Wiki FKKT - User contributions [en]

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije

2020-04-21T16:05:03Z

Anže Jenko:

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.8b00271# Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transfer between Bacteria in the Mammalian Gut]
= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobioma črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux ''V. fischeri''. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšni sistemi koristijo za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način nadzorujejo delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

= Zasnova genetskih elementov v ''E. coli'' =
== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili smerni signalni element. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, smerni signalni element konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor ''PtetA'', zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za ''araC'' in ''araB''. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena ''luxR'', ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja ''PlacIQ''. Promotor ''PlacIQ'' je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena ''lacI''. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja ''PluxI'', ki so ga vzeli iz ''V. fischeri'', ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja ''PluxI'' in ''PlacIQ'' sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na spominski element. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz ''E. coli'', ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja ''pR''. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja ''pRM''. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor ''pR'', tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na ''pRM'' in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene ''rexAB'', ''cI'', ''cro'' in ''lacZ''. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja ''pR'', s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; ''lacZ'', ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena ''cro'' [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na ''pRM'' znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja ''pR''. Promotor ''pR'' sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane ''pRM'' blokiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v ''S. typhimurium'' =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri ''E. coli'', so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri ''S. typhimurium'', le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so ''in vitro'' preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

= Viri =

[1] Rinninella, E., Raoul, P., Cintoni, M., Franceschi, F., Miggiano, G., Gasbarrini, A. in Mele, M. C. (2019). What is the Healthy Gut Microbiota Composition? A Changing Ecosystem across Age, Environment, Diet, and Diseases. ''Microorganisms'', 7(1) ,14.

[2] Swearingen, M.C., Sabag-Daigle, A. in Ahmer, B.M.M. (2013) Are there acylhomoserine lactones within mammalian intestine?'' J.'' ''Bacteriol''. 195, 173-179.

[3] Ng, W. L. in Bassler, B. L. (2009). Bacterial quorum-sensing network architectures. ''Ann. rev. genetics'', 43, 197–222.

[4] Kim, S., Kerns, S.J., Ziesack, M., Bry, L, Gerber, G.K., Way J.C. in Silver P.A. (2018). Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transfer between Bacteria in the Mammalian Gut, ''CS Synth.'' ''Biol.'' 7, 9, 2270-2281.

[5] Kotula, J.W., Kerns, S.J., Shaket, L.A., Siraj, L., Collins, J.J., Way, J.C., and Silver, P.A. (2014). Programmable bacteria detect and record an environmental signal in the mammalian gut, ''Proc.'' ''Natl. Acad. Sci''. USA 111, 4838-4843.

[6] Calos, M. P. (1978). DNA Sequence for a Low-Level Promoter of the Lac Repressor Gene and 1013 an “Up” Promoter Mutation. ''Nature'', 274 (5673), 762–765.

[7] Lee, S., Lewis, D.E.A. in Adhya, S. (2018). The Developmental Switch in Bacteriophage λ: A Critical Role of the Cro Protein. ''J Mol'' ''Biol'', 430, 58-68.

[8] Johnson, A.D., Poteete, A.R., Lauer, G., Sauer, R.T., Ackers, G.K. in Ptashne, M. (1981). Lambda Repressor and cro--components of an efficient molecular switch. ''Nature''. 294(5838), 217-223.

[9] Schubert, R.A., Dodd, I.B., Egan, J.B. in Shearwin, K.E. (2007). Cro's role in the CI Cro bistable switch is critical for {lambda}'s transition from lysogeny to lytic development. ''Genes Dev''. 21(19), 2461-2472.

[10] Teif, V.B. (2007). General transfer matrix formalism to calculate DNA-protein-drug binding in gene regulation: application to OR operator of phage lambda. ''Nucleic Acids Res''. 35(11), e80.

[11] Yartseva, A., Klaudel, H., Devillers, R. in Képès F. (2007). Incremental and unifying modelling formalism for biological interaction networks. ''BMC Bioinfo''. 8(1):433.

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije

2020-04-21T16:04:50Z

Anže Jenko:

Izhodiščni članek:[https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.8b00271# Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transfer between Bacteria in the Mammalian Gut]
= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobioma črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux ''V. fischeri''. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšni sistemi koristijo za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način nadzorujejo delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

= Zasnova genetskih elementov v ''E. coli'' =
== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili smerni signalni element. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, smerni signalni element konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor ''PtetA'', zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za ''araC'' in ''araB''. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena ''luxR'', ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja ''PlacIQ''. Promotor ''PlacIQ'' je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena ''lacI''. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja ''PluxI'', ki so ga vzeli iz ''V. fischeri'', ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja ''PluxI'' in ''PlacIQ'' sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na spominski element. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz ''E. coli'', ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja ''pR''. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja ''pRM''. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor ''pR'', tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na ''pRM'' in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene ''rexAB'', ''cI'', ''cro'' in ''lacZ''. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja ''pR'', s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; ''lacZ'', ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena ''cro'' [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na ''pRM'' znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja ''pR''. Promotor ''pR'' sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane ''pRM'' blokiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v ''S. typhimurium'' =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri ''E. coli'', so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri ''S. typhimurium'', le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so ''in vitro'' preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

= Viri =

[1] Rinninella, E., Raoul, P., Cintoni, M., Franceschi, F., Miggiano, G., Gasbarrini, A. in Mele, M. C. (2019). What is the Healthy Gut Microbiota Composition? A Changing Ecosystem across Age, Environment, Diet, and Diseases. ''Microorganisms'', 7(1) ,14.

[2] Swearingen, M.C., Sabag-Daigle, A. in Ahmer, B.M.M. (2013) Are there acylhomoserine lactones within mammalian intestine?'' J.'' ''Bacteriol''. 195, 173-179.

[3] Ng, W. L. in Bassler, B. L. (2009). Bacterial quorum-sensing network architectures. ''Ann. rev. genetics'', 43, 197–222.

[4] Kim, S., Kerns, S.J., Ziesack, M., Bry, L, Gerber, G.K., Way J.C. in Silver P.A. (2018). Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transfer between Bacteria in the Mammalian Gut, ''CS Synth.'' ''Biol.'' 7, 9, 2270-2281.

[5] Kotula, J.W., Kerns, S.J., Shaket, L.A., Siraj, L., Collins, J.J., Way, J.C., and Silver, P.A. (2014). Programmable bacteria detect and record an environmental signal in the mammalian gut, ''Proc.'' ''Natl. Acad. Sci''. USA 111, 4838-4843.

[6] Calos, M. P. (1978). DNA Sequence for a Low-Level Promoter of the Lac Repressor Gene and 1013 an “Up” Promoter Mutation. ''Nature'', 274 (5673), 762–765.

[7] Lee, S., Lewis, D.E.A. in Adhya, S. (2018). The Developmental Switch in Bacteriophage λ: A Critical Role of the Cro Protein. ''J Mol'' ''Biol'', 430, 58-68.

[8] Johnson, A.D., Poteete, A.R., Lauer, G., Sauer, R.T., Ackers, G.K. in Ptashne, M. (1981). Lambda Repressor and cro--components of an efficient molecular switch. ''Nature''. 294(5838), 217-223.

[9] Schubert, R.A., Dodd, I.B., Egan, J.B. in Shearwin, K.E. (2007). Cro's role in the CI Cro bistable switch is critical for {lambda}'s transition from lysogeny to lytic development. ''Genes Dev''. 21(19), 2461-2472.

[10] Teif, V.B. (2007). General transfer matrix formalism to calculate DNA-protein-drug binding in gene regulation: application to OR operator of phage lambda. ''Nucleic Acids Res''. 35(11), e80.

[11] Yartseva, A., Klaudel, H., Devillers, R. in Képès F. (2007). Incremental and unifying modelling formalism for biological interaction networks. ''BMC Bioinfo''. 8(1):433.

Seminarji SB 2019/20

2020-04-21T15:57:57Z

Anže Jenko:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 

21.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 

22.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinhronizirani_cikli_lize_bakterijskih_celic_za_in_vivo_dostavo_terapevtikov Sinhronizirani cikli lize bakterijskih celic za ''in vivo'' dostavo terapevtikov](Milica Janković) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Antihipertenzivni_probiotik_-_nov_pristop_zni%C5%BEevanja_krvnega_tlaka Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka] (Nika Testen) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_pot_fiksacije_ogljikovega_dioksida Sintezna pot fiksacije ogljikovega dioksida] (Ana Obaha) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 

5.5. 
1 Ajda Lenardič 
2 Jelena Štrbac 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
4 Uroš Prešern 

6.5. 
1 Sara Korošec 
2 Peter Škrinjar 
3 Luka Gregorič 
4 Urban Hribar 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
3 Daria Latysheva 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Seminarji SB 2019/20

2020-04-21T15:52:43Z

Anže Jenko:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 

21.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Anže Jenko) 

4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 

22.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinhronizirani_cikli_lize_bakterijskih_celic_za_in_vivo_dostavo_terapevtikov Sinhronizirani cikli lize bakterijskih celic za ''in vivo'' dostavo terapevtikov](Milica Janković) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Antihipertenzivni_probiotik_-_nov_pristop_zni%C5%BEevanja_krvnega_tlaka Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka] (Nika Testen) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_pot_fiksacije_ogljikovega_dioksida Sintezna pot fiksacije ogljikovega dioksida] (Ana Obaha) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 

5.5. 
1 Ajda Lenardič 
2 Jelena Štrbac 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
4 Uroš Prešern 

6.5. 
1 Sara Korošec 
2 Peter Škrinjar 
3 Luka Gregorič 
4 Urban Hribar 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
3 Daria Latysheva 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Seminarji SB 2019/20

2020-04-21T15:51:12Z

Anže Jenko:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 

21.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 

22.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinhronizirani_cikli_lize_bakterijskih_celic_za_in_vivo_dostavo_terapevtikov Sinhronizirani cikli lize bakterijskih celic za ''in vivo'' dostavo terapevtikov](Milica Janković) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Antihipertenzivni_probiotik_-_nov_pristop_zni%C5%BEevanja_krvnega_tlaka Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka] (Nika Testen) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_pot_fiksacije_ogljikovega_dioksida Sintezna pot fiksacije ogljikovega dioksida] (Ana Obaha) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 

5.5. 
1 Ajda Lenardič 
2 Jelena Štrbac 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
4 Uroš Prešern 

6.5. 
1 Sara Korošec 
2 Peter Škrinjar 
3 Luka Gregorič 
4 Urban Hribar 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
3 Daria Latysheva 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Seminarji SB 2019/20

2020-04-21T15:50:13Z

Anže Jenko:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 

21.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije]. (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 

22.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinhronizirani_cikli_lize_bakterijskih_celic_za_in_vivo_dostavo_terapevtikov Sinhronizirani cikli lize bakterijskih celic za ''in vivo'' dostavo terapevtikov](Milica Janković) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Antihipertenzivni_probiotik_-_nov_pristop_zni%C5%BEevanja_krvnega_tlaka Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka] (Nika Testen) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_pot_fiksacije_ogljikovega_dioksida Sintezna pot fiksacije ogljikovega dioksida] (Ana Obaha) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 

5.5. 
1 Ajda Lenardič 
2 Jelena Štrbac 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
4 Uroš Prešern 

6.5. 
1 Sara Korošec 
2 Peter Škrinjar 
3 Luka Gregorič 
4 Urban Hribar 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
3 Daria Latysheva 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Seminarji SB 2019/20

2020-04-21T15:45:10Z

Anže Jenko:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 

21.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3[Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_črevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije]. (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 

22.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinhronizirani_cikli_lize_bakterijskih_celic_za_in_vivo_dostavo_terapevtikov Sinhronizirani cikli lize bakterijskih celic za ''in vivo'' dostavo terapevtikov](Milica Janković) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Antihipertenzivni_probiotik_-_nov_pristop_zni%C5%BEevanja_krvnega_tlaka Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka] (Nika Testen) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_pot_fiksacije_ogljikovega_dioksida Sintezna pot fiksacije ogljikovega dioksida] (Ana Obaha) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 

5.5. 
1 Ajda Lenardič 
2 Jelena Štrbac 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
4 Uroš Prešern 

6.5. 
1 Sara Korošec 
2 Peter Škrinjar 
3 Luka Gregorič 
4 Urban Hribar 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
3 Daria Latysheva 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije

2020-04-19T21:56:41Z

Anže Jenko:

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobioma črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux ''V. fischeri''. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšni sistemi koristijo za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način nadzorujejo delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

= Zasnova genetskih elementov v ''E. coli'' =
== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili smerni signalni element. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, smerni signalni element konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor ''PtetA'', zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za ''araC'' in ''araB''. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena ''luxR'', ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja ''PlacIQ''. Promotor ''PlacIQ'' je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena ''lacI''. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja ''PluxI'', ki so ga vzeli iz ''V. fischeri'', ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja ''PluxI'' in ''PlacIQ'' sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na spominski element. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz ''E. coli'', ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja ''pR''. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja ''pRM''. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor ''pR'', tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na ''pRM'' in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene ''rexAB'', ''cI'', ''cro'' in ''lacZ''. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja ''pR'', s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; ''lacZ'', ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena ''cro'' [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na ''pRM'' znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja ''pR''. Promotor ''pR'' sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane ''pRM'' blokiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v ''S. typhimurium'' =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri ''E. coli'', so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri ''S. typhimurium'', le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so ''in vitro'' preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

= Viri =

[1] Rinninella, E., Raoul, P., Cintoni, M., Franceschi, F., Miggiano, G., Gasbarrini, A. in Mele, M. C. (2019). What is the Healthy Gut Microbiota Composition? A Changing Ecosystem across Age, Environment, Diet, and Diseases. ''Microorganisms'', 7(1) ,14.

[2] Swearingen, M.C., Sabag-Daigle, A. in Ahmer, B.M.M. (2013) Are there acylhomoserine lactones within mammalian intestine?'' J.'' ''Bacteriol''. 195, 173-179.

[3] Ng, W. L. in Bassler, B. L. (2009). Bacterial quorum-sensing network architectures. ''Ann. rev. genetics'', 43, 197–222.

[4] Kim, S., Kerns, S.J., Ziesack, M., Bry, L, Gerber, G.K., Way J.C. in Silver P.A. (2018). Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transfer between Bacteria in the Mammalian Gut, ''CS Synth.'' ''Biol.'' 7, 9, 2270-2281.

[5] Kotula, J.W., Kerns, S.J., Shaket, L.A., Siraj, L., Collins, J.J., Way, J.C., and Silver, P.A. (2014). Programmable bacteria detect and record an environmental signal in the mammalian gut, ''Proc.'' ''Natl. Acad. Sci''. USA 111, 4838-4843.

[6] Calos, M. P. (1978). DNA Sequence for a Low-Level Promoter of the Lac Repressor Gene and 1013 an “Up” Promoter Mutation. ''Nature'', 274 (5673), 762–765.

[7] Lee, S., Lewis, D.E.A. in Adhya, S. (2018). The Developmental Switch in Bacteriophage λ: A Critical Role of the Cro Protein. ''J Mol'' ''Biol'', 430, 58-68.

[8] Johnson, A.D., Poteete, A.R., Lauer, G., Sauer, R.T., Ackers, G.K. in Ptashne, M. (1981). Lambda Repressor and cro--components of an efficient molecular switch. ''Nature''. 294(5838), 217-223.

[9] Schubert, R.A., Dodd, I.B., Egan, J.B. in Shearwin, K.E. (2007). Cro's role in the CI Cro bistable switch is critical for {lambda}'s transition from lysogeny to lytic development. ''Genes Dev''. 21(19), 2461-2472.

[10] Teif, V.B. (2007). General transfer matrix formalism to calculate DNA-protein-drug binding in gene regulation: application to OR operator of phage lambda. ''Nucleic Acids Res''. 35(11), e80.

[11] Yartseva, A., Klaudel, H., Devillers, R. in Képès F. (2007). Incremental and unifying modelling formalism for biological interaction networks. ''BMC Bioinfo''. 8(1):433.

Seminarji SB 2019/20

2020-04-19T20:13:00Z

Anže Jenko:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 

21.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 

22.4. 
1 Milica Janković 
2 Nika Testen 
3 Ana Obaha 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 

5.5. 
1 Ajda Lenardič 
2 Jelena Štrbac 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
4 Uroš Prešern 

6.5. 
1 Sara Korošec 
2 Peter Škrinjar 
3 Luka Gregorič 
4 Urban Hribar 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
3 Daria Latysheva 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Seminarji SB 2019/20

2020-04-19T20:12:06Z

Anže Jenko:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 

21.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [[[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije]]] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 

22.4. 
1 Milica Janković 
2 Nika Testen 
3 Ana Obaha 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 

5.5. 
1 Ajda Lenardič 
2 Jelena Štrbac 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
4 Uroš Prešern 

6.5. 
1 Sara Korošec 
2 Peter Škrinjar 
3 Luka Gregorič 
4 Urban Hribar 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
3 Daria Latysheva 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Seminarji SB 2019/20

2020-04-19T20:06:34Z

Anže Jenko:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 

21.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 

22.4. 
1 Milica Janković 
2 Nika Testen 
3 Ana Obaha 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 

5.5. 
1 Ajda Lenardič 
2 Jelena Štrbac 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
4 Uroš Prešern 

6.5. 
1 Sara Korošec 
2 Peter Škrinjar 
3 Luka Gregorič 
4 Urban Hribar 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
3 Daria Latysheva 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije

2020-04-19T20:04:14Z

Anže Jenko: New page: = Sesalski mikrobiom = Sestava mikrobioma črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolit...

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobioma črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov v ''E. coli'' =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux ''V. fischeri''. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšni sistemi koristijo za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način nadzorujejo delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili smerni signalni element. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, smerni signalni element konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor ''PtetA'', zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za ''araC'' in ''araB''. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena ''luxR'', ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja ''PlacIQ''. Promotor ''PlacIQ'' je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena ''lacI''. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja ''PluxI'', ki so ga vzeli iz ''V. fischeri'', ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja ''PluxI'' in ''PlacIQ'' sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na spominski element. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz ''E. coli'', ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja ''pR''. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja ''pRM''. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor ''pR'', tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na ''pRM'' in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene ''rexAB'', ''cI'', ''cro'' in ''lacZ''. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja ''pR'', s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; ''lacZ'', ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena ''cro'' [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na ''pRM'' znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja ''pR''. Promotor ''pR'' sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane ''pRM'' blokiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v ''S. typhimurium'' =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri ''E. coli'', so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri ''S. typhimurium'', le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so ''in vitro'' preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

= Viri =

[1] Rinninella, E., Raoul, P., Cintoni, M., Franceschi, F., Miggiano, G., Gasbarrini, A. in Mele, M. C. (2019). What is the Healthy Gut Microbiota Composition? A Changing Ecosystem across Age, Environment, Diet, and Diseases. ''Microorganisms'', 7(1) ,14.

[2] Swearingen, M.C., Sabag-Daigle, A. in Ahmer, B.M.M. (2013) Are there acylhomoserine lactones within mammalian intestine?'' J.'' ''Bacteriol''. 195, 173-179.

[3] Ng, W. L. in Bassler, B. L. (2009). Bacterial quorum-sensing network architectures. ''Ann. rev. genetics'', 43, 197–222.

[4] Kim, S., Kerns, S.J., Ziesack, M., Bry, L, Gerber, G.K., Way J.C. in Silver P.A. (2018). Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transfer between Bacteria in the Mammalian Gut, ''CS Synth.'' ''Biol.'' 7, 9, 2270-2281.

[5] Kotula, J.W., Kerns, S.J., Shaket, L.A., Siraj, L., Collins, J.J., Way, J.C., and Silver, P.A. (2014). Programmable bacteria detect and record an environmental signal in the mammalian gut, ''Proc.'' ''Natl. Acad. Sci''. USA 111, 4838-4843.

[6] Calos, M. P. (1978). DNA Sequence for a Low-Level Promoter of the Lac Repressor Gene and 1013 an “Up” Promoter Mutation. ''Nature'', 274 (5673), 762–765.

[7] Lee, S., Lewis, D.E.A. in Adhya, S. (2018). The Developmental Switch in Bacteriophage λ: A Critical Role of the Cro Protein. ''J Mol'' ''Biol'', 430, 58-68.

[8] Johnson, A.D., Poteete, A.R., Lauer, G., Sauer, R.T., Ackers, G.K. in Ptashne, M. (1981). Lambda Repressor and cro--components of an efficient molecular switch. ''Nature''. 294(5838), 217-223.

[9] Schubert, R.A., Dodd, I.B., Egan, J.B. in Shearwin, K.E. (2007). Cro's role in the CI Cro bistable switch is critical for {lambda}'s transition from lysogeny to lytic development. ''Genes Dev''. 21(19), 2461-2472.

[10] Teif, V.B. (2007). General transfer matrix formalism to calculate DNA-protein-drug binding in gene regulation: application to OR operator of phage lambda. ''Nucleic Acids Res''. 35(11), e80.

[11] Yartseva, A., Klaudel, H., Devillers, R. in Képès F. (2007). Incremental and unifying modelling formalism for biological interaction networks. ''BMC Bioinfo''. 8(1):433.

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T20:02:42Z

Anže Jenko:

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobioma črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov v ''E. coli'' =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux ''V. fischeri''. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšni sistemi koristijo za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način nadzorujejo delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili smerni signalni element. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, smerni signalni element konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor ''PtetA'', zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za ''araC'' in ''araB''. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena ''luxR'', ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja ''PlacIQ''. Promotor ''PlacIQ'' je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena ''lacI''. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja ''PluxI'', ki so ga vzeli iz ''V. fischeri'', ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja ''PluxI'' in ''PlacIQ'' sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na spominski element. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz ''E. coli'', ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja ''pR''. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja ''pRM''. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor ''pR'', tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na ''pRM'' in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene ''rexAB'', ''cI'', ''cro'' in ''lacZ''. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja ''pR'', s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; ''lacZ'', ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena ''cro'' [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na ''pRM'' znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja ''pR''. Promotor ''pR'' sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane ''pRM'' blokiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v ''S. typhimurium'' =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri ''E. coli'', so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri ''S. typhimurium'', le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so ''in vitro'' preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

= Viri =

[1] Rinninella, E., Raoul, P., Cintoni, M., Franceschi, F., Miggiano, G., Gasbarrini, A. in Mele, M. C. (2019). What is the Healthy Gut Microbiota Composition? A Changing Ecosystem across Age, Environment, Diet, and Diseases. ''Microorganisms'', 7(1) ,14.

[2] Swearingen, M.C., Sabag-Daigle, A. in Ahmer, B.M.M. (2013) Are there acylhomoserine lactones within mammalian intestine?'' J.'' ''Bacteriol''. 195, 173-179.

