https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=Ana+Poto%C4%8Dnik 2026-07-01T09:45:13Z User contributions MediaWiki 1.45.3 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana&diff=20716 2022-05-02T22:24:43Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je s projektom PHEAST sodelovala na tekmovanju iGEM leta 2021 in se uvrstila med deset najboljših ekip.<br /> <br /> Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:DTU-Denmark<br /> <br /> Avtorica povzetka: Ana Potočnik<br /> <br /> <br /> == Problem ==<br /> <br /> Metan (CH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;) je toplogredni plin, katerega masni delež v ozračju je 0,0001 %. Industrija in kmetijstvo vsako leto v ozračje izpustita 570 milijonov ton metana. Njegov toplogredni učinek je tridesetkrat večji kot toplogredni učinek ogljikovega dioksida, zato je eden izmed ciljev trajnostnega razvoja tudi zmanjšanje izpustov metana oziroma razvoj metod, ki bi omogočale omilitev negativnih posledic izpustov. Trenutno je največji poudarek na zmanjšanju izpustov metana s spreminjanjem hrane živine, prav tako pa so tudi že aktualne strategije, ki temeljijo na odstranjevanju že izpuščenega metana. Mednje spadajo recikliranje in kompostiranje odpadkov, zajemanje metana ter sežiganje. Glavna vrednost metana je vir energije, ampak je zajemanje in sežiganje metana dražje v primerjavi z drugimi viri energije. Poleg tega se pri sežiganju sprošča ogljikov dioksid, ki je prav tako toplogredni plin. Jasno je, da doslej uporabljane metode bistveno ne zmanjšajo ravni izpustov metana, zato je potreba po učinkovitih strategijah za odstranjevanje metana iz atmosfere velika. Kot odgovor na okoljski stres so se že razvili organizmi, ki lahko preživijo v okoljih, bogatih z metanom. Najpogosteje jih najdemo na riževih poljih, v blatu, prsti ali na odlagališčih smeti. Največji pomen za spopadanje z okoljsko krizo imajo metanotrofne (metanofilne) bakterije. Ena izmed njih je gramnegativna bakterija ''Methylococcus capsulatus'', ki metan uporablja kot vir ogljika in ga pretvarja v metanol. Doslej niso našli višjih organizmov, ki bi lahko presnavljali metan, so pa odkrili seve kvasovk, ki so razvile učinkovite mehanizme za prevzem in pretvorbo metanola v biomaso in energijo na podlagi metabolnih poti, podobnih ''M. capsulatus'' [1, 2].<br /> <br /> == Cilj ==<br /> <br /> Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je v prej opisanem problemu videla možnost za razvoj seva kvasovk, ki bi metan lahko prevzemal iz okolja, ga presnavljal in s tem uporabljal kok vir ogljika. Za to nalogo so si izbrali kvasovko ''Komagataella phaffii'' (''Pichia pastoris''). ''K. phaffii'' je metilotrof, ki kot vir ogljika in energije uporablja metanol, prav tako pa je eden izmed organizmov, ki ga uporabljamo za industrijsko proizvodnjo proteinov. Njihova ideja je bila vključiti kompleks pMMO (''angl. particular methane monooxygeanse'') iz ''M. capsulatus'', ki pretvarja metan v metanol, ki ga ''K. phaffii'' lahko s pomočjo nativnih metabolnih poti uporabi kot vir ogljika in energije. Glavni cilj v okviru te ideje pa je bil razvoj javno dostopnih orodij za urejanje genoma ''K. phaffii'' za namen odstranjevanja metana. Doslej ta orodja v registru iGEM niso bila dostopna in kljub veliki razširjenosti ''K. phaffii'' v industriji je bil delež biokock v registru za ''K. phaffii'' (in ''P. pastoris'') manj kot 1 %.<br /> <br /> == Načrt in izvedba ==<br /> <br /> Za delecijo in integracijo genov v genom ''K. phaffii'' je skupina razvila sisteme CRISPR/Cas9 z uporabo orodij molekulskega kloniranja, tehnologije DNA in sintezne biologije. <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Izbrali so sev ''K. phaffii'' GS115 Δku70, ki nima gena ''ku70'', zaradi česar v celici ne more prihajati do spajanja nehomolognih koncev (NHEJ). Zaradi tega je celica za popravljanje dvoverižnih prelomov na DNA prisiljena uporabiti popravljanje s homologno rekombinacijo (HDR). To omogoči lažjo integracijo genov v genom ''K. phaffii'' [3]. <br /> <br /> === Orodje za delecijo in kromosomsko integracijo ===<br /> <br /> Za delecijo in integracijo so razvili sisteme CRISPR/Cas9. Glavni razlog za uporabo CRISPR/Cas9 sistemov je ta, da je tarčenje DNA z RNA bolj tehnično enostavno in časovno izvedljivo kot tarčenje DNA s proteinom. Najprej so na genomu v nekodirajočih regijah poiskali nevtralna integracijska mesta, dolga 500–2000 bp, ki so bila dovolj dostopna endonukleazi Cas9 (niso na telomerah). Na vsakem izmed štirih kromosomov so izbrali eno integracijsko mesto. Nato so po strogih kriterijih načrtovali 4 sgRNA, vsako za eno integracijsko mesto. Zapise za izbrane sgRNA in Cas9 so nato vnesli v vektorje. Vektorji so vsebovali še mesto ori, zapis za rezistenco proti ampicilinu, marker za kvasovke in GAP1. Za pripravo vektorjev so uporabili kloniranje in fuzijo USER (''angl. Uracil-Specific Excision Reagent''), ki omogoča direktno vstavljanje vključkov v kompatibilne vektorje USER s pomočjo zarezovalnega encima. Vektorje so nato klonirali v kompetentnih celicah ''E. coli'' DH5α. Učinkovitost tarčenja z različnimi sgRNA so testirali z metodo TAPE, kjer so pričakovali, da ima sev GS115 Δku70 nižjo viabilnost kot sev GS115 [4]. Ko so izbrali najbolj primerne sgRNA, so s pomočjo sistemov CRISPR/Cas9 lahko izbili določene gene, celice pa so kotransformirali z matrico, ki vsebuje dve 45 bp dolgi homologni zaporedji, ki se nahajata navzgor in navzdol od izbitega gena, in sodeluje pri popravljanju s homologno rekombinacijo. Gene so lahko tudi vstavili, če so celice kotransformirali z drugo matrico, ki prav tako vsebuje dve homologni zaporedji in med njima še zapis za promotor, želeni gen in terminator, kar omogoča vstavljanje gena na mesto, kjer je bil uveden dvoverižni prelom DNA s Cas9 [5].<br /> <br /> === Razvoj metanotrofnih kvasovk ===<br /> <br /> Geni, ki so jih vnesli v sev ''K. phaffii'' GS115, zapisujejo za kompleks pMMO, ki ga sestavljajo tri podenote PmoA, PmoB in PmoC. To so prokariontski geni, ki izhajajo iz metanotrofne gramnegativne bakterije ''M. capsulatus''. Za optimalno izražanje genov v ''K. phaffii'' so izvedli optimizacijo kodona. Za delovanje kompleksa pMMO se morajo vse tri podenote transportirati do membrane in tam pravilno povezati v nonamer (3α3β3γ). Kompleks se nahaja v celični membrani in omogoča najprej oksidacijo metana do metanola in nato še prenos metanola v celico [6]. Želeli so, da se podenote pMMO izražajo konstitutivno, da bi se metan lahko ob prisotnosti v mediju takoj pretvarjal. Načrtovali so matrice za popravljanje dvoverižnih prelomov, ki so vsebovale zapise za podenote pMMO in močne konstitutivne promotorje GAP1 in TEF1. V zapis so vključili tudi signalni peptid, ki je izhajal iz glikoziltransferaze ''K. phaffii'', ki je membranski protein. Lokalizacijo kompleksa so preverili z metodo DeepLoc. Za vnos genov so uporabili prej opisan sistem CRISPR/Cas9. Za preverjanje uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice so v genomu K. phaffii izbili neesencialne gene, ki so bili vključeni v nativnem metabolizmu metanola [7].<br /> <br /> == Rezultati ==<br /> <br /> V okviru projekta PHEAST so uspešno pripravili več različnih plazmidov CRISPR/Cas9 za usmerjeno urejanje genoma ''K. phaffii'' na različnih kromosomih. S temi plazmidi je omogočena delecija genov brez »brazgotin« ali stabilna integracija genov. Vrednotenje dela so razdelili na tri dele, in sicer najprej zasnovo sistemov CRISPR/Cas9, nato uporabo sistemov CRISPR/Cas9 za delecijo genov in nazadnje še integracijo genov v ''K. phaffii'' GS115. Uspešno so zasnovali sgRNA, ki ciljajo intergenske regije na štirih kromosomih, kar bi lahko v prihodnosti uporabili za urejanje genoma ''K. phaffii''. Z delecijo neesencialnih genov, vključenih v metabolizem metanola do formaldehida, so želeli pokazati, da ti geni rast le upočasnijo in ne povsem ustavijo. Prav tako jim je delecija teh genov služila pri preverjanju uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice. Pokazali so tudi, da je integracija v genom ''K. phaffii'' možna, čeprav jim ni uspelo vstaviti točno želene popravljalne matrice. <br /> <br /> == Uvedba v industriji ==<br /> <br /> ''K. phaffii'' je že industrijsko uveljavljen organizem za proizvodnjo rekombinantnih proteinov. Z uvedbo genov za kompleks pMMO bi ''K. phaffii'' postala metanotrofna in bi zato lahko predstavljala potencialen način odstranjevanja metana iz okolja. Metanotrofen sev ''K. phaffii'' bi gojili v fermentorju, do kamor bi transportirali metan. Razlog za to je evropska regulativa o GSO, ki narekuje, naj delo z GSO poteka v kontroliranem in zaprtem okolju. Zato se velik delež dela v prihodnosti usmerja v to, kako razviti učinkovito odstranjevanje metana, ki ne potrebuje GSO, da se bo to lahko izvajalo direktno na želenem mestu. Do takrat pa je najprej potreben zajem metana, po katerem bi se ta transportiral do fermentorja. Svojim strankam bi skupina ponudila tudi proizvajanje želenega proteina, ki bi ga ''K. phaffii'' proizvajala. Dodatno oviro predstavlja tudi slaba topnost metana v vodi, ampak naj bi element trajnostnega razvoja odtehtal slabši izkoristek. Skupina s svojim projektom cilja predvsem na kmetijstvo, saj bi stranke v sproščenem metanu lahko našle vrednost s pomočjo te proizvodne platforme, ki bi omogočala odstranjevanje metana in proizvodnjo proteinov kot hranil za živino. Projekt pa bi bil lahko pomemben tudi za oljno in premogovno industrijo, kjer je metan eden glavnih stranskih produktov.<br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> [1] S. Guerrero-Cruz, A. Vaksmaa, M. A. Horn, H. Niemann, M. Pijuan, A. Ho: Methanotrophs: Discoveries, Environmental Relevance, and a Perspective on Current and Future Applications. Front. Microbiol. 2021, 12.<br /> <br /> [2] H. J. Kim, J. Huh, Y. W. Kwon, D. Park, Y. Yu, Y. E. Jang, B. R. Lee, E. Jo, E. J. Lee, Y. Heo, et al.: Biological Conversion of Methane to Methanol through Genetic Reassembly of Native Catalytic Domains. Nat. Catal. 2019, 2, 342–353.<br /> <br /> [3] L. Bernauer, A. Radkohl, L. G. K. Lehmayer, A. Emmerstorfer-Augustin: Komagataella Phaffii as Emerging Model Organism in Fundamental Research. Front. Microbiol. 2021, 11.<br /> <br /> [4] L. Näätsaari, B. Mistlberger, C. Ruth, T. Hajek, F. S. Hartner, A. Glieder: Deletion of the Pichia Pastoris KU70 Homologue Facilitates Platform Strain Generation for Gene Expression and Synthetic Biology. PLoS One 2012, 7.<br /> <br /> [5] Q. Liu, X. Shi, L. Song, H. Liu, X. Zhou, Q. Wang, Y. Zhang, M. Cai: CRISPR-Cas9-Mediated Genomic Multiloci Integration in Pichia Pastoris. Microb. Cell Fact. 2019, 18.<br /> <br /> [6] M. Karbalaei, S. A. Rezaee, H. Farsiani: Pichia Pastoris: A Highly Successful Expression System for Optimal Synthesis of Heterologous Proteins. J. Cell. Physiol. 2020, 235, 5867–5881.<br /> <br /> [7] F. W. Krainer, C. Dietzsch, T. Hajek, C. Herwig, O. Spadiut, A. Glieder: Recombinant Protein Expression in Pichia Pastoris Strains with an Engineered Methanol Utilization Pathway. Microb. Cell Fact. 2012, 11.</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana&diff=20715 2022-05-02T22:23:33Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je s projektom PHEAST sodelovala na tekmovanju iGEM leta 2021 in se uvrstila med deset najboljših ekip.<br /> <br /> Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:DTU-Denmark<br /> <br /> Avtorica povzetka: Ana Potočnik<br /> <br /> <br /> == Problem ==<br /> <br /> Metan (CH&lt;sub&gt;4) je toplogredni plin, katerega masni delež v ozračju je 0,0001 %. Industrija in kmetijstvo vsako leto v ozračje izpustita 570 milijonov ton metana. Njegov toplogredni učinek je tridesetkrat večji kot toplogredni učinek ogljikovega dioksida, zato je eden izmed ciljev trajnostnega razvoja tudi zmanjšanje izpustov metana oziroma razvoj metod, ki bi omogočale omilitev negativnih posledic izpustov. Trenutno je največji poudarek na zmanjšanju izpustov metana s spreminjanjem hrane živine, prav tako pa so tudi že aktualne strategije, ki temeljijo na odstranjevanju že izpuščenega metana. Mednje spadajo recikliranje in kompostiranje odpadkov, zajemanje metana ter sežiganje. Glavna vrednost metana je vir energije, ampak je zajemanje in sežiganje metana dražje v primerjavi z drugimi viri energije. Poleg tega se pri sežiganju sprošča ogljikov dioksid, ki je prav tako toplogredni plin. Jasno je, da doslej uporabljane metode bistveno ne zmanjšajo ravni izpustov metana, zato je potreba po učinkovitih strategijah za odstranjevanje metana iz atmosfere velika. Kot odgovor na okoljski stres so se že razvili organizmi, ki lahko preživijo v okoljih, bogatih z metanom. Najpogosteje jih najdemo na riževih poljih, v blatu, prsti ali na odlagališčih smeti. Največji pomen za spopadanje z okoljsko krizo imajo metanotrofne (metanofilne) bakterije. Ena izmed njih je gramnegativna bakterija ''Methylococcus capsulatus'', ki metan uporablja kot vir ogljika in ga pretvarja v metanol. Doslej niso našli višjih organizmov, ki bi lahko presnavljali metan, so pa odkrili seve kvasovk, ki so razvile učinkovite mehanizme za prevzem in pretvorbo metanola v biomaso in energijo na podlagi metabolnih poti, podobnih ''M. capsulatus'' [1, 2].<br /> <br /> == Cilj ==<br /> <br /> Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je v prej opisanem problemu videla možnost za razvoj seva kvasovk, ki bi metan lahko prevzemal iz okolja, ga presnavljal in s tem uporabljal kok vir ogljika. Za to nalogo so si izbrali kvasovko ''Komagataella phaffii'' (''Pichia pastoris''). ''K. phaffii'' je metilotrof, ki kot vir ogljika in energije uporablja metanol, prav tako pa je eden izmed organizmov, ki ga uporabljamo za industrijsko proizvodnjo proteinov. Njihova ideja je bila vključiti kompleks pMMO (''angl. particular methane monooxygeanse'') iz ''M. capsulatus'', ki pretvarja metan v metanol, ki ga ''K. phaffii'' lahko s pomočjo nativnih metabolnih poti uporabi kot vir ogljika in energije. Glavni cilj v okviru te ideje pa je bil razvoj javno dostopnih orodij za urejanje genoma ''K. phaffii'' za namen odstranjevanja metana. Doslej ta orodja v registru iGEM niso bila dostopna in kljub veliki razširjenosti ''K. phaffii'' v industriji je bil delež biokock v registru za ''K. phaffii'' (in ''P. pastoris'') manj kot 1 %.<br /> <br /> == Načrt in izvedba ==<br /> <br /> Za delecijo in integracijo genov v genom ''K. phaffii'' je skupina razvila sisteme CRISPR/Cas9 z uporabo orodij molekulskega kloniranja, tehnologije DNA in sintezne biologije. <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Izbrali so sev ''K. phaffii'' GS115 Δku70, ki nima gena ''ku70'', zaradi česar v celici ne more prihajati do spajanja nehomolognih koncev (NHEJ). Zaradi tega je celica za popravljanje dvoverižnih prelomov na DNA prisiljena uporabiti popravljanje s homologno rekombinacijo (HDR). To omogoči lažjo integracijo genov v genom ''K. phaffii'' [3]. <br /> <br /> === Orodje za delecijo in kromosomsko integracijo ===<br /> <br /> Za delecijo in integracijo so razvili sisteme CRISPR/Cas9. Glavni razlog za uporabo CRISPR/Cas9 sistemov je ta, da je tarčenje DNA z RNA bolj tehnično enostavno in časovno izvedljivo kot tarčenje DNA s proteinom. Najprej so na genomu v nekodirajočih regijah poiskali nevtralna integracijska mesta, dolga 500–2000 bp, ki so bila dovolj dostopna endonukleazi Cas9 (niso na telomerah). Na vsakem izmed štirih kromosomov so izbrali eno integracijsko mesto. Nato so po strogih kriterijih načrtovali 4 sgRNA, vsako za eno integracijsko mesto. Zapise za izbrane sgRNA in Cas9 so nato vnesli v vektorje. Vektorji so vsebovali še mesto ori, zapis za rezistenco proti ampicilinu, marker za kvasovke in GAP1. Za pripravo vektorjev so uporabili kloniranje in fuzijo USER (''angl. Uracil-Specific Excision Reagent''), ki omogoča direktno vstavljanje vključkov v kompatibilne vektorje USER s pomočjo zarezovalnega encima. Vektorje so nato klonirali v kompetentnih celicah ''E. coli'' DH5α. Učinkovitost tarčenja z različnimi sgRNA so testirali z metodo TAPE, kjer so pričakovali, da ima sev GS115 Δku70 nižjo viabilnost kot sev GS115 [4]. Ko so izbrali najbolj primerne sgRNA, so s pomočjo sistemov CRISPR/Cas9 lahko izbili določene gene, celice pa so kotransformirali z matrico, ki vsebuje dve 45 bp dolgi homologni zaporedji, ki se nahajata navzgor in navzdol od izbitega gena, in sodeluje pri popravljanju s homologno rekombinacijo. Gene so lahko tudi vstavili, če so celice kotransformirali z drugo matrico, ki prav tako vsebuje dve homologni zaporedji in med njima še zapis za promotor, želeni gen in terminator, kar omogoča vstavljanje gena na mesto, kjer je bil uveden dvoverižni prelom DNA s Cas9 [5].<br /> <br /> === Razvoj metanotrofnih kvasovk ===<br /> <br /> Geni, ki so jih vnesli v sev ''K. phaffii'' GS115, zapisujejo za kompleks pMMO, ki ga sestavljajo tri podenote PmoA, PmoB in PmoC. To so prokariontski geni, ki izhajajo iz metanotrofne gramnegativne bakterije ''M. capsulatus''. Za optimalno izražanje genov v ''K. phaffii'' so izvedli optimizacijo kodona. Za delovanje kompleksa pMMO se morajo vse tri podenote transportirati do membrane in tam pravilno povezati v nonamer (3α3β3γ). Kompleks se nahaja v celični membrani in omogoča najprej oksidacijo metana do metanola in nato še prenos metanola v celico [6]. Želeli so, da se podenote pMMO izražajo konstitutivno, da bi se metan lahko ob prisotnosti v mediju takoj pretvarjal. Načrtovali so matrice za popravljanje dvoverižnih prelomov, ki so vsebovale zapise za podenote pMMO in močne konstitutivne promotorje GAP1 in TEF1. V zapis so vključili tudi signalni peptid, ki je izhajal iz glikoziltransferaze ''K. phaffii'', ki je membranski protein. Lokalizacijo kompleksa so preverili z metodo DeepLoc. Za vnos genov so uporabili prej opisan sistem CRISPR/Cas9. Za preverjanje uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice so v genomu K. phaffii izbili neesencialne gene, ki so bili vključeni v nativnem metabolizmu metanola [7].<br /> <br /> == Rezultati ==<br /> <br /> V okviru projekta PHEAST so uspešno pripravili več različnih plazmidov CRISPR/Cas9 za usmerjeno urejanje genoma ''K. phaffii'' na različnih kromosomih. S temi plazmidi je omogočena delecija genov brez »brazgotin« ali stabilna integracija genov. Vrednotenje dela so razdelili na tri dele, in sicer najprej zasnovo sistemov CRISPR/Cas9, nato uporabo sistemov CRISPR/Cas9 za delecijo genov in nazadnje še integracijo genov v ''K. phaffii'' GS115. Uspešno so zasnovali sgRNA, ki ciljajo intergenske regije na štirih kromosomih, kar bi lahko v prihodnosti uporabili za urejanje genoma ''K. phaffii''. Z delecijo neesencialnih genov, vključenih v metabolizem metanola do formaldehida, so želeli pokazati, da ti geni rast le upočasnijo in ne povsem ustavijo. Prav tako jim je delecija teh genov služila pri preverjanju uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice. Pokazali so tudi, da je integracija v genom ''K. phaffii'' možna, čeprav jim ni uspelo vstaviti točno želene popravljalne matrice. <br /> <br /> == Uvedba v industriji ==<br /> <br /> ''K. phaffii'' je že industrijsko uveljavljen organizem za proizvodnjo rekombinantnih proteinov. Z uvedbo genov za kompleks pMMO bi ''K. phaffii'' postala metanotrofna in bi zato lahko predstavljala potencialen način odstranjevanja metana iz okolja. Metanotrofen sev ''K. phaffii'' bi gojili v fermentorju, do kamor bi transportirali metan. Razlog za to je evropska regulativa o GSO, ki narekuje, naj delo z GSO poteka v kontroliranem in zaprtem okolju. Zato se velik delež dela v prihodnosti usmerja v to, kako razviti učinkovito odstranjevanje metana, ki ne potrebuje GSO, da se bo to lahko izvajalo direktno na želenem mestu. Do takrat pa je najprej potreben zajem metana, po katerem bi se ta transportiral do fermentorja. Svojim strankam bi skupina ponudila tudi proizvajanje želenega proteina, ki bi ga ''K. phaffii'' proizvajala. Dodatno oviro predstavlja tudi slaba topnost metana v vodi, ampak naj bi element trajnostnega razvoja odtehtal slabši izkoristek. Skupina s svojim projektom cilja predvsem na kmetijstvo, saj bi stranke v sproščenem metanu lahko našle vrednost s pomočjo te proizvodne platforme, ki bi omogočala odstranjevanje metana in proizvodnjo proteinov kot hranil za živino. Projekt pa bi bil lahko pomemben tudi za oljno in premogovno industrijo, kjer je metan eden glavnih stranskih produktov.<br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> [1] S. Guerrero-Cruz, A. Vaksmaa, M. A. Horn, H. Niemann, M. Pijuan, A. Ho: Methanotrophs: Discoveries, Environmental Relevance, and a Perspective on Current and Future Applications. Front. Microbiol. 2021, 12.<br /> <br /> [2] H. J. Kim, J. Huh, Y. W. Kwon, D. Park, Y. Yu, Y. E. Jang, B. R. Lee, E. Jo, E. J. Lee, Y. Heo, et al.: Biological Conversion of Methane to Methanol through Genetic Reassembly of Native Catalytic Domains. Nat. Catal. 2019, 2, 342–353.<br /> <br /> [3] L. Bernauer, A. Radkohl, L. G. K. Lehmayer, A. Emmerstorfer-Augustin: Komagataella Phaffii as Emerging Model Organism in Fundamental Research. Front. Microbiol. 2021, 11.<br /> <br /> [4] L. Näätsaari, B. Mistlberger, C. Ruth, T. Hajek, F. S. Hartner, A. Glieder: Deletion of the Pichia Pastoris KU70 Homologue Facilitates Platform Strain Generation for Gene Expression and Synthetic Biology. PLoS One 2012, 7.<br /> <br /> [5] Q. Liu, X. Shi, L. Song, H. Liu, X. Zhou, Q. Wang, Y. Zhang, M. Cai: CRISPR-Cas9-Mediated Genomic Multiloci Integration in Pichia Pastoris. Microb. Cell Fact. 2019, 18.<br /> <br /> [6] M. Karbalaei, S. A. Rezaee, H. Farsiani: Pichia Pastoris: A Highly Successful Expression System for Optimal Synthesis of Heterologous Proteins. J. Cell. Physiol. 2020, 235, 5867–5881.<br /> <br /> [7] F. W. Krainer, C. Dietzsch, T. Hajek, C. Herwig, O. Spadiut, A. Glieder: Recombinant Protein Expression in Pichia Pastoris Strains with an Engineered Methanol Utilization Pathway. Microb. Cell Fact. 2012, 11.</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana&diff=20714 2022-05-02T22:22:56Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je s projektom PHEAST sodelovala na tekmovanju iGEM leta 2021 in se uvrstila med deset najboljših ekip.<br /> <br /> Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:DTU-Denmark<br /> <br /> Avtorica povzetka: Ana Potočnik<br /> <br /> <br /> == Problem ==<br /> <br /> Metan (CH&lt;sub&gt;4&lt;/sub) je toplogredni plin, katerega masni delež v ozračju je 0,0001 %. Industrija in kmetijstvo vsako leto v ozračje izpustita 570 milijonov ton metana. Njegov toplogredni učinek je tridesetkrat večji kot toplogredni učinek ogljikovega dioksida, zato je eden izmed ciljev trajnostnega razvoja tudi zmanjšanje izpustov metana oziroma razvoj metod, ki bi omogočale omilitev negativnih posledic izpustov. Trenutno je največji poudarek na zmanjšanju izpustov metana s spreminjanjem hrane živine, prav tako pa so tudi že aktualne strategije, ki temeljijo na odstranjevanju že izpuščenega metana. Mednje spadajo recikliranje in kompostiranje odpadkov, zajemanje metana ter sežiganje. Glavna vrednost metana je vir energije, ampak je zajemanje in sežiganje metana dražje v primerjavi z drugimi viri energije. Poleg tega se pri sežiganju sprošča ogljikov dioksid, ki je prav tako toplogredni plin. Jasno je, da doslej uporabljane metode bistveno ne zmanjšajo ravni izpustov metana, zato je potreba po učinkovitih strategijah za odstranjevanje metana iz atmosfere velika. Kot odgovor na okoljski stres so se že razvili organizmi, ki lahko preživijo v okoljih, bogatih z metanom. Najpogosteje jih najdemo na riževih poljih, v blatu, prsti ali na odlagališčih smeti. Največji pomen za spopadanje z okoljsko krizo imajo metanotrofne (metanofilne) bakterije. Ena izmed njih je gramnegativna bakterija ''Methylococcus capsulatus'', ki metan uporablja kot vir ogljika in ga pretvarja v metanol. Doslej niso našli višjih organizmov, ki bi lahko presnavljali metan, so pa odkrili seve kvasovk, ki so razvile učinkovite mehanizme za prevzem in pretvorbo metanola v biomaso in energijo na podlagi metabolnih poti, podobnih ''M. capsulatus'' [1, 2].<br /> <br /> == Cilj ==<br /> <br /> Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je v prej opisanem problemu videla možnost za razvoj seva kvasovk, ki bi metan lahko prevzemal iz okolja, ga presnavljal in s tem uporabljal kok vir ogljika. Za to nalogo so si izbrali kvasovko ''Komagataella phaffii'' (''Pichia pastoris''). ''K. phaffii'' je metilotrof, ki kot vir ogljika in energije uporablja metanol, prav tako pa je eden izmed organizmov, ki ga uporabljamo za industrijsko proizvodnjo proteinov. Njihova ideja je bila vključiti kompleks pMMO (''angl. particular methane monooxygeanse'') iz ''M. capsulatus'', ki pretvarja metan v metanol, ki ga ''K. phaffii'' lahko s pomočjo nativnih metabolnih poti uporabi kot vir ogljika in energije. Glavni cilj v okviru te ideje pa je bil razvoj javno dostopnih orodij za urejanje genoma ''K. phaffii'' za namen odstranjevanja metana. Doslej ta orodja v registru iGEM niso bila dostopna in kljub veliki razširjenosti ''K. phaffii'' v industriji je bil delež biokock v registru za ''K. phaffii'' (in ''P. pastoris'') manj kot 1 %.<br /> <br /> == Načrt in izvedba ==<br /> <br /> Za delecijo in integracijo genov v genom ''K. phaffii'' je skupina razvila sisteme CRISPR/Cas9 z uporabo orodij molekulskega kloniranja, tehnologije DNA in sintezne biologije. <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Izbrali so sev ''K. phaffii'' GS115 Δku70, ki nima gena ''ku70'', zaradi česar v celici ne more prihajati do spajanja nehomolognih koncev (NHEJ). Zaradi tega je celica za popravljanje dvoverižnih prelomov na DNA prisiljena uporabiti popravljanje s homologno rekombinacijo (HDR). To omogoči lažjo integracijo genov v genom ''K. phaffii'' [3]. <br /> <br /> === Orodje za delecijo in kromosomsko integracijo ===<br /> <br /> Za delecijo in integracijo so razvili sisteme CRISPR/Cas9. Glavni razlog za uporabo CRISPR/Cas9 sistemov je ta, da je tarčenje DNA z RNA bolj tehnično enostavno in časovno izvedljivo kot tarčenje DNA s proteinom. Najprej so na genomu v nekodirajočih regijah poiskali nevtralna integracijska mesta, dolga 500–2000 bp, ki so bila dovolj dostopna endonukleazi Cas9 (niso na telomerah). Na vsakem izmed štirih kromosomov so izbrali eno integracijsko mesto. Nato so po strogih kriterijih načrtovali 4 sgRNA, vsako za eno integracijsko mesto. Zapise za izbrane sgRNA in Cas9 so nato vnesli v vektorje. Vektorji so vsebovali še mesto ori, zapis za rezistenco proti ampicilinu, marker za kvasovke in GAP1. Za pripravo vektorjev so uporabili kloniranje in fuzijo USER (''angl. Uracil-Specific Excision Reagent''), ki omogoča direktno vstavljanje vključkov v kompatibilne vektorje USER s pomočjo zarezovalnega encima. Vektorje so nato klonirali v kompetentnih celicah ''E. coli'' DH5α. Učinkovitost tarčenja z različnimi sgRNA so testirali z metodo TAPE, kjer so pričakovali, da ima sev GS115 Δku70 nižjo viabilnost kot sev GS115 [4]. Ko so izbrali najbolj primerne sgRNA, so s pomočjo sistemov CRISPR/Cas9 lahko izbili določene gene, celice pa so kotransformirali z matrico, ki vsebuje dve 45 bp dolgi homologni zaporedji, ki se nahajata navzgor in navzdol od izbitega gena, in sodeluje pri popravljanju s homologno rekombinacijo. Gene so lahko tudi vstavili, če so celice kotransformirali z drugo matrico, ki prav tako vsebuje dve homologni zaporedji in med njima še zapis za promotor, želeni gen in terminator, kar omogoča vstavljanje gena na mesto, kjer je bil uveden dvoverižni prelom DNA s Cas9 [5].<br /> <br /> === Razvoj metanotrofnih kvasovk ===<br /> <br /> Geni, ki so jih vnesli v sev ''K. phaffii'' GS115, zapisujejo za kompleks pMMO, ki ga sestavljajo tri podenote PmoA, PmoB in PmoC. To so prokariontski geni, ki izhajajo iz metanotrofne gramnegativne bakterije ''M. capsulatus''. Za optimalno izražanje genov v ''K. phaffii'' so izvedli optimizacijo kodona. Za delovanje kompleksa pMMO se morajo vse tri podenote transportirati do membrane in tam pravilno povezati v nonamer (3α3β3γ). Kompleks se nahaja v celični membrani in omogoča najprej oksidacijo metana do metanola in nato še prenos metanola v celico [6]. Želeli so, da se podenote pMMO izražajo konstitutivno, da bi se metan lahko ob prisotnosti v mediju takoj pretvarjal. Načrtovali so matrice za popravljanje dvoverižnih prelomov, ki so vsebovale zapise za podenote pMMO in močne konstitutivne promotorje GAP1 in TEF1. V zapis so vključili tudi signalni peptid, ki je izhajal iz glikoziltransferaze ''K. phaffii'', ki je membranski protein. Lokalizacijo kompleksa so preverili z metodo DeepLoc. Za vnos genov so uporabili prej opisan sistem CRISPR/Cas9. Za preverjanje uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice so v genomu K. phaffii izbili neesencialne gene, ki so bili vključeni v nativnem metabolizmu metanola [7].<br /> <br /> == Rezultati ==<br /> <br /> V okviru projekta PHEAST so uspešno pripravili več različnih plazmidov CRISPR/Cas9 za usmerjeno urejanje genoma ''K. phaffii'' na različnih kromosomih. S temi plazmidi je omogočena delecija genov brez »brazgotin« ali stabilna integracija genov. Vrednotenje dela so razdelili na tri dele, in sicer najprej zasnovo sistemov CRISPR/Cas9, nato uporabo sistemov CRISPR/Cas9 za delecijo genov in nazadnje še integracijo genov v ''K. phaffii'' GS115. Uspešno so zasnovali sgRNA, ki ciljajo intergenske regije na štirih kromosomih, kar bi lahko v prihodnosti uporabili za urejanje genoma ''K. phaffii''. Z delecijo neesencialnih genov, vključenih v metabolizem metanola do formaldehida, so želeli pokazati, da ti geni rast le upočasnijo in ne povsem ustavijo. Prav tako jim je delecija teh genov služila pri preverjanju uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice. Pokazali so tudi, da je integracija v genom ''K. phaffii'' možna, čeprav jim ni uspelo vstaviti točno želene popravljalne matrice. <br /> <br /> == Uvedba v industriji ==<br /> <br /> ''K. phaffii'' je že industrijsko uveljavljen organizem za proizvodnjo rekombinantnih proteinov. Z uvedbo genov za kompleks pMMO bi ''K. phaffii'' postala metanotrofna in bi zato lahko predstavljala potencialen način odstranjevanja metana iz okolja. Metanotrofen sev ''K. phaffii'' bi gojili v fermentorju, do kamor bi transportirali metan. Razlog za to je evropska regulativa o GSO, ki narekuje, naj delo z GSO poteka v kontroliranem in zaprtem okolju. Zato se velik delež dela v prihodnosti usmerja v to, kako razviti učinkovito odstranjevanje metana, ki ne potrebuje GSO, da se bo to lahko izvajalo direktno na želenem mestu. Do takrat pa je najprej potreben zajem metana, po katerem bi se ta transportiral do fermentorja. Svojim strankam bi skupina ponudila tudi proizvajanje želenega proteina, ki bi ga ''K. phaffii'' proizvajala. Dodatno oviro predstavlja tudi slaba topnost metana v vodi, ampak naj bi element trajnostnega razvoja odtehtal slabši izkoristek. Skupina s svojim projektom cilja predvsem na kmetijstvo, saj bi stranke v sproščenem metanu lahko našle vrednost s pomočjo te proizvodne platforme, ki bi omogočala odstranjevanje metana in proizvodnjo proteinov kot hranil za živino. Projekt pa bi bil lahko pomemben tudi za oljno in premogovno industrijo, kjer je metan eden glavnih stranskih produktov.<br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> [1] S. Guerrero-Cruz, A. Vaksmaa, M. A. Horn, H. Niemann, M. Pijuan, A. Ho: Methanotrophs: Discoveries, Environmental Relevance, and a Perspective on Current and Future Applications. Front. Microbiol. 2021, 12.<br /> <br /> [2] H. J. Kim, J. Huh, Y. W. Kwon, D. Park, Y. Yu, Y. E. Jang, B. R. Lee, E. Jo, E. J. Lee, Y. Heo, et al.: Biological Conversion of Methane to Methanol through Genetic Reassembly of Native Catalytic Domains. Nat. Catal. 2019, 2, 342–353.<br /> <br /> [3] L. Bernauer, A. Radkohl, L. G. K. Lehmayer, A. Emmerstorfer-Augustin: Komagataella Phaffii as Emerging Model Organism in Fundamental Research. Front. Microbiol. 2021, 11.<br /> <br /> [4] L. Näätsaari, B. Mistlberger, C. Ruth, T. Hajek, F. S. Hartner, A. Glieder: Deletion of the Pichia Pastoris KU70 Homologue Facilitates Platform Strain Generation for Gene Expression and Synthetic Biology. PLoS One 2012, 7.<br /> <br /> [5] Q. Liu, X. Shi, L. Song, H. Liu, X. Zhou, Q. Wang, Y. Zhang, M. Cai: CRISPR-Cas9-Mediated Genomic Multiloci Integration in Pichia Pastoris. Microb. Cell Fact. 2019, 18.<br /> <br /> [6] M. Karbalaei, S. A. Rezaee, H. Farsiani: Pichia Pastoris: A Highly Successful Expression System for Optimal Synthesis of Heterologous Proteins. J. Cell. Physiol. 2020, 235, 5867–5881.<br /> <br /> [7] F. W. Krainer, C. Dietzsch, T. Hajek, C. Herwig, O. Spadiut, A. Glieder: Recombinant Protein Expression in Pichia Pastoris Strains with an Engineered Methanol Utilization Pathway. Microb. Cell Fact. 2012, 11.</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana&diff=20713 2022-05-02T22:22:28Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je s projektom PHEAST sodelovala na tekmovanju iGEM leta 2021 in se uvrstila med deset najboljših ekip.<br /> <br /> Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:DTU-Denmark<br /> <br /> Avtorica povzetka: Ana Potočnik<br /> <br /> <br /> == Problem ==<br /> <br /> Metan (CH&lt;sub&gt;4&lt;\) je toplogredni plin, katerega masni delež v ozračju je 0,0001 %. Industrija in kmetijstvo vsako leto v ozračje izpustita 570 milijonov ton metana. Njegov toplogredni učinek je tridesetkrat večji kot toplogredni učinek ogljikovega dioksida, zato je eden izmed ciljev trajnostnega razvoja tudi zmanjšanje izpustov metana oziroma razvoj metod, ki bi omogočale omilitev negativnih posledic izpustov. Trenutno je največji poudarek na zmanjšanju izpustov metana s spreminjanjem hrane živine, prav tako pa so tudi že aktualne strategije, ki temeljijo na odstranjevanju že izpuščenega metana. Mednje spadajo recikliranje in kompostiranje odpadkov, zajemanje metana ter sežiganje. Glavna vrednost metana je vir energije, ampak je zajemanje in sežiganje metana dražje v primerjavi z drugimi viri energije. Poleg tega se pri sežiganju sprošča ogljikov dioksid, ki je prav tako toplogredni plin. Jasno je, da doslej uporabljane metode bistveno ne zmanjšajo ravni izpustov metana, zato je potreba po učinkovitih strategijah za odstranjevanje metana iz atmosfere velika. Kot odgovor na okoljski stres so se že razvili organizmi, ki lahko preživijo v okoljih, bogatih z metanom. Najpogosteje jih najdemo na riževih poljih, v blatu, prsti ali na odlagališčih smeti. Največji pomen za spopadanje z okoljsko krizo imajo metanotrofne (metanofilne) bakterije. Ena izmed njih je gramnegativna bakterija ''Methylococcus capsulatus'', ki metan uporablja kot vir ogljika in ga pretvarja v metanol. Doslej niso našli višjih organizmov, ki bi lahko presnavljali metan, so pa odkrili seve kvasovk, ki so razvile učinkovite mehanizme za prevzem in pretvorbo metanola v biomaso in energijo na podlagi metabolnih poti, podobnih ''M. capsulatus'' [1, 2].<br /> <br /> == Cilj ==<br /> <br /> Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je v prej opisanem problemu videla možnost za razvoj seva kvasovk, ki bi metan lahko prevzemal iz okolja, ga presnavljal in s tem uporabljal kok vir ogljika. Za to nalogo so si izbrali kvasovko ''Komagataella phaffii'' (''Pichia pastoris''). ''K. phaffii'' je metilotrof, ki kot vir ogljika in energije uporablja metanol, prav tako pa je eden izmed organizmov, ki ga uporabljamo za industrijsko proizvodnjo proteinov. Njihova ideja je bila vključiti kompleks pMMO (''angl. particular methane monooxygeanse'') iz ''M. capsulatus'', ki pretvarja metan v metanol, ki ga ''K. phaffii'' lahko s pomočjo nativnih metabolnih poti uporabi kot vir ogljika in energije. Glavni cilj v okviru te ideje pa je bil razvoj javno dostopnih orodij za urejanje genoma ''K. phaffii'' za namen odstranjevanja metana. Doslej ta orodja v registru iGEM niso bila dostopna in kljub veliki razširjenosti ''K. phaffii'' v industriji je bil delež biokock v registru za ''K. phaffii'' (in ''P. pastoris'') manj kot 1 %.<br /> <br /> == Načrt in izvedba ==<br /> <br /> Za delecijo in integracijo genov v genom ''K. phaffii'' je skupina razvila sisteme CRISPR/Cas9 z uporabo orodij molekulskega kloniranja, tehnologije DNA in sintezne biologije. <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Izbrali so sev ''K. phaffii'' GS115 Δku70, ki nima gena ''ku70'', zaradi česar v celici ne more prihajati do spajanja nehomolognih koncev (NHEJ). Zaradi tega je celica za popravljanje dvoverižnih prelomov na DNA prisiljena uporabiti popravljanje s homologno rekombinacijo (HDR). To omogoči lažjo integracijo genov v genom ''K. phaffii'' [3]. <br /> <br /> === Orodje za delecijo in kromosomsko integracijo ===<br /> <br /> Za delecijo in integracijo so razvili sisteme CRISPR/Cas9. Glavni razlog za uporabo CRISPR/Cas9 sistemov je ta, da je tarčenje DNA z RNA bolj tehnično enostavno in časovno izvedljivo kot tarčenje DNA s proteinom. Najprej so na genomu v nekodirajočih regijah poiskali nevtralna integracijska mesta, dolga 500–2000 bp, ki so bila dovolj dostopna endonukleazi Cas9 (niso na telomerah). Na vsakem izmed štirih kromosomov so izbrali eno integracijsko mesto. Nato so po strogih kriterijih načrtovali 4 sgRNA, vsako za eno integracijsko mesto. Zapise za izbrane sgRNA in Cas9 so nato vnesli v vektorje. Vektorji so vsebovali še mesto ori, zapis za rezistenco proti ampicilinu, marker za kvasovke in GAP1. Za pripravo vektorjev so uporabili kloniranje in fuzijo USER (''angl. Uracil-Specific Excision Reagent''), ki omogoča direktno vstavljanje vključkov v kompatibilne vektorje USER s pomočjo zarezovalnega encima. Vektorje so nato klonirali v kompetentnih celicah ''E. coli'' DH5α. Učinkovitost tarčenja z različnimi sgRNA so testirali z metodo TAPE, kjer so pričakovali, da ima sev GS115 Δku70 nižjo viabilnost kot sev GS115 [4]. Ko so izbrali najbolj primerne sgRNA, so s pomočjo sistemov CRISPR/Cas9 lahko izbili določene gene, celice pa so kotransformirali z matrico, ki vsebuje dve 45 bp dolgi homologni zaporedji, ki se nahajata navzgor in navzdol od izbitega gena, in sodeluje pri popravljanju s homologno rekombinacijo. Gene so lahko tudi vstavili, če so celice kotransformirali z drugo matrico, ki prav tako vsebuje dve homologni zaporedji in med njima še zapis za promotor, želeni gen in terminator, kar omogoča vstavljanje gena na mesto, kjer je bil uveden dvoverižni prelom DNA s Cas9 [5].<br /> <br /> === Razvoj metanotrofnih kvasovk ===<br /> <br /> Geni, ki so jih vnesli v sev ''K. phaffii'' GS115, zapisujejo za kompleks pMMO, ki ga sestavljajo tri podenote PmoA, PmoB in PmoC. To so prokariontski geni, ki izhajajo iz metanotrofne gramnegativne bakterije ''M. capsulatus''. Za optimalno izražanje genov v ''K. phaffii'' so izvedli optimizacijo kodona. Za delovanje kompleksa pMMO se morajo vse tri podenote transportirati do membrane in tam pravilno povezati v nonamer (3α3β3γ). Kompleks se nahaja v celični membrani in omogoča najprej oksidacijo metana do metanola in nato še prenos metanola v celico [6]. Želeli so, da se podenote pMMO izražajo konstitutivno, da bi se metan lahko ob prisotnosti v mediju takoj pretvarjal. Načrtovali so matrice za popravljanje dvoverižnih prelomov, ki so vsebovale zapise za podenote pMMO in močne konstitutivne promotorje GAP1 in TEF1. V zapis so vključili tudi signalni peptid, ki je izhajal iz glikoziltransferaze ''K. phaffii'', ki je membranski protein. Lokalizacijo kompleksa so preverili z metodo DeepLoc. Za vnos genov so uporabili prej opisan sistem CRISPR/Cas9. Za preverjanje uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice so v genomu K. phaffii izbili neesencialne gene, ki so bili vključeni v nativnem metabolizmu metanola [7].<br /> <br /> == Rezultati ==<br /> <br /> V okviru projekta PHEAST so uspešno pripravili več različnih plazmidov CRISPR/Cas9 za usmerjeno urejanje genoma ''K. phaffii'' na različnih kromosomih. S temi plazmidi je omogočena delecija genov brez »brazgotin« ali stabilna integracija genov. Vrednotenje dela so razdelili na tri dele, in sicer najprej zasnovo sistemov CRISPR/Cas9, nato uporabo sistemov CRISPR/Cas9 za delecijo genov in nazadnje še integracijo genov v ''K. phaffii'' GS115. Uspešno so zasnovali sgRNA, ki ciljajo intergenske regije na štirih kromosomih, kar bi lahko v prihodnosti uporabili za urejanje genoma ''K. phaffii''. Z delecijo neesencialnih genov, vključenih v metabolizem metanola do formaldehida, so želeli pokazati, da ti geni rast le upočasnijo in ne povsem ustavijo. Prav tako jim je delecija teh genov služila pri preverjanju uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice. Pokazali so tudi, da je integracija v genom ''K. phaffii'' možna, čeprav jim ni uspelo vstaviti točno želene popravljalne matrice. <br /> <br /> == Uvedba v industriji ==<br /> <br /> ''K. phaffii'' je že industrijsko uveljavljen organizem za proizvodnjo rekombinantnih proteinov. Z uvedbo genov za kompleks pMMO bi ''K. phaffii'' postala metanotrofna in bi zato lahko predstavljala potencialen način odstranjevanja metana iz okolja. Metanotrofen sev ''K. phaffii'' bi gojili v fermentorju, do kamor bi transportirali metan. Razlog za to je evropska regulativa o GSO, ki narekuje, naj delo z GSO poteka v kontroliranem in zaprtem okolju. Zato se velik delež dela v prihodnosti usmerja v to, kako razviti učinkovito odstranjevanje metana, ki ne potrebuje GSO, da se bo to lahko izvajalo direktno na želenem mestu. Do takrat pa je najprej potreben zajem metana, po katerem bi se ta transportiral do fermentorja. Svojim strankam bi skupina ponudila tudi proizvajanje želenega proteina, ki bi ga ''K. phaffii'' proizvajala. Dodatno oviro predstavlja tudi slaba topnost metana v vodi, ampak naj bi element trajnostnega razvoja odtehtal slabši izkoristek. Skupina s svojim projektom cilja predvsem na kmetijstvo, saj bi stranke v sproščenem metanu lahko našle vrednost s pomočjo te proizvodne platforme, ki bi omogočala odstranjevanje metana in proizvodnjo proteinov kot hranil za živino. Projekt pa bi bil lahko pomemben tudi za oljno in premogovno industrijo, kjer je metan eden glavnih stranskih produktov.<br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> [1] S. Guerrero-Cruz, A. Vaksmaa, M. A. Horn, H. Niemann, M. Pijuan, A. Ho: Methanotrophs: Discoveries, Environmental Relevance, and a Perspective on Current and Future Applications. Front. Microbiol. 2021, 12.<br /> <br /> [2] H. J. Kim, J. Huh, Y. W. Kwon, D. Park, Y. Yu, Y. E. Jang, B. R. Lee, E. Jo, E. J. Lee, Y. Heo, et al.: Biological Conversion of Methane to Methanol through Genetic Reassembly of Native Catalytic Domains. Nat. Catal. 2019, 2, 342–353.<br /> <br /> [3] L. Bernauer, A. Radkohl, L. G. K. Lehmayer, A. Emmerstorfer-Augustin: Komagataella Phaffii as Emerging Model Organism in Fundamental Research. Front. Microbiol. 2021, 11.<br /> <br /> [4] L. Näätsaari, B. Mistlberger, C. Ruth, T. Hajek, F. S. Hartner, A. Glieder: Deletion of the Pichia Pastoris KU70 Homologue Facilitates Platform Strain Generation for Gene Expression and Synthetic Biology. PLoS One 2012, 7.<br /> <br /> [5] Q. Liu, X. Shi, L. Song, H. Liu, X. Zhou, Q. Wang, Y. Zhang, M. Cai: CRISPR-Cas9-Mediated Genomic Multiloci Integration in Pichia Pastoris. Microb. Cell Fact. 2019, 18.<br /> <br /> [6] M. Karbalaei, S. A. Rezaee, H. Farsiani: Pichia Pastoris: A Highly Successful Expression System for Optimal Synthesis of Heterologous Proteins. J. Cell. Physiol. 2020, 235, 5867–5881.<br /> <br /> [7] F. W. Krainer, C. Dietzsch, T. Hajek, C. Herwig, O. Spadiut, A. Glieder: Recombinant Protein Expression in Pichia Pastoris Strains with an Engineered Methanol Utilization Pathway. Microb. Cell Fact. 2012, 11.</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana&diff=20712 2022-05-02T22:22:03Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je s projektom PHEAST sodelovala na tekmovanju iGEM leta 2021 in se uvrstila med deset najboljših ekip.<br /> <br /> Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:DTU-Denmark<br /> <br /> Avtorica povzetka: Ana Potočnik<br /> <br /> <br /> == Problem ==<br /> <br /> Metan (CH&lt;sub&gt;4 ) je toplogredni plin, katerega masni delež v ozračju je 0,0001 %. Industrija in kmetijstvo vsako leto v ozračje izpustita 570 milijonov ton metana. Njegov toplogredni učinek je tridesetkrat večji kot toplogredni učinek ogljikovega dioksida, zato je eden izmed ciljev trajnostnega razvoja tudi zmanjšanje izpustov metana oziroma razvoj metod, ki bi omogočale omilitev negativnih posledic izpustov. Trenutno je največji poudarek na zmanjšanju izpustov metana s spreminjanjem hrane živine, prav tako pa so tudi že aktualne strategije, ki temeljijo na odstranjevanju že izpuščenega metana. Mednje spadajo recikliranje in kompostiranje odpadkov, zajemanje metana ter sežiganje. Glavna vrednost metana je vir energije, ampak je zajemanje in sežiganje metana dražje v primerjavi z drugimi viri energije. Poleg tega se pri sežiganju sprošča ogljikov dioksid, ki je prav tako toplogredni plin. Jasno je, da doslej uporabljane metode bistveno ne zmanjšajo ravni izpustov metana, zato je potreba po učinkovitih strategijah za odstranjevanje metana iz atmosfere velika. Kot odgovor na okoljski stres so se že razvili organizmi, ki lahko preživijo v okoljih, bogatih z metanom. Najpogosteje jih najdemo na riževih poljih, v blatu, prsti ali na odlagališčih smeti. Največji pomen za spopadanje z okoljsko krizo imajo metanotrofne (metanofilne) bakterije. Ena izmed njih je gramnegativna bakterija ''Methylococcus capsulatus'', ki metan uporablja kot vir ogljika in ga pretvarja v metanol. Doslej niso našli višjih organizmov, ki bi lahko presnavljali metan, so pa odkrili seve kvasovk, ki so razvile učinkovite mehanizme za prevzem in pretvorbo metanola v biomaso in energijo na podlagi metabolnih poti, podobnih ''M. capsulatus'' [1, 2].<br /> <br /> == Cilj ==<br /> <br /> Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je v prej opisanem problemu videla možnost za razvoj seva kvasovk, ki bi metan lahko prevzemal iz okolja, ga presnavljal in s tem uporabljal kok vir ogljika. Za to nalogo so si izbrali kvasovko ''Komagataella phaffii'' (''Pichia pastoris''). ''K. phaffii'' je metilotrof, ki kot vir ogljika in energije uporablja metanol, prav tako pa je eden izmed organizmov, ki ga uporabljamo za industrijsko proizvodnjo proteinov. Njihova ideja je bila vključiti kompleks pMMO (''angl. particular methane monooxygeanse'') iz ''M. capsulatus'', ki pretvarja metan v metanol, ki ga ''K. phaffii'' lahko s pomočjo nativnih metabolnih poti uporabi kot vir ogljika in energije. Glavni cilj v okviru te ideje pa je bil razvoj javno dostopnih orodij za urejanje genoma ''K. phaffii'' za namen odstranjevanja metana. Doslej ta orodja v registru iGEM niso bila dostopna in kljub veliki razširjenosti ''K. phaffii'' v industriji je bil delež biokock v registru za ''K. phaffii'' (in ''P. pastoris'') manj kot 1 %.<br /> <br /> == Načrt in izvedba ==<br /> <br /> Za delecijo in integracijo genov v genom ''K. phaffii'' je skupina razvila sisteme CRISPR/Cas9 z uporabo orodij molekulskega kloniranja, tehnologije DNA in sintezne biologije. <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Izbrali so sev ''K. phaffii'' GS115 Δku70, ki nima gena ''ku70'', zaradi česar v celici ne more prihajati do spajanja nehomolognih koncev (NHEJ). Zaradi tega je celica za popravljanje dvoverižnih prelomov na DNA prisiljena uporabiti popravljanje s homologno rekombinacijo (HDR). To omogoči lažjo integracijo genov v genom ''K. phaffii'' [3]. <br /> <br /> === Orodje za delecijo in kromosomsko integracijo ===<br /> <br /> Za delecijo in integracijo so razvili sisteme CRISPR/Cas9. Glavni razlog za uporabo CRISPR/Cas9 sistemov je ta, da je tarčenje DNA z RNA bolj tehnično enostavno in časovno izvedljivo kot tarčenje DNA s proteinom. Najprej so na genomu v nekodirajočih regijah poiskali nevtralna integracijska mesta, dolga 500–2000 bp, ki so bila dovolj dostopna endonukleazi Cas9 (niso na telomerah). Na vsakem izmed štirih kromosomov so izbrali eno integracijsko mesto. Nato so po strogih kriterijih načrtovali 4 sgRNA, vsako za eno integracijsko mesto. Zapise za izbrane sgRNA in Cas9 so nato vnesli v vektorje. Vektorji so vsebovali še mesto ori, zapis za rezistenco proti ampicilinu, marker za kvasovke in GAP1. Za pripravo vektorjev so uporabili kloniranje in fuzijo USER (''angl. Uracil-Specific Excision Reagent''), ki omogoča direktno vstavljanje vključkov v kompatibilne vektorje USER s pomočjo zarezovalnega encima. Vektorje so nato klonirali v kompetentnih celicah ''E. coli'' DH5α. Učinkovitost tarčenja z različnimi sgRNA so testirali z metodo TAPE, kjer so pričakovali, da ima sev GS115 Δku70 nižjo viabilnost kot sev GS115 [4]. Ko so izbrali najbolj primerne sgRNA, so s pomočjo sistemov CRISPR/Cas9 lahko izbili določene gene, celice pa so kotransformirali z matrico, ki vsebuje dve 45 bp dolgi homologni zaporedji, ki se nahajata navzgor in navzdol od izbitega gena, in sodeluje pri popravljanju s homologno rekombinacijo. Gene so lahko tudi vstavili, če so celice kotransformirali z drugo matrico, ki prav tako vsebuje dve homologni zaporedji in med njima še zapis za promotor, želeni gen in terminator, kar omogoča vstavljanje gena na mesto, kjer je bil uveden dvoverižni prelom DNA s Cas9 [5].<br /> <br /> === Razvoj metanotrofnih kvasovk ===<br /> <br /> Geni, ki so jih vnesli v sev ''K. phaffii'' GS115, zapisujejo za kompleks pMMO, ki ga sestavljajo tri podenote PmoA, PmoB in PmoC. To so prokariontski geni, ki izhajajo iz metanotrofne gramnegativne bakterije ''M. capsulatus''. Za optimalno izražanje genov v ''K. phaffii'' so izvedli optimizacijo kodona. Za delovanje kompleksa pMMO se morajo vse tri podenote transportirati do membrane in tam pravilno povezati v nonamer (3α3β3γ). Kompleks se nahaja v celični membrani in omogoča najprej oksidacijo metana do metanola in nato še prenos metanola v celico [6]. Želeli so, da se podenote pMMO izražajo konstitutivno, da bi se metan lahko ob prisotnosti v mediju takoj pretvarjal. Načrtovali so matrice za popravljanje dvoverižnih prelomov, ki so vsebovale zapise za podenote pMMO in močne konstitutivne promotorje GAP1 in TEF1. V zapis so vključili tudi signalni peptid, ki je izhajal iz glikoziltransferaze ''K. phaffii'', ki je membranski protein. Lokalizacijo kompleksa so preverili z metodo DeepLoc. Za vnos genov so uporabili prej opisan sistem CRISPR/Cas9. Za preverjanje uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice so v genomu K. phaffii izbili neesencialne gene, ki so bili vključeni v nativnem metabolizmu metanola [7].<br /> <br /> == Rezultati ==<br /> <br /> V okviru projekta PHEAST so uspešno pripravili več različnih plazmidov CRISPR/Cas9 za usmerjeno urejanje genoma ''K. phaffii'' na različnih kromosomih. S temi plazmidi je omogočena delecija genov brez »brazgotin« ali stabilna integracija genov. Vrednotenje dela so razdelili na tri dele, in sicer najprej zasnovo sistemov CRISPR/Cas9, nato uporabo sistemov CRISPR/Cas9 za delecijo genov in nazadnje še integracijo genov v ''K. phaffii'' GS115. Uspešno so zasnovali sgRNA, ki ciljajo intergenske regije na štirih kromosomih, kar bi lahko v prihodnosti uporabili za urejanje genoma ''K. phaffii''. Z delecijo neesencialnih genov, vključenih v metabolizem metanola do formaldehida, so želeli pokazati, da ti geni rast le upočasnijo in ne povsem ustavijo. Prav tako jim je delecija teh genov služila pri preverjanju uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice. Pokazali so tudi, da je integracija v genom ''K. phaffii'' možna, čeprav jim ni uspelo vstaviti točno želene popravljalne matrice. <br /> <br /> == Uvedba v industriji ==<br /> <br /> ''K. phaffii'' je že industrijsko uveljavljen organizem za proizvodnjo rekombinantnih proteinov. Z uvedbo genov za kompleks pMMO bi ''K. phaffii'' postala metanotrofna in bi zato lahko predstavljala potencialen način odstranjevanja metana iz okolja. Metanotrofen sev ''K. phaffii'' bi gojili v fermentorju, do kamor bi transportirali metan. Razlog za to je evropska regulativa o GSO, ki narekuje, naj delo z GSO poteka v kontroliranem in zaprtem okolju. Zato se velik delež dela v prihodnosti usmerja v to, kako razviti učinkovito odstranjevanje metana, ki ne potrebuje GSO, da se bo to lahko izvajalo direktno na želenem mestu. Do takrat pa je najprej potreben zajem metana, po katerem bi se ta transportiral do fermentorja. Svojim strankam bi skupina ponudila tudi proizvajanje želenega proteina, ki bi ga ''K. phaffii'' proizvajala. Dodatno oviro predstavlja tudi slaba topnost metana v vodi, ampak naj bi element trajnostnega razvoja odtehtal slabši izkoristek. Skupina s svojim projektom cilja predvsem na kmetijstvo, saj bi stranke v sproščenem metanu lahko našle vrednost s pomočjo te proizvodne platforme, ki bi omogočala odstranjevanje metana in proizvodnjo proteinov kot hranil za živino. Projekt pa bi bil lahko pomemben tudi za oljno in premogovno industrijo, kjer je metan eden glavnih stranskih produktov.<br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> [1] S. Guerrero-Cruz, A. Vaksmaa, M. A. Horn, H. Niemann, M. Pijuan, A. Ho: Methanotrophs: Discoveries, Environmental Relevance, and a Perspective on Current and Future Applications. Front. Microbiol. 2021, 12.<br /> <br /> [2] H. J. Kim, J. Huh, Y. W. Kwon, D. Park, Y. Yu, Y. E. Jang, B. R. Lee, E. Jo, E. J. Lee, Y. Heo, et al.: Biological Conversion of Methane to Methanol through Genetic Reassembly of Native Catalytic Domains. Nat. Catal. 2019, 2, 342–353.<br /> <br /> [3] L. Bernauer, A. Radkohl, L. G. K. Lehmayer, A. Emmerstorfer-Augustin: Komagataella Phaffii as Emerging Model Organism in Fundamental Research. Front. Microbiol. 2021, 11.<br /> <br /> [4] L. Näätsaari, B. Mistlberger, C. Ruth, T. Hajek, F. S. Hartner, A. Glieder: Deletion of the Pichia Pastoris KU70 Homologue Facilitates Platform Strain Generation for Gene Expression and Synthetic Biology. PLoS One 2012, 7.<br /> <br /> [5] Q. Liu, X. Shi, L. Song, H. Liu, X. Zhou, Q. Wang, Y. Zhang, M. Cai: CRISPR-Cas9-Mediated Genomic Multiloci Integration in Pichia Pastoris. Microb. Cell Fact. 2019, 18.<br /> <br /> [6] M. Karbalaei, S. A. Rezaee, H. Farsiani: Pichia Pastoris: A Highly Successful Expression System for Optimal Synthesis of Heterologous Proteins. J. Cell. Physiol. 2020, 235, 5867–5881.<br /> <br /> [7] F. W. Krainer, C. Dietzsch, T. Hajek, C. Herwig, O. Spadiut, A. Glieder: Recombinant Protein Expression in Pichia Pastoris Strains with an Engineered Methanol Utilization Pathway. Microb. Cell Fact. 2012, 11.</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana&diff=20711 2022-05-02T22:21:39Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je s projektom PHEAST sodelovala na tekmovanju iGEM leta 2021 in se uvrstila med deset najboljših ekip.<br /> <br /> Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:DTU-Denmark<br /> <br /> Avtorica povzetka: Ana Potočnik<br /> <br /> <br /> == Problem ==<br /> <br /> Metan (CH&lt;sub&gt;4/) je toplogredni plin, katerega masni delež v ozračju je 0,0001 %. Industrija in kmetijstvo vsako leto v ozračje izpustita 570 milijonov ton metana. Njegov toplogredni učinek je tridesetkrat večji kot toplogredni učinek ogljikovega dioksida, zato je eden izmed ciljev trajnostnega razvoja tudi zmanjšanje izpustov metana oziroma razvoj metod, ki bi omogočale omilitev negativnih posledic izpustov. Trenutno je največji poudarek na zmanjšanju izpustov metana s spreminjanjem hrane živine, prav tako pa so tudi že aktualne strategije, ki temeljijo na odstranjevanju že izpuščenega metana. Mednje spadajo recikliranje in kompostiranje odpadkov, zajemanje metana ter sežiganje. Glavna vrednost metana je vir energije, ampak je zajemanje in sežiganje metana dražje v primerjavi z drugimi viri energije. Poleg tega se pri sežiganju sprošča ogljikov dioksid, ki je prav tako toplogredni plin. Jasno je, da doslej uporabljane metode bistveno ne zmanjšajo ravni izpustov metana, zato je potreba po učinkovitih strategijah za odstranjevanje metana iz atmosfere velika. Kot odgovor na okoljski stres so se že razvili organizmi, ki lahko preživijo v okoljih, bogatih z metanom. Najpogosteje jih najdemo na riževih poljih, v blatu, prsti ali na odlagališčih smeti. Največji pomen za spopadanje z okoljsko krizo imajo metanotrofne (metanofilne) bakterije. Ena izmed njih je gramnegativna bakterija ''Methylococcus capsulatus'', ki metan uporablja kot vir ogljika in ga pretvarja v metanol. Doslej niso našli višjih organizmov, ki bi lahko presnavljali metan, so pa odkrili seve kvasovk, ki so razvile učinkovite mehanizme za prevzem in pretvorbo metanola v biomaso in energijo na podlagi metabolnih poti, podobnih ''M. capsulatus'' [1, 2].<br /> <br /> == Cilj ==<br /> <br /> Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je v prej opisanem problemu videla možnost za razvoj seva kvasovk, ki bi metan lahko prevzemal iz okolja, ga presnavljal in s tem uporabljal kok vir ogljika. Za to nalogo so si izbrali kvasovko ''Komagataella phaffii'' (''Pichia pastoris''). ''K. phaffii'' je metilotrof, ki kot vir ogljika in energije uporablja metanol, prav tako pa je eden izmed organizmov, ki ga uporabljamo za industrijsko proizvodnjo proteinov. Njihova ideja je bila vključiti kompleks pMMO (''angl. particular methane monooxygeanse'') iz ''M. capsulatus'', ki pretvarja metan v metanol, ki ga ''K. phaffii'' lahko s pomočjo nativnih metabolnih poti uporabi kot vir ogljika in energije. Glavni cilj v okviru te ideje pa je bil razvoj javno dostopnih orodij za urejanje genoma ''K. phaffii'' za namen odstranjevanja metana. Doslej ta orodja v registru iGEM niso bila dostopna in kljub veliki razširjenosti ''K. phaffii'' v industriji je bil delež biokock v registru za ''K. phaffii'' (in ''P. pastoris'') manj kot 1 %.<br /> <br /> == Načrt in izvedba ==<br /> <br /> Za delecijo in integracijo genov v genom ''K. phaffii'' je skupina razvila sisteme CRISPR/Cas9 z uporabo orodij molekulskega kloniranja, tehnologije DNA in sintezne biologije. <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Izbrali so sev ''K. phaffii'' GS115 Δku70, ki nima gena ''ku70'', zaradi česar v celici ne more prihajati do spajanja nehomolognih koncev (NHEJ). Zaradi tega je celica za popravljanje dvoverižnih prelomov na DNA prisiljena uporabiti popravljanje s homologno rekombinacijo (HDR). To omogoči lažjo integracijo genov v genom ''K. phaffii'' [3]. <br /> <br /> === Orodje za delecijo in kromosomsko integracijo ===<br /> <br /> Za delecijo in integracijo so razvili sisteme CRISPR/Cas9. Glavni razlog za uporabo CRISPR/Cas9 sistemov je ta, da je tarčenje DNA z RNA bolj tehnično enostavno in časovno izvedljivo kot tarčenje DNA s proteinom. Najprej so na genomu v nekodirajočih regijah poiskali nevtralna integracijska mesta, dolga 500–2000 bp, ki so bila dovolj dostopna endonukleazi Cas9 (niso na telomerah). Na vsakem izmed štirih kromosomov so izbrali eno integracijsko mesto. Nato so po strogih kriterijih načrtovali 4 sgRNA, vsako za eno integracijsko mesto. Zapise za izbrane sgRNA in Cas9 so nato vnesli v vektorje. Vektorji so vsebovali še mesto ori, zapis za rezistenco proti ampicilinu, marker za kvasovke in GAP1. Za pripravo vektorjev so uporabili kloniranje in fuzijo USER (''angl. Uracil-Specific Excision Reagent''), ki omogoča direktno vstavljanje vključkov v kompatibilne vektorje USER s pomočjo zarezovalnega encima. Vektorje so nato klonirali v kompetentnih celicah ''E. coli'' DH5α. Učinkovitost tarčenja z različnimi sgRNA so testirali z metodo TAPE, kjer so pričakovali, da ima sev GS115 Δku70 nižjo viabilnost kot sev GS115 [4]. Ko so izbrali najbolj primerne sgRNA, so s pomočjo sistemov CRISPR/Cas9 lahko izbili določene gene, celice pa so kotransformirali z matrico, ki vsebuje dve 45 bp dolgi homologni zaporedji, ki se nahajata navzgor in navzdol od izbitega gena, in sodeluje pri popravljanju s homologno rekombinacijo. Gene so lahko tudi vstavili, če so celice kotransformirali z drugo matrico, ki prav tako vsebuje dve homologni zaporedji in med njima še zapis za promotor, želeni gen in terminator, kar omogoča vstavljanje gena na mesto, kjer je bil uveden dvoverižni prelom DNA s Cas9 [5].<br /> <br /> === Razvoj metanotrofnih kvasovk ===<br /> <br /> Geni, ki so jih vnesli v sev ''K. phaffii'' GS115, zapisujejo za kompleks pMMO, ki ga sestavljajo tri podenote PmoA, PmoB in PmoC. To so prokariontski geni, ki izhajajo iz metanotrofne gramnegativne bakterije ''M. capsulatus''. Za optimalno izražanje genov v ''K. phaffii'' so izvedli optimizacijo kodona. Za delovanje kompleksa pMMO se morajo vse tri podenote transportirati do membrane in tam pravilno povezati v nonamer (3α3β3γ). Kompleks se nahaja v celični membrani in omogoča najprej oksidacijo metana do metanola in nato še prenos metanola v celico [6]. Želeli so, da se podenote pMMO izražajo konstitutivno, da bi se metan lahko ob prisotnosti v mediju takoj pretvarjal. Načrtovali so matrice za popravljanje dvoverižnih prelomov, ki so vsebovale zapise za podenote pMMO in močne konstitutivne promotorje GAP1 in TEF1. V zapis so vključili tudi signalni peptid, ki je izhajal iz glikoziltransferaze ''K. phaffii'', ki je membranski protein. Lokalizacijo kompleksa so preverili z metodo DeepLoc. Za vnos genov so uporabili prej opisan sistem CRISPR/Cas9. Za preverjanje uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice so v genomu K. phaffii izbili neesencialne gene, ki so bili vključeni v nativnem metabolizmu metanola [7].<br /> <br /> == Rezultati ==<br /> <br /> V okviru projekta PHEAST so uspešno pripravili več različnih plazmidov CRISPR/Cas9 za usmerjeno urejanje genoma ''K. phaffii'' na različnih kromosomih. S temi plazmidi je omogočena delecija genov brez »brazgotin« ali stabilna integracija genov. Vrednotenje dela so razdelili na tri dele, in sicer najprej zasnovo sistemov CRISPR/Cas9, nato uporabo sistemov CRISPR/Cas9 za delecijo genov in nazadnje še integracijo genov v ''K. phaffii'' GS115. Uspešno so zasnovali sgRNA, ki ciljajo intergenske regije na štirih kromosomih, kar bi lahko v prihodnosti uporabili za urejanje genoma ''K. phaffii''. Z delecijo neesencialnih genov, vključenih v metabolizem metanola do formaldehida, so želeli pokazati, da ti geni rast le upočasnijo in ne povsem ustavijo. Prav tako jim je delecija teh genov služila pri preverjanju uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice. Pokazali so tudi, da je integracija v genom ''K. phaffii'' možna, čeprav jim ni uspelo vstaviti točno želene popravljalne matrice. <br /> <br /> == Uvedba v industriji ==<br /> <br /> ''K. phaffii'' je že industrijsko uveljavljen organizem za proizvodnjo rekombinantnih proteinov. Z uvedbo genov za kompleks pMMO bi ''K. phaffii'' postala metanotrofna in bi zato lahko predstavljala potencialen način odstranjevanja metana iz okolja. Metanotrofen sev ''K. phaffii'' bi gojili v fermentorju, do kamor bi transportirali metan. Razlog za to je evropska regulativa o GSO, ki narekuje, naj delo z GSO poteka v kontroliranem in zaprtem okolju. Zato se velik delež dela v prihodnosti usmerja v to, kako razviti učinkovito odstranjevanje metana, ki ne potrebuje GSO, da se bo to lahko izvajalo direktno na želenem mestu. Do takrat pa je najprej potreben zajem metana, po katerem bi se ta transportiral do fermentorja. Svojim strankam bi skupina ponudila tudi proizvajanje želenega proteina, ki bi ga ''K. phaffii'' proizvajala. Dodatno oviro predstavlja tudi slaba topnost metana v vodi, ampak naj bi element trajnostnega razvoja odtehtal slabši izkoristek. Skupina s svojim projektom cilja predvsem na kmetijstvo, saj bi stranke v sproščenem metanu lahko našle vrednost s pomočjo te proizvodne platforme, ki bi omogočala odstranjevanje metana in proizvodnjo proteinov kot hranil za živino. Projekt pa bi bil lahko pomemben tudi za oljno in premogovno industrijo, kjer je metan eden glavnih stranskih produktov.<br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> [1] S. Guerrero-Cruz, A. Vaksmaa, M. A. Horn, H. Niemann, M. Pijuan, A. Ho: Methanotrophs: Discoveries, Environmental Relevance, and a Perspective on Current and Future Applications. Front. Microbiol. 2021, 12.<br /> <br /> [2] H. J. Kim, J. Huh, Y. W. Kwon, D. Park, Y. Yu, Y. E. Jang, B. R. Lee, E. Jo, E. J. Lee, Y. Heo, et al.: Biological Conversion of Methane to Methanol through Genetic Reassembly of Native Catalytic Domains. Nat. Catal. 2019, 2, 342–353.<br /> <br /> [3] L. Bernauer, A. Radkohl, L. G. K. Lehmayer, A. Emmerstorfer-Augustin: Komagataella Phaffii as Emerging Model Organism in Fundamental Research. Front. Microbiol. 2021, 11.<br /> <br /> [4] L. Näätsaari, B. Mistlberger, C. Ruth, T. Hajek, F. S. Hartner, A. Glieder: Deletion of the Pichia Pastoris KU70 Homologue Facilitates Platform Strain Generation for Gene Expression and Synthetic Biology. PLoS One 2012, 7.<br /> <br /> [5] Q. Liu, X. Shi, L. Song, H. Liu, X. Zhou, Q. Wang, Y. Zhang, M. Cai: CRISPR-Cas9-Mediated Genomic Multiloci Integration in Pichia Pastoris. Microb. Cell Fact. 2019, 18.<br /> <br /> [6] M. Karbalaei, S. A. Rezaee, H. Farsiani: Pichia Pastoris: A Highly Successful Expression System for Optimal Synthesis of Heterologous Proteins. J. Cell. Physiol. 2020, 235, 5867–5881.<br /> <br /> [7] F. W. Krainer, C. Dietzsch, T. Hajek, C. Herwig, O. Spadiut, A. Glieder: Recombinant Protein Expression in Pichia Pastoris Strains with an Engineered Methanol Utilization Pathway. Microb. Cell Fact. 2012, 11.</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana&diff=20710 2022-05-02T22:21:22Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je s projektom PHEAST sodelovala na tekmovanju iGEM leta 2021 in se uvrstila med deset najboljših ekip.<br /> <br /> Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:DTU-Denmark<br /> <br /> Avtorica povzetka: Ana Potočnik<br /> <br /> <br /> == Problem ==<br /> <br /> Metan (CH&lt;sub&gt;4) je toplogredni plin, katerega masni delež v ozračju je 0,0001 %. Industrija in kmetijstvo vsako leto v ozračje izpustita 570 milijonov ton metana. Njegov toplogredni učinek je tridesetkrat večji kot toplogredni učinek ogljikovega dioksida, zato je eden izmed ciljev trajnostnega razvoja tudi zmanjšanje izpustov metana oziroma razvoj metod, ki bi omogočale omilitev negativnih posledic izpustov. Trenutno je največji poudarek na zmanjšanju izpustov metana s spreminjanjem hrane živine, prav tako pa so tudi že aktualne strategije, ki temeljijo na odstranjevanju že izpuščenega metana. Mednje spadajo recikliranje in kompostiranje odpadkov, zajemanje metana ter sežiganje. Glavna vrednost metana je vir energije, ampak je zajemanje in sežiganje metana dražje v primerjavi z drugimi viri energije. Poleg tega se pri sežiganju sprošča ogljikov dioksid, ki je prav tako toplogredni plin. Jasno je, da doslej uporabljane metode bistveno ne zmanjšajo ravni izpustov metana, zato je potreba po učinkovitih strategijah za odstranjevanje metana iz atmosfere velika. Kot odgovor na okoljski stres so se že razvili organizmi, ki lahko preživijo v okoljih, bogatih z metanom. Najpogosteje jih najdemo na riževih poljih, v blatu, prsti ali na odlagališčih smeti. Največji pomen za spopadanje z okoljsko krizo imajo metanotrofne (metanofilne) bakterije. Ena izmed njih je gramnegativna bakterija ''Methylococcus capsulatus'', ki metan uporablja kot vir ogljika in ga pretvarja v metanol. Doslej niso našli višjih organizmov, ki bi lahko presnavljali metan, so pa odkrili seve kvasovk, ki so razvile učinkovite mehanizme za prevzem in pretvorbo metanola v biomaso in energijo na podlagi metabolnih poti, podobnih ''M. capsulatus'' [1, 2].<br /> <br /> == Cilj ==<br /> <br /> Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je v prej opisanem problemu videla možnost za razvoj seva kvasovk, ki bi metan lahko prevzemal iz okolja, ga presnavljal in s tem uporabljal kok vir ogljika. Za to nalogo so si izbrali kvasovko ''Komagataella phaffii'' (''Pichia pastoris''). ''K. phaffii'' je metilotrof, ki kot vir ogljika in energije uporablja metanol, prav tako pa je eden izmed organizmov, ki ga uporabljamo za industrijsko proizvodnjo proteinov. Njihova ideja je bila vključiti kompleks pMMO (''angl. particular methane monooxygeanse'') iz ''M. capsulatus'', ki pretvarja metan v metanol, ki ga ''K. phaffii'' lahko s pomočjo nativnih metabolnih poti uporabi kot vir ogljika in energije. Glavni cilj v okviru te ideje pa je bil razvoj javno dostopnih orodij za urejanje genoma ''K. phaffii'' za namen odstranjevanja metana. Doslej ta orodja v registru iGEM niso bila dostopna in kljub veliki razširjenosti ''K. phaffii'' v industriji je bil delež biokock v registru za ''K. phaffii'' (in ''P. pastoris'') manj kot 1 %.<br /> <br /> == Načrt in izvedba ==<br /> <br /> Za delecijo in integracijo genov v genom ''K. phaffii'' je skupina razvila sisteme CRISPR/Cas9 z uporabo orodij molekulskega kloniranja, tehnologije DNA in sintezne biologije. <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Izbrali so sev ''K. phaffii'' GS115 Δku70, ki nima gena ''ku70'', zaradi česar v celici ne more prihajati do spajanja nehomolognih koncev (NHEJ). Zaradi tega je celica za popravljanje dvoverižnih prelomov na DNA prisiljena uporabiti popravljanje s homologno rekombinacijo (HDR). To omogoči lažjo integracijo genov v genom ''K. phaffii'' [3]. <br /> <br /> === Orodje za delecijo in kromosomsko integracijo ===<br /> <br /> Za delecijo in integracijo so razvili sisteme CRISPR/Cas9. Glavni razlog za uporabo CRISPR/Cas9 sistemov je ta, da je tarčenje DNA z RNA bolj tehnično enostavno in časovno izvedljivo kot tarčenje DNA s proteinom. Najprej so na genomu v nekodirajočih regijah poiskali nevtralna integracijska mesta, dolga 500–2000 bp, ki so bila dovolj dostopna endonukleazi Cas9 (niso na telomerah). Na vsakem izmed štirih kromosomov so izbrali eno integracijsko mesto. Nato so po strogih kriterijih načrtovali 4 sgRNA, vsako za eno integracijsko mesto. Zapise za izbrane sgRNA in Cas9 so nato vnesli v vektorje. Vektorji so vsebovali še mesto ori, zapis za rezistenco proti ampicilinu, marker za kvasovke in GAP1. Za pripravo vektorjev so uporabili kloniranje in fuzijo USER (''angl. Uracil-Specific Excision Reagent''), ki omogoča direktno vstavljanje vključkov v kompatibilne vektorje USER s pomočjo zarezovalnega encima. Vektorje so nato klonirali v kompetentnih celicah ''E. coli'' DH5α. Učinkovitost tarčenja z različnimi sgRNA so testirali z metodo TAPE, kjer so pričakovali, da ima sev GS115 Δku70 nižjo viabilnost kot sev GS115 [4]. Ko so izbrali najbolj primerne sgRNA, so s pomočjo sistemov CRISPR/Cas9 lahko izbili določene gene, celice pa so kotransformirali z matrico, ki vsebuje dve 45 bp dolgi homologni zaporedji, ki se nahajata navzgor in navzdol od izbitega gena, in sodeluje pri popravljanju s homologno rekombinacijo. Gene so lahko tudi vstavili, če so celice kotransformirali z drugo matrico, ki prav tako vsebuje dve homologni zaporedji in med njima še zapis za promotor, želeni gen in terminator, kar omogoča vstavljanje gena na mesto, kjer je bil uveden dvoverižni prelom DNA s Cas9 [5].<br /> <br /> === Razvoj metanotrofnih kvasovk ===<br /> <br /> Geni, ki so jih vnesli v sev ''K. phaffii'' GS115, zapisujejo za kompleks pMMO, ki ga sestavljajo tri podenote PmoA, PmoB in PmoC. To so prokariontski geni, ki izhajajo iz metanotrofne gramnegativne bakterije ''M. capsulatus''. Za optimalno izražanje genov v ''K. phaffii'' so izvedli optimizacijo kodona. Za delovanje kompleksa pMMO se morajo vse tri podenote transportirati do membrane in tam pravilno povezati v nonamer (3α3β3γ). Kompleks se nahaja v celični membrani in omogoča najprej oksidacijo metana do metanola in nato še prenos metanola v celico [6]. Želeli so, da se podenote pMMO izražajo konstitutivno, da bi se metan lahko ob prisotnosti v mediju takoj pretvarjal. Načrtovali so matrice za popravljanje dvoverižnih prelomov, ki so vsebovale zapise za podenote pMMO in močne konstitutivne promotorje GAP1 in TEF1. V zapis so vključili tudi signalni peptid, ki je izhajal iz glikoziltransferaze ''K. phaffii'', ki je membranski protein. Lokalizacijo kompleksa so preverili z metodo DeepLoc. Za vnos genov so uporabili prej opisan sistem CRISPR/Cas9. Za preverjanje uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice so v genomu K. phaffii izbili neesencialne gene, ki so bili vključeni v nativnem metabolizmu metanola [7].<br /> <br /> == Rezultati ==<br /> <br /> V okviru projekta PHEAST so uspešno pripravili več različnih plazmidov CRISPR/Cas9 za usmerjeno urejanje genoma ''K. phaffii'' na različnih kromosomih. S temi plazmidi je omogočena delecija genov brez »brazgotin« ali stabilna integracija genov. Vrednotenje dela so razdelili na tri dele, in sicer najprej zasnovo sistemov CRISPR/Cas9, nato uporabo sistemov CRISPR/Cas9 za delecijo genov in nazadnje še integracijo genov v ''K. phaffii'' GS115. Uspešno so zasnovali sgRNA, ki ciljajo intergenske regije na štirih kromosomih, kar bi lahko v prihodnosti uporabili za urejanje genoma ''K. phaffii''. Z delecijo neesencialnih genov, vključenih v metabolizem metanola do formaldehida, so želeli pokazati, da ti geni rast le upočasnijo in ne povsem ustavijo. Prav tako jim je delecija teh genov služila pri preverjanju uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice. Pokazali so tudi, da je integracija v genom ''K. phaffii'' možna, čeprav jim ni uspelo vstaviti točno želene popravljalne matrice. <br /> <br /> == Uvedba v industriji ==<br /> <br /> ''K. phaffii'' je že industrijsko uveljavljen organizem za proizvodnjo rekombinantnih proteinov. Z uvedbo genov za kompleks pMMO bi ''K. phaffii'' postala metanotrofna in bi zato lahko predstavljala potencialen način odstranjevanja metana iz okolja. Metanotrofen sev ''K. phaffii'' bi gojili v fermentorju, do kamor bi transportirali metan. Razlog za to je evropska regulativa o GSO, ki narekuje, naj delo z GSO poteka v kontroliranem in zaprtem okolju. Zato se velik delež dela v prihodnosti usmerja v to, kako razviti učinkovito odstranjevanje metana, ki ne potrebuje GSO, da se bo to lahko izvajalo direktno na želenem mestu. Do takrat pa je najprej potreben zajem metana, po katerem bi se ta transportiral do fermentorja. Svojim strankam bi skupina ponudila tudi proizvajanje želenega proteina, ki bi ga ''K. phaffii'' proizvajala. Dodatno oviro predstavlja tudi slaba topnost metana v vodi, ampak naj bi element trajnostnega razvoja odtehtal slabši izkoristek. Skupina s svojim projektom cilja predvsem na kmetijstvo, saj bi stranke v sproščenem metanu lahko našle vrednost s pomočjo te proizvodne platforme, ki bi omogočala odstranjevanje metana in proizvodnjo proteinov kot hranil za živino. Projekt pa bi bil lahko pomemben tudi za oljno in premogovno industrijo, kjer je metan eden glavnih stranskih produktov.<br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> [1] S. Guerrero-Cruz, A. Vaksmaa, M. A. Horn, H. Niemann, M. Pijuan, A. Ho: Methanotrophs: Discoveries, Environmental Relevance, and a Perspective on Current and Future Applications. Front. Microbiol. 2021, 12.<br /> <br /> [2] H. J. Kim, J. Huh, Y. W. Kwon, D. Park, Y. Yu, Y. E. Jang, B. R. Lee, E. Jo, E. J. Lee, Y. Heo, et al.: Biological Conversion of Methane to Methanol through Genetic Reassembly of Native Catalytic Domains. Nat. Catal. 2019, 2, 342–353.<br /> <br /> [3] L. Bernauer, A. Radkohl, L. G. K. Lehmayer, A. Emmerstorfer-Augustin: Komagataella Phaffii as Emerging Model Organism in Fundamental Research. Front. Microbiol. 2021, 11.<br /> <br /> [4] L. Näätsaari, B. Mistlberger, C. Ruth, T. Hajek, F. S. Hartner, A. Glieder: Deletion of the Pichia Pastoris KU70 Homologue Facilitates Platform Strain Generation for Gene Expression and Synthetic Biology. PLoS One 2012, 7.<br /> <br /> [5] Q. Liu, X. Shi, L. Song, H. Liu, X. Zhou, Q. Wang, Y. Zhang, M. Cai: CRISPR-Cas9-Mediated Genomic Multiloci Integration in Pichia Pastoris. Microb. Cell Fact. 2019, 18.<br /> <br /> [6] M. Karbalaei, S. A. Rezaee, H. Farsiani: Pichia Pastoris: A Highly Successful Expression System for Optimal Synthesis of Heterologous Proteins. J. Cell. Physiol. 2020, 235, 5867–5881.<br /> <br /> [7] F. W. Krainer, C. Dietzsch, T. Hajek, C. Herwig, O. Spadiut, A. Glieder: Recombinant Protein Expression in Pichia Pastoris Strains with an Engineered Methanol Utilization Pathway. Microb. Cell Fact. 2012, 11.</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana&diff=20709 2022-05-02T22:21:07Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je s projektom PHEAST sodelovala na tekmovanju iGEM leta 2021 in se uvrstila med deset najboljših ekip.<br /> <br /> Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:DTU-Denmark<br /> <br /> Avtorica povzetka: Ana Potočnik<br /> <br /> <br /> == Problem ==<br /> <br /> Metan (CH&lt;sub&gt;4&lt;/) je toplogredni plin, katerega masni delež v ozračju je 0,0001 %. Industrija in kmetijstvo vsako leto v ozračje izpustita 570 milijonov ton metana. Njegov toplogredni učinek je tridesetkrat večji kot toplogredni učinek ogljikovega dioksida, zato je eden izmed ciljev trajnostnega razvoja tudi zmanjšanje izpustov metana oziroma razvoj metod, ki bi omogočale omilitev negativnih posledic izpustov. Trenutno je največji poudarek na zmanjšanju izpustov metana s spreminjanjem hrane živine, prav tako pa so tudi že aktualne strategije, ki temeljijo na odstranjevanju že izpuščenega metana. Mednje spadajo recikliranje in kompostiranje odpadkov, zajemanje metana ter sežiganje. Glavna vrednost metana je vir energije, ampak je zajemanje in sežiganje metana dražje v primerjavi z drugimi viri energije. Poleg tega se pri sežiganju sprošča ogljikov dioksid, ki je prav tako toplogredni plin. Jasno je, da doslej uporabljane metode bistveno ne zmanjšajo ravni izpustov metana, zato je potreba po učinkovitih strategijah za odstranjevanje metana iz atmosfere velika. Kot odgovor na okoljski stres so se že razvili organizmi, ki lahko preživijo v okoljih, bogatih z metanom. Najpogosteje jih najdemo na riževih poljih, v blatu, prsti ali na odlagališčih smeti. Največji pomen za spopadanje z okoljsko krizo imajo metanotrofne (metanofilne) bakterije. Ena izmed njih je gramnegativna bakterija ''Methylococcus capsulatus'', ki metan uporablja kot vir ogljika in ga pretvarja v metanol. Doslej niso našli višjih organizmov, ki bi lahko presnavljali metan, so pa odkrili seve kvasovk, ki so razvile učinkovite mehanizme za prevzem in pretvorbo metanola v biomaso in energijo na podlagi metabolnih poti, podobnih ''M. capsulatus'' [1, 2].<br /> <br /> == Cilj ==<br /> <br /> Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je v prej opisanem problemu videla možnost za razvoj seva kvasovk, ki bi metan lahko prevzemal iz okolja, ga presnavljal in s tem uporabljal kok vir ogljika. Za to nalogo so si izbrali kvasovko ''Komagataella phaffii'' (''Pichia pastoris''). ''K. phaffii'' je metilotrof, ki kot vir ogljika in energije uporablja metanol, prav tako pa je eden izmed organizmov, ki ga uporabljamo za industrijsko proizvodnjo proteinov. Njihova ideja je bila vključiti kompleks pMMO (''angl. particular methane monooxygeanse'') iz ''M. capsulatus'', ki pretvarja metan v metanol, ki ga ''K. phaffii'' lahko s pomočjo nativnih metabolnih poti uporabi kot vir ogljika in energije. Glavni cilj v okviru te ideje pa je bil razvoj javno dostopnih orodij za urejanje genoma ''K. phaffii'' za namen odstranjevanja metana. Doslej ta orodja v registru iGEM niso bila dostopna in kljub veliki razširjenosti ''K. phaffii'' v industriji je bil delež biokock v registru za ''K. phaffii'' (in ''P. pastoris'') manj kot 1 %.<br /> <br /> == Načrt in izvedba ==<br /> <br /> Za delecijo in integracijo genov v genom ''K. phaffii'' je skupina razvila sisteme CRISPR/Cas9 z uporabo orodij molekulskega kloniranja, tehnologije DNA in sintezne biologije. <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Izbrali so sev ''K. phaffii'' GS115 Δku70, ki nima gena ''ku70'', zaradi česar v celici ne more prihajati do spajanja nehomolognih koncev (NHEJ). Zaradi tega je celica za popravljanje dvoverižnih prelomov na DNA prisiljena uporabiti popravljanje s homologno rekombinacijo (HDR). To omogoči lažjo integracijo genov v genom ''K. phaffii'' [3]. <br /> <br /> === Orodje za delecijo in kromosomsko integracijo ===<br /> <br /> Za delecijo in integracijo so razvili sisteme CRISPR/Cas9. Glavni razlog za uporabo CRISPR/Cas9 sistemov je ta, da je tarčenje DNA z RNA bolj tehnično enostavno in časovno izvedljivo kot tarčenje DNA s proteinom. Najprej so na genomu v nekodirajočih regijah poiskali nevtralna integracijska mesta, dolga 500–2000 bp, ki so bila dovolj dostopna endonukleazi Cas9 (niso na telomerah). Na vsakem izmed štirih kromosomov so izbrali eno integracijsko mesto. Nato so po strogih kriterijih načrtovali 4 sgRNA, vsako za eno integracijsko mesto. Zapise za izbrane sgRNA in Cas9 so nato vnesli v vektorje. Vektorji so vsebovali še mesto ori, zapis za rezistenco proti ampicilinu, marker za kvasovke in GAP1. Za pripravo vektorjev so uporabili kloniranje in fuzijo USER (''angl. Uracil-Specific Excision Reagent''), ki omogoča direktno vstavljanje vključkov v kompatibilne vektorje USER s pomočjo zarezovalnega encima. Vektorje so nato klonirali v kompetentnih celicah ''E. coli'' DH5α. Učinkovitost tarčenja z različnimi sgRNA so testirali z metodo TAPE, kjer so pričakovali, da ima sev GS115 Δku70 nižjo viabilnost kot sev GS115 [4]. Ko so izbrali najbolj primerne sgRNA, so s pomočjo sistemov CRISPR/Cas9 lahko izbili določene gene, celice pa so kotransformirali z matrico, ki vsebuje dve 45 bp dolgi homologni zaporedji, ki se nahajata navzgor in navzdol od izbitega gena, in sodeluje pri popravljanju s homologno rekombinacijo. Gene so lahko tudi vstavili, če so celice kotransformirali z drugo matrico, ki prav tako vsebuje dve homologni zaporedji in med njima še zapis za promotor, želeni gen in terminator, kar omogoča vstavljanje gena na mesto, kjer je bil uveden dvoverižni prelom DNA s Cas9 [5].<br /> <br /> === Razvoj metanotrofnih kvasovk ===<br /> <br /> Geni, ki so jih vnesli v sev ''K. phaffii'' GS115, zapisujejo za kompleks pMMO, ki ga sestavljajo tri podenote PmoA, PmoB in PmoC. To so prokariontski geni, ki izhajajo iz metanotrofne gramnegativne bakterije ''M. capsulatus''. Za optimalno izražanje genov v ''K. phaffii'' so izvedli optimizacijo kodona. Za delovanje kompleksa pMMO se morajo vse tri podenote transportirati do membrane in tam pravilno povezati v nonamer (3α3β3γ). Kompleks se nahaja v celični membrani in omogoča najprej oksidacijo metana do metanola in nato še prenos metanola v celico [6]. Želeli so, da se podenote pMMO izražajo konstitutivno, da bi se metan lahko ob prisotnosti v mediju takoj pretvarjal. Načrtovali so matrice za popravljanje dvoverižnih prelomov, ki so vsebovale zapise za podenote pMMO in močne konstitutivne promotorje GAP1 in TEF1. V zapis so vključili tudi signalni peptid, ki je izhajal iz glikoziltransferaze ''K. phaffii'', ki je membranski protein. Lokalizacijo kompleksa so preverili z metodo DeepLoc. Za vnos genov so uporabili prej opisan sistem CRISPR/Cas9. Za preverjanje uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice so v genomu K. phaffii izbili neesencialne gene, ki so bili vključeni v nativnem metabolizmu metanola [7].<br /> <br /> == Rezultati ==<br /> <br /> V okviru projekta PHEAST so uspešno pripravili več različnih plazmidov CRISPR/Cas9 za usmerjeno urejanje genoma ''K. phaffii'' na različnih kromosomih. S temi plazmidi je omogočena delecija genov brez »brazgotin« ali stabilna integracija genov. Vrednotenje dela so razdelili na tri dele, in sicer najprej zasnovo sistemov CRISPR/Cas9, nato uporabo sistemov CRISPR/Cas9 za delecijo genov in nazadnje še integracijo genov v ''K. phaffii'' GS115. Uspešno so zasnovali sgRNA, ki ciljajo intergenske regije na štirih kromosomih, kar bi lahko v prihodnosti uporabili za urejanje genoma ''K. phaffii''. Z delecijo neesencialnih genov, vključenih v metabolizem metanola do formaldehida, so želeli pokazati, da ti geni rast le upočasnijo in ne povsem ustavijo. Prav tako jim je delecija teh genov služila pri preverjanju uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice. Pokazali so tudi, da je integracija v genom ''K. phaffii'' možna, čeprav jim ni uspelo vstaviti točno želene popravljalne matrice. <br /> <br /> == Uvedba v industriji ==<br /> <br /> ''K. phaffii'' je že industrijsko uveljavljen organizem za proizvodnjo rekombinantnih proteinov. Z uvedbo genov za kompleks pMMO bi ''K. phaffii'' postala metanotrofna in bi zato lahko predstavljala potencialen način odstranjevanja metana iz okolja. Metanotrofen sev ''K. phaffii'' bi gojili v fermentorju, do kamor bi transportirali metan. Razlog za to je evropska regulativa o GSO, ki narekuje, naj delo z GSO poteka v kontroliranem in zaprtem okolju. Zato se velik delež dela v prihodnosti usmerja v to, kako razviti učinkovito odstranjevanje metana, ki ne potrebuje GSO, da se bo to lahko izvajalo direktno na želenem mestu. Do takrat pa je najprej potreben zajem metana, po katerem bi se ta transportiral do fermentorja. Svojim strankam bi skupina ponudila tudi proizvajanje želenega proteina, ki bi ga ''K. phaffii'' proizvajala. Dodatno oviro predstavlja tudi slaba topnost metana v vodi, ampak naj bi element trajnostnega razvoja odtehtal slabši izkoristek. Skupina s svojim projektom cilja predvsem na kmetijstvo, saj bi stranke v sproščenem metanu lahko našle vrednost s pomočjo te proizvodne platforme, ki bi omogočala odstranjevanje metana in proizvodnjo proteinov kot hranil za živino. Projekt pa bi bil lahko pomemben tudi za oljno in premogovno industrijo, kjer je metan eden glavnih stranskih produktov.<br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> [1] S. Guerrero-Cruz, A. Vaksmaa, M. A. Horn, H. Niemann, M. Pijuan, A. Ho: Methanotrophs: Discoveries, Environmental Relevance, and a Perspective on Current and Future Applications. Front. Microbiol. 2021, 12.<br /> <br /> [2] H. J. Kim, J. Huh, Y. W. Kwon, D. Park, Y. Yu, Y. E. Jang, B. R. Lee, E. Jo, E. J. Lee, Y. Heo, et al.: Biological Conversion of Methane to Methanol through Genetic Reassembly of Native Catalytic Domains. Nat. Catal. 2019, 2, 342–353.<br /> <br /> [3] L. Bernauer, A. Radkohl, L. G. K. Lehmayer, A. Emmerstorfer-Augustin: Komagataella Phaffii as Emerging Model Organism in Fundamental Research. Front. Microbiol. 2021, 11.<br /> <br /> [4] L. Näätsaari, B. Mistlberger, C. Ruth, T. Hajek, F. S. Hartner, A. Glieder: Deletion of the Pichia Pastoris KU70 Homologue Facilitates Platform Strain Generation for Gene Expression and Synthetic Biology. PLoS One 2012, 7.<br /> <br /> [5] Q. Liu, X. Shi, L. Song, H. Liu, X. Zhou, Q. Wang, Y. Zhang, M. Cai: CRISPR-Cas9-Mediated Genomic Multiloci Integration in Pichia Pastoris. Microb. Cell Fact. 2019, 18.<br /> <br /> [6] M. Karbalaei, S. A. Rezaee, H. Farsiani: Pichia Pastoris: A Highly Successful Expression System for Optimal Synthesis of Heterologous Proteins. J. Cell. Physiol. 2020, 235, 5867–5881.<br /> <br /> [7] F. W. Krainer, C. Dietzsch, T. Hajek, C. Herwig, O. Spadiut, A. Glieder: Recombinant Protein Expression in Pichia Pastoris Strains with an Engineered Methanol Utilization Pathway. Microb. Cell Fact. 2012, 11.</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana&diff=20708 2022-05-02T22:17:32Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je s projektom PHEAST sodelovala na tekmovanju iGEM leta 2021 in se uvrstila med deset najboljših ekip.