https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=AnaGrom 2026-05-03T05:45:09Z User contributions MediaWiki 1.45.3 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Uporaba_naravne_bioluminiscence_v_sintezni_biologiji&diff=11219 2016-01-17T23:22:07Z

<p>AnaGrom: </p> <hr /> <div>=='''Uvod'''==<br /> Bioluminiscenca se v naravi pojavlja v različnih živih organizmih. Med njimi najdemo različne živali, bakterije in glive. Ti organizmi uporabljajo bioluminiscenco predvsem za življenje in preživetje v okolju kjer se pojavljajo. Uporabijo jo za skrivanje pred plenilci, privabljanje plena ali partnerjev, obrambo pred plenilce, opozarjanje ostalih organizmov, sporazumevanje z okolico, mimikrijo drugih organizmov itd. Zaradi privlačnega videza in praktične uporabnosti postaja bioluminiscenca vedno bolj zanimiva tudi za raziskovalce, ki jo želijo izkoristiti v drugačne, velikokrat človeku uporabne namene. Mnogo raziskav se osredotoča na možnost popestritve okolice z okrasnimi rastlinami ali celo drevesi, ki bi imela sposobnost bioluminiscence in bi zato svetila ponoči, ali za povsem estetske stvari, kot je ustvarjanje bioluminiscenčnih slik, in med drugim tudi igrač, ki bi z uporabo bioluminiscence pritegnile zanimanje množice otrok. Pri vseh omenjenih primerih pa so potrebni določeni, različno optimizirani bioluminiscenčni sistemi. V ta namen bi se poslužili encimov z želenimi lastnostmi iz primernih sistemov (med predhodno naštetimi). Pri samem načrtovanju je potrebno upoštevati, da bodo vsi bioluminiscenčni deli sistema, genetski elementi in šasija (organizem), v katero bodo nameščeni, v sinergiji. Pomembno se je tudi poglobiti na vpliv, ki ga bo novonastali organizem imel na okolje. Potrebno je zagotoviti sisteme, ki ne bodo škodovali ostalim organizmom v okolju. V ta namen se sistem lahko na več različnih načinov spremeni (optimizira), rezultat pa je boljša in varnejša uporaba novonastalega sistema (Reeve in sod., 2014).<br /> <br /> =='''Bioluminiscenčni deli in moduli v naravi'''==<br /> Bioluminiscenca se je preko let močno razvijala in spreminjala. V naravi tako sedaj obstaja več kot 30 različnih neodvisnih sistemov, ki imajo zmožnost oddajanja svetlobe. Takšnih sistemov je zagotovo še veliko neodkritih, veliko pa na žalost tudi že izgubljenih. Med organizme, ki so sposobni oddajati svetlobo štejemo različne bakterije, glive, živali, rastline idr. V organizmih je za bioluminiscenco pomemben encim luciferaza, ki katalizira reakcijo oddajanja svetlobe. Primerjava luciferaz iz različnih organizmov ne kaže homologije med omenjenimi encimi. Tudi substrati luciferaz, luciferini, iz različnih organizmov ne izkazujejo kemično podobnih lastnosti. <br /> Sintezna biologija ima omejen izbor naravnih sistemov, a se nabor povečuje, predvsem zaradi vedno večih sekvenciranih genomov. To je omogočeno v veliki meri zaradi zmanjšanja stroškov sekvenciranja v zadnjem obdobju (Reeve in sod., 2014). <br /> <br /> ===Luminiscenca pri kresničkah===<br /> Med znanimi luciferazami je posebno dobro proučena luciferaza iz kresničk. Ta se tudi veliko uporablja kot reporterski gen. Za uporabo v drugih sistemih je velik problem poznavanje biokemije nastanka njenih substratov luciferinov.<br /> Leta 1974 so zaradi nepoznavanja genov, ki zapisujejo za substrate luciferaze (luciferine), predlagali uporabo proteina, ki bi recikliral luciferin. Ugotovili so, da se radioaktivno označeni oksiluciferin in 2-ciano-6-hidroksibenzotiazol (CHBT) pretvorita v luciferin, če ju vstavimo v živo kresničko. Nekaj deset let kasneje so sodelujoči protein odkrili in ga poimenovali encim za regeneracijo luciferina (LRE) (Gomi in Kajiyama, 2001). Oksiluciferin lahko blokira aktivno mesto kresnične luciferaze in je tako kompetitivni inhibitor luminiscence. Njegova odstranitev z LRE izboljša oddajanje svetlobe ''in vivo''. Če v sistem dodamo še D-cistein, je oddajanje svetlobe še podaljšano (Sanderson in sod., 2010). Geni za ''de novo'' biosintezo luciferina bi tako morali proizvesti le nekaj tega substrata, da bi se ta potem lahko nepretrgoma recikliral preko LRE cikla. S tem pa bi omogočili neprekinjeno oddajanje svetlobe v takem sistemu. Ker pa večina organizmov ne proizvaja D-cisteina (za sesalce je toksičen, v bakterijskih celicah pa je inhibitor rasti bakterij), to povzroča težavo pri izkoriščanju LRE cikla za recikliranje luciferina preko uporabe D-cisteina (Reeve in sod., 2014). <br /> Poleg omenjenih dveh poti je predpostavljeno recikliranje D-luciferina tudi preko izrabe L-cisteina. Ta pot v sintetičnih organizmih še ni dokazana, bi pa lahko bila v prihodnosti glavna pot za recikliranje luciferina (Niwa in sod., 2006). <br /> <br /> Luciferazo iz kresničke ''Photinus pyralis'' so leta 1986 izrazili v rastlinah tobaka pod promotorjem mozaičnega virusa cvetače. Za pridobitev luminiscence so morali raziskovalci rastlini dodati vodno raztopino z dodatkom substrata luciferina, saj rastlina sama ne proizvaja omenjenega substrata. Z omenjenim procesom so uspešno pridobili prvo transgensko večcelično rastlino, ki je izražala luminiscenco. Največ svetlobe je bilo izražene v listih in steblu rastline, saj so imeli ti predeli najboljši dostop do luciferina (Ow in sod., 1986; Reeve in sod., 2014). Edina težava za uporabo takšnih rastlin pri osvetljevanju je zaenkrat ta, da geni, ki zapisujejo za substrat luciferin, niso poznani. To je oteženo tudi zaradi dejstva, da celoten genom kresničk do sedaj še ni bil sekvenciran. Dodajanje luciferina za potek reakcije je tako sedaj še zmeraj nujno potreben za potek reakcije, kar je drag proces in zato slabo uporaben (Reeve in sod., 2014).<br /> <br /> ===Bakterijska bioluminiscenca===<br /> Luminiscenčne bakterije imajo nekaj skupnih lastnosti. Vse spadajo v razred gibljivih gram-negativnih bakrterij, ki ne tvorijo spor. Gre za najštevilčnejšo in široko razširjeno skupino med vsemi organizmi, ki oddajajo svetlobo. Najdemo jih kot prosto živeče organizme v oceanih, saprofite na mrtvih morskih organizmih ter simbionte v nekaterih organih rib in lignjev. Znane luminiscenčne bakterije najdemo v rodovih ''Aliivibrio'', ''Photobacterium'', ''Alteromonas'' in ''Photorhabdus''. Bakterijski encimski sistem za oddajanje svetlobe, ki ga kodira lux operon, je močno ohranjen med luminiscenčnimi bakterijami. Najpogostejšo arhitekturo operona predstavlja luxCDABEG. Za reakcijo oddajanja svetlobe uporabljajo bakterije kot substrate luciferaze flavin mononukleotide in dolgoverižne aldehide. Slednje pridobijo preko biosinteze maščobnih lipidov. LuxA in luxB gena zapisujeta za α in β podenoto bakterijske luciferaze. LuxC, luxD in luxE zapisujejo za encime, ki sodelujejo v sintezi aldehidnih substratov, luxG pa zapisuje za flavin reduktazo, ki je pomembna za nastanek flavin mononukleotidov. Operon je v sintezni biologiji zelo uporaben, saj vsebuje vse gene potrebne za bioluminiscenco, nastanek in kroženje substrata in reakcijo, ki proizvaja svetlobo. Ima pa zaradi svoje celovitosti tudi omejitve. Za uporabo v evkariontskih gostiteljskih sistemih je potrebno operon preoblikovati, saj evkariontska jedrna DNA ne vsebuje operonov in jih citosolni ribosomi tako ne morejo predelati (Reeve in sod., 2014).<br /> V 80. letih 20. stoletja so naredili bioluminiscenčne bakterije ''E. coli'' z uporabo operonov iz ''Aliivibrio fischeri'' in ''Vibrio harveyi'' (Reeve in sod., 2014). <br /> <br /> Naredili so tudi poizkuse transformacije celic transgenskega tobaka in korenja s pomočjo ''Agrobacterium''. Najprej so transformacijo izvedli le z zapisom za luciferazo (luxA in luxB) iz ''Vibrio harveyi''. Proteina sta se pravilno sestavila v delujočo luciferazo, saj se je ob dodatku substratov tvorila svetloba (Reeve in sod., 2014). <br /> <br /> Avtoluminiscenco v višjih evkariotih so uspeli proizvesti šele desetletje kasneje. Celotni operon lux iz ''Photobacterium leiognathi'' so vstavili v kloroplaste rastline tobaka, ki je proizvajal luminiscenco. Še istega leta so naredili šibko avtoluminiscenčne sesalske celice HEK293. Vzeli so gene celotnega operona iz ''Photorhabdus luminescens'' in ''Vibrio harveyi'', ki pa so jih morali v veliki meri spremeniti. Optimizirali so rabo kodona in 6 genov v operonu je bilo razdeljenih v tri bicistronske pare, med katera so dodali mesta IRES (virusna notranja vstopna mesta ribosoma) (Reeve in sod., 2014).<br /> Ostali poizkusi so se nanašali na uporabo operona lux iz ''V. fischeri''. Ko se je izražal pod arabinoznim inducibilnim promotorjem v ''E. coli'' z aktivacijo preko dodatka L-arabinoze, so v velikih steklenicah proizvedli ravno dovolj svetlobe, da je oseba lahko zraven brala (Reeve in sod., 2014). <br /> <br /> ===Ostali naravni luminiscenčni sistemi===<br /> Zanimiva je tudi bioluminiscenca pri glivah. Kar 71 vrst bioluminiscenčnih prizemnih gliv so že opisali, a je njihovo biokemijsko ozadje zelo slabo poznano. Našli so možne luciferine, vendar poti za njihov nastanek niso poznane, tudi prisotnost luciferaz je bila potrjena ne dolgo nazaj, sekvencirana pa do sedaj ni bila še nobena med njimi. Verjetno je v ozadju še mnogo uporabnih glivnih sistemov, ki jih je najprej potrebno odkriti, kar je naloga v naslednjih obdobjih (Reeve in sod., 2014). <br /> Podobno pomanjkanje se izkazuje tudi pri drugih vrstah, ki imajo zmožnost bioluminiscence. Med njimi so bičkarji, ožigalkarji in ceponožci. Pri teh bioluminiscenčnih organizmih so poznani encimi (luciferaza) in substrati (derivat klorofila pri bičkarjih in koelentarazin pri ožigalkarjih in ceponožcih), ostale njihove biokemijske poti pa ne, kar omejuje njihovo uporabo v sintezni biologiji (Reeve in sod., 2014).<br /> <br /> =='''Izbira gostiteljskega organizma (šasije)'''==<br /> ''E. coli'' je najpogosteje uporabljena šasija v sintezni biologiji. Zanjo imamo na voljo najbolje okarakterizirane genetske dele. Dobro okarakterizirane šasije tvorijo bolj predvidljive interakcije, vendar aplikacija omejuje izbiro šasije, saj zahteva določene lastnosti ali prilagoditve na okolje. Raziskovalci so oblikovali sistem osvetljave, pri katerem bi z gospodinjskimi odpadki zagotovili energijo za bakterije, ki bi nato zagotovile osvetljavo (Reeve in sod., 2014).<br /> <br /> Precej popularna je ideja o bioluminiscenčnih rastlinah (npr. bioluminiscenčna drevesa bi zamenjala ulične svetilke, božična drevesca). Tobak je bil prva eksperimentalna demonstracija bioluminiscence pri rastlinah, kjer je bil potreben dodatek luciferina, kot substrata. Okoli 20 let kasneje so ustvarili prvo autoluminiscentno rastlino. Krichevsky in sodelavci so uspeli ustvariti celotno funkcionalno pot bakterijske luciferaze v plastidih tobaka, da sta nastala oba luciferaza in njen substrat luciferin. To je bil tudi prvi uspešen poskus inženiringa celotne in funkcionalne tuje biokemijske multiencimske poti v plastidih. Izmed različnih luminiscentnih sistemov so izbrali bakterijski sistem emisije svetlobe, zaradi evolucijskega izvora cianobakterij. Izbrali so močan plastidni promotor in klonirali celoten operon ''Photobacterium leiognathi'' luxCDABEG. Izbrali so dve kandidatni integracijski mesti in naredili vektorje z operonom z dodanimi primernimi regijami za homologno rekombinacijo. Rastline so transformirali z bombardiranjem delcev. Imeli so srečo, da sta bila struktura ''P. leiognathi'' operona in RBS funkcionalna v plastidih ''Nicotiana tabacum'' ter da so bili RNA in proteini stabilni. Spremenili so le promotor. Kot produkt je nastala svetloba, ki je bila šibka. Celotne rastline so bile vidne s prostim očesom, šele po 5-10 min prilagoditvi na temo. Luminiscentne rastline niso imele fenotipskih razlik ali spremenjene rasti v primerjavi z divjim tipom. Torej se za proizvodnjo svetlobe ni porabila velika količina energije (Reeve in sod., 2014).<br /> <br /> Transformacija plastidov je potencialna izbira tudi za druge rastlinske šasije. Kloroplasti so v glavnem omejeni na liste in tako se energija ne porablja za tvorbo svetlobe v koreninah. Za večji nivo uporabe bio-osvetljevanja, bi uporabili za šasije večje olesenele rastline. Veliko je zanimanja tudi za bio-osvetljevanje za estetske namene. Za uresničitev tega pa bo potrebnih še kar nekaj raziskav (Reeve in sod., 2014).<br /> <br /> =='''Nadzorovanje oddajanja svetlobe'''==<br /> Biološke sisteme želimo narediti čim bolj zanesljive, predvidljive in takšne, da jih je lahko nadzorovati. Uporaba biosenzorja zahteva, da je oddajanje svetlobe natančno kontrolirano z vhodnimi signali. V primeru osvetljevanja si oddajanje svetlobe želimo le ob določenem delu dneva ali pa si želimo, da se organizem odzove na okolje (npr. v primeru onesnaženja ali kadar je sevanje UV previsoko). Z uravnavanjem genov odgovornih za oddajanje svetlobe, lahko npr. spremenimo barvo oddane svetlobe (Reeve in sod., 2014).<br /> <br /> Reporterji, ki oddajajo svetlobo, v glavnem uravnavajo proizvodnjo svetlobe s spreminjanjem nivoja transkripcije gena za luciferazo. Ta model se počasi odziva na spremembe, saj je razpolovna doba proteina 3-4 ure (Leclerc in sod., 2000). Z nekaterimi pristopi so destabilizirali protein, da bi dobili bolj odzivno regulacijo, vendar so ti pristopi še vedno v razvoju. V naravi poznamo primere zelo natančne regulacije luminiscence v primeru japonskih kresničk, ki so sposobne uskladiti utripe svetlobe na milisekundo natančno. To je mogoče zaradi pozicije luciferaze v peroksisomih pri kresničkah. Aktivnost živcev povzroči, da mitohondriji prevzamejo ATP ali pa ATP vstopi v peroksisome in ustvari svetlobo. Takšne vrste pristopi bodo morda potrebni, da bomo dosegli takojšnjo aktivacijo oddajanja svetlobe (Reeve in sod., 2014). <br /> <br /> Svetlost bi se lahko povečala z omejevanjem proizvodnje svetlobe v določenih tkivih ali v določenem delu dneva. &quot;Clock&quot; geni (omogočajo avtoregulatorno povratno zanko pri kateri cikel aktivacije in utišanja traja en dan) pri ''Arabidopsis'' so model cirkadianega ritma in so dobro okarakterizirani (Albrecht in sod., 2008). Če bi želeli da rastline svetijo le ponoči, bi bilo smiselno, da bi imele gene za oddajanje svetlobe pod kontrolo &quot;clock gene&quot; promotorja. Rastline uporabljajo fotoreceptorje, da spremljajo dolžino dneva in tako nadzorujejo čas cvetenja. Zaradi tega bi lahko razvili rastline, ki bi svetile le v času cvetenja ali le v temnih zimskih mesecih (Reeve in sod., 2014).<br /> Želja raziskovalcev je razviti biosenzorje za določevanje stopnje onesnaženosti (npr. ko-reporterji za 2 različna toksina), sisteme, ki bi delovali kot naravne ure, vendar bodo za to potrebne še mnoge raziskave in nadgraditev znanja (Reeve in sod., 2014; iGEM, 2010).<br /> <br /> =='''Obvladovanje'''==<br /> Številne sintezno biološke aplikacije bioluminiscence imajo v načrtu nameren izpust modificiranih organizmov v okolje. V tem primeru je potrebno dobro poskrbeti za varnost, saj bi organizmi z modificiranimi geni lahko imeli dolgoročen vpliv na okolje. Obstajata dve glavni zaskrbljujoči vprašanji in sicer ali bi lahko GSO izpodrinil naravne vrste ali kako drugače vplivali na okolje ter ali bi lahko spremenjen ali sintezni genetski material pobegnil iz gostitelja in kontaminiral v okolju prisotne organizme? Bioluminiscenca je sama po sebi zelo varna, proteini in kemijski intermediati niso toksični in proces pa povzroči hudo breme za gostitelja, zato je zelo verjetno, da bi bil slednji izpodrinjen v okolju. V primeru, da bi GSO pobegnil, bi svetlobno onesnaževanje negativno vplivalo na druge organizme (npr. vešče in ptice). Da bi minimizirali širjenje teh rastlin, bi uporabili le sterilne semenske rastline, z mutacijami, ki bi preprečevale cvetenje, nastanek semen, cvetnega prahu. Rastline bi lahko obvladovali tudi z auksotrofijo (inženiring organizmov, ki potrebujejo zunanjo molekulo za rast, npr. metionin, biotin, avksin). Te omogočajo normalno razmnoževanje rastlin, kadar dodajamo potrebni nutrient, sicer pa preprečujejo rast. Tudi za mikrobe lahko uporabimo auksotrofijo. Takšne mikroorganizme brez težav izpodrinejo ostali mikroorganizmi v okolju. Celice lahko obvladujemo tako, da jih fizično zamejimo z alginatnim gelom. Za večcelične organizme, kot so rastline, je horizontalen prenos genov redek tako, da je genetska omejitev zagotovljena že s fizično omejitvijo. Bioluminiscenčna drevesa ne kažejo nevarnosti, da bi se razrasla v divjino, zato ni potrebe po auksotrofiji, vendar se priporoča moška sterilnost. Mikroorganizmi so podvrženi horizontalnemu prenosu genov, zato moramo preprečiti, da se sintezna DNA znajde v nenačrtovanem gostitelju. Npr. s sistemi, kjer sta plazmid in načrtovani gostitelj odvisna drug od drugega. Najučinkovitejši varnostni sistem predstavlja sintezna DNA, ki vsebuje zaporedja, ki jih lahko pravilno prevede le bakterijski gostitelj z deljenim mehanizmom transkripcije ali translacije. Eden izmed pristopov je uporaba celičnega kodona tako, da ni več enaka univerzalnem genetskem kodu. Določene kodone in z njimi povezane tRNA lahko spremenimo tako, da načrtovana gostiteljska celica vstavi drugačne ali celo nenaravne aminokisline za določene kodone. Nenačrtovan naraven gostitelj bi v tem primeru prevedel nefunkcionalen produkt. Alternativo predstavljajo ribosomi, ki prepoznajo nenaravne RBS za translacijo (Reeve in sod., 2014). <br /> Da lahko izsledimo sintezno biološke modele uporabljamo DNA črtne kode. Okoljske vzorce direktno sekvenciramo da identificiramo onesnaženost s sintetično DNA. DNA oznake so vstavili v številne genomske lokacije za pomoč pri identifikaciji sintezno bioloških celic. Ker trenutno še ne obstaja popoln posamezen mehanizem obvladovanja, se jih uporablja več naenkrat. Pomembno pa je, da se za vsak model posamezno oceni stopnja tvegana in nevarnosti (Reeve in sod., 2014). <br /> <br /> =='''Izboljšanje in spreminjanje oddajanja svetlobe'''==<br /> Bioluminiscenčna svetloba v naravi in v laboratoriju je zelo neizrazita. Z različnimi pristopi bi lahko povečali količino proizvedene svetlobe. Obstajajo številne preproste spremembe s katerimi povečamo nivo proteinov, ki oddajajo svetlobo (npr. uporabimo močnejše promotorje, boljše RBS). Če konstrukte sintetiziramo ''de novo'' lahko optimiziramo kodone genov za oddajanje svetlobe za izražanje v izbrani šasiji. V primerih, kjer operon prepišejo iz enega samega promotorja v bakteriji, izražanje v evkariontih zahteva insercijo dodatnega promotorja med vsakim genom ali insercijo zaporedij, ki se ne vežejo na ribosome , da se zagotovi ločeno procesiranje vseh proteinov (Reeve in sod., 2014). <br /> Za optimizacijo oddajanja svetlobe se morajo produkti svetlobne emisije reciklirati kolikor je mogoče učinkovito in biti na voljo za novi substrat za nadaljnje reakcije. Pristopi za dosego tega cilja vključujejo izražanje luciferin regenerirajočega encima za luciferazo kresničk ali luxG flavin reduktazo v lux operonu. Nadaljnje optimizacije bodo vključevale analizo kvantitete metabolitov pri vsaki stopnji reakcije luminiscence. Tako bodo lahko določili stopnjo, ki določa hitrost reakcije oz. procesa. Ta je lahko odvisna od količine prisotne luciferaze, luciferina ali katerega od intermediatov (Reeve in sod., 2014). <br /> <br /> Alternativni pristop je pristop usmerjene evolucije. Začeten sistem svetlobne emisije bi lahko izrazili v bakterijah, nato pa bi na teh bakterijah izvedli mutagenezo. Optična selekcija najsvetlejših kolonij in ponavljanje tega procesa naj bi sčasoma pripeljali do modulov, ki emitirajo svetlejšo svetlobo. Prednost tega procesa je, da ni omejen od našega razumevanja katera mutacija bi lahko povečala količino proizvedene svetlobe (Reeve in sod., 2014).<br /> Spremembe v zapisih luminiscenčnih proteinov lahko privedejo do večje odpornosti na pH območje ali temperaturo. Takšna fleksibilnost bi bila zelo pomembna kadar želimo proteine izraziti v heterolognih sistemih, ki so precej različni od njihovega naravnega gostitelja. Npr. biolumuminiscenčni sistemi iz morskih živali pogosto slabo delujejo pri višjih temperaturah, ki so pogoste pri nekaterih šasijah (37 °C) (Reeve in sod., 2014). <br /> Tudi mikrookolje v katerem se pojavi bioluminiscenca je pomembno za izboljšavo reakcije emisije svetlobe. Nekatere vrste dinoflagelatov imajo specializirane organele, ki so optimizirani za bioluminiscenčne reakcije. Sintezni biologi upajo, da bodo lahko realizirali takšne strukture, saj bi jim to pomagalo optimizirati luminiscenco (Reeve in sod., 20141).<br /> <br /> ===Spremembe===<br /> Spekter valovnih dolžin lahko spremenimo na različne načine in z njim barvo emitirane svetlobe v bioluminiscenčnih reakcijah. Komaj opazne spremembe v zaporedjih aminokislin encima luciferaze, so dovolj, da signifikantno spremenijo barvo emitirane svetlobe (npr. iz zelene v rdečo pri luciferazi kresničk). Alternativa spreminjanju zaporedij je sprememba pH pri kateri reakcije potekajo (Ando in sod., 2008). Drug pristop je sprememba kemijske strukture substrata za encim (D-luciferina v primeru luciferaze kresničk). Ko bo razumevanje metaboličnih procesov nastanka luciferina boljše, bodo različne variante slednjega proizvajali po encimatskih poteh. Obstaja tudi možnost, da spremenimo barvo emitirane svetlobe po tem, ko je že bila emitirana. To lahko naredimo z uporabo fluorescenčnih proteinov, ki zagotovijo, da je želena valovna dolžina daljša kot ta, ki je že emitirala. Obstaja veliko naravnih in umetno ustvarjenih fluorescenčnih proteinov s širokim razponom frekvenc vzbujanja in emisije (Reeve in sod., 2014). <br /> <br /> =='''Zaključek'''==<br /> Naravna bioluminiscenca je prijetna za oko in učinkovita, zato bo verjetno predstavljala del biološkega inženiringa v prihodnosti. Proizvodi bi služili striktno praktičnemu do povsem estetskemu namenu. Bioluminiscenca je možen vir svetlobe, vendar ne dosega takšne stopnje svetlosti kot konvencionalni načini osvetljevanja. Lahko je uporabna kot dopolnilni vir svetlobe, ki bi doprinesel k estetskemu videzu ali pa za dostavo uporabnih informacij. Naše znanje o sistemih naravne bioluminiscence in možnostih njihovega prenosa in optimizaciji je trenutno pomanjkljivo, vendar se izboljšuje. Biti moramo odgovorni pri načrtovanju in vpeljavi novih tehnologij ter upoštevati njihov širši vpliv. Prepoznati in preprečiti moramo vsako tveganje, ki bi pri tem nastalo. Bioosvetljevanje, biozaznavanje oddajanja svetlobe in komunikacija so še na začetku razvoja, vendar z nadaljnjimi raziskavami lahko dosežemo še marsikaj na tem področju. <br /> <br /> =='''Literatura'''==<br /> 1. Reeve, B., Sanderson, T., Ellis, T. in Freemont, P. How synthetic biology would reconsider natural bioluminescence and its application. ''Adv. Biochem. Eng. Biotechnol.'' 2014, 145:3-30.<br /> <br /> 2. Gomi, K. in Kajiyama, N. Oxyluciferin, a luminescence product of firefly luciferase, is enzymatically regenerated into luciferin. ''J. Biol. Chem.'' 2001, 276(39):36508-36513.<br /> <br /> 3. Niwa, K., Nakamura, M. in Ohmiya, Y. Stereoisomeric bio-inversion key to biosynthesis of firefly D-luciferin. ''FEBS letters''. 2006, 580(22):5283-5287.<br /> <br /> 4. Ow, D. W., Wet, J. R. D. E., Helinski, D. R., Howell, S. H., Wood, K. V. in Deluca, M. Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants. ''Science (New York, N. Y.)''. 1986, 234:856-859.<br /> <br /> 5. Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J. in Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. ''BioTechniques''. 2000, 29(3): 590-596.<br /> <br /> 6. Sanderson, T., Reeve, B., Masset, P., Knott, E., Hohmann, A., Handley, W., Emmrich, P., Copley, H., in Collins., B. E. glowli - Cambridge iGEM project, 2010. http://2010.igem.org/Team:Cambridge/Tools/microMeasure (dostop 15. 1. 2016) <br /> <br /> 7. Ando, Y., Niwa, K., Yamada, N., Enomoto, T., Irie, T., Kubota, H., Ohmiya, Y. in Akiyama, H. Firefly bioluminescence quantum yield and colour change by pH-sensitive green emission. ''Nature Photonics''. 2008, 2: 44-47.<br /> <br /> 8. Albrecht, U., in Ripperger, J. A. Clock Genes. 2008. https://www.unifr.ch/biochem/assets/files/albrecht/publications/AlbrechtRipperger.pdf (dostop 15. 1. 2016)</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Uporaba_naravne_bioluminiscence_v_sintezni_biologiji&diff=11218 2016-01-17T23:17:48Z

