Wiki FKKT - User contributions [en]

Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin

2024-05-06T13:44:55Z

Alliana Kolar: /* Izbira operatorja */

Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s00299-023-03100-y Development of new binary expression systems for plant synthetic biology]

==Uvod==

Rastline imajo velik pomen v biotehnologiji, saj se z njimi ukvarjajo raziskave, povezane s prehransko varnostjo, prilagajanje vremenskim spremembam, razvoj fitosenzorjev in celo z razvojem cepiv ter zdravil. Na žalost pa rastlinska biotehnologija že več desetletij ohranja standarden pristop k prekomernem izražanju transgenov s konstitutivnimi promotorji. Zato so se v tem članku osredotočili na razvoj novega, modernejšega pristopa k prekomernem izražanju transgenov v rastlinah. Odločili so se, da bodo z ustvarjanjem konstruktov, ki so jih pridobili iz gruče genov mlc, razvili zapis za nov sintetičen mlcR, ki deluje kot aktivator transkripcije. Ta gruča genov je v glivi Penicillium citrinum odgovorna za biosintezo kompaktina [1].

===Kompaktin===

Kompaktin je znan tudi pod imenom Mevastatin ali ML-236B, spada pa v razred statinov, saj znižuje nivo holesterola v krvi. Njegova biokemijska vloga je kot kompetitivni inhibitor (HMG)-CoA reduktaze – encim, ki regulira biosintezo holesterola. V 38 kilobazno gručo genov, ki sodeluje v biosintezi kompaktina v P. citrinum, spadajo geni mlcA-H in mlcR [1, 2]. Protein MlcR deluje kot transkripcijski faktor oziroma aktivator, sestavljen je iz DNA-vezavne domene in aktivacijske domene. Specifično se veže na operator dolg 14 baznih parov, ki se nahaja med genoma mlcA in mlcC. Njegova vezava povzroči večje izražanje gena mlcA v primerjavi z mlcC (transkripcija poteka v nasprotnih smereh). Se pravi, več prisotnega MlcR povzroči večje količine kompaktina [1].

===Binarni ekspresijski sistem===

Standarden pristop za prekomerno izražanje transgena v rastlinah vključuje klasično uporabljanje konstitutivnega promotorja. Za natančnejše in bolj regulirano izražanje genov se lahko poslužimo binarnega ekspresijskega sistema. Ta je praviloma sestavljen iz dveh komponent: en del vključuje transkripcijski faktor, drugi del pa operator, kamor se veže ta transkripcijski faktor in povzroča izražanje želenega gena. Najbolj znan binarni ekspresijski sistem je UAS/GAL4 [1]. Tega se sicer najpogosteje uporablja pri izražanju genov v Drosophili melanogaster. UAS (angl. upstream activating sequence) je zaporedje, ki je zapisano tik prej promotorjem za gen, ki ga želimo izražati, GAL4 pa transkripcijski faktor iz kvasovk. Ob vezavi GAL4 na UAS pride do aktivacije izražanja tarčnega gena. Ta sistem omogoča veliko fleksibilnost, saj lahko izražamo katerikoli želeni gen, poleg tega pa nam omogoča tkivno specifično izražanje in enostavno vklapljanje oziroma izklapljanje celotnega sistema transkripcije. Prav tako omogoča izražanje gena ne glede na stopnjo razvoja organizma [3].

==Cilj==

Cilj raziskave je bil, da bi biološko sintetizirali ustrezen transkripcijski faktor, ki bi ga bilo moč uporabiti pri aktivaciji izražanja genov v rastlinah. Najprej so sintetizirali dva zapisa za protein MlcR, vsak pa je pred sabo imel različen lasten operator (en od mlcA in en od mlcC), za sabo pa zapis za GFP, s katerim bi neposredno določili, kateri zapis je imel najvišji nivo izražanja po vstavljanju v Nicotiana benthamiana. Te z najvišjim nivojem izražanja so hoteli še dodatno izboljšati tako, da so ustvarili več variant sintetičnega transkripcijskega faktorja, kjer je bila spremenjena le aktivacijska domena. Za konec so želeli na transkripcijskem nivoju iz več vidikov določiti, kateri sestavljen konstrukt bi najbolj ustrezal za nov sintetični transkripcijski faktor, ki bi deloval kot aktivator transkripcije [1].

==Rezultati==

===Izbira operatorja===

V prvem koraku so se lotili izbire operatorjev, pri katerih bodo zaznali največjo aktivnost transkripcije. Sestavili so 8 različnih kombinacij konstruktov, kjer sta vsakega od dveh transkripcijskih faktorjev (zapis za nativni MlcR in zapis za DNA-vezavno domeno MlcR z eno od sintetiziranih aktivacijskih domen, VP16) koeskpresirali s štirimi različnimi operatorji genov mlcA oziroma mlcC, kjer sta se dva enaka zapisa razlikovala po številu njunih ponovitev operatorskih zaporedij (1× mlcA, 4× mlcA, 1× mlcC in 4× mlcC). Vsak konstrukt je za vsemi temi zapisi imel še zapis za protein GFP, ki je služil kot reporterski gen. Sestavili so še 4 kontrolne konstrukte, ki so vsebovali samo reporterski del, se pravi brez dela s transkripcijskim faktorjem. Konstrukte so vstavili v vektor in jih infiltrirali v N. benthamiana. 72 ur pozneje so izmerili fluorescenco, kjer se je izkazalo, da je največji signal v primerjavi z kontrolnimi konstrukti dal konstrukt 4×mlcA-VP16, signal je bil dvakrat večji od kontrole. Zato so za nadaljnje poskuse uporabljali operator 4× mlcA [1].

===Izbira zapisa za aktivacijsko domeno===

V naslednji stopnji so želeli ugotoviti, katera aktivacijska domena bi lahko povzročila največjo transkripcijsko aktivnost. Sestavili so 5 konstruktov, kamor so vstavili 5 različnih aktivacijskih domen (VP16, VP64, VP128, TV in QF), za njimi je bil operator 4× mlcA in zapis za GFP. Za vsakega so imeli še kontrolni konstrukt brez zapisa za transkripcijski faktor. Vse te konstrukte so zopet vstavili v vektor in infiltrirali v N. benthamiana. Po istem postopku kot v prejšnjem eksperimentu so tudi tukaj merili fluorescenco in ugotovili, da je največji signal dal konstrukt z aktivacijsko domeno QF, in sicer aktivnost izražanja je bila 6-krat večja v primerjavi z kontrolo [1].

===Validacija aktivnosti v transgenski rastlini===

Da bi preverili, ali so zasnovani transkripcijski faktorji in promotorji transkripcijsko delujoči tako, kot se biološko pričakuje v rastlinah, so morali preveriti njihovo aktivnost. Pripravili so 29 linij (T0) transgenske rastline Nicotiana tabacum s tremi različnimi vektorskimi konstrukti (4× mlcA-VP16, 4× mlcA-QF in 4× mlcA), vsak je imel zapis za odpornost na higromicin (HygR). Vse linije so vzgojili do popolne zrelosti in zbrali njihova semema, da bi zasadili njihove potomce (T1) in z njimi analizirali aktivnost. Ker je reporterski sistem ostal enak, so aktivnost analizirali z merjenjem fluorescence, prav tako pa so določali izražanje gena za GFP, izražanje gena za transkripcijski faktor in izražanje HygR s qRT-PCR. Rezultati obeh metod so se ujemali – izkazalo se je, da je najvišja raven izražanja opažena pri liniji s konstruktom 4× mlcA-QF. Linije s konstruktom 4× mlcA-V16 so kljub manjšem izražanju zapisa za GFP imele v primerjavi z 4× mlcA-QF enak nivo izražanja transkripcijskih faktorjev, kar še dodatno okrepi to, da je trankripcijski faktor z aktivacijsko domeno QF zaslužen za povečano transkripcijo. Pri naslednji liniji (T2) je bil nivo izražanja zapisa za GFP še večji. Primerjali so tudi vitalnost transgenske rastline in rastline divjega tipa, pri čemer se je izkazalo, da ni nobenih negativnih fenotipskih učinkov na transgensko rastlino [1].

==Zaključek==

Glede na to, da v rastlinskih sistemih ne poznamo veliko transkripcijskih faktorjev za aktivacijo transkripcije transgenov, je to področje, na katerem je potrebno narediti še veliko raziskav. Že v tem primeru, ki je opisan v članku, je veliko možnosti za izboljšave, recimo modificiranje strukture aktivacijske domene. V tej raziskavi so aktivacijsko domeno povezali z DNA-vezavno domeno z zanko, ki je bila dolga 12 aminokislin s ponovitvami Gly-Ser. Zanimivo bi bilo preštudirati, ali z zamenjavo deležev teh dveh aminokislin ali pa z zamenjavo pozicije teh dveh domen pride do povečanega izražanja genov. Poleg tega bi lahko poskusili v eksperiment uvesti še več različnih konstruktov aktivacijskih domen. Recimo, aktivacijska domena VP16 izhaja iz človeškega virusa, zato bi bilo smiselno optimizirati eksperiment tako, da bi preučili, ali obstaja kakšna aktivacijska domena rastlinskega virusa, ki bi jo lahko vnesli v konstrukt [1]. Primer bi lahko bil gen AL2, ki v virusu mozaika zlatega paradižnika zapisuje za transkripcijski faktor, ki aktivira transkripcijo virusnega proteina ovojnice in gena BR1, ki je odgovoren za utišanje izražanja zapisa za protein ovojnice v tkivu žil rastlin [4]. Poleg tega ne bi rabili optimizirati rabe kodonov, ki je potrebna, ko vključujemo zapise iz drugih organizmov, kar lahko povzroči nestabilnost RNA. Prav tako moramo biti pozorni na dolžino konstrukta, saj lahko predolg vključek zmanjša stabilnost plazmida. Ideja za izboljšavo nivoja izražanja genov je lahko tudi ta, da dodamo še ligand vezavno domeno, ki je pogosto prisotna v sistemih za povišanje izražanja genov. Skratka, na voljo je veliko možnosti izboljšav, ki so vsekakor dobrodošle na tem področju. Z uporabo različnih logičnih vrat bi lahko prišli ne le do aktivatorjev transkripcije v rastlinah, temveč tudi do represorjev in kemijsko inducibilnih sistemov [1].

==Viri==

[1] A. C. Pfotenhauer idr., „Development of new binary expression systems for plant synthetic biology“, Plant Cell Rep, let. 43, št. 1, str. 22, jan. 2024, doi: 10.1007/s00299-023-03100-y.

[2] R. Chakravarti in V. Sahai, „Compactin - a review“, Appl Microbiol Biotechnol, let. 64, št. 5, str. 618–624, jun. 2004, doi: 10.1007/s00253-003-1553-7.

[3] T. Barwell, B. DeVeale, L. Poirier, J. Zheng, F. Seroude, in L. Seroude, „Regulating the UAS/GAL4 system in adult Drosophila with Tet-off GAL80 transgenes“, PeerJ, let. 5, str. e4167, dec. 2017, doi: 10.7717/peerj.4167.

[4] M. D. Hartitz, G. Sunter, in D. M. Bisaro, „The Tomato Golden Mosaic Virus Transactivator (TrAP) is a Single-Stranded DNA and Zinc-Binding Phosphoprotein with an Acidic Activation Domain“, Virology, let. 263, št. 1, str. 1–14, okt. 1999, doi: 10.1006/viro.1999.9925.

Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin

2024-05-06T13:39:52Z

Alliana Kolar: /* Izbira operatorja */

Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s00299-023-03100-y Development of new binary expression systems for plant synthetic biology]

==Uvod==

Rastline imajo velik pomen v biotehnologiji, saj se z njimi ukvarjajo raziskave, povezane s prehransko varnostjo, prilagajanje vremenskim spremembam, razvoj fitosenzorjev in celo z razvojem cepiv ter zdravil. Na žalost pa rastlinska biotehnologija že več desetletij ohranja standarden pristop k prekomernem izražanju transgenov s konstitutivnimi promotorji. Zato so se v tem članku osredotočili na razvoj novega, modernejšega pristopa k prekomernem izražanju transgenov v rastlinah. Odločili so se, da bodo z ustvarjanjem konstruktov, ki so jih pridobili iz gruče genov mlc, razvili zapis za nov sintetičen mlcR, ki deluje kot aktivator transkripcije. Ta gruča genov je v glivi Penicillium citrinum odgovorna za biosintezo kompaktina [1].

===Kompaktin===

Kompaktin je znan tudi pod imenom Mevastatin ali ML-236B, spada pa v razred statinov, saj znižuje nivo holesterola v krvi. Njegova biokemijska vloga je kot kompetitivni inhibitor (HMG)-CoA reduktaze – encim, ki regulira biosintezo holesterola. V 38 kilobazno gručo genov, ki sodeluje v biosintezi kompaktina v P. citrinum, spadajo geni mlcA-H in mlcR [1, 2]. Protein MlcR deluje kot transkripcijski faktor oziroma aktivator, sestavljen je iz DNA-vezavne domene in aktivacijske domene. Specifično se veže na operator dolg 14 baznih parov, ki se nahaja med genoma mlcA in mlcC. Njegova vezava povzroči večje izražanje gena mlcA v primerjavi z mlcC (transkripcija poteka v nasprotnih smereh). Se pravi, več prisotnega MlcR povzroči večje količine kompaktina [1].

===Binarni ekspresijski sistem===

Standarden pristop za prekomerno izražanje transgena v rastlinah vključuje klasično uporabljanje konstitutivnega promotorja. Za natančnejše in bolj regulirano izražanje genov se lahko poslužimo binarnega ekspresijskega sistema. Ta je praviloma sestavljen iz dveh komponent: en del vključuje transkripcijski faktor, drugi del pa operator, kamor se veže ta transkripcijski faktor in povzroča izražanje želenega gena. Najbolj znan binarni ekspresijski sistem je UAS/GAL4 [1]. Tega se sicer najpogosteje uporablja pri izražanju genov v Drosophili melanogaster. UAS (angl. upstream activating sequence) je zaporedje, ki je zapisano tik prej promotorjem za gen, ki ga želimo izražati, GAL4 pa transkripcijski faktor iz kvasovk. Ob vezavi GAL4 na UAS pride do aktivacije izražanja tarčnega gena. Ta sistem omogoča veliko fleksibilnost, saj lahko izražamo katerikoli želeni gen, poleg tega pa nam omogoča tkivno specifično izražanje in enostavno vklapljanje oziroma izklapljanje celotnega sistema transkripcije. Prav tako omogoča izražanje gena ne glede na stopnjo razvoja organizma [3].

==Cilj==

Cilj raziskave je bil, da bi biološko sintetizirali ustrezen transkripcijski faktor, ki bi ga bilo moč uporabiti pri aktivaciji izražanja genov v rastlinah. Najprej so sintetizirali dva zapisa za protein MlcR, vsak pa je pred sabo imel različen lasten operator (en od mlcA in en od mlcC), za sabo pa zapis za GFP, s katerim bi neposredno določili, kateri zapis je imel najvišji nivo izražanja po vstavljanju v Nicotiana benthamiana. Te z najvišjim nivojem izražanja so hoteli še dodatno izboljšati tako, da so ustvarili več variant sintetičnega transkripcijskega faktorja, kjer je bila spremenjena le aktivacijska domena. Za konec so želeli na transkripcijskem nivoju iz več vidikov določiti, kateri sestavljen konstrukt bi najbolj ustrezal za nov sintetični transkripcijski faktor, ki bi deloval kot aktivator transkripcije [1].

==Rezultati==

===Izbira operatorja===

V prvem koraku so se lotili izbire operatorjev, pri katerih bodo zaznali največjo aktivnost transkripcije. Sestavili so 8 različnih konstruktov, kjer sta vsakega od dveh transkripcijskih faktorjev (zapis za nativni MlcR in zapis za DNA-vezavno domeno MlcR z eno od sintetiziranih aktivacijskih domen, VP16) koeskpresirali s štirimi različnimi operatorji genov mlcA oziroma mlcC, kjer sta se dva enaka zapisa razlikovala po številu njunih ponovitev operatorskih zaporedij (1× mlcA, 4× mlcA, 1× mlcC in 4× mlcC). Vsak konstrukt je za vsemi temi zapisi imel še zapis za protein GFP, ki je služil kot reporterski gen. Sestavili so še 4 kontrolne konstrukte, ki so vsebovali samo reporterski del, se pravi brez dela s transkripcijskim faktorjem. Konstrukte so vstavili v vektor in jih infiltrirali v N. benthamiana. 72 ur pozneje so izmerili fluorescenco, kjer se je izkazalo, da je največji signal v primerjavi z kontrolnimi konstrukti dal konstrukt 4×mlcA-VP16, signal je bil dvakrat večji od kontrole. Zato so za nadaljnje poskuse uporabljali operator 4× mlcA [1].

===Izbira zapisa za aktivacijsko domeno===

V naslednji stopnji so želeli ugotoviti, katera aktivacijska domena bi lahko povzročila največjo transkripcijsko aktivnost. Sestavili so 5 konstruktov, kamor so vstavili 5 različnih aktivacijskih domen (VP16, VP64, VP128, TV in QF), za njimi je bil operator 4× mlcA in zapis za GFP. Za vsakega so imeli še kontrolni konstrukt brez zapisa za transkripcijski faktor. Vse te konstrukte so zopet vstavili v vektor in infiltrirali v N. benthamiana. Po istem postopku kot v prejšnjem eksperimentu so tudi tukaj merili fluorescenco in ugotovili, da je največji signal dal konstrukt z aktivacijsko domeno QF, in sicer aktivnost izražanja je bila 6-krat večja v primerjavi z kontrolo [1].

===Validacija aktivnosti v transgenski rastlini===

Da bi preverili, ali so zasnovani transkripcijski faktorji in promotorji transkripcijsko delujoči tako, kot se biološko pričakuje v rastlinah, so morali preveriti njihovo aktivnost. Pripravili so 29 linij (T0) transgenske rastline Nicotiana tabacum s tremi različnimi vektorskimi konstrukti (4× mlcA-VP16, 4× mlcA-QF in 4× mlcA), vsak je imel zapis za odpornost na higromicin (HygR). Vse linije so vzgojili do popolne zrelosti in zbrali njihova semema, da bi zasadili njihove potomce (T1) in z njimi analizirali aktivnost. Ker je reporterski sistem ostal enak, so aktivnost analizirali z merjenjem fluorescence, prav tako pa so določali izražanje gena za GFP, izražanje gena za transkripcijski faktor in izražanje HygR s qRT-PCR. Rezultati obeh metod so se ujemali – izkazalo se je, da je najvišja raven izražanja opažena pri liniji s konstruktom 4× mlcA-QF. Linije s konstruktom 4× mlcA-V16 so kljub manjšem izražanju zapisa za GFP imele v primerjavi z 4× mlcA-QF enak nivo izražanja transkripcijskih faktorjev, kar še dodatno okrepi to, da je trankripcijski faktor z aktivacijsko domeno QF zaslužen za povečano transkripcijo. Pri naslednji liniji (T2) je bil nivo izražanja zapisa za GFP še večji. Primerjali so tudi vitalnost transgenske rastline in rastline divjega tipa, pri čemer se je izkazalo, da ni nobenih negativnih fenotipskih učinkov na transgensko rastlino [1].

==Zaključek==

Glede na to, da v rastlinskih sistemih ne poznamo veliko transkripcijskih faktorjev za aktivacijo transkripcije transgenov, je to področje, na katerem je potrebno narediti še veliko raziskav. Že v tem primeru, ki je opisan v članku, je veliko možnosti za izboljšave, recimo modificiranje strukture aktivacijske domene. V tej raziskavi so aktivacijsko domeno povezali z DNA-vezavno domeno z zanko, ki je bila dolga 12 aminokislin s ponovitvami Gly-Ser. Zanimivo bi bilo preštudirati, ali z zamenjavo deležev teh dveh aminokislin ali pa z zamenjavo pozicije teh dveh domen pride do povečanega izražanja genov. Poleg tega bi lahko poskusili v eksperiment uvesti še več različnih konstruktov aktivacijskih domen. Recimo, aktivacijska domena VP16 izhaja iz človeškega virusa, zato bi bilo smiselno optimizirati eksperiment tako, da bi preučili, ali obstaja kakšna aktivacijska domena rastlinskega virusa, ki bi jo lahko vnesli v konstrukt [1]. Primer bi lahko bil gen AL2, ki v virusu mozaika zlatega paradižnika zapisuje za transkripcijski faktor, ki aktivira transkripcijo virusnega proteina ovojnice in gena BR1, ki je odgovoren za utišanje izražanja zapisa za protein ovojnice v tkivu žil rastlin [4]. Poleg tega ne bi rabili optimizirati rabe kodonov, ki je potrebna, ko vključujemo zapise iz drugih organizmov, kar lahko povzroči nestabilnost RNA. Prav tako moramo biti pozorni na dolžino konstrukta, saj lahko predolg vključek zmanjša stabilnost plazmida. Ideja za izboljšavo nivoja izražanja genov je lahko tudi ta, da dodamo še ligand vezavno domeno, ki je pogosto prisotna v sistemih za povišanje izražanja genov. Skratka, na voljo je veliko možnosti izboljšav, ki so vsekakor dobrodošle na tem področju. Z uporabo različnih logičnih vrat bi lahko prišli ne le do aktivatorjev transkripcije v rastlinah, temveč tudi do represorjev in kemijsko inducibilnih sistemov [1].

==Viri==

[1] A. C. Pfotenhauer idr., „Development of new binary expression systems for plant synthetic biology“, Plant Cell Rep, let. 43, št. 1, str. 22, jan. 2024, doi: 10.1007/s00299-023-03100-y.

[2] R. Chakravarti in V. Sahai, „Compactin - a review“, Appl Microbiol Biotechnol, let. 64, št. 5, str. 618–624, jun. 2004, doi: 10.1007/s00253-003-1553-7.

[3] T. Barwell, B. DeVeale, L. Poirier, J. Zheng, F. Seroude, in L. Seroude, „Regulating the UAS/GAL4 system in adult Drosophila with Tet-off GAL80 transgenes“, PeerJ, let. 5, str. e4167, dec. 2017, doi: 10.7717/peerj.4167.

[4] M. D. Hartitz, G. Sunter, in D. M. Bisaro, „The Tomato Golden Mosaic Virus Transactivator (TrAP) is a Single-Stranded DNA and Zinc-Binding Phosphoprotein with an Acidic Activation Domain“, Virology, let. 263, št. 1, str. 1–14, okt. 1999, doi: 10.1006/viro.1999.9925.

Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin

2024-05-06T11:52:08Z

Alliana Kolar: /* Binarni ekspresijski sistem */

Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s00299-023-03100-y Development of new binary expression systems for plant synthetic biology]

==Uvod==

Rastline imajo velik pomen v biotehnologiji, saj se z njimi ukvarjajo raziskave, povezane s prehransko varnostjo, prilagajanje vremenskim spremembam, razvoj fitosenzorjev in celo z razvojem cepiv ter zdravil. Na žalost pa rastlinska biotehnologija že več desetletij ohranja standarden pristop k prekomernem izražanju transgenov s konstitutivnimi promotorji. Zato so se v tem članku osredotočili na razvoj novega, modernejšega pristopa k prekomernem izražanju transgenov v rastlinah. Odločili so se, da bodo z ustvarjanjem konstruktov, ki so jih pridobili iz gruče genov mlc, razvili zapis za nov sintetičen mlcR, ki deluje kot aktivator transkripcije. Ta gruča genov je v glivi Penicillium citrinum odgovorna za biosintezo kompaktina [1].

===Kompaktin===

Kompaktin je znan tudi pod imenom Mevastatin ali ML-236B, spada pa v razred statinov, saj znižuje nivo holesterola v krvi. Njegova biokemijska vloga je kot kompetitivni inhibitor (HMG)-CoA reduktaze – encim, ki regulira biosintezo holesterola. V 38 kilobazno gručo genov, ki sodeluje v biosintezi kompaktina v P. citrinum, spadajo geni mlcA-H in mlcR [1, 2]. Protein MlcR deluje kot transkripcijski faktor oziroma aktivator, sestavljen je iz DNA-vezavne domene in aktivacijske domene. Specifično se veže na operator dolg 14 baznih parov, ki se nahaja med genoma mlcA in mlcC. Njegova vezava povzroči večje izražanje gena mlcA v primerjavi z mlcC (transkripcija poteka v nasprotnih smereh). Se pravi, več prisotnega MlcR povzroči večje količine kompaktina [1].

===Binarni ekspresijski sistem===

Standarden pristop za prekomerno izražanje transgena v rastlinah vključuje klasično uporabljanje konstitutivnega promotorja. Za natančnejše in bolj regulirano izražanje genov se lahko poslužimo binarnega ekspresijskega sistema. Ta je praviloma sestavljen iz dveh komponent: en del vključuje transkripcijski faktor, drugi del pa operator, kamor se veže ta transkripcijski faktor in povzroča izražanje želenega gena. Najbolj znan binarni ekspresijski sistem je UAS/GAL4 [1]. Tega se sicer najpogosteje uporablja pri izražanju genov v Drosophili melanogaster. UAS (angl. upstream activating sequence) je zaporedje, ki je zapisano tik prej promotorjem za gen, ki ga želimo izražati, GAL4 pa transkripcijski faktor iz kvasovk. Ob vezavi GAL4 na UAS pride do aktivacije izražanja tarčnega gena. Ta sistem omogoča veliko fleksibilnost, saj lahko izražamo katerikoli želeni gen, poleg tega pa nam omogoča tkivno specifično izražanje in enostavno vklapljanje oziroma izklapljanje celotnega sistema transkripcije. Prav tako omogoča izražanje gena ne glede na stopnjo razvoja organizma [3].

==Cilj==

Cilj raziskave je bil, da bi biološko sintetizirali ustrezen transkripcijski faktor, ki bi ga bilo moč uporabiti pri aktivaciji izražanja genov v rastlinah. Najprej so sintetizirali dva zapisa za protein MlcR, vsak pa je pred sabo imel različen lasten operator (en od mlcA in en od mlcC), za sabo pa zapis za GFP, s katerim bi neposredno določili, kateri zapis je imel najvišji nivo izražanja po vstavljanju v Nicotiana benthamiana. Te z najvišjim nivojem izražanja so hoteli še dodatno izboljšati tako, da so ustvarili več variant sintetičnega transkripcijskega faktorja, kjer je bila spremenjena le aktivacijska domena. Za konec so želeli na transkripcijskem nivoju iz več vidikov določiti, kateri sestavljen konstrukt bi najbolj ustrezal za nov sintetični transkripcijski faktor, ki bi deloval kot aktivator transkripcije [1].

==Rezultati==

===Izbira operatorja===

V prvem koraku so se lotili izbire operatorjev, pri katerih bodo zaznali največjo aktivnost transkripcije. Sestavili so 8 različnih konstruktov, kjer sta vsakega od dveh transkripcijskih faktorjev (zapis za nativni MlcR in zapis za DNA-vezavno domeno MlcR z eno od sintetiziranih aktivacijskih domen, VP16) povezali s štirimi različnimi operatorji genov mlcA oziroma mlcC, kjer sta se dva enaka zapisa razlikovala po številu njunih ponovitev operatorskih zaporedij (1× mlcA, 4× mlcA, 1× mlcC in 4× mlcC). Vsak konstrukt je za vsemi temi zapisi imel še zapis za protein GFP, ki je služil kot reporterski gen. Sestavili so še 4 kontrolne konstrukte, ki so vsebovali samo reporterski del, se pravi brez dela s transkripcijskim faktorjem. Konstrukte so vstavili v vektor in jih infiltrirali v N. benthamiana. 72 ur pozneje so izmerili fluorescenco, kjer se je izkazalo, da je največji signal v primerjavi z kontrolnimi konstrukti dal konstrukt 4×mlcA-VP16, signal je bil dvakrat večji od kontrole. Zato so za nadaljnje poskuse uporabljali operator 4× mlcA [1].

===Izbira zapisa za aktivacijsko domeno===

V naslednji stopnji so želeli ugotoviti, katera aktivacijska domena bi lahko povzročila največjo transkripcijsko aktivnost. Sestavili so 5 konstruktov, kamor so vstavili 5 različnih aktivacijskih domen (VP16, VP64, VP128, TV in QF), za njimi je bil operator 4× mlcA in zapis za GFP. Za vsakega so imeli še kontrolni konstrukt brez zapisa za transkripcijski faktor. Vse te konstrukte so zopet vstavili v vektor in infiltrirali v N. benthamiana. Po istem postopku kot v prejšnjem eksperimentu so tudi tukaj merili fluorescenco in ugotovili, da je največji signal dal konstrukt z aktivacijsko domeno QF, in sicer aktivnost izražanja je bila 6-krat večja v primerjavi z kontrolo [1].

