Wiki FKKT - User contributions [en]

Utišanje genov na osnovi majhnih protismernih DNA omogoča manipulacijo in replikacijo genoma bakteriofagov v brezceličnem sistemu

2021-05-19T08:09:54Z

Akarlek:

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00402?goto=supporting-info
===UVOD===
V sintezni biologiji se poslužujejo enega od principov sestavljanja, od spodaj navzgor, kjer skušajo sestaviti celotno celico iz različnih bioloških delov [1]. V ta namen je v uporabi brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem. Izražanje genov v brezceličnem sistemu se uporablja v študijah, kjer skušajo sestaviti minimalne žive sisteme. Eden izmed principov je vstavitev potrebnih elementov za izražanje genov v razdelek, ki ga nato vstavijo v šasijo in je zmožen samostojnega izražanja potrebnih genov, ena od zahtev pa je tudi samostojna replikacija genetska materiala znotraj razdelka [2].
Za replikacijo genoma so raziskovali replikacijske sisteme bakteriofagov, ki imajo svoj sistem replikacijen, npr. bakteriofag Q''β'', RNA genom. Za dosego samostojne replikacije genoma sistema, želimo, da je sistem zmožen samostojen izgradnje replikaze in fagnih komponent tekom replikacijskega cikla. V primeru bakteriofaga Q''β'' so ugotovili, da med replikacijo nastanejo kratke parazitske RNA sekvence. Že približno 50 let nazaj je Spiegelman uporabil 218 nt dolgo RNA sekvenco, ki je bila zmožna sintetizirati RNA replikazo. V reakcijsko mešanico je poleg RNA polimeraze dodal še RNA genom bakteriofaga Qβ kar je vodilo v replikacijo genoma [3]. V uporabi je tudi bakteriofag Φ29, katerega genom je dsDNA, in vsebuje DNA polimerazo [2].

V ''in vivo'' pogojih je ena izmed slabih lastnosti bakteriofagov specifičnost vezave na bakterijo, za produkcijo viabilnih fagov pa je le-ta potrebna ohraniti esencialne gene. V primeru uporabe brezceličnega sistema se izognemu specifičnosti vezave na bakterijo, med drugim pa je možno utišati gene esencialne za repklikacijski cikel [2].
Kontrola izražanja genov z majhnimi RNA (''angl.'' small RNA, sRNA) je v biološkem svetu zelo razširjena. Bakterije imajo sRNA, ki je delno ali v celoti komplementarna mRNA. Hibridizacija sRNA na mRNA vpliva na translacijo in stabilnost mRNA. Eden izmed pogostejših načinov regulacije je vezanje na ribosom vezavno mesto (RBS), ki se nahaja v neprevedeni regiji (UTR) na 5' koncu, in prepreči iniciacijo translacije. Bakterije s pomočjo sRNA specifično zavrejo izražanje fagnih genov brez, da bi posegli v sekvenco genoma. V brezceličnem sistemu so namesto sRNA uporabili sDNA, saj je DNA veliko bolj stabilna kot RNA. Uporabili so protismerno sDNA, ki se veže RBS specifične mRNA in tako prepreči translacijo [2].

Za ugotovitev ustreznosti teorije, so opazovali regulacijo trankripcije gena YPet, ki se prepiše v fluorescenčni protein. V brezceličnem sistemu, ekstrakt E. coli, je prišlo do in vitro transkripcije gena YPet, v katerem se je predhodno že nahajala protismerna sDNA. Med nastalo mRNA in sDNA je prišlo do hibridizacije. Izražanje gena YPet so spremljali s fluorometrom pri 29 °C. V eksperimentu so uporabili sDNA, ki je bila dolga 60 nt in je bila komplementarna 8 nt RBS regije. Poleg blokade RBS, je nastali kompleks sDNA-mRNA lahko tarča RNaze H, ki razgradi mRNA [2].

Eksperimente so izvedli pri različnih koncentracijah sDNA, gen YPet pa je bil pod kontrolo promotorja T7 ali konstitutivnega promotorja iz E. coli (J23106). Represijo so primerjali z ON/OFF razmerjem. Za ON se uporabi intenziteto fluorescence negativne kontrole (0 µM sDNA), za OFF pa intenziteto fluorescence za posamezno koncentracijo sDNA [2]. V nadaljevanju so ta pristop preizkusili na bakteriofagu T7, kjer so uporabili protismerno sDNA proti glavnemu kapsidnem proteinu (''angl.'' major capsid protein) [2].

===REZULTATI IN DISKUSIJA===
'''Represija gena YPet'''

S testom represije gena YPet pri različnih koncentracijah protismerne sDNA so ugotovili, da se represija povečuje s večanjem koncentracije sDNA, pri koncentraciji 0,05 µM pa represije niso zaznali. Pri obeh promotorjih so zaznali največjo raven represije pri maksimalni koncentraciji sDNA, 10 µM. Pri promotorju T7 so opazili 50-kratno povečanje razmerja ON/OFF, medtem ko so pri konstitutivnem promotorju opazili le 4-kratno povečanje. Ker ribosom in protismerna sDNA tekmujeta za isto vezavno mesto, RBS, lahko učinkovitost izboljšamo s povečanjem koncentracije protismerne sDNA [2].
Razlika v promotorjih je zaradi hitrosti delovanja RNA polimeraze, 20-90 nt/s pri ''E. coli'' in 240 nt/s pri bakteriofagu T7, kar pomeni, da bakteriofag proizvede več mRNA, poruši se ravnovesje med ribosomi in mRNA in tako se poveča koncentracija nastalih kompleksov sDNA-mRNA [2].

'''Vpliv dolžine sDNA na represijo translacije'''

Pri tem eksperimentu so opazovali vpliv dolžine sDNA na represijo translacije tako, da so uporabili različno dolge sDNA, 40, 50 in 60 nt, s koncentracijo 5 µM. Pri obeh promotorjih se je izkazalo, da se z dolžino sDNA zvišuje raven represije zaradi večje termodinamske stabilnosti, saj so daljši dupleksi bolj stabilni. Večji dupleksi so veliko bolj nagnjeni k razgradnji z RNazo H. Pri promotorju T7 so tudi opazili veliko razliko med ON/OFF razmerjem med 50 in 60 nt [2].

'''Utišanje bakteriofagnih genov'''

Bakteriofag T7 za replikacijo genoma potrebuje samo tri fagne proteine, gp5, gp4 in gp2.5, ter en gostiteljev protein, tioredoksin [2].
Pri tem eksperimentu so uporabili protismerno sDNA proti glavnemu kapsidnem proteinu, izbrani gen pa so vnesli pod kontrolo promotorja T7. Na koncu gena se je nahajal še T7 terminator (T7-T phi) [2].
Naprej so v odsotnosti sDNA izvedli ekspresijo fagov in izvedli plak-test, s katerim so dobili koncentracijo od 3 x 109 do 1,3 x 1010 PFU/mL. Poleg tega so morfologijo bakteriofagov preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo. Nato so v reakcijsko mešanico dodali 60 nt dolgo protismerno sDNA, pričakovali so zmanjšano nastajanje bakteriofagov. S qPCR so kvantitativno določili stopnjo replikacije. Pri vzorcih, ki so imeli sDNA, so ugotovili 30-kratno povečanje replikacije. Testirali so tudi nastajanje fagov ob dodatku sDNA in ugotovili, da se produkcija zmanjša za 4-krat [2].
S temi rezultati so dokazali, da je možno spremeniti izražanje gena brez, da bi spremenili sekvenco genoma bakteriofaga. Razlog v zmanjšanju titra fagov je v tem, da inhibiramo nastajanje glavnega kapsidnega proteina, ki je ključen pri izgradnji bakteriofaga. Vzrok v povečani repklicaji pa je povečana koncentracija dostopne DNA, saj se je manj pakira v bakteriofage [2].

'''Replikacija genoma T7 pri serijskih redčitvah'''

Pri tem eksperimentu so inkubirali 0,5 nM fagne DNA v brezceličnem sistemu ob dodatku dNTPjev pri temperaturi 29 °C. Po 4h inkubacije so prenesli del vzorca v sveže pripravljen brezcelični sistem. Pred vsakim korakom redčenja so s qPCR določili koncentracijo fagne DNA. Uspešnost replikacije so preverili tudi z agarozno gelsko elektroforezo. Ugotovili so, da je koncentracija DNA naraščala, vendar so prav tako odkrili, da se je število novonastalih kopij z generacijo nižalo [2].
Fagni genom in brezcelični sistem so vnesli emulzijo in mešali toliko časa, da so nastale lipidne kapljice. Nato so izvedli enake postopke kot so že bili opisani. Rezultati so pokazali 100-kratno povečanje koncentracije DNA v prvih dveh redčitvah, tudi plak-test je pokazal zmanjšanje vrednost PFU/mL z vsako redčitvijo [2].
Zmanjšanje replikacije z redčenjem je lahko posledica mutacij v genih, ki so odgovorni za replikacijo DNA, eden izmed vzrokov pa je lahko tudi pojav parazitske DNA. Vzrok je lahko tudi kopičenje inhibitornih produktov, ki lahko vodijo v znižano izražanje polimeraze. Vsi mehanizmi pa vodijo v zmanjšano nastajanje proteinov esencialnih za DNA replikacijo. V naravnem okolju se bakteriofag temu izogne, saj po replikaciji pride do lize celic [2].

===ZAKLJUČEK===
Protismerna sDNA je zmožna komplementarne vezave na RBS ali kodirajočo regijo mRNA, kar lahko uporabimo v brezceličnem sistemu. Podobni primeri take inhibicije so sRNA pri bakterijah, RNAi pri evkariontih in CRISPRi. Represija translacije s strani sDNA je specifična in zahteva 60 nt dolgo verigo. Z dodatkom sDNA lahko kontroliramo izražanje genov ''in vitro''. S pomočjo bakteriofaga T7 so izvedli podoben eksperiment kot Spiegelman z bakteriofagom Q''β''. Zaradi visoke procesivnosti in majhnega števila napak tekom replikacije (15x10-16 baz) DNA polimeraze faga T7, je velika možnost vpeljave le-te v sintezno celico.

===LITERATURA===
[1] A. Scott, M. J. Noga, P. De Graaf, I. Westerlaken, E. Yildirim, and C. Danelon, “Cell-free phospholipid biosynthesis by gene-encoded enzymes reconstituted in liposomes,” PLoS One, vol. 11, no. 10, pp. 1–23, 2016, doi: 10.1371/journal.pone.0163058.

[2] K. Vogele, E. Falgenhauer, S. Von Schonberg, F. C. Simmel, and T. Pirzer, “Small Antisense DNA-Based Gene Silencing Enables Cell-Free Bacteriophage Manipulation and Genome Replication,” ACS Synth. Biol., 2021, doi: 10.1021/acssynbio.0c00402.

[3] D. R. Mills, R. L. Peterson, and S. Spiegelman, “Self-Duplicating Nucleic Acid Molecule *,” Proc. Natl. Acad. Sci. Biochem., vol. 58, pp. 217–224, 1967.

Utišanje genov na osnovi majhnih protismernih DNA omogoča manipulacijo in replikacijo genoma bakteriofagov v brezceličnem sistemu

2021-05-18T19:21:11Z

Akarlek:

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00402?goto=supporting-info
===UVOD===
V sintezni biologiji se poslužujejo enega od principov sestavljanja, od spodaj navzgor, kjer skušajo sestaviti celotno celico iz različnih bioloških delov [1]. V ta namen je v uporabi brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem. Izražanje genov v brezceličnem sistemu se uporablja v študijah, kjer skušajo sestaviti minimalne žive sisteme. Eden izmed principov je vstavitev potrebnih elementov za izražanje genov v razdelek, ki ga nato vstavijo v šasijo in je zmožen samostojnega izražanja potrebnih genov, ena od zahtev pa je tudi samostojna replikacija genetska materiala znotraj razdelka [2].
Za replikacijo genoma so raziskovali replikacijske sisteme bakteriofagov, ki imajo svoj sistem replikacijen, npr. bakteriofag Q''β'', RNA genom. Za dosego samostojne replikacije genoma sistema, želimo, da je sistem zmožen samostojen izgradnje replikaze in fagnih komponent tekom replikacijskega cikla. V primeru bakteriofaga Q''β'' so ugotovili, da med replikacijo nastanejo kratke parazitske RNA sekvence. Že približno 50 let nazaj je Spiegelman uporabil 218 nt dolgo RNA sekvenco, ki je bila zmožna sintetizirati RNA replikazo. V reakcijsko mešanico je poleg RNA polimeraze dodal še RNA genom bakteriofaga Qβ kar je vodilo v replikacijo genoma [3]. V uporabi je tudi bakteriofag Φ29, katerega genom je dsDNA, in vsebuje DNA polimerazo [2].

V ''in vivo'' pogojih je ena izmed slabih lastnosti bakteriofagov specifičnost vezave na bakterijo, za produkcijo viabilnih fagov pa je le-ta potrebna ohraniti esencialne gene. V primeru uporabe brezceličnega sistema se izognemu specifičnosti vezave na bakterijo, med drugim pa je možno utišati gene esencialne za repklikacijski cikel [2].
Kontrola izražanja genov z majhnimi RNA (''angl.'' small RNA, sRNA) je v biološkem svetu zelo razširjena. Bakterije imajo sRNA, ki je delno ali v celoti komplementarna mRNA. Hibridizacija sRNA na mRNA vpliva na translacijo in stabilnost mRNA. Eden izmed pogostejših načinov regulacije je vezanje na ribosom vezavno mesto (RBS), ki se nahaja v neprevedeni regiji (UTR) na 5' koncu, in prepreči iniciacijo translacije. Bakterije s pomočjo sRNA specifično zavrejo izražanje fagnih genov brez, da bi posegli v sekvenco genoma. V brezceličnem sistemu so namesto sRNA uporabili sDNA, saj je DNA veliko bolj stabilna kot RNA. Uporabili so protismerno sDNA, ki se veže RBS specifične mRNA in tako prepreči translacijo [2].

Za ugotovitev ustreznosti teorije, so opazovali regulacijo trankripcije gena YPet, ki se prepiše v fluorescenčni protein. V brezceličnem sistemu, ekstrakt E. coli, je prišlo do in vitro transkripcije gena YPet, v katerem se je predhodno že nahajala protismerna sDNA. Med nastalo mRNA in sDNA je prišlo do hibridizacije. Izražanje gena YPet so spremljali s fluorometrom pri 29 °C. V eksperimentu so uporabili sDNA, ki je bila dolga 60 nt in je bila komplementarna 8 nt RBS regije. Poleg blokade RBS, je nastali kompleks sDNA-mRNA lahko tarča RNaze H, ki razgradi mRNA [2].

Eksperimente so izvedli pri različnih koncentracijah sDNA, gen YPet pa je bil pod kontrolo promotorja T7 ali konstitutivnega promotorja iz E. coli (J23106). Represijo so primerjali z ON/OFF razmerjem. Za ON se uporabi intenziteto fluorescence negativne kontrole (0 µM sDNA), za OFF pa intenziteto fluorescence za posamezno koncentracijo sDNA [2]. V nadaljevanju so ta pristop preizkusili na bakteriofagu T7, kjer so uporabili protismerno sDNA proti glavnemu kapsidnem proteinu (''angl.'' major capsid protein) [2].

===REZULTATI IN DISKUSIJA===
'''Represija gena YPet'''

S testom represije gena YPet pri različnih koncentracijah protismerne sDNA so ugotovili, da se represija povečuje s večanjem koncentracije sDNA, pri koncentraciji 0,05 µM pa represije niso zaznali. Pri obeh promotorjih so zaznali največjo raven represije pri maksimalni koncentraciji sDNA, 10 µM. Pri promotorju T7 so opazili 50-kratno povečanje razmerja ON/OFF, medtem ko so pri konstitutivnem promotorju opazili le 4-kratno povečanje. Ker ribosom in protismerna sDNA tekmujeta za isto vezavno mesto, RBS, lahko učinkovitost izboljšamo s povečanjem koncentracije protismerne sDNA [2].
Razlika v promotorjih je zaradi hitrosti delovanja RNA polimeraze, 20-90 nt/s pri ''E. coli'' in 240 nt/s pri bakteriofagu T7, kar pomeni, da bakteriofag proizvede več mRNA, poruši se ravnovesje med ribosomi in mRNA in tako se poveča koncentracija nastalih kompleksov sDNA-mRNA [2].

'''Vpliv dolžine sDNA na represijo translacije'''

Pri tem eksperimentu so opazovali vpliv dolžine sDNA na represijo translacije tako, da so uporabili različno dolge sDNA, 40, 50 in 60 nt, s koncentracijo 5 µM. Pri obeh promotorjih se je izkazalo, da se z dolžino sDNA zvišuje raven represije zaradi večje termodinamske stabilnosti, saj so daljši dupleksi bolj stabilni. Večji dupleksi so veliko bolj nagnjeni k razgradnji z RNazo H. Pri promotorju T7 so tudi opazili veliko razliko med ON/OFF razmerjem med 50 in 60 nt [2].

