Wiki FKKT - User contributions [en]

Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli

2021-04-05T21:50:17Z

Aljaž Bratina:

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41467-021-21135-1 Lin, DW., Liu, Y., Lee, YQ. et al. Construction of intracellular asymmetry and asymmetric division in ''Escherichia coli''. Nat Commun 12, 888 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-21135-1]
== Uvod ==
Asimetrična delitev celice je delitev, pri kateri nastaneta dve hčerinski celici, ki nimata enakih lastnosti. Med njima so lahko prisotne razlike v obliki in velikosti ter razporeditvi makromolekul in organelov. Ta pojav je značilen tako za nekatere prokariontske kot nekatere evkariontske celice. Asimetrično se delijo npr. človeške matične celice – nastane ena nova matična celica in ena celica, ki se bo diferencirala – pa tudi nekatere bakterije, npr. ''Caulobacter crescentus''. Da je delitev asimetrična, mora biti že pred njo v materinski celici vzpostavljena asimetrija oz. mora priti do polarizacije celice. To pomeni, da določeni celični mehanizmi poskrbijo za neenako razporeditev makromolekul v celici. Do tega lahko pride zaradi zunanjih ali notranjih dejavnikov [1].

== Celični mehanizmi za zagotavljanje asimetričnosti ==
Mehanizem doseganja asimetričnosti in proteinskega gradienta vključuje različne proteinske enote in interakcije med njimi. Mednje spadajo oligomerizacija proteinov in regulacije njihove difuzije. Nekatere od teh lastnosti so že okarakterizirane, mnoge pa še ne [1].

Pri polarizaciji evkariontske celice so ključni proteini PAR (angl. ''partitioning-defective proteins''). Mednje spadajo ogrodni proteini, ki služijo kot prijemališča za različne efektorske encime, včasih pa njihovo povezavo omogočajo tudi adaptorski proteini. Ključna posebnost proteinov PAR je, da na celični membrani oz. v njeni bližini tvorijo diskretne membranske domene, sestavljene iz določenih proteinov PAR, te pa so različne v posameznih delih celic – npr. na polih paličaste bakterijske celice. Pogosto neka skupina proteinov PAR izključuje drugo – torej izražanje ene skupine PAR na neki membranski domeni onemogoča nahajanje druge skupine PAR na istem mestu [2].

PopZ (angl. ''polar organizing protein'') je protein, ki ima osrednjo vlogo pri doseganju asimetričnosti bakterije ''Caulobacter crescentus''. Po nastanku najprej po celici prosto difundira, nato pa homooligomerizira in se usidra na enega izmed njenih polov. Tam deluje kot središče za interakcije z mnogimi drugimi proteini. Je intrinzično nestrukturiran protein z izjemo krajšega motiva, ki omogoča pripenjanje drugih proteinov [3].

Za asimetričnost pri Bacillus subtilis je najbolj pomemben protein DivIVA. Nahaja se predvsem v bližini negativno ukrivljenih membran. V paličasti obliki celice sta to predvsem njena pola. Zaenkrat ni točno znano, na kakšen način protein prepozna ukrivljenost, niti ni natančno poznana njegova struktura [4].

Za boljše razumevanje teh interakcij je uporaben sinteznobiološki pristop. ''E. coli'' je bakterija, ki se običajno deli simetrično. Z njenim manipuliranjem lahko ugotovimo, kateri so minimalni genetski elementi, ki določajo želen fenotip – asimetrično delitev celice. To naredimo tako, da gene iz drugih organizmov, ki ta pojav regulirajo, vnesemo v ''E. coli'', saj tako nanje ne vpliva morebitna intrinzična regulacija [5].

== Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri ''E. coli'' ==
=== PopZ kot ogrodni protein za lokalizacijo efektorskih proteinov ===
Raziskovalci so asimetričnost celice ''E. coli'' najprej poskušali doseči z vnosom gena za protein PopZ. Da bi ga lahko zasledovali, so uporabili fuzijo z rdečim fluorescirajočim proteinom (mRFP-PopZ). Uporabili so ti. Andersonov promotor J23116, ki je eden izmed standardnih bioloških delov [6]. Izražanje gena s tem promotorjem je zmerno intenzivno, sintetiziran protein pa se nahaja le na enem polu celice v jasno definiranem območju z ostro mejo. Po celični delitvi se ves izražen PopZ nahaja zgolj v eni celici – tisti, ki je nastala iz ustreznega pola. Pri uporabi skrajšane različice PopZ, ki ne vsebuje C-končne domene, pomembne za oligomerizacijo proteina, je protein po izražanju razporejen po celotni celici in se pri delitvi enakomerno razdeli med hčerinski celici. Protein PopZ torej lahko povzroči asimetričnost celice, za kar pa je nujno potrebna njegova oligomerizacija [5].

PopZ v ''C. crescentus'' deluje kot ogrodje za pripenjanje ostalih proteinov in tako zagotavlja njihovo asimetrično porazdelitev. Cilj nadaljevanja raziskave je bil ugotoviti, ali tako funkcijo lahko protein ohrani tudi v ''E. coli''. Eden izmed proteinov, ki se vežejo na PopZ je SpmX, ta pa potem deluje kot adaptor za nadaljnjo vezavo drugih proteinov. Aktivna je že njegova skrajšana oblika SpmXΔC, ki vsebuje N-končen del [7]. Pri izražanju proteina SpmXΔC s fuzijskim reporterjem sfGFP (zeleni fluorescirajoči protein) in konstrukta mRFP-PopZ pride do prekrivanja fluorescence reporterjev na enem izmed polov celice. Proteina torej kolokalizirata, kar dokazuje, da interagirata in PopZ tudi v ''E. coli'' ohrani ogrodno funkcijo za vezavo ostalih proteinov [5].

Adaptor SpmX lahko služi za vezavo nekega efektorskega proteina z encimsko aktivnostjo. V takem primeru je izražena funkcija ogrodnega proteina PopZ, da omogoči funkcionalnost nekemu efektorskemu proteinu zgolj na enem izmed polov celic. Za preučevanje možnosti tega procesa v ''E. coli'' je bila kot efektor izbrana RNA-polimeraza T7 oz. njena optimizirana oblika. Uporabljena RNA-polimeraza je bila razdeljena na dva dela, N-končni in C-končni, na vsakega od teh pa je bil v vseh poskusih pripet adaptor SpmXΔC. Raziskovalci so želeli potrditi hipotezo, da lahko lokalizacija obeh delov na celičnem polu privede obe polovici dovolj skupaj, da je polimeraza aktivna. Predhodno so v raziskavi izražali vsako polovico RNA-polimeraze T7 s fuziranim SpmXΔC in reporterjem sfGFP posebej (konstrukta N-RNAP-sfGFP-SpmXΔC oz. SpmXΔC-sfGFP-C-RNAP), toda hkrati z mRFP-PopZ. S poskusom so pokazali, da tudi taka konstrukta protein PopZ pričakovano uspešno prostorsko omeji le na en celični pol [5].

=== Zasnova ustreznih genetskih vezij ===
V osrednjem delu raziskave so bila zasnovana tri genetska vezja, vsako predstavlja nadgradnjo prejšnjega. Prvo genetsko vezje vsebuje naslednje elemente: gen za konstrukt mRFP-PopZ z Andersonovim promotorjem, zapisa za fuziji adaptorja SpmXΔC s posameznim delom RNA-polimeraze T7 (''eT7pN-spmXN'' oz. ''spmXN-eT7PC'') s promotorjem ''Ptac'', gen za reporter sfGFP s promotorjem ''PT7'' in zapis za represor Lac s svojim promotorjem. Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V bakterijah s prvim vezjem, ko je izražen tudi mRFP-PopZ, je zelena fluorescenca bistveno intenzivnejša kot v kontrolnem poskusu. To pomeni, da je prišlo do uspešnega sestavljanja RNA-polimeraze T7 in izražanja gena sfGFP, ki ima promotor, na katerega se veže obravnavna polimeraza. Poskus jasno pokaže tudi, da je RNA-polimeraza T7 lokalizirana na polu bakterije, torej tam deluje, kar pomeni da lahko ogrodni sistem z osrednjim proteinom PopZ uspešno zasidra efektorske encime na polu celice [5].

Pri uporabi prvega genetskega vezja produkt sfGFP prosto difundira po celici, torej ta sistem kljub nahajanju na celičnem polu ne omogoča asimetrične razporeditve ostalih proteinov, ki nastanejo kasneje v sintezni poti. Da bi asimetrijo dosegli, so raziskovalci skonstruirali prilagojeno, drugo genetsko vezje. Njegov pomemben element je protein DivIVA. Predhodno so v raziskavi pokazali, da se sam protein DivIVA v obliki fuzije z reporterjem sfGPF nahaja na obeh polih celice ''E. coli'', ne pa prosto po celici, kar je potrditev tega, da prepozna negativno ukrivljeno membrano. Pokazano je bilo tudi, da se proteina DivIVA in PopZ ne izključujeta. To pomeni, da se ob skupnem izražanju mRFP-PopZ in DivIVA-sfGFP prvi pričakovano nahaja na enem polu celice, DivIVA pa na obeh, tako kot če bi bila izražena vsak posebej, in se prostorsko ne ovirata [5].

V prvem genetskem vezju je bil kot reporter izbran gen za sfGFP, ki prosto difundira, v drugem pa sfGFP, vezan na DivIVA (DivIVA-sfGFP). Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V bakterijah z drugim vezjem je zelena fluorescenca bistveno bolj intenzivna na enem polu, tistem, na katerem je lokalizirana tudi RNA-polimeraza T7 (vidna kot rdeča fluorescenca zaradi posredne vezave na mRFP-PopZ). V kontrolnem poskusu je zelena fluorescenca zanemarljiva. Dodatni poskusi so pokazali tudi, da je difuzijski koeficient konstrukta DivIVA-sfGFP manjši kot od samega sfGFP, torej zadnji lažje difundira. Celostno so torej rezultati potrdili, da pri uporabi drugega vezja pride do gradienta proteina, katerega gen je za promotorjem T7. Ob prisotnosti proteinov PopZ, SpmX in DivIVA lahko torej dosežemo proteinski gradient, če želen protein interagira s proteinom DivIVA [5].

Tretje genetsko vezje je bilo dodatno prilagojeno na tak način, da je omogočalo doseči drugačne fenotipe hčerinskih celic po delitvi asimetrične matične celice ''E. coli''. Tretji sistem kot reporterski protein vsebuje fuzijo proteinov DivIVA, sfGFP in AmpC – β-laktamaze, ki omogoča odpornost na antibiotik ampicilin. Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V celici s takim vezjem je dosežena podobna asimetričnost kot pri drugem sistemu z dodatno razliko. Po delitvi celice je bil obema hčerinskima celicama dodan antibiotik ampicilin. Tista celica, ki je podedovala celični pol s kompleksom obravnavanih proteinov, torej tudi β-laktamazo, je preživela bistveno dlje časa kot tista, ki ni pridobila odpornosti na ampicilin. Pri kontrolnem poskusu sta obe hčerinski celici umrli približno enako hitro. Tak sistem torej ne omogoča le doseganja asimetrije v celici, temveč tudi asimetrično delitev z nastankom dveh celic z različno usodo [5].

== Zaključek ==
V povzeti raziskavi so potrdili, da sta proteina PopZ in DivIVA osnovni enoti za doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve v celici. Pri tem imata ključno vlogo oligomerizacija in omejena difuzija teh proteinov. Ugotovili so, da lahko ''E. coli'', ki se naravno deli simetrično, samo z izražanjem omenjenih proteinov (in adaptorja SpmX) spremenimo tako, da se polarizira in deli asimetrično. PopZ poskrbi za lokalizacijo proteinov zgolj na enem celičnem polu, DivIVA pa za gradient efektorskega proteina. Raziskava je primer uporabe principov sintezne biologije – rekonstrukcijo organizmov z dodajanjem novih genetskih vezij lahko izkoristimo za preučevanje slabše poznanih celičnih mehanizmov.

== Viri ==
[1] B. Sunchu and C. Cabernard, “Principles and mechanisms of asymmetric cell division,” ''Development (Cambridge)'', vol. 147, no. 13. Company of Biologists Ltd, Jun. 29, 2020, doi: 10.1242/dev.167650.

[2] N. W. Goehring, “PAR polarity: From complexity to design principles,” ''Exp. Cell Res.'', vol. 328, no. 2, pp. 258–266, 2014, doi: 10.1016/j.yexcr.2014.08.009.

[3] C. T. Nordyke, Y. M. Ahmed, R. Z. Puterbaugh, G. R. Bowman, and K. Varga, “Intrinsically Disordered Bacterial Polar Organizing Protein Z, PopZ, Interacts with Protein Binding Partners Through an N-terminal Molecular Recognition Feature,” ''J. Mol. Biol.'', vol. 432, no. 23, pp. 6092–6107, Nov. 2020, doi: 10.1016/j.jmb.2020.09.020.

[4] K. S. Ramamurthi and R. Losick, “Negative membrane curvature as a cue for subcellular localization of a bacterial protein,” ''Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.'', vol. 106, no. 32, pp. 13541–13545, Aug. 2009, doi: 10.1073/pnas.0906851106.

[5] D.-W. Lin et al., “Construction of intracellular asymmetry and asymmetric division in ''Escherichia coli'',” ''Nat. Commun.'', vol. 12, no. 1, pp. 1–11, Dec. 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21135-1.

[6] J. R. Kelly et al., “Measuring the activity of BioBrick promoters using an in vivo reference standard,” ''J. Biol. Eng.'', vol. 3, Apr. 2009, doi: 10.1186/1754-1611-3-4.

[7] S. K. Radhakrishnan, M. Thanbichler, and P. H. Viollier, “The dynamic interplay between a cell fate determinant and a lysozyme homolog drives the asymmetric division cycle of ''Caulobacter crescentus'',” ''Genes Dev.'', vol. 22, no. 2, pp. 212–225, Jan. 2008, doi: 10.1101/gad.1601808.

Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli

2021-04-05T21:47:52Z

Aljaž Bratina:

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41467-021-21135-1 Lin, DW., Liu, Y., Lee, YQ. et al. Construction of intracellular asymmetry and asymmetric division in ''Escherichia coli''. Nat Commun 12, 888 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-21135-1]
== Uvod ==
Asimetrična delitev celice je delitev, pri kateri nastaneta dve hčerinski celici, ki nimata enakih lastnosti. Med njima so lahko prisotne razlike v obliki in velikosti ter razporeditvi makromolekul in organelov. Ta pojav je značilen tako za nekatere prokariontske kot nekatere evkariontske celice. Asimetrično se delijo npr. človeške matične celice – nastane ena nova matična celica in ena celica, ki se bo diferencirala – pa tudi nekatere bakterije, npr. ''Caulobacter crescentus''. Da je delitev asimetrična, mora biti že pred njo v materinski celici vzpostavljena asimetrija oz. mora priti do polarizacije celice. To pomeni, da določeni celični mehanizmi poskrbijo za neenako razporeditev makromolekul v celici. Do tega lahko pride zaradi zunanjih ali notranjih dejavnikov [1].

== Celični mehanizmi za zagotavljanje asimetričnosti ==
Mehanizem doseganja asimetričnosti in proteinskega gradienta vključuje različne proteinske enote in interakcije med njimi. Mednje spadajo oligomerizacija proteinov in regulacije njihove difuzije. Nekatere od teh lastnosti so že okarakterizirane, mnoge pa še ne [1].

Pri polarizaciji evkariontske celice so ključni proteini PAR (angl. ''partitioning-defective proteins''). Mednje spadajo ogrodni proteini, ki služijo kot prijemališča za različne efektorske encime, včasih pa njihovo povezavo omogočajo tudi adaptorski proteini. Ključna posebnost proteinov PAR je, da na celični membrani oz. v njeni bližini tvorijo diskretne membranske domene, sestavljene iz določenih proteinov PAR, te pa so različne v posameznih delih celic – npr. na polih paličaste bakterijske celice. Pogosto neka skupina proteinov PAR izključuje drugo – torej izražanje ene skupine PAR na neki membranski domeni onemogoča nahajanje druge skupine PAR na istem mestu [2].

PopZ (angl. ''polar organizing protein'') je protein, ki ima osrednjo vlogo pri doseganju asimetričnosti bakterije ''Caulobacter crescentus''. Po nastanku najprej po celici prosto difundira, nato pa homooligomerizira in se usidra na enega izmed njenih polov. Tam deluje kot središče za interakcije z mnogimi drugimi proteini. Je intrinzično nestrukturiran protein z izjemo krajšega motiva, ki omogoča pripenjanje drugih proteinov [3].

Za asimetričnost pri Bacillus subtilis je najbolj pomemben protein DivIVA. Nahaja se predvsem v bližini negativno ukrivljenih membran. V paličasti obliki celice sta to predvsem njena pola. Zaenkrat ni točno znano, na kakšen način protein prepozna ukrivljenost, niti ni natančno poznana njegova struktura [4].

Za boljše razumevanje teh interakcij je uporaben sinteznobiološki pristop. ''E. coli'' je bakterija, ki se običajno deli simetrično. Z njenim manipuliranjem lahko ugotovimo, kateri so minimalni genetski elementi, ki določajo želen fenotip – asimetrično delitev celice. To naredimo tako, da gene iz drugih organizmov, ki ta pojav regulirajo, vnesemo v ''E. coli'', saj tako nanje ne vpliva morebitna intrinzična regulacija [5].

== Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri ''E. coli'' ==
=== PopZ kot ogrodni protein za lokalizacijo efektorskih proteinov ===
Raziskovalci so asimetričnost celice ''E. coli'' najprej poskušali doseči z vnosom gena za protein PopZ. Da bi ga lahko zasledovali, so uporabili fuzijo z rdečim fluorescirajočim proteinom (mRFP-PopZ). Uporabili so ti. Andersonov promotor J23116, ki je eden izmed standardnih bioloških delov [6]. Izražanje gena s tem promotorjem je zmerno intenzivno, sintetiziran protein pa se nahaja le na enem polu celice v jasno definiranem območju z ostro mejo. Po celični delitvi se ves izražen PopZ nahaja zgolj v eni celici – tisti, ki je nastala iz ustreznega pola. Pri uporabi skrajšane različice PopZ, ki ne vsebuje C-končne domene, pomembne za oligomerizacijo proteina, je protein po izražanju razporejen po celotni celici in se pri delitvi enakomerno razdeli med hčerinski celici. Protein PopZ torej lahko povzroči asimetričnost celice, za kar pa je nujno potrebna njegova oligomerizacija [5].

PopZ v ''C. crescentus'' deluje kot ogrodje za pripenjanje ostalih proteinov in tako zagotavlja njihovo asimetrično porazdelitev. Cilj nadaljevanja raziskave je bil ugotoviti, ali tako funkcijo lahko protein ohrani tudi v ''E. coli''. Eden izmed proteinov, ki se vežejo na PopZ je SpmX, ta pa potem deluje kot adaptor za nadaljnjo vezavo drugih proteinov. Aktivna je že njegova skrajšana oblika SpmXΔC, ki vsebuje N-končen del [7]. Pri izražanju proteina SpmXΔC s fuzijskim reporterjem sfGFP (zeleni fluorescirajoči protein) in konstrukta mRFP-PopZ pride do prekrivanja fluorescence reporterjev na enem izmed polov celice. Proteina torej kolokalizirata, kar dokazuje, da interagirata in PopZ tudi v ''E. coli'' ohrani ogrodno funkcijo za vezavo ostalih proteinov [5].

Adaptor SpmX lahko služi za vezavo nekega efektorskega proteina z encimsko aktivnostjo. V takem primeru je izražena funkcija ogrodnega proteina PopZ, da omogoči funkcionalnost nekemu efektorskemu proteinu zgolj na enem izmed polov celic. Za preučevanje možnosti tega procesa v ''E. coli'' je bila kot efektor izbrana RNA-polimeraza T7 oz. njena optimizirana oblika. Uporabljena RNA-polimeraza je bila razdeljena na dva dela, N-končni in C-končni, na vsakega od teh pa je bil v vseh poskusih pripet adaptor SpmXΔC. Raziskovalci so želeli potrditi hipotezo, da lahko lokalizacija obeh delov na celičnem polu privede obe polovici dovolj skupaj, da je polimeraza aktivna. Predhodno so v raziskavi izražali vsako polovico RNA-polimeraze T7 s fuziranim SpmXΔC in reporterjem sfGFP posebej (konstrukta N-RNAP-sfGFP-SpmXΔC oz. SpmXΔC-sfGFP-C-RNAP), toda hkrati z mRFP-PopZ. S poskusom so pokazali, da tudi taka konstrukta protein PopZ pričakovano uspešno prostorsko omeji le na en celični pol [5].

=== Zasnova ustreznih genetskih vezij ===
V osrednjem delu raziskave so bila zasnovana tri genetska vezja, vsako predstavlja nadgradnjo prejšnjega. Prvo genetsko vezje vsebuje naslednje elemente: gen za konstrukt mRFP-PopZ z Andersonovim promotorjem, zapisa za fuziji adaptorja SpmXΔC s posameznim delom RNA-polimeraze T7 (''eT7pN-spmXN'' oz. ''spmXN-eT7PC'') s promotorjem ''Ptac'', gen za reporter sfGFP s promotorjem ''PT7'' in zapis za represor Lac s svojim promotorjem. Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V bakterijah s prvim vezjem, ko je izražen tudi mRFP-PopZ, je zelena fluorescenca bistveno intenzivnejša kot v kontrolnem poskusu. To pomeni, da je prišlo do uspešnega sestavljanja RNA-polimeraze T7 in izražanja gena sfGFP, ki ima promotor, na katerega se veže obravnavna polimeraza. Poskus jasno pokaže tudi, da je RNA-polimeraza T7 lokalizirana na polu bakterije, torej tam deluje, kar pomeni da lahko ogrodni sistem z osrednjim proteinom PopZ uspešno zasidra efektorske encime na polu celice [5].

Pri uporabi prvega genetskega vezja produkt sfGFP prosto difundira po celici, torej ta sistem kljub nahajanju na celičnem polu ne omogoča asimetrične razporeditve ostalih proteinov, ki nastanejo kasneje v sintezni poti. Da bi asimetrijo dosegli, so raziskovalci skonstruirali prilagojeno, drugo genetsko vezje. Njegov pomemben element je protein DivIVA. Predhodno so v raziskavi pokazali, da se sam protein DivIVA v obliki fuzije z reporterjem sfGPF nahaja na obeh polih celice ''E. coli'', ne pa prosto po celici, kar je potrditev tega, da prepozna negativno ukrivljeno membrano. Pokazano je bilo tudi, da se proteina DivIVA in PopZ ne izključujeta. To pomeni, da se ob skupnem izražanju mRFP-PopZ in DivIVA-sfGFP prvi pričakovano nahaja na enem polu celice, DivIVA pa na obeh, tako kot če bi bila izražena vsak posebej, in se prostorsko ne ovirata [5].

V prvem genetskem vezju je bil kot reporter izbran gen za sfGFP, ki prosto difundira, v drugem pa sfGFP, vezan na DivIVA (DivIVA-sfGFP). Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V bakterijah z drugim vezjem je zelena fluorescenca bistveno bolj intenzivna na enem polu, tistem, na katerem je lokalizirana tudi RNA-polimeraza T7 (vidna kot rdeča fluorescenca zaradi posredne vezave na mRFP-PopZ). V kontrolnem poskusu je zelena fluorescenca zanemarljiva. Dodatni poskusi so pokazali tudi, da je difuzijski koeficient konstrukta DivIVA-sfGFP manjši kot od samega sfGFP, torej zadnji lažje difundira. Celostno so torej rezultati potrdili, da pri uporabi drugega vezja pride do gradienta proteina, katerega gen je za promotorjem T7. Ob prisotnosti proteinov PopZ, SpmX in DivIVA lahko torej dosežemo proteinski gradient, če želen protein interagira s proteinom DivIVA [5].

Tretje genetsko vezje je bilo dodatno prilagojeno na tak način, da je omogočalo doseči drugačne fenotipe hčerinskih celic po delitvi asimetrične matične celice ''E. coli''. Tretji sistem kot reporterski protein vsebuje fuzijo proteinov DivIVA, sfGFP in AmpC – β-laktamaze, ki omogoča odpornost na antibiotik ampicilin. Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V celici s takim vezjem je dosežena podobna asimetričnost kot pri drugem sistemu z dodatno razliko. Po delitvi celice je bil obema hčerinskima celicama dodan antibiotik ampicilin. Tista celica, ki je podedovala celični pol s kompleksom obravnavanih proteinov, torej tudi β-laktamazo, je preživela bistveno dlje časa kot tista, ki ni pridobila odpornosti na ampicilin. Pri kontrolnem poskusu sta obe hčerinski celici umrli približno enako hitro. Tak sistem torej ne omogoča le doseganja asimetrije v celici, temveč tudi asimetrično delitev z nastankom dveh celic z različno usodo [5].

== Zaključek ==
V povzeti raziskavi so potrdili, da sta proteina PopZ in DivIVA osnovni enoti za doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve v celici. Pri tem imata ključno vlogo oligomerizacija in omejena difuzija teh proteinov. Ugotovili so, da lahko ''E. coli'', ki se naravno deli simetrično, samo z izražanjem omenjenih proteinov (in adaptorja SpmX) spremenimo tako, da se polarizira in deli asimetrično. PopZ poskrbi za lokalizacijo proteinov zgolj na enem celičnem polu, DivIVA pa za gradient efektorskega proteina. Raziskava je primer uporabe principov sintezne biologije – rekonstrukcijo organizmov z dodajanjem novih genetskih vezij lahko izkoristimo za preučevanje slabše poznanih celičnih mehanizmov.

== Viri ==
[1] B. Sunchu and C. Cabernard, “Principles and mechanisms of asymmetric cell division,” Development (Cambridge), vol. 147, no. 13. Company of Biologists Ltd, Jun. 29, 2020, doi: 10.1242/dev.167650.

[2] N. W. Goehring, “PAR polarity: From complexity to design principles,” Exp. Cell Res., vol. 328, no. 2, pp. 258–266, 2014, doi: 10.1016/j.yexcr.2014.08.009.

[3] C. T. Nordyke, Y. M. Ahmed, R. Z. Puterbaugh, G. R. Bowman, and K. Varga, “Intrinsically Disordered Bacterial Polar Organizing Protein Z, PopZ, Interacts with Protein Binding Partners Through an N-terminal Molecular Recognition Feature,” J. Mol. Biol., vol. 432, no. 23, pp. 6092–6107, Nov. 2020, doi: 10.1016/j.jmb.2020.09.020.

[4] K. S. Ramamurthi and R. Losick, “Negative membrane curvature as a cue for subcellular localization of a bacterial protein,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 106, no. 32, pp. 13541–13545, Aug. 2009, doi: 10.1073/pnas.0906851106.

[5] D.-W. Lin et al., “Construction of intracellular asymmetry and asymmetric division in ''Escherichia coli'',” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–11, Dec. 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21135-1.

[6] J. R. Kelly et al., “Measuring the activity of BioBrick promoters using an in vivo reference standard,” J. Biol. Eng., vol. 3, Apr. 2009, doi: 10.1186/1754-1611-3-4.

[7] S. K. Radhakrishnan, M. Thanbichler, and P. H. Viollier, “The dynamic interplay between a cell fate determinant and a lysozyme homolog drives the asymmetric division cycle of ''Caulobacter crescentus'',” Genes Dev., vol. 22, no. 2, pp. 212–225, Jan. 2008, doi: 10.1101/gad.1601808.

Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli

2021-04-05T21:45:33Z

Aljaž Bratina:

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41467-021-21135-1 Lin, DW., Liu, Y., Lee, YQ. et al. Construction of intracellular asymmetry and asymmetric division in ''Escherichia coli''. Nat Commun 12, 888 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-21135-1]
== Uvod ==
Asimetrična delitev celice je delitev, pri kateri nastaneta dve hčerinski celici, ki nimata enakih lastnosti. Med njima so lahko prisotne razlike v obliki in velikosti ter razporeditvi makromolekul in organelov. Ta pojav je značilen tako za nekatere prokariontske kot nekatere evkariontske celice. Asimetrično se delijo npr. človeške matične celice – nastane ena nova matična celica in ena celica, ki se bo diferencirala – pa tudi nekatere bakterije, npr. ''Caulobacter crescentus''. Da je delitev asimetrična, mora biti že pred njo v materinski celici vzpostavljena asimetrija oz. mora priti do polarizacije celice. To pomeni, da določeni celični mehanizmi poskrbijo za neenako razporeditev makromolekul v celici. Do tega lahko pride zaradi zunanjih ali notranjih dejavnikov [1].

== Celični mehanizmi za zagotavljanje asimetričnosti ==
Mehanizem doseganja asimetričnosti in proteinskega gradienta vključuje različne proteinske enote in interakcije med njimi. Mednje spadajo oligomerizacija proteinov in regulacije njihove difuzije. Nekatere od teh lastnosti so že okarakterizirane, mnoge pa še ne [1].

Pri polarizaciji evkariontske celice so ključni proteini PAR (angl. ''partitioning-defective proteins''). Mednje spadajo ogrodni proteini, ki služijo kot prijemališča za različne efektorske encime, včasih pa njihovo povezavo omogočajo tudi adaptorski proteini. Ključna posebnost proteinov PAR je, da na celični membrani oz. v njeni bližini tvorijo diskretne membranske domene, sestavljene iz določenih proteinov PAR, te pa so različne v posameznih delih celic – npr. na polih paličaste bakterijske celice. Pogosto neka skupina proteinov PAR izključuje drugo – torej izražanje ene skupine PAR na neki membranski domeni onemogoča nahajanje druge skupine PAR na istem mestu [2].

PopZ (angl. ''polar organizing protein'') je protein, ki ima osrednjo vlogo pri doseganju asimetričnosti bakterije ''Caulobacter crescentus''. Po nastanku najprej po celici prosto difundira, nato pa homooligomerizira in se usidra na enega izmed njenih polov. Tam deluje kot središče za interakcije z mnogimi drugimi proteini. Je intrinzično nestrukturiran protein z izjemo krajšega motiva, ki omogoča pripenjanje drugih proteinov [3].

Za asimetričnost pri Bacillus subtilis je najbolj pomemben protein DivIVA. Nahaja se predvsem v bližini negativno ukrivljenih membran. V paličasti obliki celice sta to predvsem njena pola. Zaenkrat ni točno znano, na kakšen način protein prepozna ukrivljenost, niti ni natančno poznana njegova struktura [4].

Za boljše razumevanje teh interakcij je uporaben sinteznobiološki pristop. ''E. coli'' je bakterija, ki se običajno deli simetrično. Z njenim manipuliranjem lahko ugotovimo, kateri so minimalni genetski elementi, ki določajo želen fenotip – asimetrično delitev celice. To naredimo tako, da gene iz drugih organizmov, ki ta pojav regulirajo, vnesemo v ''E. coli'', saj tako nanje ne vpliva morebitna intrinzična regulacija [5].

== Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri ''E. coli'' ==
=== PopZ kot ogrodni protein za lokalizacijo efektorskih proteinov ===
Raziskovalci so asimetričnost celice ''E. coli'' najprej poskušali doseči z vnosom gena za protein PopZ. Da bi ga lahko zasledovali, so uporabili fuzijo z rdečim fluorescirajočim proteinom (mRFP-PopZ). Uporabili so ti. Andersonov promotor J23116, ki je eden izmed standardnih bioloških delov [6]. Izražanje gena s tem promotorjem je zmerno intenzivno, sintetiziran protein pa se nahaja le na enem polu celice v jasno definiranem območju z ostro mejo. Po celični delitvi se ves izražen PopZ nahaja zgolj v eni celici – tisti, ki je nastala iz ustreznega pola. Pri uporabi skrajšane različice PopZ, ki ne vsebuje C-končne domene, pomembne za oligomerizacijo proteina, je protein po izražanju razporejen po celotni celici in se pri delitvi enakomerno razdeli med hčerinski celici. Protein PopZ torej lahko povzroči asimetričnost celice, za kar pa je nujno potrebna njegova oligomerizacija [5].

PopZ v ''C. crescentus'' deluje kot ogrodje za pripenjanje ostalih proteinov in tako zagotavlja njihovo asimetrično porazdelitev. Cilj nadaljevanja raziskave je bil ugotoviti, ali tako funkcijo lahko protein ohrani tudi v ''E. coli''. Eden izmed proteinov, ki se vežejo na PopZ je SpmX, ta pa potem deluje kot adaptor za nadaljnjo vezavo drugih proteinov. Aktivna je že njegova skrajšana oblika SpmXΔC, ki vsebuje N-končen del [7]. Pri izražanju proteina SpmXΔC s fuzijskim reporterjem sfGFP (zeleni fluorescirajoči protein) in konstrukta mRFP-PopZ pride do prekrivanja fluorescence reporterjev na enem izmed polov celice. Proteina torej kolokalizirata, kar dokazuje, da interagirata in PopZ tudi v ''E. coli'' ohrani ogrodno funkcijo za vezavo ostalih proteinov [5].

Adaptor SpmX lahko služi za vezavo nekega efektorskega proteina z encimsko aktivnostjo. V takem primeru je izražena funkcija ogrodnega proteina PopZ, da omogoči funkcionalnost nekemu efektorskemu proteinu zgolj na enem izmed polov celic. Za preučevanje možnosti tega procesa v ''E. coli'' je bila kot efektor izbrana RNA-polimeraza T7 oz. njena optimizirana oblika. Uporabljena RNA-polimeraza je bila razdeljena na dva dela, N-končni in C-končni, na vsakega od teh pa je bil v vseh poskusih pripet adaptor SpmXΔC. Raziskovalci so želeli potrditi hipotezo, da lahko lokalizacija obeh delov na celičnem polu privede obe polovici dovolj skupaj, da je polimeraza aktivna. Predhodno so v raziskavi izražali vsako polovico RNA-polimeraze T7 s fuziranim SpmXΔC in reporterjem sfGFP posebej (konstrukta N-RNAP-sfGFP-SpmXΔC oz. SpmXΔC-sfGFP-C-RNAP), toda hkrati z mRFP-PopZ. S poskusom so pokazali, da tudi taka konstrukta protein PopZ pričakovano uspešno prostorsko omeji le na en celični pol [5].

=== Zasnova ustreznih genetskih vezij ===
V osrednjem delu raziskave so bila zasnovana tri genetska vezja, vsako predstavlja nadgradnjo prejšnjega. Prvo genetsko vezje vsebuje naslednje elemente: gen za konstrukt mRFP-PopZ z Andersonovim promotorjem, zapisa za fuziji adaptorja SpmXΔC s posameznim delom RNA-polimeraze T7 (eT7pN-spmXN oz. spmXN-eT7PC) s promotorjem Ptac, gen za reporter sfGFP s promotorjem PT7 in zapis za represor Lac s svojim promotorjem. Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V bakterijah s prvim vezjem, ko je izražen tudi mRFP-PopZ, je zelena fluorescenca bistveno intenzivnejša kot v kontrolnem poskusu. To pomeni, da je prišlo do uspešnega sestavljanja RNA-polimeraze T7 in izražanja gena sfGFP, ki ima promotor, na katerega se veže obravnavna polimeraza. Poskus jasno pokaže tudi, da je RNA-polimeraza T7 lokalizirana na polu bakterije, torej tam deluje, kar pomeni da lahko ogrodni sistem z osrednjim proteinom PopZ uspešno zasidra efektorske encime na polu celice [5].

Pri uporabi prvega genetskega vezja produkt sfGFP prosto difundira po celici, torej ta sistem kljub nahajanju na celičnem polu ne omogoča asimetrične razporeditve ostalih proteinov, ki nastanejo kasneje v sintezni poti. Da bi asimetrijo dosegli, so raziskovalci skonstruirali prilagojeno, drugo genetsko vezje. Njegov pomemben element je protein DivIVA. Predhodno so v raziskavi pokazali, da se sam protein DivIVA v obliki fuzije z reporterjem sfGPF nahaja na obeh polih celice ''E. coli'', ne pa prosto po celici, kar je potrditev tega, da prepozna negativno ukrivljeno membrano. Pokazano je bilo tudi, da se proteina DivIVA in PopZ ne izključujeta. To pomeni, da se ob skupnem izražanju mRFP-PopZ in DivIVA-sfGFP prvi pričakovano nahaja na enem polu celice, DivIVA pa na obeh, tako kot če bi bila izražena vsak posebej, in se prostorsko ne ovirata [5].

V prvem genetskem vezju je bil kot reporter izbran gen za sfGFP, ki prosto difundira, v drugem pa sfGFP, vezan na DivIVA (DivIVA-sfGFP). Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V bakterijah z drugim vezjem je zelena fluorescenca bistveno bolj intenzivna na enem polu, tistem, na katerem je lokalizirana tudi RNA-polimeraza T7 (vidna kot rdeča fluorescenca zaradi posredne vezave na mRFP-PopZ). V kontrolnem poskusu je zelena fluorescenca zanemarljiva. Dodatni poskusi so pokazali tudi, da je difuzijski koeficient konstrukta DivIVA-sfGFP manjši kot od samega sfGFP, torej zadnji lažje difundira. Celostno so torej rezultati potrdili, da pri uporabi drugega vezja pride do gradienta proteina, katerega gen je za promotorjem T7. Ob prisotnosti proteinov PopZ, SpmX in DivIVA lahko torej dosežemo proteinski gradient, če želen protein interagira s proteinom DivIVA [5].

Tretje genetsko vezje je bilo dodatno prilagojeno na tak način, da je omogočalo doseči drugačne fenotipe hčerinskih celic po delitvi asimetrične matične celice ''E. coli''. Tretji sistem kot reporterski protein vsebuje fuzijo proteinov DivIVA, sfGFP in AmpC – β-laktamaze, ki omogoča odpornost na antibiotik ampicilin. Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V celici s takim vezjem je dosežena podobna asimetričnost kot pri drugem sistemu z dodatno razliko. Po delitvi celice je bil obema hčerinskima celicama dodan antibiotik ampicilin. Tista celica, ki je podedovala celični pol s kompleksom obravnavanih proteinov, torej tudi β-laktamazo, je preživela bistveno dlje časa kot tista, ki ni pridobila odpornosti na ampicilin. Pri kontrolnem poskusu sta obe hčerinski celici umrli približno enako hitro. Tak sistem torej ne omogoča le doseganja asimetrije v celici, temveč tudi asimetrično delitev z nastankom dveh celic z različno usodo [5].

== Zaključek ==
V povzeti raziskavi so potrdili, da sta proteina PopZ in DivIVA osnovni enoti za doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve v celici. Pri tem imata ključno vlogo oligomerizacija in omejena difuzija teh proteinov. Ugotovili so, da lahko ''E. coli'', ki se naravno deli simetrično, samo z izražanjem omenjenih proteinov (in adaptorja SpmX) spremenimo tako, da se polarizira in deli asimetrično. PopZ poskrbi za lokalizacijo proteinov zgolj na enem celičnem polu, DivIVA pa za gradient efektorskega proteina. Raziskava je primer uporabe principov sintezne biologije – rekonstrukcijo organizmov z dodajanjem novih genetskih vezij lahko izkoristimo za preučevanje slabše poznanih celičnih mehanizmov.

== Viri ==
[1] B. Sunchu and C. Cabernard, “Principles and mechanisms of asymmetric cell division,” Development (Cambridge), vol. 147, no. 13. Company of Biologists Ltd, Jun. 29, 2020, doi: 10.1242/dev.167650.

[2] N. W. Goehring, “PAR polarity: From complexity to design principles,” Exp. Cell Res., vol. 328, no. 2, pp. 258–266, 2014, doi: 10.1016/j.yexcr.2014.08.009.

[3] C. T. Nordyke, Y. M. Ahmed, R. Z. Puterbaugh, G. R. Bowman, and K. Varga, “Intrinsically Disordered Bacterial Polar Organizing Protein Z, PopZ, Interacts with Protein Binding Partners Through an N-terminal Molecular Recognition Feature,” J. Mol. Biol., vol. 432, no. 23, pp. 6092–6107, Nov. 2020, doi: 10.1016/j.jmb.2020.09.020.

[4] K. S. Ramamurthi and R. Losick, “Negative membrane curvature as a cue for subcellular localization of a bacterial protein,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 106, no. 32, pp. 13541–13545, Aug. 2009, doi: 10.1073/pnas.0906851106.

[5] D.-W. Lin et al., “Construction of intracellular asymmetry and asymmetric division in ''Escherichia coli'',” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–11, Dec. 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21135-1.

[6] J. R. Kelly et al., “Measuring the activity of BioBrick promoters using an in vivo reference standard,” J. Biol. Eng., vol. 3, Apr. 2009, doi: 10.1186/1754-1611-3-4.

[7] S. K. Radhakrishnan, M. Thanbichler, and P. H. Viollier, “The dynamic interplay between a cell fate determinant and a lysozyme homolog drives the asymmetric division cycle of ''Caulobacter crescentus'',” Genes Dev., vol. 22, no. 2, pp. 212–225, Jan. 2008, doi: 10.1101/gad.1601808.

Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli

2021-04-05T21:40:31Z

Aljaž Bratina:

Izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/s41467-021-21135-1]
== Uvod ==
Asimetrična delitev celice je delitev, pri kateri nastaneta dve hčerinski celici, ki nimata enakih lastnosti. Med njima so lahko prisotne razlike v obliki in velikosti ter razporeditvi makromolekul in organelov. Ta pojav je značilen tako za nekatere prokariontske kot nekatere evkariontske celice. Asimetrično se delijo npr. človeške matične celice – nastane ena nova matična celica in ena celica, ki se bo diferencirala – pa tudi nekatere bakterije, npr. Caulobacter crescentus. Da je delitev asimetrična, mora biti že pred njo v materinski celici vzpostavljena asimetrija oz. mora priti do polarizacije celice. To pomeni, da določeni celični mehanizmi poskrbijo za neenako razporeditev makromolekul v celici. Do tega lahko pride zaradi zunanjih ali notranjih dejavnikov [1].

== Celični mehanizmi za zagotavljanje asimetričnosti ==
Mehanizem doseganja asimetričnosti in proteinskega gradienta vključuje različne proteinske enote in interakcije med njimi. Mednje spadajo oligomerizacija proteinov in regulacije njihove difuzije. Nekatere od teh lastnosti so že okarakterizirane, mnoge pa še ne [1].

Pri polarizaciji evkariontske celice so ključni proteini PAR (angl. partitioning-defective proteins). Mednje spadajo ogrodni proteini, ki služijo kot prijemališča za različne efektorske encime, včasih pa njihovo povezavo omogočajo tudi adaptorski proteini. Ključna posebnost proteinov PAR je, da na celični membrani oz. v njeni bližini tvorijo diskretne membranske domene, sestavljene iz določenih proteinov PAR, te pa so različne v posameznih delih celic – npr. na polih paličaste bakterijske celice. Pogosto neka skupina proteinov PAR izključuje drugo – torej izražanje ene skupine PAR na neki membranski domeni onemogoča nahajanje druge skupine PAR na istem mestu [2].

PopZ (angl. polar organizing protein) je protein, ki ima osrednjo vlogo pri doseganju asimetričnosti bakterije Caulobacter crescentus. Po nastanku najprej po celici prosto difundira, nato pa homooligomerizira in se usidra na enega izmed njenih polov. Tam deluje kot središče za interakcije z mnogimi drugimi proteini. Je intrinzično nestrukturiran protein z izjemo krajšega motiva, ki omogoča pripenjanje drugih proteinov [3].

Za asimetričnost pri Bacillus subtilis je najbolj pomemben protein DivIVA. Nahaja se predvsem v bližini negativno ukrivljenih membran. V paličasti obliki celice sta to predvsem njena pola. Zaenkrat ni točno znano, na kakšen način protein prepozna ukrivljenost, niti ni natančno poznana njegova struktura [4].

Za boljše razumevanje teh interakcij je uporaben sinteznobiološki pristop. E. coli je bakterija, ki se običajno deli simetrično. Z njenim manipuliranjem lahko ugotovimo, kateri so minimalni genetski elementi, ki določajo želen fenotip – asimetrično delitev celice. To naredimo tako, da gene iz drugih organizmov, ki ta pojav regulirajo, vnesemo v E. coli, saj tako nanje ne vpliva morebitna intrinzična regulacija [5].

== Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli ==
=== PopZ kot ogrodni protein za lokalizacijo efektorskih proteinov ===
Raziskovalci so asimetričnost celice E. coli najprej poskušali doseči z vnosom gena za protein PopZ. Da bi ga lahko zasledovali, so uporabili fuzijo z rdečim fluorescirajočim proteinom (mRFP-PopZ). Uporabili so ti. Andersonov promotor J23116, ki je eden izmed standardnih bioloških delov [6]. Izražanje gena s tem promotorjem je zmerno intenzivno, sintetiziran protein pa se nahaja le na enem polu celice v jasno definiranem območju z ostro mejo. Po celični delitvi se ves izražen PopZ nahaja zgolj v eni celici – tisti, ki je nastala iz ustreznega pola. Pri uporabi skrajšane različice PopZ, ki ne vsebuje C-končne domene, pomembne za oligomerizacijo proteina, je protein po izražanju razporejen po celotni celici in se pri delitvi enakomerno razdeli med hčerinski celici. Protein PopZ torej lahko povzroči asimetričnost celice, za kar pa je nujno potrebna njegova oligomerizacija [5].

PopZ v C. crescentus deluje kot ogrodje za pripenjanje ostalih proteinov in tako zagotavlja njihovo asimetrično porazdelitev. Cilj nadaljevanja raziskave je bil ugotoviti, ali tako funkcijo lahko protein ohrani tudi v E. coli. Eden izmed proteinov, ki se vežejo na PopZ je SpmX, ta pa potem deluje kot adaptor za nadaljnjo vezavo drugih proteinov. Aktivna je že njegova skrajšana oblika SpmXΔC, ki vsebuje N-končen del [7]. Pri izražanju proteina SpmXΔC s fuzijskim reporterjem sfGFP (zeleni fluorescirajoči protein) in konstrukta mRFP-PopZ pride do prekrivanja fluorescence reporterjev na enem izmed polov celice. Proteina torej kolokalizirata, kar dokazuje, da interagirata in PopZ tudi v E. coli ohrani ogrodno funkcijo za vezavo ostalih proteinov [5].

Adaptor SpmX lahko služi za vezavo nekega efektorskega proteina z encimsko aktivnostjo. V takem primeru je izražena funkcija ogrodnega proteina PopZ, da omogoči funkcionalnost nekemu efektorskemu proteinu zgolj na enem izmed polov celic. Za preučevanje možnosti tega procesa v E. coli je bila kot efektor izbrana RNA-polimeraza T7 oz. njena optimizirana oblika. Uporabljena RNA-polimeraza je bila razdeljena na dva dela, N-končni in C-končni, na vsakega od teh pa je bil v vseh poskusih pripet adaptor SpmXΔC. Raziskovalci so želeli potrditi hipotezo, da lahko lokalizacija obeh delov na celičnem polu privede obe polovici dovolj skupaj, da je polimeraza aktivna. Predhodno so v raziskavi izražali vsako polovico RNA-polimeraze T7 s fuziranim SpmXΔC in reporterjem sfGFP posebej (konstrukta N-RNAP-sfGFP-SpmXΔC oz. SpmXΔC-sfGFP-C-RNAP), toda hkrati z mRFP-PopZ. S poskusom so pokazali, da tudi taka konstrukta protein PopZ pričakovano uspešno prostorsko omeji le na en celični pol [5].

=== Zasnova ustreznih genetskih vezij ===
V osrednjem delu raziskave so bila zasnovana tri genetska vezja, vsako predstavlja nadgradnjo prejšnjega. Prvo genetsko vezje vsebuje naslednje elemente: gen za konstrukt mRFP-PopZ z Andersonovim promotorjem, zapisa za fuziji adaptorja SpmXΔC s posameznim delom RNA-polimeraze T7 (eT7pN-spmXN oz. spmXN-eT7PC) s promotorjem Ptac, gen za reporter sfGFP s promotorjem PT7 in zapis za represor Lac s svojim promotorjem. Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V bakterijah s prvim vezjem, ko je izražen tudi mRFP-PopZ, je zelena fluorescenca bistveno intenzivnejša kot v kontrolnem poskusu. To pomeni, da je prišlo do uspešnega sestavljanja RNA-polimeraze T7 in izražanja gena sfGFP, ki ima promotor, na katerega se veže obravnavna polimeraza. Poskus jasno pokaže tudi, da je RNA-polimeraza T7 lokalizirana na polu bakterije, torej tam deluje, kar pomeni da lahko ogrodni sistem z osrednjim proteinom PopZ uspešno zasidra efektorske encime na polu celice [5].