===Validacija aktivnosti v transgenski rastlini===

Da bi preverili, ali so zasnovani transkripcijski faktorji in promotorji transkripcijsko delujoči tako, kot se biološko pričakuje v rastlinah, so morali preveriti njihovo aktivnost. Pripravili so 29 linij (T0) transgenske rastline Nicotiana tabacum s tremi različnimi vektorskimi konstrukti (4× mlcA-VP16, 4× mlcA-QF in 4× mlcA), vsak je imel zapis za odpornost na higromicin (HygR). Vse linije so vzgojili do popolne zrelosti in zbrali njihova semema, da bi zasadili njihove potomce (T1) in z njimi analizirali aktivnost. Ker je reporterski sistem ostal enak, so aktivnost analizirali z merjenjem fluorescence, prav tako pa so določali izražanje gena za GFP, izražanje gena za transkripcijski faktor in izražanje HygR s qRT-PCR. Rezultati obeh metod so se ujemali – izkazalo se je, da je najvišja raven izražanja opažena pri liniji s konstruktom 4× mlcA-QF. Linije s konstruktom 4× mlcA-V16 so kljub manjšem izražanju zapisa za GFP imele v primerjavi z 4× mlcA-QF enak nivo izražanja transkripcijskih faktorjev, kar še dodatno okrepi to, da je trankripcijski faktor z aktivacijsko domeno QF zaslužen za povečano transkripcijo. Pri naslednji liniji (T2) je bil nivo izražanja zapisa za GFP še večji. Primerjali so tudi vitalnost transgenske rastline in rastline divjega tipa, pri čemer se je izkazalo, da ni nobenih negativnih fenotipskih učinkov na transgensko rastlino [1].

==Zaključek==

Glede na to, da v rastlinskih sistemih ne poznamo veliko transkripcijskih faktorjev za aktivacijo transkripcije transgenov, je to področje, na katerem je potrebno narediti še veliko raziskav. Že v tem primeru, ki je opisan v članku, je veliko možnosti za izboljšave, recimo modificiranje strukture aktivacijske domene. V tej raziskavi so aktivacijsko domeno povezali z DNA-vezavno domeno z zanko, ki je bila dolga 12 aminokislin s ponovitvami Gly-Ser. Zanimivo bi bilo preštudirati, ali z zamenjavo deležev teh dveh aminokislin ali pa z zamenjavo pozicije teh dveh domen pride do povečanega izražanja genov. Poleg tega bi lahko poskusili v eksperiment uvesti še več različnih konstruktov aktivacijskih domen. Recimo, aktivacijska domena VP16 izhaja iz človeškega virusa, zato bi bilo smiselno optimizirati eksperiment tako, da bi preučili, ali obstaja kakšna aktivacijska domena rastlinskega virusa, ki bi jo lahko vnesli v konstrukt [1]. Primer bi lahko bil gen AL2, ki v virusu mozaika zlatega paradižnika zapisuje za transkripcijski faktor, ki aktivira transkripcijo virusnega proteina ovojnice in gena BR1, ki je odgovoren za utišanje izražanja zapisa za protein ovojnice v tkivu žil rastlin [4]. Poleg tega ne bi rabili optimizirati rabe kodonov, ki je potrebna, ko vključujemo zapise iz drugih organizmov, kar lahko povzroči nestabilnost RNA. Prav tako moramo biti pozorni na dolžino konstrukta, saj lahko predolg vključek zmanjša stabilnost plazmida. Ideja za izboljšavo nivoja izražanja genov je lahko tudi ta, da dodamo še ligand vezavno domeno, ki je pogosto prisotna v sistemih za povišanje izražanja genov. Skratka, na voljo je veliko možnosti izboljšav, ki so vsekakor dobrodošle na tem področju. Z uporabo različnih logičnih vrat bi lahko prišli ne le do aktivatorjev transkripcije v rastlinah, temveč tudi do represorjev in kemijsko inducibilnih sistemov [1].

==Viri==

[1] A. C. Pfotenhauer idr., „Development of new binary expression systems for plant synthetic biology“, Plant Cell Rep, let. 43, št. 1, str. 22, jan. 2024, doi: 10.1007/s00299-023-03100-y.

[2] R. Chakravarti in V. Sahai, „Compactin - a review“, Appl Microbiol Biotechnol, let. 64, št. 5, str. 618–624, jun. 2004, doi: 10.1007/s00253-003-1553-7.

[3] T. Barwell, B. DeVeale, L. Poirier, J. Zheng, F. Seroude, in L. Seroude, „Regulating the UAS/GAL4 system in adult Drosophila with Tet-off GAL80 transgenes“, PeerJ, let. 5, str. e4167, dec. 2017, doi: 10.7717/peerj.4167.

[4] M. D. Hartitz, G. Sunter, in D. M. Bisaro, „The Tomato Golden Mosaic Virus Transactivator (TrAP) is a Single-Stranded DNA and Zinc-Binding Phosphoprotein with an Acidic Activation Domain“, Virology, let. 263, št. 1, str. 1–14, okt. 1999, doi: 10.1006/viro.1999.9925.

Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin

2024-05-06T11:38:43Z

Alliana Kolar: /* Kompaktin */

Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s00299-023-03100-y Development of new binary expression systems for plant synthetic biology]

==Uvod==

Rastline imajo velik pomen v biotehnologiji, saj se z njimi ukvarjajo raziskave, povezane s prehransko varnostjo, prilagajanje vremenskim spremembam, razvoj fitosenzorjev in celo z razvojem cepiv ter zdravil. Na žalost pa rastlinska biotehnologija že več desetletij ohranja standarden pristop k prekomernem izražanju transgenov s konstitutivnimi promotorji. Zato so se v tem članku osredotočili na razvoj novega, modernejšega pristopa k prekomernem izražanju transgenov v rastlinah. Odločili so se, da bodo z ustvarjanjem konstruktov, ki so jih pridobili iz gruče genov mlc, razvili zapis za nov sintetičen mlcR, ki deluje kot aktivator transkripcije. Ta gruča genov je v glivi Penicillium citrinum odgovorna za biosintezo kompaktina [1].

===Kompaktin===

Kompaktin je znan tudi pod imenom Mevastatin ali ML-236B, spada pa v razred statinov, saj znižuje nivo holesterola v krvi. Njegova biokemijska vloga je kot kompetitivni inhibitor (HMG)-CoA reduktaze – encim, ki regulira biosintezo holesterola. V 38 kilobazno gručo genov, ki sodeluje v biosintezi kompaktina v P. citrinum, spadajo geni mlcA-H in mlcR [1, 2]. Protein MlcR deluje kot transkripcijski faktor oziroma aktivator, sestavljen je iz DNA-vezavne domene in aktivacijske domene. Specifično se veže na operator dolg 14 baznih parov, ki se nahaja med genoma mlcA in mlcC. Njegova vezava povzroči večje izražanje gena mlcA v primerjavi z mlcC (transkripcija poteka v nasprotnih smereh). Se pravi, več prisotnega MlcR povzroči večje količine kompaktina [1].

===Binarni ekspresijski sistem===

Standarden pristop za prekomerno izražanje transgena v rastlinah vključuje klasično uporabljanje konstitutivnega promotorja. Za natančnejše in bolj regulirano izražanje genov se lahko poslužimo binarnega ekspresijskega sistema. Pri rastlinah je ta praviloma sestavljen iz dveh komponent: en del vključuje transkripcijski faktor, drugi del pa operator, kamor se veže ta transkripcijski faktor in povzroča izražanje želenega gena. Najbolj znan binarni ekspresijski sistem je UAS/GAL4 [1]. Tega se sicer najpogosteje uporablja pri izražanju genov v Drosophili melanogaster. UAS (angl. upstream activating sequence) je zaporedje, ki je zapisano tik prej promotorjem za gen, ki ga želimo izražati, GAL4 pa transkripcijski faktor iz kvasovk. Ob vezavi GAL4 na UAS pride do aktivacije izražanja tarčnega gena. Ta sistem omogoča veliko fleksibilnost, saj lahko izražamo katerikoli želeni gen, poleg tega pa nam omogoča tkivno specifično izražanje in enostavno vklapljanje oziroma izklapljanje celotnega sistema transkripcije. Prav tako omogoča izražanje gena ne glede na stopnjo razvoja organizma [3].

==Cilj==

Cilj raziskave je bil, da bi biološko sintetizirali ustrezen transkripcijski faktor, ki bi ga bilo moč uporabiti pri aktivaciji izražanja genov v rastlinah. Najprej so sintetizirali dva zapisa za protein MlcR, vsak pa je pred sabo imel različen lasten operator (en od mlcA in en od mlcC), za sabo pa zapis za GFP, s katerim bi neposredno določili, kateri zapis je imel najvišji nivo izražanja po vstavljanju v Nicotiana benthamiana. Te z najvišjim nivojem izražanja so hoteli še dodatno izboljšati tako, da so ustvarili več variant sintetičnega transkripcijskega faktorja, kjer je bila spremenjena le aktivacijska domena. Za konec so želeli na transkripcijskem nivoju iz več vidikov določiti, kateri sestavljen konstrukt bi najbolj ustrezal za nov sintetični transkripcijski faktor, ki bi deloval kot aktivator transkripcije [1].

==Rezultati==

===Izbira operatorja===

V prvem koraku so se lotili izbire operatorjev, pri katerih bodo zaznali največjo aktivnost transkripcije. Sestavili so 8 različnih konstruktov, kjer sta vsakega od dveh transkripcijskih faktorjev (zapis za nativni MlcR in zapis za DNA-vezavno domeno MlcR z eno od sintetiziranih aktivacijskih domen, VP16) povezali s štirimi različnimi operatorji genov mlcA oziroma mlcC, kjer sta se dva enaka zapisa razlikovala po številu njunih ponovitev operatorskih zaporedij (1× mlcA, 4× mlcA, 1× mlcC in 4× mlcC). Vsak konstrukt je za vsemi temi zapisi imel še zapis za protein GFP, ki je služil kot reporterski gen. Sestavili so še 4 kontrolne konstrukte, ki so vsebovali samo reporterski del, se pravi brez dela s transkripcijskim faktorjem. Konstrukte so vstavili v vektor in jih infiltrirali v N. benthamiana. 72 ur pozneje so izmerili fluorescenco, kjer se je izkazalo, da je največji signal v primerjavi z kontrolnimi konstrukti dal konstrukt 4×mlcA-VP16, signal je bil dvakrat večji od kontrole. Zato so za nadaljnje poskuse uporabljali operator 4× mlcA [1].

===Izbira zapisa za aktivacijsko domeno===

V naslednji stopnji so želeli ugotoviti, katera aktivacijska domena bi lahko povzročila največjo transkripcijsko aktivnost. Sestavili so 5 konstruktov, kamor so vstavili 5 različnih aktivacijskih domen (VP16, VP64, VP128, TV in QF), za njimi je bil operator 4× mlcA in zapis za GFP. Za vsakega so imeli še kontrolni konstrukt brez zapisa za transkripcijski faktor. Vse te konstrukte so zopet vstavili v vektor in infiltrirali v N. benthamiana. Po istem postopku kot v prejšnjem eksperimentu so tudi tukaj merili fluorescenco in ugotovili, da je največji signal dal konstrukt z aktivacijsko domeno QF, in sicer aktivnost izražanja je bila 6-krat večja v primerjavi z kontrolo [1].

===Validacija aktivnosti v transgenski rastlini===

Da bi preverili, ali so zasnovani transkripcijski faktorji in promotorji transkripcijsko delujoči tako, kot se biološko pričakuje v rastlinah, so morali preveriti njihovo aktivnost. Pripravili so 29 linij (T0) transgenske rastline Nicotiana tabacum s tremi različnimi vektorskimi konstrukti (4× mlcA-VP16, 4× mlcA-QF in 4× mlcA), vsak je imel zapis za odpornost na higromicin (HygR). Vse linije so vzgojili do popolne zrelosti in zbrali njihova semema, da bi zasadili njihove potomce (T1) in z njimi analizirali aktivnost. Ker je reporterski sistem ostal enak, so aktivnost analizirali z merjenjem fluorescence, prav tako pa so določali izražanje gena za GFP, izražanje gena za transkripcijski faktor in izražanje HygR s qRT-PCR. Rezultati obeh metod so se ujemali – izkazalo se je, da je najvišja raven izražanja opažena pri liniji s konstruktom 4× mlcA-QF. Linije s konstruktom 4× mlcA-V16 so kljub manjšem izražanju zapisa za GFP imele v primerjavi z 4× mlcA-QF enak nivo izražanja transkripcijskih faktorjev, kar še dodatno okrepi to, da je trankripcijski faktor z aktivacijsko domeno QF zaslužen za povečano transkripcijo. Pri naslednji liniji (T2) je bil nivo izražanja zapisa za GFP še večji. Primerjali so tudi vitalnost transgenske rastline in rastline divjega tipa, pri čemer se je izkazalo, da ni nobenih negativnih fenotipskih učinkov na transgensko rastlino [1].

==Zaključek==

Glede na to, da v rastlinskih sistemih ne poznamo veliko transkripcijskih faktorjev za aktivacijo transkripcije transgenov, je to področje, na katerem je potrebno narediti še veliko raziskav. Že v tem primeru, ki je opisan v članku, je veliko možnosti za izboljšave, recimo modificiranje strukture aktivacijske domene. V tej raziskavi so aktivacijsko domeno povezali z DNA-vezavno domeno z zanko, ki je bila dolga 12 aminokislin s ponovitvami Gly-Ser. Zanimivo bi bilo preštudirati, ali z zamenjavo deležev teh dveh aminokislin ali pa z zamenjavo pozicije teh dveh domen pride do povečanega izražanja genov. Poleg tega bi lahko poskusili v eksperiment uvesti še več različnih konstruktov aktivacijskih domen. Recimo, aktivacijska domena VP16 izhaja iz človeškega virusa, zato bi bilo smiselno optimizirati eksperiment tako, da bi preučili, ali obstaja kakšna aktivacijska domena rastlinskega virusa, ki bi jo lahko vnesli v konstrukt [1]. Primer bi lahko bil gen AL2, ki v virusu mozaika zlatega paradižnika zapisuje za transkripcijski faktor, ki aktivira transkripcijo virusnega proteina ovojnice in gena BR1, ki je odgovoren za utišanje izražanja zapisa za protein ovojnice v tkivu žil rastlin [4]. Poleg tega ne bi rabili optimizirati rabe kodonov, ki je potrebna, ko vključujemo zapise iz drugih organizmov, kar lahko povzroči nestabilnost RNA. Prav tako moramo biti pozorni na dolžino konstrukta, saj lahko predolg vključek zmanjša stabilnost plazmida. Ideja za izboljšavo nivoja izražanja genov je lahko tudi ta, da dodamo še ligand vezavno domeno, ki je pogosto prisotna v sistemih za povišanje izražanja genov. Skratka, na voljo je veliko možnosti izboljšav, ki so vsekakor dobrodošle na tem področju. Z uporabo različnih logičnih vrat bi lahko prišli ne le do aktivatorjev transkripcije v rastlinah, temveč tudi do represorjev in kemijsko inducibilnih sistemov [1].

==Viri==

[1] A. C. Pfotenhauer idr., „Development of new binary expression systems for plant synthetic biology“, Plant Cell Rep, let. 43, št. 1, str. 22, jan. 2024, doi: 10.1007/s00299-023-03100-y.

[2] R. Chakravarti in V. Sahai, „Compactin - a review“, Appl Microbiol Biotechnol, let. 64, št. 5, str. 618–624, jun. 2004, doi: 10.1007/s00253-003-1553-7.

[3] T. Barwell, B. DeVeale, L. Poirier, J. Zheng, F. Seroude, in L. Seroude, „Regulating the UAS/GAL4 system in adult Drosophila with Tet-off GAL80 transgenes“, PeerJ, let. 5, str. e4167, dec. 2017, doi: 10.7717/peerj.4167.

[4] M. D. Hartitz, G. Sunter, in D. M. Bisaro, „The Tomato Golden Mosaic Virus Transactivator (TrAP) is a Single-Stranded DNA and Zinc-Binding Phosphoprotein with an Acidic Activation Domain“, Virology, let. 263, št. 1, str. 1–14, okt. 1999, doi: 10.1006/viro.1999.9925.

Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin

2024-05-06T11:19:44Z

Alliana Kolar: /* Uvod */

Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s00299-023-03100-y Development of new binary expression systems for plant synthetic biology]

==Uvod==

Rastline imajo velik pomen v biotehnologiji, saj se z njimi ukvarjajo raziskave, povezane s prehransko varnostjo, prilagajanje vremenskim spremembam, razvoj fitosenzorjev in celo z razvojem cepiv ter zdravil. Na žalost pa rastlinska biotehnologija že več desetletij ohranja standarden pristop k prekomernem izražanju transgenov s konstitutivnimi promotorji. Zato so se v tem članku osredotočili na razvoj novega, modernejšega pristopa k prekomernem izražanju transgenov v rastlinah. Odločili so se, da bodo z ustvarjanjem konstruktov, ki so jih pridobili iz gruče genov mlc, razvili zapis za nov sintetičen mlcR, ki deluje kot aktivator transkripcije. Ta gruča genov je v glivi Penicillium citrinum odgovorna za biosintezo kompaktina [1].

===Kompaktin===

Kompaktin je znan tudi pod imenom Mevastatin ali ML-236B, spada pa v razred statinov, saj znižuje nivo holesterola v krvi. Njegova biokemijska vloga je kot kompetitivni inhibitor (HMG)-CoA reduktaze – encim, ki regulira biosintezo holesterola. V 38 kilobazno gručo genov, ki sodeluje v biosintezi kompaktina v P. citrinum, spadajo geni mlcA-H in mlcR, vključno z dvema genoma za poliketid sintazo in enim regulatornim genom, ki je odgovoren za biosintezo kompaktina [1, 2]. Protein MlcR deluje kot transkripcijski faktor oziroma aktivator, sestavljen je iz DNA-vezavne domene in aktivacijske domene. Specifično se veže na operator dolg 14 baznih parov, ki se nahaja med genoma mlcA in mlcC. Njegova vezava povzroči večje izražanje gena mlcA v primerjavi z mlcC (transkripcija poteka v nasprotnih smereh). Se pravi, več prisotnega MlcR povzroči večje količine kompaktina [1].

===Binarni ekspresijski sistem===

Standarden pristop za prekomerno izražanje transgena v rastlinah vključuje klasično uporabljanje konstitutivnega promotorja. Za natančnejše in bolj regulirano izražanje genov se lahko poslužimo binarnega ekspresijskega sistema. Pri rastlinah je ta praviloma sestavljen iz dveh komponent: en del vključuje transkripcijski faktor, drugi del pa operator, kamor se veže ta transkripcijski faktor in povzroča izražanje želenega gena. Najbolj znan binarni ekspresijski sistem je UAS/GAL4 [1]. Tega se sicer najpogosteje uporablja pri izražanju genov v Drosophili melanogaster. UAS (angl. upstream activating sequence) je zaporedje, ki je zapisano tik prej promotorjem za gen, ki ga želimo izražati, GAL4 pa transkripcijski faktor iz kvasovk. Ob vezavi GAL4 na UAS pride do aktivacije izražanja tarčnega gena. Ta sistem omogoča veliko fleksibilnost, saj lahko izražamo katerikoli želeni gen, poleg tega pa nam omogoča tkivno specifično izražanje in enostavno vklapljanje oziroma izklapljanje celotnega sistema transkripcije. Prav tako omogoča izražanje gena ne glede na stopnjo razvoja organizma [3].

==Cilj==

Cilj raziskave je bil, da bi biološko sintetizirali ustrezen transkripcijski faktor, ki bi ga bilo moč uporabiti pri aktivaciji izražanja genov v rastlinah. Najprej so sintetizirali dva zapisa za protein MlcR, vsak pa je pred sabo imel različen lasten operator (en od mlcA in en od mlcC), za sabo pa zapis za GFP, s katerim bi neposredno določili, kateri zapis je imel najvišji nivo izražanja po vstavljanju v Nicotiana benthamiana. Te z najvišjim nivojem izražanja so hoteli še dodatno izboljšati tako, da so ustvarili več variant sintetičnega transkripcijskega faktorja, kjer je bila spremenjena le aktivacijska domena. Za konec so želeli na transkripcijskem nivoju iz več vidikov določiti, kateri sestavljen konstrukt bi najbolj ustrezal za nov sintetični transkripcijski faktor, ki bi deloval kot aktivator transkripcije [1].

==Rezultati==

===Izbira operatorja===

V prvem koraku so se lotili izbire operatorjev, pri katerih bodo zaznali največjo aktivnost transkripcije. Sestavili so 8 različnih konstruktov, kjer sta vsakega od dveh transkripcijskih faktorjev (zapis za nativni MlcR in zapis za DNA-vezavno domeno MlcR z eno od sintetiziranih aktivacijskih domen, VP16) povezali s štirimi različnimi operatorji genov mlcA oziroma mlcC, kjer sta se dva enaka zapisa razlikovala po številu njunih ponovitev operatorskih zaporedij (1× mlcA, 4× mlcA, 1× mlcC in 4× mlcC). Vsak konstrukt je za vsemi temi zapisi imel še zapis za protein GFP, ki je služil kot reporterski gen. Sestavili so še 4 kontrolne konstrukte, ki so vsebovali samo reporterski del, se pravi brez dela s transkripcijskim faktorjem. Konstrukte so vstavili v vektor in jih infiltrirali v N. benthamiana. 72 ur pozneje so izmerili fluorescenco, kjer se je izkazalo, da je največji signal v primerjavi z kontrolnimi konstrukti dal konstrukt 4×mlcA-VP16, signal je bil dvakrat večji od kontrole. Zato so za nadaljnje poskuse uporabljali operator 4× mlcA [1].

===Izbira zapisa za aktivacijsko domeno===

V naslednji stopnji so želeli ugotoviti, katera aktivacijska domena bi lahko povzročila največjo transkripcijsko aktivnost. Sestavili so 5 konstruktov, kamor so vstavili 5 različnih aktivacijskih domen (VP16, VP64, VP128, TV in QF), za njimi je bil operator 4× mlcA in zapis za GFP. Za vsakega so imeli še kontrolni konstrukt brez zapisa za transkripcijski faktor. Vse te konstrukte so zopet vstavili v vektor in infiltrirali v N. benthamiana. Po istem postopku kot v prejšnjem eksperimentu so tudi tukaj merili fluorescenco in ugotovili, da je največji signal dal konstrukt z aktivacijsko domeno QF, in sicer aktivnost izražanja je bila 6-krat večja v primerjavi z kontrolo [1].

===Validacija aktivnosti v transgenski rastlini===

Da bi preverili, ali so zasnovani transkripcijski faktorji in promotorji transkripcijsko delujoči tako, kot se biološko pričakuje v rastlinah, so morali preveriti njihovo aktivnost. Pripravili so 29 linij (T0) transgenske rastline Nicotiana tabacum s tremi različnimi vektorskimi konstrukti (4× mlcA-VP16, 4× mlcA-QF in 4× mlcA), vsak je imel zapis za odpornost na higromicin (HygR). Vse linije so vzgojili do popolne zrelosti in zbrali njihova semema, da bi zasadili njihove potomce (T1) in z njimi analizirali aktivnost. Ker je reporterski sistem ostal enak, so aktivnost analizirali z merjenjem fluorescence, prav tako pa so določali izražanje gena za GFP, izražanje gena za transkripcijski faktor in izražanje HygR s qRT-PCR. Rezultati obeh metod so se ujemali – izkazalo se je, da je najvišja raven izražanja opažena pri liniji s konstruktom 4× mlcA-QF. Linije s konstruktom 4× mlcA-V16 so kljub manjšem izražanju zapisa za GFP imele v primerjavi z 4× mlcA-QF enak nivo izražanja transkripcijskih faktorjev, kar še dodatno okrepi to, da je trankripcijski faktor z aktivacijsko domeno QF zaslužen za povečano transkripcijo. Pri naslednji liniji (T2) je bil nivo izražanja zapisa za GFP še večji. Primerjali so tudi vitalnost transgenske rastline in rastline divjega tipa, pri čemer se je izkazalo, da ni nobenih negativnih fenotipskih učinkov na transgensko rastlino [1].

==Zaključek==

Glede na to, da v rastlinskih sistemih ne poznamo veliko transkripcijskih faktorjev za aktivacijo transkripcije transgenov, je to področje, na katerem je potrebno narediti še veliko raziskav. Že v tem primeru, ki je opisan v članku, je veliko možnosti za izboljšave, recimo modificiranje strukture aktivacijske domene. V tej raziskavi so aktivacijsko domeno povezali z DNA-vezavno domeno z zanko, ki je bila dolga 12 aminokislin s ponovitvami Gly-Ser. Zanimivo bi bilo preštudirati, ali z zamenjavo deležev teh dveh aminokislin ali pa z zamenjavo pozicije teh dveh domen pride do povečanega izražanja genov. Poleg tega bi lahko poskusili v eksperiment uvesti še več različnih konstruktov aktivacijskih domen. Recimo, aktivacijska domena VP16 izhaja iz človeškega virusa, zato bi bilo smiselno optimizirati eksperiment tako, da bi preučili, ali obstaja kakšna aktivacijska domena rastlinskega virusa, ki bi jo lahko vnesli v konstrukt [1]. Primer bi lahko bil gen AL2, ki v virusu mozaika zlatega paradižnika zapisuje za transkripcijski faktor, ki aktivira transkripcijo virusnega proteina ovojnice in gena BR1, ki je odgovoren za utišanje izražanja zapisa za protein ovojnice v tkivu žil rastlin [4]. Poleg tega ne bi rabili optimizirati rabe kodonov, ki je potrebna, ko vključujemo zapise iz drugih organizmov, kar lahko povzroči nestabilnost RNA. Prav tako moramo biti pozorni na dolžino konstrukta, saj lahko predolg vključek zmanjša stabilnost plazmida. Ideja za izboljšavo nivoja izražanja genov je lahko tudi ta, da dodamo še ligand vezavno domeno, ki je pogosto prisotna v sistemih za povišanje izražanja genov. Skratka, na voljo je veliko možnosti izboljšav, ki so vsekakor dobrodošle na tem področju. Z uporabo različnih logičnih vrat bi lahko prišli ne le do aktivatorjev transkripcije v rastlinah, temveč tudi do represorjev in kemijsko inducibilnih sistemov [1].

==Viri==

[1] A. C. Pfotenhauer idr., „Development of new binary expression systems for plant synthetic biology“, Plant Cell Rep, let. 43, št. 1, str. 22, jan. 2024, doi: 10.1007/s00299-023-03100-y.

[2] R. Chakravarti in V. Sahai, „Compactin - a review“, Appl Microbiol Biotechnol, let. 64, št. 5, str. 618–624, jun. 2004, doi: 10.1007/s00253-003-1553-7.

[3] T. Barwell, B. DeVeale, L. Poirier, J. Zheng, F. Seroude, in L. Seroude, „Regulating the UAS/GAL4 system in adult Drosophila with Tet-off GAL80 transgenes“, PeerJ, let. 5, str. e4167, dec. 2017, doi: 10.7717/peerj.4167.

[4] M. D. Hartitz, G. Sunter, in D. M. Bisaro, „The Tomato Golden Mosaic Virus Transactivator (TrAP) is a Single-Stranded DNA and Zinc-Binding Phosphoprotein with an Acidic Activation Domain“, Virology, let. 263, št. 1, str. 1–14, okt. 1999, doi: 10.1006/viro.1999.9925.

Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin

2024-05-06T11:11:04Z

Alliana Kolar: /* Uvod */

Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s00299-023-03100-y Development of new binary expression systems for plant synthetic biology]

==Uvod==

Rastline imajo velik pomen v biotehnologiji, saj se z njimi ukvarjajo raziskave, povezane s prehransko varnostjo, prilagajanje vremenskim spremembam, razvoj fitosenzorjev in celo z razvojem cepiv ter zdravil. Na žalost pa rastlinska biotehnologija že več desetletij ohranja standarden pristop k prekomernem izražanju transgenov. Zato so se v tem članku osredotočili na razvoj novega, modernejšega pristopa k prekomernem izražanju transgenov v rastlinah. Odločili so se, da bodo z ustvarjanjem konstruktov, ki so jih pridobili iz gruče genov mlc, razvili zapis za nov sintetičen mlcR, ki deluje kot aktivator transkripcije. Ta gruča genov je v glivi Penicillium citrinum odgovorna za biosintezo kompaktina [1].