'''Utišanje bakteriofagnih genov'''

Bakteriofag T7 za replikacijo genoma potrebuje samo tri fagne proteine, gp5, gp4 in gp2.5, ter en gostiteljev protein, tioredoksin [2].
Pri tem eksperimentu so uporabili protismerno sDNA proti glavnemu kapsidnem proteinu, izbrani gen pa so vnesli pod kontrolo promotorja T7. Na koncu gena se je nahajal še T7 terminator (T7-T phi) [2].
Naprej so v odsotnosti sDNA izvedli ekspresijo fagov in izvedli plak-test, s katerim so dobili koncentracijo od 3 x 109 do 1,3 x 1010 CFU/mL. Poleg tega so morfologijo bakteriofagov preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo. Nato so v reakcijsko mešanico dodali 60 nt dolgo protismerno sDNA, pričakovali so zmanjšano nastajanje bakteriofagov. S qPCR so kvantitativno določili stopnjo replikacije. Pri vzorcih, ki so imeli sDNA, so ugotovili 30-kratno povečanje replikacije. Testirali so tudi nastajanje fagov ob dodatku sDNA in ugotovili, da se produkcija zmanjša za 4-krat [2].
S temi rezultati so dokazali, da je možno spremeniti izražanje gena brez, da bi spremenili sekvenco genoma bakteriofaga. Razlog v zmanjšanju titra fagov je v tem, da inhibiramo nastajanje glavnega kapsidnega proteina, ki je ključen pri izgradnji bakteriofaga. Vzrok v povečani repklicaji pa je povečana koncentracija dostopne DNA, saj se je manj pakira v bakteriofage [2].

'''Replikacija genoma T7 pri serijskih redčitvah'''

Pri tem eksperimentu so inkubirali 0,5 nM fagne DNA v brezceličnem sistemu ob dodatku dNTPjev pri temperaturi 29 °C. Po 4h inkubacije so prenesli del vzorca v sveže pripravljen brezcelični sistem. Pred vsakim korakom redčenja so s qPCR določili koncentracijo fagne DNA. Uspešnost replikacije so preverili tudi z agarozno gelsko elektroforezo. Ugotovili so, da je koncentracija DNA naraščala, vendar so prav tako odkrili, da se je število novonastalih kopij z generacijo nižalo [2].
Fagni genom in brezcelični sistem so vnesli emulzijo in mešali toliko časa, da so nastale lipidne kapljice. Nato so izvedli enake postopke kot so že bili opisani. Rezultati so pokazali 100-kratno povečanje koncentracije DNA v prvih dveh redčitvah, tudi plak-test je pokazal zmanjšanje vrednost CFU/mL z vsako redčitvijo [2].
Zmanjšanje replikacije z redčenjem je lahko posledica mutacij v genih, ki so odgovorni za replikacijo DNA, eden izmed vzrokov pa je lahko tudi pojav parazitske DNA. Vzrok je lahko tudi kopičenje inhibitornih produktov, ki lahko vodijo v znižano izražanje polimeraze. Vsi mehanizmi pa vodijo v zmanjšano nastajanje proteinov esencialnih za DNA replikacijo. V naravnem okolju se bakteriofag temu izogne, saj po replikaciji pride do lize celic [2].

===ZAKLJUČEK===
Protismerna sDNA je zmožna komplementarne vezave na RBS ali kodirajočo regijo mRNA, kar lahko uporabimo v brezceličnem sistemu. Podobni primeri take inhibicije so sRNA pri bakterijah, RNAi pri evkariontih in CRISPRi. Represija translacije s strani sDNA je specifična in zahteva 60 nt dolgo verigo. Z dodatkom sDNA lahko kontroliramo izražanje genov ''in vitro''. S pomočjo bakteriofaga T7 so izvedli podoben eksperiment kot Spiegelman z bakteriofagom Q''β''. Zaradi visoke procesivnosti in majhnega števila napak tekom replikacije (15x10-16 baz) DNA polimeraze faga T7, je velika možnost vpeljave le-te v sintezno celico.

===LITERATURA===
[1] A. Scott, M. J. Noga, P. De Graaf, I. Westerlaken, E. Yildirim, and C. Danelon, “Cell-free phospholipid biosynthesis by gene-encoded enzymes reconstituted in liposomes,” PLoS One, vol. 11, no. 10, pp. 1–23, 2016, doi: 10.1371/journal.pone.0163058.

[2] K. Vogele, E. Falgenhauer, S. Von Schonberg, F. C. Simmel, and T. Pirzer, “Small Antisense DNA-Based Gene Silencing Enables Cell-Free Bacteriophage Manipulation and Genome Replication,” ACS Synth. Biol., 2021, doi: 10.1021/acssynbio.0c00402.

[3] D. R. Mills, R. L. Peterson, and S. Spiegelman, “Self-Duplicating Nucleic Acid Molecule *,” Proc. Natl. Acad. Sci. Biochem., vol. 58, pp. 217–224, 1967.

Utišanje genov na osnovi majhnih protismernih DNA omogoča manipulacijo in replikacijo genoma bakteriofagov v brezceličnem sistemu

2021-05-18T17:26:38Z

Akarlek:

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00402?goto=supporting-info
===UVOD===
V sintezni biologiji se poslužujejo enega od principov sestavljanja, od spodaj navzgor, kjer skušajo sestaviti celotno celico iz različnih bioloških delov [1]. V ta namen je v uporabi brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem. Izražanje genov v brezceličnem sistemu se uporablja v študijah, kjer skušajo sestaviti minimalne žive sisteme. Eden izmed principov je vstavitev potrebnih elementov za izražanje genov v razdelek, ki ga nato vstavijo v šasijo in je zmožen samostojnega izražanja potrebnih genov, ena od zahtev pa je tudi samostojna replikacija genetska materiala znotraj razdelka [2].
Za replikacijo genoma so raziskovali replikacijske sisteme bakteriofagov, ki imajo svoj sistem replikacijen, npr. bakteriofag Q''β'', RNA genom. Za dosego samostojne replikacije genoma sistema, želimo, da je sistem zmožen samostojen izgradnje replikaze in fagnih komponent tekom replikacijskega cikla. V primeru bakteriofaga Q''β'' so ugotovili, da med replikacijo nastanejo kratke parazitske RNA sekvence. Že približno 50 let nazaj je Spiegelman uporabil 218 nt dolgo RNA sekvenco, ki je bila zmožna sintetizirati RNA replikazo. V reakcijsko mešanico je poleg RNA polimeraze dodal še RNA genom bakteriofaga Qβ kar je vodilo v replikacijo genoma [3]. V uporabi je tudi bakteriofag Φ29, katerega genom je dsDNA, in vsebuje DNA polimerazo [2].

V ''in vivo'' pogojih je ena izmed slabih lastnosti bakteriofagov specifičnost vezave na bakterijo, za produkcijo viabilnih fagov pa je le-ta potrebna ohraniti esencialne gene. V primeru uporabe brezceličnega sistema se izognemu specifičnosti vezave na bakterijo, med drugim pa je možno utišati gene esencialne za repklikacijski cikel [2].
Kontrola izražanja genov z majhnimi RNA (''angl.'' small RNA, sRNA) je v biološkem svetu zelo razširjena. Bakterije imajo sRNA, ki je delno ali v celoti komplementarna mRNA. Hibridizacija sRNA na mRNA vpliva na translacijo in stabilnost mRNA. Eden izmed pogostejših načinov regulacije je vezanje na ribosom vezavno mesto (RBS), ki se nahaja v neprevedeni regiji (UTR) na 5' koncu, in prepreči iniciacijo translacije. Bakterije s pomočjo sRNA specifično zavrejo izražanje fagnih genov brez, da bi posegli v sekvenco genoma. V brezceličnem sistemu so namesto sRNA uporabili sDNA, saj je DNA veliko bolj stabilna kot RNA. Uporabili so protismerno sDNA, ki se veže RBS specifične mRNA in tako prepreči translacijo [2].

Za ugotovitev ustreznosti teorije, so opazovali regulacijo trankripcije gena YPet, ki se prepiše v fluorescenčni protein. V brezceličnem sistemu, ekstrakt E. coli, je prišlo do in vitro transkripcije gena YPet, v katerem se je predhodno že nahajala protismerna sDNA. Med nastalo mRNA in sDNA je prišlo do hibridizacije. Izražanje gena YPet so spremljali s fluorometrom pri 29 °C. V eksperimentu so uporabili sDNA, ki je bila dolga 60 nt in je bila komplementarna 8 nt RBS regije. Poleg blokade RBS, je nastali kompleks sDNA-mRNA lahko tarča RNaze H, ki razgradi mRNA [2].

Eksperimente so izvedli pri različnih koncentracijah sDNA, gen YPet pa je bil pod kontrolo promotorja T7 ali konstitutivnega promotorja iz E. coli (J23106). Represijo so primerjali z ON/OFF razmerjem. Za ON se uporabi intenziteto fluorescence negativne kontrole (0 µM sDNA), za OFF pa intenziteto fluorescence za posamezno koncentracijo sDNA [2]. V nadaljevanju so ta pristop preizkusili na bakteriofagu T7, kjer so uporabili protismerno sDNA proti glavnemu kapsidnem proteinu (''angl.'' major capsid protein) [2].

===REZULTATI IN DISKUSIJA===
'''Represija gena YPet'''

S testom represije gena YPet pri različnih koncentracijah protismerne sDNA so ugotovili, da se represija povečuje s večanjem koncentracije sDNA, pri koncentraciji 0,05 µM pa represije niso zaznali. Pri obeh promotorjih so zaznali največjo raven represije pri maksimalni koncentraciji sDNA, 10 µM. Pri promotorju T7 so opazili 50-kratno povečanje razmerja ON/OFF, medtem ko so pri konstitutivnem promotorju opazili le 4-kratno povečanje. Ker ribosom in protismerna sDNA tekmujeta za isto vezavno mesto, RBS, lahko učinkovitost izboljšamo s povečanjem koncentracije protismerne sDNA [2].
Razlika v promotorjih je zaradi hitrosti delovanja RNA polimeraze, 20-90 nt/s pri ''E. coli'' in 240 nt/s pri bakteriofagu T7, kar pomeni, da bakteriofag proizvede več mRNA, poruši se ravnovesje med ribosomi in mRNA in tako se poveča koncentracija nastalih kompleksov sDNA-mRNA [2].

'''Vpliv dolžine sDNA na represijo translacije'''

Pri tem eksperimentu so opazovali vpliv dolžine sDNA na represijo translacije tako, da so uporabili različno dolge sDNA, 40, 50 in 60 nt, s koncentracijo 5 µM. Pri obeh promotorjih se je izkazalo, da se z dolžino sDNA zvišuje raven represije zaradi večje termodinamske stabilnosti, saj so daljši dupleksi bolj stabilni. Večji dupleksi so veliko bolj nagnjeni k razgradnji z RNazo H. Pri promotorju T7 so tudi opazili veliko razliko med ON/OFF razmerjem med 50 in 60 nt [2].

'''Utišanje genov bakteriofagnega genoma'''

Bakteriofag T7 za replikacijo genoma potrebuje samo tri fagne proteine, gp5, gp4 in gp2.5, ter en gostiteljev protein, tioredoksin [2].
Pri tem eksperimentu so uporabili protismerno sDNA proti glavnemu kapsidnem proteinu, izbrani gen pa so vnesli pod kontrolo promotorja T7. Na koncu gena se je nahajal še T7 terminator (T7-T phi) [2].
Naprej so v odsotnosti sDNA izvedli ekspresijo fagov in izvedli plak-test, s katerim so dobili koncentracijo od 3 x 109 do 1,3 x 1010 CFU/mL. Poleg tega so morfologijo bakteriofagov preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo. Nato so v reakcijsko mešanico dodali 60 nt dolgo protismerno sDNA, pričakovali so zmanjšano nastajanje bakteriofagov. S qPCR so kvantitativno določili stopnjo replikacije. Pri vzorcih, ki so imeli sDNA, so ugotovili 30-kratno povečanje replikacije. Testirali so tudi nastajanje fagov ob dodatku sDNA in ugotovili, da se produkcija zmanjša za 4-krat [2].
S temi rezultati so dokazali, da je možno spremeniti izražanje gena brez, da bi spremenili sekvenco genoma bakteriofaga. Razlog v zmanjšanju titra fagov je v tem, da inhibiramo nastajanje glavnega kapsidnega proteina, ki je ključen pri izgradnji bakteriofaga. Vzrok v povečani repklicaji pa je povečana koncentracija dostopne DNA, saj se je manj pakira v bakteriofage [2].

'''Replikacija genoma T7 pri serijskih redčitvah'''

Pri tem eksperimentu so inkubirali 0,5 nM fagne DNA v brezceličnem sistemu ob dodatku dNTPjev pri temperaturi 29 °C. Po 4h inkubacije so prenesli del vzorca v sveže pripravljen brezcelični sistem. Pred vsakim korakom redčenja so s qPCR določili koncentracijo fagne DNA. Uspešnost replikacije so preverili tudi z agarozno gelsko elektroforezo. Ugotovili so, da je koncentracija DNA naraščala, vendar so prav tako odkrili, da se je število novonastalih kopij z generacijo nižalo [2].
Fagni genom in brezcelični sistem so vnesli emulzijo in mešali toliko časa, da so nastale lipidne kapljice. Nato so izvedli enake postopke kot so že bili opisani. Rezultati so pokazali 100-kratno povečanje koncentracije DNA v prvih dveh redčitvah, tudi plak-test je pokazal zmanjšanje vrednost CFU/mL z vsako redčitvijo [2].
Zmanjšanje replikacije z redčenjem je lahko posledica mutacij v genih, ki so odgovorni za replikacijo DNA, eden izmed vzrokov pa je lahko tudi pojav parazitske DNA. Vzrok je lahko tudi kopičenje inhibitornih produktov, ki lahko vodijo v znižano izražanje polimeraze. Vsi mehanizmi pa vodijo v zmanjšano nastajanje proteinov esencialnih za DNA replikacijo. V naravnem okolju se bakteriofag temu izogne, saj po replikaciji pride do lize celic [2].

===ZAKLJUČEK===
Protismerna sDNA je zmožna komplementarne vezave na RBS ali kodirajočo regijo mRNA, kar lahko uporabimo v brezceličnem sistemu. Podobni primeri take inhibicije so sRNA pri bakterijah, RNAi pri evkariontih in CRISPRi. Represija translacije s strani sDNA je specifična in zahteva 60 nt dolgo verigo. Z dodatkom sDNA lahko kontroliramo izražanje genov ''in vitro''. S pomočjo bakteriofaga T7 so izvedli podoben eksperiment kot Spiegelman z bakteriofagom Q''β''. Zaradi visoke procesivnosti in majhnega števila napak tekom replikacije (15x10-16 baz) DNA polimeraze faga T7, je velika možnost vpeljave le-te v sintezno celico.

===LITERATURA===
[1] A. Scott, M. J. Noga, P. De Graaf, I. Westerlaken, E. Yildirim, and C. Danelon, “Cell-free phospholipid biosynthesis by gene-encoded enzymes reconstituted in liposomes,” PLoS One, vol. 11, no. 10, pp. 1–23, 2016, doi: 10.1371/journal.pone.0163058.

[2] K. Vogele, E. Falgenhauer, S. Von Schonberg, F. C. Simmel, and T. Pirzer, “Small Antisense DNA-Based Gene Silencing Enables Cell-Free Bacteriophage Manipulation and Genome Replication,” ACS Synth. Biol., 2021, doi: 10.1021/acssynbio.0c00402.

[3] D. R. Mills, R. L. Peterson, and S. Spiegelman, “Self-Duplicating Nucleic Acid Molecule *,” Proc. Natl. Acad. Sci. Biochem., vol. 58, pp. 217–224, 1967.

Utišanje genov na osnovi majhnih protismernih DNA omogoča manipulacijo in replikacijo genoma bakteriofagov v brezceličnem sistemu

2021-05-18T16:36:24Z

Akarlek:

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00402?goto=supporting-info
===UVOD===
V sintezni biologiji se poslužujejo enega od principov sestavljanja, od spodaj navzgor, kjer skušajo sestaviti celotno celico iz različnih bioloških delov [1]. V ta namen je v uporabi brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem. Izražanje genov v brezceličnem sistemu se uporablja v študijah, kjer skušajo sestaviti minimalne žive sisteme. Eden izmed principov je vstavitev potrebnih elementov za izražanje genov v razdelek, ki ga nato vstavijo v šasijo in je zmožen samostojnega izražanja potrebnih genov, ena od zahtev pa je tudi samostojna replikacija genetska materiala znotraj razdelka [2].
Za replikacijo genoma so raziskovali replikacijske sisteme bakteriofagov, ki imajo svoj sistem replikacijen, npr. bakteriofag Q''β'', RNA genom. Za dosego samostojne replikacije genoma sistema, želimo, da je sistem zmožen samostojen izgradnje replikaze in fagnih komponent tekom replikacijskega cikla. V primeru bakteriofaga Q''β'' so ugotovili, da med replikacijo nastanejo kratke parazitske RNA sekvence. Že približno 50 let nazaj je Spiegelman uporabil 218 nt dolgo RNA sekvenco, ki je bila zmožna sintetizirati RNA replikazo. V reakcijsko mešanico je poleg RNA polimeraze dodal še RNA genom bakteriofaga Qβ kar je vodilo v replikacijo genoma [3]. V uporabi je tudi bakteriofag Φ29, katerega genom je dsDNA, in vsebuje DNA polimerazo [2].