[3] Ng, W. L. in Bassler, B. L. (2009). Bacterial quorum-sensing network architectures. ''Ann. rev. genetics'', 43, 197–222.

[4] Kim, S., Kerns, S.J., Ziesack, M., Bry, L, Gerber, G.K., Way J.C. in Silver P.A. (2018). Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transfer between Bacteria in the Mammalian Gut, ''CS Synth.'' ''Biol.'' 7, 9, 2270-2281.

[5] Kotula, J.W., Kerns, S.J., Shaket, L.A., Siraj, L., Collins, J.J., Way, J.C., and Silver, P.A. (2014). Programmable bacteria detect and record an environmental signal in the mammalian gut, ''Proc.'' ''Natl. Acad. Sci''. USA 111, 4838-4843.

[6] Calos, M. P. (1978). DNA Sequence for a Low-Level Promoter of the Lac Repressor Gene and 1013 an “Up” Promoter Mutation. ''Nature'', 274 (5673), 762–765.

[7] Lee, S., Lewis, D.E.A. in Adhya, S. (2018). The Developmental Switch in Bacteriophage λ: A Critical Role of the Cro Protein. ''J Mol'' ''Biol'', 430, 58-68.

[8] Johnson, A.D., Poteete, A.R., Lauer, G., Sauer, R.T., Ackers, G.K. in Ptashne, M. (1981). Lambda Repressor and cro--components of an efficient molecular switch. ''Nature''. 294(5838), 217-223.

[9] Schubert, R.A., Dodd, I.B., Egan, J.B. in Shearwin, K.E. (2007). Cro's role in the CI Cro bistable switch is critical for {lambda}'s transition from lysogeny to lytic development. ''Genes Dev''. 21(19), 2461-2472.

[10] Teif, V.B. (2007). General transfer matrix formalism to calculate DNA-protein-drug binding in gene regulation: application to OR operator of phage lambda. ''Nucleic Acids Res''. 35(11), e80.

[11] Yartseva, A., Klaudel, H., Devillers, R. in Képès F. (2007). Incremental and unifying modelling formalism for biological interaction networks. ''BMC Bioinfo''. 8(1):433.

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T20:00:56Z

Anže Jenko:

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobioma črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov v ''E. coli'' =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux ''V. fischeri''. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšni sistemi koristijo za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način nadzorujejo delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili smerni signalni element. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, smerni signalni element konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor ''PtetA'', zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za ''araC'' in ''araB''. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena ''luxR'', ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja ''PlacIQ''. Promotor ''PlacIQ'' je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena ''lacI''. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja ''PluxI'', ki so ga vzeli iz ''V. fischeri'', ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja ''PluxI'' in ''PlacIQ'' sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na spominski element. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz ''E. coli'', ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja ''pR''. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja ''pRM''. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor ''pR'', tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na ''pRM'' in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene ''rexAB'', ''cI'', ''cro'' in ''lacZ''. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja ''pR'', s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; ''lacZ'', ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena ''cro'' [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na ''pRM'' znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja ''pR''. Promotor ''pR'' sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane ''pRM'' blokiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v ''S. typhimurium'' =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri ''E. coli'', so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri ''S. typhimurium'', le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so ''in vitro'' preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

= Viri =

[1] Rinninella, E., Raoul, P., Cintoni, M., Franceschi, F., Miggiano, G., Gasbarrini, A. in Mele, M. C. (2019). What is the Healthy Gut Microbiota Composition? A Changing Ecosystem across Age, Environment, Diet, and Diseases. ''Microorganisms'', 7(1) ,14.

[2] Swearingen, M.C., Sabag-Daigle, A. in Ahmer, B.M.M. (2013) Are there acylhomoserine lactones within mammalian intestine?'' J.'' ''Bacteriol''. 195, 173-179.

[3] Ng, W. L. in Bassler, B. L. (2009). Bacterial quorum-sensing network architectures. ''Ann. rev. genetics'', 43, 197–222.

[4] Kim, S., Kerns, S.J., Ziesack, M., Bry, L, Gerber, G.K., Way J.C. in Silver P.A. (2018). Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transfer between Bacteria in the Mammalian Gut, ''CS Synth.'' ''Biol.'' 7, 9, 2270-2281.

[5] Kotula, J.W., Kerns, S.J., Shaket, L.A., Siraj, L., Collins, J.J., Way, J.C., and Silver, P.A. (2014). Programmable bacteria detect and record an environmental signal in the mammalian gut, ''Proc.'' ''Natl. Acad. Sci''. USA 111, 4838-4843.

[6] Calos, M. P. (1978). DNA Sequence for a Low-Level Promoter of the Lac Repressor Gene and 1013 an “Up” Promoter Mutation. ''Nature'', 274 (5673), 762–765.

[7] Lee, S., Lewis, D.E.A. in Adhya, S. (2018). The Developmental Switch in Bacteriophage λ: A Critical Role of the Cro Protein. ''J Mol'' ''Biol'', 430, 58-68.

[8] Johnson, A.D., Poteete, A.R., Lauer, G., Sauer, R.T., Ackers, G.K. in Ptashne, M. (1981). Lambda Repressor and cro--components of an efficient molecular switch. ''Nature''. 294(5838), 217-223.

[9] Schubert, R.A., Dodd, I.B., Egan, J.B. in Shearwin, K.E. (2007). Cro's role in the CI Cro bistable switch is critical for {lambda}'s transition from lysogeny to lytic development. ''Genes Dev''. 21(19), 2461-2472.

[10] Teif, V.B. (2007). General transfer matrix formalism to calculate DNA-protein-drug binding in gene regulation: application to OR operator of phage lambda. ''Nucleic Acids Res''. 35(11), e80.

[11] Yartseva, A., Klaudel, H., Devillers, R. in Képès F. (2007). Incremental and unifying modelling formalism for biological interaction networks. ''BMC Bioinfo''. 8(1):433.

Seminarji SB 2019/20

2020-04-19T19:59:44Z

Anže Jenko:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 

21.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije.] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 

22.4. 
1 Milica Janković 
2 Nika Testen 
3 Ana Obaha 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 

5.5. 
1 Ajda Lenardič 
2 Jelena Štrbac 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
4 Uroš Prešern 

6.5. 
1 Sara Korošec 
2 Peter Škrinjar 
3 Luka Gregorič 
4 Urban Hribar 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
3 Daria Latysheva 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:56:36Z

Anže Jenko: /* Zasnova genetskih elementov v E. coli */

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobioma črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov v ''E. coli'' =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux ''V. fischeri''. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšni sistemi koristijo za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način nadzorujejo delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili smerni signalni element. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, smerni signalni element konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor ''PtetA'', zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za ''araC'' in ''araB''. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena ''luxR'', ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja ''PlacIQ''. Promotor ''PlacIQ'' je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena ''lacI''. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja ''PluxI'', ki so ga vzeli iz ''V. fischeri'', ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja ''PluxI'' in ''PlacIQ'' sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na spominski element. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz ''E. coli'', ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja ''pR''. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja ''pRM''. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor ''pR'', tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na ''pRM'' in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene ''rexAB'', ''cI'', ''cro'' in ''lacZ''. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja ''pR'', s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; ''lacZ'', ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena ''cro'' [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na ''pRM'' znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja ''pR''. Promotor ''pR'' sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane ''pRM'' blokiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v ''S. typhimurium'' =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri ''E. coli'', so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri ''S. typhimurium'', le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so ''in vitro'' preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

= Viri =

[1] Rinninella, E., Raoul, P., Cintoni, M., Franceschi, F., Miggiano, G., Gasbarrini, A. in Mele, M. C. (2019). What is the Healthy Gut Microbiota Composition? A Changing Ecosystem across Age, Environment, Diet, and Diseases. ''Microorganisms'', 7(1) ,14.

[2] Swearingen, M.C., Sabag-Daigle, A. in Ahmer, B.M.M. (2013) Are there acylhomoserine lactones within mammalian intestine?'' J.'' ''Bacteriol''. 195, 173-179.

[3] Ng, W. L. in Bassler, B. L. (2009). Bacterial quorum-sensing network architectures. ''Ann. rev. genetics'', 43, 197–222.

[4] Kim, S., Kerns, S.J., Ziesack, M., Bry, L, Gerber, G.K., Way J.C. in Silver P.A. (2018). Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transfer between Bacteria in the Mammalian Gut, ''CS Synth.'' ''Biol.'' 7, 9, 2270-2281.

[5] Kotula, J.W., Kerns, S.J., Shaket, L.A., Siraj, L., Collins, J.J., Way, J.C., and Silver, P.A. (2014). Programmable bacteria detect and record an environmental signal in the mammalian gut, ''Proc.'' ''Natl. Acad. Sci''. USA 111, 4838-4843.

[6] Calos, M. P. (1978). DNA Sequence for a Low-Level Promoter of the Lac Repressor Gene and 1013 an “Up” Promoter Mutation. ''Nature'', 274 (5673), 762–765.

[7] Lee, S., Lewis, D.E.A. in Adhya, S. (2018). The Developmental Switch in Bacteriophage λ: A Critical Role of the Cro Protein. ''J Mol'' ''Biol'', 430, 58-68.

[8] Johnson, A.D., Poteete, A.R., Lauer, G., Sauer, R.T., Ackers, G.K. in Ptashne, M. (1981). Lambda Repressor and cro--components of an efficient molecular switch. ''Nature''. 294(5838), 217-223.

[9] Schubert, R.A., Dodd, I.B., Egan, J.B. in Shearwin, K.E. (2007). Cro's role in the CI Cro bistable switch is critical for {lambda}'s transition from lysogeny to lytic development. ''Genes Dev''. 21(19), 2461-2472.

[10] Teif, V.B. (2007). General transfer matrix formalism to calculate DNA-protein-drug binding in gene regulation: application to OR operator of phage lambda. ''Nucleic Acids Res''. 35(11), e80.

[11] Yartseva, A., Klaudel, H., Devillers, R. in Képès F. (2007). Incremental and unifying modelling formalism for biological interaction networks. ''BMC Bioinfo''. 8(1):433.

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:55:12Z

Anže Jenko: /* Sesalski mikrobiom */

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobioma črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov v ''E. coli'' =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux ''V. fischeri''. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili smerni signalni element. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, smerni signalni element konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor ''PtetA'', zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za ''araC'' in ''araB''. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena ''luxR'', ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja ''PlacIQ''. Promotor ''PlacIQ'' je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena ''lacI''. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja ''PluxI'', ki so ga vzeli iz ''V. fischeri'', ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja ''PluxI'' in ''PlacIQ'' sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na spominski element. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz ''E. coli'', ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja ''pR''. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja ''pRM''. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor ''pR'', tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na ''pRM'' in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene ''rexAB'', ''cI'', ''cro'' in ''lacZ''. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja ''pR'', s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; ''lacZ'', ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena ''cro'' [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na ''pRM'' znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja ''pR''. Promotor ''pR'' sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane ''pRM'' blokiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v ''S. typhimurium'' =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri ''E. coli'', so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri ''S. typhimurium'', le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so ''in vitro'' preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

= Viri =

[1] Rinninella, E., Raoul, P., Cintoni, M., Franceschi, F., Miggiano, G., Gasbarrini, A. in Mele, M. C. (2019). What is the Healthy Gut Microbiota Composition? A Changing Ecosystem across Age, Environment, Diet, and Diseases. ''Microorganisms'', 7(1) ,14.

[2] Swearingen, M.C., Sabag-Daigle, A. in Ahmer, B.M.M. (2013) Are there acylhomoserine lactones within mammalian intestine?'' J.'' ''Bacteriol''. 195, 173-179.

[3] Ng, W. L. in Bassler, B. L. (2009). Bacterial quorum-sensing network architectures. ''Ann. rev. genetics'', 43, 197–222.

[4] Kim, S., Kerns, S.J., Ziesack, M., Bry, L, Gerber, G.K., Way J.C. in Silver P.A. (2018). Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transfer between Bacteria in the Mammalian Gut, ''CS Synth.'' ''Biol.'' 7, 9, 2270-2281.

[5] Kotula, J.W., Kerns, S.J., Shaket, L.A., Siraj, L., Collins, J.J., Way, J.C., and Silver, P.A. (2014). Programmable bacteria detect and record an environmental signal in the mammalian gut, ''Proc.'' ''Natl. Acad. Sci''. USA 111, 4838-4843.

[6] Calos, M. P. (1978). DNA Sequence for a Low-Level Promoter of the Lac Repressor Gene and 1013 an “Up” Promoter Mutation. ''Nature'', 274 (5673), 762–765.

[7] Lee, S., Lewis, D.E.A. in Adhya, S. (2018). The Developmental Switch in Bacteriophage λ: A Critical Role of the Cro Protein. ''J Mol'' ''Biol'', 430, 58-68.

[8] Johnson, A.D., Poteete, A.R., Lauer, G., Sauer, R.T., Ackers, G.K. in Ptashne, M. (1981). Lambda Repressor and cro--components of an efficient molecular switch. ''Nature''. 294(5838), 217-223.

[9] Schubert, R.A., Dodd, I.B., Egan, J.B. in Shearwin, K.E. (2007). Cro's role in the CI Cro bistable switch is critical for {lambda}'s transition from lysogeny to lytic development. ''Genes Dev''. 21(19), 2461-2472.

[10] Teif, V.B. (2007). General transfer matrix formalism to calculate DNA-protein-drug binding in gene regulation: application to OR operator of phage lambda. ''Nucleic Acids Res''. 35(11), e80.

[11] Yartseva, A., Klaudel, H., Devillers, R. in Képès F. (2007). Incremental and unifying modelling formalism for biological interaction networks. ''BMC Bioinfo''. 8(1):433.

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:51:17Z

Anže Jenko: /* Delovanje sprejemnikov */

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov v ''E. coli'' =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux ''V. fischeri''. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili smerni signalni element. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, smerni signalni element konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor ''PtetA'', zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za ''araC'' in ''araB''. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena ''luxR'', ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja ''PlacIQ''. Promotor ''PlacIQ'' je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena ''lacI''. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja ''PluxI'', ki so ga vzeli iz ''V. fischeri'', ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja ''PluxI'' in ''PlacIQ'' sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na spominski element. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz ''E. coli'', ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja ''pR''. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja ''pRM''. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor ''pR'', tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na ''pRM'' in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene ''rexAB'', ''cI'', ''cro'' in ''lacZ''. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja ''pR'', s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; ''lacZ'', ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena ''cro'' [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na ''pRM'' znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja ''pR''. Promotor ''pR'' sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane ''pRM'' blokiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v ''S. typhimurium'' =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri ''E. coli'', so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri ''S. typhimurium'', le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so ''in vitro'' preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

= Viri =

[1] Rinninella, E., Raoul, P., Cintoni, M., Franceschi, F., Miggiano, G., Gasbarrini, A. in Mele, M. C. (2019). What is the Healthy Gut Microbiota Composition? A Changing Ecosystem across Age, Environment, Diet, and Diseases. ''Microorganisms'', 7(1) ,14.

[2] Swearingen, M.C., Sabag-Daigle, A. in Ahmer, B.M.M. (2013) Are there acylhomoserine lactones within mammalian intestine?'' J.'' ''Bacteriol''. 195, 173-179.

[3] Ng, W. L. in Bassler, B. L. (2009). Bacterial quorum-sensing network architectures. ''Ann. rev. genetics'', 43, 197–222.

[4] Kim, S., Kerns, S.J., Ziesack, M., Bry, L, Gerber, G.K., Way J.C. in Silver P.A. (2018). Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transfer between Bacteria in the Mammalian Gut, ''CS Synth.'' ''Biol.'' 7, 9, 2270-2281.

[5] Kotula, J.W., Kerns, S.J., Shaket, L.A., Siraj, L., Collins, J.J., Way, J.C., and Silver, P.A. (2014). Programmable bacteria detect and record an environmental signal in the mammalian gut, ''Proc.'' ''Natl. Acad. Sci''. USA 111, 4838-4843.

[6] Calos, M. P. (1978). DNA Sequence for a Low-Level Promoter of the Lac Repressor Gene and 1013 an “Up” Promoter Mutation. ''Nature'', 274 (5673), 762–765.

[7] Lee, S., Lewis, D.E.A. in Adhya, S. (2018). The Developmental Switch in Bacteriophage λ: A Critical Role of the Cro Protein. ''J Mol'' ''Biol'', 430, 58-68.

[8] Johnson, A.D., Poteete, A.R., Lauer, G., Sauer, R.T., Ackers, G.K. in Ptashne, M. (1981). Lambda Repressor and cro--components of an efficient molecular switch. ''Nature''. 294(5838), 217-223.

[9] Schubert, R.A., Dodd, I.B., Egan, J.B. in Shearwin, K.E. (2007). Cro's role in the CI Cro bistable switch is critical for {lambda}'s transition from lysogeny to lytic development. ''Genes Dev''. 21(19), 2461-2472.

[10] Teif, V.B. (2007). General transfer matrix formalism to calculate DNA-protein-drug binding in gene regulation: application to OR operator of phage lambda. ''Nucleic Acids Res''. 35(11), e80.

[11] Yartseva, A., Klaudel, H., Devillers, R. in Képès F. (2007). Incremental and unifying modelling formalism for biological interaction networks. ''BMC Bioinfo''. 8(1):433.

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:47:40Z

Anže Jenko: /* Spominski element */

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov v ''E. coli'' =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux ''V. fischeri''. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili smerni signalni element. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, smerni signalni element konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor ''PtetA'', zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za ''araC'' in ''araB''. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena ''luxR'', ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja ''PlacIQ''. Promotor ''PlacIQ'' je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena ''lacI''. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja ''PluxI'', ki so ga vzeli iz ''V. fischeri'', ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja ''PluxI'' in ''PlacIQ'' sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na spominski element. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz ''E. coli'', ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja ''pR''. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja ''pRM''. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor ''pR'', tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na ''pRM'' in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene ''rexAB'', ''cI'', ''cro'' in ''lacZ''. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja ''pR'', s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; ''lacZ'', ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena ''cro'' [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na ''pRM'' znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja ''pR''. Promotor ''pR'' sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane ''pRM'' blokiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v ''S. typhimurium'' =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri ''E. coli'', so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri ''S. typhimurium'', le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

= Viri =

[1] Rinninella, E., Raoul, P., Cintoni, M., Franceschi, F., Miggiano, G., Gasbarrini, A. in Mele, M. C. (2019). What is the Healthy Gut Microbiota Composition? A Changing Ecosystem across Age, Environment, Diet, and Diseases. ''Microorganisms'', 7(1) ,14.

[2] Swearingen, M.C., Sabag-Daigle, A. in Ahmer, B.M.M. (2013) Are there acylhomoserine lactones within mammalian intestine?'' J.'' ''Bacteriol''. 195, 173-179.

[3] Ng, W. L. in Bassler, B. L. (2009). Bacterial quorum-sensing network architectures. ''Ann. rev. genetics'', 43, 197–222.

[4] Kim, S., Kerns, S.J., Ziesack, M., Bry, L, Gerber, G.K., Way J.C. in Silver P.A. (2018). Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transfer between Bacteria in the Mammalian Gut, ''CS Synth.'' ''Biol.'' 7, 9, 2270-2281.

[5] Kotula, J.W., Kerns, S.J., Shaket, L.A., Siraj, L., Collins, J.J., Way, J.C., and Silver, P.A. (2014). Programmable bacteria detect and record an environmental signal in the mammalian gut, ''Proc.'' ''Natl. Acad. Sci''. USA 111, 4838-4843.

[6] Calos, M. P. (1978). DNA Sequence for a Low-Level Promoter of the Lac Repressor Gene and 1013 an “Up” Promoter Mutation. ''Nature'', 274 (5673), 762–765.

[7] Lee, S., Lewis, D.E.A. in Adhya, S. (2018). The Developmental Switch in Bacteriophage λ: A Critical Role of the Cro Protein. ''J Mol'' ''Biol'', 430, 58-68.

[8] Johnson, A.D., Poteete, A.R., Lauer, G., Sauer, R.T., Ackers, G.K. in Ptashne, M. (1981). Lambda Repressor and cro--components of an efficient molecular switch. ''Nature''. 294(5838), 217-223.

[9] Schubert, R.A., Dodd, I.B., Egan, J.B. in Shearwin, K.E. (2007). Cro's role in the CI Cro bistable switch is critical for {lambda}'s transition from lysogeny to lytic development. ''Genes Dev''. 21(19), 2461-2472.

[10] Teif, V.B. (2007). General transfer matrix formalism to calculate DNA-protein-drug binding in gene regulation: application to OR operator of phage lambda. ''Nucleic Acids Res''. 35(11), e80.

[11] Yartseva, A., Klaudel, H., Devillers, R. in Képès F. (2007). Incremental and unifying modelling formalism for biological interaction networks. ''BMC Bioinfo''. 8(1):433.

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:44:02Z

Anže Jenko: /* Spominski element */

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov v ''E. coli'' =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux ''V. fischeri''. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili smerni signalni element. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, smerni signalni element konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor ''PtetA'', zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za ''araC'' in ''araB''. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena ''luxR'', ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja ''PlacIQ''. Promotor ''PlacIQ'' je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena ''lacI''. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja ''PluxI'', ki so ga vzeli iz ''V. fischeri'', ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja ''PluxI'' in ''PlacIQ'' sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na spominski element. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz ''E. coli'', ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja ''pR''. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja ''pRM''. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor PR, tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na PRM in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene rexAB, cI, cro in lacZ. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja PR, s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; lacZ, ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena cro [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na PRM znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja PR. Promotor PR sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane PRM inhibiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v ''S. typhimurium'' =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri ''E. coli'', so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri ''S. typhimurium'', le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

= Viri =

[1] Rinninella, E., Raoul, P., Cintoni, M., Franceschi, F., Miggiano, G., Gasbarrini, A. in Mele, M. C. (2019). What is the Healthy Gut Microbiota Composition? A Changing Ecosystem across Age, Environment, Diet, and Diseases. ''Microorganisms'', 7(1) ,14.

[2] Swearingen, M.C., Sabag-Daigle, A. in Ahmer, B.M.M. (2013) Are there acylhomoserine lactones within mammalian intestine?'' J.'' ''Bacteriol''. 195, 173-179.

[3] Ng, W. L. in Bassler, B. L. (2009). Bacterial quorum-sensing network architectures. ''Ann. rev. genetics'', 43, 197–222.

[4] Kim, S., Kerns, S.J., Ziesack, M., Bry, L, Gerber, G.K., Way J.C. in Silver P.A. (2018). Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transfer between Bacteria in the Mammalian Gut, ''CS Synth.'' ''Biol.'' 7, 9, 2270-2281.