===Kompaktin===

Kompaktin je znan tudi pod imenom Mevastatin ali ML-236B, spada pa v razred statinov, saj znižuje nivo holesterola v krvi. Njegova biokemijska vloga je kot kompetitivni inhibitor (HMG)-CoA reduktaze – encim, ki regulira biosintezo holesterola. V 38 kilobazno gručo genov, ki sodeluje v biosintezi kompaktina v P. citrinum, spadajo geni mlcA-H in mlcR, vključno z dvema genoma za poliketid sintazo in enim regulatornim genom, ki je odgovoren za biosintezo kompaktina [1, 2]. Protein MlcR deluje kot transkripcijski faktor oziroma aktivator, sestavljen je iz DNA-vezavne domene in aktivacijske domene. Specifično se veže na operator dolg 14 baznih parov, ki se nahaja med genoma mlcA in mlcC. Njegova vezava povzroči večje izražanje gena mlcA v primerjavi z mlcC (transkripcija poteka v nasprotnih smereh). Se pravi, več prisotnega MlcR povzroči večje količine kompaktina [1].

===Binarni ekspresijski sistem===

Standarden pristop za prekomerno izražanje transgena v rastlinah vključuje klasično uporabljanje konstitutivnega promotorja. Za natančnejše in bolj regulirano izražanje genov se lahko poslužimo binarnega ekspresijskega sistema. Pri rastlinah je ta praviloma sestavljen iz dveh komponent: en del vključuje transkripcijski faktor, drugi del pa operator, kamor se veže ta transkripcijski faktor in povzroča izražanje želenega gena. Najbolj znan binarni ekspresijski sistem je UAS/GAL4 [1]. Tega se sicer najpogosteje uporablja pri izražanju genov v Drosophili melanogaster. UAS (angl. upstream activating sequence) je zaporedje, ki je zapisano tik prej promotorjem za gen, ki ga želimo izražati, GAL4 pa transkripcijski faktor iz kvasovk. Ob vezavi GAL4 na UAS pride do aktivacije izražanja tarčnega gena. Ta sistem omogoča veliko fleksibilnost, saj lahko izražamo katerikoli želeni gen, poleg tega pa nam omogoča tkivno specifično izražanje in enostavno vklapljanje oziroma izklapljanje celotnega sistema transkripcije. Prav tako omogoča izražanje gena ne glede na stopnjo razvoja organizma [3].

==Cilj==

Cilj raziskave je bil, da bi biološko sintetizirali ustrezen transkripcijski faktor, ki bi ga bilo moč uporabiti pri aktivaciji izražanja genov v rastlinah. Najprej so sintetizirali dva zapisa za protein MlcR, vsak pa je pred sabo imel različen lasten operator (en od mlcA in en od mlcC), za sabo pa zapis za GFP, s katerim bi neposredno določili, kateri zapis je imel najvišji nivo izražanja po vstavljanju v Nicotiana benthamiana. Te z najvišjim nivojem izražanja so hoteli še dodatno izboljšati tako, da so ustvarili več variant sintetičnega transkripcijskega faktorja, kjer je bila spremenjena le aktivacijska domena. Za konec so želeli na transkripcijskem nivoju iz več vidikov določiti, kateri sestavljen konstrukt bi najbolj ustrezal za nov sintetični transkripcijski faktor, ki bi deloval kot aktivator transkripcije [1].

==Rezultati==

===Izbira operatorja===

V prvem koraku so se lotili izbire operatorjev, pri katerih bodo zaznali največjo aktivnost transkripcije. Sestavili so 8 različnih konstruktov, kjer sta vsakega od dveh transkripcijskih faktorjev (zapis za nativni MlcR in zapis za DNA-vezavno domeno MlcR z eno od sintetiziranih aktivacijskih domen, VP16) povezali s štirimi različnimi operatorji genov mlcA oziroma mlcC, kjer sta se dva enaka zapisa razlikovala po številu njunih ponovitev operatorskih zaporedij (1× mlcA, 4× mlcA, 1× mlcC in 4× mlcC). Vsak konstrukt je za vsemi temi zapisi imel še zapis za protein GFP, ki je služil kot reporterski gen. Sestavili so še 4 kontrolne konstrukte, ki so vsebovali samo reporterski del, se pravi brez dela s transkripcijskim faktorjem. Konstrukte so vstavili v vektor in jih infiltrirali v N. benthamiana. 72 ur pozneje so izmerili fluorescenco, kjer se je izkazalo, da je največji signal v primerjavi z kontrolnimi konstrukti dal konstrukt 4×mlcA-VP16, signal je bil dvakrat večji od kontrole. Zato so za nadaljnje poskuse uporabljali operator 4× mlcA [1].

===Izbira zapisa za aktivacijsko domeno===

V naslednji stopnji so želeli ugotoviti, katera aktivacijska domena bi lahko povzročila največjo transkripcijsko aktivnost. Sestavili so 5 konstruktov, kamor so vstavili 5 različnih aktivacijskih domen (VP16, VP64, VP128, TV in QF), za njimi je bil operator 4× mlcA in zapis za GFP. Za vsakega so imeli še kontrolni konstrukt brez zapisa za transkripcijski faktor. Vse te konstrukte so zopet vstavili v vektor in infiltrirali v N. benthamiana. Po istem postopku kot v prejšnjem eksperimentu so tudi tukaj merili fluorescenco in ugotovili, da je največji signal dal konstrukt z aktivacijsko domeno QF, in sicer aktivnost izražanja je bila 6-krat večja v primerjavi z kontrolo [1].

===Validacija aktivnosti v transgenski rastlini===

Da bi preverili, ali so zasnovani transkripcijski faktorji in promotorji transkripcijsko delujoči tako, kot se biološko pričakuje v rastlinah, so morali preveriti njihovo aktivnost. Pripravili so 29 linij (T0) transgenske rastline Nicotiana tabacum s tremi različnimi vektorskimi konstrukti (4× mlcA-VP16, 4× mlcA-QF in 4× mlcA), vsak je imel zapis za odpornost na higromicin (HygR). Vse linije so vzgojili do popolne zrelosti in zbrali njihova semema, da bi zasadili njihove potomce (T1) in z njimi analizirali aktivnost. Ker je reporterski sistem ostal enak, so aktivnost analizirali z merjenjem fluorescence, prav tako pa so določali izražanje gena za GFP, izražanje gena za transkripcijski faktor in izražanje HygR s qRT-PCR. Rezultati obeh metod so se ujemali – izkazalo se je, da je najvišja raven izražanja opažena pri liniji s konstruktom 4× mlcA-QF. Linije s konstruktom 4× mlcA-V16 so kljub manjšem izražanju zapisa za GFP imele v primerjavi z 4× mlcA-QF enak nivo izražanja transkripcijskih faktorjev, kar še dodatno okrepi to, da je trankripcijski faktor z aktivacijsko domeno QF zaslužen za povečano transkripcijo. Pri naslednji liniji (T2) je bil nivo izražanja zapisa za GFP še večji. Primerjali so tudi vitalnost transgenske rastline in rastline divjega tipa, pri čemer se je izkazalo, da ni nobenih negativnih fenotipskih učinkov na transgensko rastlino [1].

==Zaključek==

Glede na to, da v rastlinskih sistemih ne poznamo veliko transkripcijskih faktorjev za aktivacijo transkripcije transgenov, je to področje, na katerem je potrebno narediti še veliko raziskav. Že v tem primeru, ki je opisan v članku, je veliko možnosti za izboljšave, recimo modificiranje strukture aktivacijske domene. V tej raziskavi so aktivacijsko domeno povezali z DNA-vezavno domeno z zanko, ki je bila dolga 12 aminokislin s ponovitvami Gly-Ser. Zanimivo bi bilo preštudirati, ali z zamenjavo deležev teh dveh aminokislin ali pa z zamenjavo pozicije teh dveh domen pride do povečanega izražanja genov. Poleg tega bi lahko poskusili v eksperiment uvesti še več različnih konstruktov aktivacijskih domen. Recimo, aktivacijska domena VP16 izhaja iz človeškega virusa, zato bi bilo smiselno optimizirati eksperiment tako, da bi preučili, ali obstaja kakšna aktivacijska domena rastlinskega virusa, ki bi jo lahko vnesli v konstrukt [1]. Primer bi lahko bil gen AL2, ki v virusu mozaika zlatega paradižnika zapisuje za transkripcijski faktor, ki aktivira transkripcijo virusnega proteina ovojnice in gena BR1, ki je odgovoren za utišanje izražanja zapisa za protein ovojnice v tkivu žil rastlin [4]. Poleg tega ne bi rabili optimizirati rabe kodonov, ki je potrebna, ko vključujemo zapise iz drugih organizmov, kar lahko povzroči nestabilnost RNA. Prav tako moramo biti pozorni na dolžino konstrukta, saj lahko predolg vključek zmanjša stabilnost plazmida. Ideja za izboljšavo nivoja izražanja genov je lahko tudi ta, da dodamo še ligand vezavno domeno, ki je pogosto prisotna v sistemih za povišanje izražanja genov. Skratka, na voljo je veliko možnosti izboljšav, ki so vsekakor dobrodošle na tem področju. Z uporabo različnih logičnih vrat bi lahko prišli ne le do aktivatorjev transkripcije v rastlinah, temveč tudi do represorjev in kemijsko inducibilnih sistemov [1].

==Viri==

[1] A. C. Pfotenhauer idr., „Development of new binary expression systems for plant synthetic biology“, Plant Cell Rep, let. 43, št. 1, str. 22, jan. 2024, doi: 10.1007/s00299-023-03100-y.

[2] R. Chakravarti in V. Sahai, „Compactin - a review“, Appl Microbiol Biotechnol, let. 64, št. 5, str. 618–624, jun. 2004, doi: 10.1007/s00253-003-1553-7.

[3] T. Barwell, B. DeVeale, L. Poirier, J. Zheng, F. Seroude, in L. Seroude, „Regulating the UAS/GAL4 system in adult Drosophila with Tet-off GAL80 transgenes“, PeerJ, let. 5, str. e4167, dec. 2017, doi: 10.7717/peerj.4167.

[4] M. D. Hartitz, G. Sunter, in D. M. Bisaro, „The Tomato Golden Mosaic Virus Transactivator (TrAP) is a Single-Stranded DNA and Zinc-Binding Phosphoprotein with an Acidic Activation Domain“, Virology, let. 263, št. 1, str. 1–14, okt. 1999, doi: 10.1006/viro.1999.9925.

Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin

2024-05-05T23:43:38Z

Alliana Kolar: /* Validacija aktivnosti v transgenski rastlini */

Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s00299-023-03100-y Development of new binary expression systems for plant synthetic biology]

==Uvod==

Rastline imajo velik pomen v biotehnologiji, saj se z njimi ukvarjajo raziskave, povezane s prehransko varnostjo, prilagajanje vremenskim spremembam, razvoj fitosenzorjev in celo razvoj cepiv ter zdravil. Na žalost pa rastlinska biotehnologija že več desetletij ohranja standarden pristop k prekomernem izražanju transgenov. Zato so se v tem članku osredotočili na razvoj novega, modernejšega pristopa k prekomernem izražanju transgenov v rastlinah. Odločili so se, da bodo z ustvarjanjem konstruktov, ki so jih pridobili iz gruče genov mlc, razvili zapis za nov sintetičen mlcR, ki deluje kot aktivator transkripcije. Ta gruča genov je v glivi Penicillium citrinum odgovorna za biosintezo kompaktina [1].

===Kompaktin===

Kompaktin je znan tudi pod imenom Mevastatin ali ML-236B, spada pa v razred statinov, saj znižuje nivo holesterola v krvi. Njegova biokemijska vloga je kot kompetitivni inhibitor (HMG)-CoA reduktaze – encim, ki regulira biosintezo holesterola. V 38 kilobazno gručo genov, ki sodeluje v biosintezi kompaktina v P. citrinum, spadajo geni mlcA-H in mlcR, vključno z dvema genoma za poliketid sintazo in enim regulatornim genom, ki je odgovoren za biosintezo kompaktina [1, 2]. Protein MlcR deluje kot transkripcijski faktor oziroma aktivator, sestavljen je iz DNA-vezavne domene in aktivacijske domene. Specifično se veže na operator dolg 14 baznih parov, ki se nahaja med genoma mlcA in mlcC. Njegova vezava povzroči večje izražanje gena mlcA v primerjavi z mlcC (transkripcija poteka v nasprotnih smereh). Se pravi, več prisotnega MlcR povzroči večje količine kompaktina [1].

===Binarni ekspresijski sistem===

Standarden pristop za prekomerno izražanje transgena v rastlinah vključuje klasično uporabljanje konstitutivnega promotorja. Za natančnejše in bolj regulirano izražanje genov se lahko poslužimo binarnega ekspresijskega sistema. Pri rastlinah je ta praviloma sestavljen iz dveh komponent: en del vključuje transkripcijski faktor, drugi del pa operator, kamor se veže ta transkripcijski faktor in povzroča izražanje želenega gena. Najbolj znan binarni ekspresijski sistem je UAS/GAL4 [1]. Tega se sicer najpogosteje uporablja pri izražanju genov v Drosophili melanogaster. UAS (angl. upstream activating sequence) je zaporedje, ki je zapisano tik prej promotorjem za gen, ki ga želimo izražati, GAL4 pa transkripcijski faktor iz kvasovk. Ob vezavi GAL4 na UAS pride do aktivacije izražanja tarčnega gena. Ta sistem omogoča veliko fleksibilnost, saj lahko izražamo katerikoli želeni gen, poleg tega pa nam omogoča tkivno specifično izražanje in enostavno vklapljanje oziroma izklapljanje celotnega sistema transkripcije. Prav tako omogoča izražanje gena ne glede na stopnjo razvoja organizma [3].

==Cilj==

Cilj raziskave je bil, da bi biološko sintetizirali ustrezen transkripcijski faktor, ki bi ga bilo moč uporabiti pri aktivaciji izražanja genov v rastlinah. Najprej so sintetizirali dva zapisa za protein MlcR, vsak pa je pred sabo imel različen lasten operator (en od mlcA in en od mlcC), za sabo pa zapis za GFP, s katerim bi neposredno določili, kateri zapis je imel najvišji nivo izražanja po vstavljanju v Nicotiana benthamiana. Te z najvišjim nivojem izražanja so hoteli še dodatno izboljšati tako, da so ustvarili več variant sintetičnega transkripcijskega faktorja, kjer je bila spremenjena le aktivacijska domena. Za konec so želeli na transkripcijskem nivoju iz več vidikov določiti, kateri sestavljen konstrukt bi najbolj ustrezal za nov sintetični transkripcijski faktor, ki bi deloval kot aktivator transkripcije [1].

==Rezultati==

===Izbira operatorja===

V prvem koraku so se lotili izbire operatorjev, pri katerih bodo zaznali največjo aktivnost transkripcije. Sestavili so 8 različnih konstruktov, kjer sta vsakega od dveh transkripcijskih faktorjev (zapis za nativni MlcR in zapis za DNA-vezavno domeno MlcR z eno od sintetiziranih aktivacijskih domen, VP16) povezali s štirimi različnimi operatorji genov mlcA oziroma mlcC, kjer sta se dva enaka zapisa razlikovala po številu njunih ponovitev operatorskih zaporedij (1× mlcA, 4× mlcA, 1× mlcC in 4× mlcC). Vsak konstrukt je za vsemi temi zapisi imel še zapis za protein GFP, ki je služil kot reporterski gen. Sestavili so še 4 kontrolne konstrukte, ki so vsebovali samo reporterski del, se pravi brez dela s transkripcijskim faktorjem. Konstrukte so vstavili v vektor in jih infiltrirali v N. benthamiana. 72 ur pozneje so izmerili fluorescenco, kjer se je izkazalo, da je največji signal v primerjavi z kontrolnimi konstrukti dal konstrukt 4×mlcA-VP16, signal je bil dvakrat večji od kontrole. Zato so za nadaljnje poskuse uporabljali operator 4× mlcA [1].

===Izbira zapisa za aktivacijsko domeno===

V naslednji stopnji so želeli ugotoviti, katera aktivacijska domena bi lahko povzročila največjo transkripcijsko aktivnost. Sestavili so 5 konstruktov, kamor so vstavili 5 različnih aktivacijskih domen (VP16, VP64, VP128, TV in QF), za njimi je bil operator 4× mlcA in zapis za GFP. Za vsakega so imeli še kontrolni konstrukt brez zapisa za transkripcijski faktor. Vse te konstrukte so zopet vstavili v vektor in infiltrirali v N. benthamiana. Po istem postopku kot v prejšnjem eksperimentu so tudi tukaj merili fluorescenco in ugotovili, da je največji signal dal konstrukt z aktivacijsko domeno QF, in sicer aktivnost izražanja je bila 6-krat večja v primerjavi z kontrolo [1].

===Validacija aktivnosti v transgenski rastlini===

Da bi preverili, ali so zasnovani transkripcijski faktorji in promotorji transkripcijsko delujoči tako, kot se biološko pričakuje v rastlinah, so morali preveriti njihovo aktivnost. Pripravili so 29 linij (T0) transgenske rastline Nicotiana tabacum s tremi različnimi vektorskimi konstrukti (4× mlcA-VP16, 4× mlcA-QF in 4× mlcA), vsak je imel zapis za odpornost na higromicin (HygR). Vse linije so vzgojili do popolne zrelosti in zbrali njihova semema, da bi zasadili njihove potomce (T1) in z njimi analizirali aktivnost. Ker je reporterski sistem ostal enak, so aktivnost analizirali z merjenjem fluorescence, prav tako pa so določali izražanje gena za GFP, izražanje gena za transkripcijski faktor in izražanje HygR s qRT-PCR. Rezultati obeh metod so se ujemali – izkazalo se je, da je najvišja raven izražanja opažena pri liniji s konstruktom 4× mlcA-QF. Linije s konstruktom 4× mlcA-V16 so kljub manjšem izražanju zapisa za GFP imele v primerjavi z 4× mlcA-QF enak nivo izražanja transkripcijskih faktorjev, kar še dodatno okrepi to, da je trankripcijski faktor z aktivacijsko domeno QF zaslužen za povečano transkripcijo. Pri naslednji liniji (T2) je bil nivo izražanja zapisa za GFP še večji. Primerjali so tudi vitalnost transgenske rastline in rastline divjega tipa, pri čemer se je izkazalo, da ni nobenih negativnih fenotipskih učinkov na transgensko rastlino [1].

==Zaključek==

Glede na to, da v rastlinskih sistemih ne poznamo veliko transkripcijskih faktorjev za aktivacijo transkripcije transgenov, je to področje, na katerem je potrebno narediti še veliko raziskav. Že v tem primeru, ki je opisan v članku, je veliko možnosti za izboljšave, recimo modificiranje strukture aktivacijske domene. V tej raziskavi so aktivacijsko domeno povezali z DNA-vezavno domeno z zanko, ki je bila dolga 12 aminokislin s ponovitvami Gly-Ser. Zanimivo bi bilo preštudirati, ali z zamenjavo deležev teh dveh aminokislin ali pa z zamenjavo pozicije teh dveh domen pride do povečanega izražanja genov. Poleg tega bi lahko poskusili v eksperiment uvesti še več različnih konstruktov aktivacijskih domen. Recimo, aktivacijska domena VP16 izhaja iz človeškega virusa, zato bi bilo smiselno optimizirati eksperiment tako, da bi preučili, ali obstaja kakšna aktivacijska domena rastlinskega virusa, ki bi jo lahko vnesli v konstrukt [1]. Primer bi lahko bil gen AL2, ki v virusu mozaika zlatega paradižnika zapisuje za transkripcijski faktor, ki aktivira transkripcijo virusnega proteina ovojnice in gena BR1, ki je odgovoren za utišanje izražanja zapisa za protein ovojnice v tkivu žil rastlin [4]. Poleg tega ne bi rabili optimizirati rabe kodonov, ki je potrebna, ko vključujemo zapise iz drugih organizmov, kar lahko povzroči nestabilnost RNA. Prav tako moramo biti pozorni na dolžino konstrukta, saj lahko predolg vključek zmanjša stabilnost plazmida. Ideja za izboljšavo nivoja izražanja genov je lahko tudi ta, da dodamo še ligand vezavno domeno, ki je pogosto prisotna v sistemih za povišanje izražanja genov. Skratka, na voljo je veliko možnosti izboljšav, ki so vsekakor dobrodošle na tem področju. Z uporabo različnih logičnih vrat bi lahko prišli ne le do aktivatorjev transkripcije v rastlinah, temveč tudi do represorjev in kemijsko inducibilnih sistemov [1].

==Viri==

[1] A. C. Pfotenhauer idr., „Development of new binary expression systems for plant synthetic biology“, Plant Cell Rep, let. 43, št. 1, str. 22, jan. 2024, doi: 10.1007/s00299-023-03100-y.

[2] R. Chakravarti in V. Sahai, „Compactin - a review“, Appl Microbiol Biotechnol, let. 64, št. 5, str. 618–624, jun. 2004, doi: 10.1007/s00253-003-1553-7.

[3] T. Barwell, B. DeVeale, L. Poirier, J. Zheng, F. Seroude, in L. Seroude, „Regulating the UAS/GAL4 system in adult Drosophila with Tet-off GAL80 transgenes“, PeerJ, let. 5, str. e4167, dec. 2017, doi: 10.7717/peerj.4167.

[4] M. D. Hartitz, G. Sunter, in D. M. Bisaro, „The Tomato Golden Mosaic Virus Transactivator (TrAP) is a Single-Stranded DNA and Zinc-Binding Phosphoprotein with an Acidic Activation Domain“, Virology, let. 263, št. 1, str. 1–14, okt. 1999, doi: 10.1006/viro.1999.9925.

Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin

2024-05-05T23:42:50Z

Alliana Kolar:

Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s00299-023-03100-y Development of new binary expression systems for plant synthetic biology]

==Uvod==

Rastline imajo velik pomen v biotehnologiji, saj se z njimi ukvarjajo raziskave, povezane s prehransko varnostjo, prilagajanje vremenskim spremembam, razvoj fitosenzorjev in celo razvoj cepiv ter zdravil. Na žalost pa rastlinska biotehnologija že več desetletij ohranja standarden pristop k prekomernem izražanju transgenov. Zato so se v tem članku osredotočili na razvoj novega, modernejšega pristopa k prekomernem izražanju transgenov v rastlinah. Odločili so se, da bodo z ustvarjanjem konstruktov, ki so jih pridobili iz gruče genov mlc, razvili zapis za nov sintetičen mlcR, ki deluje kot aktivator transkripcije. Ta gruča genov je v glivi Penicillium citrinum odgovorna za biosintezo kompaktina [1].

===Kompaktin===

Kompaktin je znan tudi pod imenom Mevastatin ali ML-236B, spada pa v razred statinov, saj znižuje nivo holesterola v krvi. Njegova biokemijska vloga je kot kompetitivni inhibitor (HMG)-CoA reduktaze – encim, ki regulira biosintezo holesterola. V 38 kilobazno gručo genov, ki sodeluje v biosintezi kompaktina v P. citrinum, spadajo geni mlcA-H in mlcR, vključno z dvema genoma za poliketid sintazo in enim regulatornim genom, ki je odgovoren za biosintezo kompaktina [1, 2]. Protein MlcR deluje kot transkripcijski faktor oziroma aktivator, sestavljen je iz DNA-vezavne domene in aktivacijske domene. Specifično se veže na operator dolg 14 baznih parov, ki se nahaja med genoma mlcA in mlcC. Njegova vezava povzroči večje izražanje gena mlcA v primerjavi z mlcC (transkripcija poteka v nasprotnih smereh). Se pravi, več prisotnega MlcR povzroči večje količine kompaktina [1].

===Binarni ekspresijski sistem===

Standarden pristop za prekomerno izražanje transgena v rastlinah vključuje klasično uporabljanje konstitutivnega promotorja. Za natančnejše in bolj regulirano izražanje genov se lahko poslužimo binarnega ekspresijskega sistema. Pri rastlinah je ta praviloma sestavljen iz dveh komponent: en del vključuje transkripcijski faktor, drugi del pa operator, kamor se veže ta transkripcijski faktor in povzroča izražanje želenega gena. Najbolj znan binarni ekspresijski sistem je UAS/GAL4 [1]. Tega se sicer najpogosteje uporablja pri izražanju genov v Drosophili melanogaster. UAS (angl. upstream activating sequence) je zaporedje, ki je zapisano tik prej promotorjem za gen, ki ga želimo izražati, GAL4 pa transkripcijski faktor iz kvasovk. Ob vezavi GAL4 na UAS pride do aktivacije izražanja tarčnega gena. Ta sistem omogoča veliko fleksibilnost, saj lahko izražamo katerikoli želeni gen, poleg tega pa nam omogoča tkivno specifično izražanje in enostavno vklapljanje oziroma izklapljanje celotnega sistema transkripcije. Prav tako omogoča izražanje gena ne glede na stopnjo razvoja organizma [3].

==Cilj==

Cilj raziskave je bil, da bi biološko sintetizirali ustrezen transkripcijski faktor, ki bi ga bilo moč uporabiti pri aktivaciji izražanja genov v rastlinah. Najprej so sintetizirali dva zapisa za protein MlcR, vsak pa je pred sabo imel različen lasten operator (en od mlcA in en od mlcC), za sabo pa zapis za GFP, s katerim bi neposredno določili, kateri zapis je imel najvišji nivo izražanja po vstavljanju v Nicotiana benthamiana. Te z najvišjim nivojem izražanja so hoteli še dodatno izboljšati tako, da so ustvarili več variant sintetičnega transkripcijskega faktorja, kjer je bila spremenjena le aktivacijska domena. Za konec so želeli na transkripcijskem nivoju iz več vidikov določiti, kateri sestavljen konstrukt bi najbolj ustrezal za nov sintetični transkripcijski faktor, ki bi deloval kot aktivator transkripcije [1].

==Rezultati==

===Izbira operatorja===

V prvem koraku so se lotili izbire operatorjev, pri katerih bodo zaznali največjo aktivnost transkripcije. Sestavili so 8 različnih konstruktov, kjer sta vsakega od dveh transkripcijskih faktorjev (zapis za nativni MlcR in zapis za DNA-vezavno domeno MlcR z eno od sintetiziranih aktivacijskih domen, VP16) povezali s štirimi različnimi operatorji genov mlcA oziroma mlcC, kjer sta se dva enaka zapisa razlikovala po številu njunih ponovitev operatorskih zaporedij (1× mlcA, 4× mlcA, 1× mlcC in 4× mlcC). Vsak konstrukt je za vsemi temi zapisi imel še zapis za protein GFP, ki je služil kot reporterski gen. Sestavili so še 4 kontrolne konstrukte, ki so vsebovali samo reporterski del, se pravi brez dela s transkripcijskim faktorjem. Konstrukte so vstavili v vektor in jih infiltrirali v N. benthamiana. 72 ur pozneje so izmerili fluorescenco, kjer se je izkazalo, da je največji signal v primerjavi z kontrolnimi konstrukti dal konstrukt 4×mlcA-VP16, signal je bil dvakrat večji od kontrole. Zato so za nadaljnje poskuse uporabljali operator 4× mlcA [1].

===Izbira zapisa za aktivacijsko domeno===

V naslednji stopnji so želeli ugotoviti, katera aktivacijska domena bi lahko povzročila največjo transkripcijsko aktivnost. Sestavili so 5 konstruktov, kamor so vstavili 5 različnih aktivacijskih domen (VP16, VP64, VP128, TV in QF), za njimi je bil operator 4× mlcA in zapis za GFP. Za vsakega so imeli še kontrolni konstrukt brez zapisa za transkripcijski faktor. Vse te konstrukte so zopet vstavili v vektor in infiltrirali v N. benthamiana. Po istem postopku kot v prejšnjem eksperimentu so tudi tukaj merili fluorescenco in ugotovili, da je največji signal dal konstrukt z aktivacijsko domeno QF, in sicer aktivnost izražanja je bila 6-krat večja v primerjavi z kontrolo [1].

===Validacija aktivnosti v transgenski rastlini===

Da bi preverili, ali so zasnovani transkripcijski faktorji in promotorji transkripcijsko delujoči tako, kot se biološko pričakuje v rastlinah, so morali preveriti njihovo aktivnost. Pripravili so 29 linij (T0) transgenske rastline Nicotiana tabacum s tremi različnimi vektorskimi konstrukti (4× mlcA-VP16, 4× mlcA-QF in 4× mlcA), vsak je imel zapis za odpornost na higromicin (HygR). Vse linije so vzgojili do popolne zrelosti in zbrali njihova semema, da bi zasadili njihove potomce (T1) in z njimi analizirali aktivnost. Ker je reporterski sistem ostal enak, so aktivnost analizirali z merjenjem fluorescence, prav tako pa so določali izražanje gena za GFP, izražanje gena za transkripcijski faktor in izražanje HygR s qRT-PCR. Rezultati obeh metod so se ujemali – izkazalo se je, da je najvišja raven izražanja opažena pri liniji s konstruktom 4× mlcA-QF. Linije s konstruktom 4× mlcA-V16 so kljub manjšem izražanju zapisa za GFP imele v primerjavi z 4× mlcA-QF enak nivo izražanja transkripcijskih faktorjev, kar še dodatno okrepi to, da je trankripcijski faktor z aktivacijsko domeno QF zaslužen za povečano transkripcijo. Pri naslednji liniji (T2) je bil nivo izražanja zapisa za GFP še večje. Primerjali so tudi vitalnost transgenske rastline in rastline divjega tipa, pri čemer se je izkazalo, da ni nobenih negativnih fenotipskih učinkov na transgensko rastlino [1].