Pri uporabi prvega genetskega vezja produkt sfGFP prosto difundira po celici, torej ta sistem kljub nahajanju na celičnem polu ne omogoča asimetrične razporeditve ostalih proteinov, ki nastanejo kasneje v sintezni poti. Da bi asimetrijo dosegli, so raziskovalci skonstruirali prilagojeno, drugo genetsko vezje. Njegov pomemben element je protein DivIVA. Predhodno so v raziskavi pokazali, da se sam protein DivIVA v obliki fuzije z reporterjem sfGPF nahaja na obeh polih celice E. coli, ne pa prosto po celici, kar je potrditev tega, da prepozna negativno ukrivljeno membrano. Pokazano je bilo tudi, da se proteina DivIVA in PopZ ne izključujeta. To pomeni, da se ob skupnem izražanju mRFP-PopZ in DivIVA-sfGFP prvi pričakovano nahaja na enem polu celice, DivIVA pa na obeh, tako kot če bi bila izražena vsak posebej, in se prostorsko ne ovirata [5].

V prvem genetskem vezju je bil kot reporter izbran gen za sfGFP, ki prosto difundira, v drugem pa sfGFP, vezan na DivIVA (DivIVA-sfGFP). Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V bakterijah z drugim vezjem je zelena fluorescenca bistveno bolj intenzivna na enem polu, tistem, na katerem je lokalizirana tudi RNA-polimeraza T7 (vidna kot rdeča fluorescenca zaradi posredne vezave na mRFP-PopZ). V kontrolnem poskusu je zelena fluorescenca zanemarljiva. Dodatni poskusi so pokazali tudi, da je difuzijski koeficient konstrukta DivIVA-sfGFP manjši kot od samega sfGFP, torej zadnji lažje difundira. Celostno so torej rezultati potrdili, da pri uporabi drugega vezja pride do gradienta proteina, katerega gen je za promotorjem T7. Ob prisotnosti proteinov PopZ, SpmX in DivIVA lahko torej dosežemo proteinski gradient, če želen protein interagira s proteinom DivIVA [5].

Tretje genetsko vezje je bilo dodatno prilagojeno na tak način, da je omogočalo doseči drugačne fenotipe hčerinskih celic po delitvi asimetrične matične celice E. coli. Tretji sistem kot reporterski protein vsebuje fuzijo proteinov DivIVA, sfGFP in AmpC – β-laktamaze, ki omogoča odpornost na antibiotik ampicilin. Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V celici s takim vezjem je dosežena podobna asimetričnost kot pri drugem sistemu z dodatno razliko. Po delitvi celice je bil obema hčerinskima celicama dodan antibiotik ampicilin. Tista celica, ki je podedovala celični pol s kompleksom obravnavanih proteinov, torej tudi β-laktamazo, je preživela bistveno dlje časa kot tista, ki ni pridobila odpornosti na ampicilin. Pri kontrolnem poskusu sta obe hčerinski celici umrli približno enako hitro. Tak sistem torej ne omogoča le doseganja asimetrije v celici, temveč tudi asimetrično delitev z nastankom dveh celic z različno usodo [5].

== Zaključek ==
V povzeti raziskavi so potrdili, da sta proteina PopZ in DivIVA osnovni enoti za doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve v celici. Pri tem imata ključno vlogo oligomerizacija in omejena difuzija teh proteinov. Ugotovili so, da lahko E. coli, ki se naravno deli simetrično, samo z izražanjem omenjenih proteinov (in adaptorja SpmX) spremenimo tako, da se polarizira in deli asimetrično. PopZ poskrbi za lokalizacijo proteinov zgolj na enem celičnem polu, DivIVA pa za gradient efektorskega proteina. Raziskava je primer uporabe principov sintezne biologije – rekonstrukcijo organizmov z dodajanjem novih genetskih vezij lahko izkoristimo za preučevanje slabše poznanih celičnih mehanizmov.

== Viri ==
[1] B. Sunchu and C. Cabernard, “Principles and mechanisms of asymmetric cell division,” Development (Cambridge), vol. 147, no. 13. Company of Biologists Ltd, Jun. 29, 2020, doi: 10.1242/dev.167650.

[2] N. W. Goehring, “PAR polarity: From complexity to design principles,” Exp. Cell Res., vol. 328, no. 2, pp. 258–266, 2014, doi: 10.1016/j.yexcr.2014.08.009.

[3] C. T. Nordyke, Y. M. Ahmed, R. Z. Puterbaugh, G. R. Bowman, and K. Varga, “Intrinsically Disordered Bacterial Polar Organizing Protein Z, PopZ, Interacts with Protein Binding Partners Through an N-terminal Molecular Recognition Feature,” J. Mol. Biol., vol. 432, no. 23, pp. 6092–6107, Nov. 2020, doi: 10.1016/j.jmb.2020.09.020.

[4] K. S. Ramamurthi and R. Losick, “Negative membrane curvature as a cue for subcellular localization of a bacterial protein,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 106, no. 32, pp. 13541–13545, Aug. 2009, doi: 10.1073/pnas.0906851106.

[5] D.-W. Lin et al., “Construction of intracellular asymmetry and asymmetric division in Escherichia coli,” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–11, Dec. 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21135-1.

[6] J. R. Kelly et al., “Measuring the activity of BioBrick promoters using an in vivo reference standard,” J. Biol. Eng., vol. 3, Apr. 2009, doi: 10.1186/1754-1611-3-4.

[7] S. K. Radhakrishnan, M. Thanbichler, and P. H. Viollier, “The dynamic interplay between a cell fate determinant and a lysozyme homolog drives the asymmetric division cycle of Caulobacter crescentus,” Genes Dev., vol. 22, no. 2, pp. 212–225, Jan. 2008, doi: 10.1101/gad.1601808.

Seminarji SB 2020/21

2021-04-05T21:39:11Z

Aljaž Bratina:

V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline]
(Liza Ulčakar) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv]
(Špela Supej)

Seminarji SB 2020/21

2021-04-05T21:38:48Z

Aljaž Bratina:

V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline]
(Liza Ulčakar) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli] (Aljaž Bratina) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv]
(Špela Supej)

Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli

2021-04-05T21:35:55Z

Aljaž Bratina:

== Uvod ==
Asimetrična delitev celice je delitev, pri kateri nastaneta dve hčerinski celici, ki nimata enakih lastnosti. Med njima so lahko prisotne razlike v obliki in velikosti ter razporeditvi makromolekul in organelov. Ta pojav je značilen tako za nekatere prokariontske kot nekatere evkariontske celice. Asimetrično se delijo npr. človeške matične celice – nastane ena nova matična celica in ena celica, ki se bo diferencirala – pa tudi nekatere bakterije, npr. Caulobacter crescentus. Da je delitev asimetrična, mora biti že pred njo v materinski celici vzpostavljena asimetrija oz. mora priti do polarizacije celice. To pomeni, da določeni celični mehanizmi poskrbijo za neenako razporeditev makromolekul v celici. Do tega lahko pride zaradi zunanjih ali notranjih dejavnikov [1].

== Celični mehanizmi za zagotavljanje asimetričnosti ==
Mehanizem doseganja asimetričnosti in proteinskega gradienta vključuje različne proteinske enote in interakcije med njimi. Mednje spadajo oligomerizacija proteinov in regulacije njihove difuzije. Nekatere od teh lastnosti so že okarakterizirane, mnoge pa še ne [1].

Pri polarizaciji evkariontske celice so ključni proteini PAR (angl. partitioning-defective proteins). Mednje spadajo ogrodni proteini, ki služijo kot prijemališča za različne efektorske encime, včasih pa njihovo povezavo omogočajo tudi adaptorski proteini. Ključna posebnost proteinov PAR je, da na celični membrani oz. v njeni bližini tvorijo diskretne membranske domene, sestavljene iz določenih proteinov PAR, te pa so različne v posameznih delih celic – npr. na polih paličaste bakterijske celice. Pogosto neka skupina proteinov PAR izključuje drugo – torej izražanje ene skupine PAR na neki membranski domeni onemogoča nahajanje druge skupine PAR na istem mestu [2].

PopZ (angl. polar organizing protein) je protein, ki ima osrednjo vlogo pri doseganju asimetričnosti bakterije Caulobacter crescentus. Po nastanku najprej po celici prosto difundira, nato pa homooligomerizira in se usidra na enega izmed njenih polov. Tam deluje kot središče za interakcije z mnogimi drugimi proteini. Je intrinzično nestrukturiran protein z izjemo krajšega motiva, ki omogoča pripenjanje drugih proteinov [3].

Za asimetričnost pri Bacillus subtilis je najbolj pomemben protein DivIVA. Nahaja se predvsem v bližini negativno ukrivljenih membran. V paličasti obliki celice sta to predvsem njena pola. Zaenkrat ni točno znano, na kakšen način protein prepozna ukrivljenost, niti ni natančno poznana njegova struktura [4].

Za boljše razumevanje teh interakcij je uporaben sinteznobiološki pristop. E. coli je bakterija, ki se običajno deli simetrično. Z njenim manipuliranjem lahko ugotovimo, kateri so minimalni genetski elementi, ki določajo želen fenotip – asimetrično delitev celice. To naredimo tako, da gene iz drugih organizmov, ki ta pojav regulirajo, vnesemo v E. coli, saj tako nanje ne vpliva morebitna intrinzična regulacija [5].

== Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli ==
=== PopZ kot ogrodni protein za lokalizacijo efektorskih proteinov ===
Raziskovalci so asimetričnost celice E. coli najprej poskušali doseči z vnosom gena za protein PopZ. Da bi ga lahko zasledovali, so uporabili fuzijo z rdečim fluorescirajočim proteinom (mRFP-PopZ). Uporabili so ti. Andersonov promotor J23116, ki je eden izmed standardnih bioloških delov [6]. Izražanje gena s tem promotorjem je zmerno intenzivno, sintetiziran protein pa se nahaja le na enem polu celice v jasno definiranem območju z ostro mejo. Po celični delitvi se ves izražen PopZ nahaja zgolj v eni celici – tisti, ki je nastala iz ustreznega pola. Pri uporabi skrajšane različice PopZ, ki ne vsebuje C-končne domene, pomembne za oligomerizacijo proteina, je protein po izražanju razporejen po celotni celici in se pri delitvi enakomerno razdeli med hčerinski celici. Protein PopZ torej lahko povzroči asimetričnost celice, za kar pa je nujno potrebna njegova oligomerizacija [5].

PopZ v C. crescentus deluje kot ogrodje za pripenjanje ostalih proteinov in tako zagotavlja njihovo asimetrično porazdelitev. Cilj nadaljevanja raziskave je bil ugotoviti, ali tako funkcijo lahko protein ohrani tudi v E. coli. Eden izmed proteinov, ki se vežejo na PopZ je SpmX, ta pa potem deluje kot adaptor za nadaljnjo vezavo drugih proteinov. Aktivna je že njegova skrajšana oblika SpmXΔC, ki vsebuje N-končen del [7]. Pri izražanju proteina SpmXΔC s fuzijskim reporterjem sfGFP (zeleni fluorescirajoči protein) in konstrukta mRFP-PopZ pride do prekrivanja fluorescence reporterjev na enem izmed polov celice. Proteina torej kolokalizirata, kar dokazuje, da interagirata in PopZ tudi v E. coli ohrani ogrodno funkcijo za vezavo ostalih proteinov [5].

Adaptor SpmX lahko služi za vezavo nekega efektorskega proteina z encimsko aktivnostjo. V takem primeru je izražena funkcija ogrodnega proteina PopZ, da omogoči funkcionalnost nekemu efektorskemu proteinu zgolj na enem izmed polov celic. Za preučevanje možnosti tega procesa v E. coli je bila kot efektor izbrana RNA-polimeraza T7 oz. njena optimizirana oblika. Uporabljena RNA-polimeraza je bila razdeljena na dva dela, N-končni in C-končni, na vsakega od teh pa je bil v vseh poskusih pripet adaptor SpmXΔC. Raziskovalci so želeli potrditi hipotezo, da lahko lokalizacija obeh delov na celičnem polu privede obe polovici dovolj skupaj, da je polimeraza aktivna. Predhodno so v raziskavi izražali vsako polovico RNA-polimeraze T7 s fuziranim SpmXΔC in reporterjem sfGFP posebej (konstrukta N-RNAP-sfGFP-SpmXΔC oz. SpmXΔC-sfGFP-C-RNAP), toda hkrati z mRFP-PopZ. S poskusom so pokazali, da tudi taka konstrukta protein PopZ pričakovano uspešno prostorsko omeji le na en celični pol [5].

=== Zasnova ustreznih genetskih vezij ===
V osrednjem delu raziskave so bila zasnovana tri genetska vezja, vsako predstavlja nadgradnjo prejšnjega. Prvo genetsko vezje vsebuje naslednje elemente: gen za konstrukt mRFP-PopZ z Andersonovim promotorjem, zapisa za fuziji adaptorja SpmXΔC s posameznim delom RNA-polimeraze T7 (eT7pN-spmXN oz. spmXN-eT7PC) s promotorjem Ptac, gen za reporter sfGFP s promotorjem PT7 in zapis za represor Lac s svojim promotorjem. Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V bakterijah s prvim vezjem, ko je izražen tudi mRFP-PopZ, je zelena fluorescenca bistveno intenzivnejša kot v kontrolnem poskusu. To pomeni, da je prišlo do uspešnega sestavljanja RNA-polimeraze T7 in izražanja gena sfGFP, ki ima promotor, na katerega se veže obravnavna polimeraza. Poskus jasno pokaže tudi, da je RNA-polimeraza T7 lokalizirana na polu bakterije, torej tam deluje, kar pomeni da lahko ogrodni sistem z osrednjim proteinom PopZ uspešno zasidra efektorske encime na polu celice [5].

Pri uporabi prvega genetskega vezja produkt sfGFP prosto difundira po celici, torej ta sistem kljub nahajanju na celičnem polu ne omogoča asimetrične razporeditve ostalih proteinov, ki nastanejo kasneje v sintezni poti. Da bi asimetrijo dosegli, so raziskovalci skonstruirali prilagojeno, drugo genetsko vezje. Njegov pomemben element je protein DivIVA. Predhodno so v raziskavi pokazali, da se sam protein DivIVA v obliki fuzije z reporterjem sfGPF nahaja na obeh polih celice E. coli, ne pa prosto po celici, kar je potrditev tega, da prepozna negativno ukrivljeno membrano. Pokazano je bilo tudi, da se proteina DivIVA in PopZ ne izključujeta. To pomeni, da se ob skupnem izražanju mRFP-PopZ in DivIVA-sfGFP prvi pričakovano nahaja na enem polu celice, DivIVA pa na obeh, tako kot če bi bila izražena vsak posebej, in se prostorsko ne ovirata [5].

V prvem genetskem vezju je bil kot reporter izbran gen za sfGFP, ki prosto difundira, v drugem pa sfGFP, vezan na DivIVA (DivIVA-sfGFP). Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V bakterijah z drugim vezjem je zelena fluorescenca bistveno bolj intenzivna na enem polu, tistem, na katerem je lokalizirana tudi RNA-polimeraza T7 (vidna kot rdeča fluorescenca zaradi posredne vezave na mRFP-PopZ). V kontrolnem poskusu je zelena fluorescenca zanemarljiva. Dodatni poskusi so pokazali tudi, da je difuzijski koeficient konstrukta DivIVA-sfGFP manjši kot od samega sfGFP, torej zadnji lažje difundira. Celostno so torej rezultati potrdili, da pri uporabi drugega vezja pride do gradienta proteina, katerega gen je za promotorjem T7. Ob prisotnosti proteinov PopZ, SpmX in DivIVA lahko torej dosežemo proteinski gradient, če želen protein interagira s proteinom DivIVA [5].

Tretje genetsko vezje je bilo dodatno prilagojeno na tak način, da je omogočalo doseči drugačne fenotipe hčerinskih celic po delitvi asimetrične matične celice E. coli. Tretji sistem kot reporterski protein vsebuje fuzijo proteinov DivIVA, sfGFP in AmpC – β-laktamaze, ki omogoča odpornost na antibiotik ampicilin. Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V celici s takim vezjem je dosežena podobna asimetričnost kot pri drugem sistemu z dodatno razliko. Po delitvi celice je bil obema hčerinskima celicama dodan antibiotik ampicilin. Tista celica, ki je podedovala celični pol s kompleksom obravnavanih proteinov, torej tudi β-laktamazo, je preživela bistveno dlje časa kot tista, ki ni pridobila odpornosti na ampicilin. Pri kontrolnem poskusu sta obe hčerinski celici umrli približno enako hitro. Tak sistem torej ne omogoča le doseganja asimetrije v celici, temveč tudi asimetrično delitev z nastankom dveh celic z različno usodo [5].

== Zaključek ==
V povzeti raziskavi so potrdili, da sta proteina PopZ in DivIVA osnovni enoti za doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve v celici. Pri tem imata ključno vlogo oligomerizacija in omejena difuzija teh proteinov. Ugotovili so, da lahko E. coli, ki se naravno deli simetrično, samo z izražanjem omenjenih proteinov (in adaptorja SpmX) spremenimo tako, da se polarizira in deli asimetrično. PopZ poskrbi za lokalizacijo proteinov zgolj na enem celičnem polu, DivIVA pa za gradient efektorskega proteina. Raziskava je primer uporabe principov sintezne biologije – rekonstrukcijo organizmov z dodajanjem novih genetskih vezij lahko izkoristimo za preučevanje slabše poznanih celičnih mehanizmov.

== Viri ==
[1] B. Sunchu and C. Cabernard, “Principles and mechanisms of asymmetric cell division,” Development (Cambridge), vol. 147, no. 13. Company of Biologists Ltd, Jun. 29, 2020, doi: 10.1242/dev.167650.

[2] N. W. Goehring, “PAR polarity: From complexity to design principles,” Exp. Cell Res., vol. 328, no. 2, pp. 258–266, 2014, doi: 10.1016/j.yexcr.2014.08.009.

[3] C. T. Nordyke, Y. M. Ahmed, R. Z. Puterbaugh, G. R. Bowman, and K. Varga, “Intrinsically Disordered Bacterial Polar Organizing Protein Z, PopZ, Interacts with Protein Binding Partners Through an N-terminal Molecular Recognition Feature,” J. Mol. Biol., vol. 432, no. 23, pp. 6092–6107, Nov. 2020, doi: 10.1016/j.jmb.2020.09.020.

[4] K. S. Ramamurthi and R. Losick, “Negative membrane curvature as a cue for subcellular localization of a bacterial protein,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 106, no. 32, pp. 13541–13545, Aug. 2009, doi: 10.1073/pnas.0906851106.

[5] D.-W. Lin et al., “Construction of intracellular asymmetry and asymmetric division in Escherichia coli,” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–11, Dec. 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21135-1.

[6] J. R. Kelly et al., “Measuring the activity of BioBrick promoters using an in vivo reference standard,” J. Biol. Eng., vol. 3, Apr. 2009, doi: 10.1186/1754-1611-3-4.

[7] S. K. Radhakrishnan, M. Thanbichler, and P. H. Viollier, “The dynamic interplay between a cell fate determinant and a lysozyme homolog drives the asymmetric division cycle of Caulobacter crescentus,” Genes Dev., vol. 22, no. 2, pp. 212–225, Jan. 2008, doi: 10.1101/gad.1601808.

Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli

2021-04-05T21:33:49Z

Aljaž Bratina:

== Uvod ==
Asimetrična delitev celice je delitev, pri kateri nastaneta dve hčerinski celici, ki nimata enakih lastnosti. Med njima so lahko prisotne razlike v obliki in velikosti ter razporeditvi makromolekul in organelov. Ta pojav je značilen tako za nekatere prokariontske kot nekatere evkariontske celice. Asimetrično se delijo npr. človeške matične celice – nastane ena nova matična celica in ena celica, ki se bo diferencirala – pa tudi nekatere bakterije, npr. Caulobacter crescentus. Da je delitev asimetrična, mora biti že pred njo v materinski celici vzpostavljena asimetrija oz. mora priti do polarizacije celice. To pomeni, da določeni celični mehanizmi poskrbijo za neenako razporeditev makromolekul v celici. Do tega lahko pride zaradi zunanjih ali notranjih dejavnikov [1].

== Celični mehanizmi za zagotavljanje asimetričnosti ==
Mehanizem doseganja asimetričnosti in proteinskega gradienta vključuje različne proteinske enote in interakcije med njimi. Mednje spadajo oligomerizacija proteinov in regulacije njihove difuzije. Nekatere od teh lastnosti so že okarakterizirane, mnoge pa še ne [1].
Pri polarizaciji evkariontske celice so ključni proteini PAR (angl. partitioning-defective proteins). Mednje spadajo ogrodni proteini, ki služijo kot prijemališča za različne efektorske encime, včasih pa njihovo povezavo omogočajo tudi adaptorski proteini. Ključna posebnost proteinov PAR je, da na celični membrani oz. v njeni bližini tvorijo diskretne membranske domene, sestavljene iz določenih proteinov PAR, te pa so različne v posameznih delih celic – npr. na polih paličaste bakterijske celice. Pogosto neka skupina proteinov PAR izključuje drugo – torej izražanje ene skupine PAR na neki membranski domeni onemogoča nahajanje druge skupine PAR na istem mestu [2].
PopZ (angl. polar organizing protein) je protein, ki ima osrednjo vlogo pri doseganju asimetričnosti bakterije Caulobacter crescentus. Po nastanku najprej po celici prosto difundira, nato pa homooligomerizira in se usidra na enega izmed njenih polov. Tam deluje kot središče za interakcije z mnogimi drugimi proteini. Je intrinzično nestrukturiran protein z izjemo krajšega motiva, ki omogoča pripenjanje drugih proteinov [3].
Za asimetričnost pri Bacillus subtilis je najbolj pomemben protein DivIVA. Nahaja se predvsem v bližini negativno ukrivljenih membran. V paličasti obliki celice sta to predvsem njena pola. Zaenkrat ni točno znano, na kakšen način protein prepozna ukrivljenost, niti ni natančno poznana njegova struktura [4].
Za boljše razumevanje teh interakcij je uporaben sinteznobiološki pristop. E. coli je bakterija, ki se običajno deli simetrično. Z njenim manipuliranjem lahko ugotovimo, kateri so minimalni genetski elementi, ki določajo želen fenotip – asimetrično delitev celice. To naredimo tako, da gene iz drugih organizmov, ki ta pojav regulirajo, vnesemo v E. coli, saj tako nanje ne vpliva morebitna intrinzična regulacija [5].

== Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli ==
=== PopZ kot ogrodni protein za lokalizacijo efektorskih proteinov ===
Raziskovalci so asimetričnost celice E. coli najprej poskušali doseči z vnosom gena za protein PopZ. Da bi ga lahko zasledovali, so uporabili fuzijo z rdečim fluorescirajočim proteinom (mRFP-PopZ). Uporabili so ti. Andersonov promotor J23116, ki je eden izmed standardnih bioloških delov [6]. Izražanje gena s tem promotorjem je zmerno intenzivno, sintetiziran protein pa se nahaja le na enem polu celice v jasno definiranem območju z ostro mejo. Po celični delitvi se ves izražen PopZ nahaja zgolj v eni celici – tisti, ki je nastala iz ustreznega pola. Pri uporabi skrajšane različice PopZ, ki ne vsebuje C-končne domene, pomembne za oligomerizacijo proteina, je protein po izražanju razporejen po celotni celici in se pri delitvi enakomerno razdeli med hčerinski celici. Protein PopZ torej lahko povzroči asimetričnost celice, za kar pa je nujno potrebna njegova oligomerizacija [5].
PopZ v C. crescentus deluje kot ogrodje za pripenjanje ostalih proteinov in tako zagotavlja njihovo asimetrično porazdelitev. Cilj nadaljevanja raziskave je bil ugotoviti, ali tako funkcijo lahko protein ohrani tudi v E. coli. Eden izmed proteinov, ki se vežejo na PopZ je SpmX, ta pa potem deluje kot adaptor za nadaljnjo vezavo drugih proteinov. Aktivna je že njegova skrajšana oblika SpmXΔC, ki vsebuje N-končen del [7]. Pri izražanju proteina SpmXΔC s fuzijskim reporterjem sfGFP (zeleni fluorescirajoči protein) in konstrukta mRFP-PopZ pride do prekrivanja fluorescence reporterjev na enem izmed polov celice. Proteina torej kolokalizirata, kar dokazuje, da interagirata in PopZ tudi v E. coli ohrani ogrodno funkcijo za vezavo ostalih proteinov [5].
Adaptor SpmX lahko služi za vezavo nekega efektorskega proteina z encimsko aktivnostjo. V takem primeru je izražena funkcija ogrodnega proteina PopZ, da omogoči funkcionalnost nekemu efektorskemu proteinu zgolj na enem izmed polov celic. Za preučevanje možnosti tega procesa v E. coli je bila kot efektor izbrana RNA-polimeraza T7 oz. njena optimizirana oblika. Uporabljena RNA-polimeraza je bila razdeljena na dva dela, N-končni in C-končni, na vsakega od teh pa je bil v vseh poskusih pripet adaptor SpmXΔC. Raziskovalci so želeli potrditi hipotezo, da lahko lokalizacija obeh delov na celičnem polu privede obe polovici dovolj skupaj, da je polimeraza aktivna. Predhodno so v raziskavi izražali vsako polovico RNA-polimeraze T7 s fuziranim SpmXΔC in reporterjem sfGFP posebej (konstrukta N-RNAP-sfGFP-SpmXΔC oz. SpmXΔC-sfGFP-C-RNAP), toda hkrati z mRFP-PopZ. S poskusom so pokazali, da tudi taka konstrukta protein PopZ pričakovano uspešno prostorsko omeji le na en celični pol [5].

=== Zasnova ustreznih genetskih vezij ===
V osrednjem delu raziskave so bila zasnovana tri genetska vezja, vsako predstavlja nadgradnjo prejšnjega. Prvo genetsko vezje vsebuje naslednje elemente: gen za konstrukt mRFP-PopZ z Andersonovim promotorjem, zapisa za fuziji adaptorja SpmXΔC s posameznim delom RNA-polimeraze T7 (eT7pN-spmXN oz. spmXN-eT7PC) s promotorjem Ptac, gen za reporter sfGFP s promotorjem PT7 in zapis za represor Lac s svojim promotorjem. Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V bakterijah s prvim vezjem, ko je izražen tudi mRFP-PopZ, je zelena fluorescenca bistveno intenzivnejša kot v kontrolnem poskusu. To pomeni, da je prišlo do uspešnega sestavljanja RNA-polimeraze T7 in izražanja gena sfGFP, ki ima promotor, na katerega se veže obravnavna polimeraza. Poskus jasno pokaže tudi, da je RNA-polimeraza T7 lokalizirana na polu bakterije, torej tam deluje, kar pomeni da lahko ogrodni sistem z osrednjim proteinom PopZ uspešno zasidra efektorske encime na polu celice [5].
Pri uporabi prvega genetskega vezja produkt sfGFP prosto difundira po celici, torej ta sistem kljub nahajanju na celičnem polu ne omogoča asimetrične razporeditve ostalih proteinov, ki nastanejo kasneje v sintezni poti. Da bi asimetrijo dosegli, so raziskovalci skonstruirali prilagojeno, drugo genetsko vezje. Njegov pomemben element je protein DivIVA. Predhodno so v raziskavi pokazali, da se sam protein DivIVA v obliki fuzije z reporterjem sfGPF nahaja na obeh polih celice E. coli, ne pa prosto po celici, kar je potrditev tega, da prepozna negativno ukrivljeno membrano. Pokazano je bilo tudi, da se proteina DivIVA in PopZ ne izključujeta. To pomeni, da se ob skupnem izražanju mRFP-PopZ in DivIVA-sfGFP prvi pričakovano nahaja na enem polu celice, DivIVA pa na obeh, tako kot če bi bila izražena vsak posebej, in se prostorsko ne ovirata [5].
V prvem genetskem vezju je bil kot reporter izbran gen za sfGFP, ki prosto difundira, v drugem pa sfGFP, vezan na DivIVA (DivIVA-sfGFP). Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V bakterijah z drugim vezjem je zelena fluorescenca bistveno bolj intenzivna na enem polu, tistem, na katerem je lokalizirana tudi RNA-polimeraza T7 (vidna kot rdeča fluorescenca zaradi posredne vezave na mRFP-PopZ). V kontrolnem poskusu je zelena fluorescenca zanemarljiva. Dodatni poskusi so pokazali tudi, da je difuzijski koeficient konstrukta DivIVA-sfGFP manjši kot od samega sfGFP, torej zadnji lažje difundira. Celostno so torej rezultati potrdili, da pri uporabi drugega vezja pride do gradienta proteina, katerega gen je za promotorjem T7. Ob prisotnosti proteinov PopZ, SpmX in DivIVA lahko torej dosežemo proteinski gradient, če želen protein interagira s proteinom DivIVA [5].
Tretje genetsko vezje je bilo dodatno prilagojeno na tak način, da je omogočalo doseči drugačne fenotipe hčerinskih celic po delitvi asimetrične matične celice E. coli. Tretji sistem kot reporterski protein vsebuje fuzijo proteinov DivIVA, sfGFP in AmpC – β-laktamaze, ki omogoča odpornost na antibiotik ampicilin. Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V celici s takim vezjem je dosežena podobna asimetričnost kot pri drugem sistemu z dodatno razliko. Po delitvi celice je bil obema hčerinskima celicama dodan antibiotik ampicilin. Tista celica, ki je podedovala celični pol s kompleksom obravnavanih proteinov, torej tudi β-laktamazo, je preživela bistveno dlje časa kot tista, ki ni pridobila odpornosti na ampicilin. Pri kontrolnem poskusu sta obe hčerinski celici umrli približno enako hitro. Tak sistem torej ne omogoča le doseganja asimetrije v celici, temveč tudi asimetrično delitev z nastankom dveh celic z različno usodo [5].

== Zaključek ==
V povzeti raziskavi so potrdili, da sta proteina PopZ in DivIVA osnovni enoti za doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve v celici. Pri tem imata ključno vlogo oligomerizacija in omejena difuzija teh proteinov. Ugotovili so, da lahko E. coli, ki se naravno deli simetrično, samo z izražanjem omenjenih proteinov (in adaptorja SpmX) spremenimo tako, da se polarizira in deli asimetrično. PopZ poskrbi za lokalizacijo proteinov zgolj na enem celičnem polu, DivIVA pa za gradient efektorskega proteina. Raziskava je primer uporabe principov sintezne biologije – rekonstrukcijo organizmov z dodajanjem novih genetskih vezij lahko izkoristimo za preučevanje slabše poznanih celičnih mehanizmov.

== Viri ==
[1] B. Sunchu and C. Cabernard, “Principles and mechanisms of asymmetric cell division,” Development (Cambridge), vol. 147, no. 13. Company of Biologists Ltd, Jun. 29, 2020, doi: 10.1242/dev.167650.
[2] N. W. Goehring, “PAR polarity: From complexity to design principles,” Exp. Cell Res., vol. 328, no. 2, pp. 258–266, 2014, doi: 10.1016/j.yexcr.2014.08.009.
[3] C. T. Nordyke, Y. M. Ahmed, R. Z. Puterbaugh, G. R. Bowman, and K. Varga, “Intrinsically Disordered Bacterial Polar Organizing Protein Z, PopZ, Interacts with Protein Binding Partners Through an N-terminal Molecular Recognition Feature,” J. Mol. Biol., vol. 432, no. 23, pp. 6092–6107, Nov. 2020, doi: 10.1016/j.jmb.2020.09.020.
[4] K. S. Ramamurthi and R. Losick, “Negative membrane curvature as a cue for subcellular localization of a bacterial protein,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 106, no. 32, pp. 13541–13545, Aug. 2009, doi: 10.1073/pnas.0906851106.
[5] D.-W. Lin et al., “Construction of intracellular asymmetry and asymmetric division in Escherichia coli,” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–11, Dec. 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21135-1.
[6] J. R. Kelly et al., “Measuring the activity of BioBrick promoters using an in vivo reference standard,” J. Biol. Eng., vol. 3, Apr. 2009, doi: 10.1186/1754-1611-3-4.
[7] S. K. Radhakrishnan, M. Thanbichler, and P. H. Viollier, “The dynamic interplay between a cell fate determinant and a lysozyme homolog drives the asymmetric division cycle of Caulobacter crescentus,” Genes Dev., vol. 22, no. 2, pp. 212–225, Jan. 2008, doi: 10.1101/gad.1601808.

Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli

2021-04-05T21:31:57Z

Aljaž Bratina: New page: Uvod Asimetrična delitev celice je delitev, pri kateri nastaneta dve hčerinski celici, ki nimata enakih lastnosti. Med njima so lahko prisotne razlike v obliki in velikosti ter razporedi...

Uvod
Asimetrična delitev celice je delitev, pri kateri nastaneta dve hčerinski celici, ki nimata enakih lastnosti. Med njima so lahko prisotne razlike v obliki in velikosti ter razporeditvi makromolekul in organelov. Ta pojav je značilen tako za nekatere prokariontske kot nekatere evkariontske celice. Asimetrično se delijo npr. človeške matične celice – nastane ena nova matična celica in ena celica, ki se bo diferencirala – pa tudi nekatere bakterije, npr. Caulobacter crescentus. Da je delitev asimetrična, mora biti že pred njo v materinski celici vzpostavljena asimetrija oz. mora priti do polarizacije celice. To pomeni, da določeni celični mehanizmi poskrbijo za neenako razporeditev makromolekul v celici. Do tega lahko pride zaradi zunanjih ali notranjih dejavnikov [1].

Celični mehanizmi za zagotavljanje asimetričnosti
Mehanizem doseganja asimetričnosti in proteinskega gradienta vključuje različne proteinske enote in interakcije med njimi. Mednje spadajo oligomerizacija proteinov in regulacije njihove difuzije. Nekatere od teh lastnosti so že okarakterizirane, mnoge pa še ne [1].
Pri polarizaciji evkariontske celice so ključni proteini PAR (angl. partitioning-defective proteins). Mednje spadajo ogrodni proteini, ki služijo kot prijemališča za različne efektorske encime, včasih pa njihovo povezavo omogočajo tudi adaptorski proteini. Ključna posebnost proteinov PAR je, da na celični membrani oz. v njeni bližini tvorijo diskretne membranske domene, sestavljene iz določenih proteinov PAR, te pa so različne v posameznih delih celic – npr. na polih paličaste bakterijske celice. Pogosto neka skupina proteinov PAR izključuje drugo – torej izražanje ene skupine PAR na neki membranski domeni onemogoča nahajanje druge skupine PAR na istem mestu [2].
PopZ (angl. polar organizing protein) je protein, ki ima osrednjo vlogo pri doseganju asimetričnosti bakterije Caulobacter crescentus. Po nastanku najprej po celici prosto difundira, nato pa homooligomerizira in se usidra na enega izmed njenih polov. Tam deluje kot središče za interakcije z mnogimi drugimi proteini. Je intrinzično nestrukturiran protein z izjemo krajšega motiva, ki omogoča pripenjanje drugih proteinov [3].
Za asimetričnost pri Bacillus subtilis je najbolj pomemben protein DivIVA. Nahaja se predvsem v bližini negativno ukrivljenih membran. V paličasti obliki celice sta to predvsem njena pola. Zaenkrat ni točno znano, na kakšen način protein prepozna ukrivljenost, niti ni natančno poznana njegova struktura [4].
Za boljše razumevanje teh interakcij je uporaben sinteznobiološki pristop. E. coli je bakterija, ki se običajno deli simetrično. Z njenim manipuliranjem lahko ugotovimo, kateri so minimalni genetski elementi, ki določajo želen fenotip – asimetrično delitev celice. To naredimo tako, da gene iz drugih organizmov, ki ta pojav regulirajo, vnesemo v E. coli, saj tako nanje ne vpliva morebitna intrinzična regulacija [5].

Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli
PopZ kot ogrodni protein za lokalizacijo efektorskih proteinov
Raziskovalci so asimetričnost celice E. coli najprej poskušali doseči z vnosom gena za protein PopZ. Da bi ga lahko zasledovali, so uporabili fuzijo z rdečim fluorescirajočim proteinom (mRFP-PopZ). Uporabili so ti. Andersonov promotor J23116, ki je eden izmed standardnih bioloških delov [6]. Izražanje gena s tem promotorjem je zmerno intenzivno, sintetiziran protein pa se nahaja le na enem polu celice v jasno definiranem območju z ostro mejo. Po celični delitvi se ves izražen PopZ nahaja zgolj v eni celici – tisti, ki je nastala iz ustreznega pola. Pri uporabi skrajšane različice PopZ, ki ne vsebuje C-končne domene, pomembne za oligomerizacijo proteina, je protein po izražanju razporejen po celotni celici in se pri delitvi enakomerno razdeli med hčerinski celici. Protein PopZ torej lahko povzroči asimetričnost celice, za kar pa je nujno potrebna njegova oligomerizacija [5].
PopZ v C. crescentus deluje kot ogrodje za pripenjanje ostalih proteinov in tako zagotavlja njihovo asimetrično porazdelitev. Cilj nadaljevanja raziskave je bil ugotoviti, ali tako funkcijo lahko protein ohrani tudi v E. coli. Eden izmed proteinov, ki se vežejo na PopZ je SpmX, ta pa potem deluje kot adaptor za nadaljnjo vezavo drugih proteinov. Aktivna je že njegova skrajšana oblika SpmXΔC, ki vsebuje N-končen del [7]. Pri izražanju proteina SpmXΔC s fuzijskim reporterjem sfGFP (zeleni fluorescirajoči protein) in konstrukta mRFP-PopZ pride do prekrivanja fluorescence reporterjev na enem izmed polov celice. Proteina torej kolokalizirata, kar dokazuje, da interagirata in PopZ tudi v E. coli ohrani ogrodno funkcijo za vezavo ostalih proteinov [5].
Adaptor SpmX lahko služi za vezavo nekega efektorskega proteina z encimsko aktivnostjo. V takem primeru je izražena funkcija ogrodnega proteina PopZ, da omogoči funkcionalnost nekemu efektorskemu proteinu zgolj na enem izmed polov celic. Za preučevanje možnosti tega procesa v E. coli je bila kot efektor izbrana RNA-polimeraza T7 oz. njena optimizirana oblika. Uporabljena RNA-polimeraza je bila razdeljena na dva dela, N-končni in C-končni, na vsakega od teh pa je bil v vseh poskusih pripet adaptor SpmXΔC. Raziskovalci so želeli potrditi hipotezo, da lahko lokalizacija obeh delov na celičnem polu privede obe polovici dovolj skupaj, da je polimeraza aktivna. Predhodno so v raziskavi izražali vsako polovico RNA-polimeraze T7 s fuziranim SpmXΔC in reporterjem sfGFP posebej (konstrukta N-RNAP-sfGFP-SpmXΔC oz. SpmXΔC-sfGFP-C-RNAP), toda hkrati z mRFP-PopZ. S poskusom so pokazali, da tudi taka konstrukta protein PopZ pričakovano uspešno prostorsko omeji le na en celični pol [5].
Zasnova ustreznih genetskih vezij
V osrednjem delu raziskave so bila zasnovana tri genetska vezja, vsako predstavlja nadgradnjo prejšnjega. Prvo genetsko vezje vsebuje naslednje elemente: gen za konstrukt mRFP-PopZ z Andersonovim promotorjem, zapisa za fuziji adaptorja SpmXΔC s posameznim delom RNA-polimeraze T7 (eT7pN-spmXN oz. spmXN-eT7PC) s promotorjem Ptac, gen za reporter sfGFP s promotorjem PT7 in zapis za represor Lac s svojim promotorjem. Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V bakterijah s prvim vezjem, ko je izražen tudi mRFP-PopZ, je zelena fluorescenca bistveno intenzivnejša kot v kontrolnem poskusu. To pomeni, da je prišlo do uspešnega sestavljanja RNA-polimeraze T7 in izražanja gena sfGFP, ki ima promotor, na katerega se veže obravnavna polimeraza. Poskus jasno pokaže tudi, da je RNA-polimeraza T7 lokalizirana na polu bakterije, torej tam deluje, kar pomeni da lahko ogrodni sistem z osrednjim proteinom PopZ uspešno zasidra efektorske encime na polu celice [5].
Pri uporabi prvega genetskega vezja produkt sfGFP prosto difundira po celici, torej ta sistem kljub nahajanju na celičnem polu ne omogoča asimetrične razporeditve ostalih proteinov, ki nastanejo kasneje v sintezni poti. Da bi asimetrijo dosegli, so raziskovalci skonstruirali prilagojeno, drugo genetsko vezje. Njegov pomemben element je protein DivIVA. Predhodno so v raziskavi pokazali, da se sam protein DivIVA v obliki fuzije z reporterjem sfGPF nahaja na obeh polih celice E. coli, ne pa prosto po celici, kar je potrditev tega, da prepozna negativno ukrivljeno membrano. Pokazano je bilo tudi, da se proteina DivIVA in PopZ ne izključujeta. To pomeni, da se ob skupnem izražanju mRFP-PopZ in DivIVA-sfGFP prvi pričakovano nahaja na enem polu celice, DivIVA pa na obeh, tako kot če bi bila izražena vsak posebej, in se prostorsko ne ovirata [5].
V prvem genetskem vezju je bil kot reporter izbran gen za sfGFP, ki prosto difundira, v drugem pa sfGFP, vezan na DivIVA (DivIVA-sfGFP). Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V bakterijah z drugim vezjem je zelena fluorescenca bistveno bolj intenzivna na enem polu, tistem, na katerem je lokalizirana tudi RNA-polimeraza T7 (vidna kot rdeča fluorescenca zaradi posredne vezave na mRFP-PopZ). V kontrolnem poskusu je zelena fluorescenca zanemarljiva. Dodatni poskusi so pokazali tudi, da je difuzijski koeficient konstrukta DivIVA-sfGFP manjši kot od samega sfGFP, torej zadnji lažje difundira. Celostno so torej rezultati potrdili, da pri uporabi drugega vezja pride do gradienta proteina, katerega gen je za promotorjem T7. Ob prisotnosti proteinov PopZ, SpmX in DivIVA lahko torej dosežemo proteinski gradient, če želen protein interagira s proteinom DivIVA [5].
Tretje genetsko vezje je bilo dodatno prilagojeno na tak način, da je omogočalo doseči drugačne fenotipe hčerinskih celic po delitvi asimetrične matične celice E. coli. Tretji sistem kot reporterski protein vsebuje fuzijo proteinov DivIVA, sfGFP in AmpC – β-laktamaze, ki omogoča odpornost na antibiotik ampicilin. Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V celici s takim vezjem je dosežena podobna asimetričnost kot pri drugem sistemu z dodatno razliko. Po delitvi celice je bil obema hčerinskima celicama dodan antibiotik ampicilin. Tista celica, ki je podedovala celični pol s kompleksom obravnavanih proteinov, torej tudi β-laktamazo, je preživela bistveno dlje časa kot tista, ki ni pridobila odpornosti na ampicilin. Pri kontrolnem poskusu sta obe hčerinski celici umrli približno enako hitro. Tak sistem torej ne omogoča le doseganja asimetrije v celici, temveč tudi asimetrično delitev z nastankom dveh celic z različno usodo [5].

Zaključek
V povzeti raziskavi so potrdili, da sta proteina PopZ in DivIVA osnovni enoti za doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve v celici. Pri tem imata ključno vlogo oligomerizacija in omejena difuzija teh proteinov. Ugotovili so, da lahko E. coli, ki se naravno deli simetrično, samo z izražanjem omenjenih proteinov (in adaptorja SpmX) spremenimo tako, da se polarizira in deli asimetrično. PopZ poskrbi za lokalizacijo proteinov zgolj na enem celičnem polu, DivIVA pa za gradient efektorskega proteina. Raziskava je primer uporabe principov sintezne biologije – rekonstrukcijo organizmov z dodajanjem novih genetskih vezij lahko izkoristimo za preučevanje slabše poznanih celičnih mehanizmov.

[1] B. Sunchu and C. Cabernard, “Principles and mechanisms of asymmetric cell division,” Development (Cambridge), vol. 147, no. 13. Company of Biologists Ltd, Jun. 29, 2020, doi: 10.1242/dev.167650.
[2] N. W. Goehring, “PAR polarity: From complexity to design principles,” Exp. Cell Res., vol. 328, no. 2, pp. 258–266, 2014, doi: 10.1016/j.yexcr.2014.08.009.
[3] C. T. Nordyke, Y. M. Ahmed, R. Z. Puterbaugh, G. R. Bowman, and K. Varga, “Intrinsically Disordered Bacterial Polar Organizing Protein Z, PopZ, Interacts with Protein Binding Partners Through an N-terminal Molecular Recognition Feature,” J. Mol. Biol., vol. 432, no. 23, pp. 6092–6107, Nov. 2020, doi: 10.1016/j.jmb.2020.09.020.
[4] K. S. Ramamurthi and R. Losick, “Negative membrane curvature as a cue for subcellular localization of a bacterial protein,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 106, no. 32, pp. 13541–13545, Aug. 2009, doi: 10.1073/pnas.0906851106.
[5] D.-W. Lin et al., “Construction of intracellular asymmetry and asymmetric division in Escherichia coli,” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–11, Dec. 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21135-1.
[6] J. R. Kelly et al., “Measuring the activity of BioBrick promoters using an in vivo reference standard,” J. Biol. Eng., vol. 3, Apr. 2009, doi: 10.1186/1754-1611-3-4.
[7] S. K. Radhakrishnan, M. Thanbichler, and P. H. Viollier, “The dynamic interplay between a cell fate determinant and a lysozyme homolog drives the asymmetric division cycle of Caulobacter crescentus,” Genes Dev., vol. 22, no. 2, pp. 212–225, Jan. 2008, doi: 10.1101/gad.1601808.

BNT-seminar

2021-03-12T12:49:43Z

Aljaž Bratina: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019058 
30170022 
30200303 
30019363 
30019057 
30170131 
30170078 
30019040 
30170177 
30200324 
30019063 
30170103 
30170002 
30200319 
30200309 
30200320 
30019056 
30200311 
30200306 
30170243 
30019051 
30170141 
30170061 
30019035 
30200316 
30170222 
30200317 
30170193 
30200315 
30200307 
30200321 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
16.3.2021 
16.3.2021 
23.3.2021 
23.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
13.4.2021 
20.4.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
23.3.2021 
20.4.2020 
6.4.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
11.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
30.3.2021 
13.4.2021 
11.5.2021 
13.4.2021 
18.5.2021 
18.5.2021 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Aljaž Bratina 
Matija Ruparčič 
Urban Hribar 
Sabina Sladič Oblak 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Ajda Godec 
Martin Špendl 
Tjaša Mlakar 
Sara Laznik 
Martina Lokar 
Doroteja Armič 
Martin Špendl 
Saša Slabe 
Mateja Žvipelj 
Špela Supej 
Urška Fajdiga 
Ernestina Lavrih 
Nika Mikulič Vernik 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Tadej Medved 
Urška Zagorc 
Nina Lukančič 
Urška Pečarič Strnad 
Anže Karlek 
Luka Gnidovec 
Urša Lovše 
Almina Tahirović 
Mirsad Mešić 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Urška Zagorc 
Ernestina Lavrih 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Eva Keber 
Jernej Imperl 
Barbara Slapnik 
Urša Lovše 
Mateja Žvipelj 
Neža Pavko 
Almina Tahirović 
Nika Mikulič Vernik 
Urška Fajdiga 
Saša Slabe 
Klementina Polanec 
Tjaša Mlakar 
Ajda Godec 
Jernej Imperl 
Špela Supej 
Aljaž Bratina 
Nina Lukančič 
Matija Ruparčič 
Anže Karlek 
Sabina S. Oblak 
Urban Hribar 
Mirsad Mešić 
Tina Kolenc Milavec 
Tadej Medved 
|}

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

Sistem izključitve naknadne okužbe

2019-04-09T09:48:54Z

Aljaž Bratina: /* Genska stabilnost */

==Uvod==
Superinfekcijska izključitev (ali izključitev naknadne okužbe; sistem Sie, iz angl. ''superinfection exclusion'') je fenomen, pri katerem primarna okužba z virusom prepreči naknadno okužbo z istim ali podobnim virusom. Virioni (virusni delci) nimajo lastnega metabolizma in mehanizma razmnoževanja, zato svoj dedni material vnesejo v gostiteljsko celico. Celični proteini tako omogočijo replikacijo virusnega dednega materiala in sintezo komponent, ki so nujne za obstoj virusnega delca. Običajno bakterijska gostiteljska celica lizira, pri čemer se sprostijo novonastali bakteriofagi. Mehanizem, pri katerem virusni dedni material, vključen v bakterijsko celico, prepreči prihod drugega faga, je z evolucijskega vidika za virus smiselna poteza, saj mu omogoči, da celico uporabi le za lastno razmnoževanje. Tega niso sposobni le virusi, pomembni za bakterije, ampak tudi mnogi virusi, pomembni za ljudi, živali in rastline.
==Virusna latenca==
Latentni virus je neaktiven virus, skrit v okuženi celici in njenih potomkah. Za razvoj virusne latence ima proces izključitve naknadne okužbe ključno vlogo. Lizogeni cikel virusu prvenstveno omogoči zaščito pred antivirusnimi snovmi, ki na provirusno obliko nimajo učinka, in povečanje možnosti prenosa virusnega dednega materiala tako horizontalno kot tudi na potomke gostiteljske celice.