[5] Kotula, J.W., Kerns, S.J., Shaket, L.A., Siraj, L., Collins, J.J., Way, J.C., and Silver, P.A. (2014). Programmable bacteria detect and record an environmental signal in the mammalian gut, ''Proc.'' ''Natl. Acad. Sci''. USA 111, 4838-4843.

[6] Calos, M. P. (1978). DNA Sequence for a Low-Level Promoter of the Lac Repressor Gene and 1013 an “Up” Promoter Mutation. ''Nature'', 274 (5673), 762–765.

[7] Lee, S., Lewis, D.E.A. in Adhya, S. (2018). The Developmental Switch in Bacteriophage λ: A Critical Role of the Cro Protein. ''J Mol'' ''Biol'', 430, 58-68.

[8] Johnson, A.D., Poteete, A.R., Lauer, G., Sauer, R.T., Ackers, G.K. in Ptashne, M. (1981). Lambda Repressor and cro--components of an efficient molecular switch. ''Nature''. 294(5838), 217-223.

[9] Schubert, R.A., Dodd, I.B., Egan, J.B. in Shearwin, K.E. (2007). Cro's role in the CI Cro bistable switch is critical for {lambda}'s transition from lysogeny to lytic development. ''Genes Dev''. 21(19), 2461-2472.

[10] Teif, V.B. (2007). General transfer matrix formalism to calculate DNA-protein-drug binding in gene regulation: application to OR operator of phage lambda. ''Nucleic Acids Res''. 35(11), e80.

[11] Yartseva, A., Klaudel, H., Devillers, R. in Képès F. (2007). Incremental and unifying modelling formalism for biological interaction networks. ''BMC Bioinfo''. 8(1):433.

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:42:01Z

Anže Jenko: /* Lux-sprožilni element */

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov v ''E. coli'' =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux ''V. fischeri''. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili smerni signalni element. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, smerni signalni element konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor ''PtetA'', zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za ''araC'' in ''araB''. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena ''luxR'', ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja ''PlacIQ''. Promotor ''PlacIQ'' je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena ''lacI''. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja ''PluxI'', ki so ga vzeli iz ''V. fischeri'', ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja ''PluxI'' in ''PlacIQ'' sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na spominski element. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz ''E. coli'', ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja PR. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja PRM. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor PR, tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na PRM in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene rexAB, cI, cro in lacZ. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja PR, s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; lacZ, ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena cro [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na PRM znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja PR. Promotor PR sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane PRM inhibiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v ''S. typhimurium'' =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri ''E. coli'', so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri ''S. typhimurium'', le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

= Viri =

[1] Rinninella, E., Raoul, P., Cintoni, M., Franceschi, F., Miggiano, G., Gasbarrini, A. in Mele, M. C. (2019). What is the Healthy Gut Microbiota Composition? A Changing Ecosystem across Age, Environment, Diet, and Diseases. ''Microorganisms'', 7(1) ,14.

[2] Swearingen, M.C., Sabag-Daigle, A. in Ahmer, B.M.M. (2013) Are there acylhomoserine lactones within mammalian intestine?'' J.'' ''Bacteriol''. 195, 173-179.

[3] Ng, W. L. in Bassler, B. L. (2009). Bacterial quorum-sensing network architectures. ''Ann. rev. genetics'', 43, 197–222.

[4] Kim, S., Kerns, S.J., Ziesack, M., Bry, L, Gerber, G.K., Way J.C. in Silver P.A. (2018). Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transfer between Bacteria in the Mammalian Gut, ''CS Synth.'' ''Biol.'' 7, 9, 2270-2281.

[5] Kotula, J.W., Kerns, S.J., Shaket, L.A., Siraj, L., Collins, J.J., Way, J.C., and Silver, P.A. (2014). Programmable bacteria detect and record an environmental signal in the mammalian gut, ''Proc.'' ''Natl. Acad. Sci''. USA 111, 4838-4843.

[6] Calos, M. P. (1978). DNA Sequence for a Low-Level Promoter of the Lac Repressor Gene and 1013 an “Up” Promoter Mutation. ''Nature'', 274 (5673), 762–765.

[7] Lee, S., Lewis, D.E.A. in Adhya, S. (2018). The Developmental Switch in Bacteriophage λ: A Critical Role of the Cro Protein. ''J Mol'' ''Biol'', 430, 58-68.

[8] Johnson, A.D., Poteete, A.R., Lauer, G., Sauer, R.T., Ackers, G.K. in Ptashne, M. (1981). Lambda Repressor and cro--components of an efficient molecular switch. ''Nature''. 294(5838), 217-223.

[9] Schubert, R.A., Dodd, I.B., Egan, J.B. in Shearwin, K.E. (2007). Cro's role in the CI Cro bistable switch is critical for {lambda}'s transition from lysogeny to lytic development. ''Genes Dev''. 21(19), 2461-2472.

[10] Teif, V.B. (2007). General transfer matrix formalism to calculate DNA-protein-drug binding in gene regulation: application to OR operator of phage lambda. ''Nucleic Acids Res''. 35(11), e80.

[11] Yartseva, A., Klaudel, H., Devillers, R. in Képès F. (2007). Incremental and unifying modelling formalism for biological interaction networks. ''BMC Bioinfo''. 8(1):433.

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:39:59Z

Anže Jenko: /* Zasnova oddajnika */

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov v ''E. coli'' =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux ''V. fischeri''. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili smerni signalni element. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, smerni signalni element konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor ''PtetA'', zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za araC in araB. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena luxR, ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja PlacIQ. Promotor PlacIQ je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena lacI. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja PluxI, ki so ga vzeli iz ''V. fischeri'', ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja PluxI in PlacIQ sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na spominski element. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz ''E. coli'', ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja PR. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja PRM. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor PR, tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na PRM in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene rexAB, cI, cro in lacZ. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja PR, s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; lacZ, ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena cro [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na PRM znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja PR. Promotor PR sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane PRM inhibiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v ''S. typhimurium'' =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri ''E. coli'', so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri ''S. typhimurium'', le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

= Viri =

[1] Rinninella, E., Raoul, P., Cintoni, M., Franceschi, F., Miggiano, G., Gasbarrini, A. in Mele, M. C. (2019). What is the Healthy Gut Microbiota Composition? A Changing Ecosystem across Age, Environment, Diet, and Diseases. ''Microorganisms'', 7(1) ,14.

[2] Swearingen, M.C., Sabag-Daigle, A. in Ahmer, B.M.M. (2013) Are there acylhomoserine lactones within mammalian intestine?'' J.'' ''Bacteriol''. 195, 173-179.

[3] Ng, W. L. in Bassler, B. L. (2009). Bacterial quorum-sensing network architectures. ''Ann. rev. genetics'', 43, 197–222.

[4] Kim, S., Kerns, S.J., Ziesack, M., Bry, L, Gerber, G.K., Way J.C. in Silver P.A. (2018). Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transfer between Bacteria in the Mammalian Gut, ''CS Synth.'' ''Biol.'' 7, 9, 2270-2281.

[5] Kotula, J.W., Kerns, S.J., Shaket, L.A., Siraj, L., Collins, J.J., Way, J.C., and Silver, P.A. (2014). Programmable bacteria detect and record an environmental signal in the mammalian gut, ''Proc.'' ''Natl. Acad. Sci''. USA 111, 4838-4843.

[6] Calos, M. P. (1978). DNA Sequence for a Low-Level Promoter of the Lac Repressor Gene and 1013 an “Up” Promoter Mutation. ''Nature'', 274 (5673), 762–765.

[7] Lee, S., Lewis, D.E.A. in Adhya, S. (2018). The Developmental Switch in Bacteriophage λ: A Critical Role of the Cro Protein. ''J Mol'' ''Biol'', 430, 58-68.

[8] Johnson, A.D., Poteete, A.R., Lauer, G., Sauer, R.T., Ackers, G.K. in Ptashne, M. (1981). Lambda Repressor and cro--components of an efficient molecular switch. ''Nature''. 294(5838), 217-223.

[9] Schubert, R.A., Dodd, I.B., Egan, J.B. in Shearwin, K.E. (2007). Cro's role in the CI Cro bistable switch is critical for {lambda}'s transition from lysogeny to lytic development. ''Genes Dev''. 21(19), 2461-2472.

[10] Teif, V.B. (2007). General transfer matrix formalism to calculate DNA-protein-drug binding in gene regulation: application to OR operator of phage lambda. ''Nucleic Acids Res''. 35(11), e80.

[11] Yartseva, A., Klaudel, H., Devillers, R. in Képès F. (2007). Incremental and unifying modelling formalism for biological interaction networks. ''BMC Bioinfo''. 8(1):433.

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:39:21Z

Anže Jenko: /* Viri */

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov v ''E. coli'' =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux ''V. fischeri''. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili smerni signalni element. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, ''smerni signalni element'' konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor PtetA, zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za araC in araB. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena luxR, ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja PlacIQ. Promotor PlacIQ je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena lacI. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja PluxI, ki so ga vzeli iz ''V. fischeri'', ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja PluxI in PlacIQ sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na spominski element. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz ''E. coli'', ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja PR. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja PRM. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor PR, tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na PRM in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene rexAB, cI, cro in lacZ. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja PR, s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; lacZ, ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena cro [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na PRM znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja PR. Promotor PR sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane PRM inhibiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v ''S. typhimurium'' =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri ''E. coli'', so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri ''S. typhimurium'', le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

= Viri =

[1] Rinninella, E., Raoul, P., Cintoni, M., Franceschi, F., Miggiano, G., Gasbarrini, A. in Mele, M. C. (2019). What is the Healthy Gut Microbiota Composition? A Changing Ecosystem across Age, Environment, Diet, and Diseases. ''Microorganisms'', 7(1) ,14.

[2] Swearingen, M.C., Sabag-Daigle, A. in Ahmer, B.M.M. (2013) Are there acylhomoserine lactones within mammalian intestine?'' J.'' ''Bacteriol''. 195, 173-179.

[3] Ng, W. L. in Bassler, B. L. (2009). Bacterial quorum-sensing network architectures. ''Ann. rev. genetics'', 43, 197–222.

[4] Kim, S., Kerns, S.J., Ziesack, M., Bry, L, Gerber, G.K., Way J.C. in Silver P.A. (2018). Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transfer between Bacteria in the Mammalian Gut, ''CS Synth.'' ''Biol.'' 7, 9, 2270-2281.

[5] Kotula, J.W., Kerns, S.J., Shaket, L.A., Siraj, L., Collins, J.J., Way, J.C., and Silver, P.A. (2014). Programmable bacteria detect and record an environmental signal in the mammalian gut, ''Proc.'' ''Natl. Acad. Sci''. USA 111, 4838-4843.

[6] Calos, M. P. (1978). DNA Sequence for a Low-Level Promoter of the Lac Repressor Gene and 1013 an “Up” Promoter Mutation. ''Nature'', 274 (5673), 762–765.

[7] Lee, S., Lewis, D.E.A. in Adhya, S. (2018). The Developmental Switch in Bacteriophage λ: A Critical Role of the Cro Protein. ''J Mol'' ''Biol'', 430, 58-68.

[8] Johnson, A.D., Poteete, A.R., Lauer, G., Sauer, R.T., Ackers, G.K. in Ptashne, M. (1981). Lambda Repressor and cro--components of an efficient molecular switch. ''Nature''. 294(5838), 217-223.

[9] Schubert, R.A., Dodd, I.B., Egan, J.B. in Shearwin, K.E. (2007). Cro's role in the CI Cro bistable switch is critical for {lambda}'s transition from lysogeny to lytic development. ''Genes Dev''. 21(19), 2461-2472.

[10] Teif, V.B. (2007). General transfer matrix formalism to calculate DNA-protein-drug binding in gene regulation: application to OR operator of phage lambda. ''Nucleic Acids Res''. 35(11), e80.

[11] Yartseva, A., Klaudel, H., Devillers, R. in Képès F. (2007). Incremental and unifying modelling formalism for biological interaction networks. ''BMC Bioinfo''. 8(1):433.

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:38:31Z

Anže Jenko: /* Zasnova genetskih elementov v E. coli */

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov v ''E. coli'' =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux ''V. fischeri''. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili smerni signalni element. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, ''smerni signalni element'' konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor PtetA, zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za araC in araB. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena luxR, ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja PlacIQ. Promotor PlacIQ je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena lacI. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja PluxI, ki so ga vzeli iz ''V. fischeri'', ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja PluxI in PlacIQ sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na spominski element. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz ''E. coli'', ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja PR. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja PRM. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor PR, tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na PRM in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene rexAB, cI, cro in lacZ. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja PR, s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; lacZ, ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena cro [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na PRM znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja PR. Promotor PR sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane PRM inhibiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v ''S. typhimurium'' =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri ''E. coli'', so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri ''S. typhimurium'', le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

= Viri =

[1] Rinninella, E., Raoul, P., Cintoni, M., Franceschi, F., Miggiano, G., Gasbarrini, A. in Mele, M. C. (2019). What is the Healthy Gut Microbiota Composition? A Changing Ecosystem across Age, Environment, Diet, and Diseases. ''Microorganisms'', 7(1) ,14.
[2] Swearingen, M.C., Sabag-Daigle, A. in Ahmer, B.M.M. (2013) Are there acylhomoserine lactones within mammalian intestine?'' J.'' ''Bacteriol''. 195, 173-179.
[3] Ng, W. L. in Bassler, B. L. (2009). Bacterial quorum-sensing network architectures. ''Ann. rev. genetics'', 43, 197–222.
[4] Kim, S., Kerns, S.J., Ziesack, M., Bry, L, Gerber, G.K., Way J.C. in Silver P.A. (2018). Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transfer between Bacteria in the Mammalian Gut, ''CS Synth.'' ''Biol.'' 7, 9, 2270-2281.
[5] Kotula, J.W., Kerns, S.J., Shaket, L.A., Siraj, L., Collins, J.J., Way, J.C., and Silver, P.A. (2014). Programmable bacteria detect and record an environmental signal in the mammalian gut, ''Proc.'' ''Natl. Acad. Sci''. USA 111, 4838-4843.
[6] Calos, M. P. (1978). DNA Sequence for a Low-Level Promoter of the Lac Repressor Gene and 1013 an “Up” Promoter Mutation. ''Nature'', 274 (5673), 762–765.
[7] Lee, S., Lewis, D.E.A. in Adhya, S. (2018). The Developmental Switch in Bacteriophage λ: A Critical Role of the Cro Protein. ''J Mol'' ''Biol'', 430, 58-68.
[8] Johnson, A.D., Poteete, A.R., Lauer, G., Sauer, R.T., Ackers, G.K. in Ptashne, M. (1981). Lambda Repressor and cro--components of an efficient molecular switch. ''Nature''. 294(5838), 217-223.
[9] Schubert, R.A., Dodd, I.B., Egan, J.B. in Shearwin, K.E. (2007). Cro's role in the CI Cro bistable switch is critical for {lambda}'s transition from lysogeny to lytic development. ''Genes Dev''. 21(19), 2461-2472.
[10] Teif, V.B. (2007). General transfer matrix formalism to calculate DNA-protein-drug binding in gene regulation: application to OR operator of phage lambda. ''Nucleic Acids Res''. 35(11), e80.
[11] Yartseva, A., Klaudel, H., Devillers, R. in Képès F. (2007). Incremental and unifying modelling formalism for biological interaction networks. ''BMC Bioinfo''. 8(1):433.

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:37:44Z

Anže Jenko: /* Zasnova oddajnika */

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov v ''E. coli'' =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux ''V.'''' fischeri''. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili smerni signalni element. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, ''smerni signalni element'' konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor PtetA, zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za araC in araB. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena luxR, ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja PlacIQ. Promotor PlacIQ je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena lacI. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja PluxI, ki so ga vzeli iz ''V. fischeri'', ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja PluxI in PlacIQ sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na spominski element. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz ''E. coli'', ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja PR. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja PRM. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor PR, tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na PRM in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene rexAB, cI, cro in lacZ. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja PR, s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; lacZ, ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena cro [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na PRM znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja PR. Promotor PR sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane PRM inhibiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v ''S. typhimurium'' =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri ''E. coli'', so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri ''S. typhimurium'', le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

= Viri =

[1] Rinninella, E., Raoul, P., Cintoni, M., Franceschi, F., Miggiano, G., Gasbarrini, A. in Mele, M. C. (2019). What is the Healthy Gut Microbiota Composition? A Changing Ecosystem across Age, Environment, Diet, and Diseases. ''Microorganisms'', 7(1) ,14.
[2] Swearingen, M.C., Sabag-Daigle, A. in Ahmer, B.M.M. (2013) Are there acylhomoserine lactones within mammalian intestine?'' J.'' ''Bacteriol''. 195, 173-179.
[3] Ng, W. L. in Bassler, B. L. (2009). Bacterial quorum-sensing network architectures. ''Ann. rev. genetics'', 43, 197–222.
[4] Kim, S., Kerns, S.J., Ziesack, M., Bry, L, Gerber, G.K., Way J.C. in Silver P.A. (2018). Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transfer between Bacteria in the Mammalian Gut, ''CS Synth.'' ''Biol.'' 7, 9, 2270-2281.
[5] Kotula, J.W., Kerns, S.J., Shaket, L.A., Siraj, L., Collins, J.J., Way, J.C., and Silver, P.A. (2014). Programmable bacteria detect and record an environmental signal in the mammalian gut, ''Proc.'' ''Natl. Acad. Sci''. USA 111, 4838-4843.
[6] Calos, M. P. (1978). DNA Sequence for a Low-Level Promoter of the Lac Repressor Gene and 1013 an “Up” Promoter Mutation. ''Nature'', 274 (5673), 762–765.
[7] Lee, S., Lewis, D.E.A. in Adhya, S. (2018). The Developmental Switch in Bacteriophage λ: A Critical Role of the Cro Protein. ''J Mol'' ''Biol'', 430, 58-68.
[8] Johnson, A.D., Poteete, A.R., Lauer, G., Sauer, R.T., Ackers, G.K. in Ptashne, M. (1981). Lambda Repressor and cro--components of an efficient molecular switch. ''Nature''. 294(5838), 217-223.
[9] Schubert, R.A., Dodd, I.B., Egan, J.B. in Shearwin, K.E. (2007). Cro's role in the CI Cro bistable switch is critical for {lambda}'s transition from lysogeny to lytic development. ''Genes Dev''. 21(19), 2461-2472.
[10] Teif, V.B. (2007). General transfer matrix formalism to calculate DNA-protein-drug binding in gene regulation: application to OR operator of phage lambda. ''Nucleic Acids Res''. 35(11), e80.
[11] Yartseva, A., Klaudel, H., Devillers, R. in Képès F. (2007). Incremental and unifying modelling formalism for biological interaction networks. ''BMC Bioinfo''. 8(1):433.

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:37:23Z

Anže Jenko: /* Zasnova genetskih elementov v E. coli */

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov v ''E. coli'' =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux ''V.'''' fischeri''. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili ''smerni signalni element''. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, ''smerni signalni element'' konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor PtetA, zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za araC in araB. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena luxR, ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja PlacIQ. Promotor PlacIQ je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena lacI. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja PluxI, ki so ga vzeli iz ''V. fischeri'', ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja PluxI in PlacIQ sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na spominski element. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz ''E. coli'', ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja PR. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja PRM. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor PR, tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na PRM in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene rexAB, cI, cro in lacZ. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja PR, s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; lacZ, ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena cro [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na PRM znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja PR. Promotor PR sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane PRM inhibiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v ''S. typhimurium'' =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri ''E. coli'', so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri ''S. typhimurium'', le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

= Viri =

[1] Rinninella, E., Raoul, P., Cintoni, M., Franceschi, F., Miggiano, G., Gasbarrini, A. in Mele, M. C. (2019). What is the Healthy Gut Microbiota Composition? A Changing Ecosystem across Age, Environment, Diet, and Diseases. ''Microorganisms'', 7(1) ,14.
[2] Swearingen, M.C., Sabag-Daigle, A. in Ahmer, B.M.M. (2013) Are there acylhomoserine lactones within mammalian intestine?'' J.'' ''Bacteriol''. 195, 173-179.
[3] Ng, W. L. in Bassler, B. L. (2009). Bacterial quorum-sensing network architectures. ''Ann. rev. genetics'', 43, 197–222.
[4] Kim, S., Kerns, S.J., Ziesack, M., Bry, L, Gerber, G.K., Way J.C. in Silver P.A. (2018). Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transfer between Bacteria in the Mammalian Gut, ''CS Synth.'' ''Biol.'' 7, 9, 2270-2281.
[5] Kotula, J.W., Kerns, S.J., Shaket, L.A., Siraj, L., Collins, J.J., Way, J.C., and Silver, P.A. (2014). Programmable bacteria detect and record an environmental signal in the mammalian gut, ''Proc.'' ''Natl. Acad. Sci''. USA 111, 4838-4843.
[6] Calos, M. P. (1978). DNA Sequence for a Low-Level Promoter of the Lac Repressor Gene and 1013 an “Up” Promoter Mutation. ''Nature'', 274 (5673), 762–765.
[7] Lee, S., Lewis, D.E.A. in Adhya, S. (2018). The Developmental Switch in Bacteriophage λ: A Critical Role of the Cro Protein. ''J Mol'' ''Biol'', 430, 58-68.
[8] Johnson, A.D., Poteete, A.R., Lauer, G., Sauer, R.T., Ackers, G.K. in Ptashne, M. (1981). Lambda Repressor and cro--components of an efficient molecular switch. ''Nature''. 294(5838), 217-223.
[9] Schubert, R.A., Dodd, I.B., Egan, J.B. in Shearwin, K.E. (2007). Cro's role in the CI Cro bistable switch is critical for {lambda}'s transition from lysogeny to lytic development. ''Genes Dev''. 21(19), 2461-2472.
[10] Teif, V.B. (2007). General transfer matrix formalism to calculate DNA-protein-drug binding in gene regulation: application to OR operator of phage lambda. ''Nucleic Acids Res''. 35(11), e80.
[11] Yartseva, A., Klaudel, H., Devillers, R. in Képès F. (2007). Incremental and unifying modelling formalism for biological interaction networks. ''BMC Bioinfo''. 8(1):433.