==Zaključek==

Glede na to, da v rastlinskih sistemih ne poznamo veliko transkripcijskih faktorjev za aktivacijo transkripcije transgenov, je to področje, na katerem je potrebno narediti še veliko raziskav. Že v tem primeru, ki je opisan v članku, je veliko možnosti za izboljšave, recimo modificiranje strukture aktivacijske domene. V tej raziskavi so aktivacijsko domeno povezali z DNA-vezavno domeno z zanko, ki je bila dolga 12 aminokislin s ponovitvami Gly-Ser. Zanimivo bi bilo preštudirati, ali z zamenjavo deležev teh dveh aminokislin ali pa z zamenjavo pozicije teh dveh domen pride do povečanega izražanja genov. Poleg tega bi lahko poskusili v eksperiment uvesti še več različnih konstruktov aktivacijskih domen. Recimo, aktivacijska domena VP16 izhaja iz človeškega virusa, zato bi bilo smiselno optimizirati eksperiment tako, da bi preučili, ali obstaja kakšna aktivacijska domena rastlinskega virusa, ki bi jo lahko vnesli v konstrukt [1]. Primer bi lahko bil gen AL2, ki v virusu mozaika zlatega paradižnika zapisuje za transkripcijski faktor, ki aktivira transkripcijo virusnega proteina ovojnice in gena BR1, ki je odgovoren za utišanje izražanja zapisa za protein ovojnice v tkivu žil rastlin [4]. Poleg tega ne bi rabili optimizirati rabe kodonov, ki je potrebna, ko vključujemo zapise iz drugih organizmov, kar lahko povzroči nestabilnost RNA. Prav tako moramo biti pozorni na dolžino konstrukta, saj lahko predolg vključek zmanjša stabilnost plazmida. Ideja za izboljšavo nivoja izražanja genov je lahko tudi ta, da dodamo še ligand vezavno domeno, ki je pogosto prisotna v sistemih za povišanje izražanja genov. Skratka, na voljo je veliko možnosti izboljšav, ki so vsekakor dobrodošle na tem področju. Z uporabo različnih logičnih vrat bi lahko prišli ne le do aktivatorjev transkripcije v rastlinah, temveč tudi do represorjev in kemijsko inducibilnih sistemov [1].

==Viri==

[1] A. C. Pfotenhauer idr., „Development of new binary expression systems for plant synthetic biology“, Plant Cell Rep, let. 43, št. 1, str. 22, jan. 2024, doi: 10.1007/s00299-023-03100-y.

[2] R. Chakravarti in V. Sahai, „Compactin - a review“, Appl Microbiol Biotechnol, let. 64, št. 5, str. 618–624, jun. 2004, doi: 10.1007/s00253-003-1553-7.

[3] T. Barwell, B. DeVeale, L. Poirier, J. Zheng, F. Seroude, in L. Seroude, „Regulating the UAS/GAL4 system in adult Drosophila with Tet-off GAL80 transgenes“, PeerJ, let. 5, str. e4167, dec. 2017, doi: 10.7717/peerj.4167.

[4] M. D. Hartitz, G. Sunter, in D. M. Bisaro, „The Tomato Golden Mosaic Virus Transactivator (TrAP) is a Single-Stranded DNA and Zinc-Binding Phosphoprotein with an Acidic Activation Domain“, Virology, let. 263, št. 1, str. 1–14, okt. 1999, doi: 10.1006/viro.1999.9925.

Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin

2024-05-05T23:41:00Z

Alliana Kolar:

Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s00299-023-03100-y Development of new binary expression systems for plant synthetic
biology]

==Uvod==

Rastline imajo velik pomen v biotehnologiji, saj se z njimi ukvarjajo raziskave, povezane s prehransko varnostjo, prilagajanje vremenskim spremembam, razvoj fitosenzorjev in celo razvoj cepiv ter zdravil. Na žalost pa rastlinska biotehnologija že več desetletij ohranja standarden pristop k prekomernem izražanju transgenov. Zato so se v tem članku osredotočili na razvoj novega, modernejšega pristopa k prekomernem izražanju transgenov v rastlinah. Odločili so se, da bodo z ustvarjanjem konstruktov, ki so jih pridobili iz gruče genov mlc, razvili zapis za nov sintetičen mlcR, ki deluje kot aktivator transkripcije. Ta gruča genov je v glivi Penicillium citrinum odgovorna za biosintezo kompaktina [1].

===Kompaktin===

Kompaktin je znan tudi pod imenom Mevastatin ali ML-236B, spada pa v razred statinov, saj znižuje nivo holesterola v krvi. Njegova biokemijska vloga je kot kompetitivni inhibitor (HMG)-CoA reduktaze – encim, ki regulira biosintezo holesterola. V 38 kilobazno gručo genov, ki sodeluje v biosintezi kompaktina v P. citrinum, spadajo geni mlcA-H in mlcR, vključno z dvema genoma za poliketid sintazo in enim regulatornim genom, ki je odgovoren za biosintezo kompaktina [1, 2]. Protein MlcR deluje kot transkripcijski faktor oziroma aktivator, sestavljen je iz DNA-vezavne domene in aktivacijske domene. Specifično se veže na operator dolg 14 baznih parov, ki se nahaja med genoma mlcA in mlcC. Njegova vezava povzroči večje izražanje gena mlcA v primerjavi z mlcC (transkripcija poteka v nasprotnih smereh). Se pravi, več prisotnega MlcR povzroči večje količine kompaktina [1].

===Binarni ekspresijski sistem===

Standarden pristop za prekomerno izražanje transgena v rastlinah vključuje klasično uporabljanje konstitutivnega promotorja. Za natančnejše in bolj regulirano izražanje genov se lahko poslužimo binarnega ekspresijskega sistema. Pri rastlinah je ta praviloma sestavljen iz dveh komponent: en del vključuje transkripcijski faktor, drugi del pa operator, kamor se veže ta transkripcijski faktor in povzroča izražanje želenega gena. Najbolj znan binarni ekspresijski sistem je UAS/GAL4 [1]. Tega se sicer najpogosteje uporablja pri izražanju genov v Drosophili melanogaster. UAS (angl. upstream activating sequence) je zaporedje, ki je zapisano tik prej promotorjem za gen, ki ga želimo izražati, GAL4 pa transkripcijski faktor iz kvasovk. Ob vezavi GAL4 na UAS pride do aktivacije izražanja tarčnega gena. Ta sistem omogoča veliko fleksibilnost, saj lahko izražamo katerikoli želeni gen, poleg tega pa nam omogoča tkivno specifično izražanje in enostavno vklapljanje oziroma izklapljanje celotnega sistema transkripcije. Prav tako omogoča izražanje gena ne glede na stopnjo razvoja organizma [3].

==Cilj==

Cilj raziskave je bil, da bi biološko sintetizirali ustrezen transkripcijski faktor, ki bi ga bilo moč uporabiti pri aktivaciji izražanja genov v rastlinah. Najprej so sintetizirali dva zapisa za protein MlcR, vsak pa je pred sabo imel različen lasten operator (en od mlcA in en od mlcC), za sabo pa zapis za GFP, s katerim bi neposredno določili, kateri zapis je imel najvišji nivo izražanja po vstavljanju v Nicotiana benthamiana. Te z najvišjim nivojem izražanja so hoteli še dodatno izboljšati tako, da so ustvarili več variant sintetičnega transkripcijskega faktorja, kjer je bila spremenjena le aktivacijska domena. Za konec so želeli na transkripcijskem nivoju iz več vidikov določiti, kateri sestavljen konstrukt bi najbolj ustrezal za nov sintetični transkripcijski faktor, ki bi deloval kot aktivator transkripcije [1].

==Rezultati==

===Izbira operatorja===

V prvem koraku so se lotili izbire operatorjev, pri katerih bodo zaznali največjo aktivnost transkripcije. Sestavili so 8 različnih konstruktov, kjer sta vsakega od dveh transkripcijskih faktorjev (zapis za nativni MlcR in zapis za DNA-vezavno domeno MlcR z eno od sintetiziranih aktivacijskih domen, VP16) povezali s štirimi različnimi operatorji genov mlcA oziroma mlcC, kjer sta se dva enaka zapisa razlikovala po številu njunih ponovitev operatorskih zaporedij (1× mlcA, 4× mlcA, 1× mlcC in 4× mlcC). Vsak konstrukt je za vsemi temi zapisi imel še zapis za protein GFP, ki je služil kot reporterski gen. Sestavili so še 4 kontrolne konstrukte, ki so vsebovali samo reporterski del, se pravi brez dela s transkripcijskim faktorjem. Konstrukte so vstavili v vektor in jih infiltrirali v N. benthamiana. 72 ur pozneje so izmerili fluorescenco, kjer se je izkazalo, da je največji signal v primerjavi z kontrolnimi konstrukti dal konstrukt 4×mlcA-VP16, signal je bil dvakrat večji od kontrole. Zato so za nadaljnje poskuse uporabljali operator 4× mlcA [1].

===Izbira zapisa za aktivacijsko domeno===

V naslednji stopnji so želeli ugotoviti, katera aktivacijska domena bi lahko povzročila največjo transkripcijsko aktivnost. Sestavili so 5 konstruktov, kamor so vstavili 5 različnih aktivacijskih domen (VP16, VP64, VP128, TV in QF), za njimi je bil operator 4× mlcA in zapis za GFP. Za vsakega so imeli še kontrolni konstrukt brez zapisa za transkripcijski faktor. Vse te konstrukte so zopet vstavili v vektor in infiltrirali v N. benthamiana. Po istem postopku kot v prejšnjem eksperimentu so tudi tukaj merili fluorescenco in ugotovili, da je največji signal dal konstrukt z aktivacijsko domeno QF, in sicer aktivnost izražanja je bila 6-krat večja v primerjavi z kontrolo [1].

===Validacija aktivnosti v transgenski rastlini===

Da bi preverili, ali so zasnovani transkripcijski faktorji in promotorji transkripcijsko delujoči tako, kot se biološko pričakuje v rastlinah, so morali preveriti njihovo aktivnost. Pripravili so 29 linij (T0) transgenske rastline Nicotiana tabacum s tremi različnimi vektorskimi konstrukti (4× mlcA-VP16, 4× mlcA-QF in 4× mlcA), vsak je imel zapis za odpornost na higromicin (HygR). Vse linije so vzgojili do popolne zrelosti in zbrali njihova semema, da bi zasadili njihove potomce (T1) in z njimi analizirali aktivnost. Ker je reporterski sistem ostal enak, so aktivnost analizirali z merjenjem fluorescence, prav tako pa so določali izražanje gena za GFP, izražanje gena za transkripcijski faktor in izražanje HygR s qRT-PCR. Rezultati obeh metod so se ujemali – izkazalo se je, da je najvišja raven izražanja opažena pri liniji s konstruktom 4× mlcA-QF. Linije s konstruktom 4× mlcA-V16 so kljub manjšem izražanju zapisa za GFP imele v primerjavi z 4× mlcA-QF enak nivo izražanja transkripcijskih faktorjev, kar še dodatno okrepi to, da je trankripcijski faktor z aktivacijsko domeno QF zaslužen za povečano transkripcijo. Pri naslednji liniji (T2) je bil nivo izražanja zapisa za GFP še večje. Primerjali so tudi vitalnost transgenske rastline in rastline divjega tipa, pri čemer se je izkazalo, da ni nobenih negativnih fenotipskih učinkov na transgensko rastlino [1].

==Zaključek==

Glede na to, da v rastlinskih sistemih ne poznamo veliko transkripcijskih faktorjev za aktivacijo transkripcije transgenov, je to področje, na katerem je potrebno narediti še veliko raziskav. Že v tem primeru, ki je opisan v članku, je veliko možnosti za izboljšave, recimo modificiranje strukture aktivacijske domene. V tej raziskavi so aktivacijsko domeno povezali z DNA-vezavno domeno z zanko, ki je bila dolga 12 aminokislin s ponovitvami Gly-Ser. Zanimivo bi bilo preštudirati, ali z zamenjavo deležev teh dveh aminokislin ali pa z zamenjavo pozicije teh dveh domen pride do povečanega izražanja genov. Poleg tega bi lahko poskusili v eksperiment uvesti še več različnih konstruktov aktivacijskih domen. Recimo, aktivacijska domena VP16 izhaja iz človeškega virusa, zato bi bilo smiselno optimizirati eksperiment tako, da bi preučili, ali obstaja kakšna aktivacijska domena rastlinskega virusa, ki bi jo lahko vnesli v konstrukt [1]. Primer bi lahko bil gen AL2, ki v virusu mozaika zlatega paradižnika zapisuje za transkripcijski faktor, ki aktivira transkripcijo virusnega proteina ovojnice in gena BR1, ki je odgovoren za utišanje izražanja zapisa za protein ovojnice v tkivu žil rastlin [4]. Poleg tega ne bi rabili optimizirati rabe kodonov, ki je potrebna, ko vključujemo zapise iz drugih organizmov, kar lahko povzroči nestabilnost RNA. Prav tako moramo biti pozorni na dolžino konstrukta, saj lahko predolg vključek zmanjša stabilnost plazmida. Ideja za izboljšavo nivoja izražanja genov je lahko tudi ta, da dodamo še ligand vezavno domeno, ki je pogosto prisotna v sistemih za povišanje izražanja genov. Skratka, na voljo je veliko možnosti izboljšav, ki so vsekakor dobrodošle na tem področju. Z uporabo različnih logičnih vrat bi lahko prišli ne le do aktivatorjev transkripcije v rastlinah, temveč tudi do represorjev in kemijsko inducibilnih sistemov [1].

==Viri==

[1] A. C. Pfotenhauer idr., „Development of new binary expression systems for plant synthetic biology“, Plant Cell Rep, let. 43, št. 1, str. 22, jan. 2024, doi: 10.1007/s00299-023-03100-y.

[2] R. Chakravarti in V. Sahai, „Compactin - a review“, Appl Microbiol Biotechnol, let. 64, št. 5, str. 618–624, jun. 2004, doi: 10.1007/s00253-003-1553-7.

[3] T. Barwell, B. DeVeale, L. Poirier, J. Zheng, F. Seroude, in L. Seroude, „Regulating the UAS/GAL4 system in adult Drosophila with Tet-off GAL80 transgenes“, PeerJ, let. 5, str. e4167, dec. 2017, doi: 10.7717/peerj.4167.

[4] M. D. Hartitz, G. Sunter, in D. M. Bisaro, „The Tomato Golden Mosaic Virus Transactivator (TrAP) is a Single-Stranded DNA and Zinc-Binding Phosphoprotein with an Acidic Activation Domain“, Virology, let. 263, št. 1, str. 1–14, okt. 1999, doi: 10.1006/viro.1999.9925.

Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin

2024-05-05T23:40:08Z

Alliana Kolar:

Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s00299-023-03100-y# Development of new binary expression systems for plant synthetic
biology]

==Uvod==

Rastline imajo velik pomen v biotehnologiji, saj se z njimi ukvarjajo raziskave, povezane s prehransko varnostjo, prilagajanje vremenskim spremembam, razvoj fitosenzorjev in celo razvoj cepiv ter zdravil. Na žalost pa rastlinska biotehnologija že več desetletij ohranja standarden pristop k prekomernem izražanju transgenov. Zato so se v tem članku osredotočili na razvoj novega, modernejšega pristopa k prekomernem izražanju transgenov v rastlinah. Odločili so se, da bodo z ustvarjanjem konstruktov, ki so jih pridobili iz gruče genov mlc, razvili zapis za nov sintetičen mlcR, ki deluje kot aktivator transkripcije. Ta gruča genov je v glivi Penicillium citrinum odgovorna za biosintezo kompaktina [1].

===Kompaktin===

Kompaktin je znan tudi pod imenom Mevastatin ali ML-236B, spada pa v razred statinov, saj znižuje nivo holesterola v krvi. Njegova biokemijska vloga je kot kompetitivni inhibitor (HMG)-CoA reduktaze – encim, ki regulira biosintezo holesterola. V 38 kilobazno gručo genov, ki sodeluje v biosintezi kompaktina v P. citrinum, spadajo geni mlcA-H in mlcR, vključno z dvema genoma za poliketid sintazo in enim regulatornim genom, ki je odgovoren za biosintezo kompaktina [1, 2]. Protein MlcR deluje kot transkripcijski faktor oziroma aktivator, sestavljen je iz DNA-vezavne domene in aktivacijske domene. Specifično se veže na operator dolg 14 baznih parov, ki se nahaja med genoma mlcA in mlcC. Njegova vezava povzroči večje izražanje gena mlcA v primerjavi z mlcC (transkripcija poteka v nasprotnih smereh). Se pravi, več prisotnega MlcR povzroči večje količine kompaktina [1].

===Binarni ekspresijski sistem===

Standarden pristop za prekomerno izražanje transgena v rastlinah vključuje klasično uporabljanje konstitutivnega promotorja. Za natančnejše in bolj regulirano izražanje genov se lahko poslužimo binarnega ekspresijskega sistema. Pri rastlinah je ta praviloma sestavljen iz dveh komponent: en del vključuje transkripcijski faktor, drugi del pa operator, kamor se veže ta transkripcijski faktor in povzroča izražanje želenega gena. Najbolj znan binarni ekspresijski sistem je UAS/GAL4 [1]. Tega se sicer najpogosteje uporablja pri izražanju genov v Drosophili melanogaster. UAS (angl. upstream activating sequence) je zaporedje, ki je zapisano tik prej promotorjem za gen, ki ga želimo izražati, GAL4 pa transkripcijski faktor iz kvasovk. Ob vezavi GAL4 na UAS pride do aktivacije izražanja tarčnega gena. Ta sistem omogoča veliko fleksibilnost, saj lahko izražamo katerikoli želeni gen, poleg tega pa nam omogoča tkivno specifično izražanje in enostavno vklapljanje oziroma izklapljanje celotnega sistema transkripcije. Prav tako omogoča izražanje gena ne glede na stopnjo razvoja organizma [3].

==Cilj==

Cilj raziskave je bil, da bi biološko sintetizirali ustrezen transkripcijski faktor, ki bi ga bilo moč uporabiti pri aktivaciji izražanja genov v rastlinah. Najprej so sintetizirali dva zapisa za protein MlcR, vsak pa je pred sabo imel različen lasten operator (en od mlcA in en od mlcC), za sabo pa zapis za GFP, s katerim bi neposredno določili, kateri zapis je imel najvišji nivo izražanja po vstavljanju v Nicotiana benthamiana. Te z najvišjim nivojem izražanja so hoteli še dodatno izboljšati tako, da so ustvarili več variant sintetičnega transkripcijskega faktorja, kjer je bila spremenjena le aktivacijska domena. Za konec so želeli na transkripcijskem nivoju iz več vidikov določiti, kateri sestavljen konstrukt bi najbolj ustrezal za nov sintetični transkripcijski faktor, ki bi deloval kot aktivator transkripcije [1].

==Rezultati==

===Izbira operatorja===

V prvem koraku so se lotili izbire operatorjev, pri katerih bodo zaznali največjo aktivnost transkripcije. Sestavili so 8 različnih konstruktov, kjer sta vsakega od dveh transkripcijskih faktorjev (zapis za nativni MlcR in zapis za DNA-vezavno domeno MlcR z eno od sintetiziranih aktivacijskih domen, VP16) povezali s štirimi različnimi operatorji genov mlcA oziroma mlcC, kjer sta se dva enaka zapisa razlikovala po številu njunih ponovitev operatorskih zaporedij (1× mlcA, 4× mlcA, 1× mlcC in 4× mlcC). Vsak konstrukt je za vsemi temi zapisi imel še zapis za protein GFP, ki je služil kot reporterski gen. Sestavili so še 4 kontrolne konstrukte, ki so vsebovali samo reporterski del, se pravi brez dela s transkripcijskim faktorjem. Konstrukte so vstavili v vektor in jih infiltrirali v N. benthamiana. 72 ur pozneje so izmerili fluorescenco, kjer se je izkazalo, da je največji signal v primerjavi z kontrolnimi konstrukti dal konstrukt 4×mlcA-VP16, signal je bil dvakrat večji od kontrole. Zato so za nadaljnje poskuse uporabljali operator 4× mlcA [1].

===Izbira zapisa za aktivacijsko domeno===

V naslednji stopnji so želeli ugotoviti, katera aktivacijska domena bi lahko povzročila največjo transkripcijsko aktivnost. Sestavili so 5 konstruktov, kamor so vstavili 5 različnih aktivacijskih domen (VP16, VP64, VP128, TV in QF), za njimi je bil operator 4× mlcA in zapis za GFP. Za vsakega so imeli še kontrolni konstrukt brez zapisa za transkripcijski faktor. Vse te konstrukte so zopet vstavili v vektor in infiltrirali v N. benthamiana. Po istem postopku kot v prejšnjem eksperimentu so tudi tukaj merili fluorescenco in ugotovili, da je največji signal dal konstrukt z aktivacijsko domeno QF, in sicer aktivnost izražanja je bila 6-krat večja v primerjavi z kontrolo [1].

===Validacija aktivnosti v transgenski rastlini===

Da bi preverili, ali so zasnovani transkripcijski faktorji in promotorji transkripcijsko delujoči tako, kot se biološko pričakuje v rastlinah, so morali preveriti njihovo aktivnost. Pripravili so 29 linij (T0) transgenske rastline Nicotiana tabacum s tremi različnimi vektorskimi konstrukti (4× mlcA-VP16, 4× mlcA-QF in 4× mlcA), vsak je imel zapis za odpornost na higromicin (HygR). Vse linije so vzgojili do popolne zrelosti in zbrali njihova semema, da bi zasadili njihove potomce (T1) in z njimi analizirali aktivnost. Ker je reporterski sistem ostal enak, so aktivnost analizirali z merjenjem fluorescence, prav tako pa so določali izražanje gena za GFP, izražanje gena za transkripcijski faktor in izražanje HygR s qRT-PCR. Rezultati obeh metod so se ujemali – izkazalo se je, da je najvišja raven izražanja opažena pri liniji s konstruktom 4× mlcA-QF. Linije s konstruktom 4× mlcA-V16 so kljub manjšem izražanju zapisa za GFP imele v primerjavi z 4× mlcA-QF enak nivo izražanja transkripcijskih faktorjev, kar še dodatno okrepi to, da je trankripcijski faktor z aktivacijsko domeno QF zaslužen za povečano transkripcijo. Pri naslednji liniji (T2) je bil nivo izražanja zapisa za GFP še večje. Primerjali so tudi vitalnost transgenske rastline in rastline divjega tipa, pri čemer se je izkazalo, da ni nobenih negativnih fenotipskih učinkov na transgensko rastlino [1].

==Zaključek==

Glede na to, da v rastlinskih sistemih ne poznamo veliko transkripcijskih faktorjev za aktivacijo transkripcije transgenov, je to področje, na katerem je potrebno narediti še veliko raziskav. Že v tem primeru, ki je opisan v članku, je veliko možnosti za izboljšave, recimo modificiranje strukture aktivacijske domene. V tej raziskavi so aktivacijsko domeno povezali z DNA-vezavno domeno z zanko, ki je bila dolga 12 aminokislin s ponovitvami Gly-Ser. Zanimivo bi bilo preštudirati, ali z zamenjavo deležev teh dveh aminokislin ali pa z zamenjavo pozicije teh dveh domen pride do povečanega izražanja genov. Poleg tega bi lahko poskusili v eksperiment uvesti še več različnih konstruktov aktivacijskih domen. Recimo, aktivacijska domena VP16 izhaja iz človeškega virusa, zato bi bilo smiselno optimizirati eksperiment tako, da bi preučili, ali obstaja kakšna aktivacijska domena rastlinskega virusa, ki bi jo lahko vnesli v konstrukt [1]. Primer bi lahko bil gen AL2, ki v virusu mozaika zlatega paradižnika zapisuje za transkripcijski faktor, ki aktivira transkripcijo virusnega proteina ovojnice in gena BR1, ki je odgovoren za utišanje izražanja zapisa za protein ovojnice v tkivu žil rastlin [4]. Poleg tega ne bi rabili optimizirati rabe kodonov, ki je potrebna, ko vključujemo zapise iz drugih organizmov, kar lahko povzroči nestabilnost RNA. Prav tako moramo biti pozorni na dolžino konstrukta, saj lahko predolg vključek zmanjša stabilnost plazmida. Ideja za izboljšavo nivoja izražanja genov je lahko tudi ta, da dodamo še ligand vezavno domeno, ki je pogosto prisotna v sistemih za povišanje izražanja genov. Skratka, na voljo je veliko možnosti izboljšav, ki so vsekakor dobrodošle na tem področju. Z uporabo različnih logičnih vrat bi lahko prišli ne le do aktivatorjev transkripcije v rastlinah, temveč tudi do represorjev in kemijsko inducibilnih sistemov [1].

==Viri==

[1] A. C. Pfotenhauer idr., „Development of new binary expression systems for plant synthetic biology“, Plant Cell Rep, let. 43, št. 1, str. 22, jan. 2024, doi: 10.1007/s00299-023-03100-y.

[2] R. Chakravarti in V. Sahai, „Compactin - a review“, Appl Microbiol Biotechnol, let. 64, št. 5, str. 618–624, jun. 2004, doi: 10.1007/s00253-003-1553-7.

[3] T. Barwell, B. DeVeale, L. Poirier, J. Zheng, F. Seroude, in L. Seroude, „Regulating the UAS/GAL4 system in adult Drosophila with Tet-off GAL80 transgenes“, PeerJ, let. 5, str. e4167, dec. 2017, doi: 10.7717/peerj.4167.

[4] M. D. Hartitz, G. Sunter, in D. M. Bisaro, „The Tomato Golden Mosaic Virus Transactivator (TrAP) is a Single-Stranded DNA and Zinc-Binding Phosphoprotein with an Acidic Activation Domain“, Virology, let. 263, št. 1, str. 1–14, okt. 1999, doi: 10.1006/viro.1999.9925.

Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin

2024-05-05T23:38:02Z

Alliana Kolar: /* Zaključek */

Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s00299-023-03100-y Development of new binary expression systems for plant synthetic
biology]

==Uvod==

Rastline imajo velik pomen v biotehnologiji, saj se z njimi ukvarjajo raziskave, povezane s prehransko varnostjo, prilagajanje vremenskim spremembam, razvoj fitosenzorjev in celo razvoj cepiv ter zdravil. Na žalost pa rastlinska biotehnologija že več desetletij ohranja standarden pristop k prekomernem izražanju transgenov. Zato so se v tem članku osredotočili na razvoj novega, modernejšega pristopa k prekomernem izražanju transgenov v rastlinah. Odločili so se, da bodo z ustvarjanjem konstruktov, ki so jih pridobili iz gruče genov mlc, razvili zapis za nov sintetičen mlcR, ki deluje kot aktivator transkripcije. Ta gruča genov je v glivi Penicillium citrinum odgovorna za biosintezo kompaktina [1].

===Kompaktin===

Kompaktin je znan tudi pod imenom Mevastatin ali ML-236B, spada pa v razred statinov, saj znižuje nivo holesterola v krvi. Njegova biokemijska vloga je kot kompetitivni inhibitor (HMG)-CoA reduktaze – encim, ki regulira biosintezo holesterola. V 38 kilobazno gručo genov, ki sodeluje v biosintezi kompaktina v P. citrinum, spadajo geni mlcA-H in mlcR, vključno z dvema genoma za poliketid sintazo in enim regulatornim genom, ki je odgovoren za biosintezo kompaktina [1, 2]. Protein MlcR deluje kot transkripcijski faktor oziroma aktivator, sestavljen je iz DNA-vezavne domene in aktivacijske domene. Specifično se veže na operator dolg 14 baznih parov, ki se nahaja med genoma mlcA in mlcC. Njegova vezava povzroči večje izražanje gena mlcA v primerjavi z mlcC (transkripcija poteka v nasprotnih smereh). Se pravi, več prisotnega MlcR povzroči večje količine kompaktina [1].