<br /> <br /> Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:DTU-Denmark<br /> <br /> Avtorica povzetka: Ana Potočnik<br /> <br /> <br /> == Problem ==<br /> <br /> Metan (CH4) je toplogredni plin, katerega masni delež v ozračju je 0,0001 %. Industrija in kmetijstvo vsako leto v ozračje izpustita 570 milijonov ton metana. Njegov toplogredni učinek je tridesetkrat večji kot toplogredni učinek ogljikovega dioksida, zato je eden izmed ciljev trajnostnega razvoja tudi zmanjšanje izpustov metana oziroma razvoj metod, ki bi omogočale omilitev negativnih posledic izpustov. Trenutno je največji poudarek na zmanjšanju izpustov metana s spreminjanjem hrane živine, prav tako pa so tudi že aktualne strategije, ki temeljijo na odstranjevanju že izpuščenega metana. Mednje spadajo recikliranje in kompostiranje odpadkov, zajemanje metana ter sežiganje. Glavna vrednost metana je vir energije, ampak je zajemanje in sežiganje metana dražje v primerjavi z drugimi viri energije. Poleg tega se pri sežiganju sprošča ogljikov dioksid, ki je prav tako toplogredni plin. Jasno je, da doslej uporabljane metode bistveno ne zmanjšajo ravni izpustov metana, zato je potreba po učinkovitih strategijah za odstranjevanje metana iz atmosfere velika. Kot odgovor na okoljski stres so se že razvili organizmi, ki lahko preživijo v okoljih, bogatih z metanom. Najpogosteje jih najdemo na riževih poljih, v blatu, prsti ali na odlagališčih smeti. Največji pomen za spopadanje z okoljsko krizo imajo metanotrofne (metanofilne) bakterije. Ena izmed njih je gramnegativna bakterija ''Methylococcus capsulatus'', ki metan uporablja kot vir ogljika in ga pretvarja v metanol. Doslej niso našli višjih organizmov, ki bi lahko presnavljali metan, so pa odkrili seve kvasovk, ki so razvile učinkovite mehanizme za prevzem in pretvorbo metanola v biomaso in energijo na podlagi metabolnih poti, podobnih ''M. capsulatus'' [1, 2].<br /> <br /> == Cilj ==<br /> <br /> Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je v prej opisanem problemu videla možnost za razvoj seva kvasovk, ki bi metan lahko prevzemal iz okolja, ga presnavljal in s tem uporabljal kok vir ogljika. Za to nalogo so si izbrali kvasovko ''Komagataella phaffii'' (''Pichia pastoris''). ''K. phaffii'' je metilotrof, ki kot vir ogljika in energije uporablja metanol, prav tako pa je eden izmed organizmov, ki ga uporabljamo za industrijsko proizvodnjo proteinov. Njihova ideja je bila vključiti kompleks pMMO (''angl. particular methane monooxygeanse'') iz ''M. capsulatus'', ki pretvarja metan v metanol, ki ga ''K. phaffii'' lahko s pomočjo nativnih metabolnih poti uporabi kot vir ogljika in energije. Glavni cilj v okviru te ideje pa je bil razvoj javno dostopnih orodij za urejanje genoma ''K. phaffii'' za namen odstranjevanja metana. Doslej ta orodja v registru iGEM niso bila dostopna in kljub veliki razširjenosti ''K. phaffii'' v industriji je bil delež biokock v registru za ''K. phaffii'' (in ''P. pastoris'') manj kot 1 %.<br /> <br /> == Načrt in izvedba ==<br /> <br /> Za delecijo in integracijo genov v genom ''K. phaffii'' je skupina razvila sisteme CRISPR/Cas9 z uporabo orodij molekulskega kloniranja, tehnologije DNA in sintezne biologije. <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Izbrali so sev ''K. phaffii'' GS115 Δku70, ki nima gena ''ku70'', zaradi česar v celici ne more prihajati do spajanja nehomolognih koncev (NHEJ). Zaradi tega je celica za popravljanje dvoverižnih prelomov na DNA prisiljena uporabiti popravljanje s homologno rekombinacijo (HDR). To omogoči lažjo integracijo genov v genom ''K. phaffii'' [3]. <br /> <br /> === Orodje za delecijo in kromosomsko integracijo ===<br /> <br /> Za delecijo in integracijo so razvili sisteme CRISPR/Cas9. Glavni razlog za uporabo CRISPR/Cas9 sistemov je ta, da je tarčenje DNA z RNA bolj tehnično enostavno in časovno izvedljivo kot tarčenje DNA s proteinom. Najprej so na genomu v nekodirajočih regijah poiskali nevtralna integracijska mesta, dolga 500–2000 bp, ki so bila dovolj dostopna endonukleazi Cas9 (niso na telomerah). Na vsakem izmed štirih kromosomov so izbrali eno integracijsko mesto. Nato so po strogih kriterijih načrtovali 4 sgRNA, vsako za eno integracijsko mesto. Zapise za izbrane sgRNA in Cas9 so nato vnesli v vektorje. Vektorji so vsebovali še mesto ori, zapis za rezistenco proti ampicilinu, marker za kvasovke in GAP1. Za pripravo vektorjev so uporabili kloniranje in fuzijo USER (''angl. Uracil-Specific Excision Reagent''), ki omogoča direktno vstavljanje vključkov v kompatibilne vektorje USER s pomočjo zarezovalnega encima. Vektorje so nato klonirali v kompetentnih celicah ''E. coli'' DH5α. Učinkovitost tarčenja z različnimi sgRNA so testirali z metodo TAPE, kjer so pričakovali, da ima sev GS115 Δku70 nižjo viabilnost kot sev GS115 [4]. Ko so izbrali najbolj primerne sgRNA, so s pomočjo sistemov CRISPR/Cas9 lahko izbili določene gene, celice pa so kotransformirali z matrico, ki vsebuje dve 45 bp dolgi homologni zaporedji, ki se nahajata navzgor in navzdol od izbitega gena, in sodeluje pri popravljanju s homologno rekombinacijo. Gene so lahko tudi vstavili, če so celice kotransformirali z drugo matrico, ki prav tako vsebuje dve homologni zaporedji in med njima še zapis za promotor, želeni gen in terminator, kar omogoča vstavljanje gena na mesto, kjer je bil uveden dvoverižni prelom DNA s Cas9 [5].<br /> <br /> === Razvoj metanotrofnih kvasovk ===<br /> <br /> Geni, ki so jih vnesli v sev ''K. phaffii'' GS115, zapisujejo za kompleks pMMO, ki ga sestavljajo tri podenote PmoA, PmoB in PmoC. To so prokariontski geni, ki izhajajo iz metanotrofne gramnegativne bakterije ''M. capsulatus''. Za optimalno izražanje genov v ''K. phaffii'' so izvedli optimizacijo kodona. Za delovanje kompleksa pMMO se morajo vse tri podenote transportirati do membrane in tam pravilno povezati v nonamer (3α3β3γ). Kompleks se nahaja v celični membrani in omogoča najprej oksidacijo metana do metanola in nato še prenos metanola v celico [6]. Želeli so, da se podenote pMMO izražajo konstitutivno, da bi se metan lahko ob prisotnosti v mediju takoj pretvarjal. Načrtovali so matrice za popravljanje dvoverižnih prelomov, ki so vsebovale zapise za podenote pMMO in močne konstitutivne promotorje GAP1 in TEF1. V zapis so vključili tudi signalni peptid, ki je izhajal iz glikoziltransferaze ''K. phaffii'', ki je membranski protein. Lokalizacijo kompleksa so preverili z metodo DeepLoc. Za vnos genov so uporabili prej opisan sistem CRISPR/Cas9. Za preverjanje uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice so v genomu K. phaffii izbili neesencialne gene, ki so bili vključeni v nativnem metabolizmu metanola [7].<br /> <br /> == Rezultati ==<br /> <br /> V okviru projekta PHEAST so uspešno pripravili več različnih plazmidov CRISPR/Cas9 za usmerjeno urejanje genoma ''K. phaffii'' na različnih kromosomih. S temi plazmidi je omogočena delecija genov brez »brazgotin« ali stabilna integracija genov. Vrednotenje dela so razdelili na tri dele, in sicer najprej zasnovo sistemov CRISPR/Cas9, nato uporabo sistemov CRISPR/Cas9 za delecijo genov in nazadnje še integracijo genov v ''K. phaffii'' GS115. Uspešno so zasnovali sgRNA, ki ciljajo intergenske regije na štirih kromosomih, kar bi lahko v prihodnosti uporabili za urejanje genoma ''K. phaffii''. Z delecijo neesencialnih genov, vključenih v metabolizem metanola do formaldehida, so želeli pokazati, da ti geni rast le upočasnijo in ne povsem ustavijo. Prav tako jim je delecija teh genov služila pri preverjanju uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice. Pokazali so tudi, da je integracija v genom ''K. phaffii'' možna, čeprav jim ni uspelo vstaviti točno želene popravljalne matrice. <br /> <br /> == Uvedba v industriji ==<br /> <br /> ''K. phaffii'' je že industrijsko uveljavljen organizem za proizvodnjo rekombinantnih proteinov. Z uvedbo genov za kompleks pMMO bi ''K. phaffii'' postala metanotrofna in bi zato lahko predstavljala potencialen način odstranjevanja metana iz okolja. Metanotrofen sev ''K. phaffii'' bi gojili v fermentorju, do kamor bi transportirali metan. Razlog za to je evropska regulativa o GSO, ki narekuje, naj delo z GSO poteka v kontroliranem in zaprtem okolju. Zato se velik delež dela v prihodnosti usmerja v to, kako razviti učinkovito odstranjevanje metana, ki ne potrebuje GSO, da se bo to lahko izvajalo direktno na želenem mestu. Do takrat pa je najprej potreben zajem metana, po katerem bi se ta transportiral do fermentorja. Svojim strankam bi skupina ponudila tudi proizvajanje želenega proteina, ki bi ga ''K. phaffii'' proizvajala. Dodatno oviro predstavlja tudi slaba topnost metana v vodi, ampak naj bi element trajnostnega razvoja odtehtal slabši izkoristek. Skupina s svojim projektom cilja predvsem na kmetijstvo, saj bi stranke v sproščenem metanu lahko našle vrednost s pomočjo te proizvodne platforme, ki bi omogočala odstranjevanje metana in proizvodnjo proteinov kot hranil za živino. Projekt pa bi bil lahko pomemben tudi za oljno in premogovno industrijo, kjer je metan eden glavnih stranskih produktov.<br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> [1] S. Guerrero-Cruz, A. Vaksmaa, M. A. Horn, H. Niemann, M. Pijuan, A. Ho: Methanotrophs: Discoveries, Environmental Relevance, and a Perspective on Current and Future Applications. Front. Microbiol. 2021, 12.<br /> <br /> [2] H. J. Kim, J. Huh, Y. W. Kwon, D. Park, Y. Yu, Y. E. Jang, B. R. Lee, E. Jo, E. J. Lee, Y. Heo, et al.: Biological Conversion of Methane to Methanol through Genetic Reassembly of Native Catalytic Domains. Nat. Catal. 2019, 2, 342–353.<br /> <br /> [3] L. Bernauer, A. Radkohl, L. G. K. Lehmayer, A. Emmerstorfer-Augustin: Komagataella Phaffii as Emerging Model Organism in Fundamental Research. Front. Microbiol. 2021, 11.<br /> <br /> [4] L. Näätsaari, B. Mistlberger, C. Ruth, T. Hajek, F. S. Hartner, A. Glieder: Deletion of the Pichia Pastoris KU70 Homologue Facilitates Platform Strain Generation for Gene Expression and Synthetic Biology. PLoS One 2012, 7.<br /> <br /> [5] Q. Liu, X. Shi, L. Song, H. Liu, X. Zhou, Q. Wang, Y. Zhang, M. Cai: CRISPR-Cas9-Mediated Genomic Multiloci Integration in Pichia Pastoris. Microb. Cell Fact. 2019, 18.<br /> <br /> [6] M. Karbalaei, S. A. Rezaee, H. Farsiani: Pichia Pastoris: A Highly Successful Expression System for Optimal Synthesis of Heterologous Proteins. J. Cell. Physiol. 2020, 235, 5867–5881.<br /> <br /> [7] F. W. Krainer, C. Dietzsch, T. Hajek, C. Herwig, O. Spadiut, A. Glieder: Recombinant Protein Expression in Pichia Pastoris Strains with an Engineered Methanol Utilization Pathway. Microb. Cell Fact. 2012, 11.</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana&diff=20707 2022-05-02T21:59:05Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je s projektom PHEAST sodelovala na tekmovanju iGEM leta 2021 in se uvrstila med deset najboljših ekip.<br /> <br /> Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:DTU-Denmark<br /> <br /> Avtorica povzetka: Ana Potočnik<br /> <br /> <br /> == Problem ==<br /> <br /> Metan (CH4) je toplogredni plin, katerega masni delež v ozračju je 0,0001 %. Industrija in kmetijstvo vsako leto v ozračje izpustita 570 milijonov ton metana. Njegov toplogredni učinek je tridesetkrat večji kot toplogredni učinek ogljikovega dioksida, zato je eden izmed ciljev trajnostnega razvoja tudi zmanjšanje izpustov metana oziroma razvoj metod, ki bi omogočale omilitev negativnih posledic izpustov. Trenutno je največji poudarek na zmanjšanju izpustov metana s spreminjanjem hrane živine, prav tako pa so tudi že aktualne strategije, ki temeljijo na odstranjevanju že izpuščenega metana. Mednje spadajo recikliranje in kompostiranje odpadkov, zajemanje metana ter sežiganje. Glavna vrednost metana je vir energije, ampak je zajemanje in sežiganje metana dražje v primerjavi z drugimi viri energije. Poleg tega se pri sežiganju sprošča ogljikov dioksid, ki je prav tako toplogredni plin. Jasno je, da doslej uporabljane metode bistveno ne zmanjšajo ravni izpustov metana, zato je potreba po učinkovitih strategijah za odstranjevanje metana iz atmosfere velika. Kot odgovor na okoljski stres so se že razvili organizmi, ki lahko preživijo v okoljih, bogatih z metanom. Najpogosteje jih najdemo na riževih poljih, v blatu, prsti ali na odlagališčih smeti. Največji pomen za spopadanje z okoljsko krizo imajo metanotrofne (metanofilne) bakterije. Ena izmed njih je gramnegativna bakterija ''Methylococcus capsulatus'', ki metan uporablja kot vir ogljika in ga pretvarja v metanol. Doslej niso našli višjih organizmov, ki bi lahko presnavljali metan, so pa odkrili seve kvasovk, ki so razvile učinkovite mehanizme za prevzem in pretvorbo metanola v biomaso in energijo na podlagi metabolnih poti, podobnih ''M. capsulatus'' [1, 2].<br /> <br /> == Cilj ==<br /> <br /> Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je v prej opisanem problemu videla možnost za razvoj seva kvasovk, ki bi metan lahko prevzemal iz okolja, ga presnavljal in s tem uporabljal kok vir ogljika. Za to nalogo so si izbrali kvasovko ''Komagataella phaffii'' (''Pichia pastoris''). ''K. phaffii'' je metilotrof, ki kot vir ogljika in energije uporablja metanol, prav tako pa je eden izmed organizmov, ki ga uporabljamo za industrijsko proizvodnjo proteinov. Njihova ideja je bila vključiti kompleks pMMO (''angl. particular methane monooxygeanse'') iz ''M. capsulatus'', ki pretvarja metan v metanol, ki ga ''K. phaffii'' lahko s pomočjo nativnih metabolnih poti uporabi kot vir ogljika in energije. Glavni cilj v okviru te ideje pa je bil razvoj javno dostopnih orodij za urejanje genoma ''K. phaffii'' za namen odstranjevanja metana. Doslej ta orodja v registru iGEM niso bila dostopna in kljub veliki razširjenosti ''K. phaffii'' v industriji je bil delež biokock v registru za ''K. phaffii'' (in ''P. pastoris'') manj kot 1 %.<br /> <br /> == Načrt in izvedba ==<br /> <br /> Za delecijo in integracijo genov v genom ''K. phaffii'' je skupina razvila sisteme CRISPR/Cas9 z uporabo orodij molekulskega kloniranja, tehnologije DNA in sintezne biologije. <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Izbrali so sev ''K. phaffii'' GS115 Δku70, ki nima gena ''ku70'', zaradi česar v celici ne more prihajati do spajanja nehomolognih koncev (NHEJ). Zaradi tega je celica za popravljanje dvoverižnih prelomov na DNA prisiljena uporabiti popravljanje s homologno rekombinacijo (HDR). To omogoči lažjo integracijo genov v genom ''K. phaffii'' [3]. <br /> <br /> === Orodje za delecijo in kromosomsko integracijo ===<br /> <br /> Za delecijo in integracijo so razvili sisteme CRISPR/Cas9. Glavni razlog za uporabo CRISPR/Cas9 sistemov je ta, da je tarčenje DNA z RNA bolj tehnično enostavno in časovno izvedljivo kot tarčenje DNA s proteinom. Najprej so na genomu v nekodirajočih regijah poiskali nevtralna integracijska mesta, dolga 500 – 2000 bp, ki so bila dovolj dostopna endonukleazi Cas9 (niso na telomerah). Na vsakem izmed štirih kromosomov so izbrali eno integracijsko mesto. Nato so po strogih kriterijih načrtovali 4 sgRNA, vsako za eno integracijsko mesto. Zapise za izbrane sgRNA in Cas9 so nato vnesli v vektorje. Vektorji so vsebovali še mesto ori, zapis za rezistenco proti ampicilinu, marker za kvasovke in GAP1. Za pripravo vektorjev so uporabili kloniranje in fuzijo USER (''angl. Uracil-Specific Excision Reagent''), ki omogoča direktno vstavljanje vključkov v kompatibilne vektorje USER s pomočjo zarezovalnega encima. Vektorje so nato klonirali v kompetentnih celicah ''E. coli'' DH5α. Učinkovitost tarčenja z različnimi sgRNA so testirali z metodo TAPE, kjer so pričakovali, da ima sev GS115 Δku70 nižjo viabilnost kot sev GS115 [4]. Ko so izbrali najbolj primerne sgRNA, so s pomočjo sistemov CRISPR/Cas9 lahko izbili določene gene, celice pa so kotransformirali z matrico, ki vsebuje dve 45 bp dolgi homologni zaporedji, ki se nahajata navzgor in navzdol od izbitega gena, in sodeluje pri popravljanju s homologno rekombinacijo. Gene so lahko tudi vstavili, če so celice kotransformirali z drugo matrico, ki prav tako vsebuje dve homologni zaporedji in med njima še zapis za promotor, želeni gen in terminator, kar omogoča vstavljanje gena na mesto, kjer je bil uveden dvoverižni prelom DNA s Cas9 [5].<br /> <br /> === Razvoj metanotrofnih kvasovk ===<br /> <br /> Geni, ki so jih vnesli v sev ''K. phaffii'' GS115, zapisujejo za kompleks pMMO, ki ga sestavljajo tri podenote PmoA, PmoB in PmoC. To so prokariontski geni, ki izhajajo iz metanotrofne gramnegativne bakterije ''M. capsulatus''. Za optimalno izražanje genov v ''K. phaffii'' so izvedli optimizacijo kodona. Za delovanje kompleksa pMMO se morajo vse tri podenote transportirati do membrane in tam pravilno povezati v nonamer (3α3β3γ). Kompleks se nahaja v celični membrani in omogoča najprej oksidacijo metana do metanola in nato še prenos metanola v celico [6]. Želeli so, da se podenote pMMO izražajo konstitutivno, da bi se metan lahko ob prisotnosti v mediju takoj pretvarjal. Načrtovali so matrice za popravljanje dvoverižnih prelomov, ki so vsebovale zapise za podenote pMMO in močne konstitutivne promotorje GAP1 in TEF1. V zapis so vključili tudi signalni peptid, ki je izhajal iz glikoziltransferaze ''K. phaffii'', ki je membranski protein. Lokalizacijo kompleksa so preverili z metodo DeepLoc. Za vnos genov so uporabili prej opisan sistem CRISPR/Cas9. Za preverjanje uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice so v genomu K. phaffii izbili neesencialne gene, ki so bili vključeni v nativnem metabolizmu metanola [7].<br /> <br /> == Rezultati ==<br /> <br /> V okviru projekta PHEAST so uspešno pripravili več različnih plazmidov CRISPR/Cas9 za usmerjeno urejanje genoma ''K. phaffii'' na različnih kromosomih. S temi plazmidi je omogočena delecija genov brez »brazgotin« ali stabilna integracija genov. Vrednotenje dela so razdelili na tri dele, in sicer najprej zasnovo sistemov CRISPR/Cas9, nato uporabo sistemov CRISPR/Cas9 za delecijo genov in nazadnje še integracijo genov v ''K. phaffii'' GS115. Uspešno so zasnovali sgRNA, ki ciljajo intergenske regije na štirih kromosomih, kar bi lahko v prihodnosti uporabili za urejanje genoma ''K. phaffii''. Z delecijo neesencialnih genov, vključenih v metabolizem metanola do formaldehida, so želeli pokazati, da ti geni rast le upočasnijo in ne povsem ustavijo. Prav tako jim je delecija teh genov služila pri preverjanju uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice. Pokazali so tudi, da je integracija v genom ''K. phaffii'' možna, čeprav jim ni uspelo vstaviti točno želene popravljalne matrice. <br /> <br /> == Uvedba v industriji ==<br /> <br /> ''K. phaffii'' je že industrijsko uveljavljen organizem za proizvodnjo rekombinantnih proteinov. Z uvedbo genov za kompleks pMMO bi ''K. phaffii'' postala metanotrofna in bi zato lahko predstavljala potencialen način odstranjevanja metana iz okolja. Metanotrofen sev ''K. phaffii'' bi gojili v fermentorju, do kamor bi transportirali metan. Razlog za to je evropska regulativa o GSO, ki narekuje, naj delo z GSO poteka v kontroliranem in zaprtem okolju. Zato se velik delež dela v prihodnosti usmerja v to, kako razviti učinkovito odstranjevanje metana, ki ne potrebuje GSO, da se bo to lahko izvajalo direktno na želenem mestu. Do takrat pa je najprej potreben zajem metana, po katerem bi se ta transportiral do fermentorja. Svojim strankam bi skupina ponudila tudi proizvajanje želenega proteina, ki bi ga ''K. phaffii'' proizvajala. Dodatno oviro predstavlja tudi slaba topnost metana v vodi, ampak naj bi element trajnostnega razvoja odtehtal slabši izkoristek. Skupina s svojim projektom cilja predvsem na kmetijstvo, saj bi stranke v sproščenem metanu lahko našle vrednost s pomočjo te proizvodne platforme, ki bi omogočala odstranjevanje metana in proizvodnjo proteinov kot hranil za živino. Projekt pa bi bil lahko pomemben tudi za oljno in premogovno industrijo, kjer je metan eden glavnih stranskih produktov.<br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> [1] S. Guerrero-Cruz, A. Vaksmaa, M. A. Horn, H. Niemann, M. Pijuan, A. Ho: Methanotrophs: Discoveries, Environmental Relevance, and a Perspective on Current and Future Applications. Front. Microbiol. 2021, 12.<br /> <br /> [2] H. J. Kim, J. Huh, Y. W. Kwon, D. Park, Y. Yu, Y. E. Jang, B. R. Lee, E. Jo, E. J. Lee, Y. Heo, et al.: Biological Conversion of Methane to Methanol through Genetic Reassembly of Native Catalytic Domains. Nat. Catal. 2019, 2, 342–353.<br /> <br /> [3] L. Bernauer, A. Radkohl, L. G. K. Lehmayer, A. Emmerstorfer-Augustin: Komagataella Phaffii as Emerging Model Organism in Fundamental Research. Front. Microbiol. 2021, 11.<br /> <br /> [4] L. Näätsaari, B. Mistlberger, C. Ruth, T. Hajek, F. S. Hartner, A. Glieder: Deletion of the Pichia Pastoris KU70 Homologue Facilitates Platform Strain Generation for Gene Expression and Synthetic Biology. PLoS One 2012, 7.<br /> <br /> [5] Q. Liu, X. Shi, L. Song, H. Liu, X. Zhou, Q. Wang, Y. Zhang, M. Cai: CRISPR-Cas9-Mediated Genomic Multiloci Integration in Pichia Pastoris. Microb. Cell Fact. 2019, 18.<br /> <br /> [6] M. Karbalaei, S. A. Rezaee, H. Farsiani: Pichia Pastoris: A Highly Successful Expression System for Optimal Synthesis of Heterologous Proteins. J. Cell. Physiol. 2020, 235, 5867–5881.<br /> <br /> [7] F. W. Krainer, C. Dietzsch, T. Hajek, C. Herwig, O. Spadiut, A. Glieder: Recombinant Protein Expression in Pichia Pastoris Strains with an Engineered Methanol Utilization Pathway. Microb. Cell Fact. 2012, 11.</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana&diff=20706 2022-05-02T21:57:26Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je s projektom PHEAST sodelovala na tekmovanju iGEM leta 2021 in se uvrstila med deset najboljših ekip.<br /> <br /> Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:DTU-Denmark<br /> <br /> Avtorica povzetka: Ana Potočnik<br /> <br /> <br /> == Problem ==<br /> <br /> Metan (CH4) je toplogredni plin, katerega masni delež v ozračju je 0,0001 %. Industrija in kmetijstvo vsako leto v ozračje izpustita 570 milijonov ton metana. Njegov toplogredni učinek je tridesetkrat večji kot toplogredni učinek ogljikovega dioksida, zato je eden izmed ciljev trajnostnega razvoja tudi zmanjšanje izpustov metana oziroma razvoj metod, ki bi omogočale omilitev negativnih posledic izpustov. Trenutno je največji poudarek na zmanjšanju izpustov metana s spreminjanjem hrane živine, prav tako pa so tudi že aktualne strategije, ki temeljijo na odstranjevanju že izpuščenega metana. Mednje spadajo recikliranje in kompostiranje odpadkov, zajemanje metana ter sežiganje. Glavna vrednost metana je vir energije, ampak je zajemanje in sežiganje metana dražje v primerjavi z drugimi viri energije. Poleg tega se pri sežiganju sprošča ogljikov dioksid, ki je prav tako toplogredni plin. Jasno je, da doslej uporabljane metode bistveno ne zmanjšajo ravni izpustov metana, zato je potreba po učinkovitih strategijah za odstranjevanje metana iz atmosfere velika. Kot odgovor na okoljski stres so se že razvili organizmi, ki lahko preživijo v okoljih, bogatih z metanom. Najpogosteje jih najdemo na riževih poljih, v blatu, prsti ali na odlagališčih smeti. Največji pomen za spopadanje z okoljsko krizo imajo metanotrofne (metanofilne) bakterije. Ena izmed njih je gramnegativna bakterija ''Methylococcus capsulatus'', ki metan uporablja kot vir ogljika in ga pretvarja v metanol. Doslej niso našli višjih organizmov, ki bi lahko presnavljali metan, so pa odkrili seve kvasovk, ki so razvile učinkovite mehanizme za prevzem in pretvorbo metanola v biomaso in energijo na podlagi metabolnih poti, podobnih ''M. capsulatus'' [1, 2].<br /> <br /> == Cilj ==<br /> <br /> Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je v prej opisanem problemu videla možnost za razvoj seva kvasovk, ki bi metan lahko prevzemal iz okolja, ga presnavljal in s tem uporabljal kok vir ogljika. Za to nalogo so si izbrali kvasovko ''Komagataella phaffii'' (''Pichia pastoris''). ''K. phaffii'' je metilotrof, ki kot vir ogljika in energije uporablja metanol, prav tako pa je eden izmed organizmov, ki ga uporabljamo za industrijsko proizvodnjo proteinov. Njihova ideja je bila vključiti kompleks pMMO (''angl. particular methane monooxygeanse'') iz ''M. capsulatus'', ki pretvarja metan v metanol, ki ga ''K. phaffii'' lahko s pomočjo nativnih metabolnih poti uporabi kot vir ogljika in energije. Glavni cilj v okviru te ideje pa je bil razvoj javno dostopnih orodij za urejanje genoma ''K. phaffii'' za namen odstranjevanja metana. Doslej ta orodja v registru iGEM niso bila dostopna in kljub veliki razširjenosti ''K. phaffii'' v industriji je bil delež biokock v registru za ''K. phaffii'' (in ''P. pastoris'') manj kot 1 %.<br /> <br /> == Načrt in izvedba ==<br /> <br /> Za delecijo in integracijo genov v genom ''K. phaffii'' je skupina razvila sisteme CRISPR/Cas9 z uporabo orodij molekulskega kloniranja, tehnologije DNA in sintezne biologije. <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Izbrali so sev ''K. phaffii'' GS115 Δku70, ki nima gena ''ku70'', zaradi česar v celici ne more prihajati do spajanja nehomolognih koncev (NHEJ). Zaradi tega je celica za popravljanje dvoverižnih prelomov na DNA prisiljena uporabiti popravljanje s homologno rekombinacijo (HDR). To omogoči lažjo integracijo genov v genom ''K. phaffii'' [3]. <br /> <br /> === Orodje za delecijo in kromosomsko integracijo ===<br /> <br /> Za delecijo in integracijo so razvili sisteme CRISPR/Cas9. Glavni razlog za uporabo CRISPR/Cas9 sistemov je ta, da je tarčenje DNA z RNA bolj tehnično enostavno in časovno izvedljivo kot tarčenje DNA s proteinom. Najprej so na genomu v nekodirajočih regijah poiskali nevtralna integracijska mesta, dolga 500 – 2000 bp, ki so bila dovolj dostopna endonukleazi Cas9 (niso na telomerah). Na vsakem izmed štirih kromosomov so izbrali eno integracijsko mesto. Nato so po strogih kriterijih načrtovali 4 sgRNA, vsako za eno integracijsko mesto. Zapise za izbrane sgRNA in Cas9 so nato vnesli v vektorje. Vektorji so vsebovali še mesto ori, zapis za rezistenco proti ampicilinu, marker za kvasovke in GAP1. Za pripravo vektorjev so uporabili kloniranje in fuzijo USER (''angl. Uracil-Specific Excision Reagent''), ki omogoča direktno vstavljanje vključkov v kompatibilne vektorje USER s pomočjo zarezovalnega encima. Vektorje so nato klonirali v kompetentnih celicah ''E. coli'' DH5α. Učinkovitost tarčenja z različnimi sgRNA so testirali z metodo TAPE, kjer so pričakovali, da ima sev GS115 Δku70 nižjo viabilnost kot sev GS115 [4]. Ko so izbrali najbolj primerne sgRNA, so s pomočjo sistemov CRISPR/Cas9 lahko izbili določene gene, celice pa so kotransformirali z matrico, ki vsebuje dve 45 bp dolgi homologni zaporedji, ki se nahajata navzgor in navzdol od izbitega gena, in sodeluje pri popravljanju s homologno rekombinacijo. Gene so lahko tudi vstavili, če so celice kotransformirali z drugo matrico, ki prav tako vsebuje dve homologni zaporedji in med njima še zapis za promotor, želeni gen in terminator, kar omogoča vstavljanje gena na mesto, kjer je bil uveden dvoverižni prelom DNA s Cas9 [5].<br /> <br /> === Razvoj metanotrofnih kvasovk ===<br /> <br /> Geni, ki so jih vnesli v sev ''K. phaffii'' GS115, zapisujejo za kompleks pMMO, ki ga sestavljajo tri podenote PmoA, PmoB in PmoC. To so prokariontski geni, ki izhajajo iz metanotrofne gramnegativne bakterije ''M. capsulatus''. Za optimalno izražanje genov v ''K. phaffii'' so izvedli optimizacijo kodona. Za delovanje kompleksa pMMO se morajo vse tri podenote transportirati do membrane in tam pravilno povezati v nonamer (3α3β3γ). Kompleks se nahaja v celični membrani in omogoča najprej oksidacijo metana do metanola in nato še prenos metanola v celico [6]. Želeli so, da se podenote pMMO izražajo konstitutivno, da bi se metan lahko ob prisotnosti v mediju takoj pretvarjal. Načrtovali so matrice za popravljanje dvoverižnih prelomov, ki so vsebovale zapise za podenote pMMO in močne konstitutivne promotorje GAP1 in TEF1. V zapis so vključili tudi signalni peptid, ki je izhajal iz glikoziltransferaze ''K. phaffii'', ki je membranski protein. Lokalizacijo kompleksa so preverili z metodo DeepLoc. Za vnos genov so uporabili prej opisan sistem CRISPR/Cas9. Za preverjanje uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice so v genomu K. phaffii izbili neesencialne gene, ki so bili vključeni v nativnem metabolizmu metanola [7].<br /> <br /> == Rezultati ==<br /> <br /> V okviru projekta PHEAST so uspešno pripravili več različnih plazmidov CRISPR/Cas9 za usmerjeno urejanje genoma ''K. phaffii'' na različnih kromosomih. S temi plazmidi je omogočena delecija genov brez »brazgotin« ali stabilna integracija genov. Vrednotenje dela so razdelili na tri dele, in sicer najprej zasnovo sistemov CRISPR/Cas9, nato uporabo sistemov CRISPR/Cas9 za delecijo genov in nazadnje še integracijo genov v ''K. phaffii'' GS115. Uspešno so zasnovali sgRNA, ki ciljajo intergenske regije na štirih kromosomih, kar bi lahko v prihodnosti uporabili za urejanje genoma ''K. phaffii''. Z delecijo neesencialnih genov, vključenih v metabolizem metanola do formaldehida, so želeli pokazati, da ti geni rast le upočasnijo in ne povsem ustavijo. Prav tako jim je delecija teh genov služila pri preverjanju uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice. Pokazali so tudi, da je integracija v genom ''K. phaffii'' možna, čeprav jim ni uspelo vstaviti točno želene popravljalne matrice. <br /> <br /> == Uvedba v industriji ==<br /> <br /> ''K. phaffii'' je že industrijsko uveljavljen organizem za proizvodnjo rekombinantnih proteinov. Z uvedbo genov za kompleks pMMO bi ''K. phaffii'' postala metanotrofna in bi zato lahko predstavljala potencialen način odstranjevanja metana iz okolja. Metanotrofen sev ''K. phaffii'' bi gojili v fermentorju, do kamor bi transportirali metan. Razlog za to je evropska regulativa o GSO, ki narekuje, naj delo z GSO poteka v kontroliranem in zaprtem okolju. Zato se velik delež dela v prihodnosti usmerja v to, kako razviti učinkovito odstranjevanje metana, ki ne potrebuje GSO, da se bo to lahko izvajalo direktno na želenem mestu. Do takrat pa je najprej potreben zajem metana, po katerem bi se ta transportiral do fermentorja. Svojim strankam bi skupina ponudila tudi proizvajanje želenega proteina, ki bi ga ''K. phaffii'' proizvajala. Dodatno oviro predstavlja tudi slaba topnost metana v vodi, ampak naj bi element trajnostnega razvoja odtehtal slabši izkoristek. Skupina s svojim projektom cilja predvsem na kmetijstvo, saj bi stranke v sproščenem metanu lahko našle vrednost s pomočjo te proizvodne platforme, ki bi omogočala odstranjevanje metana in proizvodnjo proteinov kot hranil za živino. Projekt pa bi bil lahko pomemben tudi za oljno in premogovno industrijo, kjer je metan eden glavnih stranskih produktov.<br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> [1] S. Guerrero-Cruz, A. Vaksmaa, M. A. Horn, H. Niemann, M. Pijuan, A. Ho: Methanotrophs: Discoveries, Environmental Relevance, and a Perspective on Current and Future Applications. Front. Microbiol. 2021, 12.<br /> [2] H. J. Kim, J. Huh, Y. W. Kwon, D. Park, Y. Yu, Y. E. Jang, B. R. Lee, E. Jo, E. J. Lee, Y. Heo, et al.: Biological Conversion of Methane to Methanol through Genetic Reassembly of Native Catalytic Domains. Nat. Catal. 2019, 2, 342–353.<br /> [3] L. Bernauer, A. Radkohl, L. G. K. Lehmayer, A. Emmerstorfer-Augustin: Komagataella Phaffii as Emerging Model Organism in Fundamental Research. Front. Microbiol. 2021, 11.<br /> [4] L. Näätsaari, B. Mistlberger, C. Ruth, T. Hajek, F. S. Hartner, A. Glieder: Deletion of the Pichia Pastoris KU70 Homologue Facilitates Platform Strain Generation for Gene Expression and Synthetic Biology. PLoS One 2012, 7.<br /> [5] Q. Liu, X. Shi, L. Song, H. Liu, X. Zhou, Q. Wang, Y. Zhang, M. Cai: CRISPR-Cas9-Mediated Genomic Multiloci Integration in Pichia Pastoris. Microb. Cell Fact. 2019, 18.<br /> [6] M. Karbalaei, S. A. Rezaee, H. Farsiani: Pichia Pastoris: A Highly Successful Expression System for Optimal Synthesis of Heterologous Proteins. J. Cell. Physiol. 2020, 235, 5867–5881.<br /> [7] F. W. Krainer, C. Dietzsch, T. Hajek, C. Herwig, O. Spadiut, A. Glieder: Recombinant Protein Expression in Pichia Pastoris Strains with an Engineered Methanol Utilization Pathway. Microb. Cell Fact. 2012, 11.</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana&diff=20705 2022-05-02T21:56:38Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je s projektom PHEAST sodelovala na tekmovanju iGEM leta 2021 in se uvrstila med deset najboljših ekip.<br /> <br /> Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:DTU-Denmark<br /> <br /> Avtorica povzetka: Ana Potočnik<br /> <br /> <br /> == Problem ==<br /> <br /> Metan (CH4) je toplogredni plin, katerega masni delež v ozračju je 0,0001 %. Industrija in kmetijstvo vsako leto v ozračje izpustita 570 milijonov ton metana. Njegov toplogredni učinek je tridesetkrat večji kot toplogredni učinek ogljikovega dioksida, zato je eden izmed ciljev trajnostnega razvoja tudi zmanjšanje izpustov metana oziroma razvoj metod, ki bi omogočale omilitev negativnih posledic izpustov. Trenutno je največji poudarek na zmanjšanju izpustov metana s spreminjanjem hrane živine, prav tako pa so tudi že aktualne strategije, ki temeljijo na odstranjevanju že izpuščenega metana. Mednje spadajo recikliranje in kompostiranje odpadkov, zajemanje metana ter sežiganje. Glavna vrednost metana je vir energije, ampak je zajemanje in sežiganje metana dražje v primerjavi z drugimi viri energije. Poleg tega se pri sežiganju sprošča ogljikov dioksid, ki je prav tako toplogredni plin. Jasno je, da doslej uporabljane metode bistveno ne zmanjšajo ravni izpustov metana, zato je potreba po učinkovitih strategijah za odstranjevanje metana iz atmosfere velika. Kot odgovor na okoljski stres so se že razvili organizmi, ki lahko preživijo v okoljih, bogatih z metanom. Najpogosteje jih najdemo na riževih poljih, v blatu, prsti ali na odlagališčih smeti. Največji pomen za spopadanje z okoljsko krizo imajo metanotrofne (metanofilne) bakterije. Ena izmed njih je gramnegativna bakterija ''Methylococcus capsulatus'', ki metan uporablja kot vir ogljika in ga pretvarja v metanol. Doslej niso našli višjih organizmov, ki bi lahko presnavljali metan, so pa odkrili seve kvasovk, ki so razvile učinkovite mehanizme za prevzem in pretvorbo metanola v biomaso in energijo na podlagi metabolnih poti, podobnih ''M. capsulatus'' [1, 2].<br /> <br /> == Cilj ==<br /> <br /> Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je v prej opisanem problemu videla možnost za razvoj seva kvasovk, ki bi metan lahko prevzemal iz okolja, ga presnavljal in s tem uporabljal kok vir ogljika. Za to nalogo so si izbrali kvasovko ''Komagataella phaffii'' (''Pichia pastoris''). ''K. phaffii'' je metilotrof, ki kot vir ogljika in energije uporablja metanol, prav tako pa je eden izmed organizmov, ki ga uporabljamo za industrijsko proizvodnjo proteinov. Njihova ideja je bila vključiti kompleks pMMO (''angl. particular methane monooxygeanse'') iz ''M. capsulatus'', ki pretvarja metan v metanol, ki ga ''K. phaffii'' lahko s pomočjo nativnih metabolnih poti uporabi kot vir ogljika in energije. Glavni cilj v okviru te ideje pa je bil razvoj javno dostopnih orodij za urejanje genoma ''K. phaffii'' za namen odstranjevanja metana. Doslej ta orodja v registru iGEM niso bila dostopna in kljub veliki razširjenosti ''K. phaffii'' v industriji je bil delež biokock v registru za ''K. phaffii'' (in ''P. pastoris'') manj kot 1 %.<br /> <br /> == Načrt in izvedba ==<br /> <br /> Za delecijo in integracijo genov v genom ''K. phaffii'' je skupina razvila sisteme CRISPR/Cas9 z uporabo orodij molekulskega kloniranja, tehnologije DNA in sintezne biologije. <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Izbrali so sev ''K. phaffii'' GS115 Δku70, ki nima gena ku70, zaradi česar v celici ne more prihajati do spajanja nehomolognih koncev (NHEJ). Zaradi tega je celica za popravljanje dvoverižnih prelomov na DNA prisiljena uporabiti popravljanje s homologno rekombinacijo (HDR). To omogoči lažjo integracijo genov v genom ''K. phaffii'' [3]. <br /> <br /> === Orodje za delecijo in kromosomsko integracijo ===<br /> <br /> Za delecijo in integracijo so razvili sisteme CRISPR/Cas9. Glavni razlog za uporabo CRISPR/Cas9 sistemov je ta, da je tarčenje DNA z RNA bolj tehnično enostavno in časovno izvedljivo kot tarčenje DNA s proteinom. Najprej so na genomu v nekodirajočih regijah poiskali nevtralna integracijska mesta, dolga 500 – 2000 bp, ki so bila dovolj dostopna endonukleazi Cas9 (niso na telomerah). Na vsakem izmed štirih kromosomov so izbrali eno integracijsko mesto. Nato so po strogih kriterijih načrtovali 4 sgRNA, vsako za eno integracijsko mesto. Zapise za izbrane sgRNA in Cas9 so nato vnesli v vektorje. Vektorji so vsebovali še mesto ori, zapis za rezistenco proti ampicilinu, marker za kvasovke in GAP1. Za pripravo vektorjev so uporabili kloniranje in fuzijo USER (''angl. Uracil-Specific Excision Reagent''), ki omogoča direktno vstavljanje vključkov v kompatibilne vektorje USER s pomočjo zarezovalnega encima. Vektorje so nato klonirali v kompetentnih celicah ''E. coli'' DH5α. Učinkovitost tarčenja z različnimi sgRNA so testirali z metodo TAPE, kjer so pričakovali, da ima sev GS115 Δku70 nižjo viabilnost kot sev GS115 [4]. Ko so izbrali najbolj primerne sgRNA, so s pomočjo sistemov CRISPR/Cas9 lahko izbili določene gene, celice pa so kotransformirali z matrico, ki vsebuje dve 45 bp dolgi homologni zaporedji, ki se nahajata navzgor in navzdol od izbitega gena, in sodeluje pri popravljanju s homologno rekombinacijo. Gene so lahko tudi vstavili, če so celice kotransformirali z drugo matrico, ki prav tako vsebuje dve homologni zaporedji in med njima še zapis za promotor, želeni gen in terminator, kar omogoča vstavljanje gena na mesto, kjer je bil uveden dvoverižni prelom DNA s Cas9 [5].<br /> <br /> === Razvoj metanotrofnih kvasovk ===<br /> <br /> Geni, ki so jih vnesli v sev ''K. phaffii'' GS115, zapisujejo za kompleks pMMO, ki ga sestavljajo tri podenote PmoA, PmoB in PmoC. To so prokariontski geni, ki izhajajo iz metanotrofne gramnegativne bakterije ''M. capsulatus''. Za optimalno izražanje genov v ''K. phaffii'' so izvedli optimizacijo kodona. Za delovanje kompleksa pMMO se morajo vse tri podenote transportirati do membrane in tam pravilno povezati v nonamer (3α3β3γ). Kompleks se nahaja v celični membrani in omogoča najprej oksidacijo metana do metanola in nato še prenos metanola v celico [6]. Želeli so, da se podenote pMMO izražajo konstitutivno, da bi se metan lahko ob prisotnosti v mediju takoj pretvarjal. Načrtovali so matrice za popravljanje dvoverižnih prelomov, ki so vsebovale zapise za podenote pMMO in močne konstitutivne promotorje GAP1 in TEF1. V zapis so vključili tudi signalni peptid, ki je izhajal iz glikoziltransferaze ''K. phaffii'', ki je membranski protein. Lokalizacijo kompleksa so preverili z metodo DeepLoc. Za vnos genov so uporabili prej opisan sistem CRISPR/Cas9. Za preverjanje uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice so v genomu K. phaffii izbili neesencialne gene, ki so bili vključeni v nativnem metabolizmu metanola [7].<br /> <br /> == Rezultati ==<br /> <br /> V okviru projekta PHEAST so uspešno pripravili več različnih plazmidov CRISPR/Cas9 za usmerjeno urejanje genoma ''K. phaffii'' na različnih kromosomih. S temi plazmidi je omogočena delecija genov brez »brazgotin« ali stabilna integracija genov. Vrednotenje dela so razdelili na tri dele, in sicer najprej zasnovo sistemov CRISPR/Cas9, nato uporabo sistemov CRISPR/Cas9 za delecijo genov in nazadnje še integracijo genov v ''K. phaffii'' GS115. Uspešno so zasnovali sgRNA, ki ciljajo intergenske regije na štirih kromosomih, kar bi lahko v prihodnosti uporabili za urejanje genoma ''K. phaffii''. Z delecijo neesencialnih genov, vključenih v metabolizem metanola do formaldehida, so želeli pokazati, da ti geni rast le upočasnijo in ne povsem ustavijo. Prav tako jim je delecija teh genov služila pri preverjanju uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice. Pokazali so tudi, da je integracija v genom ''K. phaffii'' možna, čeprav jim ni uspelo vstaviti točno želene popravljalne matrice. <br /> <br /> == Uvedba v industriji ==<br /> <br /> ''K. phaffii'' je že industrijsko uveljavljen organizem za proizvodnjo rekombinantnih proteinov. Z uvedbo genov za kompleks pMMO bi ''K. phaffii'' postala metanotrofna in bi zato lahko predstavljala potencialen način odstranjevanja metana iz okolja. Metanotrofen sev ''K. phaffii'' bi gojili v fermentorju, do kamor bi transportirali metan. Razlog za to je evropska regulativa o GSO, ki narekuje, naj delo z GSO poteka v kontroliranem in zaprtem okolju. Zato se velik delež dela v prihodnosti usmerja v to, kako razviti učinkovito odstranjevanje metana, ki ne potrebuje GSO, da se bo to lahko izvajalo direktno na želenem mestu. Do takrat pa je najprej potreben zajem metana, po katerem bi se ta transportiral do fermentorja. Svojim strankam bi skupina ponudila tudi proizvajanje želenega proteina, ki bi ga ''K. phaffii'' proizvajala. Dodatno oviro predstavlja tudi slaba topnost metana v vodi, ampak naj bi element trajnostnega razvoja odtehtal slabši izkoristek. Skupina s svojim projektom cilja predvsem na kmetijstvo, saj bi stranke v sproščenem metanu lahko našle vrednost s pomočjo te proizvodne platforme, ki bi omogočala odstranjevanje metana in proizvodnjo proteinov kot hranil za živino. Projekt pa bi bil lahko pomemben tudi za oljno in premogovno industrijo, kjer je metan eden glavnih stranskih produktov.<br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> [1] S. Guerrero-Cruz, A. Vaksmaa, M. A. Horn, H. Niemann, M. Pijuan, A. Ho: Methanotrophs: Discoveries, Environmental Relevance, and a Perspective on Current and Future Applications. Front. Microbiol. 2021, 12.<br /> [2] H. J. Kim, J. Huh, Y. W. Kwon, D. Park, Y. Yu, Y. E. Jang, B. R. Lee, E. Jo, E. J. Lee, Y. Heo, et al.: Biological Conversion of Methane to Methanol through Genetic Reassembly of Native Catalytic Domains. Nat. Catal. 2019, 2, 342–353.<br /> [3] L. Bernauer, A. Radkohl, L. G. K. Lehmayer, A. Emmerstorfer-Augustin: Komagataella Phaffii as Emerging Model Organism in Fundamental Research. Front. Microbiol. 2021, 11.<br /> [4] L. Näätsaari, B. Mistlberger, C. Ruth, T. Hajek, F. S. Hartner, A. Glieder: Deletion of the Pichia Pastoris KU70 Homologue Facilitates Platform Strain Generation for Gene Expression and Synthetic Biology. PLoS One 2012, 7.<br /> [5] Q. Liu, X. Shi, L. Song, H. Liu, X. Zhou, Q. Wang, Y. Zhang, M. Cai: CRISPR-Cas9-Mediated Genomic Multiloci Integration in Pichia Pastoris. Microb. Cell Fact. 2019, 18.<br /> [6] M. Karbalaei, S. A. Rezaee, H. Farsiani: Pichia Pastoris: A Highly Successful Expression System for Optimal Synthesis of Heterologous Proteins. J. Cell. Physiol. 2020, 235, 5867–5881.<br /> [7] F. W. Krainer, C. Dietzsch, T. Hajek, C. Herwig, O. Spadiut, A. Glieder: Recombinant Protein Expression in Pichia Pastoris Strains with an Engineered Methanol Utilization Pathway. Microb. Cell Fact. 2012, 11.</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana&diff=20704 2022-05-02T21:55:17Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je s projektom PHEAST sodelovala na tekmovanju iGEM leta 2021 in se uvrstila med deset najboljših ekip.<br /> <br /> Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:DTU-Denmark<br /> <br /> Avtorica povzetka: Ana Potočnik<br /> <br /> <br /> == Problem ==<br /> <br /> Metan (CH4) je toplogredni plin, katerega masni delež v ozračju je 0,0001 %. Industrija in kmetijstvo vsako leto v ozračje izpustita 570 milijonov ton metana. Njegov toplogredni učinek je tridesetkrat večji kot toplogredni učinek ogljikovega dioksida, zato je eden izmed ciljev trajnostnega razvoja tudi zmanjšanje izpustov metana oziroma razvoj metod, ki bi omogočale omilitev negativnih posledic izpustov. Trenutno je največji poudarek na zmanjšanju izpustov metana s spreminjanjem hrane živine, prav tako pa so tudi že aktualne strategije, ki temeljijo na odstranjevanju že izpuščenega metana. Mednje spadajo recikliranje in kompostiranje odpadkov, zajemanje metana ter sežiganje. Glavna vrednost metana je vir energije, ampak je zajemanje in sežiganje metana dražje v primerjavi z drugimi viri energije. Poleg tega se pri sežiganju sprošča ogljikov dioksid, ki je prav tako toplogredni plin. Jasno je, da doslej uporabljane metode bistveno ne zmanjšajo ravni izpustov metana, zato je potreba po učinkovitih strategijah za odstranjevanje metana iz atmosfere velika. Kot odgovor na okoljski stres so se že razvili organizmi, ki lahko preživijo v okoljih, bogatih z metanom. Najpogosteje jih najdemo na riževih poljih, v blatu, prsti ali na odlagališčih smeti. Največji pomen za spopadanje z okoljsko krizo imajo metanotrofne (metanofilne) bakterije. Ena izmed njih je gramnegativna bakterija ''Methylococcus capsulatus'', ki metan uporablja kot vir ogljika in ga pretvarja v metanol. Doslej niso našli višjih organizmov, ki bi lahko presnavljali metan, so pa odkrili seve kvasovk, ki so razvile učinkovite mehanizme za prevzem in pretvorbo metanola v biomaso in energijo na podlagi metabolnih poti, podobnih M. capsulatus [1, 2].<br /> <br /> == Cilj ==<br /> <br /> Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je v prej opisanem problemu videla možnost za razvoj seva kvasovk, ki bi metan lahko prevzemal iz okolja, ga presnavljal in s tem uporabljal kok vir ogljika. Za to nalogo so si izbrali kvasovko ''Komagataella phaffii'' (''Pichia pastoris''). ''K. phaffii'' je metilotrof, ki kot vir ogljika in energije uporablja metanol, prav tako pa je eden izmed organizmov, ki ga uporabljamo za industrijsko proizvodnjo proteinov. Njihova ideja je bila vključiti kompleks pMMO (''angl. particular methane monooxygeanse'') iz ''M. capsulatus'', ki pretvarja metan v metanol, ki ga ''K. phaffii'' lahko s pomočjo nativnih metabolnih poti uporabi kot vir ogljika in energije. Glavni cilj v okviru te ideje pa je bil razvoj javno dostopnih orodij za urejanje genoma ''K. phaffii'' za namen odstranjevanja metana. Doslej ta orodja v registru iGEM niso bila dostopna in kljub veliki razširjenosti ''K. phaffii'' v industriji je bil delež biokock v registru za ''K. phaffii'' (in ''P. pastoris'') manj kot 1 %.<br /> <br /> == Načrt in izvedba ==<br /> <br /> Za delecijo in integracijo genov v genom ''K. phaffii'' je skupina razvila sisteme CRISPR/Cas9 z uporabo orodij molekulskega kloniranja, tehnologije DNA in sintezne biologije. <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Izbrali so sev ''K. phaffii'' GS115 Δku70, ki nima gena ku70, zaradi česar v celici ne more prihajati do spajanja nehomolognih koncev (NHEJ). Zaradi tega je celica za popravljanje dvoverižnih prelomov na DNA prisiljena uporabiti popravljanje s homologno rekombinacijo (HDR). To omogoči lažjo integracijo genov v genom ''K. phaffii'' [3]. <br /> <br /> === Orodje za delecijo in kromosomsko integracijo ===<br /> <br /> Za delecijo in integracijo so razvili sisteme CRISPR/Cas9. Glavni razlog za uporabo CRISPR/Cas9 sistemov je ta, da je tarčenje DNA z RNA bolj tehnično enostavno in časovno izvedljivo kot tarčenje DNA s proteinom. Najprej so na genomu v nekodirajočih regijah poiskali nevtralna integracijska mesta, dolga 500 – 2000 bp, ki so bila dovolj dostopna endonukleazi Cas9 (niso na telomerah). Na vsakem izmed štirih kromosomov so izbrali eno integracijsko mesto. Nato so po strogih kriterijih načrtovali 4 sgRNA, vsako za eno integracijsko mesto. Zapise za izbrane sgRNA in Cas9 so nato vnesli v vektorje. Vektorji so vsebovali še mesto ori, zapis za rezistenco proti ampicilinu, marker za kvasovke in GAP1. Za pripravo vektorjev so uporabili kloniranje in fuzijo USER (''angl. Uracil-Specific Excision Reagent''), ki omogoča direktno vstavljanje vključkov v kompatibilne vektorje USER s pomočjo zarezovalnega encima. Vektorje so nato klonirali v kompetentnih celicah ''E. coli'' DH5α. Učinkovitost tarčenja z različnimi sgRNA so testirali z metodo TAPE, kjer so pričakovali, da ima sev GS115 Δku70 nižjo viabilnost kot sev GS115 [4]. Ko so izbrali najbolj primerne sgRNA, so s pomočjo sistemov CRISPR/Cas9 lahko izbili določene gene, celice pa so kotransformirali z matrico, ki vsebuje dve 45 bp dolgi homologni zaporedji, ki se nahajata navzgor in navzdol od izbitega gena, in sodeluje pri popravljanju s homologno rekombinacijo. Gene so lahko tudi vstavili, če so celice kotransformirali z drugo matrico, ki prav tako vsebuje dve homologni zaporedji in med njima še zapis za promotor, želeni gen in terminator, kar omogoča vstavljanje gena na mesto, kjer je bil uveden dvoverižni prelom DNA s Cas9 [5].<br /> <br /> === Razvoj metanotrofnih kvasovk ===<br /> <br /> Geni, ki so jih vnesli v sev ''K. phaffii'' GS115, zapisujejo za kompleks pMMO, ki ga sestavljajo tri podenote PmoA, PmoB in PmoC. To so prokariontski geni, ki izhajajo iz metanotrofne gramnegativne bakterije ''M. capsulatus''. Za optimalno izražanje genov v ''K. phaffii'' so izvedli optimizacijo kodona. Za delovanje kompleksa pMMO se morajo vse tri podenote transportirati do membrane in tam pravilno povezati v nonamer (3α3β3γ). Kompleks se nahaja v celični membrani in omogoča najprej oksidacijo metana do metanola in nato še prenos metanola v celico [6]. Želeli so, da se podenote pMMO izražajo konstitutivno, da bi se metan lahko ob prisotnosti v mediju takoj pretvarjal. Načrtovali so matrice za popravljanje dvoverižnih prelomov, ki so vsebovale zapise za podenote pMMO in močne konstitutivne promotorje GAP1 in TEF1. V zapis so vključili tudi signalni peptid, ki je izhajal iz glikoziltransferaze ''K. phaffii'', ki je membranski protein. Lokalizacijo kompleksa so preverili z metodo DeepLoc. Za vnos genov so uporabili prej opisan sistem CRISPR/Cas9. Za preverjanje uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice so v genomu K. phaffii izbili neesencialne gene, ki so bili vključeni v nativnem metabolizmu metanola [7].<br /> <br /> == Rezultati ==<br /> <br /> V okviru projekta PHEAST so uspešno pripravili več različnih plazmidov CRISPR/Cas9 za usmerjeno urejanje genoma ''K. phaffii'' na različnih kromosomih. S temi plazmidi je omogočena delecija genov brez »brazgotin« ali stabilna integracija genov. Vrednotenje dela so razdelili na tri dele, in sicer najprej zasnovo sistemov CRISPR/Cas9, nato uporabo sistemov CRISPR/Cas9 za delecijo genov in nazadnje še integracijo genov v ''K. phaffii'' GS115. Uspešno so zasnovali sgRNA, ki ciljajo intergenske regije na štirih kromosomih, kar bi lahko v prihodnosti uporabili za urejanje genoma ''K. phaffii''. Z delecijo neesencialnih genov, vključenih v metabolizem metanola do formaldehida, so želeli pokazati, da ti geni rast le upočasnijo in ne povsem ustavijo. Prav tako jim je delecija teh genov služila pri preverjanju uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice. Pokazali so tudi, da je integracija v genom ''K. phaffii'' možna, čeprav jim ni uspelo vstaviti točno želene popravljalne matrice. <br /> <br /> == Uvedba v industriji ==<br /> <br /> ''K. phaffii'' je že industrijsko uveljavljen organizem za proizvodnjo rekombinantnih proteinov. Z uvedbo genov za kompleks pMMO bi ''K. phaffii'' postala metanotrofna in bi zato lahko predstavljala potencialen način odstranjevanja metana iz okolja. Metanotrofen sev ''K. phaffii'' bi gojili v fermentorju, do kamor bi transportirali metan. Razlog za to je evropska regulativa o GSO, ki narekuje, naj delo z GSO poteka v kontroliranem in zaprtem okolju. Zato se velik delež dela v prihodnosti usmerja v to, kako razviti učinkovito odstranjevanje metana, ki ne potrebuje GSO, da se bo to lahko izvajalo direktno na želenem mestu. Do takrat pa je najprej potreben zajem metana, po katerem bi se ta transportiral do fermentorja. Svojim strankam bi skupina ponudila tudi proizvajanje želenega proteina, ki bi ga ''K. phaffii'' proizvajala. Dodatno oviro predstavlja tudi slaba topnost metana v vodi, ampak naj bi element trajnostnega razvoja odtehtal slabši izkoristek. Skupina s svojim projektom cilja predvsem na kmetijstvo, saj bi stranke v sproščenem metanu lahko našle vrednost s pomočjo te proizvodne platforme, ki bi omogočala odstranjevanje metana in proizvodnjo proteinov kot hranil za živino. Projekt pa bi bil lahko pomemben tudi za oljno in premogovno industrijo, kjer je metan eden glavnih stranskih produktov.<br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> [1] S. Guerrero-Cruz, A. Vaksmaa, M. A. Horn, H. Niemann, M. Pijuan, A. Ho: Methanotrophs: Discoveries, Environmental Relevance, and a Perspective on Current and Future Applications. Front. Microbiol. 2021, 12.<br /> [2] H. J. Kim, J. Huh, Y. W. Kwon, D. Park, Y. Yu, Y. E. Jang, B. R. Lee, E. Jo, E. J. Lee, Y. Heo, et al.: Biological Conversion of Methane to Methanol through Genetic Reassembly of Native Catalytic Domains. Nat. Catal. 2019, 2, 342–353.<br /> [3] L. Bernauer, A. Radkohl, L. G. K. Lehmayer, A. Emmerstorfer-Augustin: Komagataella Phaffii as Emerging Model Organism in Fundamental Research. Front. Microbiol. 2021, 11.<br /> [4] L. Näätsaari, B. Mistlberger, C. Ruth, T. Hajek, F. S. Hartner, A. Glieder: Deletion of the Pichia Pastoris KU70 Homologue Facilitates Platform Strain Generation for Gene Expression and Synthetic Biology. PLoS One 2012, 7.<br /> [5] Q. Liu, X. Shi, L. Song, H. Liu, X. Zhou, Q. Wang, Y. Zhang, M. Cai: CRISPR-Cas9-Mediated Genomic Multiloci Integration in Pichia Pastoris. Microb. Cell Fact. 2019, 18.<br /> [6] M. Karbalaei, S. A. Rezaee, H. Farsiani: Pichia Pastoris: A Highly Successful Expression System for Optimal Synthesis of Heterologous Proteins. J. Cell. Physiol. 2020, 235, 5867–5881.<br /> [7] F. W. Krainer, C. Dietzsch, T. Hajek, C. Herwig, O. Spadiut, A. Glieder: Recombinant Protein Expression in Pichia Pastoris Strains with an Engineered Methanol Utilization Pathway. Microb. Cell Fact. 2012, 11.</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana&diff=20703 2022-05-02T21:51:44Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je s projektom PHEAST sodelovala na tekmovanju iGEM leta 2021 in se uvrstila med deset najboljših ekip.<br /> <br /> Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:DTU-Denmark<br /> <br /> Avtorica povzetka: Ana Potočnik<br /> <br /> <br /> == Problem ==<br /> <br /> Metan (CH4) je toplogredni plin, katerega masni delež v ozračju je 0,0001 %. Industrija in kmetijstvo vsako leto v ozračje izpustita 570 milijonov ton metana. Njegov toplogredni učinek je tridesetkrat večji kot toplogredni učinek ogljikovega dioksida, zato je eden izmed ciljev trajnostnega razvoja tudi zmanjšanje izpustov metana oziroma razvoj metod, ki bi omogočale omilitev negativnih posledic izpustov. Trenutno je največji poudarek na zmanjšanju izpustov metana s spreminjanjem hrane živine, prav tako pa so tudi že aktualne strategije, ki temeljijo na odstranjevanju že izpuščenega metana. Mednje spadajo recikliranje in kompostiranje odpadkov, zajemanje metana ter sežiganje. Glavna vrednost metana je vir energije, ampak je zajemanje in sežiganje metana dražje v primerjavi z drugimi viri energije. Poleg tega se pri sežiganju sprošča ogljikov dioksid, ki je prav tako toplogredni plin. Jasno je, da doslej uporabljane metode bistveno ne zmanjšajo ravni izpustov metana, zato je potreba po učinkovitih strategijah za odstranjevanje metana iz atmosfere velika. Kot odgovor na okoljski stres so se že razvili organizmi, ki lahko preživijo v okoljih, bogatih z metanom. Najpogosteje jih najdemo na riževih poljih, v blatu, prsti ali na odlagališčih smeti. Največji pomen za spopadanje z okoljsko krizo imajo metanotrofne (metanofilne) bakterije. Ena izmed njih je gramnegativna bakterija Methylococcus capsulatus, ki metan uporablja kot vir ogljika in ga pretvarja v metanol. Doslej niso našli višjih organizmov, ki bi lahko presnavljali metan, so pa odkrili seve kvasovk, ki so razvile učinkovite mehanizme za prevzem in pretvorbo metanola v biomaso in energijo na podlagi metabolnih poti, podobnih M. capsulatus [1, 2].<br /> <br /> == Cilj ==<br /> <br /> Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je v prej opisanem problemu videla možnost za razvoj seva kvasovk, ki bi metan lahko prevzemal iz okolja, ga presnavljal in s tem uporabljal kok vir ogljika. Za to nalogo so si izbrali kvasovko Komagataella phaffii (Pichia pastoris). K. phaffii je metilotrof, ki kot vir ogljika in energije uporablja metanol, prav tako pa je eden izmed organizmov, ki ga uporabljamo za industrijsko proizvodnjo proteinov. Njihova ideja je bila vključiti kompleks pMMO (angl. particular methane monooxygeanse) iz M. capsulatus, ki pretvarja metan v metanol, ki ga K. phaffii lahko s pomočjo nativnih metabolnih poti uporabi kot vir ogljika in energije. Glavni cilj v okviru te ideje pa je bil razvoj javno dostopnih orodij za urejanje genoma K. phaffii za namen odstranjevanja metana. Doslej ta orodja v registru iGEM niso bila dostopna in kljub veliki razširjenosti K. phaffii v industriji je bil delež biokock v registru za K. phaffii (in P. pastoris) manj kot 1 %.<br /> <br /> == Načrt in izvedba ==<br /> <br /> Za delecijo in integracijo genov v genom K. phaffii je skupina razvila sisteme CRISPR/Cas9 z uporabo orodij molekulskega kloniranja, tehnologije DNA in sintezne biologije. <br /> <br /> === Izbira šasije ===<br /> <br /> Izbrali so sev K. phaffii GS115 Δku70, ki nima gena ku70, zaradi česar v celici ne more prihajati do spajanja nehomolognih koncev (NHEJ). Zaradi tega je celica za popravljanje dvoverižnih prelomov na DNA prisiljena uporabiti popravljanje s homologno rekombinacijo (HDR). To omogoči lažjo integracijo genov v genom K. phaffii [3]. <br /> <br /> === Orodje za delecijo in kromosomsko integracijo ===<br /> <br /> Za delecijo in integracijo so razvili sisteme CRISPR/Cas9. Glavni razlog za uporabo CRISPR/Cas9 sistemov je ta, da je tarčenje DNA z RNA bolj tehnično enostavno in časovno izvedljivo kot tarčenje DNA s proteinom. Najprej so na genomu v nekodirajočih regijah poiskali nevtralna integracijska mesta, dolga 500 – 2000 bp, ki so bila dovolj dostopna endonukleazi Cas9 (niso na telomerah). Na vsakem izmed štirih kromosomov so izbrali eno integracijsko mesto. Nato so po strogih kriterijih načrtovali 4 sgRNA, vsako za eno integracijsko mesto. Zapise za izbrane sgRNA in Cas9 so nato vnesli v vektorje. Vektorji so vsebovali še mesto ori, zapis za rezistenco proti ampicilinu, marker za kvasovke in GAP1. Za pripravo vektorjev so uporabili kloniranje in fuzijo USER (angl. Uracil-Specific Excision Reagent), ki omogoča direktno vstavljanje vključkov v kompatibilne vektorje USER s pomočjo zarezovalnega encima. Vektorje so nato klonirali v kompetentnih celicah E. coli DH5α. Učinkovitost tarčenja z različnimi sgRNA so testirali z metodo TAPE, kjer so pričakovali, da ima sev GS115 Δku70 nižjo viabilnost kot sev GS115 [4]. Ko so izbrali najbolj primerne sgRNA, so s pomočjo sistemov CRISPR/Cas9 lahko izbili določene gene, celice pa so kotransformirali z matrico, ki vsebuje dve 45 bp dolgi homologni zaporedji, ki se nahajata navzgor in navzdol od izbitega gena, in sodeluje pri popravljanju s homologno rekombinacijo. Gene so lahko tudi vstavili, če so celice kotransformirali z drugo matrico, ki prav tako vsebuje dve homologni zaporedji in med njima še zapis za promotor, želeni gen in terminator, kar omogoča vstavljanje gena na mesto, kjer je bil uveden dvoverižni prelom DNA s Cas9 [5].<br /> <br /> === Razvoj metanotrofnih kvasovk ===<br /> <br /> Geni, ki so jih vnesli v sev K. phaffii GS115, zapisujejo za kompleks pMMO, ki ga sestavljajo tri podenote PmoA, PmoB in PmoC. To so prokariontski geni, ki izhajajo iz metanotrofne gramnegativne bakterije M. capsulatus. Za optimalno izražanje genov v K. phaffii so izvedli optimizacijo kodona. Za delovanje kompleksa pMMO se morajo vse tri podenote transportirati do membrane in tam pravilno povezati v nonamer (3α3β3γ). Kompleks se nahaja v celični membrani in omogoča najprej oksidacijo metana do metanola in nato še prenos metanola v celico [6]. Želeli so, da se podenote pMMO izražajo konstitutivno, da bi se metan lahko ob prisotnosti v mediju takoj pretvarjal. Načrtovali so matrice za popravljanje dvoverižnih prelomov, ki so vsebovale zapise za podenote pMMO in močne konstitutivne promotorje GAP1 in TEF1. V zapis so vključili tudi signalni peptid, ki je izhajal iz glikoziltransferaze K. phaffii, ki je membranski protein. Lokalizacijo kompleksa so preverili z metodo DeepLoc. Za vnos genov so uporabili prej opisan sistem CRISPR/Cas9. Za preverjanje uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice so v genomu K. phaffii izbili neesencialne gene, ki so bili vključeni v nativnem metabolizmu metanola [7].<br /> <br /> == Rezultati ==<br /> <br /> V okviru projekta PHEAST so uspešno pripravili več različnih plazmidov CRISPR/Cas9 za usmerjeno urejanje genoma K. phaffii na različnih kromosomih. S temi plazmidi je omogočena delecija genov brez »brazgotin« ali stabilna integracija genov. Vrednotenje dela so razdelili na tri dele, in sicer najprej zasnovo sistemov CRISPR/Cas9, nato uporabo sistemov CRISPR/Cas9 za delecijo genov in nazadnje še integracijo genov v K. phaffii GS115. Uspešno so zasnovali sgRNA, ki ciljajo intergenske regije na štirih kromosomih, kar bi lahko v prihodnosti uporabili za urejanje genoma K. phaffii. Z delecijo neesencialnih genov, vključenih v metabolizem metanola do formaldehida, so želeli pokazati, da ti geni rast le upočasnijo in ne povsem ustavijo. Prav tako jim je delecija teh genov služila pri preverjanju uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice. Pokazali so tudi, da je integracija v genom K. phaffii možna, čeprav jim ni uspelo vstaviti točno želene popravljalne matrice. <br /> <br /> == Uvedba v industriji ==<br /> <br /> K. phaffii je že industrijsko uveljavljen organizem za proizvodnjo rekombinantnih proteinov. Z uvedbo genov za kompleks pMMO bi K. phaffii postala metanotrofna in bi zato lahko predstavljala potencialen način odstranjevanja metana iz okolja. Metanotrofen sev K. phaffii bi gojili v fermentorju, do kamor bi transportirali metan. Razlog za to je evropska regulativa o GSO, ki narekuje, naj delo z GSO poteka v kontroliranem in zaprtem okolju. Zato se velik delež dela v prihodnosti usmerja v to, kako razviti učinkovito odstranjevanje metana, ki ne potrebuje GSO, da se bo to lahko izvajalo direktno na želenem mestu. Do takrat pa je najprej potreben zajem metana, po katerem bi se ta transportiral do fermentorja. Svojim strankam bi skupina ponudila tudi proizvajanje želenega proteina, ki bi ga K. phaffii proizvajala. Dodatno oviro predstavlja tudi slaba topnost metana v vodi, ampak naj bi element trajnostnega razvoja odtehtal slabši izkoristek. Skupina s svojim projektom cilja predvsem na kmetijstvo, saj bi stranke v sproščenem metanu lahko našle vrednost s pomočjo te proizvodne platforme, ki bi omogočala odstranjevanje metana in proizvodnjo proteinov kot hranil za živino. Projekt pa bi bil lahko pomemben tudi za oljno in premogovno industrijo, kjer je metan eden glavnih stranskih produktov.<br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> [1] S. Guerrero-Cruz, A. Vaksmaa, M. A. Horn, H. Niemann, M. Pijuan, A. Ho: Methanotrophs: Discoveries, Environmental Relevance, and a Perspective on Current and Future Applications. Front. Microbiol. 2021, 12.<br /> [2] H. J. Kim, J. Huh, Y. W. Kwon, D. Park, Y. Yu, Y. E. Jang, B. R. Lee, E. Jo, E. J. Lee, Y. Heo, et al.: Biological Conversion of Methane to Methanol through Genetic Reassembly of Native Catalytic Domains. Nat. Catal. 2019, 2, 342–353.<br /> [3] L. Bernauer, A. Radkohl, L. G. K. Lehmayer, A. Emmerstorfer-Augustin: Komagataella Phaffii as Emerging Model Organism in Fundamental Research. Front. Microbiol. 2021, 11.<br /> [4] L. Näätsaari, B. Mistlberger, C. Ruth, T. Hajek, F. S. Hartner, A. Glieder: Deletion of the Pichia Pastoris KU70 Homologue Facilitates Platform Strain Generation for Gene Expression and Synthetic Biology. PLoS One 2012, 7.<br /> [5] Q. Liu, X. Shi, L. Song, H. Liu, X. Zhou, Q. Wang, Y. Zhang, M. Cai: CRISPR-Cas9-Mediated Genomic Multiloci Integration in Pichia Pastoris. Microb. Cell Fact. 2019, 18.<br /> [6] M. Karbalaei, S. A. Rezaee, H. Farsiani: Pichia Pastoris: A Highly Successful Expression System for Optimal Synthesis of Heterologous Proteins. J. Cell. Physiol. 2020, 235, 5867–5881.<br /> [7] F. W. Krainer, C. Dietzsch, T. Hajek, C. Herwig, O. Spadiut, A. Glieder: Recombinant Protein Expression in Pichia Pastoris Strains with an Engineered Methanol Utilization Pathway. Microb. Cell Fact. 2012, 11.</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana&diff=20702 2022-05-02T21:48:23Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je s projektom PHEAST sodelovala na tekmovanju iGEM leta 2021 in se uvrstila med deset najboljših ekip.<br /> <br /> Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:DTU-Denmark<br /> <br /> Avtorica povzetka: Ana Potočnik<br /> <br /> <br /> == Problem ==<br /> <br /> Metan (CH4) je toplogredni plin, katerega masni delež v ozračju je 0,0001 %. Industrija in kmetijstvo vsako leto v ozračje izpustita 570 milijonov ton metana. Njegov toplogredni učinek je tridesetkrat večji kot toplogredni učinek ogljikovega dioksida, zato je eden izmed ciljev trajnostnega razvoja tudi zmanjšanje izpustov metana oziroma razvoj metod, ki bi omogočale omilitev negativnih posledic izpustov. Trenutno je največji poudarek na zmanjšanju izpustov metana s spreminjanjem hrane živine, prav tako pa so tudi že aktualne strategije, ki temeljijo na odstranjevanju že izpuščenega metana. Mednje spadajo recikliranje in kompostiranje odpadkov, zajemanje metana ter sežiganje. Glavna vrednost metana je vir energije, ampak je zajemanje in sežiganje metana dražje v primerjavi z drugimi viri energije. Poleg tega se pri sežiganju sprošča ogljikov dioksid, ki je prav tako toplogredni plin. Jasno je, da doslej uporabljane metode bistveno ne zmanjšajo ravni izpustov metana, zato je potreba po učinkovitih strategijah za odstranjevanje metana iz atmosfere velika. Kot odgovor na okoljski stres so se že razvili organizmi, ki lahko preživijo v okoljih, bogatih z metanom. Najpogosteje jih najdemo na riževih poljih, v blatu, prsti ali na odlagališčih smeti. Največji pomen za spopadanje z okoljsko krizo imajo metanotrofne (metanofilne) bakterije. Ena izmed njih je gramnegativna bakterija Methylococcus capsulatus, ki metan uporablja kot vir ogljika in ga pretvarja v metanol. Doslej niso našli višjih organizmov, ki bi lahko presnavljali metan, so pa odkrili seve kvasovk, ki so razvile učinkovite mehanizme za prevzem in pretvorbo metanola v biomaso in energijo na podlagi metabolnih poti, podobnih M. capsulatus [1, 2].<br /> <br /> == Cilj ==<br /> <br /> Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je v prej opisanem problemu videla možnost za razvoj seva kvasovk, ki bi metan lahko prevzemal iz okolja, ga presnavljal in s tem uporabljal kok vir ogljika. Za to nalogo so si izbrali kvasovko Komagataella phaffii (Pichia pastoris). K. phaffii je metilotrof, ki kot vir ogljika in energije uporablja metanol, prav tako pa je eden izmed organizmov, ki ga uporabljamo za industrijsko proizvodnjo proteinov. Njihova ideja je bila vključiti kompleks pMMO (angl. particular methane monooxygeanse) iz M. capsulatus, ki pretvarja metan v metanol, ki ga K. phaffii lahko s pomočjo nativnih metabolnih poti uporabi kot vir ogljika in energije. Glavni cilj v okviru te ideje pa je bil razvoj javno dostopnih orodij za urejanje genoma K. phaffii za namen odstranjevanja metana. Doslej ta orodja v registru iGEM niso bila dostopna in kljub veliki razširjenosti K. phaffii v industriji je bil delež biokock v registru za K. phaffii (in P. pastoris) manj kot 1 %.<br /> <br /> == Načrt in izvedba ==<br /> <br /> Za delecijo in integracijo genov v genom K. phaffii je skupina razvila sisteme CRISPR/Cas9 z uporabo orodij molekulskega kloniranja, tehnologije DNA in sintezne biologije. <br /> <br /> '''Izbira šasije'''<br /> <br /> Izbrali so sev K. phaffii GS115 Δku70, ki nima gena ku70, zaradi česar v celici ne more prihajati do spajanja nehomolognih koncev (NHEJ). Zaradi tega je celica za popravljanje dvoverižnih prelomov na DNA prisiljena uporabiti popravljanje s homologno rekombinacijo (HDR). To omogoči lažjo integracijo genov v genom K. phaffii [3]. <br /> <br /> '''Orodje za delecijo in kromosomsko integracijo'''<br /> <br /> Za delecijo in integracijo so razvili sisteme CRISPR/Cas9. Glavni razlog za uporabo CRISPR/Cas9 sistemov je ta, da je tarčenje DNA z RNA bolj tehnično enostavno in časovno izvedljivo kot tarčenje DNA s proteinom. Najprej so na genomu v nekodirajočih regijah poiskali nevtralna integracijska mesta, dolga 500 – 2000 bp, ki so bila dovolj dostopna endonukleazi Cas9 (niso na telomerah). Na vsakem izmed štirih kromosomov so izbrali eno integracijsko mesto. Nato so po strogih kriterijih načrtovali 4 sgRNA, vsako za eno integracijsko mesto. Zapise za izbrane sgRNA in Cas9 so nato vnesli v vektorje. Vektorji so vsebovali še mesto ori, zapis za rezistenco proti ampicilinu, marker za kvasovke in GAP1. Za pripravo vektorjev so uporabili kloniranje in fuzijo USER (angl. Uracil-Specific Excision Reagent), ki omogoča direktno vstavljanje vključkov v kompatibilne vektorje USER s pomočjo zarezovalnega encima. Vektorje so nato klonirali v kompetentnih celicah E. coli DH5α. Učinkovitost tarčenja z različnimi sgRNA so testirali z metodo TAPE, kjer so pričakovali, da ima sev GS115 Δku70 nižjo viabilnost kot sev GS115 [4]. Ko so izbrali najbolj primerne sgRNA, so s pomočjo sistemov CRISPR/Cas9 lahko izbili določene gene, celice pa so kotransformirali z matrico, ki vsebuje dve 45 bp dolgi homologni zaporedji, ki se nahajata navzgor in navzdol od izbitega gena, in sodeluje pri popravljanju s homologno rekombinacijo. Gene so lahko tudi vstavili, če so celice kotransformirali z drugo matrico, ki prav tako vsebuje dve homologni zaporedji in med njima še zapis za promotor, želeni gen in terminator, kar omogoča vstavljanje gena na mesto, kjer je bil uveden dvoverižni prelom DNA s Cas9 [5].<br /> <br /> '''Razvoj metanotrofnih kvasovk'''<br /> <br /> Geni, ki so jih vnesli v sev K. phaffii GS115, zapisujejo za kompleks pMMO, ki ga sestavljajo tri podenote PmoA, PmoB in PmoC. To so prokariontski geni, ki izhajajo iz metanotrofne gramnegativne bakterije M. capsulatus. Za optimalno izražanje genov v K. phaffii so izvedli optimizacijo kodona. Za delovanje kompleksa pMMO se morajo vse tri podenote transportirati do membrane in tam pravilno povezati v nonamer (3α3β3γ). Kompleks se nahaja v celični membrani in omogoča najprej oksidacijo metana do metanola in nato še prenos metanola v celico [6]. Želeli so, da se podenote pMMO izražajo konstitutivno, da bi se metan lahko ob prisotnosti v mediju takoj pretvarjal. Načrtovali so matrice za popravljanje dvoverižnih prelomov, ki so vsebovale zapise za podenote pMMO in močne konstitutivne promotorje GAP1 in TEF1. V zapis so vključili tudi signalni peptid, ki je izhajal iz glikoziltransferaze K. phaffii, ki je membranski protein. Lokalizacijo kompleksa so preverili z metodo DeepLoc. Za vnos genov so uporabili prej opisan sistem CRISPR/Cas9. Za preverjanje uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice so v genomu K. phaffii izbili neesencialne gene, ki so bili vključeni v nativnem metabolizmu metanola [7].<br /> <br /> == Rezultati ==<br /> <br /> V okviru projekta PHEAST so uspešno pripravili več različnih plazmidov CRISPR/Cas9 za usmerjeno urejanje genoma K. phaffii na različnih kromosomih. S temi plazmidi je omogočena delecija genov brez »brazgotin« ali stabilna integracija genov. Vrednotenje dela so razdelili na tri dele, in sicer najprej zasnovo sistemov CRISPR/Cas9, nato uporabo sistemov CRISPR/Cas9 za delecijo genov in nazadnje še integracijo genov v K. phaffii GS115. Uspešno so zasnovali sgRNA, ki ciljajo intergenske regije na štirih kromosomih, kar bi lahko v prihodnosti uporabili za urejanje genoma K. phaffii. Z delecijo neesencialnih genov, vključenih v metabolizem metanola do formaldehida, so želeli pokazati, da ti geni rast le upočasnijo in ne povsem ustavijo. Prav tako jim je delecija teh genov služila pri preverjanju uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice. Pokazali so tudi, da je integracija v genom K. phaffii možna, čeprav jim ni uspelo vstaviti točno želene popravljalne matrice. <br /> <br /> == Uvedba v industriji ==<br /> <br /> K. phaffii je že industrijsko uveljavljen organizem za proizvodnjo rekombinantnih proteinov. Z uvedbo genov za kompleks pMMO bi K. phaffii postala metanotrofna in bi zato lahko predstavljala potencialen način odstranjevanja metana iz okolja. Metanotrofen sev K. phaffii bi gojili v fermentorju, do kamor bi transportirali metan. Razlog za to je evropska regulativa o GSO, ki narekuje, naj delo z GSO poteka v kontroliranem in zaprtem okolju. Zato se velik delež dela v prihodnosti usmerja v to, kako razviti učinkovito odstranjevanje metana, ki ne potrebuje GSO, da se bo to lahko izvajalo direktno na želenem mestu. Do takrat pa je najprej potreben zajem metana, po katerem bi se ta transportiral do fermentorja. Svojim strankam bi skupina ponudila tudi proizvajanje želenega proteina, ki bi ga K. phaffii proizvajala. Dodatno oviro predstavlja tudi slaba topnost metana v vodi, ampak naj bi element trajnostnega razvoja odtehtal slabši izkoristek. Skupina s svojim projektom cilja predvsem na kmetijstvo, saj bi stranke v sproščenem metanu lahko našle vrednost s pomočjo te proizvodne platforme, ki bi omogočala odstranjevanje metana in proizvodnjo proteinov kot hranil za živino. Projekt pa bi bil lahko pomemben tudi za oljno in premogovno industrijo, kjer je metan eden glavnih stranskih produktov.<br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> [1] S. Guerrero-Cruz, A. Vaksmaa, M. A. Horn, H. Niemann, M. Pijuan, A. Ho: Methanotrophs: Discoveries, Environmental Relevance, and a Perspective on Current and Future Applications. Front. Microbiol. 2021, 12.<br /> [2] H. J. Kim, J. Huh, Y. W. Kwon, D. Park, Y. Yu, Y. E. Jang, B. R. Lee, E. Jo, E. J. Lee, Y. Heo, et al.: Biological Conversion of Methane to Methanol through Genetic Reassembly of Native Catalytic Domains. Nat. Catal. 2019, 2, 342–353.<br /> [3] L. Bernauer, A. Radkohl, L. G. K. Lehmayer, A. Emmerstorfer-Augustin: Komagataella Phaffii as Emerging Model Organism in Fundamental Research. Front. Microbiol. 2021, 11.<br /> [4] L. Näätsaari, B. Mistlberger, C. Ruth, T. Hajek, F. S. Hartner, A. Glieder: Deletion of the Pichia Pastoris KU70 Homologue Facilitates Platform Strain Generation for Gene Expression and Synthetic Biology. PLoS One 2012, 7.<br /> [5] Q. Liu, X. Shi, L. Song, H. Liu, X. Zhou, Q. Wang, Y. Zhang, M. Cai: CRISPR-Cas9-Mediated Genomic Multiloci Integration in Pichia Pastoris. Microb. Cell Fact. 2019, 18.<br /> [6] M. Karbalaei, S. A. Rezaee, H. Farsiani: Pichia Pastoris: A Highly Successful Expression System for Optimal Synthesis of Heterologous Proteins. J. Cell. Physiol. 2020, 235, 5867–5881.<br /> [7] F. W. Krainer, C. Dietzsch, T. Hajek, C. Herwig, O. Spadiut, A. Glieder: Recombinant Protein Expression in Pichia Pastoris Strains with an Engineered Methanol Utilization Pathway. Microb. Cell Fact. 2012, 11.</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana&diff=20701 2022-05-02T21:46:47Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je s projektom PHEAST sodelovala na tekmovanju iGEM leta 2021 in se uvrstila med deset najboljših ekip.<br /> <br /> Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:DTU-Denmark<br /> <br /> Avtorica povzetka: Ana Potočnik<br /> <br /> <br /> == Problem ==<br /> <br /> Metan (CH4) je toplogredni plin, katerega masni delež v ozračju je 0,0001 %. Industrija in kmetijstvo vsako leto v ozračje izpustita 570 milijonov ton metana. Njegov toplogredni učinek je tridesetkrat večji kot toplogredni učinek ogljikovega dioksida, zato je eden izmed ciljev trajnostnega razvoja tudi zmanjšanje izpustov metana oziroma razvoj metod, ki bi omogočale omilitev negativnih posledic izpustov. Trenutno je največji poudarek na zmanjšanju izpustov metana s spreminjanjem hrane živine, prav tako pa so tudi že aktualne strategije, ki temeljijo na odstranjevanju že izpuščenega metana. Mednje spadajo recikliranje in kompostiranje odpadkov, zajemanje metana ter sežiganje. Glavna vrednost metana je vir energije, ampak je zajemanje in sežiganje metana dražje v primerjavi z drugimi viri energije. Poleg tega se pri sežiganju sprošča ogljikov dioksid, ki je prav tako toplogredni plin. Jasno je, da doslej uporabljane metode bistveno ne zmanjšajo ravni izpustov metana, zato je potreba po učinkovitih strategijah za odstranjevanje metana iz atmosfere velika. Kot odgovor na okoljski stres so se že razvili organizmi, ki lahko preživijo v okoljih, bogatih z metanom. Najpogosteje jih najdemo na riževih poljih, v blatu, prsti ali na odlagališčih smeti. Največji pomen za spopadanje z okoljsko krizo imajo metanotrofne (metanofilne) bakterije. Ena izmed njih je gramnegativna bakterija Methylococcus capsulatus, ki metan uporablja kot vir ogljika in ga pretvarja v metanol. Doslej niso našli višjih organizmov, ki bi lahko presnavljali metan, so pa odkrili seve kvasovk, ki so razvile učinkovite mehanizme za prevzem in pretvorbo metanola v biomaso in energijo na podlagi metabolnih poti, podobnih M. capsulatus [1, 2].<br /> <br /> == Cilj ==<br /> <br /> Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je v prej opisanem problemu videla možnost za razvoj seva kvasovk, ki bi metan lahko prevzemal iz okolja, ga presnavljal in s tem uporabljal kok vir ogljika. Za to nalogo so si izbrali kvasovko Komagataella phaffii (Pichia pastoris). K. phaffii je metilotrof, ki kot vir ogljika in energije uporablja metanol, prav tako pa je eden izmed organizmov, ki ga uporabljamo za industrijsko proizvodnjo proteinov. Njihova ideja je bila vključiti kompleks pMMO (angl. particular methane monooxygeanse) iz M. capsulatus, ki pretvarja metan v metanol, ki ga K. phaffii lahko s pomočjo nativnih metabolnih poti uporabi kot vir ogljika in energije. Glavni cilj v okviru te ideje pa je bil razvoj javno dostopnih orodij za urejanje genoma K. phaffii za namen odstranjevanja metana. Doslej ta orodja v registru iGEM niso bila dostopna in kljub veliki razširjenosti K. phaffii v industriji je bil delež biokock v registru za K. phaffii (in P. pastoris) manj kot 1 %.<br /> <br /> == Načrt in izvedba ==<br /> <br /> Za delecijo in integracijo genov v genom K. phaffii je skupina razvila sisteme CRISPR/Cas9 z uporabo orodij molekulskega kloniranja, tehnologije DNA in sintezne biologije. <br /> <br /> == Izbira šasije ==<br /> <br /> Izbrali so sev K. phaffii GS115 Δku70, ki nima gena ku70, zaradi česar v celici ne more prihajati do spajanja nehomolognih koncev (NHEJ). Zaradi tega je celica za popravljanje dvoverižnih prelomov na DNA prisiljena uporabiti popravljanje s homologno rekombinacijo (HDR). To omogoči lažjo integracijo genov v genom K. phaffii [3]. <br /> Orodje za delecijo in kromosomsko integracijo<br /> Za delecijo in integracijo so razvili sisteme CRISPR/Cas9. Glavni razlog za uporabo CRISPR/Cas9 sistemov je ta, da je tarčenje DNA z RNA bolj tehnično enostavno in časovno izvedljivo kot tarčenje DNA s proteinom. Najprej so na genomu v nekodirajočih regijah poiskali nevtralna integracijska mesta, dolga 500 – 2000 bp, ki so bila dovolj dostopna endonukleazi Cas9 (niso na telomerah). Na vsakem izmed štirih kromosomov so izbrali eno integracijsko mesto. Nato so po strogih kriterijih načrtovali 4 sgRNA, vsako za eno integracijsko mesto. Zapise za izbrane sgRNA in Cas9 so nato vnesli v vektorje. Vektorji so vsebovali še mesto ori, zapis za rezistenco proti ampicilinu, marker za kvasovke in GAP1. Za pripravo vektorjev so uporabili kloniranje in fuzijo USER (angl. Uracil-Specific Excision Reagent), ki omogoča direktno vstavljanje vključkov v kompatibilne vektorje USER s pomočjo zarezovalnega encima. Vektorje so nato klonirali v kompetentnih celicah E. coli DH5α. Učinkovitost tarčenja z različnimi sgRNA so testirali z metodo TAPE, kjer so pričakovali, da ima sev GS115 Δku70 nižjo viabilnost kot sev GS115 [4]. Ko so izbrali najbolj primerne sgRNA, so s pomočjo sistemov CRISPR/Cas9 lahko izbili določene gene, celice pa so kotransformirali z matrico, ki vsebuje dve 45 bp dolgi homologni zaporedji, ki se nahajata navzgor in navzdol od izbitega gena, in sodeluje pri popravljanju s homologno rekombinacijo. Gene so lahko tudi vstavili, če so celice kotransformirali z drugo matrico, ki prav tako vsebuje dve homologni zaporedji in med njima še zapis za promotor, želeni gen in terminator, kar omogoča vstavljanje gena na mesto, kjer je bil uveden dvoverižni prelom DNA s Cas9 [5].<br /> <br /> == Razvoj metanotrofnih kvasovk ==<br /> <br /> Geni, ki so jih vnesli v sev K. phaffii GS115, zapisujejo za kompleks pMMO, ki ga sestavljajo tri podenote PmoA, PmoB in PmoC. To so prokariontski geni, ki izhajajo iz metanotrofne gramnegativne bakterije M. capsulatus. Za optimalno izražanje genov v K. phaffii so izvedli optimizacijo kodona. Za delovanje kompleksa pMMO se morajo vse tri podenote transportirati do membrane in tam pravilno povezati v nonamer (3α3β3γ). Kompleks se nahaja v celični membrani in omogoča najprej oksidacijo metana do metanola in nato še prenos metanola v celico [6]. Želeli so, da se podenote pMMO izražajo konstitutivno, da bi se metan lahko ob prisotnosti v mediju takoj pretvarjal. Načrtovali so matrice za popravljanje dvoverižnih prelomov, ki so vsebovale zapise za podenote pMMO in močne konstitutivne promotorje GAP1 in TEF1. V zapis so vključili tudi signalni peptid, ki je izhajal iz glikoziltransferaze K. phaffii, ki je membranski protein. Lokalizacijo kompleksa so preverili z metodo DeepLoc. Za vnos genov so uporabili prej opisan sistem CRISPR/Cas9. Za preverjanje uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice so v genomu K. phaffii izbili neesencialne gene, ki so bili vključeni v nativnem metabolizmu metanola [7].<br /> <br /> == Rezultati ==<br /> <br /> V okviru projekta PHEAST so uspešno pripravili več različnih plazmidov CRISPR/Cas9 za usmerjeno urejanje genoma K. phaffii na različnih kromosomih. S temi plazmidi je omogočena delecija genov brez »brazgotin« ali stabilna integracija genov. Vrednotenje dela so razdelili na tri dele, in sicer najprej zasnovo sistemov CRISPR/Cas9, nato uporabo sistemov CRISPR/Cas9 za delecijo genov in nazadnje še integracijo genov v K. phaffii GS115. Uspešno so zasnovali sgRNA, ki ciljajo intergenske regije na štirih kromosomih, kar bi lahko v prihodnosti uporabili za urejanje genoma K. phaffii. Z delecijo neesencialnih genov, vključenih v metabolizem metanola do formaldehida, so želeli pokazati, da ti geni rast le upočasnijo in ne povsem ustavijo. Prav tako jim je delecija teh genov služila pri preverjanju uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice. Pokazali so tudi, da je integracija v genom K. phaffii možna, čeprav jim ni uspelo vstaviti točno želene popravljalne matrice. <br /> <br /> == Uvedba v industriji ==<br /> <br /> K. phaffii je že industrijsko uveljavljen organizem za proizvodnjo rekombinantnih proteinov. Z uvedbo genov za kompleks pMMO bi K. phaffii postala metanotrofna in bi zato lahko predstavljala potencialen način odstranjevanja metana iz okolja. Metanotrofen sev K. phaffii bi gojili v fermentorju, do kamor bi transportirali metan. Razlog za to je evropska regulativa o GSO, ki narekuje, naj delo z GSO poteka v kontroliranem in zaprtem okolju. Zato se velik delež dela v prihodnosti usmerja v to, kako razviti učinkovito odstranjevanje metana, ki ne potrebuje GSO, da se bo to lahko izvajalo direktno na želenem mestu. Do takrat pa je najprej potreben zajem metana, po katerem bi se ta transportiral do fermentorja. Svojim strankam bi skupina ponudila tudi proizvajanje želenega proteina, ki bi ga K. phaffii proizvajala. Dodatno oviro predstavlja tudi slaba topnost metana v vodi, ampak naj bi element trajnostnega razvoja odtehtal slabši izkoristek. Skupina s svojim projektom cilja predvsem na kmetijstvo, saj bi stranke v sproščenem metanu lahko našle vrednost s pomočjo te proizvodne platforme, ki bi omogočala odstranjevanje metana in proizvodnjo proteinov kot hranil za živino. Projekt pa bi bil lahko pomemben tudi za oljno in premogovno industrijo, kjer je metan eden glavnih stranskih produktov.<br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> [1] S. Guerrero-Cruz, A. Vaksmaa, M. A. Horn, H. Niemann, M. Pijuan, A. Ho: Methanotrophs: Discoveries, Environmental Relevance, and a Perspective on Current and Future Applications. Front. Microbiol. 2021, 12.<br /> [2] H. J. Kim, J. Huh, Y. W. Kwon, D. Park, Y. Yu, Y. E. Jang, B. R. Lee, E. Jo, E. J. Lee, Y. Heo, et al.: Biological Conversion of Methane to Methanol through Genetic Reassembly of Native Catalytic Domains. Nat. Catal. 2019, 2, 342–353.<br /> [3] L. Bernauer, A. Radkohl, L. G. K. Lehmayer, A. Emmerstorfer-Augustin: Komagataella Phaffii as Emerging Model Organism in Fundamental Research. Front. Microbiol. 2021, 11.<br /> [4] L. Näätsaari, B. Mistlberger, C. Ruth, T. Hajek, F. S. Hartner, A. Glieder: Deletion of the Pichia Pastoris KU70 Homologue Facilitates Platform Strain Generation for Gene Expression and Synthetic Biology. PLoS One 2012, 7.<br /> [5] Q. Liu, X. Shi, L. Song, H. Liu, X. Zhou, Q. Wang, Y. Zhang, M. Cai: CRISPR-Cas9-Mediated Genomic Multiloci Integration in Pichia Pastoris. Microb. Cell Fact. 2019, 18.<br /> [6] M. Karbalaei, S. A. Rezaee, H. Farsiani: Pichia Pastoris: A Highly Successful Expression System for Optimal Synthesis of Heterologous Proteins. J. Cell. Physiol. 2020, 235, 5867–5881.<br /> [7] F. W. Krainer, C. Dietzsch, T. Hajek, C. Herwig, O. Spadiut, A. Glieder: Recombinant Protein Expression in Pichia Pastoris Strains with an Engineered Methanol Utilization Pathway. Microb. Cell Fact. 2012, 11.</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2021/22&diff=20649 2022-05-02T17:07:32Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_E._coli Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inžiniring_in_izkoriščanje_sintetične_alosterije_luciferaze_NanoLuc Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc] (Rebeka Dajčman)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularen_RNA_interferenčni_sistem_za_regulacijo_multipleksnih_genov Modularen RNA interferenčni sistem za regulacijo multipleksnih genov] (Marko Pavleković)<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Openplast Openplast] (Kim Glavič) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana PHEAST - ''P. pastoris'' za odstranjevanje metana] (Ana Potočnik) &lt;br&gt;<br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2021/22&diff=20648 2022-05-02T17:06:19Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_E._coli Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inžiniring_in_izkoriščanje_sintetične_alosterije_luciferaze_NanoLuc Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc] (Rebeka Dajčman)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularen_RNA_interferenčni_sistem_za_regulacijo_multipleksnih_genov Modularen RNA interferenčni sistem za regulacijo multipleksnih genov] (Marko Pavleković)<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Openplast Openplast] (Kim Glavič) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana] (Ana Potočnik) &lt;br&gt;<br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana&diff=20647 2022-05-02T17:04:28Z