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:34:43Z

Anže Jenko: /* Spominski element */

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov v ''E. coli'' =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux V. fischeri. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili ''smerni signalni element''. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, ''smerni signalni element'' konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor PtetA, zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za araC in araB. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena luxR, ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja PlacIQ. Promotor PlacIQ je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena lacI. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja PluxI, ki so ga vzeli iz V. fischeri, ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja PluxI in PlacIQ sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na spominski element. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz ''E. coli'', ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja PR. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja PRM. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor PR, tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na PRM in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene rexAB, cI, cro in lacZ. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja PR, s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; lacZ, ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena cro [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na PRM znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja PR. Promotor PR sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane PRM inhibiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v ''S. typhimurium'' =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri ''E. coli'', so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri ''S. typhimurium'', le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

= Viri =

[1] Rinninella, E., Raoul, P., Cintoni, M., Franceschi, F., Miggiano, G., Gasbarrini, A. in Mele, M. C. (2019). What is the Healthy Gut Microbiota Composition? A Changing Ecosystem across Age, Environment, Diet, and Diseases. ''Microorganisms'', 7(1) ,14.
[2] Swearingen, M.C., Sabag-Daigle, A. in Ahmer, B.M.M. (2013) Are there acylhomoserine lactones within mammalian intestine?'' J.'' ''Bacteriol''. 195, 173-179.
[3] Ng, W. L. in Bassler, B. L. (2009). Bacterial quorum-sensing network architectures. ''Ann. rev. genetics'', 43, 197–222.
[4] Kim, S., Kerns, S.J., Ziesack, M., Bry, L, Gerber, G.K., Way J.C. in Silver P.A. (2018). Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transfer between Bacteria in the Mammalian Gut, ''CS Synth.'' ''Biol.'' 7, 9, 2270-2281.
[5] Kotula, J.W., Kerns, S.J., Shaket, L.A., Siraj, L., Collins, J.J., Way, J.C., and Silver, P.A. (2014). Programmable bacteria detect and record an environmental signal in the mammalian gut, ''Proc.'' ''Natl. Acad. Sci''. USA 111, 4838-4843.
[6] Calos, M. P. (1978). DNA Sequence for a Low-Level Promoter of the Lac Repressor Gene and 1013 an “Up” Promoter Mutation. ''Nature'', 274 (5673), 762–765.
[7] Lee, S., Lewis, D.E.A. in Adhya, S. (2018). The Developmental Switch in Bacteriophage λ: A Critical Role of the Cro Protein. ''J Mol'' ''Biol'', 430, 58-68.
[8] Johnson, A.D., Poteete, A.R., Lauer, G., Sauer, R.T., Ackers, G.K. in Ptashne, M. (1981). Lambda Repressor and cro--components of an efficient molecular switch. ''Nature''. 294(5838), 217-223.
[9] Schubert, R.A., Dodd, I.B., Egan, J.B. in Shearwin, K.E. (2007). Cro's role in the CI Cro bistable switch is critical for {lambda}'s transition from lysogeny to lytic development. ''Genes Dev''. 21(19), 2461-2472.
[10] Teif, V.B. (2007). General transfer matrix formalism to calculate DNA-protein-drug binding in gene regulation: application to OR operator of phage lambda. ''Nucleic Acids Res''. 35(11), e80.
[11] Yartseva, A., Klaudel, H., Devillers, R. in Képès F. (2007). Incremental and unifying modelling formalism for biological interaction networks. ''BMC Bioinfo''. 8(1):433.

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:33:12Z

Anže Jenko: /* Zasnova genetskih elementov v S. typhimurium */

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov v ''E. coli'' =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux V. fischeri. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili ''smerni signalni element''. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, ''smerni signalni element'' konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor PtetA, zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za araC in araB. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena luxR, ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja PlacIQ. Promotor PlacIQ je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena lacI. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja PluxI, ki so ga vzeli iz V. fischeri, ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja PluxI in PlacIQ sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na ''spominski element''. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz ''E. coli'', ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja PR. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja PRM. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor PR, tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na PRM in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene rexAB, cI, cro in lacZ. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja PR, s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; lacZ, ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena cro [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na PRM znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja PR. Promotor PR sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane PRM inhibiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v ''S. typhimurium'' =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri ''E. coli'', so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri ''S. typhimurium'', le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

= Viri =

[1] Rinninella, E., Raoul, P., Cintoni, M., Franceschi, F., Miggiano, G., Gasbarrini, A. in Mele, M. C. (2019). What is the Healthy Gut Microbiota Composition? A Changing Ecosystem across Age, Environment, Diet, and Diseases. ''Microorganisms'', 7(1) ,14.
[2] Swearingen, M.C., Sabag-Daigle, A. in Ahmer, B.M.M. (2013) Are there acylhomoserine lactones within mammalian intestine?'' J.'' ''Bacteriol''. 195, 173-179.
[3] Ng, W. L. in Bassler, B. L. (2009). Bacterial quorum-sensing network architectures. ''Ann. rev. genetics'', 43, 197–222.
[4] Kim, S., Kerns, S.J., Ziesack, M., Bry, L, Gerber, G.K., Way J.C. in Silver P.A. (2018). Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transfer between Bacteria in the Mammalian Gut, ''CS Synth.'' ''Biol.'' 7, 9, 2270-2281.
[5] Kotula, J.W., Kerns, S.J., Shaket, L.A., Siraj, L., Collins, J.J., Way, J.C., and Silver, P.A. (2014). Programmable bacteria detect and record an environmental signal in the mammalian gut, ''Proc.'' ''Natl. Acad. Sci''. USA 111, 4838-4843.
[6] Calos, M. P. (1978). DNA Sequence for a Low-Level Promoter of the Lac Repressor Gene and 1013 an “Up” Promoter Mutation. ''Nature'', 274 (5673), 762–765.
[7] Lee, S., Lewis, D.E.A. in Adhya, S. (2018). The Developmental Switch in Bacteriophage λ: A Critical Role of the Cro Protein. ''J Mol'' ''Biol'', 430, 58-68.
[8] Johnson, A.D., Poteete, A.R., Lauer, G., Sauer, R.T., Ackers, G.K. in Ptashne, M. (1981). Lambda Repressor and cro--components of an efficient molecular switch. ''Nature''. 294(5838), 217-223.
[9] Schubert, R.A., Dodd, I.B., Egan, J.B. in Shearwin, K.E. (2007). Cro's role in the CI Cro bistable switch is critical for {lambda}'s transition from lysogeny to lytic development. ''Genes Dev''. 21(19), 2461-2472.
[10] Teif, V.B. (2007). General transfer matrix formalism to calculate DNA-protein-drug binding in gene regulation: application to OR operator of phage lambda. ''Nucleic Acids Res''. 35(11), e80.
[11] Yartseva, A., Klaudel, H., Devillers, R. in Képès F. (2007). Incremental and unifying modelling formalism for biological interaction networks. ''BMC Bioinfo''. 8(1):433.

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:30:11Z

Anže Jenko:

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov v ''E. coli'' =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux V. fischeri. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili ''smerni signalni element''. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, ''smerni signalni element'' konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor PtetA, zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za araC in araB. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena luxR, ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja PlacIQ. Promotor PlacIQ je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena lacI. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja PluxI, ki so ga vzeli iz V. fischeri, ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja PluxI in PlacIQ sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na ''spominski element''. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz ''E. coli'', ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja PR. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja PRM. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor PR, tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na PRM in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene rexAB, cI, cro in lacZ. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja PR, s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; lacZ, ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena cro [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na PRM znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja PR. Promotor PR sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane PRM inhibiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v ''S. typhimurium'' =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri E. coli, so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri ''S. typhimurium'', le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

= Viri =

[1] Rinninella, E., Raoul, P., Cintoni, M., Franceschi, F., Miggiano, G., Gasbarrini, A. in Mele, M. C. (2019). What is the Healthy Gut Microbiota Composition? A Changing Ecosystem across Age, Environment, Diet, and Diseases. ''Microorganisms'', 7(1) ,14.
[2] Swearingen, M.C., Sabag-Daigle, A. in Ahmer, B.M.M. (2013) Are there acylhomoserine lactones within mammalian intestine?'' J.'' ''Bacteriol''. 195, 173-179.
[3] Ng, W. L. in Bassler, B. L. (2009). Bacterial quorum-sensing network architectures. ''Ann. rev. genetics'', 43, 197–222.
[4] Kim, S., Kerns, S.J., Ziesack, M., Bry, L, Gerber, G.K., Way J.C. in Silver P.A. (2018). Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transfer between Bacteria in the Mammalian Gut, ''CS Synth.'' ''Biol.'' 7, 9, 2270-2281.
[5] Kotula, J.W., Kerns, S.J., Shaket, L.A., Siraj, L., Collins, J.J., Way, J.C., and Silver, P.A. (2014). Programmable bacteria detect and record an environmental signal in the mammalian gut, ''Proc.'' ''Natl. Acad. Sci''. USA 111, 4838-4843.
[6] Calos, M. P. (1978). DNA Sequence for a Low-Level Promoter of the Lac Repressor Gene and 1013 an “Up” Promoter Mutation. ''Nature'', 274 (5673), 762–765.
[7] Lee, S., Lewis, D.E.A. in Adhya, S. (2018). The Developmental Switch in Bacteriophage λ: A Critical Role of the Cro Protein. ''J Mol'' ''Biol'', 430, 58-68.
[8] Johnson, A.D., Poteete, A.R., Lauer, G., Sauer, R.T., Ackers, G.K. in Ptashne, M. (1981). Lambda Repressor and cro--components of an efficient molecular switch. ''Nature''. 294(5838), 217-223.
[9] Schubert, R.A., Dodd, I.B., Egan, J.B. in Shearwin, K.E. (2007). Cro's role in the CI Cro bistable switch is critical for {lambda}'s transition from lysogeny to lytic development. ''Genes Dev''. 21(19), 2461-2472.
[10] Teif, V.B. (2007). General transfer matrix formalism to calculate DNA-protein-drug binding in gene regulation: application to OR operator of phage lambda. ''Nucleic Acids Res''. 35(11), e80.
[11] Yartseva, A., Klaudel, H., Devillers, R. in Képès F. (2007). Incremental and unifying modelling formalism for biological interaction networks. ''BMC Bioinfo''. 8(1):433.

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:23:48Z

Anže Jenko: /* Zasnova genetskih elementov */

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov v ''E. coli'' =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux V. fischeri. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili ''smerni signalni element''. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, ''smerni signalni element'' konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor PtetA, zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za araC in araB. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena luxR, ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja PlacIQ. Promotor PlacIQ je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena lacI. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja PluxI, ki so ga vzeli iz V. fischeri, ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja PluxI in PlacIQ sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na ''spominski element''. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz ''E. coli'', ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja PR. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja PRM. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor PR, tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na PRM in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene rexAB, cI, cro in lacZ. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja PR, s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; lacZ, ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena cro [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na PRM znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja PR. Promotor PR sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane PRM inhibiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v ''S. typhimurium'' =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri E. coli, so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri ''S. typhimurium'', le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:23:20Z

Anže Jenko: /* Zasnova genetskih elementov v S. typhimurium */

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux V. fischeri. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili ''smerni signalni element''. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, ''smerni signalni element'' konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor PtetA, zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za araC in araB. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena luxR, ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja PlacIQ. Promotor PlacIQ je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena lacI. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja PluxI, ki so ga vzeli iz V. fischeri, ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja PluxI in PlacIQ sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na ''spominski element''. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz ''E. coli'', ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja PR. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja PRM. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor PR, tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na PRM in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene rexAB, cI, cro in lacZ. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja PR, s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; lacZ, ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena cro [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na PRM znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja PR. Promotor PR sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane PRM inhibiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v ''S. typhimurium'' =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri E. coli, so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri ''S. typhimurium'', le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:22:40Z

Anže Jenko: /* Spominski element */

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux V. fischeri. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili ''smerni signalni element''. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, ''smerni signalni element'' konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor PtetA, zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za araC in araB. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena luxR, ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja PlacIQ. Promotor PlacIQ je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena lacI. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja PluxI, ki so ga vzeli iz V. fischeri, ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja PluxI in PlacIQ sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na ''spominski element''. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz ''E. coli'', ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja PR. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja PRM. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor PR, tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na PRM in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene rexAB, cI, cro in lacZ. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja PR, s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; lacZ, ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena cro [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na PRM znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja PR. Promotor PR sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane PRM inhibiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v S. typhimurium =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri E. coli, so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri S. typhimurium, le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:21:17Z

Anže Jenko: /* Sistem zaznavanja gostote bakterij */

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med ''Escherichio coli'' in oslabljeno ''Salmonello enterico typhimurium'', ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux V. fischeri. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili ''smerni signalni element''. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, ''smerni signalni element'' konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor PtetA, zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za araC in araB. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena luxR, ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja PlacIQ. Promotor PlacIQ je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena lacI. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja PluxI, ki so ga vzeli iz V. fischeri, ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja PluxI in PlacIQ sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na ''spominski element''. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz E. coli, ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja PR. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja PRM. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor PR, tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na PRM in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene rexAB, cI, cro in lacZ. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja PR, s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; lacZ, ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena cro [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na PRM znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja PR. Promotor PR sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane PRM inhibiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v S. typhimurium =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri E. coli, so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri S. typhimurium, le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:20:44Z

Anže Jenko: /* Delovanje oddajnikov */

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med Escherichio coli in oslabljeno Salmonello enterico typhimurium, ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux V. fischeri. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili ''smerni signalni element''. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, ''smerni signalni element'' konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor PtetA, zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za araC in araB. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena luxR, ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja PlacIQ. Promotor PlacIQ je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena lacI. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja PluxI, ki so ga vzeli iz V. fischeri, ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja PluxI in PlacIQ sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na ''spominski element''. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz E. coli, ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja PR. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja PRM. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor PR, tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na PRM in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene rexAB, cI, cro in lacZ. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja PR, s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; lacZ, ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena cro [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na PRM znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja PR. Promotor PR sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane PRM inhibiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v S. typhimurium =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri E. coli, so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri S. typhimurium, le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri ''E. coli'' (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:20:21Z

Anže Jenko: /* Model vklopa sprejemnikov */

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med Escherichio coli in oslabljeno Salmonello enterico typhimurium, ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux V. fischeri. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili ''smerni signalni element''. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, ''smerni signalni element'' konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor PtetA, zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za araC in araB. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena luxR, ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja PlacIQ. Promotor PlacIQ je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena lacI. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja PluxI, ki so ga vzeli iz V. fischeri, ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja PluxI in PlacIQ sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na ''spominski element''. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz E. coli, ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja PR. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja PRM. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor PR, tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na PRM in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene rexAB, cI, cro in lacZ. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja PR, s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; lacZ, ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena cro [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na PRM znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja PR. Promotor PR sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane PRM inhibiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v S. typhimurium =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri E. coli, so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri S. typhimurium, le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri E. coli (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih ''in vitro'', kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:18:09Z

Anže Jenko: /* Delovanje sprejemnikov */

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med Escherichio coli in oslabljeno Salmonello enterico typhimurium, ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux V. fischeri. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili ''smerni signalni element''. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, ''smerni signalni element'' konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor PtetA, zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za araC in araB. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena luxR, ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja PlacIQ. Promotor PlacIQ je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena lacI. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja PluxI, ki so ga vzeli iz V. fischeri, ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja PluxI in PlacIQ sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na ''spominski element''. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz E. coli, ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja PR. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja PRM. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor PR, tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na PRM in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene rexAB, cI, cro in lacZ. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja PR, s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; lacZ, ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena cro [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na PRM znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja PR. Promotor PR sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane PRM inhibiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v S. typhimurium =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri E. coli, so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri S. typhimurium, le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj ''E. coli'' [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri E. coli (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov, ki kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih in vitro, kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:17:50Z

Anže Jenko: /* Delovanje sprejemnikov */

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med Escherichio coli in oslabljeno Salmonello enterico typhimurium, ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux V. fischeri. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili ''smerni signalni element''. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, ''smerni signalni element'' konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor PtetA, zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za araC in araB. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena luxR, ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja PlacIQ. Promotor PlacIQ je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena lacI. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja PluxI, ki so ga vzeli iz V. fischeri, ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja PluxI in PlacIQ sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na ''spominski element''. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz E. coli, ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja PR. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja PRM. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor PR, tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na PRM in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene rexAB, cI, cro in lacZ. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja PR, s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; lacZ, ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena cro [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na PRM znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja PR. Promotor PR sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane PRM inhibiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v S. typhimurium =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri E. coli, so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri S. typhimurium, le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki ''E. coli'' so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj E. coli [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri E. coli (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov, ki kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih in vitro, kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:17:06Z

Anže Jenko: /* Eksperimentalne ugotovitve */

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med Escherichio coli in oslabljeno Salmonello enterico typhimurium, ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux V. fischeri. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili ''smerni signalni element''. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, ''smerni signalni element'' konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor PtetA, zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za araC in araB. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena luxR, ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja PlacIQ. Promotor PlacIQ je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena lacI. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja PluxI, ki so ga vzeli iz V. fischeri, ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja PluxI in PlacIQ sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na ''spominski element''. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz E. coli, ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja PR. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja PRM. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor PR, tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na PRM in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene rexAB, cI, cro in lacZ. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja PR, s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; lacZ, ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena cro [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na PRM znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja PR. Promotor PR sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane PRM inhibiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v S. typhimurium =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri E. coli, so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri S. typhimurium, le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
== Delovanje sistema ''in vitro'' ==
=== Delovanje sprejemnikov ===
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov ''E. coli'' na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki E. coli so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki ''S. typhimurium'' imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj E. coli [3, 4].

=== Delovanje oddajnikov ===
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa ''luxI''. Proizvodnja 3OC6HSL pri ''S. typhimurium'' je bila slabša kot pri E. coli (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

== Delovanje sistema ''in vivo'' ==
Pri testih ''in vivo'' v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov, ki kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih in vitro, kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:12:04Z

Anže Jenko: /* Zasnova genetskih elementov */

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med Escherichio coli in oslabljeno Salmonello enterico typhimurium, ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux V. fischeri. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

== Zasnova oddajnika ==
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili ''smerni signalni element''. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, ''smerni signalni element'' konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor PtetA, zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

== Zasnova sprejemnika ==
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

=== Lux-sprožilni element ===
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za araC in araB. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena luxR, ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja PlacIQ. Promotor PlacIQ je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena lacI. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja PluxI, ki so ga vzeli iz V. fischeri, ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja PluxI in PlacIQ sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

=== Spominski element ===
Nastali protein Cro nadalje vpliva na ''spominski element''. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz E. coli, ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja PR. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja PRM. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor PR, tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na PRM in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene rexAB, cI, cro in lacZ. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja PR, s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; lacZ, ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena cro [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na PRM znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja PR. Promotor PR sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane PRM inhibiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

= Zasnova genetskih elementov v S. typhimurium =
Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri E. coli, so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri S. typhimurium, le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov E. coli na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki E. coli so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki S. typhimurium imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj E. coli [3, 4].

Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa luxI. Proizvodnja 3OC6HSL pri S. typhimurium je bila slabša kot pri E. coli (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

Pri testih in vivo v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov, ki kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih in vitro, kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T19:03:39Z

Anže Jenko:

= Sesalski mikrobiom =
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

= Sistem zaznavanja gostote bakterij =
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med Escherichio coli in oslabljeno Salmonello enterico typhimurium, ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov =

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux V. fischeri. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili ''smerni signalni element''. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, ''smerni signalni element'' konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor PtetA, zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4,5].

Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za araC in araB. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena luxR, ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja PlacIQ. Promotor PlacIQ je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena lacI.
Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja PluxI, ki so ga vzeli iz V. fischeri, ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja PluxI in PlacIQ sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

Nastali protein Cro nadalje vpliva na ''spominski element''. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz E. coli, ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja PR. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja PRM. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor PR, tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na PRM in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene rexAB, cI, cro in lacZ. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja PR, s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; lacZ, ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena cro [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na PRM znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja PR. Promotor PR sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane PRM inhibiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, da lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

Zatem so zasnovali sistem prenosa informacij še v S. typhimurium. Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri E. coli, so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri S. typhimurium, le da so zapisom optimizirali kodon [4].

= Eksperimentalne ugotovitve =
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov E. coli na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki E. coli so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki S. typhimurium imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj E. coli [3, 4].

Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa luxI. Proizvodnja 3OC6HSL pri S. typhimurium je bila slabša kot pri E. coli (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

Pri testih in vivo v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

= Model vklopa sprejemnikov =
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov, ki kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih in vitro, kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

2020-04-19T18:59:14Z

Anže Jenko: New page: = Sesalski mikrobiom Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolito...

= Sesalski mikrobiom
Sestava mikrobiote črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].
=Sistem zaznavanja gostote bakterij
O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med Escherichio coli in oslabljeno Salmonello enterico typhimurium, ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].
Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

= Zasnova genetskih elementov
Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux V. fischeri. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšen sistem koristi za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način narekuje delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].
Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili ''smerni signalni element''. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, ''smerni signalni element'' konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor PtetA, zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].
Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4,5].
Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za araC in araB. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena luxR, ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja PlacIQ. Promotor PlacIQ je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena lacI.
Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja PluxI, ki so ga vzeli iz V. fischeri, ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja PluxI in PlacIQ sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].
Nastali protein Cro nadalje vpliva na ''spominski element''. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz E. coli, ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].
Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja PR. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja PRM. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor PR, tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na PRM in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].
Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene rexAB, cI, cro in lacZ. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja PR, s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; lacZ, ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena cro. [4, 5, 10]
Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na PRM znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja PR. Promotor PR sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane PRM inhibiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, da lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].
Zatem so zasnovali sistem prenosa informacij še v S. typhimurium. Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri E. coli, so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri S. typhimurium, le da so zapisom optimizirali kodon [4].
Eksperimentalne ugotovitve
Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov E. coli na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki E. coli so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki S. typhimurium imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj E. coli [3, 4].
Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa luxI. Proizvodnja 3OC6HSL pri S. typhimurium je bila slabša kot pri E. coli (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

Pri testih in vivo v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].
= Model vklopa sprejemnikov
Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov, ki kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih in vitro, kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

BIO2 Povzetki seminarjev 2017

2018-01-13T01:06:31Z

Anže Jenko: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2017/2018 */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2017/2018 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2017 stran]

=== Luka Gregorič: Pozitivne vloge negativnih regulatorjev ===

Pri preučevanju regulacije sistemov v celici, so negativni regulatorji bolj temen, neraziskan del celotnega procesa, čeprav enako pomemben. Brez njih se lahko v celici začenja nenadzorovano deljenje in posledično rakavost tkiva, ali pa se nam poveča možnost hujšega obolenja. V živčnem sistemu lahko brez GPR-jev poteče prekomerna mielinizacija aksonov, ki pomenijo veliko zmanjšanje vseh kognitivnih sposobnosti organizma in posledično tudi manjšo zmožnost prilagajanja. V mišičnem tkivu, pa lahko pomanjkanje ali slabše delovanje negativnih regulatorjev naredi tkiva manj eksplozivna in povzroči hitrejše staranje, zaradi razlik med tkivi tipa 1 in tipa 2. V najhujšem primeru pa nam pomanjkanje negativnih regulatorjev celo povzroči mišično atofijo, medtem ko nam bi boljše poznavanje prav njih lahko omogočilo, da obdržimo mlade mišice čez celo življenje. Hitrost celotnega delovanja negativnih regulatorjev pa ni odvisna od moči signala, saj signal v zelo majhnem času lahko spravijo na prvotno raven, ne glede na to, kdaj se je ta signal začel. Visoka odzivnost signalov pa tudi pomaga telesu, ko se rabi hitro odzvati na različne dražljaje. Najhitrejše to naredi tako, da je signal vedno aktiviran in se izklopi le ob primeru, da se je potrebno hitro odzvati.