<p>AnaGrom: New page: ==&#039;&#039;&#039;Uvod&#039;&#039;&#039;== Bioluminiscenca se v naravi pojavlja v različnih živih organizmih. Med njimi najdemo različne živali, bakterije in glive. Ti organizmi uporabljajo bioluminiscenco predvs...</p> <hr /> <div>=='''Uvod'''==<br /> Bioluminiscenca se v naravi pojavlja v različnih živih organizmih. Med njimi najdemo različne živali, bakterije in glive. Ti organizmi uporabljajo bioluminiscenco predvsem za življenje in preživetje v okolju kjer se pojavljajo. Uporabijo jo za skrivanje pred plenilci, privabljanje plena ali partnerjev, obrambo pred plenilce, opozarjanje ostalih organizmov, sporazumevanje z okolico, mimikrijo drugih organizmov itd. Zaradi privlačnega videza in praktične uporabnosti postaja bioluminiscenca vedno bolj zanimiva tudi za raziskovalce, ki jo želijo izkoristiti v drugačne, velikokrat človeku uporabne namene. Mnogo raziskav se osredotoča na možnost popestritve okolice z okrasnimi rastlinami ali celo drevesi, ki bi imela sposobnost bioluminiscence in bi zato svetila ponoči, ali za povsem estetske stvari, kot je ustvarjanje bioluminiscenčnih slik, in med drugim tudi igrač, ki bi z uporabo bioluminiscence pritegnile zanimanje množice otrok. Pri vseh omenjenih primerih pa so potrebni določeni, različno optimizirani bioluminiscenčni sistemi. V ta namen bi se poslužili encimov z želenimi lastnostmi iz primernih sistemov (med predhodno naštetimi). Pri samem načrtovanju je potrebno upoštevati, da bodo vsi bioluminiscenčni deli sistema, genetski elementi in šasija (organizem), v katero bodo nameščeni, v sinergiji. Pomembno se je tudi poglobiti na vpliv, ki ga bo novonastali organizem imel na okolje. Potrebno je zagotoviti sisteme, ki ne bodo škodovali ostalim organizmom v okolju. V ta namen se sistem lahko na več različnih načinov spremeni (optimizira), rezultat pa je boljša in varnejša uporaba novonastalega sistema (Reeve in sod., 2014).<br /> <br /> =='''Bioluminiscenčni deli in moduli v naravi'''==<br /> Bioluminiscenca se je preko let močno razvijala in spreminjala. V naravi tako sedaj obstaja več kot 30 različnih neodvisnih sistemov, ki imajo zmožnost oddajanja svetlobe. Takšnih sistemov je zagotovo še veliko neodkritih, veliko pa na žalost tudi že izgubljenih. Med organizme, ki so sposobni oddajati svetlobo štejemo različne bakterije, glive, živali, rastline idr. V organizmih je za bioluminiscenco pomemben encim luciferaza, ki katalizira reakcijo oddajanja svetlobe. Primerjava luciferaz iz različnih organizmov ne kaže homologije med omenjenimi encimi. Tudi substrati luciferaz, luciferini, iz različnih organizmov ne izkazujejo kemično podobnih lastnosti. <br /> Sintezna biologija ima omejen izbor naravnih sistemov, a se nabor povečuje, predvsem zaradi vedno večih sekvenciranih genomov. To je omogočeno v veliki meri zaradi zmanjšanja stroškov sekvenciranja v zadnjem obdobju (Reeve in sod., 2014). <br /> <br /> ===Luminiscenca pri kresničkah===<br /> Med znanimi luciferazami je posebno dobro proučena luciferaza iz kresničk. Ta se tudi veliko uporablja kot reporterski gen. Za uporabo v drugih sistemih je velik problem poznavanje biokemije nastanka njenih substratov luciferinov.<br /> Leta 1974 so zaradi nepoznavanja genov, ki zapisujejo za substrate luciferaze (luciferine), predlagali uporabo proteina, ki bi recikliral luciferin. Ugotovili so, da se radioaktivno označeni oksiluciferin in 2-ciano-6-hidroksibenzotiazol (CHBT) pretvorita v luciferin, če ju vstavimo v živo kresničko. Nekaj deset let kasneje so sodelujoči protein odkrili in ga poimenovali encim za regeneracijo luciferina (LRE) (Gomi in Kajiyama, 2001). Oksiluciferin lahko blokira aktivno mesto kresnične luciferaze in je tako kompetitivni inhibitor luminiscence. Njegova odstranitev z LRE izboljša oddajanje svetlobe ''in vivo''. Če v sistem dodamo še D-cistein, je oddajanje svetlobe še podaljšano (Sanderson in sod., 2010). Geni za ''de novo'' biosintezo luciferina bi tako morali proizvesti le nekaj tega substrata, da bi se ta potem lahko nepretrgoma recikliral preko LRE cikla. S tem pa bi omogočili neprekinjeno oddajanje svetlobe v takem sistemu. Ker pa večina organizmov ne proizvaja D-cisteina (za sesalce je toksičen, v bakterijskih celicah pa je inhibitor rasti bakterij), to povzroča težavo pri izkoriščanju LRE cikla za recikliranje luciferina preko uporabe D-cisteina (Reeve in sod., 2014). <br /> Poleg omenjenih dveh poti je predpostavljeno recikliranje D-luciferina tudi preko izrabe L-cisteina. Ta pot v sintetičnih organizmih še ni dokazana, bi pa lahko bila v prihodnosti glavna pot za recikliranje luciferina (Niwa in sod., 2006). <br /> <br /> Luciferazo iz kresničke ''Photinus pyralis'' so leta 1986 izrazili v rastlinah tobaka pod promotorjem mozaičnega virusa cvetače. Za pridobitev luminiscence so morali raziskovalci rastlini dodati vodno raztopino z dodatkom substrata luciferina, saj rastlina sama ne proizvaja omenjenega substrata. Z omenjenim procesom so uspešno pridobili prvo transgensko večcelično rastlino, ki je izražala luminiscenco. Največ svetlobe je bilo izražene v listih in steblu rastline, saj so imeli ti predeli najboljši dostop do luciferina (Ow in sod., 1986; Reeve in sod., 2014). Edina težava za uporabo takšnih rastlin pri osvetljevanju je zaenkrat ta, da geni, ki zapisujejo za substrat luciferin, niso poznani. To je oteženo tudi zaradi dejstva, da celoten genom kresničk do sedaj še ni bil sekvenciran. Dodajanje luciferina za potek reakcije je tako sedaj še zmeraj nujno potreben za potek reakcije, kar je drag proces in zato slabo uporaben (Reeve in sod., 2014).<br /> <br /> ===Bakterijska bioluminiscenca===<br /> Luminiscenčne bakterije imajo nekaj skupnih lastnosti. Vse spadajo v razred gibljivih gram-negativnih bakrterij, ki ne tvorijo spor. Gre za najštevilčnejšo in široko razširjeno skupino med vsemi organizmi, ki oddajajo svetlobo. Najdemo jih kot prosto živeče organizme v oceanih, saprofite na mrtvih morskih organizmih ter simbionte v nekaterih organih rib in lignjev. Znane luminiscenčne bakterije najdemo v rodovih ''Aliivibrio'', ''Photobacterium'', ''Alteromonas'' in ''Photorhabdus''. Bakterijski encimski sistem za oddajanje svetlobe, ki ga kodira lux operon, je močno ohranjen med luminiscenčnimi bakterijami. Najpogostejšo arhitekturo operona predstavlja luxCDABEG. Za reakcijo oddajanja svetlobe uporabljajo bakterije kot substrate luciferaze flavin mononukleotide in dolgoverižne aldehide. Slednje pridobijo preko biosinteze maščobnih lipidov. LuxA in luxB gena zapisujeta za α in β podenoto bakterijske luciferaze. LuxC, luxD in luxE zapisujejo za encime, ki sodelujejo v sintezi aldehidnih substratov, luxG pa zapisuje za flavin reduktazo, ki je pomembna za nastanek flavin mononukleotidov. Operon je v sintezni biologiji zelo uporaben, saj vsebuje vse gene potrebne za bioluminiscenco, nastanek in kroženje substrata in reakcijo, ki proizvaja svetlobo. Ima pa zaradi svoje celovitosti tudi omejitve. Za uporabo v evkariontskih gostiteljskih sistemih je potrebno operon preoblikovati, saj evkariontska jedrna DNA ne vsebuje operonov in jih citosolni ribosomi tako ne morejo predelati (Reeve in sod., 2014).<br /> V 80. letih 20. stoletja so naredili bioluminiscenčne bakterije ''E. coli'' z uporabo operonov iz ''Aliivibrio fischeri'' in ''Vibrio harveyi'' (Reeve in sod., 2014). <br /> <br /> Naredili so tudi poizkuse transformacije celic transgenskega tobaka in korenja s pomočjo ''Agrobacterium''. Najprej so transformacijo izvedli le z zapisom za luciferazo (luxA in luxB) iz ''Vibrio harveyi''. Proteina sta se pravilno sestavila v delujočo luciferazo, saj se je ob dodatku substratov tvorila svetloba (Reeve in sod., 2014). <br /> <br /> Avtoluminiscenco v višjih evkariotih so uspeli proizvesti šele desetletje kasneje. Celotni operon lux iz ''Photobacterium leiognathi'' so vstavili v kloroplaste rastline tobaka, ki je proizvajal luminiscenco. Še istega leta so naredili šibko avtoluminiscenčne sesalske celice HEK293. Vzeli so gene celotnega operona iz ''Photorhabdus luminescens'' in ''Vibrio harveyi'', ki pa so jih morali v veliki meri spremeniti. Optimizirali so rabo kodona in 6 genov v operonu je bilo razdeljenih v tri bicistronske pare, med katera so dodali mesta IRES (virusna notranja vstopna mesta ribosoma) (Reeve in sod., 2014).<br /> Ostali poizkusi so se nanašali na uporabo operona lux iz ''V. fischeri''. Ko se je izražal pod arabinoznim inducibilnim promotorjem v ''E. coli'' z aktivacijo preko dodatka L-arabinoze, so v velikih steklenicah proizvedli ravno dovolj svetlobe, da je oseba lahko zraven brala (Reeve in sod., 2014). <br /> <br /> ===Ostali naravni luminiscenčni sistemi===<br /> Zanimiva je tudi bioluminiscenca pri glivah. Kar 71 vrst bioluminiscenčnih prizemnih gliv so že opisali, a je njihovo biokemijsko ozadje zelo slabo poznano. Našli so možne luciferine, vendar poti za njihov nastanek niso poznane, tudi prisotnost luciferaz je bila potrjena ne dolgo nazaj, sekvencirana pa do sedaj ni bila še nobena med njimi. Verjetno je v ozadju še mnogo uporabnih glivnih sistemov, ki jih je najprej potrebno odkriti, kar je naloga v naslednjih obdobjih (Reeve in sod., 2014). <br /> Podobno pomanjkanje se izkazuje tudi pri drugih vrstah, ki imajo zmožnost bioluminiscence. Med njimi so bičkarji, ožigalkarji in ceponožci. Pri teh bioluminiscenčnih organizmih so poznani encimi (luciferaza) in substrati (derivat klorofila pri bičkarjih in koelentarazin pri ožigalkarjih in ceponožcih), ostale njihove biokemijske poti pa ne, kar omejuje njihovo uporabo v sintezni biologiji (Reeve in sod., 2014).<br /> <br /> =='''Izbira gostiteljskega organizma (šasije)'''==<br /> ''E. coli'' je najpogosteje uporabljena šasija v sintezni biologiji. Zanjo imamo na voljo najbolje okarakterizirane genetske dele. Dobro okarakterizirane šasije tvorijo bolj predvidljive interakcije, vendar aplikacija omejuje izbiro šasije, saj zahteva določene lastnosti ali prilagoditve na okolje. Raziskovalci so oblikovali sistem osvetljave, pri katerem bi z gospodinjskimi odpadki zagotovili energijo za bakterije, ki bi nato zagotovile osvetljavo (Reeve in sod., 2014).<br /> <br /> Precej popularna je ideja o bioluminiscenčnih rastlinah (npr. bioluminiscenčna drevesa bi zamenjala ulične svetilke, božična drevesca). Tobak je bil prva eksperimentalna demonstracija bioluminiscence pri rastlinah, kjer je bil potreben dodatek luciferina, kot substrata. Okoli 20 let kasneje so ustvarili prvo autoluminiscentno rastlino. Krichevsky in sodelavci so uspeli ustvariti celotno funkcionalno pot bakterijske luciferaze v plastidih tobaka, da sta nastala oba luciferaza in njen substrat luciferin. To je bil tudi prvi uspešen poskus inženiringa celotne in funkcionalne tuje biokemijske multiencimske poti v plastidih. Izmed različnih luminiscentnih sistemov so izbrali bakterijski sistem emisije svetlobe, zaradi evolucijskega izvora cianobakterij. Izbrali so močan plastidni promotor in klonirali celoten operon ''Photobacterium leiognathi'' luxCDABEG. Izbrali so dve kandidatni integracijski mesti in naredili vektorje z operonom z dodanimi primernimi regijami za homologno rekombinacijo. Rastline so transformirali z bombardiranjem delcev. Imeli so srečo, da sta bila struktura ''P. leiognathi'' operona in RBS funkcionalna v plastidih ''Nicotiana tabacum'' ter da so bili RNA in proteini stabilni. Spremenili so le promotor. Kot produkt je nastala svetloba, ki je bila šibka. Celotne rastline so bile vidne s prostim očesom, šele po 5-10 min prilagoditvi na temo. Luminiscentne rastline niso imele fenotipskih razlik ali spremenjene rasti v primerjavi z divjim tipom. Torej se za proizvodnjo svetlobe ni porabila velika količina energije (Reeve in sod., 2014).<br /> <br /> Transformacija plastidov je potencialna izbira tudi za druge rastlinske šasije. Kloroplasti so v glavnem omejeni na liste in tako se energija ne porablja za tvorbo svetlobe v koreninah. Za večji nivo uporabe bio-osvetljevanja, bi uporabili za šasije večje olesenele rastline. Veliko je zanimanja tudi za bio-osvetljevanje za estetske namene. Za uresničitev tega pa bo potrebnih še kar nekaj raziskav (Reeve in sod., 2014).<br /> <br /> ==Nadzorovanje oddajanja svetlobe==<br /> Biološke sisteme želimo narediti čim bolj zanesljive, predvidljive in takšne, da jih je lahko nadzorovati. Uporaba biosenzorja zahteva, da je oddajanje svetlobe natančno kontrolirano z vhodnimi signali. V primeru osvetljevanja si oddajanje svetlobe želimo le ob določenem delu dneva ali pa si želimo, da se organizem odzove na okolje (npr. v primeru onesnaženja ali kadar je sevanje UV previsoko). Z uravnavanjem genov odgovornih za oddajanje svetlobe, lahko npr. spremenimo barvo oddane svetlobe (Reeve in sod., 2014).<br /> <br /> Reporterji, ki oddajajo svetlobo, v glavnem uravnavajo proizvodnjo svetlobe s spreminjanjem nivoja transkripcije gena za luciferazo. Ta model se počasi odziva na spremembe, saj je razpolovna doba proteina 3-4 ure (Leclerc in sod., 2000). Z nekaterimi pristopi so destabilizirali protein, da bi dobili bolj odzivno regulacijo, vendar so ti pristopi še vedno v razvoju. V naravi poznamo primere zelo natančne regulacije luminiscence v primeru japonskih kresničk, ki so sposobne uskladiti utripe svetlobe na milisekundo natančno. To je mogoče zaradi pozicije luciferaze v peroksisomih pri kresničkah. Aktivnost živcev povzroči, da mitohondriji prevzamejo ATP ali pa ATP vstopi v peroksisome in ustvari svetlobo. Takšne vrste pristopi bodo morda potrebni, da bomo dosegli takojšnjo aktivacijo oddajanja svetlobe (Reeve in sod., 2014). <br /> <br /> Svetlost bi se lahko povečala z omejevanjem proizvodnje svetlobe v določenih tkivih ali v določenem delu dneva. &quot;Clock&quot; geni (omogočajo avtoregulatorno povratno zanko pri kateri cikel aktivacije in utišanja traja en dan) pri ''Arabidopsis'' so model cirkadianega ritma in so dobro okarakterizirani (Albrecht in sod., 2008). Če bi želeli da rastline svetijo le ponoči, bi bilo smiselno, da bi imele gene za oddajanje svetlobe pod kontrolo &quot;clock gene&quot; promotorja. Rastline uporabljajo fotoreceptorje, da spremljajo dolžino dneva in tako nadzorujejo čas cvetenja. Zaradi tega bi lahko razvili rastline, ki bi svetile le v času cvetenja ali le v temnih zimskih mesecih (Reeve in sod., 2014).<br /> Želja raziskovalcev je razviti biosenzorje za določevanje stopnje onesnaženosti (npr. ko-reporterji za 2 različna toksina), sisteme, ki bi delovali kot naravne ure, vendar bodo za to potrebne še mnoge raziskave in nadgraditev znanja (Reeve in sod., 2014; iGEM, 2010).<br /> <br /> =='''Obvladovanje'''==<br /> Številne sintezno biološke aplikacije bioluminiscence imajo v načrtu nameren izpust modificiranih organizmov v okolje. V tem primeru je potrebno dobro poskrbeti za varnost, saj bi organizmi z modificiranimi geni lahko imeli dolgoročen vpliv na okolje. Obstajata dve glavni zaskrbljujoči vprašanji in sicer ali bi lahko GSO izpodrinil naravne vrste ali kako drugače vplivali na okolje ter ali bi lahko spremenjen ali sintezni genetski material pobegnil iz gostitelja in kontaminiral v okolju prisotne organizme? Bioluminiscenca je sama po sebi zelo varna, proteini in kemijski intermediati niso toksični in proces pa povzroči hudo breme za gostitelja, zato je zelo verjetno, da bi bil slednji izpodrinjen v okolju. V primeru, da bi GSO pobegnil, bi svetlobno onesnaževanje negativno vplivalo na druge organizme (npr. vešče in ptice). Da bi minimizirali širjenje teh rastlin, bi uporabili le sterilne semenske rastline, z mutacijami, ki bi preprečevale cvetenje, nastanek semen, cvetnega prahu. Rastline bi lahko obvladovali tudi z auksotrofijo (inženiring organizmov, ki potrebujejo zunanjo molekulo za rast, npr. metionin, biotin, avksin). Te omogočajo normalno razmnoževanje rastlin, kadar dodajamo potrebni nutrient, sicer pa preprečujejo rast. Tudi za mikrobe lahko uporabimo auksotrofijo. Takšne mikroorganizme brez težav izpodrinejo ostali mikroorganizmi v okolju. Celice lahko obvladujemo tako, da jih fizično zamejimo z alginatnim gelom. Za večcelične organizme, kot so rastline, je horizontalen prenos genov redek tako, da je genetska omejitev zagotovljena že s fizično omejitvijo. Bioluminiscenčna drevesa ne kažejo nevarnosti, da bi se razrasla v divjino, zato ni potrebe po auksotrofiji, vendar se priporoča moška sterilnost. Mikroorganizmi so podvrženi horizontalnemu prenosu genov, zato moramo preprečiti, da se sintezna DNA znajde v nenačrtovanem gostitelju. Npr. s sistemi, kjer sta plazmid in načrtovani gostitelj odvisna drug od drugega. Najučinkovitejši varnostni sistem predstavlja sintezna DNA, ki vsebuje zaporedja, ki jih lahko pravilno prevede le bakterijski gostitelj z deljenim mehanizmom transkripcije ali translacije. Eden izmed pristopov je uporaba celičnega kodona tako, da ni več enaka univerzalnem genetskem kodu. Določene kodone in z njimi povezane tRNA lahko spremenimo tako, da načrtovana gostiteljska celica vstavi drugačne ali celo nenaravne aminokisline za določene kodone. Nenačrtovan naraven gostitelj bi v tem primeru prevedel nefunkcionalen produkt. Alternativo predstavljajo ribosomi, ki prepoznajo nenaravne RBS za translacijo (Reeve in sod., 2014). <br /> Da lahko izsledimo sintezno biološke modele uporabljamo DNA črtne kode. Okoljske vzorce direktno sekvenciramo da identificiramo onesnaženost s sintetično DNA. DNA oznake so vstavili v številne genomske lokacije za pomoč pri identifikaciji sintezno bioloških celic. Ker trenutno še ne obstaja popoln posamezen mehanizem obvladovanja, se jih uporablja več naenkrat. Pomembno pa je, da se za vsak model posamezno oceni stopnja tvegana in nevarnosti (Reeve in sod., 2014). <br /> <br /> =='''Izboljšanje in spreminjanje oddajanja svetlobe'''==<br /> Bioluminiscenčna svetloba v naravi in v laboratoriju je zelo neizrazita. Z različnimi pristopi bi lahko povečali količino proizvedene svetlobe. Obstajajo številne preproste spremembe s katerimi povečamo nivo proteinov, ki oddajajo svetlobo (npr. uporabimo močnejše promotorje, boljše RBS). Če konstrukte sintetiziramo ''de novo'' lahko optimiziramo kodone genov za oddajanje svetlobe za izražanje v izbrani šasiji. V primerih, kjer operon prepišejo iz enega samega promotorja v bakteriji, izražanje v evkariontih zahteva insercijo dodatnega promotorja med vsakim genom ali insercijo zaporedij, ki se ne vežejo na ribosome , da se zagotovi ločeno procesiranje vseh proteinov (Reeve in sod., 2014). <br /> Za optimizacijo oddajanja svetlobe se morajo produkti svetlobne emisije reciklirati kolikor je mogoče učinkovito in biti na voljo za novi substrat za nadaljnje reakcije. Pristopi za dosego tega cilja vključujejo izražanje luciferin regenerirajočega encima za luciferazo kresničk ali luxG flavin reduktazo v lux operonu. Nadaljnje optimizacije bodo vključevale analizo kvantitete metabolitov pri vsaki stopnji reakcije luminiscence. Tako bodo lahko določili stopnjo, ki določa hitrost reakcije oz. procesa. Ta je lahko odvisna od količine prisotne luciferaze, luciferina ali katerega od intermediatov (Reeve in sod., 2014). <br /> <br /> Alternativni pristop je pristop usmerjene evolucije. Začeten sistem svetlobne emisije bi lahko izrazili v bakterijah, nato pa bi na teh bakterijah izvedli mutagenezo. Optična selekcija najsvetlejših kolonij in ponavljanje tega procesa naj bi sčasoma pripeljali do modulov, ki emitirajo svetlejšo svetlobo. Prednost tega procesa je, da ni omejen od našega razumevanja katera mutacija bi lahko povečala količino proizvedene svetlobe (Reeve in sod., 2014).<br /> Spremembe v zapisih luminiscenčnih proteinov lahko privedejo do večje odpornosti na pH območje ali temperaturo. Takšna fleksibilnost bi bila zelo pomembna kadar želimo proteine izraziti v heterolognih sistemih, ki so precej različni od njihovega naravnega gostitelja. Npr. biolumuminiscenčni sistemi iz morskih živali pogosto slabo delujejo pri višjih temperaturah, ki so pogoste pri nekaterih šasijah (37 °C) (Reeve in sod., 2014). <br /> Tudi mikrookolje v katerem se pojavi bioluminiscenca je pomembno za izboljšavo reakcije emisije svetlobe. Nekatere vrste dinoflagelatov imajo specializirane organele, ki so optimizirani za bioluminiscenčne reakcije. Sintezni biologi upajo, da bodo lahko realizirali takšne strukture, saj bi jim to pomagalo optimizirati luminiscenco (Reeve in sod., 20141).<br /> <br /> ===Spremembe===<br /> Spekter valovnih dolžin lahko spremenimo na različne načine in z njim barvo emitirane svetlobe v bioluminiscenčnih reakcijah. Komaj opazne spremembe v zaporedjih aminokislin encima luciferaze, so dovolj, da signifikantno spremenijo barvo emitirane svetlobe (npr. iz zelene v rdečo pri luciferazi kresničk). Alternativa spreminjanju zaporedij je sprememba pH pri kateri reakcije potekajo (Ando in sod., 2008). Drug pristop je sprememba kemijske strukture substrata za encim (D-luciferina v primeru luciferaze kresničk). Ko bo razumevanje metaboličnih procesov nastanka luciferina boljše, bodo različne variante slednjega proizvajali po encimatskih poteh. Obstaja tudi možnost, da spremenimo barvo emitirane svetlobe po tem, ko je že bila emitirana. To lahko naredimo z uporabo fluorescenčnih proteinov, ki zagotovijo, da je želena valovna dolžina daljša kot ta, ki je že emitirala. Obstaja veliko naravnih in umetno ustvarjenih fluorescenčnih proteinov s širokim razponom frekvenc vzbujanja in emisije (Reeve in sod., 2014). <br /> <br /> ===Zaključek===<br /> Naravna bioluminiscenca je prijetna za oko in učinkovita, zato bo verjetno predstavljala del biološkega inženiringa v prihodnosti. Proizvodi bi služili striktno praktičnemu do povsem estetskemu namenu. Bioluminiscenca je možen vir svetlobe, vendar ne dosega takšne stopnje svetlosti kot konvencionalni načini osvetljevanja. Lahko je uporabna kot dopolnilni vir svetlobe, ki bi doprinesel k estetskemu videzu ali pa za dostavo uporabnih informacij. Naše znanje o sistemih naravne bioluminiscence in možnostih njihovega prenosa in optimizaciji je trenutno pomanjkljivo, vendar se izboljšuje. Biti moramo odgovorni pri načrtovanju in vpeljavi novih tehnologij ter upoštevati njihov širši vpliv. Prepoznati in preprečiti moramo vsako tveganje, ki bi pri tem nastalo. Bioosvetljevanje, biozaznavanje oddajanja svetlobe in komunikacija so še na začetku razvoja, vendar z nadaljnjimi raziskavami lahko dosežemo še marsikaj na tem področju. <br /> <br /> =='''Literatura'''==<br /> 1. Reeve, B., Sanderson, T., Ellis, T. in Freemont, P. How synthetic biology would reconsider natural bioluminescence and its application. ''Adv. Biochem. Eng. Biotechnol.'' 2014, 145:3-30.<br /> <br /> 2. Gomi, K. in Kajiyama, N. Oxyluciferin, a luminescence product of firefly luciferase, is enzymatically regenerated into luciferin. ''J. Biol. Chem.'' 2001, 276(39):36508-36513.<br /> <br /> 3. Niwa, K., Nakamura, M. in Ohmiya, Y. Stereoisomeric bio-inversion key to biosynthesis of firefly D-luciferin. ''FEBS letters''. 2006, 580(22):5283-5287.<br /> <br /> 4. Ow, D. W., Wet, J. R. D. E., Helinski, D. R., Howell, S. H., Wood, K. V. in Deluca, M. Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants. ''Science (New York, N. Y.)''. 1986, 234:856-859.<br /> <br /> 5. Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J. in Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. ''BioTechniques''. 2000, 29(3): 590-596.<br /> <br /> 6. Sanderson, T., Reeve, B., Masset, P., Knott, E., Hohmann, A., Handley, W., Emmrich, P., Copley, H., in Collins., B. E. glowli - Cambridge iGEM project, 2010. http://2010.igem.org/Team:Cambridge/Tools/microMeasure (dostop 15. 1. 2016) <br /> <br /> 7. Ando, Y., Niwa, K., Yamada, N., Enomoto, T., Irie, T., Kubota, H., Ohmiya, Y. in Akiyama, H. Firefly bioluminescence quantum yield and colour change by pH-sensitive green emission. ''Nature Photonics''. 2008, 2: 44-47.<br /> <br /> 8. Albrecht, U., in Ripperger, J. A. Clock Genes. 2008. https://www.unifr.ch/biochem/assets/files/albrecht/publications/AlbrechtRipperger.pdf (dostop 15. 1. 2016)</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2015/16&diff=11217 2016-01-17T22:41:12Z

<p>AnaGrom: </p> <hr /> <div>Seminarji iz Sintezne biologije v študijskem letu 2015/16 so:<br /> <br /> Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/2866/synthetic-biology-engineering-complexity-and-refactoring-cell-capabilities SYNTHETIC BIOLOGY: ENGINEERING COMPLEXITY AND REFACTORING CELL CAPABILITIES]<br /> <br /> * Production of fatty acid-derived valuable chemicals in synthetic microbes ([[Proizvodnja kemikalij iz derivatov maščobnih kislin s pomočjo sintetičnih mikroorganizmov]]) (Maja Grdadolnik)&lt;br&gt;<br /> * Optimization of the IPP precursor supply for the production of lycopene, decaprenoxanthin and astaxanthin by Corynebacterium glutamicum ([[Optimizacija sinteze IPP kot prekursorja za produkcijo likopena, dekaprenoksantina in astaksantina v Corynebacterium glutamicum]]) (Griša Prinčič)&lt;br&gt;<br /> * Engineering sugar utilization and microbial tolerance toward lignocellulose conversion [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konverzija_lignoceluloze_s_pomočjo_izkoriščanja_mikrobne_tolerance_in_inženiringa_sladkorjev] (Kim Potočnik) &lt;br&gt;<br /> * Cofactor engineering for enhancing the flux of metabolic pathways [[INŽENIRING KOFAKTORJEV ZA IZBOLJŠANJE METABOLIČNIH POTI]] (Nastja Štemberger)&lt;br&gt;<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4354409/ Can the natural diversity of quorum-sensing advance synthetic biology?] ([[Ali lahko naravna diverziteta quorum sensinga pripomore k napredku v sintezni biologiji?]]) (Tina Snoj)&lt;br&gt;<br /> * [http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fbioe.2015.00093/full Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits] ([[Določanje učinkovitosti bioloških naprav in vezij z razmerjem signal-šum]]) (Jakob G. Lavrenčič)&lt;br&gt;<br /> * A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli ([[Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli]]) (Ajda Rojc)&lt;br&gt;<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4211546/ New transposon tools tailored for metabolic engineering of Gram-negative microbial cell factories] ([[Metabolični inženiring gram-negativnih bakterij s transpozonskim sistemom]]) (Rok Razpotnik)&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/455/synthetic-biology-applications-in-industrial-microbiology SYNTHETIC BIOLOGY APPLICATIONS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY]<br /> <br /> * Recent Progress in Synthetic Biology for Microbial Production of C3–C10 Alcohols (Urška Rauter) ([[Napredki v sintezni biologiji pri proizvodnji C3-C10 alkoholov v mikroorganizmih]])<br /> * Visualizing Evolution in Real-Time Method for Strain Engineering ([[Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo]]) (Samo Zakotnik)<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3367458/ Engineering Microbial Consortia to Enhance Biomining and Bioremediation] ([[Načrtovanje mikrobnih konzorcijev za izboljšanje biorudarstva in bioremediacije]]) (Maja Kostanjevec)<br /> * Engineering Microbial Chemical Factories to Produce Renewable “Biomonomers” ([[Mikrobiološka proizvodnja obnovljivih biomonomerov in bioplastike]])(Nastja Pirman)<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3446811/ Application of Synthetic Biology in Cyanobacteria and Algae] ([[Uporaba sintezne biologije v cianobakterijah in algah]]) (Špela Tomaž)<br /> * Synthetic Feedback Loop Model for Increasing Microbial Biofuel Production Using a Biosensor ([[Model s povratno zanko za povečanje mikrobne produkcije biogoriva z uporabo biosenzorja]])(Jernej Pušnik)<br /> * Balance of XYL1 and XYL2 Expression in Different Yeast Chassis for Improved xylose Fermentation ([[Ravnotežje med ekspresijo XYL1 in XYL2 v različnih šasijah kvasovk v povezavi s povečano fermentacijo ksiloze]]) (Monika Praznik)<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3630320/ Design and Development of Synthetic Microbial Platform Cells for Bioenergy] ([[Načrtovanje in razvijanje sintetičnih mikrobnih celičnih platform za pridobivanje bioenergije]])(Erik Mršnik)<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3616241/ Microbial Production of Isoprenoids Enabled by Synthetic Biology] ([[Mikrobna produkcija izoprenoidov s sintezno biologijo]]) (Dominik Kert) <br /> * Chemical synthetic biology: a mini-review ([[Kratki pregled kemijske sintezne biologije]]) (Anka Hotko)<br /> <br /> <br /> Seminarji iz preglednih člankov:<br /> <br /> * [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S002228361500618X Towards engineering biological systems in a broader context] ([[Inženiring bioloških sistemov v širšem kontekstu]]) (Aleksander Benčič)<br /> * [http://revistes.iec.cat/index.php/IM/article/viewFile/139212/137876 Synthetic biology: Novel approaches for microbiology] ([[Sintezno biološki pristopi v mikrobiologiji]]) (Daša Janeš)<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26463592 Tools and principles for microbial gene circuit engineering] (Marko Radojković)<br /> * Sensitive cells: enabling tools for static and dynamic control of microbial metabolic pathways ([[Dinamično uravnavanje (regulacija) metabolnih poti]]) (Katja Leben)<br /> * Chassis optimization as a cornerstone for the application of synthetic biology based strategies in microbial secondary metabolism ([[Oprimizacija šasij kot osnovni korak pri uporabi sintezno biološkega pristopa pri karakterizaciji mikrobnega sekundarnega metabolizma]]) (Jure Zabret)<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4571725/ Recent advances and opportunities in synthetic logic gates engineering in living cells] ([[Napredki v načrtovanju bioloških logičnih vrat v živih celicah]]) (Monika Biasizzo)<br /> * Programmable genetic circuits for pathway engineering ([[Genetska vezja v metabolnem inženiringu]])(Urban Javoršek)<br /> * [http://web.media.mit.edu/~neri/MATTER.MEDIA/Publications/Better_together-_engineering_and_application_of_microbial_symbioses.pdf Better together: engineering and application of microbial symbioses] ([[V slogi je moč: načrtovanje in uporaba mikrobne simbioze]]) (Nejc Petrišič)<br /> * Synthetic biology for microbial production of lipid-based biofuels ([[Produkcija lipidnih biogoriv s sintezno biologijo]]) (Urška Pevec)<br /> * Engineering Biosynthesis Mechanisms for Diversifying Polyhydroxyalkanoates ([[Inženiring biosintetskih mehanizmov za raznolike polihidroksialkanoate]]) (Mojca Banič)<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4519758/pdf/fmicb-06-00775.pdf Synthetic biology of fungal natural products] ([[Sintezna biologija naravnih produktov (nitastih) gliv]]) (Estera Merljak)<br /> * Synthetic biology and biomimetic chemistry as converging technologies fostering a new generation of smart biosensors ([[Sintezna biologija in biomimetika pri razvoju biosenzorjev]]) (Benjamin Bajželj)<br /> * [http://splasho.com/blog/papers/Bioluminescence.pdf How Synthetic Biology Would Reconsider Natural Bioluminescence and its Application] ([[Uporaba naravne bioluminiscence v sintezni biologiji]]) (Ana Grom &amp; Ana Unkovič) &lt;br&gt;<br /> * Synthetic Biology-Toward Therapeutic Solutions ([[Uporaba sintezne biologije v terapevtske namene]]) (Tanja Korpar)<br /> * [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X15306197 Synthetically modified mRNA for efficient and fast human iPS cell generation and direct transdifferentiation to myoblasts] ([[Učinkovita in hitra priprava človeških iPS celic in neposredna transdiferenciacija v mioblaste s sintetično modificirano mRNA]]) (Mirjana Malnar)<br /> * Mammalian synthetic biology: emerging medical applications([[Sintezna biologija sesalcev in medicinske aplikacije]]) ( Maša Mirkoviić)<br /> * Biology devices and circuits for RNA-based ‘smart vaccines’: a propositional review ([[Biološke naprave in vezja za pripravo pametnih cepiv na osnovi RNA]])(Monika Škrjanc)</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2015/16&diff=11180 2016-01-12T18:15:05Z

<p>AnaGrom: </p> <hr /> <div>Seminarji iz Sintezne biologije v študijskem letu 2015/16 so:<br /> <br /> Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/2866/synthetic-biology-engineering-complexity-and-refactoring-cell-capabilities SYNTHETIC BIOLOGY: ENGINEERING COMPLEXITY AND REFACTORING CELL CAPABILITIES]<br /> <br /> * Production of fatty acid-derived valuable chemicals in synthetic microbes ([[Proizvodnja kemikalij iz derivatov maščobnih kislin s pomočjo sintetičnih mikroorganizmov]]) (Maja Grdadolnik)&lt;br&gt;<br /> * Optimization of the IPP precursor supply for the production of lycopene, decaprenoxanthin and astaxanthin by Corynebacterium glutamicum ([[Optimizacija sinteze IPP kot prekursorja za produkcijo likopena, dekaprenoksantina in astaksantina v Corynebacterium glutamicum]]) (Griša Prinčič)&lt;br&gt;<br /> * Engineering sugar utilization and microbial tolerance toward lignocellulose conversion [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konverzija_lignoceluloze_s_pomočjo_izkoriščanja_mikrobne_tolerance_in_inženiringa_sladkorjev] (Kim Potočnik) &lt;br&gt;<br /> * Cofactor engineering for enhancing the flux of metabolic pathways [[INŽENIRING KOFAKTORJEV ZA IZBOLJŠANJE METABOLIČNIH POTI]] (Nastja Štemberger)&lt;br&gt;<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4354409/ Can the natural diversity of quorum-sensing advance synthetic biology?] ([[Ali lahko naravna diverziteta quorum sensinga pripomore k napredku v sintezni biologiji?]]) (Tina Snoj)&lt;br&gt;<br /> * [http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fbioe.2015.00093/full Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits] ([[Določanje učinkovitosti bioloških naprav in vezij z razmerjem signal-šum]]) (Jakob G. Lavrenčič)&lt;br&gt;<br /> * A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli ([[Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli]]) (Ajda Rojc)&lt;br&gt;<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4211546/ New transposon tools tailored for metabolic engineering of Gram-negative microbial cell factories] ([[Metabolični inženiring gram-negativnih bakterij s transpozonskim sistemom]]) (Rok Razpotnik)&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/455/synthetic-biology-applications-in-industrial-microbiology SYNTHETIC BIOLOGY APPLICATIONS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY]<br /> <br /> * Recent Progress in Synthetic Biology for Microbial Production of C3–C10 Alcohols (Urška Rauter) ([[Napredki v sintezni biologiji pri proizvodnji C3-C10 alkoholov v mikroorganizmih]])<br /> * Visualizing Evolution in Real-Time Method for Strain Engineering ([[Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo]]) (Samo Zakotnik)<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3367458/ Engineering Microbial Consortia to Enhance Biomining and Bioremediation] ([[Načrtovanje mikrobnih konzorcijev za izboljšanje biorudarstva in bioremediacije]]) (Maja Kostanjevec)<br /> * Engineering Microbial Chemical Factories to Produce Renewable “Biomonomers” ([[Mikrobiološka proizvodnja obnovljivih biomonomerov in bioplastike]])(Nastja Pirman)<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3446811/ Application of Synthetic Biology in Cyanobacteria and Algae] ([[Uporaba sintezne biologije v cianobakterijah in algah]]) (Špela Tomaž)<br /> * Synthetic Feedback Loop Model for Increasing Microbial Biofuel Production Using a Biosensor (Jernej Pušnik)<br /> * Balance of XYL1 and XYL2 Expression in Different Yeast Chassis for Improved xylose Fermentation ([[Ravnotežje med ekspresijo XYL1 in XYL2 v različnih šasijah kvasovk v povezavi s povečano fermentacijo ksiloze]]) (Monika Praznik)<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3630320/ Design and Development of Synthetic Microbial Platform Cells for Bioenergy] ([[Načrtovanje in razvijanje sintetičnih mikrobnih celičnih platform za pridobivanje bioenergije]])(Erik Mršnik)<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3616241/ Microbial Production of Isoprenoids Enabled by Synthetic Biology] ([[Mikrobna produkcija izoprenoidov s sintezno biologijo]]) (Dominik Kert) <br /> * Chemical synthetic biology: a mini-review ([[Kratki pregled kemijske sintezne biologije]]) (Anka Hotko)<br /> <br /> <br /> Seminarji iz preglednih člankov:<br /> <br /> * [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S002228361500618X Towards engineering biological systems in a broader context] ([[Inženiring bioloških sistemov v širšem kontekstu]]) (Aleksander Benčič)<br /> * [http://revistes.iec.cat/index.php/IM/article/viewFile/139212/137876 Synthetic biology: Novel approaches for microbiology] ([[Sintezno biološki pristopi v mikrobiologiji]]) (Daša Janeš)<br /> * Tools and principles for microbial gene circuit engineering (Marko Radojković)<br /> * Sensitive cells: enabling tools for static and dynamic control of microbial metabolic pathways ([[Dinamično uravnavanje (regulacija) metabolnih poti]]) (Katja Leben)<br /> * Chassis optimization as a cornerstone for the application of synthetic biology based strategies in microbial secondary metabolism ([[Oprimizacija šasij kot osnovni korak pri uporabi sintezno biološkega pristopa pri karakterizaciji mikrobnega sekundarnega metabolizma]]) (Jure Zabret)<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4571725/ Recent advances and opportunities in synthetic logic gates engineering in living cells] ([[Napredki v načrtovanju bioloških logičnih vrat v živih celicah]]) (Monika Biasizzo)<br /> * Programmable genetic circuits for pathway engineering (Urban Javoršek)<br /> * [http://web.media.mit.edu/~neri/MATTER.MEDIA/Publications/Better_together-_engineering_and_application_of_microbial_symbioses.pdf Better together: engineering and application of microbial symbioses] ([[V slogi je moč: načrtovanje in uporaba mikrobne simbioze]]) (Nejc Petrišič)<br /> * Synthetic biology for microbial production of lipid-based biofuels ([[Produkcija lipidnih biogoriv s sintezno biologijo]]) (Urška Pevec)<br /> * Engineering Biosynthesis Mechanisms for Diversifying Polyhydroxyalkanoates ([[Inženiring biosintetskih mehanizmov za raznolike polihidroksialkanoate]]) (Mojca Banič)<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4519758/pdf/fmicb-06-00775.pdf Synthetic biology of fungal natural products] ([[Sintezna biologija naravnih produktov (nitastih) gliv]]) (Estera Merljak)<br /> * Synthetic biology and biomimetic chemistry as converging technologies fostering a new generation of smart biosensors ([[Sintezna biologija in biomimetika pri razvoju biosenzorjev]]) (Benjamin Bajželj)<br /> * [http://splasho.com/blog/papers/Bioluminescence.pdf How Synthetic Biology Would Reconsider Natural Bioluminescence and its Application] (Ana Grom &amp; Ana Unkovič) &lt;br&gt;<br /> * Synthetic Biology-Toward Therapeutic Solutions (Tanja Korpar)<br /> * Synthetically modified mRNA for efficient and fast human iPS cell generation and direct transdifferentiation to myoblasts (Mirjana Malnar)<br /> * Mammalian synthetic biology: emerging medical applications([[Sintezna biologija sesalcev in medicinske aplikacije]]) ( Maša Mirkoviić)<br /> biology devices and circuits for RNA-based ‘smart vaccines’: a propositional review (Monika Škrjanc)</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Kloniranje_mi%C5%A1i_iz_iPSC&diff=8201 2013-06-04T22:25:00Z