===Binarni ekspresijski sistem===

Standarden pristop za prekomerno izražanje transgena v rastlinah vključuje klasično uporabljanje konstitutivnega promotorja. Za natančnejše in bolj regulirano izražanje genov se lahko poslužimo binarnega ekspresijskega sistema. Pri rastlinah je ta praviloma sestavljen iz dveh komponent: en del vključuje transkripcijski faktor, drugi del pa operator, kamor se veže ta transkripcijski faktor in povzroča izražanje želenega gena. Najbolj znan binarni ekspresijski sistem je UAS/GAL4 [1]. Tega se sicer najpogosteje uporablja pri izražanju genov v Drosophili melanogaster. UAS (angl. upstream activating sequence) je zaporedje, ki je zapisano tik prej promotorjem za gen, ki ga želimo izražati, GAL4 pa transkripcijski faktor iz kvasovk. Ob vezavi GAL4 na UAS pride do aktivacije izražanja tarčnega gena. Ta sistem omogoča veliko fleksibilnost, saj lahko izražamo katerikoli želeni gen, poleg tega pa nam omogoča tkivno specifično izražanje in enostavno vklapljanje oziroma izklapljanje celotnega sistema transkripcije. Prav tako omogoča izražanje gena ne glede na stopnjo razvoja organizma [3].

==Cilj==

Cilj raziskave je bil, da bi biološko sintetizirali ustrezen transkripcijski faktor, ki bi ga bilo moč uporabiti pri aktivaciji izražanja genov v rastlinah. Najprej so sintetizirali dva zapisa za protein MlcR, vsak pa je pred sabo imel različen lasten operator (en od mlcA in en od mlcC), za sabo pa zapis za GFP, s katerim bi neposredno določili, kateri zapis je imel najvišji nivo izražanja po vstavljanju v Nicotiana benthamiana. Te z najvišjim nivojem izražanja so hoteli še dodatno izboljšati tako, da so ustvarili več variant sintetičnega transkripcijskega faktorja, kjer je bila spremenjena le aktivacijska domena. Za konec so želeli na transkripcijskem nivoju iz več vidikov določiti, kateri sestavljen konstrukt bi najbolj ustrezal za nov sintetični transkripcijski faktor, ki bi deloval kot aktivator transkripcije [1].

==Rezultati==

===Izbira operatorja===

V prvem koraku so se lotili izbire operatorjev, pri katerih bodo zaznali največjo aktivnost transkripcije. Sestavili so 8 različnih konstruktov, kjer sta vsakega od dveh transkripcijskih faktorjev (zapis za nativni MlcR in zapis za DNA-vezavno domeno MlcR z eno od sintetiziranih aktivacijskih domen, VP16) povezali s štirimi različnimi operatorji genov mlcA oziroma mlcC, kjer sta se dva enaka zapisa razlikovala po številu njunih ponovitev operatorskih zaporedij (1× mlcA, 4× mlcA, 1× mlcC in 4× mlcC). Vsak konstrukt je za vsemi temi zapisi imel še zapis za protein GFP, ki je služil kot reporterski gen. Sestavili so še 4 kontrolne konstrukte, ki so vsebovali samo reporterski del, se pravi brez dela s transkripcijskim faktorjem. Konstrukte so vstavili v vektor in jih infiltrirali v N. benthamiana. 72 ur pozneje so izmerili fluorescenco, kjer se je izkazalo, da je največji signal v primerjavi z kontrolnimi konstrukti dal konstrukt 4×mlcA-VP16, signal je bil dvakrat večji od kontrole. Zato so za nadaljnje poskuse uporabljali operator 4× mlcA [1].

===Izbira zapisa za aktivacijsko domeno===

V naslednji stopnji so želeli ugotoviti, katera aktivacijska domena bi lahko povzročila največjo transkripcijsko aktivnost. Sestavili so 5 konstruktov, kamor so vstavili 5 različnih aktivacijskih domen (VP16, VP64, VP128, TV in QF), za njimi je bil operator 4× mlcA in zapis za GFP. Za vsakega so imeli še kontrolni konstrukt brez zapisa za transkripcijski faktor. Vse te konstrukte so zopet vstavili v vektor in infiltrirali v N. benthamiana. Po istem postopku kot v prejšnjem eksperimentu so tudi tukaj merili fluorescenco in ugotovili, da je največji signal dal konstrukt z aktivacijsko domeno QF, in sicer aktivnost izražanja je bila 6-krat večja v primerjavi z kontrolo [1].

===Validacija aktivnosti v transgenski rastlini===

Da bi preverili, ali so zasnovani transkripcijski faktorji in promotorji transkripcijsko delujoči tako, kot se biološko pričakuje v rastlinah, so morali preveriti njihovo aktivnost. Pripravili so 29 linij (T0) transgenske rastline Nicotiana tabacum s tremi različnimi vektorskimi konstrukti (4× mlcA-VP16, 4× mlcA-QF in 4× mlcA), vsak je imel zapis za odpornost na higromicin (HygR). Vse linije so vzgojili do popolne zrelosti in zbrali njihova semema, da bi zasadili njihove potomce (T1) in z njimi analizirali aktivnost. Ker je reporterski sistem ostal enak, so aktivnost analizirali z merjenjem fluorescence, prav tako pa so določali izražanje gena za GFP, izražanje gena za transkripcijski faktor in izražanje HygR s qRT-PCR. Rezultati obeh metod so se ujemali – izkazalo se je, da je najvišja raven izražanja opažena pri liniji s konstruktom 4× mlcA-QF. Linije s konstruktom 4× mlcA-V16 so kljub manjšem izražanju zapisa za GFP imele v primerjavi z 4× mlcA-QF enak nivo izražanja transkripcijskih faktorjev, kar še dodatno okrepi to, da je trankripcijski faktor z aktivacijsko domeno QF zaslužen za povečano transkripcijo. Pri naslednji liniji (T2) je bil nivo izražanja zapisa za GFP še večje. Primerjali so tudi vitalnost transgenske rastline in rastline divjega tipa, pri čemer se je izkazalo, da ni nobenih negativnih fenotipskih učinkov na transgensko rastlino [1].

==Zaključek==

Glede na to, da v rastlinskih sistemih ne poznamo veliko transkripcijskih faktorjev za aktivacijo transkripcije transgenov, je to področje, na katerem je potrebno narediti še veliko raziskav. Že v tem primeru, ki je opisan v članku, je veliko možnosti za izboljšave, recimo modificiranje strukture aktivacijske domene. V tej raziskavi so aktivacijsko domeno povezali z DNA-vezavno domeno z zanko, ki je bila dolga 12 aminokislin s ponovitvami Gly-Ser. Zanimivo bi bilo preštudirati, ali z zamenjavo deležev teh dveh aminokislin ali pa z zamenjavo pozicije teh dveh domen pride do povečanega izražanja genov. Poleg tega bi lahko poskusili v eksperiment uvesti še več različnih konstruktov aktivacijskih domen. Recimo, aktivacijska domena VP16 izhaja iz človeškega virusa, zato bi bilo smiselno optimizirati eksperiment tako, da bi preučili, ali obstaja kakšna aktivacijska domena rastlinskega virusa, ki bi jo lahko vnesli v konstrukt [1]. Primer bi lahko bil gen AL2, ki v virusu mozaika zlatega paradižnika zapisuje za transkripcijski faktor, ki aktivira transkripcijo virusnega proteina ovojnice in gena BR1, ki je odgovoren za utišanje izražanja zapisa za protein ovojnice v tkivu žil rastlin [4]. Poleg tega ne bi rabili optimizirati rabe kodonov, ki je potrebna, ko vključujemo zapise iz drugih organizmov, kar lahko povzroči nestabilnost RNA. Prav tako moramo biti pozorni na dolžino konstrukta, saj lahko predolg vključek zmanjša stabilnost plazmida. Ideja za izboljšavo nivoja izražanja genov je lahko tudi ta, da dodamo še ligand vezavno domeno, ki je pogosto prisotna v sistemih za povišanje izražanja genov. Skratka, na voljo je veliko možnosti izboljšav, ki so vsekakor dobrodošle na tem področju. Z uporabo različnih logičnih vrat bi lahko prišli ne le do aktivatorjev transkripcije v rastlinah, temveč tudi do represorjev in kemijsko inducibilnih sistemov [1].

==Viri==

[1] A. C. Pfotenhauer idr., „Development of new binary expression systems for plant synthetic biology“, Plant Cell Rep, let. 43, št. 1, str. 22, jan. 2024, doi: 10.1007/s00299-023-03100-y.

[2] R. Chakravarti in V. Sahai, „Compactin - a review“, Appl Microbiol Biotechnol, let. 64, št. 5, str. 618–624, jun. 2004, doi: 10.1007/s00253-003-1553-7.

[3] T. Barwell, B. DeVeale, L. Poirier, J. Zheng, F. Seroude, in L. Seroude, „Regulating the UAS/GAL4 system in adult Drosophila with Tet-off GAL80 transgenes“, PeerJ, let. 5, str. e4167, dec. 2017, doi: 10.7717/peerj.4167.

[4] M. D. Hartitz, G. Sunter, in D. M. Bisaro, „The Tomato Golden Mosaic Virus Transactivator (TrAP) is a Single-Stranded DNA and Zinc-Binding Phosphoprotein with an Acidic Activation Domain“, Virology, let. 263, št. 1, str. 1–14, okt. 1999, doi: 10.1006/viro.1999.9925.

Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin

2024-05-05T23:33:30Z

Alliana Kolar: /* Cilj */

Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s00299-023-03100-y Development of new binary expression systems for plant synthetic
biology]

==Uvod==

Rastline imajo velik pomen v biotehnologiji, saj se z njimi ukvarjajo raziskave, povezane s prehransko varnostjo, prilagajanje vremenskim spremembam, razvoj fitosenzorjev in celo razvoj cepiv ter zdravil. Na žalost pa rastlinska biotehnologija že več desetletij ohranja standarden pristop k prekomernem izražanju transgenov. Zato so se v tem članku osredotočili na razvoj novega, modernejšega pristopa k prekomernem izražanju transgenov v rastlinah. Odločili so se, da bodo z ustvarjanjem konstruktov, ki so jih pridobili iz gruče genov mlc, razvili zapis za nov sintetičen mlcR, ki deluje kot aktivator transkripcije. Ta gruča genov je v glivi Penicillium citrinum odgovorna za biosintezo kompaktina [1].

===Kompaktin===

Kompaktin je znan tudi pod imenom Mevastatin ali ML-236B, spada pa v razred statinov, saj znižuje nivo holesterola v krvi. Njegova biokemijska vloga je kot kompetitivni inhibitor (HMG)-CoA reduktaze – encim, ki regulira biosintezo holesterola. V 38 kilobazno gručo genov, ki sodeluje v biosintezi kompaktina v P. citrinum, spadajo geni mlcA-H in mlcR, vključno z dvema genoma za poliketid sintazo in enim regulatornim genom, ki je odgovoren za biosintezo kompaktina [1, 2]. Protein MlcR deluje kot transkripcijski faktor oziroma aktivator, sestavljen je iz DNA-vezavne domene in aktivacijske domene. Specifično se veže na operator dolg 14 baznih parov, ki se nahaja med genoma mlcA in mlcC. Njegova vezava povzroči večje izražanje gena mlcA v primerjavi z mlcC (transkripcija poteka v nasprotnih smereh). Se pravi, več prisotnega MlcR povzroči večje količine kompaktina [1].

===Binarni ekspresijski sistem===

Standarden pristop za prekomerno izražanje transgena v rastlinah vključuje klasično uporabljanje konstitutivnega promotorja. Za natančnejše in bolj regulirano izražanje genov se lahko poslužimo binarnega ekspresijskega sistema. Pri rastlinah je ta praviloma sestavljen iz dveh komponent: en del vključuje transkripcijski faktor, drugi del pa operator, kamor se veže ta transkripcijski faktor in povzroča izražanje želenega gena. Najbolj znan binarni ekspresijski sistem je UAS/GAL4 [1]. Tega se sicer najpogosteje uporablja pri izražanju genov v Drosophili melanogaster. UAS (angl. upstream activating sequence) je zaporedje, ki je zapisano tik prej promotorjem za gen, ki ga želimo izražati, GAL4 pa transkripcijski faktor iz kvasovk. Ob vezavi GAL4 na UAS pride do aktivacije izražanja tarčnega gena. Ta sistem omogoča veliko fleksibilnost, saj lahko izražamo katerikoli želeni gen, poleg tega pa nam omogoča tkivno specifično izražanje in enostavno vklapljanje oziroma izklapljanje celotnega sistema transkripcije. Prav tako omogoča izražanje gena ne glede na stopnjo razvoja organizma [3].

==Cilj==

Cilj raziskave je bil, da bi biološko sintetizirali ustrezen transkripcijski faktor, ki bi ga bilo moč uporabiti pri aktivaciji izražanja genov v rastlinah. Najprej so sintetizirali dva zapisa za protein MlcR, vsak pa je pred sabo imel različen lasten operator (en od mlcA in en od mlcC), za sabo pa zapis za GFP, s katerim bi neposredno določili, kateri zapis je imel najvišji nivo izražanja po vstavljanju v Nicotiana benthamiana. Te z najvišjim nivojem izražanja so hoteli še dodatno izboljšati tako, da so ustvarili več variant sintetičnega transkripcijskega faktorja, kjer je bila spremenjena le aktivacijska domena. Za konec so želeli na transkripcijskem nivoju iz več vidikov določiti, kateri sestavljen konstrukt bi najbolj ustrezal za nov sintetični transkripcijski faktor, ki bi deloval kot aktivator transkripcije [1].

==Rezultati==

===Izbira operatorja===

V prvem koraku so se lotili izbire operatorjev, pri katerih bodo zaznali največjo aktivnost transkripcije. Sestavili so 8 različnih konstruktov, kjer sta vsakega od dveh transkripcijskih faktorjev (zapis za nativni MlcR in zapis za DNA-vezavno domeno MlcR z eno od sintetiziranih aktivacijskih domen, VP16) povezali s štirimi različnimi operatorji genov mlcA oziroma mlcC, kjer sta se dva enaka zapisa razlikovala po številu njunih ponovitev operatorskih zaporedij (1× mlcA, 4× mlcA, 1× mlcC in 4× mlcC). Vsak konstrukt je za vsemi temi zapisi imel še zapis za protein GFP, ki je služil kot reporterski gen. Sestavili so še 4 kontrolne konstrukte, ki so vsebovali samo reporterski del, se pravi brez dela s transkripcijskim faktorjem. Konstrukte so vstavili v vektor in jih infiltrirali v N. benthamiana. 72 ur pozneje so izmerili fluorescenco, kjer se je izkazalo, da je največji signal v primerjavi z kontrolnimi konstrukti dal konstrukt 4×mlcA-VP16, signal je bil dvakrat večji od kontrole. Zato so za nadaljnje poskuse uporabljali operator 4× mlcA [1].

===Izbira zapisa za aktivacijsko domeno===

V naslednji stopnji so želeli ugotoviti, katera aktivacijska domena bi lahko povzročila največjo transkripcijsko aktivnost. Sestavili so 5 konstruktov, kamor so vstavili 5 različnih aktivacijskih domen (VP16, VP64, VP128, TV in QF), za njimi je bil operator 4× mlcA in zapis za GFP. Za vsakega so imeli še kontrolni konstrukt brez zapisa za transkripcijski faktor. Vse te konstrukte so zopet vstavili v vektor in infiltrirali v N. benthamiana. Po istem postopku kot v prejšnjem eksperimentu so tudi tukaj merili fluorescenco in ugotovili, da je največji signal dal konstrukt z aktivacijsko domeno QF, in sicer aktivnost izražanja je bila 6-krat večja v primerjavi z kontrolo [1].

===Validacija aktivnosti v transgenski rastlini===

Da bi preverili, ali so zasnovani transkripcijski faktorji in promotorji transkripcijsko delujoči tako, kot se biološko pričakuje v rastlinah, so morali preveriti njihovo aktivnost. Pripravili so 29 linij (T0) transgenske rastline Nicotiana tabacum s tremi različnimi vektorskimi konstrukti (4× mlcA-VP16, 4× mlcA-QF in 4× mlcA), vsak je imel zapis za odpornost na higromicin (HygR). Vse linije so vzgojili do popolne zrelosti in zbrali njihova semema, da bi zasadili njihove potomce (T1) in z njimi analizirali aktivnost. Ker je reporterski sistem ostal enak, so aktivnost analizirali z merjenjem fluorescence, prav tako pa so določali izražanje gena za GFP, izražanje gena za transkripcijski faktor in izražanje HygR s qRT-PCR. Rezultati obeh metod so se ujemali – izkazalo se je, da je najvišja raven izražanja opažena pri liniji s konstruktom 4× mlcA-QF. Linije s konstruktom 4× mlcA-V16 so kljub manjšem izražanju zapisa za GFP imele v primerjavi z 4× mlcA-QF enak nivo izražanja transkripcijskih faktorjev, kar še dodatno okrepi to, da je trankripcijski faktor z aktivacijsko domeno QF zaslužen za povečano transkripcijo. Pri naslednji liniji (T2) je bil nivo izražanja zapisa za GFP še večje. Primerjali so tudi vitalnost transgenske rastline in rastline divjega tipa, pri čemer se je izkazalo, da ni nobenih negativnih fenotipskih učinkov na transgensko rastlino [1].

==Zaključek==

Glede na to, da v rastlinskih sistemih ne poznamo veliko transkripcijskih faktorjev za aktivacijo transkripcije transgenov v rastlinah, je to področje, na katerem je potrebno narediti še veliko raziskav. Že v tem primeru, ki je opisan v članku, je veliko možnosti za izboljšave, recimo strukturo aktivacijske domene. V tej raziskavi so aktivacijsko domeno povezali z DNA-vezavno domeno z zanko, ki je bila dolga 12 aminokislin s ponovitvami Gly-Ser. Zanimivo bi bilo preštudirati, ali z zamenjavo deležev teh dveh aminokislin ali pa z zamenjavo pozicije teh dveh domen pride do povečanega izražanja genov. Poleg tega bi lahko poskusili v eksperiment uvesti še več različnih konstruktov aktivacijskih domen. Recimo, aktivacijska domena VP16 izhaja iz človeškega virusa, zato bi bilo smiselno optimizirati eksperiment tako, da bi preučili, ali obstaja kakšna aktivacijska domena rastlinskega virusa, ki bi jo lahko vnesli v konstrukt [1]. Primer bi lahko bil gen AL2, ki v virusu mozaika zlatega paradižnika zapisuje za transkripcijski faktor, ki aktivira transkripcijo virusnega proteina ovojnice in gena BR1, ki je odgovoren za utišanje izražanja zapisa za protein ovojnice v tkivu žil rastlin [4]. Poleg tega ne bi rabili optimzirati rabe kodonov, ki je potrebna, ko vključujemo zapise iz drugih organizmov, kar lahko povzroči nestabilnost RNA. Prav tako moramo biti pozorni na dolžino konstrukta, saj lahko predolg vključek zmanjša stabilnost plazmida. Ideja za izboljšavo nivoja izražanja genov je lahko tudi ta, da dodamo še ligand vezavno domeno, ki je pogosto prisotna v sistemih za povišanje izražanja genov. Skratka, na voljo je veliko možnosti izboljšav, ki so vsekakor dobrodošle na tem področju. Z uporabo različnih logičnih vrat bi lahko prišli ne le do aktivatorjev transkripcije v rastlinah, temveč tudi do represorjev in kemijsko inducibilnih sistemov [1].
==Viri==

[1] A. C. Pfotenhauer idr., „Development of new binary expression systems for plant synthetic biology“, Plant Cell Rep, let. 43, št. 1, str. 22, jan. 2024, doi: 10.1007/s00299-023-03100-y.

[2] R. Chakravarti in V. Sahai, „Compactin - a review“, Appl Microbiol Biotechnol, let. 64, št. 5, str. 618–624, jun. 2004, doi: 10.1007/s00253-003-1553-7.

[3] T. Barwell, B. DeVeale, L. Poirier, J. Zheng, F. Seroude, in L. Seroude, „Regulating the UAS/GAL4 system in adult Drosophila with Tet-off GAL80 transgenes“, PeerJ, let. 5, str. e4167, dec. 2017, doi: 10.7717/peerj.4167.

[4] M. D. Hartitz, G. Sunter, in D. M. Bisaro, „The Tomato Golden Mosaic Virus Transactivator (TrAP) is a Single-Stranded DNA and Zinc-Binding Phosphoprotein with an Acidic Activation Domain“, Virology, let. 263, št. 1, str. 1–14, okt. 1999, doi: 10.1006/viro.1999.9925.

Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin

2024-05-05T23:32:45Z

Alliana Kolar: /* Cilj */

Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s00299-023-03100-y Development of new binary expression systems for plant synthetic
biology]

==Uvod==

Rastline imajo velik pomen v biotehnologiji, saj se z njimi ukvarjajo raziskave, povezane s prehransko varnostjo, prilagajanje vremenskim spremembam, razvoj fitosenzorjev in celo razvoj cepiv ter zdravil. Na žalost pa rastlinska biotehnologija že več desetletij ohranja standarden pristop k prekomernem izražanju transgenov. Zato so se v tem članku osredotočili na razvoj novega, modernejšega pristopa k prekomernem izražanju transgenov v rastlinah. Odločili so se, da bodo z ustvarjanjem konstruktov, ki so jih pridobili iz gruče genov mlc, razvili zapis za nov sintetičen mlcR, ki deluje kot aktivator transkripcije. Ta gruča genov je v glivi Penicillium citrinum odgovorna za biosintezo kompaktina [1].

===Kompaktin===

Kompaktin je znan tudi pod imenom Mevastatin ali ML-236B, spada pa v razred statinov, saj znižuje nivo holesterola v krvi. Njegova biokemijska vloga je kot kompetitivni inhibitor (HMG)-CoA reduktaze – encim, ki regulira biosintezo holesterola. V 38 kilobazno gručo genov, ki sodeluje v biosintezi kompaktina v P. citrinum, spadajo geni mlcA-H in mlcR, vključno z dvema genoma za poliketid sintazo in enim regulatornim genom, ki je odgovoren za biosintezo kompaktina [1, 2]. Protein MlcR deluje kot transkripcijski faktor oziroma aktivator, sestavljen je iz DNA-vezavne domene in aktivacijske domene. Specifično se veže na operator dolg 14 baznih parov, ki se nahaja med genoma mlcA in mlcC. Njegova vezava povzroči večje izražanje gena mlcA v primerjavi z mlcC (transkripcija poteka v nasprotnih smereh). Se pravi, več prisotnega MlcR povzroči večje količine kompaktina [1].

===Binarni ekspresijski sistem===

Standarden pristop za prekomerno izražanje transgena v rastlinah vključuje klasično uporabljanje konstitutivnega promotorja. Za natančnejše in bolj regulirano izražanje genov se lahko poslužimo binarnega ekspresijskega sistema. Pri rastlinah je ta praviloma sestavljen iz dveh komponent: en del vključuje transkripcijski faktor, drugi del pa operator, kamor se veže ta transkripcijski faktor in povzroča izražanje želenega gena. Najbolj znan binarni ekspresijski sistem je UAS/GAL4 [1]. Tega se sicer najpogosteje uporablja pri izražanju genov v Drosophili melanogaster. UAS (angl. upstream activating sequence) je zaporedje, ki je zapisano tik prej promotorjem za gen, ki ga želimo izražati, GAL4 pa transkripcijski faktor iz kvasovk. Ob vezavi GAL4 na UAS pride do aktivacije izražanja tarčnega gena. Ta sistem omogoča veliko fleksibilnost, saj lahko izražamo katerikoli želeni gen, poleg tega pa nam omogoča tkivno specifično izražanje in enostavno vklapljanje oziroma izklapljanje celotnega sistema transkripcije. Prav tako omogoča izražanje gena ne glede na stopnjo razvoja organizma [3].

==Cilj==

Cilj raziskave je bil, da bi biološko sintetizirali ustrezen transkripcijski faktor, ki bi ga bilo moč uporabiti pri izražanju genov v rastlinah. Najprej so sintetizirali dva zapisa za protein MlcR, vsak pa je pred sabo imel različen lasten operator (en od mlcA in en od mlcC), za sabo pa zapis za GFP, s katerim bi neposredno določili, kateri zapis je imel najvišji nivo izražanja po vstavljanju v Nicotiana benthamiana. Te z najvišjim nivojem izražanja so hoteli še dodatno izboljšati tako, da so ustvarili več variant sintetičnega transkripcijskega faktorja, kjer je bila spremenjena le aktivacijska domena. Za konec so želeli na transkripcijskem nivoju iz več vidikov določiti, kateri sestavljen konstrukt bi najbolj ustrezal za nov sintetični transkripcijski faktor, ki bi deloval kot aktivator transkripcije [1].

==Rezultati==

===Izbira operatorja===

V prvem koraku so se lotili izbire operatorjev, pri katerih bodo zaznali največjo aktivnost transkripcije. Sestavili so 8 različnih konstruktov, kjer sta vsakega od dveh transkripcijskih faktorjev (zapis za nativni MlcR in zapis za DNA-vezavno domeno MlcR z eno od sintetiziranih aktivacijskih domen, VP16) povezali s štirimi različnimi operatorji genov mlcA oziroma mlcC, kjer sta se dva enaka zapisa razlikovala po številu njunih ponovitev operatorskih zaporedij (1× mlcA, 4× mlcA, 1× mlcC in 4× mlcC). Vsak konstrukt je za vsemi temi zapisi imel še zapis za protein GFP, ki je služil kot reporterski gen. Sestavili so še 4 kontrolne konstrukte, ki so vsebovali samo reporterski del, se pravi brez dela s transkripcijskim faktorjem. Konstrukte so vstavili v vektor in jih infiltrirali v N. benthamiana. 72 ur pozneje so izmerili fluorescenco, kjer se je izkazalo, da je največji signal v primerjavi z kontrolnimi konstrukti dal konstrukt 4×mlcA-VP16, signal je bil dvakrat večji od kontrole. Zato so za nadaljnje poskuse uporabljali operator 4× mlcA [1].

===Izbira zapisa za aktivacijsko domeno===

V naslednji stopnji so želeli ugotoviti, katera aktivacijska domena bi lahko povzročila največjo transkripcijsko aktivnost. Sestavili so 5 konstruktov, kamor so vstavili 5 različnih aktivacijskih domen (VP16, VP64, VP128, TV in QF), za njimi je bil operator 4× mlcA in zapis za GFP. Za vsakega so imeli še kontrolni konstrukt brez zapisa za transkripcijski faktor. Vse te konstrukte so zopet vstavili v vektor in infiltrirali v N. benthamiana. Po istem postopku kot v prejšnjem eksperimentu so tudi tukaj merili fluorescenco in ugotovili, da je največji signal dal konstrukt z aktivacijsko domeno QF, in sicer aktivnost izražanja je bila 6-krat večja v primerjavi z kontrolo [1].

===Validacija aktivnosti v transgenski rastlini===

Da bi preverili, ali so zasnovani transkripcijski faktorji in promotorji transkripcijsko delujoči tako, kot se biološko pričakuje v rastlinah, so morali preveriti njihovo aktivnost. Pripravili so 29 linij (T0) transgenske rastline Nicotiana tabacum s tremi različnimi vektorskimi konstrukti (4× mlcA-VP16, 4× mlcA-QF in 4× mlcA), vsak je imel zapis za odpornost na higromicin (HygR). Vse linije so vzgojili do popolne zrelosti in zbrali njihova semema, da bi zasadili njihove potomce (T1) in z njimi analizirali aktivnost. Ker je reporterski sistem ostal enak, so aktivnost analizirali z merjenjem fluorescence, prav tako pa so določali izražanje gena za GFP, izražanje gena za transkripcijski faktor in izražanje HygR s qRT-PCR. Rezultati obeh metod so se ujemali – izkazalo se je, da je najvišja raven izražanja opažena pri liniji s konstruktom 4× mlcA-QF. Linije s konstruktom 4× mlcA-V16 so kljub manjšem izražanju zapisa za GFP imele v primerjavi z 4× mlcA-QF enak nivo izražanja transkripcijskih faktorjev, kar še dodatno okrepi to, da je trankripcijski faktor z aktivacijsko domeno QF zaslužen za povečano transkripcijo. Pri naslednji liniji (T2) je bil nivo izražanja zapisa za GFP še večje. Primerjali so tudi vitalnost transgenske rastline in rastline divjega tipa, pri čemer se je izkazalo, da ni nobenih negativnih fenotipskih učinkov na transgensko rastlino [1].