V ''in vivo'' pogojih je ena izmed slabih lastnosti bakteriofagov specifičnost vezave na bakterijo, za produkcijo viabilnih fagov pa je le-ta potrebna ohraniti esencialne gene. V primeru uporabe brezceličnega sistema se izognemu specifičnosti vezave na bakterijo, med drugim pa je možno izbite gene esencialne za repklikacijski cikel [2].
Kontrola izražanja genov z majhnimi RNA (''angl.'' small RNA, sRNA) je v biološkem svetu zelo razširjena. Bakterije imajo sRNA, ki je delno ali v celoti komplementarna mRNA. Hibridizacija sRNA na mRNA vpliva na translacijo in stabilnost mRNA. Eden izmed pogostejših načinov regulacije je vezanje na ribosom vezavno mesto (RBS), ki se nahaja v neprevedeni regiji (UTR) na 5' koncu, in prepreči iniciacijo translacije. Bakterije s pomočjo sRNA specifično zavrejo izražanje fagnih genov brez, da bi posegli v sekvenco genoma. V brezceličnem sistemu so namesto sRNA uporabili sDNA, saj je DNA veliko bolj stabilna kot RNA. Uporabili so protismerno sDNA, ki se veže RBS specifične mRNA in tako prepreči translacijo [2].

Za ugotovitev ustreznosti teorije, so opazovali regulacijo trankripcije gena YPet, ki se prepiše v fluorescenčni protein. V brezceličnem sistemu, ekstrakt E. coli, je prišlo do in vitro transkripcije gena YPet, v katerem se je predhodno že nahajala protismerna sDNA. Med nastalo mRNA in sDNA je prišlo do hibridizacije. Izražanje gena YPet so spremljali s fluorometrom pri 29 °C. V eksperimentu so uporabili sDNA, ki je bila dolga 60 nt in je bila komplementarna 8 nt RBS regije. Poleg blokade RBS, je nastali kompleks sDNA-mRNA lahko tarča RNaze H, ki razgradi mRNA [2].

Eksperimente so izvedli pri različnih koncentracijah sDNA, gen YPet pa je bil pod kontrolo promotorja T7 ali konstitutivnega promotorja iz E. coli (J23106). Represijo so primerjali z ON/OFF razmerjem. Za ON se uporabi intenziteto fluorescence negativne kontrole (0 µM sDNA), za OFF pa intenziteto fluorescence za posamezno koncentracijo sDNA [2]. V nadaljevanju so ta pristop preizkusili na bakteriofagu T7, kjer so uporabili protismerno sDNA proti glavnemu kapsidnem proteinu (''angl.'' major capsid protein) [2].

===REZULTATI IN DISKUSIJA===
'''Represija gena YPet'''

S testom represije gena YPet pri različnih koncentracijah protismerne sDNA so ugotovili, da se represija povečuje s večanjem koncentracije sDNA, pri koncentraciji 0,05 µM pa represije niso zaznali. Pri obeh promotorjih so zaznali največjo raven represije pri maksimalni koncentraciji sDNA, 10 µM. Pri promotorju T7 so opazili 50-kratno povečanje razmerja ON/OFF, medtem ko so pri konstitutivnem promotorju opazili le 4-kratno povečanje. Ker ribosom in protismerna sDNA tekmujeta za isto vezavno mesto, RBS, lahko učinkovitost izboljšamo s povečanjem koncentracije protismerne sDNA [2].
Razlika v promotorjih je zaradi hitrosti delovanja RNA polimeraze, 20-90 nt/s pri ''E. coli'' in 240 nt/s pri bakteriofagu T7, kar pomeni, da bakteriofag proizvede več mRNA, poruši se ravnovesje med ribosomi in mRNA in tako se poveča koncentracija nastalih kompleksov sDNA-mRNA [2].

'''Vpliv dolžine sDNA na represijo translacije'''

Pri tem eksperimentu so opazovali vpliv dolžine sDNA na represijo translacije tako, da so uporabili različno dolge sDNA, 40, 50 in 60 nt, s koncentracijo 5 µM. Pri obeh promotorjih se je izkazalo, da se z dolžino sDNA zvišuje raven represije zaradi večje termodinamske stabilnosti, saj so daljši dupleksi bolj stabilni. Večji dupleksi so veliko bolj nagnjeni k razgradnji z RNazo H. Pri promotorju T7 so tudi opazili veliko razliko med ON/OFF razmerjem med 50 in 60 nt [2].

'''Izbitje genov iz bakteriofagnega genoma'''

Bakteriofag T7 za replikacijo genoma potrebuje samo tri fagne proteine, gp5, gp4 in gp2.5, ter en gostiteljev protein, tioredoksin [2].
Pri tem eksperimentu so uporabili protismerno sDNA proti glavnemu kapsidnem proteinu, izbrani gen pa so vnesli pod kontrolo promotorja T7. Na koncu gena se je nahajal še T7 terminator (T7-T phi) [2].
Naprej so v odsotnosti sDNA izvedli ekspresijo fagov in izvedli plak-test, s katerim so dobili koncentracijo od 3 x 109 do 1,3 x 1010 CFU/mL. Poleg tega so morfologijo bakteriofagov preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo. Nato so v reakcijsko mešanico dodali 60 nt dolgo protismerno sDNA, pričakovali so zmanjšano nastajanje bakteriofagov. S qPCR so kvantitativno določili stopnjo replikacije. Pri vzorcih, ki so imeli sDNA, so ugotovili 30-kratno povečanje replikacije. Testirali so tudi nastajanje fagov ob dodatku sDNA in ugotovili, da se produkcija zmanjša za 4-krat [2].
S temi rezultati so dokazali, da je možno spremeniti izražanje gena brez, da bi spremenili sekvenco genoma bakteriofaga. Razlog v zmanjšanju titra fagov je v tem, da inhibiramo nastajanje glavnega kapsidnega proteina, ki je ključen pri izgradnji bakteriofaga. Vzrok v povečani repklicaji pa je povečana koncentracija dostopne DNA, saj se je manj pakira v bakteriofage [2].

'''Replikacija genoma T7 pri serijskih redčitvah'''

Pri tem eksperimentu so inkubirali 0,5 nM fagne DNA v brezceličnem sistemu ob dodatku dNTPjev pri temperaturi 29 °C. Po 4h inkubacije so prenesli del vzorca v sveže pripravljen brezcelični sistem. Pred vsakim korakom redčenja so s qPCR določili koncentracijo fagne DNA. Uspešnost replikacije so preverili tudi z agarozno gelsko elektroforezo. Ugotovili so, da je koncentracija DNA naraščala, vendar so prav tako odkrili, da se je število novonastalih kopij z generacijo nižalo [2].
Fagni genom in brezcelični sistem so vnesli emulzijo in mešali toliko časa, da so nastale lipidne kapljice. Nato so izvedli enake postopke kot so že bili opisani. Rezultati so pokazali 100-kratno povečanje koncentracije DNA v prvih dveh redčitvah, tudi plak-test je pokazal zmanjšanje vrednost CFU/mL z vsako redčitvijo [2].
Zmanjšanje replikacije z redčenjem je lahko posledica mutacij v genih, ki so odgovorni za replikacijo DNA, eden izmed vzrokov pa je lahko tudi pojav parazitske DNA. Vzrok je lahko tudi kopičenje inhibitornih produktov, ki lahko vodijo v znižano izražanje polimeraze. Vsi mehanizmi pa vodijo v zmanjšano nastajanje proteinov esencialnih za DNA replikacijo. V naravnem okolju se bakteriofag temu izogne, saj po replikaciji pride do lize celic [2].

===ZAKLJUČEK===
Protismerna sDNA je zmožna komplementarne vezave na RBS ali kodirajočo regijo mRNA, kar lahko uporabimo v brezceličnem sistemu. Podobni primeri take inhibicije so sRNA pri bakterijah, RNAi pri evkariontih in CRISPRi. Represija translacije s strani sDNA je specifična in zahteva 60 nt dolgo verigo. Z dodatkom sDNA lahko kontroliramo izražanje genov in vitro. S pomočjo bakteriofaga T7 so izvedli podoben eksperiment kot Spiegelman z bakteriofagom Q''β''. Zaradi visoke procesivnosti in majhnega števila napak tekom replikacije (15x10-16 baz) DNA polimeraze faga T7, je velika možnost vpeljave le-te v sintezno celico.

===LITERATURA===
[1] A. Scott, M. J. Noga, P. De Graaf, I. Westerlaken, E. Yildirim, and C. Danelon, “Cell-free phospholipid biosynthesis by gene-encoded enzymes reconstituted in liposomes,” PLoS One, vol. 11, no. 10, pp. 1–23, 2016, doi: 10.1371/journal.pone.0163058.

[2] K. Vogele, E. Falgenhauer, S. Von Schonberg, F. C. Simmel, and T. Pirzer, “Small Antisense DNA-Based Gene Silencing Enables Cell-Free Bacteriophage Manipulation and Genome Replication,” ACS Synth. Biol., 2021, doi: 10.1021/acssynbio.0c00402.

[3] D. R. Mills, R. L. Peterson, and S. Spiegelman, “Self-Duplicating Nucleic Acid Molecule *,” Proc. Natl. Acad. Sci. Biochem., vol. 58, pp. 217–224, 1967.

Utišanje genov na osnovi majhnih protismernih DNA omogoča manipulacijo in replikacijo genoma bakteriofagov v brezceličnem sistemu

2021-05-18T16:11:58Z

Akarlek:

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00402?goto=supporting-info
===UVOD===
V sintezni biologiji se poslužujejo enega od principov sestavljanja, od spodaj navzgor, kjer skušajo sestaviti celotno celico iz različnih bioloških delov [1]. V ta namen je v uporabi brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem. Izražanje genov v brezceličnem sistemu se uporablja v študijah, kjer skušajo sestaviti minimalne žive sisteme. Eden izmed principov je vstavitev potrebnih elementov za izražanje genov v razdelek, ki ga nato vstavijo v šasijo in je zmožen samostojnega izražanja potrebnih genov, ena od zahtev pa je tudi samostojna replikacija genetska materiala znotraj razdelka [2].
Za replikacijo genoma so raziskovali replikacijske sisteme bakteriofagov, ki imajo svoj sistem replikacijen, npr. bakteriofag Q''β'', RNA genom. Za dosego samostojne replikacije genoma sistema, želimo, da je sistem zmožen samostojen izgradnje replikaze in fagnih komponent tekom replikacijskega cikla. V primeru bakteriofaga Q''β'' so ugotovili, da med replikacijo nastanejo kratke parazitske RNA sekvence. Že približno 50 let nazaj je Spiegelman uporabil 218 nt dolgo RNA sekvenco, ki je bila zmožna sintetizirati RNA polimerazo. V reakcijsko mešanico je poleg RNA polimeraze dodal še RNA genom bakteriofaga Qβ kar je vodilo v replikacijo genoma [3]. V uporabi je tudi bakteriofag Φ29, katerega genom je dsDNA, in vsebuje DNA polimerazo [2].

V ''in vivo'' pogojih je ena izmed slabih lastnosti bakteriofagov specifičnost vezave na bakterijo, za produkcijo viabilnih fagov pa je le-ta potrebna ohraniti esencialne gene. V primeru uporabe brezceličnega sistema se izognemu specifičnosti vezave na bakterijo, med drugim pa je možno izbite gene esencialne za repklikacijski cikel [2].
Kontrola izražanja genov z majhnimi RNA (''angl.'' small RNA, sRNA) je v biološkem svetu zelo razširjena. Bakterije imajo sRNA, ki je delno ali v celoti komplementarna mRNA. Hibridizacija sRNA na mRNA vpliva na translacijo in stabilnost mRNA. Eden izmed pogostejših načinov regulacije je vezanje na ribosom vezavno mesto (RBS), ki se nahaja v neprevedeni regiji (UTR) na 5' koncu, in prepreči iniciacijo translacije. Bakterije s pomočjo sRNA specifično zavrejo izražanje fagnih genov brez, da bi posegli v sekvenco genoma. V brezceličnem sistemu so namesto sRNA uporabili sDNA, saj je DNA veliko bolj stabilna kot RNA. Uporabili so protismerno sDNA, ki se veže RBS specifične mRNA in tako prepreči translacijo [2].

Za ugotovitev ustreznosti teorije, so opazovali regulacijo trankripcije gena YPet, ki se prepiše v fluorescenčni protein. V brezceličnem sistemu, ekstrakt E. coli, je prišlo do in vitro transkripcije gena YPet, v katerem se je predhodno že nahajala protismerna sDNA. Med nastalo mRNA in sDNA je prišlo do hibridizacije. Izražanje gena YPet so spremljali s fluorometrom pri 29 °C. V eksperimentu so uporabili sDNA, ki je bila dolga 60 nt in je bila komplementarna 8 nt RBS regije. Poleg blokade RBS, je nastali kompleks sDNA-mRNA lahko tarča RNaze H, ki razgradi mRNA [2].

Eksperimente so izvedli pri različnih koncentracijah sDNA, gen YPet pa je bil pod kontrolo promotorja T7 ali konstitutivnega promotorja iz E. coli (J23106). Represijo so primerjali z ON/OFF razmerjem. Za ON se uporabi intenziteto fluorescence negativne kontrole (0 µM sDNA), za OFF pa intenziteto fluorescence za posamezno koncentracijo sDNA [2]. V nadaljevanju so ta pristop preizkusili na bakteriofagu T7, kjer so uporabili protismerno sDNA proti glavnemu kapsidnem proteinu (''angl.'' major capsid protein) [2].

===REZULTATI IN DISKUSIJA===
'''Represija gena YPet'''

S testom represije gena YPet pri različnih koncentracijah protismerne sDNA so ugotovili, da se represija povečuje s večanjem koncentracije sDNA, pri koncentraciji 0,05 µM pa represije niso zaznali. Pri obeh promotorjih so zaznali največjo raven represije pri maksimalni koncentraciji sDNA, 10 µM. Pri promotorju T7 so opazili 50-kratno povečanje razmerja ON/OFF, medtem ko so pri konstitutivnem promotorju opazili le 4-kratno povečanje. Ker ribosom in protismerna sDNA tekmujeta za isto vezavno mesto, RBS, lahko učinkovitost izboljšamo s povečanjem koncentracije protismerne sDNA [2].
Razlika v promotorjih je zaradi hitrosti delovanja RNA polimeraze, 20-90 nt/s pri ''E. coli'' in 240 nt/s pri bakteriofagu T7, kar pomeni, da bakteriofag proizvede več mRNA, poruši se ravnovesje med ribosomi in mRNA in tako se poveča koncentracija nastalih kompleksov sDNA-mRNA [2].

'''Vpliv dolžine sDNA na represijo translacije'''

Pri tem eksperimentu so opazovali vpliv dolžine sDNA na represijo translacije tako, da so uporabili različno dolge sDNA, 40, 50 in 60 nt, s koncentracijo 5 µM. Pri obeh promotorjih se je izkazalo, da se z dolžino sDNA zvišuje raven represije zaradi večje termodinamske stabilnosti, saj so daljši dupleksi bolj stabilni. Večji dupleksi so veliko bolj nagnjeni k razgradnji z RNazo H. Pri promotorju T7 so tudi opazili veliko razliko med ON/OFF razmerjem med 50 in 60 nt [2].

'''Izbitje genov iz bakteriofagnega genoma'''

Bakteriofag T7 za replikacijo genoma potrebuje samo tri fagne proteine, gp5, gp4 in gp2.5, ter en gostiteljev protein, tioredoksin [2].
Pri tem eksperimentu so uporabili protismerno sDNA proti glavnemu kapsidnem proteinu, izbrani gen pa so vnesli pod kontrolo promotorja T7. Na koncu gena se je nahajal še T7 terminator (T7-T phi) [2].
Naprej so v odsotnosti sDNA izvedli ekspresijo fagov in izvedli plak-test, s katerim so dobili koncentracijo od 3 x 109 do 1,3 x 1010 CFU/mL. Poleg tega so morfologijo bakteriofagov preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo. Nato so v reakcijsko mešanico dodali 60 nt dolgo protismerno sDNA, pričakovali so zmanjšano nastajanje bakteriofagov. S qPCR so kvantitativno določili stopnjo replikacije. Pri vzorcih, ki so imeli sDNA, so ugotovili 30-kratno povečanje replikacije. Testirali so tudi nastajanje fagov ob dodatku sDNA in ugotovili, da se produkcija zmanjša za 4-krat [2].
S temi rezultati so dokazali, da je možno spremeniti izražanje gena brez, da bi spremenili sekvenco genoma bakteriofaga. Razlog v zmanjšanju titra fagov je v tem, da inhibiramo nastajanje glavnega kapsidnega proteina, ki je ključen pri izgradnji bakteriofaga. Vzrok v povečani repklicaji pa je povečana koncentracija dostopne DNA, saj se je manj pakira v bakteriofage [2].

'''Replikacija genoma T7 pri serijskih redčitvah'''

Pri tem eksperimentu so inkubirali 0,5 nM fagne DNA v brezceličnem sistemu ob dodatku dNTPjev pri temperaturi 29 °C. Po 4h inkubacije so prenesli del vzorca v sveže pripravljen brezcelični sistem. Pred vsakim korakom redčenja so s qPCR določili koncentracijo fagne DNA. Uspešnost replikacije so preverili tudi z agarozno gelsko elektroforezo. Ugotovili so, da je koncentracija DNA naraščala, vendar so prav tako odkrili, da se je število novonastalih kopij z generacijo nižalo [2].
Fagni genom in brezcelični sistem so vnesli emulzijo in mešali toliko časa, da so nastale lipidne kapljice. Nato so izvedli enake postopke kot so že bili opisani. Rezultati so pokazali 100-kratno povečanje koncentracije DNA v prvih dveh redčitvah, tudi plak-test je pokazal zmanjšanje vrednost CFU/mL z vsako redčitvijo [2].
Zmanjšanje replikacije z redčenjem je lahko posledica mutacij v genih, ki so odgovorni za replikacijo DNA, eden izmed vzrokov pa je lahko tudi pojav parazitske DNA. Vzrok je lahko tudi kopičenje inhibitornih produktov, ki lahko vodijo v znižano izražanje polimeraze. Vsi mehanizmi pa vodijo v zmanjšano nastajanje proteinov esencialnih za DNA replikacijo. V naravnem okolju se bakteriofag temu izogne, saj po replikaciji pride do lize celic [2].