==Genska stabilnost==
Preprečitev naknadne okužbe gostiteljske celice je za virus pomembna tudi evolucijsko z vidika genske stabilnosti, saj v posamezni virusni populaciji določa strukturo dednega materiala delcev. Izključitev superinfekcije primarnemu virusu, ki si z osebki istega ali sorodnega seva deli isto ekološko nišo in kompetitivno išče gostitelja, omogoči ohranjanje zaporedja nukleotidov oziroma stabilnost genskega materiala. Če je v celici kopija dednega zapisa le enega virusa, obstaja manjša verjetnost, da bi prišlo do neželenih rekombinacij in prerazporeditev genov, to pa omogoča vsesplošno raznolikost znotraj skupine virusov. Biodiverziteta fagov znotraj skupine virusov tipa T omogoča prepoznavanje različnih – celo modificiranih – receptorjev na gostiteljski celici.

==Zgodnje raziskave==
Fenomen izključitve naknadne okužbe sorodnih virusov so znanstveniki prvič opazili v začetku 50. let 20. stoletja. Med raziskavami na fagih tipa T so ugotovili, da je okužba z dvema virusoma neuspešna, razen v primeru, če virusa dodajo hkrati. Če so enega dodali prej kot drugega, drugi ni okužil celice.
Obstoj mehanizma, ki v gostiteljski celici povzroči korenito spremembo v dovzetnosti za sprejemanje dednega materiala sekundarnega bakteriofaga, dodanega z nekaj minutno zakasnitvijo, so posredno dokazali preko razpada genskega materiala le-tega. Kot sredstvo obarjanja dednega materiala razpadlega sekundarno dodanega virusa jim je služila trikloroocetna kislina. Zanimivo je bilo, da se je 50 % vzorca nahajalo v topni frakciji, kar pa je jasno kazalo na razpad DNA (trikloroocetna kislina obori polimere, daljše od 20 nukleotidov). Nadaljnje serije poskusov so jim pomagale pridobiti dokaze, da ni razpadla le DNA viriona, pač pa celoten delec, in da ni prišlo do prenosa genetske informacije sekundarnega virusa na potomce.
==Mehanizmi Sie==
Virusni dedni material vsebuje zapise za proteine, ki omogočajo izključitev naknadne okužbe. Ti virusni proteini lahko preprečijo vstop dednega materiala sekundarnega virusa v citoplazmo primarno okužene gostiteljske celice tako, da inhibirajo virusne peptidoglikan hidrolazne encime, ki virusnemu delcu omogočijo »preboj« skozi celično steno bakterijske celice. Lahko pa povzročijo modifikacijo specifičnih receptorjev na površini celice, ki jih prepoznajo virioni.
V nadaljevanju je opisanih nekaj primerov sistemov superinfekcijske izključitve pri posameznih gramnegativnih in grampozitivnih bakterijah.

==Sie pri gramnegativnih bakterijah==
Obstaja več proteinskih mehanizmov, ki v različnih gramnegativnih bakterijah povzročijo superinfekcijsko izključitev. Zapis za te proteine se nahaja v genomu bakteriofagov, ki primarno okužijo celico. Najbolje raziskan sistem Sie obsega proteina Imm (iz angl. ''immunity'', tj. imunost) in Sp (iz angl. ''spackle'', tj. kit, kitati), ki ju kodira genom faga T4 (in njemu podobnih fagov). Ti fagi specifično okužijo bakterijo ''Escherchia coli''. Ta proteina povzročata izključitev le omenjenih fagov, medtem ko superinfekcija ostalim (P1, c1, λ …) s tem mehanizmom ni onemogočena.
===Protein Imm===
Protein Imm je sestavljen iz ene polipeptidne verige, ki vsebuje 83 aminokislinskih ostankov. Njegova tridimenzionalna struktura še ni bila rešena. Ima dve daljši hidrofobni regiji: ena je iz 30, druga pa iz 28 ostankov. Z njima se protein najverjetneje usidra v plazmalemo ''E. coli''. Med njima je hidrofilen del iz 4 ostankov, od katerih sta dva pozitivno nabita (R33 in K36). C-končni del iz 18 ostankov je prav tako nekoliko bolj hidrofilen. Eksperimentalno je bilo ugotovljeno, da je C-končna regija usmerjena proti citosolu. Pri tem so bili sintetizirani fuzijski proteini Imm z β-galaktozidazo (ta se normalno nahaja v citosolu) in pa s kislo fosfatazo (ta se normalno nahaja v periplazemskem prostoru). Izkazalo se je, da sta v takem primeru oba encima aktivna v citosolu, kar pomeni, da se C-končna regija proteina Imm nahaja na citosolni strani. Ta regija torej ne more služiti za prepoznavanje faga. Poleg tega C-končni del ne kaže nobene specifičnosti in njegov skupni naboj ne predstavlja pomembne vloge. Tudi če se ta del, ki je nekoliko bazičen, zamenja z zaporedjem, ki vsebuje nekaj več kislih aminokislinskih ostankov, se aktivnost proteina večinoma ohrani. 
Podobno se ob odstranitvi dveh pozitivnih nabojev v vmesni regiji izkaže, da aktivnost proteina ni inhibirana, temveč le nekoliko zmanjšana. Nenavadni sta tudi dolžini membranskih domen (30 in 28 aminokislinskih ostankov, v običajnih transmembranskih domenah pa okrog 20). Zaradi navedenih razlogov obstajajo argumentirana domnevanja, da Imm sploh ni integralni protein. Predlagano je bilo, da Imm le interagira z drugim proteinom, ki je komponenta mesta na plazmalemi za vnos fagne DNA. Imm z vezavo na ta protein, ki zanj dejansko deluje kot receptor, spremeni njegovo konformacijo, s tem pa onemogoči prenos virusne DNA skozi plazmalemo v celico in jo preusmeri v periplazemski prostor. Empirični podati kažejo, da se 50 % DNA nabere v periplazmi, tam pa jo razgradi endonukleaza I. Ostalih 50 % ostane v fagu. 
Imunost preko tega mehanizma se razvije zelo hitro, tj. po največ 2 minutah po infekciji s primarnim fagom. ''E. coli'' ima približno 200 mest za vnos DNA (precej manj kot receptorjev za fage). Ker Imm deluje stehiometrično, je približno taka tudi njegova koncentracija. Zaradi tako majhne količine ga je ''in vivo'' zelo težko dokazati.

===Protein Sp===
Za superinfekcijsko izkjučitev faga T4 je v ''E. coli'' le v 80 % primerov odgovoren protein Imm, popolno imunost pa omogoča membranski protein Sp. Poskus je pokazal, da ima sistem ''E. coli'' in superinfekcijskega faga z deletiranim genom za Sp podobne značilnosti kot sistem, v katerem fag nima aktivnega lizocima, proteina 5. Za vnos DNA v celico fag namreč potrebuje ta protein, ki po vezavi na celico s svojo lizocimsko aktivnostjo razgradi peptidoglikanski sloj in s tem prebode periplazemski prostor ter tako dostopa do mesta za vnos DNA na plazmalemi. Protein Sp inhibira delovanje proteina 5, zato fag ne more razgraditi peptidoglikana in tako inducirati superinfekcije v gostiteljski celici. Tudi za ta protein je znano aminokislinsko zaporedje, ne pa njegova tridimenzionalna struktura.

==Sie pri grampozitivnih bakterijah==
===Protein Sie2009===
Poznavanje mehanizmov preprečevanja injiciranja DNA fagov je pri grampozitivnih bakterijah bolj omejeno kot pri gramnegativnih bakterijah. Prve objave mehanizmov Sie pri grampozitivnih bakterijah segajo v leto 2002, torej okoli 50 let po začetku proučevanja Sie. Prvi identificirani protein pri grampozitivnih bakterijah, ki omogoča Sie, je Sie2009, protein faga Tuc2009, katerega gostitelj je bakterija ''Lactococcus lactis'', ki ima pomembno vlogo pri mlečni fermentaciji. 
Gen Sie2009, ki zapisuje ta protein, se nahaja v lizogenem modulu DNA faga Tuc2009 med genom za integrazo (encim, ki omogoča vstavljanje fagne DNA v krožno DNA gostitelja) in genom, ki kodira represor. Na podlagi njegove lokacije in primerjave z geni za zapis proteinov, ki prav tako omejujejo razmnoževanje fagov, so sklepali, da Sie2009 onemogoča okužbo bakterije s fagi. Zato so želeli to nedvomno dokazati in ugotoviti, na kateri stopnji razmnoževanja bakteriofaga deluje. Sistematične preiskave so pričeli tako, da so gen vstavili v plazmid, z le-tem okužili različne vrste oziroma seve bakterij in testirali njihovo odpornost na različne bakteriofage. Izkazalo se je, da protein Sie2009 omogoča odpornost proti določenim vrstam fagov le nekaterim vrstam bakterij. 
Raziskave so nadaljevali s proučevanjem lokacije nahajanja proteina Sie2009. Ugotovili so, da je pripet na celično membrano. Preko različnih eksperimentov so še ugotovili, da protein Sie2009 ne vpliva na pritrjevanje fagov na površino bakterijske celice, niti ne ovira transformacije plazmidov ali transfekcije. Na podlagi teh rezultatov so prišli do zaključka, da Sie2009 blokira injiciranje fagne DNA, kar je bil takrat popolnoma na novo odkrit mehanizem Sie. Natančnejša razlaga pa še danes ni znana.

===Protein LTP===
Med najbolje raziskane sisteme Sie pri grampozitivnih bakterijah spada sistem LTP faga TP-J34, katerega gostitelj je bakterija ''Streptoccocus thermophilus'' J34, ki se uporablja v proizvodnji jogurta. V lizogenem modulu faga TP-J34 se nahaja genetsko stikalo, ki leži med divergentno prepisovanima genoma ''crh'' in ''cro''. Gen ''crh'' je sestavni del operona, ki ga poleg tega strukturnega gena sestavljajo še geni ''orf3'', ''ltp'' in ''int'' (po vrstnem redu prepisovanja). Gen ''crh'' kodira protein, ki je represor, gen ''orf3'' pa protein, ki je regulator. Gen ''int'' zapisuje protein integrazo, ki omogoča vstavljanje fagne DNA v krožno DNA gostitelja, gen ''ltp'' pa nosi zapis za protein LTP, 142 aminokislinskih ostankov velik lipoprotein, ki se nahaja na zunanji strani celične membrane. 
Protein LTP se izraža v lizogenem ciklu fag in omogoča sistem Sie, kar je pokazal sledeč eksperiment. V bakterije vrst ''Streptococcus thermophilus'' in ''Lactococcus lactis'' so preko plazmidov vstavili gen za protein LTP, ki je oviral razmnoževanje virusov v teh bakterijah. Pri obeh gostiteljskih bakterijah je odsotnost podvojevanja fagne DNA dokazala, da je bilo preprečeno injiciranje fagne DNA. Protein LTP pa ni onemogočal sekundarne okužbe le pri bakteriofagih TP-J34, ampak tudi pri drugih vrstah fagov. Za najobčutljivejšo se je izkazala vrsta laktokokih fagov P008, saj se je stopnja razmnoževanja fagov znižala približno za faktor 108. 
Skozi raziskave so prišli do zaključka, da LTP preprečuje vstop DNA v bakterijsko celico. Z imunokemijskim označevanjem z zlatom in elektronsko mikroskopijo so nedvomno potrdili, da se nahaja na zunanji strani celične membrane. Na podlagi strukture so sklepali, da je LTP protein, ki veže proteine. S tem so lahko izključili hipotezo, da se veže neposredno na DNA in tako onemogoča njen vstop v celico. Torej mora obstajati drug mehanizem. 
Preden lahko bakteriofagi iz družine ''Siphoviridae'' injicirajo DNA, ki je zapakirana v glavi virusa, morajo iz svojega repa potisniti ''tape measure protein'' (TMP), ki določa dolžino cevke repa, saj se le-ta sestavi okoli njega. Ko TMP zapusti fagov rep, tvori poro skozi celično membrano, skozi katero lahko pride DNA v celico. Dokazali so, da protein LTP veže protein TMP in tako povzroči injiciranje DNA v periplazmo namesto v celico. Tam se le-ta nato razgradi. Naknadna okužba je tako onemogočena.

==Viri==
*Dulbecco, R. Mutual Exclusion between related phages. ''Journal of Bacteriology'', 1951, št. 63, str. 209–217
*Lu, M.-J. in Henning, U. Superinfection exclusion by T-even-type coliphages. ''Trends in Microbiology'', 1994, let. 2, št. 4, str. 137–139
*Lu, M.-J., Stierhof, Y.-D. in Henning, U. Location and unusual membrane topology of the immunity protein of the ''Escherichia coli'' phage T4. ''Journal of Virology'', 1993, let. 67, št. 8, str. 4905–4913
*Heller, K. J. in Neve, H. Superinfection exclusion und DNA-Injektion bei Siphoviridae-Phagen. ''Biospektrum'', 2014, let. 20, št. 1, str. 26–29.
*McGrath, S., Fitzgerald, G. F. in van Sinderen, D. Identification and characterization of phage-resistance genes in temperate lactococcal bacteriophages. ''Molecular Microbiology'', 2002, let. 43, št. 2, 509–520.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Sistem izključitve naknadne okužbe

2019-04-09T09:48:44Z

Aljaž Bratina: /* Virusna latenca */

==Uvod==
Superinfekcijska izključitev (ali izključitev naknadne okužbe; sistem Sie, iz angl. ''superinfection exclusion'') je fenomen, pri katerem primarna okužba z virusom prepreči naknadno okužbo z istim ali podobnim virusom. Virioni (virusni delci) nimajo lastnega metabolizma in mehanizma razmnoževanja, zato svoj dedni material vnesejo v gostiteljsko celico. Celični proteini tako omogočijo replikacijo virusnega dednega materiala in sintezo komponent, ki so nujne za obstoj virusnega delca. Običajno bakterijska gostiteljska celica lizira, pri čemer se sprostijo novonastali bakteriofagi. Mehanizem, pri katerem virusni dedni material, vključen v bakterijsko celico, prepreči prihod drugega faga, je z evolucijskega vidika za virus smiselna poteza, saj mu omogoči, da celico uporabi le za lastno razmnoževanje. Tega niso sposobni le virusi, pomembni za bakterije, ampak tudi mnogi virusi, pomembni za ljudi, živali in rastline.
==Virusna latenca==
Latentni virus je neaktiven virus, skrit v okuženi celici in njenih potomkah. Za razvoj virusne latence ima proces izključitve naknadne okužbe ključno vlogo. Lizogeni cikel virusu prvenstveno omogoči zaščito pred antivirusnimi snovmi, ki na provirusno obliko nimajo učinka, in povečanje možnosti prenosa virusnega dednega materiala tako horizontalno kot tudi na potomke gostiteljske celice.

===Genska stabilnost===
Preprečitev naknadne okužbe gostiteljske celice je za virus pomembna tudi evolucijsko z vidika genske stabilnosti, saj v posamezni virusni populaciji določa strukturo dednega materiala delcev. Izključitev superinfekcije primarnemu virusu, ki si z osebki istega ali sorodnega seva deli isto ekološko nišo in kompetitivno išče gostitelja, omogoči ohranjanje zaporedja nukleotidov oziroma stabilnost genskega materiala. Če je v celici kopija dednega zapisa le enega virusa, obstaja manjša verjetnost, da bi prišlo do neželenih rekombinacij in prerazporeditev genov, to pa omogoča vsesplošno raznolikost znotraj skupine virusov. Biodiverziteta fagov znotraj skupine virusov tipa T omogoča prepoznavanje različnih – celo modificiranih – receptorjev na gostiteljski celici.

==Zgodnje raziskave==
Fenomen izključitve naknadne okužbe sorodnih virusov so znanstveniki prvič opazili v začetku 50. let 20. stoletja. Med raziskavami na fagih tipa T so ugotovili, da je okužba z dvema virusoma neuspešna, razen v primeru, če virusa dodajo hkrati. Če so enega dodali prej kot drugega, drugi ni okužil celice.
Obstoj mehanizma, ki v gostiteljski celici povzroči korenito spremembo v dovzetnosti za sprejemanje dednega materiala sekundarnega bakteriofaga, dodanega z nekaj minutno zakasnitvijo, so posredno dokazali preko razpada genskega materiala le-tega. Kot sredstvo obarjanja dednega materiala razpadlega sekundarno dodanega virusa jim je služila trikloroocetna kislina. Zanimivo je bilo, da se je 50 % vzorca nahajalo v topni frakciji, kar pa je jasno kazalo na razpad DNA (trikloroocetna kislina obori polimere, daljše od 20 nukleotidov). Nadaljnje serije poskusov so jim pomagale pridobiti dokaze, da ni razpadla le DNA viriona, pač pa celoten delec, in da ni prišlo do prenosa genetske informacije sekundarnega virusa na potomce.
==Mehanizmi Sie==
Virusni dedni material vsebuje zapise za proteine, ki omogočajo izključitev naknadne okužbe. Ti virusni proteini lahko preprečijo vstop dednega materiala sekundarnega virusa v citoplazmo primarno okužene gostiteljske celice tako, da inhibirajo virusne peptidoglikan hidrolazne encime, ki virusnemu delcu omogočijo »preboj« skozi celično steno bakterijske celice. Lahko pa povzročijo modifikacijo specifičnih receptorjev na površini celice, ki jih prepoznajo virioni.
V nadaljevanju je opisanih nekaj primerov sistemov superinfekcijske izključitve pri posameznih gramnegativnih in grampozitivnih bakterijah.

==Sie pri gramnegativnih bakterijah==
Obstaja več proteinskih mehanizmov, ki v različnih gramnegativnih bakterijah povzročijo superinfekcijsko izključitev. Zapis za te proteine se nahaja v genomu bakteriofagov, ki primarno okužijo celico. Najbolje raziskan sistem Sie obsega proteina Imm (iz angl. ''immunity'', tj. imunost) in Sp (iz angl. ''spackle'', tj. kit, kitati), ki ju kodira genom faga T4 (in njemu podobnih fagov). Ti fagi specifično okužijo bakterijo ''Escherchia coli''. Ta proteina povzročata izključitev le omenjenih fagov, medtem ko superinfekcija ostalim (P1, c1, λ …) s tem mehanizmom ni onemogočena.
===Protein Imm===
Protein Imm je sestavljen iz ene polipeptidne verige, ki vsebuje 83 aminokislinskih ostankov. Njegova tridimenzionalna struktura še ni bila rešena. Ima dve daljši hidrofobni regiji: ena je iz 30, druga pa iz 28 ostankov. Z njima se protein najverjetneje usidra v plazmalemo ''E. coli''. Med njima je hidrofilen del iz 4 ostankov, od katerih sta dva pozitivno nabita (R33 in K36). C-končni del iz 18 ostankov je prav tako nekoliko bolj hidrofilen. Eksperimentalno je bilo ugotovljeno, da je C-končna regija usmerjena proti citosolu. Pri tem so bili sintetizirani fuzijski proteini Imm z β-galaktozidazo (ta se normalno nahaja v citosolu) in pa s kislo fosfatazo (ta se normalno nahaja v periplazemskem prostoru). Izkazalo se je, da sta v takem primeru oba encima aktivna v citosolu, kar pomeni, da se C-končna regija proteina Imm nahaja na citosolni strani. Ta regija torej ne more služiti za prepoznavanje faga. Poleg tega C-končni del ne kaže nobene specifičnosti in njegov skupni naboj ne predstavlja pomembne vloge. Tudi če se ta del, ki je nekoliko bazičen, zamenja z zaporedjem, ki vsebuje nekaj več kislih aminokislinskih ostankov, se aktivnost proteina večinoma ohrani. 
Podobno se ob odstranitvi dveh pozitivnih nabojev v vmesni regiji izkaže, da aktivnost proteina ni inhibirana, temveč le nekoliko zmanjšana. Nenavadni sta tudi dolžini membranskih domen (30 in 28 aminokislinskih ostankov, v običajnih transmembranskih domenah pa okrog 20). Zaradi navedenih razlogov obstajajo argumentirana domnevanja, da Imm sploh ni integralni protein. Predlagano je bilo, da Imm le interagira z drugim proteinom, ki je komponenta mesta na plazmalemi za vnos fagne DNA. Imm z vezavo na ta protein, ki zanj dejansko deluje kot receptor, spremeni njegovo konformacijo, s tem pa onemogoči prenos virusne DNA skozi plazmalemo v celico in jo preusmeri v periplazemski prostor. Empirični podati kažejo, da se 50 % DNA nabere v periplazmi, tam pa jo razgradi endonukleaza I. Ostalih 50 % ostane v fagu. 
Imunost preko tega mehanizma se razvije zelo hitro, tj. po največ 2 minutah po infekciji s primarnim fagom. ''E. coli'' ima približno 200 mest za vnos DNA (precej manj kot receptorjev za fage). Ker Imm deluje stehiometrično, je približno taka tudi njegova koncentracija. Zaradi tako majhne količine ga je ''in vivo'' zelo težko dokazati.

===Protein Sp===
Za superinfekcijsko izkjučitev faga T4 je v ''E. coli'' le v 80 % primerov odgovoren protein Imm, popolno imunost pa omogoča membranski protein Sp. Poskus je pokazal, da ima sistem ''E. coli'' in superinfekcijskega faga z deletiranim genom za Sp podobne značilnosti kot sistem, v katerem fag nima aktivnega lizocima, proteina 5. Za vnos DNA v celico fag namreč potrebuje ta protein, ki po vezavi na celico s svojo lizocimsko aktivnostjo razgradi peptidoglikanski sloj in s tem prebode periplazemski prostor ter tako dostopa do mesta za vnos DNA na plazmalemi. Protein Sp inhibira delovanje proteina 5, zato fag ne more razgraditi peptidoglikana in tako inducirati superinfekcije v gostiteljski celici. Tudi za ta protein je znano aminokislinsko zaporedje, ne pa njegova tridimenzionalna struktura.

==Sie pri grampozitivnih bakterijah==
===Protein Sie2009===
Poznavanje mehanizmov preprečevanja injiciranja DNA fagov je pri grampozitivnih bakterijah bolj omejeno kot pri gramnegativnih bakterijah. Prve objave mehanizmov Sie pri grampozitivnih bakterijah segajo v leto 2002, torej okoli 50 let po začetku proučevanja Sie. Prvi identificirani protein pri grampozitivnih bakterijah, ki omogoča Sie, je Sie2009, protein faga Tuc2009, katerega gostitelj je bakterija ''Lactococcus lactis'', ki ima pomembno vlogo pri mlečni fermentaciji. 
Gen Sie2009, ki zapisuje ta protein, se nahaja v lizogenem modulu DNA faga Tuc2009 med genom za integrazo (encim, ki omogoča vstavljanje fagne DNA v krožno DNA gostitelja) in genom, ki kodira represor. Na podlagi njegove lokacije in primerjave z geni za zapis proteinov, ki prav tako omejujejo razmnoževanje fagov, so sklepali, da Sie2009 onemogoča okužbo bakterije s fagi. Zato so želeli to nedvomno dokazati in ugotoviti, na kateri stopnji razmnoževanja bakteriofaga deluje. Sistematične preiskave so pričeli tako, da so gen vstavili v plazmid, z le-tem okužili različne vrste oziroma seve bakterij in testirali njihovo odpornost na različne bakteriofage. Izkazalo se je, da protein Sie2009 omogoča odpornost proti določenim vrstam fagov le nekaterim vrstam bakterij. 
Raziskave so nadaljevali s proučevanjem lokacije nahajanja proteina Sie2009. Ugotovili so, da je pripet na celično membrano. Preko različnih eksperimentov so še ugotovili, da protein Sie2009 ne vpliva na pritrjevanje fagov na površino bakterijske celice, niti ne ovira transformacije plazmidov ali transfekcije. Na podlagi teh rezultatov so prišli do zaključka, da Sie2009 blokira injiciranje fagne DNA, kar je bil takrat popolnoma na novo odkrit mehanizem Sie. Natančnejša razlaga pa še danes ni znana.

===Protein LTP===
Med najbolje raziskane sisteme Sie pri grampozitivnih bakterijah spada sistem LTP faga TP-J34, katerega gostitelj je bakterija ''Streptoccocus thermophilus'' J34, ki se uporablja v proizvodnji jogurta. V lizogenem modulu faga TP-J34 se nahaja genetsko stikalo, ki leži med divergentno prepisovanima genoma ''crh'' in ''cro''. Gen ''crh'' je sestavni del operona, ki ga poleg tega strukturnega gena sestavljajo še geni ''orf3'', ''ltp'' in ''int'' (po vrstnem redu prepisovanja). Gen ''crh'' kodira protein, ki je represor, gen ''orf3'' pa protein, ki je regulator. Gen ''int'' zapisuje protein integrazo, ki omogoča vstavljanje fagne DNA v krožno DNA gostitelja, gen ''ltp'' pa nosi zapis za protein LTP, 142 aminokislinskih ostankov velik lipoprotein, ki se nahaja na zunanji strani celične membrane. 
Protein LTP se izraža v lizogenem ciklu fag in omogoča sistem Sie, kar je pokazal sledeč eksperiment. V bakterije vrst ''Streptococcus thermophilus'' in ''Lactococcus lactis'' so preko plazmidov vstavili gen za protein LTP, ki je oviral razmnoževanje virusov v teh bakterijah. Pri obeh gostiteljskih bakterijah je odsotnost podvojevanja fagne DNA dokazala, da je bilo preprečeno injiciranje fagne DNA. Protein LTP pa ni onemogočal sekundarne okužbe le pri bakteriofagih TP-J34, ampak tudi pri drugih vrstah fagov. Za najobčutljivejšo se je izkazala vrsta laktokokih fagov P008, saj se je stopnja razmnoževanja fagov znižala približno za faktor 108. 
Skozi raziskave so prišli do zaključka, da LTP preprečuje vstop DNA v bakterijsko celico. Z imunokemijskim označevanjem z zlatom in elektronsko mikroskopijo so nedvomno potrdili, da se nahaja na zunanji strani celične membrane. Na podlagi strukture so sklepali, da je LTP protein, ki veže proteine. S tem so lahko izključili hipotezo, da se veže neposredno na DNA in tako onemogoča njen vstop v celico. Torej mora obstajati drug mehanizem. 
Preden lahko bakteriofagi iz družine ''Siphoviridae'' injicirajo DNA, ki je zapakirana v glavi virusa, morajo iz svojega repa potisniti ''tape measure protein'' (TMP), ki določa dolžino cevke repa, saj se le-ta sestavi okoli njega. Ko TMP zapusti fagov rep, tvori poro skozi celično membrano, skozi katero lahko pride DNA v celico. Dokazali so, da protein LTP veže protein TMP in tako povzroči injiciranje DNA v periplazmo namesto v celico. Tam se le-ta nato razgradi. Naknadna okužba je tako onemogočena.

==Viri==
*Dulbecco, R. Mutual Exclusion between related phages. ''Journal of Bacteriology'', 1951, št. 63, str. 209–217
*Lu, M.-J. in Henning, U. Superinfection exclusion by T-even-type coliphages. ''Trends in Microbiology'', 1994, let. 2, št. 4, str. 137–139
*Lu, M.-J., Stierhof, Y.-D. in Henning, U. Location and unusual membrane topology of the immunity protein of the ''Escherichia coli'' phage T4. ''Journal of Virology'', 1993, let. 67, št. 8, str. 4905–4913
*Heller, K. J. in Neve, H. Superinfection exclusion und DNA-Injektion bei Siphoviridae-Phagen. ''Biospektrum'', 2014, let. 20, št. 1, str. 26–29.
*McGrath, S., Fitzgerald, G. F. in van Sinderen, D. Identification and characterization of phage-resistance genes in temperate lactococcal bacteriophages. ''Molecular Microbiology'', 2002, let. 43, št. 2, 509–520.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Sistem izključitve naknadne okužbe

2019-04-09T09:48:26Z

Aljaž Bratina: /* Genska stabilnost */

==Uvod==
Superinfekcijska izključitev (ali izključitev naknadne okužbe; sistem Sie, iz angl. ''superinfection exclusion'') je fenomen, pri katerem primarna okužba z virusom prepreči naknadno okužbo z istim ali podobnim virusom. Virioni (virusni delci) nimajo lastnega metabolizma in mehanizma razmnoževanja, zato svoj dedni material vnesejo v gostiteljsko celico. Celični proteini tako omogočijo replikacijo virusnega dednega materiala in sintezo komponent, ki so nujne za obstoj virusnega delca. Običajno bakterijska gostiteljska celica lizira, pri čemer se sprostijo novonastali bakteriofagi. Mehanizem, pri katerem virusni dedni material, vključen v bakterijsko celico, prepreči prihod drugega faga, je z evolucijskega vidika za virus smiselna poteza, saj mu omogoči, da celico uporabi le za lastno razmnoževanje. Tega niso sposobni le virusi, pomembni za bakterije, ampak tudi mnogi virusi, pomembni za ljudi, živali in rastline.
===Virusna latenca===
Latentni virus je neaktiven virus, skrit v okuženi celici in njenih potomkah. Za razvoj virusne latence ima proces izključitve naknadne okužbe ključno vlogo. Lizogeni cikel virusu prvenstveno omogoči zaščito pred antivirusnimi snovmi, ki na provirusno obliko nimajo učinka, in povečanje možnosti prenosa virusnega dednega materiala tako horizontalno kot tudi na potomke gostiteljske celice.

===Genska stabilnost===
Preprečitev naknadne okužbe gostiteljske celice je za virus pomembna tudi evolucijsko z vidika genske stabilnosti, saj v posamezni virusni populaciji določa strukturo dednega materiala delcev. Izključitev superinfekcije primarnemu virusu, ki si z osebki istega ali sorodnega seva deli isto ekološko nišo in kompetitivno išče gostitelja, omogoči ohranjanje zaporedja nukleotidov oziroma stabilnost genskega materiala. Če je v celici kopija dednega zapisa le enega virusa, obstaja manjša verjetnost, da bi prišlo do neželenih rekombinacij in prerazporeditev genov, to pa omogoča vsesplošno raznolikost znotraj skupine virusov. Biodiverziteta fagov znotraj skupine virusov tipa T omogoča prepoznavanje različnih – celo modificiranih – receptorjev na gostiteljski celici.

==Zgodnje raziskave==
Fenomen izključitve naknadne okužbe sorodnih virusov so znanstveniki prvič opazili v začetku 50. let 20. stoletja. Med raziskavami na fagih tipa T so ugotovili, da je okužba z dvema virusoma neuspešna, razen v primeru, če virusa dodajo hkrati. Če so enega dodali prej kot drugega, drugi ni okužil celice.
Obstoj mehanizma, ki v gostiteljski celici povzroči korenito spremembo v dovzetnosti za sprejemanje dednega materiala sekundarnega bakteriofaga, dodanega z nekaj minutno zakasnitvijo, so posredno dokazali preko razpada genskega materiala le-tega. Kot sredstvo obarjanja dednega materiala razpadlega sekundarno dodanega virusa jim je služila trikloroocetna kislina. Zanimivo je bilo, da se je 50 % vzorca nahajalo v topni frakciji, kar pa je jasno kazalo na razpad DNA (trikloroocetna kislina obori polimere, daljše od 20 nukleotidov). Nadaljnje serije poskusov so jim pomagale pridobiti dokaze, da ni razpadla le DNA viriona, pač pa celoten delec, in da ni prišlo do prenosa genetske informacije sekundarnega virusa na potomce.
==Mehanizmi Sie==
Virusni dedni material vsebuje zapise za proteine, ki omogočajo izključitev naknadne okužbe. Ti virusni proteini lahko preprečijo vstop dednega materiala sekundarnega virusa v citoplazmo primarno okužene gostiteljske celice tako, da inhibirajo virusne peptidoglikan hidrolazne encime, ki virusnemu delcu omogočijo »preboj« skozi celično steno bakterijske celice. Lahko pa povzročijo modifikacijo specifičnih receptorjev na površini celice, ki jih prepoznajo virioni.
V nadaljevanju je opisanih nekaj primerov sistemov superinfekcijske izključitve pri posameznih gramnegativnih in grampozitivnih bakterijah.

==Sie pri gramnegativnih bakterijah==
Obstaja več proteinskih mehanizmov, ki v različnih gramnegativnih bakterijah povzročijo superinfekcijsko izključitev. Zapis za te proteine se nahaja v genomu bakteriofagov, ki primarno okužijo celico. Najbolje raziskan sistem Sie obsega proteina Imm (iz angl. ''immunity'', tj. imunost) in Sp (iz angl. ''spackle'', tj. kit, kitati), ki ju kodira genom faga T4 (in njemu podobnih fagov). Ti fagi specifično okužijo bakterijo ''Escherchia coli''. Ta proteina povzročata izključitev le omenjenih fagov, medtem ko superinfekcija ostalim (P1, c1, λ …) s tem mehanizmom ni onemogočena.
===Protein Imm===
Protein Imm je sestavljen iz ene polipeptidne verige, ki vsebuje 83 aminokislinskih ostankov. Njegova tridimenzionalna struktura še ni bila rešena. Ima dve daljši hidrofobni regiji: ena je iz 30, druga pa iz 28 ostankov. Z njima se protein najverjetneje usidra v plazmalemo ''E. coli''. Med njima je hidrofilen del iz 4 ostankov, od katerih sta dva pozitivno nabita (R33 in K36). C-končni del iz 18 ostankov je prav tako nekoliko bolj hidrofilen. Eksperimentalno je bilo ugotovljeno, da je C-končna regija usmerjena proti citosolu. Pri tem so bili sintetizirani fuzijski proteini Imm z β-galaktozidazo (ta se normalno nahaja v citosolu) in pa s kislo fosfatazo (ta se normalno nahaja v periplazemskem prostoru). Izkazalo se je, da sta v takem primeru oba encima aktivna v citosolu, kar pomeni, da se C-končna regija proteina Imm nahaja na citosolni strani. Ta regija torej ne more služiti za prepoznavanje faga. Poleg tega C-končni del ne kaže nobene specifičnosti in njegov skupni naboj ne predstavlja pomembne vloge. Tudi če se ta del, ki je nekoliko bazičen, zamenja z zaporedjem, ki vsebuje nekaj več kislih aminokislinskih ostankov, se aktivnost proteina večinoma ohrani. 
Podobno se ob odstranitvi dveh pozitivnih nabojev v vmesni regiji izkaže, da aktivnost proteina ni inhibirana, temveč le nekoliko zmanjšana. Nenavadni sta tudi dolžini membranskih domen (30 in 28 aminokislinskih ostankov, v običajnih transmembranskih domenah pa okrog 20). Zaradi navedenih razlogov obstajajo argumentirana domnevanja, da Imm sploh ni integralni protein. Predlagano je bilo, da Imm le interagira z drugim proteinom, ki je komponenta mesta na plazmalemi za vnos fagne DNA. Imm z vezavo na ta protein, ki zanj dejansko deluje kot receptor, spremeni njegovo konformacijo, s tem pa onemogoči prenos virusne DNA skozi plazmalemo v celico in jo preusmeri v periplazemski prostor. Empirični podati kažejo, da se 50 % DNA nabere v periplazmi, tam pa jo razgradi endonukleaza I. Ostalih 50 % ostane v fagu. 
Imunost preko tega mehanizma se razvije zelo hitro, tj. po največ 2 minutah po infekciji s primarnim fagom. ''E. coli'' ima približno 200 mest za vnos DNA (precej manj kot receptorjev za fage). Ker Imm deluje stehiometrično, je približno taka tudi njegova koncentracija. Zaradi tako majhne količine ga je ''in vivo'' zelo težko dokazati.

===Protein Sp===
Za superinfekcijsko izkjučitev faga T4 je v ''E. coli'' le v 80 % primerov odgovoren protein Imm, popolno imunost pa omogoča membranski protein Sp. Poskus je pokazal, da ima sistem ''E. coli'' in superinfekcijskega faga z deletiranim genom za Sp podobne značilnosti kot sistem, v katerem fag nima aktivnega lizocima, proteina 5. Za vnos DNA v celico fag namreč potrebuje ta protein, ki po vezavi na celico s svojo lizocimsko aktivnostjo razgradi peptidoglikanski sloj in s tem prebode periplazemski prostor ter tako dostopa do mesta za vnos DNA na plazmalemi. Protein Sp inhibira delovanje proteina 5, zato fag ne more razgraditi peptidoglikana in tako inducirati superinfekcije v gostiteljski celici. Tudi za ta protein je znano aminokislinsko zaporedje, ne pa njegova tridimenzionalna struktura.

==Sie pri grampozitivnih bakterijah==
===Protein Sie2009===
Poznavanje mehanizmov preprečevanja injiciranja DNA fagov je pri grampozitivnih bakterijah bolj omejeno kot pri gramnegativnih bakterijah. Prve objave mehanizmov Sie pri grampozitivnih bakterijah segajo v leto 2002, torej okoli 50 let po začetku proučevanja Sie. Prvi identificirani protein pri grampozitivnih bakterijah, ki omogoča Sie, je Sie2009, protein faga Tuc2009, katerega gostitelj je bakterija ''Lactococcus lactis'', ki ima pomembno vlogo pri mlečni fermentaciji. 
Gen Sie2009, ki zapisuje ta protein, se nahaja v lizogenem modulu DNA faga Tuc2009 med genom za integrazo (encim, ki omogoča vstavljanje fagne DNA v krožno DNA gostitelja) in genom, ki kodira represor. Na podlagi njegove lokacije in primerjave z geni za zapis proteinov, ki prav tako omejujejo razmnoževanje fagov, so sklepali, da Sie2009 onemogoča okužbo bakterije s fagi. Zato so želeli to nedvomno dokazati in ugotoviti, na kateri stopnji razmnoževanja bakteriofaga deluje. Sistematične preiskave so pričeli tako, da so gen vstavili v plazmid, z le-tem okužili različne vrste oziroma seve bakterij in testirali njihovo odpornost na različne bakteriofage. Izkazalo se je, da protein Sie2009 omogoča odpornost proti določenim vrstam fagov le nekaterim vrstam bakterij. 
Raziskave so nadaljevali s proučevanjem lokacije nahajanja proteina Sie2009. Ugotovili so, da je pripet na celično membrano. Preko različnih eksperimentov so še ugotovili, da protein Sie2009 ne vpliva na pritrjevanje fagov na površino bakterijske celice, niti ne ovira transformacije plazmidov ali transfekcije. Na podlagi teh rezultatov so prišli do zaključka, da Sie2009 blokira injiciranje fagne DNA, kar je bil takrat popolnoma na novo odkrit mehanizem Sie. Natančnejša razlaga pa še danes ni znana.

===Protein LTP===
Med najbolje raziskane sisteme Sie pri grampozitivnih bakterijah spada sistem LTP faga TP-J34, katerega gostitelj je bakterija ''Streptoccocus thermophilus'' J34, ki se uporablja v proizvodnji jogurta. V lizogenem modulu faga TP-J34 se nahaja genetsko stikalo, ki leži med divergentno prepisovanima genoma ''crh'' in ''cro''. Gen ''crh'' je sestavni del operona, ki ga poleg tega strukturnega gena sestavljajo še geni ''orf3'', ''ltp'' in ''int'' (po vrstnem redu prepisovanja). Gen ''crh'' kodira protein, ki je represor, gen ''orf3'' pa protein, ki je regulator. Gen ''int'' zapisuje protein integrazo, ki omogoča vstavljanje fagne DNA v krožno DNA gostitelja, gen ''ltp'' pa nosi zapis za protein LTP, 142 aminokislinskih ostankov velik lipoprotein, ki se nahaja na zunanji strani celične membrane. 
Protein LTP se izraža v lizogenem ciklu fag in omogoča sistem Sie, kar je pokazal sledeč eksperiment. V bakterije vrst ''Streptococcus thermophilus'' in ''Lactococcus lactis'' so preko plazmidov vstavili gen za protein LTP, ki je oviral razmnoževanje virusov v teh bakterijah. Pri obeh gostiteljskih bakterijah je odsotnost podvojevanja fagne DNA dokazala, da je bilo preprečeno injiciranje fagne DNA. Protein LTP pa ni onemogočal sekundarne okužbe le pri bakteriofagih TP-J34, ampak tudi pri drugih vrstah fagov. Za najobčutljivejšo se je izkazala vrsta laktokokih fagov P008, saj se je stopnja razmnoževanja fagov znižala približno za faktor 108. 
Skozi raziskave so prišli do zaključka, da LTP preprečuje vstop DNA v bakterijsko celico. Z imunokemijskim označevanjem z zlatom in elektronsko mikroskopijo so nedvomno potrdili, da se nahaja na zunanji strani celične membrane. Na podlagi strukture so sklepali, da je LTP protein, ki veže proteine. S tem so lahko izključili hipotezo, da se veže neposredno na DNA in tako onemogoča njen vstop v celico. Torej mora obstajati drug mehanizem. 
Preden lahko bakteriofagi iz družine ''Siphoviridae'' injicirajo DNA, ki je zapakirana v glavi virusa, morajo iz svojega repa potisniti ''tape measure protein'' (TMP), ki določa dolžino cevke repa, saj se le-ta sestavi okoli njega. Ko TMP zapusti fagov rep, tvori poro skozi celično membrano, skozi katero lahko pride DNA v celico. Dokazali so, da protein LTP veže protein TMP in tako povzroči injiciranje DNA v periplazmo namesto v celico. Tam se le-ta nato razgradi. Naknadna okužba je tako onemogočena.

==Viri==
*Dulbecco, R. Mutual Exclusion between related phages. ''Journal of Bacteriology'', 1951, št. 63, str. 209–217
*Lu, M.-J. in Henning, U. Superinfection exclusion by T-even-type coliphages. ''Trends in Microbiology'', 1994, let. 2, št. 4, str. 137–139
*Lu, M.-J., Stierhof, Y.-D. in Henning, U. Location and unusual membrane topology of the immunity protein of the ''Escherichia coli'' phage T4. ''Journal of Virology'', 1993, let. 67, št. 8, str. 4905–4913
*Heller, K. J. in Neve, H. Superinfection exclusion und DNA-Injektion bei Siphoviridae-Phagen. ''Biospektrum'', 2014, let. 20, št. 1, str. 26–29.
*McGrath, S., Fitzgerald, G. F. in van Sinderen, D. Identification and characterization of phage-resistance genes in temperate lactococcal bacteriophages. ''Molecular Microbiology'', 2002, let. 43, št. 2, 509–520.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Sistem izključitve naknadne okužbe

2019-04-09T09:48:15Z

Aljaž Bratina: /* Virusna latenca */

==Uvod==
Superinfekcijska izključitev (ali izključitev naknadne okužbe; sistem Sie, iz angl. ''superinfection exclusion'') je fenomen, pri katerem primarna okužba z virusom prepreči naknadno okužbo z istim ali podobnim virusom. Virioni (virusni delci) nimajo lastnega metabolizma in mehanizma razmnoževanja, zato svoj dedni material vnesejo v gostiteljsko celico. Celični proteini tako omogočijo replikacijo virusnega dednega materiala in sintezo komponent, ki so nujne za obstoj virusnega delca. Običajno bakterijska gostiteljska celica lizira, pri čemer se sprostijo novonastali bakteriofagi. Mehanizem, pri katerem virusni dedni material, vključen v bakterijsko celico, prepreči prihod drugega faga, je z evolucijskega vidika za virus smiselna poteza, saj mu omogoči, da celico uporabi le za lastno razmnoževanje. Tega niso sposobni le virusi, pomembni za bakterije, ampak tudi mnogi virusi, pomembni za ljudi, živali in rastline.
===Virusna latenca===
Latentni virus je neaktiven virus, skrit v okuženi celici in njenih potomkah. Za razvoj virusne latence ima proces izključitve naknadne okužbe ključno vlogo. Lizogeni cikel virusu prvenstveno omogoči zaščito pred antivirusnimi snovmi, ki na provirusno obliko nimajo učinka, in povečanje možnosti prenosa virusnega dednega materiala tako horizontalno kot tudi na potomke gostiteljske celice.

==Genska stabilnost==
Preprečitev naknadne okužbe gostiteljske celice je za virus pomembna tudi evolucijsko z vidika genske stabilnosti, saj v posamezni virusni populaciji določa strukturo dednega materiala delcev. Izključitev superinfekcije primarnemu virusu, ki si z osebki istega ali sorodnega seva deli isto ekološko nišo in kompetitivno išče gostitelja, omogoči ohranjanje zaporedja nukleotidov oziroma stabilnost genskega materiala. Če je v celici kopija dednega zapisa le enega virusa, obstaja manjša verjetnost, da bi prišlo do neželenih rekombinacij in prerazporeditev genov, to pa omogoča vsesplošno raznolikost znotraj skupine virusov. Biodiverziteta fagov znotraj skupine virusov tipa T omogoča prepoznavanje različnih – celo modificiranih – receptorjev na gostiteljski celici.
==Zgodnje raziskave==
Fenomen izključitve naknadne okužbe sorodnih virusov so znanstveniki prvič opazili v začetku 50. let 20. stoletja. Med raziskavami na fagih tipa T so ugotovili, da je okužba z dvema virusoma neuspešna, razen v primeru, če virusa dodajo hkrati. Če so enega dodali prej kot drugega, drugi ni okužil celice.
Obstoj mehanizma, ki v gostiteljski celici povzroči korenito spremembo v dovzetnosti za sprejemanje dednega materiala sekundarnega bakteriofaga, dodanega z nekaj minutno zakasnitvijo, so posredno dokazali preko razpada genskega materiala le-tega. Kot sredstvo obarjanja dednega materiala razpadlega sekundarno dodanega virusa jim je služila trikloroocetna kislina. Zanimivo je bilo, da se je 50 % vzorca nahajalo v topni frakciji, kar pa je jasno kazalo na razpad DNA (trikloroocetna kislina obori polimere, daljše od 20 nukleotidov). Nadaljnje serije poskusov so jim pomagale pridobiti dokaze, da ni razpadla le DNA viriona, pač pa celoten delec, in da ni prišlo do prenosa genetske informacije sekundarnega virusa na potomce.
==Mehanizmi Sie==
Virusni dedni material vsebuje zapise za proteine, ki omogočajo izključitev naknadne okužbe. Ti virusni proteini lahko preprečijo vstop dednega materiala sekundarnega virusa v citoplazmo primarno okužene gostiteljske celice tako, da inhibirajo virusne peptidoglikan hidrolazne encime, ki virusnemu delcu omogočijo »preboj« skozi celično steno bakterijske celice. Lahko pa povzročijo modifikacijo specifičnih receptorjev na površini celice, ki jih prepoznajo virioni.
V nadaljevanju je opisanih nekaj primerov sistemov superinfekcijske izključitve pri posameznih gramnegativnih in grampozitivnih bakterijah.