=== Ines Medved: Vohalni receptorji v epidermisu ===
Primarna vloga vohalnih receptorjev je zaznava vonja, ki je zelo pomembna. Poleg zaznave vonja pa imajo receptorji za vonj tudi druge funkcije. Ti receptorji se nahajajo v tkivih, ki niso povezana z vohalno nalogo. Nahajajo se skoraj po celotnem telesu npr. v ledvicah, možganih, srcu, koži, v krvi … V epidermisu so našli dva takšna receptorja, in sicer receptorja OR2AT4 in OR51E2. Kljub podobnemu mehanizmu delovanja se po funkciji zelo razlikujeta. OR2AT4 ob stimulaciji z agonistom poveča celično proliferacijo, vpliva na migracijo celic in sodeluje pri reepitalizaciji v procesu celjenja ran. Ugotovili so, da sodeluje tudi pri zaprtju rane. Za razliko od OR2AT4 receptor OR51E2 zmanjša celično proliferacijo, sodeluje pa v melanogenezi, dendritogenezi in pri celični diferenciaciji. Vohalni receptor OR51E2 ima vlogo tudi v rakavih celicah prostate. Receptorja sta zelo specifična. Vohalni receptor OR2AT4 stimulira le sandanol in brahmanol, OR51E2 pa β-ionon. Za oba receptorja so našli tudi antagoniste, ki blokirajo Ca2+ signal. Za OR2AT4 so odkrili dva antagonista oksifenilon in fenirat, za receptor OR51E2 pa α-ionon. Kljub podobni lokaciji in mehanizmom se receptorja zelo razlikujeta. Medtem ko bi se OR2AT4 lahko uporabljal pri zdravljenju oziroma celjenju rane, bi bil lahko receptor OR51E2 potencialni pokazatelj za rakave celice.

===Daria Latysheva: The role of intrinsically disordered proteins in signalling pathways and regulation ===

Intrinsically disordered proteins (IDPs) are proteins, which do not have a defined three – dimensional structure, yet are completely functional. Found mostly in eukaryotic cells, they play an important role in biosignalling and regulation of a cell. Undergoing coupled folding and binding, IDPs’ recognition elements are cable of taking over the structures of different targets. Since IDPs have multiple interaction motifs, they often serve as signalling centres, thus contributing to the dynamic assembly of complex molecules and varied signalling pathways. Undergoing post – translational modifications, these proteins also add complexity to the regulatory networks and can change the original output of the crosswalk. IDPs are also an important component of higher - order signalling assemblies, enabling the formation of reversible complexes. Being an attractive field of the research, IDPs were not yet studied completely and there is still much to be understood about the structure, functions and the location of IDPs in the cell. Experimental and computational techniques are being developed to identify and characterise disordered regions in proteins in order to emphasize the prevalent role of IDPs in cellular signalling and regulation.

===Polona Skrt: Mehanizem zaznavanja okusa maščobe ===

Okus je pomembna zaznavna zmožnost, saj nas usmerja pri uživanju hranilne in prebavljive hrane ter nas ščiti pred strupi in ostalimi nevarnimi snovmi. Čutne celice se nahajajo v brbončicah v ustni votlini, na jeziku in v grlu. V brbončicah se nahaja okoli 100 celic, ki jih delimo v 3 skupine. Prvi tip so celice podobne glia celicam, ki se ovijejo okoli ostalih celic in jim nudijo oporo ter preprečujejo nekontrolirano širjenje živčnih prenašalcev. Naslednji tip so t.i. receptorske celice, ki zaznavajo sladko, grenko in umami ter sproščajo nevrotransmiterje, ki signal prenesejo do živčevja. Tretji tip celic so predsinaptične celice, ki se odzivajo predvsem na kisel okus. Njihova posebnost je, da se prek sinaps direktno povezujejo z živčnim vlakni. Pri signalizaciji okusov so zelo pomembni z G-proteini povezani receptorji, ki omogočajo zaznavanje sladkega, grenkega in umami okusa ter ionski kanalčki, ki prenašajo informacijo o kislem in slanem okusu. Ne dolgo nazaj so znanstveniki, k prej omenjenim petim osnovnim okusom, dodali še šestega – okus po maščobi. Signalizacija najverjetneje poteka preko receptorja CD36, možni pa so še GPR120 in GPR40 ter DRK kanalčki. Mehanizem je še dokaj neraziskan, predpostavljajo pa sodelovanje med več receptorji.

===Peter Škrinjar: Receptorji za okus in njihova povezava z debelostjo ===

Okus je eden izmed petih osnovnih čutov, katerega naloga je prepoznavanje hranil in preprečevanje vnosa telesu nevarnih snovi. Pri tem mu pomagajo receptorji za okus. Te se razlikujejo za vseh pet osnovnih okusov – grenko, sladko in umami zaznamo s pomočjo GPCR-jev, slano in kislo pa s pomočjo ionskih kanalčkov. Raziskave še potekajo glede receptorjev za maščobnokislinski okus. Poleg receptorjev v ustih pa poznamo tudi receptorje za okus v prebavni cevi. Tam so te pomembni predvsem v enteroendokrinih celicah, kjer ob prisotnosti različnih ligandov sprožijo izločanje različnih peptidnih hormonov (GLP-1, CCK, PYY itd.). Te nato stimulirajo vagusni živec, ki prenese informacijo do možganov, ki se primerno odzovejo (npr. ob prisotnosti sladkorjev se v prebavni cevi izloča GLP-1, ki sproži izločanje inzulina iz trebušne slinavke). Receptorje za okus lahko povežemo tudi z debelostjo. Genetske razlike pri receptorjih za maščobnokislinski okus (predvsem CD36, ki je najbolj raziskan) lahko povzročijo slabše zaznavanje maščobnih kislin, kar bi nato vodilo do debelosti. To povezavo je sicer potrebno še dokazati. Podobno bi lahko predvidevali za maščobnokislinske receptorje v prebavnem traktu. Kot alternativa za zdravljenje debelosti se je pojavila hipoteza o zdravljenju preko receptorjev za okus na adipocitah brez α-gustducina, na katere imajo grenke komponente inhibicijski učinek.

===Milica Janković: Jedrni receptorji: Karakteristike in regulacija receptorjev ter identifikacija ligandov===

Jedrni receptorji so proteini prisotni v celicah, ki prenašajo signale svojih ligandov. Naddružino jedrnih receptorjev sestavlja 48 transkripcijskih faktorjev (pri ljudeh). Aktivirajo se po vezavi liganda in vključujejo receptorje za steroidne hormone, lipofilne vitamine, ščitnične hormone in retinoinsko kislino. Receptor- ligandni kompleks se veže na specifično področje na DNA, katero imenujemo hormonski responsni element (HRE). Jedrni receptorji so transkripcijski faktorji, ker delujejo direktno v jedru in spreminjajo ekspresijo genov ter na ta način vplivajo na razvoj, diferencijacijo in homeostazo in metabolizem. Obstajajo štirje tipi nuklearnih receptorjev, ki se razlikujejo po signalnih poteh.Zavzemajo tudi različne konformacije, ki so povzročene z vezavo agonista, oziroma antagonista. Morda najbolj revolucionarna ugotovitev, je bilo presenetljivo odkritje, da obstajajo številni receptorji, kateri so povezani na majhne molekulske ligande. Ker ti ligandi niso znani, receptorji so poimenovani siroti (orphans) receptorji. Vprašanje je bilo, kako bi lahko prišli do odkritja tistih ligandov? Vsi jedrni receptorji imajo podobno strukturo, na podlagi česa je bilo lahko narediti vrsto testov za identifikacijo ligandov.
Ker se pa vežejo na majhne molekule, predstavljajo zanimive terapevtske cilje. Bi bili bogat vir za razvoj sintetičnih majhnih molekul kot ligandov.

===Tina Turel: Vpliv mikroorganizmov na presnovo glukoze===

V biomedicini je v zadnjih letih prišlo do odkritja, da črevesna mikroflora sodeluje v različnih metabolnih procesih. Mikroorganizmi v črevesju komunicirajo z gostiteljem preko TLR-jev. TLR so receptorji v prirojenem imunskem sistemu, ki zaznajo določeno patogeno zaporedje in aktivirajo imunski odziv oziroma omogočajo komunikacijo med črevesno mikrofloro in gostiteljem. Prav tako pa lahko TLR-ji pa omogočijo, da v različnih metabolnih procesih lahko sodelujejo tudi mikroorganizmi. V študiji so se znanstveniki usmerili v določitev vseh členov, ki vplivajo na presnovo glukoze. Presnova glukoze je univerzalni postopek, ki je prisoten v vseh vretenčarjih in tudi v nekaterih nevretenčarjih. Študija je odkrila manjkajočo povezavo med IFNɣ in presnovo glukoze in sicer A. muciniphilo, ključni mikroorganizem, ki je odgovoren za izboljšanje tolerance na glukozo. Potrdili so, da bakterija lahko izboljša toleranco glukoze v različnih gostiteljih. Irgm1 so določili kot glavnega posrednik med IFNɣ in A. muciniphilo. Dejstvo je, da je A. muciniphila prisotna tudi v človeški mikroflori, zato so znanstveniki opravili poskuse tudi na prostovoljcih. Izkazalo se je, da je postopek in pa vpliv določenih komponent na presnovo in toleranco glukoze enak kot pri miših. Raziskava pa ponuja novo pot v zdravljenju metabolnih bolezni in sicer reguliranje ravni A. muciniphile.

===Ana Maklin: Vloga PGP in PHO13 v metabolizmu===

PGP in njegov ortolog PHO13 v kvasovkah sta bila predmet številnih raziskav. Njune funkcije so zelo raznolike, jasno pa je, da s svojo fosfatazno aktivnostjo ter drugimi lastnostmi pomembno vplivata tudi na metabolizem. Zaradi stranske aktivnosti nekaterih encimov v metabolnih procesi, nastajajo tudi produkti, ki lahko ovirajo normalno delovanje celic. Evolucijsko gledano, so organizmi torej morali ustvariti popravljalni sistem, ki prepreči nadaljnje posledice teh napak. Naloga PGP in PHO13 je, da s svojo aktivnostjo pretvorita neželjene produkte, ki nastajajo zaradi stranske aktivnosti encimov, v druge, ki niso škodljivi. V metabolizmu glukoze, zaradi stranske aktivnosti gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze in piruvat kinaze nastajata 4-fosfoeritronat in 2-fosfolaktat. Prvi je inhibitor 6-fosfoglukonat dehidrogenaze, drugi pa fosfofruktokinaze-1. Inhibicija teh dveh encimov bi brez PGP in PHO13 povzročila moteno glikolizo in pentoza fosftno pot. PHO13 oziroma njegova odsotno v celicah ima pomembo vlogo tudi pri pretvorbi rastlinske biomase v etanol. Ker uporaba etanola iz biomase kot vir obnovljive energije postaja vedno bolj razširjena, je PHO13 postal pomemben predmet za napredek v metabolnem inženirstvu. Deaktivacija PHO13 v kvasovkah z izraženimi XR/XDH/XK namreč preprečuje defosforilacijo ksiluloze 5-fosfata, kar omogoča nadaljevanje metabolnih procesov potrebnih za nastanek etanola, izboljša toleranco na običajne inhibitorje fermentacije (šibke kisline, produkti razgradnje sladkorjev) ter povzroči pospešeno transkripcijo genov, vključenih v pentozo fosfatno pot (naprimer TAL1,ki kodira protein transaldolazo, enega ključnih encimov pri neoksidativni pentoza fosfatni poti).

===Barbara Slapnik: Regulacija metabolizma glukoze v sesalskih celičnih kulturah===

Regulacija metabolizma glukoze je iz vidika celičnih kultur zelo pomembna, saj vpliva na celično rast in produktivnost celic. Boljše poznavanje regulacije metabolizma nam omogoča njegovo kontroliranje in s tem možnost za povečanje produktivnosti celic v celičnih kulturah. Regulacija metabolizma glukoze v celici poteka v več stopnjah. Pretok omejujejo intermediati, ki vstopajo še v druge metabolne poti. Zelo pomembna stopnja je regulacija z encimi. Glavni encimi, ki regulirajo glikolizo so heksokinaza, fosfofruktokinaza in piruvat kinaza. Poznamo več izooblik encimov, ki se razlikujejo po delovanju in afiniteti do substratov. Regulacija metabolizma glukoze poteka tudi na nivoju celične signalizacije. Protein kinaza B, ki ga imenujemo tudi Akt je odvisen od prisotnosti inzulina. Akt vpliva na izražanje glukoznega prenašalca 1 in delovanje heksokinaze ter fosfofruktokinaze. AMP kinaza je ključna za aktivacijo katabolnih poti in inhibicijo anabolnih poti. c-Myc je transkripcijski faktor, ki vpliva na izražanje glukoznega prenašalca 1 in delovanje fosfofruktokinaze, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze, fosfoglicerat kinaze in enolaze. p53 je transkripcijski faktor, ki zmanjša transkripcijo glukoznega prenašalca 1 in 3 ter aktivnost fosfoglicerat mutaze. Razumevanje regulacije metabolizma glukoze nam omogoča boljšo celično rast v bioreaktorjih.

===Ajda Krč: Spremembe v delovanju Krebsovega cikla in sposobnost prilagajanja parazitov na razmere v okolju===

Preučevanje parazitov, predvsem njihovega življenjskega kroga ter biokemijskih procesov, ki skrbijo za njihovo rast in razvoj, je pomembno predvsem z vidika preprečevanja bolezni, ki jih povzročajo s svojim zajedanjem v gostiteljskih organizmih. Paraziti iz debla Apicomplexa, v katerega spadata tudi Plasmodium falciparum in Toxoplasma gondii imajo značilen organel, t.i. apikoplast, s katerim prodrejo v gostiteljsko celico. Plasmodium falciparum spada v družino plazmodijev, zajedavcev eritrocitov, ki povzročajo malarijo, Toxoplazma gondii pa je glavni krivec za pojav toksoplazmoze. Življenjski krog teh parazitov se običajno deli na spolno in nespolno fazo razmnoževanja. Obe fazi spremljajo določeni procesi, ki pomagajo organizmom preživeti v najrazličnejših okoljih. Med mehanizme, ki sodelujejo pri preživetju, gotovo spada tudi ogljikov metabolizem, ki vključuje procese glikolize, glutaminolize, reakcije v Krebsovem ciklu ter elektronsko prenašalno verigo. V seminarski nalogi so opisane nekatere spremembe in prilagoditve določenih encimov Krebsovega cikla na okolje, v katerem se organizem nahaja, ter anaplerotične poti, v katere je Krebsov cikel parazitov vpleten. Prav tako so razložene nekatere alternativne poti, po katerih paraziti pridejo do potrebne energije (reakcije glutaminolize) glede na fazo v njihovem razvoju.

===Urban Hribar: Metabolizem polariziranih makrofagov===

Makrofagi lahko spremenijo svoje delovanje kot odziv na zunanje dejavnike za opravljanje različnih nalog. Temu procesu pravimo aktivacija oziroma polarizacija makrofagov. Makrofagi se lahko palarizirajo v makrofage tipa M1 (klasično aktivirani) in tipa M2 (alternativno aktivirani). Makrofagi M1 so pomembni v boju proti okužbam mikrobov in so znani kot makrofagi, ki promovirajo vnetja. Proizvajajo tudi dušikov oksid (NO) in vnetostne citokinine. Na dolgi rok lahko makrofagi M1 in njihovi produkti škodujejo tkivu lastnega oganizma. Zato makrofagi tipa M2 zavirajo vnetja in so odgovorni za popravilo tkiva. Pri funkcijah teh makrofagov imajo pomembno vlogo tudi spremenjeni metabolizmi polariziranih makrofagov. Makrofagi M1 imajo pospešeno delovanje glikolize ter zmanjšano aktivnost oksidativne fosforilacije. Z pospešeno glikolizo ter laktatno fermentacijo makrofagi proizvajajo večino svojih zalog ATP. Poleg tega ima tudi prekinjen krebsov cikel na dveh mestih. Prvo mesto je pri reakciji izocitrata v alfa-ketoglutarat, drugo mesto pa pri reakciji sukcinata v fumarat. Prekinitve v ciklu vodijo do kopičenja intermediatov, ki pa se uporabljajo za sintezo NO, prostgladinov in vnetnosnih citokinov. Hkrati je krebsov cikel makrofagov M1 povezan z ciklom sečnine, ki lahko proizvaja NO. Posebnost makrofagov M1 je tudi da v mitohondrijih proizvajajo povečane količine reaktivnih kisikovih zvrst (ROS). Te se tudi uporabljajo za boj proti bakterijam in proizvodnjo vnetnostnih citokinov.

===Urška Zagorc: Salmonela in citratni cikel===

Zastrupitev z bakterijo salmonelo spada med najpogostejše zastrupitve s hrano. Bakterija lahko živi v različnih okoljih, saj zna zelo dobro prilagoditi svoj metabolizem in se hkrati tudi izmakniti naravnemu imunskemu sistemu. Za to poskrbijo številni encimi citratnega cikla v salmoneli. Encimi akonitaza, izocitrat dehidrogenaza in izocitrat liaza inhibirajo delovanje inflamasoma NLRP3. Inflamasom je receptor imunskega sistema in aktivira kaspaze, ki vodijo v celično smrt. Z inhibiranim delovanjem teh inflamasomov posledično ne pride do celične smrti škodljivih celic. Tudi citrat in citratni cikel imata pri ohranjanju bakterije salmonele svojo vlogo. Citrat, na primer, je povezan v kompleks z železom. Ob izpostavljenosti dušikovemu oksidu, ki ima velik vpliv na celoten ogljikov metabolizem, se citrat porablja. Zmanjša se količina železa v celici, ki je bila prej v ravnotežju, hkrati pa se zmanjša tudi rast salmonele. Citratni cikel pa ni edini način, ki ga uporablja bakterija salmonela za svoje preživetje. Razvila je namreč mnogo poti, po katerih se lahko izogne oviram gostitelja. Ta se poleg inflamasomov bori s salmoneli strupenimi snovmi, kot je dušikov oksid, a tudi za to je bakterija že našla rešitev.

===Lija Srnovršnik: Hepatična oksidacija maščobnih kislin med stradanjem===

Jetra so ključna pri uravnavanju ravnotežja energije v celotnem telesu.
Da bi razumeli vlogo hepatične β-oksidacije maščobnih kislin med obdobjem stradanja, so vzredili miši z izločenim genom za delovanje karnitin acil-transferaze 2 v jetrih (Cpt2L-⁄- miši). Ta encim katalizira obvezen korak v mitohondrijski dolgoverižni β-oksidaciji maščobnih kislin. Karnitin acil-transferaza 2 namreč sodeluje pri prenosu maščobnih kislin v notranjost mitohondrija in brez nje β-oksidacija ne more potekati. Miši so stradali 24 ur, kar je povzročilo nalaganje maščobe na jetra in povišano raven lipidov v krvi, vendar pa odsotnost ketonskih telesc, medtem ko je raven glukoze ostala normalna. Če med stradanjem, hepatična oksidacija ne poteka, se inducirajo PPARα tarčni geni v jetrih. Sistemska homeostaza energije je bila večinoma vzdrževana v stradajočih Cpt2L-⁄- miših z adaptacijami v hepatični in sistemski ekspresiji genov za oksidacijo, na kar so vplivali PPARα tarčni geni, ki vključujejo prokatabolične hepatokine Fgf21, Gdf15 and Igfbp1.
Da bi primerjali rezultate, so Cpt2L-⁄- miši hranili s ketonsko dieto, prišlo je do hude lipolize ter posledično hepatomegalije (povečanja jeter), poškodb samega organa in posledično smrti. Opazili so popolno odsotnost zalog triacilglicerolov v adipocitih. Ti podatki kažejo, da hepatična oksidacija maščobnih kislin ni nujno potrebna za preživetje med pomanjkanjem hrane, vendar je ključna za omejitev lipolize v adipocitih ter regulacijo nadomestnega katabolizma, ko je glukoza omejena.

===Patrik Levačić: Ceramidi in njihova povezava z debelostjo===
V modernem svetu je debelost vse večji problem, če ne celo eden glavnih krivcev za bolezni, ki so povezane s prekomerno cirkulacijo lipidov v krvi, kot je npr. ateroskleroza ipd. Tekom debelosti je prisotnega več sladkorja v obliki glukoze, lipidov ter vnetji. Ker je presežek lipidov, natančneje maščobnih kislin v obtoku, so to primerni pogoji za tvorbo ceramidov, ki so sicer še sestavljeni iz sfingozina, ki se preko aminske skupine poveže z maščobno kislino. Ceramidi se eni glavnih krivcev za znižano stopnjo oksidacije maščobnih kislin, to pripomore k nalaganju maščobnega tkiva na organe ter v adipocitno tkivo, a žal lahko tudi adipocitno tkivo raste do neke mere, ko doseže maksimalno velikost posatne to tkivo nefunkcionalno in ne more več shranjevati lipidov. Rezultat je prekomerna cirkulacija lipidov v krvi. V seminarju je največ govora o dveh specifičnih ceramidih, ceramid C16:0 ter ceramid C18:0, ki sta v raziskavah imela vlogo negativnega regulatorja metabolizma lipidov ter slodkorjev. Kakršnekoli motnje metabolizma pa se odražajo v obliki vnetji, slabši funkcionalnosti celic, samih organelov v notranjosti celice ter kroničnih obolenj kot so npr. sladkorna bolezen. Za boj proti debelosti je večina študij ugotovila, da s povišanim procentom oksidiranih maščobnih kislin dosežemo zmanjšanje deleža prostih maščobnih kislin ter blokiramo tvorbo novih ceramidov.