===ZAKLJUČEK===
Protismerna sDNA je zmožna komplementarne vezave na RBS ali kodirajočo regijo mRNA, kar lahko uporabimo v brezceličnem sistemu. Podobni primeri take inhibicije so sRNA pri bakterijah, RNAi pri evkariontih in CRISPRi. Represija translacije s strani sDNA je specifična in zahteva 60 nt dolgo verigo. Z dodatkom sDNA lahko kontroliramo izražanje genov in vitro. S pomočjo bakteriofaga T7 so izvedli podoben eksperiment kot Spiegelman z bakteriofagom Q''β''. Zaradi visoke procesivnosti in majhnega števila napak tekom replikacije (15x10-16 baz) DNA polimeraze faga T7, je velika možnost vpeljave le-te v sintezno celico.

===LITERATURA===
[1] A. Scott, M. J. Noga, P. De Graaf, I. Westerlaken, E. Yildirim, and C. Danelon, “Cell-free phospholipid biosynthesis by gene-encoded enzymes reconstituted in liposomes,” PLoS One, vol. 11, no. 10, pp. 1–23, 2016, doi: 10.1371/journal.pone.0163058.

[2] K. Vogele, E. Falgenhauer, S. Von Schonberg, F. C. Simmel, and T. Pirzer, “Small Antisense DNA-Based Gene Silencing Enables Cell-Free Bacteriophage Manipulation and Genome Replication,” ACS Synth. Biol., 2021, doi: 10.1021/acssynbio.0c00402.

[3] D. R. Mills, R. L. Peterson, and S. Spiegelman, “Self-Duplicating Nucleic Acid Molecule *,” Proc. Natl. Acad. Sci. Biochem., vol. 58, pp. 217–224, 1967.

Utišanje genov na osnovi majhnih protismernih DNA omogoča manipulacijo in replikacijo genoma bakteriofagov v brezceličnem sistemu

2021-05-17T21:43:34Z

Akarlek:

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00402?goto=supporting-info
===UVOD===
V sintezni biologiji se poslužujejo enega od principov sestavljanja, od spodaj navzgor, kjer skušajo sestaviti celotno celico iz različnih bioloških delov [1]. V ta namen je v uporabi brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem. Izražanje genov v brezceličnem sistemu se uporablja v študijah, kjer skušajo sestaviti minimalne žive sisteme. Eden izmed principov je vstavitev potrebnih elementov za izražanje genov v razdelek, ki ga nato vstavijo v šasijo in je zmožen samostojnega izražanja potrebnih genov, ena od zahtev pa je tudi samostojna replikacija genetska materiala znotraj razdelka [2].
Za replikacijo genoma so raziskovali replikacijske sisteme bakteriofagov, ki imajo svoj sistem replikacijen, npr. bakteriofag Q''β'', RNA genom. Za dosego samostojne replikacije genoma sistema, želimo, da je sistem zmožen samostojen izgradnje replikaze in fagnih komponent tekom replikacijskega cikla. V primeru bakteriofaga Q''β'' so ugotovili, da med replikacijo nastanejo kratke parazitske RNA sekvence. Že približno 40 let nazaj je Spiegelman uporabil 218 nt dolgo RNA sekvenco, ki je bila zmožna sintetizirati RNA polimerazo. V reakcijsko mešanico je poleg RNA polimeraze dodal še RNA genom bakteriofaga Qβ kar je vodilo v replikacijo genoma [3]. V uporabi je tudi bakteriofag Φ29, katerega genom je dsDNA, in vsebuje DNA polimerazo [2].

V ''in vivo'' pogojih je ena izmed slabih lastnosti bakteriofagov specifičnost vezave na bakterijo, za produkcijo viabilnih fagov pa je le-ta potrebna ohraniti esencialne gene. V primeru uporabe brezceličnega sistema se izognemu specifičnosti vezave na bakterijo, med drugim pa je možno izbite gene esencialne za repklikacijski cikel [2].
Kontrola izražanja genov z majhnimi RNA (''angl.'' small RNA, sRNA) je v biološkem svetu zelo razširjena. Bakterije imajo sRNA, ki je delno ali v celoti komplementarna mRNA. Hibridizacija sRNA na mRNA vpliva na translacijo in stabilnost mRNA. Eden izmed pogostejših načinov regulacije je vezanje na ribosom vezavno mesto (RBS), ki se nahaja v neprevedeni regiji (UTR) na 5' koncu, in prepreči iniciacijo translacije. Bakterije s pomočjo sRNA specifično zavrejo izražanje fagnih genov brez, da bi posegli v sekvenco genoma. V brezceličnem sistemu so namesto sRNA uporabili sDNA, saj je DNA veliko bolj stabilna kot RNA. Uporabili so protismerno sDNA, ki se veže RBS specifične mRNA in tako prepreči translacijo [2].

Za ugotovitev ustreznosti teorije, so opazovali regulacijo trankripcije gena YPet, ki se prepiše v fluorescenčni protein. V brezceličnem sistemu, ekstrakt E. coli, je prišlo do in vitro transkripcije gena YPet, v katerem se je predhodno že nahajala protismerna sDNA. Med nastalo mRNA in sDNA je prišlo do hibridizacije. Izražanje gena YPet so spremljali s fluorometrom pri 29 °C. V eksperimentu so uporabili sDNA, ki je bila dolga 60 nt in je bila komplementarna 8 nt RBS regije. Poleg blokade RBS, je nastali kompleks sDNA-mRNA lahko tarča RNaze H, ki razgradi mRNA [2].

Eksperimente so izvedli pri različnih koncentracijah sDNA, gen YPet pa je bil pod kontrolo promotorja T7 ali konstitutivnega promotorja iz E. coli (J23106). Represijo so primerjali z ON/OFF razmerjem. Za ON se uporabi intenziteto fluorescence negativne kontrole (0 µM sDNA), za OFF pa intenziteto fluorescence za posamezno koncentracijo sDNA [2]. V nadaljevanju so ta pristop preizkusili na bakteriofagu T7, kjer so uporabili protismerno sDNA proti glavnemu kapsidnem proteinu (''angl.'' major capsid protein) [2].

===REZULTATI IN DISKUSIJA===
'''Represija gena YPet'''

S testom represije gena YPet pri različnih koncentracijah protismerne sDNA so ugotovili, da se represija povečuje s večanjem koncentracije sDNA, pri koncentraciji 0,05 µM pa represije niso zaznali. Pri obeh promotorjih so zaznali največjo raven represije pri maksimalni koncentraciji sDNA, 10 µM. Pri promotorju T7 so opazili 50-kratno povečanje razmerja ON/OFF, medtem ko so pri konstitutivnem promotorju opazili le 4-kratno povečanje. Ker ribosom in protismerna sDNA tekmujeta za isto vezavno mesto, RBS, lahko učinkovitost izboljšamo s povečanjem koncentracije protismerne sDNA [2].
Razlika v promotorjih je zaradi hitrosti delovanja RNA polimeraze, 20-90 nt/s pri ''E. coli'' in 240 nt/s pri bakteriofagu T7, kar pomeni, da bakteriofag proizvede več mRNA, poruši se ravnovesje med ribosomi in mRNA in tako se poveča koncentracija nastalih kompleksov sDNA-mRNA [2].

'''Vpliv dolžine sDNA na represijo translacije'''

Pri tem eksperimentu so opazovali vpliv dolžine sDNA na represijo translacije tako, da so uporabili različno dolge sDNA, 40, 50 in 60 nt, s koncentracijo 5 µM. Pri obeh promotorjih se je izkazalo, da se z dolžino sDNA zvišuje raven represije zaradi večje termodinamske stabilnosti, saj so daljši dupleksi bolj stabilni. Večji dupleksi so veliko bolj nagnjeni k razgradnji z RNazo H. Pri promotorju T7 so tudi opazili veliko razliko med ON/OFF razmerjem med 50 in 60 nt [2].

'''Izbitje genov iz bakteriofagnega genoma'''

Bakteriofag T7 za replikacijo genoma potrebuje samo tri fagne proteine, gp5, gp4 in gp2.5, ter en gostiteljev protein, tioredoksin [2].
Pri tem eksperimentu so uporabili protismerno sDNA proti glavnemu kapsidnem proteinu, izbrani gen pa so vnesli pod kontrolo promotorja T7. Na koncu gena se je nahajal še T7 terminator (T7-T phi) [2].
Naprej so v odsotnosti sDNA izvedli ekspresijo fagov in izvedli plak-test, s katerim so dobili koncentracijo od 3 x 109 do 1,3 x 1010 CFU/mL. Poleg tega so morfologijo bakteriofagov preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo. Nato so v reakcijsko mešanico dodali 60 nt dolgo protismerno sDNA, pričakovali so zmanjšano nastajanje bakteriofagov. S qPCR so kvantitativno določili stopnjo replikacije. Pri vzorcih, ki so imeli sDNA, so ugotovili 30-kratno povečanje replikacije. Testirali so tudi nastajanje fagov ob dodatku sDNA in ugotovili, da se produkcija zmanjša za 4-krat [2].
S temi rezultati so dokazali, da je možno spremeniti izražanje gena brez, da bi spremenili sekvenco genoma bakteriofaga. Razlog v zmanjšanju titra fagov je v tem, da inhibiramo nastajanje glavnega kapsidnega proteina, ki je ključen pri izgradnji bakteriofaga. Vzrok v povečani repklicaji pa je povečana koncentracija dostopne DNA, saj se je manj pakira v bakteriofage [2].

'''Replikacija genoma T7 pri serijskih redčitvah'''

Pri tem eksperimentu so inkubirali 0,5 nM fagne DNA v brezceličnem sistemu ob dodatku dNTPjev pri temperaturi 29 °C. Po 4h inkubacije so prenesli del vzorca v sveže pripravljen brezcelični sistem. Pred vsakim korakom redčenja so s qPCR določili koncentracijo fagne DNA. Uspešnost replikacije so preverili tudi z agarozno gelsko elektroforezo. Ugotovili so, da je koncentracija DNA naraščala, vendar so prav tako odkrili, da se je število novonastalih kopij z generacijo nižalo [2].
Fagni genom in brezcelični sistem so vnesli emulzijo in mešali toliko časa, da so nastale lipidne kapljice. Nato so izvedli enake postopke kot so že bili opisani. Rezultati so pokazali 100-kratno povečanje koncentracije DNA v prvih dveh redčitvah, tudi plak-test je pokazal zmanjšanje vrednost CFU/mL z vsako redčitvijo [2].
Zmanjšanje replikacije z redčenjem je lahko posledica mutacij v genih, ki so odgovorni za replikacijo DNA, eden izmed vzrokov pa je lahko tudi pojav parazitske DNA. Vzrok je lahko tudi kopičenje inhibitornih produktov, ki lahko vodijo v znižano izražanje polimeraze. Vsi mehanizmi pa vodijo v zmanjšano nastajanje proteinov esencialnih za DNA replikacijo. V naravnem okolju se bakteriofag temu izogne, saj po replikaciji pride do lize celic [2].

===ZAKLJUČEK===
Protismerna sDNA je zmožna komplementarne vezave na RBS ali kodirajočo regijo mRNA, kar lahko uporabimo v brezceličnem sistemu. Podobni primeri take inhibicije so sRNA pri bakterijah, RNAi pri evkariontih in CRISPRi. Represija translacije s strani sDNA je specifična in zahteva 60 nt dolgo verigo. Z dodatkom sDNA lahko kontroliramo izražanje genov in vitro. S pomočjo bakteriofaga T7 so izvedli podoben eksperiment kot Spiegelman z bakteriofagom Q''β''. Zaradi visoke procesivnosti in majhnega števila napak tekom replikacije (15x10-16 baz) DNA polimeraze faga T7, je velika možnost vpeljave le-te v sintezno celico.

===LITERATURA===
[1] A. Scott, M. J. Noga, P. De Graaf, I. Westerlaken, E. Yildirim, and C. Danelon, “Cell-free phospholipid biosynthesis by gene-encoded enzymes reconstituted in liposomes,” PLoS One, vol. 11, no. 10, pp. 1–23, 2016, doi: 10.1371/journal.pone.0163058.

[2] K. Vogele, E. Falgenhauer, S. Von Schonberg, F. C. Simmel, and T. Pirzer, “Small Antisense DNA-Based Gene Silencing Enables Cell-Free Bacteriophage Manipulation and Genome Replication,” ACS Synth. Biol., 2021, doi: 10.1021/acssynbio.0c00402.

[3] D. R. Mills, R. L. Peterson, and S. Spiegelman, “Self-Duplicating Nucleic Acid Molecule *,” Proc. Natl. Acad. Sci. Biochem., vol. 58, pp. 217–224, 1967.

Utišanje genov na osnovi majhnih protismernih DNA omogoča manipulacijo in replikacijo genoma bakteriofagov v brezceličnem sistemu

2021-05-17T21:43:06Z

Akarlek:

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00402?goto=supporting-info
===UVOD===
V sintezni biologiji se poslužujejo enega od principov sestavljanja, od spodaj navzgor, kjer skušajo sestaviti celotno celico iz različnih bioloških delov [1]. V ta namen je v uporabi brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem. Izražanje genov v brezceličnem sistemu se uporablja v študijah, kjer skušajo sestaviti minimalne žive sisteme. Eden izmed principov je vstavitev potrebnih elementov za izražanje genov v razdelek, ki ga nato vstavijo v šasijo in je zmožen samostojnega izražanja potrebnih genov, ena od zahtev pa je tudi samostojna replikacija genetska materiala znotraj razdelka [2].
Za replikacijo genoma so raziskovali replikacijske sisteme bakteriofagov, ki imajo svoj sistem replikacijen, npr. bakteriofag Q''β'', RNA genom. Za dosego samostojne replikacije genoma sistema, želimo, da je sistem zmožen samostojen izgradnje replikaze in fagnih komponent tekom replikacijskega cikla. V primeru bakteriofaga Q''β'' so ugotovili, da med replikacijo nastanejo kratke parazitske RNA sekvence. Že približno 40 let nazaj je Spiegelman uporabil 218 nt dolgo RNA sekvenco, ki je bila zmožna sintetizirati RNA polimerazo. V reakcijsko mešanico je poleg RNA polimeraze dodal še RNA genom bakteriofaga Qβ kar je vodilo v replikacijo genoma [3]. V uporabi je tudi bakteriofag Φ29, katerega genom je dsDNA, in vsebuje DNA polimerazo [2].

V ''in vivo'' pogojih je ena izmed slabih lastnosti bakteriofagov specifičnost vezave na bakterijo, za produkcijo viabilnih fagov pa je le-ta potrebna ohraniti esencialne gene. V primeru uporabe brezceličnega sistema se izognemu specifičnosti vezave na bakterijo, med drugim pa je možno izbite gene esencialne za repklikacijski cikel [2].
Kontrola izražanja genov z majhnimi RNA (''angl.'' small RNA, sRNA) je v biološkem svetu zelo razširjena. Bakterije imajo sRNA, ki je delno ali v celoti komplementarna mRNA. Hibridizacija sRNA na mRNA vpliva na translacijo in stabilnost mRNA. Eden izmed pogostejših načinov regulacije je vezanje na ribosom vezavno mesto (RBS), ki se nahaja v neprevedeni regiji (UTR) na 5' koncu, in prepreči iniciacijo translacije. Bakterije s pomočjo sRNA specifično zavrejo izražanje fagnih genov brez, da bi posegli v sekvenco genoma. V brezceličnem sistemu so namesto sRNA uporabili sDNA, saj je DNA veliko bolj stabilna kot RNA. Uporabili so protismerno sDNA, ki se veže RBS specifične mRNA in tako prepreči translacijo [2].

Za ugotovitev ustreznosti teorije, so opazovali regulacijo trankripcije gena YPet, ki se prepiše v fluorescenčni protein. V brezceličnem sistemu, ekstrakt E. coli, je prišlo do in vitro transkripcije gena YPet, v katerem se je predhodno že nahajala protismerna sDNA. Med nastalo mRNA in sDNA je prišlo do hibridizacije. Izražanje gena YPet so spremljali s fluorometrom pri 29 °C. V eksperimentu so uporabili sDNA, ki je bila dolga 60 nt in je bila komplementarna 8 nt RBS regije. Poleg blokade RBS, je nastali kompleks sDNA-mRNA lahko tarča RNaze H, ki razgradi mRNA [2].

Eksperimente so izvedli pri različnih koncentracijah sDNA, gen YPet pa je bil pod kontrolo promotorja T7 ali konstitutivnega promotorja iz E. coli (J23106). Represijo so primerjali z ON/OFF razmerjem. Za ON se uporabi intenziteto fluorescence negativne kontrole (0 µM sDNA), za OFF pa intenziteto fluorescence za posamezno koncentracijo sDNA [2]. V nadaljevanju so ta pristop preizkusili na bakteriofagu T7, kjer so uporabili protismerno sDNA proti glavnemu kapsidnem proteinu (''angl.'' major capsid protein) [2].