<p>Ana Potočnik: New page: Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je s projektom PHEAST sodelovala na tekmovanju iGEM leta 2021 in se uvrstila med deset najboljših ekip. Spletna stran projekta: https://2021.i...</p> <hr /> <div>Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je s projektom PHEAST sodelovala na tekmovanju iGEM leta 2021 in se uvrstila med deset najboljših ekip.<br /> <br /> Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:DTU-Denmark<br /> <br /> Avtorica povzetka: Ana Potočnik</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Tveganja_pri_uporabi_fagov_za_zdravljenje&diff=17428 2020-05-16T19:36:02Z

<p>Ana Potočnik: /* Viri in literatura */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> <br /> Dosedanje raziskave so pokazale, da bi bili bakteriofagi primerni za zdravljenje nekaterih bakterijskih okužb predvsem zaradi sposobnosti, da ubijejo bakterije in zdravijo okužbo, ne da bi pri tem poškodovali celice gostiteljskega organizma. Prav tako bi se z uporabo bakteriofagov do določene mere izognili težavam in tveganjem, ki jih povzročijo drugi načini zdravljenja (npr. antibiotiki). Kljub številnim prednostim so takšni načini zdravljenja bakterijskih okužb danes na voljo samo v nekaterih vzhodnoevropskih državah, saj obstajajo določena tveganja. Če bi tveganja uspeli zmanjšati, bi v prihodnosti lahko zdravljenje bakterijskih okužb z antibiotiki dopolnili z zdravljenjem z bakteriofagi, saj bi bila kombinirana terapija bolj učinkovita.<br /> <br /> ==Težave pri izbiri ustreznega bakteriofaga==<br /> <br /> ==Bakterijska rezistenca==<br /> <br /> ==Rezistenca na antibiotike in horizontalni prenos genov==<br /> <br /> ==Sprostitev celičnih komponent iz liziranih celic==<br /> <br /> ==Neželen odziv imunskega sistema==<br /> <br /> ==Negativne posledice za okolje==<br /> <br /> ==Viri in literatura==<br /> <br /> Principi, N, Silvestri, E. in Esposito, S. Advantages and Limitations of Bacteriophages for the Treatment of Bacterial Infections. ''Frontiers in Pharmacology''. 2019, 10, str. 513. &lt;br&gt;<br /> <br /> Doss, J., Culbertson, K., Hahn, D., Comacho, J. in Barekzi, N. A Review of Phage Therapy against Bacterial Pathogens of Aquatic and Terrestrial Organisms. ''Viruses''. 2017, 9(3), str. 50. &lt;br&gt;<br /> <br /> Drulis-Kawa, Z., Majkowska-Skrobek, G., Maciejewska, B., Delattre, A. S. in Lavigne, R. Larning from Bacteriophages - Advantages and Limitations of Phage and Phage-Encoded Protein Applications. ''Current Protein&amp;Peptide Science''. 2012, 13(8), str. 699-722. &lt;br&gt;<br /> <br /> Labrie, S. J., Samson, J. E. in Moineau, S. Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology''. 2010, 8(5), str. 317-327. &lt;br&gt;<br /> <br /> Meaden, S., Koskella, B. Exploring the risks of phage application in the environment. ''Frontiers in Microbiology''. 2013, 4, str. 358. &lt;br&gt;<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Tveganja_pri_uporabi_fagov_za_zdravljenje&diff=17427 2020-05-16T19:35:02Z