==Zaključek==

Glede na to, da v rastlinskih sistemih ne poznamo veliko transkripcijskih faktorjev za aktivacijo transkripcije transgenov v rastlinah, je to področje, na katerem je potrebno narediti še veliko raziskav. Že v tem primeru, ki je opisan v članku, je veliko možnosti za izboljšave, recimo strukturo aktivacijske domene. V tej raziskavi so aktivacijsko domeno povezali z DNA-vezavno domeno z zanko, ki je bila dolga 12 aminokislin s ponovitvami Gly-Ser. Zanimivo bi bilo preštudirati, ali z zamenjavo deležev teh dveh aminokislin ali pa z zamenjavo pozicije teh dveh domen pride do povečanega izražanja genov. Poleg tega bi lahko poskusili v eksperiment uvesti še več različnih konstruktov aktivacijskih domen. Recimo, aktivacijska domena VP16 izhaja iz človeškega virusa, zato bi bilo smiselno optimizirati eksperiment tako, da bi preučili, ali obstaja kakšna aktivacijska domena rastlinskega virusa, ki bi jo lahko vnesli v konstrukt [1]. Primer bi lahko bil gen AL2, ki v virusu mozaika zlatega paradižnika zapisuje za transkripcijski faktor, ki aktivira transkripcijo virusnega proteina ovojnice in gena BR1, ki je odgovoren za utišanje izražanja zapisa za protein ovojnice v tkivu žil rastlin [4]. Poleg tega ne bi rabili optimzirati rabe kodonov, ki je potrebna, ko vključujemo zapise iz drugih organizmov, kar lahko povzroči nestabilnost RNA. Prav tako moramo biti pozorni na dolžino konstrukta, saj lahko predolg vključek zmanjša stabilnost plazmida. Ideja za izboljšavo nivoja izražanja genov je lahko tudi ta, da dodamo še ligand vezavno domeno, ki je pogosto prisotna v sistemih za povišanje izražanja genov. Skratka, na voljo je veliko možnosti izboljšav, ki so vsekakor dobrodošle na tem področju. Z uporabo različnih logičnih vrat bi lahko prišli ne le do aktivatorjev transkripcije v rastlinah, temveč tudi do represorjev in kemijsko inducibilnih sistemov [1].
==Viri==

[1] A. C. Pfotenhauer idr., „Development of new binary expression systems for plant synthetic biology“, Plant Cell Rep, let. 43, št. 1, str. 22, jan. 2024, doi: 10.1007/s00299-023-03100-y.

[2] R. Chakravarti in V. Sahai, „Compactin - a review“, Appl Microbiol Biotechnol, let. 64, št. 5, str. 618–624, jun. 2004, doi: 10.1007/s00253-003-1553-7.

[3] T. Barwell, B. DeVeale, L. Poirier, J. Zheng, F. Seroude, in L. Seroude, „Regulating the UAS/GAL4 system in adult Drosophila with Tet-off GAL80 transgenes“, PeerJ, let. 5, str. e4167, dec. 2017, doi: 10.7717/peerj.4167.

[4] M. D. Hartitz, G. Sunter, in D. M. Bisaro, „The Tomato Golden Mosaic Virus Transactivator (TrAP) is a Single-Stranded DNA and Zinc-Binding Phosphoprotein with an Acidic Activation Domain“, Virology, let. 263, št. 1, str. 1–14, okt. 1999, doi: 10.1006/viro.1999.9925.

Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin

2024-05-05T23:27:24Z

Alliana Kolar: /* Cilj */

Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s00299-023-03100-y Development of new binary expression systems for plant synthetic
biology]

==Uvod==

Rastline imajo velik pomen v biotehnologiji, saj se z njimi ukvarjajo raziskave, povezane s prehransko varnostjo, prilagajanje vremenskim spremembam, razvoj fitosenzorjev in celo razvoj cepiv ter zdravil. Na žalost pa rastlinska biotehnologija že več desetletij ohranja standarden pristop k prekomernem izražanju transgenov. Zato so se v tem članku osredotočili na razvoj novega, modernejšega pristopa k prekomernem izražanju transgenov v rastlinah. Odločili so se, da bodo z ustvarjanjem konstruktov, ki so jih pridobili iz gruče genov mlc, razvili zapis za nov sintetičen mlcR, ki deluje kot aktivator transkripcije. Ta gruča genov je v glivi Penicillium citrinum odgovorna za biosintezo kompaktina [1].

===Kompaktin===

Kompaktin je znan tudi pod imenom Mevastatin ali ML-236B, spada pa v razred statinov, saj znižuje nivo holesterola v krvi. Njegova biokemijska vloga je kot kompetitivni inhibitor (HMG)-CoA reduktaze – encim, ki regulira biosintezo holesterola. V 38 kilobazno gručo genov, ki sodeluje v biosintezi kompaktina v P. citrinum, spadajo geni mlcA-H in mlcR, vključno z dvema genoma za poliketid sintazo in enim regulatornim genom, ki je odgovoren za biosintezo kompaktina [1, 2]. Protein MlcR deluje kot transkripcijski faktor oziroma aktivator, sestavljen je iz DNA-vezavne domene in aktivacijske domene. Specifično se veže na operator dolg 14 baznih parov, ki se nahaja med genoma mlcA in mlcC. Njegova vezava povzroči večje izražanje gena mlcA v primerjavi z mlcC (transkripcija poteka v nasprotnih smereh). Se pravi, več prisotnega MlcR povzroči večje količine kompaktina [1].

===Binarni ekspresijski sistem===

Standarden pristop za prekomerno izražanje transgena v rastlinah vključuje klasično uporabljanje konstitutivnega promotorja. Za natančnejše in bolj regulirano izražanje genov se lahko poslužimo binarnega ekspresijskega sistema. Pri rastlinah je ta praviloma sestavljen iz dveh komponent: en del vključuje transkripcijski faktor, drugi del pa operator, kamor se veže ta transkripcijski faktor in povzroča izražanje želenega gena. Najbolj znan binarni ekspresijski sistem je UAS/GAL4 [1]. Tega se sicer najpogosteje uporablja pri izražanju genov v Drosophili melanogaster. UAS (angl. upstream activating sequence) je zaporedje, ki je zapisano tik prej promotorjem za gen, ki ga želimo izražati, GAL4 pa transkripcijski faktor iz kvasovk. Ob vezavi GAL4 na UAS pride do aktivacije izražanja tarčnega gena. Ta sistem omogoča veliko fleksibilnost, saj lahko izražamo katerikoli želeni gen, poleg tega pa nam omogoča tkivno specifično izražanje in enostavno vklapljanje oziroma izklapljanje celotnega sistema transkripcije. Prav tako omogoča izražanje gena ne glede na stopnjo razvoja organizma [3].

==Cilj==

Cilj raziskave je bil, da bi biološko sintetizirali ustrezen transkripcijski faktor, ki bi ga bilo moč uporabiti pri izražanju genov v rastlinah. Najprej so sintetizirali dva zapisa za protein MlcR, vsak pa je pred sabo imel različen lasten operator (en od mlcA in en od mlcC), za sabo pa zapis za GFP, s katerim bi neposredno določili, kateri zapis je imel najmočnejši promotor po vstavljanju in izražanju v Nicotiana benthamiana. Te z najvišjim nivojem izražanja so hoteli še dodatno izboljšati tako, da so ustvarili več variant sintetičnega transkripcijskega faktorja, kjer je bila spremenjena le aktivatorska domena. Za konec so želeli na transkripcijskem in translacijskem nivoju vstavljenega zapisa določiti, kateri zapis bi najbolj ustrezal za nov sintetični transkripcijski faktor, ki bi deloval kot aktivator transkripcije [1].

==Rezultati==

===Izbira operatorja===

V prvem koraku so se lotili izbire operatorjev, pri katerih bodo zaznali največjo aktivnost transkripcije. Sestavili so 8 različnih konstruktov, kjer sta vsakega od dveh transkripcijskih faktorjev (zapis za nativni MlcR in zapis za DNA-vezavno domeno MlcR z eno od sintetiziranih aktivacijskih domen, VP16) povezali s štirimi različnimi operatorji genov mlcA oziroma mlcC, kjer sta se dva enaka zapisa razlikovala po številu njunih ponovitev operatorskih zaporedij (1× mlcA, 4× mlcA, 1× mlcC in 4× mlcC). Vsak konstrukt je za vsemi temi zapisi imel še zapis za protein GFP, ki je služil kot reporterski gen. Sestavili so še 4 kontrolne konstrukte, ki so vsebovali samo reporterski del, se pravi brez dela s transkripcijskim faktorjem. Konstrukte so vstavili v vektor in jih infiltrirali v N. benthamiana. 72 ur pozneje so izmerili fluorescenco, kjer se je izkazalo, da je največji signal v primerjavi z kontrolnimi konstrukti dal konstrukt 4×mlcA-VP16, signal je bil dvakrat večji od kontrole. Zato so za nadaljnje poskuse uporabljali operator 4× mlcA [1].

===Izbira zapisa za aktivacijsko domeno===

V naslednji stopnji so želeli ugotoviti, katera aktivacijska domena bi lahko povzročila največjo transkripcijsko aktivnost. Sestavili so 5 konstruktov, kamor so vstavili 5 različnih aktivacijskih domen (VP16, VP64, VP128, TV in QF), za njimi je bil operator 4× mlcA in zapis za GFP. Za vsakega so imeli še kontrolni konstrukt brez zapisa za transkripcijski faktor. Vse te konstrukte so zopet vstavili v vektor in infiltrirali v N. benthamiana. Po istem postopku kot v prejšnjem eksperimentu so tudi tukaj merili fluorescenco in ugotovili, da je največji signal dal konstrukt z aktivacijsko domeno QF, in sicer aktivnost izražanja je bila 6-krat večja v primerjavi z kontrolo [1].

===Validacija aktivnosti v transgenski rastlini===

Da bi preverili, ali so zasnovani transkripcijski faktorji in promotorji transkripcijsko delujoči tako, kot se biološko pričakuje v rastlinah, so morali preveriti njihovo aktivnost. Pripravili so 29 linij (T0) transgenske rastline Nicotiana tabacum s tremi različnimi vektorskimi konstrukti (4× mlcA-VP16, 4× mlcA-QF in 4× mlcA), vsak je imel zapis za odpornost na higromicin (HygR). Vse linije so vzgojili do popolne zrelosti in zbrali njihova semema, da bi zasadili njihove potomce (T1) in z njimi analizirali aktivnost. Ker je reporterski sistem ostal enak, so aktivnost analizirali z merjenjem fluorescence, prav tako pa so določali izražanje gena za GFP, izražanje gena za transkripcijski faktor in izražanje HygR s qRT-PCR. Rezultati obeh metod so se ujemali – izkazalo se je, da je najvišja raven izražanja opažena pri liniji s konstruktom 4× mlcA-QF. Linije s konstruktom 4× mlcA-V16 so kljub manjšem izražanju zapisa za GFP imele v primerjavi z 4× mlcA-QF enak nivo izražanja transkripcijskih faktorjev, kar še dodatno okrepi to, da je trankripcijski faktor z aktivacijsko domeno QF zaslužen za povečano transkripcijo. Pri naslednji liniji (T2) je bil nivo izražanja zapisa za GFP še večje. Primerjali so tudi vitalnost transgenske rastline in rastline divjega tipa, pri čemer se je izkazalo, da ni nobenih negativnih fenotipskih učinkov na transgensko rastlino [1].

==Zaključek==

Glede na to, da v rastlinskih sistemih ne poznamo veliko transkripcijskih faktorjev za aktivacijo transkripcije transgenov v rastlinah, je to področje, na katerem je potrebno narediti še veliko raziskav. Že v tem primeru, ki je opisan v članku, je veliko možnosti za izboljšave, recimo strukturo aktivacijske domene. V tej raziskavi so aktivacijsko domeno povezali z DNA-vezavno domeno z zanko, ki je bila dolga 12 aminokislin s ponovitvami Gly-Ser. Zanimivo bi bilo preštudirati, ali z zamenjavo deležev teh dveh aminokislin ali pa z zamenjavo pozicije teh dveh domen pride do povečanega izražanja genov. Poleg tega bi lahko poskusili v eksperiment uvesti še več različnih konstruktov aktivacijskih domen. Recimo, aktivacijska domena VP16 izhaja iz človeškega virusa, zato bi bilo smiselno optimizirati eksperiment tako, da bi preučili, ali obstaja kakšna aktivacijska domena rastlinskega virusa, ki bi jo lahko vnesli v konstrukt [1]. Primer bi lahko bil gen AL2, ki v virusu mozaika zlatega paradižnika zapisuje za transkripcijski faktor, ki aktivira transkripcijo virusnega proteina ovojnice in gena BR1, ki je odgovoren za utišanje izražanja zapisa za protein ovojnice v tkivu žil rastlin [4]. Poleg tega ne bi rabili optimzirati rabe kodonov, ki je potrebna, ko vključujemo zapise iz drugih organizmov, kar lahko povzroči nestabilnost RNA. Prav tako moramo biti pozorni na dolžino konstrukta, saj lahko predolg vključek zmanjša stabilnost plazmida. Ideja za izboljšavo nivoja izražanja genov je lahko tudi ta, da dodamo še ligand vezavno domeno, ki je pogosto prisotna v sistemih za povišanje izražanja genov. Skratka, na voljo je veliko možnosti izboljšav, ki so vsekakor dobrodošle na tem področju. Z uporabo različnih logičnih vrat bi lahko prišli ne le do aktivatorjev transkripcije v rastlinah, temveč tudi do represorjev in kemijsko inducibilnih sistemov [1].
==Viri==

[1] A. C. Pfotenhauer idr., „Development of new binary expression systems for plant synthetic biology“, Plant Cell Rep, let. 43, št. 1, str. 22, jan. 2024, doi: 10.1007/s00299-023-03100-y.

[2] R. Chakravarti in V. Sahai, „Compactin - a review“, Appl Microbiol Biotechnol, let. 64, št. 5, str. 618–624, jun. 2004, doi: 10.1007/s00253-003-1553-7.

[3] T. Barwell, B. DeVeale, L. Poirier, J. Zheng, F. Seroude, in L. Seroude, „Regulating the UAS/GAL4 system in adult Drosophila with Tet-off GAL80 transgenes“, PeerJ, let. 5, str. e4167, dec. 2017, doi: 10.7717/peerj.4167.

[4] M. D. Hartitz, G. Sunter, in D. M. Bisaro, „The Tomato Golden Mosaic Virus Transactivator (TrAP) is a Single-Stranded DNA and Zinc-Binding Phosphoprotein with an Acidic Activation Domain“, Virology, let. 263, št. 1, str. 1–14, okt. 1999, doi: 10.1006/viro.1999.9925.

Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin

2024-05-05T23:26:56Z

Alliana Kolar: /* Cilj */

Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s00299-023-03100-y Development of new binary expression systems for plant synthetic
biology]

==Uvod==

Rastline imajo velik pomen v biotehnologiji, saj se z njimi ukvarjajo raziskave, povezane s prehransko varnostjo, prilagajanje vremenskim spremembam, razvoj fitosenzorjev in celo razvoj cepiv ter zdravil. Na žalost pa rastlinska biotehnologija že več desetletij ohranja standarden pristop k prekomernem izražanju transgenov. Zato so se v tem članku osredotočili na razvoj novega, modernejšega pristopa k prekomernem izražanju transgenov v rastlinah. Odločili so se, da bodo z ustvarjanjem konstruktov, ki so jih pridobili iz gruče genov mlc, razvili zapis za nov sintetičen mlcR, ki deluje kot aktivator transkripcije. Ta gruča genov je v glivi Penicillium citrinum odgovorna za biosintezo kompaktina [1].

===Kompaktin===

Kompaktin je znan tudi pod imenom Mevastatin ali ML-236B, spada pa v razred statinov, saj znižuje nivo holesterola v krvi. Njegova biokemijska vloga je kot kompetitivni inhibitor (HMG)-CoA reduktaze – encim, ki regulira biosintezo holesterola. V 38 kilobazno gručo genov, ki sodeluje v biosintezi kompaktina v P. citrinum, spadajo geni mlcA-H in mlcR, vključno z dvema genoma za poliketid sintazo in enim regulatornim genom, ki je odgovoren za biosintezo kompaktina [1, 2]. Protein MlcR deluje kot transkripcijski faktor oziroma aktivator, sestavljen je iz DNA-vezavne domene in aktivacijske domene. Specifično se veže na operator dolg 14 baznih parov, ki se nahaja med genoma mlcA in mlcC. Njegova vezava povzroči večje izražanje gena mlcA v primerjavi z mlcC (transkripcija poteka v nasprotnih smereh). Se pravi, več prisotnega MlcR povzroči večje količine kompaktina [1].

===Binarni ekspresijski sistem===

Standarden pristop za prekomerno izražanje transgena v rastlinah vključuje klasično uporabljanje konstitutivnega promotorja. Za natančnejše in bolj regulirano izražanje genov se lahko poslužimo binarnega ekspresijskega sistema. Pri rastlinah je ta praviloma sestavljen iz dveh komponent: en del vključuje transkripcijski faktor, drugi del pa operator, kamor se veže ta transkripcijski faktor in povzroča izražanje želenega gena. Najbolj znan binarni ekspresijski sistem je UAS/GAL4 [1]. Tega se sicer najpogosteje uporablja pri izražanju genov v Drosophili melanogaster. UAS (angl. upstream activating sequence) je zaporedje, ki je zapisano tik prej promotorjem za gen, ki ga želimo izražati, GAL4 pa transkripcijski faktor iz kvasovk. Ob vezavi GAL4 na UAS pride do aktivacije izražanja tarčnega gena. Ta sistem omogoča veliko fleksibilnost, saj lahko izražamo katerikoli želeni gen, poleg tega pa nam omogoča tkivno specifično izražanje in enostavno vklapljanje oziroma izklapljanje celotnega sistema transkripcije. Prav tako omogoča izražanje gena ne glede na stopnjo razvoja organizma [3].

==Cilj==

Cilj raziskave je bil, da bi biološko sintetizirali ustrezen transkripcijski faktor, ki bi ga bilo moč uporabiti pri izražanju genov v rastlinah. Najprej so sintetizirali dva zapisa za protein MlcR, vsak pa je pred sabo imel različen lasten operator (en od mlcA in en od mlcC), za sabo pa zapis za GFP, s katerim bi neposredno določili, kateri zapis je imel najmočnejši promotor po vstavljanju in izražanju v Nicotiana benthamiana. Te z najvišjim nivojem izražanja so hoteli še izboljšati tako, da so ustvarili več variant sintetičnega transkripcijskega faktorja, kjer je bila spremenjena le aktivatorska domena. Za konec so želeli na transkripcijskem in translacijskem nivoju vstavljenega zapisa določiti, kateri zapis bi najbolj ustrezal za nov sintetični transkripcijski faktor, ki bi deloval kot aktivator transkripcije [1].

==Rezultati==

===Izbira operatorja===

V prvem koraku so se lotili izbire operatorjev, pri katerih bodo zaznali največjo aktivnost transkripcije. Sestavili so 8 različnih konstruktov, kjer sta vsakega od dveh transkripcijskih faktorjev (zapis za nativni MlcR in zapis za DNA-vezavno domeno MlcR z eno od sintetiziranih aktivacijskih domen, VP16) povezali s štirimi različnimi operatorji genov mlcA oziroma mlcC, kjer sta se dva enaka zapisa razlikovala po številu njunih ponovitev operatorskih zaporedij (1× mlcA, 4× mlcA, 1× mlcC in 4× mlcC). Vsak konstrukt je za vsemi temi zapisi imel še zapis za protein GFP, ki je služil kot reporterski gen. Sestavili so še 4 kontrolne konstrukte, ki so vsebovali samo reporterski del, se pravi brez dela s transkripcijskim faktorjem. Konstrukte so vstavili v vektor in jih infiltrirali v N. benthamiana. 72 ur pozneje so izmerili fluorescenco, kjer se je izkazalo, da je največji signal v primerjavi z kontrolnimi konstrukti dal konstrukt 4×mlcA-VP16, signal je bil dvakrat večji od kontrole. Zato so za nadaljnje poskuse uporabljali operator 4× mlcA [1].

===Izbira zapisa za aktivacijsko domeno===

V naslednji stopnji so želeli ugotoviti, katera aktivacijska domena bi lahko povzročila največjo transkripcijsko aktivnost. Sestavili so 5 konstruktov, kamor so vstavili 5 različnih aktivacijskih domen (VP16, VP64, VP128, TV in QF), za njimi je bil operator 4× mlcA in zapis za GFP. Za vsakega so imeli še kontrolni konstrukt brez zapisa za transkripcijski faktor. Vse te konstrukte so zopet vstavili v vektor in infiltrirali v N. benthamiana. Po istem postopku kot v prejšnjem eksperimentu so tudi tukaj merili fluorescenco in ugotovili, da je največji signal dal konstrukt z aktivacijsko domeno QF, in sicer aktivnost izražanja je bila 6-krat večja v primerjavi z kontrolo [1].

===Validacija aktivnosti v transgenski rastlini===

Da bi preverili, ali so zasnovani transkripcijski faktorji in promotorji transkripcijsko delujoči tako, kot se biološko pričakuje v rastlinah, so morali preveriti njihovo aktivnost. Pripravili so 29 linij (T0) transgenske rastline Nicotiana tabacum s tremi različnimi vektorskimi konstrukti (4× mlcA-VP16, 4× mlcA-QF in 4× mlcA), vsak je imel zapis za odpornost na higromicin (HygR). Vse linije so vzgojili do popolne zrelosti in zbrali njihova semema, da bi zasadili njihove potomce (T1) in z njimi analizirali aktivnost. Ker je reporterski sistem ostal enak, so aktivnost analizirali z merjenjem fluorescence, prav tako pa so določali izražanje gena za GFP, izražanje gena za transkripcijski faktor in izražanje HygR s qRT-PCR. Rezultati obeh metod so se ujemali – izkazalo se je, da je najvišja raven izražanja opažena pri liniji s konstruktom 4× mlcA-QF. Linije s konstruktom 4× mlcA-V16 so kljub manjšem izražanju zapisa za GFP imele v primerjavi z 4× mlcA-QF enak nivo izražanja transkripcijskih faktorjev, kar še dodatno okrepi to, da je trankripcijski faktor z aktivacijsko domeno QF zaslužen za povečano transkripcijo. Pri naslednji liniji (T2) je bil nivo izražanja zapisa za GFP še večje. Primerjali so tudi vitalnost transgenske rastline in rastline divjega tipa, pri čemer se je izkazalo, da ni nobenih negativnih fenotipskih učinkov na transgensko rastlino [1].

==Zaključek==

Glede na to, da v rastlinskih sistemih ne poznamo veliko transkripcijskih faktorjev za aktivacijo transkripcije transgenov v rastlinah, je to področje, na katerem je potrebno narediti še veliko raziskav. Že v tem primeru, ki je opisan v članku, je veliko možnosti za izboljšave, recimo strukturo aktivacijske domene. V tej raziskavi so aktivacijsko domeno povezali z DNA-vezavno domeno z zanko, ki je bila dolga 12 aminokislin s ponovitvami Gly-Ser. Zanimivo bi bilo preštudirati, ali z zamenjavo deležev teh dveh aminokislin ali pa z zamenjavo pozicije teh dveh domen pride do povečanega izražanja genov. Poleg tega bi lahko poskusili v eksperiment uvesti še več različnih konstruktov aktivacijskih domen. Recimo, aktivacijska domena VP16 izhaja iz človeškega virusa, zato bi bilo smiselno optimizirati eksperiment tako, da bi preučili, ali obstaja kakšna aktivacijska domena rastlinskega virusa, ki bi jo lahko vnesli v konstrukt [1]. Primer bi lahko bil gen AL2, ki v virusu mozaika zlatega paradižnika zapisuje za transkripcijski faktor, ki aktivira transkripcijo virusnega proteina ovojnice in gena BR1, ki je odgovoren za utišanje izražanja zapisa za protein ovojnice v tkivu žil rastlin [4]. Poleg tega ne bi rabili optimzirati rabe kodonov, ki je potrebna, ko vključujemo zapise iz drugih organizmov, kar lahko povzroči nestabilnost RNA. Prav tako moramo biti pozorni na dolžino konstrukta, saj lahko predolg vključek zmanjša stabilnost plazmida. Ideja za izboljšavo nivoja izražanja genov je lahko tudi ta, da dodamo še ligand vezavno domeno, ki je pogosto prisotna v sistemih za povišanje izražanja genov. Skratka, na voljo je veliko možnosti izboljšav, ki so vsekakor dobrodošle na tem področju. Z uporabo različnih logičnih vrat bi lahko prišli ne le do aktivatorjev transkripcije v rastlinah, temveč tudi do represorjev in kemijsko inducibilnih sistemov [1].
==Viri==

[1] A. C. Pfotenhauer idr., „Development of new binary expression systems for plant synthetic biology“, Plant Cell Rep, let. 43, št. 1, str. 22, jan. 2024, doi: 10.1007/s00299-023-03100-y.

[2] R. Chakravarti in V. Sahai, „Compactin - a review“, Appl Microbiol Biotechnol, let. 64, št. 5, str. 618–624, jun. 2004, doi: 10.1007/s00253-003-1553-7.

[3] T. Barwell, B. DeVeale, L. Poirier, J. Zheng, F. Seroude, in L. Seroude, „Regulating the UAS/GAL4 system in adult Drosophila with Tet-off GAL80 transgenes“, PeerJ, let. 5, str. e4167, dec. 2017, doi: 10.7717/peerj.4167.

[4] M. D. Hartitz, G. Sunter, in D. M. Bisaro, „The Tomato Golden Mosaic Virus Transactivator (TrAP) is a Single-Stranded DNA and Zinc-Binding Phosphoprotein with an Acidic Activation Domain“, Virology, let. 263, št. 1, str. 1–14, okt. 1999, doi: 10.1006/viro.1999.9925.

Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin

2024-05-05T23:26:43Z

Alliana Kolar: /* Cilj */

Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s00299-023-03100-y Development of new binary expression systems for plant synthetic
biology]

==Uvod==

Rastline imajo velik pomen v biotehnologiji, saj se z njimi ukvarjajo raziskave, povezane s prehransko varnostjo, prilagajanje vremenskim spremembam, razvoj fitosenzorjev in celo razvoj cepiv ter zdravil. Na žalost pa rastlinska biotehnologija že več desetletij ohranja standarden pristop k prekomernem izražanju transgenov. Zato so se v tem članku osredotočili na razvoj novega, modernejšega pristopa k prekomernem izražanju transgenov v rastlinah. Odločili so se, da bodo z ustvarjanjem konstruktov, ki so jih pridobili iz gruče genov mlc, razvili zapis za nov sintetičen mlcR, ki deluje kot aktivator transkripcije. Ta gruča genov je v glivi Penicillium citrinum odgovorna za biosintezo kompaktina [1].

===Kompaktin===

Kompaktin je znan tudi pod imenom Mevastatin ali ML-236B, spada pa v razred statinov, saj znižuje nivo holesterola v krvi. Njegova biokemijska vloga je kot kompetitivni inhibitor (HMG)-CoA reduktaze – encim, ki regulira biosintezo holesterola. V 38 kilobazno gručo genov, ki sodeluje v biosintezi kompaktina v P. citrinum, spadajo geni mlcA-H in mlcR, vključno z dvema genoma za poliketid sintazo in enim regulatornim genom, ki je odgovoren za biosintezo kompaktina [1, 2]. Protein MlcR deluje kot transkripcijski faktor oziroma aktivator, sestavljen je iz DNA-vezavne domene in aktivacijske domene. Specifično se veže na operator dolg 14 baznih parov, ki se nahaja med genoma mlcA in mlcC. Njegova vezava povzroči večje izražanje gena mlcA v primerjavi z mlcC (transkripcija poteka v nasprotnih smereh). Se pravi, več prisotnega MlcR povzroči večje količine kompaktina [1].

===Binarni ekspresijski sistem===

Standarden pristop za prekomerno izražanje transgena v rastlinah vključuje klasično uporabljanje konstitutivnega promotorja. Za natančnejše in bolj regulirano izražanje genov se lahko poslužimo binarnega ekspresijskega sistema. Pri rastlinah je ta praviloma sestavljen iz dveh komponent: en del vključuje transkripcijski faktor, drugi del pa operator, kamor se veže ta transkripcijski faktor in povzroča izražanje želenega gena. Najbolj znan binarni ekspresijski sistem je UAS/GAL4 [1]. Tega se sicer najpogosteje uporablja pri izražanju genov v Drosophili melanogaster. UAS (angl. upstream activating sequence) je zaporedje, ki je zapisano tik prej promotorjem za gen, ki ga želimo izražati, GAL4 pa transkripcijski faktor iz kvasovk. Ob vezavi GAL4 na UAS pride do aktivacije izražanja tarčnega gena. Ta sistem omogoča veliko fleksibilnost, saj lahko izražamo katerikoli želeni gen, poleg tega pa nam omogoča tkivno specifično izražanje in enostavno vklapljanje oziroma izklapljanje celotnega sistema transkripcije. Prav tako omogoča izražanje gena ne glede na stopnjo razvoja organizma [3].