===Jerneja Nimac: Ketonska telesca kot signalni metaboliti===

Nove raziskave na področju ketonskih telesc kažejo, da ta niso le pasivni prenašalci energije, ampak tudi pomembni signalni metaboliti. Najpomembnejši med njimi je β-hidroksibutirat (BHB). Signalne vloge, ki mu jih pripisujejo so inhibicija histonske deacetilaze razreda I (HDAC), aktivacija z G-proteinom sklopljenega receptorja HCAR2 in inhibicija prav tako z G-proteinom sklopljenega receptorja FFAR3. Ko BHB inhibira HDAC se poveča izražanje genov, ki zmanjšajo oksidativni stres, poleg tega pa naj bi ta inhibicija izboljšala občutljivost na inzulin. Antilipolitični učinek receptorja HCAR2 inhibira hormonsko odzivno triglicerid lipazo, kar ustvari negativno povratno zanko in zaustavitev ketogeneze. Vpliv BHB na receptor FFAR3 pa še ni popolnoma raziskan. Predpostavljajo, da BHB vpliva na FFAR3 v odvisnosti od pogojev, torej G-proteina in koncentracije BHB, je pa ena od raziskav pokazala, da molekula BHB z vezavo na FFAR3 inhibira od napetosti odvisne kalcijeve kanalčke. Molekula BHB se veže tudi na inflamasom NLRP3 in z njegovo inhibicijo prepreči izstop K+. Poleg ketonskega telesca BHB pa ima nekaj signalnih funkcij tudi acetoacetat. Slednji skupaj z molekulo BHB regulira vezikularni transporter glutamata (VGLUT2), in sicer tako da inhibira od Cl- odvisni vnos glutamata. Signalna funkcija ketonskih telesc v celici pa sproži odzive, ki naj bi pripomogli k zaviranju epilepsije, demence, raka in vplivali na staranje.

===Nika Mikulič Vernik: Hiperamoniemija in metode zdravljenja===

Amonijak se v telesu porablja v anabolizmu aminokislin, sintezi proteinov in zagotavljanju pH vrednosti. Kadar ga je v krvni plazmi preveč, ga mora telo detoksicirati in izločiti, za kar skrbi cikel uree v jetrnih celicah. Preostanek amonijaka odstrani glutamin sintetaza, ki iz glutamata tvori glutamin. Če je amonijaka v krvi preveč, to stanje imenujemo hiperamoniemija. Za razvoj te bolezni poznamo več vzrokov, glede na njih pa ločimo primarno (okvare encimov ali transporterjev, ki delujejo v ciklu uree) in sekundarno hiperamoniemijo (inhibicija cikla uree).
Ker ima amonijev ion NH4+ podoben atomski radij kot K+, lahko membrane prehaja na enak način. Preide lahko tudi krvno možgansko bariero, kar povzroča nevrološke težave, kot so zatekanje astrocitov, povečana permeabilnost krvno možganske bariere, cerebralni edem (zatekanje možganov) in hepatična encefalopatija, kar lahko vodi v komo in celo smrt.
Zdravila za zdravljenje hiperamoniemije imajo dva možna načina delovanja; 1) zmanjšanje nastanka in absorpcije amonijaka (zmanjševanje števila bakterij, ki proizvajajo ureaze, ali zmanjševanje degradacije glutamina in glicina); 2) izboljšanje sistemov za detoksikacijo in izločanje. Zraven tega se uporabljajo tudi razne dialize, genske in celične terapije ter kirurški posegi.

===Tanja Zupan: Presnovne bolezni aminokislin===

Bolezen javorjevega sirupa (MSUD), fenilketonurija (PKU), hiperamoniemija (HA), citrulinemija (CTLN), tirozinemija, cistinoza in Hartnupova bolezen so presnovne bolezni aminokislin, ki se dedujejo avtosomno recesivno. Bolezen javorjevega sirupa se pojavi zaradi nedelovanje encima BCKDH (ang. »branched-chain α-ketoacid dehydrogenase complex«), zato se v urinu poveča koncentracija α-ketokislin, ki dajejo urinu značilen vonj po javorjevm sirupu. Nedelovanje encima fenilalanin hidroksilaza (PAH), ki sodeluje pri presnovi fenilalanina v tirozin pa povzroči fenilketonurijo. Tirozinemija je posledica pomanjkanja oz. nedelovanje encimov v metabolni poti tirozina, delimo jo na tri tipe: tirozinemija tipa I (pomanjkanje encima fumarilacetoacetate (FAH), ki katalizira razgradnjo fumarilacetoacetata v acetoacetat in fumarat), tirozinemija tipa II (pomanjkanje encima tirozin aminotrasnferaze (TAT) v jetrih, ki tirozin pretvori v p-hidroksilfenilpiruvat), tirozinemija tipa III (pomanjkanje p-hidroksifenilpiruvat dioksigenaza). Cistinoza pa je bolezen, ki je posledica okvarjenega transporta cistina iz lizosomov v citoplazmo, pri čemer se cistin kopiči v celicah in jih poškoduje zaradi tvorbe kristalov. Hiperamoniemija in citrulinemija sta bolezni, ki ju povzroči nedelovanje encimov v ciklu sečnine. Za hiperamoniemijo je značilna zvišana koncentracija amoniaka v krvi zaradi pomanjkanja encima ornitin transkarbamilaze (OTC). Citrulinemijo delimo na dva tipa, citrulinemijo tipa I ali klasično citrulinemijo, pri kateri gre za pomanjaknja argininosukcinata, ter citrulinemijo tipa II, kjer gre za pomanjkanje citronov. Bolezni zdravimo oz. omejimo njene posledice s strogo vseživljenjsko dieto, pri kateri omejimo vnos določene aminokisline v organizem.

===Anja Tavčar: Regulacija imunskega odziva z metabolizmom L-arginina===
L-arginin je pri človeku ena od pogojno esencialnih aminokislin, kar pomeni, da ga moramo v primerih, ko potreba po njem presega zmožnosti lastne produkcije, vnašati s hrano. Njegov metabolizem poteka v tako imenovanih mieloidnih celicah zaviralkah (MSC), in sicer s pomočjo encima arginaze (ARG, nastajata urea in L-ornitin) ali NO-sintaze (NOS, nastajata NO in L-citrulin). Obe vrsti encimov za svoje delovanje nujno potrebujeta kofaktorje, da pa do aktivnosti sploh pride, mora mieloidna celica prejeti signal iz okolice. Običajno gre za vezavo katerega od številnih citokinov, ki služijo kot signalne molekule med različnimi elementi imunskega sistema. Pri razumevanju uravnavanja oz. usklajevanja delovanja ARG in NOS ostaja še kar nekaj nerazrešenih vprašanj in problematik, vendar lahko kljub temu potrdimo, da je njuna združena aktivnost pomemben supresor T celic ter hkrati odličen označevalec mieloidnih celic zaviralk, ki so razširjene po celem telesu. Z regulacijo aktivnosti teh dveh encimov celice vplivajo na delovanje okoliških limfocitov T in tako inhibirajo njihovo pretirano izražanje ter poliferacijo po odstranitvi patogena iz sistema, ki bi sicer privedla do akumulacije T celic. V primeru, da do tega zaviranja ne pride, govorimo o avtoimunskih boleznih, kjer zaradi predolge izpostavljenosti citotksičnim limfocitom, prihaja do okvar, ki vodijo v napadanje telesu lastnih celic ter nastanka tumorjev.

===Maja Vrabec: Poškodbe mitohondrijske DNA in popravljalni mehanizmi===
V mitohondrijski DNA se mutacije kopičijo bistveno hitreje in v večji meri kot v jedrni DNA. Zaradi sproščanja reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) iz dihalne verige v mitohondrijih in omejenega nabora mehanizmov odstranjevanja oziroma pretvarjanja le-teh v manj škodljive kompomnente, je oksidativno okolje mitohondrijske DNA dolgo časa veljalo za glavni razlog večjega števila mutacij. Pred nekaj leti pa je bilo dokazano, da so glavni razlog za kopičenje mutacij v mitohondrijski DNA napake v replikaciji, kar vključuje neustrezno delovanje mitohondrijske DNA polimeraze POLG ter nesorazmernosti in modifikacije v zalogah deoksi nukleotidov tri-fosfat, ki so namenjeni za vključitev v novonastajajoče verige. Mitohondrijska DNA ima bistveno manjši nabor popravljalnih mehanizmov kot jedrna DNA, zaradi česar veliko mutacij ostane nepopravljenih in se kopičijo. Poleg tega ima določen vpliv na količino mutacij v DNA tudi okolje in razne škodljive komponente v njem, ki največkrat preko tvorbe aduktov z mtDNA močno ovirajo ali onemogočajo delovanje mitohondrijske DNA polimeraze med replikacijo in transkripcijo. Najpogostejše mutacije v mitohondrijski DNA so zamenjava enega nukleotida in vstavitev oziroma odstranitev posamezne baze. Določen delež mutacij je prisoten načeloma v vseh mitohondrijskih genomih, posledice za funkcionalnost celotnega mitohondrija in celice se začnejo kazati šele, ko količina mutacij doseže nek določen nivo, ki je odvisen od tipa celic.

===Anja Černe: Vpliv mitohondrijskega stresa na staranje===
Mitohondrij je glavni določevalec aktivnosti HSR (odgovor na stres), vzdrževanja proteostaze in življenske dobe. HSR je transkripcijski program, ki se vzpostavi kot odgovor na stres. Glavni člen pri HSR je transkripcijski faktor HSF-1 (heat-shock factor 1). V začetku reproduktivne dobe se aktivnost HSR zmanjša v prid razmnoževanju. Inhibicijo HSR spodbudi povišana histonska metilacija histona H3K27 na delih kromosoma, kjer je lociran gen za stres. Preko blagega mitohondrijskega stresa lahko v celicah zmanjšamo represijo HSR ter upočasnimo proces staranja. Induciran stres mora biti v omejen. Motnje v mitohondriju lahko sprožimo s kemikalijami (inhibicija kompleksov I in III), infekcijo s patogenimi bakterijami ali preko neravnovesij v mitohondrijski DNA. Celica se na stres odzove z odgovorom UPRmt, s katerim obnovi proteostazo (proteinska homeostaza). Kadar pride do kolapsa proteostaze (stanje, v katerem šaperoni ne zmorejo dovolj učinkovito oz. hitro popravljati nepravilno zvite proteine), se sproži mitohondrijski odgovor na nezvite proteine - UPRmt. Tovrsten odgovor se začne z delovanjem protease CLPP-1, ki razgradi moteče proteine na kratke peptide in le-te transporter HAF-1 izvozi iz matriksa. Peptidi nato aktivirajo transkripcijski faktor AFTS-1, ki se v jedru veže na promotorje genov za mitohondrijske šaperone. V mitohondriju je zelo pomembna regulacija aktivacije kompleksa I; pretirana inhibicija ima lahko usodne učinke (npr. pomanjkanje testosterona znatno zniža aktivnost kompleksa I), medtem ko blago utišanje lahko doprinese k upočasnjevanju staranja (npr. rotenon inhibira kompleks I, kar spodbuja UPRmt).

===Špela Deučman: Vloga reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) pri celični signalizaciji===
Pri mnogih celičnih procesih nastaja superoksid oz. radikali, ki se kasneje s kisikom združijo v superoksid. Te spojine, imenovane reaktivne kisikove zvrsti (ROS), nastajajo predvsem v mitohondrijih, peroksisomih, endoplazemskem retikulumu in na kompleksih NADPH oksidaze. Zaradi njihove velike reaktivnost so znanstveniki dolgo časa menili, da so to nezaželene molekule, ki povzročajo poškodbe lipidov, proteinov in DNA. V zadnjih dveh desetletjih pa so ugotovili, da imajo pomembno vlogo v homeostazi in kot posredniki intraceličnega signaliziranja. Regulacija ROS z encimi in antioksidanti je ključnega pomena, saj preprečuje poškodbe celičnih struktur in celično smrt hkrati pa vzdržuje dovolj veliko koncentracijo za namene signalizacije. Organizmi so razvili več mehanizmov in najpogostejši med njimi je mehanizem imenovan »redox relay«, pri katerem H2O2 oksidira cisteinske ostanke proteinov kot so PRXs in GPXs. Pri kvasovkah H2O2 oksidira Orp1, ki v nadaljevanju oksidira Yap1. Pri tako imenovanem »floodgate« mehanizemu nastaja H2O2, ki regulira sintezo kortikosterona (pri miših) z negativno povratno zanko, kar omogoča akumulacijo H2O2 ter nadaljnjo signalizacijo. Pri signalizaciji z drugimi rastnimi faktorji prav tako nastaja in se akumulira H2O2, vendar se PRX začasno inaktivira s fosforilacijo. Pri hipoksičnih pogojih se PRX1 oksidira in s tem preprečuje oksidacijo (inaktivacijo) AMPK. Pri interakciji ASK1 in TRX slednji deluje kot nosilec in negativni regulator ASK1. Ob oksidaciji TRX z H2O2 ASK1 oddisociira in tako postane aktiven.

===Katja Doberšek: Vpliv zunanjih dejavnikov na sintezo celuloze===
Celuloza je najpomembnejša sestavina primarne celične stene višje razvitih rastlin. Sintetizira se na plazmalemi na posebnih proteinskih strukturah, imenovanih celulozo sintazni kompleksi ali rozete. To so strukture iz šestih delov, organiziranih v šestkotnik s premerom okoli 30nm. Na vsakem izmed teh šestih delov se nahajajo tri molekule proteina celulozne sintaze, ki glukozne ostanke povezuje v celulozno fibrilo. Rozeta je skupaj s proteini celulozne sintaze pripeta na sistem kortikalnih mikrotubulov, po katerih se premika. Na okoljske stresorje se rastline različno odzivajo, vendar gre pri tem pogosto za spremembe v mehanizmu sinteze celuloze in raziskave so v zadnjem času veliko pozornosti posvečale boljšemu spoznavanju teh odzivov. Okoljske stresorje delimo na abiotske, kot so temperatura, količina svetlobe in osmotski tlak, ter biotske, kot so prisotnost drugih organizmov, predvsem bakterij ali virusov. Pri izražanju genov za proteine, ki sodelujejo pri mehanizmu sinteze celuloze, imajo pomembno vlogo nekateri rastlinski hormoni – fitohormoni, ki se sprošččajo pod vplivom okoljskih stresorjev. To so hormoni družine brasinosteroidov in ABA, ki ga imenujejo tudi rastlinski hormon stresa. Ti s svojim delovanjem namreč aktivirajo ali deaktivirajo določene transkripcijske faktorje, ki se lahko direktno vežejo na promotorsko regijo genov za proteine CESA in drugih.

===Martin Špendl: Lektini in prepoznavanje sladkornih podenot===
Večina organizmov sintetizira proteine, ki lahko vežejo ogljikove hidrate specifično in reverzibilno. Imenujemo jih lektini (izpeljava latinskega glagola izbrati) ali aglutinini, zaradi svoje sposobnosti tvorbe skupkov in obarjanja celic, tako kot protitelesa. Bolj natančno so to proteini, ki lahko vežejo mono- ali oligosaharide v ne-katalitične domene. Saharidi svoje strukture ob vezavi ne spreminjajo, lahko pa spremenijo energijsko stanje le-teh. Od protiteles jih razlikujemo po tem, da njihova prisotnost ni nujno povezana z imunskim odzivom in so lahko prisotni tudi kot posledica stresa ali spremembe v okolici. Večinoma se nahajajo v ekstra-celularnem matriksu (ECM), lizosomih, membranah celic in jedru. Najbolj pogosti so v semenih stročnic. Njihova naloga je prevajanje informacij saharidnih podenot glikolipidov, glikoproteinov in proteoglikanov, ki lahko zaradi svojih mnogoterih struktur v zgoščenem prostoru, kot je na primer EMC, prenašajo veliko gostoto le-teh. Posledično morajo biti vezavna mesta lektinov temu primerno bolj kompleksna. Na osnovi teh lastnosti lektinov izvirajo postopki obdelave vzorca pri naravoslovnih metod in farmacevtskih sintezah zdravilnih učinkovin.Lektini tipa C, ki imajo v svojem vezavnem mestu kation kalcija, so v visokih koncentracijah toksični. Zato moramo živila, ki vsebujejo lektine (na primer stročnice, žita, kostanj in krompir) pred zaužitjem skuhati, da se denaturirajo. V nasprotnem primeru lahko uživanje lektinskih živil privede do bruhanja, driske, prebavnih motenj, slabosti in napenjanja.

===Lea Knez: Trehaloza-6-fosfat kot signalna molekula v rastlinah===
V rastlinah imajo ogljikovi hidrati ključno vlogo v metabolizmu, poleg tega, pa lahko delujejo tudi kot signalne molekule. Ena izmed takih signalnih poti vključuje zaznavanje ter odziv na trehalozo-6-fosfat (T6P). Sintezo T6P katalizira encim trehaloza-6-fosfat sintaza (TPS). T6P deluje kot signal za razpoložljive zaloge ogljikovih hidratov, saj je njegova koncentracija v celicah tesno povezana s koncentracijo saharoze. Dokazali so, da T6P vpliva na sintezo škroba ter da inducira cvetenje rastlin, vendar so potrebne nadaljne raziskave za ugotovitev mehanizma delovanja T6P v teh procesih. T6P je prvi odkriti metabolit, ki sodeluje pri koordinaciji metabolizma z rastjo in razvojem rastline. Izguba gena za encim TPS upočasni razvoj in shranjevanje energijskih zalog v embriju. Predlagali so regulatorni mehanizem kjer T6P deluje na SnRK1 (sucrose non-fermenting related kinase-1) tako da ga inhibira, kar spodbudi anabolične procese in rast rastline. Ob nižjih koncentracijah T6P, pa se SnRK1 aktivira in pospeši katabolične procese ter adaptacijo rastline na zmanjšane zaloge ogljika. Genom rastline Arabidopsis thaliana vsebuje 11 TPS (AtTPS1-11) genov, od katerih so le za TPS1 dokazali encimsko aktivnost, funkcije ostalih homologov pa so še neznane. V bodočih raziskavah bi bilo predvsem pomembno razumeti kakšno vlogo imajo vsi encimi iz družine TPS v rastlinah.

===Nika Goršek: Lipidi v gostiteljski celici ob okužbi z virusom hepatitis C===
Virus hepatitis C je glavni krivec za razvoj jetrne steatoze, fibroze, ciroze in hepatocelularnega karcinoma. Z virusom je okuženih že 170 milijonov ljudi. Življenjski cikel HCV je tesno povezan z metabolizmom lipidov, od vstopa pa vse do njegovega sestavljanja in sekrecije. Virus se poveže s celico preko številnih receptorjev, ki so vključeni predvsem v metabolizem lipidov (LDL-r, SR-BI, NPC1L1, CD81, TfR1, klaudin-1 in okludin). V celico pa vstopi preko s klatrinom posredovane endocitoze. Translacija virusnih polipeptidov poteka na membrana endoplazemskega retikuluma. Pri replikaciji sodelujejo tako virusni kot celični proteini. Replikacija poteka na membranskih mrežah, ki služijo kot osnova za nastanek replikacijeskega kompleksa. Virus si prilasti lipidni metabolizem in tako v membranske mreže privablja sfingolipide in holesterol preko lipidnih transfer proteinov. Virus je zmožen relokalizirati fosfatidilinozitol 4-kinazo III α, ki omogoča sintezo fosfatidilinozitol-4-fosfatov (glicerofosfolipidi), ki so nujno potrebni za nastanek replikacijskega kompleksa.
Raznorazne analize so pokazale, da je virus spremenil ekspresijo genov v gostiteljski celici. Predvsem se je spremenila regulacija genov za holesterolno biosintezo – se je povečala.
Virusne – lipidne interakcije so zelo privlačne za razvoj posrednih protivirusnih zdravil, saj je za virus težje, da razvije mutacije, ki bi delovale proti zdravilom, katerih tarča je gostiteljska celica. Obstajajo nekatera, za zdaj še ne priznana zdravila, ki vplivajo na gostiteljsko celico, vendar so za njihovo uporabo potrebne dodatne analize in raziskave.

===Nika Zaveršek:Povezava velike depresivne motnje z razmerjem med omega-6 in omega-3 maščobnimi kislinami===
Velika depresivna motnja je duševna motnja, ki jo spremljajo občutki tesnobe, letargije, razdražljivosti, krivde, težave s koncentracijo, izguba veselja in zanimanja do običajno prijetnih dejavnosti, lahko povzroči tudi samomorilne misli. V zadnjih desetletjih je depresija postala bolj pogosta. V tem časovnem okvirju pa se je drastično spremenila tudi prehrana v tem delu sveta, in sicer predvsem v razmerju zaužitih esencialnih omega-6 in omega-3 maščobnih kislin, ki je od ugotovljenega idealnega razmerja 2:1 narastla do zaužitih 15-20:1. Povečano razmerje lahko povzroči nevrološke, kognitivne bolezni, bolezni srca in ožilja, možganov in ožilja ter bolezni povezanih z razpoloženjem. Razmerje omega-6:omega-3 maščobnih kislin vpliva na sestavo fosfolipidov v membrani in s tem na njeno fluidnost ter sintezo eikozanoidov, ki regulirajo vnetja, zato poznamo pro- in protivnetne. Izkaže pa se, da ti eikozanoidi ne regulirajo samo vnetij, ampak tudi vse druge mehanizme povezane z njimi, kot so HPA os in posledično sinteza kortizola, ta pa regulira sintezo nevrotransmiterjev npr.: serotonin. Fluidnost membran pa poleg tega vpliva tudi na kvartarno strukturo membranskih proteinov v nevronih in tako na njihovo afiniteto za nevrotransmiterje.

===Špela Supej: Biosinteza rastlinskih alkaloidov===
Alkaloidi so strukturno zelo raznolika skupina naravnih organskih spojin, ki nastanejo kot sekundarni metaboliti pri rastlinski presnovi aminokislin. Za njihovo zgradbo je značilno, da vsebujejo dušik, ki je običajno vezan v heterocikličen obroč. Večina alkaloidov je zelo strupenih in imajo izrazito grenak okus ter tako za mnoge rastline predstavljajo učinkovito zaščito pred rastlinojedci in patogenimi organizmi. Kljub temu pa se mnogi zaradi svojih fizioloških in koristnih farmakoloških lastnosti uporabljajo v medicini. Glede na izvor ločimo alkaloide, ki so sintetizirani iz aminokislin in tiste, ki so sintetizirani iz nukleotidov. V seminarju predstavim sintezo dveh pomembnih alkaloidov in njun vpliv na človeško telo. Tropanski alkaloid nikotin v rastlini tobaka nastane iz treh aminokislin (asparginske kisline, ornitina in metionina) in iz gliceraldehida. Biosinteza poteka v dveh delih, eden izmed njenih glavnih regulatorjev pa je rastlinski hormon jasmonska kislina, ki sproži povečano izražanje genov za sintezo encimov, ki so potrebni za nastanek nikotina. Ta v človeškem telesu deluje kot agonist na večino nikotin acetilholinskih receptorjev in povzroča sproščanje dopamina in adrenalina v krvni obtok. Drug pomemben alkaloid, ki je predstavljen, je kofein, ki izvira iz družine purinskih alkaloidov. Sintetizira se iz ksantozina, v telesu pa deluje kot blago poživilo in diuretik.