==Sie pri gramnegativnih bakterijah==
Obstaja več proteinskih mehanizmov, ki v različnih gramnegativnih bakterijah povzročijo superinfekcijsko izključitev. Zapis za te proteine se nahaja v genomu bakteriofagov, ki primarno okužijo celico. Najbolje raziskan sistem Sie obsega proteina Imm (iz angl. ''immunity'', tj. imunost) in Sp (iz angl. ''spackle'', tj. kit, kitati), ki ju kodira genom faga T4 (in njemu podobnih fagov). Ti fagi specifično okužijo bakterijo ''Escherchia coli''. Ta proteina povzročata izključitev le omenjenih fagov, medtem ko superinfekcija ostalim (P1, c1, λ …) s tem mehanizmom ni onemogočena.
===Protein Imm===
Protein Imm je sestavljen iz ene polipeptidne verige, ki vsebuje 83 aminokislinskih ostankov. Njegova tridimenzionalna struktura še ni bila rešena. Ima dve daljši hidrofobni regiji: ena je iz 30, druga pa iz 28 ostankov. Z njima se protein najverjetneje usidra v plazmalemo ''E. coli''. Med njima je hidrofilen del iz 4 ostankov, od katerih sta dva pozitivno nabita (R33 in K36). C-končni del iz 18 ostankov je prav tako nekoliko bolj hidrofilen. Eksperimentalno je bilo ugotovljeno, da je C-končna regija usmerjena proti citosolu. Pri tem so bili sintetizirani fuzijski proteini Imm z β-galaktozidazo (ta se normalno nahaja v citosolu) in pa s kislo fosfatazo (ta se normalno nahaja v periplazemskem prostoru). Izkazalo se je, da sta v takem primeru oba encima aktivna v citosolu, kar pomeni, da se C-končna regija proteina Imm nahaja na citosolni strani. Ta regija torej ne more služiti za prepoznavanje faga. Poleg tega C-končni del ne kaže nobene specifičnosti in njegov skupni naboj ne predstavlja pomembne vloge. Tudi če se ta del, ki je nekoliko bazičen, zamenja z zaporedjem, ki vsebuje nekaj več kislih aminokislinskih ostankov, se aktivnost proteina večinoma ohrani. 
Podobno se ob odstranitvi dveh pozitivnih nabojev v vmesni regiji izkaže, da aktivnost proteina ni inhibirana, temveč le nekoliko zmanjšana. Nenavadni sta tudi dolžini membranskih domen (30 in 28 aminokislinskih ostankov, v običajnih transmembranskih domenah pa okrog 20). Zaradi navedenih razlogov obstajajo argumentirana domnevanja, da Imm sploh ni integralni protein. Predlagano je bilo, da Imm le interagira z drugim proteinom, ki je komponenta mesta na plazmalemi za vnos fagne DNA. Imm z vezavo na ta protein, ki zanj dejansko deluje kot receptor, spremeni njegovo konformacijo, s tem pa onemogoči prenos virusne DNA skozi plazmalemo v celico in jo preusmeri v periplazemski prostor. Empirični podati kažejo, da se 50 % DNA nabere v periplazmi, tam pa jo razgradi endonukleaza I. Ostalih 50 % ostane v fagu. 
Imunost preko tega mehanizma se razvije zelo hitro, tj. po največ 2 minutah po infekciji s primarnim fagom. ''E. coli'' ima približno 200 mest za vnos DNA (precej manj kot receptorjev za fage). Ker Imm deluje stehiometrično, je približno taka tudi njegova koncentracija. Zaradi tako majhne količine ga je ''in vivo'' zelo težko dokazati.

===Protein Sp===
Za superinfekcijsko izkjučitev faga T4 je v ''E. coli'' le v 80 % primerov odgovoren protein Imm, popolno imunost pa omogoča membranski protein Sp. Poskus je pokazal, da ima sistem ''E. coli'' in superinfekcijskega faga z deletiranim genom za Sp podobne značilnosti kot sistem, v katerem fag nima aktivnega lizocima, proteina 5. Za vnos DNA v celico fag namreč potrebuje ta protein, ki po vezavi na celico s svojo lizocimsko aktivnostjo razgradi peptidoglikanski sloj in s tem prebode periplazemski prostor ter tako dostopa do mesta za vnos DNA na plazmalemi. Protein Sp inhibira delovanje proteina 5, zato fag ne more razgraditi peptidoglikana in tako inducirati superinfekcije v gostiteljski celici. Tudi za ta protein je znano aminokislinsko zaporedje, ne pa njegova tridimenzionalna struktura.

==Sie pri grampozitivnih bakterijah==
===Protein Sie2009===
Poznavanje mehanizmov preprečevanja injiciranja DNA fagov je pri grampozitivnih bakterijah bolj omejeno kot pri gramnegativnih bakterijah. Prve objave mehanizmov Sie pri grampozitivnih bakterijah segajo v leto 2002, torej okoli 50 let po začetku proučevanja Sie. Prvi identificirani protein pri grampozitivnih bakterijah, ki omogoča Sie, je Sie2009, protein faga Tuc2009, katerega gostitelj je bakterija ''Lactococcus lactis'', ki ima pomembno vlogo pri mlečni fermentaciji. 
Gen Sie2009, ki zapisuje ta protein, se nahaja v lizogenem modulu DNA faga Tuc2009 med genom za integrazo (encim, ki omogoča vstavljanje fagne DNA v krožno DNA gostitelja) in genom, ki kodira represor. Na podlagi njegove lokacije in primerjave z geni za zapis proteinov, ki prav tako omejujejo razmnoževanje fagov, so sklepali, da Sie2009 onemogoča okužbo bakterije s fagi. Zato so želeli to nedvomno dokazati in ugotoviti, na kateri stopnji razmnoževanja bakteriofaga deluje. Sistematične preiskave so pričeli tako, da so gen vstavili v plazmid, z le-tem okužili različne vrste oziroma seve bakterij in testirali njihovo odpornost na različne bakteriofage. Izkazalo se je, da protein Sie2009 omogoča odpornost proti določenim vrstam fagov le nekaterim vrstam bakterij. 
Raziskave so nadaljevali s proučevanjem lokacije nahajanja proteina Sie2009. Ugotovili so, da je pripet na celično membrano. Preko različnih eksperimentov so še ugotovili, da protein Sie2009 ne vpliva na pritrjevanje fagov na površino bakterijske celice, niti ne ovira transformacije plazmidov ali transfekcije. Na podlagi teh rezultatov so prišli do zaključka, da Sie2009 blokira injiciranje fagne DNA, kar je bil takrat popolnoma na novo odkrit mehanizem Sie. Natančnejša razlaga pa še danes ni znana.

===Protein LTP===
Med najbolje raziskane sisteme Sie pri grampozitivnih bakterijah spada sistem LTP faga TP-J34, katerega gostitelj je bakterija ''Streptoccocus thermophilus'' J34, ki se uporablja v proizvodnji jogurta. V lizogenem modulu faga TP-J34 se nahaja genetsko stikalo, ki leži med divergentno prepisovanima genoma ''crh'' in ''cro''. Gen ''crh'' je sestavni del operona, ki ga poleg tega strukturnega gena sestavljajo še geni ''orf3'', ''ltp'' in ''int'' (po vrstnem redu prepisovanja). Gen ''crh'' kodira protein, ki je represor, gen ''orf3'' pa protein, ki je regulator. Gen ''int'' zapisuje protein integrazo, ki omogoča vstavljanje fagne DNA v krožno DNA gostitelja, gen ''ltp'' pa nosi zapis za protein LTP, 142 aminokislinskih ostankov velik lipoprotein, ki se nahaja na zunanji strani celične membrane. 
Protein LTP se izraža v lizogenem ciklu fag in omogoča sistem Sie, kar je pokazal sledeč eksperiment. V bakterije vrst ''Streptococcus thermophilus'' in ''Lactococcus lactis'' so preko plazmidov vstavili gen za protein LTP, ki je oviral razmnoževanje virusov v teh bakterijah. Pri obeh gostiteljskih bakterijah je odsotnost podvojevanja fagne DNA dokazala, da je bilo preprečeno injiciranje fagne DNA. Protein LTP pa ni onemogočal sekundarne okužbe le pri bakteriofagih TP-J34, ampak tudi pri drugih vrstah fagov. Za najobčutljivejšo se je izkazala vrsta laktokokih fagov P008, saj se je stopnja razmnoževanja fagov znižala približno za faktor 108. 
Skozi raziskave so prišli do zaključka, da LTP preprečuje vstop DNA v bakterijsko celico. Z imunokemijskim označevanjem z zlatom in elektronsko mikroskopijo so nedvomno potrdili, da se nahaja na zunanji strani celične membrane. Na podlagi strukture so sklepali, da je LTP protein, ki veže proteine. S tem so lahko izključili hipotezo, da se veže neposredno na DNA in tako onemogoča njen vstop v celico. Torej mora obstajati drug mehanizem. 
Preden lahko bakteriofagi iz družine ''Siphoviridae'' injicirajo DNA, ki je zapakirana v glavi virusa, morajo iz svojega repa potisniti ''tape measure protein'' (TMP), ki določa dolžino cevke repa, saj se le-ta sestavi okoli njega. Ko TMP zapusti fagov rep, tvori poro skozi celično membrano, skozi katero lahko pride DNA v celico. Dokazali so, da protein LTP veže protein TMP in tako povzroči injiciranje DNA v periplazmo namesto v celico. Tam se le-ta nato razgradi. Naknadna okužba je tako onemogočena.

==Viri==
*Dulbecco, R. Mutual Exclusion between related phages. ''Journal of Bacteriology'', 1951, št. 63, str. 209–217
*Lu, M.-J. in Henning, U. Superinfection exclusion by T-even-type coliphages. ''Trends in Microbiology'', 1994, let. 2, št. 4, str. 137–139
*Lu, M.-J., Stierhof, Y.-D. in Henning, U. Location and unusual membrane topology of the immunity protein of the ''Escherichia coli'' phage T4. ''Journal of Virology'', 1993, let. 67, št. 8, str. 4905–4913
*Heller, K. J. in Neve, H. Superinfection exclusion und DNA-Injektion bei Siphoviridae-Phagen. ''Biospektrum'', 2014, let. 20, št. 1, str. 26–29.
*McGrath, S., Fitzgerald, G. F. in van Sinderen, D. Identification and characterization of phage-resistance genes in temperate lactococcal bacteriophages. ''Molecular Microbiology'', 2002, let. 43, št. 2, 509–520.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Sistem izključitve naknadne okužbe

2019-04-09T09:47:45Z

Aljaž Bratina: /* Protein Sie2009 */

==Uvod==
Superinfekcijska izključitev (ali izključitev naknadne okužbe; sistem Sie, iz angl. ''superinfection exclusion'') je fenomen, pri katerem primarna okužba z virusom prepreči naknadno okužbo z istim ali podobnim virusom. Virioni (virusni delci) nimajo lastnega metabolizma in mehanizma razmnoževanja, zato svoj dedni material vnesejo v gostiteljsko celico. Celični proteini tako omogočijo replikacijo virusnega dednega materiala in sintezo komponent, ki so nujne za obstoj virusnega delca. Običajno bakterijska gostiteljska celica lizira, pri čemer se sprostijo novonastali bakteriofagi. Mehanizem, pri katerem virusni dedni material, vključen v bakterijsko celico, prepreči prihod drugega faga, je z evolucijskega vidika za virus smiselna poteza, saj mu omogoči, da celico uporabi le za lastno razmnoževanje. Tega niso sposobni le virusi, pomembni za bakterije, ampak tudi mnogi virusi, pomembni za ljudi, živali in rastline.
==Virusna latenca==
Latentni virus je neaktiven virus, skrit v okuženi celici in njenih potomkah. Za razvoj virusne latence ima proces izključitve naknadne okužbe ključno vlogo. Lizogeni cikel virusu prvenstveno omogoči zaščito pred antivirusnimi snovmi, ki na provirusno obliko nimajo učinka, in povečanje možnosti prenosa virusnega dednega materiala tako horizontalno kot tudi na potomke gostiteljske celice.
==Genska stabilnost==
Preprečitev naknadne okužbe gostiteljske celice je za virus pomembna tudi evolucijsko z vidika genske stabilnosti, saj v posamezni virusni populaciji določa strukturo dednega materiala delcev. Izključitev superinfekcije primarnemu virusu, ki si z osebki istega ali sorodnega seva deli isto ekološko nišo in kompetitivno išče gostitelja, omogoči ohranjanje zaporedja nukleotidov oziroma stabilnost genskega materiala. Če je v celici kopija dednega zapisa le enega virusa, obstaja manjša verjetnost, da bi prišlo do neželenih rekombinacij in prerazporeditev genov, to pa omogoča vsesplošno raznolikost znotraj skupine virusov. Biodiverziteta fagov znotraj skupine virusov tipa T omogoča prepoznavanje različnih – celo modificiranih – receptorjev na gostiteljski celici.
==Zgodnje raziskave==
Fenomen izključitve naknadne okužbe sorodnih virusov so znanstveniki prvič opazili v začetku 50. let 20. stoletja. Med raziskavami na fagih tipa T so ugotovili, da je okužba z dvema virusoma neuspešna, razen v primeru, če virusa dodajo hkrati. Če so enega dodali prej kot drugega, drugi ni okužil celice.
Obstoj mehanizma, ki v gostiteljski celici povzroči korenito spremembo v dovzetnosti za sprejemanje dednega materiala sekundarnega bakteriofaga, dodanega z nekaj minutno zakasnitvijo, so posredno dokazali preko razpada genskega materiala le-tega. Kot sredstvo obarjanja dednega materiala razpadlega sekundarno dodanega virusa jim je služila trikloroocetna kislina. Zanimivo je bilo, da se je 50 % vzorca nahajalo v topni frakciji, kar pa je jasno kazalo na razpad DNA (trikloroocetna kislina obori polimere, daljše od 20 nukleotidov). Nadaljnje serije poskusov so jim pomagale pridobiti dokaze, da ni razpadla le DNA viriona, pač pa celoten delec, in da ni prišlo do prenosa genetske informacije sekundarnega virusa na potomce.
==Mehanizmi Sie==
Virusni dedni material vsebuje zapise za proteine, ki omogočajo izključitev naknadne okužbe. Ti virusni proteini lahko preprečijo vstop dednega materiala sekundarnega virusa v citoplazmo primarno okužene gostiteljske celice tako, da inhibirajo virusne peptidoglikan hidrolazne encime, ki virusnemu delcu omogočijo »preboj« skozi celično steno bakterijske celice. Lahko pa povzročijo modifikacijo specifičnih receptorjev na površini celice, ki jih prepoznajo virioni.
V nadaljevanju je opisanih nekaj primerov sistemov superinfekcijske izključitve pri posameznih gramnegativnih in grampozitivnih bakterijah.

==Sie pri gramnegativnih bakterijah==
Obstaja več proteinskih mehanizmov, ki v različnih gramnegativnih bakterijah povzročijo superinfekcijsko izključitev. Zapis za te proteine se nahaja v genomu bakteriofagov, ki primarno okužijo celico. Najbolje raziskan sistem Sie obsega proteina Imm (iz angl. ''immunity'', tj. imunost) in Sp (iz angl. ''spackle'', tj. kit, kitati), ki ju kodira genom faga T4 (in njemu podobnih fagov). Ti fagi specifično okužijo bakterijo ''Escherchia coli''. Ta proteina povzročata izključitev le omenjenih fagov, medtem ko superinfekcija ostalim (P1, c1, λ …) s tem mehanizmom ni onemogočena.
===Protein Imm===
Protein Imm je sestavljen iz ene polipeptidne verige, ki vsebuje 83 aminokislinskih ostankov. Njegova tridimenzionalna struktura še ni bila rešena. Ima dve daljši hidrofobni regiji: ena je iz 30, druga pa iz 28 ostankov. Z njima se protein najverjetneje usidra v plazmalemo ''E. coli''. Med njima je hidrofilen del iz 4 ostankov, od katerih sta dva pozitivno nabita (R33 in K36). C-končni del iz 18 ostankov je prav tako nekoliko bolj hidrofilen. Eksperimentalno je bilo ugotovljeno, da je C-končna regija usmerjena proti citosolu. Pri tem so bili sintetizirani fuzijski proteini Imm z β-galaktozidazo (ta se normalno nahaja v citosolu) in pa s kislo fosfatazo (ta se normalno nahaja v periplazemskem prostoru). Izkazalo se je, da sta v takem primeru oba encima aktivna v citosolu, kar pomeni, da se C-končna regija proteina Imm nahaja na citosolni strani. Ta regija torej ne more služiti za prepoznavanje faga. Poleg tega C-končni del ne kaže nobene specifičnosti in njegov skupni naboj ne predstavlja pomembne vloge. Tudi če se ta del, ki je nekoliko bazičen, zamenja z zaporedjem, ki vsebuje nekaj več kislih aminokislinskih ostankov, se aktivnost proteina večinoma ohrani. 
Podobno se ob odstranitvi dveh pozitivnih nabojev v vmesni regiji izkaže, da aktivnost proteina ni inhibirana, temveč le nekoliko zmanjšana. Nenavadni sta tudi dolžini membranskih domen (30 in 28 aminokislinskih ostankov, v običajnih transmembranskih domenah pa okrog 20). Zaradi navedenih razlogov obstajajo argumentirana domnevanja, da Imm sploh ni integralni protein. Predlagano je bilo, da Imm le interagira z drugim proteinom, ki je komponenta mesta na plazmalemi za vnos fagne DNA. Imm z vezavo na ta protein, ki zanj dejansko deluje kot receptor, spremeni njegovo konformacijo, s tem pa onemogoči prenos virusne DNA skozi plazmalemo v celico in jo preusmeri v periplazemski prostor. Empirični podati kažejo, da se 50 % DNA nabere v periplazmi, tam pa jo razgradi endonukleaza I. Ostalih 50 % ostane v fagu. 
Imunost preko tega mehanizma se razvije zelo hitro, tj. po največ 2 minutah po infekciji s primarnim fagom. ''E. coli'' ima približno 200 mest za vnos DNA (precej manj kot receptorjev za fage). Ker Imm deluje stehiometrično, je približno taka tudi njegova koncentracija. Zaradi tako majhne količine ga je ''in vivo'' zelo težko dokazati.

===Protein Sp===
Za superinfekcijsko izkjučitev faga T4 je v ''E. coli'' le v 80 % primerov odgovoren protein Imm, popolno imunost pa omogoča membranski protein Sp. Poskus je pokazal, da ima sistem ''E. coli'' in superinfekcijskega faga z deletiranim genom za Sp podobne značilnosti kot sistem, v katerem fag nima aktivnega lizocima, proteina 5. Za vnos DNA v celico fag namreč potrebuje ta protein, ki po vezavi na celico s svojo lizocimsko aktivnostjo razgradi peptidoglikanski sloj in s tem prebode periplazemski prostor ter tako dostopa do mesta za vnos DNA na plazmalemi. Protein Sp inhibira delovanje proteina 5, zato fag ne more razgraditi peptidoglikana in tako inducirati superinfekcije v gostiteljski celici. Tudi za ta protein je znano aminokislinsko zaporedje, ne pa njegova tridimenzionalna struktura.

==Sie pri grampozitivnih bakterijah==
===Protein Sie2009===
Poznavanje mehanizmov preprečevanja injiciranja DNA fagov je pri grampozitivnih bakterijah bolj omejeno kot pri gramnegativnih bakterijah. Prve objave mehanizmov Sie pri grampozitivnih bakterijah segajo v leto 2002, torej okoli 50 let po začetku proučevanja Sie. Prvi identificirani protein pri grampozitivnih bakterijah, ki omogoča Sie, je Sie2009, protein faga Tuc2009, katerega gostitelj je bakterija ''Lactococcus lactis'', ki ima pomembno vlogo pri mlečni fermentaciji. 
Gen Sie2009, ki zapisuje ta protein, se nahaja v lizogenem modulu DNA faga Tuc2009 med genom za integrazo (encim, ki omogoča vstavljanje fagne DNA v krožno DNA gostitelja) in genom, ki kodira represor. Na podlagi njegove lokacije in primerjave z geni za zapis proteinov, ki prav tako omejujejo razmnoževanje fagov, so sklepali, da Sie2009 onemogoča okužbo bakterije s fagi. Zato so želeli to nedvomno dokazati in ugotoviti, na kateri stopnji razmnoževanja bakteriofaga deluje. Sistematične preiskave so pričeli tako, da so gen vstavili v plazmid, z le-tem okužili različne vrste oziroma seve bakterij in testirali njihovo odpornost na različne bakteriofage. Izkazalo se je, da protein Sie2009 omogoča odpornost proti določenim vrstam fagov le nekaterim vrstam bakterij. 
Raziskave so nadaljevali s proučevanjem lokacije nahajanja proteina Sie2009. Ugotovili so, da je pripet na celično membrano. Preko različnih eksperimentov so še ugotovili, da protein Sie2009 ne vpliva na pritrjevanje fagov na površino bakterijske celice, niti ne ovira transformacije plazmidov ali transfekcije. Na podlagi teh rezultatov so prišli do zaključka, da Sie2009 blokira injiciranje fagne DNA, kar je bil takrat popolnoma na novo odkrit mehanizem Sie. Natančnejša razlaga pa še danes ni znana.

===Protein LTP===
Med najbolje raziskane sisteme Sie pri grampozitivnih bakterijah spada sistem LTP faga TP-J34, katerega gostitelj je bakterija ''Streptoccocus thermophilus'' J34, ki se uporablja v proizvodnji jogurta. V lizogenem modulu faga TP-J34 se nahaja genetsko stikalo, ki leži med divergentno prepisovanima genoma ''crh'' in ''cro''. Gen ''crh'' je sestavni del operona, ki ga poleg tega strukturnega gena sestavljajo še geni ''orf3'', ''ltp'' in ''int'' (po vrstnem redu prepisovanja). Gen ''crh'' kodira protein, ki je represor, gen ''orf3'' pa protein, ki je regulator. Gen ''int'' zapisuje protein integrazo, ki omogoča vstavljanje fagne DNA v krožno DNA gostitelja, gen ''ltp'' pa nosi zapis za protein LTP, 142 aminokislinskih ostankov velik lipoprotein, ki se nahaja na zunanji strani celične membrane. 
Protein LTP se izraža v lizogenem ciklu fag in omogoča sistem Sie, kar je pokazal sledeč eksperiment. V bakterije vrst ''Streptococcus thermophilus'' in ''Lactococcus lactis'' so preko plazmidov vstavili gen za protein LTP, ki je oviral razmnoževanje virusov v teh bakterijah. Pri obeh gostiteljskih bakterijah je odsotnost podvojevanja fagne DNA dokazala, da je bilo preprečeno injiciranje fagne DNA. Protein LTP pa ni onemogočal sekundarne okužbe le pri bakteriofagih TP-J34, ampak tudi pri drugih vrstah fagov. Za najobčutljivejšo se je izkazala vrsta laktokokih fagov P008, saj se je stopnja razmnoževanja fagov znižala približno za faktor 108. 
Skozi raziskave so prišli do zaključka, da LTP preprečuje vstop DNA v bakterijsko celico. Z imunokemijskim označevanjem z zlatom in elektronsko mikroskopijo so nedvomno potrdili, da se nahaja na zunanji strani celične membrane. Na podlagi strukture so sklepali, da je LTP protein, ki veže proteine. S tem so lahko izključili hipotezo, da se veže neposredno na DNA in tako onemogoča njen vstop v celico. Torej mora obstajati drug mehanizem. 
Preden lahko bakteriofagi iz družine ''Siphoviridae'' injicirajo DNA, ki je zapakirana v glavi virusa, morajo iz svojega repa potisniti ''tape measure protein'' (TMP), ki določa dolžino cevke repa, saj se le-ta sestavi okoli njega. Ko TMP zapusti fagov rep, tvori poro skozi celično membrano, skozi katero lahko pride DNA v celico. Dokazali so, da protein LTP veže protein TMP in tako povzroči injiciranje DNA v periplazmo namesto v celico. Tam se le-ta nato razgradi. Naknadna okužba je tako onemogočena.

==Viri==
*Dulbecco, R. Mutual Exclusion between related phages. ''Journal of Bacteriology'', 1951, št. 63, str. 209–217
*Lu, M.-J. in Henning, U. Superinfection exclusion by T-even-type coliphages. ''Trends in Microbiology'', 1994, let. 2, št. 4, str. 137–139
*Lu, M.-J., Stierhof, Y.-D. in Henning, U. Location and unusual membrane topology of the immunity protein of the ''Escherichia coli'' phage T4. ''Journal of Virology'', 1993, let. 67, št. 8, str. 4905–4913
*Heller, K. J. in Neve, H. Superinfection exclusion und DNA-Injektion bei Siphoviridae-Phagen. ''Biospektrum'', 2014, let. 20, št. 1, str. 26–29.
*McGrath, S., Fitzgerald, G. F. in van Sinderen, D. Identification and characterization of phage-resistance genes in temperate lactococcal bacteriophages. ''Molecular Microbiology'', 2002, let. 43, št. 2, 509–520.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Sistem izključitve naknadne okužbe

2019-04-09T09:46:51Z

Aljaž Bratina: /* Protein Sie2009 */

==Uvod==
Superinfekcijska izključitev (ali izključitev naknadne okužbe; sistem Sie, iz angl. ''superinfection exclusion'') je fenomen, pri katerem primarna okužba z virusom prepreči naknadno okužbo z istim ali podobnim virusom. Virioni (virusni delci) nimajo lastnega metabolizma in mehanizma razmnoževanja, zato svoj dedni material vnesejo v gostiteljsko celico. Celični proteini tako omogočijo replikacijo virusnega dednega materiala in sintezo komponent, ki so nujne za obstoj virusnega delca. Običajno bakterijska gostiteljska celica lizira, pri čemer se sprostijo novonastali bakteriofagi. Mehanizem, pri katerem virusni dedni material, vključen v bakterijsko celico, prepreči prihod drugega faga, je z evolucijskega vidika za virus smiselna poteza, saj mu omogoči, da celico uporabi le za lastno razmnoževanje. Tega niso sposobni le virusi, pomembni za bakterije, ampak tudi mnogi virusi, pomembni za ljudi, živali in rastline.
==Virusna latenca==
Latentni virus je neaktiven virus, skrit v okuženi celici in njenih potomkah. Za razvoj virusne latence ima proces izključitve naknadne okužbe ključno vlogo. Lizogeni cikel virusu prvenstveno omogoči zaščito pred antivirusnimi snovmi, ki na provirusno obliko nimajo učinka, in povečanje možnosti prenosa virusnega dednega materiala tako horizontalno kot tudi na potomke gostiteljske celice.
==Genska stabilnost==
Preprečitev naknadne okužbe gostiteljske celice je za virus pomembna tudi evolucijsko z vidika genske stabilnosti, saj v posamezni virusni populaciji določa strukturo dednega materiala delcev. Izključitev superinfekcije primarnemu virusu, ki si z osebki istega ali sorodnega seva deli isto ekološko nišo in kompetitivno išče gostitelja, omogoči ohranjanje zaporedja nukleotidov oziroma stabilnost genskega materiala. Če je v celici kopija dednega zapisa le enega virusa, obstaja manjša verjetnost, da bi prišlo do neželenih rekombinacij in prerazporeditev genov, to pa omogoča vsesplošno raznolikost znotraj skupine virusov. Biodiverziteta fagov znotraj skupine virusov tipa T omogoča prepoznavanje različnih – celo modificiranih – receptorjev na gostiteljski celici.
==Zgodnje raziskave==
Fenomen izključitve naknadne okužbe sorodnih virusov so znanstveniki prvič opazili v začetku 50. let 20. stoletja. Med raziskavami na fagih tipa T so ugotovili, da je okužba z dvema virusoma neuspešna, razen v primeru, če virusa dodajo hkrati. Če so enega dodali prej kot drugega, drugi ni okužil celice.
Obstoj mehanizma, ki v gostiteljski celici povzroči korenito spremembo v dovzetnosti za sprejemanje dednega materiala sekundarnega bakteriofaga, dodanega z nekaj minutno zakasnitvijo, so posredno dokazali preko razpada genskega materiala le-tega. Kot sredstvo obarjanja dednega materiala razpadlega sekundarno dodanega virusa jim je služila trikloroocetna kislina. Zanimivo je bilo, da se je 50 % vzorca nahajalo v topni frakciji, kar pa je jasno kazalo na razpad DNA (trikloroocetna kislina obori polimere, daljše od 20 nukleotidov). Nadaljnje serije poskusov so jim pomagale pridobiti dokaze, da ni razpadla le DNA viriona, pač pa celoten delec, in da ni prišlo do prenosa genetske informacije sekundarnega virusa na potomce.
==Mehanizmi Sie==
Virusni dedni material vsebuje zapise za proteine, ki omogočajo izključitev naknadne okužbe. Ti virusni proteini lahko preprečijo vstop dednega materiala sekundarnega virusa v citoplazmo primarno okužene gostiteljske celice tako, da inhibirajo virusne peptidoglikan hidrolazne encime, ki virusnemu delcu omogočijo »preboj« skozi celično steno bakterijske celice. Lahko pa povzročijo modifikacijo specifičnih receptorjev na površini celice, ki jih prepoznajo virioni.
V nadaljevanju je opisanih nekaj primerov sistemov superinfekcijske izključitve pri posameznih gramnegativnih in grampozitivnih bakterijah.

==Sie pri gramnegativnih bakterijah==
Obstaja več proteinskih mehanizmov, ki v različnih gramnegativnih bakterijah povzročijo superinfekcijsko izključitev. Zapis za te proteine se nahaja v genomu bakteriofagov, ki primarno okužijo celico. Najbolje raziskan sistem Sie obsega proteina Imm (iz angl. ''immunity'', tj. imunost) in Sp (iz angl. ''spackle'', tj. kit, kitati), ki ju kodira genom faga T4 (in njemu podobnih fagov). Ti fagi specifično okužijo bakterijo ''Escherchia coli''. Ta proteina povzročata izključitev le omenjenih fagov, medtem ko superinfekcija ostalim (P1, c1, λ …) s tem mehanizmom ni onemogočena.
===Protein Imm===
Protein Imm je sestavljen iz ene polipeptidne verige, ki vsebuje 83 aminokislinskih ostankov. Njegova tridimenzionalna struktura še ni bila rešena. Ima dve daljši hidrofobni regiji: ena je iz 30, druga pa iz 28 ostankov. Z njima se protein najverjetneje usidra v plazmalemo ''E. coli''. Med njima je hidrofilen del iz 4 ostankov, od katerih sta dva pozitivno nabita (R33 in K36). C-končni del iz 18 ostankov je prav tako nekoliko bolj hidrofilen. Eksperimentalno je bilo ugotovljeno, da je C-končna regija usmerjena proti citosolu. Pri tem so bili sintetizirani fuzijski proteini Imm z β-galaktozidazo (ta se normalno nahaja v citosolu) in pa s kislo fosfatazo (ta se normalno nahaja v periplazemskem prostoru). Izkazalo se je, da sta v takem primeru oba encima aktivna v citosolu, kar pomeni, da se C-končna regija proteina Imm nahaja na citosolni strani. Ta regija torej ne more služiti za prepoznavanje faga. Poleg tega C-končni del ne kaže nobene specifičnosti in njegov skupni naboj ne predstavlja pomembne vloge. Tudi če se ta del, ki je nekoliko bazičen, zamenja z zaporedjem, ki vsebuje nekaj več kislih aminokislinskih ostankov, se aktivnost proteina večinoma ohrani. 
Podobno se ob odstranitvi dveh pozitivnih nabojev v vmesni regiji izkaže, da aktivnost proteina ni inhibirana, temveč le nekoliko zmanjšana. Nenavadni sta tudi dolžini membranskih domen (30 in 28 aminokislinskih ostankov, v običajnih transmembranskih domenah pa okrog 20). Zaradi navedenih razlogov obstajajo argumentirana domnevanja, da Imm sploh ni integralni protein. Predlagano je bilo, da Imm le interagira z drugim proteinom, ki je komponenta mesta na plazmalemi za vnos fagne DNA. Imm z vezavo na ta protein, ki zanj dejansko deluje kot receptor, spremeni njegovo konformacijo, s tem pa onemogoči prenos virusne DNA skozi plazmalemo v celico in jo preusmeri v periplazemski prostor. Empirični podati kažejo, da se 50 % DNA nabere v periplazmi, tam pa jo razgradi endonukleaza I. Ostalih 50 % ostane v fagu. 
Imunost preko tega mehanizma se razvije zelo hitro, tj. po največ 2 minutah po infekciji s primarnim fagom. ''E. coli'' ima približno 200 mest za vnos DNA (precej manj kot receptorjev za fage). Ker Imm deluje stehiometrično, je približno taka tudi njegova koncentracija. Zaradi tako majhne količine ga je ''in vivo'' zelo težko dokazati.

===Protein Sp===
Za superinfekcijsko izkjučitev faga T4 je v ''E. coli'' le v 80 % primerov odgovoren protein Imm, popolno imunost pa omogoča membranski protein Sp. Poskus je pokazal, da ima sistem ''E. coli'' in superinfekcijskega faga z deletiranim genom za Sp podobne značilnosti kot sistem, v katerem fag nima aktivnega lizocima, proteina 5. Za vnos DNA v celico fag namreč potrebuje ta protein, ki po vezavi na celico s svojo lizocimsko aktivnostjo razgradi peptidoglikanski sloj in s tem prebode periplazemski prostor ter tako dostopa do mesta za vnos DNA na plazmalemi. Protein Sp inhibira delovanje proteina 5, zato fag ne more razgraditi peptidoglikana in tako inducirati superinfekcije v gostiteljski celici. Tudi za ta protein je znano aminokislinsko zaporedje, ne pa njegova tridimenzionalna struktura.

==Sie pri grampozitivnih bakterijah==
===Protein Sie2009===
Poznavanje mehanizmov preprečevanja injiciranja DNA fagov je pri grampozitivnih bakterijah bolj omejeno kot pri gramnegativnih bakterijah. Prve objave mehanizmov Sie pri grampozitivnih bakterijah segajo v leto 2002, torej okoli 50 let po začetku proučevanja Sie. Prvi identificirani protein pri grampozitivnih bakterijah, ki omogoča Sie, je Sie2009, protein faga Tuc2009, katerega gostitelj je bakterija ''Lactococcus lactis'', ki ima pomembno vlogo pri mlečni fermentaciji. 
Gen Sie2009, ki zapisuje ta protein, se nahaja v lizogenem modulu DNA faga Tuc2009 med genom za integrazo (encim, ki omogoča vstavljanje fagne DNA v krožno DNA gostitelja) in genom, ki kodira represor. Na podlagi njegove lokacije in primerjave z geni za zapis proteinov, ki prav tako omejujejo razmnoževanje fagov, so sklepali, da Sie2009 onemogoča okužbo bakterije s fagi. Zato so želeli to nedvomno dokazati in ugotoviti, na kateri stopnji razmnoževanja bakteriofaga deluje. Sistematične preiskave so pričeli tako, da so gen vstavili v plazmid, z le-tem okužili različne vrste oziroma seve bakterij in testirali njihovo odpornost na različne bakteriofage. Izkazalo se je, da protein Sie2009 omogoča odpornost proti določenim vrstam fagov le nekaterim vrstam bakterij. 
Raziskave so nadaljevali s proučevanjem lokacije nahajanja proteina Sie2009. Ugotovili so, da je pripet na celično membrano. Preko različnih eksperimentov so še ugotovili, da protein Sie2009 ne vpliva na pritrjevanje fagov na površino bakterijske celice, niti ne ovira transformacije plazmidov ali transfekcije. Na podlagi teh rezultatov so prišli do zaključka, da Sie2009 blokira injiciranje fagne DNA, kar je bil takrat popolnoma na novo odkrit mehanizem Sie. Natančnejša razlaga pa še danes ni znana.

===Protein LTP===
Med najbolje raziskane sisteme Sie pri grampozitivnih bakterijah spada sistem LTP faga TP-J34, katerega gostitelj je bakterija ''Streptoccocus thermophilus'' J34, ki se uporablja v proizvodnji jogurta. V lizogenem modulu faga TP-J34 se nahaja genetsko stikalo, ki leži med divergentno prepisovanima genoma ''crh'' in ''cro''. Gen ''crh'' je sestavni del operona, ki ga poleg tega strukturnega gena sestavljajo še geni ''orf3'', ''ltp'' in ''int'' (po vrstnem redu prepisovanja). Gen ''crh'' kodira protein, ki je represor, gen ''orf3'' pa protein, ki je regulator. Gen ''int'' zapisuje protein integrazo, ki omogoča vstavljanje fagne DNA v krožno DNA gostitelja, gen ''ltp'' pa nosi zapis za protein LTP, 142 aminokislinskih ostankov velik lipoprotein, ki se nahaja na zunanji strani celične membrane. 
Protein LTP se izraža v lizogenem ciklu fag in omogoča sistem Sie, kar je pokazal sledeč eksperiment. V bakterije vrst ''Streptococcus thermophilus'' in ''Lactococcus lactis'' so preko plazmidov vstavili gen za protein LTP, ki je oviral razmnoževanje virusov v teh bakterijah. Pri obeh gostiteljskih bakterijah je odsotnost podvojevanja fagne DNA dokazala, da je bilo preprečeno injiciranje fagne DNA. Protein LTP pa ni onemogočal sekundarne okužbe le pri bakteriofagih TP-J34, ampak tudi pri drugih vrstah fagov. Za najobčutljivejšo se je izkazala vrsta laktokokih fagov P008, saj se je stopnja razmnoževanja fagov znižala približno za faktor 108. 
Skozi raziskave so prišli do zaključka, da LTP preprečuje vstop DNA v bakterijsko celico. Z imunokemijskim označevanjem z zlatom in elektronsko mikroskopijo so nedvomno potrdili, da se nahaja na zunanji strani celične membrane. Na podlagi strukture so sklepali, da je LTP protein, ki veže proteine. S tem so lahko izključili hipotezo, da se veže neposredno na DNA in tako onemogoča njen vstop v celico. Torej mora obstajati drug mehanizem. 
Preden lahko bakteriofagi iz družine ''Siphoviridae'' injicirajo DNA, ki je zapakirana v glavi virusa, morajo iz svojega repa potisniti ''tape measure protein'' (TMP), ki določa dolžino cevke repa, saj se le-ta sestavi okoli njega. Ko TMP zapusti fagov rep, tvori poro skozi celično membrano, skozi katero lahko pride DNA v celico. Dokazali so, da protein LTP veže protein TMP in tako povzroči injiciranje DNA v periplazmo namesto v celico. Tam se le-ta nato razgradi. Naknadna okužba je tako onemogočena.

==Viri==
*Dulbecco, R. Mutual Exclusion between related phages. ''Journal of Bacteriology'', 1951, št. 63, str. 209–217
*Lu, M.-J. in Henning, U. Superinfection exclusion by T-even-type coliphages. ''Trends in Microbiology'', 1994, let. 2, št. 4, str. 137–139
*Lu, M.-J., Stierhof, Y.-D. in Henning, U. Location and unusual membrane topology of the immunity protein of the ''Escherichia coli'' phage T4. ''Journal of Virology'', 1993, let. 67, št. 8, str. 4905–4913
*Heller, K. J. in Neve, H. Superinfection exclusion und DNA-Injektion bei Siphoviridae-Phagen. ''Biospektrum'', 2014, let. 20, št. 1, str. 26–29.
*McGrath, S., Fitzgerald, G. F. in van Sinderen, D. Identification and characterization of phage-resistance genes in temperate lactococcal bacteriophages. ''Molecular Microbiology'', 2002, let. 43, št. 2, 509–520.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Sistem izključitve naknadne okužbe

2019-04-09T09:46:30Z

Aljaž Bratina: /* Protein Sie2009 */

==Uvod==
Superinfekcijska izključitev (ali izključitev naknadne okužbe; sistem Sie, iz angl. ''superinfection exclusion'') je fenomen, pri katerem primarna okužba z virusom prepreči naknadno okužbo z istim ali podobnim virusom. Virioni (virusni delci) nimajo lastnega metabolizma in mehanizma razmnoževanja, zato svoj dedni material vnesejo v gostiteljsko celico. Celični proteini tako omogočijo replikacijo virusnega dednega materiala in sintezo komponent, ki so nujne za obstoj virusnega delca. Običajno bakterijska gostiteljska celica lizira, pri čemer se sprostijo novonastali bakteriofagi. Mehanizem, pri katerem virusni dedni material, vključen v bakterijsko celico, prepreči prihod drugega faga, je z evolucijskega vidika za virus smiselna poteza, saj mu omogoči, da celico uporabi le za lastno razmnoževanje. Tega niso sposobni le virusi, pomembni za bakterije, ampak tudi mnogi virusi, pomembni za ljudi, živali in rastline.
==Virusna latenca==
Latentni virus je neaktiven virus, skrit v okuženi celici in njenih potomkah. Za razvoj virusne latence ima proces izključitve naknadne okužbe ključno vlogo. Lizogeni cikel virusu prvenstveno omogoči zaščito pred antivirusnimi snovmi, ki na provirusno obliko nimajo učinka, in povečanje možnosti prenosa virusnega dednega materiala tako horizontalno kot tudi na potomke gostiteljske celice.
==Genska stabilnost==
Preprečitev naknadne okužbe gostiteljske celice je za virus pomembna tudi evolucijsko z vidika genske stabilnosti, saj v posamezni virusni populaciji določa strukturo dednega materiala delcev. Izključitev superinfekcije primarnemu virusu, ki si z osebki istega ali sorodnega seva deli isto ekološko nišo in kompetitivno išče gostitelja, omogoči ohranjanje zaporedja nukleotidov oziroma stabilnost genskega materiala. Če je v celici kopija dednega zapisa le enega virusa, obstaja manjša verjetnost, da bi prišlo do neželenih rekombinacij in prerazporeditev genov, to pa omogoča vsesplošno raznolikost znotraj skupine virusov. Biodiverziteta fagov znotraj skupine virusov tipa T omogoča prepoznavanje različnih – celo modificiranih – receptorjev na gostiteljski celici.
==Zgodnje raziskave==
Fenomen izključitve naknadne okužbe sorodnih virusov so znanstveniki prvič opazili v začetku 50. let 20. stoletja. Med raziskavami na fagih tipa T so ugotovili, da je okužba z dvema virusoma neuspešna, razen v primeru, če virusa dodajo hkrati. Če so enega dodali prej kot drugega, drugi ni okužil celice.
Obstoj mehanizma, ki v gostiteljski celici povzroči korenito spremembo v dovzetnosti za sprejemanje dednega materiala sekundarnega bakteriofaga, dodanega z nekaj minutno zakasnitvijo, so posredno dokazali preko razpada genskega materiala le-tega. Kot sredstvo obarjanja dednega materiala razpadlega sekundarno dodanega virusa jim je služila trikloroocetna kislina. Zanimivo je bilo, da se je 50 % vzorca nahajalo v topni frakciji, kar pa je jasno kazalo na razpad DNA (trikloroocetna kislina obori polimere, daljše od 20 nukleotidov). Nadaljnje serije poskusov so jim pomagale pridobiti dokaze, da ni razpadla le DNA viriona, pač pa celoten delec, in da ni prišlo do prenosa genetske informacije sekundarnega virusa na potomce.
==Mehanizmi Sie==
Virusni dedni material vsebuje zapise za proteine, ki omogočajo izključitev naknadne okužbe. Ti virusni proteini lahko preprečijo vstop dednega materiala sekundarnega virusa v citoplazmo primarno okužene gostiteljske celice tako, da inhibirajo virusne peptidoglikan hidrolazne encime, ki virusnemu delcu omogočijo »preboj« skozi celično steno bakterijske celice. Lahko pa povzročijo modifikacijo specifičnih receptorjev na površini celice, ki jih prepoznajo virioni.
V nadaljevanju je opisanih nekaj primerov sistemov superinfekcijske izključitve pri posameznih gramnegativnih in grampozitivnih bakterijah.

==Sie pri gramnegativnih bakterijah==
Obstaja več proteinskih mehanizmov, ki v različnih gramnegativnih bakterijah povzročijo superinfekcijsko izključitev. Zapis za te proteine se nahaja v genomu bakteriofagov, ki primarno okužijo celico. Najbolje raziskan sistem Sie obsega proteina Imm (iz angl. ''immunity'', tj. imunost) in Sp (iz angl. ''spackle'', tj. kit, kitati), ki ju kodira genom faga T4 (in njemu podobnih fagov). Ti fagi specifično okužijo bakterijo ''Escherchia coli''. Ta proteina povzročata izključitev le omenjenih fagov, medtem ko superinfekcija ostalim (P1, c1, λ …) s tem mehanizmom ni onemogočena.
===Protein Imm===
Protein Imm je sestavljen iz ene polipeptidne verige, ki vsebuje 83 aminokislinskih ostankov. Njegova tridimenzionalna struktura še ni bila rešena. Ima dve daljši hidrofobni regiji: ena je iz 30, druga pa iz 28 ostankov. Z njima se protein najverjetneje usidra v plazmalemo ''E. coli''. Med njima je hidrofilen del iz 4 ostankov, od katerih sta dva pozitivno nabita (R33 in K36). C-končni del iz 18 ostankov je prav tako nekoliko bolj hidrofilen. Eksperimentalno je bilo ugotovljeno, da je C-končna regija usmerjena proti citosolu. Pri tem so bili sintetizirani fuzijski proteini Imm z β-galaktozidazo (ta se normalno nahaja v citosolu) in pa s kislo fosfatazo (ta se normalno nahaja v periplazemskem prostoru). Izkazalo se je, da sta v takem primeru oba encima aktivna v citosolu, kar pomeni, da se C-končna regija proteina Imm nahaja na citosolni strani. Ta regija torej ne more služiti za prepoznavanje faga. Poleg tega C-končni del ne kaže nobene specifičnosti in njegov skupni naboj ne predstavlja pomembne vloge. Tudi če se ta del, ki je nekoliko bazičen, zamenja z zaporedjem, ki vsebuje nekaj več kislih aminokislinskih ostankov, se aktivnost proteina večinoma ohrani. 
Podobno se ob odstranitvi dveh pozitivnih nabojev v vmesni regiji izkaže, da aktivnost proteina ni inhibirana, temveč le nekoliko zmanjšana. Nenavadni sta tudi dolžini membranskih domen (30 in 28 aminokislinskih ostankov, v običajnih transmembranskih domenah pa okrog 20). Zaradi navedenih razlogov obstajajo argumentirana domnevanja, da Imm sploh ni integralni protein. Predlagano je bilo, da Imm le interagira z drugim proteinom, ki je komponenta mesta na plazmalemi za vnos fagne DNA. Imm z vezavo na ta protein, ki zanj dejansko deluje kot receptor, spremeni njegovo konformacijo, s tem pa onemogoči prenos virusne DNA skozi plazmalemo v celico in jo preusmeri v periplazemski prostor. Empirični podati kažejo, da se 50 % DNA nabere v periplazmi, tam pa jo razgradi endonukleaza I. Ostalih 50 % ostane v fagu. 
Imunost preko tega mehanizma se razvije zelo hitro, tj. po največ 2 minutah po infekciji s primarnim fagom. ''E. coli'' ima približno 200 mest za vnos DNA (precej manj kot receptorjev za fage). Ker Imm deluje stehiometrično, je približno taka tudi njegova koncentracija. Zaradi tako majhne količine ga je ''in vivo'' zelo težko dokazati.

===Protein Sp===
Za superinfekcijsko izkjučitev faga T4 je v ''E. coli'' le v 80 % primerov odgovoren protein Imm, popolno imunost pa omogoča membranski protein Sp. Poskus je pokazal, da ima sistem ''E. coli'' in superinfekcijskega faga z deletiranim genom za Sp podobne značilnosti kot sistem, v katerem fag nima aktivnega lizocima, proteina 5. Za vnos DNA v celico fag namreč potrebuje ta protein, ki po vezavi na celico s svojo lizocimsko aktivnostjo razgradi peptidoglikanski sloj in s tem prebode periplazemski prostor ter tako dostopa do mesta za vnos DNA na plazmalemi. Protein Sp inhibira delovanje proteina 5, zato fag ne more razgraditi peptidoglikana in tako inducirati superinfekcije v gostiteljski celici. Tudi za ta protein je znano aminokislinsko zaporedje, ne pa njegova tridimenzionalna struktura.