<p>Ana Potočnik: /* Viri in literatura */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> <br /> Dosedanje raziskave so pokazale, da bi bili bakteriofagi primerni za zdravljenje nekaterih bakterijskih okužb predvsem zaradi sposobnosti, da ubijejo bakterije in zdravijo okužbo, ne da bi pri tem poškodovali celice gostiteljskega organizma. Prav tako bi se z uporabo bakteriofagov do določene mere izognili težavam in tveganjem, ki jih povzročijo drugi načini zdravljenja (npr. antibiotiki). Kljub številnim prednostim so takšni načini zdravljenja bakterijskih okužb danes na voljo samo v nekaterih vzhodnoevropskih državah, saj obstajajo določena tveganja. Če bi tveganja uspeli zmanjšati, bi v prihodnosti lahko zdravljenje bakterijskih okužb z antibiotiki dopolnili z zdravljenjem z bakteriofagi, saj bi bila kombinirana terapija bolj učinkovita.<br /> <br /> ==Težave pri izbiri ustreznega bakteriofaga==<br /> <br /> ==Bakterijska rezistenca==<br /> <br /> ==Rezistenca na antibiotike in horizontalni prenos genov==<br /> <br /> ==Sprostitev celičnih komponent iz liziranih celic==<br /> <br /> ==Neželen odziv imunskega sistema==<br /> <br /> ==Negativne posledice za okolje==<br /> <br /> ==Viri in literatura==<br /> <br /> Principi, N, Silvestri, E. in Esposito, S. Advantages and Limitations of Bacteriophages for the Treatment of Bacterial Infections. Frontiers in Pharmacology, 2019, 10, str. 513. &lt;br&gt;<br /> <br /> Doss, J., Culbertson, K., Hahn, D., Comacho, J. in Barekzi, N. A Review of Phage Therapy against Bacterial Pathogens of Aquatic and Terrestrial Organisms. Viruses, 2017, 9(3), str. 50. &lt;br&gt;<br /> <br /> Drulis-Kawa, Z., Majkowska-Skrobek, G., Maciejewska, B., Delattre, A. S. in Lavigne, R. Larning from Bacteriophages - Advantages and Limitations of Phage and Phage-Encoded Protein Applications. Current Protein&amp;Peptide Science, 2012, 13(8), str. 699-722. &lt;br&gt;<br /> <br /> Labrie, S. J., Samson, J. E. in Moineau, S. Bacteriophage resistance mechanisms. Nature Reviews Microbiology, 2010, 8(5), str. 317-327. &lt;br&gt;<br /> <br /> Meaden, S., Koskella, B. Exploring the risks of phage application in the environment. Frontiers in Microbiology, 2013, 4, str. 358. &lt;br&gt;<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Tveganja_pri_uporabi_fagov_za_zdravljenje&diff=17424 2020-05-16T19:21:55Z