<p>AnaGrom: /* Pridobivanje celičnih linij (1. primer) */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> <br /> Odrasle diferencirane celice lahko z uporabo majhnega števila določenih transkripcijskih faktorjev reprogramiramo oz. spremenimo v inducirane pluripotentne matične celice (iPS celice), ki so v marsičem podobne embrionalnim matičnim celicam (ES celice). Z iPS celicami bi bilo možno zdraviti različne degenerativne in genetske bolezni, nadomeščati poškodovana tkiva, uporabne bi bile kot modeli za raziskave bolezni, pri vsem tem pa ne bi prišlo do etično sporne uporabe embrionalnih celic. Vendar pa imajo iPSC tudi določene slabosti; v nekaterih raziskavah so se izkazale za tumorigene in nagnjene k hitrejšemu celičnemu staranju.<br /> <br /> Pojavljalo pa se je tudi vprašanje o njihovi pluripotentnosti, saj je to ena od bistvenih značilnosti matičnih celic. Pluripotentne matične celice prispevajo k razvoju vseh treh zarodnih plasti (endoderma, mezoderma in ektoderma) in so se tako sposobne razviti v vse celice zarodka, ne morejo pa tvoriti izvenembrionalnih tkiv.<br /> <br /> ES celice so se izkazale kot bolj učikovite pri kloniranju. V naslednjih raziskavah se poroča o uspehih kloniranja živih miši iz reprogramiranih fibroblastov, kar kaže na to, da so lahko vse značilnosti stopnje pluripotentosti nadomeščene brez izpostavljanja neznanim ooplazemskim faktorjem. Primerjanje teh polno pluripotentnih iPS celičnih linij bo lahko pokazalo molekulske markerje potrebne za pluripotentna stanja.<br /> <br /> ==Preverjanje pluripotentnosti z genetskimi in celičnimi analizami==<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (1. primer)===<br /> <br /> V prvem primeru so se najprej lotili načrtovanja genetske oznake za razlikovanje izvora celic iz blastociste ali iPS celic. Mišje embriontske fibroblaste se je pridobilo s križanjem dveh mišjih trangenih linij (Pchd21/Cre ter Z/EG).<br /> *Z/EG linija vsebuje v večini celici viden ter selektiven marker ß-GEO (fuzija gena za ß-galaktozidazo ter gena za rezistenco na neomicin; tu pride lahko do detekcije aktivnega encime ß-galaktozidaze preko X-galaktoze, kjer se tvori modro obarvan produkt, ali pa se kot selekcijski marker uporabi odpornost klonov proti neomicinu; v raziskavi se je uporabil prvi marker).<br /> *Pchd21/Cre linija; promotor protokadherina 21(katerega ekspresija je značilna predvsem za dva tipa nevronov pri vohalnem sistemu v glomerulu) podpira ekspresijo Cre rekombinaze (je specifična rekombinaza, ki katalizira specifično rekombinacijo na točno določenem mestu v DNA).<br /> Tako je prišlo pri kombiniranju celičnih linij pri sveh tipih vohalnih nevronov miši, zaradi delovanja Cre rekombinaze do izreza »floksiranega« ß-geo gena, kar pa je kot za posledico imelo izražanje GFP (zelenega fluoscirajočega proteina).<br /> <br /> Nepravilno izražanje reprogramirajočih genov skozi razvoj bi lahko inhibiral embionalni in poporodni razvoj. Odločili so se za tesno kontrolo trangene ekspresije v iPS celicah. Štiri »Yamanaka« faktorje (Oct4, Klf4, Sox2 in Myc-c) so prenesli v celice preko retrovirusa ter ih postavili pod okrilje tetO promotorja (prepis pod tem promotorjem se inducira v prisotnosti antibiotika tetraciklina ali njegovih derivatov (npr. doksiciklina)). V našem sistemu je sistem aktiviran preko izboljšane verzije reverznega tetraciklin transaktivatorja (rtTAM2.2), v prisotnosti doksiciklina. Da bi se vpodbudila še večja učinkovitost reprogramiranja in izolacija popolno reprogramiranih iPS celic so izpostavili mišje embironalne fibroblaste valproični kislini, za katero se je izkazalo, da poveča reprogramsko učinkovitost in inhibicira nepopolnoma reprogramiranih celic z inhibicijo njihovih celičnih delitev.<br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (1. primer)===<br /> <br /> Z reprogramiranjem Pcdh21/cre-Z/EG fibroblastov se je po 5 dneh v prisotnosti doksiciklina in VPA ter po 7 dneh le v prisotnosti doksiciklina razvilo 21 celičnih linij, označenih z oznakami iMZ1-21.<br /> Ker univerzalnega testa za ugotavljanje pluripotetnosti še ni, so izvedli vrsto testiranj, na podlagi katerih so izbrali celične linije primerne za test tetraploidne komplementacije. <br /> <br /> Glede na morfologijo oz. nenormalno širjenje so zavrgli 9 celičnih linij, ostalih 15 pa testirali z imonofluorescenco za ekspresijo markerjev za pluripotentnost (Sox2, Oct4). <br /> Vse linije so vsebovale izražene markerje prav tako so se iz vseh razvila embrionalna telesa, pri katerih so testirali sposobnost tvorbe mišjih vohalnih nevronov. Celične linije so razdelili v 2 skupini: tiste, ki so razvile veliko število mišjih vohalnih nevronov: celične linije iMZ2, iMZ10, iMZ12, iMZ13, iMZ18, iMZ11, iMZ14, iMZ17, iMZ20 in iMZ21 ter skupino celičnih linij, ki so razvile malo vohalnih nevronov: iMZ3, iMZ15, iMZ7, iMZ9.<br /> V nadaljnjih testiranjih so linije primerjali s kontrolno skupino embrionalnih celic z imunooznačevanjem treh pluripotentnih markerjev za:<br /> <br /> Nanog, ki je transkripcijski faktor za Rex1 promotor ter je ključnega pomena za ohranjanje pluripotentnosti (Rex1 je prav tako eden izmed markerjev za pluripotentnost, njegova količina močno upade ob začetku diferenciacije celic) <br /> <br /> Oct4, ta transkripcijski faktor je aktiven predvsem v oocitih, ostaja pa prisoten tudi v embriih. Pojavlja se tudi v nediferenciranih celicah tumorjev, utišanje njegovega gena pa pripelje do diferenciacije celic.<br /> <br /> SSEA-1: ob začetku diferenciacije celic se izražanje SSEA-1 gena močno poveča, antigene za SSEA-1 oz. drugače imenovanemu tudi CD15 najdemo v zarodnih oz. embrionalnih celicah glodavcev ter njihovih rakavih celicah.<br /> <br /> Na podlagi teh markerjev so ugotavljali podrobnosti z embrionalnimi celicami ter izbrali 7 celičnih linij, ki so se v podobnosti ujemale z embrionalnimi celicami in posledično razlikovale od fibroblastov iz katerih so reprogramirali iPS celice. <br /> 4 od 7 celičnih linij so razvile veliko mišjih vohalnih nevronov (iMZ9, iMZ11, iMZ14, iMZ17 in iMZ21). To skupino ter skupino linij, ki so bile pozitivne na vse pluripotentne markerje, vendar so razvile relativno nizko število vohalnih nevronov so izbrali za nadaljnje analize kariotipa. <br /> Štiri od osmih linij so bile euploidne (iMZ9, iMZ11, iMZ15 in iMZ21) ter tako primerne za uporabo v testu tetraploidne komplementacije.<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (1. primer)===<br /> <br /> Preko detekcije ß-galaktozidaze v mišjih tkivih (obarvanje celic iz celičnih linij in negativni rezultat pri celicah blastocist), PCR tehnike za detekcijo mikrosatelitnih markerjev in PCR tehnike za ugotavljanje prisotnosti albino (donor blastociste je albino osebek) mutacije na Tyr genu so dokazali, da konstitucija celic v mišjih osebkih izhaja izključno iz celice celičnih linij in so se vsa tkiva razvila izključno iz pluripotentnih celic.<br /> Southern blot analiza za Oct4 in rtTAM2.2 je pokazala vzorec provirusne integracije, ki je identična vzorcem integracije iz iPS celičnih linij. Nobena do sedaj znana ES celična linija ne vsebuje dane genetske modfikacije, kar kaže na to, da ni prišlo do kontaminacije z nobeno prej obstajajočo ES celično linijo.<br /> Kvantitativna PCR z reverzno transkripcijo (qRT-PCR) je pokazala skoraj popolno utišanost provirusnih transgenov pri iPSC celicah v odsotnosti doksicilkina. Celične linije so se ponovno tretirale z doksiciklinom. Iz celičnih linij, iz katerih je izšlo večina iPS miši je v odsotnosti doksiciklina bila prisotna reducirana ekspresija vseh 4ih reprogamirajočih faktorjev. Medtem ko je pri manj uspešnih linijah prišlo do zaznavne detekcije ekspresije Oct4 in /ali Klf4; kar kaže na nepopolno reprogramiranje manj uspešnih celičnih linij.<br /> Specifičnost sistema se je potrdila tudi z imunoflorescenčno analizo nevronov za percepcijo vonja, ki je kazala pozitivno bravanje za ß-galaktozidazo razen dveh tipov nevronov kjer je bila prisotna ekspresija GFP.<br /> <br /> Mnogo izboljšav je lahko odgovornih za dano pluripotentnost celičnih linij.<br /> 1.) Visoka stopnja indukcije transgena preko rtTAM2.2 in daljši čas ekspresije reprogramijajočih faktorjev kot navadno (več časa za bolj popolno reprogramiranje)<br /> 2.) Reguliranje ekspresije našega transgena preko doksiciklina, kar je pomagalo preprečiti nepravilno ekspresijo reprogramijajočih faktorjev skozi embrionalni razvoj<br /> 3.) Daljša terapija z valproično kislino je lahko omogočila reprogramiranje epigenoma v stanje kromatina bolj podobnemu tistemu v ES celicah<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (2. primer)===<br /> <br /> V drugem primeru so mišje embrionalne fibroblaste ki odražajo Oct4 z GFP okužili (preko retrovirusa) z “Yamanaka” faktorji. Druga modifikacija je vključevala zamenjavo seruma v katerem se celice gojijo s fetalnim govejim serumom. <br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (2. primer)===<br /> <br /> Na gojiščih na katerih so gojili mišje embrionalne fibroblaste, v katere so prenesli &quot;Yamanaka faktorje&quot;, so po 10 dneh zaznali večjo količino alkalne fosfataze, katere povišana količina se pojavlja v membrani pluripotentih celic ter med drugim služi kot test pluripotentonost. Prav tako so zaznali zeleni fluorescirajoči protein (GPF), ki je kazal na prisotnost Oct4 (katerega količina upade ob začetku diferenciacije celic).<br /> <br /> Celice so iz gojišča odvzeli po 14 dneh, (celične linije IP14D), 20 dneh (celične linije IP20D) in 36 dneh (celične linije IP36D) ter na tak način pridobili 31 stabilnih, diploentnih celičnih linij s 40 kromosomi.<br /> <br /> Test z bisulfidnim skevenciranjem je v treh od pridobljenih celičnih linij (IP20D-3, IP36D-3 ter IP14D-1) pokazal podoben metilacijski vzorec kot vzorec kontrolne skupine embrionalnih celic, h krati pa se je močno razlikoval od mišjih embrionalnih fibroblastov, iz katerih so z reprogramiranjem pridobili zgoraj omenjene pluripotentne celične linije. <br /> Pluripotentnost teh linij so dokazali tudi z vnosom le teh v miši s hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo pri katerih se je razvil teratom z vsemi tremi zarodnimi plastmi. <br /> <br /> Za nadaljnjo testiranje pluripotentnosti so naključno izbrali celične linije ter jih vključili v normalno CD-1 blastocisto ter jo prenesli v CD-1 samico miši, ter opazovali razvoj embriov do mladičev.<br /> Rezultati so pokazali da celične linije IP36D in IP20D razvijejo žive miši z 5-80% himernostjo, linije IP14D pa miši z 10-95% himernostjo. <br /> Kloniranje miši s tetraploidno komplementacijo ni bilo enako uspešno pri vseh celičnih linijah, iz celičnih linij IP36D so se sicer razvili embrii, ki pa so v 10. dnevu razvoja umrli. Celične linije IP20D prav tako niso razvile živih mladičev oz. embriov starejših od 17 dni, med tem ko se je iz celičnih linij IP14D razvilo tudi do 22 živih mladičev. <br /> Rezultati celične linije IP14D-1 so bili celo primerljivi z rezultati kontrolne skupine z embrionalnimi celicami (v obeh primerih se je razvilo približno 3% živih mladičev).<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (2. primer)===<br /> <br /> Bisulfitno sekveniranje pa je pokazalo demetilacijo na Nanog in Oct4 promotorjih v induciranih celičnih linijah, v primerjavi z originalnimi fibroblasti, ki kažejo veliko večjo metiliranosti. Se pa vzorec pogostosti metiliranja sovpada s tistim iz ES celic – kar kaže na potek epigenetskega reprogramiranja. Povečana stopnja demetilacije najverjetneje kaže na povečano stopnjo transkripcije pluripotentnih markerjev. <br /> Z uporabo PCR tehnike unikatnih mikrosatelitov se je dokazal izvor celic iz miši, ki je izključno iz pluripotentnih celičnih linij. Z kvantitativno reverzno PCR tehniko se je tudi tu dokazovala ekspresija štirih reprogramijajočih faktorjev.<br /> Analiza preko mikročipov je pokazala, da je ekspresija pluripotentnih markerjev podobna med iPS celicami in ES celicami, se pa izključuje z izvornimi fibroblastnimi celicami.<br /> <br /> Našemu sistemu zagotavljanja pluripotentnosti so bile dovedene genetske izboljšave. Na podlagi ugotavljanja epigenetskega statusa pluripotentnih celic iz celičnih linij, izražanju specifičnih pluripotentnih markerjev, dokazovanju izvora celic, specifičnosti sistema ter stopnje reprogramiranja so se dokazale številne izboljšave ter podprle polni pluripotentni status iPS celic.<br /> <br /> ==Preverjanje funkcionalne in razvojne pluripotentnosti==<br /> <br /> ===Funkcionalna pluripotentnost===<br /> <br /> Z določenimi metodami se preverja sposobnost diferenciacije celic v vse tri zarodne plasti, kar nakazuje na velik diferenciacijski potencial.<br /> <br /> Te raziskave lahko potekajo ''in vitro'', ena takih je oblikovanje embrioidnih teles. To so tridimenzionalni agregati matičnih celic, ki se spontano oblikujejo v suspenziji. Z njihovo pomočjo se oceni sposobnost diferenciacije in razvoja v vse tri zarodne plasti, vendar pa ne nakazujejo na izoblikovanje celic v strukture in tkiva.<br /> <br /> Pogosto se uporablja ''in vivo'' metoda, pri kateri se tvori teratom. Pri tem testu v miš, ki trpi za hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo (okvarjeni so limfociti T in B), injiciramo preiskovane iPS celice. Če so le-te pluripotentne, se razvijejo v teratom; tumor, ki vsebuje različne celice vseh treh zarodnih plasti.<br /> <br /> ===Razvojna pluripotentnost===<br /> <br /> To je najvišja raven pluripotentnosti, s katero se preverja sposobnost razvoja iPS celic v vse celične tipe odraslega organizma, vključno s spolnimi celicami.<br /> <br /> Ena od pogosto uporabljenih metod je tvorba himer. Himere so organizmi, ki so sestavljeni iz vsaj dveh vrst genetsko različnih celic in nastanejo pri spojitvi celic iz vsaj dveh zarodkov. Za namene raziskav iPS celic se himerne miši pripravijo z agregacijo preiskovanih matičnih celic z embrijem v 8-celičnem stadiju ali injiciranjem matičnih celic v blastocisto. Ta se nato prenese v mišjo samico, ki povrže himerne mladiče. Ti so glede na genetsko sestavo nekakšna mešanica obeh vrst uporabljenih celic. Injicirane matične celice prispevajo le k razvoju zarodka, ne pa tudi k nastanku izvenembrionalnih tkiv (placente).<br /> V obravnavanih raziskavah so za pripravo iPS celic uporabili embrionalne fibroblaste iz miši s črnim kožuhom, nato pa so iPS celice injicirali v blastocisto albino miši. Rojeni mladiči so imeli značilen lisast kožuh (črne in bele barve).<br /> <br /> Za najstrožji in najzahtevnejši test dokazovanja pluripotentnosti velja test tetraploidne komplementacije. Z uporabo električnega toka poteče pfuzija dveh zarodkov v 2-celičnem stadiju in tako nastane tetraploidna blastocista, iz katere se lahko diferencirajo izvenembrionalna tkiva, ne more pa se razviti zarodek. Šele z vnosom diploidnih matičnih celic v tetraploidno blastocisto omogočimo normalen razvoj zarodka, katerega celice izhajajo izključno iz injiciranih matičnih celic, placenta pa iz tetraploidnih celic.<br /> V raziskavah je tetraploidna blastocista izhajala iz albino miši, prav take vrste pa je bila tudi samica, v katero so vsadili tetraploidno celico z vnesenimi iPS celicami. Dobljene miši so bile izključno rjave barve, tako kot tiste, iz katerih so izolirali embrionalne fibroblaste za pripravo iPS celic, kar potrjuje, da celice organizma izhajajo le iz vnesenih iPS celic.<br /> <br /> Po uspešni tvorbi himer in tetraploidni komplementaciji se dobljene mišje samce pari s samicami. Z metodo prenosa genskega materiala se preverja, ali lahko iPS celice prispevajo tudi k razvoju funkcionalnih spolnih celic, ki so odgovorne za nastanek viabilnih potomcev.<br /> <br /> ==Odstotek viabilnosti in uspešnosti kloniranja==<br /> <br /> Odstotek preživelih v prvih uspešnih poskusih kloniranja miši iz induciranih pluripotentnih celic variira od 0,3% do 13% (odvisno od celične linije). Uspešnost kloniranja je podobna uspešni tetraploidne komplementacije z ES celicami ter SCNT-ES metodi. Večina preživelih osebkov ni kazala morfoloških defektov. Pri umrlih osebkih pa so se tipično kazale težave z dihanjem, ki je pogosta v tetraploidni komplementaciji z ES celicami.<br /> Kloniranje je pogosto kazalo morfološke abnormalnosti kot so težave pri dihanju, neonatalna prekomerna velikost ter splošno velik odstotek smrtnosti in neuspešnosti. Največji razlog se gotovo skriva v nepopolnem reprogramiranju celic uporabljenih za kloniranje in nepravilnim epigenetskim profilom. Samo področje je slabo raziskano.<br /> Študije so kljub temu pokazale da neonatalno prekomerno velikost povzroča tehnika kloniranja prenosa jedra (SCNT metoda). Prav tako so pokazale, da je povečana abnormalnost pri dihanju in večja smrtnost prisotna pri osebkih z nižjo stopnjo heterozigotnosti.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> Zaenkrat še ni znan univerzalen set označevalcev, ki bi nakazoval na popolno pluripotentnost iPS celic. Tetraploidna komplementacija zato ostaja najbolj primeren test za ocenjevanje sposobnosti iPS celic za razvoj v vse celične linije nekega organizma. Z uspešno pomnoženimi mišimi s testom tetraploidne komplementacije so dokazali, da je z direktnim reprogramiranjem s 4 faktorji možno ustvariti iPS celice, ki so funkcionalno primerljive z embrionalnimi celicami. Dokazana pa je tudi ”uspešnost” metode tetraploidne komplementacije z iPS celicami za pridobivanje odraslih miši iz diferenciranih celic.<br /> <br /> Še vedno pa ni povsem jasno, kaj povzroča razlike v pluripotentnosti med iPS celičnimi linijami. Raziskovalci domnevajo, da so za to odgovorne specifične značilnosti reprogramiranih celičnih linij. V prihodnosti bi bilo potrebno nameniti pozornost tudi delno reprogramiranim in manj pluripotentnim celičnim linijam, ki ne ustvarijo viabilnih miši pri testu tetraploidne komplementacije (zadoščajo pa katerim drugim kriterijem pluripotentnosti), saj bi z njihovim preučevanjem lahko odkrili razlike in mehanizme reprogramiranja na molekularni ravni.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> *Boland M.J. in sod. Adult mice generated from induced pluripotent stem cells. ''Nature'', 2009, številka 461, str. 91-94<br /> *Kang L. in Gao S. Pluripotency of induced pluripotent stem cells. ''Journal of animal science and biotechnology'', 2012, letnik 3, številka 5.<br /> *Smith K.P. in sod. Pluripotency: Toward a Gold Standard for Human ES and iPS Cells. ''Journal of Cell Physiology'', 2009, številka 220, str. 21-29<br /> *Stadtfeld M. in sod. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. ''Genes Dev''., 2010, letn. 24, str. 2239-2263.<br /> *Zhao X.Y. in sod. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. ''Nature'', 2009, številka 461, str. 86-90<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Kloniranje_mi%C5%A1i_iz_iPSC&diff=8198 2013-06-03T15:35:14Z

<p>AnaGrom: /* Pridobivanje celičnih linij (2. primer) */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> <br /> Odrasle diferencirane celice lahko z uporabo majhnega števila določenih transkripcijskih faktorjev reprogramiramo oz. spremenimo v inducirane pluripotentne matične celice (iPS celice), ki so v marsičem podobne embrionalnim matičnim celicam (ES celice). Z iPS celicami bi bilo možno zdraviti različne degenerativne in genetske bolezni, nadomeščati poškodovana tkiva, uporabne bi bile kot modeli za raziskave bolezni, pri vsem tem pa ne bi prišlo do etično sporne uporabe embrionalnih celic. Vendar pa imajo iPSC tudi določene slabosti; v nekaterih raziskavah so se izkazale za tumorigene in nagnjene k hitrejšemu celičnemu staranju.<br /> <br /> Pojavljalo pa se je tudi vprašanje o njihovi pluripotentnosti, saj je to ena od bistvenih značilnosti matičnih celic. Pluripotentne matične celice prispevajo k razvoju vseh treh zarodnih plasti (endoderma, mezoderma in ektoderma) in so se tako sposobne razviti v vse celice zarodka, ne morejo pa tvoriti izvenembrionalnih tkiv.<br /> <br /> ES celice so se izkazale kot bolj učikovite pri kloniranju. V naslednjih raziskavah se poroča o uspehih kloniranja živih miši iz reprogramiranih fibroblastov, kar kaže na to, da so lahko vse značilnosti stopnje pluripotentosti nadomeščene brez izpostavljanja neznanim ooplazemskim faktorjem. Primerjanje teh polno pluripotentnih iPS celičnih linij bo lahko pokazalo molekulske markerje potrebne za pluripotentna stanja.<br /> <br /> ==Preverjanje pluripotentnosti z genetskimi in celičnimi analizami==<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (1. primer)===<br /> <br /> V prvem primeru so se najprej lotili načrtovanja genetske oznake za razlikovanje izvora celic iz blastociste ali iPS celic. Mišje embriontske fibroblaste se je pridobilo s križanjem dveh mišjih trangenih linij (Pchd21/Cre ter Z/EG).<br /> *Z/EG linija vsebuje v večini celici viden ter selektiven marker ß-GEO (fuzija gena za ß-galaktozidazo ter gena za rezistenco na neomicin; tu pride lahko do detekcije aktivnega encime ß-galaktozidaze preko X-galaktoze, kjer se tvori modro obarvan produkt, ali pa se kot selekcijski marker uporabi odpornost klonov proti neomicinu; v raziskavi se je uporabil prvi marker).<br /> *Pchd21/Cre linija; promotor protokadherina 21(katerega ekspresija je značilna predvsem za dva tipa nevronov pri vohalnem sistemu v glomerulu) podpira ekspresijo Cre rekombinaze (je specifična rekombinaza, ki katalizira specifično rekombinacijo na točno določenem mestu v DNA).<br /> Tako je prišlo pri kombiniranju celičnih linij pri sveh tipih vohalnih nevronov miši, zaradi delovanja Cre rekombinaze do izreza »floksiranega« ß-geo gena, kar pa je kot za posledico imelo izražanje GFP (zelenega fluoscirajočega proteina).<br /> <br /> Nepravilno izražanje reprogramirajočih genov skozi razvoj bi lahko inhibiral embionalni in poporodni razvoj. Odločili so se za tesno kontrolo trangene ekspresije v iPS celicah. Štiri »Yamanaka« faktorje (Oct4, Klf4, Sox2 in Myc-c) so prenesli v celice preko retrovirusa ter ih postavili pod okrilje tetO promotorja (prepis pod tem promotorjem se inducira v prisotnosti antibiotika tetraciklina ali njegovih derivatov (npr. doksiciklina)). V našem sistemu je sistem aktiviran preko izboljšane verzije reverznega tetraciklin transaktivatorja (rtTAM2.2), v prisotnosti doksiciklina. Da bi se vpodbudila še večja učinkovitost reprogramiranja in izolacija popolno reprogramiranih iPS celic so izpostavili mišje embironalne fibroblaste valproični kislini, za katero se je izkazalo, da poveča reprogramsko učinkovitost in inhibicira nepopolnoma reprogramiranih celic z inhibicijo njihovih celičnih delitev.<br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (1. primer)===<br /> <br /> Z reprogramiranjem Pcdh21/cre-Z/EG fibroblastov se je po 5 dneh v prisotnosti doksiciklina in VPA ter po 7 dneh le v prisotnosti doksiciklina razvilo 21 celičnih linij, označenih z oznakami iMZ1-21.<br /> Ker univerzalnega testa za ugotavljanje pluripotetnosti še ni, so izvedli vrsto testiranj, na podlagi katerih so izbrali celične linije primerne za test tetraploidne komplementacije. <br /> <br /> Glede na morfologijo oz. nenormalno širjenje so zavrgli 9 celičnih linij, ostalih 15 pa testirali z imonofluorescenco za ekspresijo markerjev za pluripotentnost (Sox2, Oct4). <br /> Vse linije so vsebovale izražene markerje prav tako so se iz vseh razvila embrionalna telesa, pri katerih so testirali sposobnost tvorbe mišjih vohalnih nevronov. Celične linije so razdelili v 2 skupini: tiste, ki so razvile veliko število mišjih vohalnih nevronov: celične linije iMZ2, iMZ10, iMZ12, iMZ13, iMZ18, iMZ11, iMZ14, iMZ17, iMZ20 in iMZ21 ter skupino celičnih linij, ki so razvile malo vohalnih nevronov: iMZ3, iMZ15, iMZ7, iMZ9.<br /> V nadaljnjih testiranjih so linije primerjali s kontrolno skupino embrionalnih celic z imunooznačevanjem treh pluripotentnih markerjev za:<br /> <br /> Nanog, ki je transkripcijski faktor za Rex1 promotor ter je ključnega pomena za ohranjanje pluripotentnosti (Rex1 je prav tako eden izmed markerjev za pluripotentnost, njegova količina močno upade ob začetku diferenciacije celic) <br /> <br /> Oct4, ta transkripcijski faktor je aktiven predvsem v oocitih, ostaja pa prisoten tudi v embriih. Pojavlja se tudi v nediferenciranih celicah tumorjev, utišanje njegovega gena pa pripelje do diferenciacije celic.<br /> <br /> Anti - SSEA-1: ob začetku diferenciacije celic se izražanje SSEA-1 gena močno poveča, antigene za SSEA-1 oz. drugače imenovanemu tudi CD15 najdemo v zarodnih oz. embrionalnih celicah glodavcev ter njihovih rakavih celicah.<br /> <br /> Na podlagi teh markerjev so ugotavljali podrobnosti z embrionalnimi celicami ter izbrali 7 celičnih linij, ki so se v podobnosti ujemale z embrionalnimi celicami in posledično razlikovale od fibroblastov iz katerih so reprogramirali iPS celice. <br /> 4 od 7 celičnih linij so razvile veliko mišjih vohalnih nevronov (iMZ9, iMZ11, iMZ14, iMZ17 in iMZ21). To skupino ter skupino linij, ki so bile pozitivne na vse pluripotentne markerje, vendar so razvile relativno nizko število vohalnih nevronov so izbrali za nadaljnje analize kariotipa. <br /> Štiri od osmih linij so bile euploidne (iMZ9, iMZ11, iMZ15 in iMZ21) ter tako primerne za uporabo v testu tetraploidne komplementacije.<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (1. primer)===<br /> <br /> Preko detekcije ß-galaktozidaze v mišjih tkivih (obarvanje celic iz celičnih linij in negativni rezultat pri celicah blastocist), PCR tehnike za detekcijo mikrosatelitnih markerjev in PCR tehnike za ugotavljanje prisotnosti albino (donor blastociste je albino osebek) mutacije na Tyr genu so dokazali, da konstitucija celic v mišjih osebkih izhaja izključno iz celice celičnih linij in so se vsa tkiva razvila izključno iz pluripotentnih celic.<br /> Southern blot analiza za Oct4 in rtTAM2.2 je pokazala vzorec provirusne integracije, ki je identična vzorcem integracije iz iPS celičnih linij. Nobena do sedaj znana ES celična linija ne vsebuje dane genetske modfikacije, kar kaže na to, da ni prišlo do kontaminacije z nobeno prej obstajajočo ES celično linijo.<br /> Kvantitativna PCR z reverzno transkripcijo (qRT-PCR) je pokazala skoraj popolno utišanost provirusnih transgenov pri iPSC celicah v odsotnosti doksicilkina. Celične linije so se ponovno tretirale z doksiciklinom. Iz celičnih linij, iz katerih je izšlo večina iPS miši je v odsotnosti doksiciklina bila prisotna reducirana ekspresija vseh 4ih reprogamirajočih faktorjev. Medtem ko je pri manj uspešnih linijah prišlo do zaznavne detekcije ekspresije Oct4 in /ali Klf4; kar kaže na nepopolno reprogramiranje manj uspešnih celičnih linij.<br /> Specifičnost sistema se je potrdila tudi z imunoflorescenčno analizo nevronov za percepcijo vonja, ki je kazala pozitivno bravanje za ß-galaktozidazo razen dveh tipov nevronov kjer je bila prisotna ekspresija GFP.<br /> <br /> Mnogo izboljšav je lahko odgovornih za dano pluripotentnost celičnih linij.<br /> 1.) Visoka stopnja indukcije transgena preko rtTAM2.2 in daljši čas ekspresije reprogramijajočih faktorjev kot navadno (več časa za bolj popolno reprogramiranje)<br /> 2.) Reguliranje ekspresije našega transgena preko doksiciklina, kar je pomagalo preprečiti nepravilno ekspresijo reprogramijajočih faktorjev skozi embrionalni razvoj<br /> 3.) Daljša terapija z valproično kislino je lahko omogočila reprogramiranje epigenoma v stanje kromatina bolj podobnemu tistemu v ES celicah<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (2. primer)===<br /> <br /> V drugem primeru so mišje embrionalne fibroblaste ki odražajo Oct4 z GFP okužili (preko retrovirusa) z “Yamanaka” faktorji. Druga modifikacija je vključevala zamenjavo seruma v katerem se celice gojijo s fetalnim govejim serumom. <br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (2. primer)===<br /> <br /> Na gojiščih na katerih so gojili mišje embrionalne fibroblaste, v katere so prenesli &quot;Yamanaka faktorje&quot;, so po 10 dneh zaznali večjo količino alkalne fosfataze, katere povišana količina se pojavlja v membrani pluripotentih celic ter med drugim služi kot test pluripotentonost. Prav tako so zaznali zeleni fluorescirajoči protein (GPF), ki je kazal na prisotnost Oct4 (katerega količina upade ob začetku diferenciacije celic).<br /> <br /> Celice so iz gojišča odvzeli po 14 dneh, (celične linije IP14D), 20 dneh (celične linije IP20D) in 36 dneh (celične linije IP36D) ter na tak način pridobili 31 stabilnih, diploentnih celičnih linij s 40 kromosomi.<br /> <br /> Test z bisulfidnim skevenciranjem je v treh od pridobljenih celičnih linij (IP20D-3, IP36D-3 ter IP14D-1) pokazal podoben metilacijski vzorec kot vzorec kontrolne skupine embrionalnih celic, h krati pa se je močno razlikoval od mišjih embrionalnih fibroblastov, iz katerih so z reprogramiranjem pridobili zgoraj omenjene pluripotentne celične linije. <br /> Pluripotentnost teh linij so dokazali tudi z vnosom le teh v miši s hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo pri katerih se je razvil teratom z vsemi tremi zarodnimi plastmi. <br /> <br /> Za nadaljnjo testiranje pluripotentnosti so naključno izbrali celične linije ter jih vključili v normalno CD-1 blastocisto ter jo prenesli v CD-1 samico miši, ter opazovali razvoj embriov do mladičev.<br /> Rezultati so pokazali da celične linije IP36D in IP20D razvijejo žive miši z 5-80% himernostjo, linije IP14D pa miši z 10-95% himernostjo. <br /> Kloniranje miši s tetraploidno komplementacijo ni bilo enako uspešno pri vseh celičnih linijah, iz celičnih linij IP36D so se sicer razvili embrii, ki pa so v 10. dnevu razvoja umrli. Celične linije IP20D prav tako niso razvile živih mladičev oz. embriov starejših od 17 dni, med tem ko se je iz celičnih linij IP14D razvilo tudi do 22 živih mladičev. <br /> Rezultati celične linije IP14D-1 so bili celo primerljivi z rezultati kontrolne skupine z embrionalnimi celicami (v obeh primerih se je razvilo približno 3% živih mladičev).<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (2. primer)===<br /> <br /> Bisulfitno sekveniranje pa je pokazalo demetilacijo na Nanog in Oct4 promotorjih v induciranih celičnih linijah, v primerjavi z originalnimi fibroblasti, ki kažejo veliko večjo metiliranosti. Se pa vzorec pogostosti metiliranja sovpada s tistim iz ES celic – kar kaže na potek epigenetskega reprogramiranja. Povečana stopnja demetilacije najverjetneje kaže na povečano stopnjo transkripcije pluripotentnih markerjev. <br /> Z uporabo PCR tehnike unikatnih mikrosatelitov se je dokazal izvor celic iz miši, ki je izključno iz pluripotentnih celičnih linij. Z kvantitativno reverzno PCR tehniko se je tudi tu dokazovala ekspresija štirih reprogramijajočih faktorjev.<br /> Analiza preko mikročipov je pokazala, da je ekspresija pluripotentnih markerjev podobna med iPS celicami in ES celicami, se pa izključuje z izvornimi fibroblastnimi celicami.<br /> <br /> Našemu sistemu zagotavljanja pluripotentnosti so bile dovedene genetske izboljšave. Na podlagi ugotavljanja epigenetskega statusa pluripotentnih celic iz celičnih linij, izražanju specifičnih pluripotentnih markerjev, dokazovanju izvora celic, specifičnosti sistema ter stopnje reprogramiranja so se dokazale številne izboljšave ter podprle polni pluripotentni status iPS celic.<br /> <br /> ==Preverjanje funkcionalne in razvojne pluripotentnosti==<br /> <br /> ===Funkcionalna pluripotentnost===<br /> <br /> Z določenimi metodami se preverja sposobnost diferenciacije celic v vse tri zarodne plasti, kar nakazuje na velik diferenciacijski potencial.<br /> <br /> Te raziskave lahko potekajo ''in vitro'', ena takih je oblikovanje embrioidnih teles. To so tridimenzionalni agregati matičnih celic, ki se spontano oblikujejo v suspenziji. Z njihovo pomočjo se oceni sposobnost diferenciacije in razvoja v vse tri zarodne plasti, vendar pa ne nakazujejo na izoblikovanje celic v strukture in tkiva.<br /> <br /> Pogosto se uporablja ''in vivo'' metoda, pri kateri se tvori teratom. Pri tem testu v miš, ki trpi za hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo (okvarjeni so limfociti T in B), injiciramo preiskovane iPS celice. Če so le-te pluripotentne, se razvijejo v teratom; tumor, ki vsebuje različne celice vseh treh zarodnih plasti.<br /> <br /> ===Razvojna pluripotentnost===<br /> <br /> To je najvišja raven pluripotentnosti, s katero se preverja sposobnost razvoja iPS celic v vse celične tipe odraslega organizma, vključno s spolnimi celicami.<br /> <br /> Ena od pogosto uporabljenih metod je tvorba himer. Himere so organizmi, ki so sestavljeni iz vsaj dveh vrst genetsko različnih celic in nastanejo pri spojitvi celic iz vsaj dveh zarodkov. Za namene raziskav iPS celic se himerne miši pripravijo z agregacijo preiskovanih matičnih celic z embrijem v 8-celičnem stadiju ali injiciranjem matičnih celic v blastocisto. Ta se nato prenese v mišjo samico, ki povrže himerne mladiče. Ti so glede na genetsko sestavo nekakšna mešanica obeh vrst uporabljenih celic. Injicirane matične celice prispevajo le k razvoju zarodka, ne pa tudi k nastanku izvenembrionalnih tkiv (placente).<br /> V obravnavanih raziskavah so za pripravo iPS celic uporabili embrionalne fibroblaste iz miši s črnim kožuhom, nato pa so iPS celice injicirali v blastocisto albino miši. Rojeni mladiči so imeli značilen lisast kožuh (črne in bele barve).<br /> <br /> Za najstrožji in najzahtevnejši test dokazovanja pluripotentnosti velja test tetraploidne komplementacije. Z uporabo električnega toka poteče pfuzija dveh zarodkov v 2-celičnem stadiju in tako nastane tetraploidna blastocista, iz katere se lahko diferencirajo izvenembrionalna tkiva, ne more pa se razviti zarodek. Šele z vnosom diploidnih matičnih celic v tetraploidno blastocisto omogočimo normalen razvoj zarodka, katerega celice izhajajo izključno iz injiciranih matičnih celic, placenta pa iz tetraploidnih celic.<br /> V raziskavah je tetraploidna blastocista izhajala iz albino miši, prav take vrste pa je bila tudi samica, v katero so vsadili tetraploidno celico z vnesenimi iPS celicami. Dobljene miši so bile izključno rjave barve, tako kot tiste, iz katerih so izolirali embrionalne fibroblaste za pripravo iPS celic, kar potrjuje, da celice organizma izhajajo le iz vnesenih iPS celic.<br /> <br /> Po uspešni tvorbi himer in tetraploidni komplementaciji se dobljene mišje samce pari s samicami. Z metodo prenosa genskega materiala se preverja, ali lahko iPS celice prispevajo tudi k razvoju funkcionalnih spolnih celic, ki so odgovorne za nastanek viabilnih potomcev.<br /> <br /> ==Odstotek viabilnosti in uspešnosti kloniranja==<br /> <br /> Odstotek preživelih v prvih uspešnih poskusih kloniranja miši iz induciranih pluripotentnih celic variira od 0,3% do 13% (odvisno od celične linije). Uspešnost kloniranja je podobna uspešni tetraploidne komplementacije z ES celicami ter SCNT-ES metodi. Večina preživelih osebkov ni kazala morfoloških defektov. Pri umrlih osebkih pa so se tipično kazale težave z dihanjem, ki je pogosta v tetraploidni komplementaciji z ES celicami.<br /> Kloniranje je pogosto kazalo morfološke abnormalnosti kot so težave pri dihanju, neonatalna prekomerna velikost ter splošno velik odstotek smrtnosti in neuspešnosti. Največji razlog se gotovo skriva v nepopolnem reprogramiranju celic uporabljenih za kloniranje in nepravilnim epigenetskim profilom. Samo področje je slabo raziskano.<br /> Študije so kljub temu pokazale da neonatalno prekomerno velikost povzroča tehnika kloniranja prenosa jedra (SCNT metoda). Prav tako so pokazale, da je povečana abnormalnost pri dihanju in večja smrtnost prisotna pri osebkih z nižjo stopnjo heterozigotnosti.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> Zaenkrat še ni znan univerzalen set označevalcev, ki bi nakazoval na popolno pluripotentnost iPS celic. Tetraploidna komplementacija zato ostaja najbolj primeren test za ocenjevanje sposobnosti iPS celic za razvoj v vse celične linije nekega organizma. Z uspešno pomnoženimi mišimi s testom tetraploidne komplementacije so dokazali, da je z direktnim reprogramiranjem s 4 faktorji možno ustvariti iPS celice, ki so funkcionalno primerljive z embrionalnimi celicami. Dokazana pa je tudi ”uspešnost” metode tetraploidne komplementacije z iPS celicami za pridobivanje odraslih miši iz diferenciranih celic.<br /> <br /> Še vedno pa ni povsem jasno, kaj povzroča razlike v pluripotentnosti med iPS celičnimi linijami. Raziskovalci domnevajo, da so za to odgovorne specifične značilnosti reprogramiranih celičnih linij. V prihodnosti bi bilo potrebno nameniti pozornost tudi delno reprogramiranim in manj pluripotentnim celičnim linijam, ki ne ustvarijo viabilnih miši pri testu tetraploidne komplementacije (zadoščajo pa katerim drugim kriterijem pluripotentnosti), saj bi z njihovim preučevanjem lahko odkrili razlike in mehanizme reprogramiranja na molekularni ravni.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> *Boland M.J. in sod. Adult mice generated from induced pluripotent stem cells. ''Nature'', 2009, številka 461, str. 91-94<br /> *Kang L. in Gao S. Pluripotency of induced pluripotent stem cells. ''Journal of animal science and biotechnology'', 2012, letnik 3, številka 5.<br /> *Smith K.P. in sod. Pluripotency: Toward a Gold Standard for Human ES and iPS Cells. ''Journal of Cell Physiology'', 2009, številka 220, str. 21-29<br /> *Stadtfeld M. in sod. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. ''Genes Dev''., 2010, letn. 24, str. 2239-2263.<br /> *Zhao X.Y. in sod. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. ''Nature'', 2009, številka 461, str. 86-90<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Kloniranje_mi%C5%A1i_iz_iPSC&diff=8180 2013-05-28T08:20:05Z