===Luka Fratina: Industrijska proizvodnja aminokislin===
Aminokisline se v industriji porabljajo v živilski, farmacevtski in kozmetični industriji. Največ se jih porablja kot dodatek k krmi, pa tudi kot farmacevtski prekurzorji in umetna sladila. Za proizvodnjo aminokislin se uporabljata dva načina: fermentacija in encimatične metode. Fermentacija poteka v fermenatorjih in se uporablja za večino aminokislin. Pri tem je zelo pomembno urediti biosintetične poti, da le te potekajo tako, da dobimo največjo proizvodnjo. To dosežemo tako, da v bakterije, kakor je C. glutamicum uvajamo mutacije, vedno bolj pa je prisotno tudi metabolčno inžinirstvo. Poleg tega je dober način tudi povečati prepustnost membran, saj se tako aminokislin lažje sprostijo v okolje in ne zavirajo encimov. Nekateri encimi so tudi v nizki prisotnosti in zavirajo produkcijo, zato je treba povečati ekspresijo genov za te encime. Kako vplivati na regulacijo in posldično pridobiti ogromno količino aminokisline se razlikuje za vsako aminokislino posebej.Encimatične metode delujejo na na konceptu izoliranih encimov na membrani in se uporabljajo predvsem za neproteogene aminokisline. Proizvodnja aminokislin se vsako leto povečuje, poleg tega pa se z nadaljnami raziskavami vpeljujejo postopke, s katerimi bi se v prihodnoasti proizvajali tudi aminokisline, ki se jih v tem trenutku ne da, kot je mitionin.

===Uroš Prešern: Ribonukleotid reduktaza - encim, ki po vseh letih od odkritja še vedno preseneča===
Ribonukleotid reduktaza je encim, ki katalizira redukcijo ribonukleotidov v deoksiribonukleotide. Od njenega odkritja pred slabimi šestdesetimi leti je ribonukleotid reduktaza nenehno presenečala raziskovalce s svojo neobičajnostjo. Velja za prvi odkriti proteinski radikal, ki katalizira redukcijo ribonukleotidov preko radikalskega mehanizma. Nenavadna je tudi alosterična regulacija encima, saj je poleg aktivnosti encima regulirana tudi specifičnost substrata, ki omogoča ohranjanje pravilnega razmerja med koncentracijami posameznih deoksinukleotidov v celici. Prisotna je v vseh organizmih, skozi evolucijo pa so se izoblikovali trije različni razredi encima, ki se med drugim razlikujejo po načinu tvorbe radikala in občutljivosti na kisik. Najbolj zastopan je razred Ia, kamor spada ribonukleotid reduktaza iz E. coli, pa tudi njen človeški homolog. Za ta razred velja, da je encim sestavljen iz dveh različnih podenot, ki tvorita aktiven kompleks α2β2. V podenoti α se nahaja aktivno mesto in obe regulatorni mesti, podenota β pa vsebuje dvojedrni železov center, poleg pa se nahaja tirozinski ostanek, na katerem se ob prisotnosti kisika tvori radikal. Ta se nato prenese na cisteinski ostanek v aktivnem mestu, kjer sproži redukcijo ribonukleotidov. Kot eden izmed ključnih členov v sintezi DNA je aktivnost ribonukleotid reduktaze močno regulirana, nepravilnosti v regulaciji ali delovanju encima pa lahko pripeljejo do rakavih obolenj.

===Andreja Habič: Rjavo maščobno tkivo kot sekrecijski organ===

Odkritje rjavega maščevja (BAT, ''Brown Adipose Tissue'') pri človeku sega že v leto 1902. Dolgo je veljalo, da je tkivo prisotno le pri novorojenčkih, in sicer z namenom zaščite pred mrazom, v prvih letih odraščanja pa postopoma izgine. Prvič se je o BAT pri odraslem človeku poročalo leta 1972, za nadaljnje raziskave pa je področje postalo zanimivo šele v novem tisočletju, s pojavom tehnik, ki so omogočile potrditev prisotnosti (aktivnega) BAT pri odraslem človeku ''in vivo''. Primarna naloga BAT je proizvodnja toplote, ki se sprošča pri procesu netresave termogeneze, ki poteka v klasičnih rjavih in nedavno odkritih 'bež' adipocitih. V zadnjem desetletju je poleg aktivacije maščobnega tkiva pritegnila pozornost njegova sekrecijska vloga. Identificirani so bili številni BAT-sekreti, t.i. batokini, ki delujejo parakrino (NGF, VEGFA, NO), avtokrino (IGF1, FGF2, PGE2, endokanabinoidi) in/ali endokrino (FGF21, NRG4, IGFBP2, RBP4). Prisotnost večine batokinov ima za posledico povečano aktivnost BAT in/ali povečanje njegovega volumna; odgovorni so tudi za komunikacijo z drugimi organi, npr. s srcem, centralnim živčevjem, kostmi, jetri in trebušno slinavko. Glede na to, da raziskave nakazujejo na pozitivno vlogo aktivnega BAT na zdravstveno stanje tako pri glodalcih kot pri ljudeh (povezujejo jo npr. z zaščito pred debelostjo in diabetesom), bi biokemijsko razumevanje mehanizmov aktivacije BAT in njegove sekrecije ter komunikacije z drugimi organi lahko imelo terapevtski potencial.

===Andrej Race: Ghrelin===

Our organism has many hormones for reducing appetite, on the other hand there is only one currently known that increases it, ghrelin. This peptide is known for his effect on food intake and body fat gain, and as a releasing agent for growth hormone, but his role is more complex. In this text we describe the unique mechanism by which ghrelin is modified from his inactive des-acyltaed form to his active acylted form in his producing cells, point out the substances that effect his concentration in blood and reveal receptors and their ligands that stimulate or inhibit ghrelin release. Des-acyl ghrelin, although it can’t activate ghrelin receptor, has shown that it has a, for now still speculated, effect on the body. In addition to his most known roles, ghrelin acts to increase blood glucose and gut motility, benefit memory and learning, change sleep/wake cycle, and many more. The organs that are the target of ghrelin are many and here are described changes in functionality of those organs that are most effected. Ghrelin system serves to achieve heathy metabolism and weight homeostasis, and to generally allow survival.

===Anže Jenko:Sprožitev metamorfoze pri vinskih mušicah===
Metamorfoza oz. preobrazba označuje biološki proces, pri katerem v kratkem času pride pri številnih in velikih sprememb in označuje prehod iz mladostniškega v odrasli stadij. Pri vinskih mušicah poteka popolna preobrazba, za katero je značilen stadij bube.Pri vsem tem pa ključno vlogo odigrajo hranila in njihova dostopnost. Ko je ličinki na voljo zadostna količina hranil, se prične biosinteza steroidnih hormonov. Ti so skozi evolucijo v kraljestvu živali prevzeli vlogo nadzornika nad naglimi prehodi v razvoju. Pri procesu metamorfoze odigra ključno vlogo hormon ekdison. Ta deluje na heterodimerni nuklearni receptor, ki je transkripcijski faktor, ki nato preko vpliva na gene in posledične kaskade dogodkov privedejo do celicam specifičnih hormonskih odzivov. Ekdison je glavni levitveni hormon in se v fazi ličinke sintetizira v posebni žlezi (PG), v aktivno obliko 20E pa se preoblikuje šele zatem, ko je bil izločen v hemolimfo.
Kontrolo nad biosintezo E/E20 pa imajo tudi tipični okoliški parametri, kot so prehrana, temperatura in svetloba, informacije o le-teh pa do žleznih celic pride preko nevronov oz. drugih hormonov. Do sedaj so bili pri vinskih mušicah kot nevroni, ki direktni izraščajo v PG poznani le PTTH nevroni. V raziskavi pa so identificirali še podskupino serotoninskih nevronov, ki z različno stopnjo izraščanja v odvisnosti od dostopnosti hranil, posredujejo pri začetku razvoja in zorenja.

BIO2 Seminar 2017

2018-01-13T00:09:35Z

Anže Jenko: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Ines Medved || 12 || Receptorji za vonj v epidermisu || Špela Supej || Lea Knez || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Luka Gregorič || 12 || Pozitivne vloge negativnih regulatorjev || Uroš Prešern || Katja Doberšek || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Daria Latysheva || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2017#Daria_Latysheva:_The_role_of_intrinsically_disordered_proteins_in_signalling_pathways_and_regulation The role of intrinsically disordered proteins in signallng pathways and regulation] || Luka Fratina || Martin Špendl || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Polona Skrt || 12 || Mehanizem zaznavanja okusa maščobe || Andreja Habič || Ajda Galič || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Peter Škrinjar || 12 || Receptorji za okus in njihova povezava z debelostjo || Andrej Race || Nika Zaveršek || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Milica Janković || 12 || Nuklearni receptorji: Karakteristike in regulacija receptorjev ter identifikacija ligandov || Anže Jenko || Nika Goršek || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Tina Turel || 14-15 || Vpliv mikroorganizmov na presnovo glukoze || Ines Medved || Špela Supej || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Barbara Slapnik || 14-15 || Regulacija metabolizma glukoze v celičnih kulturah|| Luka Gregorič || Uroš Prešern || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Ana Maklin || 14-15 || Vloga PGP in PHO13 v metabolizmu || Daria Latysheva || Luka Fratina || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Ajda Krč || 16 || Spremembe v delovanju Krebsovega cikla in sposobnost prilagajanja parazitov na razmere v okolju || Polona Skrt || Andreja Habič || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Urban Hribar || 16 || Metabolizem polariziranih makrofagov || Peter Škrinjar || Andrej Race || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Urška Zagorc || 16 || Salmonela in citratni cikel || Milica Janković || Anže Jenko || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Patrik Levačić || 17 || Ceramidi in njihova povezava z debelostjo || Tina Turel || Ines Medved || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Jerneja Nimac || 17 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2017#Jerneja_Nimac:_Ketonska_telesca_kot_signalni_metaboliti Ketonska telesca kot signalni metaboliti] || Barbara Slapnik || Luka Gregorič || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Lija Srnovršnik || 17 || Hepatična oksidacija maščobnih kislin med stradanjem || Ana Maklin || Daria Latysheva || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Nika Mikulič || 18 || Hiperamoniemija in metode zdravljenja || Ajda Krč || Polona Skrt || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Tanja Zupan || 18 || Presnovne bolezni aminokislin || Urban Hribar || Peter Škrinjar || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Anja Tavčar || 18 || Regulacija imunskega odziva z metabolizmom l-arginina || Urška Zagorc || Milica Janković || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Maja Vrabec || 19 || Poškodbe mitohondrijske DNA in popravljalni mehanizmi || Patrik Levačić || Tina Turel || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Špela Deučman || 19 || Vloga reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) pri celični signalizaciji || Jerneja Nimac || Barbara Slapnik || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Anja Černe || 19 || Vpliv mitohondrijskega stresa na staranje || Lija Srnovršnik || Ana Maklin || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Lea Knez || 20 || Trehaloza-6-fosfat kot signalna molekula v rastlinah || Nika Mikulič || Ajda Krč || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Katja Doberšek || 20 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2017#Katja_Doberšek:_Vpliv_zunajceličnih_dejavnikov_na_sintezo_celuloze_v_rastlinskih_celicah Vpliv zunajceličnih dejavnikov na sintezo celuloze v rastlinskih celicah] || Tanja Zupan || Urban Hribar || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Martin Špendl || 20 || Lektini in prepoznavanje sladkornih podenot || Anja Tavčar || Urška Zagorc || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Ajda Galič || 21 || || Katja Dolenc || Patrik Levačić || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Nika Zaveršek || 21 || Povezava velike depresivne motnje z razmerjem med omega-6 in omega-3 maščobnimi kislinami || Špela Deučman || Jerneja Nimac || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Nika Goršek || 21 || Lipidi v gostiteljski celici ob okužbi z virusom hepatitisa C || Anja Černe || Lija Srnovršnik || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Špela Supej || 22 || Biosinteza rastlinskih alkaloidov || Lea Knez || Katja Dolenc|| 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Uroš Prešern || 22 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2017#Uro.C5.A1_Pre.C5.A1ern:_Ribonukleotid_reduktaza_-_encim.2C_ki_po_vseh_letih_od_odkritja_.C5.A1e_vedno_presene.C4.8Da Ribonukleotid reduktaza: encim, ki po vseh letih od odkritja še vedno preseneča] || Katja Doberšek || Tanja Zupan || 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Luka Fratina || 22 || Industrijska proizvodnja aminokislin || Martin Špendl || Anja Tavčar || 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Andreja Habič || 23 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2017#Andreja_Habi.C4.8D:_Rjavo_ma.C5.A1.C4.8Dobno_tkivo_kot_sekrecijski_organ Rjavo maščobno tkivo kot sekrecijski organ] || Ajda Galič || Maja Vrabec || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Andrej Race || 23 || Ghrelin || Nika Zaveršek || Špela Deučman || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Anže Jenko || 23 || Sprožitev metamorfoze pri vinskih mušicah || Nika Goršek || Anja Černe || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Katja Dolenc || 23 || || Maja Vrabec || Nika Mikulič || 20/01/17 || 22/01/17 || 24/01/17
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2017|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2017 Povzetki seminarjev

2017-03-25T21:05:52Z

Anže Jenko: /* Ana Scott: Naslov seminarja */

[[TBK2017-seminar|Nazaj na osnovno stran]]
===Ana Scott: Naslov seminarja===
Tekst ....

'''Patrik Levaćić: Prehrambni aditivi v sladkarijah ter žvečilnih gumijih lahko spremenijo funkcionanlnost in strukturo prebavnih celic'''

Vnos nano delcev titanovega dioksida (TiO2) preko prehrambenih izdelkov kot so sladkarije ter žvečilni gumiji je praktično nemogoče. Prebavni trakt služi kot pomembna meja med telesom in zunanjim okoljem. Cilj raziskave je bilo opazovanje posledic vnosa 30 nano meterskih delcev titanovega dioksida preko modela celične strukture tankega črevesja ter določitev kako akutna ter kronična izpostavljenost takim delcem lahko vpliva na funkcionalnost in strukturo celice. Postopek prepoznavanja TiO2 delcev je zelo kompleksen, navadno se uporablja Ramanova spektroskopija, ki izkorišča lastnosti molekule kot so vibracijska ter rotacijska stanja, s tem pa dobimo tako imenovani ''finger-print'' molekule, saj ima vsaka molekula svoje lastnosti in se po njih loči od drugih molekul. Rezultati raziskave so potrdili, da čeprav akutna izpostavljenost ni pustila resnejših posledic na celični strukturi, ima kronična izpostavljenost kar nekaj posledic na celičnem nivoju. Spremeni se funkcionalnost celice, nivo delovanja membranskih encimov vpade, spremeni se prav tako tudi struktura, saj se zmanjša sposobnost vsrkavanja nutrientov preko mikrovilov.

'''Tina Turel: Povezanost retrovirusov z razvojem možganov'''

Možgani človeka so bistveno bolj razviti od možganov drugih sesalcev in zato veliko težji za raziskovanje in razumevanje. Številne raziskave so dokazale, da bi transportni elementi (TE-ji), ki so še pred nekaj leti veljali za neuporaben del DNA, tako imenovan »junk DNK«, lahko bili odgovorni za današnjo stopnjo razvitosti človeških možganov.
Retrovirusi so posebna skupina virusov. Nekateri veljajo za škodljive (HIV), drugi pa so povsem neškodljivi. V našem DNA je več kot 1000 različnih retrovirusov. V raziskavi, ki jo je vodil Johan Jakobsson in se je odvijala v Lundu, so dokazovali pomembno vlogo ERV-ja, endogenega retrovirusa v razvoju človeških možganov. Želeli so pokazati, da nekaj tisoč ERV-jev, mnogi so primarno specifični, delujejo kot priklopna podlaga za epigenetske represorsko beljakovino TRIM28, ki vzpostavi lokalni hetero kromatin okoli ERV-jev. Retrovirusi lahko pri vsakem človeku reagirajo drugače, saj so tak tip genetskega materiala, da se lahko nahajajo v katerem koli delu v genomu. Različna izražanja ERV-ja pa bi bila lahko tudi razlog za možganske okvare, ki povzročijo bolezni, kot so ALS, shizofrenija in bipolarna motnja .

'''Nina Mezgec Mrzlikar: Regulacija gena DISC-1 kot potencialnega zdravila za shizofrenijo'''

Shizofrenija je duševna motnja, ki se razvije v zgodnjem odraslem obdobju. DISC-1 (Disrupted-In-Schizophrenia-1) je protein, kodiran z genom DISC-1 in je močno izražen v možganskem hipokampusu. Sodeluje pri razvoju aksonov in povezovanju celic. Caveolin-1 je ogrodni protein bistven pri regulaciji receptorjev na membranah in spodbuja razvoj novih povezav med živčnimi celicami. V tej raziskavi so znanstveniki proučevali vpliv proteina Cav-1 na izražanje gena DISC-1 v živčnih celicah. Ugotovljeno je bilo, da prekomerno izražen gen Cav-1 povzroči večje izražanje gena DISC-1 in drugih sinaptičnih proteinov, ki so potrebni za prenos živčnega signala. V miših, katerim so iz hipokampusa odstranili Cav-1 je posledično prišlo do manjšega izražanja DISC-1 in hkrati drugih sinaptičnih proteinov. Izguba Cav-1 torej zmanjšuje aktivnost sinaps, kar pa je vzrok za številne nevrodegenerativne bolezni, kot je tudi shizofrenija. Ugotovitve kažejo na pomembno vlogo proteina Caveolin-1 v celicah, saj vzdržuje pravilno delovanje receptorjev in s tem prenos živčnega signala.

'''Sonja Gabrijelčič: Ribosomske mutacije spodbujajo razvoj odpornosti proti antibiotikom v okolju z več zdravilnimi učinkovinami'''

Odpornost bakterij na antibiotike je v porastu po vsem svetu. Pojavlja se tako v državah v razvoju, kjer je predvsem posledica nekvalitetnih antibiotikov, kot v najrazvitejših državah sveta, kjer se pojavlja več in več patogenov, ki lahko preživijo v okolju z več zdravilnimi učinkovinami oziroma antibiotiki. Bakterije lahko pridobijo odpornost ali z izmenjavo mobilnih genetskih elementov ali z mutacijo genetskega materiala, ki je že v celici. V raziskavi, ki jo opisuje članek, so raziskovalci želeli opazovati slednje, zato so izmed bakterij, ki so lahko sočasno odporne na več antibiotikov, izbrali Mycobacterium smegmatis, sorodnico bakterije, ki povzroča tuberkulozo, in eno od predstavnic skupine bakterij, pri kateri do izmenjevanja plazmidov praktično ne pride. Klasificirali so tipe mutacij, do katerih je prišlo, in se osredotočili predvsem na mutacije, ki so se zgodile na mestih genoma, kjer se kodirajo proteini, ki so sestavni deli ribosomov. Ugotovili so, da so taki mutanti odporni na antibiotike z različnimi mehanizmi delovanja, ki jim niso bili še nikoli izpostavljeni, na antibiotike širokega spektra in poleg tega tudi na nekatere druge mehanske strese na membrane.

'''Daria Latysheva: Mehanski raztezek sproži hitro delitev epitelijskih celic'''

Mehansko aktivni kanalčki so membranski proteini, ki so neposredno odvisni od sile in pretvarjajo mehanske držljaje v električne oz. biokemijske signale. Piezo1 je mehansko aktiven ionski kanalček, ki spodbuja celično smrt v predelih z visoko gostoto celic. V raziskavi so ugotovili, da kotrolira tudi mitotsko delitev. Raziskali so mehanizem delovanja Piezo1 v procesu celične delitve. Pri nizki gostoti celic oz. kjer so celice raztegnjene se Piezo1 lokalizira na celični membrani ter se odpre; posledično sproži influks kalcija v celico. ERK1 se aktivira zaradi povečane koncentracije Ca2+ ionov, kar vpliva na aktivnost ciklina B v G2 fazi mitotske delitve in povzroči proliferacijo. Način, na kateri Piezo1 aktivira dva nasprotna procesa je odvisen od lokacije in načina aktivacije kanalčka. V predelih z nizko gostoto celic se Piezo1 lokalizira na celični membrani ter hitro aktivira celično delitev. Če so celice razporejene tesno druga ob drugi, se Piezo1 oblikuje v velike citiplazemske agregate in spodbuja celično smrt. Zaradi sposobnosti zaznave mehanskega raztezka ter prevelike in premajhne gostote celic Piezo 1 deluje kot homeostatski senzor in kontrolira število epitelijskih celic.

'''Nika Goršek: Nove študije razkrivajo delovanje molekulske črpalke, ki izloča zdravila proti raku'''

MRP1 ali »Multidrug resistance protein« je protein, ki spada v družino ABC-transporterjev. Pomemben je pri reguliranju redoks homeostaze, vnetij in sekrecije hormonov. Znano je tudi, da ima pomembno vlogo pri odpornosti na zdravila in njihovem črpanju iz celic. V raziskavi na univerzi Rockefeller so z uporabo elektronske kriomikroskopije določili njegovo zgradbo. Sestavljajo ga štirje glavni deli: dva transmembranska dela, ki tvorita telo transporterja, dva dela, ki vežeta ATP, motiv v obliki lase in N-terminalni transmembranski del. Čeprav ima MRP1 dva dela, ki bi lahko vezala ATP, pa tega veže le en, saj pri drugem delu pride do drugačnega zaporedja aminokislin. V raziskavah so dokazali, da mutacije določenih delov proteina vodijo v bolezenska stanja in da bi sprememba le ene aminokisline v zaporedju vplivala na aktivnost proteina. MRP1 ima le eno dvojno vezavno mesto, ki je pozitivno nabito. Pestrost substratov je zaradi takega vezavnega mesta veliko večja, kot pri nekaterih drugih znanih proteinih. Prenaša lahko organske, amfipatične in aninonske molekule, na primer zdravila proti raku, opijate, antidepresive in tudi nekatere za življenje pomembne snovi (hormoni in protivnetne molekule). Ob vezavi substrata se oblika proteina MRP1 spremeni, aktivnost pa se poveča. Po končanem transportu pa protein preide nazaj v prvotno, neaktivno obliko.

'''Dragana Savković: Stopnja preživetja evkariontskih celic po elektroforezni nanoinjekciji'''

Znotrajcelična dostava makromolekul je pomemben korak za terapevtske in raziskovalne namene. Za uvajanje tujih molekul v citoplazmo živih celic uporabljale so se metode, katere so se v večini primerov uporabljale za veliko število celic v kulturi in je splošno znano, da veliko število teh celic (do 50%) ne preživi ta proces. Da bi rešili ta problem, razvili so alternativno metodo znotrajcelične dobave, oziroma znotrajcelično elektroforezno nanoinjekcijo. V raziskavi so primerjali stopnjo preživetja celic injiciranih z pipeto s premerom 100 nm in pipeto s premerom 500 nm. Ugotovili so, da je stopnja preživetja z uporabo 100 nm pipeto veliko večja kot s 500 nm pipeto in tudi da ostale preživele celice kažejo bolj naraven cikel celic.