==Sie pri grampozitivnih bakterijah==
===Protein Sie2009===
Poznavanje mehanizmov preprečevanja injiciranja DNA fagov je pri grampozitivnih bakterijah bolj omejeno kot pri gramnegativnih bakterijah. Prve objave mehanizmov Sie pri grampozitivnih bakterijah segajo v leto 2002, torej okoli 50 let po začetku proučevanja Sie. Prvi identificirani protein pri grampozitivnih bakterijah, ki omogoča Sie, je Sie2009, protein faga Tuc2009, katerega gostitelj je bakterija ''Lactococcus lactis'', ki ima pomembno vlogo pri mlečni fermentaciji. 
Gen Sie2009, ki zapisuje ta protein, se nahaja v lizogenem modulu DNA faga Tuc2009 med genom za integrazo (encim, ki omogoča vstavljanje fagne DNA v krožno DNA gostitelja) in genom, ki kodira represor. Na podlagi njegove lokacije in primerjave z geni za zapis proteinov, ki prav tako omejujejo razmnoževanje fagov, so sklepali, da Sie2009 onemogoča okužbo bakterije s fagi. Zato so želeli to nedvomno dokazati in ugotoviti, na kateri stopnji razmnoževanja bakteriofaga deluje. Sistematične preiskave so pričeli tako, da so gen vstavili v plazmid, z le-tem okužili različne vrste oziroma seve bakterij in testirali njihovo odpornost na različne bakteriofage. Izkazalo se je, da protein Sie2009 omogoča odpornost proti določenim vrstam fagov le nekaterim vrstam bakterij. 
Raziskave so nadaljevali s proučevanjem lokacije nahajanja proteina Sie2009. Ugotovili so, da je pripet na celično membrano. Preko različnih eksperimentov so še ugotovili, da protein Sie2009 ne vpliva na pritrjevanje fagov na površino bakterijske celice, niti ne ovira transformacije plazmidov ali transfekcije. Na podlagi teh rezultatov so prišli do zaključka, da Sie2009 blokira injiciranje fagne DNA, kar je bil takrat popolnoma na novo odkrit mehanizem Sie. Natančnejša razlaga pa še danes ni znana.

===Protein LTP===
Med najbolje raziskane sisteme Sie pri grampozitivnih bakterijah spada sistem LTP faga TP-J34, katerega gostitelj je bakterija ''Streptoccocus thermophilus'' J34, ki se uporablja v proizvodnji jogurta. V lizogenem modulu faga TP-J34 se nahaja genetsko stikalo, ki leži med divergentno prepisovanima genoma ''crh'' in ''cro''. Gen ''crh'' je sestavni del operona, ki ga poleg tega strukturnega gena sestavljajo še geni ''orf3'', ''ltp'' in ''int'' (po vrstnem redu prepisovanja). Gen ''crh'' kodira protein, ki je represor, gen ''orf3'' pa protein, ki je regulator. Gen ''int'' zapisuje protein integrazo, ki omogoča vstavljanje fagne DNA v krožno DNA gostitelja, gen ''ltp'' pa nosi zapis za protein LTP, 142 aminokislinskih ostankov velik lipoprotein, ki se nahaja na zunanji strani celične membrane. 
Protein LTP se izraža v lizogenem ciklu fag in omogoča sistem Sie, kar je pokazal sledeč eksperiment. V bakterije vrst ''Streptococcus thermophilus'' in ''Lactococcus lactis'' so preko plazmidov vstavili gen za protein LTP, ki je oviral razmnoževanje virusov v teh bakterijah. Pri obeh gostiteljskih bakterijah je odsotnost podvojevanja fagne DNA dokazala, da je bilo preprečeno injiciranje fagne DNA. Protein LTP pa ni onemogočal sekundarne okužbe le pri bakteriofagih TP-J34, ampak tudi pri drugih vrstah fagov. Za najobčutljivejšo se je izkazala vrsta laktokokih fagov P008, saj se je stopnja razmnoževanja fagov znižala približno za faktor 108. 
Skozi raziskave so prišli do zaključka, da LTP preprečuje vstop DNA v bakterijsko celico. Z imunokemijskim označevanjem z zlatom in elektronsko mikroskopijo so nedvomno potrdili, da se nahaja na zunanji strani celične membrane. Na podlagi strukture so sklepali, da je LTP protein, ki veže proteine. S tem so lahko izključili hipotezo, da se veže neposredno na DNA in tako onemogoča njen vstop v celico. Torej mora obstajati drug mehanizem. 
Preden lahko bakteriofagi iz družine ''Siphoviridae'' injicirajo DNA, ki je zapakirana v glavi virusa, morajo iz svojega repa potisniti ''tape measure protein'' (TMP), ki določa dolžino cevke repa, saj se le-ta sestavi okoli njega. Ko TMP zapusti fagov rep, tvori poro skozi celično membrano, skozi katero lahko pride DNA v celico. Dokazali so, da protein LTP veže protein TMP in tako povzroči injiciranje DNA v periplazmo namesto v celico. Tam se le-ta nato razgradi. Naknadna okužba je tako onemogočena.

==Viri==
*Dulbecco, R. Mutual Exclusion between related phages. ''Journal of Bacteriology'', 1951, št. 63, str. 209–217
*Lu, M.-J. in Henning, U. Superinfection exclusion by T-even-type coliphages. ''Trends in Microbiology'', 1994, let. 2, št. 4, str. 137–139
*Lu, M.-J., Stierhof, Y.-D. in Henning, U. Location and unusual membrane topology of the immunity protein of the ''Escherichia coli'' phage T4. ''Journal of Virology'', 1993, let. 67, št. 8, str. 4905–4913
*Heller, K. J. in Neve, H. Superinfection exclusion und DNA-Injektion bei Siphoviridae-Phagen. ''Biospektrum'', 2014, let. 20, št. 1, str. 26–29.
*McGrath, S., Fitzgerald, G. F. in van Sinderen, D. Identification and characterization of phage-resistance genes in temperate lactococcal bacteriophages. ''Molecular Microbiology'', 2002, let. 43, št. 2, 509–520.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Sistem izključitve naknadne okužbe

2019-04-09T09:46:03Z

Aljaž Bratina: /* Protein LTP */

==Uvod==
Superinfekcijska izključitev (ali izključitev naknadne okužbe; sistem Sie, iz angl. ''superinfection exclusion'') je fenomen, pri katerem primarna okužba z virusom prepreči naknadno okužbo z istim ali podobnim virusom. Virioni (virusni delci) nimajo lastnega metabolizma in mehanizma razmnoževanja, zato svoj dedni material vnesejo v gostiteljsko celico. Celični proteini tako omogočijo replikacijo virusnega dednega materiala in sintezo komponent, ki so nujne za obstoj virusnega delca. Običajno bakterijska gostiteljska celica lizira, pri čemer se sprostijo novonastali bakteriofagi. Mehanizem, pri katerem virusni dedni material, vključen v bakterijsko celico, prepreči prihod drugega faga, je z evolucijskega vidika za virus smiselna poteza, saj mu omogoči, da celico uporabi le za lastno razmnoževanje. Tega niso sposobni le virusi, pomembni za bakterije, ampak tudi mnogi virusi, pomembni za ljudi, živali in rastline.
==Virusna latenca==
Latentni virus je neaktiven virus, skrit v okuženi celici in njenih potomkah. Za razvoj virusne latence ima proces izključitve naknadne okužbe ključno vlogo. Lizogeni cikel virusu prvenstveno omogoči zaščito pred antivirusnimi snovmi, ki na provirusno obliko nimajo učinka, in povečanje možnosti prenosa virusnega dednega materiala tako horizontalno kot tudi na potomke gostiteljske celice.
==Genska stabilnost==
Preprečitev naknadne okužbe gostiteljske celice je za virus pomembna tudi evolucijsko z vidika genske stabilnosti, saj v posamezni virusni populaciji določa strukturo dednega materiala delcev. Izključitev superinfekcije primarnemu virusu, ki si z osebki istega ali sorodnega seva deli isto ekološko nišo in kompetitivno išče gostitelja, omogoči ohranjanje zaporedja nukleotidov oziroma stabilnost genskega materiala. Če je v celici kopija dednega zapisa le enega virusa, obstaja manjša verjetnost, da bi prišlo do neželenih rekombinacij in prerazporeditev genov, to pa omogoča vsesplošno raznolikost znotraj skupine virusov. Biodiverziteta fagov znotraj skupine virusov tipa T omogoča prepoznavanje različnih – celo modificiranih – receptorjev na gostiteljski celici.
==Zgodnje raziskave==
Fenomen izključitve naknadne okužbe sorodnih virusov so znanstveniki prvič opazili v začetku 50. let 20. stoletja. Med raziskavami na fagih tipa T so ugotovili, da je okužba z dvema virusoma neuspešna, razen v primeru, če virusa dodajo hkrati. Če so enega dodali prej kot drugega, drugi ni okužil celice.
Obstoj mehanizma, ki v gostiteljski celici povzroči korenito spremembo v dovzetnosti za sprejemanje dednega materiala sekundarnega bakteriofaga, dodanega z nekaj minutno zakasnitvijo, so posredno dokazali preko razpada genskega materiala le-tega. Kot sredstvo obarjanja dednega materiala razpadlega sekundarno dodanega virusa jim je služila trikloroocetna kislina. Zanimivo je bilo, da se je 50 % vzorca nahajalo v topni frakciji, kar pa je jasno kazalo na razpad DNA (trikloroocetna kislina obori polimere, daljše od 20 nukleotidov). Nadaljnje serije poskusov so jim pomagale pridobiti dokaze, da ni razpadla le DNA viriona, pač pa celoten delec, in da ni prišlo do prenosa genetske informacije sekundarnega virusa na potomce.
==Mehanizmi Sie==
Virusni dedni material vsebuje zapise za proteine, ki omogočajo izključitev naknadne okužbe. Ti virusni proteini lahko preprečijo vstop dednega materiala sekundarnega virusa v citoplazmo primarno okužene gostiteljske celice tako, da inhibirajo virusne peptidoglikan hidrolazne encime, ki virusnemu delcu omogočijo »preboj« skozi celično steno bakterijske celice. Lahko pa povzročijo modifikacijo specifičnih receptorjev na površini celice, ki jih prepoznajo virioni.
V nadaljevanju je opisanih nekaj primerov sistemov superinfekcijske izključitve pri posameznih gramnegativnih in grampozitivnih bakterijah.

==Sie pri gramnegativnih bakterijah==
Obstaja več proteinskih mehanizmov, ki v različnih gramnegativnih bakterijah povzročijo superinfekcijsko izključitev. Zapis za te proteine se nahaja v genomu bakteriofagov, ki primarno okužijo celico. Najbolje raziskan sistem Sie obsega proteina Imm (iz angl. ''immunity'', tj. imunost) in Sp (iz angl. ''spackle'', tj. kit, kitati), ki ju kodira genom faga T4 (in njemu podobnih fagov). Ti fagi specifično okužijo bakterijo ''Escherchia coli''. Ta proteina povzročata izključitev le omenjenih fagov, medtem ko superinfekcija ostalim (P1, c1, λ …) s tem mehanizmom ni onemogočena.
===Protein Imm===
Protein Imm je sestavljen iz ene polipeptidne verige, ki vsebuje 83 aminokislinskih ostankov. Njegova tridimenzionalna struktura še ni bila rešena. Ima dve daljši hidrofobni regiji: ena je iz 30, druga pa iz 28 ostankov. Z njima se protein najverjetneje usidra v plazmalemo ''E. coli''. Med njima je hidrofilen del iz 4 ostankov, od katerih sta dva pozitivno nabita (R33 in K36). C-končni del iz 18 ostankov je prav tako nekoliko bolj hidrofilen. Eksperimentalno je bilo ugotovljeno, da je C-končna regija usmerjena proti citosolu. Pri tem so bili sintetizirani fuzijski proteini Imm z β-galaktozidazo (ta se normalno nahaja v citosolu) in pa s kislo fosfatazo (ta se normalno nahaja v periplazemskem prostoru). Izkazalo se je, da sta v takem primeru oba encima aktivna v citosolu, kar pomeni, da se C-končna regija proteina Imm nahaja na citosolni strani. Ta regija torej ne more služiti za prepoznavanje faga. Poleg tega C-končni del ne kaže nobene specifičnosti in njegov skupni naboj ne predstavlja pomembne vloge. Tudi če se ta del, ki je nekoliko bazičen, zamenja z zaporedjem, ki vsebuje nekaj več kislih aminokislinskih ostankov, se aktivnost proteina večinoma ohrani. 
Podobno se ob odstranitvi dveh pozitivnih nabojev v vmesni regiji izkaže, da aktivnost proteina ni inhibirana, temveč le nekoliko zmanjšana. Nenavadni sta tudi dolžini membranskih domen (30 in 28 aminokislinskih ostankov, v običajnih transmembranskih domenah pa okrog 20). Zaradi navedenih razlogov obstajajo argumentirana domnevanja, da Imm sploh ni integralni protein. Predlagano je bilo, da Imm le interagira z drugim proteinom, ki je komponenta mesta na plazmalemi za vnos fagne DNA. Imm z vezavo na ta protein, ki zanj dejansko deluje kot receptor, spremeni njegovo konformacijo, s tem pa onemogoči prenos virusne DNA skozi plazmalemo v celico in jo preusmeri v periplazemski prostor. Empirični podati kažejo, da se 50 % DNA nabere v periplazmi, tam pa jo razgradi endonukleaza I. Ostalih 50 % ostane v fagu. 
Imunost preko tega mehanizma se razvije zelo hitro, tj. po največ 2 minutah po infekciji s primarnim fagom. ''E. coli'' ima približno 200 mest za vnos DNA (precej manj kot receptorjev za fage). Ker Imm deluje stehiometrično, je približno taka tudi njegova koncentracija. Zaradi tako majhne količine ga je ''in vivo'' zelo težko dokazati.

===Protein Sp===
Za superinfekcijsko izkjučitev faga T4 je v ''E. coli'' le v 80 % primerov odgovoren protein Imm, popolno imunost pa omogoča membranski protein Sp. Poskus je pokazal, da ima sistem ''E. coli'' in superinfekcijskega faga z deletiranim genom za Sp podobne značilnosti kot sistem, v katerem fag nima aktivnega lizocima, proteina 5. Za vnos DNA v celico fag namreč potrebuje ta protein, ki po vezavi na celico s svojo lizocimsko aktivnostjo razgradi peptidoglikanski sloj in s tem prebode periplazemski prostor ter tako dostopa do mesta za vnos DNA na plazmalemi. Protein Sp inhibira delovanje proteina 5, zato fag ne more razgraditi peptidoglikana in tako inducirati superinfekcije v gostiteljski celici. Tudi za ta protein je znano aminokislinsko zaporedje, ne pa njegova tridimenzionalna struktura.

==Sie pri grampozitivnih bakterijah==
===Protein Sie2009===
Poznavanje mehanizmov preprečevanja injiciranja DNA fagov je pri grampozitivnih bakterijah bolj omejeno kot pri gramnegativnih bakterijah. Prve objave mehanizmov Sie pri grampozitivnih bakterijah segajo v leto 2002, torej okoli 50 let po začetku proučevanja Sie. Prvi identificirani protein pri grampozitivnih bakterijah, ki omogoča Sie, je Sie2009, protein faga Tuc2009, katerega gostitelj je bakterija ''Lactococcus lactis'', ki ima pomembno vlogo pri mlečni fermentaciji. 
Gen Sie2009, ki zapisuje ta protein, se nahaja v lizogenem modulu DNA faga Tuc2009 med genom za integrazo (encim, ki omogoča vstavljanje fagne DNA v krožno DNA gostitelja) in genom, ki kodira represor. Na podlagi njegove lokacije in primerjave z geni za zapis proteinov, ki prav tako omejujejo razmnoževanje fagov, so sklepali, da Sie2009 onemogoča okužbo bakterije s fagi. Zato so želeli to nedvomno dokazati in ugotoviti, na kateri stopnji razmnoževanja bakteriofaga deluje. Sistematične preiskave so pričeli tako, da so gen vstavili v plazmid, z le-tem okužili različne vrste oziroma seve bakterij in testirali njihovo odpornost na različne bakteriofage. Izkazalo se je, da protein Sie2009 omogoča odpornost proti določenim vrstam fagov le nekaterim vrstam bakterij. 
Raziskave so nadaljevali s proučevanjem lokacije nahajanja proteina Sie2009. Ugotovili so, da je pripet na celično membrano. Preko različnih eksperimentov so še ugotovili, da protein Sie2009 ne vpliva na pritrjevanje fagov na površino bakterijske celice, niti ne ovira transformacije plazmidov ali transfekcije. Na podlagi teh rezultatov so prišli do zaključka, da Sie2009 blokira injiciranje fagne DNA, kar je bil takrat popolnoma na novo odkrit mehanizem Sie. Natančnejša razlaga pa še danes ni znana.

===Protein LTP===
Med najbolje raziskane sisteme Sie pri grampozitivnih bakterijah spada sistem LTP faga TP-J34, katerega gostitelj je bakterija ''Streptoccocus thermophilus'' J34, ki se uporablja v proizvodnji jogurta. V lizogenem modulu faga TP-J34 se nahaja genetsko stikalo, ki leži med divergentno prepisovanima genoma ''crh'' in ''cro''. Gen ''crh'' je sestavni del operona, ki ga poleg tega strukturnega gena sestavljajo še geni ''orf3'', ''ltp'' in ''int'' (po vrstnem redu prepisovanja). Gen ''crh'' kodira protein, ki je represor, gen ''orf3'' pa protein, ki je regulator. Gen ''int'' zapisuje protein integrazo, ki omogoča vstavljanje fagne DNA v krožno DNA gostitelja, gen ''ltp'' pa nosi zapis za protein LTP, 142 aminokislinskih ostankov velik lipoprotein, ki se nahaja na zunanji strani celične membrane. 
Protein LTP se izraža v lizogenem ciklu fag in omogoča sistem Sie, kar je pokazal sledeč eksperiment. V bakterije vrst ''Streptococcus thermophilus'' in ''Lactococcus lactis'' so preko plazmidov vstavili gen za protein LTP, ki je oviral razmnoževanje virusov v teh bakterijah. Pri obeh gostiteljskih bakterijah je odsotnost podvojevanja fagne DNA dokazala, da je bilo preprečeno injiciranje fagne DNA. Protein LTP pa ni onemogočal sekundarne okužbe le pri bakteriofagih TP-J34, ampak tudi pri drugih vrstah fagov. Za najobčutljivejšo se je izkazala vrsta laktokokih fagov P008, saj se je stopnja razmnoževanja fagov znižala približno za faktor 108. 
Skozi raziskave so prišli do zaključka, da LTP preprečuje vstop DNA v bakterijsko celico. Z imunokemijskim označevanjem z zlatom in elektronsko mikroskopijo so nedvomno potrdili, da se nahaja na zunanji strani celične membrane. Na podlagi strukture so sklepali, da je LTP protein, ki veže proteine. S tem so lahko izključili hipotezo, da se veže neposredno na DNA in tako onemogoča njen vstop v celico. Torej mora obstajati drug mehanizem. 
Preden lahko bakteriofagi iz družine ''Siphoviridae'' injicirajo DNA, ki je zapakirana v glavi virusa, morajo iz svojega repa potisniti ''tape measure protein'' (TMP), ki določa dolžino cevke repa, saj se le-ta sestavi okoli njega. Ko TMP zapusti fagov rep, tvori poro skozi celično membrano, skozi katero lahko pride DNA v celico. Dokazali so, da protein LTP veže protein TMP in tako povzroči injiciranje DNA v periplazmo namesto v celico. Tam se le-ta nato razgradi. Naknadna okužba je tako onemogočena.

==Viri==
*Dulbecco, R. Mutual Exclusion between related phages. ''Journal of Bacteriology'', 1951, št. 63, str. 209–217
*Lu, M.-J. in Henning, U. Superinfection exclusion by T-even-type coliphages. ''Trends in Microbiology'', 1994, let. 2, št. 4, str. 137–139
*Lu, M.-J., Stierhof, Y.-D. in Henning, U. Location and unusual membrane topology of the immunity protein of the ''Escherichia coli'' phage T4. ''Journal of Virology'', 1993, let. 67, št. 8, str. 4905–4913
*Heller, K. J. in Neve, H. Superinfection exclusion und DNA-Injektion bei Siphoviridae-Phagen. ''Biospektrum'', 2014, let. 20, št. 1, str. 26–29.
*McGrath, S., Fitzgerald, G. F. in van Sinderen, D. Identification and characterization of phage-resistance genes in temperate lactococcal bacteriophages. ''Molecular Microbiology'', 2002, let. 43, št. 2, 509–520.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Sistem izključitve naknadne okužbe

2019-04-09T09:45:17Z

Aljaž Bratina: /* Protein Sie2009 */

==Uvod==
Superinfekcijska izključitev (ali izključitev naknadne okužbe; sistem Sie, iz angl. ''superinfection exclusion'') je fenomen, pri katerem primarna okužba z virusom prepreči naknadno okužbo z istim ali podobnim virusom. Virioni (virusni delci) nimajo lastnega metabolizma in mehanizma razmnoževanja, zato svoj dedni material vnesejo v gostiteljsko celico. Celični proteini tako omogočijo replikacijo virusnega dednega materiala in sintezo komponent, ki so nujne za obstoj virusnega delca. Običajno bakterijska gostiteljska celica lizira, pri čemer se sprostijo novonastali bakteriofagi. Mehanizem, pri katerem virusni dedni material, vključen v bakterijsko celico, prepreči prihod drugega faga, je z evolucijskega vidika za virus smiselna poteza, saj mu omogoči, da celico uporabi le za lastno razmnoževanje. Tega niso sposobni le virusi, pomembni za bakterije, ampak tudi mnogi virusi, pomembni za ljudi, živali in rastline.
==Virusna latenca==
Latentni virus je neaktiven virus, skrit v okuženi celici in njenih potomkah. Za razvoj virusne latence ima proces izključitve naknadne okužbe ključno vlogo. Lizogeni cikel virusu prvenstveno omogoči zaščito pred antivirusnimi snovmi, ki na provirusno obliko nimajo učinka, in povečanje možnosti prenosa virusnega dednega materiala tako horizontalno kot tudi na potomke gostiteljske celice.
==Genska stabilnost==
Preprečitev naknadne okužbe gostiteljske celice je za virus pomembna tudi evolucijsko z vidika genske stabilnosti, saj v posamezni virusni populaciji določa strukturo dednega materiala delcev. Izključitev superinfekcije primarnemu virusu, ki si z osebki istega ali sorodnega seva deli isto ekološko nišo in kompetitivno išče gostitelja, omogoči ohranjanje zaporedja nukleotidov oziroma stabilnost genskega materiala. Če je v celici kopija dednega zapisa le enega virusa, obstaja manjša verjetnost, da bi prišlo do neželenih rekombinacij in prerazporeditev genov, to pa omogoča vsesplošno raznolikost znotraj skupine virusov. Biodiverziteta fagov znotraj skupine virusov tipa T omogoča prepoznavanje različnih – celo modificiranih – receptorjev na gostiteljski celici.
==Zgodnje raziskave==
Fenomen izključitve naknadne okužbe sorodnih virusov so znanstveniki prvič opazili v začetku 50. let 20. stoletja. Med raziskavami na fagih tipa T so ugotovili, da je okužba z dvema virusoma neuspešna, razen v primeru, če virusa dodajo hkrati. Če so enega dodali prej kot drugega, drugi ni okužil celice.
Obstoj mehanizma, ki v gostiteljski celici povzroči korenito spremembo v dovzetnosti za sprejemanje dednega materiala sekundarnega bakteriofaga, dodanega z nekaj minutno zakasnitvijo, so posredno dokazali preko razpada genskega materiala le-tega. Kot sredstvo obarjanja dednega materiala razpadlega sekundarno dodanega virusa jim je služila trikloroocetna kislina. Zanimivo je bilo, da se je 50 % vzorca nahajalo v topni frakciji, kar pa je jasno kazalo na razpad DNA (trikloroocetna kislina obori polimere, daljše od 20 nukleotidov). Nadaljnje serije poskusov so jim pomagale pridobiti dokaze, da ni razpadla le DNA viriona, pač pa celoten delec, in da ni prišlo do prenosa genetske informacije sekundarnega virusa na potomce.
==Mehanizmi Sie==
Virusni dedni material vsebuje zapise za proteine, ki omogočajo izključitev naknadne okužbe. Ti virusni proteini lahko preprečijo vstop dednega materiala sekundarnega virusa v citoplazmo primarno okužene gostiteljske celice tako, da inhibirajo virusne peptidoglikan hidrolazne encime, ki virusnemu delcu omogočijo »preboj« skozi celično steno bakterijske celice. Lahko pa povzročijo modifikacijo specifičnih receptorjev na površini celice, ki jih prepoznajo virioni.
V nadaljevanju je opisanih nekaj primerov sistemov superinfekcijske izključitve pri posameznih gramnegativnih in grampozitivnih bakterijah.

==Sie pri gramnegativnih bakterijah==
Obstaja več proteinskih mehanizmov, ki v različnih gramnegativnih bakterijah povzročijo superinfekcijsko izključitev. Zapis za te proteine se nahaja v genomu bakteriofagov, ki primarno okužijo celico. Najbolje raziskan sistem Sie obsega proteina Imm (iz angl. ''immunity'', tj. imunost) in Sp (iz angl. ''spackle'', tj. kit, kitati), ki ju kodira genom faga T4 (in njemu podobnih fagov). Ti fagi specifično okužijo bakterijo ''Escherchia coli''. Ta proteina povzročata izključitev le omenjenih fagov, medtem ko superinfekcija ostalim (P1, c1, λ …) s tem mehanizmom ni onemogočena.
===Protein Imm===
Protein Imm je sestavljen iz ene polipeptidne verige, ki vsebuje 83 aminokislinskih ostankov. Njegova tridimenzionalna struktura še ni bila rešena. Ima dve daljši hidrofobni regiji: ena je iz 30, druga pa iz 28 ostankov. Z njima se protein najverjetneje usidra v plazmalemo ''E. coli''. Med njima je hidrofilen del iz 4 ostankov, od katerih sta dva pozitivno nabita (R33 in K36). C-končni del iz 18 ostankov je prav tako nekoliko bolj hidrofilen. Eksperimentalno je bilo ugotovljeno, da je C-končna regija usmerjena proti citosolu. Pri tem so bili sintetizirani fuzijski proteini Imm z β-galaktozidazo (ta se normalno nahaja v citosolu) in pa s kislo fosfatazo (ta se normalno nahaja v periplazemskem prostoru). Izkazalo se je, da sta v takem primeru oba encima aktivna v citosolu, kar pomeni, da se C-končna regija proteina Imm nahaja na citosolni strani. Ta regija torej ne more služiti za prepoznavanje faga. Poleg tega C-končni del ne kaže nobene specifičnosti in njegov skupni naboj ne predstavlja pomembne vloge. Tudi če se ta del, ki je nekoliko bazičen, zamenja z zaporedjem, ki vsebuje nekaj več kislih aminokislinskih ostankov, se aktivnost proteina večinoma ohrani. 
Podobno se ob odstranitvi dveh pozitivnih nabojev v vmesni regiji izkaže, da aktivnost proteina ni inhibirana, temveč le nekoliko zmanjšana. Nenavadni sta tudi dolžini membranskih domen (30 in 28 aminokislinskih ostankov, v običajnih transmembranskih domenah pa okrog 20). Zaradi navedenih razlogov obstajajo argumentirana domnevanja, da Imm sploh ni integralni protein. Predlagano je bilo, da Imm le interagira z drugim proteinom, ki je komponenta mesta na plazmalemi za vnos fagne DNA. Imm z vezavo na ta protein, ki zanj dejansko deluje kot receptor, spremeni njegovo konformacijo, s tem pa onemogoči prenos virusne DNA skozi plazmalemo v celico in jo preusmeri v periplazemski prostor. Empirični podati kažejo, da se 50 % DNA nabere v periplazmi, tam pa jo razgradi endonukleaza I. Ostalih 50 % ostane v fagu. 
Imunost preko tega mehanizma se razvije zelo hitro, tj. po največ 2 minutah po infekciji s primarnim fagom. ''E. coli'' ima približno 200 mest za vnos DNA (precej manj kot receptorjev za fage). Ker Imm deluje stehiometrično, je približno taka tudi njegova koncentracija. Zaradi tako majhne količine ga je ''in vivo'' zelo težko dokazati.

===Protein Sp===
Za superinfekcijsko izkjučitev faga T4 je v ''E. coli'' le v 80 % primerov odgovoren protein Imm, popolno imunost pa omogoča membranski protein Sp. Poskus je pokazal, da ima sistem ''E. coli'' in superinfekcijskega faga z deletiranim genom za Sp podobne značilnosti kot sistem, v katerem fag nima aktivnega lizocima, proteina 5. Za vnos DNA v celico fag namreč potrebuje ta protein, ki po vezavi na celico s svojo lizocimsko aktivnostjo razgradi peptidoglikanski sloj in s tem prebode periplazemski prostor ter tako dostopa do mesta za vnos DNA na plazmalemi. Protein Sp inhibira delovanje proteina 5, zato fag ne more razgraditi peptidoglikana in tako inducirati superinfekcije v gostiteljski celici. Tudi za ta protein je znano aminokislinsko zaporedje, ne pa njegova tridimenzionalna struktura.

==Sie pri grampozitivnih bakterijah==
===Protein Sie2009===
Poznavanje mehanizmov preprečevanja injiciranja DNA fagov je pri grampozitivnih bakterijah bolj omejeno kot pri gramnegativnih bakterijah. Prve objave mehanizmov Sie pri grampozitivnih bakterijah segajo v leto 2002, torej okoli 50 let po začetku proučevanja Sie. Prvi identificirani protein pri grampozitivnih bakterijah, ki omogoča Sie, je Sie2009, protein faga Tuc2009, katerega gostitelj je bakterija ''Lactococcus lactis'', ki ima pomembno vlogo pri mlečni fermentaciji. 
Gen Sie2009, ki zapisuje ta protein, se nahaja v lizogenem modulu DNA faga Tuc2009 med genom za integrazo (encim, ki omogoča vstavljanje fagne DNA v krožno DNA gostitelja) in genom, ki kodira represor. Na podlagi njegove lokacije in primerjave z geni za zapis proteinov, ki prav tako omejujejo razmnoževanje fagov, so sklepali, da Sie2009 onemogoča okužbo bakterije s fagi. Zato so želeli to nedvomno dokazati in ugotoviti, na kateri stopnji razmnoževanja bakteriofaga deluje. Sistematične preiskave so pričeli tako, da so gen vstavili v plazmid, z le-tem okužili različne vrste oziroma seve bakterij in testirali njihovo odpornost na različne bakteriofage. Izkazalo se je, da protein Sie2009 omogoča odpornost proti določenim vrstam fagov le nekaterim vrstam bakterij. 
Raziskave so nadaljevali s proučevanjem lokacije nahajanja proteina Sie2009. Ugotovili so, da je pripet na celično membrano. Preko različnih eksperimentov so še ugotovili, da protein Sie2009 ne vpliva na pritrjevanje fagov na površino bakterijske celice, niti ne ovira transformacije plazmidov ali transfekcije. Na podlagi teh rezultatov so prišli do zaključka, da Sie2009 blokira injiciranje fagne DNA, kar je bil takrat popolnoma na novo odkrit mehanizem Sie. Natančnejša razlaga pa še danes ni znana.

===Protein LTP===
Med najbolje raziskane sisteme Sie pri grampozitivnih bakterijah spada sistem LTP faga TP-J34, katerega gostitelj je bakterija ''Streptoccocus thermophilus'' J34, ki se uporablja v proizvodnji jogurta. V lizogenem modulu faga TP-J34 se nahaja genetsko stikalo, ki leži med divergentno prepisovanima genoma ''crh'' in ''cro''. Gen ''crh'' je sestavni del operona, ki ga poleg tega strukturnega gena sestavljajo še geni ''orf3'', ''ltp'' in ''int'' (po vrstnem redu prepisovanja). Gen ''crh'' kodira protein, ki je represor, gen ''orf3'' pa protein, ki je regulator. Gen ''int'' zapisuje protein integrazo, ki omogoča vstavljanje fagne DNA v krožno DNA gostitelja, gen ''ltp'' pa nosi zapis za protein LTP, 142 aminokislinskih ostankov velik lipoprotein, ki se nahaja na zunanji strani celične membrane.
Protein LTP se izraža v lizogenem ciklu fag in omogoča sistem Sie, kar je pokazal sledeč eksperiment. V bakterije vrst ''Streptococcus thermophilus'' in ''Lactococcus lactis'' so preko plazmidov vstavili gen za protein LTP, ki je oviral razmnoževanje virusov v teh bakterijah. Pri obeh gostiteljskih bakterijah je odsotnost podvojevanja fagne DNA dokazala, da je bilo preprečeno injiciranje fagne DNA. Protein LTP pa ni onemogočal sekundarne okužbe le pri bakteriofagih TP-J34, ampak tudi pri drugih vrstah fagov. Za najobčutljivejšo se je izkazala vrsta laktokokih fagov P008, saj se je stopnja razmnoževanja fagov znižala približno za faktor 108.
Skozi raziskave so prišli do zaključka, da LTP preprečuje vstop DNA v bakterijsko celico. Z imunokemijskim označevanjem z zlatom in elektronsko mikroskopijo so nedvomno potrdili, da se nahaja na zunanji strani celične membrane. Na podlagi strukture so sklepali, da je LTP protein, ki veže proteine. S tem so lahko izključili hipotezo, da se veže neposredno na DNA in tako onemogoča njen vstop v celico. Torej mora obstajati drug mehanizem.
Preden lahko bakteriofagi iz družine ''Siphoviridae'' injicirajo DNA, ki je zapakirana v glavi virusa, morajo iz svojega repa potisniti ''tape measure protein'' (TMP), ki določa dolžino cevke repa, saj se le-ta sestavi okoli njega. Ko TMP zapusti fagov rep, tvori poro skozi celično membrano, skozi katero lahko pride DNA v celico. Dokazali so, da protein LTP veže protein TMP in tako povzroči injiciranje DNA v periplazmo namesto v celico. Tam se le-ta nato razgradi. Naknadna okužba je tako onemogočena.

==Viri==
*Dulbecco, R. Mutual Exclusion between related phages. ''Journal of Bacteriology'', 1951, št. 63, str. 209–217
*Lu, M.-J. in Henning, U. Superinfection exclusion by T-even-type coliphages. ''Trends in Microbiology'', 1994, let. 2, št. 4, str. 137–139
*Lu, M.-J., Stierhof, Y.-D. in Henning, U. Location and unusual membrane topology of the immunity protein of the ''Escherichia coli'' phage T4. ''Journal of Virology'', 1993, let. 67, št. 8, str. 4905–4913
*Heller, K. J. in Neve, H. Superinfection exclusion und DNA-Injektion bei Siphoviridae-Phagen. ''Biospektrum'', 2014, let. 20, št. 1, str. 26–29.
*McGrath, S., Fitzgerald, G. F. in van Sinderen, D. Identification and characterization of phage-resistance genes in temperate lactococcal bacteriophages. ''Molecular Microbiology'', 2002, let. 43, št. 2, 509–520.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Sistem izključitve naknadne okužbe

2019-04-09T09:44:43Z

Aljaž Bratina: /* Protein Imm */

==Uvod==
Superinfekcijska izključitev (ali izključitev naknadne okužbe; sistem Sie, iz angl. ''superinfection exclusion'') je fenomen, pri katerem primarna okužba z virusom prepreči naknadno okužbo z istim ali podobnim virusom. Virioni (virusni delci) nimajo lastnega metabolizma in mehanizma razmnoževanja, zato svoj dedni material vnesejo v gostiteljsko celico. Celični proteini tako omogočijo replikacijo virusnega dednega materiala in sintezo komponent, ki so nujne za obstoj virusnega delca. Običajno bakterijska gostiteljska celica lizira, pri čemer se sprostijo novonastali bakteriofagi. Mehanizem, pri katerem virusni dedni material, vključen v bakterijsko celico, prepreči prihod drugega faga, je z evolucijskega vidika za virus smiselna poteza, saj mu omogoči, da celico uporabi le za lastno razmnoževanje. Tega niso sposobni le virusi, pomembni za bakterije, ampak tudi mnogi virusi, pomembni za ljudi, živali in rastline.
==Virusna latenca==
Latentni virus je neaktiven virus, skrit v okuženi celici in njenih potomkah. Za razvoj virusne latence ima proces izključitve naknadne okužbe ključno vlogo. Lizogeni cikel virusu prvenstveno omogoči zaščito pred antivirusnimi snovmi, ki na provirusno obliko nimajo učinka, in povečanje možnosti prenosa virusnega dednega materiala tako horizontalno kot tudi na potomke gostiteljske celice.
==Genska stabilnost==
Preprečitev naknadne okužbe gostiteljske celice je za virus pomembna tudi evolucijsko z vidika genske stabilnosti, saj v posamezni virusni populaciji določa strukturo dednega materiala delcev. Izključitev superinfekcije primarnemu virusu, ki si z osebki istega ali sorodnega seva deli isto ekološko nišo in kompetitivno išče gostitelja, omogoči ohranjanje zaporedja nukleotidov oziroma stabilnost genskega materiala. Če je v celici kopija dednega zapisa le enega virusa, obstaja manjša verjetnost, da bi prišlo do neželenih rekombinacij in prerazporeditev genov, to pa omogoča vsesplošno raznolikost znotraj skupine virusov. Biodiverziteta fagov znotraj skupine virusov tipa T omogoča prepoznavanje različnih – celo modificiranih – receptorjev na gostiteljski celici.
==Zgodnje raziskave==
Fenomen izključitve naknadne okužbe sorodnih virusov so znanstveniki prvič opazili v začetku 50. let 20. stoletja. Med raziskavami na fagih tipa T so ugotovili, da je okužba z dvema virusoma neuspešna, razen v primeru, če virusa dodajo hkrati. Če so enega dodali prej kot drugega, drugi ni okužil celice.
Obstoj mehanizma, ki v gostiteljski celici povzroči korenito spremembo v dovzetnosti za sprejemanje dednega materiala sekundarnega bakteriofaga, dodanega z nekaj minutno zakasnitvijo, so posredno dokazali preko razpada genskega materiala le-tega. Kot sredstvo obarjanja dednega materiala razpadlega sekundarno dodanega virusa jim je služila trikloroocetna kislina. Zanimivo je bilo, da se je 50 % vzorca nahajalo v topni frakciji, kar pa je jasno kazalo na razpad DNA (trikloroocetna kislina obori polimere, daljše od 20 nukleotidov). Nadaljnje serije poskusov so jim pomagale pridobiti dokaze, da ni razpadla le DNA viriona, pač pa celoten delec, in da ni prišlo do prenosa genetske informacije sekundarnega virusa na potomce.
==Mehanizmi Sie==
Virusni dedni material vsebuje zapise za proteine, ki omogočajo izključitev naknadne okužbe. Ti virusni proteini lahko preprečijo vstop dednega materiala sekundarnega virusa v citoplazmo primarno okužene gostiteljske celice tako, da inhibirajo virusne peptidoglikan hidrolazne encime, ki virusnemu delcu omogočijo »preboj« skozi celično steno bakterijske celice. Lahko pa povzročijo modifikacijo specifičnih receptorjev na površini celice, ki jih prepoznajo virioni.
V nadaljevanju je opisanih nekaj primerov sistemov superinfekcijske izključitve pri posameznih gramnegativnih in grampozitivnih bakterijah.

==Sie pri gramnegativnih bakterijah==
Obstaja več proteinskih mehanizmov, ki v različnih gramnegativnih bakterijah povzročijo superinfekcijsko izključitev. Zapis za te proteine se nahaja v genomu bakteriofagov, ki primarno okužijo celico. Najbolje raziskan sistem Sie obsega proteina Imm (iz angl. ''immunity'', tj. imunost) in Sp (iz angl. ''spackle'', tj. kit, kitati), ki ju kodira genom faga T4 (in njemu podobnih fagov). Ti fagi specifično okužijo bakterijo ''Escherchia coli''. Ta proteina povzročata izključitev le omenjenih fagov, medtem ko superinfekcija ostalim (P1, c1, λ …) s tem mehanizmom ni onemogočena.
===Protein Imm===
Protein Imm je sestavljen iz ene polipeptidne verige, ki vsebuje 83 aminokislinskih ostankov. Njegova tridimenzionalna struktura še ni bila rešena. Ima dve daljši hidrofobni regiji: ena je iz 30, druga pa iz 28 ostankov. Z njima se protein najverjetneje usidra v plazmalemo ''E. coli''. Med njima je hidrofilen del iz 4 ostankov, od katerih sta dva pozitivno nabita (R33 in K36). C-končni del iz 18 ostankov je prav tako nekoliko bolj hidrofilen. Eksperimentalno je bilo ugotovljeno, da je C-končna regija usmerjena proti citosolu. Pri tem so bili sintetizirani fuzijski proteini Imm z β-galaktozidazo (ta se normalno nahaja v citosolu) in pa s kislo fosfatazo (ta se normalno nahaja v periplazemskem prostoru). Izkazalo se je, da sta v takem primeru oba encima aktivna v citosolu, kar pomeni, da se C-končna regija proteina Imm nahaja na citosolni strani. Ta regija torej ne more služiti za prepoznavanje faga. Poleg tega C-končni del ne kaže nobene specifičnosti in njegov skupni naboj ne predstavlja pomembne vloge. Tudi če se ta del, ki je nekoliko bazičen, zamenja z zaporedjem, ki vsebuje nekaj več kislih aminokislinskih ostankov, se aktivnost proteina večinoma ohrani. 
Podobno se ob odstranitvi dveh pozitivnih nabojev v vmesni regiji izkaže, da aktivnost proteina ni inhibirana, temveč le nekoliko zmanjšana. Nenavadni sta tudi dolžini membranskih domen (30 in 28 aminokislinskih ostankov, v običajnih transmembranskih domenah pa okrog 20). Zaradi navedenih razlogov obstajajo argumentirana domnevanja, da Imm sploh ni integralni protein. Predlagano je bilo, da Imm le interagira z drugim proteinom, ki je komponenta mesta na plazmalemi za vnos fagne DNA. Imm z vezavo na ta protein, ki zanj dejansko deluje kot receptor, spremeni njegovo konformacijo, s tem pa onemogoči prenos virusne DNA skozi plazmalemo v celico in jo preusmeri v periplazemski prostor. Empirični podati kažejo, da se 50 % DNA nabere v periplazmi, tam pa jo razgradi endonukleaza I. Ostalih 50 % ostane v fagu. 
Imunost preko tega mehanizma se razvije zelo hitro, tj. po največ 2 minutah po infekciji s primarnim fagom. ''E. coli'' ima približno 200 mest za vnos DNA (precej manj kot receptorjev za fage). Ker Imm deluje stehiometrično, je približno taka tudi njegova koncentracija. Zaradi tako majhne količine ga je ''in vivo'' zelo težko dokazati.

===Protein Sp===
Za superinfekcijsko izkjučitev faga T4 je v ''E. coli'' le v 80 % primerov odgovoren protein Imm, popolno imunost pa omogoča membranski protein Sp. Poskus je pokazal, da ima sistem ''E. coli'' in superinfekcijskega faga z deletiranim genom za Sp podobne značilnosti kot sistem, v katerem fag nima aktivnega lizocima, proteina 5. Za vnos DNA v celico fag namreč potrebuje ta protein, ki po vezavi na celico s svojo lizocimsko aktivnostjo razgradi peptidoglikanski sloj in s tem prebode periplazemski prostor ter tako dostopa do mesta za vnos DNA na plazmalemi. Protein Sp inhibira delovanje proteina 5, zato fag ne more razgraditi peptidoglikana in tako inducirati superinfekcije v gostiteljski celici. Tudi za ta protein je znano aminokislinsko zaporedje, ne pa njegova tridimenzionalna struktura.

==Sie pri grampozitivnih bakterijah==
===Protein Sie2009===
Poznavanje mehanizmov preprečevanja injiciranja DNA fagov je pri grampozitivnih bakterijah bolj omejeno kot pri gramnegativnih bakterijah. Prve objave mehanizmov Sie pri grampozitivnih bakterijah segajo v leto 2002, torej okoli 50 let po začetku proučevanja Sie. Prvi identificirani protein pri grampozitivnih bakterijah, ki omogoča Sie, je Sie2009, protein faga Tuc2009, katerega gostitelj je bakterija ''Lactococcus lactis'', ki ima pomembno vlogo pri mlečni fermentaciji.
Gen Sie2009, ki zapisuje ta protein, se nahaja v lizogenem modulu DNA faga Tuc2009 med genom za integrazo (encim, ki omogoča vstavljanje fagne DNA v krožno DNA gostitelja) in genom, ki kodira represor. Na podlagi njegove lokacije in primerjave z geni za zapis proteinov, ki prav tako omejujejo razmnoževanje fagov, so sklepali, da Sie2009 onemogoča okužbo bakterije s fagi. Zato so želeli to nedvomno dokazati in ugotoviti, na kateri stopnji razmnoževanja bakteriofaga deluje. Sistematične preiskave so pričeli tako, da so gen vstavili v plazmid, z le-tem okužili različne vrste oziroma seve bakterij in testirali njihovo odpornost na različne bakteriofage. Izkazalo se je, da protein Sie2009 omogoča odpornost proti določenim vrstam fagov le nekaterim vrstam bakterij.
Raziskave so nadaljevali s proučevanjem lokacije nahajanja proteina Sie2009. Ugotovili so, da je pripet na celično membrano. Preko različnih eksperimentov so še ugotovili, da protein Sie2009 ne vpliva na pritrjevanje fagov na površino bakterijske celice, niti ne ovira transformacije plazmidov ali transfekcije. Na podlagi teh rezultatov so prišli do zaključka, da Sie2009 blokira injiciranje fagne DNA, kar je bil takrat popolnoma na novo odkrit mehanizem Sie. Natančnejša razlaga pa še danes ni znana.

===Protein LTP===
Med najbolje raziskane sisteme Sie pri grampozitivnih bakterijah spada sistem LTP faga TP-J34, katerega gostitelj je bakterija ''Streptoccocus thermophilus'' J34, ki se uporablja v proizvodnji jogurta. V lizogenem modulu faga TP-J34 se nahaja genetsko stikalo, ki leži med divergentno prepisovanima genoma ''crh'' in ''cro''. Gen ''crh'' je sestavni del operona, ki ga poleg tega strukturnega gena sestavljajo še geni ''orf3'', ''ltp'' in ''int'' (po vrstnem redu prepisovanja). Gen ''crh'' kodira protein, ki je represor, gen ''orf3'' pa protein, ki je regulator. Gen ''int'' zapisuje protein integrazo, ki omogoča vstavljanje fagne DNA v krožno DNA gostitelja, gen ''ltp'' pa nosi zapis za protein LTP, 142 aminokislinskih ostankov velik lipoprotein, ki se nahaja na zunanji strani celične membrane.
Protein LTP se izraža v lizogenem ciklu fag in omogoča sistem Sie, kar je pokazal sledeč eksperiment. V bakterije vrst ''Streptococcus thermophilus'' in ''Lactococcus lactis'' so preko plazmidov vstavili gen za protein LTP, ki je oviral razmnoževanje virusov v teh bakterijah. Pri obeh gostiteljskih bakterijah je odsotnost podvojevanja fagne DNA dokazala, da je bilo preprečeno injiciranje fagne DNA. Protein LTP pa ni onemogočal sekundarne okužbe le pri bakteriofagih TP-J34, ampak tudi pri drugih vrstah fagov. Za najobčutljivejšo se je izkazala vrsta laktokokih fagov P008, saj se je stopnja razmnoževanja fagov znižala približno za faktor 108.
Skozi raziskave so prišli do zaključka, da LTP preprečuje vstop DNA v bakterijsko celico. Z imunokemijskim označevanjem z zlatom in elektronsko mikroskopijo so nedvomno potrdili, da se nahaja na zunanji strani celične membrane. Na podlagi strukture so sklepali, da je LTP protein, ki veže proteine. S tem so lahko izključili hipotezo, da se veže neposredno na DNA in tako onemogoča njen vstop v celico. Torej mora obstajati drug mehanizem.
Preden lahko bakteriofagi iz družine ''Siphoviridae'' injicirajo DNA, ki je zapakirana v glavi virusa, morajo iz svojega repa potisniti ''tape measure protein'' (TMP), ki določa dolžino cevke repa, saj se le-ta sestavi okoli njega. Ko TMP zapusti fagov rep, tvori poro skozi celično membrano, skozi katero lahko pride DNA v celico. Dokazali so, da protein LTP veže protein TMP in tako povzroči injiciranje DNA v periplazmo namesto v celico. Tam se le-ta nato razgradi. Naknadna okužba je tako onemogočena.