<p>AnaGrom: /* Pridobivanje celičnih linij (2. primer) */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> <br /> Odrasle diferencirane celice lahko z uporabo majhnega števila določenih transkripcijskih faktorjev reprogramiramo oz. spremenimo v inducirane pluripotentne matične celice (iPS celice), ki so v marsičem podobne embrionalnim matičnim celicam (ES celice). Z iPS celicami bi bilo možno zdraviti različne degenerativne in genetske bolezni, nadomeščati poškodovana tkiva, uporabne bi bile kot modeli za raziskave bolezni, pri vsem tem pa ne bi prišlo do etično sporne uporabe embrionalnih celic. Vendar pa imajo iPSC tudi določene slabosti; v nekaterih raziskavah so se izkazale za tumorigene in nagnjene k hitrejšemu celičnemu staranju.<br /> <br /> Pojavljalo pa se je tudi vprašanje o njihovi pluripotentnosti, saj je to ena od bistvenih značilnosti matičnih celic. Pluripotentne matične celice prispevajo k razvoju vseh treh zarodnih plasti (endoderma, mezoderma in ektoderma) in so se tako sposobne razviti v vse celice zarodka, ne morejo pa tvoriti izvenembrionalnih tkiv.<br /> <br /> ES celice so se izkazale kot bolj učikovite pri kloniranju. V naslednjih raziskavah se poroča o uspehih kloniranja živih miši iz reprogramiranih fibroblastov, kar kaže na to, da so lahko vse značilnosti stopnje pluripotentosti nadomeščene brez izpostavljanja neznanim ooplazemskim faktorjem. Primerjanje teh polno pluripotentnih iPS celičnih linij bo lahko pokazalo molekulske markerje potrebne za pluripotentna stanja.<br /> <br /> ==Preverjanje pluripotentnosti z genetskimi in celičnimi analizami==<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (1. primer)===<br /> <br /> V prvem primeru so se najprej lotili načrtovanja genetske oznake za razlikovanje izvora celic iz blastociste ali iPS celic. Mišje embriontske fibroblaste se je pridobilo s križanjem dveh mišjih trangenih linij (Pchd21/Cre ter Z/EG).<br /> *Z/EG linija vsebuje v večini celici viden ter selektiven marker ß-GEO (fuzija gena za ß-galaktozidazo ter gena za rezistenco na neomicin; tu pride lahko do detekcije aktivnega encime ß-galaktozidaze preko X-galaktoze, kjer se tvori modro obarvan produkt, ali pa se kot selekcijski marker uporabi odpornost klonov proti neomicinu; v raziskavi se je uporabil prvi marker).<br /> *Pchd21/Cre linija; promotor protokadherina 21(katerega ekspresija je značilna predvsem za dva tipa nevronov pri vohalnem sistemu v glomerulu) podpira ekspresijo Cre rekombinaze (je specifična rekombinaza, ki katalizira specifično rekombinacijo na točno določenem mestu v DNA).<br /> Tako je prišlo pri kombiniranju celičnih linij pri sveh tipih vohalnih nevronov miši, zaradi delovanja Cre rekombinaze do izreza »floksiranega« ß-geo gena, kar pa je kot za posledico imelo izražanje GFP (zelenega fluoscirajočega proteina).<br /> <br /> Nepravilno izražanje reprogramirajočih genov skozi razvoj bi lahko inhibiral embionalni in poporodni razvoj. Odločili so se za tesno kontrolo trangene ekspresije v iPS celicah. Štiri »Yamanaka« faktorje (Oct4, Klf4, Sox2 in Myc-c) so prenesli v celice preko retrovirusa ter ih postavili pod okrilje tetO promotorja (prepis pod tem promotorjem se inducira v prisotnosti antibiotika tetraciklina ali njegovih derivatov (npr. doksiciklina)). V našem sistemu je sistem aktiviran preko izboljšane verzije reverznega tetraciklin transaktivatorja (rtTAM2.2), v prisotnosti doksiciklina. Da bi se vpodbudila še večja učinkovitost reprogramiranja in izolacija popolno reprogramiranih iPS celic so izpostavili mišje embironalne fibroblaste valproični kislini, za katero se je izkazalo, da poveča reprogramsko učinkovitost in inhibicira nepopolnoma reprogramiranih celic z inhibicijo njihovih celičnih delitev.<br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (1. primer)===<br /> <br /> Z reprogramiranjem Pcdh21/cre-Z/EG fibroblastov se je po 5 dneh v prisotnosti doksiciklina in VPA ter po 7 dneh le v prisotnosti doksiciklina razvilo 21 celičnih linij, označenih z oznakami iMZ1-21.<br /> Ker univerzalnega testa za ugotavljanje pluripotetnosti še ni, so izvedli vrsto testiranj, na podlagi katerih so izbrali celične linije primerne za test tetraploidne komplementacije. <br /> <br /> Glede na morfologijo oz. nenormalno širjenje so zavrgli 9 celičnih linij, ostalih 15 pa testirali z imonofluorescenco za ekspresijo markerjev za pluripotentnost (Sox2, Oct4). <br /> Vse linije so vsebovale izražene markerje prav tako so se iz vseh razvila embrionalna telesa, pri katerih so testirali sposobnost tvorbe mišjih vohalnih nevronov. Celične linije so razdelili v 2 skupini: tiste, ki so razvile veliko število mišjih vohalnih nevronov: celične linije iMZ2, iMZ10, iMZ12, iMZ13, iMZ18, iMZ11, iMZ14, iMZ17, iMZ20 in iMZ21 ter skupino celičnih linij, ki so razvile malo vohalnih nevronov: iMZ3, iMZ15, iMZ7, iMZ9.<br /> V nadaljnjih testiranjih so linije primerjali s kontrolno skupino embrionalnih celic z imunooznačevanjem treh pluripotentnih markerjev za:<br /> <br /> Nanog, ki je transkripcijski faktor za Rex1 promotor ter je ključnega pomena za ohranjanje pluripotentnosti (Rex1 je prav tako eden izmed markerjev za pluripotentnost, njegova količina močno upade ob začetku diferenciacije celic) <br /> <br /> Oct4, ta transkripcijski faktor je aktiven predvsem v oocitih, ostaja pa prisoten tudi v embriih. Pojavlja se tudi v nediferenciranih celicah tumorjev, utišanje njegovega gena pa pripelje do diferenciacije celic.<br /> <br /> Anti - SSEA-1: ob začetku diferenciacije celic se izražanje SSEA-1 gena močno poveča, antigene za SSEA-1 oz. drugače imenovanemu tudi CD15 najdemo v zarodnih oz. embrionalnih celicah glodavcev ter njihovih rakavih celicah.<br /> <br /> Na podlagi teh markerjev so ugotavljali podrobnosti z embrionalnimi celicami ter izbrali 7 celičnih linij, ki so se v podobnosti ujemale z embrionalnimi celicami in posledično razlikovale od fibroblastov iz katerih so reprogramirali iPS celice. <br /> 4 od 7 celičnih linij so razvile veliko mišjih vohalnih nevronov (iMZ9, iMZ11, iMZ14, iMZ17 in iMZ21). To skupino ter skupino linij, ki so bile pozitivne na vse pluripotentne markerje, vendar so razvile relativno nizko število vohalnih nevronov so izbrali za nadaljnje analize kariotipa. <br /> Štiri od osmih linij so bile euploidne (iMZ9, iMZ11, iMZ15 in iMZ21) ter tako primerne za uporabo v testu tetraploidne komplementacije.<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (1. primer)===<br /> <br /> Preko detekcije ß-galaktozidaze v mišjih tkivih (obarvanje celic iz celičnih linij in negativni rezultat pri celicah blastocist), PCR tehnike za detekcijo mikrosatelitnih markerjev in PCR tehnike za ugotavljanje prisotnosti albino (donor blastociste je albino osebek) mutacije na Tyr genu so dokazali, da konstitucija celic v mišjih osebkih izhaja izključno iz celice celičnih linij in so se vsa tkiva razvila izključno iz pluripotentnih celic.<br /> Southern blot analiza za Oct4 in rtTAM2.2 je pokazala vzorec provirusne integracije, ki je identična vzorcem integracije iz iPS celičnih linij. Nobena do sedaj znana ES celična linija ne vsebuje dane genetske modfikacije, kar kaže na to, da ni prišlo do kontaminacije z nobeno prej obstajajočo ES celično linijo.<br /> Kvantitativna PCR z reverzno transkripcijo (qRT-PCR) je pokazala skoraj popolno utišanost provirusnih transgenov pri iPSC celicah v odsotnosti doksicilkina. Celične linije so se ponovno tretirale z doksiciklinom. Iz celičnih linij, iz katerih je izšlo večina iPS miši je v odsotnosti doksiciklina bila prisotna reducirana ekspresija vseh 4ih reprogamirajočih faktorjev. Medtem ko je pri manj uspešnih linijah prišlo do zaznavne detekcije ekspresije Oct4 in /ali Klf4; kar kaže na nepopolno reprogramiranje manj uspešnih celičnih linij.<br /> Specifičnost sistema se je potrdila tudi z imunoflorescenčno analizo nevronov za percepcijo vonja, ki je kazala pozitivno bravanje za ß-galaktozidazo razen dveh tipov nevronov kjer je bila prisotna ekspresija GFP.<br /> <br /> Mnogo izboljšav je lahko odgovornih za dano pluripotentnost celičnih linij.<br /> 1.) Visoka stopnja indukcije transgena preko rtTAM2.2 in daljši čas ekspresije reprogramijajočih faktorjev kot navadno (več časa za bolj popolno reprogramiranje)<br /> 2.) Reguliranje ekspresije našega transgena preko doksiciklina, kar je pomagalo preprečiti nepravilno ekspresijo reprogramijajočih faktorjev skozi embrionalni razvoj<br /> 3.) Daljša terapija z valproično kislino je lahko omogočila reprogramiranje epigenoma v stanje kromatina bolj podobnemu tistemu v ES celicah<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (2. primer)===<br /> <br /> V drugem primeru so mišje embrionalne fibroblaste ki odražajo Oct4 z GFP okužili (preko retrovirusa) z “Yamanaka” faktorji. Druga modifikacija je vključevala zamenjavo seruma v katerem se celice gojijo s fetalnim govejim serumom. <br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (2. primer)===<br /> <br /> Na gojiščih na katerih so gojili mišje embrionalne fibroblaste, v katere so prenesli &quot;Yamanaka faktorje&quot;, so po 10 dneh zaznali večjo količino alkalne fosfataze, katere povišana količina se pojavlja v membrani pluripotentih celic ter med drugim služi kot test pluripotentonost. Prav tako so zaznali zeleni fluorescirajoči protein (GPF), ki je kazal na prisotnost Oct4 (katerega količina upade ob začetku diferenciacije celic).<br /> <br /> Celice so iz gojišča odvzeli po 14 dneh, (celične linije IP14D), 20 dneh (celične linije IP20D) in 36 dneh (celične linije IP36D) ter na tak način pridobili 31 stabilnih, diploentnih celičnih linij s 40 kromosomi.<br /> <br /> Test bisulfidne metilacije je v treh od pridobljenih celičnih linij (IP20D-3, IP36D-3 ter IP14D-1) pokazal demetilacijo promotorjev Oct4 in Nanog, vzorec katere je bil zelo podoben demetilaciji kontrolne skupine embrionalnih celic, h krati pa se je močno razlikoval od mišjih embrionalnih fibroblastov, iz katerih so z reprogramiranjem pridobili zgoraj omenjene pluripotentne celične linije. <br /> Pluripotentnost teh linij so dokazali tudi z vnosom le teh v miši s hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo pri katerih se je razvil teratom z vsemi tremi zarodnimi plastmi. <br /> <br /> Za nadaljnjo testiranje pluripotentnosti so naključno izbrali celične linije ter jih vključili v normalno CD-1 blastocisto ter jo prenesli v CD-1 samico miši, ter opazovali razvoj embriov do mladičev.<br /> Rezultati so pokazali da celične linije IP36D in IP20D razvijejo žive miši z 5-80% himernostjo, linije IP14D pa miši z 10-95% himernostjo. <br /> Kloniranje miši s tetraploidno komplementacijo ni bilo enako uspešno pri vseh celičnih linijah, iz celičnih linij IP36D so se sicer razvili embrii, ki pa so v 10. dnevu razvoja umrli. Celične linije IP20D prav tako niso razvile živih mladičev oz. embriov starejših od 17 dni, med tem ko se je iz celičnih linij IP14D razvilo tudi do 22 živih mladičev. <br /> Rezultati celične linije IP14D-1 so bili celo primerljivi z rezultati kontrolne skupine z embrionalnimi celicami (v obeh primerih se je razvilo približno 3% živih mladičev).<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (2. primer)===<br /> <br /> Bisulfitno sekveniranje pa je pokazalo demetilacijo na Nanog in Oct4 promotorjih v induciranih celičnih linijah, v primerjavi z originalnimi fibroblasti, ki kažejo veliko večjo metiliranosti. Se pa vzorec pogostosti metiliranja sovpada s tistim iz ES celic – kar kaže na potek epigenetskega reprogramiranja. Povečana stopnja demetilacije najverjetneje kaže na povečano stopnjo transkripcije pluripotentnih markerjev. <br /> Z uporabo PCR tehnike unikatnih mikrosatelitov se je dokazal izvor celic iz miši, ki je izključno iz pluripotentnih celičnih linij. Z kvantitativno reverzno PCR tehniko se je tudi tu dokazovala ekspresija štirih reprogramijajočih faktorjev.<br /> Analiza preko mikročipov je pokazala, da je ekspresija pluripotentnih markerjev podobna med iPS celicami in ES celicami, se pa izključuje z izvornimi fibroblastnimi celicami.<br /> <br /> Našemu sistemu zagotavljanja pluripotentnosti so bile dovedene genetske izboljšave. Na podlagi ugotavljanja epigenetskega statusa pluripotentnih celic iz celičnih linij, izražanju specifičnih pluripotentnih markerjev, dokazovanju izvora celic, specifičnosti sistema ter stopnje reprogramiranja so se dokazale številne izboljšave ter podprle polni pluripotentni status iPS celic.<br /> <br /> ==Preverjanje funkcionalne in razvojne pluripotentnosti==<br /> <br /> ===Funkcionalna pluripotentnost===<br /> <br /> Z določenimi metodami se preverja sposobnost diferenciacije celic v vse tri zarodne plasti, kar nakazuje na velik diferenciacijski potencial.<br /> <br /> Te raziskave lahko potekajo ''in vitro'', ena takih je oblikovanje embrioidnih teles. To so tridimenzionalni agregati matičnih celic, ki se spontano oblikujejo v suspenziji. Z njihovo pomočjo se oceni sposobnost diferenciacije in razvoja v vse tri zarodne plasti, vendar pa ne nakazujejo na izoblikovanje celic v strukture in tkiva.<br /> <br /> Pogosto se uporablja ''in vivo'' metoda, pri kateri se tvori teratom. Pri tem testu v miš, ki trpi za hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo (okvarjeni so limfociti T in B), injiciramo preiskovane iPS celice. Če so le-te pluripotentne, se razvijejo v teratom; tumor, ki vsebuje različne celice vseh treh zarodnih plasti.<br /> <br /> ===Razvojna pluripotentnost===<br /> <br /> To je najvišja raven pluripotentnosti, s katero se preverja sposobnost razvoja iPS celic v vse celične tipe odraslega organizma, vključno s spolnimi celicami.<br /> <br /> Ena od pogosto uporabljenih metod je tvorba himer. Himere so organizmi, ki so sestavljeni iz vsaj dveh vrst genetsko različnih celic in nastanejo pri spojitvi celic iz vsaj dveh zarodkov. Za namene raziskav iPS celic se himerne miši pripravijo z agregacijo preiskovanih matičnih celic z embrijem v 8-celičnem stadiju ali injiciranjem matičnih celic v blastocisto. Ta se nato prenese v mišjo samico, ki povrže himerne mladiče. Ti so glede na genetsko sestavo nekakšna mešanica obeh vrst uporabljenih celic. Injicirane matične celice prispevajo le k razvoju zarodka, ne pa tudi k nastanku izvenembrionalnih tkiv (placente).<br /> V obravnavanih raziskavah so za pripravo iPS celic uporabili embrionalne fibroblaste iz miši s črnim kožuhom, nato pa so iPS celice injicirali v blastocisto albino miši. Rojeni mladiči so imeli značilen lisast kožuh (črne in bele barve).<br /> <br /> Za najstrožji in najzahtevnejši test dokazovanja pluripotentnosti velja test tetraploidne komplementacije. Z uporabo električnega toka poteče pfuzija dveh zarodkov v 2-celičnem stadiju in tako nastane tetraploidna blastocista, iz katere se lahko diferencirajo izvenembrionalna tkiva, ne more pa se razviti zarodek. Šele z vnosom diploidnih matičnih celic v tetraploidno blastocisto omogočimo normalen razvoj zarodka, katerega celice izhajajo izključno iz injiciranih matičnih celic, placenta pa iz tetraploidnih celic.<br /> V raziskavah je tetraploidna blastocista izhajala iz albino miši, prav take vrste pa je bila tudi samica, v katero so vsadili tetraploidno celico z vnesenimi iPS celicami. Dobljene miši so bile izključno rjave barve, tako kot tiste, iz katerih so izolirali embrionalne fibroblaste za pripravo iPS celic, kar potrjuje, da celice organizma izhajajo le iz vnesenih iPS celic.<br /> <br /> Po uspešni tvorbi himer in tetraploidni komplementaciji se dobljene mišje samce pari s samicami. Z metodo prenosa genskega materiala se preverja, ali lahko iPS celice prispevajo tudi k razvoju funkcionalnih spolnih celic, ki so odgovorne za nastanek viabilnih potomcev.<br /> <br /> ==Odstotek viabilnosti in uspešnosti kloniranja==<br /> <br /> Odstotek preživelih v prvih uspešnih poskusih kloniranja miši iz induciranih pluripotentnih celic variira od 0,3% do 13% (odvisno od celične linije). Uspešnost kloniranja je podobna uspešni tetraploidne komplementacije z ES celicami ter SCNT-ES metodi. Večina preživelih osebkov ni kazala morfoloških defektov. Pri umrlih osebkih pa so se tipično kazale težave z dihanjem, ki je pogosta v tetraploidni komplementaciji z ES celicami.<br /> Kloniranje je pogosto kazalo morfološke abnormalnosti kot so težave pri dihanju, neonatalna prekomerna velikost ter splošno velik odstotek smrtnosti in neuspešnosti. Največji razlog se gotovo skriva v nepopolnem reprogramiranju celic uporabljenih za kloniranje in nepravilnim epigenetskim profilom. Samo področje je slabo raziskano.<br /> Študije so kljub temu pokazale da neonatalno prekomerno velikost povzroča tehnika kloniranja prenosa jedra (SCNT metoda). Prav tako so pokazale, da je povečana abnormalnost pri dihanju in večja smrtnost prisotna pri osebkih z nižjo stopnjo heterozigotnosti.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> Zaenkrat še ni znan univerzalen set označevalcev, ki bi nakazoval na popolno pluripotentnost iPS celic. Tetraploidna komplementacija zato ostaja najbolj primeren test za ocenjevanje sposobnosti iPS celic za razvoj v vse celične linije nekega organizma. Z uspešno pomnoženimi mišimi s testom tetraploidne komplementacije so dokazali, da je z direktnim reprogramiranjem s 4 faktorji možno ustvariti iPS celice, ki so funkcionalno primerljive z embrionalnimi celicami. Dokazana pa je tudi ”uspešnost” metode tetraploidne komplementacije z iPS celicami za pridobivanje odraslih miši iz diferenciranih celic.<br /> <br /> Še vedno pa ni povsem jasno, kaj povzroča razlike v pluripotentnosti med iPS celičnimi linijami. Raziskovalci domnevajo, da so za to odgovorne specifične značilnosti reprogramiranih celičnih linij. V prihodnosti bi bilo potrebno nameniti pozornost tudi delno reprogramiranim in manj pluripotentnim celičnim linijam, ki ne ustvarijo viabilnih miši pri testu tetraploidne komplementacije (zadoščajo pa katerim drugim kriterijem pluripotentnosti), saj bi z njihovim preučevanjem lahko odkrili razlike in mehanizme reprogramiranja na molekularni ravni.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> *Boland M.J. in sod. Adult mice generated from induced pluripotent stem cells. ''Nature'', 2009, številka 461, str. 91-94<br /> *Kang L. in Gao S. Pluripotency of induced pluripotent stem cells. ''Journal of animal science and biotechnology'', 2012, letnik 3, številka 5.<br /> *Smith K.P. in sod. Pluripotency: Toward a Gold Standard for Human ES and iPS Cells. ''Journal of Cell Physiology'', 2009, številka 220, str. 21-29<br /> *Stadtfeld M. in sod. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. ''Genes Dev''., 2010, letn. 24, str. 2239-2263.<br /> *Zhao X.Y. in sod. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. ''Nature'', 2009, številka 461, str. 86-90<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Kloniranje_mi%C5%A1i_iz_iPSC&diff=8179 2013-05-28T07:14:19Z

<p>AnaGrom: /* Pridobivanje celičnih linij (2. primer) */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> <br /> Odrasle diferencirane celice lahko z uporabo majhnega števila določenih transkripcijskih faktorjev reprogramiramo oz. spremenimo v inducirane pluripotentne matične celice (iPS celice), ki so v marsičem podobne embrionalnim matičnim celicam (ES celice). Z iPS celicami bi bilo možno zdraviti različne degenerativne in genetske bolezni, nadomeščati poškodovana tkiva, uporabne bi bile kot modeli za raziskave bolezni, pri vsem tem pa ne bi prišlo do etično sporne uporabe embrionalnih celic. Vendar pa imajo iPSC tudi določene slabosti; v nekaterih raziskavah so se izkazale za tumorigene in nagnjene k hitrejšemu celičnemu staranju.<br /> <br /> Pojavljalo pa se je tudi vprašanje o njihovi pluripotentnosti, saj je to ena od bistvenih značilnosti matičnih celic. Pluripotentne matične celice prispevajo k razvoju vseh treh zarodnih plasti (endoderma, mezoderma in ektoderma) in so se tako sposobne razviti v vse celice zarodka, ne morejo pa tvoriti izvenembrionalnih tkiv.<br /> <br /> ES celice so se izkazale kot bolj učikovite pri kloniranju. V naslednjih raziskavah se poroča o uspehih kloniranja živih miši iz reprogramiranih fibroblastov, kar kaže na to, da so lahko vse značilnosti stopnje pluripotentosti nadomeščene brez izpostavljanja neznanim ooplazemskim faktorjem. Primerjanje teh polno pluripotentnih iPS celičnih linij bo lahko pokazalo molekulske markerje potrebne za pluripotentna stanja.<br /> <br /> ==Preverjanje pluripotentnosti z genetskimi in celičnimi analizami==<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (1. primer)===<br /> <br /> V prvem primeru so se najprej lotili načrtovanja genetske oznake za razlikovanje izvora celic iz blastociste ali iPS celic. Mišje embriontske fibroblaste se je pridobilo s križanjem dveh mišjih trangenih linij (Pchd21/Cre ter Z/EG).<br /> *Z/EG linija vsebuje v večini celici viden ter selektiven marker ß-GEO (fuzija gena za ß-galaktozidazo ter gena za rezistenco na neomicin; tu pride lahko do detekcije aktivnega encime ß-galaktozidaze preko X-galaktoze, kjer se tvori modro obarvan produkt, ali pa se kot selekcijski marker uporabi odpornost klonov proti neomicinu; v raziskavi se je uporabil prvi marker).<br /> *Pchd21/Cre linija; promotor protokadherina 21(katerega ekspresija je značilna predvsem za dva tipa nevronov pri vohalnem sistemu v glomerulu) podpira ekspresijo Cre rekombinaze (je specifična rekombinaza, ki katalizira specifično rekombinacijo na točno določenem mestu v DNA).<br /> Tako je prišlo pri kombiniranju celičnih linij pri sveh tipih vohalnih nevronov miši, zaradi delovanja Cre rekombinaze do izreza »floksiranega« ß-geo gena, kar pa je kot za posledico imelo izražanje GFP (zelenega fluoscirajočega proteina).<br /> <br /> Nepravilno izražanje reprogramirajočih genov skozi razvoj bi lahko inhibiral embionalni in poporodni razvoj. Odločili so se za tesno kontrolo trangene ekspresije v iPS celicah. Štiri »Yamanaka« faktorje (Oct4, Klf4, Sox2 in Myc-c) so prenesli v celice preko retrovirusa ter ih postavili pod okrilje tetO promotorja (prepis pod tem promotorjem se inducira v prisotnosti antibiotika tetraciklina ali njegovih derivatov (npr. doksiciklina)). V našem sistemu je sistem aktiviran preko izboljšane verzije reverznega tetraciklin transaktivatorja (rtTAM2.2), v prisotnosti doksiciklina. Da bi se vpodbudila še večja učinkovitost reprogramiranja in izolacija popolno reprogramiranih iPS celic so izpostavili mišje embironalne fibroblaste valproični kislini, za katero se je izkazalo, da poveča reprogramsko učinkovitost in inhibicira nepopolnoma reprogramiranih celic z inhibicijo njihovih celičnih delitev.<br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (1. primer)===<br /> <br /> Z reprogramiranjem Pcdh21/cre-Z/EG fibroblastov se je po 5 dneh v prisotnosti doksiciklina in VPA ter po 7 dneh le v prisotnosti doksiciklina razvilo 21 celičnih linij, označenih z oznakami iMZ1-21.<br /> Ker univerzalnega testa za ugotavljanje pluripotetnosti še ni, so izvedli vrsto testiranj, na podlagi katerih so izbrali celične linije primerne za test tetraploidne komplementacije. <br /> <br /> Glede na morfologijo oz. nenormalno širjenje so zavrgli 9 celičnih linij, ostalih 15 pa testirali z imonofluorescenco za ekspresijo markerjev za pluripotentnost (Sox2, Oct4). <br /> Vse linije so vsebovale izražene markerje prav tako so se iz vseh razvila embrionalna telesa, pri katerih so testirali sposobnost tvorbe mišjih vohalnih nevronov. Celične linije so razdelili v 2 skupini: tiste, ki so razvile veliko število mišjih vohalnih nevronov: celične linije iMZ2, iMZ10, iMZ12, iMZ13, iMZ18, iMZ11, iMZ14, iMZ17, iMZ20 in iMZ21 ter skupino celičnih linij, ki so razvile malo vohalnih nevronov: iMZ3, iMZ15, iMZ7, iMZ9.<br /> V nadaljnjih testiranjih so linije primerjali s kontrolno skupino embrionalnih celic z imunooznačevanjem treh pluripotentnih markerjev za:<br /> <br /> Nanog, ki je transkripcijski faktor za Rex1 promotor ter je ključnega pomena za ohranjanje pluripotentnosti (Rex1 je prav tako eden izmed markerjev za pluripotentnost, njegova količina močno upade ob začetku diferenciacije celic) <br /> <br /> Oct4, ta transkripcijski faktor je aktiven predvsem v oocitih, ostaja pa prisoten tudi v embriih. Pojavlja se tudi v nediferenciranih celicah tumorjev, utišanje njegovega gena pa pripelje do diferenciacije celic.<br /> <br /> Anti - SSEA-1: ob začetku diferenciacije celic se izražanje SSEA-1 gena močno poveča, antigene za SSEA-1 oz. drugače imenovanemu tudi CD15 najdemo v zarodnih oz. embrionalnih celicah glodavcev ter njihovih rakavih celicah.<br /> <br /> Na podlagi teh markerjev so ugotavljali podrobnosti z embrionalnimi celicami ter izbrali 7 celičnih linij, ki so se v podobnosti ujemale z embrionalnimi celicami in posledično razlikovale od fibroblastov iz katerih so reprogramirali iPS celice. <br /> 4 od 7 celičnih linij so razvile veliko mišjih vohalnih nevronov (iMZ9, iMZ11, iMZ14, iMZ17 in iMZ21). To skupino ter skupino linij, ki so bile pozitivne na vse pluripotentne markerje, vendar so razvile relativno nizko število vohalnih nevronov so izbrali za nadaljnje analize kariotipa. <br /> Štiri od osmih linij so bile euploidne (iMZ9, iMZ11, iMZ15 in iMZ21) ter tako primerne za uporabo v testu tetraploidne komplementacije.<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (1. primer)===<br /> <br /> Preko detekcije ß-galaktozidaze v mišjih tkivih (obarvanje celic iz celičnih linij in negativni rezultat pri celicah blastocist), PCR tehnike za detekcijo mikrosatelitnih markerjev in PCR tehnike za ugotavljanje prisotnosti albino (donor blastociste je albino osebek) mutacije na Tyr genu so dokazali, da konstitucija celic v mišjih osebkih izhaja izključno iz celice celičnih linij in so se vsa tkiva razvila izključno iz pluripotentnih celic.<br /> Southern blot analiza za Oct4 in rtTAM2.2 je pokazala vzorec provirusne integracije, ki je identična vzorcem integracije iz iPS celičnih linij. Nobena do sedaj znana ES celična linija ne vsebuje dane genetske modfikacije, kar kaže na to, da ni prišlo do kontaminacije z nobeno prej obstajajočo ES celično linijo.<br /> Kvantitativna PCR z reverzno transkripcijo (qRT-PCR) je pokazala skoraj popolno utišanost provirusnih transgenov pri iPSC celicah v odsotnosti doksicilkina. Celične linije so se ponovno tretirale z doksiciklinom. Iz celičnih linij, iz katerih je izšlo večina iPS miši je v odsotnosti doksiciklina bila prisotna reducirana ekspresija vseh 4ih reprogamirajočih faktorjev. Medtem ko je pri manj uspešnih linijah prišlo do zaznavne detekcije ekspresije Oct4 in /ali Klf4; kar kaže na nepopolno reprogramiranje manj uspešnih celičnih linij.<br /> Specifičnost sistema se je potrdila tudi z imunoflorescenčno analizo nevronov za percepcijo vonja, ki je kazala pozitivno bravanje za ß-galaktozidazo razen dveh tipov nevronov kjer je bila prisotna ekspresija GFP.<br /> <br /> Mnogo izboljšav je lahko odgovornih za dano pluripotentnost celičnih linij.<br /> 1.) Visoka stopnja indukcije transgena preko rtTAM2.2 in daljši čas ekspresije reprogramijajočih faktorjev kot navadno (več časa za bolj popolno reprogramiranje)<br /> 2.) Reguliranje ekspresije našega transgena preko doksiciklina, kar je pomagalo preprečiti nepravilno ekspresijo reprogramijajočih faktorjev skozi embrionalni razvoj<br /> 3.) Daljša terapija z valproično kislino je lahko omogočila reprogramiranje epigenoma v stanje kromatina bolj podobnemu tistemu v ES celicah<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (2. primer)===<br /> <br /> V drugem primeru so mišje embrionalne fibroblaste ki odražajo Oct4 z GFP okužili (preko retrovirusa) z “Yamanaka” faktorji. Druga modifikacija je vključevala zamenjavo seruma v katerem se celice gojijo s fetalnim govejim serumom. <br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (2. primer)===<br /> <br /> Na gojiščih na katerih so gojili mišje embrionalne fibroblaste, v katere so prenesli &quot;Yamanaka faktorje&quot;, so po 10 dneh zaznali večjo količino alkalne fosfataze, katere povišana količina se pojavlja v membrani pluripotentih celic ter med drugim služi kot test pluripotentonost. Prav tako so zaznali zeleni fluorescirajoči protein (GPF), ki je kazal na prisotnost Oct4 (katerega količina upade ob začetku diferenciacije celic).<br /> <br /> Celice so iz gojišča odvzeli po 14 dneh, (celične linije IP14D), 20 dneh (celične linije IP20D) in 36 dneh (celične linije IP36D) ter na tak način pridobili 31 stabilnih, diploentnih celičnih linij s 40 kromosomi.<br /> <br /> Test bisulfidne metilacije je v treh od pridobljenih celičnih linij (IP20D-3, IP36D-3 ter IP14D-1) pokazal demetilacijo promotorjev Oct4 in Nanog, vzorec katere je bil zelo podoben demetilaciji kontrolne skupine embrionalnih celic, h krati pa se je močno razlikoval od mišjih embrionalnih fibroblastov, iz katerih so z reprogramiranjem pridobili zgoraj omenjene pluripotentne celične linije. <br /> Pluripotentnost teh linij so dokazali tudi z vnosom le teh v miši s hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo pri katerih se je razvil teratom z vsemi tremi zarodnimi plastmi. <br /> <br /> Za nadaljnjo testiranje pluripotentnosti so naključno izbrali celične linije ter jih vključili v normalno CD-1 blastocisto ter jo prenesli v CD-1 samico miši, ter opazovali razvoj embriov do mladičev.<br /> Rezultati so pokazali da celične linije IP36D in IP20D razvijejo žive miški z 5-80% himernostjo, linije IP14D pa miši z 10-95% himernostjo. <br /> Kloniranje miši s tetraploidno komplementacijo ni bilo enako uspešno pri vseh celičnih linijah, iz celičnih linij IP36D so se sicer razvili embrii, ki pa so v 10. dnevu razvoja umrli. Celične linije IP20D prav tako niso razvile živih mladičev oz. embriov starejših od 17 dni, med tem ko se je iz celičnih linij IP14D razvilo tudi do 22 živih mladičev. <br /> Rezultati celične linije IP14D-1 so bili celo primerljivi z rezultati kontrolne skupine z embrionalnimi celicami (v obeh primerih se je razvilo približno 3% živih mladičev).<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (2. primer)===<br /> <br /> Bisulfitno sekveniranje pa je pokazalo demetilacijo na Nanog in Oct4 promotorjih v induciranih celičnih linijah, v primerjavi z originalnimi fibroblasti, ki kažejo veliko večjo metiliranosti. Se pa vzorec pogostosti metiliranja sovpada s tistim iz ES celic – kar kaže na potek epigenetskega reprogramiranja. Povečana stopnja demetilacije najverjetneje kaže na povečano stopnjo transkripcije pluripotentnih markerjev. <br /> Z uporabo PCR tehnike unikatnih mikrosatelitov se je dokazal izvor celic iz miši, ki je izključno iz pluripotentnih celičnih linij. Z kvantitativno reverzno PCR tehniko se je tudi tu dokazovala ekspresija štirih reprogramijajočih faktorjev.<br /> Analiza preko mikročipov je pokazala, da je ekspresija pluripotentnih markerjev podobna med iPS celicami in ES celicami, se pa izključuje z izvornimi fibroblastnimi celicami.<br /> <br /> Našemu sistemu zagotavljanja pluripotentnosti so bile dovedene genetske izboljšave. Na podlagi ugotavljanja epigenetskega statusa pluripotentnih celic iz celičnih linij, izražanju specifičnih pluripotentnih markerjev, dokazovanju izvora celic, specifičnosti sistema ter stopnje reprogramiranja so se dokazale številne izboljšave ter podprle polni pluripotentni status iPS celic.<br /> <br /> ==Preverjanje funkcionalne in razvojne pluripotentnosti==<br /> <br /> ===Funkcionalna pluripotentnost===<br /> <br /> Z določenimi metodami se preverja sposobnost diferenciacije celic v vse tri zarodne plasti, kar nakazuje na velik diferenciacijski potencial.<br /> <br /> Te raziskave lahko potekajo ''in vitro'', ena takih je oblikovanje embrioidnih teles. To so tridimenzionalni agregati matičnih celic, ki se spontano oblikujejo v suspenziji. Z njihovo pomočjo se oceni sposobnost diferenciacije in razvoja v vse tri zarodne plasti, vendar pa ne nakazujejo na izoblikovanje celic v strukture in tkiva.<br /> <br /> Pogosto se uporablja ''in vivo'' metoda, pri kateri se tvori teratom. Pri tem testu v miš, ki trpi za hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo (okvarjeni so limfociti T in B), injiciramo preiskovane iPS celice. Če so le-te pluripotentne, se razvijejo v teratom; tumor, ki vsebuje različne celice vseh treh zarodnih plasti.<br /> <br /> ===Razvojna pluripotentnost===<br /> <br /> To je najvišja raven pluripotentnosti, s katero se preverja sposobnost razvoja iPS celic v vse celične tipe odraslega organizma, vključno s spolnimi celicami.<br /> <br /> Ena od pogosto uporabljenih metod je tvorba himer. Himere so organizmi, ki so sestavljeni iz vsaj dveh vrst genetsko različnih celic in nastanejo pri spojitvi celic iz vsaj dveh zarodkov. Za namene raziskav iPS celic se himerne miši pripravijo z agregacijo preiskovanih matičnih celic z embrijem v 8-celičnem stadiju ali injiciranjem matičnih celic v blastocisto. Ta se nato prenese v mišjo samico, ki povrže himerne mladiče. Ti so glede na genetsko sestavo nekakšna mešanica obeh vrst uporabljenih celic. Injicirane matične celice prispevajo le k razvoju zarodka, ne pa tudi k nastanku izvenembrionalnih tkiv (placente).<br /> V obravnavanih raziskavah so za pripravo iPS celic uporabili embrionalne fibroblaste iz miši s črnim kožuhom, nato pa so iPS celice injicirali v blastocisto albino miši. Rojeni mladiči so imeli značilen lisast kožuh (črne in bele barve).<br /> <br /> Za najstrožji in najzahtevnejši test dokazovanja pluripotentnosti velja test tetraploidne komplementacije. Z uporabo električnega toka poteče pfuzija dveh zarodkov v 2-celičnem stadiju in tako nastane tetraploidna blastocista, iz katere se lahko diferencirajo izvenembrionalna tkiva, ne more pa se razviti zarodek. Šele z vnosom diploidnih matičnih celic v tetraploidno blastocisto omogočimo normalen razvoj zarodka, katerega celice izhajajo izključno iz injiciranih matičnih celic, placenta pa iz tetraploidnih celic.<br /> V raziskavah je tetraploidna blastocista izhajala iz albino miši, prav take vrste pa je bila tudi samica, v katero so vsadili tetraploidno celico z vnesenimi iPS celicami. Dobljene miši so bile izključno rjave barve, tako kot tiste, iz katerih so izolirali embrionalne fibroblaste za pripravo iPS celic, kar potrjuje, da celice organizma izhajajo le iz vnesenih iPS celic.<br /> <br /> Po uspešni tvorbi himer in tetraploidni komplementaciji se dobljene mišje samce pari s samicami. Z metodo prenosa genskega materiala se preverja, ali lahko iPS celice prispevajo tudi k razvoju funkcionalnih spolnih celic, ki so odgovorne za nastanek viabilnih potomcev.<br /> <br /> ==Odstotek viabilnosti in uspešnosti kloniranja==<br /> <br /> Odstotek preživelih v prvih uspešnih poskusih kloniranja miši iz induciranih pluripotentnih celic variira od 0,3% do 13% (odvisno od celične linije). Uspešnost kloniranja je podobna uspešni tetraploidne komplementacije z ES celicami ter SCNT-ES metodi. Večina preživelih osebkov ni kazala morfoloških defektov. Pri umrlih osebkih pa so se tipično kazale težave z dihanjem, ki je pogosta v tetraploidni komplementaciji z ES celicami.<br /> Kloniranje je pogosto kazalo morfološke abnormalnosti kot so težave pri dihanju, neonatalna prekomerna velikost ter splošno velik odstotek smrtnosti in neuspešnosti. Največji razlog se gotovo skriva v nepopolnem reprogramiranju celic uporabljenih za kloniranje in nepravilnim epigenetskim profilom. Samo področje je slabo raziskano.<br /> Študije so kljub temu pokazale da neonatalno prekomerno velikost povzroča tehnika kloniranja prenosa jedra (SCNT metoda). Prav tako so pokazale, da je povečana abnormalnost pri dihanju in večja smrtnost prisotna pri osebkih z nižjo stopnjo heterozigotnosti.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> Zaenkrat še ni znan univerzalen set označevalcev, ki bi nakazoval na popolno pluripotentnost iPS celic. Tetraploidna komplementacija zato ostaja najbolj primeren test za ocenjevanje sposobnosti iPS celic za razvoj v vse celične linije nekega organizma. Z uspešno pomnoženimi mišimi s testom tetraploidne komplementacije so dokazali, da je z direktnim reprogramiranjem s 4 faktorji možno ustvariti iPS celice, ki so funkcionalno primerljive z embrionalnimi celicami. Dokazana pa je tudi ”uspešnost” metode tetraploidne komplementacije z iPS celicami za pridobivanje odraslih miši iz diferenciranih celic.<br /> <br /> Še vedno pa ni povsem jasno, kaj povzroča razlike v pluripotentnosti med iPS celičnimi linijami. Raziskovalci domnevajo, da so za to odgovorne specifične značilnosti reprogramiranih celičnih linij. V prihodnosti bi bilo potrebno nameniti pozornost tudi delno reprogramiranim in manj pluripotentnim celičnim linijam, ki ne ustvarijo viabilnih miši pri testu tetraploidne komplementacije (zadoščajo pa katerim drugim kriterijem pluripotentnosti), saj bi z njihovim preučevanjem lahko odkrili razlike in mehanizme reprogramiranja na molekularni ravni.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> *Boland M.J. in sod. Adult mice generated from induced pluripotent stem cells. ''Nature'', 2009, številka 461, str. 91-94<br /> *Kang L. in Gao S. Pluripotency of induced pluripotent stem cells. ''Journal of animal science and biotechnology'', 2012, letnik 3, številka 5.<br /> *Smith K.P. in sod. Pluripotency: Toward a Gold Standard for Human ES and iPS Cells. ''Journal of Cell Physiology'', 2009, številka 220, str. 21-29<br /> *Stadtfeld M. in sod. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. ''Genes Dev''., 2010, letn. 24, str. 2239-2263.<br /> *Zhao X.Y. in sod. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. ''Nature'', 2009, številka 461, str. 86-90<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Kloniranje_mi%C5%A1i_iz_iPSC&diff=8178 2013-05-28T07:13:42Z