<p>Ana Potočnik: /* Viri in literatura */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> <br /> Dosedanje raziskave so pokazale, da bi bili bakteriofagi primerni za zdravljenje nekaterih bakterijskih okužb predvsem zaradi sposobnosti, da ubijejo bakterije in zdravijo okužbo, ne da bi pri tem poškodovali celice gostiteljskega organizma. Prav tako bi se z uporabo bakteriofagov do določene mere izognili težavam in tveganjem, ki jih povzročijo drugi načini zdravljenja (npr. antibiotiki). Kljub številnim prednostim so takšni načini zdravljenja bakterijskih okužb danes na voljo samo v nekaterih vzhodnoevropskih državah, saj obstajajo določena tveganja. Če bi tveganja uspeli zmanjšati, bi v prihodnosti lahko zdravljenje bakterijskih okužb z antibiotiki dopolnili z zdravljenjem z bakteriofagi, saj bi bila kombinirana terapija bolj učinkovita.<br /> <br /> ==Težave pri izbiri ustreznega bakteriofaga==<br /> <br /> ==Bakterijska rezistenca==<br /> <br /> ==Rezistenca na antibiotike in horizontalni prenos genov==<br /> <br /> ==Sprostitev celičnih komponent iz liziranih celic==<br /> <br /> ==Neželen odziv imunskega sistema==<br /> <br /> ==Negativne posledice za okolje==<br /> <br /> ==Viri in literatura==<br /> <br /> * Principi, N, Silvestri, E. in Esposito, S. Advantages and Limitations of Bacteriophages for the Treatment of Bacterial Infections. Frontiers in Pharmacology, 2019, 10, str. 513. &lt;br&gt;<br /> <br /> * Doss, J., Culbertson, K., Hahn, D., Comacho, J. in Barekzi, N. A Review of Phage Therapy against Bacterial Pathogens of Aquatic and Terrestrial Organisms. Viruses, 2017, 9(3), str. 50. &lt;br&gt;<br /> <br /> * Drulis-Kawa, Z., Majkowska-Skrobek, G., Maciejewska, B., Delattre, A. S. in Lavigne, R. Larning from Bacteriophages - Advantages and Limitations of Phage and Phage-Encoded Protein Applications. Current Protein&amp;Peptide Science, 2012, 13(8), str. 699-722. &lt;br&gt;<br /> <br /> * Labrie, S. J., Samson, J. E. in Moineau, S. Bacteriophage resistance mechanisms. Nature Reviews Microbiology, 2010, 8(5), str. 317-327. &lt;br&gt;<br /> <br /> * Meaden, S., Koskella, B. Exploring the risks of phage application in the environment. Frontiers in Microbiology, 2013, 4, str. 358. &lt;br&gt;<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Tveganja_pri_uporabi_fagov_za_zdravljenje&diff=17423 2020-05-16T19:20:35Z

<p>Ana Potočnik: /* Viri in literatura */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> <br /> Dosedanje raziskave so pokazale, da bi bili bakteriofagi primerni za zdravljenje nekaterih bakterijskih okužb predvsem zaradi sposobnosti, da ubijejo bakterije in zdravijo okužbo, ne da bi pri tem poškodovali celice gostiteljskega organizma. Prav tako bi se z uporabo bakteriofagov do določene mere izognili težavam in tveganjem, ki jih povzročijo drugi načini zdravljenja (npr. antibiotiki). Kljub številnim prednostim so takšni načini zdravljenja bakterijskih okužb danes na voljo samo v nekaterih vzhodnoevropskih državah, saj obstajajo določena tveganja. Če bi tveganja uspeli zmanjšati, bi v prihodnosti lahko zdravljenje bakterijskih okužb z antibiotiki dopolnili z zdravljenjem z bakteriofagi, saj bi bila kombinirana terapija bolj učinkovita.<br /> <br /> ==Težave pri izbiri ustreznega bakteriofaga==<br /> <br /> ==Bakterijska rezistenca==<br /> <br /> ==Rezistenca na antibiotike in horizontalni prenos genov==<br /> <br /> ==Sprostitev celičnih komponent iz liziranih celic==<br /> <br /> ==Neželen odziv imunskega sistema==<br /> <br /> ==Negativne posledice za okolje==<br /> <br /> ==Viri in literatura==<br /> Principi, N, Silvestri, E. in Esposito, S. Advantages and Limitations of Bacteriophages for the Treatment of Bacterial Infections. Frontiers in Pharmacology, 2019, 10, str. 513. &lt;br&gt;<br /> Doss, J., Culbertson, K., Hahn, D., Comacho, J. in Barekzi, N. A Review of Phage Therapy against Bacterial Pathogens of Aquatic and Terrestrial Organisms. Viruses, 2017, 9(3), str. 50. &lt;br&gt;<br /> Drulis-Kawa, Z., Majkowska-Skrobek, G., Maciejewska, B., Delattre, A. S. in Lavigne, R. Larning from Bacteriophages - Advantages and Limitations of Phage and Phage-Encoded Protein Applications. Current Protein&amp;Peptide Science, 2012, 13(8), str. 699-722. &lt;br&gt;<br /> Labrie, S. J., Samson, J. E. in Moineau, S. Bacteriophage resistance mechanisms. Nature Reviews Microbiology, 2010, 8(5), str. 317-327. &lt;br&gt;<br /> Meaden, S., Koskella, B. Exploring the risks of phage application in the environment. Frontiers in Microbiology, 2013, 4, str. 358. &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Tveganja_pri_uporabi_fagov_za_zdravljenje&diff=17422 2020-05-16T19:18:11Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Maja Trifkovič (Uvod, Bakterijska rezistenca, Rezistenca na antibiotike in horizontalni prenos genov) &lt;br&gt;<br /> Maja Mahorič (Težave pri izbiri ustreznega bakteriofaga, Sprostitev celičnih komponent iz liziranih celic) &lt;br&gt;<br /> Ana Potočnik (Neželen odziv imunskega sistema, Negativne posledice za okolje) &lt;br&gt;</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Tveganja_pri_uporabi_fagov_za_zdravljenje&diff=17421 2020-05-16T19:17:03Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Maja Trifkovič (Uvod, Bakterijska rezistenca, Rezistenca na antibiotike in horizontalni prenos genov) &lt;br&gt;<br /> Maja Mahorič ( &lt;br&gt;<br /> Ana Potočnik (Neželen odziv imunskega sistema, Negativne posledice za okolje) &lt;br&gt;</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Tveganja_pri_uporabi_fagov_za_zdravljenje&diff=17417 2020-05-16T19:13:50Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Maja Trifkovič (Uvod, &lt;br&gt;<br /> Maja Mahorič ( &lt;br&gt;<br /> Ana Potočnik ( &lt;br&gt;</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Tveganja_pri_uporabi_fagov_za_zdravljenje&diff=17416 2020-05-16T19:13:27Z

<p>Ana Potočnik: New page: Maja Trifkovič (Uvod, Maja Mahorič ( Ana Potočnik (</p> <hr /> <div>Maja Trifkovič (Uvod, <br /> Maja Mahorič (<br /> Ana Potočnik (</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Tveganja_pri_uporabi_fagov_za_zdravljenje&diff=17414 2020-05-16T19:10:49Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> <br /> Dosedanje raziskave so pokazale, da bi bili bakteriofagi primerni za zdravljenje nekaterih bakterijskih okužb predvsem zaradi sposobnosti, da ubijejo bakterije in zdravijo okužbo, ne da bi pri tem poškodovali celice gostiteljskega organizma. Prav tako bi se z uporabo bakteriofagov do določene mere izognili težavam in tveganjem, ki jih povzročijo drugi načini zdravljenja (npr. antibiotiki). Kljub številnim prednostim so takšni načini zdravljenja bakterijskih okužb danes na voljo samo v nekaterih vzhodnoevropskih državah, saj obstajajo določena tveganja. Če bi tveganja uspeli zmanjšati, bi v prihodnosti lahko zdravljenje bakterijskih okužb z antibiotiki dopolnili z zdravljenjem z bakteriofagi, saj bi bila kombinirana terapija bolj učinkovita.<br /> <br /> ==Težave pri izbiri ustreznega bakteriofaga==<br /> <br /> ==Bakterijska rezistenca==<br /> <br /> ==Rezistenca na antibiotike in horizontalni prenos genov==</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Tveganja_pri_uporabi_fagov_za_zdravljenje&diff=17406 2020-05-16T17:15:08Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>==Uvod==</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Uporaba_fagov_v_boju_proti_patogenim_bakterijam_v_%C5%BEivilih&diff=17405 2020-05-16T17:14:39Z