===REZULTATI IN DISKUSIJA===
'''Represija gena YPet'''

S testom represije gena YPet pri različnih koncentracijah protismerne sDNA so ugotovili, da se represija povečuje s večanjem koncentracije sDNA, pri koncentraciji 0,05 µM pa represije niso zaznali. Pri obeh promotorjih so zaznali največjo raven represije pri maksimalni koncentraciji sDNA, 10 µM. Pri promotorju T7 so opazili 50-kratno povečanje razmerja ON/OFF, medtem ko so pri konstitutivnem promotorju opazili le 4-kratno povečanje. Ker ribosom in protismerna sDNA tekmujeta za isto vezavno mesto, RBS, lahko učinkovitost izboljšamo s povečanjem koncentracije protismerne sDNA [2].
Razlika v promotorjih je zaradi hitrosti delovanja RNA polimeraze, 20-90 nt/s pri ''E. coli'' in 240 nt/s pri bakteriofagu T7, kar pomeni, da bakteriofag proizvede več mRNA, poruši se ravnovesje med ribosomi in mRNA in tako se poveča koncentracija nastalih kompleksov sDNA-mRNA [2].

'''Vpliv dolžine sDNA na represijo translacije'''

Pri tem eksperimentu so opazovali vpliv dolžine sDNA na represijo translacije tako, da so uporabili različno dolge sDNA, 40, 50 in 60 nt, s koncentracijo 5 µM. Pri obeh promotorjih se je izkazalo, da se z dolžino sDNA zvišuje raven represije zaradi večje termodinamske stabilnosti, saj so daljši dupleksi bolj stabilni. Večji dupleksi so veliko bolj nagnjeni k razgradnji z RNazo H. Pri promotorju T7 so tudi opazili veliko razliko med ON/OFF razmerjem med 50 in 60 nt [2].

'''Izbitje genov iz bakteriofagnega genoma'''

Bakteriofag T7 za replikacijo genoma potrebuje samo tri fagne proteine, gp5, gp4 in gp2.5, ter en gostiteljev protein, tioredoksin [2].
Pri tem eksperimentu so uporabili protismerno sDNA proti glavnemu kapsidnem proteinu, izbrani gen pa so vnesli pod kontrolo promotorja T7. Na koncu gena se je nahajal še T7 terminator (T7-T phi) [2].
Naprej so v odsotnosti sDNA izvedli ekspresijo fagov in izvedli plak-test, s katerim so dobili koncentracijo od 3 x 109 do 1,3 x 1010 CFU/mL. Poleg tega so morfologijo bakteriofagov preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo. Nato so v reakcijsko mešanico dodali 60 nt dolgo protismerno sDNA, pričakovali so zmanjšano nastajanje bakteriofagov. S qPCR so kvantitativno določili stopnjo replikacije. Pri vzorcih, ki so imeli sDNA, so ugotovili 30-kratno povečanje replikacije. Testirali so tudi nastajanje fagov ob dodatku sDNA in ugotovili, da se produkcija zmanjša za 4-krat [2].
S temi rezultati so dokazali, da je možno spremeniti izražanje gena brez, da bi spremenili sekvenco genoma bakteriofaga. Razlog v zmanjšanju titra fagov je v tem, da inhibiramo nastajanje glavnega kapsidnega proteina, ki je ključen pri izgradnji bakteriofaga. Vzrok v povečani repklicaji pa je povečana koncentracija dostopne DNA, saj se je manj pakira v bakteriofage [2].

'''Replikacija genoma T7 pri serijskih redčitvah'''

Pri tem eksperimentu so inkubirali 0,5 nM fagne DNA v brezceličnem sistemu ob dodatku dNTPjev pri temperaturi 29 °C. Po 4h inkubacije so prenesli del vzorca v sveže pripravljen brezcelični sistem. Pred vsakim korakom redčenja so s qPCR določili koncentracijo fagne DNA. Uspešnost replikacije so preverili tudi z agarozno gelsko elektroforezo. Ugotovili so, da je koncentracija DNA naraščala, vendar so prav tako odkrili, da se je število novonastalih kopij z generacijo nižalo [2].
Fagni genom in brezcelični sistem so vnesli emulzijo in mešali toliko časa, da so nastale lipidne kapljice. Nato so izvedli enake postopke kot so že bili opisani. Rezultati so pokazali 100-kratno povečanje koncentracije DNA v prvih dveh redčitvah, tudi plak-test je pokazal zmanjšanje vrednost CFU/mL z vsako redčitvijo [2].
Zmanjšanje replikacije z redčenjem je lahko posledica mutacij v genih, ki so odgovorni za replikacijo DNA, eden izmed vzrokov pa je lahko tudi pojav parazitske DNA. Vzrok je lahko tudi kopičenje inhibitornih produktov, ki lahko vodijo v znižano izražanje polimeraze. Vsi mehanizmi pa vodijo v zmanjšano nastajanje proteinov esencialnih za DNA replikacijo. V naravnem okolju se bakteriofag temu izogne, saj po replikaciji pride do lize celic [2].

===ZAKLJUČEK===
Protismerna sDNA je zmožna komplementarne vezave na RBS ali kodirajočo regijo mRNA, kar lahko uporabimo v brezceličnem sistemu. Podobni primeri take inhibicije so sRNA pri bakterijah, RNAi pri evkariontih in CRISPRi. Represija translacije s strani sDNA je specifična in zahteva 60 nt dolgo verigo. Z dodatkom sDNA lahko kontroliramo izražanje genov in vitro. S pomočjo bakteriofaga T7 so izvedli podoben eksperiment kot Spiegelman z bakteriofagom Q''β''. Zaradi visoke procesivnosti in majhnega števila napak tekom replikacije (15x10-16 baz) DNA polimeraze faga T7, je velika možnost vpeljave le-te v sintezno celico.

===LITERATURA===
[1] A. Scott, M. J. Noga, P. De Graaf, I. Westerlaken, E. Yildirim, and C. Danelon, “Cell-free phospholipid biosynthesis by gene-encoded enzymes reconstituted in liposomes,” PLoS One, vol. 11, no. 10, pp. 1–23, 2016, doi: 10.1371/journal.pone.0163058.
[2] K. Vogele, E. Falgenhauer, S. Von Schonberg, F. C. Simmel, and T. Pirzer, “Small Antisense DNA-Based Gene Silencing Enables Cell-Free Bacteriophage Manipulation and Genome Replication,” ACS Synth. Biol., 2021, doi: 10.1021/acssynbio.0c00402.
[3] D. R. Mills, R. L. Peterson, and S. Spiegelman, “Self-Duplicating Nucleic Acid Molecule *,” Proc. Natl. Acad. Sci. Biochem., vol. 58, pp. 217–224, 1967.

Utišanje genov na osnovi majhnih protismernih DNA omogoča manipulacijo in replikacijo genoma bakteriofagov v brezceličnem sistemu

2021-05-17T13:34:04Z

Akarlek: New page: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00402?goto=supporting-info

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00402?goto=supporting-info

Seminarji SB 2020/21

2021-05-17T13:33:14Z

Akarlek:

[http://www.example.com link title]V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline] (Liza Ulčakar) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reverzibilna_toplotna_regulacija_za_bifunkcionalno_dinamično_uravnavanje_izražanja_genov_v_E._coli Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli] (Urška Fajdiga) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dna_optogenetska_naprava_na_osnovi_BRET_za_pulzirajo%C4%8Do_ekspresijo_transgena%2C_ki_omogo%C4%8Da_glukozno_homeostazo_pri_mi%C5%A1ih Sintetična optogenetska naprava na osnovi BRET za pulzirajočo ekspresijo transgena, ki omogoča glukozno homeostazo pri miših] (Paula Horvat) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hkratna_karakterizacija_več_različnih_racionalno_načrtovanih_promotorskih_arhitektur Vpogled v kombinatorno logiko z IPTG induciranih sistemov] (Urška Zagorc) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ponovno_določanje_specifičnosti_izven_citoplazme_aktivnih_sigma_faktorjev Ponovno določanje specifičnosti izven citoplazme aktivnih sigma faktorjev] (Eva Keber) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hierarhi%C4%8Dno_sestavljanje_asimetri%C4%8Dnih_ikozaedri%C4%8Dnih_virusnih_kapsid Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid] (Urška Pečarič Strnad) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Avtomatizirano_oblikovanje_sintezne_mikrobne_zdru%C5%BEbe Avtomatizirano oblikovanje sintezne mikrobne združbe] (Urša Lovše) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Regulacija_stopnje_izra%C5%BEanja_z_L-arabinozo_v_ekspresijskem_sistemu_T7_z_razklopljeno_rastjo Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo] (Maruša Mišmaš) 
# [[Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom|Oblikovanje sintetičnega faga iz ''P. aeruginosa'' z reduciranim genomom]] (Martina Lokar) 
# [[Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju]] (Saša Slabe) 
#[[Uravnavanje izražanja genov s pomočjo nanoteles in njihov vpliv na epigenetski spomin]] (Sara Laznik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_humanih_CAR_imunskih_celic_z_napredno_logiko_in_porazdeljenim_računalništvom Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom] (Tjaša Mlakar) 
# [[Utišanje genov na osnovi majhnih protismernih DNA omogoča manipulacijo in replikacijo genoma bakteriofagov v brezceličnem sistemu]] (Anže Karlek) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv] (Špela Supej) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 
# [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) 
# [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) 
# [[Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe]] (Mirsad Mešić) 
# [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) 
# [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) 
# [[NANOFLEX: Standardiziran, prilagodljiv in priročen celični biosenzor]] (Martin Špendl) 
# [[FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib]] (Mateja Žvipelj) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/samoreplicirajoč_COVID-19_test Samoreplicirajoč COVID-19-test] (Irma Zeljković) 
# [[Renervate: Polimer za zdravljenje poškodb hrbtenjače]] (Sabina Sladič Oblak) 
 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi

2021-04-20T15:49:47Z

Akarlek:

Norovirusi so vzrok za približno milijon hudih oblik akutnega gastroenteritisa. V velikem merilu so, s pomočjo ''E. coli'', proizvedli lakto-''N''-fukopentozo (LNFP I), enega izmed humanih mlečnih oligosaharidov (HMO), ki negativno vpliva na vezavo norovirusov na antigene krvnih skupin (angl. histo-blood group antigen, HBGA).

== NOROVIRUSI IN VEZAVA NA HUMANE RECEPTORJE ==
Norovirusi sodijo v družino ''Caliciviridae'', za katere je značilna ikozaedrična kapsida brez ovojnice ter pozitivno usmerjena ssRNA. Genom je organiziran v tri odprte bralne okvirje (ORF), ki zapisujejo proteine kapside. V ORF2 je zapisana glavna strukturna beljakovina VP1, ki ima N-končno S (angl. shell – lupina) domeno in tvori ikozaedrično sredico kapside, ter C-kočno P (angl. protrusion – prodirajoča) domeno, ki deluje kot epitop in sodeluje v vezavi na receptor. ORF3 zapisuje manjšo strukturno beljakovino VP2. Noroviruse delimo v šest genomskih skupin, od GI do GVI, ki povzročajo akutne gastroenteritise pri vseh starostnih skupinah [1].

Norovirusi prepoznajo HBGA kot receptorje za vstop v celice [2]. HBGA so na površini črevesnih celic, najdemo pa jih tudi raztopljene v krvi, želodčnem soku in materinem mleku. Gen ''FUT2'' zapisuje α1,2-fukoziltransferazo, ki katalizira reakcijo vezave fukoze na terminalno galaktozo prekurzorja za H-antigen. Glede ne terminalni ogljikov hidrat na H-antigenu, ki je vezan na glikoprotein oz. glikolipid, delimo HBGA na tip A (''N''-acetilgalaktozamin) in tip B (galaktoza) [3].

Na interakcije med HBGA in norovirusom negativno vplivajo HMO, ki so po strukturi podobni HBGA, zato se norovirusi vežejo nanje. Prav tako, kot HBGA, tudi HMO naravno najdemo v materinem mleku, kar služi kot zaščita novorojenčkov pred norovirusi in posledično diarejo. Poznamo več različnih HMO: 2'-fukozillaktoza (2'FL), lakto-''N''-fukopentoza I (LNFP I), difuzillakto-''N''-heksoza (DFLNH), idr. Vsak HMO ima različno afiniteto do različnega genotipa. LNFP I na primer izkazuje visoko afiniteto do GII.4 Sydney.

== PROIZVODNJA LNFP I ==
Za proizvodnjo in sekrecijo LNFP I so uporabili genetsko modificirano ''E. coli'' BL21(DE3), s katero so pridobili proizvodni sev. V genom slednjega so integrirali gene, potrebne za proizvodnjo LNFP I, hkrati pa so deaktivirali oziroma delatirali gene, ki sodelujejo v metabolnih poteh, ki bi motile proizvodnjo LNFP I. Vsi vstavljeni geni so bili pod kontrolo konstituivnega promotorja.

Za razgradnjo stranskih produktov in neželenih saharidov proizvodnje LNFP I, so prav tako genetsko modificirali ''E. coli'' BL21(DE3), da so pridobili razgradni sev. Le-ta ima sposobnost razgradnje laktoze do galaktoze in glukoze ter lakto-''N''-triozo II (LNT II) do laktoze ali ''N''-acetilglukozamina (GlcNAc).

Proizvodna in razgradna seva so gojili na ločenih gojiščih z dodatkom mineralni soli in glukoze, ki je vir ogljika, brez antibiotika, pri temperaturi 30°C in pH 7. Fermentacija je potekala v treh fazah: faza eksponentne rasti, dohranjevalna faza in faza razgradnje stranskih produktov. 25 L predhodno pripravljene kulture proizvodnega seva so prenesli v fermentator s 700 L enakega gojišča, kateremu so dodajali glukozo do želene optične gostote (OD600nm = 5). Nato so začeli dodajati laktozo, ki je substrat za sintezo lakto-''N''-tetroze (LNT), do končne koncentracije 5 mM. Pri OD600nm = 20, se je porabila vsa zaloga glukoze. Tako se je začela dohranjevalna faza, dodajanje glukoze in vzdrževanje nasičenosti kisika v fermentacijski juhi. Po 7 urah so v fermentacijski juhi s pomočjo HPLC zasledili prisotnost LNT II, LNT in LNFP I. Po 52 urah so zaustavili fermentacijo z dodatkom razgradnega seva, prav tako pa so prenehali dodajati vir ogljika, da je razgradni sev kot vir ogljika uporabil LNT II in laktozo. V nadaljnjih korakih so očistili LNFP I, prisotnost pa so potrdili z masno spektroskopijo. Sledila je encimska pretvorba očiščenega LNFP I v HBGA tipa A1 in B1 z rekombinantno pripravljanjema encimoma, GTA in GTB (glikoziltransferaza A ali B).

S površinsko plazmonsko resonanco (SPR) so določili zmožnost inhibicije virusnih delcev na površino čipa, ki je prekrit s krvno-skupinskimi antigeni, trisaharidi A (TriA) ali trisaharidi B (TriB). Kot inhibitorje so uporabili fukozo, LNFP I, HBGA B1, HBGA A1, itd. Iz eksperimentov, kjer so uporabili različno koncentracijo inhibitorja, so lahko določili srednjo inhibitorno koncetracijo (IC50). Z metodo ELISA so določali zmožnost laktoze, fukoze in HMO (LNT, 2'FL, LNFP I), da inhibirajo vezavo norovirusov, genotipa GII.17 in GII.4, na mucin iz humane amnijske tekočine ali želodčnega soka.

== ZAKLJUČEK ==
V članku so dokazali zmožnost priprave kompleksnih fukoziliranih HMO v velikem merilu, prav tako pa so dokazali, da je kombinacija fukoziliranih HMO, tako kompleksnih kot preprostih, uspešna pri preprečevanju infekcij z norovirusi, torej bodo lahko fukozilirani HMO služili kot profilaktični ali terapevtski antivirotiki.

== LITERATURA ==
[1] S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” J. Biotechnol., vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001.

[2] M. Tan and X. Jiang, “Histo-blood group antigens: A common niche for norovirus and rotavirus,” Expert Rev. Mol. Med., vol. 16, no. March, 2014, doi: 10.1017/erm.2014.2.

[3] J. Nordgren and L. Svensson, “Genetic susceptibility to human norovirus infection: An update,” Viruses, vol. 11, no. 3, pp. 1–19, 2019, doi: 10.3390/v11030226.

Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi

2021-04-18T09:38:28Z

Akarlek:

Norovirusi so vzrok za približno milijon hudih oblik akutnega gastroenteritisa. V velikem merilu so, s pomočjo ''E. coli'', proizvedli lakto-''N''-fukopentozo (LNFP I), enega izmed humanih mlečnih oligosaharidov (HMO), ki negativno vpliva na vezavo norovirusov na antigene krvnih skupin (angl. histo-blood group antigen, HBGA).