<p>AnaGrom: /* Pridobivanje celičnih linij (2. primer) */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> <br /> Odrasle diferencirane celice lahko z uporabo majhnega števila določenih transkripcijskih faktorjev reprogramiramo oz. spremenimo v inducirane pluripotentne matične celice (iPS celice), ki so v marsičem podobne embrionalnim matičnim celicam (ES celice). Z iPS celicami bi bilo možno zdraviti različne degenerativne in genetske bolezni, nadomeščati poškodovana tkiva, uporabne bi bile kot modeli za raziskave bolezni, pri vsem tem pa ne bi prišlo do etično sporne uporabe embrionalnih celic. Vendar pa imajo iPSC tudi določene slabosti; v nekaterih raziskavah so se izkazale za tumorigene in nagnjene k hitrejšemu celičnemu staranju.<br /> <br /> Pojavljalo pa se je tudi vprašanje o njihovi pluripotentnosti, saj je to ena od bistvenih značilnosti matičnih celic. Pluripotentne matične celice prispevajo k razvoju vseh treh zarodnih plasti (endoderma, mezoderma in ektoderma) in so se tako sposobne razviti v vse celice zarodka, ne morejo pa tvoriti izvenembrionalnih tkiv.<br /> <br /> ES celice so se izkazale kot bolj učikovite pri kloniranju. V naslednjih raziskavah se poroča o uspehih kloniranja živih miši iz reprogramiranih fibroblastov, kar kaže na to, da so lahko vse značilnosti stopnje pluripotentosti nadomeščene brez izpostavljanja neznanim ooplazemskim faktorjem. Primerjanje teh polno pluripotentnih iPS celičnih linij bo lahko pokazalo molekulske markerje potrebne za pluripotentna stanja.<br /> <br /> ==Preverjanje pluripotentnosti z genetskimi in celičnimi analizami==<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (1. primer)===<br /> <br /> V prvem primeru so se najprej lotili načrtovanja genetske oznake za razlikovanje izvora celic iz blastociste ali iPS celic. Mišje embriontske fibroblaste se je pridobilo s križanjem dveh mišjih trangenih linij (Pchd21/Cre ter Z/EG).<br /> *Z/EG linija vsebuje v večini celici viden ter selektiven marker ß-GEO (fuzija gena za ß-galaktozidazo ter gena za rezistenco na neomicin; tu pride lahko do detekcije aktivnega encime ß-galaktozidaze preko X-galaktoze, kjer se tvori modro obarvan produkt, ali pa se kot selekcijski marker uporabi odpornost klonov proti neomicinu; v raziskavi se je uporabil prvi marker).<br /> *Pchd21/Cre linija; promotor protokadherina 21(katerega ekspresija je značilna predvsem za dva tipa nevronov pri vohalnem sistemu v glomerulu) podpira ekspresijo Cre rekombinaze (je specifična rekombinaza, ki katalizira specifično rekombinacijo na točno določenem mestu v DNA).<br /> Tako je prišlo pri kombiniranju celičnih linij pri sveh tipih vohalnih nevronov miši, zaradi delovanja Cre rekombinaze do izreza »floksiranega« ß-geo gena, kar pa je kot za posledico imelo izražanje GFP (zelenega fluoscirajočega proteina).<br /> <br /> Nepravilno izražanje reprogramirajočih genov skozi razvoj bi lahko inhibiral embionalni in poporodni razvoj. Odločili so se za tesno kontrolo trangene ekspresije v iPS celicah. Štiri »Yamanaka« faktorje (Oct4, Klf4, Sox2 in Myc-c) so prenesli v celice preko retrovirusa ter ih postavili pod okrilje tetO promotorja (prepis pod tem promotorjem se inducira v prisotnosti antibiotika tetraciklina ali njegovih derivatov (npr. doksiciklina)). V našem sistemu je sistem aktiviran preko izboljšane verzije reverznega tetraciklin transaktivatorja (rtTAM2.2), v prisotnosti doksiciklina. Da bi se vpodbudila še večja učinkovitost reprogramiranja in izolacija popolno reprogramiranih iPS celic so izpostavili mišje embironalne fibroblaste valproični kislini, za katero se je izkazalo, da poveča reprogramsko učinkovitost in inhibicira nepopolnoma reprogramiranih celic z inhibicijo njihovih celičnih delitev.<br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (1. primer)===<br /> <br /> Z reprogramiranjem Pcdh21/cre-Z/EG fibroblastov se je po 5 dneh v prisotnosti doksiciklina in VPA ter po 7 dneh le v prisotnosti doksiciklina razvilo 21 celičnih linij, označenih z oznakami iMZ1-21.<br /> Ker univerzalnega testa za ugotavljanje pluripotetnosti še ni, so izvedli vrsto testiranj, na podlagi katerih so izbrali celične linije primerne za test tetraploidne komplementacije. <br /> <br /> Glede na morfologijo oz. nenormalno širjenje so zavrgli 9 celičnih linij, ostalih 15 pa testirali z imonofluorescenco za ekspresijo markerjev za pluripotentnost (Sox2, Oct4). <br /> Vse linije so vsebovale izražene markerje prav tako so se iz vseh razvila embrionalna telesa, pri katerih so testirali sposobnost tvorbe mišjih vohalnih nevronov. Celične linije so razdelili v 2 skupini: tiste, ki so razvile veliko število mišjih vohalnih nevronov: celične linije iMZ2, iMZ10, iMZ12, iMZ13, iMZ18, iMZ11, iMZ14, iMZ17, iMZ20 in iMZ21 ter skupino celičnih linij, ki so razvile malo vohalnih nevronov: iMZ3, iMZ15, iMZ7, iMZ9.<br /> V nadaljnjih testiranjih so linije primerjali s kontrolno skupino embrionalnih celic z imunooznačevanjem treh pluripotentnih markerjev za:<br /> <br /> Nanog, ki je transkripcijski faktor za Rex1 promotor ter je ključnega pomena za ohranjanje pluripotentnosti (Rex1 je prav tako eden izmed markerjev za pluripotentnost, njegova količina močno upade ob začetku diferenciacije celic) <br /> <br /> Oct4, ta transkripcijski faktor je aktiven predvsem v oocitih, ostaja pa prisoten tudi v embriih. Pojavlja se tudi v nediferenciranih celicah tumorjev, utišanje njegovega gena pa pripelje do diferenciacije celic.<br /> <br /> Anti - SSEA-1: ob začetku diferenciacije celic se izražanje SSEA-1 gena močno poveča, antigene za SSEA-1 oz. drugače imenovanemu tudi CD15 najdemo v zarodnih oz. embrionalnih celicah glodavcev ter njihovih rakavih celicah.<br /> <br /> Na podlagi teh markerjev so ugotavljali podrobnosti z embrionalnimi celicami ter izbrali 7 celičnih linij, ki so se v podobnosti ujemale z embrionalnimi celicami in posledično razlikovale od fibroblastov iz katerih so reprogramirali iPS celice. <br /> 4 od 7 celičnih linij so razvile veliko mišjih vohalnih nevronov (iMZ9, iMZ11, iMZ14, iMZ17 in iMZ21). To skupino ter skupino linij, ki so bile pozitivne na vse pluripotentne markerje, vendar so razvile relativno nizko število vohalnih nevronov so izbrali za nadaljnje analize kariotipa. <br /> Štiri od osmih linij so bile euploidne (iMZ9, iMZ11, iMZ15 in iMZ21) ter tako primerne za uporabo v testu tetraploidne komplementacije.<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (1. primer)===<br /> <br /> Preko detekcije ß-galaktozidaze v mišjih tkivih (obarvanje celic iz celičnih linij in negativni rezultat pri celicah blastocist), PCR tehnike za detekcijo mikrosatelitnih markerjev in PCR tehnike za ugotavljanje prisotnosti albino (donor blastociste je albino osebek) mutacije na Tyr genu so dokazali, da konstitucija celic v mišjih osebkih izhaja izključno iz celice celičnih linij in so se vsa tkiva razvila izključno iz pluripotentnih celic.<br /> Southern blot analiza za Oct4 in rtTAM2.2 je pokazala vzorec provirusne integracije, ki je identična vzorcem integracije iz iPS celičnih linij. Nobena do sedaj znana ES celična linija ne vsebuje dane genetske modfikacije, kar kaže na to, da ni prišlo do kontaminacije z nobeno prej obstajajočo ES celično linijo.<br /> Kvantitativna PCR z reverzno transkripcijo (qRT-PCR) je pokazala skoraj popolno utišanost provirusnih transgenov pri iPSC celicah v odsotnosti doksicilkina. Celične linije so se ponovno tretirale z doksiciklinom. Iz celičnih linij, iz katerih je izšlo večina iPS miši je v odsotnosti doksiciklina bila prisotna reducirana ekspresija vseh 4ih reprogamirajočih faktorjev. Medtem ko je pri manj uspešnih linijah prišlo do zaznavne detekcije ekspresije Oct4 in /ali Klf4; kar kaže na nepopolno reprogramiranje manj uspešnih celičnih linij.<br /> Specifičnost sistema se je potrdila tudi z imunoflorescenčno analizo nevronov za percepcijo vonja, ki je kazala pozitivno bravanje za ß-galaktozidazo razen dveh tipov nevronov kjer je bila prisotna ekspresija GFP.<br /> <br /> Mnogo izboljšav je lahko odgovornih za dano pluripotentnost celičnih linij.<br /> 1.) Visoka stopnja indukcije transgena preko rtTAM2.2 in daljši čas ekspresije reprogramijajočih faktorjev kot navadno (več časa za bolj popolno reprogramiranje)<br /> 2.) Reguliranje ekspresije našega transgena preko doksiciklina, kar je pomagalo preprečiti nepravilno ekspresijo reprogramijajočih faktorjev skozi embrionalni razvoj<br /> 3.) Daljša terapija z valproično kislino je lahko omogočila reprogramiranje epigenoma v stanje kromatina bolj podobnemu tistemu v ES celicah<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (2. primer)===<br /> <br /> V drugem primeru so mišje embrionalne fibroblaste ki odražajo Oct4 z GFP okužili (preko retrovirusa) z “Yamanaka” faktorji. Druga modifikacija je vključevala zamenjavo seruma v katerem se celice gojijo s fetalnim govejim serumom. <br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (2. primer)===<br /> <br /> Na gojiščih na katerih so gojili mišje embrionalne fibroblaste, v katere so prenesli &quot;Yamanaka faktorje&quot;, so po 10 dneh zaznali večjo količino alkalne fosfataze, katere povišana količina se pojavlja v membrani pluripotentih celic ter med drugim služi kot test pluripotentonost. Prav tako so zaznali zeleni fluorescirajoči protein (GPF), ki je kazal na prisotnost Oct4 (katerega količina upade ob začetku diferenciacije celic).<br /> <br /> Celice so iz gojišča odvzeli po 14 dneh, (celične linije IP14D), 20 dneh (celične linije IP20D) in 36 dneh (celične linije IP36D) ter na tak način pridobili 31 stabilnih celičnih linij, diploentnih celičnih linij s 40 kromosomi.<br /> <br /> Test bisulfidne metilacije je v treh od pridobljenih celičnih linij (IP20D-3, IP36D-3 ter IP14D-1) pokazal demetilacijo promotorjev Oct4 in Nanog, vzorec katere je bil zelo podoben demetilaciji kontrolne skupine embrionalnih celic, h krati pa se je močno razlikoval od mišjih embrionalnih fibroblastov, iz katerih so z reprogramiranjem pridobili zgoraj omenjene pluripotentne celične linije. <br /> Pluripotentnost teh linij so dokazali tudi z vnosom le teh v miši s hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo pri katerih se je razvil teratom z vsemi tremi zarodnimi plastmi. <br /> <br /> Za nadaljnjo testiranje pluripotentnosti so naključno izbrali celične linije ter jih vključili v normalno CD-1 blastocisto ter jo prenesli v CD-1 samico miši, ter opazovali razvoj embriov do mladičev.<br /> Rezultati so pokazali da celične linije IP36D in IP20D razvijejo žive miški z 5-80% himernostjo, linije IP14D pa miši z 10-95% himernostjo. <br /> Kloniranje miši s tetraploidno komplementacijo ni bilo enako uspešno pri vseh celičnih linijah, iz celičnih linij IP36D so se sicer razvili embrii, ki pa so v 10. dnevu razvoja umrli. Celične linije IP20D prav tako niso razvile živih mladičev oz. embriov starejših od 17 dni, med tem ko se je iz celičnih linij IP14D razvilo tudi do 22 živih mladičev. <br /> Rezultati celične linije IP14D-1 so bili celo primerljivi z rezultati kontrolne skupine z embrionalnimi celicami (v obeh primerih se je razvilo približno 3% živih mladičev).<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (2. primer)===<br /> <br /> Bisulfitno sekveniranje pa je pokazalo demetilacijo na Nanog in Oct4 promotorjih v induciranih celičnih linijah, v primerjavi z originalnimi fibroblasti, ki kažejo veliko večjo metiliranosti. Se pa vzorec pogostosti metiliranja sovpada s tistim iz ES celic – kar kaže na potek epigenetskega reprogramiranja. Povečana stopnja demetilacije najverjetneje kaže na povečano stopnjo transkripcije pluripotentnih markerjev. <br /> Z uporabo PCR tehnike unikatnih mikrosatelitov se je dokazal izvor celic iz miši, ki je izključno iz pluripotentnih celičnih linij. Z kvantitativno reverzno PCR tehniko se je tudi tu dokazovala ekspresija štirih reprogramijajočih faktorjev.<br /> Analiza preko mikročipov je pokazala, da je ekspresija pluripotentnih markerjev podobna med iPS celicami in ES celicami, se pa izključuje z izvornimi fibroblastnimi celicami.<br /> <br /> Našemu sistemu zagotavljanja pluripotentnosti so bile dovedene genetske izboljšave. Na podlagi ugotavljanja epigenetskega statusa pluripotentnih celic iz celičnih linij, izražanju specifičnih pluripotentnih markerjev, dokazovanju izvora celic, specifičnosti sistema ter stopnje reprogramiranja so se dokazale številne izboljšave ter podprle polni pluripotentni status iPS celic.<br /> <br /> ==Preverjanje funkcionalne in razvojne pluripotentnosti==<br /> <br /> ===Funkcionalna pluripotentnost===<br /> <br /> Z določenimi metodami se preverja sposobnost diferenciacije celic v vse tri zarodne plasti, kar nakazuje na velik diferenciacijski potencial.<br /> <br /> Te raziskave lahko potekajo ''in vitro'', ena takih je oblikovanje embrioidnih teles. To so tridimenzionalni agregati matičnih celic, ki se spontano oblikujejo v suspenziji. Z njihovo pomočjo se oceni sposobnost diferenciacije in razvoja v vse tri zarodne plasti, vendar pa ne nakazujejo na izoblikovanje celic v strukture in tkiva.<br /> <br /> Pogosto se uporablja ''in vivo'' metoda, pri kateri se tvori teratom. Pri tem testu v miš, ki trpi za hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo (okvarjeni so limfociti T in B), injiciramo preiskovane iPS celice. Če so le-te pluripotentne, se razvijejo v teratom; tumor, ki vsebuje različne celice vseh treh zarodnih plasti.<br /> <br /> ===Razvojna pluripotentnost===<br /> <br /> To je najvišja raven pluripotentnosti, s katero se preverja sposobnost razvoja iPS celic v vse celične tipe odraslega organizma, vključno s spolnimi celicami.<br /> <br /> Ena od pogosto uporabljenih metod je tvorba himer. Himere so organizmi, ki so sestavljeni iz vsaj dveh vrst genetsko različnih celic in nastanejo pri spojitvi celic iz vsaj dveh zarodkov. Za namene raziskav iPS celic se himerne miši pripravijo z agregacijo preiskovanih matičnih celic z embrijem v 8-celičnem stadiju ali injiciranjem matičnih celic v blastocisto. Ta se nato prenese v mišjo samico, ki povrže himerne mladiče. Ti so glede na genetsko sestavo nekakšna mešanica obeh vrst uporabljenih celic. Injicirane matične celice prispevajo le k razvoju zarodka, ne pa tudi k nastanku izvenembrionalnih tkiv (placente).<br /> V obravnavanih raziskavah so za pripravo iPS celic uporabili embrionalne fibroblaste iz miši s črnim kožuhom, nato pa so iPS celice injicirali v blastocisto albino miši. Rojeni mladiči so imeli značilen lisast kožuh (črne in bele barve).<br /> <br /> Za najstrožji in najzahtevnejši test dokazovanja pluripotentnosti velja test tetraploidne komplementacije. Z uporabo električnega toka poteče pfuzija dveh zarodkov v 2-celičnem stadiju in tako nastane tetraploidna blastocista, iz katere se lahko diferencirajo izvenembrionalna tkiva, ne more pa se razviti zarodek. Šele z vnosom diploidnih matičnih celic v tetraploidno blastocisto omogočimo normalen razvoj zarodka, katerega celice izhajajo izključno iz injiciranih matičnih celic, placenta pa iz tetraploidnih celic.<br /> V raziskavah je tetraploidna blastocista izhajala iz albino miši, prav take vrste pa je bila tudi samica, v katero so vsadili tetraploidno celico z vnesenimi iPS celicami. Dobljene miši so bile izključno rjave barve, tako kot tiste, iz katerih so izolirali embrionalne fibroblaste za pripravo iPS celic, kar potrjuje, da celice organizma izhajajo le iz vnesenih iPS celic.<br /> <br /> Po uspešni tvorbi himer in tetraploidni komplementaciji se dobljene mišje samce pari s samicami. Z metodo prenosa genskega materiala se preverja, ali lahko iPS celice prispevajo tudi k razvoju funkcionalnih spolnih celic, ki so odgovorne za nastanek viabilnih potomcev.<br /> <br /> ==Odstotek viabilnosti in uspešnosti kloniranja==<br /> <br /> Odstotek preživelih v prvih uspešnih poskusih kloniranja miši iz induciranih pluripotentnih celic variira od 0,3% do 13% (odvisno od celične linije). Uspešnost kloniranja je podobna uspešni tetraploidne komplementacije z ES celicami ter SCNT-ES metodi. Večina preživelih osebkov ni kazala morfoloških defektov. Pri umrlih osebkih pa so se tipično kazale težave z dihanjem, ki je pogosta v tetraploidni komplementaciji z ES celicami.<br /> Kloniranje je pogosto kazalo morfološke abnormalnosti kot so težave pri dihanju, neonatalna prekomerna velikost ter splošno velik odstotek smrtnosti in neuspešnosti. Največji razlog se gotovo skriva v nepopolnem reprogramiranju celic uporabljenih za kloniranje in nepravilnim epigenetskim profilom. Samo področje je slabo raziskano.<br /> Študije so kljub temu pokazale da neonatalno prekomerno velikost povzroča tehnika kloniranja prenosa jedra (SCNT metoda). Prav tako so pokazale, da je povečana abnormalnost pri dihanju in večja smrtnost prisotna pri osebkih z nižjo stopnjo heterozigotnosti.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> Zaenkrat še ni znan univerzalen set označevalcev, ki bi nakazoval na popolno pluripotentnost iPS celic. Tetraploidna komplementacija zato ostaja najbolj primeren test za ocenjevanje sposobnosti iPS celic za razvoj v vse celične linije nekega organizma. Z uspešno pomnoženimi mišimi s testom tetraploidne komplementacije so dokazali, da je z direktnim reprogramiranjem s 4 faktorji možno ustvariti iPS celice, ki so funkcionalno primerljive z embrionalnimi celicami. Dokazana pa je tudi ”uspešnost” metode tetraploidne komplementacije z iPS celicami za pridobivanje odraslih miši iz diferenciranih celic.<br /> <br /> Še vedno pa ni povsem jasno, kaj povzroča razlike v pluripotentnosti med iPS celičnimi linijami. Raziskovalci domnevajo, da so za to odgovorne specifične značilnosti reprogramiranih celičnih linij. V prihodnosti bi bilo potrebno nameniti pozornost tudi delno reprogramiranim in manj pluripotentnim celičnim linijam, ki ne ustvarijo viabilnih miši pri testu tetraploidne komplementacije (zadoščajo pa katerim drugim kriterijem pluripotentnosti), saj bi z njihovim preučevanjem lahko odkrili razlike in mehanizme reprogramiranja na molekularni ravni.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> *Boland M.J. in sod. Adult mice generated from induced pluripotent stem cells. ''Nature'', 2009, številka 461, str. 91-94<br /> *Kang L. in Gao S. Pluripotency of induced pluripotent stem cells. ''Journal of animal science and biotechnology'', 2012, letnik 3, številka 5.<br /> *Smith K.P. in sod. Pluripotency: Toward a Gold Standard for Human ES and iPS Cells. ''Journal of Cell Physiology'', 2009, številka 220, str. 21-29<br /> *Stadtfeld M. in sod. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. ''Genes Dev''., 2010, letn. 24, str. 2239-2263.<br /> *Zhao X.Y. in sod. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. ''Nature'', 2009, številka 461, str. 86-90<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Kloniranje_mi%C5%A1i_iz_iPSC&diff=8177 2013-05-28T07:10:45Z

<p>AnaGrom: /* Pridobivanje celičnih linij (1. primer) */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> <br /> Odrasle diferencirane celice lahko z uporabo majhnega števila določenih transkripcijskih faktorjev reprogramiramo oz. spremenimo v inducirane pluripotentne matične celice (iPS celice), ki so v marsičem podobne embrionalnim matičnim celicam (ES celice). Z iPS celicami bi bilo možno zdraviti različne degenerativne in genetske bolezni, nadomeščati poškodovana tkiva, uporabne bi bile kot modeli za raziskave bolezni, pri vsem tem pa ne bi prišlo do etično sporne uporabe embrionalnih celic. Vendar pa imajo iPSC tudi določene slabosti; v nekaterih raziskavah so se izkazale za tumorigene in nagnjene k hitrejšemu celičnemu staranju.<br /> <br /> Pojavljalo pa se je tudi vprašanje o njihovi pluripotentnosti, saj je to ena od bistvenih značilnosti matičnih celic. Pluripotentne matične celice prispevajo k razvoju vseh treh zarodnih plasti (endoderma, mezoderma in ektoderma) in so se tako sposobne razviti v vse celice zarodka, ne morejo pa tvoriti izvenembrionalnih tkiv.<br /> <br /> ES celice so se izkazale kot bolj učikovite pri kloniranju. V naslednjih raziskavah se poroča o uspehih kloniranja živih miši iz reprogramiranih fibroblastov, kar kaže na to, da so lahko vse značilnosti stopnje pluripotentosti nadomeščene brez izpostavljanja neznanim ooplazemskim faktorjem. Primerjanje teh polno pluripotentnih iPS celičnih linij bo lahko pokazalo molekulske markerje potrebne za pluripotentna stanja.<br /> <br /> ==Preverjanje pluripotentnosti z genetskimi in celičnimi analizami==<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (1. primer)===<br /> <br /> V prvem primeru so se najprej lotili načrtovanja genetske oznake za razlikovanje izvora celic iz blastociste ali iPS celic. Mišje embriontske fibroblaste se je pridobilo s križanjem dveh mišjih trangenih linij (Pchd21/Cre ter Z/EG).<br /> *Z/EG linija vsebuje v večini celici viden ter selektiven marker ß-GEO (fuzija gena za ß-galaktozidazo ter gena za rezistenco na neomicin; tu pride lahko do detekcije aktivnega encime ß-galaktozidaze preko X-galaktoze, kjer se tvori modro obarvan produkt, ali pa se kot selekcijski marker uporabi odpornost klonov proti neomicinu; v raziskavi se je uporabil prvi marker).<br /> *Pchd21/Cre linija; promotor protokadherina 21(katerega ekspresija je značilna predvsem za dva tipa nevronov pri vohalnem sistemu v glomerulu) podpira ekspresijo Cre rekombinaze (je specifična rekombinaza, ki katalizira specifično rekombinacijo na točno določenem mestu v DNA).<br /> Tako je prišlo pri kombiniranju celičnih linij pri sveh tipih vohalnih nevronov miši, zaradi delovanja Cre rekombinaze do izreza »floksiranega« ß-geo gena, kar pa je kot za posledico imelo izražanje GFP (zelenega fluoscirajočega proteina).<br /> <br /> Nepravilno izražanje reprogramirajočih genov skozi razvoj bi lahko inhibiral embionalni in poporodni razvoj. Odločili so se za tesno kontrolo trangene ekspresije v iPS celicah. Štiri »Yamanaka« faktorje (Oct4, Klf4, Sox2 in Myc-c) so prenesli v celice preko retrovirusa ter ih postavili pod okrilje tetO promotorja (prepis pod tem promotorjem se inducira v prisotnosti antibiotika tetraciklina ali njegovih derivatov (npr. doksiciklina)). V našem sistemu je sistem aktiviran preko izboljšane verzije reverznega tetraciklin transaktivatorja (rtTAM2.2), v prisotnosti doksiciklina. Da bi se vpodbudila še večja učinkovitost reprogramiranja in izolacija popolno reprogramiranih iPS celic so izpostavili mišje embironalne fibroblaste valproični kislini, za katero se je izkazalo, da poveča reprogramsko učinkovitost in inhibicira nepopolnoma reprogramiranih celic z inhibicijo njihovih celičnih delitev.<br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (1. primer)===<br /> <br /> Z reprogramiranjem Pcdh21/cre-Z/EG fibroblastov se je po 5 dneh v prisotnosti doksiciklina in VPA ter po 7 dneh le v prisotnosti doksiciklina razvilo 21 celičnih linij, označenih z oznakami iMZ1-21.<br /> Ker univerzalnega testa za ugotavljanje pluripotetnosti še ni, so izvedli vrsto testiranj, na podlagi katerih so izbrali celične linije primerne za test tetraploidne komplementacije. <br /> <br /> Glede na morfologijo oz. nenormalno širjenje so zavrgli 9 celičnih linij, ostalih 15 pa testirali z imonofluorescenco za ekspresijo markerjev za pluripotentnost (Sox2, Oct4). <br /> Vse linije so vsebovale izražene markerje prav tako so se iz vseh razvila embrionalna telesa, pri katerih so testirali sposobnost tvorbe mišjih vohalnih nevronov. Celične linije so razdelili v 2 skupini: tiste, ki so razvile veliko število mišjih vohalnih nevronov: celične linije iMZ2, iMZ10, iMZ12, iMZ13, iMZ18, iMZ11, iMZ14, iMZ17, iMZ20 in iMZ21 ter skupino celičnih linij, ki so razvile malo vohalnih nevronov: iMZ3, iMZ15, iMZ7, iMZ9.<br /> V nadaljnjih testiranjih so linije primerjali s kontrolno skupino embrionalnih celic z imunooznačevanjem treh pluripotentnih markerjev za:<br /> <br /> Nanog, ki je transkripcijski faktor za Rex1 promotor ter je ključnega pomena za ohranjanje pluripotentnosti (Rex1 je prav tako eden izmed markerjev za pluripotentnost, njegova količina močno upade ob začetku diferenciacije celic) <br /> <br /> Oct4, ta transkripcijski faktor je aktiven predvsem v oocitih, ostaja pa prisoten tudi v embriih. Pojavlja se tudi v nediferenciranih celicah tumorjev, utišanje njegovega gena pa pripelje do diferenciacije celic.<br /> <br /> Anti - SSEA-1: ob začetku diferenciacije celic se izražanje SSEA-1 gena močno poveča, antigene za SSEA-1 oz. drugače imenovanemu tudi CD15 najdemo v zarodnih oz. embrionalnih celicah glodavcev ter njihovih rakavih celicah.<br /> <br /> Na podlagi teh markerjev so ugotavljali podrobnosti z embrionalnimi celicami ter izbrali 7 celičnih linij, ki so se v podobnosti ujemale z embrionalnimi celicami in posledično razlikovale od fibroblastov iz katerih so reprogramirali iPS celice. <br /> 4 od 7 celičnih linij so razvile veliko mišjih vohalnih nevronov (iMZ9, iMZ11, iMZ14, iMZ17 in iMZ21). To skupino ter skupino linij, ki so bile pozitivne na vse pluripotentne markerje, vendar so razvile relativno nizko število vohalnih nevronov so izbrali za nadaljnje analize kariotipa. <br /> Štiri od osmih linij so bile euploidne (iMZ9, iMZ11, iMZ15 in iMZ21) ter tako primerne za uporabo v testu tetraploidne komplementacije.<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (1. primer)===<br /> <br /> Preko detekcije ß-galaktozidaze v mišjih tkivih (obarvanje celic iz celičnih linij in negativni rezultat pri celicah blastocist), PCR tehnike za detekcijo mikrosatelitnih markerjev in PCR tehnike za ugotavljanje prisotnosti albino (donor blastociste je albino osebek) mutacije na Tyr genu so dokazali, da konstitucija celic v mišjih osebkih izhaja izključno iz celice celičnih linij in so se vsa tkiva razvila izključno iz pluripotentnih celic.<br /> Southern blot analiza za Oct4 in rtTAM2.2 je pokazala vzorec provirusne integracije, ki je identična vzorcem integracije iz iPS celičnih linij. Nobena do sedaj znana ES celična linija ne vsebuje dane genetske modfikacije, kar kaže na to, da ni prišlo do kontaminacije z nobeno prej obstajajočo ES celično linijo.<br /> Kvantitativna PCR z reverzno transkripcijo (qRT-PCR) je pokazala skoraj popolno utišanost provirusnih transgenov pri iPSC celicah v odsotnosti doksicilkina. Celične linije so se ponovno tretirale z doksiciklinom. Iz celičnih linij, iz katerih je izšlo večina iPS miši je v odsotnosti doksiciklina bila prisotna reducirana ekspresija vseh 4ih reprogamirajočih faktorjev. Medtem ko je pri manj uspešnih linijah prišlo do zaznavne detekcije ekspresije Oct4 in /ali Klf4; kar kaže na nepopolno reprogramiranje manj uspešnih celičnih linij.<br /> Specifičnost sistema se je potrdila tudi z imunoflorescenčno analizo nevronov za percepcijo vonja, ki je kazala pozitivno bravanje za ß-galaktozidazo razen dveh tipov nevronov kjer je bila prisotna ekspresija GFP.<br /> <br /> Mnogo izboljšav je lahko odgovornih za dano pluripotentnost celičnih linij.<br /> 1.) Visoka stopnja indukcije transgena preko rtTAM2.2 in daljši čas ekspresije reprogramijajočih faktorjev kot navadno (več časa za bolj popolno reprogramiranje)<br /> 2.) Reguliranje ekspresije našega transgena preko doksiciklina, kar je pomagalo preprečiti nepravilno ekspresijo reprogramijajočih faktorjev skozi embrionalni razvoj<br /> 3.) Daljša terapija z valproično kislino je lahko omogočila reprogramiranje epigenoma v stanje kromatina bolj podobnemu tistemu v ES celicah<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (2. primer)===<br /> <br /> V drugem primeru so mišje embrionalne fibroblaste ki odražajo Oct4 z GFP okužili (preko retrovirusa) z “Yamanaka” faktorji. Druga modifikacija je vključevala zamenjavo seruma v katerem se celice gojijo s fetalnim govejim serumom. <br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (2. primer)===<br /> <br /> Na gojiščih na katerih so gojili mišje embrionalne fibroblaste, v katere so prenesli Yamanaka faktorje, so po 10 dneh zaznali večjo količino alkalne fosfataze, katere povišana količina se pojavlja v membrani pluripotentih celic ter med drugim služi kot test pluripotentonost. Prav tako so zaznali zeleni fluorescirajoči protein (GPF), ki je kazal na prisotnost Oct4 (katerega količina upade ob začetku diferenciacije celic).<br /> <br /> Celice so iz gojišča odvzeli po 14 dneh, (celične linije IP14D), 20 dneh (celične linije IP20D) in 36 dneh (celične linije IP36D) ter na tak način pridobili 31 stabilnih celičnih linij, diploentnih celičnih linij s 40 kromosomi.<br /> <br /> Test bisulfidne metilacije je v treh od pridobljenih celičnih linij (IP20D-3, IP36D-3 ter IP14D-1) pokazal demetilacijo promotorjev Oct4 in Nanog, ki je zelo podobna demetilaciji kontrolne skupine embrionalnih celic, h krati pa se močno razlikuje od mišjih embrionalnih fibroblastov, iz katerih so z reprogramiranjem pridobili zgoraj omenjene pluripotentne celične linije. <br /> Pluripotentnost teh linij so dokazali tudi z vnosom le teh v miši s hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo pri katerih se je razvil teratom z vsemi tremi zarodnimi plastmi. <br /> <br /> Za nadaljnjo testiranje pluripotentnosti so naključno izbrali celične linije ter jih vključili v normalno CD-1 blastocisto ter jo prenesli v CD-1 samico miši, ter opazovali razvoj embriov do mladičev.<br /> Rezultati so pokazali da celične linije IP36D in IP20D razvijejo žive miški z 5-80% himernostjo, linije IP14D pa miši z 10-95% himernostjo. <br /> Kloniranje miši s tetraploidno komplementacijo ni bilo enako uspešno pri vseh celičnih linijah, iz celičnih linij IP36D so se sicer razvili embrii, ki pa so v 10. dnevu razvoja umrli. Celične linije IP20D prav tako niso razvile živih mladičev oz. embriov starejših od 17 dni, med tem ko se je iz celičnih linij IP14D razvilo tudi do 22 živih mladičev. <br /> Rezultati celične linije IP14D-1 so bili celo primerljivi z rezultati kontrolne skupine z embrionalnimi celicami (v obeh primerih se je razvilo približno 3% živih mladičev).<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (2. primer)===<br /> <br /> Bisulfitno sekveniranje pa je pokazalo demetilacijo na Nanog in Oct4 promotorjih v induciranih celičnih linijah, v primerjavi z originalnimi fibroblasti, ki kažejo veliko večjo metiliranosti. Se pa vzorec pogostosti metiliranja sovpada s tistim iz ES celic – kar kaže na potek epigenetskega reprogramiranja. Povečana stopnja demetilacije najverjetneje kaže na povečano stopnjo transkripcije pluripotentnih markerjev. <br /> Z uporabo PCR tehnike unikatnih mikrosatelitov se je dokazal izvor celic iz miši, ki je izključno iz pluripotentnih celičnih linij. Z kvantitativno reverzno PCR tehniko se je tudi tu dokazovala ekspresija štirih reprogramijajočih faktorjev.<br /> Analiza preko mikročipov je pokazala, da je ekspresija pluripotentnih markerjev podobna med iPS celicami in ES celicami, se pa izključuje z izvornimi fibroblastnimi celicami.<br /> <br /> Našemu sistemu zagotavljanja pluripotentnosti so bile dovedene genetske izboljšave. Na podlagi ugotavljanja epigenetskega statusa pluripotentnih celic iz celičnih linij, izražanju specifičnih pluripotentnih markerjev, dokazovanju izvora celic, specifičnosti sistema ter stopnje reprogramiranja so se dokazale številne izboljšave ter podprle polni pluripotentni status iPS celic.<br /> <br /> ==Preverjanje funkcionalne in razvojne pluripotentnosti==<br /> <br /> ===Funkcionalna pluripotentnost===<br /> <br /> Z določenimi metodami se preverja sposobnost diferenciacije celic v vse tri zarodne plasti, kar nakazuje na velik diferenciacijski potencial.<br /> <br /> Te raziskave lahko potekajo ''in vitro'', ena takih je oblikovanje embrioidnih teles. To so tridimenzionalni agregati matičnih celic, ki se spontano oblikujejo v suspenziji. Z njihovo pomočjo se oceni sposobnost diferenciacije in razvoja v vse tri zarodne plasti, vendar pa ne nakazujejo na izoblikovanje celic v strukture in tkiva.<br /> <br /> Pogosto se uporablja ''in vivo'' metoda, pri kateri se tvori teratom. Pri tem testu v miš, ki trpi za hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo (okvarjeni so limfociti T in B), injiciramo preiskovane iPS celice. Če so le-te pluripotentne, se razvijejo v teratom; tumor, ki vsebuje različne celice vseh treh zarodnih plasti.<br /> <br /> ===Razvojna pluripotentnost===<br /> <br /> To je najvišja raven pluripotentnosti, s katero se preverja sposobnost razvoja iPS celic v vse celične tipe odraslega organizma, vključno s spolnimi celicami.<br /> <br /> Ena od pogosto uporabljenih metod je tvorba himer. Himere so organizmi, ki so sestavljeni iz vsaj dveh vrst genetsko različnih celic in nastanejo pri spojitvi celic iz vsaj dveh zarodkov. Za namene raziskav iPS celic se himerne miši pripravijo z agregacijo preiskovanih matičnih celic z embrijem v 8-celičnem stadiju ali injiciranjem matičnih celic v blastocisto. Ta se nato prenese v mišjo samico, ki povrže himerne mladiče. Ti so glede na genetsko sestavo nekakšna mešanica obeh vrst uporabljenih celic. Injicirane matične celice prispevajo le k razvoju zarodka, ne pa tudi k nastanku izvenembrionalnih tkiv (placente).<br /> V obravnavanih raziskavah so za pripravo iPS celic uporabili embrionalne fibroblaste iz miši s črnim kožuhom, nato pa so iPS celice injicirali v blastocisto albino miši. Rojeni mladiči so imeli značilen lisast kožuh (črne in bele barve).<br /> <br /> Za najstrožji in najzahtevnejši test dokazovanja pluripotentnosti velja test tetraploidne komplementacije. Z uporabo električnega toka poteče pfuzija dveh zarodkov v 2-celičnem stadiju in tako nastane tetraploidna blastocista, iz katere se lahko diferencirajo izvenembrionalna tkiva, ne more pa se razviti zarodek. Šele z vnosom diploidnih matičnih celic v tetraploidno blastocisto omogočimo normalen razvoj zarodka, katerega celice izhajajo izključno iz injiciranih matičnih celic, placenta pa iz tetraploidnih celic.<br /> V raziskavah je tetraploidna blastocista izhajala iz albino miši, prav take vrste pa je bila tudi samica, v katero so vsadili tetraploidno celico z vnesenimi iPS celicami. Dobljene miši so bile izključno rjave barve, tako kot tiste, iz katerih so izolirali embrionalne fibroblaste za pripravo iPS celic, kar potrjuje, da celice organizma izhajajo le iz vnesenih iPS celic.<br /> <br /> Po uspešni tvorbi himer in tetraploidni komplementaciji se dobljene mišje samce pari s samicami. Z metodo prenosa genskega materiala se preverja, ali lahko iPS celice prispevajo tudi k razvoju funkcionalnih spolnih celic, ki so odgovorne za nastanek viabilnih potomcev.<br /> <br /> ==Odstotek viabilnosti in uspešnosti kloniranja==<br /> <br /> Odstotek preživelih v prvih uspešnih poskusih kloniranja miši iz induciranih pluripotentnih celic variira od 0,3% do 13% (odvisno od celične linije). Uspešnost kloniranja je podobna uspešni tetraploidne komplementacije z ES celicami ter SCNT-ES metodi. Večina preživelih osebkov ni kazala morfoloških defektov. Pri umrlih osebkih pa so se tipično kazale težave z dihanjem, ki je pogosta v tetraploidni komplementaciji z ES celicami.<br /> Kloniranje je pogosto kazalo morfološke abnormalnosti kot so težave pri dihanju, neonatalna prekomerna velikost ter splošno velik odstotek smrtnosti in neuspešnosti. Največji razlog se gotovo skriva v nepopolnem reprogramiranju celic uporabljenih za kloniranje in nepravilnim epigenetskim profilom. Samo področje je slabo raziskano.<br /> Študije so kljub temu pokazale da neonatalno prekomerno velikost povzroča tehnika kloniranja prenosa jedra (SCNT metoda). Prav tako so pokazale, da je povečana abnormalnost pri dihanju in večja smrtnost prisotna pri osebkih z nižjo stopnjo heterozigotnosti.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> Zaenkrat še ni znan univerzalen set označevalcev, ki bi nakazoval na popolno pluripotentnost iPS celic. Tetraploidna komplementacija zato ostaja najbolj primeren test za ocenjevanje sposobnosti iPS celic za razvoj v vse celične linije nekega organizma. Z uspešno pomnoženimi mišimi s testom tetraploidne komplementacije so dokazali, da je z direktnim reprogramiranjem s 4 faktorji možno ustvariti iPS celice, ki so funkcionalno primerljive z embrionalnimi celicami. Dokazana pa je tudi ”uspešnost” metode tetraploidne komplementacije z iPS celicami za pridobivanje odraslih miši iz diferenciranih celic.<br /> <br /> Še vedno pa ni povsem jasno, kaj povzroča razlike v pluripotentnosti med iPS celičnimi linijami. Raziskovalci domnevajo, da so za to odgovorne specifične značilnosti reprogramiranih celičnih linij. V prihodnosti bi bilo potrebno nameniti pozornost tudi delno reprogramiranim in manj pluripotentnim celičnim linijam, ki ne ustvarijo viabilnih miši pri testu tetraploidne komplementacije (zadoščajo pa katerim drugim kriterijem pluripotentnosti), saj bi z njihovim preučevanjem lahko odkrili razlike in mehanizme reprogramiranja na molekularni ravni.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> *Boland M.J. in sod. Adult mice generated from induced pluripotent stem cells. ''Nature'', 2009, številka 461, str. 91-94<br /> *Kang L. in Gao S. Pluripotency of induced pluripotent stem cells. ''Journal of animal science and biotechnology'', 2012, letnik 3, številka 5.<br /> *Smith K.P. in sod. Pluripotency: Toward a Gold Standard for Human ES and iPS Cells. ''Journal of Cell Physiology'', 2009, številka 220, str. 21-29<br /> *Stadtfeld M. in sod. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. ''Genes Dev''., 2010, letn. 24, str. 2239-2263.<br /> *Zhao X.Y. in sod. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. ''Nature'', 2009, številka 461, str. 86-90<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Kloniranje_mi%C5%A1i_iz_iPSC&diff=8176 2013-05-28T01:32:33Z

