaninu 7. Aromatske aminokisline v osrednjem peptidu so oksidativno prečno povezane. Prečne povezave tvorijo posebno strukturno konformacijo, »čeljust«, v katero se vežejo peptidni deli peptidoglikana. [[slika: https://www.researchgate.net/figure/50893040_fig6_Figure-1-Chemical-structures-of-Type-I-1-vancomycin-2-balhimycin-and-Type-IV-3 ]]

Glikopeptidi se s čeljustmi vežejo na C-konce peptidoglikana, ki so ključni za tvorbo kompleksa transglikozilaza-peptidoglikan ali transpeptidaza-peptidoglikan. V splošnem glikopeptidi prepoznajo skupine aminokislin s stereokemijsko konformacijo -L-D-D, najmanjša enota, na katero se lahko vežejo, pa je -D-ala-D-ala. Za C-konce nastajajoče konce peptidoglikana, je značilno zaporedje L-lys-D-ala-D-ala, preko katerega transglikozilaza poveže dve peptidoglikanski enoti, transpeptidaza pa preko njega nove peptide vgrajuje v celično steno. Glikopeptidi z zaporedjem –D-ala-D-ala v peptidnem delu peptidoglikana tvorijo vodikove vezi in se na ta način, kljub svoji siceršnji rigidnosti, ovijejo okoli peptidoglikana, kar preprečuje vezavo encimov. Vodikove vezi po navadi nastanejo med C-končno karboksilno skupino motiva -D-ala-D-ala in amidnimi skupinami aminokislin iz heptapeptidnega ogrodja glikopeptidov. Mogoč je tudi nastanek vodikove vezi med aminsko skupino končnega alanina v motivu –D-ala-D-ala in kisikom karbonilne skupine osrednjega peptida. [[slika: http://offset.peczuh.uconn.edu/wp-content/uploads/sites/240/2015/08/b100912p-f2.gif. ]]

Večina glikopeptidnih antibiotikov lahko preko tvorbe vodikovih vezi tudi homodimerizira. Takšna homodimerizacija je skoraj vedno, izjema je le rizocitin, kooperativna z vezavo na zaporedje -D-ala-D-ala. Kooperativnost naj bi bila posledica tega, da vezava peptidoglikana v strukturo glikopeptida uvede simetrijo, ki omogoči tvorbo več intramolekularnih vodikovih vezi. Slednje spremenijo konformacijo glikopeptida tako, da tesneje ovije peptid in tvori nove vezi. Dimerizacija predstavlja tudi večjo sterično oviro za transpeptidazo in transglikozilazo. Glikopeptidni antibiotiki, ki imajo večjo tandenco za dimerizacijo, so načeloma učinkovitejši.
Teikoplanin je najbolj znan antibiotik iz družine glikopeptidov, ki ne tvori homodimerov. Kljub temu je njegovo delovanje zelo učinkovito, saj vsebuje dodatno vezano N-subsituirano maščobnokislinsko stransko verigo. Ta je vezana preko glukozaminskega ostanka, ki je vezan na 4. aminokislino osrednjega heptapeptida. Iz tega je jasno razvidno, da na učinkovitost antibiotika vplivajo tudi njegove stranske skupine. Hidrofobne stranske verige v splošnem omogočajo boljšo lokalizacijo in sidranje antibiotika na tarčno mesto, še pomembneje pa je, da omogočajo precej močne intramolekularne interakcije, katerih vpliv je pojasnjen nekoliko višje v besedilu. [[slika: http://www.hull.ac.uk/php/chsanb/LMWeb/Image84.gif ]]
Rezistentne bakterije se učinku gikopeptidov lahko izognejo tako, da namesto zadnjega D-alanina v oligopeptide vgrajujejo D-laktat. Na takšne oligopeptide se glikopeptidi ne vežejo.