==Cilj==

Cilj raziskave je bil, da bi biološko sintetizirali ustrezen transkripcijski faktor, ki bi ga bilo moč uporabiti pri izražanju genov v rastlinah. Najprej so sintetizirali dva zapisa za protein MlcR, vsak pa je pred sabo imel različen lasten operator (en od mlcA in en od mlcC), za sabo pa zapis za GFP, s katerim bi neposredno določili, kateri zapis je imel najmočnejši promotor po vstavljanju in izražanju v Nicotiana benthamiana. Te z najvišjih nivojem izražanja so hoteli še izboljšati tako, da so ustvarili več variant sintetičnega transkripcijskega faktorja, kjer je bila spremenjena le aktivatorska domena. Za konec so želeli na transkripcijskem in translacijskem nivoju vstavljenega zapisa določiti, kateri zapis bi najbolj ustrezal za nov sintetični transkripcijski faktor, ki bi deloval kot aktivator transkripcije [1].

==Rezultati==

===Izbira operatorja===

V prvem koraku so se lotili izbire operatorjev, pri katerih bodo zaznali največjo aktivnost transkripcije. Sestavili so 8 različnih konstruktov, kjer sta vsakega od dveh transkripcijskih faktorjev (zapis za nativni MlcR in zapis za DNA-vezavno domeno MlcR z eno od sintetiziranih aktivacijskih domen, VP16) povezali s štirimi različnimi operatorji genov mlcA oziroma mlcC, kjer sta se dva enaka zapisa razlikovala po številu njunih ponovitev operatorskih zaporedij (1× mlcA, 4× mlcA, 1× mlcC in 4× mlcC). Vsak konstrukt je za vsemi temi zapisi imel še zapis za protein GFP, ki je služil kot reporterski gen. Sestavili so še 4 kontrolne konstrukte, ki so vsebovali samo reporterski del, se pravi brez dela s transkripcijskim faktorjem. Konstrukte so vstavili v vektor in jih infiltrirali v N. benthamiana. 72 ur pozneje so izmerili fluorescenco, kjer se je izkazalo, da je največji signal v primerjavi z kontrolnimi konstrukti dal konstrukt 4×mlcA-VP16, signal je bil dvakrat večji od kontrole. Zato so za nadaljnje poskuse uporabljali operator 4× mlcA [1].

===Izbira zapisa za aktivacijsko domeno===

V naslednji stopnji so želeli ugotoviti, katera aktivacijska domena bi lahko povzročila največjo transkripcijsko aktivnost. Sestavili so 5 konstruktov, kamor so vstavili 5 različnih aktivacijskih domen (VP16, VP64, VP128, TV in QF), za njimi je bil operator 4× mlcA in zapis za GFP. Za vsakega so imeli še kontrolni konstrukt brez zapisa za transkripcijski faktor. Vse te konstrukte so zopet vstavili v vektor in infiltrirali v N. benthamiana. Po istem postopku kot v prejšnjem eksperimentu so tudi tukaj merili fluorescenco in ugotovili, da je največji signal dal konstrukt z aktivacijsko domeno QF, in sicer aktivnost izražanja je bila 6-krat večja v primerjavi z kontrolo [1].

===Validacija aktivnosti v transgenski rastlini===

Da bi preverili, ali so zasnovani transkripcijski faktorji in promotorji transkripcijsko delujoči tako, kot se biološko pričakuje v rastlinah, so morali preveriti njihovo aktivnost. Pripravili so 29 linij (T0) transgenske rastline Nicotiana tabacum s tremi različnimi vektorskimi konstrukti (4× mlcA-VP16, 4× mlcA-QF in 4× mlcA), vsak je imel zapis za odpornost na higromicin (HygR). Vse linije so vzgojili do popolne zrelosti in zbrali njihova semema, da bi zasadili njihove potomce (T1) in z njimi analizirali aktivnost. Ker je reporterski sistem ostal enak, so aktivnost analizirali z merjenjem fluorescence, prav tako pa so določali izražanje gena za GFP, izražanje gena za transkripcijski faktor in izražanje HygR s qRT-PCR. Rezultati obeh metod so se ujemali – izkazalo se je, da je najvišja raven izražanja opažena pri liniji s konstruktom 4× mlcA-QF. Linije s konstruktom 4× mlcA-V16 so kljub manjšem izražanju zapisa za GFP imele v primerjavi z 4× mlcA-QF enak nivo izražanja transkripcijskih faktorjev, kar še dodatno okrepi to, da je trankripcijski faktor z aktivacijsko domeno QF zaslužen za povečano transkripcijo. Pri naslednji liniji (T2) je bil nivo izražanja zapisa za GFP še večje. Primerjali so tudi vitalnost transgenske rastline in rastline divjega tipa, pri čemer se je izkazalo, da ni nobenih negativnih fenotipskih učinkov na transgensko rastlino [1].

==Zaključek==

Glede na to, da v rastlinskih sistemih ne poznamo veliko transkripcijskih faktorjev za aktivacijo transkripcije transgenov v rastlinah, je to področje, na katerem je potrebno narediti še veliko raziskav. Že v tem primeru, ki je opisan v članku, je veliko možnosti za izboljšave, recimo strukturo aktivacijske domene. V tej raziskavi so aktivacijsko domeno povezali z DNA-vezavno domeno z zanko, ki je bila dolga 12 aminokislin s ponovitvami Gly-Ser. Zanimivo bi bilo preštudirati, ali z zamenjavo deležev teh dveh aminokislin ali pa z zamenjavo pozicije teh dveh domen pride do povečanega izražanja genov. Poleg tega bi lahko poskusili v eksperiment uvesti še več različnih konstruktov aktivacijskih domen. Recimo, aktivacijska domena VP16 izhaja iz človeškega virusa, zato bi bilo smiselno optimizirati eksperiment tako, da bi preučili, ali obstaja kakšna aktivacijska domena rastlinskega virusa, ki bi jo lahko vnesli v konstrukt [1]. Primer bi lahko bil gen AL2, ki v virusu mozaika zlatega paradižnika zapisuje za transkripcijski faktor, ki aktivira transkripcijo virusnega proteina ovojnice in gena BR1, ki je odgovoren za utišanje izražanja zapisa za protein ovojnice v tkivu žil rastlin [4]. Poleg tega ne bi rabili optimzirati rabe kodonov, ki je potrebna, ko vključujemo zapise iz drugih organizmov, kar lahko povzroči nestabilnost RNA. Prav tako moramo biti pozorni na dolžino konstrukta, saj lahko predolg vključek zmanjša stabilnost plazmida. Ideja za izboljšavo nivoja izražanja genov je lahko tudi ta, da dodamo še ligand vezavno domeno, ki je pogosto prisotna v sistemih za povišanje izražanja genov. Skratka, na voljo je veliko možnosti izboljšav, ki so vsekakor dobrodošle na tem področju. Z uporabo različnih logičnih vrat bi lahko prišli ne le do aktivatorjev transkripcije v rastlinah, temveč tudi do represorjev in kemijsko inducibilnih sistemov [1].
==Viri==

[1] A. C. Pfotenhauer idr., „Development of new binary expression systems for plant synthetic biology“, Plant Cell Rep, let. 43, št. 1, str. 22, jan. 2024, doi: 10.1007/s00299-023-03100-y.

[2] R. Chakravarti in V. Sahai, „Compactin - a review“, Appl Microbiol Biotechnol, let. 64, št. 5, str. 618–624, jun. 2004, doi: 10.1007/s00253-003-1553-7.

[3] T. Barwell, B. DeVeale, L. Poirier, J. Zheng, F. Seroude, in L. Seroude, „Regulating the UAS/GAL4 system in adult Drosophila with Tet-off GAL80 transgenes“, PeerJ, let. 5, str. e4167, dec. 2017, doi: 10.7717/peerj.4167.

[4] M. D. Hartitz, G. Sunter, in D. M. Bisaro, „The Tomato Golden Mosaic Virus Transactivator (TrAP) is a Single-Stranded DNA and Zinc-Binding Phosphoprotein with an Acidic Activation Domain“, Virology, let. 263, št. 1, str. 1–14, okt. 1999, doi: 10.1006/viro.1999.9925.

Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin

2024-05-05T23:24:18Z

Alliana Kolar:

Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s00299-023-03100-y Development of new binary expression systems for plant synthetic
biology]

==Uvod==

Rastline imajo velik pomen v biotehnologiji, saj se z njimi ukvarjajo raziskave, povezane s prehransko varnostjo, prilagajanje vremenskim spremembam, razvoj fitosenzorjev in celo razvoj cepiv ter zdravil. Na žalost pa rastlinska biotehnologija že več desetletij ohranja standarden pristop k prekomernem izražanju transgenov. Zato so se v tem članku osredotočili na razvoj novega, modernejšega pristopa k prekomernem izražanju transgenov v rastlinah. Odločili so se, da bodo z ustvarjanjem konstruktov, ki so jih pridobili iz gruče genov mlc, razvili zapis za nov sintetičen mlcR, ki deluje kot aktivator transkripcije. Ta gruča genov je v glivi Penicillium citrinum odgovorna za biosintezo kompaktina [1].

===Kompaktin===

Kompaktin je znan tudi pod imenom Mevastatin ali ML-236B, spada pa v razred statinov, saj znižuje nivo holesterola v krvi. Njegova biokemijska vloga je kot kompetitivni inhibitor (HMG)-CoA reduktaze – encim, ki regulira biosintezo holesterola. V 38 kilobazno gručo genov, ki sodeluje v biosintezi kompaktina v P. citrinum, spadajo geni mlcA-H in mlcR, vključno z dvema genoma za poliketid sintazo in enim regulatornim genom, ki je odgovoren za biosintezo kompaktina [1, 2]. Protein MlcR deluje kot transkripcijski faktor oziroma aktivator, sestavljen je iz DNA-vezavne domene in aktivacijske domene. Specifično se veže na operator dolg 14 baznih parov, ki se nahaja med genoma mlcA in mlcC. Njegova vezava povzroči večje izražanje gena mlcA v primerjavi z mlcC (transkripcija poteka v nasprotnih smereh). Se pravi, več prisotnega MlcR povzroči večje količine kompaktina [1].

===Binarni ekspresijski sistem===

Standarden pristop za prekomerno izražanje transgena v rastlinah vključuje klasično uporabljanje konstitutivnega promotorja. Za natančnejše in bolj regulirano izražanje genov se lahko poslužimo binarnega ekspresijskega sistema. Pri rastlinah je ta praviloma sestavljen iz dveh komponent: en del vključuje transkripcijski faktor, drugi del pa operator, kamor se veže ta transkripcijski faktor in povzroča izražanje želenega gena. Najbolj znan binarni ekspresijski sistem je UAS/GAL4 [1]. Tega se sicer najpogosteje uporablja pri izražanju genov v Drosophili melanogaster. UAS (angl. upstream activating sequence) je zaporedje, ki je zapisano tik prej promotorjem za gen, ki ga želimo izražati, GAL4 pa transkripcijski faktor iz kvasovk. Ob vezavi GAL4 na UAS pride do aktivacije izražanja tarčnega gena. Ta sistem omogoča veliko fleksibilnost, saj lahko izražamo katerikoli želeni gen, poleg tega pa nam omogoča tkivno specifično izražanje in enostavno vklapljanje oziroma izklapljanje celotnega sistema transkripcije. Prav tako omogoča izražanje gena ne glede na stopnjo razvoja organizma [3].

==Cilj==

Cilj raziskave je bil, da bi biološko sintetizirali ustrezen transkripcijski faktor, ki bi ga bilo moč uporabiti pri izražanju genov v rastlinah. Najprej so sintetizirali dva zapisa za protein MlcR, vsak pa je pred sabo imel različen lasten operator (en od mlcA in en od mlcC), za sabo pa zapis za GFP, s katerim bi neposredno določili, kateri zapis je imel najmočnejši promotor po vstavljanju in izražanju v Nicotiana benthamiana. Te z najmočnejšimi promotorji so hoteli še izboljšati tako, da so ustvarili več variant sintetičnega transkripcijskega faktorja, kjer je bila spremenjena le aktivatorska domena. Za konec so želeli na transkripcijskem in translacijskem nivoju vstavljenega zapisa določiti, kateri zapis bi najbolj ustrezal za nov sintetični transkripcijski faktor, ki bi deloval kot aktivator transkripcije [1].

==Rezultati==

===Izbira operatorja===

V prvem koraku so se lotili izbire operatorjev, pri katerih bodo zaznali največjo aktivnost transkripcije. Sestavili so 8 različnih konstruktov, kjer sta vsakega od dveh transkripcijskih faktorjev (zapis za nativni MlcR in zapis za DNA-vezavno domeno MlcR z eno od sintetiziranih aktivacijskih domen, VP16) povezali s štirimi različnimi operatorji genov mlcA oziroma mlcC, kjer sta se dva enaka zapisa razlikovala po številu njunih ponovitev operatorskih zaporedij (1× mlcA, 4× mlcA, 1× mlcC in 4× mlcC). Vsak konstrukt je za vsemi temi zapisi imel še zapis za protein GFP, ki je služil kot reporterski gen. Sestavili so še 4 kontrolne konstrukte, ki so vsebovali samo reporterski del, se pravi brez dela s transkripcijskim faktorjem. Konstrukte so vstavili v vektor in jih infiltrirali v N. benthamiana. 72 ur pozneje so izmerili fluorescenco, kjer se je izkazalo, da je največji signal v primerjavi z kontrolnimi konstrukti dal konstrukt 4×mlcA-VP16, signal je bil dvakrat večji od kontrole. Zato so za nadaljnje poskuse uporabljali operator 4× mlcA [1].

===Izbira zapisa za aktivacijsko domeno===

V naslednji stopnji so želeli ugotoviti, katera aktivacijska domena bi lahko povzročila največjo transkripcijsko aktivnost. Sestavili so 5 konstruktov, kamor so vstavili 5 različnih aktivacijskih domen (VP16, VP64, VP128, TV in QF), za njimi je bil operator 4× mlcA in zapis za GFP. Za vsakega so imeli še kontrolni konstrukt brez zapisa za transkripcijski faktor. Vse te konstrukte so zopet vstavili v vektor in infiltrirali v N. benthamiana. Po istem postopku kot v prejšnjem eksperimentu so tudi tukaj merili fluorescenco in ugotovili, da je največji signal dal konstrukt z aktivacijsko domeno QF, in sicer aktivnost izražanja je bila 6-krat večja v primerjavi z kontrolo [1].

===Validacija aktivnosti v transgenski rastlini===

Da bi preverili, ali so zasnovani transkripcijski faktorji in promotorji transkripcijsko delujoči tako, kot se biološko pričakuje v rastlinah, so morali preveriti njihovo aktivnost. Pripravili so 29 linij (T0) transgenske rastline Nicotiana tabacum s tremi različnimi vektorskimi konstrukti (4× mlcA-VP16, 4× mlcA-QF in 4× mlcA), vsak je imel zapis za odpornost na higromicin (HygR). Vse linije so vzgojili do popolne zrelosti in zbrali njihova semema, da bi zasadili njihove potomce (T1) in z njimi analizirali aktivnost. Ker je reporterski sistem ostal enak, so aktivnost analizirali z merjenjem fluorescence, prav tako pa so določali izražanje gena za GFP, izražanje gena za transkripcijski faktor in izražanje HygR s qRT-PCR. Rezultati obeh metod so se ujemali – izkazalo se je, da je najvišja raven izražanja opažena pri liniji s konstruktom 4× mlcA-QF. Linije s konstruktom 4× mlcA-V16 so kljub manjšem izražanju zapisa za GFP imele v primerjavi z 4× mlcA-QF enak nivo izražanja transkripcijskih faktorjev, kar še dodatno okrepi to, da je trankripcijski faktor z aktivacijsko domeno QF zaslužen za povečano transkripcijo. Pri naslednji liniji (T2) je bil nivo izražanja zapisa za GFP še večje. Primerjali so tudi vitalnost transgenske rastline in rastline divjega tipa, pri čemer se je izkazalo, da ni nobenih negativnih fenotipskih učinkov na transgensko rastlino [1].

==Zaključek==

Glede na to, da v rastlinskih sistemih ne poznamo veliko transkripcijskih faktorjev za aktivacijo transkripcije transgenov v rastlinah, je to področje, na katerem je potrebno narediti še veliko raziskav. Že v tem primeru, ki je opisan v članku, je veliko možnosti za izboljšave, recimo strukturo aktivacijske domene. V tej raziskavi so aktivacijsko domeno povezali z DNA-vezavno domeno z zanko, ki je bila dolga 12 aminokislin s ponovitvami Gly-Ser. Zanimivo bi bilo preštudirati, ali z zamenjavo deležev teh dveh aminokislin ali pa z zamenjavo pozicije teh dveh domen pride do povečanega izražanja genov. Poleg tega bi lahko poskusili v eksperiment uvesti še več različnih konstruktov aktivacijskih domen. Recimo, aktivacijska domena VP16 izhaja iz človeškega virusa, zato bi bilo smiselno optimizirati eksperiment tako, da bi preučili, ali obstaja kakšna aktivacijska domena rastlinskega virusa, ki bi jo lahko vnesli v konstrukt [1]. Primer bi lahko bil gen AL2, ki v virusu mozaika zlatega paradižnika zapisuje za transkripcijski faktor, ki aktivira transkripcijo virusnega proteina ovojnice in gena BR1, ki je odgovoren za utišanje izražanja zapisa za protein ovojnice v tkivu žil rastlin [4]. Poleg tega ne bi rabili optimzirati rabe kodonov, ki je potrebna, ko vključujemo zapise iz drugih organizmov, kar lahko povzroči nestabilnost RNA. Prav tako moramo biti pozorni na dolžino konstrukta, saj lahko predolg vključek zmanjša stabilnost plazmida. Ideja za izboljšavo nivoja izražanja genov je lahko tudi ta, da dodamo še ligand vezavno domeno, ki je pogosto prisotna v sistemih za povišanje izražanja genov. Skratka, na voljo je veliko možnosti izboljšav, ki so vsekakor dobrodošle na tem področju. Z uporabo različnih logičnih vrat bi lahko prišli ne le do aktivatorjev transkripcije v rastlinah, temveč tudi do represorjev in kemijsko inducibilnih sistemov [1].
==Viri==

[1] A. C. Pfotenhauer idr., „Development of new binary expression systems for plant synthetic biology“, Plant Cell Rep, let. 43, št. 1, str. 22, jan. 2024, doi: 10.1007/s00299-023-03100-y.

[2] R. Chakravarti in V. Sahai, „Compactin - a review“, Appl Microbiol Biotechnol, let. 64, št. 5, str. 618–624, jun. 2004, doi: 10.1007/s00253-003-1553-7.

[3] T. Barwell, B. DeVeale, L. Poirier, J. Zheng, F. Seroude, in L. Seroude, „Regulating the UAS/GAL4 system in adult Drosophila with Tet-off GAL80 transgenes“, PeerJ, let. 5, str. e4167, dec. 2017, doi: 10.7717/peerj.4167.

[4] M. D. Hartitz, G. Sunter, in D. M. Bisaro, „The Tomato Golden Mosaic Virus Transactivator (TrAP) is a Single-Stranded DNA and Zinc-Binding Phosphoprotein with an Acidic Activation Domain“, Virology, let. 263, št. 1, str. 1–14, okt. 1999, doi: 10.1006/viro.1999.9925.

Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin

2024-05-05T23:04:29Z

Alliana Kolar:

Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s00299-023-03100-y Development of new binary expression systems for plant synthetic
biology]

==Uvod==

Rastline imajo velik pomen v biotehnologiji, saj se z njimi ukvarjajo raziskave, povezane s prehransko varnostjo, prilagajanje vremenskim spremembam, razvoj fitosenzorjev in celo razvoj cepiv ter zdravil. Na žalost pa rastlinska biotehnologija že več desetletij ohranja standarden pristop k prekomernem izražanju transgenov. Zato so se v tem članku osredotočili na razvoj novega, modernejšega pristopa k prekomernem izražanju transgenov v rastlinah. Odločili so se, da bodo z ustvarjanjem konstruktov, ki so jih pridobili iz gruče genov mlc, razvili zapis za nov sintetičen mlcR, ki deluje kot aktivator transkripcije. Ta gruča genov je v glivi Penicillium citrinum odgovorna za biosintezo kompaktina [1].

===Kompaktin===

Kompaktin je znan tudi pod imenom Mevastatin ali ML-236B, spada pa v razred statinov, saj znižuje nivo holesterola v krvi. Njegova biokemijska vloga je kot kompetitivni inhibitor (HMG)-CoA reduktaze – encim, ki regulira biosintezo holesterola. V 38 kilobazno gručo genov, ki sodeluje v biosintezi kompaktina v P. citrinum, spadajo geni mlcA-H in mlcR, vključno z dvema genoma za poliketid sintazo in enim regulatornim genom, ki je odgovoren za biosintezo kompaktina [1], [2]. Protein mlcR deluje kot transkripcijski faktor oziroma aktivator, sestavljen je iz DNA-vezavne domene in aktivacijske domene. Specifično se veže na operator dolg 14 baznih parov, ki se nahaja med genoma mlcA in mlcC. Njegova vezava povzroči večje izražanje gena mlcA v primerjavi z mlcC (transkripcija poteka v nasprotnih smereh). Obstaja pa tudi povezava med mlcR in kompaktinom – več prisotnega mlcR povzroči tudi večje količine kompaktina [1].

===Binarni ekspresijski sistem===

Standarden pristop za prekomerno izražanje transgena v rastlinah vključuje klasično uporabljanje konstitutivnega promotorja. Za natančnejše in bolj regulirano izražanje genov se lahko poslužimo binarnega ekspresijskega sistema. Pri rastlinah je ta praviloma sestavljen iz dveh komponent: en del vključuje transkripcijski faktor, drugi del pa operator, kamor se veže ta transkripcijski faktor in povzroča izražanje želenega gena. Najbolj znan binarni ekspresijski sistem je UAS/GAL4 [1]. Tega se sicer najpogosteje uporablja pri izražanju genov v Drosophili melanogaster. UAS (angl. upstream activating sequence) je zaporedje, ki je zapisano tik prej promotorjem za gen, ki ga želimo izražati, GAL4 pa transkripcijski faktor iz kvasovk. Ob vezavi GAL4 na UAS pride do aktivacije izražanja tarčnega gena. Ta sistem omogoča veliko fleksibilnost, saj lahko izražamo katerikoli želeni gen, poleg tega pa nam omogoča tkivno specifično izražanje in enostavno vklapljanje oziroma izklapljanje celotnega sistema transkripcije. Prav tako omogoča izražanje gena ne glede na stopnjo razvoja organizma [3].

==Cilj==

Cilj raziskave je bil, da bi biološko sintetizirali ustrezen transkripcijski faktor, ki bi ga bilo moč uporabiti pri izražanju genov v rastlinah. Najprej so sintetizirali dva zapisa za protein mlcR, vsak pa je pred sabo imel različen lasten operator (en od mlcA in en od mlcC), za sabo pa zapis za GFP, s katerim bi neposredno določili, kateri zapis je imel najmočnejši promotor po vstavljanju in izražanju v Nicotiana benthamiana. Te z najmočnejšimi promotorji so hoteli še izboljšati tako, da so ustvarili več variant sintetičnega transkripcijskega faktorja, kjer je bila spremenjena le aktivatorska domena. Za konec so želeli na transkripcijskem in translacijskem nivoju vstavljenega zapisa določiti, kateri zapis bi najbolj ustrezal za nov sintetični transkripcijski faktor, ki bi deloval kot aktivator transkripcije [1].

==Rezultati==

===Izbira operatorja===

V prvem koraku so se lotili izbire operatorjev, pri katerih bodo zaznali največjo aktivnost transkripcije. Sestavili so 8 različnih konstruktov, kjer sta vsakega od dveh transkripcijskih faktorjev (zapis za nativni MlcR in zapis za DNA-vezavno domeno MlcR z eno od sintetiziranih aktivacijskih domen, VP16) povezali s štirimi različnimi operatorji genov mlcA oziroma mlcC, kjer sta se dva enaka zapisa razlikovala po številu njunih ponovitev operatorskih zaporedij (1× mlcA, 4× mlcA, 1× mlcC in 4× mlcC). Vsak konstrukt je za vsemi temi zapisi imel še zapis za protein GFP, ki je služil kot reporterski gen. Sestavili so še 4 kontrolne konstrukte, ki so vsebovali samo reporterski del, se pravi brez dela s transkripcijskim faktorjem. Konstrukte so vstavili v vektor in jih infiltrirali v N. benthamiana. 72 ur pozneje so izmerili fluorescenco, kjer se je izkazalo, da je največji signal v primerjavi z kontrolnimi konstrukti dal konstrukt 4×mclA-VP16, signal je bil dvakrat večji od kontrole. Zato so za nadaljnje poskuse uporabljali operator 4× mclA [1].

===Izbira zapisa za aktivacijsko domeno===

V naslednji stopnji so želeli ugotoviti, katera aktivacijska domena bi lahko povzročila največjo transkripcijsko aktivnost. Sestavili so 5 konstruktov, kamor so vstavili 5 različnih aktivacijskih domen (VP16, VP64, VP128, TV in QF), za njimi je bil operator 4× mlcA in zapis za GFP. Za vsakega so imeli še kontrolni konstrukt brez zapisa za transkripcijski faktor. Vse te konstrukte so zopet vstavili v vektor in infiltrirali v N. benthamiana. Po istem postopku kot v prejšnjem eksperimentu so tudi tukaj merili fluorescenco in ugotovili, da je največji signal dal konstrukt z aktivacijsko domeno QF, in sicer aktivnost izražanja je bila 6-krat večja v primerjavi z kontrolo [1].

===Validacija aktivnosti v transgenski rastlini===

Da bi preverili, ali so zasnovani transkripcijski faktorji in promotorji transkripcijsko delujoči tako, kot se biološko pričakuje v rastlinah, so morali preveriti njihovo aktivnost. Pripravili so 29 linij (T0) transgenske rastline Nicotiana tabacum s tremi različnimi vektorskimi konstrukti (4× mlcAVP16, 4× mlcA-QF in 4× mlcA), vsak je imel zapis za odpornost na higromicin (HygR). Vse linije so vzgojili do popolne zrelosti in zbrali njihova semema, da bi zasadili njihove potomce (T1) in z njimi analizirali aktivnost. Ker je reporterski sistem ostal enak, so aktivnost analizirali z merjenjem fluorescence, prav tako pa so določali izražanje gena za GFP, izražanje gena za transkripcijski faktor in izražanje HygR s qRT PCR. Rezultati obeh metod so se ujemali – izkazalo se je, da je najvišja raven izražanja opažena pri liniji s konstruktom 4× mlcA-QF. Linije s konstruktom 4× mlcA-V16 so kljub manjšem izražanju zapisa za GFP imele v primerjavi z 4× mlcA-QF enak nivo izražanja transkripcijskih faktorjev, kar še dodatno okrepi to, da je trankripcijski faktor z aktivacijsko domeno QF zaslužen za povečano transkripcijo. Pri naslednji liniji (T2) je bil nivo izražanja zapisa za GFP še večje. Primerjali so tudi vitalnost transgenske rastline in rastline divjega tipa, pri čemer se je izkazalo, da ni nobenih negativnih fenotipskih učinkov na transgensko rastlino [1].

==Zaključek==

Glede na to, da v rastlinskih sistemih ne poznamo veliko transkripcijskih faktorjev za aktivacijo transkripcije transgenov v rastlinah, je to področje, na katerem je potrebno narediti še veliko raziskav. Že v tem primeru, ki je opisan v članku, je veliko možnosti za izboljšave, recimo strukturo aktivacijske domene. V tej raziskavi so aktivacijsko domeno povezali z DNA-vezavno domeno z zanko, ki je bila dolga 12 aminokislin s ponovitvami Gly-Ser. Zanimivo bi bilo preštudirati, ali z zamenjavo deležev teh dveh aminokislin ali pa z zamenjavo pozicije teh dveh domen pride do povečanega izražanja genov. Poleg tega bi lahko poskusili v eksperiment uvesti še več različnih konstruktov aktivacijskih domen. Recimo, aktivacijska domena VP16 izhaja iz človeškega virusa, zato bi bilo smiselno optimizirati eksperiment tako, da bi preučili, ali obstaja kakšna aktivacijska domena rastlinskega virusa, ki bi jo lahko vnesli v konstrukt [1]. Primer bi lahko bil gen AL2, ki v virusu mozaika zlatega paradižnika zapisuje za transkripcijski faktor, ki aktivira transkripcijo virusnega proteina ovojnice in gena BR1, ki je odgovoren za utišanje izražanja zapisa za protein ovojnice v tkivu žil rastlin [4]. Poleg tega ne bi rabili optimzirati rabe kodonov, ki je potrebna, ko vključujemo zapise iz drugih organizmov, kar lahko povzroči nestabilnost RNA. Prav tako moramo biti pozorni na dolžino konstrukta, saj lahko predolg vključek zmanjša stabilnost plazmida. Ideja za izboljšavo nivoja izražanja genov je lahko tudi ta, da dodamo še ligand vezavno domeno, ki je pogosto prisotna v sistemih za povišanje izražanja genov. Skratka, na voljo je veliko možnosti izboljšav, ki so vsekakor dobrodošle na tem področju. Z uporabo različnih logičnih vrat bi lahko prišli ne le do aktivatorjev transkripcije v rastlinah, temveč tudi do represorjev in kemijsko inducibilnih sistemov [1].
==Viri==

[1] A. C. Pfotenhauer idr., „Development of new binary expression systems for plant synthetic biology“, Plant Cell Rep, let. 43, št. 1, str. 22, jan. 2024, doi: 10.1007/s00299-023-03100-y.