<p>AnaGrom: /* Pridobivanje celičnih linij (1. primer) */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> <br /> Odrasle diferencirane celice lahko z uporabo majhnega števila določenih transkripcijskih faktorjev reprogramiramo oz. spremenimo v inducirane pluripotentne matične celice (iPS celice), ki so v marsičem podobne embrionalnim matičnim celicam (ES celice). Z iPS celicami bi bilo možno zdraviti različne degenerativne in genetske bolezni, nadomeščati poškodovana tkiva, uporabne bi bile kot modeli za raziskave bolezni, pri vsem tem pa ne bi prišlo do etično sporne uporabe embrionalnih celic. Vendar pa imajo iPSC tudi določene slabosti; v nekaterih raziskavah so se izkazale za tumorigene in nagnjene k hitrejšemu celičnemu staranju.<br /> <br /> Pojavljalo pa se je tudi vprašanje o njihovi pluripotentnosti, saj je to ena od bistvenih značilnosti matičnih celic. Pluripotentne matične celice prispevajo k razvoju vseh treh zarodnih plasti (endoderma, mezoderma in ektoderma) in so se tako sposobne razviti v vse celice zarodka, ne morejo pa tvoriti izvenembrionalnih tkiv.<br /> <br /> ES celice so se izkazale kot bolj učikovite pri kloniranju. V naslednjih raziskavah se poroča o uspehih kloniranja živih miši iz reprogramiranih fibroblastov, kar kaže na to, da so lahko vse značilnosti stopnje pluripotentosti nadomeščene brez izpostavljanja neznanim ooplazemskim faktorjem. Primerjanje teh polno pluripotentnih iPS celičnih linij bo lahko pokazalo molekulske markerje potrebne za pluripotentna stanja.<br /> <br /> ==Preverjanje pluripotentnosti z genetskimi in celičnimi analizami==<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (1. primer)===<br /> <br /> V prvem primeru so se najprej lotili načrtovanja genetske oznake za razlikovanje izvora celic iz blastociste ali iPS celic. Mišje embriontske fibroblaste se je pridobilo s križanjem dveh mišjih trangenih linij (Pchd21/Cre ter Z/EG).<br /> *Z/EG linija vsebuje v večini celici viden ter selektiven marker ß-GEO (fuzija gena za ß-galaktozidazo ter gena za rezistenco na neomicin; tu pride lahko do detekcije aktivnega encime ß-galaktozidaze preko X-galaktoze, kjer se tvori modro obarvan produkt, ali pa se kot selekcijski marker uporabi odpornost klonov proti neomicinu; v raziskavi se je uporabil prvi marker).<br /> *Pchd21/Cre linija; promotor protokadherina 21(katerega ekspresija je značilna predvsem za dva tipa nevronov pri vohalnem sistemu v glomerulu) podpira ekspresijo Cre rekombinaze (je specifična rekombinaza, ki katalizira specifično rekombinacijo na točno določenem mestu v DNA).<br /> Tako je prišlo pri kombiniranju celičnih linij pri sveh tipih vohalnih nevronov miši, zaradi delovanja Cre rekombinaze do izreza »floksiranega« ß-geo gena, kar pa je kot za posledico imelo izražanje GFP (zelenega fluoscirajočega proteina).<br /> <br /> Nepravilno izražanje reprogramirajočih genov skozi razvoj bi lahko inhibiral embionalni in poporodni razvoj. Odločili so se za tesno kontrolo trangene ekspresije v iPS celicah. Štiri »Yamanaka« faktorje (Oct4, Klf4, Sox2 in Myc-c) so prenesli v celice preko retrovirusa ter ih postavili pod okrilje tetO promotorja (prepis pod tem promotorjem se inducira v prisotnosti antibiotika tetraciklina ali njegovih derivatov (npr. doksiciklina)). V našem sistemu je sistem aktiviran preko izboljšane verzije reverznega tetraciklin transaktivatorja (rtTAM2.2), v prisotnosti doksiciklina. Da bi se vpodbudila še večja učinkovitost reprogramiranja in izolacija popolno reprogramiranih iPS celic so izpostavili mišje embironalne fibroblaste valproični kislini, za katero se je izkazalo, da poveča reprogramsko učinkovitost in inhibicira nepopolnoma reprogramiranih celic z inhibicijo njihovih celičnih delitev.<br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (1. primer)===<br /> <br /> Z reprogramiranjem Pcdh21/cre-Z/EG fibroblastov se je po 5 dneh v prisotnosti dox in VPA in 7 dneh le v prisotnosti dox razvilo 21 celičnih linij, označenih z oznakami iMZ1-21.<br /> Ker univerzalnega testa za ugotavljanje pluripotetnosti še ni, so izvedli vrsto testiranj, na podlagi katerih so izbrali celične linije primerne za test tetraploidne komplementacije. <br /> <br /> Glede na morfologijo oz. nenormalno širjenje so zavrgli 9 celičnih linij, ostalih 5 pa testirali z imonofluorescenco za ekspresijo markerjev za pluripotentnost (Sox2, Oct4). <br /> Vse linije so vsebovale izražene markerje prav tako so se iz vseh razvila embrionalna telesa, pri katerih so testirali sposobnost tvorbe mišjih vohalnih nevronov. Celične linije so razdelili v 2 skupini: tiste, ki so razvile veliko število mišjih vohalnih nevronov: celične linije iMZ2, iMZ10, iMZ12, iMZ13, iMZ18, iMZ11, iMZ14, iMZ17, iMZ20 in iMZ21 ter skupino celičnih linij, ki so razvile malo vohalnih nevronov: iMZ3, iMZ15, iMZ7, iMZ9.<br /> V nadaljnjih testiranjih so linije primerjali s kontrolno skupino embrionalnih celic z imunooznačevanjem treh pluripotentnih markerjev za:<br /> <br /> Nanog: transkripcijski faktor za Rex1 promotor ter je ključnega pomena za ohranjanje pluripotentnosti (Rex1 je prav tako eden izmed markerjev za pluripotentnost, njegova količina močno upade ob začetku diferenciacije celic) <br /> <br /> Oct4: ta transkripcijski faktor je aktiven predvsem v oocitih, ostaja pa prisoten tudi v embriih. Pojavlja se tudi v nediferenciranih celicah tumorjev, njegovo utišanje pa pripelje do diferenciacije celic.<br /> <br /> Anti - SSEA-1: ob začetku diferenciacije celic se izražanje SSEA-1 gena močno poveča, antigene za SSEA-1 oz. drugače imenovanemu tudi CD15 najdemo v zarodnih oz. embrionalnih celicah glodavcev ter njihovih rakavih celicah.<br /> <br /> Na podlagi teh markerjev so ugotavljali podrobnosti z embrionalnimi celicami ter izbrali 7 celičnih linij, ki so se v podobnosti ujemale z embrionalnimi celicami in posledično razlikovale od fibroblastov iz katerih so reprogramirali iPS celice. <br /> 4 od 7 celičnih linij so razvile veliko mišjih vohalnih nevronov (iMZ9, iMZ11, iMZ14, iMZ17 in iMZ21). To skupino ter skupino linij, ki so bile pozitivne na vse pluripotentne markerje, vendar so razvile relativno nizko število vohalnih nevronov so izbrali za nadaljnje analize kariotipa. <br /> Štiri od osmih linij so bile euploidne (iMZ9, iMZ11, iMZ15 in iMZ21) ter tako primerne za uporabo v testu tetraploidne komplementacije.<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (1. primer)===<br /> <br /> Preko detekcije ß-galaktozidaze v mišjih tkivih (obarvanje celic iz celičnih linij in negativni rezultat pri celicah blastocist), PCR tehnike za detekcijo mikrosatelitnih markerjev in PCR tehnike za ugotavljanje prisotnosti albino (donor blastociste je albino osebek) mutacije na Tyr genu so dokazali, da konstitucija celic v mišjih osebkih izhaja izključno iz celice celičnih linij in so se vsa tkiva razvila izključno iz pluripotentnih celic.<br /> Southern blot analiza za Oct4 in rtTAM2.2 je pokazala vzorec provirusne integracije, ki je identična vzorcem integracije iz iPS celičnih linij. Nobena do sedaj znana ES celična linija ne vsebuje dane genetske modfikacije, kar kaže na to, da ni prišlo do kontaminacije z nobeno prej obstajajočo ES celično linijo.<br /> Kvantitativna PCR z reverzno transkripcijo (qRT-PCR) je pokazala skoraj popolno utišanost provirusnih transgenov pri iPSC celicah v odsotnosti doksicilkina. Celične linije so se ponovno tretirale z doksiciklinom. Iz celičnih linij, iz katerih je izšlo večina iPS miši je v odsotnosti doksiciklina bila prisotna reducirana ekspresija vseh 4ih reprogamirajočih faktorjev. Medtem ko je pri manj uspešnih linijah prišlo do zaznavne detekcije ekspresije Oct4 in /ali Klf4; kar kaže na nepopolno reprogramiranje manj uspešnih celičnih linij.<br /> Specifičnost sistema se je potrdila tudi z imunoflorescenčno analizo nevronov za percepcijo vonja, ki je kazala pozitivno bravanje za ß-galaktozidazo razen dveh tipov nevronov kjer je bila prisotna ekspresija GFP.<br /> <br /> Mnogo izboljšav je lahko odgovornih za dano pluripotentnost celičnih linij.<br /> 1.) Visoka stopnja indukcije transgena preko rtTAM2.2 in daljši čas ekspresije reprogramijajočih faktorjev kot navadno (več časa za bolj popolno reprogramiranje)<br /> 2.) Reguliranje ekspresije našega transgena preko doksiciklina, kar je pomagalo preprečiti nepravilno ekspresijo reprogramijajočih faktorjev skozi embrionalni razvoj<br /> 3.) Daljša terapija z valproično kislino je lahko omogočila reprogramiranje epigenoma v stanje kromatina bolj podobnemu tistemu v ES celicah<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (2. primer)===<br /> <br /> V drugem primeru so mišje embrionalne fibroblaste ki odražajo Oct4 z GFP okužili (preko retrovirusa) z “Yamanaka” faktorji. Druga modifikacija je vključevala zamenjavo seruma v katerem se celice gojijo s fetalnim govejim serumom. <br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (2. primer)===<br /> <br /> Na gojiščih na katerih so gojili mišje embrionalne fibroblaste, v katere so prenesli Yamanaka faktorje, so po 10 dneh zaznali večjo količino alkalne fosfataze, katere povišana količina se pojavlja v membrani pluripotentih celic ter med drugim služi kot test pluripotentonost. Prav tako so zaznali zeleni fluorescirajoči protein (GPF), ki je kazal na prisotnost Oct4 (katerega količina upade ob začetku diferenciacije celic).<br /> <br /> Celice so iz gojišča odvzeli po 14 dneh, (celične linije IP14D), 20 dneh (celične linije IP20D) in 36 dneh (celične linije IP36D) ter na tak način pridobili 31 stabilnih celičnih linij, diploentnih celičnih linij s 40 kromosomi.<br /> <br /> Test bisulfidne metilacije je v treh od pridobljenih celičnih linij (IP20D-3, IP36D-3 ter IP14D-1) pokazal demetilacijo promotorjev Oct4 in Nanog, ki je zelo podobna demetilaciji kontrolne skupine embrionalnih celic, h krati pa se močno razlikuje od mišjih embrionalnih fibroblastov, iz katerih so z reprogramiranjem pridobili zgoraj omenjene pluripotentne celične linije. <br /> Pluripotentnost teh linij so dokazali tudi z vnosom le teh v miši s hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo pri katerih se je razvil teratom z vsemi tremi zarodnimi plastmi. <br /> <br /> Za nadaljnjo testiranje pluripotentnosti so naključno izbrali celične linije ter jih vključili v normalno CD-1 blastocisto ter jo prenesli v CD-1 samico miši, ter opazovali razvoj embriov do mladičev.<br /> Rezultati so pokazali da celične linije IP36D in IP20D razvijejo žive miški z 5-80% himernostjo, linije IP14D pa miši z 10-95% himernostjo. <br /> Kloniranje miši s tetraploidno komplementacijo ni bilo enako uspešno pri vseh celičnih linijah, iz celičnih linij IP36D so se sicer razvili embrii, ki pa so v 10. dnevu razvoja umrli. Celične linije IP20D prav tako niso razvile živih mladičev oz. embriov starejših od 17 dni, med tem ko se je iz celičnih linij IP14D razvilo tudi do 22 živih mladičev. <br /> Rezultati celične linije IP14D-1 so bili celo primerljivi z rezultati kontrolne skupine z embrionalnimi celicami (v obeh primerih se je razvilo približno 3% živih mladičev).<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (2. primer)===<br /> <br /> Bisulfitno sekveniranje pa je pokazalo demetilacijo na Nanog in Oct4 promotorjih v induciranih celičnih linijah, v primerjavi z originalnimi fibroblasti, ki kažejo veliko večjo metiliranosti. Se pa vzorec pogostosti metiliranja sovpada s tistim iz ES celic – kar kaže na potek epigenetskega reprogramiranja. Povečana stopnja demetilacije najverjetneje kaže na povečano stopnjo transkripcije pluripotentnih markerjev. <br /> Z uporabo PCR tehnike unikatnih mikrosatelitov se je dokazal izvor celic iz miši, ki je izključno iz pluripotentnih celičnih linij. Z kvantitativno reverzno PCR tehniko se je tudi tu dokazovala ekspresija štirih reprogramijajočih faktorjev.<br /> Analiza preko mikročipov je pokazala, da je ekspresija pluripotentnih markerjev podobna med iPS celicami in ES celicami, se pa izključuje z izvornimi fibroblastnimi celicami.<br /> <br /> Našemu sistemu zagotavljanja pluripotentnosti so bile dovedene genetske izboljšave. Na podlagi ugotavljanja epigenetskega statusa pluripotentnih celic iz celičnih linij, izražanju specifičnih pluripotentnih markerjev, dokazovanju izvora celic, specifičnosti sistema ter stopnje reprogramiranja so se dokazale številne izboljšave ter podprle polni pluripotentni status iPS celic.<br /> <br /> ==Preverjanje funkcionalne in razvojne pluripotentnosti==<br /> <br /> ===Funkcionalna pluripotentnost===<br /> <br /> Z določenimi metodami se preverja sposobnost diferenciacije celic v vse tri zarodne plasti, kar nakazuje na velik diferenciacijski potencial.<br /> <br /> Te raziskave lahko potekajo ''in vitro'', ena takih je oblikovanje embrioidnih teles. To so tridimenzionalni agregati matičnih celic, ki se spontano oblikujejo v suspenziji. Z njihovo pomočjo se oceni sposobnost diferenciacije in razvoja v vse tri zarodne plasti, vendar pa ne nakazujejo na izoblikovanje celic v strukture in tkiva.<br /> <br /> Pogosto se uporablja ''in vivo'' metoda, pri kateri se tvori teratom. Pri tem testu v miš, ki trpi za hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo (okvarjeni so limfociti T in B), injiciramo preiskovane iPS celice. Če so le-te pluripotentne, se razvijejo v teratom; tumor, ki vsebuje različne celice vseh treh zarodnih plasti.<br /> <br /> ===Razvojna pluripotentnost===<br /> <br /> To je najvišja raven pluripotentnosti, s katero se preverja sposobnost razvoja iPS celic v vse celične tipe odraslega organizma, vključno s spolnimi celicami.<br /> <br /> Ena od pogosto uporabljenih metod je tvorba himer. Himere so organizmi, ki so sestavljeni iz vsaj dveh vrst genetsko različnih celic in nastanejo pri spojitvi celic iz vsaj dveh zarodkov. Za namene raziskav iPS celic se himerne miši pripravijo z agregacijo preiskovanih matičnih celic z embrijem v 8-celičnem stadiju ali injiciranjem matičnih celic v blastocisto. Ta se nato prenese v mišjo samico, ki povrže himerne mladiče. Ti so glede na genetsko sestavo nekakšna mešanica obeh vrst uporabljenih celic. Injicirane matične celice prispevajo le k razvoju zarodka, ne pa tudi k nastanku izvenembrionalnih tkiv (placente).<br /> V obravnavanih raziskavah so za pripravo iPS celic uporabili embrionalne fibroblaste iz miši s črnim kožuhom, nato pa so iPS celice injicirali v blastocisto albino miši. Rojeni mladiči so imeli značilen lisast kožuh (črne in bele barve).<br /> <br /> Za najstrožji in najzahtevnejši test dokazovanja pluripotentnosti velja test tetraploidne komplementacije. Z uporabo električnega toka poteče pfuzija dveh zarodkov v 2-celičnem stadiju in tako nastane tetraploidna blastocista, iz katere se lahko diferencirajo izvenembrionalna tkiva, ne more pa se razviti zarodek. Šele z vnosom diploidnih matičnih celic v tetraploidno blastocisto omogočimo normalen razvoj zarodka, katerega celice izhajajo izključno iz injiciranih matičnih celic, placenta pa iz tetraploidnih celic.<br /> V raziskavah je tetraploidna blastocista izhajala iz albino miši, prav take vrste pa je bila tudi samica, v katero so vsadili tetraploidno celico z vnesenimi iPS celicami. Dobljene miši so bile izključno rjave barve, tako kot tiste, iz katerih so izolirali embrionalne fibroblaste za pripravo iPS celic, kar potrjuje, da celice organizma izhajajo le iz vnesenih iPS celic.<br /> <br /> Po uspešni tvorbi himer in tetraploidni komplementaciji se dobljene mišje samce pari s samicami. Z metodo prenosa genskega materiala se preverja, ali lahko iPS celice prispevajo tudi k razvoju funkcionalnih spolnih celic, ki so odgovorne za nastanek viabilnih potomcev.<br /> <br /> ==Odstotek viabilnosti in uspešnosti kloniranja==<br /> <br /> Odstotek preživelih v prvih uspešnih poskusih kloniranja miši iz induciranih pluripotentnih celic variira od 0,3% do 13% (odvisno od celične linije). Uspešnost kloniranja je podobna uspešni tetraploidne komplementacije z ES celicami ter SCNT-ES metodi. Večina preživelih osebkov ni kazala morfoloških defektov. Pri umrlih osebkih pa so se tipično kazale težave z dihanjem, ki je pogosta v tetraploidni komplementaciji z ES celicami.<br /> Kloniranje je pogosto kazalo morfološke abnormalnosti kot so težave pri dihanju, neonatalna prekomerna velikost ter splošno velik odstotek smrtnosti in neuspešnosti. Največji razlog se gotovo skriva v nepopolnem reprogramiranju celic uporabljenih za kloniranje in nepravilnim epigenetskim profilom. Samo področje je slabo raziskano.<br /> Študije so kljub temu pokazale da neonatalno prekomerno velikost povzroča tehnika kloniranja prenosa jedra (SCNT metoda). Prav tako so pokazale, da je povečana abnormalnost pri dihanju in večja smrtnost prisotna pri osebkih z nižjo stopnjo heterozigotnosti.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> Zaenkrat še ni znan univerzalen set označevalcev, ki bi nakazoval na popolno pluripotentnost iPS celic. Tetraploidna komplementacija zato ostaja najbolj primeren test za ocenjevanje sposobnosti iPS celic za razvoj v vse celične linije nekega organizma. Z uspešno pomnoženimi mišimi s testom tetraploidne komplementacije so dokazali, da je z direktnim reprogramiranjem s 4 faktorji možno ustvariti iPS celice, ki so funkcionalno primerljive z embrionalnimi celicami. Dokazana pa je tudi ”uspešnost” metode tetraploidne komplementacije z iPS celicami za pridobivanje odraslih miši iz diferenciranih celic.<br /> <br /> Še vedno pa ni povsem jasno, kaj povzroča razlike v pluripotentnosti med iPS celičnimi linijami. Raziskovalci domnevajo, da so za to odgovorne specifične značilnosti reprogramiranih celičnih linij. V prihodnosti bi bilo potrebno nameniti pozornost tudi delno reprogramiranim in manj pluripotentnim celičnim linijam, ki ne ustvarijo viabilnih miši pri testu tetraploidne komplementacije (zadoščajo pa katerim drugim kriterijem pluripotentnosti), saj bi z njihovim preučevanjem lahko odkrili razlike in mehanizme reprogramiranja na molekularni ravni.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> *Boland M.J. in sod. Adult mice generated from induced pluripotent stem cells. ''Nature'', 2009, številka 461, str. 91-94<br /> *Kang L. in Gao S. Pluripotency of induced pluripotent stem cells. ''Journal of animal science and biotechnology'', 2012, letnik 3, številka 5.<br /> *Smith K.P. in sod. Pluripotency: Toward a Gold Standard for Human ES and iPS Cells. ''Journal of Cell Physiology'', 2009, številka 220, str. 21-29<br /> *Stadtfeld M. in sod. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. ''Genes Dev''., 2010, letn. 24, str. 2239-2263.<br /> *Zhao X.Y. in sod. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. ''Nature'', 2009, številka 461, str. 86-90<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Kloniranje_mi%C5%A1i_iz_iPSC&diff=8175 2013-05-28T01:32:08Z

<p>AnaGrom: /* Pridobivanje celičnih linij (1. primer) */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> <br /> Odrasle diferencirane celice lahko z uporabo majhnega števila določenih transkripcijskih faktorjev reprogramiramo oz. spremenimo v inducirane pluripotentne matične celice (iPS celice), ki so v marsičem podobne embrionalnim matičnim celicam (ES celice). Z iPS celicami bi bilo možno zdraviti različne degenerativne in genetske bolezni, nadomeščati poškodovana tkiva, uporabne bi bile kot modeli za raziskave bolezni, pri vsem tem pa ne bi prišlo do etično sporne uporabe embrionalnih celic. Vendar pa imajo iPSC tudi določene slabosti; v nekaterih raziskavah so se izkazale za tumorigene in nagnjene k hitrejšemu celičnemu staranju.<br /> <br /> Pojavljalo pa se je tudi vprašanje o njihovi pluripotentnosti, saj je to ena od bistvenih značilnosti matičnih celic. Pluripotentne matične celice prispevajo k razvoju vseh treh zarodnih plasti (endoderma, mezoderma in ektoderma) in so se tako sposobne razviti v vse celice zarodka, ne morejo pa tvoriti izvenembrionalnih tkiv.<br /> <br /> ES celice so se izkazale kot bolj učikovite pri kloniranju. V naslednjih raziskavah se poroča o uspehih kloniranja živih miši iz reprogramiranih fibroblastov, kar kaže na to, da so lahko vse značilnosti stopnje pluripotentosti nadomeščene brez izpostavljanja neznanim ooplazemskim faktorjem. Primerjanje teh polno pluripotentnih iPS celičnih linij bo lahko pokazalo molekulske markerje potrebne za pluripotentna stanja.<br /> <br /> ==Preverjanje pluripotentnosti z genetskimi in celičnimi analizami==<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (1. primer)===<br /> <br /> V prvem primeru so se najprej lotili načrtovanja genetske oznake za razlikovanje izvora celic iz blastociste ali iPS celic. Mišje embriontske fibroblaste se je pridobilo s križanjem dveh mišjih trangenih linij (Pchd21/Cre ter Z/EG).<br /> *Z/EG linija vsebuje v večini celici viden ter selektiven marker ß-GEO (fuzija gena za ß-galaktozidazo ter gena za rezistenco na neomicin; tu pride lahko do detekcije aktivnega encime ß-galaktozidaze preko X-galaktoze, kjer se tvori modro obarvan produkt, ali pa se kot selekcijski marker uporabi odpornost klonov proti neomicinu; v raziskavi se je uporabil prvi marker).<br /> *Pchd21/Cre linija; promotor protokadherina 21(katerega ekspresija je značilna predvsem za dva tipa nevronov pri vohalnem sistemu v glomerulu) podpira ekspresijo Cre rekombinaze (je specifična rekombinaza, ki katalizira specifično rekombinacijo na točno določenem mestu v DNA).<br /> Tako je prišlo pri kombiniranju celičnih linij pri sveh tipih vohalnih nevronov miši, zaradi delovanja Cre rekombinaze do izreza »floksiranega« ß-geo gena, kar pa je kot za posledico imelo izražanje GFP (zelenega fluoscirajočega proteina).<br /> <br /> Nepravilno izražanje reprogramirajočih genov skozi razvoj bi lahko inhibiral embionalni in poporodni razvoj. Odločili so se za tesno kontrolo trangene ekspresije v iPS celicah. Štiri »Yamanaka« faktorje (Oct4, Klf4, Sox2 in Myc-c) so prenesli v celice preko retrovirusa ter ih postavili pod okrilje tetO promotorja (prepis pod tem promotorjem se inducira v prisotnosti antibiotika tetraciklina ali njegovih derivatov (npr. doksiciklina)). V našem sistemu je sistem aktiviran preko izboljšane verzije reverznega tetraciklin transaktivatorja (rtTAM2.2), v prisotnosti doksiciklina. Da bi se vpodbudila še večja učinkovitost reprogramiranja in izolacija popolno reprogramiranih iPS celic so izpostavili mišje embironalne fibroblaste valproični kislini, za katero se je izkazalo, da poveča reprogramsko učinkovitost in inhibicira nepopolnoma reprogramiranih celic z inhibicijo njihovih celičnih delitev.<br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (1. primer)===<br /> <br /> Z reprogramiranjem Pcdh21/cre-Z/EG fibroblastov se je po 5 dneh v prisotnosti dox in VPA in 7 dneh le v prisotnosti dox razvilo 21 celičnih linij, označenih z oznakami iMZ1-21.<br /> Ker univerzalnega testa za ugotavljanje pluripotetnosti še ni, so izvedli vrsto testiranj, na podlagi katerih so izbrali celične linije primerne za test tetraploidne komplementacije. <br /> <br /> Glede na morfologijo oz. nenormalno širjenje so zavrgli 9 celičnih linij, ostalih 5 pa testirali z imonofluorescenco za ekspresijo markerjev za pluripotentnost (Sox2, Oct4). <br /> Vse linije so vsebovale izražene markerje prav tako so se iz vseh razvila embrionalna telesa, pri katerih so testirali sposobnost tvorbe mišjih vohalnih nevronov. Celične linije so razdelili v 2 skupini: tiste, ki so razvile veliko število mišjih vohalnih nevronov: celične linije iMZ2, iMZ10, iMZ12, iMZ13, iMZ18, iMZ11, iMZ14, iMZ17, iMZ20 in iMZ21 ter skupino celičnih linij, ki so razvile malo vohalnih nevronov: iMZ3, iMZ15, iMZ7, iMZ9.<br /> V nadaljnjih testiranjih so linije primerjali s kontrolno skupino embrionalnih celic z imunooznačevanjem treh pluripotentnih markerjev za:<br /> <br /> Nanog: transkripcijski faktor za Rex1 promotor ter je ključnega pomena za ohranjanje pluripotentnosti (Rex1 je prav tako eden izmed markerjev za pluripotentnost, njegova količina močno upade ob začetku diferenciacije celic) <br /> <br /> Oct4: ta transkripcijski faktor je aktiven predvsem v oocitih, ostaja pa prisoten tudi v embriih. Pojavlja se tudi v nediferenciranih celicah tumorjev, njegovo utišanje pa pripelje do diferenciacije celic.<br /> <br /> Anti - SSEA-1: ob začetku diferenciacije celic se izražanje SSEA-1 gena močno poveča, antigene za SSEA-1 oz. drugače imenovanemu tudi CD15 najdemo v zarodnih oz. embrionalnih celicah glodavcev ter njihovih rakavih celicah. <br /> Na podlagi teh markerjev so ugotavljali podrobnosti z embrionalnimi celicami ter izbrali 7 celičnih linij, ki so se v podobnosti ujemale z embrionalnimi celicami in posledično razlikovale od fibroblastov iz katerih so reprogramirali iPS celice. <br /> 4 od 7 celičnih linij so razvile veliko mišjih vohalnih nevronov (iMZ9, iMZ11, iMZ14, iMZ17 in iMZ21). To skupino ter skupino linij, ki so bile pozitivne na vse pluripotentne markerje, vendar so razvile relativno nizko število vohalnih nevronov so izbrali za nadaljnje analize kariotipa. <br /> Štiri od osmih linij so bile euploidne (iMZ9, iMZ11, iMZ15 in iMZ21) ter tako primerne za uporabo v testu tetraploidne komplementacije.<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (1. primer)===<br /> <br /> Preko detekcije ß-galaktozidaze v mišjih tkivih (obarvanje celic iz celičnih linij in negativni rezultat pri celicah blastocist), PCR tehnike za detekcijo mikrosatelitnih markerjev in PCR tehnike za ugotavljanje prisotnosti albino (donor blastociste je albino osebek) mutacije na Tyr genu so dokazali, da konstitucija celic v mišjih osebkih izhaja izključno iz celice celičnih linij in so se vsa tkiva razvila izključno iz pluripotentnih celic.<br /> Southern blot analiza za Oct4 in rtTAM2.2 je pokazala vzorec provirusne integracije, ki je identična vzorcem integracije iz iPS celičnih linij. Nobena do sedaj znana ES celična linija ne vsebuje dane genetske modfikacije, kar kaže na to, da ni prišlo do kontaminacije z nobeno prej obstajajočo ES celično linijo.<br /> Kvantitativna PCR z reverzno transkripcijo (qRT-PCR) je pokazala skoraj popolno utišanost provirusnih transgenov pri iPSC celicah v odsotnosti doksicilkina. Celične linije so se ponovno tretirale z doksiciklinom. Iz celičnih linij, iz katerih je izšlo večina iPS miši je v odsotnosti doksiciklina bila prisotna reducirana ekspresija vseh 4ih reprogamirajočih faktorjev. Medtem ko je pri manj uspešnih linijah prišlo do zaznavne detekcije ekspresije Oct4 in /ali Klf4; kar kaže na nepopolno reprogramiranje manj uspešnih celičnih linij.<br /> Specifičnost sistema se je potrdila tudi z imunoflorescenčno analizo nevronov za percepcijo vonja, ki je kazala pozitivno bravanje za ß-galaktozidazo razen dveh tipov nevronov kjer je bila prisotna ekspresija GFP.<br /> <br /> Mnogo izboljšav je lahko odgovornih za dano pluripotentnost celičnih linij.<br /> 1.) Visoka stopnja indukcije transgena preko rtTAM2.2 in daljši čas ekspresije reprogramijajočih faktorjev kot navadno (več časa za bolj popolno reprogramiranje)<br /> 2.) Reguliranje ekspresije našega transgena preko doksiciklina, kar je pomagalo preprečiti nepravilno ekspresijo reprogramijajočih faktorjev skozi embrionalni razvoj<br /> 3.) Daljša terapija z valproično kislino je lahko omogočila reprogramiranje epigenoma v stanje kromatina bolj podobnemu tistemu v ES celicah<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (2. primer)===<br /> <br /> V drugem primeru so mišje embrionalne fibroblaste ki odražajo Oct4 z GFP okužili (preko retrovirusa) z “Yamanaka” faktorji. Druga modifikacija je vključevala zamenjavo seruma v katerem se celice gojijo s fetalnim govejim serumom. <br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (2. primer)===<br /> <br /> Na gojiščih na katerih so gojili mišje embrionalne fibroblaste, v katere so prenesli Yamanaka faktorje, so po 10 dneh zaznali večjo količino alkalne fosfataze, katere povišana količina se pojavlja v membrani pluripotentih celic ter med drugim služi kot test pluripotentonost. Prav tako so zaznali zeleni fluorescirajoči protein (GPF), ki je kazal na prisotnost Oct4 (katerega količina upade ob začetku diferenciacije celic).<br /> <br /> Celice so iz gojišča odvzeli po 14 dneh, (celične linije IP14D), 20 dneh (celične linije IP20D) in 36 dneh (celične linije IP36D) ter na tak način pridobili 31 stabilnih celičnih linij, diploentnih celičnih linij s 40 kromosomi.<br /> <br /> Test bisulfidne metilacije je v treh od pridobljenih celičnih linij (IP20D-3, IP36D-3 ter IP14D-1) pokazal demetilacijo promotorjev Oct4 in Nanog, ki je zelo podobna demetilaciji kontrolne skupine embrionalnih celic, h krati pa se močno razlikuje od mišjih embrionalnih fibroblastov, iz katerih so z reprogramiranjem pridobili zgoraj omenjene pluripotentne celične linije. <br /> Pluripotentnost teh linij so dokazali tudi z vnosom le teh v miši s hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo pri katerih se je razvil teratom z vsemi tremi zarodnimi plastmi. <br /> <br /> Za nadaljnjo testiranje pluripotentnosti so naključno izbrali celične linije ter jih vključili v normalno CD-1 blastocisto ter jo prenesli v CD-1 samico miši, ter opazovali razvoj embriov do mladičev.<br /> Rezultati so pokazali da celične linije IP36D in IP20D razvijejo žive miški z 5-80% himernostjo, linije IP14D pa miši z 10-95% himernostjo. <br /> Kloniranje miši s tetraploidno komplementacijo ni bilo enako uspešno pri vseh celičnih linijah, iz celičnih linij IP36D so se sicer razvili embrii, ki pa so v 10. dnevu razvoja umrli. Celične linije IP20D prav tako niso razvile živih mladičev oz. embriov starejših od 17 dni, med tem ko se je iz celičnih linij IP14D razvilo tudi do 22 živih mladičev. <br /> Rezultati celične linije IP14D-1 so bili celo primerljivi z rezultati kontrolne skupine z embrionalnimi celicami (v obeh primerih se je razvilo približno 3% živih mladičev).<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (2. primer)===<br /> <br /> Bisulfitno sekveniranje pa je pokazalo demetilacijo na Nanog in Oct4 promotorjih v induciranih celičnih linijah, v primerjavi z originalnimi fibroblasti, ki kažejo veliko večjo metiliranosti. Se pa vzorec pogostosti metiliranja sovpada s tistim iz ES celic – kar kaže na potek epigenetskega reprogramiranja. Povečana stopnja demetilacije najverjetneje kaže na povečano stopnjo transkripcije pluripotentnih markerjev. <br /> Z uporabo PCR tehnike unikatnih mikrosatelitov se je dokazal izvor celic iz miši, ki je izključno iz pluripotentnih celičnih linij. Z kvantitativno reverzno PCR tehniko se je tudi tu dokazovala ekspresija štirih reprogramijajočih faktorjev.<br /> Analiza preko mikročipov je pokazala, da je ekspresija pluripotentnih markerjev podobna med iPS celicami in ES celicami, se pa izključuje z izvornimi fibroblastnimi celicami.<br /> <br /> Našemu sistemu zagotavljanja pluripotentnosti so bile dovedene genetske izboljšave. Na podlagi ugotavljanja epigenetskega statusa pluripotentnih celic iz celičnih linij, izražanju specifičnih pluripotentnih markerjev, dokazovanju izvora celic, specifičnosti sistema ter stopnje reprogramiranja so se dokazale številne izboljšave ter podprle polni pluripotentni status iPS celic.<br /> <br /> ==Preverjanje funkcionalne in razvojne pluripotentnosti==<br /> <br /> ===Funkcionalna pluripotentnost===<br /> <br /> Z določenimi metodami se preverja sposobnost diferenciacije celic v vse tri zarodne plasti, kar nakazuje na velik diferenciacijski potencial.<br /> <br /> Te raziskave lahko potekajo ''in vitro'', ena takih je oblikovanje embrioidnih teles. To so tridimenzionalni agregati matičnih celic, ki se spontano oblikujejo v suspenziji. Z njihovo pomočjo se oceni sposobnost diferenciacije in razvoja v vse tri zarodne plasti, vendar pa ne nakazujejo na izoblikovanje celic v strukture in tkiva.<br /> <br /> Pogosto se uporablja ''in vivo'' metoda, pri kateri se tvori teratom. Pri tem testu v miš, ki trpi za hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo (okvarjeni so limfociti T in B), injiciramo preiskovane iPS celice. Če so le-te pluripotentne, se razvijejo v teratom; tumor, ki vsebuje različne celice vseh treh zarodnih plasti.<br /> <br /> ===Razvojna pluripotentnost===<br /> <br /> To je najvišja raven pluripotentnosti, s katero se preverja sposobnost razvoja iPS celic v vse celične tipe odraslega organizma, vključno s spolnimi celicami.<br /> <br /> Ena od pogosto uporabljenih metod je tvorba himer. Himere so organizmi, ki so sestavljeni iz vsaj dveh vrst genetsko različnih celic in nastanejo pri spojitvi celic iz vsaj dveh zarodkov. Za namene raziskav iPS celic se himerne miši pripravijo z agregacijo preiskovanih matičnih celic z embrijem v 8-celičnem stadiju ali injiciranjem matičnih celic v blastocisto. Ta se nato prenese v mišjo samico, ki povrže himerne mladiče. Ti so glede na genetsko sestavo nekakšna mešanica obeh vrst uporabljenih celic. Injicirane matične celice prispevajo le k razvoju zarodka, ne pa tudi k nastanku izvenembrionalnih tkiv (placente).<br /> V obravnavanih raziskavah so za pripravo iPS celic uporabili embrionalne fibroblaste iz miši s črnim kožuhom, nato pa so iPS celice injicirali v blastocisto albino miši. Rojeni mladiči so imeli značilen lisast kožuh (črne in bele barve).<br /> <br /> Za najstrožji in najzahtevnejši test dokazovanja pluripotentnosti velja test tetraploidne komplementacije. Z uporabo električnega toka poteče pfuzija dveh zarodkov v 2-celičnem stadiju in tako nastane tetraploidna blastocista, iz katere se lahko diferencirajo izvenembrionalna tkiva, ne more pa se razviti zarodek. Šele z vnosom diploidnih matičnih celic v tetraploidno blastocisto omogočimo normalen razvoj zarodka, katerega celice izhajajo izključno iz injiciranih matičnih celic, placenta pa iz tetraploidnih celic.<br /> V raziskavah je tetraploidna blastocista izhajala iz albino miši, prav take vrste pa je bila tudi samica, v katero so vsadili tetraploidno celico z vnesenimi iPS celicami. Dobljene miši so bile izključno rjave barve, tako kot tiste, iz katerih so izolirali embrionalne fibroblaste za pripravo iPS celic, kar potrjuje, da celice organizma izhajajo le iz vnesenih iPS celic.<br /> <br /> Po uspešni tvorbi himer in tetraploidni komplementaciji se dobljene mišje samce pari s samicami. Z metodo prenosa genskega materiala se preverja, ali lahko iPS celice prispevajo tudi k razvoju funkcionalnih spolnih celic, ki so odgovorne za nastanek viabilnih potomcev.<br /> <br /> ==Odstotek viabilnosti in uspešnosti kloniranja==<br /> <br /> Odstotek preživelih v prvih uspešnih poskusih kloniranja miši iz induciranih pluripotentnih celic variira od 0,3% do 13% (odvisno od celične linije). Uspešnost kloniranja je podobna uspešni tetraploidne komplementacije z ES celicami ter SCNT-ES metodi. Večina preživelih osebkov ni kazala morfoloških defektov. Pri umrlih osebkih pa so se tipično kazale težave z dihanjem, ki je pogosta v tetraploidni komplementaciji z ES celicami.<br /> Kloniranje je pogosto kazalo morfološke abnormalnosti kot so težave pri dihanju, neonatalna prekomerna velikost ter splošno velik odstotek smrtnosti in neuspešnosti. Največji razlog se gotovo skriva v nepopolnem reprogramiranju celic uporabljenih za kloniranje in nepravilnim epigenetskim profilom. Samo področje je slabo raziskano.<br /> Študije so kljub temu pokazale da neonatalno prekomerno velikost povzroča tehnika kloniranja prenosa jedra (SCNT metoda). Prav tako so pokazale, da je povečana abnormalnost pri dihanju in večja smrtnost prisotna pri osebkih z nižjo stopnjo heterozigotnosti.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> Zaenkrat še ni znan univerzalen set označevalcev, ki bi nakazoval na popolno pluripotentnost iPS celic. Tetraploidna komplementacija zato ostaja najbolj primeren test za ocenjevanje sposobnosti iPS celic za razvoj v vse celične linije nekega organizma. Z uspešno pomnoženimi mišimi s testom tetraploidne komplementacije so dokazali, da je z direktnim reprogramiranjem s 4 faktorji možno ustvariti iPS celice, ki so funkcionalno primerljive z embrionalnimi celicami. Dokazana pa je tudi ”uspešnost” metode tetraploidne komplementacije z iPS celicami za pridobivanje odraslih miši iz diferenciranih celic.<br /> <br /> Še vedno pa ni povsem jasno, kaj povzroča razlike v pluripotentnosti med iPS celičnimi linijami. Raziskovalci domnevajo, da so za to odgovorne specifične značilnosti reprogramiranih celičnih linij. V prihodnosti bi bilo potrebno nameniti pozornost tudi delno reprogramiranim in manj pluripotentnim celičnim linijam, ki ne ustvarijo viabilnih miši pri testu tetraploidne komplementacije (zadoščajo pa katerim drugim kriterijem pluripotentnosti), saj bi z njihovim preučevanjem lahko odkrili razlike in mehanizme reprogramiranja na molekularni ravni.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> *Boland M.J. in sod. Adult mice generated from induced pluripotent stem cells. ''Nature'', 2009, številka 461, str. 91-94<br /> *Kang L. in Gao S. Pluripotency of induced pluripotent stem cells. ''Journal of animal science and biotechnology'', 2012, letnik 3, številka 5.<br /> *Smith K.P. in sod. Pluripotency: Toward a Gold Standard for Human ES and iPS Cells. ''Journal of Cell Physiology'', 2009, številka 220, str. 21-29<br /> *Stadtfeld M. in sod. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. ''Genes Dev''., 2010, letn. 24, str. 2239-2263.<br /> *Zhao X.Y. in sod. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. ''Nature'', 2009, številka 461, str. 86-90<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Kloniranje_mi%C5%A1i_iz_iPSC&diff=8174 2013-05-28T01:31:11Z