<p>Ana Potočnik: /* Uvod */</p> <hr /> <div>==Uvod== <br /> <br /> Vsakodnevno ljudje po celem svetu kupujejo in uživajo razna živila rastlinskega in živalskega izvora v dobri veri, da so živila varna in ne vsebujejo patogenih baterij. Ampak vsako leto na milijone ljudi zboli zaradi okužbe z raznimi patogeni, ki so jih zaužili s hrano. Torej patogene bakterije so prisotne v hrani, ki jo kupujemo in predstavljajo problem s katerim se spopada prehrambena industrija. Pojav rezistence bakterij na enega ali celo več antibiotikov ( t.i. multidrug-resistant bacteria) in pa sprememba v odnosu potrošnikov do kemijskih aditivov in težnja po čim bolj naravni hrani, obdelani s čim manj kemikalijami je spodbudila razvoj novih alternativnih sredstev proti bakterijam. <br /> <br /> Možno rešitev tega problema predstavljajo bakteriofagi. Nahajajo se tako v naravnih kot v umetnih okoljih in kot virusi, ki uporabljajo bakterijske celice za svoje razmnoževanje, predstavljajo naravne sovražnike bakterijam.<br /> <br /> ==Prednosti uporabe bakteriofagov== <br /> <br /> Za uporabo v boju proti bakterijam v živilih imajo bakteriofagi določene prednosti: <br /> <br /> *Visoka specifičnost: bakteriofagi katerih tarča so patogene bakterije in bakterije, ki povzročajo kvarjenje hrane ne ogrožajo naravne mikrobiote gastrointestinalnega trakta; <br /> <br /> *Zmožnost samorazmnoževnaja: že majhna doza bakteriofagov se je zmožna razmnožiti ob prisotnosti gostiteljskih bakterij in ko gostiteljskih bakterij ni več se tudi razmnoževanje ustavi; <br /> <br /> *Zmožnost adaptacije: tako, kot so se zmožne bakterije prilagoditi in razviti obrambne mehanizme proti bakteriofagom, so tudi oni zmožni adaptacije na te spremembe; <br /> <br /> *Odpornost: bakteriofagi so močno odporni na stres ki ga prinese predelava hrane; <br /> <br /> *Do sedaj še niso opazili negativnih efektov, ki bi jih imeli bakteriofagi na evkariontske celice; <br /> <br /> *Ne spremenijo zaznavnih lastnosti hrane, kot so okus, vonj in videz; <br /> <br /> Poleg tega so bakteriofage izolirali iz raznih surovih živil (npr. govedina, perutnina), procesiranih živil, fermentiranih produktov (npr. jogurt, sir) in morske hrane. Kar pomeni da jih ljudje že dnevno zauživamo. <br /> <br /> ==Uporaba bakteriofagov== <br /> <br /> V namen boja proti bakterijam v živilih se striktno uporabljajo samo litični bakteriofagi, saj je namen odstraniti bakterijske celice. Bakteriofage se v glavnem uporablja na štirih stopnjah tekom pridelave in predelave hrane. In sicer: <br /> <br /> *Med primarno produkcijo: z dodatkom bakteriofagov preprečimo bakterijske okužbe med gojenjem rastlin in živali; <br /> <br /> *Med procesiranjem: s tem preprečimo razvoj bakterijskih kolonij tekom procesiranja hrane; <br /> <br /> *Pri sanitaciji: za čiščenje površin, ki pridejo v stik z živili tekom procesa; <br /> <br /> *Pri konzervaciji: preprečevanje kontaminacije in razmnoževanja patogenih bakterij med shranjevanjem živil. <br /> <br /> ==Uporaba bakteriofagov pri pridelavi rastlin== <br /> <br /> Sposobnost kmetijstva da kontinuirno oskrbuje prebivalstvo z dovoljšno količino hrane je ključnega pomena. Bakterijske okužbe rastlin predstavljajo eno od ovir, ki to onemogočajo. Do sedaj je bilo izvedenih že veliko študij, ki potrjujejo učinkovitost bakteriofagnih koktajlov proti številnim bakterijam, ki okužijo rastline, kot so na primer: Erwinia spp., Xanthomonas spp., Pseudomonas syringeae pv. phaseolicola in Ralstonia solanacearum. <br /> <br /> Za uporabo bakteriofagov v boju proti bakterijskim okužbam v kmetijstvu se je potrebno spopasti z določenimi problemi. Potrebno je razviti način efektivne terapije z bakteriofagi za hektare obdelovalnih površin. Upoštevati je treba, da so v takih odprtih okoljih patogeni konstantno prisotni in dejavniki kot so veter, voda in insekti ves čas vnašajo nove patogene. V upoštev je treba vzeti razne pesticide, ki se jih v kmetijstvu uporablja, ki imajo lahko negativen vpliv na bakteriofage. Problem predstavljajo tudi razni klimatski dejavniki, kot so nihanje temperature, suša, UV sevanje. <br /> <br /> V raziskavi so primerjali učinkovitost bakteriofagov proti bakteriji Xanthomonas campestris pv. pruni na plodovih nektarin v kontroliranih klimatskih pogojih in v sadovnjaku. Čeprav je 92 % sadja ostalo zdravega, so opazili da je bilo zmanjšanje populacije bakteriofagov v sadovnjaku za 104 večje. Možna razlaga za tako zmanjšanje populacije v naravnem okolju je povišana temperatura, dehidracija in UV sevanje. <br /> <br /> V nadaljnjih študijah so se zato še posebej posvetile vplivu okoljskih dejavnikov. Ugotovili so da suspenzija bakteriofagov v bakteriofagov v 0,75% raztopini posnetega mleka v prahu ali pa 0,5% procentne saharoze, pomaga pri preživetju fagov v boju proti Xanthomonas spp. pri paradižniku. Obe mešanici sta pomagali pri blaženju vpliva UV sevanja. Trenutno potekajo še dodatne raziskave o potencialnih faktorjih, ki bi bili zmožni zmanjšati negativni efekt UV sevanja. <br /> <br /> ==Uporaba bakteriofagov pri živinoreji== <br /> <br /> Večino dosedanjih študij zdravljenja živali z bakteriofagi se je izvajalo na štirih skupinah živali: perutnini, govedu, ovcah ter prašičih. Študije na kokoših so pokazale, da so terapije z bakteriofagi obetavne pri zmanjševanju patogenih bakterij v vzorcih vzetih iz slepega črevesa živali. Ena študija vpliva mešanice bakteriofagov na količino bakterij Campylobacter jejuni je pokazala začetni upad za 3 log CFU(Colony Forming Units)/g v primerjavi z kontrolno skupino in po 5 dneh se je količina nekoliko stabilizirala in bila za 1 log CFU/g manjša od kontrolne skupine. Poleg efektivnosti administracije bakteriofagov po infekciji so opazovali tudi skupino v katero so preventivno vnesli bakteriofage. Opazili so, da je prvotna kolonizacija črevesja opočasnjena, a se je po tednu dni stabilizirala in bila primerljiva skupini z post infekcijsko terapijo. <br /> <br /> Za zmanjšanje količine Salmonella enterica pri prašičih med transportom in pred zakolom so uporabili koktajl bakteriofagov. Opazili so zmanjšanje kontaminacije črevesja prašičev za 90-95% v primerjavi z kontrolno skupino. <br /> <br /> Ideje za aplikacije bakteriofagov niso omejene samo na kopenske živali, ampak se raziskuje tudi različne načine za administracijo bakteriofagov preko hrane za ribe. Težava pri tem je sproščanje bakteriofagov s hrane v slano vodo. Rešitev tega problema bi lahko predstavljali premazi iz biopolimerov, ki bi zaustavili uhajanje bakteriofagov. <br /> <br /> ==Faktorji, ki vplivajo na efektivnost delovanja bakteriofagov== <br /> <br /> Študije na živilih kažejo na to, da na efektivnost delovanja bakteriofagov vpliva več faktorjev (koncentracija fagov, lastnosti matriksa, kje in kdaj v proizvodnem postopku se dodajo bakteriofagi, izbira bakteriofaga, način aplikacije). <br /> <br /> Višja koncentracija bakteriofagov ponavadi privede do večjega zmanjšanja bakterij. Vendar ni vedno mogoče ali ni ekonomsko smiselno uporabljati visoke koncentracije fagov. Prav tako lahko tudi nižje koncentracije privedejo do zaželenih rezultatov, npr. pri kokoših, ki so bile okužene z patogenimi E. coli je pri naravnem izbruhu bakterij že nižja koncentracija bakteriofagov znatno znižala umrljivost. <br /> <br /> Ko dodajamo bakteriofage živilom je precej pomembno kakšne so lastnosti matriksa tega živila, ker te lahko vplivajo na efektivnost bakteriofagov. Pri raziskavi, kjer so primerjali efektivnost fagov v polnomastnem mleku, posnetem mleku, energijski pijači, jabolčnem soku in surovem tekočem jajcu so opazili najmanjšo efektivnost pri jajcu. Predvidevali so, da je efektivnost zmanjšala velika viskoznost jajca in s tem omejila difuzijo bakteriofaga. <br /> <br /> Način s katerim apliciramo bakteriofage močno vpliva na efektivnost. Pogosto se uporablja razprševanje, a se pri tem v okolje vnese tuje bakteriofage in spiranje opreme ni vedno mogoče. Najboljše rezultate pri živalih kažejo eksperimenti, kjer se koktajl bakteriofagov vnese oralno v žival, pri tem pa je pomembno, da pazimo na prebavne poti in ustrezno zaščitimo bakteriofage. Za zaščito pred nizkim pH-je v želodcu se poleg bakteriofaga vnese tudi antacid ali pa se enkapsulira bakteriofag. <br /> <br /> ==Enkapsulacija bakteriofagov== <br /> <br /> Enkapsulacija bakteriofagov v specifične ovoje omogoči kontrolo nad sproščanjem bakteriofagov, ko so izpolnjeni pravi pogoji. Načinov kako se bakteriofage enkapsulira je veliko in še vedno se razvijajo novi postopki. <br /> <br /> Pogost način zaščite bakteriofagov, ki se vnašajo s hrano in vodo je enkapsulacija v kapsule, ki so narejene iz alginata ter obdane z različnimi polimeri. Za močnejšo strukturo alginatnega hidrogela se zraven dodaja hitozan, izolat sirotke ali ksantan gumi. Takšen postopek je bil prvič omenjen leta 2008, ko so raziskovalci enkapsulirali za Salmonella specifičen bakteriofag FelixO1 v kapsule iz alginata obdane z hitozanom. Zaradi te predelave so bakteriofagi delno obdržali svojo aktivnost, ko so bili dani v simulirano želodčno kislino, a se je čas sproščanja bakteriofagov podaljšal na 5 h. <br /> <br /> Pri enem od že patentiranih načinov enkapsulacije so bakteriofage imobilizirali v prahu posnetega mleka in vse to zaprli v kapsulo narejeno iz palmitinske in stearinske kisline. Bakteriofagi v takšnih kapsulah so bili bolj odporni na pH 2,15 kot kontrolna skupina bakteriofagov. <br /> <br /> ==Uporaba bakteriofagov in encimov, ki se prenašajo s fagi, v procesu biosanitizacije površin v prehrambni industriji== <br /> <br /> Tvorba mikrobioloških biofilmov na površinah opreme je ena glavnih težav v obratih za proizvodnjo hrane. Biofilm je vsak skupek mikroorganizmov, v katerem se celice pritrjene ena na drugo in pogosto tudi na neko površino (biotsko ali abiotsko). Te celice se obdajo z sluzastim zunajceličnim matriksom, sestavljenim iz zunajceličnih polimernih snovi (EPS). Celice v biofilmu proizvajajo komponente EPS, ki je običajno konglomeracija zunajceličnih polisaharidov, beljakovin, lipidov in DNA. <br /> <br /> Za bakterijske celice (L. monocytogenes, Salmonella, E. coli, Yersinia), ki tvorijo biofilme, je značilna visoka odpornost na neugodne okolijske razmere, antibiotike in razkužila. Biofilmi so dinamične strukture, katerih dovzetnost za bakteriofage je odvisna od vrste bakteriofaga in njegove sposobnosti proizvajanja encimov, ki lahko uničijo biofilm, ter od razpoložljivosti receptorskih mest za fage. <br /> <br /> Velik potencial za boj proti bakterijskim biofilmom imajo encimi, ki jih proizvajajo bakteriofagi (depolimeraze in endolizini). Depolimeraza (DP) lahko razgradi strukturne, kapsularne in zunajcelične polisaharide, da olajša adhezijo fagov na celice. Depolimeraze se lahko pojavijo kot sestavni deli fagov ali kot topni proteini. Depolimeraze delimo na hidrolaze (polisaharaze) in lizaze. <br /> <br /> <br /> <br /> ==Uporaba endolizinov bakteriofagov pri konzerviranju hrane== <br /> <br /> Druga vrsta encima, ki jo proizvajajo bakteriofagi, ki ima potencialno uporabo v biosanitizaciji so endolizini. Uporabljajo se lahko eksogeno za uničenje gram-pozitivnih bakterij. Da so endolizini bolj učinkoviti proti gram-negativnim bakterijam je treba zunanjo membrano permeabilizirati (npr. z jabolčno in citronsko kislino). Določeni endolizini imajo povečano antimikrobno delovanje v prisotnosti Ca2+ in Mn2+. <br /> <br /> Uporaba endolizinov bakteriofaga je mogoča na različnih stopnjah pridelave in predelave hrane. Učinkovitost endolizinov se poveča pri obdelavi hrane pri visokem hidrostatičnem tlaku. Druga obetavna metoda vključuje uporabo rekombinantnih bakterij, ki izločajo endolizine. Do danes niso našli nobenih sevov odpornih na endolizin. Za bakterije je razvoj odpornosti proti endolizinom težaven, saj bi ti organizmi morali spremeniti strukturo svoje celične stene. <br /> <br /> <br /> <br /> ==Dvojna narava bakteriofagov v mlečnem sektorju== <br /> <br /> Bakteriofagi lahko zaradi svoje prisotnosti prispevajo k velikim finančnim izgubam v industriji. V mlečni industriji bakteriofagi (Caudovirales, Podoviridae in Siphoviridae) uničijo fermentacijski proces z lizo mlečnokislinskih bakterij (LAB). <br /> <br /> Zmerni fagi integrirajo svoj genetski material v gostiteljski genom in ta se prenese na potomce. V življenjskem ciklu faga lahko zmerni bakteriofag LAB ostane dlje časa v obliki profaga. Stres, povezan s predelavo hrane, lahko aktivira profage in sproži litični cikel in s tem smrt LAB. <br /> <br /> Obstaja veliko virov za fagno kontaminacijo fermentiranih izdelkov, ki vključujejo surovo mleko in sirotko v prahu. Surovo mleko je naravni rezervoar LAB, zato ima lahko bakteriofage, specifične za LAB. Začetne kulture LAB so tudi lahko vir okužbe z bakteriofagi. Drugi pomembni viri onesnaženja z bakteriofagi so zrak in površina v mlekarnah. <br /> <br /> Bakteriofagi so pa lahko tudi koristni v mlečni industriji. Zaradi visoke specifičnosti se fagi lahko uporabljajo za uničenje patogenov, na primer bakterije Staphylococcus, ki jih pogosto najdemo v mlečnih izdelkih. Vseeno pa je določeno tveganje, da fermentacija ne uspe, kar zmanjšamo z: <br /> <br /> *Uporabo učinkovitih razkužil (natrijev hipoklorit) <br /> <br /> *Rotacijo sevov (sirarne) <br /> <br /> *Genski inženiringom - izgradnja na fage odpornih sevov LAB <br /> <br /> <br /> <br /> ==Detekcija fagov v mlečnih izdelkih== <br /> <br /> Za detekcijo se uporabljajo klasične mikrobiološke metode, na primer preizkus s plaki ali spremljanje zakisanosti. V surovem mleku je mogoče uporabiti tudi molekularno biološke metode - qPCR in klasični PCR. Metoda qPCR temelji na fluorescentnih tehnikah in omogoča hitrejšo detekcijo kot PCR. Dodatna metoda je pretočna citometrija, kjer spremljamo fizikalne in kemijske lastnosti populacije celic, njihovo množično odmrtje. <br /> <br /> ==Viri== <br /> <br /> * M. Połaska and B. Sokołowska, “Review bacteriophages—a new hope or a huge problem in the food industry,” AIMS Microbiology. 2019. <br /> <br /> * R. Lewis and C. Hill, “Overcoming barriers to phage application in food and feed,” Current Opinion in Biotechnology. 2020. <br /> <br /> * E. Parente, T. M. Cogan, and I. B. Powell, “Starter Cultures: General Aspects,” in Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology: Fourth Edition, 2017. <br /> <br /> * Maddocks, Sarah, and Rowena Jenkins. “Quantitative PCR.” Understanding PCR. 2017. <br /> <br /> * A. Svircev, D. Roach, and A. Castle, “Framing the future with bacteriophages in agriculture,” Viruses. 2018. <br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bakteriofagi&diff=17404 2020-05-16T17:12:48Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2019/20 obravnavajo različne vidike bakteriofagov, od njihove zgradbe in delovanja, do vloge v okolju in izrabe za zdravljenje. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si oglejte prosojnice v spletni učilnici - 3. teden marca. V okviru posameznih glavnih poglavij lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).<br /> <br /> Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti (lahko tudi dva, če pa bi kakšno temo na vsak način rad obdelal en sam, mi prej pišite, da se pogovorimo glede vsebine in obsega). Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200-1800 besed), ki ste jih uporabili.<br /> <br /> Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'. <br /> Predstavitev naj bo dolga 15-20 minut, temu pa bo sledila razprava (pribl. 5 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite le malo splošnega uvoda, ki naj ima za nalogo, da umesti vašo temo v kontekst problematike bakteriofagov.<br /> <br /> Predvidena umestitev seminarjev v semestru je razvidna iz spletne učilnice, a zaenkrat ni mogoče zagotovo reči, da ne bo kakšnih sprememb zaradi ukrepov proti širjenju koronavirusa. <br /> <br /> Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. 10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).<br /> <br /> Spodnji seznam vključuje povezave do nekaterih preglednih člankov iz zadnjega obdobja, ki jih lahko uporabite za osnovo pri pripravi. Večinoma pa navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili 15-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro en za drugim - predvidoma po 8 na teden), tako da boste osnove hitro osvojili in jih ni treba ponavljati.<br /> <br /> <br /> Poglavja za seminarje so:<br /> <br /> '''STRUKTURA IN DELOVANJE FAGOV'''&lt;br&gt;<br /> https://www.intechopen.com/books/bacteriophages-perspectives-and-future/bacteriophages-their-structural-organisation-and-function (poglavje, 2019)&lt;br&gt;<br /> 1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov&lt;br&gt;<br /> 2. Struktura kapsid in prokapsid&lt;br&gt;<br /> 3. Struktura konektorjev in repov&lt;br&gt;<br /> 4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6416446/ (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6209105/ (pregledni, 2018)&lt;br&gt;<br /> 6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1879625718300142?via%&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2018)&lt;br&gt;<br /> 7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1570963919301888?via%&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2020)&lt;br&gt;<br /> 8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> '''INTERAKCIJE in EKOLOGIJA'''&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29523063&lt;br&gt;<br /> 9. Interakcija faga z bakterijo &lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X19300031 (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.mdpi.com/2076-0817/8/3/100/htm (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (brez človeka - to je predhodna tema)&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/08927014.2019.1613525 in https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32125643&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019+2020)&lt;br&gt;<br /> 12. Delovanje fagov na heterogene biofilme&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0966842X19300599?via%&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom&lt;br&gt;<br /> <br /> https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11274-013-1358-5 (pregledni, 2013)&lt;br&gt;<br /> 14. Cianofagi&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> '''UPORABA BAKTERIOFAGOV'''&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2019.00513/full (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb&lt;br&gt;<br /> 16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh&lt;br&gt;<br /> 17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5371805/&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2017 - samo kratko poglavje o uporabi na rastlinah)&lt;br&gt;<br /> 18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0160412019305410 (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.aimspress.com/fileOther/PDF/microbiology/microbiol-05-04-&lt;br&gt;<br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S095816691930093X?via%3Dihub&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019 + 2020)&lt;br&gt;<br /> 20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm &lt;br&gt;<br /> in https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166919301296?via%3Dihub &lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019 + 2020)&lt;br&gt;<br /> 21. Biotehnološka izraba fagov &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> <br /> ----<br /> <br /> Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju. <br /> Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.<br /> <br /> 0. Analiza bakteriofagov v smrekovem gozdu (Jana Dolenc, Tilen Deželak, Sonja Mavrič)&lt;br&gt;<br /> <br /> 1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov&lt;br&gt;<br /> 2. Struktura kapsid in prokapsid&lt;br&gt;<br /> 3. Struktura konektorjev in repov&lt;br&gt;<br /> 4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov&lt;br&gt;<br /> 5. [[Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda]] (Kim Glavič, Nastja Feguš, Nina Varda) &lt;br&gt;<br /> 6. [[Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni]] (Žiga Vičič, Dunia Sahir, Maja Globočnik)&lt;br&gt;<br /> 7. [[Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina]] (Anja Konjc, Tina Logonder, Manca Osolin)&lt;br&gt;<br /> 8. [[Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave]] (Tina Arnšek, Ana Babnik, Greta Junger)&lt;br&gt;<br /> 9. [[Interakcija faga z bakterijo]] (Anastasija Nechevska, Marjeta Milostnik, Ana Vičič)&lt;br&gt;<br /> 10.[[Interakcije fagov s človeškimi tkivi]] (Michelle Oletič, Nika Vegelj, Rebeka Dajčman)&lt;br&gt;<br /> 11. [[Fagi v naravnih in umetnih okoljih]] (Lena Trnovec, Maja Kolar, Liza Praznik)&lt;br&gt;<br /> 12. Delovanje fagov na heterogene biofilme&lt;br&gt;<br /> 13. [[Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom]] (Žan Fortuna, Tevž Levstek, Lara Drinovec)&lt;br&gt;<br /> 14. [[Cianofagi]] (Timotej Zgonik)&lt;br&gt;<br /> 15. [[Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb]] (Maša Gabrič, Maša Andoljšek, Vivian Nemanič)&lt;br&gt;<br /> 16. [[Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh]] (Tim Nograšek, Jure Povšin, Sašo Jakob)&lt;br&gt;<br /> 17. [[Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje]] (Maja Mahorič, Ana Potočnik, Maja Trifkovič)&lt;br&gt;<br /> 18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin (Tanja Janko, Špela Šubelj in Matic Krivec)&lt;br&gt;<br /> 19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti&lt;br&gt;<br /> 20. [[Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih]] (Tadej Uršič, Teo Nograšek, Oskar Nemec)&lt;br&gt;<br /> 21. Biotehnološka izraba fagov &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> <br /> Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: &lt;nowiki&gt;[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]&lt;/nowiki&gt;&lt;br&gt; <br /> <br /> Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).<br /> <br /> #[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Tveganja_pri_uporabi_fagov_za_zdravljenje&diff=16842 2020-04-24T10:58:51Z

<p>Ana Potočnik: New page: Uvod</p> <hr /> <div>Uvod</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:Ana_Poto%C4%8Dnik&diff=16841 2020-04-24T10:55:04Z

<p>Ana Potočnik: Removing all content from page</p> <hr /> <div></div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:Ana_Poto%C4%8Dnik&diff=16840 2020-04-24T10:54:43Z

<p>Ana Potočnik: New page: Tveganje</p> <hr /> <div>Tveganje</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bakteriofagi&diff=16195 2020-03-12T21:29:45Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2019/20 obravnavajo različne vidike bakteriofagov, od njihove zgradbe in delovanja, do vloge v okolju in izrabe za zdravljenje. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si oglejte prosojnice v spletni učilnici - 3. teden marca. V okviru posameznih glavnih poglavij lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).<br /> <br /> Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti (lahko tudi dva, če pa bi kakšno temo na vsak način rad obdelal en sam, mi prej pišite, da se pogovorimo glede vsebine in obsega). Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200-1800 besed), ki ste jih uporabili.<br /> <br /> Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'. <br /> Predstavitev naj bo dolga 15-20 minut, temu pa bo sledila razprava (pribl. 5 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite le malo splošnega uvoda, ki naj ima za nalogo, da umesti vašo temo v kontekst problematike bakteriofagov.<br /> <br /> Predvidena umestitev seminarjev v semestru je razvidna iz spletne učilnice, a zaenkrat ni mogoče zagotovo reči, da ne bo kakšnih sprememb zaradi ukrepov proti širjenju koronavirusa. <br /> <br /> Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. 10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).<br /> <br /> Spodnji seznam vključuje povezave do nekaterih preglednih člankov iz zadnjega obdobja, ki jih lahko uporabite za osnovo pri pripravi. Večinoma pa navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili 15-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro en za drugim - predvidoma po 8 na teden), tako da boste osnove hitro osvojili in jih ni treba ponavljati.<br /> <br /> <br /> Poglavja za seminarje so:<br /> <br /> '''STRUKTURA IN DELOVANJE FAGOV'''&lt;br&gt;<br /> https://www.intechopen.com/books/bacteriophages-perspectives-and-future/bacteriophages-their-structural-organisation-and-function (poglavje, 2019)&lt;br&gt;<br /> 1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov&lt;br&gt;<br /> 2. Struktura kapsid in prokapsid&lt;br&gt;<br /> 3. Struktura konektorjev in repov&lt;br&gt;<br /> 4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6416446/ (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6209105/ (pregledni, 2018)&lt;br&gt;<br /> 6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1879625718300142?via%&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2018)&lt;br&gt;<br /> 7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1570963919301888?via%&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2020)&lt;br&gt;<br /> 8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> '''INTERAKCIJE in EKOLOGIJA'''&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29523063&lt;br&gt;<br /> 9. Interakcija faga z bakterijo &lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X19300031 (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.mdpi.com/2076-0817/8/3/100/htm (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (brez človeka - to je predhodna tema)&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/08927014.2019.1613525 in https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32125643&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019+2020)&lt;br&gt;<br /> 12. Delovanje fagov na heterogene biofilme&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0966842X19300599?via%&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom&lt;br&gt;<br /> <br /> https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11274-013-1358-5 (pregledni, 2013)&lt;br&gt;<br /> 14. Cianofagi&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> '''UPORABA BAKTERIOFAGOV'''&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2019.00513/full (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb&lt;br&gt;<br /> 16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh&lt;br&gt;<br /> 17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5371805/&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2017 - samo kratko poglavje o uporabi na rastlinah)&lt;br&gt;<br /> 18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0160412019305410 (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.aimspress.com/fileOther/PDF/microbiology/microbiol-05-04-&lt;br&gt;<br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S095816691930093X?via%3Dihub&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019 + 2020)&lt;br&gt;<br /> 20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm &lt;br&gt;<br /> in https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166919301296?via%3Dihub &lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019 + 2020)&lt;br&gt;<br /> 21. Biotehnološka izraba fagov &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> <br /> ----<br /> <br /> Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju. <br /> Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.<br /> <br /> 0. Analiza bakteriofagov v smrekovem gozdu (Jana Dolenc, Tilen Deželak, Sonja Mavrič)&lt;br&gt;<br /> <br /> 1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov&lt;br&gt;<br /> 2. Struktura kapsid in prokapsid&lt;br&gt;<br /> 3. Struktura konektorjev in repov&lt;br&gt;<br /> 4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov&lt;br&gt;<br /> 5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda (Kim Glavič, Nastja Feguš, Nina Varda) &lt;br&gt;<br /> 6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni (Žiga Vičič, Dunia Sahir, Maja Globočnik)&lt;br&gt;<br /> 7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina&lt;br&gt;<br /> 8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave (Tina Arnšek, Ana Babnik, Greta Junger)&lt;br&gt;<br /> 9. Interakcija faga z bakterijo (Anastasija Nechevska, Marjeta Milostnik)&lt;br&gt;<br /> 10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi (Michelle Oletič, Nika Vegelj, Rebeka Dajčman)&lt;br&gt;<br /> 11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (Lena Trnovec, Maja Kolar)&lt;br&gt;<br /> 12. Delovanje fagov na heterogene biofilme&lt;br&gt;<br /> 13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom (Žan Fortuna, Tevž Levstek)&lt;br&gt;<br /> 14. Cianofagi&lt;br&gt;<br /> 15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb (Maša Gabrič, Maša Andoljšek, Vivian Nemanič)&lt;br&gt;<br /> 16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh(Tim Nograšek, Jure Povšin, Sašo Jakob)&lt;br&gt;<br /> 17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje (Maja Mahorič, Ana Potočnik, Maja Trifkovič)&lt;br&gt;<br /> 18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin&lt;br&gt;<br /> 19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti&lt;br&gt;<br /> 20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih (Tadej Uršič, Teo Nograšek)&lt;br&gt;<br /> 21. Biotehnološka izraba fagov &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> <br /> Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: &lt;nowiki&gt;[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]&lt;/nowiki&gt;&lt;br&gt; <br /> <br /> Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).<br /> <br /> #[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bakteriofagi&diff=16194 2020-03-12T21:15:28Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2019/20 obravnavajo različne vidike bakteriofagov, od njihove zgradbe in delovanja, do vloge v okolju in izrabe za zdravljenje. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si oglejte prosojnice v spletni učilnici - 3. teden marca. V okviru posameznih glavnih poglavij lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).<br /> <br /> Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti (lahko tudi dva, če pa bi kakšno temo na vsak način rad obdelal en sam, mi prej pišite, da se pogovorimo glede vsebine in obsega). Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200-1800 besed), ki ste jih uporabili.<br /> <br /> Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'. <br /> Predstavitev naj bo dolga 15-20 minut, temu pa bo sledila razprava (pribl. 5 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite le malo splošnega uvoda, ki naj ima za nalogo, da umesti vašo temo v kontekst problematike bakteriofagov.<br /> <br /> Predvidena umestitev seminarjev v semestru je razvidna iz spletne učilnice, a zaenkrat ni mogoče zagotovo reči, da ne bo kakšnih sprememb zaradi ukrepov proti širjenju koronavirusa. <br /> <br /> Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. 10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).<br /> <br /> Spodnji seznam vključuje povezave do nekaterih preglednih člankov iz zadnjega obdobja, ki jih lahko uporabite za osnovo pri pripravi. Večinoma pa navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili 15-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro en za drugim - predvidoma po 8 na teden), tako da boste osnove hitro osvojili in jih ni treba ponavljati.<br /> <br /> <br /> Poglavja za seminarje so:<br /> <br /> '''STRUKTURA IN DELOVANJE FAGOV'''&lt;br&gt;<br /> https://www.intechopen.com/books/bacteriophages-perspectives-and-future/bacteriophages-their-structural-organisation-and-function (poglavje, 2019)&lt;br&gt;<br /> 1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov&lt;br&gt;<br /> 2. Struktura kapsid in prokapsid&lt;br&gt;<br /> 3. Struktura konektorjev in repov&lt;br&gt;<br /> 4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6416446/ (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6209105/ (pregledni, 2018)&lt;br&gt;<br /> 6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1879625718300142?via%&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2018)&lt;br&gt;<br /> 7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1570963919301888?via%&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2020)&lt;br&gt;<br /> 8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> '''INTERAKCIJE in EKOLOGIJA'''&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29523063&lt;br&gt;<br /> 9. Interakcija faga z bakterijo &lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X19300031 (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.mdpi.com/2076-0817/8/3/100/htm (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (brez človeka - to je predhodna tema)&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/08927014.2019.1613525 in https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32125643&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019+2020)&lt;br&gt;<br /> 12. Delovanje fagov na heterogene biofilme&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0966842X19300599?via%&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom&lt;br&gt;<br /> <br /> https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11274-013-1358-5 (pregledni, 2013)&lt;br&gt;<br /> 14. Cianofagi&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> '''UPORABA BAKTERIOFAGOV'''&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2019.00513/full (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb&lt;br&gt;<br /> 16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh&lt;br&gt;<br /> 17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5371805/&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2017 - samo kratko poglavje o uporabi na rastlinah)&lt;br&gt;<br /> 18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0160412019305410 (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.aimspress.com/fileOther/PDF/microbiology/microbiol-05-04-&lt;br&gt;<br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S095816691930093X?via%3Dihub&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019 + 2020)&lt;br&gt;<br /> 20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm &lt;br&gt;<br /> in https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166919301296?via%3Dihub &lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019 + 2020)&lt;br&gt;<br /> 21. Biotehnološka izraba fagov &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> <br /> ----<br /> <br /> Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju. <br /> Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.<br /> <br /> 0. Analiza bakteriofagov v smrekovem gozdu (Jana Dolenc, Tilen Deželak, Sonja Mavrič)&lt;br&gt;<br /> <br /> 1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov&lt;br&gt;<br /> 2. Struktura kapsid in prokapsid&lt;br&gt;<br /> 3. Struktura konektorjev in repov&lt;br&gt;<br /> 4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov&lt;br&gt;<br /> 5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda (Kim Glavič, Nastja Feguš, Nina Varda) &lt;br&gt;<br /> 6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni (Žiga Vičič, Dunia Sahir, Maja Globočnik)&lt;br&gt;<br /> 7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina&lt;br&gt;<br /> 8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave&lt;br&gt;<br /> 9. Interakcija faga z bakterijo (Anastasija Nechevska, Marjeta Milostnik)&lt;br&gt;<br /> 10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi (Michelle Oletič, Nika Vegelj, Rebeka Dajčman)&lt;br&gt;<br /> 11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (Lena Trnovec, Maja Kolar)&lt;br&gt;<br /> 12. Delovanje fagov na heterogene biofilme&lt;br&gt;<br /> 13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom (Žan Fortuna, Tevž Levstek)&lt;br&gt;<br /> 14. Cianofagi&lt;br&gt;<br /> 15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb (Maša Gabrič, Maša Andoljšek, Vivian Nemanič)&lt;br&gt;<br /> 16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh(Tim Nograšek, Jure Povšin, Sašo Jakob)&lt;br&gt;<br /> 17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje (Maja Mahorič, Ana Potočnik, Maja Trifkovič)&lt;br&gt;<br /> 18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin&lt;br&gt;<br /> 19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti&lt;br&gt;<br /> 20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih (Tadej Uršič, Teo Nograšek)&lt;br&gt;<br /> 21. Biotehnološka izraba fagov &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> <br /> Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: &lt;nowiki&gt;[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]&lt;/nowiki&gt;&lt;br&gt; <br /> <br /> Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).<br /> <br /> #[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bakteriofagi&diff=16192 2020-03-12T20:12:53Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2019/20 obravnavajo različne vidike bakteriofagov, od njihove zgradbe in delovanja, do vloge v okolju in izrabe za zdravljenje. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si oglejte prosojnice v spletni učilnici - 3. teden marca. V okviru posameznih glavnih poglavij lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).<br /> <br /> Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti (lahko tudi dva, če pa bi kakšno temo na vsak način rad obdelal en sam, mi prej pišite, da se pogovorimo glede vsebine in obsega). Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200-1800 besed), ki ste jih uporabili.<br /> <br /> Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'. <br /> Predstavitev naj bo dolga 15-20 minut, temu pa bo sledila razprava (pribl. 5 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite le malo splošnega uvoda, ki naj ima za nalogo, da umesti vašo temo v kontekst problematike bakteriofagov.<br /> <br /> Predvidena umestitev seminarjev v semestru je razvidna iz spletne učilnice, a zaenkrat ni mogoče zagotovo reči, da ne bo kakšnih sprememb zaradi ukrepov proti širjenju koronavirusa. <br /> <br /> Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. 10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).<br /> <br /> Spodnji seznam vključuje povezave do nekaterih preglednih člankov iz zadnjega obdobja, ki jih lahko uporabite za osnovo pri pripravi. Večinoma pa navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili 15-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro en za drugim - predvidoma po 8 na teden), tako da boste osnove hitro osvojili in jih ni treba ponavljati.<br /> <br /> <br /> Poglavja za seminarje so:<br /> <br /> '''STRUKTURA IN DELOVANJE FAGOV'''&lt;br&gt;<br /> https://www.intechopen.com/books/bacteriophages-perspectives-and-future/bacteriophages-their-structural-organisation-and-function (poglavje, 2019)&lt;br&gt;<br /> 1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov&lt;br&gt;<br /> 2. Struktura kapsid in prokapsid&lt;br&gt;<br /> 3. Struktura konektorjev in repov&lt;br&gt;<br /> 4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6416446/ (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6209105/ (pregledni, 2018)&lt;br&gt;<br /> 6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1879625718300142?via%&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2018)&lt;br&gt;<br /> 7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1570963919301888?via%&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2020)&lt;br&gt;<br /> 8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> '''INTERAKCIJE in EKOLOGIJA'''&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29523063&lt;br&gt;<br /> 9. Interakcija faga z bakterijo &lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X19300031 (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.mdpi.com/2076-0817/8/3/100/htm (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (brez človeka - to je predhodna tema)&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/08927014.2019.1613525 in https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32125643&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019+2020)&lt;br&gt;<br /> 12. Delovanje fagov na heterogene biofilme&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0966842X19300599?via%&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom&lt;br&gt;<br /> <br /> https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11274-013-1358-5 (pregledni, 2013)&lt;br&gt;<br /> 14. Cianofagi&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> '''UPORABA BAKTERIOFAGOV'''&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2019.00513/full (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb&lt;br&gt;<br /> 16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh&lt;br&gt;<br /> 17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5371805/&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2017 - samo kratko poglavje o uporabi na rastlinah)&lt;br&gt;<br /> 18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0160412019305410 (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.aimspress.com/fileOther/PDF/microbiology/microbiol-05-04-&lt;br&gt;<br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S095816691930093X?via%3Dihub&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019 + 2020)&lt;br&gt;<br /> 20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm &lt;br&gt;<br /> in https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166919301296?via%3Dihub &lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019 + 2020)&lt;br&gt;<br /> 21. Biotehnološka izraba fagov &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> <br /> ----<br /> <br /> Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju. <br /> Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.<br /> <br /> 0. Analiza bakteriofagov v smrekovem gozdu (Jana Dolenc, Tilen Deželak, Sonja Mavrič)&lt;br&gt;<br /> <br /> 1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov&lt;br&gt;<br /> 2. Struktura kapsid in prokapsid&lt;br&gt;<br /> 3. Struktura konektorjev in repov&lt;br&gt;<br /> 4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov&lt;br&gt;<br /> 5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda (Kim Glavič, Nastja Feguš, Nina Varda) &lt;br&gt;<br /> 6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni (Žiga Vičič, Dunia Sahir, Maja Globočnik)&lt;br&gt;<br /> 7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina&lt;br&gt;<br /> 8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave&lt;br&gt;<br /> 9. Interakcija faga z bakterijo (Anastasija Nechevska, Marjeta Milostnik)&lt;br&gt;<br /> 10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi (Michelle Oletič, Nika Vegelj, Rebeka Dajčman)&lt;br&gt;<br /> 11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (Lena Trnovec, Maja Kolar)&lt;br&gt;<br /> 12. Delovanje fagov na heterogene biofilme&lt;br&gt;<br /> 13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom&lt;br&gt;<br /> 14. Cianofagi&lt;br&gt;<br /> 15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb (Maša Gabrič, Maša Andoljšek, Vivian Nemanič)&lt;br&gt;<br /> 16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh(Tim Nograšek, Jure Povšin, Sašo Jakob)&lt;br&gt;<br /> 17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje&lt;br&gt;<br /> 18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin&lt;br&gt;<br /> 19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti&lt;br&gt;<br /> 20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih (Tadej Uršič, Teo Nograšek)&lt;br&gt;<br /> 21. Biotehnološka izraba fagov &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> <br /> Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: &lt;nowiki&gt;[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]&lt;/nowiki&gt;&lt;br&gt; <br /> <br /> Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).<br /> <br /> #[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bakteriofagi&diff=16191 2020-03-12T20:09:16Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2019/20 obravnavajo različne vidike bakteriofagov, od njihove zgradbe in delovanja, do vloge v okolju in izrabe za zdravljenje. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si oglejte prosojnice v spletni učilnici - 3. teden marca. V okviru posameznih glavnih poglavij lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).<br /> <br /> Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti (lahko tudi dva, če pa bi kakšno temo na vsak način rad obdelal en sam, mi prej pišite, da se pogovorimo glede vsebine in obsega). Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200-1800 besed), ki ste jih uporabili.<br /> <br /> Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'. <br /> Predstavitev naj bo dolga 15-20 minut, temu pa bo sledila razprava (pribl. 5 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite le malo splošnega uvoda, ki naj ima za nalogo, da umesti vašo temo v kontekst problematike bakteriofagov.<br /> <br /> Predvidena umestitev seminarjev v semestru je razvidna iz spletne učilnice, a zaenkrat ni mogoče zagotovo reči, da ne bo kakšnih sprememb zaradi ukrepov proti širjenju koronavirusa. <br /> <br /> Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. 10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).<br /> <br /> Spodnji seznam vključuje povezave do nekaterih preglednih člankov iz zadnjega obdobja, ki jih lahko uporabite za osnovo pri pripravi. Večinoma pa navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili 15-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro en za drugim - predvidoma po 8 na teden), tako da boste osnove hitro osvojili in jih ni treba ponavljati.<br /> <br /> <br /> Poglavja za seminarje so:<br /> <br /> '''STRUKTURA IN DELOVANJE FAGOV'''&lt;br&gt;<br /> https://www.intechopen.com/books/bacteriophages-perspectives-and-future/bacteriophages-their-structural-organisation-and-function (poglavje, 2019)&lt;br&gt;<br /> 1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov&lt;br&gt;<br /> 2. Struktura kapsid in prokapsid&lt;br&gt;<br /> 3. Struktura konektorjev in repov&lt;br&gt;<br /> 4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6416446/ (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6209105/ (pregledni, 2018)&lt;br&gt;<br /> 6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1879625718300142?via%&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2018)&lt;br&gt;<br /> 7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1570963919301888?via%&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2020)&lt;br&gt;<br /> 8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> '''INTERAKCIJE in EKOLOGIJA'''&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29523063&lt;br&gt;<br /> 9. Interakcija faga z bakterijo &lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X19300031 (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.mdpi.com/2076-0817/8/3/100/htm (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (brez človeka - to je predhodna tema)&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/08927014.2019.1613525 in https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32125643&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019+2020)&lt;br&gt;<br /> 12. Delovanje fagov na heterogene biofilme&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0966842X19300599?via%&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom&lt;br&gt;<br /> <br /> https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11274-013-1358-5 (pregledni, 2013)&lt;br&gt;<br /> 14. Cianofagi&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> '''UPORABA BAKTERIOFAGOV'''&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2019.00513/full (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb&lt;br&gt;<br /> 16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh&lt;br&gt;<br /> 17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5371805/&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2017 - samo kratko poglavje o uporabi na rastlinah)&lt;br&gt;<br /> 18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0160412019305410 (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.aimspress.com/fileOther/PDF/microbiology/microbiol-05-04-&lt;br&gt;<br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S095816691930093X?via%3Dihub&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019 + 2020)&lt;br&gt;<br /> 20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm &lt;br&gt;<br /> in https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166919301296?via%3Dihub &lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019 + 2020)&lt;br&gt;<br /> 21. Biotehnološka izraba fagov &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> <br /> ----<br /> <br /> Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju. <br /> Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.<br /> <br /> 0. Analiza bakteriofagov v smrekovem gozdu (Jana Dolenc, Tilen Deželak, Sonja Mavrič)&lt;br&gt;<br /> <br /> 1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov&lt;br&gt;<br /> 2. Struktura kapsid in prokapsid&lt;br&gt;<br /> 3. Struktura konektorjev in repov&lt;br&gt;<br /> 4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov&lt;br&gt;<br /> 5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda (Kim Glavič, Nastja Feguš, Nina Varda) &lt;br&gt;<br /> 6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni (Žiga Vičič, Dunia Sahir, Maja Globočnik)&lt;br&gt;<br /> 7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina (Ana Potočnik,)&lt;br&gt;<br /> 8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave&lt;br&gt;<br /> 9. Interakcija faga z bakterijo (Anastasija Nechevska, Marjeta Milostnik)&lt;br&gt;<br /> 10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi (Michelle Oletič, Nika Vegelj, Rebeka Dajčman)&lt;br&gt;<br /> 11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (Lena Trnovec, Maja Kolar)&lt;br&gt;<br /> 12. Delovanje fagov na heterogene biofilme&lt;br&gt;<br /> 13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom&lt;br&gt;<br /> 14. Cianofagi&lt;br&gt;<br /> 15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb (Maša Gabrič, Maša Andoljšek, Vivian Nemanič)&lt;br&gt;<br /> 16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh(Tim Nograšek, Jure Povšin, Sašo Jakob)&lt;br&gt;<br /> 17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje&lt;br&gt;<br /> 18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin&lt;br&gt;<br /> 19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti&lt;br&gt;<br /> 20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih (Tadej Uršič, Teo Nograšek)&lt;br&gt;<br /> 21. Biotehnološka izraba fagov &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> <br /> Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: &lt;nowiki&gt;[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]&lt;/nowiki&gt;&lt;br&gt; <br /> <br /> Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).<br /> <br /> #[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bakteriofagi&diff=16190 2020-03-12T20:08:49Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2019/20 obravnavajo različne vidike bakteriofagov, od njihove zgradbe in delovanja, do vloge v okolju in izrabe za zdravljenje. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si oglejte prosojnice v spletni učilnici - 3. teden marca. V okviru posameznih glavnih poglavij lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).<br /> <br /> Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti (lahko tudi dva, če pa bi kakšno temo na vsak način rad obdelal en sam, mi prej pišite, da se pogovorimo glede vsebine in obsega). Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200-1800 besed), ki ste jih uporabili.<br /> <br /> Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'. <br /> Predstavitev naj bo dolga 15-20 minut, temu pa bo sledila razprava (pribl. 5 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite le malo splošnega uvoda, ki naj ima za nalogo, da umesti vašo temo v kontekst problematike bakteriofagov.<br /> <br /> Predvidena umestitev seminarjev v semestru je razvidna iz spletne učilnice, a zaenkrat ni mogoče zagotovo reči, da ne bo kakšnih sprememb zaradi ukrepov proti širjenju koronavirusa. <br /> <br /> Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. 10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).<br /> <br /> Spodnji seznam vključuje povezave do nekaterih preglednih člankov iz zadnjega obdobja, ki jih lahko uporabite za osnovo pri pripravi. Večinoma pa navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili 15-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro en za drugim - predvidoma po 8 na teden), tako da boste osnove hitro osvojili in jih ni treba ponavljati.<br /> <br /> <br /> Poglavja za seminarje so:<br /> <br /> '''STRUKTURA IN DELOVANJE FAGOV'''&lt;br&gt;<br /> https://www.intechopen.com/books/bacteriophages-perspectives-and-future/bacteriophages-their-structural-organisation-and-function (poglavje, 2019)&lt;br&gt;<br /> 1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov&lt;br&gt;<br /> 2. Struktura kapsid in prokapsid&lt;br&gt;<br /> 3. Struktura konektorjev in repov&lt;br&gt;<br /> 4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6416446/ (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6209105/ (pregledni, 2018)&lt;br&gt;<br /> 6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1879625718300142?via%&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2018)&lt;br&gt;<br /> 7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1570963919301888?via%&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2020)&lt;br&gt;<br /> 8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> '''INTERAKCIJE in EKOLOGIJA'''&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29523063&lt;br&gt;<br /> 9. Interakcija faga z bakterijo &lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X19300031 (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.mdpi.com/2076-0817/8/3/100/htm (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (brez človeka - to je predhodna tema)&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/08927014.2019.1613525 in https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32125643&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019+2020)&lt;br&gt;<br /> 12. Delovanje fagov na heterogene biofilme&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0966842X19300599?via%&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom&lt;br&gt;<br /> <br /> https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11274-013-1358-5 (pregledni, 2013)&lt;br&gt;<br /> 14. Cianofagi&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> '''UPORABA BAKTERIOFAGOV'''&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2019.00513/full (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb&lt;br&gt;<br /> 16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh&lt;br&gt;<br /> 17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5371805/&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2017 - samo kratko poglavje o uporabi na rastlinah)&lt;br&gt;<br /> 18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0160412019305410 (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.aimspress.com/fileOther/PDF/microbiology/microbiol-05-04-&lt;br&gt;<br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S095816691930093X?via%3Dihub&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019 + 2020)&lt;br&gt;<br /> 20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm &lt;br&gt;<br /> in https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166919301296?via%3Dihub &lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019 + 2020)&lt;br&gt;<br /> 21. Biotehnološka izraba fagov &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> <br /> ----<br /> <br /> Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju. <br /> Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.<br /> <br /> 0. Analiza bakteriofagov v smrekovem gozdu (Jana Dolenc, Tilen Deželak, Sonja Mavrič)&lt;br&gt;<br /> <br /> 1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov&lt;br&gt;<br /> 2. Struktura kapsid in prokapsid&lt;br&gt;<br /> 3. Struktura konektorjev in repov&lt;br&gt;<br /> 4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov&lt;br&gt;<br /> 5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda (Kim Glavič, Nastja Feguš, Nina Varda) &lt;br&gt;<br /> 6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni (Žiga Vičič, Dunia Sahir, Maja Globočnik)&lt;br&gt;<br /> 7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina&lt;br&gt; (Ana Potočnik,)&lt;br&gt;<br /> 8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave&lt;br&gt;<br /> 9. Interakcija faga z bakterijo (Anastasija Nechevska, Marjeta Milostnik)&lt;br&gt;<br /> 10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi (Michelle Oletič, Nika Vegelj, Rebeka Dajčman)&lt;br&gt;<br /> 11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (Lena Trnovec, Maja Kolar)&lt;br&gt;<br /> 12. Delovanje fagov na heterogene biofilme&lt;br&gt;<br /> 13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom&lt;br&gt;<br /> 14. Cianofagi&lt;br&gt;<br /> 15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb (Maša Gabrič, Maša Andoljšek, Vivian Nemanič)&lt;br&gt;<br /> 16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh(Tim Nograšek, Jure Povšin, Sašo Jakob)&lt;br&gt;<br /> 17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje&lt;br&gt;<br /> 18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin&lt;br&gt;<br /> 19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti&lt;br&gt;<br /> 20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih (Tadej Uršič, Teo Nograšek)&lt;br&gt;<br /> 21. Biotehnološka izraba fagov &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> <br /> Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: &lt;nowiki&gt;[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]&lt;/nowiki&gt;&lt;br&gt; <br /> <br /> Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).<br /> <br /> #[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bakteriofagi&diff=16189 2020-03-12T20:08:23Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2019/20 obravnavajo različne vidike bakteriofagov, od njihove zgradbe in delovanja, do vloge v okolju in izrabe za zdravljenje. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si oglejte prosojnice v spletni učilnici - 3. teden marca. V okviru posameznih glavnih poglavij lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).<br /> <br /> Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti (lahko tudi dva, če pa bi kakšno temo na vsak način rad obdelal en sam, mi prej pišite, da se pogovorimo glede vsebine in obsega). Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200-1800 besed), ki ste jih uporabili.<br /> <br /> Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'. <br /> Predstavitev naj bo dolga 15-20 minut, temu pa bo sledila razprava (pribl. 5 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite le malo splošnega uvoda, ki naj ima za nalogo, da umesti vašo temo v kontekst problematike bakteriofagov.<br /> <br /> Predvidena umestitev seminarjev v semestru je razvidna iz spletne učilnice, a zaenkrat ni mogoče zagotovo reči, da ne bo kakšnih sprememb zaradi ukrepov proti širjenju koronavirusa. <br /> <br /> Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. 10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).<br /> <br /> Spodnji seznam vključuje povezave do nekaterih preglednih člankov iz zadnjega obdobja, ki jih lahko uporabite za osnovo pri pripravi. Večinoma pa navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili 15-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro en za drugim - predvidoma po 8 na teden), tako da boste osnove hitro osvojili in jih ni treba ponavljati.<br /> <br /> <br /> Poglavja za seminarje so:<br /> <br /> '''STRUKTURA IN DELOVANJE FAGOV'''&lt;br&gt;<br /> https://www.intechopen.com/books/bacteriophages-perspectives-and-future/bacteriophages-their-structural-organisation-and-function (poglavje, 2019)&lt;br&gt;<br /> 1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov&lt;br&gt;<br /> 2. Struktura kapsid in prokapsid&lt;br&gt;<br /> 3. Struktura konektorjev in repov&lt;br&gt;<br /> 4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6416446/ (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6209105/ (pregledni, 2018)&lt;br&gt;<br /> 6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1879625718300142?via%&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2018)&lt;br&gt;<br /> 7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1570963919301888?via%&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2020)&lt;br&gt;<br /> 8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> '''INTERAKCIJE in EKOLOGIJA'''&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29523063&lt;br&gt;<br /> 9. Interakcija faga z bakterijo &lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X19300031 (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.mdpi.com/2076-0817/8/3/100/htm (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (brez človeka - to je predhodna tema)&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/08927014.2019.1613525 in https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32125643&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019+2020)&lt;br&gt;<br /> 12. Delovanje fagov na heterogene biofilme&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0966842X19300599?via%&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom&lt;br&gt;<br /> <br /> https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11274-013-1358-5 (pregledni, 2013)&lt;br&gt;<br /> 14. Cianofagi&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> '''UPORABA BAKTERIOFAGOV'''&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2019.00513/full (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb&lt;br&gt;<br /> 16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh&lt;br&gt;<br /> 17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5371805/&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2017 - samo kratko poglavje o uporabi na rastlinah)&lt;br&gt;<br /> 18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0160412019305410 (pregledni, 2019)&lt;br&gt;<br /> 19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.aimspress.com/fileOther/PDF/microbiology/microbiol-05-04-&lt;br&gt;<br /> https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S095816691930093X?via%3Dihub&lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019 + 2020)&lt;br&gt;<br /> 20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih&lt;br&gt;<br /> <br /> https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm &lt;br&gt;<br /> in https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166919301296?via%3Dihub &lt;br&gt;<br /> (pregledni, 2019 + 2020)&lt;br&gt;<br /> 21. Biotehnološka izraba fagov &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> <br /> ----<br /> <br /> Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju. <br /> Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.<br /> <br /> 0. Analiza bakteriofagov v smrekovem gozdu (Jana Dolenc, Tilen Deželak, Sonja Mavrič)&lt;br&gt;<br /> <br /> 1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov&lt;br&gt;<br /> 2. Struktura kapsid in prokapsid&lt;br&gt;<br /> 3. Struktura konektorjev in repov&lt;br&gt;<br /> 4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov&lt;br&gt;<br /> 5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda (Kim Glavič, Nastja Feguš, Nina Varda) &lt;br&gt;<br /> 6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni (Žiga Vičič, Dunia Sahir, Maja Globočnik)&lt;br&gt;<br /> 7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina&lt;br&gt; (Ana Potočnik,)<br /> 8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave&lt;br&gt;<br /> 9. Interakcija faga z bakterijo (Anastasija Nechevska, Marjeta Milostnik)&lt;br&gt;<br /> 10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi (Michelle Oletič, Nika Vegelj, Rebeka Dajčman)&lt;br&gt;<br /> 11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (Lena Trnovec, Maja Kolar)&lt;br&gt;<br /> 12. Delovanje fagov na heterogene biofilme&lt;br&gt;<br /> 13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom&lt;br&gt;<br /> 14. Cianofagi&lt;br&gt;<br /> 15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb (Maša Gabrič, Maša Andoljšek, Vivian Nemanič)&lt;br&gt;<br /> 16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh(Tim Nograšek, Jure Povšin, Sašo Jakob)&lt;br&gt;<br /> 17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje&lt;br&gt;<br /> 18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin&lt;br&gt;<br /> 19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti&lt;br&gt;<br /> 20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih (Tadej Uršič, Teo Nograšek)&lt;br&gt;<br /> 21. Biotehnološka izraba fagov &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> <br /> Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: &lt;nowiki&gt;[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]&lt;/nowiki&gt;&lt;br&gt; <br /> <br /> Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).<br /> <br /> #[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO2_Povzetki_seminarjev_2019&diff=15930 2019-10-21T17:52:26Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>== Kim Glavič: ATP KOT SIGNALNA MOLEKULA ŽIVALI IN RASTLIN ==<br /> <br /> Molekula ATP ni le temeljni vir energije za mnoge procese v celici, temveč tudi signalna molekula v zunajceličnem matriksu živali in rastlin. ATP, kot velika polarna molekula, se iz celic rastlin izloči s pomočjo eksocitotskih veziklov ali ATP prenašalcev. Iz živalskih celic pa s pomočjo eksocitotskih veziklov, ATP prenašalcev ali koneksonskih hemikanalčkov. Ob povečanih koncentracijah molekul ATP v zunajceličnem matriksu se te vežejo na ustrezne P2- receptorje. Po sprostitvi nazaj v matriks pa njihovo koncentracijo uravnavajo ekto-nukleotidaze. Na splošno aktivacija P2- receptorjev povzroči povišanje koncentracije kalcijevih ionov in dušikovega monoksida v citosolu celice ter nastanek reaktivnih kisikovih zvrsti v zunajceličnem matriksu. Kalcijevi ioni, dušikov monoksid in reaktivne kisikove zvrsti so sekundarni obveščevalci, ki so ključni za fiziološki odziv celice. Rastlinska ATP-signalizacija ima pomembno vlogo pri časovni regulaciji kalitve cvetnega prahu, rasti pelodne cevke, nastanku koreninskih gomoljev in zaznavanju ter posledično izogibanju oviram pri rasti korenin. Živalska ATP-signalizacija sodeluje pri nastanku imunskega odziva, prenosu živčnih signalov, celični smrti in regulaciji mnogih drugih procesov.<br /> <br /> == Tevž Levstek: GLICINSKI TRANSPORTERJI KOT TERAPEVTSKE TARČE ==<br /> <br /> Glicin je proteinogena aminokislina, ki opravlja tudi funkcijo signalne molekule, natančneje nevrotransmiterja. Najdemo ga v dveh vrstah sinaps: glicinergičnih, kjer je glavni nevrotransmiter in glutamatergičnih, kjer ima pomožno vlogo, saj pomaga glutamatu pri signaliziranju. Koncentracije glicina v medceličnini regulirajo glicinski transporterji, ki jih delimo na GlyT1 in GlyT2. Glicinergična sinapsa je inhibitorna, kar pomeni, da če glicin aktivira svoj receptor, posinaptično celico hiperpolarizira (še poveča raven kloridnih ionov v njej). V tej sinapsi GlyT1 zmanjšuje koncentracijo glicina, saj ga transportira v okoliške glia celice. GlyT2 po drugi strani pa zvišuje koncentracijo glicina, saj zbira razpršen glicin, ga reciklira in omogoči ponovno usmerjeno pošiljanje proti receptorjem. V glutamatergičnih sinapsah pa je glicin skupaj z glutamatom ekscitatorna signalna molekula. Če se glicin veže na protein NMDA, ki je na posinaptični membrani, mu s pozitivno alosterično modifikacijo olajša vezavo z glutamatom, ki odpre kationski kanalček in depolarizira celico. Tu regulira koncentracijo glicina le GlyT1, ki jo zmanjšuje, GlyT2 pa tu ne nastopa. Razumevanje delovanja obeh sinaps nam lahko omogoči sintezo novih zdravil, ki bi bolj učinkovito delovala proti nekaterim duševnim boleznim kot so shizofrenija, alkoholizem, obsesivno-kompulzivna motnja in še precej drugim. Ta zdravila najpogosteje inhibirajo delovanje GlyT1 in imajo veliko uspešnost pri glodalcih. Pri ljudeh pa na žalost še ni bilo dobrih rezultatov in na razvoj tovrstnega zdravila še čakamo.<br /> <br /> == Ana Potočnik: FOSFATIDILSERIN KOT SIGNALNA MOLEKULA ==<br /> <br /> Fosfatidilserin je glicerofosfolipid in pomemben gradnik celičnih membran. V zdravih in živečih celicah se nahaja izključno na notranji, citosolni strani fosfolipidnega dvosloja. To asimetrično razporeditev s pomočjo ATP vzpostavlja aminofosfolipidna translokaza. Poleg svoje strukturne vloge ima fosfatidilserin tudi pomembno funkcijo v mnogih signalizacijskih poteh. Kot signalna molekula sodeluje pri koagulaciji krvi, fagocitozi apoptoznih celic, celični fuziji in odlaganju mineralov v osteoblaste. Ključna lastnost fosfatidilserina kot signalne molekule je njegova negativno nabita polarna glava. Preko nje fosfatidilserin z drugimi signalnimi molekulami ali receptorji tvori elektrostatske ali stereospecifične interakcije. Sodeluje pri signalizaciji znotraj celice in tudi pri ekstracelularni signalizaciji. Ko sodeluje pri ekstracelularni signalizaciji, se nahaja tudi na ekstracelularni strani fosfolipidnega dvosloja. Prehod fosfatidilserina iz notranje na zunanjo stran uravnavajo skramblaze. Te so lahko aktivirane s pomočjo kaspaz, ki so encimi, prisotni v apoptozni celici. Med molekulami, ki se vežejo na fosfatidilserin, so najbolj preučevane tiste, ki za vezavo nanj uporabijo Gla domeno. Laktahedrin, ki je na fagocit vezan preko integrinov αvβ3, z vezavo na fosfatidilserin apoptozno celico pritrdi k makrofagu. Gas6 in protein S, ki se prav tako vežeta na fosfatidilserin, pa preko TAM receptorjev sprožita tirozinkinazno aktivnost. Aktivira se Rac1 in polimerizacija aktina sproži fagocitozo apoptozne celice. Izpostavljenost fosfatidilserina na ekstracelularni strani celice je zadosten signal makrofagu, da fagocitira celico. To nakazuje na pomembno vlogo fosfatidilserina kot signalne molekule.</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO2_Seminar_2019&diff=15920 2019-10-17T20:30:11Z