'''Urška Zagorc: Proteini, zgodnje opozorilo sladkorne bolezni tipa 1'''

Sladkorna bolezen tipa 1, ki je značilna predvsem za otroke in mladostnike, je posledica motnje v imunskem sistemu. Organizem uniči lastne celice v trebušni slinavki, ki proizvajajo inzulin. Ta omogoča glukozi iz hrane vstop v celico, s čimer celica dobi hrano in energijo. V raziskavi nemškega raziskovalnega centra za zdravje in okolje Helmholtz Zentrum München so sodelovali otroci, katerih ožji družinski član ima diabetes tipa 1 in otroci brez dednih dispozicij. Analizirali so krvne vzorce otrok z avto-protitelesi ter jih primerjala z vzorci otrok, ki ne kažejo znakov bolezni niti nimajo protiteles.Identificirali so 41 peptidov iz 26 proteinov, ki se razlikujejo v krvnih vzorcih tistih otrok s protitelesi in tistih brez. Glede na koncentracijo peptidov v treh proteinih (hepatocitni rastni faktor HGF, istem komplementa H in ceruloplazmin) in glede na starost otroka, so dosegli tudi boljšo oceno hitrosti razvoja bolezni. Večja koncentracija sistema komplementa H in hepatocitnega rastnega faktorja ter nižja koncentracija ceruloplazmina pri tem nižji starosti bolnika, pomenijo hitrejši napredek bolezni. Identificirani proteini nam pokažejo bolj natančno oceno stopnje pred pojavom simptomov. Zaradi njih je možno tudi ugotoviti ali ima bolnik s protitelesi, večjo ali manjšo možnost za razvoj sladkorne bolezni tipa 1 in kako hitro se bo bolezen razvila.

'''Anja Černe: Uporaba askorbata pri zdravljenju raka'''

Če askorbat vnesemo v organizem v manjših koncentracijah ima antioksidativne učinke, medtem ko se pri vnosu v večjih koncentracijah obnaša kot prooksidant. Farmakološko koncentriran askorbat povzroča tok izvenceličnega H2O2 v celico in vse celice, tako zdrave kot rakave, encimsko razgrajujejo H2O2, ki je zanje toksičen. Glavni encimi, ki razgrajujejo H2O2 pri velikih količinah so katalaze. Ker pa je katalaz v rakavih celicah malo, so rakave celice bolj dovzetne škodljive učinke, zato je askorbat zanje selektivno toksičen. Katalazna aktivnost v rakavih celicah lahko napove, kako se bo tumor odzval na terapijo z askorbatom. Pri nekaterih vrstah tkiv je rast tumorjev bolj upočasnjena, pri drugih manj (odvisnost od količine katalaz, ki jih tkivo vsebuje). Število aktivnih katalaznih monomerov na celico in ED50 (koločina snovi, ki učinkuje pri 50% osebkih) sta sorazmerna s konstanto celične razgradnje H2O2. Radikali, ki nastanejo pri reakciji med ionom kovine in H2O2, poškodujejo DNA, v kolikšni meri se to zgodi pa je odvisno od količine askorbata.

'''Jerneja Nimac: S CRISPR/Cas9 nad X-vezavno kronično granulomatozno bolezen'''

Kronična granulomatozna bolezen je dedna bolezen imunskega sistema, ki nastane zaradi mutacije v genu CYBB, ki kodira gp91phox. Slednji je katalitični center NADPH oksidaze 2 (NOX2), ki ima pomembno vlogo pri obrambi organizma pred okužbami. Mutacije v genu CYBB na kromosomu Xp21.1 pa so odgovorne za X-vezavno obliko kronične granulomatozne bolezni. Za popravljanje takšne monogenske mutacije so v raziskavi uporabili sistem CRISPR/Cas9. Ta sistem so za obrambo pred virusnimi okužbami razvile bakterije in arheje, gre pa za poseben od RNA odvisen sistem pridobljene imunosti, ki specifično prepozna in reže tujo tarčno DNA. V raziskavi so skušali s sistemom CRISPR/Cas9 popraviti mutacijo C676T na eksonu 7 gena CYBB. Z DHR testi so ugotovili, da s CRISPR/Cas9 popravljene mieloične celice obnovijo aktivnost NOX2 in ponovno izražajo protein gp91phox. S spreminjanjem količine ssODN pa so dokazali, da je stopnja popravljenih genov večja, če je količina ssODN večja, delež indelov pa se zmanjša. Prav tako so potrdili uspešno presaditev s CRISPR/Cas9 popravljenih krvotvornih matičnih in predniških celic in njihovo diferenciacijo v nepoškodovane mieloične in limfocitne celice v NSG miših v obdobju petih mesecev.

'''Barbara Slapnik: Holesterol v celični membrani'''

Holesterol je razporejen po celični membrani. Pomemben je za vzdrževanje membranske fluidnosti, membrano naredi bolj togo in manj prepustno. Njegova porazdelitev med zunanjim in notranjim fosfolipidnim slojem pa ni enakomerna. V raziskavi so razvili dopolnilne senzorje, ki omogočajo vpogled holesterola v obeh slojih sočasno in določili njegovo točno koncentracijo. Ugotovili so, da je koncentracija holesterola v zunanjem sloju celične membrane znatno višja kot koncentracija v notranjem sloju. Visoka koncentracija holesterola v zunanjem sloju celične membrane zmanjša njeno prepustnost, medtem ko nizka koncentracija holesterola v notranjem sloju omogoča celično sporočanje. Rezultati prikazujejo pomen transbilarne asimetrije holesterola v celični membrani in njegovo prerazporeditev za celično homeostazo, rast in razmnoževanje. Podajajo tudi povezavo med holesterolom v notranjem sloju celične membrane in rakom. Določili so točno koncentracijo holesterola, kar jim omogoča boljšo diagnostiko in zdravljenje raka, vendar so za to potrebne še nadaljnje raziskave. Rezultati prav tako predstavljajo osnovo za nadaljnje študije transbilarne dinamike in funkcij holesterola in drugih lipidov v celici.

'''Nadja Škafar: Dostava protitumorskih zdravil s pomočjo makrofagov in biorazgradljivih nanodelcev'''

Nanotehnologija igra pomembno vlogo v moderni medicini, še posebej na področju zdravljenja bolezni s tarčno dostavo zdravil. Glavna prednost nanodostavnih sistemov (NS) pred danes uveljavljenimi metodami zdravljenja raka je selektivna dostava protitumorskih učinkovin tumorskim celicam, kar zmanjša možnost pojava neželenih stranskih učinkov, s tem pa se bolniku omogoči boljša kakovost življenja med in po zdravljenju. Dosedanje raziskave na področju NS so temeljile na injiciranju nanodelcev v krvni obtok. Ker pa ob vnosu nanodelcev v telo prihaja do medsebojnega delovanja NS s celicami imunskega sistema, jih te, še preden lahko nanodelci dostavijo zdravila do željenega mesta, odstranijo s fagocitozo. Raziskovalca Jian Yang in Cheng Dong sta zato s svojo ekipo skušala razviti novo tehniko NS, ki problematiko reakcij med NS in makrofagi v bioloških sistemih odpravi tako, da makrofage uporablja kot nosilce nanodelcev do tumorskih celic. Rezultati so pokazali, da so lahko makrofagi uspešni nosilci nanodelcev ter da bi lahko bili NS takšnega tipa v prihodnosti uspešna metoda za zdravljenje številnih bolezni.

'''Špela Deučman: Raziskovanje vzrokov kronične zavrnitve presajenih pljuč'''

Pri presajenih organih je največja skrb zavrnitev, ki je lahko akutna ali kronična. Pri slednji presadek sčasoma izgubi funkcijo in odmre, kar lahko povzroči smrt prejemnika. Stopnja preživetja presaditve pljuč je nižja od vseh ostalih presaditev organov. Pri 50% pacientov se pojavi obliterantni bronhiolitis oz. BOS, ki je glavni razlog kronične zavrnitve pljuč. Namen raziskave je bil odkriti signalno pot med NFAT1 (transkripcijski faktor), β-cateninom (koregulator transkripcije), ATX (eksoencim) in LPA1 (receptor) oz. LPA (sporočevalec) ter predlagati potencialno terapevtsko vlogo LPA1 antagonistov ter ATX inhibitorjev z namenom, da bi preprečili BOS. Odkrili so pozitivno korelacijo ekspresije med β-cateninom in kolagenom I. Ker LPA prepreči razgradnjo aktivnega β-catenina in ker je za nastanek LPA odgovoren ATX, so raziskali mehanizme reguliranja ekspresije ATX. Ugotovili so, da ekspresijo ATX regulira transkripcijski faktor NFAT1. Znano je, da LPA povečuje znotrajcelično koncentracijo prostih Ca2+ ionov, ti pa so povezani z aktivacijo in jedrsko translokacijo NFAT1. To pomeni, da LPA regulira ekspresijo NFAT1 in posledično tudi ATX. Pri raziskovanju na miših so uporabili LPA1 antagoniste in ATX inhibitorje, ki so vidno zmanjšali napredek BOS.

'''Anže Jenko: Koriščenje kemiluminiscence dioksietanovih sond za prikazovanje celice'''

Kemiluminiscenčne sonde veljajo za eno izmed najbolj občutljivih diagnostičnih metod pri določanju encimske aktivnosti in koncentracije analita, kar v praktičnem življenju denimo koristi forenzikom. Ker pa je splošno uveljavljen princip koriščenje kemiluminiscence slabo dodelan in privede do velikih energetskih izgub. Raziskovalci so tako v sami raziskavi preizkušali kemiluminiscenčne in fluorescenčne lastnosti različnih derivatov Schaapovega adamatiliden-dioksetana, na katerega so vezali različne substituente, ki pa so imeli znaten vpliv. Na ta način so želeli ustvariti enokomponentni sistem, z visoko intenziteto izseva, ki pa je tudi primeren v fizioloških razmerah. To jim je na koncu tudi uspelo. Na najbolj ustrezni izmed sintetiziranih sond, so hidroksilno skupino na benzenovem obroču ''zamaskirali'' z drugačnimi zaščitnimi skupinami. Vsaka izmed teh skupin pa je bila občutljiva na različne molekule (denimo beta-galaktoza na encim beta-galaktozidaza), reakcija s katerimi je povzročila destabilizacijo - vzbujeno stanje sonde in posledično kemiluminiscenco. Ta mehanizem je pokazal visoko mero selektivnosti, zato so ga lahko praktično koristili pri mikroskopskem prikazovanju celic. Pri celicah z genom za prekomerno izražanje beta-galaktozidaze je z uporabo relavantne sonde (ustrezna zaščitna skupina) prišlo do obarvanja, pri takšni, kjer pa tega encima ni bilo prisotnega, pa do obarvanja ni prišlo.

TBK2017 Povzetki seminarjev

2017-03-25T20:53:57Z

Anže Jenko: /* Ana Scott: Naslov seminarja */

TBK2017-seminar

2017-03-14T23:25:36Z

Anže Jenko: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||12.12.||12.12.||12.12.||r1||r2||r3
|-
| Nina Mezgec Mrzlikar || Regulacija gena DISC-1 kot potencialnega zdravila za shizofrenijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170105144339.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar || Emilija Bogatinova
|-
| Tina Turel || Povezanost retrovirusov z razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170112110840.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Katja Doberšek || Uroš Prešern || Nika Zaveršek
|-
| Sonja Gabrijelčič || Ribosomske mutacije spodbujajo razvoj odpornosti proti antibiotikom v okolju z več zdravilnimi učinkovinami ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170221110808.htm https://elifesciences.org/content/6/e20420 || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Mariša Cvitanič || Špela Supej || Tanja Zupan
|-
| Patrik Levačić || Prehrambni aditivi v sladkarijah ter žvečilnih gumijih lahko spremenijo funkcionalnost in strukturo prebavnih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170217012450.htm|| 28.02. || 03.03. || 06.03. || Ajda Krč || Lea Knez || Andrej Race
|-
| Nika Goršek ||Nove študije razkrivajo delovanje molekulske črpalke, ki izloča zdravila proti raku || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170224160629.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Adela Šajn || Maja Jankovič || Urška Košir
|-
| Dragana Savković || Stopnja preživetja evkariotskih celic po elektroforezni nano-injekciji || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301105437.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Milica Janković || Luka Fratina || Martin Špendl
|-
| Hana Hiršman || || || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Ajda Godec || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik
|-
| Daria Latysheva || Mehanski raztezek sproži hitro delitev epitelijskih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170215131543.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Andreja Habič || Maja Vrabec || Ines Medved
|-
| Urška Zagorc || Proteini, zgodnje opozorilo sladkorne bolezni tipa 1 || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/11/161107112428.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar
|-
| Anja Černe || Učinek farmakološkega askorbata na rakave celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170109134014.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Tina Turel || Katja Doberšek || Uroš Prešern
|-
| Barbara Slapnik ||Holesterol v celični membrani || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170117163039.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič || Špela Supej
|-
| Jerneja Nimac || S CRISPR/Cas9 nad x-vezavno obliko kronične granulomatozne bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170112110734.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Patrik Levačić || Ajda Krč || Lea Knez
|-
| Gašper Anton Komatar || || || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Nika Goršek || Adela Šajn || Maja Jankovič
|-
| Nadja Škafar || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170104154408.htm|| 21.03. || 24.03. || 27.03. || Dragana Savković || Milica Janković || Luka Fratina
|-
| Anže Jenko || Koriščenje kemiluminiscence dioksietanovih sond za prikazovanje celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170308081051.htm || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Hana Hiršman || Ajda Godec || Anja Tavčar
|-
| Špela Deučman || Raziskovanje vzrokov kronične zavrnitve presajenih pljuč || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301105426.htm || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Daria Latysheva || Andreja Habič || Maja Vrabec
|-
| Luka Gregorič || Merjenje količine urina v plavalnih bazenih s pomočjo merjenja koncentracije umetnih sladil || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301084913.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski
|-
| Jana Kotnik || || || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Anja Černe || Tina Turel || Katja Doberšek
|-
| Andrej Špenko || Nova tehnika za boljšo regeneracijo kostnega tkiva || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/12/161220093946.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič
|-
| Ana Maklin || || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170313102420.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Jerneja Nimac || Patrik Levačić || Ajda Krč
|-
| Emilija Bogatinova ||NO3-anioni lahko delujejo kot Lewisovo kislino v tvrdnem stanju || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170222131802.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek || Adela Šajn
|-
| Nika Zaveršek || Bakterije lahko s pomočjo posebnih sintetičnih molekul spremenimo v električne generatorje || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170209133509.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Nadja Škafar || Dragana Savković || Milica Janković
|-
| Tanja Zupan || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2016/12/161214151637.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Anže Jenko || Hana Hiršman || Ajda Godec
|-
| Andrej Race || || || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Špela Deučman || Daria Latysheva || Andreja Habič
|-
| Urška Košir || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Luka Gregorič || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar
|-
| Martin Špendl || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Jana Kotnik || Anja Černe || Tina Turel
|-
| Nika Mikulič Vernik || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Andrej Špenko || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič
|-
| Ines Medved ||Kako lahko z zmanjšanim vnosom hrane upočasnimo proces staranja ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170213151306.htm || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Ana Maklin || Jerneja Nimac || Patrik Levačić
|-
| Urban Hribar || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek
|-
| Uroš Prešern || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Nika Zaveršek || Nadja Škafar || Dragana Savković
|-
| Špela Supej || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170223114801.htm || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Tanja Zupan || Anže Jenko || Hana Hiršman
|-
| Lea Knez || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170217012518.htm || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Andrej Race || Špela Deučman || Daria Latysheva
|-
| Maja Jankovič || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Urška Košir || Luka Gregorič || Urška Zagorc
|-
| Luka Fratina || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Martin Špendl || Jana Kotnik || Anja Černe
|-
| Anja Tavčar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170302143951.htm || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko || Barbara Slapnik
|-
| Maja Vrabec || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Ines Medved || Ana Maklin || Jerneja Nimac
|-
| Vesna Dimitrovski || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Urban Hribar || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar
|-
| Katja Doberšek || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170213083810.htm || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Uroš Prešern || Nika Zaveršek || Nadja Škafar
|-
| Mariša Cvitanič || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Špela Supej || Tanja Zupan || Anže Jenko
|-
| Ajda Krč || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Lea Knez || Andrej Race || Špela Deučman
|-
| Adela Šajn || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Jankovič || Urška Košir || Luka Gregorič
|-
| Milica Janković || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Luka Fratina || Martin Špendl || Jana Kotnik
|-
| Ajda Godec || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko
|-
| Andreja Habič || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Vrabec || Ines Medved || Ana Maklin
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete v PubMed povezavi [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ tukaj]
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2017_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2017_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2017_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2017_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2017_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).'''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2017-seminar

2017-03-14T23:13:38Z

Anže Jenko: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||12.12.||12.12.||12.12.||r1||r2||r3
|-
| Nina Mezgec Mrzlikar || Regulacija gena DISC-1 kot potencialnega zdravila za shizofrenijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170105144339.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar || Emilija Bogatinova
|-
| Tina Turel || Povezanost retrovirusov z razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170112110840.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Katja Doberšek || Uroš Prešern || Nika Zaveršek
|-
| Sonja Gabrijelčič || Ribosomske mutacije spodbujajo razvoj odpornosti proti antibiotikom v okolju z več zdravilnimi učinkovinami ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170221110808.htm https://elifesciences.org/content/6/e20420 || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Mariša Cvitanič || Špela Supej || Tanja Zupan
|-
| Patrik Levačić || Prehrambni aditivi v sladkarijah ter žvečilnih gumijih lahko spremenijo funkcionalnost in strukturo prebavnih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170217012450.htm|| 28.02. || 03.03. || 06.03. || Ajda Krč || Lea Knez || Andrej Race
|-
| Nika Goršek ||Nove študije razkrivajo delovanje molekulske črpalke, ki izloča zdravila proti raku || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170224160629.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Adela Šajn || Maja Jankovič || Urška Košir
|-
| Dragana Savković || Stopnja preživetja evkariotskih celic po elektroforezni nano-injekciji || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301105437.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Milica Janković || Luka Fratina || Martin Špendl
|-
| Hana Hiršman || || || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Ajda Godec || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik
|-
| Daria Latysheva || Mehanski raztezek sproži hitro delitev epitelijskih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170215131543.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Andreja Habič || Maja Vrabec || Ines Medved
|-
| Urška Zagorc || Proteini, zgodnje opozorilo sladkorne bolezni tipa 1 || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/11/161107112428.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar
|-
| Anja Černe || Učinek farmakološkega askorbata na rakave celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170109134014.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Tina Turel || Katja Doberšek || Uroš Prešern
|-
| Barbara Slapnik ||Holesterol v celični membrani || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170117163039.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič || Špela Supej
|-
| Jerneja Nimac || S CRISPR/Cas9 nad x-vezavno obliko kronične granulomatozne bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170112110734.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Patrik Levačić || Ajda Krč || Lea Knez
|-
| Gašper Anton Komatar || || || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Nika Goršek || Adela Šajn || Maja Jankovič
|-
| Nadja Škafar || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170104154408.htm|| 21.03. || 24.03. || 27.03. || Dragana Savković || Milica Janković || Luka Fratina
|-
| Anže Jenko || || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170308081051.htm || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Hana Hiršman || Ajda Godec || Anja Tavčar
|-
| Špela Deučman || Raziskovanje vzrokov kronične zavrnitve presajenih pljuč || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301105426.htm || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Daria Latysheva || Andreja Habič || Maja Vrabec
|-
| Luka Gregorič || Merjenje količine urina v plavalnih bazenih s pomočjo merjenja koncentracije umetnih sladil || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301084913.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski
|-
| Jana Kotnik || || || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Anja Černe || Tina Turel || Katja Doberšek
|-
| Andrej Špenko || Nova tehnika za boljšo regeneracijo kostnega tkiva || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/12/161220093946.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič
|-
| Ana Maklin || || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170313102420.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Jerneja Nimac || Patrik Levačić || Ajda Krč
|-
| Emilija Bogatinova ||NO3-anioni lahko delujejo kot Lewisovo kislino v tvrdnem stanju || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170222131802.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek || Adela Šajn
|-
| Nika Zaveršek || Bakterije lahko s pomočjo posebnih sintetičnih molekul spremenimo v električne generatorje || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170209133509.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Nadja Škafar || Dragana Savković || Milica Janković
|-
| Tanja Zupan || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2016/12/161214151637.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Anže Jenko || Hana Hiršman || Ajda Godec
|-
| Andrej Race || || || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Špela Deučman || Daria Latysheva || Andreja Habič
|-
| Urška Košir || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Luka Gregorič || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar
|-
| Martin Špendl || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Jana Kotnik || Anja Černe || Tina Turel
|-
| Nika Mikulič Vernik || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Andrej Špenko || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič
|-
| Ines Medved ||Kako lahko z zmanjšanim vnosom hrane upočasnimo proces staranja ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170213151306.htm || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Ana Maklin || Jerneja Nimac || Patrik Levačić
|-
| Urban Hribar || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek
|-
| Uroš Prešern || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Nika Zaveršek || Nadja Škafar || Dragana Savković
|-
| Špela Supej || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170223114801.htm || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Tanja Zupan || Anže Jenko || Hana Hiršman
|-
| Lea Knez || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170217012518.htm || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Andrej Race || Špela Deučman || Daria Latysheva
|-
| Maja Jankovič || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Urška Košir || Luka Gregorič || Urška Zagorc
|-
| Luka Fratina || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Martin Špendl || Jana Kotnik || Anja Černe
|-
| Anja Tavčar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170302143951.htm || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko || Barbara Slapnik
|-
| Maja Vrabec || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Ines Medved || Ana Maklin || Jerneja Nimac
|-
| Vesna Dimitrovski || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Urban Hribar || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar
|-
| Katja Doberšek || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170213083810.htm || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Uroš Prešern || Nika Zaveršek || Nadja Škafar
|-
| Mariša Cvitanič || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Špela Supej || Tanja Zupan || Anže Jenko
|-
| Ajda Krč || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Lea Knez || Andrej Race || Špela Deučman
|-
| Adela Šajn || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Jankovič || Urška Košir || Luka Gregorič
|-
| Milica Janković || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Luka Fratina || Martin Špendl || Jana Kotnik
|-
| Ajda Godec || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko
|-
| Andreja Habič || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Vrabec || Ines Medved || Ana Maklin
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete v PubMed povezavi [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ tukaj]
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2017_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2017_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2017_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2017_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2017_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).'''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.