==Viri==
*Dulbecco, R. Mutual Exclusion between related phages. ''Journal of Bacteriology'', 1951, št. 63, str. 209–217
*Lu, M.-J. in Henning, U. Superinfection exclusion by T-even-type coliphages. ''Trends in Microbiology'', 1994, let. 2, št. 4, str. 137–139
*Lu, M.-J., Stierhof, Y.-D. in Henning, U. Location and unusual membrane topology of the immunity protein of the ''Escherichia coli'' phage T4. ''Journal of Virology'', 1993, let. 67, št. 8, str. 4905–4913
*Heller, K. J. in Neve, H. Superinfection exclusion und DNA-Injektion bei Siphoviridae-Phagen. ''Biospektrum'', 2014, let. 20, št. 1, str. 26–29.
*McGrath, S., Fitzgerald, G. F. in van Sinderen, D. Identification and characterization of phage-resistance genes in temperate lactococcal bacteriophages. ''Molecular Microbiology'', 2002, let. 43, št. 2, 509–520.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

BIO2 Seminar 2018

2018-11-02T11:13:12Z

Aljaž Bratina: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Eva Gartner || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Eva_Gartner:_Wnt_signalizacija_in_njena_vloga_pri_sr.C4.8Dni_fibrozi Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi] || Anamarija Agnič || Anastasija Nechevska || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Aljaž Bratina || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Alja.C5.BE_Bratina:_Pomen_razli.C4.8Dnih_signalnih_poti_pri_staranju Pomen različnih signalnih poti pri staranju]|| Lara Drinovec || Liza Ulčakar || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Karmen Mlinar || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Karmen_Mlinar:_Signalizacija_in_odzivi_na_abiotski_stres_pri_rastlinah Signalizacija in odzivi na abiotski stres v rastlinah] || Luka Gnidovec || Maja Škof || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Tina Zavodnik || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Zavodnik:_Mehani.C4.8Dna_transdukcija_in_proteini_Piezo Mehanična transdukcija in proteini Piezo] || Jernej Imperl || Ajda Godec || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Meta Kodrič || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Meta_Kodri.C4.8D:_Svetlobne_signalne_poti_za_uravnavanje_fotomorfogeneze Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze] || Laura Gašperšič || Neža Blaznik || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Neža Žerjav || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Ne.C5.BEa_.C5.BDerjav:_Vloga_kaspaz_pri_celi.C4.8Dni_smrti Vloga kaspaz pri celični smrti] || Nika Boštic || Urša Štrancar || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Doroteja Armič || 14-15 || Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze || Eva Gartner || Anamarija Agnič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Lara Drinovec || 14-15 || moj naslov || Aljaž Bratina || Barbara Jaklič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Martina Lokar || 14-15 || Biotinilacija proteinov || Karmen Mlinar || Luka Gnidovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Marko Pavleković || 16 || moj naslov || Tina Zavodnik || Jernej Imperl || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Valeriya Musina || 16 || moj naslov || Meta Kodrič || Laura Gašperšič || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Tina Kolenc Milavec || 16 || Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule || Neža Žerjav || Nika Boštic || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Andrej Špenko || 17 || moj naslov || Doroteja Armič || Eva Gartner || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Tadej Medved || 17 || Vpliv oksidacije maščobnih kislin na usodo celic || Sanja Stanković || Aljaž Bratina || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Klementina Polanec || 17 || moj naslov || Martina Lokar || Karmen Mlinar || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Rebeka Dajčman || 17 || moj naslov || Marko Pavleković || Tina Zavodnik || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Sumeja Kudelić || 18 || moj naslov || Valeriya Musina || Meta Kodrič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Matija Ruparčič || 18 || moj naslov || Tina Kolenc Milavec || Neža Žerjav || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Maks Kumek || 18 || moj naslov || Andrej Špenko || Doroteja Armič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Anže Šumah || 19 || moj naslov || Tadej Medved || Sanja Stanković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Barbara Jaklič || 19 || moj naslov || Klementina Polanec || Martina Lokar || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Gašper Anton Komatar || 19 || moj naslov || Rebeka Dajčman || Marko Pavleković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Praznik Liza || 19 || moj naslov || Sumeja Kudelić || Valeriya Musina || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Lara Hrvatin || 20 || moj naslov || Matija Ruparčič || Tina Kolenc Milavec || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Sonja Gabrijelčič || 20 || moj naslov || Maks Kumek || Andrej Špenko || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Anastasija Nechevska || 20 || moj naslov || Anže Šumah || Tadej Medved || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Liza Ulčakar || 21 || moj naslov || Barbara Jaklič || Klementina Polanec || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Maja Škof || 21 || moj naslov || Gašper Anton Komatar || Rebeka Dajčman || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Ajda Godec || 21 || moj naslov || Praznik Liza || Sumeja Kudelić || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Neža Blaznik || 22 || moj naslov || Lara Hrvatin || Matija Ruparčič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Urša Štrancar || 22 || moj naslov || Sonja Gabrijelčič || Maks Kumek || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Anamarija Agnič || 22 || moj naslov || Anastasija Nechevska || Anže Šumah || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Sanja Stanković || 23 || moj naslov || Liza Ulčakar || Lara Drinovec|| 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Luka Gnidovec || 23 || moj naslov || Maja Škof || Gašper Anton Komatar || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Jernej Imperl || 23 || moj naslov || Ajda Godec || Praznik Liza || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Laura Gašperšič || 23 || moj naslov || Neža Blaznik || Lara Hrvatin || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Nika Boštic || 23 || moj naslov || Urša Štrancar || Sonja Gabrijelčič || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2018|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Seminar 2018

2018-10-15T15:27:44Z

Aljaž Bratina: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Eva Gartner || 12 || Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi || Anamarija Agnič || Anastasija Nechevska || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Aljaž Bratina || 12 || Pomen različnih signalnih poti pri staranju [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Alja%C5%BE%20Bratina:%20Pomen%20razli%C4%8Dnih%20signalnih%20poti%20pri%20staranju]|| Lara Drinovec || Liza Ulčakar || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Karmen Mlinar || 12 || Signalizacija in odzivi na abiotski stres v rastlinah [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018] || Luka Gnidovec || Maja Škof || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Tina Zavodnik || 12 || moj naslov || Jernej Imperl || Ajda Godec || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Meta Kodrič || 12 || moj naslov || Laura Gašperšič || Neža Blaznik || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Neža Žerjav || 12 || Vloga kaspaz pri nekrozi || Nika Boštic || Urša Štrancar || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Doroteja Armič || 14-15 || Vloga bifunkcionalnega encima PFK-2/FBPaza-2 v metabolizmu glukoze || Eva Gartner || Anamarija Agnič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Lara Drinovec || 14-15 || moj naslov || Aljaž Bratina || Barbara Jaklič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Martina Lokar || 14-15 || Mehanizmi biotinilacije proteinov || Karmen Mlinar || Luka Gnidovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Marko Pavleković || 16 || moj naslov || Tina Zavodnik || Jernej Imperl || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Valeriya Musina || 16 || moj naslov || Meta Kodrič || Laura Gašperšič || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Tina Kolenc Milavec || 16 || moj naslov || Neža Žerjav || Nika Boštic || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Andrej Špenko || 17 || moj naslov || Doroteja Armič || Eva Gartner || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Tadej Medved || 17 || moj naslov || Sanja Stanković || Aljaž Bratina || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Klementina Polanec || 17 || moj naslov || Martina Lokar || Karmen Mlinar || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Rebeka Dajčman || 17 || moj naslov || Marko Pavleković || Tina Zavodnik || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Sumeja Kudelić || 18 || moj naslov || Valeriya Musina || Meta Kodrič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Matija Ruparčič || 18 || moj naslov || Tina Kolenc Milavec || Neža Žerjav || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Maks Kumek || 18 || moj naslov || Andrej Špenko || Doroteja Armič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Anže Šumah || 19 || moj naslov || Tadej Medved || Sanja Stanković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Barbara Jaklič || 19 || moj naslov || Klementina Polanec || Martina Lokar || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Gašper Anton Komatar || 19 || moj naslov || Rebeka Dajčman || Marko Pavleković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Praznik Liza || 19 || moj naslov || Sumeja Kudelić || Valeriya Musina || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Lara Hrvatin || 20 || moj naslov || Matija Ruparčič || Tina Kolenc Milavec || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Sonja Gabrijelčič || 20 || moj naslov || Maks Kumek || Andrej Špenko || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Anastasija Nechevska || 20 || moj naslov || Anže Šumah || Tadej Medved || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Liza Ulčakar || 21 || moj naslov || Barbara Jaklič || Klementina Polanec || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Maja Škof || 21 || moj naslov || Gašper Anton Komatar || Rebeka Dajčman || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Ajda Godec || 21 || moj naslov || Praznik Liza || Sumeja Kudelić || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Neža Blaznik || 22 || moj naslov || Lara Hrvatin || Matija Ruparčič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Urša Štrancar || 22 || moj naslov || Sonja Gabrijelčič || Maks Kumek || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Anamarija Agnič || 22 || moj naslov || Anastasija Nechevska || Anže Šumah || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Sanja Stanković || 23 || moj naslov || Liza Ulčakar || Lara Drinovec|| 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Luka Gnidovec || 23 || moj naslov || Maja Škof || Gašper Anton Komatar || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Jernej Imperl || 23 || moj naslov || Ajda Godec || Praznik Liza || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Laura Gašperšič || 23 || moj naslov || Neža Blaznik || Lara Hrvatin || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Nika Boštic || 23 || moj naslov || Urša Štrancar || Sonja Gabrijelčič || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2017|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Seminar 2018

2018-10-15T15:25:50Z

Aljaž Bratina: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Eva Gartner || 12 || Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi || Anamarija Agnič || Anastasija Nechevska || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Aljaž Bratina || 12 || Staranje in lipidne signalne molekule [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Alja%C5%BE%20Bratina:%20Pomen%20razli%C4%8Dnih%20signalnih%20poti%20pri%20staranju]|| Lara Drinovec || Liza Ulčakar || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Karmen Mlinar || 12 || Signalizacija in odzivi na abiotski stres v rastlinah [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018] || Luka Gnidovec || Maja Škof || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Tina Zavodnik || 12 || moj naslov || Jernej Imperl || Ajda Godec || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Meta Kodrič || 12 || moj naslov || Laura Gašperšič || Neža Blaznik || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Neža Žerjav || 12 || Vloga kaspaz pri nekrozi || Nika Boštic || Urša Štrancar || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Doroteja Armič || 14-15 || Vloga bifunkcionalnega encima PFK-2/FBPaza-2 v metabolizmu glukoze || Eva Gartner || Anamarija Agnič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Lara Drinovec || 14-15 || moj naslov || Aljaž Bratina || Barbara Jaklič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Martina Lokar || 14-15 || Mehanizmi biotinilacije proteinov || Karmen Mlinar || Luka Gnidovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Marko Pavleković || 16 || moj naslov || Tina Zavodnik || Jernej Imperl || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Valeriya Musina || 16 || moj naslov || Meta Kodrič || Laura Gašperšič || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Tina Kolenc Milavec || 16 || moj naslov || Neža Žerjav || Nika Boštic || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Andrej Špenko || 17 || moj naslov || Doroteja Armič || Eva Gartner || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Tadej Medved || 17 || moj naslov || Sanja Stanković || Aljaž Bratina || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Klementina Polanec || 17 || moj naslov || Martina Lokar || Karmen Mlinar || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Rebeka Dajčman || 17 || moj naslov || Marko Pavleković || Tina Zavodnik || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Sumeja Kudelić || 18 || moj naslov || Valeriya Musina || Meta Kodrič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Matija Ruparčič || 18 || moj naslov || Tina Kolenc Milavec || Neža Žerjav || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Maks Kumek || 18 || moj naslov || Andrej Špenko || Doroteja Armič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Anže Šumah || 19 || moj naslov || Tadej Medved || Sanja Stanković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Barbara Jaklič || 19 || moj naslov || Klementina Polanec || Martina Lokar || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Gašper Anton Komatar || 19 || moj naslov || Rebeka Dajčman || Marko Pavleković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Praznik Liza || 19 || moj naslov || Sumeja Kudelić || Valeriya Musina || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Lara Hrvatin || 20 || moj naslov || Matija Ruparčič || Tina Kolenc Milavec || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Sonja Gabrijelčič || 20 || moj naslov || Maks Kumek || Andrej Špenko || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Anastasija Nechevska || 20 || moj naslov || Anže Šumah || Tadej Medved || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Liza Ulčakar || 21 || moj naslov || Barbara Jaklič || Klementina Polanec || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Maja Škof || 21 || moj naslov || Gašper Anton Komatar || Rebeka Dajčman || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Ajda Godec || 21 || moj naslov || Praznik Liza || Sumeja Kudelić || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Neža Blaznik || 22 || moj naslov || Lara Hrvatin || Matija Ruparčič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Urša Štrancar || 22 || moj naslov || Sonja Gabrijelčič || Maks Kumek || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Anamarija Agnič || 22 || moj naslov || Anastasija Nechevska || Anže Šumah || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Sanja Stanković || 23 || moj naslov || Liza Ulčakar || Lara Drinovec|| 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Luka Gnidovec || 23 || moj naslov || Maja Škof || Gašper Anton Komatar || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Jernej Imperl || 23 || moj naslov || Ajda Godec || Praznik Liza || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Laura Gašperšič || 23 || moj naslov || Neža Blaznik || Lara Hrvatin || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Nika Boštic || 23 || moj naslov || Urša Štrancar || Sonja Gabrijelčič || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2017|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Povzetki seminarjev 2018

2018-10-15T15:06:18Z

Aljaž Bratina: /* Karmen Mlinar: Signalizacija in odzivi na abiotski stres pri rastlinah */

===Karmen Mlinar: Signalizacija in odzivi na abiotski stres pri rastlinah===
Rastline živijo v stalno spreminjajočem se okolju, ki je pogosto neugodno in stresno za njihovo rast in razvoj. Primer abiotskega stresa so suša, ekstremne temperature, slanost tal, pomanjkanje hranil v prsti ipd. Rastline lahko stres preživijo tako, da se mu prilagodijo ali pa izognejo. V nasprotnem primeru so obsojene na smrt. Identificiranih je le malo senzorjev, ki zaznavajo stres. Pri signalizaciji odzivov na stresna okolja pogosto sodeluje družina kinaz SnRK, ki zaznajo spremembe v energijskem statusu rastline, ki jih povzroči stres. Znane so tri poddružine SnRKs: SnRK1s, ki sodelujejo pri uravnavanju metabolizma, SnRK2s, ki sodelujejo pri osmotskem stresu in ABA signalizaciji, in SnRK3s, ki so ključni regulatorji ionske homeostaze pri spopadanju s solnim stresom. Pri ionskem stresu pogosto problem predstavlja Na+. Pri njegovi signalizaciji je ključna SOS signalna pot. Signalizacija temperaturnega stresa se začne s spremembami v fluidnosti membrane, kar zaznajo integralni membranski proteini. Pri signalizaciji pogosto sodelujejo tudi MAPKs, CPKs in stresni hormon ABA, pomembno vlogo pa nosijo sekundarni sporočevalci kot sta kalcij in ROS. Vse to stremi k vzpostavitvi ionske in vodne homeostaze ter celične stabilnosti v stresnem okolju. Z razumevanjem signalizacije stresa in odzivov, ki sledijo, bomo lahko izboljšali odpornost pridelkov na stres in s tem zagotovili kmetijsko stabilnost in preskrbo s hrano za rastoče svetovno prebivalstvo.

===Aljaž Bratina: Pomen različnih signalnih poti pri staranju===
Staranje je postopna izguba fiziološke integritete in vodi v prizadeto funkcionalnost ter povečano možnost za smrt. Hitremu staranju nasprotna je dolgoživost, to je stanje, v katerem organizem ne izgublja funkcionalnosti ali jo izgublja počasneje. Staranje lahko opredelimo z devetimi splošnimi lastnostmi, ki jih opazimo v večini organizmov. Pri preučevanju staranja opazujemo organizem C. elegans, ki lahko med razvojem v primeru neugodnih razmer razvije stanje dauer, v katerem je razvoj ustavljen in je tako organizem sposoben preživeti dalj časa. Pri regulaciji staranja in dolgoživosti so pomembne mnoge celične signalne poti, kot del njih pa predvsem jedrni receptorji, ki uravnavajo prepisovanje genov, ki imajo vpliv na hitrost staranja oz. vzdrževanje dolgoživosti. V seminarski nalogi so opisane štiri pomembne signalne poti in njihov vpliv na staranje. Pri prvi je pomemben jedrni receptor DAF-12, ki za svoje delovanje potrebuje steroid DA. Neugodne razmere ga deaktivirajo, kar vodi v razvoj stanja dauer. Na dolgoživost pozitivno vpliva tudi aktiviran kompleks NSBP-1 in jedrnega receptorja DAF-16, ki sta del signalne poti IIS. To pot regulira tudi količina holesterola v celici. Dolgoživost povzročajo tudi prekinitveni post, pri katerem se aktivira jedrni receptor AP-1, pa tudi odstranitev zarodnih celic, ki poleg prej omenjene DAF-12 in DAF-16 aktivira tudi nekatere druge receptorje, npr. NHR-80 in NH3-49.

BIO2 Povzetki seminarjev 2017

2018-10-15T15:04:28Z

Aljaž Bratina: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2017/2018 */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2017/2018 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2017 stran]

=== Luka Gregorič: Pozitivne vloge negativnih regulatorjev ===

Pri preučevanju regulacije sistemov v celici, so negativni regulatorji bolj temen, neraziskan del celotnega procesa, čeprav enako pomemben. Brez njih se lahko v celici začenja nenadzorovano deljenje in posledično rakavost tkiva, ali pa se nam poveča možnost hujšega obolenja. V živčnem sistemu lahko brez GPR-jev poteče prekomerna mielinizacija aksonov, ki pomenijo veliko zmanjšanje vseh kognitivnih sposobnosti organizma in posledično tudi manjšo zmožnost prilagajanja. V mišičnem tkivu, pa lahko pomanjkanje ali slabše delovanje negativnih regulatorjev naredi tkiva manj eksplozivna in povzroči hitrejše staranje, zaradi razlik med tkivi tipa 1 in tipa 2. V najhujšem primeru pa nam pomanjkanje negativnih regulatorjev celo povzroči mišično atofijo, medtem ko nam bi boljše poznavanje prav njih lahko omogočilo, da obdržimo mlade mišice čez celo življenje. Hitrost celotnega delovanja negativnih regulatorjev pa ni odvisna od moči signala, saj signal v zelo majhnem času lahko spravijo na prvotno raven, ne glede na to, kdaj se je ta signal začel. Visoka odzivnost signalov pa tudi pomaga telesu, ko se rabi hitro odzvati na različne dražljaje. Najhitrejše to naredi tako, da je signal vedno aktiviran in se izklopi le ob primeru, da se je potrebno hitro odzvati.

=== Ines Medved: Vohalni receptorji v epidermisu ===
Primarna vloga vohalnih receptorjev je zaznava vonja, ki je zelo pomembna. Poleg zaznave vonja pa imajo receptorji za vonj tudi druge funkcije. Ti receptorji se nahajajo v tkivih, ki niso povezana z vohalno nalogo. Nahajajo se skoraj po celotnem telesu npr. v ledvicah, možganih, srcu, koži, v krvi … V epidermisu so našli dva takšna receptorja, in sicer receptorja OR2AT4 in OR51E2. Kljub podobnemu mehanizmu delovanja se po funkciji zelo razlikujeta. OR2AT4 ob stimulaciji z agonistom poveča celično proliferacijo, vpliva na migracijo celic in sodeluje pri reepitalizaciji v procesu celjenja ran. Ugotovili so, da sodeluje tudi pri zaprtju rane. Za razliko od OR2AT4 receptor OR51E2 zmanjša celično proliferacijo, sodeluje pa v melanogenezi, dendritogenezi in pri celični diferenciaciji. Vohalni receptor OR51E2 ima vlogo tudi v rakavih celicah prostate. Receptorja sta zelo specifična. Vohalni receptor OR2AT4 stimulira le sandanol in brahmanol, OR51E2 pa β-ionon. Za oba receptorja so našli tudi antagoniste, ki blokirajo Ca2+ signal. Za OR2AT4 so odkrili dva antagonista oksifenilon in fenirat, za receptor OR51E2 pa α-ionon. Kljub podobni lokaciji in mehanizmom se receptorja zelo razlikujeta. Medtem ko bi se OR2AT4 lahko uporabljal pri zdravljenju oziroma celjenju rane, bi bil lahko receptor OR51E2 potencialni pokazatelj za rakave celice.

===Daria Latysheva: The role of intrinsically disordered proteins in signalling pathways and regulation ===

Intrinsically disordered proteins (IDPs) are proteins, which do not have a defined three – dimensional structure, yet are completely functional. Found mostly in eukaryotic cells, they play an important role in biosignalling and regulation of a cell. Undergoing coupled folding and binding, IDPs’ recognition elements are cable of taking over the structures of different targets. Since IDPs have multiple interaction motifs, they often serve as signalling centres, thus contributing to the dynamic assembly of complex molecules and varied signalling pathways. Undergoing post – translational modifications, these proteins also add complexity to the regulatory networks and can change the original output of the crosswalk. IDPs are also an important component of higher - order signalling assemblies, enabling the formation of reversible complexes. Being an attractive field of the research, IDPs were not yet studied completely and there is still much to be understood about the structure, functions and the location of IDPs in the cell. Experimental and computational techniques are being developed to identify and characterise disordered regions in proteins in order to emphasize the prevalent role of IDPs in cellular signalling and regulation.

===Polona Skrt: Mehanizem zaznavanja okusa maščobe ===

Okus je pomembna zaznavna zmožnost, saj nas usmerja pri uživanju hranilne in prebavljive hrane ter nas ščiti pred strupi in ostalimi nevarnimi snovmi. Čutne celice se nahajajo v brbončicah v ustni votlini, na jeziku in v grlu. V brbončicah se nahaja okoli 100 celic, ki jih delimo v 3 skupine. Prvi tip so celice podobne glia celicam, ki se ovijejo okoli ostalih celic in jim nudijo oporo ter preprečujejo nekontrolirano širjenje živčnih prenašalcev. Naslednji tip so t.i. receptorske celice, ki zaznavajo sladko, grenko in umami ter sproščajo nevrotransmiterje, ki signal prenesejo do živčevja. Tretji tip celic so predsinaptične celice, ki se odzivajo predvsem na kisel okus. Njihova posebnost je, da se prek sinaps direktno povezujejo z živčnim vlakni. Pri signalizaciji okusov so zelo pomembni z G-proteini povezani receptorji, ki omogočajo zaznavanje sladkega, grenkega in umami okusa ter ionski kanalčki, ki prenašajo informacijo o kislem in slanem okusu. Ne dolgo nazaj so znanstveniki, k prej omenjenim petim osnovnim okusom, dodali še šestega – okus po maščobi. Signalizacija najverjetneje poteka preko receptorja CD36, možni pa so še GPR120 in GPR40 ter DRK kanalčki. Mehanizem je še dokaj neraziskan, predpostavljajo pa sodelovanje med več receptorji.

===Peter Škrinjar: Receptorji za okus in njihova povezava z debelostjo ===

Okus je eden izmed petih osnovnih čutov, katerega naloga je prepoznavanje hranil in preprečevanje vnosa telesu nevarnih snovi. Pri tem mu pomagajo receptorji za okus. Te se razlikujejo za vseh pet osnovnih okusov – grenko, sladko in umami zaznamo s pomočjo GPCR-jev, slano in kislo pa s pomočjo ionskih kanalčkov. Raziskave še potekajo glede receptorjev za maščobnokislinski okus. Poleg receptorjev v ustih pa poznamo tudi receptorje za okus v prebavni cevi. Tam so te pomembni predvsem v enteroendokrinih celicah, kjer ob prisotnosti različnih ligandov sprožijo izločanje različnih peptidnih hormonov (GLP-1, CCK, PYY itd.). Te nato stimulirajo vagusni živec, ki prenese informacijo do možganov, ki se primerno odzovejo (npr. ob prisotnosti sladkorjev se v prebavni cevi izloča GLP-1, ki sproži izločanje inzulina iz trebušne slinavke). Receptorje za okus lahko povežemo tudi z debelostjo. Genetske razlike pri receptorjih za maščobnokislinski okus (predvsem CD36, ki je najbolj raziskan) lahko povzročijo slabše zaznavanje maščobnih kislin, kar bi nato vodilo do debelosti. To povezavo je sicer potrebno še dokazati. Podobno bi lahko predvidevali za maščobnokislinske receptorje v prebavnem traktu. Kot alternativa za zdravljenje debelosti se je pojavila hipoteza o zdravljenju preko receptorjev za okus na adipocitah brez α-gustducina, na katere imajo grenke komponente inhibicijski učinek.

===Milica Janković: Jedrni receptorji: Karakteristike in regulacija receptorjev ter identifikacija ligandov===

Jedrni receptorji so proteini prisotni v celicah, ki prenašajo signale svojih ligandov. Naddružino jedrnih receptorjev sestavlja 48 transkripcijskih faktorjev (pri ljudeh). Aktivirajo se po vezavi liganda in vključujejo receptorje za steroidne hormone, lipofilne vitamine, ščitnične hormone in retinoinsko kislino. Receptor- ligandni kompleks se veže na specifično področje na DNA, katero imenujemo hormonski responsni element (HRE). Jedrni receptorji so transkripcijski faktorji, ker delujejo direktno v jedru in spreminjajo ekspresijo genov ter na ta način vplivajo na razvoj, diferencijacijo in homeostazo in metabolizem. Obstajajo štirje tipi nuklearnih receptorjev, ki se razlikujejo po signalnih poteh.Zavzemajo tudi različne konformacije, ki so povzročene z vezavo agonista, oziroma antagonista. Morda najbolj revolucionarna ugotovitev, je bilo presenetljivo odkritje, da obstajajo številni receptorji, kateri so povezani na majhne molekulske ligande. Ker ti ligandi niso znani, receptorji so poimenovani siroti (orphans) receptorji. Vprašanje je bilo, kako bi lahko prišli do odkritja tistih ligandov? Vsi jedrni receptorji imajo podobno strukturo, na podlagi česa je bilo lahko narediti vrsto testov za identifikacijo ligandov.
Ker se pa vežejo na majhne molekule, predstavljajo zanimive terapevtske cilje. Bi bili bogat vir za razvoj sintetičnih majhnih molekul kot ligandov.

===Tina Turel: Vpliv mikroorganizmov na presnovo glukoze===

V biomedicini je v zadnjih letih prišlo do odkritja, da črevesna mikroflora sodeluje v različnih metabolnih procesih. Mikroorganizmi v črevesju komunicirajo z gostiteljem preko TLR-jev. TLR so receptorji v prirojenem imunskem sistemu, ki zaznajo določeno patogeno zaporedje in aktivirajo imunski odziv oziroma omogočajo komunikacijo med črevesno mikrofloro in gostiteljem. Prav tako pa lahko TLR-ji pa omogočijo, da v različnih metabolnih procesih lahko sodelujejo tudi mikroorganizmi. V študiji so se znanstveniki usmerili v določitev vseh členov, ki vplivajo na presnovo glukoze. Presnova glukoze je univerzalni postopek, ki je prisoten v vseh vretenčarjih in tudi v nekaterih nevretenčarjih. Študija je odkrila manjkajočo povezavo med IFNɣ in presnovo glukoze in sicer A. muciniphilo, ključni mikroorganizem, ki je odgovoren za izboljšanje tolerance na glukozo. Potrdili so, da bakterija lahko izboljša toleranco glukoze v različnih gostiteljih. Irgm1 so določili kot glavnega posrednik med IFNɣ in A. muciniphilo. Dejstvo je, da je A. muciniphila prisotna tudi v človeški mikroflori, zato so znanstveniki opravili poskuse tudi na prostovoljcih. Izkazalo se je, da je postopek in pa vpliv določenih komponent na presnovo in toleranco glukoze enak kot pri miših. Raziskava pa ponuja novo pot v zdravljenju metabolnih bolezni in sicer reguliranje ravni A. muciniphile.

===Ana Maklin: Vloga PGP in PHO13 v metabolizmu===

PGP in njegov ortolog PHO13 v kvasovkah sta bila predmet številnih raziskav. Njune funkcije so zelo raznolike, jasno pa je, da s svojo fosfatazno aktivnostjo ter drugimi lastnostmi pomembno vplivata tudi na metabolizem. Zaradi stranske aktivnosti nekaterih encimov v metabolnih procesi, nastajajo tudi produkti, ki lahko ovirajo normalno delovanje celic. Evolucijsko gledano, so organizmi torej morali ustvariti popravljalni sistem, ki prepreči nadaljnje posledice teh napak. Naloga PGP in PHO13 je, da s svojo aktivnostjo pretvorita neželjene produkte, ki nastajajo zaradi stranske aktivnosti encimov, v druge, ki niso škodljivi. V metabolizmu glukoze, zaradi stranske aktivnosti gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze in piruvat kinaze nastajata 4-fosfoeritronat in 2-fosfolaktat. Prvi je inhibitor 6-fosfoglukonat dehidrogenaze, drugi pa fosfofruktokinaze-1. Inhibicija teh dveh encimov bi brez PGP in PHO13 povzročila moteno glikolizo in pentoza fosftno pot. PHO13 oziroma njegova odsotno v celicah ima pomembo vlogo tudi pri pretvorbi rastlinske biomase v etanol. Ker uporaba etanola iz biomase kot vir obnovljive energije postaja vedno bolj razširjena, je PHO13 postal pomemben predmet za napredek v metabolnem inženirstvu. Deaktivacija PHO13 v kvasovkah z izraženimi XR/XDH/XK namreč preprečuje defosforilacijo ksiluloze 5-fosfata, kar omogoča nadaljevanje metabolnih procesov potrebnih za nastanek etanola, izboljša toleranco na običajne inhibitorje fermentacije (šibke kisline, produkti razgradnje sladkorjev) ter povzroči pospešeno transkripcijo genov, vključenih v pentozo fosfatno pot (naprimer TAL1,ki kodira protein transaldolazo, enega ključnih encimov pri neoksidativni pentoza fosfatni poti).

===Barbara Slapnik: Regulacija metabolizma glukoze v sesalskih celičnih kulturah===

Regulacija metabolizma glukoze je iz vidika celičnih kultur zelo pomembna, saj vpliva na celično rast in produktivnost celic. Boljše poznavanje regulacije metabolizma nam omogoča njegovo kontroliranje in s tem možnost za povečanje produktivnosti celic v celičnih kulturah. Regulacija metabolizma glukoze v celici poteka v več stopnjah. Pretok omejujejo intermediati, ki vstopajo še v druge metabolne poti. Zelo pomembna stopnja je regulacija z encimi. Glavni encimi, ki regulirajo glikolizo so heksokinaza, fosfofruktokinaza in piruvat kinaza. Poznamo več izooblik encimov, ki se razlikujejo po delovanju in afiniteti do substratov. Regulacija metabolizma glukoze poteka tudi na nivoju celične signalizacije. Protein kinaza B, ki ga imenujemo tudi Akt je odvisen od prisotnosti inzulina. Akt vpliva na izražanje glukoznega prenašalca 1 in delovanje heksokinaze ter fosfofruktokinaze. AMP kinaza je ključna za aktivacijo katabolnih poti in inhibicijo anabolnih poti. c-Myc je transkripcijski faktor, ki vpliva na izražanje glukoznega prenašalca 1 in delovanje fosfofruktokinaze, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze, fosfoglicerat kinaze in enolaze. p53 je transkripcijski faktor, ki zmanjša transkripcijo glukoznega prenašalca 1 in 3 ter aktivnost fosfoglicerat mutaze. Razumevanje regulacije metabolizma glukoze nam omogoča boljšo celično rast v bioreaktorjih.

===Ajda Krč: Spremembe v delovanju Krebsovega cikla in sposobnost prilagajanja parazitov na razmere v okolju===

Preučevanje parazitov, predvsem njihovega življenjskega kroga ter biokemijskih procesov, ki skrbijo za njihovo rast in razvoj, je pomembno predvsem z vidika preprečevanja bolezni, ki jih povzročajo s svojim zajedanjem v gostiteljskih organizmih. Paraziti iz debla Apicomplexa, v katerega spadata tudi Plasmodium falciparum in Toxoplasma gondii imajo značilen organel, t.i. apikoplast, s katerim prodrejo v gostiteljsko celico. Plasmodium falciparum spada v družino plazmodijev, zajedavcev eritrocitov, ki povzročajo malarijo, Toxoplazma gondii pa je glavni krivec za pojav toksoplazmoze. Življenjski krog teh parazitov se običajno deli na spolno in nespolno fazo razmnoževanja. Obe fazi spremljajo določeni procesi, ki pomagajo organizmom preživeti v najrazličnejših okoljih. Med mehanizme, ki sodelujejo pri preživetju, gotovo spada tudi ogljikov metabolizem, ki vključuje procese glikolize, glutaminolize, reakcije v Krebsovem ciklu ter elektronsko prenašalno verigo. V seminarski nalogi so opisane nekatere spremembe in prilagoditve določenih encimov Krebsovega cikla na okolje, v katerem se organizem nahaja, ter anaplerotične poti, v katere je Krebsov cikel parazitov vpleten. Prav tako so razložene nekatere alternativne poti, po katerih paraziti pridejo do potrebne energije (reakcije glutaminolize) glede na fazo v njihovem razvoju.

===Urban Hribar: Metabolizem polariziranih makrofagov===

Makrofagi lahko spremenijo svoje delovanje kot odziv na zunanje dejavnike za opravljanje različnih nalog. Temu procesu pravimo aktivacija oziroma polarizacija makrofagov. Makrofagi se lahko palarizirajo v makrofage tipa M1 (klasično aktivirani) in tipa M2 (alternativno aktivirani). Makrofagi M1 so pomembni v boju proti okužbam mikrobov in so znani kot makrofagi, ki promovirajo vnetja. Proizvajajo tudi dušikov oksid (NO) in vnetostne citokinine. Na dolgi rok lahko makrofagi M1 in njihovi produkti škodujejo tkivu lastnega oganizma. Zato makrofagi tipa M2 zavirajo vnetja in so odgovorni za popravilo tkiva. Pri funkcijah teh makrofagov imajo pomembno vlogo tudi spremenjeni metabolizmi polariziranih makrofagov. Makrofagi M1 imajo pospešeno delovanje glikolize ter zmanjšano aktivnost oksidativne fosforilacije. Z pospešeno glikolizo ter laktatno fermentacijo makrofagi proizvajajo večino svojih zalog ATP. Poleg tega ima tudi prekinjen krebsov cikel na dveh mestih. Prvo mesto je pri reakciji izocitrata v alfa-ketoglutarat, drugo mesto pa pri reakciji sukcinata v fumarat. Prekinitve v ciklu vodijo do kopičenja intermediatov, ki pa se uporabljajo za sintezo NO, prostgladinov in vnetnosnih citokinov. Hkrati je krebsov cikel makrofagov M1 povezan z ciklom sečnine, ki lahko proizvaja NO. Posebnost makrofagov M1 je tudi da v mitohondrijih proizvajajo povečane količine reaktivnih kisikovih zvrst (ROS). Te se tudi uporabljajo za boj proti bakterijam in proizvodnjo vnetnostnih citokinov.

===Urška Zagorc: Salmonela in citratni cikel===

Zastrupitev z bakterijo salmonelo spada med najpogostejše zastrupitve s hrano. Bakterija lahko živi v različnih okoljih, saj zna zelo dobro prilagoditi svoj metabolizem in se hkrati tudi izmakniti naravnemu imunskemu sistemu. Za to poskrbijo številni encimi citratnega cikla v salmoneli. Encimi akonitaza, izocitrat dehidrogenaza in izocitrat liaza inhibirajo delovanje inflamasoma NLRP3. Inflamasom je receptor imunskega sistema in aktivira kaspaze, ki vodijo v celično smrt. Z inhibiranim delovanjem teh inflamasomov posledično ne pride do celične smrti škodljivih celic. Tudi citrat in citratni cikel imata pri ohranjanju bakterije salmonele svojo vlogo. Citrat, na primer, je povezan v kompleks z železom. Ob izpostavljenosti dušikovemu oksidu, ki ima velik vpliv na celoten ogljikov metabolizem, se citrat porablja. Zmanjša se količina železa v celici, ki je bila prej v ravnotežju, hkrati pa se zmanjša tudi rast salmonele. Citratni cikel pa ni edini način, ki ga uporablja bakterija salmonela za svoje preživetje. Razvila je namreč mnogo poti, po katerih se lahko izogne oviram gostitelja. Ta se poleg inflamasomov bori s salmoneli strupenimi snovmi, kot je dušikov oksid, a tudi za to je bakterija že našla rešitev.

===Lija Srnovršnik: Hepatična oksidacija maščobnih kislin med stradanjem===

Jetra so ključna pri uravnavanju ravnotežja energije v celotnem telesu.
Da bi razumeli vlogo hepatične β-oksidacije maščobnih kislin med obdobjem stradanja, so vzredili miši z izločenim genom za delovanje karnitin acil-transferaze 2 v jetrih (Cpt2L-⁄- miši). Ta encim katalizira obvezen korak v mitohondrijski dolgoverižni β-oksidaciji maščobnih kislin. Karnitin acil-transferaza 2 namreč sodeluje pri prenosu maščobnih kislin v notranjost mitohondrija in brez nje β-oksidacija ne more potekati. Miši so stradali 24 ur, kar je povzročilo nalaganje maščobe na jetra in povišano raven lipidov v krvi, vendar pa odsotnost ketonskih telesc, medtem ko je raven glukoze ostala normalna. Če med stradanjem, hepatična oksidacija ne poteka, se inducirajo PPARα tarčni geni v jetrih. Sistemska homeostaza energije je bila večinoma vzdrževana v stradajočih Cpt2L-⁄- miših z adaptacijami v hepatični in sistemski ekspresiji genov za oksidacijo, na kar so vplivali PPARα tarčni geni, ki vključujejo prokatabolične hepatokine Fgf21, Gdf15 and Igfbp1.
Da bi primerjali rezultate, so Cpt2L-⁄- miši hranili s ketonsko dieto, prišlo je do hude lipolize ter posledično hepatomegalije (povečanja jeter), poškodb samega organa in posledično smrti. Opazili so popolno odsotnost zalog triacilglicerolov v adipocitih. Ti podatki kažejo, da hepatična oksidacija maščobnih kislin ni nujno potrebna za preživetje med pomanjkanjem hrane, vendar je ključna za omejitev lipolize v adipocitih ter regulacijo nadomestnega katabolizma, ko je glukoza omejena.

===Patrik Levačić: Ceramidi in njihova povezava z debelostjo===
V modernem svetu je debelost vse večji problem, če ne celo eden glavnih krivcev za bolezni, ki so povezane s prekomerno cirkulacijo lipidov v krvi, kot je npr. ateroskleroza ipd. Tekom debelosti je prisotnega več sladkorja v obliki glukoze, lipidov ter vnetji. Ker je presežek lipidov, natančneje maščobnih kislin v obtoku, so to primerni pogoji za tvorbo ceramidov, ki so sicer še sestavljeni iz sfingozina, ki se preko aminske skupine poveže z maščobno kislino. Ceramidi se eni glavnih krivcev za znižano stopnjo oksidacije maščobnih kislin, to pripomore k nalaganju maščobnega tkiva na organe ter v adipocitno tkivo, a žal lahko tudi adipocitno tkivo raste do neke mere, ko doseže maksimalno velikost posatne to tkivo nefunkcionalno in ne more več shranjevati lipidov. Rezultat je prekomerna cirkulacija lipidov v krvi. V seminarju je največ govora o dveh specifičnih ceramidih, ceramid C16:0 ter ceramid C18:0, ki sta v raziskavah imela vlogo negativnega regulatorja metabolizma lipidov ter slodkorjev. Kakršnekoli motnje metabolizma pa se odražajo v obliki vnetji, slabši funkcionalnosti celic, samih organelov v notranjosti celice ter kroničnih obolenj kot so npr. sladkorna bolezen. Za boj proti debelosti je večina študij ugotovila, da s povišanim procentom oksidiranih maščobnih kislin dosežemo zmanjšanje deleža prostih maščobnih kislin ter blokiramo tvorbo novih ceramidov.

===Jerneja Nimac: Ketonska telesca kot signalni metaboliti===

Nove raziskave na področju ketonskih telesc kažejo, da ta niso le pasivni prenašalci energije, ampak tudi pomembni signalni metaboliti. Najpomembnejši med njimi je β-hidroksibutirat (BHB). Signalne vloge, ki mu jih pripisujejo so inhibicija histonske deacetilaze razreda I (HDAC), aktivacija z G-proteinom sklopljenega receptorja HCAR2 in inhibicija prav tako z G-proteinom sklopljenega receptorja FFAR3. Ko BHB inhibira HDAC se poveča izražanje genov, ki zmanjšajo oksidativni stres, poleg tega pa naj bi ta inhibicija izboljšala občutljivost na inzulin. Antilipolitični učinek receptorja HCAR2 inhibira hormonsko odzivno triglicerid lipazo, kar ustvari negativno povratno zanko in zaustavitev ketogeneze. Vpliv BHB na receptor FFAR3 pa še ni popolnoma raziskan. Predpostavljajo, da BHB vpliva na FFAR3 v odvisnosti od pogojev, torej G-proteina in koncentracije BHB, je pa ena od raziskav pokazala, da molekula BHB z vezavo na FFAR3 inhibira od napetosti odvisne kalcijeve kanalčke. Molekula BHB se veže tudi na inflamasom NLRP3 in z njegovo inhibicijo prepreči izstop K+. Poleg ketonskega telesca BHB pa ima nekaj signalnih funkcij tudi acetoacetat. Slednji skupaj z molekulo BHB regulira vezikularni transporter glutamata (VGLUT2), in sicer tako da inhibira od Cl- odvisni vnos glutamata. Signalna funkcija ketonskih telesc v celici pa sproži odzive, ki naj bi pripomogli k zaviranju epilepsije, demence, raka in vplivali na staranje.

===Nika Mikulič Vernik: Hiperamoniemija in metode zdravljenja===

Amonijak se v telesu porablja v anabolizmu aminokislin, sintezi proteinov in zagotavljanju pH vrednosti. Kadar ga je v krvni plazmi preveč, ga mora telo detoksicirati in izločiti, za kar skrbi cikel uree v jetrnih celicah. Preostanek amonijaka odstrani glutamin sintetaza, ki iz glutamata tvori glutamin. Če je amonijaka v krvi preveč, to stanje imenujemo hiperamoniemija. Za razvoj te bolezni poznamo več vzrokov, glede na njih pa ločimo primarno (okvare encimov ali transporterjev, ki delujejo v ciklu uree) in sekundarno hiperamoniemijo (inhibicija cikla uree).
Ker ima amonijev ion NH4+ podoben atomski radij kot K+, lahko membrane prehaja na enak način. Preide lahko tudi krvno možgansko bariero, kar povzroča nevrološke težave, kot so zatekanje astrocitov, povečana permeabilnost krvno možganske bariere, cerebralni edem (zatekanje možganov) in hepatična encefalopatija, kar lahko vodi v komo in celo smrt.
Zdravila za zdravljenje hiperamoniemije imajo dva možna načina delovanja; 1) zmanjšanje nastanka in absorpcije amonijaka (zmanjševanje števila bakterij, ki proizvajajo ureaze, ali zmanjševanje degradacije glutamina in glicina); 2) izboljšanje sistemov za detoksikacijo in izločanje. Zraven tega se uporabljajo tudi razne dialize, genske in celične terapije ter kirurški posegi.

===Tanja Zupan: Presnovne bolezni aminokislin===

Bolezen javorjevega sirupa (MSUD), fenilketonurija (PKU), hiperamoniemija (HA), citrulinemija (CTLN), tirozinemija, cistinoza in Hartnupova bolezen so presnovne bolezni aminokislin, ki se dedujejo avtosomno recesivno. Bolezen javorjevega sirupa se pojavi zaradi nedelovanje encima BCKDH (ang. »branched-chain α-ketoacid dehydrogenase complex«), zato se v urinu poveča koncentracija α-ketokislin, ki dajejo urinu značilen vonj po javorjevm sirupu. Nedelovanje encima fenilalanin hidroksilaza (PAH), ki sodeluje pri presnovi fenilalanina v tirozin pa povzroči fenilketonurijo. Tirozinemija je posledica pomanjkanja oz. nedelovanje encimov v metabolni poti tirozina, delimo jo na tri tipe: tirozinemija tipa I (pomanjkanje encima fumarilacetoacetate (FAH), ki katalizira razgradnjo fumarilacetoacetata v acetoacetat in fumarat), tirozinemija tipa II (pomanjkanje encima tirozin aminotrasnferaze (TAT) v jetrih, ki tirozin pretvori v p-hidroksilfenilpiruvat), tirozinemija tipa III (pomanjkanje p-hidroksifenilpiruvat dioksigenaza). Cistinoza pa je bolezen, ki je posledica okvarjenega transporta cistina iz lizosomov v citoplazmo, pri čemer se cistin kopiči v celicah in jih poškoduje zaradi tvorbe kristalov. Hiperamoniemija in citrulinemija sta bolezni, ki ju povzroči nedelovanje encimov v ciklu sečnine. Za hiperamoniemijo je značilna zvišana koncentracija amoniaka v krvi zaradi pomanjkanja encima ornitin transkarbamilaze (OTC). Citrulinemijo delimo na dva tipa, citrulinemijo tipa I ali klasično citrulinemijo, pri kateri gre za pomanjaknja argininosukcinata, ter citrulinemijo tipa II, kjer gre za pomanjkanje citronov. Bolezni zdravimo oz. omejimo njene posledice s strogo vseživljenjsko dieto, pri kateri omejimo vnos določene aminokisline v organizem.

===Anja Tavčar: Regulacija imunskega odziva z metabolizmom L-arginina===
L-arginin je pri človeku ena od pogojno esencialnih aminokislin, kar pomeni, da ga moramo v primerih, ko potreba po njem presega zmožnosti lastne produkcije, vnašati s hrano. Njegov metabolizem poteka v tako imenovanih mieloidnih celicah zaviralkah (MSC), in sicer s pomočjo encima arginaze (ARG, nastajata urea in L-ornitin) ali NO-sintaze (NOS, nastajata NO in L-citrulin). Obe vrsti encimov za svoje delovanje nujno potrebujeta kofaktorje, da pa do aktivnosti sploh pride, mora mieloidna celica prejeti signal iz okolice. Običajno gre za vezavo katerega od številnih citokinov, ki služijo kot signalne molekule med različnimi elementi imunskega sistema. Pri razumevanju uravnavanja oz. usklajevanja delovanja ARG in NOS ostaja še kar nekaj nerazrešenih vprašanj in problematik, vendar lahko kljub temu potrdimo, da je njuna združena aktivnost pomemben supresor T celic ter hkrati odličen označevalec mieloidnih celic zaviralk, ki so razširjene po celem telesu. Z regulacijo aktivnosti teh dveh encimov celice vplivajo na delovanje okoliških limfocitov T in tako inhibirajo njihovo pretirano izražanje ter poliferacijo po odstranitvi patogena iz sistema, ki bi sicer privedla do akumulacije T celic. V primeru, da do tega zaviranja ne pride, govorimo o avtoimunskih boleznih, kjer zaradi predolge izpostavljenosti citotksičnim limfocitom, prihaja do okvar, ki vodijo v napadanje telesu lastnih celic ter nastanka tumorjev.

===Maja Vrabec: Poškodbe mitohondrijske DNA in popravljalni mehanizmi===
V mitohondrijski DNA se mutacije kopičijo bistveno hitreje in v večji meri kot v jedrni DNA. Zaradi sproščanja reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) iz dihalne verige v mitohondrijih in omejenega nabora mehanizmov odstranjevanja oziroma pretvarjanja le-teh v manj škodljive kompomnente, je oksidativno okolje mitohondrijske DNA dolgo časa veljalo za glavni razlog večjega števila mutacij. Pred nekaj leti pa je bilo dokazano, da so glavni razlog za kopičenje mutacij v mitohondrijski DNA napake v replikaciji, kar vključuje neustrezno delovanje mitohondrijske DNA polimeraze POLG ter nesorazmernosti in modifikacije v zalogah deoksi nukleotidov tri-fosfat, ki so namenjeni za vključitev v novonastajajoče verige. Mitohondrijska DNA ima bistveno manjši nabor popravljalnih mehanizmov kot jedrna DNA, zaradi česar veliko mutacij ostane nepopravljenih in se kopičijo. Poleg tega ima določen vpliv na količino mutacij v DNA tudi okolje in razne škodljive komponente v njem, ki največkrat preko tvorbe aduktov z mtDNA močno ovirajo ali onemogočajo delovanje mitohondrijske DNA polimeraze med replikacijo in transkripcijo. Najpogostejše mutacije v mitohondrijski DNA so zamenjava enega nukleotida in vstavitev oziroma odstranitev posamezne baze. Določen delež mutacij je prisoten načeloma v vseh mitohondrijskih genomih, posledice za funkcionalnost celotnega mitohondrija in celice se začnejo kazati šele, ko količina mutacij doseže nek določen nivo, ki je odvisen od tipa celic.