<p>Ana Potočnik: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>= Biokemijski seminar =<br /> doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> {| {{table}}<br /> ! ime in priimek !! poglavje !! naslov seminarja !! recenzent 1 !! recenzent 2 !! datum oddaje !! datum recenzije !! datum predstavitve<br /> |-<br /> ! Tevž Levstek<br /> | 12 || || Sašo Jakob || Andrej Špenko || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019<br /> |-<br /> ! Ana Potočnik<br /> | 12 || Fosfatidilserin kot signalna molekula || Marjeta Milostnik || Maja Mahorič || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019<br /> |-<br /> ! Kim Glavič<br /> | 12 || ATP kot signalna molekula živali in rastlin || Tina Logonder || Tim Nograšek || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019<br /> |-<br /> ! Nika Vegelj<br /> | 12 || || Žan Fortuna || Nina Varda || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019<br /> |-<br /> ! Tadej Uršič<br /> | 12 || || Michelle Oletič || Tina Arnšek || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019<br /> |-<br /> ! Natalija Razpotnik<br /> | 12 || || Maša Gabrič || Timotej Zgonik || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019<br /> |-<br /> ! Maja Kolar<br /> | 14-15 || || Tevž Levstek || Sašo Jakob || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019<br /> |-<br /> ! Jure Povšin<br /> | 14-15 || || Ana Potočnik || Marjeta Milostnik || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019<br /> |-<br /> ! Manca Osolin<br /> | 14-15 || || Kim Glavič || Tina Logonder || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019<br /> |-<br /> ! Greta Junger<br /> | 16 || || Nika Vegelj || Žan Fortuna || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019<br /> |-<br /> ! Oskar Nemec<br /> | 16 || || Tadej Uršič || Michelle Oletič || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019<br /> |-<br /> ! Teo Nograšek<br /> | 16 || || Natalija Razpotnik || Maša Gabrič || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019<br /> |-<br /> ! Ana Babnik<br /> | 17 || || Maja Kolar || Tevž Levstek || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019<br /> |-<br /> ! Maša Andoljšek<br /> | 17 || || Jure Povšin || Ana Potočnik || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019<br /> |-<br /> ! Nastja Feguš<br /> | 17 || || Manca Osolin || Kim Glavič || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019<br /> |-<br /> ! Vivian Nemanič<br /> | 18 || || Greta Junger || Nika Vegelj || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019<br /> |-<br /> ! Lena Trnovec<br /> | 18 || || Oskar Nemec || Tadej Uršič || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019<br /> |-<br /> ! Sonja Gabrijelčič<br /> | 18 || || Teo Nograšek || Natalija Razpotnik || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019<br /> |}<br /> <br /> Dokončno razporeditev bom objavil naknadno.<br /> *številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada<br /> Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.<br /> <br /> == Gradivo za predavanja ==<br /> Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/<br /> username: bio2<br /> password: samozame<br /> <br /> ==Naloga==<br /> '''Vaša naloga za seminar je:&lt;br&gt;'''<br /> Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].<br /> <br /> Za pripravo seminarja velja naslednje:&lt;br&gt;<br /> * [[BIO2 Povzetki seminarjev 2018|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom. <br /> * Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od &lt;font color=red&gt;2700 do 3000 besed &lt;/font&gt;, a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. &lt;font color=red&gt;Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. &lt;/font&gt;<br /> * Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].<br /> * Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].<br /> * Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].<br /> * Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.<br /> * Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx<br /> * 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx<br /> * &lt;font color=green&gt;312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši&lt;/font&gt;<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana &lt;font color=green&gt;zeleno&lt;/font&gt;.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> &lt;font color=green&gt;Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.<br /> Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.&lt;/font&gt;<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica &quot;in&quot;. <br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=TBK2019_Povzetki_seminarjev&diff=15724 2019-04-23T20:29:55Z

<p>Ana Potočnik: </p> <hr /> <div>=== Sašo Jakob: Terapija pljučnih bolezni z vdihavanjem mRNA ===<br /> Messenger RNA (mRNA) lahko v znanosti uporabimo tako, da jo vstavimo v žive celice, ki lahko sintetizirajo proteine glede na kodiran zapis v njej. Na ta način lahko sintetiziramo proteine za različne namene, eden pomembnejših je zdravljenje bolezni. V primeru respiratornih bolezni, je administracija zdravil (proteinov) lokalno na pljučno tkivo omejena na zgornje dele dihal (sapnik in bronhiji). Zato so že dolgo v uporabi neinvazivna aerosolna zdravila, ki zdravilo enakomerno razdelijo po celotnem bronhijskem in alveolarnem epitelu. Možnosti uporabe aerosolne mRNA za indukcijo sinteze proteinov v pljučnem epitelu so raziskovali Patel in sodelavci. Na podlagi preteklih raziskav so izbrali nekaj molekul, ki bi lahko sodelovale pri dostavi mRNA do pljučnih celic. Teste so izvajali na različnih vrstah laboratorijskih miši. Po smrti so pregledali vse njihove organe in pri njih ugotavljali prisotnost molekul, ki so jih v tkivu pričakovali. Ugotovili so, da je hiperrazvejen PBAE v kompleksu z želeno mRNA najprimernejši način njene dostave do celic pljučnega epitela. Na koncu so s postopkom liofilizacije, kar je sušenje in zmrzovanje pri zelo nizkih temperaturah, dosegli tudi uporabno življenjsko dobo takšnih zmesi.<br /> <br /> === Maja Kolar: Pomen velikosti aksonskih mitohondrijev v možganih ===<br /> Nevroni spadajo med najbolj polarizirane celice v naravi. To jim omogoča oblikovanje različnih lokaliziranih struktur, kot so akson in dendriti. Možgansko skorjo sestavljajo kortikalni nevroni, v katerih se oblike mitohondrijev razlikujejo glede na lokacijo; v dendritih in somi so dolge, cevaste oblike, medtem ko so v izrastkih aksona veliko krajši in kroglasti. Majhnost aksonskih mitohondrijev je povezana predvsem s fizijo oz. binarno cepitvijo, ki poteka prek oligomerizacije Drp1 proteina iz skupine dinaminov zunanji membrani. Ker je Drp1 citoplazemski protein, se z mitohondrijsko zunanjo membrano veže prek 4 različnih receptorjev, nevroznanstveniki Univerze v Columbiji, Lewis in sodelavci, pa so raziskovali predvsem receptor MFF (ang. mitochondrial fission factor), saj je v kortikalnih nevronih najpogostejši. Ekspresijo MFF gena so Lewis in sodelavci zavirali prek uporabe shRNA (ang. short hairpin RNA) ki je umetno izdelan RNA in se uporablja za RNA posege pri zaviranju ekspresije tarčnih genov. Z raziskavo so dokazali, da MFF nima znatnega vpliva na membranski potencial mitohondrijev in na njihovo skupno sposobnost pridelave ATP, je pa z zmanjšanim delovanjem izrazito vplival na povečanje presinaptičnih mitohondrijev. To je povečalo mitohondrijsko sposobnost absorpcije Ca2+ ionov med nevrotransmisijo, kar je vodilo do zmanjšanega presinaptičnega citoplazemskega kopičenja Ca2+. Posledično se je zmanjšalo sproščanje nevrotransmitorjev v sinaptično špranjo, zmanjšala aksonska razvejanost v možganih in oslabila medsebojna povezanost nevronov.<br /> <br /> === Timotej Zgonik: Vijačna struktura v biomolekulah se lahko razvije na dokaj preprost način ===<br /> Že dolgo časa v biokemiji obstaja problem, kako so iz akiralnih molekul nastali kiralni komplesksi, saj je pri eksperimentih vedno bilo treba dodati kiralni center, da so se ostale molekule pravilno zvile. Raziskovalci Tehnološkega inštituta v Georgiji so izvedli tri eksperimente, ki so demonstrirali tvorbo homokiralnih struktur iz akiralnih komponent. V prvem eksperimentu so pripravili raztopino triaminopirimidina (TAP) in 6-(2,4,6-triokso-1,3,5-triazinan-1-il)heksanojske kisline (CyCo6). Spojini sta se povezali v heksamerne rozete, te pa so se nalagale v stolpiče tako leve in desne kiralnosti. Ko so v drugem eksperimentu v raztopini zamenjali CyCo6 z analogno, a kiralno spojino, je bila kiralnost vseh posledično nastalih struktur enaka. Tudi če je bila le vsaka tisoča molekula CyCo6 zamenjana s kiralnim analogom, so bile strukture še vedno homokiralne. Enako je veljalo tudi, če sta bila v raztopini prisotna enantiomera obeh kiralnosti, a je bil eden v rahlem presežku. Pri tretjem poskusu so rezultate uspeli ponoviti tudi za organske spojine, ki bi na Zemlji lahko bile prisotne pred nastankom življenja, čeprav je bil pri tem bil učinek ojačitve kiralnosti šibkejši, enantiomerski presežek, potreben za homokiralnost, pa večji. Vendarle gre pri tem za prvi primer, ko so spontano nastali analogi nukleotidov povzročili tvorbo homokiralnih struktur.<br /> <br /> === Nina Varda: Kompleksne molekule, ki se zvijajo kot proteini, lahko nastanejo spontano ===<br /> Proteini in nukleinske kisline so ključne za delovanje živih organizmov. Zanje je značilno, da se zvijejo v posebne konformacije, ki določajo njihove funkcije. A načrt po katerem bi se makromolekule zvijale še ni bil odkrit. Tako se je razvilo področje raziskovanja foldamerov (sintetičnih oligomerov, ki se zvijajo v sekundarne in terciarne strukture npr. v vijačnice in plošče). Otto in sodelavci so v svoji raziskavi predstavili kompleksno molekulo, ki lahko nastane spontano. Iz gradnika, ki ga sestavljata aminokislinska in adeninska podenota, so pridobili makrocikel iz 15 gradnikov. 15mer se je tako v kristalni obliki, kot tudi v raztopini zvil, zaradi nekovalentnih interakcij med gradniki. Najbolj opazen strukturni motiv je nalaganje aromatskih obročev v kupe (sekundarne strukture). Ena molekula se zvije v 5 kupov, pri čemer je vsak sestavljen iz treh fenilnih obročev in dveh adeninskih obročev. Ker so kupi med sabo orientirani, je prisotna tudi terciarna struktura. Pri nekaterih foldamerih so že bile odkrite katalitske in inhibitorne lastnosti. Ker so foldameri, ki so zaradi svoje terciarne zgradbe relativno kompleksni, sposobni spontanega nastanka, je možno, da so se pojavili in imeli pomembno vlogo že v zgodnjih fazah nastanka življenja.<br /> <br /> ===Anja Konjc: Nanodelci v boju proti raku===<br /> <br /> Nanodelci postajajo čedalje pomembnejši pri razvoju zdravil, saj imajo določene posebnosti, ki omogočajo tarčno usmerjanje zdravil in zmanjševanje njihovih stranskih učinkov (npr. pri kemoterapiji). Vendar so predhodne raziskave pokazale določene pomanjkljivosti. S sintezo posebnega ščita, imenovanega proteinski koronski ščit (PCS), so raziskovalci rešili te omejitve. Ugotovili so namreč, da PCS zmanjša interakcije nanodelcev s serumskimi proteini in omogoči, da makrofagi teh delcev ne fagocitirajo. Tako nanodelci ostanejo več časa v krvi in prenesejo zdravila na ciljno mesto (npr. v tumorje). Nanodelci so namreč sposobni prenašati sorazmerno velike količine molekul (npr. zdravil), ki jih vstavimo v njihove pore. Znanstveniki so PCS sintetizirali tako, da so nanodelce prevlekli s posebnimi proteini. Obnašanje tako prevlečenih nanodelcev so opazovali z različnimi poskusi. Ko so mišim vbrizgali različne nanodelce, so ugotovili, da so se v tumorjih najbolj nakopičili tisti s PCS. To je dokazalo hipotezo, da lahko ti nanodelci uspešno prinesejo zdravila v tumorje, ne da bi pri tem prišlo do imunskega odziva, torej fagocitoze delcev. Zato bodo tudi v prihodnje nanodelci s PCS imeli pomembno vlogo pri zdravljenju različnih obolenj, ne le rakavih, saj povečujejo učinkovitost zdravljenja.<br /> <br /> === Oskar Nemec: Shizofrenija je povezana z nenavadnim imunskim odzivom na virus Epstein-Barr ===<br /> Ustanovi Johns Hopkins Medicine in Sheppard Pratt Health System sta izvedli raziskavo, ki je pokazala, da imajo ljudje s shizofrenijo povečano količino protiteles proti virusu Epstein-Barr (VEB). Gre za herpesvirus, ki lahko povzroči infekcijsko mononukleozo. Za povečan imunski odziv je morda krivo dejstvo, da shizofrenija spremeni imunski sistem pacientov in jih naredi bolj občutljive na virus ali pa okužba poveča tveganje za izoblikovanje shizofrenije. Študijo so izvedli na 743 osebah - 432 je bilo obolelih za shizofrenijo, 311 pa jih je bilo zdravih. Najprej so izmerili količino protiteles proti komponentam virusa in primerjali količino protiteles med zdravo skupino in shizofreniki. Ugotovili so, da imajo shizofreniki od 1.7 do 2.3-krat večjo verjetnost, da imajo povečano količino protiteles proti VEB. Merili so tudi količino protiteles proti ostalim podobnim virusom, ampak pri shizofrenikih niso ugotovili odstopanja od zdrave skupine. Nato so proučevali DNA udeležencev ter ugotovili, da če ima dana oseba povečano količino protiteles proti VEB in tudi genetsko dovzetnost za shizofrenijo, je verjetnost da je ta oseba v skupini shizofrenikov osemkrat večja kot pa verjetnost, da je oseba zdrava. Ker ni pravih zdravil proti virusu, je pomembno, da odkrijejo, kako preprečiti delitev virusa. Povečano razumevanje delovanja infekcije z virusom VEB nam lahko morda pomaga pri zdravljenju shizofrenije.<br /> <br /> === Vivian Nemanič: Zmanjšanje stranskih učinkov kemoterapije z absorpcijsko napravo ===<br /> Zdravila, ki jih uporabljamo za kemoterapijo, imajo veliko stranskih učinkov na naše telo. Da pa da zdravila delovala, so potrebne zelo velike količine, ki pa ne morejo ostati samo na tumorju oz. na prizadetem organu. V tej študiji so skušali ugotoviti kako bi preprečili, da zdravila zakrožijo po celem telesu in rešitev bi lahko bila absorpcijska naprava, ki bi nase vezala zdravilo iz krvi in tako pravzaprav absorbirala do 70% zdravila, ki ni ostalo v tumorju. To napravo bi izdelali s 3D tiskalnikom, zato da bi bila optimalne oblike in velikosti in bi se popolnoma prilegala žili. Eksperiment so izvedli na prašičih za primer jetrnega raka in bil je zelo uspešen. Verjetno bi absorpcijska naprava delovala tudi pri drugih vrstah raka in pri različnih zdravilih za kemoterapijo, poleg tega pa je pomembno da naprava ne ovira krvnega obtoka ali povzroče tromboze. Torej je varna za naše telo, saj naj ne bi imela nobenih negativnih učinkov na delovanje našega telesa, saj jo po približno eni uri po začetku kemoterapije vzamemo iz telesa, saj hitro opravi svojo nalogo. Naprava bi lahko postala zelo pomembna tudi pri odstranjevanju toksinov pri bakterijskih okužbah, okoljskih toksinov, ali pa tudi samih celic, ki bi jih ujeli na podlagi specifičnih kemijskih, fizikalnih ali bioloških značilnosti.<br /> <br /> === Kim Glavič: Preveč popravljanja DNA lahko poškoduje tkiva ===<br /> Zaradi nenehnega nastajanja poškodb DNA, ki jih povzročajo okoljski dejavniki, stranski produkti celičnega metabolizma ali pa kemoterapevtiki (npr. alkilirajoče snovi), so se razvili različni popravljalni mehanizmi, ki te napake popravljajo in skrbijo za zaščito zdravih tkiv. Eden takih mehanizmov je tudi popravljanje z izcepom baze (BER), ki v večini celic učinkovito odstrani napake. V nekaterih celicah, ki vsebujejo večje količine DNA-glikozilaze (AAG) pa njegova prevelika aktivnost povzroči kaskado dogodkov, kateri vodijo do celične smrti. Raziskovalci so ugotovili, da je povzročena degeneracija celic odvisna tako od količine AAG kot tudi od spola organizma ter, da sta pri propadanju teh celic prisotni dve vrsti celičnih smrti in sicer apoptoza (genetsko kontrolirana programirana celična smrt) ter nekroza (poteče kadar celica propade zaradi poškodbe). Pri slednji se med procesom propadanja izloča protein, ki posredno vpliva na nastanek vnetne reakcije torej prodiranja makrofagov na mesto propadajočih celic. TI makrofagi pa vplivajo na nastanek zelo reaktivnih kisikovih spojin, katere povzročijo še več poškodb DNA. Zaradi tega se aktivnost AAG še poveča, kar pa povzroči še večjo količino propadlih celic.<br /> <br /> === Ela Sabadin: Genska terapija lahko ozdravi prirojeno gluhost pri miših ===<br /> Znanstveniki so uspeli obnoviti sluh v odrasli miši modela DFNB9 gluhosti – motnja sluha, ki predstavlja enega najbolj pogostih primerov genetsko prirojene gluhosti. Posamezniki z DFNB9 so popolnoma gluhi in imajo pomanjkanje gena za kodiranje otoferlina (pri ljudeh je kodiran z otof genom), proteina, ki je bistven za prenašanje zvočnih informacij v slušno-senzoričnih sinapsah. Z injeciranjem tega gena v bolne miši, so znanstveniki uspešno obnovili funkcijo slušne sinapse in povrnili sluh na skoraj normalno stopnjo. Genska terapija na podlagi AAV (adeno-associated virus) je obetajoča terapevtska možnost za zdravljenje gluhosti, vendar je njena vloga omejena s potencialno ozkim terapevtskim oknom. Kakorkoli, ker je AAV omejil kapaciteto paketa DNA (približno 4,7 kilobaz), je zahtevno uporabiti to tehniko za gene, katerih regija kodiranja (cDNA) presega 5 kb, kot je na primer gen za kodiranje otoferlina, ki ima regijo kodiranja dolgo 6 kb. Znanstveniki so premagali to oviro s prilagajanjem AAV pristopa, znanega kot dvojna AAV strategija. Rezultati, doseženi s strani znanstvenikov, kažejo na to, da ja terapevtsko okno za prenos lokalnih genov pri pacientih z DFNB9 prirojeno gluhostjo lahko širše kot zgolj ideja in ponuja upe za razširitev teh ugotovitev na ostale tipe gluhosti.<br /> <br /> === Aleksandra Rauter: Izolirana bakterija črevesne flore in njena možna povezava z depresijo ===<br /> Črevesna flora je kompleksni mikrobni ekosistem v gastrointestinalnem traktu sesalcev. Vpliva na mnoge pomembne funkcije gostitelja, vpliva pa tudi na živčni sistem. V sami raziskavi so se osredotočili na rastne faktorje, ki vplivajo na celično delitev, proliferacijo. Zaradi odsotnosti rastnih faktorjev v umetnih medijih, je večina bakterij še negojenih, kar ovira naše razumevanje njihovih bioloških vlog. V študiji so z uporabo kokulture izolirali bakterijo KLE1738, ki je za svojo rast potrebovala prisotnost bakterije Bacteroides fragilis. Analiza supernatanta B. fragilis je vodila v izolacijo rastnega faktorja. To je bila GABA (Gamma AminoButyric Acid), ki je glavni nevrotransmiterski inhibitor v centralnem živčnem sistemu. Na podlagi spremenjenih vrednosti GABA v odvisnosti od antibiotikov in prisotnosti mikroorganizmov, so prišli do zaključka, da je črevesna flora posredno povezana tudi z različnimi boleznimi. Raziskali so, kako ševilčnost B. fragilis vpliva na nevronsko mrežo in povezavo med posameznimi regijami v možganih. Rezultati so pokazali, da zmanjšano število bakterij obratno korelira s funkcionalno povezavo med posameznimi možganskimi regijami. Prekrivanje teh z regijami limbičnega sistema je vplivalo na čustvene odizve. Z izolirano bakterijo KLE1738 niso našli nobene povezave. Dejstvo, da številčnost bakterij Bacteroides (in posledično vrednosti GABA) vpliva na fiziologijo možganskih regij, so potrdile tudi ostale študije. Raziskovalci so mnenja, da je to prvi korak k razumevanju te povezave.<br /> <br /> === Ana Babnik: Kako nas okuži določena vrsta bakterij? ===<br /> Znano je, da Gram negativne bakterije v veziklih zunanje membrane transportirajo toksine, zaradi katerih zbolimo. O mehanizmu nastanku veziklov zunanje membrane se do sedaj ni vedelo veliko, predlaganih pa je bilo nekaj teorij biogeneze teh veziklov. Raziskovalcem iz Binghamton University v New Yorku je uspelo odkriti mehanizem, kako bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'' komunicirajo med sabo preko majhnih molekul ''Pseudomonas quinolone signal'' (PQS). Ta bakterija je pomembna, saj je predmet mnogih raziskav in pri živalih, rastlinah in ljudeh povzroča hude okužbe. Molekula PQS se preko več korakov vgradi v vrhnji sloj zunanje membrane, s tem asimetrično poveča membrano in povzroči uvihanje. Li in sodelavci so s simulacijami, pri katerih so približali molekulo na 1 nm (trajanje 300 ns ali 500 ns), dokazali, da pri tem delujejo močne vodikove vezi med fosfatno skupino membrane in funkcionalnimi skupinami PQS, ki pomagajo pri spontani umestitvi v membrano. Z meritvami minimalne razdalje med vrhnjim slojem in PQS, ki je znašal 1,35 nm, so potrdili izjemno stabilnost faze vezave molekule na površino. Odkrili pa so tudi spremembo iz odprte v zaprto konformacijo PQS, ki zmanjša odbojne sile pri penetraciji vrhnjega dela membrane. Sklepajo, da bi tak model komunikacije bakterij lahko obstajal še pri drugih vrstah Gram negativnih bakterij. Spoznanja raziskave pa prinašajo boljše razumevanje mehanizmov biogeneze membranskih veziklov, ki raziskovalcem pomagajo razumeti interakcije med več vrstami ter tako posledično iskati rešitve za preprečitev potencialnih okužb.<br /> <br /> <br /> === Karmen Ferjan: Sestavina zelenega čaja, ki pomaga siRNA zdrsniti v celico ===<br /> Glavni problem pri kliničnem prenosu siRNA v zdravilih je dostava v citosol. Mnogi polimeri so bili razviti za ta prenos siRNA, ampak noben hkrati ni ustrezal, bili so premalo učinkoviti ali pa preveč toksični. Članek objavljen v reviji ACS central Science poroča o preprosti strategiji za izgradnjo nanodelcev v obliki jedra z lupino, ki je zelo učinkovita za dostavo siRNA. Nanodelec je pripravljen z entropijsko-gnanim kompleksom siRNA in sestavine zelenega čaja EGCG, ter je obložen z polimeri nizke molekulske mase. Poskusi so bili izvedeni z šestimi različno razvejanimi naravnimi in sintetičnimi polimeri. Izdelan nanodelec je imenovan GNP (Green Nanoparticle). Ta strategija lajša polimerom zgoščevanje siRNA v enoten nanodelec, ki lažje dostopa v celico kot siRNA brez catechina. Zgoščevanje dokažemo z drugačno barvo fluresciranj v prisotnosti EtBr. Namen uporabe GNP je lajšanje bolezenskih stanj kot je na primer kronično črevesno vnetje. Poskusi uporabe so bili izvedeni na HeLa celicah ter na miših. EGCG je z antioksidantskimi, proti-vnetnimi, antibakterijskimi in proti-rakotvornimi učinki navdihujoč za lokalno zdravljenje različnih bolezni.<br /> <br /> <br /> === Maša Andoljšek: Zrele človeške celice lahko spremenijo svojo funkcijo ===<br /> Poznamo diferenciacijo zrelih celic pri rastlinah, nekaterih živalih, manj pa pri sesalcih. Splošno velja, da človeške odrasle matične celice ne morejo spremeniti svoje funkcije. Raziskava je bila na temo plastičnosti, to pomeni spreminjanje naloge zrele celice. Raziskovali so, ali lahko celice alfa (proizvajalke glukagona) ali celice gama (proizvajalke pankreatičnega polipeptida), ki se nahajajo v Langerhansovih otočkih trebušne slinavke, spremenijo svojo funkcijo in začnejo proizvajati inzulin, kot celice beta. Raziskava je potekala in vitro, nato pa še in vivo, saj so psevdootočke, spremenjenih celic z transkripcijskimi faktorji(Pdx1, Mafa in Nkx6-1), transplantirali v miši. Sprva so celicam alfa dodali zeleni fluorescenčni protein in zgodilo se ni nič, nato so ob dodatku Pdx1 in Mafa začele proizvajati največ inzulina, ter tudi nekatere gene celic beta. Čez nekaj tednov so proizvajale le še inzulin. Potrdili so diferenciacijo celic alfa in gama in vitro. Prilagajanje je bilo s časom čedalje bolj uspešno. Celice alfa in vivo so postale uspešne proizvajalke inzulina in ob transplantaciji psevdodotočkov celic alfa zdravih donorjev so ozdravili diabetes pri miši. Ugotovili so, da so se celice hitreje spremenile in vivo, kot in vitro. Da bi ugotovitve te raziskave postale del zdravljenja je potrebno še veliko, bi pa lahko bilo to zdravljenje uspešnejše od zdravljenja diabetesa danes.<br /> <br /> <br /> === Nika Vegelj: Nove poti iskanja funkcionalnega zdravila za virus HIV ===<br /> Virus HIV spada v družino retrovirusov, njegov genom pa je sestavljen iz dveh enojnih vijačnic RNA. Virus HIV primarno okuži celice, ki so pomembne pri imunskem odzivu, to so CD4+ T celice. Problem virusa HIV je ta, da se ga telo ne more znebiti zgolj s tvorbo protiteles, saj ostane integriran v genomu obolelega. Okužba z virusom HIV nato sproži odmiranje celic, ter apoptozo neokuženih celic, ki pridejo v stik z okuženimi. Zmanjšanje števila CD4+ T limfocitov pa vodi do nezadostnega celično posredovanega imunskega odziva. Funkcionalno zdravilo za virus HIV zahteva, da si organizem ponovno zgradi imunski sistem. Virus HIV primarno okuži celice, ki so pomembne pri imunskem odzivu, to pa so CD4+ T limfociti. Ko virus okuži CD4+ T limfocite, se lahko aktivno deli, da proizvede čim več novih virusov ali pa gre v stanje mirovanja. Znanstveniki so z raziskavo prikazali, da stimulacija CD4 T limfocitov z anti - α4 β7 antitelesi lahko modulirajo količino cofilina in popravijo defekt migracije T limfocitov, ki ga je povzročila hiperaktivacija cofilina. Znanstveniki so torej s to raziskavo odkrili nove možnosti za testiranje novih terapevtikov, ki bi obnovili sistem za migracijo T celic ter repopulacijo tkiv za rekonstrukcijo imunskega sistema in posledično nadzora nad virusom.<br /> <br /> <br /> === Tevž Levstek: Odkritje, ki izboljša razumevanje, kako se nekateri virusi množijo ===<br /> Osnovno razumevanje razmnoževanja virusov domneva, da določen virus okuži eno celico, ki pa naprej proizvede nove viruse in tako nadaljuje z okužbo sosednjih celic. Obstajajo pa tudi drugačni, večdelni virusi. Tovrstni virusi ne vsebujejo vsega dednega zapisa v le eni kapsidi, ampak so segmenti dednega materiala razporejeni po virusni populaciji. Omenjeni segmenti navadno zapisujejo različne, zaključene enote genskega zapisa, raziskovalci pa so v tem primeru uporabili virus, ki je imel 8 genskih segmentov. Ker je zelo majhna možnost, da bi vseh osem segmentov okužilo isto celico, so raziskovalci preverili, ali ti med sabo pri vstopanju v celice kakor koli vplivajo, da bi se ta možnost povečala. Ugotovili so, da se to ne dogaja in da dejansko skoraj nobena celica ne dobi vseh virusovih segmentov. Nadalje so raziskali, ali se sploh lahko razmnožujejo virusi iz celice, ki nima vseh genskih segmentov. Pokazali so, da v celicah, ki imajo določen virusni segment, nimajo pa segmenta z geni za replikacijo, ta vseeno poteka. Pojavijo se tudi proteini, ki jih ne zapisuje segment v celici, ampak segment v sosednji celici. Čeprav direktno niso dokazali, da bi virusovi proteini potovali iz ene celice v drugo, je dokazano, da se nekako pojavijo v celicah, ki zanje ne vsebujejo genskega zapisa, če katera od celic poleg ta zapis vsebuje. To pomeni, da najverjetneje med okuženimi celicami poteka transport ali dovršenih proteinov ali pa molekul mRNA, ki te beljakovine zapisujejo.<br /> <br /> === Michelle Oletič: Naivni makrofagi ===<br /> Plazminogen aktivator zaviralec-1 (PAI-1) ima pro-tumorigenično funkcijo preko pro-angiogene in anti-apoptotične aktivnosti. V novi študiji je DeClerckova ekipa pokazala, da rakaste celice uporabljajo PAI-1, da prelisičijo imunski sistem telesa v podporo raku. Raziskava Los Angelske otroške bolnišnice z Yves DeClerck načelu je bila namenjena dokazovanju, da PAI-1 spodbuja rekrutiranje in M2 polarizacijo monocitov oz. makrofagov prek različnih strukturnih domen. Eni od teh dveh sta njegova LRP1 interakcijska domena in uPA interakcijska domena, ki pospešuje polarizacijo makrofagov M2 in indukcijo aktivacijske poti avtokrinega interlevkina (IL) -6 / STAT3. Raziskava, ki je potekala in vivo na miših je pokazala zadovoljive rezultate, da je izražanje PAI-1 povezano s povečano tumorigenostjo, povečano prisotnostjo M2 makrofagov, višjimi nivoji IL-6 in povečano fosforilacijo STAT3 v makrofagih. Močne pozitivne povezave med ekspresijo PAI-1, IL-6 in CD163 (M2 marker) so bile ugotovljene tudi z analizo podatkov več kot 11.000 vzorcev bolnikov z različnimi vrstami rakov pri ljudeh. Ti podatki skupaj zagotavljajo dokaze za mehanizem, ki pojasnjuje pro-tumogerično dejavnost pri raku. Tako odkritje je izrednega pomena pri zdravljenju raka in velik prvi korak k načinu odkrivanja novih možnosti.<br /> <br /> === Ana Vičič: Zdravila naslednje generacije, ki bi ovirala prenos malarijskega parazita v komarje ===<br /> Za razumevanje pristopa znanstvenikov k problemu malarije moramo vedeti, da se infekcijske celice malarijskega parazita P. falciparum, ki jih med ljudmi prenašajo Anopheles komarji, v komarje prvotno v neaktivni obliki prenesejo iz človeka. Če bi torej z določenimi substancami preprečili prenos parazita v komarje, bi s tem onemogočili raznašanje aktiviranega parazita v človeški populaciji. Delves, M. J. in sodelavci so v omenjeni raziskavi za izhodišče vzeli 'Global Health Chemical Diversity Library' (GHCDL), knjižnico 68 689 različnih spojin s proti-malarijskim potencialom. Za postopno oženje nabora spojin in končno identifikacijo najobetavnejših so uporabili številne kriterije in analize v vrstnem redu kot sledi; učinkovitost v majhnih koncentracijah, majhna citotoksičnost za človeške celice, biološka, kemijska in fenotipska analiza, ter dva in vivo testa. S temeljitim pregledom GHCDL so identificirali in analizirali številne obetavne spojine za blokiranje prenosa malarijskih parazitov v komarje. V ožjo selekcijo so sprejeli tri spojine, BPCA, DDD01245291 in DDD01035881. Nato so na podlagi rezultatov in vivo testov za najobetavnejšo spojino določili DDD01035881 in njene analoge, ki prav tako vsebujejo N-4HCS ogrodje.<br /> <br /> === Lena Trnovec: Serotonin lahko regulira izražanje genov v nevronih. ===<br /> Ko govorimo o dednosti in izražanju genov, imamo največkrat v mislih zaporedje nukleotidov v molekuli DNK in spremembe v njem. Vzroki za te spremembe so kompleksni molekularni mehanizmi, med katere spadajo tako kemične modifikacije molekul DNK in RNK kot tudi post-translacijske modifikacije histonov – proteinov, okoli katerih se ovija kromatin. V članku v reviji Nature znanstveniki iz Mount Sinai School of Medicine poročajo, da so histoni lahko modificirani s pomočjo serotonina – proteina, ki je znan predvsem po svoji ključni vlogi v uravnavanju aktivnosti nevronov.Serotonin (tudi 5-hidroksitriptamin ali 5-HT) je biogeni monoamin, ki ima v človeškem organizmu vlogo tkivnega hormona in živčnega prenašalca. Raziskava je razkrila, da serotonin lahko neposredno (brez receptorja) cilja na kromatin preko post-translacijske modifikacije, ki ji pravimo serotonilacija. Prišli so do ugotovitev, da transglutaminaza 2 serotonilira histon H3 na položaju Q5 takrat, ko je položaj K4 trimetiliran. Kombinacija teh dveh post-translacijskih modifikacij se imenuje H3K4me3Q5ser. Ker sta modificirani lizinski in glutaminski ostanek drug ob drugem, je možno, da je stabilnost teh dveh modifikacij soodvisna. Njuna bližina bi lahko tudi pomagala pri funkciji transkripcijskih faktorjev TFIID in posledično vplivala na gensko izražanje.<br /> <br /> === Marjeta Milostnik: Ključ do podaljšane življenjske dobe? Rubicon spremeni delovanje avtofagije med staranjem ===<br /> Avtofagija je proces celične razgradnje, s katerim celica reciklira snovi, ki so odvečne ali poškodovane. Pri tem uporablja lizosomske encime in strukture imenovane avtofagosomi, ki v citoplazmi zajamejo material za razgradnjo in ga dostavijo lizosomom, s katerimi skupaj tvojijo avtofagosome. V predstavljeni raziskavi so prišli do spoznanja, da je delovanje avtofagije s starostjo vpada in s tem povezali povečanje količine proteina Rubicon v celici. Raziskava je pokazala novo vlogo Rubicona, ki je bil doslej znan le kot protein ki interagira z Beclin-1. Ugotovili so, da ima Rubicon ključno vlogo pri regulianju staranja. Z raziskovanjem na organizmih C. elegans, samicah sadne muhe in miših so odkrili, da znižanje Rubicona aktivira avtofagijo, čeprav še vedno ni jasno kako. Skladno s pričakovanji je aktiviranje avtofagije podaljšalo življenjsko dobo, nekje bolj, nekje manj učinkovito. Znižanje nivoja Rubicona je bilo najbolj učinkovito v nevronih (živčnih celicah), saj se je takrat najbolj povečala življenjska doba organizma. Rezultati na miših, skupaj z rezultati na črvih in muhah kažejo, da je znižanje Rubicona v nevronih dovolj, da izboljša starostne fenotipe v organizmih, v primeru C. elegans je znižanje Rubicona zmanjšalo kopičenje proteina v steni telesne mišice, kar je eden od znakov staranja.<br /> <br /> ===Matevž Drnovšek: Koruzni sirup z visoko vsebnostjo fruktoze pospeši proliferacijo raka pri miših ===<br /> Povečana poraba sladkih pijač je povezana z razširjanjem prekomerne debelosti po svetu, ki je izbruhnila v 80. letih prejšnjega stoletja . V povsem istem časovnem obdobju so znanstveniki zasledili povečanje pojavnosti kolorektalnega raka predvsem med mladimi in odraslimi srednjih let. Ti podatki kažejo na možno povezavo med debelostjo, razvojem kolorektalnega raka in pogostim uživanjem sladkih pijač. Dokazano je, da prekomerno uživanje sladkih pijač povzroča debelost. Debelost pa posledično povečuje tveganje za kolorektalnega raka, za katerim najbolj pogosto zbolevajo moški. Dva dejavnika, ki dokazano vplivata na pospešeno proliferacijo tumorjev sta debelost in presnovni sindrom. Do sedaj pa še ni bilo dokazano, da bi prekomerno uživanje sladkih pijač neposredno vplivalo na proliferacijo tumorjev v črevesju. To povezavo so poskušali znanstveniki odkriti in dokazati z raziskavo na miših, ki so jih hranili z mešanico glukoznega in fruktoznega sirupa.<br /> <br /> ===Maša Gabrič: Cepivo, s katerim bi lahko izkoreninili otroško paralizo===<br /> Cepiva so najbolj učinkovita metoda kontroliranja virusnih okužb. Dokaz za to je izkoreninjenje črnih koz, močno zmanjšanje okužb s poliovirusom, HPV (Human Papillomavirus), gripo… Poliomielitis ali otroška paraliza je močno nalezljiva bolezen, ki jo povzroča poliovirus in se danes pojavlja le še v redkih državah v razvoju. Trenutno sta v uporabi dve cepivi proti poliomielitisu, OPV (Oral Poliovirus Vaccine), ki je oralno cepivo in vsebuje oslabljen virus ter IPV (Inactivated Poiliovirus Vaccine), ki ga injiciramo v mišico in vsebuje deaktiviran virus. OPV je bil zelo priljubljen, ker omogoča lažji potek masovnih cepilnih akcij, ki jih izvajajo v državah v razvoj, saj ni potrebe po sterilnih iglah. Da bi izkoreninili otroško paralizo pa bomo morali OPV nadomestiti z IPV, saj ima ta v redkih primerih škodljiv, nasprotni učinek, paralizo, povezano s cepivom. IPV je lahko pri optimalni temperaturi (2 – 8°C) hranjeno do 4 leta, vendar pa formula ni stabilna pri temperaturah višjih od 8°C, kar močno otežuje njegovo prenašanje in shranjevanje. Znanstveniki so razvili cepivo, ki je ostalo stabilno po 4 tedenski inkubaciji pri 4, 25 in 40°C ter je induciralo močna nevtralizacijska protitelesa in polno zaščito prodi poliovirusu divjega tipa pri miši.<br /> <br /> ===Alliana Kolar: Hiperaktivnost možganskih celic bi lahko bila razlog za neučinkovitost antidepresivov===<br /> Klinična depresija je najbolj prevladujoča psihiatrična motnja, za katero trpi vedno več ljudi. Zdravi se jo z različnimi antidepresivi, najpogosteje s selektivnim zaviralcem ponovnega privzema serotonina (SSRI - Selective Serotonin Reuptake Inhibitors), ki deluje tako, da uravnoteži nepravilno presnovo serotonina (5-HT), namreč to je vzrok ali posledica (to nam je zaenkrat še neznano) depresije. Ker se približno 30% pacientov ne odzove na te antidepresive, so znanstveniki hoteli ugotoviti, kaj je razlog za neučinkovitost zdravila. Po osmih tednih zdravljenja pacientov s SSRI, so s tehnologijo induciranih pluripotentnih matičnih celic generirali nevrone pacientov, ki se odzovejo na zdravila, pacientov ki se ne odzovejo na zdravila in popolnoma zdravih posameznikov. Rezultati so pokazali, da je v nevronih pacientov, ki se ne odzovejo na SSRI, v primerjavi z drugima dvema skupinama višja aktivnost delovanja, kar pomeni, da se serotonin hitreje presnavlja, to pa povzroča nižjo koncentracijo serotonina v nevronih. Razlog za hiperaktivnost nevronov je v večjem številu serotonergičnih receptorjev 5-HT7 in 5-HT2A, ki igrajo vlogo pri prenosu serotonina do encima, kjer se razgradi. Ta problem bi lahko rešili z vezavo antagonistov na receptorje, ki zasedejo njihovo mesto in posledično se serotonin ne more vezati nanje, kar ohranja višjo koncentracijo serotonina v nevronih.<br /> <br /> ===Laura Unuk: Kako HIV-1 protein zavira odgovore imunskega sistema===<br /> HIV ali virus humane imunske pomanjkljivosti povzroča počasi napredujoče kronične bolezni z dolgo dobo inkubacije. Za uspeh zasluženi proteini Vif, Nef, Vpr in Vpu, saj vznemirijo nekatere prirojene imunske senzorje. Znanstveniki so v raziskavah ugotovili novo vlogo Vpu-ja in sicer sposobnost, da prepreči aktivacijo NF-κB. V tej študiji so tako pojasnili (1) globalni vpliv Vpu na izražanje gostiteljskega gena, (2) transkripcijske faktorje, ki jih je usmerila Vpu, in (3) vlogo protiukrepanja tetherina pri imunosupresivni aktivnosti Vpu. Imuno-fluorescenčna mikroskopija je pokazala, da je Vpu-posredovano zaviranje aktivnosti NF-κB povezana z zmanjšano jedrsko translokacijo p65. Z različnimi tehnikami in metodami so pokazali, da Vpu zavira transkripcijo množice NF-κB-inducibilnih gostiteljskih genov s ključnimi vlogami imunskih odgovorih in da Vpu zmanjša izražanje IFN-jev tipa I in drugih pro-vnetnih citokinov. Analiza posameznih genov je pokazala, da Vpu bistveno zmanjša ravni mRNA gostiteljskih restrikcijskih faktorjev. Te ugotovitve kažejo, da Vpu virusa HIV-1 izvaja široko imunsko-zaviralno aktivnost pri okuženih primarnih CD4 + T celicah.<br /> <br /> ===Jure Povšin: Vpliv položaja celice na njeno obnovo===<br /> Iz preprostega vzorca tkiva rastline, kot je veja ali list, lahko zraste popolnoma nova rastlina. Nove tehnologije sekvenciranja so omogočile izvedbo analize transkriptoma na ravni ene celice, a večina teh metod izgubi informacijo o položaju celice, ki je ključna pri razumevanju regeneracije celic, saj si celice, ki se dotikajo, pošiljajo signale med seboj. Raziskovalci iz Nara Institute of Science and Technology (NAIST) so oblikovali metodo, s katero so lahko iz individualnih živih celic iz nepoškodovanega tkiva izvlekli jedro, ki je vsebovalo RNA, brez da bi ogrožali celične informacije o položaju.To metodo so poimenovali single cell-digital gene expression (1cell-DGE). To je neka vrsta enoceličnega RNA-sekvenciranja , ki uporablja mikromanipulacijo za ekstrahiranje vsebine posamezne žive celice v nepoškodovanem tkivu, medtem ko se zabeleži tudi informacija o njenem položaju. To metodo so uporabili na rastlini Physcomitrella patens. Raziskovalci so izrezali distalno polovico listov te rastline ter takoj po rezu in še enkrat po 24 urah izsesali jedro in okoliško citoplazmo iz posameznih celic listov, ki so se bile na mestu reza ter sintetizirali cDNA iz RNA . Analizirali so RNA iz 31 celic takoj po izrezu in 34 celic 24 ur kasneje. Skupaj je bilo ugotovljenih 6382 diferencialno izraženih genov, od katerih je bilo izraženih 2382 genov v vzorcih odvzetih po 0 urah in 4000 genov v vzorcih odvzetih po 24 urah.<br /> <br /> ===Žan Fortuna: Molekula, ki bi lahko odstranila virus hepatitisa C===<br /> V zadnjih letih so bili sintetični peptidi obetavni cilji za razvoj zdravil, ki imajo nizke stranske učinke, so stroškovno učinkoviti in dovzetni za racionalno načrtovanje. Peptid Hecate je bil prvotno opisan kot močan bakterijski zaviralec in kasneje kot zdravilo proti raku s funkcijami, povezanimi z lastnostmi lipidne interakcije. Hepatitis C je bolezen, ki napada predvsem jetra in jo povzroča virus hepatitisa C. Virusi, kot je virus hepatitisa C (VHC), imajo življenjski cikel, ki je odvisen od lipidov in bi jih lahko Hecate prizadel na več načinov. Znanstveniki so spremenili strukturo peptida in so na njegovem N-koncu dodali različne radikale in tako spremljali njihove učinke na virus hepatitisa C in citotoksičnost. Hecate, konjugiran z galno kislino, je bil najučinkovitejši derivat peptida Hecate, ki je bil uspešen zaviralec v infekcijskem ciklu HCV. Najobetavnejši vidik pa je bil mehanizem delovanja GA-Hecate, ki je bil povezan z uravnoteženo medsebojno interakcijo lipidov z virusnimi ovojnicami in lipidnimi kapljicami. Ta peptid zavira tako prehod virusa v celico in njegov izhod iz nje, kot tudi zavira podvajanje virusne RNA v celici in izgradnjo snovi, potrebnih za njegovo pravilno delovanje.<br /> <br /> ===Tim Nograšek: Molekulska proteza za bolnike s cistično fibrozo===<br /> Cistična fibroza je med ljudmi pogosta bolezen, pri kateri pride do okvare proteina CFTR(Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). Omenjeni protein skrbi v epitelnih celicah dihal za pravilen prehod klorovih in hidrogenkarbonatnih ionov. Prehod je lahko onemogočen, če pride da mutacije na 7. kromosomu in posledično prenos anionov ni več omogočen. Da bi preprečili posledice kot so padec pH-ja, višja viskoznost mukusa na apikalni strani epitelnih celic in padec odpornosti proti bakterijam, so raziskovalci z University of Illinois, pod vodstvom Dr. Martin D. Burke odkrili ustrezno molekulsko protezo in sicer Amphotericin B (AmB). AmB je majhna molekula naravnega izvora, ki je zmožna tvorbe ionskih kanalčkov. Do sedaj je bila v zdravstvu znana kot droga za glivične okužbe, raziskave pa so pokazale, da je zmožna nadomestiti protein CFTR in opravljati naloge namesto njega. Raziskovalci so s poskusi na in-vitro tkivih pljuč in in-vivo okuženih pujsih z cistično fibrozo pokazali, da se je raven 〖HCO〗_3 – po dodatku AmB ponovno dvignila na apikalnem delu celic. Posledično se je pH vrednost ponovno vrnila na normalno raven. Uravnovešenost kationov in anionov je omogočila ponoven prehod vode skozi celice in mukus na površini ni bil več tako gost. Tako se je viskoznost zmanjšala in odpornost proti bakterijam dvignila, saj se niso več morale zadrževati v mukusu. AmB je dokazano nadomestila različne tipe mutacij CFTR-ja in je potencialno zdravilo za bolnike z cistično fibrozo.<br /> <br /> ===Ana Potočnik: Bakteriofagi sprožijo protivirusno imunost in preprečijo odstranitev bakterijske okužbe===<br /> Na mestih bakterijskih okužb so velikokrat prisotni bakteriofagi, a je njihov vpliv na celice sesalcev še dokaj nejasen. V raziskavi so določili patogene vloge nitastega bakteriofaga Pf, ki ga producira bakterija Pseudomonas aeruginosa (Pa), da bi zatrla protibakterijski imunski odziv organizma. Pa je Gram negativna bakterija, ki pogosto okuži dihalne poti, sečila, kri, opekline in rane. Je eden nevarnejših patogenov, saj je že zelo odporna proti antibiotikom, okužba pa je velikokrat smrtonosna. Pf v mišjih in človeških ranah spodbujajo okužbo s Pa, na kar kaže korelacija med starostjo kronične rane, okužene s Pa, in prisotnostjo Pf. Predlagajo model, kjer mišji ali človeški levkocit endocitira bakteriofag Pf, nato pa deli Pf povzročijo, da tolični receptorji, kot je TLR3, preko adapterjev TRIF, ki spodbudijo sintezo interferona tipa 1, posledično inhibirajo sintezo citokinov TNF, in zato omejujejo fagocitozo bakterij Pa ter tako pospešijo in poslabšajo bakterijsko okužbo. Imunski sistem tako deluje protivirusno namesto protibakterijsko. Cepljenje proti Pf zmanjša bakterijsko okužbo s Pa v človeških ali mišjih ranah. Cepljenje proti bakteriofagom predstavlja potencialno strategijo za preprečevanje bakterijskih okužb.</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=TBK2019-seminar&diff=15686 2019-04-22T17:37:23Z