<p>AnaGrom: /* Pridobivanje celičnih linij (1. primer) */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> <br /> Odrasle diferencirane celice lahko z uporabo majhnega števila določenih transkripcijskih faktorjev reprogramiramo oz. spremenimo v inducirane pluripotentne matične celice (iPS celice), ki so v marsičem podobne embrionalnim matičnim celicam (ES celice). Z iPS celicami bi bilo možno zdraviti različne degenerativne in genetske bolezni, nadomeščati poškodovana tkiva, uporabne bi bile kot modeli za raziskave bolezni, pri vsem tem pa ne bi prišlo do etično sporne uporabe embrionalnih celic. Vendar pa imajo iPSC tudi določene slabosti; v nekaterih raziskavah so se izkazale za tumorigene in nagnjene k hitrejšemu celičnemu staranju.<br /> <br /> Pojavljalo pa se je tudi vprašanje o njihovi pluripotentnosti, saj je to ena od bistvenih značilnosti matičnih celic. Pluripotentne matične celice prispevajo k razvoju vseh treh zarodnih plasti (endoderma, mezoderma in ektoderma) in so se tako sposobne razviti v vse celice zarodka, ne morejo pa tvoriti izvenembrionalnih tkiv.<br /> <br /> ES celice so se izkazale kot bolj učikovite pri kloniranju. V naslednjih raziskavah se poroča o uspehih kloniranja živih miši iz reprogramiranih fibroblastov, kar kaže na to, da so lahko vse značilnosti stopnje pluripotentosti nadomeščene brez izpostavljanja neznanim ooplazemskim faktorjem. Primerjanje teh polno pluripotentnih iPS celičnih linij bo lahko pokazalo molekulske markerje potrebne za pluripotentna stanja.<br /> <br /> ==Preverjanje pluripotentnosti z genetskimi in celičnimi analizami==<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (1. primer)===<br /> <br /> V prvem primeru so se najprej lotili načrtovanja genetske oznake za razlikovanje izvora celic iz blastociste ali iPS celic. Mišje embriontske fibroblaste se je pridobilo s križanjem dveh mišjih trangenih linij (Pchd21/Cre ter Z/EG).<br /> *Z/EG linija vsebuje v večini celici viden ter selektiven marker ß-GEO (fuzija gena za ß-galaktozidazo ter gena za rezistenco na neomicin; tu pride lahko do detekcije aktivnega encime ß-galaktozidaze preko X-galaktoze, kjer se tvori modro obarvan produkt, ali pa se kot selekcijski marker uporabi odpornost klonov proti neomicinu; v raziskavi se je uporabil prvi marker).<br /> *Pchd21/Cre linija; promotor protokadherina 21(katerega ekspresija je značilna predvsem za dva tipa nevronov pri vohalnem sistemu v glomerulu) podpira ekspresijo Cre rekombinaze (je specifična rekombinaza, ki katalizira specifično rekombinacijo na točno določenem mestu v DNA).<br /> Tako je prišlo pri kombiniranju celičnih linij pri sveh tipih vohalnih nevronov miši, zaradi delovanja Cre rekombinaze do izreza »floksiranega« ß-geo gena, kar pa je kot za posledico imelo izražanje GFP (zelenega fluoscirajočega proteina).<br /> <br /> Nepravilno izražanje reprogramirajočih genov skozi razvoj bi lahko inhibiral embionalni in poporodni razvoj. Odločili so se za tesno kontrolo trangene ekspresije v iPS celicah. Štiri »Yamanaka« faktorje (Oct4, Klf4, Sox2 in Myc-c) so prenesli v celice preko retrovirusa ter ih postavili pod okrilje tetO promotorja (prepis pod tem promotorjem se inducira v prisotnosti antibiotika tetraciklina ali njegovih derivatov (npr. doksiciklina)). V našem sistemu je sistem aktiviran preko izboljšane verzije reverznega tetraciklin transaktivatorja (rtTAM2.2), v prisotnosti doksiciklina. Da bi se vpodbudila še večja učinkovitost reprogramiranja in izolacija popolno reprogramiranih iPS celic so izpostavili mišje embironalne fibroblaste valproični kislini, za katero se je izkazalo, da poveča reprogramsko učinkovitost in inhibicira nepopolnoma reprogramiranih celic z inhibicijo njihovih celičnih delitev.<br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (1. primer)===<br /> <br /> Z reprogramiranjem Pcdh21/cre-Z/EG fibroblastov se je po 5 dneh v prisotnosti dox in VPA in 7 dneh le v prisotnosti dox razvilo 21 celičnih linij, označenih z oznakami iMZ1-21.<br /> Ker univerzalnega testa za ugotavljanje pluripotetnosti še ni, so izvedli vrsto testiranj, na podlagi katerih so izbrali celične linije primerne za test tetraploidne komplementacije. <br /> <br /> Glede na morfologijo oz. nenormalno širjenje so zavrgli 9 celičnih linij, ostalih 5 pa testirali z imonofluorescenco za ekspresijo markerjev za pluripotentnost (Sox2, Oct4). <br /> Vse linije so vsebovale izražene markerje prav tako so se iz vseh razvila embrionalna telesa, pri katerih so testirali sposobnost tvorbe mišjih vohalnih nevronov. Celične linije so razdelili v 2 skupini: tiste, ki so razvile veliko število mišjih vohalnih nevronov: celične linije iMZ2, iMZ10, iMZ12, iMZ13, iMZ18, iMZ11, iMZ14, iMZ17, iMZ20 in iMZ21 ter skupino celičnih linij, ki so razvile malo vohalnih nevronov: iMZ3, iMZ15, iMZ7, iMZ9.<br /> V nadaljnjih testiranjih so linije primerjali s kontrolno skupino embrionalnih celic z imunooznačevanjem treh pluripotentnih markerjev za:<br /> Nanog: transkripcijski faktor za Rex1 promotor ter je ključnega pomena za ohranjanje pluripotentnosti (Rex1 je prav tako eden izmed markerjev za pluripotentnost, njegova količina močno upade ob začetku diferenciacije celic) <br /> Oct4: ta transkripcijski faktor je aktiven predvsem v oocitih, ostaja pa prisoten tudi v embriih. Pojavlja se tudi v nediferenciranih celicah tumorjev, njegovo utišanje pa pripelje do diferenciacije celic.<br /> Anti - SSEA-1: ob začetku diferenciacije celic se izražanje SSEA-1 gena močno poveča, antigene za SSEA-1 oz. drugače imenovanemu tudi CD15 najdemo v zarodnih oz. embrionalnih celicah glodavcev ter njihovih rakavih celicah. <br /> Na podlagi teh markerjev so ugotavljali podrobnosti z embrionalnimi celicami ter izbrali 7 celičnih linij, ki so se v podobnosti ujemale z embrionalnimi celicami in posledično razlikovale od fibroblastov iz katerih so reprogramirali iPS celice. <br /> 4 od 7 celičnih linij so razvile veliko mišjih vohalnih nevronov (iMZ9, iMZ11, iMZ14, iMZ17 in iMZ21). To skupino ter skupino linij, ki so bile pozitivne na vse pluripotentne markerje, vendar so razvile relativno nizko število vohalnih nevronov so izbrali za nadaljnje analize kariotipa. <br /> Štiri od osmih linij so bile euploidne (iMZ9, iMZ11, iMZ15 in iMZ21) ter tako primerne za uporabo v testu tetraploidne komplementacije.<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (1. primer)===<br /> <br /> Preko detekcije ß-galaktozidaze v mišjih tkivih (obarvanje celic iz celičnih linij in negativni rezultat pri celicah blastocist), PCR tehnike za detekcijo mikrosatelitnih markerjev in PCR tehnike za ugotavljanje prisotnosti albino (donor blastociste je albino osebek) mutacije na Tyr genu so dokazali, da konstitucija celic v mišjih osebkih izhaja izključno iz celice celičnih linij in so se vsa tkiva razvila izključno iz pluripotentnih celic.<br /> Southern blot analiza za Oct4 in rtTAM2.2 je pokazala vzorec provirusne integracije, ki je identična vzorcem integracije iz iPS celičnih linij. Nobena do sedaj znana ES celična linija ne vsebuje dane genetske modfikacije, kar kaže na to, da ni prišlo do kontaminacije z nobeno prej obstajajočo ES celično linijo.<br /> Kvantitativna PCR z reverzno transkripcijo (qRT-PCR) je pokazala skoraj popolno utišanost provirusnih transgenov pri iPSC celicah v odsotnosti doksicilkina. Celične linije so se ponovno tretirale z doksiciklinom. Iz celičnih linij, iz katerih je izšlo večina iPS miši je v odsotnosti doksiciklina bila prisotna reducirana ekspresija vseh 4ih reprogamirajočih faktorjev. Medtem ko je pri manj uspešnih linijah prišlo do zaznavne detekcije ekspresije Oct4 in /ali Klf4; kar kaže na nepopolno reprogramiranje manj uspešnih celičnih linij.<br /> Specifičnost sistema se je potrdila tudi z imunoflorescenčno analizo nevronov za percepcijo vonja, ki je kazala pozitivno bravanje za ß-galaktozidazo razen dveh tipov nevronov kjer je bila prisotna ekspresija GFP.<br /> <br /> Mnogo izboljšav je lahko odgovornih za dano pluripotentnost celičnih linij.<br /> 1.) Visoka stopnja indukcije transgena preko rtTAM2.2 in daljši čas ekspresije reprogramijajočih faktorjev kot navadno (več časa za bolj popolno reprogramiranje)<br /> 2.) Reguliranje ekspresije našega transgena preko doksiciklina, kar je pomagalo preprečiti nepravilno ekspresijo reprogramijajočih faktorjev skozi embrionalni razvoj<br /> 3.) Daljša terapija z valproično kislino je lahko omogočila reprogramiranje epigenoma v stanje kromatina bolj podobnemu tistemu v ES celicah<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (2. primer)===<br /> <br /> V drugem primeru so mišje embrionalne fibroblaste ki odražajo Oct4 z GFP okužili (preko retrovirusa) z “Yamanaka” faktorji. Druga modifikacija je vključevala zamenjavo seruma v katerem se celice gojijo s fetalnim govejim serumom. <br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (2. primer)===<br /> <br /> Na gojiščih na katerih so gojili mišje embrionalne fibroblaste, v katere so prenesli Yamanaka faktorje, so po 10 dneh zaznali večjo količino alkalne fosfataze, katere povišana količina se pojavlja v membrani pluripotentih celic ter med drugim služi kot test pluripotentonost. Prav tako so zaznali zeleni fluorescirajoči protein (GPF), ki je kazal na prisotnost Oct4 (katerega količina upade ob začetku diferenciacije celic).<br /> <br /> Celice so iz gojišča odvzeli po 14 dneh, (celične linije IP14D), 20 dneh (celične linije IP20D) in 36 dneh (celične linije IP36D) ter na tak način pridobili 31 stabilnih celičnih linij, diploentnih celičnih linij s 40 kromosomi.<br /> <br /> Test bisulfidne metilacije je v treh od pridobljenih celičnih linij (IP20D-3, IP36D-3 ter IP14D-1) pokazal demetilacijo promotorjev Oct4 in Nanog, ki je zelo podobna demetilaciji kontrolne skupine embrionalnih celic, h krati pa se močno razlikuje od mišjih embrionalnih fibroblastov, iz katerih so z reprogramiranjem pridobili zgoraj omenjene pluripotentne celične linije. <br /> Pluripotentnost teh linij so dokazali tudi z vnosom le teh v miši s hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo pri katerih se je razvil teratom z vsemi tremi zarodnimi plastmi. <br /> <br /> Za nadaljnjo testiranje pluripotentnosti so naključno izbrali celične linije ter jih vključili v normalno CD-1 blastocisto ter jo prenesli v CD-1 samico miši, ter opazovali razvoj embriov do mladičev.<br /> Rezultati so pokazali da celične linije IP36D in IP20D razvijejo žive miški z 5-80% himernostjo, linije IP14D pa miši z 10-95% himernostjo. <br /> Kloniranje miši s tetraploidno komplementacijo ni bilo enako uspešno pri vseh celičnih linijah, iz celičnih linij IP36D so se sicer razvili embrii, ki pa so v 10. dnevu razvoja umrli. Celične linije IP20D prav tako niso razvile živih mladičev oz. embriov starejših od 17 dni, med tem ko se je iz celičnih linij IP14D razvilo tudi do 22 živih mladičev. <br /> Rezultati celične linije IP14D-1 so bili celo primerljivi z rezultati kontrolne skupine z embrionalnimi celicami (v obeh primerih se je razvilo približno 3% živih mladičev).<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (2. primer)===<br /> <br /> Bisulfitno sekveniranje pa je pokazalo demetilacijo na Nanog in Oct4 promotorjih v induciranih celičnih linijah, v primerjavi z originalnimi fibroblasti, ki kažejo veliko večjo metiliranosti. Se pa vzorec pogostosti metiliranja sovpada s tistim iz ES celic – kar kaže na potek epigenetskega reprogramiranja. Povečana stopnja demetilacije najverjetneje kaže na povečano stopnjo transkripcije pluripotentnih markerjev. <br /> Z uporabo PCR tehnike unikatnih mikrosatelitov se je dokazal izvor celic iz miši, ki je izključno iz pluripotentnih celičnih linij. Z kvantitativno reverzno PCR tehniko se je tudi tu dokazovala ekspresija štirih reprogramijajočih faktorjev.<br /> Analiza preko mikročipov je pokazala, da je ekspresija pluripotentnih markerjev podobna med iPS celicami in ES celicami, se pa izključuje z izvornimi fibroblastnimi celicami.<br /> <br /> Našemu sistemu zagotavljanja pluripotentnosti so bile dovedene genetske izboljšave. Na podlagi ugotavljanja epigenetskega statusa pluripotentnih celic iz celičnih linij, izražanju specifičnih pluripotentnih markerjev, dokazovanju izvora celic, specifičnosti sistema ter stopnje reprogramiranja so se dokazale številne izboljšave ter podprle polni pluripotentni status iPS celic.<br /> <br /> ==Preverjanje funkcionalne in razvojne pluripotentnosti==<br /> <br /> ===Funkcionalna pluripotentnost===<br /> <br /> Z določenimi metodami se preverja sposobnost diferenciacije celic v vse tri zarodne plasti, kar nakazuje na velik diferenciacijski potencial.<br /> <br /> Te raziskave lahko potekajo ''in vitro'', ena takih je oblikovanje embrioidnih teles. To so tridimenzionalni agregati matičnih celic, ki se spontano oblikujejo v suspenziji. Z njihovo pomočjo se oceni sposobnost diferenciacije in razvoja v vse tri zarodne plasti, vendar pa ne nakazujejo na izoblikovanje celic v strukture in tkiva.<br /> <br /> Pogosto se uporablja ''in vivo'' metoda, pri kateri se tvori teratom. Pri tem testu v miš, ki trpi za hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo (okvarjeni so limfociti T in B), injiciramo preiskovane iPS celice. Če so le-te pluripotentne, se razvijejo v teratom; tumor, ki vsebuje različne celice vseh treh zarodnih plasti.<br /> <br /> ===Razvojna pluripotentnost===<br /> <br /> To je najvišja raven pluripotentnosti, s katero se preverja sposobnost razvoja iPS celic v vse celične tipe odraslega organizma, vključno s spolnimi celicami.<br /> <br /> Ena od pogosto uporabljenih metod je tvorba himer. Himere so organizmi, ki so sestavljeni iz vsaj dveh vrst genetsko različnih celic in nastanejo pri spojitvi celic iz vsaj dveh zarodkov. Za namene raziskav iPS celic se himerne miši pripravijo z agregacijo preiskovanih matičnih celic z embrijem v 8-celičnem stadiju ali injiciranjem matičnih celic v blastocisto. Ta se nato prenese v mišjo samico, ki povrže himerne mladiče. Ti so glede na genetsko sestavo nekakšna mešanica obeh vrst uporabljenih celic. Injicirane matične celice prispevajo le k razvoju zarodka, ne pa tudi k nastanku izvenembrionalnih tkiv (placente).<br /> V obravnavanih raziskavah so za pripravo iPS celic uporabili embrionalne fibroblaste iz miši s črnim kožuhom, nato pa so iPS celice injicirali v blastocisto albino miši. Rojeni mladiči so imeli značilen lisast kožuh (črne in bele barve).<br /> <br /> Za najstrožji in najzahtevnejši test dokazovanja pluripotentnosti velja test tetraploidne komplementacije. Z uporabo električnega toka poteče pfuzija dveh zarodkov v 2-celičnem stadiju in tako nastane tetraploidna blastocista, iz katere se lahko diferencirajo izvenembrionalna tkiva, ne more pa se razviti zarodek. Šele z vnosom diploidnih matičnih celic v tetraploidno blastocisto omogočimo normalen razvoj zarodka, katerega celice izhajajo izključno iz injiciranih matičnih celic, placenta pa iz tetraploidnih celic.<br /> V raziskavah je tetraploidna blastocista izhajala iz albino miši, prav take vrste pa je bila tudi samica, v katero so vsadili tetraploidno celico z vnesenimi iPS celicami. Dobljene miši so bile izključno rjave barve, tako kot tiste, iz katerih so izolirali embrionalne fibroblaste za pripravo iPS celic, kar potrjuje, da celice organizma izhajajo le iz vnesenih iPS celic.<br /> <br /> Po uspešni tvorbi himer in tetraploidni komplementaciji se dobljene mišje samce pari s samicami. Z metodo prenosa genskega materiala se preverja, ali lahko iPS celice prispevajo tudi k razvoju funkcionalnih spolnih celic, ki so odgovorne za nastanek viabilnih potomcev.<br /> <br /> ==Odstotek viabilnosti in uspešnosti kloniranja==<br /> <br /> Odstotek preživelih v prvih uspešnih poskusih kloniranja miši iz induciranih pluripotentnih celic variira od 0,3% do 13% (odvisno od celične linije). Uspešnost kloniranja je podobna uspešni tetraploidne komplementacije z ES celicami ter SCNT-ES metodi. Večina preživelih osebkov ni kazala morfoloških defektov. Pri umrlih osebkih pa so se tipično kazale težave z dihanjem, ki je pogosta v tetraploidni komplementaciji z ES celicami.<br /> Kloniranje je pogosto kazalo morfološke abnormalnosti kot so težave pri dihanju, neonatalna prekomerna velikost ter splošno velik odstotek smrtnosti in neuspešnosti. Največji razlog se gotovo skriva v nepopolnem reprogramiranju celic uporabljenih za kloniranje in nepravilnim epigenetskim profilom. Samo področje je slabo raziskano.<br /> Študije so kljub temu pokazale da neonatalno prekomerno velikost povzroča tehnika kloniranja prenosa jedra (SCNT metoda). Prav tako so pokazale, da je povečana abnormalnost pri dihanju in večja smrtnost prisotna pri osebkih z nižjo stopnjo heterozigotnosti.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> Zaenkrat še ni znan univerzalen set označevalcev, ki bi nakazoval na popolno pluripotentnost iPS celic. Tetraploidna komplementacija zato ostaja najbolj primeren test za ocenjevanje sposobnosti iPS celic za razvoj v vse celične linije nekega organizma. Z uspešno pomnoženimi mišimi s testom tetraploidne komplementacije so dokazali, da je z direktnim reprogramiranjem s 4 faktorji možno ustvariti iPS celice, ki so funkcionalno primerljive z embrionalnimi celicami. Dokazana pa je tudi ”uspešnost” metode tetraploidne komplementacije z iPS celicami za pridobivanje odraslih miši iz diferenciranih celic.<br /> <br /> Še vedno pa ni povsem jasno, kaj povzroča razlike v pluripotentnosti med iPS celičnimi linijami. Raziskovalci domnevajo, da so za to odgovorne specifične značilnosti reprogramiranih celičnih linij. V prihodnosti bi bilo potrebno nameniti pozornost tudi delno reprogramiranim in manj pluripotentnim celičnim linijam, ki ne ustvarijo viabilnih miši pri testu tetraploidne komplementacije (zadoščajo pa katerim drugim kriterijem pluripotentnosti), saj bi z njihovim preučevanjem lahko odkrili razlike in mehanizme reprogramiranja na molekularni ravni.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> *Boland M.J. in sod. Adult mice generated from induced pluripotent stem cells. ''Nature'', 2009, številka 461, str. 91-94<br /> *Kang L. in Gao S. Pluripotency of induced pluripotent stem cells. ''Journal of animal science and biotechnology'', 2012, letnik 3, številka 5.<br /> *Smith K.P. in sod. Pluripotency: Toward a Gold Standard for Human ES and iPS Cells. ''Journal of Cell Physiology'', 2009, številka 220, str. 21-29<br /> *Stadtfeld M. in sod. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. ''Genes Dev''., 2010, letn. 24, str. 2239-2263.<br /> *Zhao X.Y. in sod. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. ''Nature'', 2009, številka 461, str. 86-90<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Kloniranje_mi%C5%A1i_iz_iPSC&diff=8173 2013-05-28T01:06:04Z

<p>AnaGrom: /* Pridobivanje celičnih linij (1. primer) */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> <br /> Odrasle diferencirane celice lahko z uporabo majhnega števila določenih transkripcijskih faktorjev reprogramiramo oz. spremenimo v inducirane pluripotentne matične celice (iPS celice), ki so v marsičem podobne embrionalnim matičnim celicam (ES celice). Z iPS celicami bi bilo možno zdraviti različne degenerativne in genetske bolezni, nadomeščati poškodovana tkiva, uporabne bi bile kot modeli za raziskave bolezni, pri vsem tem pa ne bi prišlo do etično sporne uporabe embrionalnih celic. Vendar pa imajo iPSC tudi določene slabosti; v nekaterih raziskavah so se izkazale za tumorigene in nagnjene k hitrejšemu celičnemu staranju.<br /> <br /> Pojavljalo pa se je tudi vprašanje o njihovi pluripotentnosti, saj je to ena od bistvenih značilnosti matičnih celic. Pluripotentne matične celice prispevajo k razvoju vseh treh zarodnih plasti (endoderma, mezoderma in ektoderma) in so se tako sposobne razviti v vse celice zarodka, ne morejo pa tvoriti izvenembrionalnih tkiv.<br /> <br /> ES celice so se izkazale kot bolj učikovite pri kloniranju. V naslednjih raziskavah se poroča o uspehih kloniranja živih miši iz reprogramiranih fibroblastov, kar kaže na to, da so lahko vse značilnosti stopnje pluripotentosti nadomeščene brez izpostavljanja neznanim ooplazemskim faktorjem. Primerjanje teh polno pluripotentnih iPS celičnih linij bo lahko pokazalo molekulske markerje potrebne za pluripotentna stanja.<br /> <br /> ==Preverjanje pluripotentnosti z genetskimi in celičnimi analizami==<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (1. primer)===<br /> <br /> V prvem primeru so se najprej lotili načrtovanja genetske oznake za razlikovanje izvora celic iz blastociste ali iPS celic. Mišje embriontske fibroblaste se je pridobilo s križanjem dveh mišjih trangenih linij (Pchd21/Cre ter Z/EG).<br /> *Z/EG linija vsebuje v večini celici viden ter selektiven marker ß-GEO (fuzija gena za ß-galaktozidazo ter gena za rezistenco na neomicin; tu pride lahko do detekcije aktivnega encime ß-galaktozidaze preko X-galaktoze, kjer se tvori modro obarvan produkt, ali pa se kot selekcijski marker uporabi odpornost klonov proti neomicinu; v raziskavi se je uporabil prvi marker).<br /> *Pchd21/Cre linija; promotor protokadherina 21(katerega ekspresija je značilna predvsem za dva tipa nevronov pri vohalnem sistemu v glomerulu) podpira ekspresijo Cre rekombinaze (je specifična rekombinaza, ki katalizira specifično rekombinacijo na točno določenem mestu v DNA).<br /> Tako je prišlo pri kombiniranju celičnih linij pri sveh tipih vohalnih nevronov miši, zaradi delovanja Cre rekombinaze do izreza »floksiranega« ß-geo gena, kar pa je kot za posledico imelo izražanje GFP (zelenega fluoscirajočega proteina).<br /> <br /> Nepravilno izražanje reprogramirajočih genov skozi razvoj bi lahko inhibiral embionalni in poporodni razvoj. Odločili so se za tesno kontrolo trangene ekspresije v iPS celicah. Štiri »Yamanaka« faktorje (Oct4, Klf4, Sox2 in Myc-c) so prenesli v celice preko retrovirusa ter ih postavili pod okrilje tetO promotorja (prepis pod tem promotorjem se inducira v prisotnosti antibiotika tetraciklina ali njegovih derivatov (npr. doksiciklina)). V našem sistemu je sistem aktiviran preko izboljšane verzije reverznega tetraciklin transaktivatorja (rtTAM2.2), v prisotnosti doksiciklina. Da bi se vpodbudila še večja učinkovitost reprogramiranja in izolacija popolno reprogramiranih iPS celic so izpostavili mišje embironalne fibroblaste valproični kislini, za katero se je izkazalo, da poveča reprogramsko učinkovitost in inhibicira nepopolnoma reprogramiranih celic z inhibicijo njihovih celičnih delitev.<br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (1. primer)===<br /> <br /> Z reprogramiranjem Pcdh21/cre-Z/EG fibroblastov se je po 5 dneh v prisotnosti dox in VPA in 7 dneh le v prisotnosti dox razvilo 21 celičnih linij, označenih z oznakami iMZ1-21.<br /> Ker univerzalnega testa za ugotavljanje pluripotetnosti še ni, so izvedli vrsto testiranj, na podlagi katerih so izbrali celične linije primerne za test tetraploidne komplementacije. <br /> <br /> Glede na morfologijo oz. nenormalno širjenje so zavrgli 9 celičnih linij, ostalih 5 pa testirali z imonofluorescenco za ekspresijo markerjev za pluripotentnost (Sox2, Oct4). <br /> Vse linije so vsebovale izražene markerje prav tako so se iz vseh razvila embrionalna telesa, pri katerih so testirali sposobnost tvorbe mišjih vohalnih nevronov. Celične linije so razdelili v 2 skupini: tiste, ki so razvile veliko število mišjih vohalnih nevronov: celične linije iMZ2, iMZ10, iMZ12, iMZ13, iMZ18, iMZ11, iMZ14, iMZ17, iMZ20 in iMZ21 (ob testiranju z imunofluorescenco, so zaradi proteina GFP s katerim so testirali izražanje Oct4, linije fluorescirale močno zeleno) ter skupino celičnih linij, ki so razvile malo vohalnih nevronov: iMZ3, iMZ15, iMZ7, iMZ9.<br /> V nadaljnjih testiranjih so linije primerjali s kontrolno skupino embrionalnih celic z imunooznačevanjem treh pluripotentnih markerjev za:<br /> Nanog: transkripcijski faktor za Rex1 promotor ter je ključnega pomena za ohranjanje pluripotentnosti (Rex1 je prav tako eden izmed markerjev za pluripotentnost, njegova količina močno upade ob začetku diferenciacije celic) <br /> Oct4: ta transkripcijski faktor je aktiven predvsem v oocitih, ostaja pa prisoten tudi v embriih. Pojavlja se tudi v nediferenciranih celicah tumorjev, njegovo utišanje pa pripelje do diferenciacije celic.<br /> Anti - SSEA-1: ob začetku diferenciacije celic se izražanje SSEA-1 gena močno poveča, antigene za SSEA-1 oz. drugače imenovanemu tudi CD15 najdemo v zarodnih oz. embrionalnih celicah glodavcev ter njihovih rakavih celicah. <br /> Na podlagi teh markerjev so ugotavljali podrobnosti z embrionalnimi celicami ter izbrali 7 celičnih linij, ki so se v podobnosti ujemale z embrionalnimi celicami in posledično razlikovale od fibroblastov iz katerih so reprogramirali iPS celice. <br /> 4 od 7 celičnih linij so razvile veliko mišjih vohalnih nevronov (iMZ9, iMZ11, iMZ14, iMZ17 in iMZ21). To skupino ter skupino linij, ki so bile pozitivne na vse pluripotentne markerje, vendar so razvile relativno nizko število vohalnih nevronov so izbrali za nadaljnje analize kariotipa. <br /> Štiri od osmih linij so bile euploidne (iMZ9, iMZ11, iMZ15 in iMZ21) ter tako primerne za uporabo v testu tetraploidne komplementacije.<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (1. primer)===<br /> <br /> Preko detekcije ß-galaktozidaze v mišjih tkivih (obarvanje celic iz celičnih linij in negativni rezultat pri celicah blastocist), PCR tehnike za detekcijo mikrosatelitnih markerjev in PCR tehnike za ugotavljanje prisotnosti albino (donor blastociste je albino osebek) mutacije na Tyr genu so dokazali, da konstitucija celic v mišjih osebkih izhaja izključno iz celice celičnih linij in so se vsa tkiva razvila izključno iz pluripotentnih celic.<br /> Southern blot analiza za Oct4 in rtTAM2.2 je pokazala vzorec provirusne integracije, ki je identična vzorcem integracije iz iPS celičnih linij. Nobena do sedaj znana ES celična linija ne vsebuje dane genetske modfikacije, kar kaže na to, da ni prišlo do kontaminacije z nobeno prej obstajajočo ES celično linijo.<br /> Kvantitativna PCR z reverzno transkripcijo (qRT-PCR) je pokazala skoraj popolno utišanost provirusnih transgenov pri iPSC celicah v odsotnosti doksicilkina. Celične linije so se ponovno tretirale z doksiciklinom. Iz celičnih linij, iz katerih je izšlo večina iPS miši je v odsotnosti doksiciklina bila prisotna reducirana ekspresija vseh 4ih reprogamirajočih faktorjev. Medtem ko je pri manj uspešnih linijah prišlo do zaznavne detekcije ekspresije Oct4 in /ali Klf4; kar kaže na nepopolno reprogramiranje manj uspešnih celičnih linij.<br /> Specifičnost sistema se je potrdila tudi z imunoflorescenčno analizo nevronov za percepcijo vonja, ki je kazala pozitivno bravanje za ß-galaktozidazo razen dveh tipov nevronov kjer je bila prisotna ekspresija GFP.<br /> <br /> Mnogo izboljšav je lahko odgovornih za dano pluripotentnost celičnih linij.<br /> 1.) Visoka stopnja indukcije transgena preko rtTAM2.2 in daljši čas ekspresije reprogramijajočih faktorjev kot navadno (več časa za bolj popolno reprogramiranje)<br /> 2.) Reguliranje ekspresije našega transgena preko doksiciklina, kar je pomagalo preprečiti nepravilno ekspresijo reprogramijajočih faktorjev skozi embrionalni razvoj<br /> 3.) Daljša terapija z valproično kislino je lahko omogočila reprogramiranje epigenoma v stanje kromatina bolj podobnemu tistemu v ES celicah<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (2. primer)===<br /> <br /> V drugem primeru so mišje embrionalne fibroblaste ki odražajo Oct4 z GFP okužili (preko retrovirusa) z “Yamanaka” faktorji. Druga modifikacija je vključevala zamenjavo seruma v katerem se celice gojijo s fetalnim govejim serumom. <br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (2. primer)===<br /> <br /> Na gojiščih na katerih so gojili mišje embrionalne fibroblaste, v katere so prenesli Yamanaka faktorje, so po 10 dneh zaznali večjo količino alkalne fosfataze, katere povišana količina se pojavlja v membrani pluripotentih celic ter med drugim služi kot test pluripotentonost. Prav tako so zaznali zeleni fluorescirajoči protein (GPF), ki je kazal na prisotnost Oct4 (katerega količina upade ob začetku diferenciacije celic).<br /> <br /> Celice so iz gojišča odvzeli po 14 dneh, (celične linije IP14D), 20 dneh (celične linije IP20D) in 36 dneh (celične linije IP36D) ter na tak način pridobili 31 stabilnih celičnih linij, diploentnih celičnih linij s 40 kromosomi.<br /> <br /> Test bisulfidne metilacije je v treh od pridobljenih celičnih linij (IP20D-3, IP36D-3 ter IP14D-1) pokazal demetilacijo promotorjev Oct4 in Nanog, ki je zelo podobna demetilaciji kontrolne skupine embrionalnih celic, h krati pa se močno razlikuje od mišjih embrionalnih fibroblastov, iz katerih so z reprogramiranjem pridobili zgoraj omenjene pluripotentne celične linije. <br /> Pluripotentnost teh linij so dokazali tudi z vnosom le teh v miši s hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo pri katerih se je razvil teratom z vsemi tremi zarodnimi plastmi. <br /> <br /> Za nadaljnjo testiranje pluripotentnosti so naključno izbrali celične linije ter jih vključili v normalno CD-1 blastocisto ter jo prenesli v CD-1 samico miši, ter opazovali razvoj embriov do mladičev.<br /> Rezultati so pokazali da celične linije IP36D in IP20D razvijejo žive miški z 5-80% himernostjo, linije IP14D pa miši z 10-95% himernostjo. <br /> Kloniranje miši s tetraploidno komplementacijo ni bilo enako uspešno pri vseh celičnih linijah, iz celičnih linij IP36D so se sicer razvili embrii, ki pa so v 10. dnevu razvoja umrli. Celične linije IP20D prav tako niso razvile živih mladičev oz. embriov starejših od 17 dni, med tem ko se je iz celičnih linij IP14D razvilo tudi do 22 živih mladičev. <br /> Rezultati celične linije IP14D-1 so bili celo primerljivi z rezultati kontrolne skupine z embrionalnimi celicami (v obeh primerih se je razvilo približno 3% živih mladičev).<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (2. primer)===<br /> <br /> Bisulfitno sekveniranje pa je pokazalo demetilacijo na Nanog in Oct4 promotorjih v induciranih celičnih linijah, v primerjavi z originalnimi fibroblasti, ki kažejo veliko večjo metiliranosti. Se pa vzorec pogostosti metiliranja sovpada s tistim iz ES celic – kar kaže na potek epigenetskega reprogramiranja. Povečana stopnja demetilacije najverjetneje kaže na povečano stopnjo transkripcije pluripotentnih markerjev. <br /> Z uporabo PCR tehnike unikatnih mikrosatelitov se je dokazal izvor celic iz miši, ki je izključno iz pluripotentnih celičnih linij. Z kvantitativno reverzno PCR tehniko se je tudi tu dokazovala ekspresija štirih reprogramijajočih faktorjev.<br /> Analiza preko mikročipov je pokazala, da je ekspresija pluripotentnih markerjev podobna med iPS celicami in ES celicami, se pa izključuje z izvornimi fibroblastnimi celicami.<br /> <br /> Našemu sistemu zagotavljanja pluripotentnosti so bile dovedene genetske izboljšave. Na podlagi ugotavljanja epigenetskega statusa pluripotentnih celic iz celičnih linij, izražanju specifičnih pluripotentnih markerjev, dokazovanju izvora celic, specifičnosti sistema ter stopnje reprogramiranja so se dokazale številne izboljšave ter podprle polni pluripotentni status iPS celic.<br /> <br /> ==Preverjanje funkcionalne in razvojne pluripotentnosti==<br /> <br /> ===Funkcionalna pluripotentnost===<br /> <br /> Z določenimi metodami se preverja sposobnost diferenciacije celic v vse tri zarodne plasti, kar nakazuje na velik diferenciacijski potencial.<br /> <br /> Te raziskave lahko potekajo ''in vitro'', ena takih je oblikovanje embrioidnih teles. To so tridimenzionalni agregati matičnih celic, ki se spontano oblikujejo v suspenziji. Z njihovo pomočjo se oceni sposobnost diferenciacije in razvoja v vse tri zarodne plasti, vendar pa ne nakazujejo na izoblikovanje celic v strukture in tkiva.<br /> <br /> Pogosto se uporablja ''in vivo'' metoda, pri kateri se tvori teratom. Pri tem testu v miš, ki trpi za hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo (okvarjeni so limfociti T in B), injiciramo preiskovane iPS celice. Če so le-te pluripotentne, se razvijejo v teratom; tumor, ki vsebuje različne celice vseh treh zarodnih plasti.<br /> <br /> ===Razvojna pluripotentnost===<br /> <br /> To je najvišja raven pluripotentnosti, s katero se preverja sposobnost razvoja iPS celic v vse celične tipe odraslega organizma, vključno s spolnimi celicami.<br /> <br /> Ena od pogosto uporabljenih metod je tvorba himer. Himere so organizmi, ki so sestavljeni iz vsaj dveh vrst genetsko različnih celic in nastanejo pri spojitvi celic iz vsaj dveh zarodkov. Za namene raziskav iPS celic se himerne miši pripravijo z agregacijo preiskovanih matičnih celic z embrijem v 8-celičnem stadiju ali injiciranjem matičnih celic v blastocisto. Ta se nato prenese v mišjo samico, ki povrže himerne mladiče. Ti so glede na genetsko sestavo nekakšna mešanica obeh vrst uporabljenih celic. Injicirane matične celice prispevajo le k razvoju zarodka, ne pa tudi k nastanku izvenembrionalnih tkiv (placente).<br /> V obravnavanih raziskavah so za pripravo iPS celic uporabili embrionalne fibroblaste iz miši s črnim kožuhom, nato pa so iPS celice injicirali v blastocisto albino miši. Rojeni mladiči so imeli značilen lisast kožuh (črne in bele barve).<br /> <br /> Za najstrožji in najzahtevnejši test dokazovanja pluripotentnosti velja test tetraploidne komplementacije. Z uporabo električnega toka poteče pfuzija dveh zarodkov v 2-celičnem stadiju in tako nastane tetraploidna blastocista, iz katere se lahko diferencirajo izvenembrionalna tkiva, ne more pa se razviti zarodek. Šele z vnosom diploidnih matičnih celic v tetraploidno blastocisto omogočimo normalen razvoj zarodka, katerega celice izhajajo izključno iz injiciranih matičnih celic, placenta pa iz tetraploidnih celic.<br /> V raziskavah je tetraploidna blastocista izhajala iz albino miši, prav take vrste pa je bila tudi samica, v katero so vsadili tetraploidno celico z vnesenimi iPS celicami. Dobljene miši so bile izključno rjave barve, tako kot tiste, iz katerih so izolirali embrionalne fibroblaste za pripravo iPS celic, kar potrjuje, da celice organizma izhajajo le iz vnesenih iPS celic.<br /> <br /> Po uspešni tvorbi himer in tetraploidni komplementaciji se dobljene mišje samce pari s samicami. Z metodo prenosa genskega materiala se preverja, ali lahko iPS celice prispevajo tudi k razvoju funkcionalnih spolnih celic, ki so odgovorne za nastanek viabilnih potomcev.<br /> <br /> ==Odstotek viabilnosti in uspešnosti kloniranja==<br /> <br /> Odstotek preživelih v prvih uspešnih poskusih kloniranja miši iz induciranih pluripotentnih celic variira od 0,3% do 13% (odvisno od celične linije). Uspešnost kloniranja je podobna uspešni tetraploidne komplementacije z ES celicami ter SCNT-ES metodi. Večina preživelih osebkov ni kazala morfoloških defektov. Pri umrlih osebkih pa so se tipično kazale težave z dihanjem, ki je pogosta v tetraploidni komplementaciji z ES celicami.<br /> Kloniranje je pogosto kazalo morfološke abnormalnosti kot so težave pri dihanju, neonatalna prekomerna velikost ter splošno velik odstotek smrtnosti in neuspešnosti. Največji razlog se gotovo skriva v nepopolnem reprogramiranju celic uporabljenih za kloniranje in nepravilnim epigenetskim profilom. Samo področje je slabo raziskano.<br /> Študije so kljub temu pokazale da neonatalno prekomerno velikost povzroča tehnika kloniranja prenosa jedra (SCNT metoda). Prav tako so pokazale, da je povečana abnormalnost pri dihanju in večja smrtnost prisotna pri osebkih z nižjo stopnjo heterozigotnosti.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> Zaenkrat še ni znan univerzalen set označevalcev, ki bi nakazoval na popolno pluripotentnost iPS celic. Tetraploidna komplementacija zato ostaja najbolj primeren test za ocenjevanje sposobnosti iPS celic za razvoj v vse celične linije nekega organizma. Z uspešno pomnoženimi mišimi s testom tetraploidne komplementacije so dokazali, da je z direktnim reprogramiranjem s 4 faktorji možno ustvariti iPS celice, ki so funkcionalno primerljive z embrionalnimi celicami. Dokazana pa je tudi ”uspešnost” metode tetraploidne komplementacije z iPS celicami za pridobivanje odraslih miši iz diferenciranih celic.<br /> <br /> Še vedno pa ni povsem jasno, kaj povzroča razlike v pluripotentnosti med iPS celičnimi linijami. Raziskovalci domnevajo, da so za to odgovorne specifične značilnosti reprogramiranih celičnih linij. V prihodnosti bi bilo potrebno nameniti pozornost tudi delno reprogramiranim in manj pluripotentnim celičnim linijam, ki ne ustvarijo viabilnih miši pri testu tetraploidne komplementacije (zadoščajo pa katerim drugim kriterijem pluripotentnosti), saj bi z njihovim preučevanjem lahko odkrili razlike in mehanizme reprogramiranja na molekularni ravni.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> *Boland M.J. in sod. Adult mice generated from induced pluripotent stem cells. ''Nature'', 2009, številka 461, str. 91-94<br /> *Kang L. in Gao S. Pluripotency of induced pluripotent stem cells. ''Journal of animal science and biotechnology'', 2012, letnik 3, številka 5.<br /> *Smith K.P. in sod. Pluripotency: Toward a Gold Standard for Human ES and iPS Cells. ''Journal of Cell Physiology'', 2009, številka 220, str. 21-29<br /> *Stadtfeld M. in sod. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. ''Genes Dev''., 2010, letn. 24, str. 2239-2263.<br /> *Zhao X.Y. in sod. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. ''Nature'', 2009, številka 461, str. 86-90<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Kloniranje_mi%C5%A1i_iz_iPSC&diff=8172 2013-05-28T01:05:16Z