== NOROVIRUSI IN VEZAVA NA HUMANE RECEPTORJE ==
Norovirusi sodijo v družino ''Caliciviridae'', za katere je značilna ikozaedrična kapsida brez ovojnice ter pozitivno usmerjena ssRNA. Genom je organiziran v tri odprte bralne okvirje (ORF), ki zapisujejo proteine kapside. V ORF1 je zapisana glavna strukturna beljakovina VP1, ki ima N-končno S (angl. shell – lupina) domeno in tvori ikozaedrično sredico kapside, ter C-kočno P (angl. protrusion – prodirajoča) domeno, ki deluje kot epitop in sodeluje v vezavi na receptor. ORF2 zapisuje manjšo strukturno beljakovino VP2. Noroviruse delimo v šest genomskih skupin, od GI do GVI, ki povzročajo akutne gastroenteritise pri vseh starostnih skupinah [1].

Norovirusi prepoznajo HBGA kot receptorje za vstop v celice [2]. HBGA so na površini črevesnih celic, najdemo pa jih tudi raztopljene v krvi, želodčnem soku in materinem mleku. Gen ''FUT2'' zapisuje α1,2-fukoziltransferazo, ki katalizira reakcijo vezave fukoze na terminalno galaktozo prekurzorja za H-antigen. Glede ne terminalni ogljikov hidrat na H-antigenu, ki je vezan na glikoprotein oz. glikolipid, delimo HBGA na tip A (''N''-acetilgalaktozamin) in tip B (galaktoza) [3].

Na interakcije med HBGA in norovirusom negativno vplivajo HMO, ki so po strukturi podobni HBGA, zato se norovirusi vežejo nanje. Prav tako, kot HBGA, tudi HMO naravno najdemo v materinem mleku, kar služi kot zaščita novorojenčkov pred norovirusi in posledično diarejo. Poznamo več različnih HMO: 2'-fukozillaktoza (2'FL), lakto-''N''-fukopentoza I (LNFP I), difuzillakto-''N''-heksoza (DFLNH), idr. Vsak HMO ima različno afiniteto do različnega genotipa. LNFP I na primer izkazuje visoko afiniteto do GII.4 Sydney.

== PROIZVODNJA LNFP I ==
Za proizvodnjo in sekrecijo LNFP I so uporabili genetsko modificirano ''E. coli'' BL21(DE3), s katero so pridobili proizvodni sev. V genom slednjega so integrirali gene, potrebne za proizvodnjo LNFP I, hkrati pa so deaktivirali oziroma delatirali gene, ki sodelujejo v metabolnih poteh, ki bi motile proizvodnjo LNFP I. Vsi vstavljeni geni so bili pod kontrolo konstituivnega promotorja.

Za razgradnjo stranskih produktov in neželenih saharidov proizvodnje LNFP I, so prav tako genetsko modificirali ''E. coli'' BL21(DE3), da so pridobili razgradni sev. Le-ta ima sposobnost razgradnje laktoze do galaktoze in glukoze ter lakto-''N''-triozo II (LNT II) do laktoze ali ''N''-acetilglukozamina (GlcNAc).

Proizvodna in razgradna seva so gojili na ločenih gojiščih z dodatkom mineralni soli in glukoze, ki je vir ogljika, brez antibiotika, pri temperaturi 30°C in pH 7. Fermentacija je potekala v treh fazah: faza eksponentne rasti, dohranjevalna faza in faza razgradnje stranskih produktov. 25 L predhodno pripravljene kulture proizvodnega seva so prenesli v fermentator s 700 L enakega gojišča, kateremu so dodajali glukozo do želene optične gostote (OD600nm = 5). Nato so začeli dodajati laktozo, ki je substrat za sintezo lakto-''N''-tetroze (LNT), do končne koncentracije 5 mM. Pri OD600nm = 20, se je porabila vsa zaloga glukoze. Tako se je začela dohranjevalna faza, dodajanje glukoze in vzdrževanje nasičenosti kisika v fermentacijski juhi. Po 7 urah so v fermentacijski juhi s pomočjo HPLC zasledili prisotnost LNT II, LNT in LNFP I. Po 52 urah so zaustavili fermentacijo z dodatkom razgradnega seva, prav tako pa so prenehali dodajati vir ogljika, da je razgradni sev kot vir ogljika uporabil LNT II in laktozo. V nadaljnjih korakih so očistili LNFP I, prisotnost pa so potrdili z masno spektroskopijo. Sledila je encimska pretvorba očiščenega LNFP I v HBGA tipa A1 in B1 z rekombinantno pripravljanjema encimoma, GTA in GTB (glikoziltransferaza A ali B).

S površinsko plazmonsko resonanco (SPR) so določili zmožnost inhibicije virusnih delcev na površino čipa, ki je prekrit s krvno-skupinskimi antigeni, trisaharidi A (TriA) ali trisaharidi B (TriB). Kot inhibitorje so uporabili fukozo, LNFP I, HBGA B1, HBGA A1, itd. Iz eksperimentov, kjer so uporabili različno koncentracijo inhibitorja, so lahko določili srednjo inhibitorno koncetracijo (IC50). Z metodo ELISA so določali zmožnost laktoze, fukoze in HMO (LNT, 2'FL, LNFP I), da inhibirajo vezavo norovirusov, genotipa GII.17 in GII.4, na mucin iz humane amnijske tekočine ali želodčnega soka.

== ZAKLJUČEK ==
V članku so dokazali zmožnost priprave kompleksnih fukoziliranih HMO v velikem merilu, prav tako pa so dokazali, da je kombinacija fukoziliranih HMO, tako kompleksnih kot preprostih, uspešna pri preprečevanju infekcij z norovirusi, torej bodo lahko fukozilirani HMO služili kot profilaktični ali terapevtski antivirotiki.

== LITERATURA ==
[1] S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” J. Biotechnol., vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001.

[2] M. Tan and X. Jiang, “Histo-blood group antigens: A common niche for norovirus and rotavirus,” Expert Rev. Mol. Med., vol. 16, no. March, 2014, doi: 10.1017/erm.2014.2.

[3] J. Nordgren and L. Svensson, “Genetic susceptibility to human norovirus infection: An update,” Viruses, vol. 11, no. 3, pp. 1–19, 2019, doi: 10.3390/v11030226.

Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi

2021-04-18T09:38:10Z

Akarlek:

== UVOD ==
Norovirusi so vzrok za približno milijon hudih oblik akutnega gastroenteritisa. V velikem merilu so, s pomočjo ''E. coli'', proizvedli lakto-''N''-fukopentozo (LNFP I), enega izmed humanih mlečnih oligosaharidov (HMO), ki negativno vpliva na vezavo norovirusov na antigene krvnih skupin (angl. histo-blood group antigen, HBGA).

== NOROVIRUSI IN VEZAVA NA HUMANE RECEPTORJE ==
Norovirusi sodijo v družino ''Caliciviridae'', za katere je značilna ikozaedrična kapsida brez ovojnice ter pozitivno usmerjena ssRNA. Genom je organiziran v tri odprte bralne okvirje (ORF), ki zapisujejo proteine kapside. V ORF1 je zapisana glavna strukturna beljakovina VP1, ki ima N-končno S (angl. shell – lupina) domeno in tvori ikozaedrično sredico kapside, ter C-kočno P (angl. protrusion – prodirajoča) domeno, ki deluje kot epitop in sodeluje v vezavi na receptor. ORF2 zapisuje manjšo strukturno beljakovino VP2. Noroviruse delimo v šest genomskih skupin, od GI do GVI, ki povzročajo akutne gastroenteritise pri vseh starostnih skupinah [1].

Norovirusi prepoznajo HBGA kot receptorje za vstop v celice [2]. HBGA so na površini črevesnih celic, najdemo pa jih tudi raztopljene v krvi, želodčnem soku in materinem mleku. Gen ''FUT2'' zapisuje α1,2-fukoziltransferazo, ki katalizira reakcijo vezave fukoze na terminalno galaktozo prekurzorja za H-antigen. Glede ne terminalni ogljikov hidrat na H-antigenu, ki je vezan na glikoprotein oz. glikolipid, delimo HBGA na tip A (''N''-acetilgalaktozamin) in tip B (galaktoza) [3].

Na interakcije med HBGA in norovirusom negativno vplivajo HMO, ki so po strukturi podobni HBGA, zato se norovirusi vežejo nanje. Prav tako, kot HBGA, tudi HMO naravno najdemo v materinem mleku, kar služi kot zaščita novorojenčkov pred norovirusi in posledično diarejo. Poznamo več različnih HMO: 2'-fukozillaktoza (2'FL), lakto-''N''-fukopentoza I (LNFP I), difuzillakto-''N''-heksoza (DFLNH), idr. Vsak HMO ima različno afiniteto do različnega genotipa. LNFP I na primer izkazuje visoko afiniteto do GII.4 Sydney.

== PROIZVODNJA LNFP I ==
Za proizvodnjo in sekrecijo LNFP I so uporabili genetsko modificirano ''E. coli'' BL21(DE3), s katero so pridobili proizvodni sev. V genom slednjega so integrirali gene, potrebne za proizvodnjo LNFP I, hkrati pa so deaktivirali oziroma delatirali gene, ki sodelujejo v metabolnih poteh, ki bi motile proizvodnjo LNFP I. Vsi vstavljeni geni so bili pod kontrolo konstituivnega promotorja.

Za razgradnjo stranskih produktov in neželenih saharidov proizvodnje LNFP I, so prav tako genetsko modificirali ''E. coli'' BL21(DE3), da so pridobili razgradni sev. Le-ta ima sposobnost razgradnje laktoze do galaktoze in glukoze ter lakto-''N''-triozo II (LNT II) do laktoze ali ''N''-acetilglukozamina (GlcNAc).

Proizvodna in razgradna seva so gojili na ločenih gojiščih z dodatkom mineralni soli in glukoze, ki je vir ogljika, brez antibiotika, pri temperaturi 30°C in pH 7. Fermentacija je potekala v treh fazah: faza eksponentne rasti, dohranjevalna faza in faza razgradnje stranskih produktov. 25 L predhodno pripravljene kulture proizvodnega seva so prenesli v fermentator s 700 L enakega gojišča, kateremu so dodajali glukozo do želene optične gostote (OD600nm = 5). Nato so začeli dodajati laktozo, ki je substrat za sintezo lakto-''N''-tetroze (LNT), do končne koncentracije 5 mM. Pri OD600nm = 20, se je porabila vsa zaloga glukoze. Tako se je začela dohranjevalna faza, dodajanje glukoze in vzdrževanje nasičenosti kisika v fermentacijski juhi. Po 7 urah so v fermentacijski juhi s pomočjo HPLC zasledili prisotnost LNT II, LNT in LNFP I. Po 52 urah so zaustavili fermentacijo z dodatkom razgradnega seva, prav tako pa so prenehali dodajati vir ogljika, da je razgradni sev kot vir ogljika uporabil LNT II in laktozo. V nadaljnjih korakih so očistili LNFP I, prisotnost pa so potrdili z masno spektroskopijo. Sledila je encimska pretvorba očiščenega LNFP I v HBGA tipa A1 in B1 z rekombinantno pripravljanjema encimoma, GTA in GTB (glikoziltransferaza A ali B).

S površinsko plazmonsko resonanco (SPR) so določili zmožnost inhibicije virusnih delcev na površino čipa, ki je prekrit s krvno-skupinskimi antigeni, trisaharidi A (TriA) ali trisaharidi B (TriB). Kot inhibitorje so uporabili fukozo, LNFP I, HBGA B1, HBGA A1, itd. Iz eksperimentov, kjer so uporabili različno koncentracijo inhibitorja, so lahko določili srednjo inhibitorno koncetracijo (IC50). Z metodo ELISA so določali zmožnost laktoze, fukoze in HMO (LNT, 2'FL, LNFP I), da inhibirajo vezavo norovirusov, genotipa GII.17 in GII.4, na mucin iz humane amnijske tekočine ali želodčnega soka.

== ZAKLJUČEK ==
V članku so dokazali zmožnost priprave kompleksnih fukoziliranih HMO v velikem merilu, prav tako pa so dokazali, da je kombinacija fukoziliranih HMO, tako kompleksnih kot preprostih, uspešna pri preprečevanju infekcij z norovirusi, torej bodo lahko fukozilirani HMO služili kot profilaktični ali terapevtski antivirotiki.

== LITERATURA ==
[1] S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” J. Biotechnol., vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001.

[2] M. Tan and X. Jiang, “Histo-blood group antigens: A common niche for norovirus and rotavirus,” Expert Rev. Mol. Med., vol. 16, no. March, 2014, doi: 10.1017/erm.2014.2.

[3] J. Nordgren and L. Svensson, “Genetic susceptibility to human norovirus infection: An update,” Viruses, vol. 11, no. 3, pp. 1–19, 2019, doi: 10.3390/v11030226.

Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi

2021-04-18T09:37:54Z

Akarlek:

== UVOD ==
Norovirusi so vzrok za približno milijon hudih oblik akutnega gastroenteritisa. V velikem merilu so, s pomočjo ''E. coli'', proizvedli lakto-''N''-fukopentozo (LNFP I), enega izmed humanih mlečnih oligosaharidov (HMO), ki negativno vpliva na vezavo norovirusov na antigene krvnih skupin (angl. histo-blood group antigen, HBGA).

== NOROVIRUS IN VEZAVA NA HUMANE RECEPTORJE ==
Norovirusi sodijo v družino ''Caliciviridae'', za katere je značilna ikozaedrična kapsida brez ovojnice ter pozitivno usmerjena ssRNA. Genom je organiziran v tri odprte bralne okvirje (ORF), ki zapisujejo proteine kapside. V ORF1 je zapisana glavna strukturna beljakovina VP1, ki ima N-končno S (angl. shell – lupina) domeno in tvori ikozaedrično sredico kapside, ter C-kočno P (angl. protrusion – prodirajoča) domeno, ki deluje kot epitop in sodeluje v vezavi na receptor. ORF2 zapisuje manjšo strukturno beljakovino VP2. Noroviruse delimo v šest genomskih skupin, od GI do GVI, ki povzročajo akutne gastroenteritise pri vseh starostnih skupinah [1].

Norovirusi prepoznajo HBGA kot receptorje za vstop v celice [2]. HBGA so na površini črevesnih celic, najdemo pa jih tudi raztopljene v krvi, želodčnem soku in materinem mleku. Gen ''FUT2'' zapisuje α1,2-fukoziltransferazo, ki katalizira reakcijo vezave fukoze na terminalno galaktozo prekurzorja za H-antigen. Glede ne terminalni ogljikov hidrat na H-antigenu, ki je vezan na glikoprotein oz. glikolipid, delimo HBGA na tip A (''N''-acetilgalaktozamin) in tip B (galaktoza) [3].

Na interakcije med HBGA in norovirusom negativno vplivajo HMO, ki so po strukturi podobni HBGA, zato se norovirusi vežejo nanje. Prav tako, kot HBGA, tudi HMO naravno najdemo v materinem mleku, kar služi kot zaščita novorojenčkov pred norovirusi in posledično diarejo. Poznamo več različnih HMO: 2'-fukozillaktoza (2'FL), lakto-''N''-fukopentoza I (LNFP I), difuzillakto-''N''-heksoza (DFLNH), idr. Vsak HMO ima različno afiniteto do različnega genotipa. LNFP I na primer izkazuje visoko afiniteto do GII.4 Sydney.

== PROIZVODNJA LNFP I ==
Za proizvodnjo in sekrecijo LNFP I so uporabili genetsko modificirano ''E. coli'' BL21(DE3), s katero so pridobili proizvodni sev. V genom slednjega so integrirali gene, potrebne za proizvodnjo LNFP I, hkrati pa so deaktivirali oziroma delatirali gene, ki sodelujejo v metabolnih poteh, ki bi motile proizvodnjo LNFP I. Vsi vstavljeni geni so bili pod kontrolo konstituivnega promotorja.

Za razgradnjo stranskih produktov in neželenih saharidov proizvodnje LNFP I, so prav tako genetsko modificirali ''E. coli'' BL21(DE3), da so pridobili razgradni sev. Le-ta ima sposobnost razgradnje laktoze do galaktoze in glukoze ter lakto-''N''-triozo II (LNT II) do laktoze ali ''N''-acetilglukozamina (GlcNAc).

Proizvodna in razgradna seva so gojili na ločenih gojiščih z dodatkom mineralni soli in glukoze, ki je vir ogljika, brez antibiotika, pri temperaturi 30°C in pH 7. Fermentacija je potekala v treh fazah: faza eksponentne rasti, dohranjevalna faza in faza razgradnje stranskih produktov. 25 L predhodno pripravljene kulture proizvodnega seva so prenesli v fermentator s 700 L enakega gojišča, kateremu so dodajali glukozo do želene optične gostote (OD600nm = 5). Nato so začeli dodajati laktozo, ki je substrat za sintezo lakto-''N''-tetroze (LNT), do končne koncentracije 5 mM. Pri OD600nm = 20, se je porabila vsa zaloga glukoze. Tako se je začela dohranjevalna faza, dodajanje glukoze in vzdrževanje nasičenosti kisika v fermentacijski juhi. Po 7 urah so v fermentacijski juhi s pomočjo HPLC zasledili prisotnost LNT II, LNT in LNFP I. Po 52 urah so zaustavili fermentacijo z dodatkom razgradnega seva, prav tako pa so prenehali dodajati vir ogljika, da je razgradni sev kot vir ogljika uporabil LNT II in laktozo. V nadaljnjih korakih so očistili LNFP I, prisotnost pa so potrdili z masno spektroskopijo. Sledila je encimska pretvorba očiščenega LNFP I v HBGA tipa A1 in B1 z rekombinantno pripravljanjema encimoma, GTA in GTB (glikoziltransferaza A ali B).