<p>Ana Potočnik: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>= Temelji biokemije- seminar =<br /> <br /> Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.<br /> <br /> Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita. <br /> Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.<br /> Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## &quot;##&quot; sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.<br /> Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> <br /> {| border=&quot;1&quot; cellpadding=&quot;4&quot; cellspacing=&quot;0&quot; style=&quot;border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;&quot; <br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Ime in priimek'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Naslov seminarja'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Povezava'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Rok za oddajo'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Rok za recenzijo'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum predstavitve'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 1'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 2'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 3'''<br /> |-<br /> | Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3<br /> |-<br /> | Maša Andoljšek||Zrele človeške celice lahko spremenijo svojo funkcijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190213132309.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Isidora Stevanoska|| Tina Arnšek|| Lena Trnovec<br /> |-<br /> | Maja Trifkovič||naslov||povezava do novice||21.02.||22.02.||25.02.|| Manca Osolin|| Tadej Uršič|| Ana Vičič<br /> |-<br /> | Teo Nograšek||Kako se proteini vgradijo v celično membrano||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Ajda Košorok|| Ana Potočnik|| Maša Gabrič<br /> |-<br /> | Maja Kolar||Pomen velikosti aksonskih mitohondrijev v možganih||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181127110959.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Hana Zajc|| Mateja Milošević|| <br /> Laura Unuk<br /> |-<br /> | Nina Varda||Kompleksne molekule, ki se zvijajo kot proteini, lahko nastanejo spontano||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190117110824.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Katja Benčuk|| Nastja Feguš|| Sašo Jakob<br /> |-<br /> | Anja Konjc||Nanodelci v boju proti raku||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190117092550.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Tina Logonder|| Maja Mahorič|| Alliana Kolar<br /> |-<br /> | Timotej Zgonik||Vijačna struktura v biomolekulah se lahko razvije na dokaj preprost način||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190124095112.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Špela Sotlar|| Nika Banovšek|| Nika Ramšak<br /> |-<br /> | Ela Sabadin||Genska terapija lahko ozdravi prirojeno gluhost pri miši ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190219111643.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Maša Andoljšek|| Greta Junger|| Tim Nograšek<br /> |-<br /> | Kim Glavič||Preveč popravljanja DNA lahko poškoduje tkiva||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190212141409.htm||05.03||08.03.||11.03.|| Maja Trifkovič|| Isidora Stevanoska|| Žan Fortuna<br /> |-<br /> | Oskar Nemec||Shizofrenija je povezana z nenavadnim imunskim odzivom na virus Epstein-Barr||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190109090911.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Teo Nograšek|| Manca Osolin|| Jure Povšin<br /> |-<br /> | Vivian Nemanič||Zmanjšanje stranskih učinkov kemoterapije z absorpcijsko napravo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190109090930.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Maja Kolar|| Ajda Košorok|| Jernej Kastelic<br /> |-<br /> | Srna Anastasovska||Bakterijski genotoksin kolibaktin človeškega črevesa alkilira DNA.||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214153159.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Nina Varda|| Hana Zajc|| Tina Arnšek<br /> |-<br /> | Karmen Ferjan||Sestavina zelenega čaja, ki pomaga siRNA zdrsniti v celico||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/09/180919083446.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Anja Konjc|| Katja Benčuk|| Tadej Uršič<br /> |-<br /> | Ana Babnik||Kako nas okuži določena vrsta bakterij?||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190225075613.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Timotej Zgonik|| Tina Logonder|| Ana Potočnik<br /> |-<br /> | Aleksandra Rauter||Izolirana bakterija črevesne flore in njena možna povezava z depresijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190213124350.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Ela Sabadin|| Špela Sotlar|| Mateja Milošević<br /> |-<br /> | Nika Vegelj||Nove poti iskanja funkcionalnega zdravila za virus HIV||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190207173229.htm||19.03.||22.03.||25.03.|| Kim Glavič|| Maša Andoljšek|| Nastja Feguš<br /> |-<br /> | Adela Šajn||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Oskar Nemec|| Maja Trifkovič|| Maja Mahorič<br /> |-<br /> | Michelle Oletič||Naivni makrofagi||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181129142441.htm?fbclid=IwAR2x562KFLljGOmHD5T40KXBf6I2L72TpMpvVM0I3lNBckrVxXW3cXQG-vM||19.03.||22.03.||25.03.|| Vivian Nemanič|| Teo Nograšek|| Nika Banovšek<br /> |-<br /> | Tevž Levstek||Odkritje, ki izboljša razumevanje, kako se nekateri virusi množijo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190312123658.htm||19.03.||22.03.||25.03.|| Srna Anastasovska|| Maja Kolar|| Greta Junger<br /> |-<br /> | Matevž Drnovšek||Koruzni sirup z visoko vsebnostjo fruktoze pospeši proliferacijo raka pri miših||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190321141924.htm||26.03.||29.03.||01.04.|| Karmen Ferjan|| Nina Varda|| Isidora Stevanoska<br /> |-<br /> | Marjeta Milostnik||Ključ do podaljšane življenjske dobe? Rubicon spremeni delovanje avtofagije med staranjem||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190219111744.htm<br /> ||26.03.||29.03.||01.04.|| Ana Babnik|| Anja Konjc|| Manca Osolin<br /> |-<br /> | Lena Trnovec||Serotonin lahko regulira izražanje genov v nevronih.|| https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190313143312.htm ||26.03.||29.03.||01.04.|| Aleksandra Rauter|| Timotej Zgonik|| Ajda Košorok<br /> |-<br /> | Ana Vičič||Snov, ki preprečuje malarijo pri komarjih.|| https://www.sciencedaily.com/releases/2018/09/180918082059.htm ||26.03.||29.03.||01.04.|| Nika Vegelj|| Ela Sabadin|| Hana Zajc<br /> |-<br /> | Maša Gabrič||Cepivo, s katerim bi lahko izkoreninili otroško paralizo||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181127092558.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Adela Šajn|| Kim Glavič|| Katja Benčuk<br /> |-<br /> | Laura Unuk||Kako HIV-1 protein zatira odgovore imunskega sistema||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190205102525.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Michelle Oletič|| Oskar Nemec|| Tina Logonder<br /> |-<br /> | Sašo Jakob||Terapija pljučnih bolezni z vdihavanjem mRNA ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190104104032.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Tevž Levstek|| Vivian Nemanič|| Špela Sotlar<br /> |-<br /> | Alliana Kolar||Hiperaktivnost možganskih celic bi lahko bila razlog za neučinkovitost antidepresivov||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190131162500.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Matevž Drnovšek|| Srna Anastasovska|| Maša Andoljšek<br /> |-<br /> | Nika Ramšak|| ||||09.04.||12.04.||15.04.|| Marjeta Milostnik|| Karmen Ferjan|| Maja Trifkovič<br /> |-<br /> | Tim Nograšek||Molekulska proteza za bolnike s cistično fibrozo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190313143248.htm||09.04.||12.04.||15.04.|| Lena Trnovec|| Ana Babnik|| Teo Nograšek<br /> |-<br /> | Žan Fortuna||Molekula, ki lahko odstrani virus hepatitisa C||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/12/181219142543.htm||09.04.||12.04.||15.04.|| Ana Vičič|| Aleksandra Rauter|| Maja Kolar<br /> |-<br /> | Jure Povšin||Vpliv položaja celice na njeno obnovo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190327112716.htm||09.04.||12.04.||15.04.|| Maša Gabrič|| Nika Vegelj|| Nina Varda<br /> |-<br /> | Jernej Kastelic||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Laura Unuk|| Adela Šajn|| Anja Konjc<br /> |-<br /> | Tina Arnšek||Razvitje prvih funkcionalnih ciljnih inhibitorjev arašidovih alergenov||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/04/190408161718.htm||23.04.||26.04.||29.04.|| Sašo Jakob|| Michelle Oletič|| Timotej Zgonik<br /> |-<br /> | Tadej Uršič||Proteini, ki navadno ubijejo celico, zatrejo listerijo in ne poškodujejo gostiteljske celice||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/04/190418131251.htm||23.04.||26.04.||29.04.|| Alliana Kolar|| Tevž Levstek|| Ela Sabadin<br /> |-<br /> | Ana Potočnik||Bakterija sodeluje z virusom, da poveča možnosti za okužbo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190328150753.htm||23.04.||26.04.||29.04.|| Nika Ramšak|| Matevž Drnovšek|| Kim Glavič<br /> |-<br /> | Mateja Milošević||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Tim Nograšek|| Marjeta Milostnik|| Oskar Nemec<br /> |-<br /> | Nastja Feguš||||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190227081526.htm||30.04.||03.05.||06.05.|| Žan Fortuna|| Lena Trnovec|| Vivian Nemanič<br /> |-<br /> | Maja Mahorič||Spreminjanje odprtih ran v kožo||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/09/180905131831.htm||30.04.||03.05.||06.05.|| Jure Povšin|| Ana Vičič|| Srna Anastasovska<br /> |-<br /> | Nika Banovšek||Kako nevroni nadzorujejo napačno zvite proteine||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190327112652.htm||30.04.||03.05.||06.05.|| Jernej Kastelic|| Maša Gabrič|| Karmen Ferjan<br /> |-<br /> | Greta Junger||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Tina Arnšek|| Laura Unuk|| Ana Babnik<br /> |-<br /> | Isidora Stevanoska||Črni nanodelci upočasnjujejo rast tumorjev||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/04/190404104404.htm||07.05.||10.05.||13.05.|| Tadej Uršič|| Sašo Jakob|| Aleksandra Rauter<br /> |-<br /> | Manca Osolin||Kako lahko mitohondrijski encim sproži celično smrt||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190314151623.htm||07.05.||10.05.||13.05.|| Ana Potočnik|| Alliana Kolar|| Nika Vegelj<br /> |-<br /> | Ajda Košorok||New pill can deliver insulin through the stomach||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190207142206.htm||07.05.||10.05.||13.05.|| Mateja Milošević|| Nika Ramšak|| Adela Šajn<br /> |-<br /> | Hana Zajc||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Nastja Feguš|| Tim Nograšek|| Michelle Oletič<br /> |-<br /> | Katja Benčuk||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Maja Mahorič|| Žan Fortuna|| Tevž Levstek<br /> |-<br /> | Tina Logonder||RNA-vezavni protein Pum2 je tarča v boju proti staranju||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190110141826.htm||14.05.||17.05.||20.05.|| Nika Banovšek|| Jure Povšin|| Matevž Drnovšek<br /> |-<br /> | Špela Sotlar||Vpogled v mehanizem, ki nadzira poškodbe DNA||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190226112344.htm||14.05.||17.05.||20.05.|| Greta Junger|| Jernej Kastelic|| Marjeta Milostnik<br /> <br /> |}<br /> <br /> ==Naloga==<br /> * samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino. <br /> * članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].<br /> * naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo <br /> * [[TBK2019 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom. <br /> * Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!<br /> *Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).<br /> * Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].<br /> * vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].<br /> * Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.<br /> * Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.<br /> * En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.<br /> * Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!<br /> Poslati morate naslednje datoteke:<br /> * TBK_2019_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx<br /> * TBK_2019_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja<br /> * TBK_2019_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2019_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)<br /> * TBK_2019_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx<br /> * TBK_2019_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Faktor vpliva==<br /> Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&amp;base=JCR COBISS-u]. V polje &quot;Naslov revije&quot; vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.<br /> <br /> ==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;'''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). &lt;br&gt;'''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).&lt;br&gt;'''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

Ana Potočnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=TBK2019-seminar&diff=15685 2019-04-22T17:29:13Z

<p>Ana Potočnik: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>= Temelji biokemije- seminar =<br /> <br /> Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.<br /> <br /> Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita. <br /> Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.<br /> Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## &quot;##&quot; sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.<br /> Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> <br /> {| border=&quot;1&quot; cellpadding=&quot;4&quot; cellspacing=&quot;0&quot; style=&quot;border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;&quot; <br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Ime in priimek'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Naslov seminarja'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Povezava'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Rok za oddajo'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Rok za recenzijo'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum predstavitve'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 1'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 2'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 3'''<br /> |-<br /> | Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3<br /> |-<br /> | Maša Andoljšek||Zrele človeške celice lahko spremenijo svojo funkcijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190213132309.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Isidora Stevanoska|| Tina Arnšek|| Lena Trnovec<br /> |-<br /> | Maja Trifkovič||naslov||povezava do novice||21.02.||22.02.||25.02.|| Manca Osolin|| Tadej Uršič|| Ana Vičič<br /> |-<br /> | Teo Nograšek||Kako se proteini vgradijo v celično membrano||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Ajda Košorok|| Ana Potočnik|| Maša Gabrič<br /> |-<br /> | Maja Kolar||Pomen velikosti aksonskih mitohondrijev v možganih||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181127110959.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Hana Zajc|| Mateja Milošević|| <br /> Laura Unuk<br /> |-<br /> | Nina Varda||Kompleksne molekule, ki se zvijajo kot proteini, lahko nastanejo spontano||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190117110824.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Katja Benčuk|| Nastja Feguš|| Sašo Jakob<br /> |-<br /> | Anja Konjc||Nanodelci v boju proti raku||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190117092550.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Tina Logonder|| Maja Mahorič|| Alliana Kolar<br /> |-<br /> | Timotej Zgonik||Vijačna struktura v biomolekulah se lahko razvije na dokaj preprost način||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190124095112.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Špela Sotlar|| Nika Banovšek|| Nika Ramšak<br /> |-<br /> | Ela Sabadin||Genska terapija lahko ozdravi prirojeno gluhost pri miši ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190219111643.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Maša Andoljšek|| Greta Junger|| Tim Nograšek<br /> |-<br /> | Kim Glavič||Preveč popravljanja DNA lahko poškoduje tkiva||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190212141409.htm||05.03||08.03.||11.03.|| Maja Trifkovič|| Isidora Stevanoska|| Žan Fortuna<br /> |-<br /> | Oskar Nemec||Shizofrenija je povezana z nenavadnim imunskim odzivom na virus Epstein-Barr||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190109090911.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Teo Nograšek|| Manca Osolin|| Jure Povšin<br /> |-<br /> | Vivian Nemanič||Zmanjšanje stranskih učinkov kemoterapije z absorpcijsko napravo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190109090930.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Maja Kolar|| Ajda Košorok|| Jernej Kastelic<br /> |-<br /> | Srna Anastasovska||Bakterijski genotoksin kolibaktin človeškega črevesa alkilira DNA.||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214153159.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Nina Varda|| Hana Zajc|| Tina Arnšek<br /> |-<br /> | Karmen Ferjan||Sestavina zelenega čaja, ki pomaga siRNA zdrsniti v celico||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/09/180919083446.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Anja Konjc|| Katja Benčuk|| Tadej Uršič<br /> |-<br /> | Ana Babnik||Kako nas okuži določena vrsta bakterij?||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190225075613.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Timotej Zgonik|| Tina Logonder|| Ana Potočnik<br /> |-<br /> | Aleksandra Rauter||Izolirana bakterija črevesne flore in njena možna povezava z depresijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190213124350.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Ela Sabadin|| Špela Sotlar|| Mateja Milošević<br /> |-<br /> | Nika Vegelj||Nove poti iskanja funkcionalnega zdravila za virus HIV||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190207173229.htm||19.03.||22.03.||25.03.|| Kim Glavič|| Maša Andoljšek|| Nastja Feguš<br /> |-<br /> | Adela Šajn||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Oskar Nemec|| Maja Trifkovič|| Maja Mahorič<br /> |-<br /> | Michelle Oletič||Naivni makrofagi||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181129142441.htm?fbclid=IwAR2x562KFLljGOmHD5T40KXBf6I2L72TpMpvVM0I3lNBckrVxXW3cXQG-vM||19.03.||22.03.||25.03.|| Vivian Nemanič|| Teo Nograšek|| Nika Banovšek<br /> |-<br /> | Tevž Levstek||Odkritje, ki izboljša razumevanje, kako se nekateri virusi množijo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190312123658.htm||19.03.||22.03.||25.03.|| Srna Anastasovska|| Maja Kolar|| Greta Junger<br /> |-<br /> | Matevž Drnovšek||Koruzni sirup z visoko vsebnostjo fruktoze pospeši proliferacijo raka pri miših||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190321141924.htm||26.03.||29.03.||01.04.|| Karmen Ferjan|| Nina Varda|| Isidora Stevanoska<br /> |-<br /> | Marjeta Milostnik||Ključ do podaljšane življenjske dobe? Rubicon spremeni delovanje avtofagije med staranjem||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190219111744.htm<br /> ||26.03.||29.03.||01.04.|| Ana Babnik|| Anja Konjc|| Manca Osolin<br /> |-<br /> | Lena Trnovec||Serotonin lahko regulira izražanje genov v nevronih.|| https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190313143312.htm ||26.03.||29.03.||01.04.|| Aleksandra Rauter|| Timotej Zgonik|| Ajda Košorok<br /> |-<br /> | Ana Vičič||Snov, ki preprečuje malarijo pri komarjih.|| https://www.sciencedaily.com/releases/2018/09/180918082059.htm ||26.03.||29.03.||01.04.|| Nika Vegelj|| Ela Sabadin|| Hana Zajc<br /> |-<br /> | Maša Gabrič||Cepivo, s katerim bi lahko izkoreninili otroško paralizo||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181127092558.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Adela Šajn|| Kim Glavič|| Katja Benčuk<br /> |-<br /> | Laura Unuk||Kako HIV-1 protein zatira odgovore imunskega sistema||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190205102525.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Michelle Oletič|| Oskar Nemec|| Tina Logonder<br /> |-<br /> | Sašo Jakob||Terapija pljučnih bolezni z vdihavanjem mRNA ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190104104032.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Tevž Levstek|| Vivian Nemanič|| Špela Sotlar<br /> |-<br /> | Alliana Kolar||Hiperaktivnost možganskih celic bi lahko bila razlog za neučinkovitost antidepresivov||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190131162500.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Matevž Drnovšek|| Srna Anastasovska|| Maša Andoljšek<br /> |-<br /> | Nika Ramšak|| ||||09.04.||12.04.||15.04.|| Marjeta Milostnik|| Karmen Ferjan|| Maja Trifkovič<br /> |-<br /> | Tim Nograšek||Molekulska proteza za bolnike s cistično fibrozo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190313143248.htm||09.04.||12.04.||15.04.|| Lena Trnovec|| Ana Babnik|| Teo Nograšek<br /> |-<br /> | Žan Fortuna||Molekula, ki lahko odstrani virus hepatitisa C||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/12/181219142543.htm||09.04.||12.04.||15.04.|| Ana Vičič|| Aleksandra Rauter|| Maja Kolar<br /> |-<br /> | Jure Povšin||Vpliv položaja celice na njeno obnovo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190327112716.htm||09.04.||12.04.||15.04.|| Maša Gabrič|| Nika Vegelj|| Nina Varda<br /> |-<br /> | Jernej Kastelic||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Laura Unuk|| Adela Šajn|| Anja Konjc<br /> |-<br /> | Tina Arnšek||Razvitje prvih funkcionalnih ciljnih inhibitorjev arašidovih alergenov||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/04/190408161718.htm||23.04.||26.04.||29.04.|| Sašo Jakob|| Michelle Oletič|| Timotej Zgonik<br /> |-<br /> | Tadej Uršič||Proteini, ki navadno ubijejo celico, zatrejo listerijo in ne poškodujejo gostiteljske celice||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/04/190418131251.htm||23.04.||26.04.||29.04.|| Alliana Kolar|| Tevž Levstek|| Ela Sabadin<br /> |-<br /> | Ana Potočnik||Bakterija sodeluje z virusom, da povzroči kronične rane||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190328150753.htm||23.04.||26.04.||29.04.|| Nika Ramšak|| Matevž Drnovšek|| Kim Glavič<br /> |-<br /> | Mateja Milošević||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Tim Nograšek|| Marjeta Milostnik|| Oskar Nemec<br /> |-<br /> | Nastja Feguš||||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190227081526.htm||30.04.||03.05.||06.05.|| Žan Fortuna|| Lena Trnovec|| Vivian Nemanič<br /> |-<br /> | Maja Mahorič||Spreminjanje odprtih ran v kožo||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/09/180905131831.htm||30.04.||03.05.||06.05.|| Jure Povšin|| Ana Vičič|| Srna Anastasovska<br /> |-<br /> | Nika Banovšek||Kako nevroni nadzorujejo napačno zvite proteine||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190327112652.htm||30.04.||03.05.||06.05.|| Jernej Kastelic|| Maša Gabrič|| Karmen Ferjan<br /> |-<br /> | Greta Junger||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Tina Arnšek|| Laura Unuk|| Ana Babnik<br /> |-<br /> | Isidora Stevanoska||Črni nanodelci upočasnjujejo rast tumorjev||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/04/190404104404.htm||07.05.||10.05.||13.05.|| Tadej Uršič|| Sašo Jakob|| Aleksandra Rauter<br /> |-<br /> | Manca Osolin||Kako lahko mitohondrijski encim sproži celično smrt||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190314151623.htm||07.05.||10.05.||13.05.|| Ana Potočnik|| Alliana Kolar|| Nika Vegelj<br /> |-<br /> | Ajda Košorok||New pill can deliver insulin through the stomach||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190207142206.htm||07.05.||10.05.||13.05.|| Mateja Milošević|| Nika Ramšak|| Adela Šajn<br /> |-<br /> | Hana Zajc||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Nastja Feguš|| Tim Nograšek|| Michelle Oletič<br /> |-<br /> | Katja Benčuk||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Maja Mahorič|| Žan Fortuna|| Tevž Levstek<br /> |-<br /> | Tina Logonder||RNA-vezavni protein Pum2 je tarča v boju proti staranju||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190110141826.htm||14.05.||17.05.||20.05.|| Nika Banovšek|| Jure Povšin|| Matevž Drnovšek<br /> |-<br /> | Špela Sotlar||Vpogled v mehanizem, ki nadzira poškodbe DNA||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190226112344.htm||14.05.||17.05.||20.05.|| Greta Junger|| Jernej Kastelic|| Marjeta Milostnik<br /> <br /> |}<br /> <br /> ==Naloga==<br /> * samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino. <br /> * članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].<br /> * naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo <br /> * [[TBK2019 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom. <br /> * Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!<br /> *Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).<br /> * Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].<br /> * vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].<br /> * Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.<br /> * Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.<br /> * En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.<br /> * Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!<br /> Poslati morate naslednje datoteke:<br /> * TBK_2019_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx<br /> * TBK_2019_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja<br /> * TBK_2019_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2019_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)<br /> * TBK_2019_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx<br /> * TBK_2019_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Faktor vpliva==<br /> Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&amp;base=JCR COBISS-u]. V polje &quot;Naslov revije&quot; vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.<br /> <br /> ==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;'''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). &lt;br&gt;'''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).&lt;br&gt;'''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

Ana Potočnik