===Anja Černe: Vpliv mitohondrijskega stresa na staranje===
Mitohondrij je glavni določevalec aktivnosti HSR (odgovor na stres), vzdrževanja proteostaze in življenske dobe. HSR je transkripcijski program, ki se vzpostavi kot odgovor na stres. Glavni člen pri HSR je transkripcijski faktor HSF-1 (heat-shock factor 1). V začetku reproduktivne dobe se aktivnost HSR zmanjša v prid razmnoževanju. Inhibicijo HSR spodbudi povišana histonska metilacija histona H3K27 na delih kromosoma, kjer je lociran gen za stres. Preko blagega mitohondrijskega stresa lahko v celicah zmanjšamo represijo HSR ter upočasnimo proces staranja. Induciran stres mora biti v omejen. Motnje v mitohondriju lahko sprožimo s kemikalijami (inhibicija kompleksov I in III), infekcijo s patogenimi bakterijami ali preko neravnovesij v mitohondrijski DNA. Celica se na stres odzove z odgovorom UPRmt, s katerim obnovi proteostazo (proteinska homeostaza). Kadar pride do kolapsa proteostaze (stanje, v katerem šaperoni ne zmorejo dovolj učinkovito oz. hitro popravljati nepravilno zvite proteine), se sproži mitohondrijski odgovor na nezvite proteine - UPRmt. Tovrsten odgovor se začne z delovanjem protease CLPP-1, ki razgradi moteče proteine na kratke peptide in le-te transporter HAF-1 izvozi iz matriksa. Peptidi nato aktivirajo transkripcijski faktor AFTS-1, ki se v jedru veže na promotorje genov za mitohondrijske šaperone. V mitohondriju je zelo pomembna regulacija aktivacije kompleksa I; pretirana inhibicija ima lahko usodne učinke (npr. pomanjkanje testosterona znatno zniža aktivnost kompleksa I), medtem ko blago utišanje lahko doprinese k upočasnjevanju staranja (npr. rotenon inhibira kompleks I, kar spodbuja UPRmt).

===Špela Deučman: Vloga reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) pri celični signalizaciji===
Pri mnogih celičnih procesih nastaja superoksid oz. radikali, ki se kasneje s kisikom združijo v superoksid. Te spojine, imenovane reaktivne kisikove zvrsti (ROS), nastajajo predvsem v mitohondrijih, peroksisomih, endoplazemskem retikulumu in na kompleksih NADPH oksidaze. Zaradi njihove velike reaktivnost so znanstveniki dolgo časa menili, da so to nezaželene molekule, ki povzročajo poškodbe lipidov, proteinov in DNA. V zadnjih dveh desetletjih pa so ugotovili, da imajo pomembno vlogo v homeostazi in kot posredniki intraceličnega signaliziranja. Regulacija ROS z encimi in antioksidanti je ključnega pomena, saj preprečuje poškodbe celičnih struktur in celično smrt hkrati pa vzdržuje dovolj veliko koncentracijo za namene signalizacije. Organizmi so razvili več mehanizmov in najpogostejši med njimi je mehanizem imenovan »redox relay«, pri katerem H2O2 oksidira cisteinske ostanke proteinov kot so PRXs in GPXs. Pri kvasovkah H2O2 oksidira Orp1, ki v nadaljevanju oksidira Yap1. Pri tako imenovanem »floodgate« mehanizemu nastaja H2O2, ki regulira sintezo kortikosterona (pri miših) z negativno povratno zanko, kar omogoča akumulacijo H2O2 ter nadaljnjo signalizacijo. Pri signalizaciji z drugimi rastnimi faktorji prav tako nastaja in se akumulira H2O2, vendar se PRX začasno inaktivira s fosforilacijo. Pri hipoksičnih pogojih se PRX1 oksidira in s tem preprečuje oksidacijo (inaktivacijo) AMPK. Pri interakciji ASK1 in TRX slednji deluje kot nosilec in negativni regulator ASK1. Ob oksidaciji TRX z H2O2 ASK1 oddisociira in tako postane aktiven.

===Katja Doberšek: Vpliv zunanjih dejavnikov na sintezo celuloze===
Celuloza je najpomembnejša sestavina primarne celične stene višje razvitih rastlin. Sintetizira se na plazmalemi na posebnih proteinskih strukturah, imenovanih celulozo sintazni kompleksi ali rozete. To so strukture iz šestih delov, organiziranih v šestkotnik s premerom okoli 30nm. Na vsakem izmed teh šestih delov se nahajajo tri molekule proteina celulozne sintaze, ki glukozne ostanke povezuje v celulozno fibrilo. Rozeta je skupaj s proteini celulozne sintaze pripeta na sistem kortikalnih mikrotubulov, po katerih se premika. Na okoljske stresorje se rastline različno odzivajo, vendar gre pri tem pogosto za spremembe v mehanizmu sinteze celuloze in raziskave so v zadnjem času veliko pozornosti posvečale boljšemu spoznavanju teh odzivov. Okoljske stresorje delimo na abiotske, kot so temperatura, količina svetlobe in osmotski tlak, ter biotske, kot so prisotnost drugih organizmov, predvsem bakterij ali virusov. Pri izražanju genov za proteine, ki sodelujejo pri mehanizmu sinteze celuloze, imajo pomembno vlogo nekateri rastlinski hormoni – fitohormoni, ki se sprošččajo pod vplivom okoljskih stresorjev. To so hormoni družine brasinosteroidov in ABA, ki ga imenujejo tudi rastlinski hormon stresa. Ti s svojim delovanjem namreč aktivirajo ali deaktivirajo določene transkripcijske faktorje, ki se lahko direktno vežejo na promotorsko regijo genov za proteine CESA in drugih.

===Martin Špendl: Lektini in prepoznavanje sladkornih podenot===
Večina organizmov sintetizira proteine, ki lahko vežejo ogljikove hidrate specifično in reverzibilno. Imenujemo jih lektini (izpeljava latinskega glagola izbrati) ali aglutinini, zaradi svoje sposobnosti tvorbe skupkov in obarjanja celic, tako kot protitelesa. Bolj natančno so to proteini, ki lahko vežejo mono- ali oligosaharide v ne-katalitične domene. Saharidi svoje strukture ob vezavi ne spreminjajo, lahko pa spremenijo energijsko stanje le-teh. Od protiteles jih razlikujemo po tem, da njihova prisotnost ni nujno povezana z imunskim odzivom in so lahko prisotni tudi kot posledica stresa ali spremembe v okolici. Večinoma se nahajajo v ekstra-celularnem matriksu (ECM), lizosomih, membranah celic in jedru. Najbolj pogosti so v semenih stročnic. Njihova naloga je prevajanje informacij saharidnih podenot glikolipidov, glikoproteinov in proteoglikanov, ki lahko zaradi svojih mnogoterih struktur v zgoščenem prostoru, kot je na primer EMC, prenašajo veliko gostoto le-teh. Posledično morajo biti vezavna mesta lektinov temu primerno bolj kompleksna. Na osnovi teh lastnosti lektinov izvirajo postopki obdelave vzorca pri naravoslovnih metod in farmacevtskih sintezah zdravilnih učinkovin.Lektini tipa C, ki imajo v svojem vezavnem mestu kation kalcija, so v visokih koncentracijah toksični. Zato moramo živila, ki vsebujejo lektine (na primer stročnice, žita, kostanj in krompir) pred zaužitjem skuhati, da se denaturirajo. V nasprotnem primeru lahko uživanje lektinskih živil privede do bruhanja, driske, prebavnih motenj, slabosti in napenjanja.

===Lea Knez: Trehaloza-6-fosfat kot signalna molekula v rastlinah===
V rastlinah imajo ogljikovi hidrati ključno vlogo v metabolizmu, poleg tega, pa lahko delujejo tudi kot signalne molekule. Ena izmed takih signalnih poti vključuje zaznavanje ter odziv na trehalozo-6-fosfat (T6P). Sintezo T6P katalizira encim trehaloza-6-fosfat sintaza (TPS). T6P deluje kot signal za razpoložljive zaloge ogljikovih hidratov, saj je njegova koncentracija v celicah tesno povezana s koncentracijo saharoze. Dokazali so, da T6P vpliva na sintezo škroba ter da inducira cvetenje rastlin, vendar so potrebne nadaljne raziskave za ugotovitev mehanizma delovanja T6P v teh procesih. T6P je prvi odkriti metabolit, ki sodeluje pri koordinaciji metabolizma z rastjo in razvojem rastline. Izguba gena za encim TPS upočasni razvoj in shranjevanje energijskih zalog v embriju. Predlagali so regulatorni mehanizem kjer T6P deluje na SnRK1 (sucrose non-fermenting related kinase-1) tako da ga inhibira, kar spodbudi anabolične procese in rast rastline. Ob nižjih koncentracijah T6P, pa se SnRK1 aktivira in pospeši katabolične procese ter adaptacijo rastline na zmanjšane zaloge ogljika. Genom rastline Arabidopsis thaliana vsebuje 11 TPS (AtTPS1-11) genov, od katerih so le za TPS1 dokazali encimsko aktivnost, funkcije ostalih homologov pa so še neznane. V bodočih raziskavah bi bilo predvsem pomembno razumeti kakšno vlogo imajo vsi encimi iz družine TPS v rastlinah.

===Nika Goršek: Lipidi v gostiteljski celici ob okužbi z virusom hepatitis C===
Virus hepatitis C je glavni krivec za razvoj jetrne steatoze, fibroze, ciroze in hepatocelularnega karcinoma. Z virusom je okuženih že 170 milijonov ljudi. Življenjski cikel HCV je tesno povezan z metabolizmom lipidov, od vstopa pa vse do njegovega sestavljanja in sekrecije. Virus se poveže s celico preko številnih receptorjev, ki so vključeni predvsem v metabolizem lipidov (LDL-r, SR-BI, NPC1L1, CD81, TfR1, klaudin-1 in okludin). V celico pa vstopi preko s klatrinom posredovane endocitoze. Translacija virusnih polipeptidov poteka na membrana endoplazemskega retikuluma. Pri replikaciji sodelujejo tako virusni kot celični proteini. Replikacija poteka na membranskih mrežah, ki služijo kot osnova za nastanek replikacijeskega kompleksa. Virus si prilasti lipidni metabolizem in tako v membranske mreže privablja sfingolipide in holesterol preko lipidnih transfer proteinov. Virus je zmožen relokalizirati fosfatidilinozitol 4-kinazo III α, ki omogoča sintezo fosfatidilinozitol-4-fosfatov (glicerofosfolipidi), ki so nujno potrebni za nastanek replikacijskega kompleksa.
Raznorazne analize so pokazale, da je virus spremenil ekspresijo genov v gostiteljski celici. Predvsem se je spremenila regulacija genov za holesterolno biosintezo – se je povečala.
Virusne – lipidne interakcije so zelo privlačne za razvoj posrednih protivirusnih zdravil, saj je za virus težje, da razvije mutacije, ki bi delovale proti zdravilom, katerih tarča je gostiteljska celica. Obstajajo nekatera, za zdaj še ne priznana zdravila, ki vplivajo na gostiteljsko celico, vendar so za njihovo uporabo potrebne dodatne analize in raziskave.

===Nika Zaveršek:Povezava velike depresivne motnje z razmerjem med omega-6 in omega-3 maščobnimi kislinami===
Velika depresivna motnja je duševna motnja, ki jo spremljajo občutki tesnobe, letargije, razdražljivosti, krivde, težave s koncentracijo, izguba veselja in zanimanja do običajno prijetnih dejavnosti, lahko povzroči tudi samomorilne misli. V zadnjih desetletjih je depresija postala bolj pogosta. V tem časovnem okvirju pa se je drastično spremenila tudi prehrana v tem delu sveta, in sicer predvsem v razmerju zaužitih esencialnih omega-6 in omega-3 maščobnih kislin, ki je od ugotovljenega idealnega razmerja 2:1 narastla do zaužitih 15-20:1. Povečano razmerje lahko povzroči nevrološke, kognitivne bolezni, bolezni srca in ožilja, možganov in ožilja ter bolezni povezanih z razpoloženjem. Razmerje omega-6:omega-3 maščobnih kislin vpliva na sestavo fosfolipidov v membrani in s tem na njeno fluidnost ter sintezo eikozanoidov, ki regulirajo vnetja, zato poznamo pro- in protivnetne. Izkaže pa se, da ti eikozanoidi ne regulirajo samo vnetij, ampak tudi vse druge mehanizme povezane z njimi, kot so HPA os in posledično sinteza kortizola, ta pa regulira sintezo nevrotransmiterjev npr.: serotonin. Fluidnost membran pa poleg tega vpliva tudi na kvartarno strukturo membranskih proteinov v nevronih in tako na njihovo afiniteto za nevrotransmiterje.

===Špela Supej: Biosinteza rastlinskih alkaloidov===
Alkaloidi so strukturno zelo raznolika skupina naravnih organskih spojin, ki nastanejo kot sekundarni metaboliti pri rastlinski presnovi aminokislin. Za njihovo zgradbo je značilno, da vsebujejo dušik, ki je običajno vezan v heterocikličen obroč. Večina alkaloidov je zelo strupenih in imajo izrazito grenak okus ter tako za mnoge rastline predstavljajo učinkovito zaščito pred rastlinojedci in patogenimi organizmi. Kljub temu pa se mnogi zaradi svojih fizioloških in koristnih farmakoloških lastnosti uporabljajo v medicini. Glede na izvor ločimo alkaloide, ki so sintetizirani iz aminokislin in tiste, ki so sintetizirani iz nukleotidov. V seminarju predstavim sintezo dveh pomembnih alkaloidov in njun vpliv na človeško telo. Tropanski alkaloid nikotin v rastlini tobaka nastane iz treh aminokislin (asparginske kisline, ornitina in metionina) in iz gliceraldehida. Biosinteza poteka v dveh delih, eden izmed njenih glavnih regulatorjev pa je rastlinski hormon jasmonska kislina, ki sproži povečano izražanje genov za sintezo encimov, ki so potrebni za nastanek nikotina. Ta v človeškem telesu deluje kot agonist na večino nikotin acetilholinskih receptorjev in povzroča sproščanje dopamina in adrenalina v krvni obtok. Drug pomemben alkaloid, ki je predstavljen, je kofein, ki izvira iz družine purinskih alkaloidov. Sintetizira se iz ksantozina, v telesu pa deluje kot blago poživilo in diuretik.

===Luka Fratina: Industrijska proizvodnja aminokislin===
Aminokisline se v industriji porabljajo v živilski, farmacevtski in kozmetični industriji. Največ se jih porablja kot dodatek k krmi, pa tudi kot farmacevtski prekurzorji in umetna sladila. Za proizvodnjo aminokislin se uporabljata dva načina: fermentacija in encimatične metode. Fermentacija poteka v fermenatorjih in se uporablja za večino aminokislin. Pri tem je zelo pomembno urediti biosintetične poti, da le te potekajo tako, da dobimo največjo proizvodnjo. To dosežemo tako, da v bakterije, kakor je C. glutamicum uvajamo mutacije, vedno bolj pa je prisotno tudi metabolčno inžinirstvo. Poleg tega je dober način tudi povečati prepustnost membran, saj se tako aminokislin lažje sprostijo v okolje in ne zavirajo encimov. Nekateri encimi so tudi v nizki prisotnosti in zavirajo produkcijo, zato je treba povečati ekspresijo genov za te encime. Kako vplivati na regulacijo in posldično pridobiti ogromno količino aminokisline se razlikuje za vsako aminokislino posebej.Encimatične metode delujejo na na konceptu izoliranih encimov na membrani in se uporabljajo predvsem za neproteogene aminokisline. Proizvodnja aminokislin se vsako leto povečuje, poleg tega pa se z nadaljnami raziskavami vpeljujejo postopke, s katerimi bi se v prihodnoasti proizvajali tudi aminokisline, ki se jih v tem trenutku ne da, kot je mitionin.

===Uroš Prešern: Ribonukleotid reduktaza - encim, ki po vseh letih od odkritja še vedno preseneča===
Ribonukleotid reduktaza je encim, ki katalizira redukcijo ribonukleotidov v deoksiribonukleotide. Od njenega odkritja pred slabimi šestdesetimi leti je ribonukleotid reduktaza nenehno presenečala raziskovalce s svojo neobičajnostjo. Velja za prvi odkriti proteinski radikal, ki katalizira redukcijo ribonukleotidov preko radikalskega mehanizma. Nenavadna je tudi alosterična regulacija encima, saj je poleg aktivnosti encima regulirana tudi specifičnost substrata, ki omogoča ohranjanje pravilnega razmerja med koncentracijami posameznih deoksinukleotidov v celici. Prisotna je v vseh organizmih, skozi evolucijo pa so se izoblikovali trije različni razredi encima, ki se med drugim razlikujejo po načinu tvorbe radikala in občutljivosti na kisik. Najbolj zastopan je razred Ia, kamor spada ribonukleotid reduktaza iz E. coli, pa tudi njen človeški homolog. Za ta razred velja, da je encim sestavljen iz dveh različnih podenot, ki tvorita aktiven kompleks α2β2. V podenoti α se nahaja aktivno mesto in obe regulatorni mesti, podenota β pa vsebuje dvojedrni železov center, poleg pa se nahaja tirozinski ostanek, na katerem se ob prisotnosti kisika tvori radikal. Ta se nato prenese na cisteinski ostanek v aktivnem mestu, kjer sproži redukcijo ribonukleotidov. Kot eden izmed ključnih členov v sintezi DNA je aktivnost ribonukleotid reduktaze močno regulirana, nepravilnosti v regulaciji ali delovanju encima pa lahko pripeljejo do rakavih obolenj.

===Andreja Habič: Rjavo maščobno tkivo kot sekrecijski organ===

Odkritje rjavega maščevja (BAT, ''Brown Adipose Tissue'') pri človeku sega že v leto 1902. Dolgo je veljalo, da je tkivo prisotno le pri novorojenčkih, in sicer z namenom zaščite pred mrazom, v prvih letih odraščanja pa postopoma izgine. Prvič se je o BAT pri odraslem človeku poročalo leta 1972, za nadaljnje raziskave pa je področje postalo zanimivo šele v novem tisočletju, s pojavom tehnik, ki so omogočile potrditev prisotnosti (aktivnega) BAT pri odraslem človeku ''in vivo''. Primarna naloga BAT je proizvodnja toplote, ki se sprošča pri procesu netresave termogeneze, ki poteka v klasičnih rjavih in nedavno odkritih 'bež' adipocitih. V zadnjem desetletju je poleg aktivacije maščobnega tkiva pritegnila pozornost njegova sekrecijska vloga. Identificirani so bili številni BAT-sekreti, t.i. batokini, ki delujejo parakrino (NGF, VEGFA, NO), avtokrino (IGF1, FGF2, PGE2, endokanabinoidi) in/ali endokrino (FGF21, NRG4, IGFBP2, RBP4). Prisotnost večine batokinov ima za posledico povečano aktivnost BAT in/ali povečanje njegovega volumna; odgovorni so tudi za komunikacijo z drugimi organi, npr. s srcem, centralnim živčevjem, kostmi, jetri in trebušno slinavko. Glede na to, da raziskave nakazujejo na pozitivno vlogo aktivnega BAT na zdravstveno stanje tako pri glodalcih kot pri ljudeh (povezujejo jo npr. z zaščito pred debelostjo in diabetesom), bi biokemijsko razumevanje mehanizmov aktivacije BAT in njegove sekrecije ter komunikacije z drugimi organi lahko imelo terapevtski potencial.

===Andrej Race: Ghrelin===

While our organism has many hormones for reducing appetite, there is currently only one known that increases it, ghrelin. This peptide is known for its effect on food intake and body fat gain, and as a releasing agent for growth hormone, but its role is more complex. In this text we describe the unique mechanism by which ghrelin is modified from its inactive des-acylated form to its active acylated form in his producing cells, point out the substances that effect its concentration in blood and reveal receptors and their ligands that stimulate or inhibit ghrelin release. Des-acyl ghrelin, although it can’t activate ghrelin receptor, has shown that it has a, for now still speculated, effect on the body. In addition to its most known roles, ghrelin acts to increase blood glucose and gut motility, benefit memory and learning, change sleep/wake cycle, and much more. The organs that are the target of ghrelin are many and here are described changes in functionality of those organs that are most effected. Ghrelin system serves to achieve heathy metabolism and weight homeostasis, and to generally allow survival.

===Anže Jenko:Sprožitev metamorfoze pri vinskih mušicah===
Metamorfoza oz. preobrazba označuje biološki proces, pri katerem v kratkem času pride pri številnih in velikih sprememb in označuje prehod iz mladostniškega v odrasli stadij. Pri vinskih mušicah poteka popolna preobrazba, za katero je značilen stadij bube.Pri vsem tem pa ključno vlogo odigrajo hranila in njihova dostopnost. Ko je ličinki na voljo zadostna količina hranil, se prične biosinteza steroidnih hormonov. Ti so skozi evolucijo v kraljestvu živali prevzeli vlogo nadzornika nad naglimi prehodi v razvoju. Pri procesu metamorfoze odigra ključno vlogo hormon ekdison. Ta deluje na heterodimerni nuklearni receptor, ki je transkripcijski faktor, ki nato preko vpliva na gene in posledične kaskade dogodkov privedejo do celicam specifičnih hormonskih odzivov. Ekdison je glavni levitveni hormon in se v fazi ličinke sintetizira v posebni žlezi (PG), v aktivno obliko 20E pa se preoblikuje šele zatem, ko je bil izločen v hemolimfo.
Kontrolo nad biosintezo E/E20 pa imajo tudi tipični okoliški parametri, kot so prehrana, temperatura in svetloba, informacije o le-teh pa do žleznih celic pride preko nevronov oz. drugih hormonov. Do sedaj so bili pri vinskih mušicah kot nevroni, ki direktni izraščajo v PG poznani le PTTH nevroni. V raziskavi pa so identificirali še podskupino serotoninskih nevronov, ki z različno stopnjo izraščanja v odvisnosti od dostopnosti hranil, posredujejo pri začetku razvoja in zorenja.

===Katja Dolenc: OKSITOCIN IN NJEGOVA VLOGA pri prosocialnih učinkih MDMA (ecstasyja)===
Oksitocin je kratek nevropeptid, ki mediira več fizioloških odzivov, kot je naprimer krčenje gladkih mišic maternice med porodom in izločanje mleka pri dojenju, ima pa tudi pomembne vloge pri socialnem in reproduktivnem vedenju sesalcev. OT se proizvaja v hipotalamsu in se iz zadnjega režnja hipofize sprošča v sistemski obtok. Oksitocinska signalizacija v celicah poteka prek oksitocinskih receptorjev, ki spadajo v z G proteinom povezane receptorje tipa I, in tako mediira različne odzive v tkivih. Regulacija biosinteze in sekrecije OT je povezana s transmembranskim receptorjem CD 38, ki je bolj znan kot receptor na limfocotih, in tudi s serotoninskim receptorjem 5-HT1A , ki je glavna tarča delovanja rekreativne droge MDMA, 3, 4 metilendioksimetamfetamin, znane tudi pod imenom ecstasy. MDMA je popularen predvsem zaradi svojih prosocialnih učinkov in občutkov evforije, ki jih najverjetneje sproži aktivacija oksitocinergičnih mehanizmov.

BIO2 Povzetki seminarjev 2017

2018-10-15T15:02:42Z

Aljaž Bratina: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2017/2018 */

BIO2 Povzetki seminarjev 2017

2018-10-15T15:02:17Z

Aljaž Bratina: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2017/2018 */

BIO2 Seminar 2018

2018-10-10T17:01:52Z

Aljaž Bratina: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Eva Gartner || 12 || moj naslov || Anamarija Agnič || Anastasija Nechevska || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Aljaž Bratina || 12 || Staranje in lipidne signalne molekule || Lara Drinovec || Liza Ulčakar || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Karmen Mlinar || 12 || moj naslov || Luka Gnidovec || Maja Škof || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Tina Zavodnik || 12 || moj naslov || Jernej Imperl || Ajda Godec || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Meta Kodrič || 12 || moj naslov || Laura Gašperšič || Neža Blaznik || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Neža Žerjav || 12 || moj naslov || Nika Boštic || Urša Štrancar || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Doroteja Armič || 14-15 || moj naslov || Eva Gartner || Anamarija Agnič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Sanja Stanković || 14-15 || moj naslov || Aljaž Bratina || Lara Drinovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Martina Lokar || 14-15 || Mehanizmi biotinilacije proteinov || Karmen Mlinar || Luka Gnidovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Marko Pavleković || 16 || moj naslov || Tina Zavodnik || Jernej Imperl || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Valeriya Musina || 16 || moj naslov || Meta Kodrič || Laura Gašperšič || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Tina Kolenc Milavec || 16 || moj naslov || Neža Žerjav || Nika Boštic || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Andrej Špenko || 17 || moj naslov || Doroteja Armič || Eva Gartner || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Tadej Medved || 17 || moj naslov || Sanja Stanković || Aljaž Bratina || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Klementina Polanec || 17 || moj naslov || Martina Lokar || Karmen Mlinar || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Rebeka Dajčman || 17 || moj naslov || Marko Pavleković || Tina Zavodnik || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Sumeja Kudelić || 18 || moj naslov || Valeriya Musina || Meta Kodrič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Matija Ruparčič || 18 || moj naslov || Tina Kolenc Milavec || Neža Žerjav || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Maks Kumek || 18 || moj naslov || Andrej Špenko || Doroteja Armič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Anže Šumah || 19 || moj naslov || Tadej Medved || Sanja Stanković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Barbara Jaklič || 19 || moj naslov || Klementina Polanec || Martina Lokar || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Gašper Anton Komatar || 19 || moj naslov || Rebeka Dajčman || Marko Pavleković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Praznik Liza || 19 || moj naslov || Sumeja Kudelić || Valeriya Musina || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Lara Hrvatin || 20 || moj naslov || Matija Ruparčič || Tina Kolenc Milavec || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Sonja Gabrijelčič || 20 || moj naslov || Maks Kumek || Andrej Špenko || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Anastasija Nechevska || 20 || moj naslov || Anže Šumah || Tadej Medved || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Liza Ulčakar || 21 || moj naslov || Barbara Jaklič || Klementina Polanec || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Maja Škof || 21 || moj naslov || Gašper Anton Komatar || Rebeka Dajčman || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Ajda Godec || 21 || moj naslov || Praznik Liza || Sumeja Kudelić || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Neža Blaznik || 22 || moj naslov || Lara Hrvatin || Matija Ruparčič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Urša Štrancar || 22 || moj naslov || Sonja Gabrijelčič || Maks Kumek || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Anamarija Agnič || 22 || moj naslov || Anastasija Nechevska || Anže Šumah || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Lara Drinovec || 23 || moj naslov || Liza Ulčakar || Barbara Jaklič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Luka Gnidovec || 23 || moj naslov || Maja Škof || Gašper Anton Komatar || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Jernej Imperl || 23 || moj naslov || Ajda Godec || Praznik Liza || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Laura Gašperšič || 23 || moj naslov || Neža Blaznik || Lara Hrvatin || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Nika Boštic || 23 || moj naslov || Urša Štrancar || Sonja Gabrijelčič || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2017|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2018-seminar

2018-04-03T22:00:53Z

Aljaž Bratina: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Doroteja Armič || Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180118162449.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Martina Lokar || Liza Ulčakar || Zoja Siter
|-
| Valeriya Musina || Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171213124751.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Nika Boštic || Tiana Karmen Kokalj || Aljaž Bratina
|-
| Dea Simonič || Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170824141207.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Sumeja Kudelić || Jernej Imperl || Anamarija Agnič
|-
| Neža Štremfelj ||Delovanje inzulinskih receptorjev||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103256.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Luka Gnidovec || Matija Ruparčič || Simona Gorgievska
|-
| Gašper Komatar || Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri tvorbi spomina || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171009093207.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Lara Hrvatin || Tiana Karmen Kokalj || Matej Jereb
|-
| Marko Pavleković || Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171121155811.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Klementina Polanec || Meta Kodrič || Lara Drinovec
|-
| Laura Gašperšič || Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170808150001.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Karmen Mlinar || Ana Menegalija || Maks Kumek
|-
| Rebeka Dajčman || Več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171003124646.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Ula Nikolaja Ratajec || Andreja Marija Belič || Neža Blaznik
|-
| Maja Škof || Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje. || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171127105937.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Doroteja Armič || Barbara Jaklič || Liza Ulčakar
|-
| Tina Kolenc Milavec || Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219071758.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Valeriya Musina || Eva Gartner || Jana Rajchevska
|-
| Tina Zavodnik || Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180202112629.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Dea Simonič || Martina Lokar || Jernej Imperl
|-
| Tadej Medved || Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180305130632.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Neža Štremfelj || Nika Boštic || Matija Ruparčič
|-
| Bogdan Jovićević || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Laura Gašperšič || Lara Hrvatin || Ana Menegalija
|-
| Polona Kalan || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180214111055.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Rebeka Dajčman || Klementina Polanec || Andreja Marija Belič
|-
| Liza Praznik ||Vpliv šaperono Skp in SurA na zvijanje proteinov FhuA v terciarno strukturo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2015/09/150907113757.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Maja Škof || Karmen Mlinar || Barbara Jaklič
|-
| Anže Šumah || Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171114104201.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Tina Kolenc Milavec || Ula Nikolaja Ratajec || Eva Gartner
|-
| Neža Žerjav|| Dodajanje enega samega nukleotida omejuje aktivnost človeške telomeraze ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180227142114.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tina Zavodnik || Doroteja Armič || Martina Lokar
|-
| Urša Štrancar || Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo supermolekularnega para FRET || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103254.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tadej Medved || Valeriya Musina || Nika Boštic
|-
| Zoja Siter || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Neža Žerjav || Dea Simonič || Sumeja Kudelić
|-
| Aljaž Bratina || Intrinzična destabilizacija ribosoma || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171120101314.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Anastasija Nechevska || Neža Štremfelj || Luka Gnidovec
|-
| Anamarija Agnič || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Bogdan Jovićević || Sumeja Kudelić || Lara Hrvatin
|-
| Simona Gorgievska || Optical tools to detect metabolic changes linked to disease || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180307161351.htm|| 10.04. || 13.04. || 16.04. || Polona Kalan || Marko Pavleković || Klementina Polanec
|-
| Matej Jereb || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Liza Praznik || Laura Gašperšič || Karmen Mlinar
|-
| Lara Drinovec || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Anže Šumah || Rebeka Dajčman || Ula Nikolaja Ratajec
|-
| Maks Kumek || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Marko Pavleković || Maja Škof || Doroteja Armič
|-
| Neža Blaznik || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Urša Štrancar || Tina Kolenc Milavec || Valeriya Musina
|-
| Liza Ulčakar || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171129163851.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Zoja Siter || Tina Zavodnik || Dea Simonič
|-
| Anastasija Nechevska || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Aljaž Bratina || Tadej Medved || Neža Štremfelj
|-
| Jernej Imperl || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Anamarija Agnič || Neža Žerjav || Luka Gnidovec
|-
| Matija Ruparčič || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Simona Gorgievska || Anastasija Nechevska || Marko Pavleković
|-
| Tiana Karmen Kokalj || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Matej Jereb || Bogdan Jovićević || Laura Gašperšič
|-
| Meta Kodrič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180125101321.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Lara Drinovec || Polona Kalan || Rebeka Dajčman
|-
| Ana Menegalija || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Maks Kumek || Liza Praznik || Maja Škof
|-
| Andreja Marija Belič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Neža Blaznik || Anže Šumah || Tina Kolenc Milavec
|-
| Barbara Jaklič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180220161201.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Liza Ulčakar || Meta Kodrič || Tina Zavodnik
|-
| Eva Gartner || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Gašper Komatar || Urša Štrancar || Tadej Medved
|-
| Martina Lokar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180301144138.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Jernej Imperl || Zoja Siter || Neža Žerjav
|-
| Nika Boštic || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Matija Ruparčič || Aljaž Bratina || Anastasija Nechevska
|-
| Sumeja Kudelić ||Toksin botulin "preskočil" v novo vrsto bakterije ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180126122856.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Tiana Karmen Kokalj || Anamarija Agnič || Bogdan Jovićević
|-
| Luka Gnidovec || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Meta Kodrič || Simona Gorgievska || Polona Kalan
|-
| Lara Hrvatin || Mg2+ ioni omogočajo kondenzacijo kromosomov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180201104559.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Ana Menegalija || Matej Jereb || Liza Praznik
|-
| Klementina Polanec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Andreja Marija Belič || Lara Drinovec || Anže Šumah
|-
| Karmen Mlinar || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Barbara Jaklič || Maks Kumek || Gašper Komatar
|-
| Ula Nikolaja Ratajec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Eva Gartner || Neža Blaznik || Urša Štrancar
|-
| rezerva || || || 29.05. || 01.06. || 04.06. || || ||
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2018_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2018_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2018_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2018_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2018_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2017 Povzetki seminarjev

2018-04-03T21:59:24Z

Aljaž Bratina: /* Ana Scott: Naslov seminarja */

[[TBK2017-seminar|Nazaj na osnovno stran]]
===Ana Scott: Naslov seminarja===
Tekst ....

'''Uroš Prešern: Nukleaza, ki povzroči partanatos oziroma od PARP-1 odvisno celično smrt'''

Partanatos je ena izmed vrst celične smrti, ki nastopi zaradi prevelike aktivnosti poli(ADP-riboza) polimeraze 1 (PARP-1) v jedru. Pogost je v primeru možganske kapi, infarkta in nevrodegenerativnih boleznih, zaradi česar bi boljše poznavanje samega procesa omogočilo razvoj novih načinov zdravljenja teh obolenj. V predhodnih raziskavah so ugotovili, da partanatos nastopi, ko molekule poli-ADP-riboze, ki jih PARP-1 sintetizira, preidejo iz jedra v citosol, kjer aktivirajo premestitev indukcijskega faktorja apoptoze (AIF) iz mitohondrijev v jedro. Temu sledi razrez DNA. Nukleaza, ki povzroči razrez DNA, je bila do nedavnega manjkajoči člen v partanatosu. Skupini raziskovalcev je uspelo odkriti, da je iskana nukleaza inhibitorni dejavnik migracije makrofagov (MIF). Pokazali so, da se med partanatosom MIF veže na AIF in se skupaj z njim premesti v jedro, kjer povzroči fragmentacijo DNA. Inhibicija nukleazne aktivnosti MIF se je v modelu možganske kapi pri miših odrazila v 75-odstotnem zmanjšanju volumna prizadetega tkiva, pospešeno pa je bilo tudi okrevanje. Rezultati raziskave odpirajo potencialne možnosti za zdravljenje akutnih in kroničnih nevroloških bolezni, v katerih nastopi partanatos.

'''Doroteja Armič: Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR'''

Pluripotentne matične celice so še nediferencirane celice, ki imajo sposobnost, da se diferencirajo v skoraj vse tipe celic. Poznamo več vrst pluripotentnih matičnih celic. Ene izmed njih so inducirane pluripotentne matične celice (celice iPS). To so pluripotentne celice, ki jih umetno dediferencirajo iz odraslih somatskih celic. Leta 2006 so odkrili postopek pridobivanja celic iPS iz mišjih fibroblastov. Ugotovili so, da so za reprogramiranje somatskih celic najpomembnejši štirje transkripcijski dejavniki, in sicer Oct4, Sox2, Klf4 in c-Myc. Letos pa je skupini znanstvenikov uspelo odkriti nov, bolj enostaven postopek pridobivanja celic iPS. Ugotovili so namreč, da lahko sprožijo njihov nastanek že z aktivacijo enega samega gena – Oct4 ali Sox2. Aktivacija Sox2-promotorja oziroma Oct4-promotorja in Oct4-ojačevalca hkrati pa nato povzroči aktivacijo ostalih genov, ki sodelujejo pri vzpostavitvi pluripotentnosti v celicah. Za aktivacijo genov so uporabili tehnologijo CRISPR. Primerjali so uporabo dveh sistemov – dCas9-SunTag-VP64 in dCas9-SunTag-p300core. V obeh primerih so dobili primerljive rezultate. Uporaba celic iPS je pomembna v regenerativni medicini, saj lahko zamenja uporabo človeških embrionalnih matičnih celic. Z uporabo celic iPS, generiranih iz pacientovih lastnih celic, ne bi prišlo do zavrnitvenih reakcij, prav tako pa bi se izognili etičnih pomislekov. Znanstveniki predvidevajo, da lahko tehnologija reprogramiranja celic, ki so jo uporabili na mišjih celicah, z manjšimi spremembami deluje tudi na človeških celicah.

'''Dea Simonič: Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu'''

Avtoimunska bolezen je bolezen, ki nastane zaradi pretiranega odziva imunskega sistema na celice, ki so last organizma. Veliko vlogo pri nastanku avtoimunske bolezni imajo limfociti B, ki omogočajo humoralni imunski odziv. Transkripcijski faktor T-bet v limfocitih B povzroči razvoj ABC, te celice so pa »pogon« avtoimunske bolezni. Avtoimunska bolezen se v veliki večini primerov razširi po telesu . Vzrok tega so ravno limfociti B, ki razširijo svoj napad po telesu in pride do širjenja epitopa. Ta proces se začne, ko imunski sistem napade antigene na drugih delih telesa, ki jih na začetku ni hotel uničiti. Telo začne pospeševano uničevati lastna tkiva. Da bi razumeli, zakaj pride do tega mehanizma so raziskovalci uporabili fluorescenčne markerje beljakovin, ki razlikujejo različne celične skupke limfocitov B (oziroma germinalne centre), na miših obolelih z lupusom. V germinalnih centrih limfociti B »tekmujejo« med sabo, kateri bo naredil najboljše protitelo, ki bo nevtraliziralo zaznano grožnjo. Te germinalne skupke so s pomočjo markerjev zaznali kot 10 različnih barv. Po tednu ali dveh začne prevladovati ena sama barva. Ta germinalni skupek je ustvaril najboljše protitelo in skupaj z ostalimi limfociti aktiviral avtoimunski protinapad. S to študijo so raziskovalci naredili velik korak v smer zaustavitve oziroma zdravljenja avtoimunske bolezni.

'''Valeriya Musina: Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke'''

Uničenje mitohondrijev je eden najbolj obetavnih pristopov pri razvoju novih zdravil proti raku. Znanstveniki so sintetizirali peptid, ki vsebuje baker, ki ga zlahka sprejmejo mitohondriji v matičnih celicah raka dojk, kjer le ta učinkovito povzroča apoptozo. Rakaste celice, ki imajo povečani metabolizem, ne samo, da vsebujejo več mitohondrijev kot zdrave celice, temveč so te tudi drugačni, strukturno in funkcionalno. Zaradi posebnih značilnosti in njihove odločilne vloge v presnovi celic so maligne mitohondrije pomembne tarčej za nove terapevtske spojine. Mitohondrije je možno uničiti z uvajanjem sredstev za proizvajanje reaktivnih vrst kisika (ROS). Te reaktivne spojine ovirajo metabolizem mitohondrijev. Kot močan ROS generator je bila predlagana organokovinska spojina bakrov(II) fenantrolin. Za dostavo in prenos skozi zunanjo membrano mitohondrija pa so bakrov(II) fenantrolin vezali na specifičen peptid, ki prodira v mitohondrije. Preizkusi so bili izvedeni z dvema celicnima linijama raka dojke, ena celična linija je vsebovala matične celice raka dojk. Rezultati so bili : odvisna od količine odmerka izguba sposobnosti za preživetje, razpad membran mitohondrijev, nastanek ROS in slabši metabolizma mitohondrijev. Zdravilo je bolj vplivalo na matične celice raka, kar je bilo razloženo z večjo vsebnostjo mitohondrijev. Ta študija izpostavlja potencial metalopeptida tako za dostavo kot tudi za uničenje mitohondrijev, zlasti v matičnih celicah raka.

'''Neža Štremfelj: Delovanje inzulinskih receptorjev'''

Človeški inzulinski receptorji igrajo pomembno vlogo v človeškem telesu. Signalizacija z inzulinskimi receptorji igra ključno vlogo pri regulaciji metabolizma in pri rasti v večceličnih organizmih. Nepravilno delovanje inzulinskih receptorjev je povezano z mnogimi hujšimi obolenji, na primer z rakavim obolenjem, diabetesom in Alzheimerjevo boleznijo.
Glavna ideja raziskave, ki jo opisuje članek, ki sem si ga izbrala za osnovo moje seminarske naloge je, da vezava inzulina na inzulinski receptor preoblikuje zunajcelični del transmembranskih proteinov (ektodomeno) receptorja iz U-konformacije v T-konformacijo. Prerazporeditev v ektodomeni se razširi tudi na transmembranske domene, ki so, ko je receptor neaktiviran pomaknjene narazen, ob vezavi inzulina pa se pomaknejo skupaj, kar omogoči fosforilizacijo tirozin kinaze v citoplazmi. Pri transmembranski signalizaciji z inzulinskim receptorjem poleg dimerizacije z vezavo liganda pride tudi do strukturnih sprememb znotraj receptorskega dimera.

'''Marko Pavleković: Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado'''

Multipla skleroza je avtoimunska bolezen, pri kateri limfociti napadejo živčne celice in jih demielinizirajo ter tako škodujejo prenosu signalov med nevroni. Iz predhodnih raziskav so odkrili, da sta za multiplo sklerozo najbolj krivi celiti pomagalki T 1 in T 17. Da bi prišli do centralnega živčnega sistema morata celici najprej prečkati vaskularno pregrado. Kako to dosežeta so raziskovali znanstveniki z univerze v Kolumbiji in z univerze v Kaliforniji. Z dvo-fotonsko mikroskopijo so opazovali tesne stike pri miših obolelih za eksperimentalnim avtoimunskim encefalomielitisom, ki je živalski primer multiple skleroze. Ugotovili so, da krvno-možgansko pregrado preideta na dva različna načina: s transcitozo in skozi prekinjene tesne stike med endotelnimi celicami. S pomočjo miši, ki jim je primanjkovalo kaveol (kaveolina1) pa so dokazali, da za prehod do centralnega živčnega sistema celica T 1 izkorišča transcitozo, medtem ko celica T 17 prehaja skozi prekinjene tesne stike. Te ugotovitve bi lahko močno pomagale pri nadaljnjem zdravljenju bolezni, kjer bi se osredotočili na preprečevanje dostopa imunskih celic do centralnega živčnega sistema.

'''Rebeka Dajčman: več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija'''

Kalcij igra ključno vlogo pri skoraj vseh procesih v celici. Razni signali, kot je na primer sinteza RNA in DNA ali pa migracija celic, je posledica spremembe intracelularne koncentracije kalcija. Spremembo koncentracije lahko zaznamo z merjenjem intenzivnosti fluorescentne svetlobe, ki jo oddajajo GCaMP proteini. Če celice poškodujemo z laserskim mehurčkom, ustvarimo rano, ki je podobna udarcu. Sledijo trije mehanizmi signaliziranja, ki so odvisni od velikosti rane. Takoj po poškodbi celične membrane uide kalcij iz ekstracelularne tekočine v citosol, kjer se koncentracija kalcija dvigne. Kalcij nato skupaj s signalnimi molekulami difundira v okoliške celice in temu pravimo prvi val oz. takojšnji odziv. Po 45 sekundah mu sledi drugi močnejši valj, ki pa se širi počasneje, ker skozi membrano prehajajo večji signalni proteini. Ti signali sprožijo sistemski odziv na poškodbo, ki poskrbi, da se celice v najkrajšem možnem času regenerirajo. Da pri regeneraciji povrhnjice kože ne nastanejo brazgotine poskušamo v tkivo, ki je bilo poškodovano, vstaviti lasne mešičke. Ti pripomorejo k nastajanju maščobe in tako preprečijo brazgotinjenje. Če se poškoduje žilna stena pa sistem poskrbi za nastanek strdkov, ki so sestavljeni iz krvnih celic in fibrina. Trombociti navijejo fibrin v toge zvitke in ti se s pomočjo posebnih encimov raztopijo v krvi. Nova odkritja o celičnemu celjenju pripomorejo k hitrejšemu in učinkovitejšemu celjenju ran.

'''Gašper Anton Komatar: Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri vorbi spomina'''

LTP ali dolgoročna potenciacija pomeni povečanje sinaptične moči za dolgo časa in ker gre pri tvorbi spominov prav za povečanje sinaptične aktivnosti, je med znanstveniki priznan kot najverjetnejši model učenja in tvorbe spomina na celični ravni. Med LTP se poveča število receptorjev AMPA v postsinaptični membrani, kar še dodatno poveča sinaptično moč.
Kakšen je mehanizem in katere molekule sodelujejo pri prenosu in vgradnji AMPAR v postsinaptično membrano, to je bilo glavno vprašanje raziskovalcev v članku, ki sem si ga izbral za seminarsko nalogo. Že dlje časa je bilo znano, da ephirinB2, ApoER2 in Reelin sodelujejo pri razvoju možganov kot regulatorji migracije nevronov. Znanstveniki so preverili, če sodelujejo tudi pri procesih prenosa in vgradnje AMPAR v membrano. S tehniko knockout (inaktivacija določenih genov) ter z imunoprecepcijo, so selektivno inhibirali interakcije med proteini, rezultate pa so beležili s fluorescentnimi analizami in prenosom western. Ugotovili so, da tvorba kompleksa multiplih receptorjev ApoER2/ephirinB2/AMPAR in GRIP1 povzroči vgradnjo tega AMPAR na membrano dendrita in sproži signalne kaskade, ki regulirajo vgradnjo novih AMPAR. Ko je bila interakcija med temi proteini inhibirana, so bili nevroni nezmožni reagirati na spremembe v njihovem omrežju, kar je zmanjšano sinaptično aktivnost. To pomeni, da skupki teh proteinov vzdržujejo oz. ojačajo sinaptično aktivnost. S tem so znanstveniki dokazali, da zgoraj omenjen kompleks receptorjev zares sodeluje pri tvorbi spominov.

'''Laura Gašperšič: Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2'''

Pri Alzheimerjevi bolezni je glavni simptom okvara spomina, do česar pride zaradi utišanja genov, ki sodelujejo pri tvorbi novih spominov. Do utišanja pride zaradi deacetilacije histonov, ki jo povzročijo encimi histonske deacetilaze (HDAC). Pri utišanju genov za tvorbo spominov je najpomembnejši HDAC2. Njegova raven je pri bolnikih z Alzheimerjevo boleznijo povišana. Encimi HDAC so si po zgradbi podobni, poleg tega tvori en encim več različnih kompleksov, kar lahko pri inhibiciji encimov HDAC sproži tudi stranske učinke. Raziskovalci so zato želeli najti molekulo, s katero se HDAC2 veže na promotorje genov za učenje in spomin. S prvimi raziskavami so določili 3 najbolj verjetne proteine: Tdp2, Sap30 in Sp3, z meritvami pa so ugotovili, da Sp3 vpliva na delovanje sinapse. V nadaljnjih raziskavah so dokazali, da kompleks med HDAC2 in Sp3 v bolezenskem stanju z vezavo na promotorje negativno uravnava izražanje genov povezanih z delovanjem sinapse. V zadnjem delu raziskave so želeli določiti del HDAC2, ki se veže na Sp3 in inhibirati nastanek kompleksa med HDAC2 in Sp3. Ugotovili so, da se na Sp3 veže C-konec HDAC2. C-končni fragment HDAC2 se že sam veže na Sp3, s čimer se zmanjša število kompleksov med HDAC2 in Sp3 na promotorjih. Fragment HDAC2 pa se ne veže na druge proteine, s katerimi HDAC nadzorujejo druge pomembne procese. Izražanje C-končnega fragmenta HDAC2 torej predstavlja obetaven način, s katerim bi lahko zdravili nevrološke bolezni povezane z okvarami spomina.