S površinsko plazmonsko resonanco (SPR) so določili zmožnost inhibicije virusnih delcev na površino čipa, ki je prekrit s krvno-skupinskimi antigeni, trisaharidi A (TriA) ali trisaharidi B (TriB). Kot inhibitorje so uporabili fukozo, LNFP I, HBGA B1, HBGA A1, itd. Iz eksperimentov, kjer so uporabili različno koncentracijo inhibitorja, so lahko določili srednjo inhibitorno koncetracijo (IC50). Z metodo ELISA so določali zmožnost laktoze, fukoze in HMO (LNT, 2'FL, LNFP I), da inhibirajo vezavo norovirusov, genotipa GII.17 in GII.4, na mucin iz humane amnijske tekočine ali želodčnega soka.

== ZAKLJUČEK ==
V članku so dokazali zmožnost priprave kompleksnih fukoziliranih HMO v velikem merilu, prav tako pa so dokazali, da je kombinacija fukoziliranih HMO, tako kompleksnih kot preprostih, uspešna pri preprečevanju infekcij z norovirusi, torej bodo lahko fukozilirani HMO služili kot profilaktični ali terapevtski antivirotiki.

== LITERATURA ==
[1] S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” J. Biotechnol., vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001.

[2] M. Tan and X. Jiang, “Histo-blood group antigens: A common niche for norovirus and rotavirus,” Expert Rev. Mol. Med., vol. 16, no. March, 2014, doi: 10.1017/erm.2014.2.

[3] J. Nordgren and L. Svensson, “Genetic susceptibility to human norovirus infection: An update,” Viruses, vol. 11, no. 3, pp. 1–19, 2019, doi: 10.3390/v11030226.

Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi

2021-04-18T09:37:03Z

Akarlek:

== UVOD ==
Norovirusi so vzrok za približno milijon hudih oblik akutnega gastroenteritisa. V velikem merilu so, s pomočjo ''E. coli'', proizvedli lakto-''N''-fukopentozo (LNFP I), enega izmed humanih mlečnih oligosaharidov (HMO), ki negativno vpliva na vezavo norovirusov na antigene krvnih skupin (angl. histo-blood group antigen, HBGA).

== NOROVIRUS IN VEZAVA NA HUMANE RECEPTORJE ==
Norovirusi sodijo v družino ''Caliciviridae'', za katere je značilna ikozaedrična kapsida brez ovojnice ter pozitivno usmerjena ssRNA. Genom je organiziran v tri odprte bralne okvirje (ORF), ki zapisujejo proteine kapside. V ORF1 je zapisana glavna strukturna beljakovina VP1, ki ima N-končno S (angl. shell – lupina) domeno in tvori ikozaedrično sredico kapside, ter C-kočno P (angl. protrusion – prodirajoča) domeno, ki deluje kot epitop in sodeluje v vezavi na receptor. ORF2 zapisuje manjšo strukturno beljakovino VP2. Noroviruse delimo v šest genomskih skupin, od GI do GVI, ki povzročajo akutne gastroenteritise pri vseh starostnih skupinah [1].
Norovirusi prepoznajo HBGA kot receptorje za vstop v celice [2]. HBGA so na površini črevesnih celic, najdemo pa jih tudi raztopljene v krvi, želodčnem soku in materinem mleku. Gen ''FUT2'' zapisuje α1,2-fukoziltransferazo, ki katalizira reakcijo vezave fukoze na terminalno galaktozo prekurzorja za H-antigen. Glede ne terminalni ogljikov hidrat na H-antigenu, ki je vezan na glikoprotein oz. glikolipid, delimo HBGA na tip A (''N''-acetilgalaktozamin) in tip B (galaktoza) [3].
Na interakcije med HBGA in norovirusom negativno vplivajo HMO, ki so po strukturi podobni HBGA, zato se norovirusi vežejo nanje. Prav tako, kot HBGA, tudi HMO naravno najdemo v materinem mleku, kar služi kot zaščita novorojenčkov pred norovirusi in posledično diarejo. Poznamo več različnih HMO: 2'-fukozillaktoza (2'FL), lakto-''N''-fukopentoza I (LNFP I), difuzillakto-''N''-heksoza (DFLNH), idr. Vsak HMO ima različno afiniteto do različnega genotipa. LNFP I na primer izkazuje visoko afiniteto do GII.4 Sydney.

== PROIZVODNJA LNFP I ==
Za proizvodnjo in sekrecijo LNFP I so uporabili genetsko modificirano ''E. coli'' BL21(DE3), s katero so pridobili proizvodni sev. V genom slednjega so integrirali gene, potrebne za proizvodnjo LNFP I, hkrati pa so deaktivirali oziroma delatirali gene, ki sodelujejo v metabolnih poteh, ki bi motile proizvodnjo LNFP I. Vsi vstavljeni geni so bili pod kontrolo konstituivnega promotorja.
Za razgradnjo stranskih produktov in neželenih saharidov proizvodnje LNFP I, so prav tako genetsko modificirali ''E. coli'' BL21(DE3), da so pridobili razgradni sev. Le-ta ima sposobnost razgradnje laktoze do galaktoze in glukoze ter lakto-''N''-triozo II (LNT II) do laktoze ali ''N''-acetilglukozamina (GlcNAc).
Proizvodna in razgradna seva so gojili na ločenih gojiščih z dodatkom mineralni soli in glukoze, ki je vir ogljika, brez antibiotika, pri temperaturi 30°C in pH 7. Fermentacija je potekala v treh fazah: faza eksponentne rasti, dohranjevalna faza in faza razgradnje stranskih produktov. 25 L predhodno pripravljene kulture proizvodnega seva so prenesli v fermentator s 700 L enakega gojišča, kateremu so dodajali glukozo do želene optične gostote (OD600nm = 5). Nato so začeli dodajati laktozo, ki je substrat za sintezo lakto-''N''-tetroze (LNT), do končne koncentracije 5 mM. Pri OD600nm = 20, se je porabila vsa zaloga glukoze. Tako se je začela dohranjevalna faza, dodajanje glukoze in vzdrževanje nasičenosti kisika v fermentacijski juhi. Po 7 urah so v fermentacijski juhi s pomočjo HPLC zasledili prisotnost LNT II, LNT in LNFP I. Po 52 urah so zaustavili fermentacijo z dodatkom razgradnega seva, prav tako pa so prenehali dodajati vir ogljika, da je razgradni sev kot vir ogljika uporabil LNT II in laktozo. V nadaljnjih korakih so očistili LNFP I, prisotnost pa so potrdili z masno spektroskopijo. Sledila je encimska pretvorba očiščenega LNFP I v HBGA tipa A1 in B1 z rekombinantno pripravljanjema encimoma, GTA in GTB (glikoziltransferaza A ali B).
S površinsko plazmonsko resonanco (SPR) so določili zmožnost inhibicije virusnih delcev na površino čipa, ki je prekrit s krvno-skupinskimi antigeni, trisaharidi A (TriA) ali trisaharidi B (TriB). Kot inhibitorje so uporabili fukozo, LNFP I, HBGA B1, HBGA A1, itd. Iz eksperimentov, kjer so uporabili različno koncentracijo inhibitorja, so lahko določili srednjo inhibitorno koncetracijo (IC50). Z metodo ELISA so določali zmožnost laktoze, fukoze in HMO (LNT, 2'FL, LNFP I), da inhibirajo vezavo norovirusov, genotipa GII.17 in GII.4, na mucin iz humane amnijske tekočine ali želodčnega soka.

== ZAKLJUČEK ==
V članku so dokazali zmožnost priprave kompleksnih fukoziliranih HMO v velikem merilu, prav tako pa so dokazali, da je kombinacija fukoziliranih HMO, tako kompleksnih kot preprostih, uspešna pri preprečevanju infekcij z norovirusi, torej bodo lahko fukozilirani HMO služili kot profilaktični ali terapevtski antivirotiki.

== LITERATURA ==
[1] S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” J. Biotechnol., vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001.

[2] M. Tan and X. Jiang, “Histo-blood group antigens: A common niche for norovirus and rotavirus,” Expert Rev. Mol. Med., vol. 16, no. March, 2014, doi: 10.1017/erm.2014.2.

[3] J. Nordgren and L. Svensson, “Genetic susceptibility to human norovirus infection: An update,” Viruses, vol. 11, no. 3, pp. 1–19, 2019, doi: 10.3390/v11030226.

Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi

2021-04-18T09:36:38Z

Akarlek:

== UVOD ==
Norovirusi so vzrok za približno milijon hudih oblik akutnega gastroenteritisa. V velikem merilu so, s pomočjo ''E. coli'', proizvedli lakto-''N''-fukopentozo (LNFP I), enega izmed humanih mlečnih oligosaharidov (HMO), ki negativno vpliva na vezavo norovirusov na antigene krvnih skupin (angl. histo-blood group antigen, HBGA).

== NOROVIRUS IN VEZAVA NA HUMANE RECEPTORJE ==
Norovirusi sodijo v družino ''Caliciviridae'', za katere je značilna ikozaedrična kapsida brez ovojnice ter pozitivno usmerjena ssRNA. Genom je organiziran v tri odprte bralne okvirje (ORF), ki zapisujejo proteine kapside. V ORF1 je zapisana glavna strukturna beljakovina VP1, ki ima N-končno S (angl. shell – lupina) domeno in tvori ikozaedrično sredico kapside, ter C-kočno P (angl. protrusion – prodirajoča) domeno, ki deluje kot epitop in sodeluje v vezavi na receptor. ORF2 zapisuje manjšo strukturno beljakovino VP2. Noroviruse delimo v šest genomskih skupin, od GI do GVI, ki povzročajo akutne gastroenteritise pri vseh starostnih skupinah [1].
Norovirusi prepoznajo HBGA kot receptorje za vstop v celice [2]. HBGA so na površini črevesnih celic, najdemo pa jih tudi raztopljene v krvi, želodčnem soku in materinem mleku. Gen ''FUT2'' zapisuje α1,2-fukoziltransferazo, ki katalizira reakcijo vezave fukoze na terminalno galaktozo prekurzorja za H-antigen. Glede ne terminalni ogljikov hidrat na H-antigenu, ki je vezan na glikoprotein oz. glikolipid, delimo HBGA na tip A (''N''-acetilgalaktozamin) in tip B (galaktoza) [3].
Na interakcije med HBGA in norovirusom negativno vplivajo HMO, ki so po strukturi podobni HBGA, zato se norovirusi vežejo nanje. Prav tako, kot HBGA, tudi HMO naravno najdemo v materinem mleku, kar služi kot zaščita novorojenčkov pred norovirusi in posledično diarejo. Poznamo več različnih HMO: 2'-fukozillaktoza (2'FL), lakto-''N''-fukopentoza I (LNFP I), difuzillakto-''N''-heksoza (DFLNH), idr. Vsak HMO ima različno afiniteto do različnega genotipa. LNFP I na primer izkazuje visoko afiniteto do GII.4 Sydney.

== PROIZVODNJA LNFP I ==
Za proizvodnjo in sekrecijo LNFP I so uporabili genetsko modificirano ''E. coli'' BL21(DE3), s katero so pridobili proizvodni sev. V genom slednjega so integrirali gene, potrebne za proizvodnjo LNFP I, hkrati pa so deaktivirali oziroma delatirali gene, ki sodelujejo v metabolnih poteh, ki bi motile proizvodnjo LNFP I. Vsi vstavljeni geni so bili pod kontrolo konstituivnega promotorja.
Za razgradnjo stranskih produktov in neželenih saharidov proizvodnje LNFP I, so prav tako genetsko modificirali ''E. coli'' BL21(DE3), da so pridobili razgradni sev. Le-ta ima sposobnost razgradnje laktoze do galaktoze in glukoze ter lakto-''N''-triozo II (LNT II) do laktoze ali ''N''-acetilglukozamina (GlcNAc).
Proizvodna in razgradna seva so gojili na ločenih gojiščih z dodatkom mineralni soli in glukoze, ki je vir ogljika, brez antibiotika, pri temperaturi 30°C in pH 7. Fermentacija je potekala v treh fazah: faza eksponentne rasti, dohranjevalna faza in faza razgradnje stranskih produktov. 25 L predhodno pripravljene kulture proizvodnega seva so prenesli v fermentator s 700 L enakega gojišča, kateremu so dodajali glukozo do želene optične gostote (OD600nm = 5). Nato so začeli dodajati laktozo, ki je substrat za sintezo lakto-''N''-tetroze (LNT), do končne koncentracije 5 mM. Pri OD600nm = 20, se je porabila vsa zaloga glukoze. Tako se je začela dohranjevalna faza, dodajanje glukoze in vzdrževanje nasičenosti kisika v fermentacijski juhi. Po 7 urah so v fermentacijski juhi s pomočjo HPLC zasledili prisotnost LNT II, LNT in LNFP I. Po 52 urah so zaustavili fermentacijo z dodatkom razgradnega seva, prav tako pa so prenehali dodajati vir ogljika, da je razgradni sev kot vir ogljika uporabil LNT II in laktozo. V nadaljnjih korakih so očistili LNFP I, prisotnost pa so potrdili z masno spektroskopijo. Sledila je encimska pretvorba očiščenega LNFP I v HBGA tipa A1 in B1 z rekombinantno pripravljanjema encimoma, GTA in GTB (glikoziltransferaza A ali B).
S površinsko plazmonsko resonanco (SPR) so določili zmožnost inhibicije virusnih delcev na površino čipa, ki je prekrit s krvno-skupinskimi antigeni, trisaharidi A (TriA) ali trisaharidi B (TriB). Kot inhibitorje so uporabili fukozo, LNFP I, HBGA B1, HBGA A1, itd. Iz eksperimentov, kjer so uporabili različno koncentracijo inhibitorja, so lahko določili srednjo inhibitorno koncetracijo (IC50). Z metodo ELISA so določali zmožnost laktoze, fukoze in HMO (LNT, 2'FL, LNFP I), da inhibirajo vezavo norovirusov, genotipa GII.17 in GII.4, na mucin iz humane amnijske tekočine ali želodčnega soka.

== ZAKLJUČEK ==
V članku so dokazali zmožnost priprave kompleksnih fukoziliranih HMO v velikem merilu, prav tako pa so dokazali, da je kombinacija fukoziliranih HMO, tako kompleksnih kot preprostih, uspešna pri preprečevanju infekcij z norovirusi, torej bodo lahko fukozilirani HMO služili kot profilaktični ali terapevtski antivirotiki.

== LITERATURA ==
[1] S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” J. Biotechnol., vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001.
[2] M. Tan and X. Jiang, “Histo-blood group antigens: A common niche for norovirus and rotavirus,” Expert Rev. Mol. Med., vol. 16, no. March, 2014, doi: 10.1017/erm.2014.2.
[3] J. Nordgren and L. Svensson, “Genetic susceptibility to human norovirus infection: An update,” Viruses, vol. 11, no. 3, pp. 1–19, 2019, doi: 10.3390/v11030226.

Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi

2021-04-18T09:36:02Z

Akarlek: New page: == UVOD == Norovirusi so vzrok za približno milijon hudih oblik akutnega gastroenteritisa. V velikem merilu so, s pomočjo ''E. coli'', proizvedli lakto-''N''-fukopentozo (LNFP I), enega ...

== UVOD ==
Norovirusi so vzrok za približno milijon hudih oblik akutnega gastroenteritisa. V velikem merilu so, s pomočjo ''E. coli'', proizvedli lakto-''N''-fukopentozo (LNFP I), enega izmed humanih mlečnih oligosaharidov (HMO), ki negativno vpliva na vezavo norovirusov na antigene krvnih skupin (angl. histo-blood group antigen, HBGA).

== NOROVIRUS IN VEZAVA NA HUMANE RECEPTORJE ==
Norovirusi sodijo v družino ''Caliciviridae'', za katere je značilna ikozaedrična kapsida brez ovojnice ter pozitivno usmerjena ssRNA. Genom je organiziran v tri odprte bralne okvirje (ORF), ki zapisujejo proteine kapside. V ORF1 je zapisana glavna strukturna beljakovina VP1, ki ima N-končno S (angl. shell – lupina) domeno in tvori ikozaedrično sredico kapside, ter C-kočno P (angl. protrusion – prodirajoča) domeno, ki deluje kot epitop in sodeluje v vezavi na receptor. ORF2 zapisuje manjšo strukturno beljakovino VP2. Noroviruse delimo v šest genomskih skupin, od GI do GVI, ki povzročajo akutne gastroenteritise pri vseh starostnih skupinah [1].
Norovirusi prepoznajo HBGA kot receptorje za vstop v celice [2]. HBGA so na površini črevesnih celic, najdemo pa jih tudi raztopljene v krvi, želodčnem soku in materinem mleku. Gen ''FUT2'' zapisuje α1,2-fukoziltransferazo, ki katalizira reakcijo vezave fukoze na terminalno galaktozo prekurzorja za H-antigen. Glede ne terminalni ogljikov hidrat na H-antigenu, ki je vezan na glikoprotein oz. glikolipid, delimo HBGA na tip A (''N''-acetilgalaktozamin) in tip B (galaktoza) [3].
Na interakcije med HBGA in norovirusom negativno vplivajo HMO, ki so po strukturi podobni HBGA, zato se norovirusi vežejo nanje. Prav tako, kot HBGA, tudi HMO naravno najdemo v materinem mleku, kar služi kot zaščita novorojenčkov pred norovirusi in posledično diarejo. Poznamo več različnih HMO: 2'-fukozillaktoza (2'FL), lakto-''N''-fukopentoza I (LNFP I), difuzillakto-''N''-heksoza (DFLNH), idr. Vsak HMO ima različno afiniteto do različnega genotipa. LNFP I na primer izkazuje visoko afiniteto do GII.4 Sydney.