[2] R. Chakravarti in V. Sahai, „Compactin - a review“, Appl Microbiol Biotechnol, let. 64, št. 5, str. 618–624, jun. 2004, doi: 10.1007/s00253-003-1553-7.

[3] T. Barwell, B. DeVeale, L. Poirier, J. Zheng, F. Seroude, in L. Seroude, „Regulating the UAS/GAL4 system in adult Drosophila with Tet-off GAL80 transgenes“, PeerJ, let. 5, str. e4167, dec. 2017, doi: 10.7717/peerj.4167.

[4] M. D. Hartitz, G. Sunter, in D. M. Bisaro, „The Tomato Golden Mosaic Virus Transactivator (TrAP) is a Single-Stranded DNA and Zinc-Binding Phosphoprotein with an Acidic Activation Domain“, Virology, let. 263, št. 1, str. 1–14, okt. 1999, doi: 10.1006/viro.1999.9925.

Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin

2024-05-05T23:01:00Z

Alliana Kolar:

Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s00299-023-03100-y Development of new binary expression systems for plant synthetic
biology]

==Uvod==

Rastline imajo velik pomen v biotehnologiji, saj se z njimi ukvarjajo raziskave, povezane s prehransko varnostjo, prilagajanje vremenskim spremembam, razvoj fitosenzorjev in celo razvoj cepiv ter zdravil. Na žalost pa rastlinska biotehnologija že več desetletij ohranja standarden pristop k prekomernem izražanju transgenov. Zato so se v tem članku osredotočili na razvoj novega, modernejšega pristopa k prekomernem izražanju transgenov v rastlinah. Odločili so se, da bodo z ustvarjanjem konstruktov, ki so jih pridobili iz gruče genov mlc, razvili zapis za nov sintetičen mlcR, ki deluje kot aktivator transkripcije. Ta gruča genov je v glivi Penicillium citrinum odgovorna za biosintezo kompaktina [1].

===Kompaktin===

Kompaktin je znan tudi pod imenom Mevastatin ali ML-236B, spada pa v razred statinov, saj znižuje nivo holesterola v krvi. Njegova biokemijska vloga je kot kompetitivni inhibitor (HMG)-CoA reduktaze – encim, ki regulira biosintezo holesterola. V 38 kilobazno gručo genov, ki sodeluje v biosintezi kompaktina v P. citrinum, spadajo geni mlcA-H in mlcR, vključno z dvema genoma za poliketid sintazo in enim regulatornim genom, ki je odgovoren za biosintezo kompaktina [1], [2]. Protein mlcR deluje kot transkripcijski faktor oziroma aktivator, sestavljen je iz DNA-vezavne domene in aktivacijske domene. Specifično se veže na operator dolg 14 baznih parov, ki se nahaja med genoma mlcA in mlcC. Njegova vezava povzroči večje izražanje gena mlcA v primerjavi z mlcC (transkripcija poteka v nasprotnih smereh). Obstaja pa tudi povezava med mlcR in kompaktinom – več prisotnega mlcR povzroči tudi večje količine kompaktina [1].

===Binarni ekspresijski sistem===

Standarden pristop za prekomerno izražanje transgena v rastlinah vključuje klasično uporabljanje konstitutivnega promotorja. Za natančnejše in bolj regulirano izražanje genov se lahko poslužimo binarnega ekspresijskega sistema. Pri rastlinah je ta praviloma sestavljen iz dveh komponent: en del vključuje transkripcijski faktor, drugi del pa operator, kamor se veže ta transkripcijski faktor in povzroča izražanje želenega gena. Najbolj znan binarni ekspresijski sistem je UAS/GAL4 [1]. Tega se sicer najpogosteje uporablja pri izražanju genov v Drosophili melanogaster. UAS (angl. upstream activating sequence) je zaporedje, ki je zapisano tik prej promotorjem za gen, ki ga želimo izražati, GAL4 pa transkripcijski faktor iz kvasovk. Ob vezavi GAL4 na UAS pride do aktivacije izražanja tarčnega gena. Ta sistem omogoča veliko fleksibilnost, saj lahko izražamo katerikoli želeni gen, poleg tega pa nam omogoča tkivno specifično izražanje in enostavno vklapljanje oziroma izklapljanje celotnega sistema transkripcije. Prav tako omogoča izražanje gena ne glede na stopnjo razvoja organizma [3].

==Cilj==

Cilj raziskave je bil, da bi biološko sintetizirali ustrezen transkripcijski faktor, ki bi ga bilo moč uporabiti pri izražanju genov v rastlinah. Najprej so sintetizirali dva zapisa za protein mlcR, vsak pa je pred sabo imel različen lasten operator (en od mlcA in en od mlcC), za sabo pa zapis za GFP, s katerim bi neposredno določili, kateri zapis je imel najmočnejši promotor po vstavljanju in izražanju v Nicotiana benthamiana. Te z najmočnejšimi promotorji so hoteli še izboljšati tako, da so ustvarili več variant sintetičnega transkripcijskega faktorja, kjer je bila spremenjena le aktivatorska domena. Za konec so želeli na transkripcijskem in translacijskem nivoju vstavljenega zapisa določiti, kateri zapis bi najbolj ustrezal za nov sintetični transkripcijski faktor, ki bi deloval kot aktivator transkripcije [1].

==Rezultati==

===Izbira operatorja===

V prvem koraku so se lotili izbire operatorjev, pri katerih bodo zaznali največjo aktivnost transkripcije. Sestavili so 8 različnih konstruktov, kjer sta vsakega od dveh transkripcijskih faktorjev (zapis za nativni MlcR in zapis za DNA-vezavno domeno MlcR z eno od sintetiziranih aktivacijskih domen, VP16) povezali s štirimi različnimi operatorji genov mlcA oziroma mlcC, kjer sta se dva enaka zapisa razlikovala po številu njunih ponovitev operatorskih zaporedij (1× mlcA, 4× mlcA, 1× mlcC in 4× mlcC). Vsak konstrukt je za vsemi temi zapisi imel še zapis za protein GFP, ki je služil kot reporterski gen. Sestavili so še 4 kontrolne konstrukte, ki so vsebovali samo reporterski del, se pravi brez dela s transkripcijskim faktorjem. Konstrukte so vstavili v vektor in jih infiltrirali v N. benthamiana. 72 ur pozneje so izmerili fluorescenco, kjer se je izkazalo, da je največji signal v primerjavi z kontrolnimi konstrukti dal konstrukt 4×mclA-VP16, signal je bil dvakrat večji od kontrole. Zato so za nadaljnje poskuse uporabljali operator 4× mclA [1].

===Izbira zapisa za aktivacijsko domeno===

V naslednji stopnji so želeli ugotoviti, katera aktivacijska domena bi lahko povzročila največjo transkripcijsko aktivnost. Sestavili so 5 konstruktov, kamor so vstavili 5 različnih aktivacijskih domen (VP16, VP64, VP128, TV in QF), za njimi je bil operator 4× mlcA in zapis za GFP. Za vsakega so imeli še kontrolni konstrukt brez zapisa za transkripcijski faktor. Vse te konstrukte so zopet vstavili v vektor in infiltrirali v N. benthamiana. Po istem postopku kot v prejšnjem eksperimentu so tudi tukaj merili fluorescenco in ugotovili, da je največji signal dal konstrukt z aktivacijsko domeno QF, in sicer aktivnost izražanja je bila 6-krat večja v primerjavi z kontrolo [1].

===Validacija aktivnosti v transgenski rastlini===

Da bi preverili, ali so zasnovani transkripcijski faktorji in promotorji transkripcijsko delujoči tako, kot se biološko pričakuje v rastlinah, so morali preveriti njihovo aktivnost. Pripravili so 29 linij (T0) transgenske rastline Nicotiana tabacum s tremi različnimi vektorskimi konstrukti (4× mlcAVP16, 4× mlcA-QF in 4× mlcA), vsak je imel zapis za odpornost na higromicin (HygR). Vse linije so vzgojili do popolne zrelosti in zbrali njihova semema, da bi zasadili njihove potomce (T1) in z njimi analizirali aktivnost. Ker je reporterski sistem ostal enak, so aktivnost analizirali z merjenjem fluorescence, prav tako pa so določali izražanje gena za GFP, izražanje gena za transkripcijski faktor in izražanje HygR s qRT PCR. Rezultati obeh metod so se ujemali – izkazalo se je, da je najvišja raven izražanja opažena pri liniji s konstruktom 4× mlcA-QF. Linije s konstruktom 4× mlcA-V16 so kljub manjšem izražanju zapisa za GFP imele v primerjavi z 4× mlcA-QF enak nivo izražanja transkripcijskih faktorjev, kar še dodatno okrepi to, da je trankripcijski faktor z aktivacijsko domeno QF zaslužen za povečano transkripcijo. Pri naslednji liniji (T2) je bil nivo izražanja zapisa za GFP še večje. Primerjali so tudi vitalnost transgenske rastline in rastline divjega tipa, pri čemer se je izkazalo, da ni nobenih negativnih fenotipskih učinkov na transgensko rastlino [1].

==Zaključek==

Glede na to, da v rastlinskih sistemih ne poznamo veliko transkripcijskih faktorjev za aktivacijo transkripcije transgenov v rastlinah, je to področje, na katerem je potrebno narediti še veliko raziskav. Že v tem primeru, ki je opisan v članku, je veliko možnosti za izboljšave, recimo strukturo aktivacijske domene. V tej raziskavi so aktivacijsko domeno povezali z DNA-vezavno domeno z zanko, ki je bila dolga 12 aminokislin s ponovitvami Gly-Ser. Zanimivo bi bilo preštudirati, ali z zamenjavo deležev teh dveh aminokislin ali pa z zamenjavo pozicije teh dveh domen pride do povečanega izražanja genov. Poleg tega bi lahko poskusili v eksperiment uvesti še več različnih konstruktov aktivacijskih domen. Recimo, aktivacijska domena VP16 izhaja iz človeškega virusa, zato bi bilo smiselno optimizirati eksperiment tako, da bi preučili, ali obstaja kakšna aktivacijska domena rastlinskega virusa, ki bi jo lahko vnesli v konstrukt [1]. Primer bi lahko bil gen AL2, ki v virusu mozaika zlatega paradižnika zapisuje za transkripcijski faktor, ki aktivira transkripcijo virusnega proteina ovojnice in gena BR1, ki je odgovoren za utišanje izražanja zapisa za protein ovojnice v tkivu žil rastlin [4]. Poleg tega ne bi rabili optimzirati rabe kodonov, ki je potrebna, ko vključujemo zapise iz drugih organizmov, kar lahko povzroči nestabilnost RNA. Prav tako moramo biti pozorni na dolžino konstrukta, saj lahko predolg vključek zmanjša stabilnost plazmida. Ideja za izboljšavo nivoja izražanja genov je lahko tudi ta, da dodamo še ligand vezavno domeno, ki je pogosto prisotna v sistemih za povišanje izražanja genov. Skratka, na voljo je veliko možnosti izboljšav, ki so vsekakor dobrodošle na tem področju. Z uporabo različnih logičnih vrat bi lahko prišli ne le do aktivatorjev transkripcije v rastlinah, temveč tudi do represorjev in kemijsko inducibilnih sistemov [1].
==Viri==

[1] A. C. Pfotenhauer idr., „Development of new binary expression systems for plant synthetic biology“, Plant Cell Rep, let. 43, št. 1, str. 22, jan. 2024, doi: 10.1007/s00299-023-03100-y.

[2] R. Chakravarti in V. Sahai, „Compactin - a review“, Appl Microbiol Biotechnol, let. 64, št. 5, str. 618–624, jun. 2004, doi: 10.1007/s00253-003-1553-7.

[3] T. Barwell, B. DeVeale, L. Poirier, J. Zheng, F. Seroude, in L. Seroude, „Regulating the UAS/GAL4 system in adult Drosophila with Tet-off GAL80 transgenes“, PeerJ, let. 5, str. e4167, dec. 2017, doi: 10.7717/peerj.4167.

[4] M. D. Hartitz, G. Sunter, in D. M. Bisaro, „The Tomato Golden Mosaic Virus Transactivator (TrAP) is a Single-Stranded DNA and Zinc-Binding Phosphoprotein with an Acidic Activation Domain“, Virology, let. 263, št. 1, str. 1–14, okt. 1999, doi: 10.1006/viro.1999.9925.

Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin

2024-05-05T21:43:04Z

Alliana Kolar:

Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin

2024-05-05T21:42:14Z

Alliana Kolar:

2022-04-25T11:37:59Z

Alliana Kolar: /* Uvod */

==Uvod==
Transpozoni (TE) so mobilna DNA zaporedja v genomu. Aktivni TE se lahko premikajo po genomu in izražajo, kar celici povzroča dodatni stres. Če je še veliko ostalih negativnih dejavnikov, skupaj pripomorejo k nenormalnem celičnem delovanju. Zato je veliko TE epigenetsko utišanih, ob mutacijah pa se ta utišanja razveljavijo, kar lahko kot skupek vseh dejavnikov vodi do tvorbe rakavih celic in posledično do rakavih obolenj.
- v somatskih celicah je metilacija TE zelo stabilna, v spolnih in v pre-implatacijskem embriju pa je aktivnost TE visoka

==Epigenetske modifikacije na transpozonih==
Transpozicijski elementi (TE) so lahko v genomu epigenetsko spremenjeni, kar povzroči bodisi njihovo utišanje ali izražanje. Stalna mobilizacija TE bi hitro povzročila gensko nestabilnost, zato so nekateri utišani. Pri obolenju zdravih celic v rakave se lahko ta epigenetska utišanja razveljavijo in posledično se TE aktivirajo. V nekaterih primerih pa lahko pride tudi do utišanja TE kot posledica epigenetskih sprememb. V obeh primerih to lahko vodi do tvorbe rakastih celic. Epigenetske modifikacije, ki jih poznamo so DNA metilacije, histonske modifikacij in od nekodirajočih RNA odvisno izražanje genov. Metilacije DNA so pogoste na CpG otočkih (regije na DNA, ki so v smeri 5' konec proti 3' konec, bogate s cisteini in gvanini). Metilacije histona so lahko supresirajoča (trimetilacija lizinov 9 in 27 na H3, ki jih pogosto najdemo na nukleosomih, kjer so TE starejših ERV pa na LTR z H3K9me2 in H3M9me3) ali aktivirajoča (acetilacije), odvisno je od lokacije in stopnje, do katere je določen histon metiliran. Poleg tega poznamo še fosforilacijo in ubikvitinacijo histona.

Ko je retrotranspozicija LINE-1 (dolgi razpršeni nukleotidni element 1) izven nadzora, pride do obolenj, najbolj pa jo povezujemo s tvorbo raka, ko govorimo o hipometilaciji LINE-1, saj njegova aktivacija vodi do vrsto procesov, ki prispevajo k tvorbi rakavih celic. Pri rakavih celicah opazimo, da na mestih, kjer je prvotno prišlo do metilacije (pretežno je to na CpG otočkih) oziroma utišanja, izgubimo vse te metilacije in jih pridobimo na promotorski regiji genov za kodiranje tumor supresorske proteine. Protein 53 (p53) je eden izmed tumor supresorskih proteinov, katerega mutacije so večkrat opažene v rakastih človeških celicah. Mutiran lahko reaktivira LINE-1.

DNA metilacije so pogostejše pri mlajših TE, še posebej na ERV (endogen retrovirus, spadajo v TE razreda I), saj so bogatejše s CpG otočki kot starejše. Ob metilaciji citozina lahko pride do spontane deaminacije, kar vodi do pretvorbe citozina v timin. Dlje kot je ERV vključen v genom, več takih mutacij dobimo in posledično je tudi manj CpG otočkov na ERV. Ob tem pa ne more priti do metilacij in določen TE, ki je bil nekoč epigenetsko utišan, se lahko aktivira. To privede tudi do ekspanzije genoma.

Pri sesalcih opazimo tudi epigenetsko utišanje, ki ga vodi molekula RNA. Poznamo siRNA (mala interferenčna RNA) in miRNA (mikro RNA), obe zavirata retrotranspozicijo LINE-1 in sodelujeta pri uravnavanju normalnega delovanja celičnih procesov. Omembe vredna je tudi piRNA (PIWI-interakcijska RNA), ki je enoverižna, ta vodi proteine PIWI (proteini izraženi predvsem v zarodni liniji, potrebni so za spermatogenezo, v povezavi s piRNA cepijo TE) do mest v genomu, ki jih je treba utišat. Tudi ta zatira retrotranspozicijo LINE-1 v moških spolnih celicah miši in v induciranih pluripotentnih matičnih celicah ljudi.

Stres iz okolja in tudi življenjski stil vplivata na epigenetske spremembe na TE. Že zmerni oksidativni stres in toplotni šok zvišata pogostost transpozicije. Ob kroničnem zvišanju kortizola pa vodi do zmanjšanja demetilacij DNA, to pa povzroči aktivacijo retrotranspozonov. Zdrav življenjski stil je pozitivno vpliva na metilacijo LINE-1, kajenje pa ravno obratno povzroči izražanje metiltransferaz. Kot zanimivost lahko še dodamo, da se je v raziskavah in vitro izkazalo, da polifenoli, kot so epigalokatehin galat, ki je prisoten v zelenem čaju in genistein v soji, inhibirajo delovanje DNA metiltransferaz in tako vplivajo na celične linije raka debelega črevesja, požiralnika, dojk in prostate. Če imamo veliko poškodb na DNA, se nivo SIRT6 (deacetilaza, ki sodeluje pri zatiranju LINE-1 med staranjem) 'izčrpa', posledično se aktivirajo retrotranspozoni. Izražanje LINE-1 in njegovo mobilizacijo nadzoruje melatonin, katerega izražanje se s staranjem slabša, to pa povzroči njegovo aktivacijo. Kljub vsemu se moramo zavedati, da se različna tkiva različno odzovejo na stres, recimo pri akutnem psihološkem stresu se je v malih možganih aktivnost retotranspozona povečala, v hipokampusu pa je prišlo do trimetilacije, ki je zavirala njegovo aktivnost.

==Vloga transpozonov pri rakavih obolenjih ==

Pri integriteti genoma imajo transpozoni ključno vlogo, zato lahko neregulirana aktivnost transpozonov privede do genomske nestabilnosti in posledično rakavih celic.
Znotraj in zunajcelični dejavaniki vplivajo na celični stres in lahko aktivirajo transpozone z metilacijo in spremembami kromatina. Aktivirani transpozoni lahko nadalnje inducirajo genomsko nestabilnost, aktivacijo onkogeneze in transkripcijsko deregulacijo.

Transpozoni so sposobni spremeniti izražanje gena z insercijo v eksonsko regijo. S tem direktno vplivajo na biološko funkcijo gena, premakne se lahko tudi bralni okvir (ORF). Insercija transpozonov v intronske regije vpliva na alternativno izrezovanje genov. Nastanejo lahko napačni ali mutirani produkti. To poveča genomsko nestabilnost in poveča možnosti za nastanka mutacij.
Posledica aktivnih transpozonov so tudi dvojni zlomi DNA (DSBs), ki so za celico najnevarnejši in prispevajo k genomski nestabilnosti ter lahko vodijo celico v celično smrt, mutacije ali preureditev kromosomov. DSBs nastanejo zarad endonukleaz, ki nastajajo iz avtonomnih transpozonov in delujejo kot endotoksini, ki naredijo dvojne zlome DNA na naključnih mestih v genomu.
Pri nealelni homologni rekombinaciji (NAHR) lahko pride do napak pri prekrižanju med mejozo in mitozo, kar lahko privede do delecije ali duplikacije na rekombinantnih mestih.

'''Vloga LINE-1 (L1) pri raku'''

LINE-1 je edini delujoč retrotranspozon pri človeku in ima pomembno vlogo pri genomski nestabilnosti v rakavih celicah. L1 se prepiše preko bicistronske RNA, ki kodira RNA povezovalni protein, odprt bralni okvir 1 protein (ORF1p ali p40) in endonukleazno ter reverzno transktiptazo (ORF2p). L1 elementi so v zdravih celicah epigenetsko utišani, občasno pa preidejo L1 promotorji v aktivno obliko, posledica česar je transkripcija in nastanek ORF1p proteina. ORF1p je ključen za retrotranspozicijo L1 elementov v genomu. L1 elementi se povečajo z aktivnostjo ORF2p, ki z reverznotranskripcijo prepiše L1 mRNA in vstavi L1 DNA na nov položaj v genomu.
LINE-1 elementi imajo dvojno vlogo, pri nekaterih mutacijah L1 insercije vodijo mutacije in tako direktno vplivajo na onkogeno transformacijo. V drugih primerih pa so samo zraven, vendar ne vplivajo na razvoj rakavih celic.
V študiji ki je analizirala malo pod 3000 genomov iz rakov z 38 podtipi, je identificirala več vlog L1, vključno z kromoskomskimi delecijami tumor supreskorskih genov in strukturnimi spremembami. Odkrili so tudi možnost, da je zgodnja LINE reaktivacija lahko glavni faktor za nastanek rakavih celic, vendar se to zgodi v manj kot 1% primerov.

''Regulacija L1 s p53''

Tumor supersor P53 je eden glavnih regulatorjev, ki preprečuje raka. TP53 gen je najbolj pogosto mutiran gen pri človeških rakavih obolenjih. Študije prikazujejo nasprotujoče si dokaze o odnosu med L1 in p53. Večina dokazov kaže antagonističen odnos. P53 zavre transkripcijo Alu elementov z vezavo na 5' konec neprevajajoče se regije (UTR) in spodbuja adicijo histonskih metiltransferaznih proteinov, ki utišajo transkrpicijo L1. Agonističen odnos pa je bil opažen pri zarodnih celicah, kjer P53 spodbuja transkripcijo LINE-1. Posledica česar je nastanetk ORF2p, ki povzroči dvoje zlome DNA in poveča aktivnost P53. Nastane pozitivna aktivacijska zanka, ki nakoncu celico vodi v apoptozo.

''L1 retrotranspozicija inducira celični stres preko odziva na poškodbe DNA''

Aktivacija L1 elementov in s tem možnost retrotranspozicije lahko aktivira odziv na poškodbe DNA in omeji le celično rast ne pa tudi retrotranspozicijske aktivnosti. To bi lahko uporabili za zdravljenje, saj z aktivacijo L1 pride do genomske nestabilnosti, kar lahko vodi do apoptoze.

==3==
==Viri==

Transpozoni in rak

2022-04-25T11:16:09Z

Alliana Kolar: /* Uvod */

Transpozoni in rak

2022-04-25T10:59:51Z

Alliana Kolar: /* Epigenetske modifikacije na transpozonih */

==Uvod==
==Epigenetske modifikacije na transpozonih==
Transpozicijski elementi (TE) so lahko v genomu epigenetsko spremenjeni, kar povzroči bodisi njihovo utišanje ali izražanje. Stalna mobilizacija TE bi hitro povzročila gensko nestabilnost, zato so nekateri utišani. Pri obolenju zdravih celic v rakave se lahko ta epigenetska utišanja razveljavijo in posledično se TE aktivirajo. V nekaterih primerih pa lahko pride tudi do utišanja TE kot posledica epigenetskih sprememb. V obeh primerih to lahko vodi do tvorbe rakastih celic. Epigenetske modifikacije, ki jih poznamo so DNA metilacije, histonske modifikacij in od nekodirajočih RNA odvisno izražanje genov. Metilacije DNA so pogoste na CpG otočkih (regije na DNA, ki so v smeri 5' konec proti 3' konec, bogate s cisteini in gvanini). Metilacije histona so lahko supresirajoča (trimetilacija lizinov 9 in 27 na H3, ki jih pogosto najdemo na nukleosomih, kjer so TE starejših ERV pa na LTR z H3K9me2 in H3M9me3) ali aktivirajoča (acetilacije), odvisno je od lokacije in stopnje, do katere je določen histon metiliran. Poleg tega poznamo še fosforilacijo in ubikvitinacijo histona.

Ko je retrotranspozicija LINE-1 (dolgi razpršeni nukleotidni element 1) izven nadzora, pride do obolenj, najbolj pa jo povezujemo s tvorbo raka, ko govorimo o hipometilaciji LINE-1, saj njegova aktivacija vodi do vrsto procesov, ki prispevajo k tvorbi rakavih celic. Pri rakavih celicah opazimo, da na mestih, kjer je prvotno prišlo do metilacije (pretežno je to na CpG otočkih) oziroma utišanja, izgubimo vse te metilacije in jih pridobimo na promotorski regiji genov za kodiranje tumor supresorske proteine. Protein 53 (p53) je eden izmed tumor supresorskih proteinov, katerega mutacije so večkrat opažene v rakastih človeških celicah. Mutiran lahko reaktivira LINE-1.

DNA metilacije so pogostejše pri mlajših TE, še posebej na ERV (endogen retrovirus, spadajo v TE razreda I), saj so bogatejše s CpG otočki kot starejše. Ob metilaciji citozina lahko pride do spontane deaminacije, kar vodi do pretvorbe citozina v timin. Dlje kot je ERV vključen v genom, več takih mutacij dobimo in posledično je tudi manj CpG otočkov na ERV. Ob tem pa ne more priti do metilacij in določen TE, ki je bil nekoč epigenetsko utišan, se lahko aktivira. To privede tudi do ekspanzije genoma.

Pri sesalcih opazimo tudi epigenetsko utišanje, ki ga vodi molekula RNA. Poznamo siRNA (mala interferenčna RNA) in miRNA (mikro RNA), obe zavirata retrotranspozicijo LINE-1 in sodelujeta pri uravnavanju normalnega delovanja celičnih procesov. Omembe vredna je tudi piRNA (PIWI-interakcijska RNA), ki je enoverižna, ta vodi proteine PIWI (proteini izraženi predvsem v zarodni liniji, potrebni so za spermatogenezo, v povezavi s piRNA cepijo TE) do mest v genomu, ki jih je treba utišat. Tudi ta zatira retrotranspozicijo LINE-1 v moških spolnih celicah miši in v induciranih pluripotentnih matičnih celicah ljudi.

Stres iz okolja in tudi življenjski stil vplivata na epigenetske spremembe na TE. Že zmerni oksidativni stres in toplotni šok zvišata pogostost transpozicije. Ob kroničnem zvišanju kortizola pa vodi do zmanjšanja demetilacij DNA, to pa povzroči aktivacijo retrotranspozonov. Zdrav življenjski stil je pozitivno vpliva na metilacijo LINE-1, kajenje pa ravno obratno povzroči izražanje metiltransferaz. Kot zanimivost lahko še dodamo, da se je v raziskavah in vitro izkazalo, da polifenoli, kot so epigalokatehin galat, ki je prisoten v zelenem čaju in genistein v soji, inhibirajo delovanje DNA metiltransferaz in tako vplivajo na celične linije raka debelega črevesja, požiralnika, dojk in prostate. Če imamo veliko poškodb na DNA, se nivo SIRT6 (deacetilaza, ki sodeluje pri zatiranju LINE-1 med staranjem) 'izčrpa', posledično se aktivirajo retrotranspozoni. Izražanje LINE-1 in njegovo mobilizacijo nadzoruje melatonin, katerega izražanje se s staranjem slabša, to pa povzroči njegovo aktivacijo. Kljub vsemu se moramo zavedati, da se različna tkiva različno odzovejo na stres, recimo pri akutnem psihološkem stresu se je v malih možganih aktivnost retotranspozona povečala, v hipokampusu pa je prišlo do trimetilacije, ki je zavirala njegovo aktivnost.

==2==
==3==
==Viri==

2022-04-20T13:51:38Z

Alliana Kolar: /* Transpozoni in rak */

==1==
==2==
==3==