'''Maja Škof: Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje'''

Koronavirusi so razširjeni po vsem svetu in največkrat povzročajo okužbe dihal pri ljudeh in živalih. Spadajo med RNA viruse, za katere je značilna visoka stopnja genskih mutacij, kar jim omogoča, da se uspešno prilagajajo na okolje. S-proteini so trimerni proteini, s katerimi se koronavirusi vežejo na gostiteljsko celico, nato pa sprožijo spojitev virusne in celične membrane, kar omoči, da virusna RNA preide v celico. S-proteini so sestavljeni iz dveh podenot, S1 in S2. Pri vezavi na celični protein sodeluje zunanji del podenote S1, ki je v obliki treh podaljšanih zank (receptorsko-vezavne zanke). Med aminokislinami S-proteina in receptorskega proteina se vzpostavijo medmolekulske vezi, nato pa podenota S2 sproži spojitev s celično membrano. S1 je tudi glavna tarča protiteles, ki preprečujejo virusu, da bi vstopil v celico. A protitelo, ki se uspešno veže na sev virusa, ob ponovni okužbi virusa ne prepozna več. To je posledica naključnih genskih mutacij. Analiza genomov koronavirusov, izoliranih v zadnjih 50-ih letih, je pokazala, da se receptorsko-vezavne zanke S-proteinon med seboj občutno razlikujejo. Kar 73% aminokislin na receptorsko-vezavnih zankah variira. Odstotek je ravno dovolj velik, da se koronavirusi še vedno lahko vežejo na receptor, protitelesa pa jih ne zaznajo več.

'''Tadej Medved: Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3'''

Ključnega pomena za procese, kot so celično gibanje in endocitoza, so aktinski filamenti. Nastanek in prerazporeditev le-teh nadzorujejo določeni proteinski kompleksi; za razvejane aktinske filamente je to Arp2/3. Le-ta je sestavljen iz več podenot; najpomembnejši sta Arp2 in Arp3, ki sta po strukturi podobni aktinu. Na Arp2/3 se vežejo proteini družine WASP, ki spravijo proteinski kompleks v konformacijo, pri kateri lahko dejansko vrši nastanek novih filamentov. Za vse WASP-e velja, da se na Arp2/3 vežejo z odsekom VCA(verprolin, central, acidic), a do podatkov o strukturah takšnih vezi se znanost še ni dokopala. S pomočjo "cross-linking" masne spektrometrije in "reversed phase liquid" kromatografije je pred kratkim nastal model, ki zadovoljivo opisuje mesta, na katera se vežejo WASP-i. Vezava namreč poteka na dveh mestih: na hrbtni strani Arp2/3 in na spodnji strani kompleksa, pri Arp2 in poddomeno ARPC1. Na Arp2/3 se pri WASP-u veže odsek CA, konec odseka V pa ostaja prost za vezavo aktina. Izkazalo se je, da se za uspešno nukleacijo aktina vezavni mesti za aktin in CA ne smeta prekrivati; odsek WASP C pa je še zlasti pomemben za aktivacijo Arp2/3.

'''Tina Zavodnik: Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost'''

Mitohondriji so zelo kompleksni organeli, ki za normalno opravljanje svojih funkcij potrebujejo številne proteine. Večina teh proteinov se sintetizira v citoplazmi, nato pa so uvoženi nazaj v mitohondrije. Ob morebitni okvari transportnih mehanizmov in posledično okvarjenih mitohondrijih pa pride do akumulacije proteinov v citoplazmi, kar poruši celično ravnovesje. Skupina znanstvenikov iz Nemčije in Poljske pa je odkrila mehanizem, ki poškodovanim mitohondrijem omogoča nadzor nad sintezo proteinov z induciranjem reverzibilnih sprememb na translacijskem mehanizmu. Kot signal uporabijo ROS, ki povzroči oksidacijo tiolov na peptidih, ki so sestavni deli translacijskega mehanizma. Do odkritja so prišli s kvantitativno analizo cisteinskih ostankov oz. tiolnih skupin na proteomu kvasovke Saccharomyces cerevisia ter izdelali obsežno zbirko oksidacijskih stanj peptidov, ki so vsebovali tiolne skupine. Analizo so ponovili še na gojenih celicah kvasovke, ki so bile izpostavljene induciranemu oksidativnemu stresu s pomočjo H2O2, ter na mutiranih celicah z disfunkcionalnimi mitohondriji. Pri obojih so zaznali povečano oksidacijo Cys-peptidov in zmanjšano translacijsko aktivnost. Z odstranitvijo stresorskega faktorja pa se je translacijska aktivnost delno do popolnoma obnovila, kar dokazuje, da je oksidacija peptidov, ki so del mehanizmov za sintetiziranje novih proteinov, reverzibilen proces. Cisteinski ostanki torej delujejo kot nekakšni senzorji za ROS in ob oksidativnem stresu inhibirajo sintetiziranje novih proteinov.

'''Tina Kolenc Milavec: Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli'''

Alfa-sinuklein je majhen, v vodi topen protein brez stabilne terciarne strukture, ki ga genetsko in nevropatološko povezujejo s Parkinsonovo boleznijo, o njegovi vlogi pri razvoju bolezni pa še marsikaj ni znano. Nahaja se predvsem v živčnih končičih, kjer je ravnovesje med α-sinukleinom raztopljenim v citosolu in tistim vezanim na fosfolipidni dvosloj močno regulirano. Ker se α-sinuklein nahaja na območju, kjer koncentracija kalcija ves čas močno niha, so raziskovalci Lautenschläger ''et al.'' predpostavili, da je normalna fiziološka funkcija α-sinukleina odvisna od kalcija. Da bi bolje razumeli funkcijo tega proteina, so v raziskavi izvedli več ''ex vivo'' ter ''in vitro'' eksperimentov, s katerimi so skušali ugotoviti predvsem to, kako se α-sinuklein veže na membrano sinaptičnega vezikla ter kako koncentraciji kalcija in α-sinukleina vplivata na homeostazo sinaptičnih veziklov ter na združevanje α-sinukleina v fibrilarne skupke. Povečana koncentracija kalcija in/ali α-sinukleina namreč pod določenimi pogoji povzroča toksičnost in posledično celično smrt, saj α-sinuklein oligomerizira ter tvori dolge in debele netopne fibrile, ki so del Lewyjevih telesc – citoplazemskih vključkov, značilnih za Parkinsonovo bolezen. Iz medicinskega stališča pa je zanimiva ugotovitev, da isradipin (antagonist kalicevih kanalčkov) preprečuje fibrilizacijo, saj znižuje znotrajcelično koncentracijo kalcija, kar odpira nove možnosti za razvoj zdravil proti Parkinsonovi bolezni.

'''Anže Šumah: Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53'''

Protein p53 je tumorski zatiralec (tumor supresor), ki je zaradi svoje nadvse pomembne vloge pri ohranjanju celovitosti celičnega genoma pogosto deležen naziva »varuh genoma«. V normalnih primerih je izražanje tega proteina na nizki ravni, v primeru celičnega stresa pa deluje kot prepisovalni dejavnik, ki uravnava izražanje genov, ki so vključeni v nadzor celičnega cikla, popravljanje DNA in apoptozo. Ugotovili so, da je okoli 50 % vseh človeških oblik raka povezanih z mutacijami gena TP53 (gena za sintezo p53), zato so v raziskavi želeli razviti genski senzor, ki bi bil sposoben uničiti celice, ki ne sintetizirajo p53 (so rakave). Na podlagi promotorjev, ki jih p53 kot prepisovalni dejavnik zavira ali aktivira, so razvili senzor, ki v primeru pomanjkanja p53 sintetizira protein »Herpes simplex virus thymidine kinase« (HSV-TK), preko katerega lahko z zdravilom Ganciclovir uničimo rakasto celico, ki je brez p53. V primeru, da je p53 prisoten (je celica »zdrava«), pa je sinteza HSV-TK zavirana preko različnih mehanizmov. Senzor so najprej testirali na celični kulturi HCT116 (rakaste človeške črevesne celice) s fluorescentnima proteinskima markerjema, nato pa še v živih organizmih, in sicer golih miših brez imunosti. Tako so dokazali tako in vitro kot tudi in vivo uporabnost izdelanega genskega senzorja, ki bi ga bilo mogoče uporabiti v terapevtske namene.

'''Liza Praznik: Vpliv šaperonov Skp in SurA na zvijanje izvenmembranskih proteinov FhuA v terciarno strukturo'''

Naloga posebne vrste proteinov, imenovanih šaperoni je, da preoblikujejo polipeptidne verige v terciarno strukturo, v kateri so ti zmožni aktivnega delovanja. Delovanje in odzivanje šaperonov na različne dejavnike je še dokaj neznano, zato je skupina znanstvenikov Univerze v Baslu raziskovalo šaperona Skp in SurA, holdaz, ki delujeta na protein FhuA. Ta se nahaja na zunanji membrani gram negativnih bakterij, kjer služi kot receptor za ferikrom in tvori obliko beta-sodčka. Z večkratnimi ponovitvami poskusov so ugotovili, da se v prisotnosti obeh šaperonov struktura proteina, vgrajenega v membrano, ne podere, če jo delno razvijemo, ne glede na to, do katere stopnje. Šaperona sta obenem zmožna delno razvit protein preoblikovati nazaj v funkcionalno obliko, ki omogoča ponovno delovanje v membrani. Naloga obeh šaperonov je, da zadržujeta zvit polipeptid v dinamični, termodinamsko najugodnejši konformaciji, s katero se posamezni beta-zavoji polipeptida lahko vstavljajo v membrano. Ugotovljeno pa je bilo, da je šaperon SurA pri tem znatno učinkovitejši. Rezultati raziskave omogočajo boljši vpogled v mehanizme delovanja šaperonov in nakazujejo, kako pomembni so za učinkovito delovanje proteinov.

'''Urša Štrancar: Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo para fret'''

Mitofagija je kataboličen proces razgradnje mitohondrijev s pomočjo encimov v lizosomih, pri čemer se neuporabni deli mitohondrija razgradijo in reciklirajo. Da bi tak proces lahko opazovali in ga podrobno preučili, so znanstveniki v eksperimentu ob raziskovanju mitofagije uporabili eno novejših metod za prikaz celičnih procesov v živih celicah, par FRET, ki temelji na visoki vezavni afiniteti med dvema sintetičnima molekulama (kromoforoma) CB[7]-Cy3 in AdA-Cy5. Konfokalna laserska skenirna mikroskopija je pokazala, da sta bili molekuli CB[7]-Cy3 in AdA-Cy5 najprej intracelularno ločeni in zbrani v mitohondriju oz. lizosomu, nato pa sta po združitvi lizosoma in mitohondrija tvorili kompleks gost-gostitelj, prikazan kot fluorescenčni signal para FRET, ki ga človeško oko ob opazovanju na mikroskopu lahko zazna. Ta ugotovitev pa ni prikazala le zelo stabilne vezi med CB[7] in AdA v živi celici, temveč je potrdila tudi, da par FRET lahko prikaže dinamične procese spajanja celičnih organelov v mitofagiji. Kompleks, ki ga tvorita zgoraj navedeni molekuli, prav tako ni citotoksičen, zato je zelo uporaben za raziskovanje procesa mitofagije, nadaljno pa tudi procesov avtofagije v drugih celičnih organelih.

'''Neža Žerjav: Dodajanje enega samega nukleotida omejuje aktivnost človeške telomeraze'''

Telomeraza je vrsta DNA-polimeraze, ki na konce kromosomov dodaja nukleotidna zaporedja (GGTTAG) ob pomoči matrične RNA. Procesivni katabolni cikel telomeraze sestavljajo translokacija matrice, dodajanje prvega nukleotida in dodajanje preostalih petih nukleotdov. Zanimanje znanstvenikov je vzbudila zaradi počasnega delovanja v primerjavi z ostalimi DNA-polimerazami. Za pojasnitev mehanizma, ki omejuje njeno delovanje, so znanstveniki raziskovali vpliv prekinitvenega signala matrične RNA na visoko Michaelisovo konstanto prvega nukleotida, odvisnost procesivnosti in hitrosti telomeraze v odvisnosti od koncentracije dGTP, vpliv spremenjenega prvega nukleotida in posledice odstranitve prekinitvenega signala. Prišli so do zaključka, da prekinitveni signal povzroča počasnejše dodajanje prvega nukleotida v telomerno zaporedje, kar zmanjša procesivnost in hitrost telomeraze, ki pa ju lahko lahko povečano s povečano koncentracijo ustreznega deoksinukleozid fosfata.

'''Aljaž Bratina: Intrinzična destabilizacija ribosoma'''

Sinteza proteinov v celici poteka na ribosomih, ki so sestavljeni iz dveh podenot. Med prevajanjem RNA (translacija) se genski zapis pretvori v zaporedje aminokislin, ki se zvijejo v protein. Polipeptidno verigo, ki nastaja na ribosomu, in je vezana na tRNA, imenujemo nascenti polipeptid. Hitrost translacije ni vedno enaka in je podvržena mnogim anomalijam. Včasih se od ribosoma predčasno odcepi tRNA z vezanim nascentnim polipeptidom, lahko pa določeno zaporedje v nascentnem polipeptidu celo povzroči disociacijo ribosoma na dve podenoti in s tem prekine sintezo proteina. To imenujemo intrinzična destabilizacija ribosoma (IRD). IRD-inducirajoče zaporedje je ponavadi sestavljeno iz negativno nabitih aminokislin (aspartata in glutamata) ali prolina v različnih kombinacijah. Ugotovljeno je bilo, da nekatera zaporedja povzročajo IRD le in vitro, druga pa tudi in vivo. To pomeni, da ribosom vsebuje nek mehanizem, ki IRD zavira. To je protein bL31, ki povezuje podenoti ribosoma in s tem stabilizira ribosom. Celica IRD izkorišča tudi za nadzorovanje koncentracije magnezijevih ionov. Večja kot je ta koncentracija, manj proteina MgtA (prenašalec Mg2+) se bo tvorilo. Pomembno vlogo pri tem razmerju ima MgtL, polipeptid, ki je kodiran tik pred MgtA, in vsebuje IRD zaporedje. IRD je raziskana le na prokariontskih organizmih, vendar je možno, da je ta proces prisoten tudi v evkariontih.

TBK2017 Povzetki seminarjev

2018-04-03T21:59:07Z

Aljaž Bratina: /* Ana Scott: Naslov seminarja */

[[TBK2017-seminar|Nazaj na osnovno stran]]
===Ana Scott: Naslov seminarja===
Tekst ....

'''Uroš Prešern: Nukleaza, ki povzroči partanatos oziroma od PARP-1 odvisno celično smrt'''

Partanatos je ena izmed vrst celične smrti, ki nastopi zaradi prevelike aktivnosti poli(ADP-riboza) polimeraze 1 (PARP-1) v jedru. Pogost je v primeru možganske kapi, infarkta in nevrodegenerativnih boleznih, zaradi česar bi boljše poznavanje samega procesa omogočilo razvoj novih načinov zdravljenja teh obolenj. V predhodnih raziskavah so ugotovili, da partanatos nastopi, ko molekule poli-ADP-riboze, ki jih PARP-1 sintetizira, preidejo iz jedra v citosol, kjer aktivirajo premestitev indukcijskega faktorja apoptoze (AIF) iz mitohondrijev v jedro. Temu sledi razrez DNA. Nukleaza, ki povzroči razrez DNA, je bila do nedavnega manjkajoči člen v partanatosu. Skupini raziskovalcev je uspelo odkriti, da je iskana nukleaza inhibitorni dejavnik migracije makrofagov (MIF). Pokazali so, da se med partanatosom MIF veže na AIF in se skupaj z njim premesti v jedro, kjer povzroči fragmentacijo DNA. Inhibicija nukleazne aktivnosti MIF se je v modelu možganske kapi pri miših odrazila v 75-odstotnem zmanjšanju volumna prizadetega tkiva, pospešeno pa je bilo tudi okrevanje. Rezultati raziskave odpirajo potencialne možnosti za zdravljenje akutnih in kroničnih nevroloških bolezni, v katerih nastopi partanatos.

'''Doroteja Armič: Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR'''

Pluripotentne matične celice so še nediferencirane celice, ki imajo sposobnost, da se diferencirajo v skoraj vse tipe celic. Poznamo več vrst pluripotentnih matičnih celic. Ene izmed njih so inducirane pluripotentne matične celice (celice iPS). To so pluripotentne celice, ki jih umetno dediferencirajo iz odraslih somatskih celic. Leta 2006 so odkrili postopek pridobivanja celic iPS iz mišjih fibroblastov. Ugotovili so, da so za reprogramiranje somatskih celic najpomembnejši štirje transkripcijski dejavniki, in sicer Oct4, Sox2, Klf4 in c-Myc. Letos pa je skupini znanstvenikov uspelo odkriti nov, bolj enostaven postopek pridobivanja celic iPS. Ugotovili so namreč, da lahko sprožijo njihov nastanek že z aktivacijo enega samega gena – Oct4 ali Sox2. Aktivacija Sox2-promotorja oziroma Oct4-promotorja in Oct4-ojačevalca hkrati pa nato povzroči aktivacijo ostalih genov, ki sodelujejo pri vzpostavitvi pluripotentnosti v celicah. Za aktivacijo genov so uporabili tehnologijo CRISPR. Primerjali so uporabo dveh sistemov – dCas9-SunTag-VP64 in dCas9-SunTag-p300core. V obeh primerih so dobili primerljive rezultate. Uporaba celic iPS je pomembna v regenerativni medicini, saj lahko zamenja uporabo človeških embrionalnih matičnih celic. Z uporabo celic iPS, generiranih iz pacientovih lastnih celic, ne bi prišlo do zavrnitvenih reakcij, prav tako pa bi se izognili etičnih pomislekov. Znanstveniki predvidevajo, da lahko tehnologija reprogramiranja celic, ki so jo uporabili na mišjih celicah, z manjšimi spremembami deluje tudi na človeških celicah.

'''Dea Simonič: Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu'''

Avtoimunska bolezen je bolezen, ki nastane zaradi pretiranega odziva imunskega sistema na celice, ki so last organizma. Veliko vlogo pri nastanku avtoimunske bolezni imajo limfociti B, ki omogočajo humoralni imunski odziv. Transkripcijski faktor T-bet v limfocitih B povzroči razvoj ABC, te celice so pa »pogon« avtoimunske bolezni. Avtoimunska bolezen se v veliki večini primerov razširi po telesu . Vzrok tega so ravno limfociti B, ki razširijo svoj napad po telesu in pride do širjenja epitopa. Ta proces se začne, ko imunski sistem napade antigene na drugih delih telesa, ki jih na začetku ni hotel uničiti. Telo začne pospeševano uničevati lastna tkiva. Da bi razumeli, zakaj pride do tega mehanizma so raziskovalci uporabili fluorescenčne markerje beljakovin, ki razlikujejo različne celične skupke limfocitov B (oziroma germinalne centre), na miših obolelih z lupusom. V germinalnih centrih limfociti B »tekmujejo« med sabo, kateri bo naredil najboljše protitelo, ki bo nevtraliziralo zaznano grožnjo. Te germinalne skupke so s pomočjo markerjev zaznali kot 10 različnih barv. Po tednu ali dveh začne prevladovati ena sama barva. Ta germinalni skupek je ustvaril najboljše protitelo in skupaj z ostalimi limfociti aktiviral avtoimunski protinapad. S to študijo so raziskovalci naredili velik korak v smer zaustavitve oziroma zdravljenja avtoimunske bolezni.

'''Valeriya Musina: Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke'''

Uničenje mitohondrijev je eden najbolj obetavnih pristopov pri razvoju novih zdravil proti raku. Znanstveniki so sintetizirali peptid, ki vsebuje baker, ki ga zlahka sprejmejo mitohondriji v matičnih celicah raka dojk, kjer le ta učinkovito povzroča apoptozo. Rakaste celice, ki imajo povečani metabolizem, ne samo, da vsebujejo več mitohondrijev kot zdrave celice, temveč so te tudi drugačni, strukturno in funkcionalno. Zaradi posebnih značilnosti in njihove odločilne vloge v presnovi celic so maligne mitohondrije pomembne tarčej za nove terapevtske spojine. Mitohondrije je možno uničiti z uvajanjem sredstev za proizvajanje reaktivnih vrst kisika (ROS). Te reaktivne spojine ovirajo metabolizem mitohondrijev. Kot močan ROS generator je bila predlagana organokovinska spojina bakrov(II) fenantrolin. Za dostavo in prenos skozi zunanjo membrano mitohondrija pa so bakrov(II) fenantrolin vezali na specifičen peptid, ki prodira v mitohondrije. Preizkusi so bili izvedeni z dvema celicnima linijama raka dojke, ena celična linija je vsebovala matične celice raka dojk. Rezultati so bili : odvisna od količine odmerka izguba sposobnosti za preživetje, razpad membran mitohondrijev, nastanek ROS in slabši metabolizma mitohondrijev. Zdravilo je bolj vplivalo na matične celice raka, kar je bilo razloženo z večjo vsebnostjo mitohondrijev. Ta študija izpostavlja potencial metalopeptida tako za dostavo kot tudi za uničenje mitohondrijev, zlasti v matičnih celicah raka.

'''Neža Štremfelj: Delovanje inzulinskih receptorjev'''

Človeški inzulinski receptorji igrajo pomembno vlogo v človeškem telesu. Signalizacija z inzulinskimi receptorji igra ključno vlogo pri regulaciji metabolizma in pri rasti v večceličnih organizmih. Nepravilno delovanje inzulinskih receptorjev je povezano z mnogimi hujšimi obolenji, na primer z rakavim obolenjem, diabetesom in Alzheimerjevo boleznijo.
Glavna ideja raziskave, ki jo opisuje članek, ki sem si ga izbrala za osnovo moje seminarske naloge je, da vezava inzulina na inzulinski receptor preoblikuje zunajcelični del transmembranskih proteinov (ektodomeno) receptorja iz U-konformacije v T-konformacijo. Prerazporeditev v ektodomeni se razširi tudi na transmembranske domene, ki so, ko je receptor neaktiviran pomaknjene narazen, ob vezavi inzulina pa se pomaknejo skupaj, kar omogoči fosforilizacijo tirozin kinaze v citoplazmi. Pri transmembranski signalizaciji z inzulinskim receptorjem poleg dimerizacije z vezavo liganda pride tudi do strukturnih sprememb znotraj receptorskega dimera.

'''Marko Pavleković: Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado'''

Multipla skleroza je avtoimunska bolezen, pri kateri limfociti napadejo živčne celice in jih demielinizirajo ter tako škodujejo prenosu signalov med nevroni. Iz predhodnih raziskav so odkrili, da sta za multiplo sklerozo najbolj krivi celiti pomagalki T 1 in T 17. Da bi prišli do centralnega živčnega sistema morata celici najprej prečkati vaskularno pregrado. Kako to dosežeta so raziskovali znanstveniki z univerze v Kolumbiji in z univerze v Kaliforniji. Z dvo-fotonsko mikroskopijo so opazovali tesne stike pri miših obolelih za eksperimentalnim avtoimunskim encefalomielitisom, ki je živalski primer multiple skleroze. Ugotovili so, da krvno-možgansko pregrado preideta na dva različna načina: s transcitozo in skozi prekinjene tesne stike med endotelnimi celicami. S pomočjo miši, ki jim je primanjkovalo kaveol (kaveolina1) pa so dokazali, da za prehod do centralnega živčnega sistema celica T 1 izkorišča transcitozo, medtem ko celica T 17 prehaja skozi prekinjene tesne stike. Te ugotovitve bi lahko močno pomagale pri nadaljnjem zdravljenju bolezni, kjer bi se osredotočili na preprečevanje dostopa imunskih celic do centralnega živčnega sistema.

'''Rebeka Dajčman: več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija'''

Kalcij igra ključno vlogo pri skoraj vseh procesih v celici. Razni signali, kot je na primer sinteza RNA in DNA ali pa migracija celic, je posledica spremembe intracelularne koncentracije kalcija. Spremembo koncentracije lahko zaznamo z merjenjem intenzivnosti fluorescentne svetlobe, ki jo oddajajo GCaMP proteini. Če celice poškodujemo z laserskim mehurčkom, ustvarimo rano, ki je podobna udarcu. Sledijo trije mehanizmi signaliziranja, ki so odvisni od velikosti rane. Takoj po poškodbi celične membrane uide kalcij iz ekstracelularne tekočine v citosol, kjer se koncentracija kalcija dvigne. Kalcij nato skupaj s signalnimi molekulami difundira v okoliške celice in temu pravimo prvi val oz. takojšnji odziv. Po 45 sekundah mu sledi drugi močnejši valj, ki pa se širi počasneje, ker skozi membrano prehajajo večji signalni proteini. Ti signali sprožijo sistemski odziv na poškodbo, ki poskrbi, da se celice v najkrajšem možnem času regenerirajo. Da pri regeneraciji povrhnjice kože ne nastanejo brazgotine poskušamo v tkivo, ki je bilo poškodovano, vstaviti lasne mešičke. Ti pripomorejo k nastajanju maščobe in tako preprečijo brazgotinjenje. Če se poškoduje žilna stena pa sistem poskrbi za nastanek strdkov, ki so sestavljeni iz krvnih celic in fibrina. Trombociti navijejo fibrin v toge zvitke in ti se s pomočjo posebnih encimov raztopijo v krvi. Nova odkritja o celičnemu celjenju pripomorejo k hitrejšemu in učinkovitejšemu celjenju ran.

'''Gašper Anton Komatar: Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri vorbi spomina'''

LTP ali dolgoročna potenciacija pomeni povečanje sinaptične moči za dolgo časa in ker gre pri tvorbi spominov prav za povečanje sinaptične aktivnosti, je med znanstveniki priznan kot najverjetnejši model učenja in tvorbe spomina na celični ravni. Med LTP se poveča število receptorjev AMPA v postsinaptični membrani, kar še dodatno poveča sinaptično moč.
Kakšen je mehanizem in katere molekule sodelujejo pri prenosu in vgradnji AMPAR v postsinaptično membrano, to je bilo glavno vprašanje raziskovalcev v članku, ki sem si ga izbral za seminarsko nalogo. Že dlje časa je bilo znano, da ephirinB2, ApoER2 in Reelin sodelujejo pri razvoju možganov kot regulatorji migracije nevronov. Znanstveniki so preverili, če sodelujejo tudi pri procesih prenosa in vgradnje AMPAR v membrano. S tehniko knockout (inaktivacija določenih genov) ter z imunoprecepcijo, so selektivno inhibirali interakcije med proteini, rezultate pa so beležili s fluorescentnimi analizami in prenosom western. Ugotovili so, da tvorba kompleksa multiplih receptorjev ApoER2/ephirinB2/AMPAR in GRIP1 povzroči vgradnjo tega AMPAR na membrano dendrita in sproži signalne kaskade, ki regulirajo vgradnjo novih AMPAR. Ko je bila interakcija med temi proteini inhibirana, so bili nevroni nezmožni reagirati na spremembe v njihovem omrežju, kar je zmanjšano sinaptično aktivnost. To pomeni, da skupki teh proteinov vzdržujejo oz. ojačajo sinaptično aktivnost. S tem so znanstveniki dokazali, da zgoraj omenjen kompleks receptorjev zares sodeluje pri tvorbi spominov.

'''Laura Gašperšič: Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2'''

Pri Alzheimerjevi bolezni je glavni simptom okvara spomina, do česar pride zaradi utišanja genov, ki sodelujejo pri tvorbi novih spominov. Do utišanja pride zaradi deacetilacije histonov, ki jo povzročijo encimi histonske deacetilaze (HDAC). Pri utišanju genov za tvorbo spominov je najpomembnejši HDAC2. Njegova raven je pri bolnikih z Alzheimerjevo boleznijo povišana. Encimi HDAC so si po zgradbi podobni, poleg tega tvori en encim več različnih kompleksov, kar lahko pri inhibiciji encimov HDAC sproži tudi stranske učinke. Raziskovalci so zato želeli najti molekulo, s katero se HDAC2 veže na promotorje genov za učenje in spomin. S prvimi raziskavami so določili 3 najbolj verjetne proteine: Tdp2, Sap30 in Sp3, z meritvami pa so ugotovili, da Sp3 vpliva na delovanje sinapse. V nadaljnjih raziskavah so dokazali, da kompleks med HDAC2 in Sp3 v bolezenskem stanju z vezavo na promotorje negativno uravnava izražanje genov povezanih z delovanjem sinapse. V zadnjem delu raziskave so želeli določiti del HDAC2, ki se veže na Sp3 in inhibirati nastanek kompleksa med HDAC2 in Sp3. Ugotovili so, da se na Sp3 veže C-konec HDAC2. C-končni fragment HDAC2 se že sam veže na Sp3, s čimer se zmanjša število kompleksov med HDAC2 in Sp3 na promotorjih. Fragment HDAC2 pa se ne veže na druge proteine, s katerimi HDAC nadzorujejo druge pomembne procese. Izražanje C-končnega fragmenta HDAC2 torej predstavlja obetaven način, s katerim bi lahko zdravili nevrološke bolezni povezane z okvarami spomina.

'''Maja Škof: Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje'''

Koronavirusi so razširjeni po vsem svetu in največkrat povzročajo okužbe dihal pri ljudeh in živalih. Spadajo med RNA viruse, za katere je značilna visoka stopnja genskih mutacij, kar jim omogoča, da se uspešno prilagajajo na okolje. S-proteini so trimerni proteini, s katerimi se koronavirusi vežejo na gostiteljsko celico, nato pa sprožijo spojitev virusne in celične membrane, kar omoči, da virusna RNA preide v celico. S-proteini so sestavljeni iz dveh podenot, S1 in S2. Pri vezavi na celični protein sodeluje zunanji del podenote S1, ki je v obliki treh podaljšanih zank (receptorsko-vezavne zanke). Med aminokislinami S-proteina in receptorskega proteina se vzpostavijo medmolekulske vezi, nato pa podenota S2 sproži spojitev s celično membrano. S1 je tudi glavna tarča protiteles, ki preprečujejo virusu, da bi vstopil v celico. A protitelo, ki se uspešno veže na sev virusa, ob ponovni okužbi virusa ne prepozna več. To je posledica naključnih genskih mutacij. Analiza genomov koronavirusov, izoliranih v zadnjih 50-ih letih, je pokazala, da se receptorsko-vezavne zanke S-proteinon med seboj občutno razlikujejo. Kar 73% aminokislin na receptorsko-vezavnih zankah variira. Odstotek je ravno dovolj velik, da se koronavirusi še vedno lahko vežejo na receptor, protitelesa pa jih ne zaznajo več.

'''Tadej Medved: Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3'''

Ključnega pomena za procese, kot so celično gibanje in endocitoza, so aktinski filamenti. Nastanek in prerazporeditev le-teh nadzorujejo določeni proteinski kompleksi; za razvejane aktinske filamente je to Arp2/3. Le-ta je sestavljen iz več podenot; najpomembnejši sta Arp2 in Arp3, ki sta po strukturi podobni aktinu. Na Arp2/3 se vežejo proteini družine WASP, ki spravijo proteinski kompleks v konformacijo, pri kateri lahko dejansko vrši nastanek novih filamentov. Za vse WASP-e velja, da se na Arp2/3 vežejo z odsekom VCA(verprolin, central, acidic), a do podatkov o strukturah takšnih vezi se znanost še ni dokopala. S pomočjo "cross-linking" masne spektrometrije in "reversed phase liquid" kromatografije je pred kratkim nastal model, ki zadovoljivo opisuje mesta, na katera se vežejo WASP-i. Vezava namreč poteka na dveh mestih: na hrbtni strani Arp2/3 in na spodnji strani kompleksa, pri Arp2 in poddomeno ARPC1. Na Arp2/3 se pri WASP-u veže odsek CA, konec odseka V pa ostaja prost za vezavo aktina. Izkazalo se je, da se za uspešno nukleacijo aktina vezavni mesti za aktin in CA ne smeta prekrivati; odsek WASP C pa je še zlasti pomemben za aktivacijo Arp2/3.

'''Tina Zavodnik: Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost'''

Mitohondriji so zelo kompleksni organeli, ki za normalno opravljanje svojih funkcij potrebujejo številne proteine. Večina teh proteinov se sintetizira v citoplazmi, nato pa so uvoženi nazaj v mitohondrije. Ob morebitni okvari transportnih mehanizmov in posledično okvarjenih mitohondrijih pa pride do akumulacije proteinov v citoplazmi, kar poruši celično ravnovesje. Skupina znanstvenikov iz Nemčije in Poljske pa je odkrila mehanizem, ki poškodovanim mitohondrijem omogoča nadzor nad sintezo proteinov z induciranjem reverzibilnih sprememb na translacijskem mehanizmu. Kot signal uporabijo ROS, ki povzroči oksidacijo tiolov na peptidih, ki so sestavni deli translacijskega mehanizma. Do odkritja so prišli s kvantitativno analizo cisteinskih ostankov oz. tiolnih skupin na proteomu kvasovke Saccharomyces cerevisia ter izdelali obsežno zbirko oksidacijskih stanj peptidov, ki so vsebovali tiolne skupine. Analizo so ponovili še na gojenih celicah kvasovke, ki so bile izpostavljene induciranemu oksidativnemu stresu s pomočjo H2O2, ter na mutiranih celicah z disfunkcionalnimi mitohondriji. Pri obojih so zaznali povečano oksidacijo Cys-peptidov in zmanjšano translacijsko aktivnost. Z odstranitvijo stresorskega faktorja pa se je translacijska aktivnost delno do popolnoma obnovila, kar dokazuje, da je oksidacija peptidov, ki so del mehanizmov za sintetiziranje novih proteinov, reverzibilen proces. Cisteinski ostanki torej delujejo kot nekakšni senzorji za ROS in ob oksidativnem stresu inhibirajo sintetiziranje novih proteinov.

'''Tina Kolenc Milavec: Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli'''

Alfa-sinuklein je majhen, v vodi topen protein brez stabilne terciarne strukture, ki ga genetsko in nevropatološko povezujejo s Parkinsonovo boleznijo, o njegovi vlogi pri razvoju bolezni pa še marsikaj ni znano. Nahaja se predvsem v živčnih končičih, kjer je ravnovesje med α-sinukleinom raztopljenim v citosolu in tistim vezanim na fosfolipidni dvosloj močno regulirano. Ker se α-sinuklein nahaja na območju, kjer koncentracija kalcija ves čas močno niha, so raziskovalci Lautenschläger ''et al.'' predpostavili, da je normalna fiziološka funkcija α-sinukleina odvisna od kalcija. Da bi bolje razumeli funkcijo tega proteina, so v raziskavi izvedli več ''ex vivo'' ter ''in vitro'' eksperimentov, s katerimi so skušali ugotoviti predvsem to, kako se α-sinuklein veže na membrano sinaptičnega vezikla ter kako koncentraciji kalcija in α-sinukleina vplivata na homeostazo sinaptičnih veziklov ter na združevanje α-sinukleina v fibrilarne skupke. Povečana koncentracija kalcija in/ali α-sinukleina namreč pod določenimi pogoji povzroča toksičnost in posledično celično smrt, saj α-sinuklein oligomerizira ter tvori dolge in debele netopne fibrile, ki so del Lewyjevih telesc – citoplazemskih vključkov, značilnih za Parkinsonovo bolezen. Iz medicinskega stališča pa je zanimiva ugotovitev, da isradipin (antagonist kalicevih kanalčkov) preprečuje fibrilizacijo, saj znižuje znotrajcelično koncentracijo kalcija, kar odpira nove možnosti za razvoj zdravil proti Parkinsonovi bolezni.

'''Anže Šumah: Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53'''

Protein p53 je tumorski zatiralec (tumor supresor), ki je zaradi svoje nadvse pomembne vloge pri ohranjanju celovitosti celičnega genoma pogosto deležen naziva »varuh genoma«. V normalnih primerih je izražanje tega proteina na nizki ravni, v primeru celičnega stresa pa deluje kot prepisovalni dejavnik, ki uravnava izražanje genov, ki so vključeni v nadzor celičnega cikla, popravljanje DNA in apoptozo. Ugotovili so, da je okoli 50 % vseh človeških oblik raka povezanih z mutacijami gena TP53 (gena za sintezo p53), zato so v raziskavi želeli razviti genski senzor, ki bi bil sposoben uničiti celice, ki ne sintetizirajo p53 (so rakave). Na podlagi promotorjev, ki jih p53 kot prepisovalni dejavnik zavira ali aktivira, so razvili senzor, ki v primeru pomanjkanja p53 sintetizira protein »Herpes simplex virus thymidine kinase« (HSV-TK), preko katerega lahko z zdravilom Ganciclovir uničimo rakasto celico, ki je brez p53. V primeru, da je p53 prisoten (je celica »zdrava«), pa je sinteza HSV-TK zavirana preko različnih mehanizmov. Senzor so najprej testirali na celični kulturi HCT116 (rakaste človeške črevesne celice) s fluorescentnima proteinskima markerjema, nato pa še v živih organizmih, in sicer golih miših brez imunosti. Tako so dokazali tako in vitro kot tudi in vivo uporabnost izdelanega genskega senzorja, ki bi ga bilo mogoče uporabiti v terapevtske namene.

'''Liza Praznik: Vpliv šaperonov Skp in SurA na zvijanje izvenmembranskih proteinov FhuA v terciarno strukturo'''

Naloga posebne vrste proteinov, imenovanih šaperoni je, da preoblikujejo polipeptidne verige v terciarno strukturo, v kateri so ti zmožni aktivnega delovanja. Delovanje in odzivanje šaperonov na različne dejavnike je še dokaj neznano, zato je skupina znanstvenikov Univerze v Baslu raziskovalo šaperona Skp in SurA, holdaz, ki delujeta na protein FhuA. Ta se nahaja na zunanji membrani gram negativnih bakterij, kjer služi kot receptor za ferikrom in tvori obliko beta-sodčka. Z večkratnimi ponovitvami poskusov so ugotovili, da se v prisotnosti obeh šaperonov struktura proteina, vgrajenega v membrano, ne podere, če jo delno razvijemo, ne glede na to, do katere stopnje. Šaperona sta obenem zmožna delno razvit protein preoblikovati nazaj v funkcionalno obliko, ki omogoča ponovno delovanje v membrani. Naloga obeh šaperonov je, da zadržujeta zvit polipeptid v dinamični, termodinamsko najugodnejši konformaciji, s katero se posamezni beta-zavoji polipeptida lahko vstavljajo v membrano. Ugotovljeno pa je bilo, da je šaperon SurA pri tem znatno učinkovitejši. Rezultati raziskave omogočajo boljši vpogled v mehanizme delovanja šaperonov in nakazujejo, kako pomembni so za učinkovito delovanje proteinov.

'''Urša Štrancar: Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo para fret'''

Mitofagija je kataboličen proces razgradnje mitohondrijev s pomočjo encimov v lizosomih, pri čemer se neuporabni deli mitohondrija razgradijo in reciklirajo. Da bi tak proces lahko opazovali in ga podrobno preučili, so znanstveniki v eksperimentu ob raziskovanju mitofagije uporabili eno novejših metod za prikaz celičnih procesov v živih celicah, par FRET, ki temelji na visoki vezavni afiniteti med dvema sintetičnima molekulama (kromoforoma) CB[7]-Cy3 in AdA-Cy5. Konfokalna laserska skenirna mikroskopija je pokazala, da sta bili molekuli CB[7]-Cy3 in AdA-Cy5 najprej intracelularno ločeni in zbrani v mitohondriju oz. lizosomu, nato pa sta po združitvi lizosoma in mitohondrija tvorili kompleks gost-gostitelj, prikazan kot fluorescenčni signal para FRET, ki ga človeško oko ob opazovanju na mikroskopu lahko zazna. Ta ugotovitev pa ni prikazala le zelo stabilne vezi med CB[7] in AdA v živi celici, temveč je potrdila tudi, da par FRET lahko prikaže dinamične procese spajanja celičnih organelov v mitofagiji. Kompleks, ki ga tvorita zgoraj navedeni molekuli, prav tako ni citotoksičen, zato je zelo uporaben za raziskovanje procesa mitofagije, nadaljno pa tudi procesov avtofagije v drugih celičnih organelih.

'''Neža Žerjav: Dodajanje enega samega nukleotida omejuje aktivnost človeške telomeraze'''

Telomeraza je vrsta DNA-polimeraze, ki na konce kromosomov dodaja nukleotidna zaporedja (GGTTAG) ob pomoči matrične RNA. Procesivni katabolni cikel telomeraze sestavljajo translokacija matrice, dodajanje prvega nukleotida in dodajanje preostalih petih nukleotdov. Zanimanje znanstvenikov je vzbudila zaradi počasnega delovanja v primerjavi z ostalimi DNA-polimerazami. Za pojasnitev mehanizma, ki omejuje njeno delovanje, so znanstveniki raziskovali vpliv prekinitvenega signala matrične RNA na visoko Michaelisovo konstanto prvega nukleotida, odvisnost procesivnosti in hitrosti telomeraze v odvisnosti od koncentracije dGTP, vpliv spremenjenega prvega nukleotida in posledice odstranitve prekinitvenega signala. Prišli so do zaključka, da prekinitveni signal povzroča počasnejše dodajanje prvega nukleotida v telomerno zaporedje, kar zmanjša procesivnost in hitrost telomeraze, ki pa ju lahko lahko povečano s povečano koncentracijo ustreznega deoksinukleozid fosfata.

'''Aljaž Bratina: Intrinzična destabilizacija ribosoma'''
Sinteza proteinov v celici poteka na ribosomih, ki so sestavljeni iz dveh podenot. Med prevajanjem RNA (translacija) se genski zapis pretvori v zaporedje aminokislin, ki se zvijejo v protein. Polipeptidno verigo, ki nastaja na ribosomu, in je vezana na tRNA, imenujemo nascenti polipeptid. Hitrost translacije ni vedno enaka in je podvržena mnogim anomalijam. Včasih se od ribosoma predčasno odcepi tRNA z vezanim nascentnim polipeptidom, lahko pa določeno zaporedje v nascentnem polipeptidu celo povzroči disociacijo ribosoma na dve podenoti in s tem prekine sintezo proteina. To imenujemo intrinzična destabilizacija ribosoma (IRD). IRD-inducirajoče zaporedje je ponavadi sestavljeno iz negativno nabitih aminokislin (aspartata in glutamata) ali prolina v različnih kombinacijah. Ugotovljeno je bilo, da nekatera zaporedja povzročajo IRD le in vitro, druga pa tudi in vivo. To pomeni, da ribosom vsebuje nek mehanizem, ki IRD zavira. To je protein bL31, ki povezuje podenoti ribosoma in s tem stabilizira ribosom. Celica IRD izkorišča tudi za nadzorovanje koncentracije magnezijevih ionov. Večja kot je ta koncentracija, manj proteina MgtA (prenašalec Mg2+) se bo tvorilo. Pomembno vlogo pri tem razmerju ima MgtL, polipeptid, ki je kodiran tik pred MgtA, in vsebuje IRD zaporedje. IRD je raziskana le na prokariontskih organizmih, vendar je možno, da je ta proces prisoten tudi v evkariontih.

TBK2018-seminar

2018-03-20T16:54:52Z

Aljaž Bratina: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Doroteja Armič || Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180118162449.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Martina Lokar || Liza Ulčakar || Zoja Siter
|-
| Valeriya Musina || Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171213124751.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Nika Boštic || Tiana Karmen Kokalj || Aljaž Bratina
|-
| Dea Simonič || Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170824141207.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Sumeja Kudelić || Jernej Imperl || Anamarija Agnič
|-
| Neža Štremfelj ||Delovanje inzulinskih receptorjev||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103256.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Luka Gnidovec || Matija Ruparčič || Simona Gorgievska
|-
| Gašper Komatar || Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri tvorbi spomina || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171009093207.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Lara Hrvatin || Tiana Karmen Kokalj || Matej Jereb
|-
| Marko Pavleković || Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171121155811.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Klementina Polanec || Meta Kodrič || Lara Drinovec
|-
| Laura Gašperšič || Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170808150001.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Karmen Mlinar || Ana Menegalija || Maks Kumek
|-
| Rebeka Dajčman || Več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171003124646.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Ula Nikolaja Ratajec || Andreja Marija Belič || Neža Blaznik
|-
| Maja Škof || Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje. || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171127105937.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Doroteja Armič || Barbara Jaklič || Liza Ulčakar
|-
| Tina Kolenc Milavec || Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219071758.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Valeriya Musina || Eva Gartner || Jana Rajchevska
|-
| Tina Zavodnik || Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180202112629.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Dea Simonič || Martina Lokar || Jernej Imperl
|-
| Tadej Medved || Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180305130632.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Neža Štremfelj || Nika Boštic || Matija Ruparčič
|-
| Bogdan Jovićević || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Laura Gašperšič || Lara Hrvatin || Ana Menegalija
|-
| Polona Kalan || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180214111055.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Rebeka Dajčman || Klementina Polanec || Andreja Marija Belič
|-
| Liza Praznik || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2015/09/150907113757.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Maja Škof || Karmen Mlinar || Barbara Jaklič
|-
| Anže Šumah || Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171114104201.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Tina Kolenc Milavec || Ula Nikolaja Ratajec || Eva Gartner
|-
| Neža Žerjav|| ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180227142114.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tina Zavodnik || Doroteja Armič || Martina Lokar
|-
| Urša Štrancar || Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo supermolekularnega para FRET || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103254.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tadej Medved || Valeriya Musina || Nika Boštic
|-
| Zoja Siter || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Neža Žerjav || Dea Simonič || Sumeja Kudelić
|-
| Aljaž Bratina || || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171120101314.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Anastasija Nechevska || Neža Štremfelj || Luka Gnidovec
|-
| Anamarija Agnič || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Bogdan Jovićević || Sumeja Kudelić || Lara Hrvatin
|-
| Simona Gorgievska || Optical tools to detect metabolic changes linked to disease || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180307161351.htm|| 10.04. || 13.04. || 16.04. || Polona Kalan || Marko Pavleković || Klementina Polanec
|-
| Matej Jereb || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Liza Praznik || Laura Gašperšič || Karmen Mlinar
|-
| Lara Drinovec || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Anže Šumah || Rebeka Dajčman || Ula Nikolaja Ratajec
|-
| Maks Kumek || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Marko Pavleković || Maja Škof || Doroteja Armič
|-
| Neža Blaznik || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Urša Štrancar || Tina Kolenc Milavec || Valeriya Musina
|-
| Liza Ulčakar || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171129163851.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Zoja Siter || Tina Zavodnik || Dea Simonič
|-
| Anastasija Nechevska || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Aljaž Bratina || Tadej Medved || Neža Štremfelj
|-
| Jernej Imperl || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Anamarija Agnič || Neža Žerjav || Luka Gnidovec
|-
| Matija Ruparčič || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Simona Gorgievska || Anastasija Nechevska || Marko Pavleković
|-
| Tiana Karmen Kokalj || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Matej Jereb || Bogdan Jovićević || Laura Gašperšič
|-
| Meta Kodrič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180125101321.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Lara Drinovec || Polona Kalan || Rebeka Dajčman
|-
| Ana Menegalija || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Maks Kumek || Liza Praznik || Maja Škof
|-
| Andreja Marija Belič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Neža Blaznik || Anže Šumah || Tina Kolenc Milavec
|-
| Barbara Jaklič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Liza Ulčakar || Meta Kodrič || Tina Zavodnik
|-
| Eva Gartner || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Gašper Komatar || Urša Štrancar || Tadej Medved
|-
| Martina Lokar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180301144138.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Jernej Imperl || Zoja Siter || Neža Žerjav
|-
| Nika Boštic || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Matija Ruparčič || Aljaž Bratina || Anastasija Nechevska
|-
| Sumeja Kudelić ||Toksin botulin "preskočil" v novo vrsto bakterije ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180126122856.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Tiana Karmen Kokalj || Anamarija Agnič || Bogdan Jovićević
|-
| Luka Gnidovec || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Meta Kodrič || Simona Gorgievska || Polona Kalan
|-
| Lara Hrvatin || Mg2+ ioni omogočajo kondenzacijo kromosomov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180201104559.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Ana Menegalija || Matej Jereb || Liza Praznik
|-
| Klementina Polanec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Andreja Marija Belič || Lara Drinovec || Anže Šumah
|-
| Karmen Mlinar || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Barbara Jaklič || Maks Kumek || Gašper Komatar
|-
| Ula Nikolaja Ratajec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Eva Gartner || Neža Blaznik || Urša Štrancar
|-
| rezerva || || || 29.05. || 01.06. || 04.06. || || ||
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2018_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2018_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2018_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2018_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2018_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.