== PROIZVODNJA LNFP I ==
Za proizvodnjo in sekrecijo LNFP I so uporabili genetsko modificirano ''E. coli'' BL21(DE3), s katero so pridobili proizvodni sev. V genom slednjega so integrirali gene, potrebne za proizvodnjo LNFP I, hkrati pa so deaktivirali oziroma delatirali gene, ki sodelujejo v metabolnih poteh, ki bi motile proizvodnjo LNFP I. Vsi vstavljeni geni so bili pod kontrolo konstituivnega promotorja.
Za razgradnjo stranskih produktov in neželenih saharidov proizvodnje LNFP I, so prav tako genetsko modificirali ''E. coli'' BL21(DE3), da so pridobili razgradni sev. Le-ta ima sposobnost razgradnje laktoze do galaktoze in glukoze ter lakto-''N''-triozo II (LNT II) do laktoze ali ''N''-acetilglukozamina (GlcNAc).
Proizvodna in razgradna seva so gojili na ločenih gojiščih z dodatkom mineralni soli in glukoze, ki je vir ogljika, brez antibiotika, pri temperaturi 30°C in pH 7. Fermentacija je potekala v treh fazah: faza eksponentne rasti, dohranjevalna faza in faza razgradnje stranskih produktov. 25 L predhodno pripravljene kulture proizvodnega seva so prenesli v fermentator s 700 L enakega gojišča, kateremu so dodajali glukozo do želene optične gostote (OD600nm = 5). Nato so začeli dodajati laktozo, ki je substrat za sintezo lakto-''N''-tetroze (LNT), do končne koncentracije 5 mM. Pri OD600nm = 20, se je porabila vsa zaloga glukoze. Tako se je začela dohranjevalna faza, dodajanje glukoze in vzdrževanje nasičenosti kisika v fermentacijski juhi. Po 7 urah so v fermentacijski juhi s pomočjo HPLC zasledili prisotnost LNT II, LNT in LNFP I. Po 52 urah so zaustavili fermentacijo z dodatkom razgradnega seva, prav tako pa so prenehali dodajati vir ogljika, da je razgradni sev kot vir ogljika uporabil LNT II in laktozo. V nadaljnjih korakih so očistili LNFP I, prisotnost pa so potrdili z masno spektroskopijo. Sledila je encimska pretvorba očiščenega LNFP I v HBGA tipa A1 in B1 z rekombinantno pripravljanjema encimoma, GTA in GTB (glikoziltransferaza A ali B).
S površinsko plazmonsko resonanco (SPR) so določili zmožnost inhibicije virusnih delcev na površino čipa, ki je prekrit s krvno-skupinskimi antigeni, trisaharidi A (TriA) ali trisaharidi B (TriB). Kot inhibitorje so uporabili fukozo, LNFP I, HBGA B1, HBGA A1, itd. Iz eksperimentov, kjer so uporabili različno koncentracijo inhibitorja, so lahko določili srednjo inhibitorno koncetracijo (IC50). Z metodo ELISA so določali zmožnost laktoze, fukoze in HMO (LNT, 2'FL, LNFP I), da inhibirajo vezavo norovirusov, genotipa GII.17 in GII.4, na mucin iz humane amnijske tekočine ali želodčnega soka.

== ZAKLJUČEK ==
V članku so dokazali zmožnost priprave kompleksnih fukoziliranih HMO v velikem merilu, prav tako pa so dokazali, da je kombinacija fukoziliranih HMO, tako kompleksnih kot preprostih, uspešna pri preprečevanju infekcij z norovirusi, torej bodo lahko fukozilirani HMO služili kot profilaktični ali terapevtski antivirotiki.

MBT seminarji 2021

2021-04-17T09:19:45Z

Akarlek:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.) 
# An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)
# Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse (H. Li ''et. al''; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117(52), 2021; https://doi.org/10.1073/pnas.2003991117). [[Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.]] Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. (T. Walter ''et. al.''; Microorganisms 8(6), 2020; https://doi.org/10.3390/microorganisms8060866). [[Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum]]. Saša Slabe (14.4.)
# Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from ''Pseudomonas nitroreducens'' Jin1. (Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5). [[Učinkovita biosinteza vanilina iz izoevgenola z uporabo rekombinantne izoevgenol monooksigenaze Jin1 iz bakterije Pseudomonas nitroreducens]]. Luka Gnidovec (15.4.)
# One-pot production of butyl butyrate from glucose using a cognate “diamond-shaped” ''E. coli'' consortium (J. P. Sinumvayo "et. al"; Bioresources and Bioprocessing 8, 2021; https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-021-00372-8#Sec9). [[Proizvodnja butil butirata iz glukoze z uporabo "diamantnega" konzorcija E. coli]] Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors (S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” ''J. Biotechnol.'', vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001). [[Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi]] Anže Karlek (21.4.)
# Ana Maklin (22.4.)
# Urban Hribar (22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Urška Fajdiga (5.5.)
# Mirsad Mešić (6.5.)
# Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Jerneja Nimac (12.5.)
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Klementina Polanec (13.5.)
# Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Željka Erić (19.5.)
# Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Katja Doberšek (20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# Almina Tahirović (26.5.)
# Eva Keber (27.5.)
# Nina Lukančič (27.5.)

MBT seminarji 2021

2021-04-17T09:17:50Z

Akarlek:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.) 
# An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)
# Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse (H. Li ''et. al''; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117(52), 2021; https://doi.org/10.1073/pnas.2003991117). [[Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.]] Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. (T. Walter ''et. al.''; Microorganisms 8(6), 2020; https://doi.org/10.3390/microorganisms8060866). [[Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum]]. Saša Slabe (14.4.)
# Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from ''Pseudomonas nitroreducens'' Jin1. (Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5). [[Učinkovita biosinteza vanilina iz izoevgenola z uporabo rekombinantne izoevgenol monooksigenaze Jin1 iz bakterije Pseudomonas nitroreducens]]. Luka Gnidovec (15.4.)
# One-pot production of butyl butyrate from glucose using a cognate “diamond-shaped” ''E. coli'' consortium (J. P. Sinumvayo "et. al"; Bioresources and Bioprocessing 8, 2021; https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-021-00372-8#Sec9). [[Proizvodnja butil butirata iz glukoze z uporabo "diamantnega" konzorcija E. coli]] Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors (S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” ''J. Biotechnol.'', vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001.). [[Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi]] Anže Karlek (21.4.)
# Ana Maklin (22.4.)
# Urban Hribar (22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Urška Fajdiga (5.5.)
# Mirsad Mešić (6.5.)
# Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Jerneja Nimac (12.5.)
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Klementina Polanec (13.5.)
# Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Željka Erić (19.5.)
# Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Katja Doberšek (20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# Almina Tahirović (26.5.)
# Eva Keber (27.5.)
# Nina Lukančič (27.5.)

Molekularnobiološke značilnosti SARS-CoV-2 in aktualni mutanti (južnoafriški, britanski, nigerijski,...)

2021-03-10T18:09:23Z

Akarlek:

<h3>Molekularne značilnosti SARS-CoV-2</h3>

Koronavirusi (CoV) sodijo v družino ''Coronaviridae'', ki se deli na štiri skupine: ''Alphacoronavirus'', ''Gammacoronavirus'', ''Deltacoronavirus'' in ''Betacoronavirus'', kamor uvrščamo SARS-CoV-2, ki povzroča koronavirusno bolezen oziroma COVID-19. Pri človeku povzročata bolezni skupin alfa in beta. Povzročajo dihalna obolenja pri ljudeh in gastrointestinalna obolenja pri živalih. Pri ljudeh so simptomi v glavnem blagi, z izjemoma pri imunokopromitiranih osebah kjer se lahko razvije pljučnica ali bronhitis. Vse do prve epidemije leta 2003, povzročene s strani SARS-CoV, so okužbe s koronavirusi veljale za nesmrtonosne. CoV je prešel preko direktnega kontakta iz živali, netopirjev, na človeka – torej gre za zoonotski prenos.

'''Struktura genoma SARS-CoV-2'''

Genom SARS-CoV-2 je enovijačna, pozitivno usmerjena RNA, dolga 29 903 nt, in zapisuje ~ 14 odprtih bralnih okvirjev – ORF ter ~ 29 proteinov. RNA zapis vsebuje 3' in 5' neprevajajoči regiji, 5'-kapo in poli(A)-rep na 3' koncu. Na 5' koncu se nahaja ORF1a/b, ki znaša približno dve tretjini celotne dolžine genoma ter zapisuje poliprotein 1a (pp1a) in poliprotein 1ab (pp1ab). Ostali ORF-ji, ki se nahajajo na 3' koncu zapisujejo strukturne proteine: protein bodice (S), membranski protein (M), proteini ovojnice (E) in proteini nukleokapside (N). Po vstopu viriona v tarčno celico se genomska RNA takoj prevede v dva polipretina 1a in 1ab, ki se procesirata v 16 nestrukturnih proteinov, ki skupaj tvorijo replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki se nahaja v dvojno-membranskih veziklih. Nastali kompleks vzame pozitivno usmerjeno genomsko RNA kot matrico za sintezo nove negativno usmerjene RNA, ki lahko služi kot matrica za transkripcijo pozitivno usmerjene subgenomske mRNA ali kot matrica za replikacijo genomske RNA. V zapisu za subgenomsko mRNA najdemo START kodon, zaporedje AUG, sam zapis pa po dolžini ni enak genomski RNA in služi kot mRNA za sintezo virusnih proteinov, ki se ne nahajajo v ORF1a/b. Če primerjamo genom SARS-CoV-2 z ostalimi koronavirus opazimo 54 % identičnost.

'''Protein S'''

Glikoprotein, ki je ključen v patogenezi SARS-CoV-2, saj se preko receptor vezavne domene RBD, na podenoti S1, veže na ACE2, ki je na gostiteljski celici. Regija RBD velja za najbolj variabilen dela SARS-CoV-2. Celoten protein je zgrajen iz 1273 aminokislinskih ostankov in sestavljen iz treh podenot: S1, S2 in S2'. Podenota S1 je vključena v pritrditev viriona na gostiteljsko celico preko ACE2, sledi vstop virona v celico. Med vstopanjem v celico pride do konformacijskih sprememb proteina S. Podenota S2 sodeluje pri fuziji viriona in membrane tarčne celice. Tekom tega procesa se podenota S2 nahaja v treh različnih konformacijah. Podenota S2' proteolitično cepi vez med podenotama S1 in S2.

<h3>Aktualne mutante in njihov pomen</h3>

Pri podvojevanju virusov stalno prihaja do napak, ki se zaradi odsotnosti popravljalnih mehanizmov ne popravijo in vodijo v mutacije, s tem pa v nastajanje novih sevov, ki imajo lahko pomembne implikacije za globalno zdravstvo. Nove porajajoče mutante SARS-CoV-2 se lahko hitreje širijo med ljudmi, lahko povzročajo spremenjeno obliko bolezni, se izognejo nekaterim diagnostičnim testom in zmanjšajo učinkovitost tarčnih zdravil in/ali cepiv. Virus SARS-CoV-2 sodi med viruse z dednim zapisov v obliki RNA, za katere je značilno, da pridobijo cca. eno napako na cikel podvojevanja. Koronavirusi sicer zaradi prisotnosti popravljalnega encima eksoribonukleaze mutirajo s ½ hitrostjo virusa gripe in ¼ hitrost virusa HIV. V januarju 2020 se je pojavila mutacija D614G, ki se je hitro razširila po svetu in do junija 2020 nadomestila prvi identificirani sev na Kitajskem, katerega izvor še ni natančno preučen. Ta mutacija omogoča hitrejše in učinkovitejše pritrjevanje virusa na receptor na človeških celicah.

Britanski sev se je pojavil septembra 2020 v Angliji in je povezan s hitrejšim širjenjem bolezni, ki pa ne poteka v težji obliki. Sev definira 23 mutacij, od katerih je najpomembnejša N501Y na mestu, kjer se protein S povezuje z receptorjem ACE2 in povzroči boljše povezovanje in tako večjo verjetnost okužbe. Druge pomembne mutacije so še del69/70, ki prav tako spremeni interakcijo z ACE2, in P681H, ki pripomore k hitrejšemu nastajanju proteina S v celicah.

Južnoafriški sev se je prvič pojavil v oktobru 2020. Trenutno ni dokazov, ki bi kazali da je povezan s težjim potekom bolezni, vendar pa se zaradi mutacij v regiji za vezavo na receptor lahko izogne protitelesom. Poleg mutacije N501Y, ki je enaka kot pri britanskem sevu, ima še dve pomembni mutaciji v regiji, ki se povezuje z receptorjem – K417N in E484K. Kombinacija teh mutacij spremeni obliko vezavnega dela in poveča možnost za pobeg imunskemu sistemu.

Brazilski sev so prvič karakterizirali v januarju 2021 in ima 17 unikatnih mutacij, najbolj značilne pa so mutacije, ki so prisotne tudi pri drugih sevih – K417T, E484K in N501Y. Različica je zelo podobna južnoafriškemu sevu in ima spremenjeno vezavo na receptor ACE2, hkrati pa analize kažejo večjo možnost ponovne infekcije s tem virusom po že preboleli bolezni.

Nigerijski sev so prvič odkrili avgusta 2020. Zanj je značilna mutacija P681H, ki je prisotna tudi pri britanskem sevu, a nima nobene druge mutacije značilne za britansko varianto. Trenutno ni nobenih dokazov, da bi se ta sev širil hitreje, povzročal težjo bolezen ali vplival na delovanje cepiv.

Protikovidna cepiva

2021-03-09T21:44:18Z

Akarlek:

študentski seminar pri predmetu Molekularna biotehnologija 2020/21 
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo 
Magistrski študij Biokemija 

Seminar pripravljajo študentje 1. in 2. letnika magistrskega študija. Kratki povzetki morajo biti napisani na taki ravni zahtevnosti, da so razumljivi širši javnosti. Predstavitve seminarjev (6 oz. 12 minut) imajo splošen uvod in strokovno nadaljevanje. Vsebina temelji na javno dostopnih podatkih v času priprave seminarja. Po zadnji seminarski predstavitvi bomo predvidoma izdali zbornih povzetkov, ki bo vključeval tudi slikovne razlage. Poleg tega seminarja morajo študentje pripraviti tudi daljšo predstavitev teme iz znanstvene literature.

Razpored predstavitev:

# [[Molekularnobiološke značilnosti SARS-CoV-2 in aktualni mutanti (južnoafriški, britanski, nigerijski,...)]] - 11.3. (12 min) 
# [[Interakcija SARS-CoV-2 s tarčno celico]] - 11.3. (6 min) 
# Značilnosti cepiva proizvajalca Moderna (mRNA) - 18.3. (12 min) 
# Rezultati kliničnih testiranj cepiva proizvajalca Moderna (mRNA) - 18.3.(6 min) 
# Značilnosti cepiva proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1) - 25.3. (12 min) 
# Rezultati kliničnih testiranj proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1) - 25.3. 
# Značilnosti cepiva proizvajalca Pfizer / BioNTech (mRNA) - 1.4. 
# Rezultati kliničnih testiranj cepiva proizvajalca Pfizer / BioNTech (mRNA) - 1.4. 
# Značilnosti cepiva proizvajalca Johnson&Johnson / Jennsen (Ad26) - 8.4. 
# Opuščena cepiva: Merck (IAVI, Themix), Imperial College London, Univ. of Queensland - 8.4. 
# Značilnosti cepiva Sputnik V (Gamaleya) (Ad26, Ad5) - 15.4. 
# Značilnosti cepiva CanSino (Ad5) - 15.4. 
# Značilnosti cepiv Sinopharm in Sinovac (inaktivirano) - 22.4. 
# Značilnosti cepiva Bharat Biotech (inaktivirano) - 22.4. 
# Značilnosti cepiva Novavax (proteinsko) - 6.5. 
# Značilnosti cepiva Vector Institute (proteinsko) - 6.5. 
# Značilnosti cepiva EpiVacCorona (peptidno) - 13.5. 
# Značilnosti cepiva Zyadus Cadilla (DNA) - 13.5. 
# Značilnosti cepiva COVAXX / UBI (peptidno) - 20.5.

BNT-seminar

2021-03-08T17:21:04Z

Akarlek:

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019057 
30170131 
30170078 
30170177 
30170103 
30170002 
30200319 
30200309 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
23.3.2021 
20.4.2020 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Martin Špendl 
Martina Lokar 
Doroteja Armič 
Martin Špendl 
Saša Slabe 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Jernej Imperl 
Mateja Žvipelj 
Neža Pavko 
Almina Tahirović 
Nika Mikulič Vernik 
|-

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BNT-seminar

2021-03-08T17:20:30Z

Akarlek:

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019057 
30170131 
30170078 
30170177 
30170103 
30170002 
30200319
30200309
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
23.3.2021
20.4.2020
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Martin Špendl 
Martina Lokar 
Doroteja Armič 
Martin Špendl
Saša Slabe
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Jernej Imperl 
Mateja Žvipelj 
Neža Pavko 
Almina Tahirović
Nika Mikulič Vernik
|-

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.