<p>AnaGrom: /* Pridobivanje celičnih linij (2. primer) */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> <br /> Odrasle diferencirane celice lahko z uporabo majhnega števila določenih transkripcijskih faktorjev reprogramiramo oz. spremenimo v inducirane pluripotentne matične celice (iPS celice), ki so v marsičem podobne embrionalnim matičnim celicam (ES celice). Z iPS celicami bi bilo možno zdraviti različne degenerativne in genetske bolezni, nadomeščati poškodovana tkiva, uporabne bi bile kot modeli za raziskave bolezni, pri vsem tem pa ne bi prišlo do etično sporne uporabe embrionalnih celic. Vendar pa imajo iPSC tudi določene slabosti; v nekaterih raziskavah so se izkazale za tumorigene in nagnjene k hitrejšemu celičnemu staranju.<br /> <br /> Pojavljalo pa se je tudi vprašanje o njihovi pluripotentnosti, saj je to ena od bistvenih značilnosti matičnih celic. Pluripotentne matične celice prispevajo k razvoju vseh treh zarodnih plasti (endoderma, mezoderma in ektoderma) in so se tako sposobne razviti v vse celice zarodka, ne morejo pa tvoriti izvenembrionalnih tkiv.<br /> <br /> ES celice so se izkazale kot bolj učikovite pri kloniranju. V naslednjih raziskavah se poroča o uspehih kloniranja živih miši iz reprogramiranih fibroblastov, kar kaže na to, da so lahko vse značilnosti stopnje pluripotentosti nadomeščene brez izpostavljanja neznanim ooplazemskim faktorjem. Primerjanje teh polno pluripotentnih iPS celičnih linij bo lahko pokazalo molekulske markerje potrebne za pluripotentna stanja.<br /> <br /> ==Preverjanje pluripotentnosti z genetskimi in celičnimi analizami==<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (1. primer)===<br /> <br /> V prvem primeru so se najprej lotili načrtovanja genetske oznake za razlikovanje izvora celic iz blastociste ali iPS celic. Mišje embriontske fibroblaste se je pridobilo s križanjem dveh mišjih trangenih linij (Pchd21/Cre ter Z/EG).<br /> *Z/EG linija vsebuje v večini celici viden ter selektiven marker ß-GEO (fuzija gena za ß-galaktozidazo ter gena za rezistenco na neomicin; tu pride lahko do detekcije aktivnega encime ß-galaktozidaze preko X-galaktoze, kjer se tvori modro obarvan produkt, ali pa se kot selekcijski marker uporabi odpornost klonov proti neomicinu; v raziskavi se je uporabil prvi marker).<br /> *Pchd21/Cre linija; promotor protokadherina 21(katerega ekspresija je značilna predvsem za dva tipa nevronov pri vohalnem sistemu v glomerulu) podpira ekspresijo Cre rekombinaze (je specifična rekombinaza, ki katalizira specifično rekombinacijo na točno določenem mestu v DNA).<br /> Tako je prišlo pri kombiniranju celičnih linij pri sveh tipih vohalnih nevronov miši, zaradi delovanja Cre rekombinaze do izreza »floksiranega« ß-geo gena, kar pa je kot za posledico imelo izražanje GFP (zelenega fluoscirajočega proteina).<br /> <br /> Nepravilno izražanje reprogramirajočih genov skozi razvoj bi lahko inhibiral embionalni in poporodni razvoj. Odločili so se za tesno kontrolo trangene ekspresije v iPS celicah. Štiri »Yamanaka« faktorje (Oct4, Klf4, Sox2 in Myc-c) so prenesli v celice preko retrovirusa ter ih postavili pod okrilje tetO promotorja (prepis pod tem promotorjem se inducira v prisotnosti antibiotika tetraciklina ali njegovih derivatov (npr. doksiciklina)). V našem sistemu je sistem aktiviran preko izboljšane verzije reverznega tetraciklin transaktivatorja (rtTAM2.2), v prisotnosti doksiciklina. Da bi se vpodbudila še večja učinkovitost reprogramiranja in izolacija popolno reprogramiranih iPS celic so izpostavili mišje embironalne fibroblaste valproični kislini, za katero se je izkazalo, da poveča reprogramsko učinkovitost in inhibicira nepopolnoma reprogramiranih celic z inhibicijo njihovih celičnih delitev.<br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (1. primer)===<br /> <br /> Na gojiščih na katerih so gojili celice, v katere so prenesli Yamanaka faktoje, so po 10 dneh zaznali alkalno fosfatazo, katere povišana količina se pojavlja v membrani pluripotentih celic ter med drugim služi kot test pluripotentonosti.<br /> <br /> Celice se iz gojišča odvzeli po 14, 20 in 36 dneh ter na tak način pridobili 31 stabilnih celičnih linij, diploentnih celic s 40 kromosomi.<br /> <br /> Test bisulfidne metilacije je v pridobljenih celičnih linijah je v 3 celičnih linijah: IP20D-3, IP36D-3 ter IP14D-1 pokazal demetilacijo promotorjev Oct4 in Nanog, ki je zelo podobna demetilaciji kontrolne skupine embrionalnih celic, h krati pa se močno razlikuje od mišjih embrionalnih fibroblastov, iz katerih so z reprogramiranjem pridobili zgoraj omenjene celične linije.<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (1. primer)===<br /> <br /> Preko detekcije ß-galaktozidaze v mišjih tkivih (obarvanje celic iz celičnih linij in negativni rezultat pri celicah blastocist), PCR tehnike za detekcijo mikrosatelitnih markerjev in PCR tehnike za ugotavljanje prisotnosti albino (donor blastociste je albino osebek) mutacije na Tyr genu so dokazali, da konstitucija celic v mišjih osebkih izhaja izključno iz celice celičnih linij in so se vsa tkiva razvila izključno iz pluripotentnih celic.<br /> Southern blot analiza za Oct4 in rtTAM2.2 je pokazala vzorec provirusne integracije, ki je identična vzorcem integracije iz iPS celičnih linij. Nobena do sedaj znana ES celična linija ne vsebuje dane genetske modfikacije, kar kaže na to, da ni prišlo do kontaminacije z nobeno prej obstajajočo ES celično linijo.<br /> Kvantitativna PCR z reverzno transkripcijo (qRT-PCR) je pokazala skoraj popolno utišanost provirusnih transgenov pri iPSC celicah v odsotnosti doksicilkina. Celične linije so se ponovno tretirale z doksiciklinom. Iz celičnih linij, iz katerih je izšlo večina iPS miši je v odsotnosti doksiciklina bila prisotna reducirana ekspresija vseh 4ih reprogamirajočih faktorjev. Medtem ko je pri manj uspešnih linijah prišlo do zaznavne detekcije ekspresije Oct4 in /ali Klf4; kar kaže na nepopolno reprogramiranje manj uspešnih celičnih linij.<br /> Specifičnost sistema se je potrdila tudi z imunoflorescenčno analizo nevronov za percepcijo vonja, ki je kazala pozitivno bravanje za ß-galaktozidazo razen dveh tipov nevronov kjer je bila prisotna ekspresija GFP.<br /> <br /> Mnogo izboljšav je lahko odgovornih za dano pluripotentnost celičnih linij.<br /> 1.) Visoka stopnja indukcije transgena preko rtTAM2.2 in daljši čas ekspresije reprogramijajočih faktorjev kot navadno (več časa za bolj popolno reprogramiranje)<br /> 2.) Reguliranje ekspresije našega transgena preko doksiciklina, kar je pomagalo preprečiti nepravilno ekspresijo reprogramijajočih faktorjev skozi embrionalni razvoj<br /> 3.) Daljša terapija z valproično kislino je lahko omogočila reprogramiranje epigenoma v stanje kromatina bolj podobnemu tistemu v ES celicah<br /> <br /> ===Genetske izboljšave (2. primer)===<br /> <br /> V drugem primeru so mišje embrionalne fibroblaste ki odražajo Oct4 z GFP okužili (preko retrovirusa) z “Yamanaka” faktorji. Druga modifikacija je vključevala zamenjavo seruma v katerem se celice gojijo s fetalnim govejim serumom. <br /> <br /> ===Pridobivanje celičnih linij (2. primer)===<br /> <br /> Na gojiščih na katerih so gojili mišje embrionalne fibroblaste, v katere so prenesli Yamanaka faktorje, so po 10 dneh zaznali večjo količino alkalne fosfataze, katere povišana količina se pojavlja v membrani pluripotentih celic ter med drugim služi kot test pluripotentonost. Prav tako so zaznali zeleni fluorescirajoči protein (GPF), ki je kazal na prisotnost Oct4 (katerega količina upade ob začetku diferenciacije celic).<br /> <br /> Celice so iz gojišča odvzeli po 14 dneh, (celične linije IP14D), 20 dneh (celične linije IP20D) in 36 dneh (celične linije IP36D) ter na tak način pridobili 31 stabilnih celičnih linij, diploentnih celičnih linij s 40 kromosomi.<br /> <br /> Test bisulfidne metilacije je v treh od pridobljenih celičnih linij (IP20D-3, IP36D-3 ter IP14D-1) pokazal demetilacijo promotorjev Oct4 in Nanog, ki je zelo podobna demetilaciji kontrolne skupine embrionalnih celic, h krati pa se močno razlikuje od mišjih embrionalnih fibroblastov, iz katerih so z reprogramiranjem pridobili zgoraj omenjene pluripotentne celične linije. <br /> Pluripotentnost teh linij so dokazali tudi z vnosom le teh v miši s hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo pri katerih se je razvil teratom z vsemi tremi zarodnimi plastmi. <br /> <br /> Za nadaljnjo testiranje pluripotentnosti so naključno izbrali celične linije ter jih vključili v normalno CD-1 blastocisto ter jo prenesli v CD-1 samico miši, ter opazovali razvoj embriov do mladičev.<br /> Rezultati so pokazali da celične linije IP36D in IP20D razvijejo žive miški z 5-80% himernostjo, linije IP14D pa miši z 10-95% himernostjo. <br /> Kloniranje miši s tetraploidno komplementacijo ni bilo enako uspešno pri vseh celičnih linijah, iz celičnih linij IP36D so se sicer razvili embrii, ki pa so v 10. dnevu razvoja umrli. Celične linije IP20D prav tako niso razvile živih mladičev oz. embriov starejših od 17 dni, med tem ko se je iz celičnih linij IP14D razvilo tudi do 22 živih mladičev. <br /> Rezultati celične linije IP14D-1 so bili celo primerljivi z rezultati kontrolne skupine z embrionalnimi celicami (v obeh primerih se je razvilo približno 3% živih mladičev).<br /> <br /> ===Celične in genetske analize (2. primer)===<br /> <br /> Bisulfitno sekveniranje pa je pokazalo demetilacijo na Nanog in Oct4 promotorjih v induciranih celičnih linijah, v primerjavi z originalnimi fibroblasti, ki kažejo veliko večjo metiliranosti. Se pa vzorec pogostosti metiliranja sovpada s tistim iz ES celic – kar kaže na potek epigenetskega reprogramiranja. Povečana stopnja demetilacije najverjetneje kaže na povečano stopnjo transkripcije pluripotentnih markerjev. <br /> Z uporabo PCR tehnike unikatnih mikrosatelitov se je dokazal izvor celic iz miši, ki je izključno iz pluripotentnih celičnih linij. Z kvantitativno reverzno PCR tehniko se je tudi tu dokazovala ekspresija štirih reprogramijajočih faktorjev.<br /> Analiza preko mikročipov je pokazala, da je ekspresija pluripotentnih markerjev podobna med iPS celicami in ES celicami, se pa izključuje z izvornimi fibroblastnimi celicami.<br /> <br /> Našemu sistemu zagotavljanja pluripotentnosti so bile dovedene genetske izboljšave. Na podlagi ugotavljanja epigenetskega statusa pluripotentnih celic iz celičnih linij, izražanju specifičnih pluripotentnih markerjev, dokazovanju izvora celic, specifičnosti sistema ter stopnje reprogramiranja so se dokazale številne izboljšave ter podprle polni pluripotentni status iPS celic.<br /> <br /> ==Preverjanje funkcionalne in razvojne pluripotentnosti==<br /> <br /> ===Funkcionalna pluripotentnost===<br /> <br /> Z določenimi metodami se preverja sposobnost diferenciacije celic v vse tri zarodne plasti, kar nakazuje na velik diferenciacijski potencial.<br /> <br /> Te raziskave lahko potekajo ''in vitro'', ena takih je oblikovanje embrioidnih teles. To so tridimenzionalni agregati matičnih celic, ki se spontano oblikujejo v suspenziji. Z njihovo pomočjo se oceni sposobnost diferenciacije in razvoja v vse tri zarodne plasti, vendar pa ne nakazujejo na izoblikovanje celic v strukture in tkiva.<br /> <br /> Pogosto se uporablja ''in vivo'' metoda, pri kateri se tvori teratom. Pri tem testu v miš, ki trpi za hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo (okvarjeni so limfociti T in B), injiciramo preiskovane iPS celice. Če so le-te pluripotentne, se razvijejo v teratom; tumor, ki vsebuje različne celice vseh treh zarodnih plasti.<br /> <br /> ===Razvojna pluripotentnost===<br /> <br /> To je najvišja raven pluripotentnosti, s katero se preverja sposobnost razvoja iPS celic v vse celične tipe odraslega organizma, vključno s spolnimi celicami.<br /> <br /> Ena od pogosto uporabljenih metod je tvorba himer. Himere so organizmi, ki so sestavljeni iz vsaj dveh vrst genetsko različnih celic in nastanejo pri spojitvi celic iz vsaj dveh zarodkov. Za namene raziskav iPS celic se himerne miši pripravijo z agregacijo preiskovanih matičnih celic z embrijem v 8-celičnem stadiju ali injiciranjem matičnih celic v blastocisto. Ta se nato prenese v mišjo samico, ki povrže himerne mladiče. Ti so glede na genetsko sestavo nekakšna mešanica obeh vrst uporabljenih celic. Injicirane matične celice prispevajo le k razvoju zarodka, ne pa tudi k nastanku izvenembrionalnih tkiv (placente).<br /> V obravnavanih raziskavah so za pripravo iPS celic uporabili embrionalne fibroblaste iz miši s črnim kožuhom, nato pa so iPS celice injicirali v blastocisto albino miši. Rojeni mladiči so imeli značilen lisast kožuh (črne in bele barve).<br /> <br /> Za najstrožji in najzahtevnejši test dokazovanja pluripotentnosti velja test tetraploidne komplementacije. Z uporabo električnega toka poteče pfuzija dveh zarodkov v 2-celičnem stadiju in tako nastane tetraploidna blastocista, iz katere se lahko diferencirajo izvenembrionalna tkiva, ne more pa se razviti zarodek. Šele z vnosom diploidnih matičnih celic v tetraploidno blastocisto omogočimo normalen razvoj zarodka, katerega celice izhajajo izključno iz injiciranih matičnih celic, placenta pa iz tetraploidnih celic.<br /> V raziskavah je tetraploidna blastocista izhajala iz albino miši, prav take vrste pa je bila tudi samica, v katero so vsadili tetraploidno celico z vnesenimi iPS celicami. Dobljene miši so bile izključno rjave barve, tako kot tiste, iz katerih so izolirali embrionalne fibroblaste za pripravo iPS celic, kar potrjuje, da celice organizma izhajajo le iz vnesenih iPS celic.<br /> <br /> Po uspešni tvorbi himer in tetraploidni komplementaciji se dobljene mišje samce pari s samicami. Z metodo prenosa genskega materiala se preverja, ali lahko iPS celice prispevajo tudi k razvoju funkcionalnih spolnih celic, ki so odgovorne za nastanek viabilnih potomcev.<br /> <br /> ==Odstotek viabilnosti in uspešnosti kloniranja==<br /> <br /> Odstotek preživelih v prvih uspešnih poskusih kloniranja miši iz induciranih pluripotentnih celic variira od 0,3% do 13% (odvisno od celične linije). Uspešnost kloniranja je podobna uspešni tetraploidne komplementacije z ES celicami ter SCNT-ES metodi. Večina preživelih osebkov ni kazala morfoloških defektov. Pri umrlih osebkih pa so se tipično kazale težave z dihanjem, ki je pogosta v tetraploidni komplementaciji z ES celicami.<br /> Kloniranje je pogosto kazalo morfološke abnormalnosti kot so težave pri dihanju, neonatalna prekomerna velikost ter splošno velik odstotek smrtnosti in neuspešnosti. Največji razlog se gotovo skriva v nepopolnem reprogramiranju celic uporabljenih za kloniranje in nepravilnim epigenetskim profilom. Samo področje je slabo raziskano.<br /> Študije so kljub temu pokazale da neonatalno prekomerno velikost povzroča tehnika kloniranja prenosa jedra (SCNT metoda). Prav tako so pokazale, da je povečana abnormalnost pri dihanju in večja smrtnost prisotna pri osebkih z nižjo stopnjo heterozigotnosti.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> Zaenkrat še ni znan univerzalen set označevalcev, ki bi nakazoval na popolno pluripotentnost iPS celic. Tetraploidna komplementacija zato ostaja najbolj primeren test za ocenjevanje sposobnosti iPS celic za razvoj v vse celične linije nekega organizma. Z uspešno pomnoženimi mišimi s testom tetraploidne komplementacije so dokazali, da je z direktnim reprogramiranjem s 4 faktorji možno ustvariti iPS celice, ki so funkcionalno primerljive z embrionalnimi celicami. Dokazana pa je tudi ”uspešnost” metode tetraploidne komplementacije z iPS celicami za pridobivanje odraslih miši iz diferenciranih celic.<br /> <br /> Še vedno pa ni povsem jasno, kaj povzroča razlike v pluripotentnosti med iPS celičnimi linijami. Raziskovalci domnevajo, da so za to odgovorne specifične značilnosti reprogramiranih celičnih linij. V prihodnosti bi bilo potrebno nameniti pozornost tudi delno reprogramiranim in manj pluripotentnim celičnim linijam, ki ne ustvarijo viabilnih miši pri testu tetraploidne komplementacije (zadoščajo pa katerim drugim kriterijem pluripotentnosti), saj bi z njihovim preučevanjem lahko odkrili razlike in mehanizme reprogramiranja na molekularni ravni.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> *Boland M.J. in sod. Adult mice generated from induced pluripotent stem cells. ''Nature'', 2009, številka 461, str. 91-94<br /> *Kang L. in Gao S. Pluripotency of induced pluripotent stem cells. ''Journal of animal science and biotechnology'', 2012, letnik 3, številka 5.<br /> *Smith K.P. in sod. Pluripotency: Toward a Gold Standard for Human ES and iPS Cells. ''Journal of Cell Physiology'', 2009, številka 220, str. 21-29<br /> *Stadtfeld M. in sod. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. ''Genes Dev''., 2010, letn. 24, str. 2239-2263.<br /> *Zhao X.Y. in sod. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. ''Nature'', 2009, številka 461, str. 86-90<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Kloniranje_mi%C5%A1i_iz_iPSC&diff=8147 2013-05-27T21:59:44Z

<p>AnaGrom: New page: &#039;&#039;&#039;1. Uvod&#039;&#039;&#039; Odrasle diferencirane celice lahko z uporabo majhnega števila določenih transkripcijskih faktorjev reprogramiramo oz. spremenimo v inducirane pluripotentne matične celic...</p> <hr /> <div>'''1. Uvod'''<br /> <br /> Odrasle diferencirane celice lahko z uporabo majhnega števila določenih transkripcijskih faktorjev reprogramiramo oz. spremenimo v inducirane pluripotentne matične celice (iPS celice), ki so v marsičem podobne embrionalnim matičnim celicam (ES celice). Z iPS celicami bi bilo možno zdraviti različne degenerativne in genetske bolezni, nadomeščati poškodovana tkiva, uporabne bi bile kot modeli za raziskave bolezni, pri vsem tem pa ne bi prišlo do etično sporne uporabe embrionalnih celic. Vendar pa imajo iPSC tudi določene slabosti; v nekaterih raziskavah so se izkazale za tumorigene in nagnjene k hitrejšemu celičnemu staranju.<br /> <br /> Pojavljalo pa se je tudi vprašanje o njihovi pluripotentnosti, saj je to ena od bistvenih značilnosti matičnih celic. Pluripotentne matične celice prispevajo k razvoju vseh treh zarodnih plasti (endoderma, mezoderma in ektoderma) in so se tako sposobne razviti v vse celice zarodka, ne morejo pa tvoriti izvenembrionalnih tkiv.<br /> <br /> ES celice so se izkazale kot bolj učikovite pri kloniranju. V naslednjih raziskavah se poroča o uspehih kloniranja živih miši iz reprogramiranih fibroblastov, kar kaže na to, da so lahko vse značilnosti stopnje pluripotentosti nadomeščene brez izpostavljanja neznanim ooplazemskim faktorjem. Primerjanje teh polno pluripotentnih iPS celičnih linij bo lahko pokazalo molekulske markerje potrebne za pluripotentna stanja.<br /> <br /> '''2. Preverjanje pluripotentnosti z genetskimi in celičnimi analizami'''<br /> <br /> ''2.1 genetske izboljšave (1. primer)''<br /> <br /> V prvem primeru so se najprej lotili načrtovanja genetske oznake za razlikovanje izvora celic iz blastociste ali iPS celic. Mišje embriontske fibroblaste se je pridobilo s križanjem dveh mišjih trangenih linij (Pchd21/Cre ter Z/EG).<br /> - Z/EG linija vsebuje v večini celici viden ter selektiven marker ß-GEO (fuzija gena za ß-galaktozidazo ter gena za rezistenco na neomicin; tu pride lahko do detekcije aktivnega encime ß-galaktozidaze preko X-galaktoze, kjer se tvori modro obarvan produkt, ali pa se kot selekcijski marker uporabi odpornost klonov proti neomicinu; v raziskavi se je uporabil prvi marker).<br /> - Pchd21/Cre linija; promotor protokadherina 21(katerega ekspresija je značilna predvsem za dva tipa nevronov pri vohalnem sistemu v glomerulu) podpira ekspresijo Cre rekombinaze (je specifična rekombinaza, ki katalizira specifično rekombinacijo na točno določenem mestu v DNA).<br /> Tako je prišlo pri kombiniranju celičnih linij pri sveh tipih vohalnih nevronov miši, zaradi delovanja Cre rekombinaze do izreza »floksiranega« ß-geo gena, kar pa je kot za posledico imelo izražanje GFP (zelenega fluoscirajočega proteina).<br /> <br /> Nepravilno izražanje reprogramirajočih genov skozi razvoj bi lahko inhibiral embionalni in poporodni razvoj. Odločili so se za tesno kontrolo trangene ekspresije v iPS celicah. Štiri »Yamanaka« faktorje (Oct4, Klf4, Sox2 in Myc-c) so prenesli v celice preko retrovirusa ter ih postavili pod okrilje tetO promotorja (prepis pod tem promotorjem se inducira v prisotnosti antibiotika tetraciklina ali njegovih derivatov (npr. doksiciklina)). V našem sistemu je sistem aktiviran preko izboljšane verzije reverznega tetraciklin transaktivatorja (rtTAM2.2), v prisotnosti doksiciklina. Da bi se vpodbudila še večja učinkovitost reprogramiranja in izolacija popolno reprogramiranih iPS celic so izpostavili mišje embironalne fibroblaste valproični kislini, za katero se je izkazalo, da poveča reprogramsko učinkovitost in inhibicira nepopolnoma reprogramiranih celic z inhibicijo njihovih celičnih delitev.<br /> <br /> ''2.2 pridobivanje celičnih linij (1. primer)''<br /> <br /> Na gojiščih na katerih so gojili celice, v katere so prenesli Yamanaka faktoje, so po 10 dneh zaznali alkalno fosfatazo, katere povišana količina se pojavlja v membrani pluripotentih celic ter med drugim služi kot test pluripotentonosti.<br /> <br /> Celice se iz gojišča odvzeli po 14, 20 in 36 dneh ter na tak način pridobili 31 stabilnih celičnih linij, diploentnih celic s 40 kromosomi.<br /> <br /> Test bifulfidne metilacije je v pridobljenih celičnih linijah je v 3 celičnih linijah: IP20D-3, IP36D-3 ter IP14D-1 pokazal demetilacijo promotorjev Oct4 in Nanog, ki je zelo podobna demetilaciji kontrolne skupine embrionalnih celic, h krati pa se močno razlikuje od mišjih embrionalnih fibroblastov, iz katerih so z reprogramiranjem pridobili zgoraj omenjene celične linije.<br /> <br /> ''2.3 celične in genetske analize (1. primer)''<br /> <br /> Preko detekcije ß-galaktozidaze v mišjih tkivih (obarvanje celic iz celičnih linij in negativni rezultat pri celicah blastocist), PCR tehnike za detekcijo mikrosatelitnih markerjev in PCR tehnike za ugotavljanje prisotnosti albino (donor blastociste je albino osebek) mutacije na Tyr genu so dokazali, da konstitucija celic v mišjih osebkih izhaja izključno iz celice celičnih linij in so se vsa tkiva razvila izključno iz pluripotentnih celic.<br /> Southern blot analiza za Oct4 in rtTAM2.2 je pokazala vzorec provirusne integracije, ki je identična vzorcem integracije iz iPS celičnih linij. Nobena do sedaj znana ES celična linija ne vsebuje dane genetske modfikacije, kar kaže na to, da ni prišlo do kontaminacije z nobeno prej obstajajočo ES celično linijo.<br /> Kvantitativna PCR z reverzno transkripcijo (qRT-PCR) je pokazala skoraj popolno utišanost provirusnih transgenov pri iPSC celicah v odsotnosti doksicilkina. Celične linije so se ponovno tretirale z doksiciklinom. Iz celičnih linij, iz katerih je izšlo večina iPS miši je v odsotnosti doksiciklina bila prisotna reducirana ekspresija vseh 4ih reprogamirajočih faktorjev. Medtem ko je pri manj uspešnih linijah prišlo do zaznavne detekcije ekspresije Oct4 in /ali Klf4; kar kaže na nepopolno reprogramiranje manj uspešnih celičnih linij.<br /> Specifičnost sistema se je potrdila tudi z imunoflorescenčno analizo nevronov za percepcijo vonja, ki je kazala pozitivno bravanje za ß-galaktozidazo razen dveh tipov nevronov kjer je bila prisotna ekspresija GFP.<br /> <br /> Mnogo izboljšav je lahko odgovornih za dano pluripotentnost celičnih linij.<br /> 1.) Visoka stopnja indukcije transgena preko rtTAM2.2 in daljši čas ekspresije reprogramijajočih faktorjev kot navadno (več časa za bolj popolno reprogramiranje)<br /> 2.) Reguliranje ekspresije našega transgena preko doksiciklina, kar je pomagalo preprečiti nepravilno ekspresijo reprogramijajočih faktorjev skozi embrionalni razvoj<br /> 3.) Daljša terapija z valproično kislino je lahko omogočila reprogramiranje epigenoma v stanje kromatina bolj podobnemu tistemu v ES celicah<br /> <br /> ''2.4 genetske izboljšave (2. primer)''<br /> <br /> V drugem primeru so mišje embrionalne fibroblaste ki odražajo Oct4 z GFP okužili (preko retrovirusa) z “Yamanaka” faktorji. Druga modifikacija je vključevala zamenjavo seruma v katerem se celice gojijo s fetalnim govejim serumom. <br /> <br /> ''2. 5 pridobivanje celičnih linij (2.primer)''<br /> <br /> Z reprogramiranjem Pcdh21/cre-Z/EG fibroblastov se je po 5 dneh v prisotnosti dox in VPA in 7 dneh le v prisotnosti dox razvilo 21 celičnih linij, označenih z oznakami iMZ1-21.<br /> Ker univerzalnega testa za ugotavljanje pluripotetnosti še ni, so izvedli vrsto testiranj, na podlagi katerih so izbrali celične linije primerne za test tetraploidne komplementacije. <br /> <br /> Glede na morfologijo oz. nenormalno širjenje so zavrgli 9 celičnih linij, ostalih 5 pa testirali z imonofluorescenco za ekspresijo markerjev za pluripotentnost (Sox2, Oct4).<br /> Vse linije so vsebovale izražene markerje prav tako so se iz vseh razvila embrionalna telesa, pri katerih so testirali sposobnost tvorbe mišjih vohalnih nevronov. Celične linije 2, 10, 12, 13, 18, 11, 14, 17, 20 in 21 so razvile veliko mišjih vohalnih nevronov (ob testiranju z imunofluorescenco, so zaradi proteina GFP s katerim so testirali izražanje Oct4, linije fluorescirale močno zeleno).<br /> V nadaljnjih testiranjih so linije primerjali s kontrolno skupino embrionalnih celic ter na podlagi podobnosti izbrali 7 celičnih linij, od katerih so 4 razvile veliko mišjih vohalnih nevronov (iMZ 9, 11, 14, 17 in 21). To skupino ter skupino linij, ki so bile pozitivne na vse pluripotentne markerje, vendar so razvile relativno nizko število vohalnih nevronov so izbrali za nadaljnje analize kariotipa.<br /> štiri od osmih linij so bile euploidne (iMZ9, iMZ11, iMZ15 in iMZ21) ter tako primerne za uporabo v testu tetraploidne komplementacije.<br /> <br /> ''2.6 celične in genetske analize (2. primer)''<br /> <br /> Bisulfitno sekveniranje pa je pokazalo demetilacijo na Nanog in Oct4 promotorjih v induciranih celičnih linijah, v primerjavi z originalnimi fibroblasti, ki kažejo veliko večjo metiliranosti. Se pa vzorec pogostosti metiliranja sovpada s tistim iz ES celic – kar kaže na potek epigenetskega reprogramiranja. Povečana stopnja demetilacije najverjetneje kaže na povečano stopnjo transkripcije pluripotentnih markerjev. <br /> Z uporabo PCR tehnike unikatnih mikrosatelitov se je dokazal izvor celic iz miši, ki je izključno iz pluripotentnih celičnih linij. Z kvantitativno reverzno PCR tehniko se je tudi tu dokazovala ekspresija štirih reprogramijajočih faktorjev.<br /> Analiza preko mikročipov je pokazala, da je ekspresija pluripotentnih markerjev podobna med iPS celicami in ES celicami, se pa izključuje z izvornimi fibroblastnimi celicami.<br /> <br /> Našemu sistemu zagotavljanja pluripotentnosti so bile dovedene genetske izboljšave. Na podlagi ugotavljanja epigenetskega statusa pluripotentnih celic iz celičnih linij, izražanju specifičnih pluripotentnih markerjev, dokazovanju izvora celic, specifičnosti sistema ter stopnje reprogramiranja so se dokazale številne izboljšave ter podprle polni pluripotentni status iPS celic.<br /> <br /> '''3. Preverjanje funkcionalne in razvojne pluripotentnosti'''<br /> <br /> ''3.1 Funkcionalna pluripotentnost<br /> ''<br /> Z določenimi metodami se preverja sposobnost diferenciacije celic v vse tri zarodne plasti, kar nakazuje na velik diferenciacijski potencial.<br /> Te raziskave lahko potekajo in vitro, ena takih je oblikovanje embrioidnih teles. To so tridimenzionalni agregati matičnih celic, ki se spontano oblikujejo v suspenziji. Z njihovo pomočjo se oceni sposobnost diferenciacije in razvoja v vse tri zarodne plasti, vendar pa ne nakazujejo na izoblikovanje celic v strukture in tkiva.<br /> Pogosto se uporablja in vivo metoda, pri kateri se tvori teratom. Pri tem testu v miš, ki trpi za hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo (okvarjeni so limfociti T in B), injiciramo preiskovane iPS celice. Če so le-te pluripotentne, se razvijejo v teratom; tumor, ki vsebuje različne celice vseh treh zarodnih plasti.<br /> <br /> ''3.2 Razvojna pluripotentnost''<br /> <br /> To je najvišja raven pluripotentnosti, s katero se preverja sposobnost razvoja iPS celic v vse celične tipe odraslega organizma, vključno s spolnimi celicami.<br /> Ena od pogosto uporabljenih metod je tvorba himer. Himere so organizmi, ki so sestavljeni iz vsaj dveh vrst genetsko različnih celic in nastanejo pri spojitvi celic iz vsaj dveh zarodkov. Za namene raziskav iPS celic se himerne miši pripravijo z agregacijo preiskovanih matičnih celic z embrijem v 8-celičnem stadiju ali injiciranjem matičnih celic v blastocisto. Ta se nato prenese v mišjo samico, ki povrže himerne mladiče. Ti so glede na genetsko sestavo nekakšna mešanica obeh vrst uporabljenih celic. Injicirane matične celice prispevajo le k razvoju zarodka, ne pa tudi k nastanku izvenembrionalnih tkiv (placente).<br /> V obravnavanih raziskavah so za pripravo iPS celic uporabili embrionalne fibroblaste iz miši s črnim kožuhom, nato pa so iPS celice injicirali v blastocisto albino miši. Rojeni mladiči so imeli značilen lisast kožuh (črne in bele barve).<br /> <br /> Za najstrožji in najzahtevnejši test dokazovanja pluripotentnosti velja test tetraploidne komplementacije. Z uporabo električnega toka poteče pfuzija dveh zarodkov v 2-celičnem stadiju in tako nastane tetraploidna blastocista, iz katere se lahko diferencirajo izvenembrionalna tkiva, ne more pa se razviti zarodek. Šele z vnosom diploidnih matičnih celic v tetraploidno blastocisto omogočimo normalen razvoj zarodka, katerega celice izhajajo izključno iz injiciranih matičnih celic, placenta pa iz tetraploidnih celic.<br /> V raziskavah je tetraploidna blastocista izhajala iz albino miši, prav take vrste pa je bila tudi samica, v katero so vsadili tetraploidno celico z vnesenimi iPS celicami. Dobljene miši so bile izključno rjave barve, tako kot tiste, iz katerih so izolirali embrionalne fibroblaste za pripravo iPS celic, kar potrjuje, da celice organizma izhajajo le iz vnesenih iPS celic.<br /> <br /> Po uspešni tvorbi himer in tetraploidni komplementaciji se dobljene mišje samce pari s samicami. Z metodo prenosa genskega materiala se preverja, ali lahko iPS celice prispevajo tudi k razvoju funkcionalnih spolnih celic, ki so odgovorne za nastanek viabilnih potomcev.<br /> <br /> <br /> '''4. Odstotek viabilnosti in uspešnosti kloniranja'''<br /> <br /> Odstotek preživelih v prvih uspešnih poskusih kloniranja miši iz induciranih pluripotentnih celic variira od 0,3% do 13% (odvisno od celične linije). Uspešnost kloniranja je podobna uspešni tetraploidne komplementacije z ES celicami ter SCNT-ES metodi. Večina preživelih osebkov ni kazala morfoloških defektov. Pri umrlih osebkih pa so se tipično kazale težave z dihanjem, ki je pogosta v tetraploidni komplementaciji z ES celicami.<br /> Kloniranje je pogosto kazalo morfološke abnormalnosti kot so težave pri dihanju, neonatalna prekomerna velikost ter splošno velik odstotek smrtnosti in neuspešnosti. Največji razlog se gotovo skriva v nepopolnem reprogramiranju celic uporabljenih za kloniranje in nepravilnim epigenetskim profilom. Samo področje je slabo raziskano.<br /> Študije so kljub temu pokazale da neonatalno prekomerno velikost povzroča tehnika kloniranja prenosa jedra (SCNT metoda). Prav tako so pokazale, da je povečana abnormalnost pri dihanju in večja smrtnost prisotna pri osebkih z nižjo stopnjo heterozigotnosti.<br /> <br /> '''5. Zaključek'''<br /> <br /> Zaenkrat še ni znan univerzalen set označevalcev, ki bi nakazoval na popolno pluripotentnost iPS celic. Tetraploidna komplementacija zato ostaja najbolj primeren test za ocenjevanje sposobnosti iPS celic za razvoj v vse celične linije nekega organizma. Z uspešno pomnoženimi mišimi s testom tetraploidne komplementacije so dokazali, da je z direktnim reprogramiranjem s 4 faktorji možno ustvariti iPS celice, ki so funkcionalno primerljive z embrionalnimi celicami. Dokazana pa je tudi ”uspešnost” metode tetraploidne komplementacije z iPS celicami za pridobivanje odraslih miši iz diferenciranih celic.<br /> Še vedno pa ni povsem jasno, kaj povzroča razlike v pluripotentnosti med iPS celičnimi linijami. Raziskovalci domnevajo, da so za to odgovorne specifične značilnosti reprogramiranih celičnih linij. V prihodnosti bi bilo potrebno nameniti pozornost tudi delno reprogramiranim in manj pluripotentnim celičnim linijam, ki ne ustvarijo viabilnih miši pri testu tetraploidne komplementacije (zadoščajo pa katerim drugim kriterijem pluripotentnosti), saj bi z njihovim preučevanjem lahko odkrili razlike in mehanizme reprogramiranja na molekularni ravni.<br /> <br /> '''6. Viri''' <br /> <br /> Stadtfeld M. et al. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications.Genes Dev., 2010, letn. 24, str. 2239-2263.<br /> Smith K.P. in sod. Pluripotency: Toward a Gold Standard for Human ES and iPS Cells. Journal of Cell Physiology, 2009, številka 220, str. 21-29<br /> Kang L. in Gao S. Pluripotency of induced pluripotent stem cells. Journal of animal science and biotechnology, 2012, letnik 3, številka 5.<br /> Zhao X.Y. in sod. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. Nature, 2009, številka 461, str. 86-90<br /> Boland M.J. in sod. Adut mice generated from induced pluripotent stem cells. Nature, 2009, številka 461, str. 91-94</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Reprogramiranje_z_dvema_faktorjema&diff=8083 2013-05-27T19:49:52Z

<p>AnaGrom: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Inducirane pluripotentne matične celice (iPSCs) so proizvedene iz že diferenciranih celic z dediferenciacijo. Nastanek induciranih pluripotentnih celic je mogoč z izražanjem določenih transkripcijskih faktorjev. Seznam je na začetku obsegal 24 faktorjev, ki pa so ga uspeli skrčiti na le štiri faktorje. <br /> <br /> ==Faktorji==<br /> Pri iPSCs največkrat omenjajo Yamanaka faktorje Oct4, c-Myc, Klf4 in Sox2, poimenovanih po njihovem odkritelju. Izražanje teh štirih faktorjev je zadostno za pridobitev induciranih pluripotentnih celic. Težnja po odkritju metode, ki bi potrdila, da je tudi manj faktorjev zadostnih za zagotovitev pluripotentnosti celic, je bila velika zaradi vsaj dveh razlogov. Manj vključujočih faktorjev bi pomenilo tudi manj tveganj in manj komplikacij. Hkrati pa so želeli izključiti onkogene faktorje, kot sta Klf4 in c-Myc. Z raziskavami so potrdili, da sta dovolj tudi le dva od Yamanaka faktorjev, katerih izbira ni poljubna.<br /> Delovanje faktorjev Klf4, Oct4 in Sox2 je kooperativno, delujejo na iste tarčne gene. C-Myc pa deluje na povsem druge tarčne gene in tu ni v povezavi z ostalimi faktorji. Že to nakazuje na večjo možnost zamenjave faktorja c-Myc, kot pa katerega od ostalih faktorjev, ki so v sodelovanju in vplivajo na iste gene.<br /> <br /> *'''Oct4'''<br /> Oct4 (Octamer-binding transcription factor 4). Oct4 je pri ljudeh kodiran z genom ''POU5F1''. Regulacija tega gena je zelo pomembna pri vzdrževanju stanja pluripotentnosti. Prevelika ali premajhna količina Oct4 povzroči diferenciacijo celice, kar pomeni izgubo pluripotentnosti. Faktorja Oct4 in Klf4 sta dovolj za pridobitev iPSCs.<br /> *'''Sox2'''<br /> SRY (sex determining region Y) box 2 ali Sox2. Primarna vloga faktorja Sox2 je vpliv na izražanje Oct4. Faktorja tvorita heterodimer in se kooperativno vežeta na DNA na nepalindromskih zaporedjih. S tem aktivirata faktorje za zagotovitev pluripotentnosti. Sox2 pa vpliva tudi na tarčni gen ''Nanog'', ki je povezan s pluripotentnostjo. Kombinacija faktorjev Sox2 in Oct4 je bila pri človeških fibroblastih ugotovljena za primerno in zadostno pri zagotavljanju pluripotentnosti iPSCs. Izguba pluripotentnosti pri faktorju Sox2 in Oct4 je regulirana s hipermetilacijo nekaterih vezavnih mest Sox2 in Oct4 v moških zarodnih celicah.<br /> *'''c-Myc'''<br /> c-Myc je pomemben pri nastanku iPSCs, saj sodeluje pri acetilaciji histonov. Lastnost tega faktorja je, da je onkogen. Temu je tudi sledil trend, da se odkrije način proizvajanja iPSCs, pri katerih omenjenega faktorja ne bi bilo potrebno izraziti/uporabiti.<br /> *'''Klf4'''<br /> Krüppel-like factor 4 je pri ljudeh zapisan z genom ''KLF4''. V četverki faktorjev za pluripotentnost celic so ga uspeli nadomestiti.<br /> <br /> ==Reprogramiranje celic, ki endogeno že izražajo enega ali več faktorjev== <br /> Prvi način, kako pridobiti iPS celice brez uporabe c-Myc in Klf4, je uporaba celic, ki ta dva faktorja izražajo endogeno.<br /> <br /> ===Reprogramiranje odraslih živčnih matičnih celic z uporabo dveh faktorjev=== <br /> Odrasle živčne matične celice so se izkazale kot primerne, saj endogeno izražajo višje ravni Sox2 in c-Myc, kot pa zarodne matične celice. Izražajo tudi Klf4. Višje izražanje Sox2 naj bi zagotavljalo matičnost in jo pomagalo vzdrževati. Predvideva se, da Sox2 nadzira izražanje Oct4. Živčne matične celice se lahko razvijejo v astrocite, oligodendrocite in nevrone. Lahko jih izoliramo iz zarodka, odraslega ali ''post mortem''. Izmed petnajstih preizkušenih kombinacij so iPS celice nastale le pri parih Oct4 in Kfl4 ter paru Oct4 in c-Myc. Par Oct4 in Kfl4 se je izkazal kot potencialno zanimiv, ker za njegovo pripravo ni potreben c-Myc ter tako ne povzroča nastanka tumorjev v potomcih.S tem iPS celice približuje klinični uporabi. Raziskava je bila najprej izvedena na mišjih živčnih matičnih celicah, nato pa so metodo kot uspešno potrdili še na človeških živčnih matičnih celicah.<br /> ===Reprogramiranje celic dermalne papile z uporabo dveh faktorjev=== <br /> Živčne matične celice so težje dostopne, za njihovo pridobitev so včasih potrebni invazivni postopki. Kot alternativa se ponujajo celice dermalne papile, specializirani fibroblasti. Nahajajo se v koži, na meji med dermisom in epidermisom. So lažje dostopni in tudi zanje je bilo ugotovljeno, da endogeno izražajo Sox2 in c-Myc ter Klf4. Raziskava je pokazala, da jih je možno dediferncirati z uporabo štirih, treh (Oct4, Klf4 in c-Myc) ter dveh faktorjev, in sicer Oct4 in Klf4. Časi, potrebni za dediferenciacijo s štirimi, tremi in dvema faktorjema, so primerljivi s časi, potrebnimi za dedifernciacijo odraslih živčnih matičnih celic. Se pa iPS celice, pridobljene iz dermalnih papil, razlikujejo od iPS celic, pridobljenih iz odraslih živčnih matičnih celic, v tem, da imajo promotor za faktor Nanog hipometiliran.<br /> ===Reprogramiranje mišjih odraslih živčnih matičnih celic z uporabo enega faktorja===<br /> Ker je bilo ugotovljeno, da odrasle živčne matične celice izražajo tri izmed štirih faktorjev (vse, razen Oct4), so raziskovalci poskusili pridobiti iPS celice samo z ekspresijo Oct4. Že od samega začetka raziskovanja faktorjev, ki ločujejo embrionalne celice od ostalih celic, ki niso pluripotentne, se na podlagi profila izražanja zdi, da ima Oct4 glavno vlogo pri pluripotentnosti celic. Odrasle živčne matične celice so po indukciji Oct4 z retrovirusom postale iPS celice po štirih do petih tednih, izkoristek pa je bil v primerjavi s tistimi, pridobljenimi z dvema faktorjema (Oct4 in Klf4), slabši za desetkrat. Southern blot analiza je pokazala, da enofaktorske celice (Oct4) vsebujejo dve ali pet virusnih integracij, medtem ko so dvofaktorske(Oct4 in Klf4) in štirifaktorske (Oct4, Kfl4, Sox2 in c-Myc) vsebovale po sedem virusnih integracij. To pomeni, da je pri enofaktorskih celicah manjši poseg v sam genom celic in s tem tudi manjše tveganje za neželene posledice. Pluripotentnost je bila v nadaljevanju potrjena z nastankom teratomov po indukciji enofaktorskih celic v golo miš in mikroinjeciranjem v mišje blastociste, kjer so enofaktorske celice prispevale k nastanku vseh treh zarodnih plasti, številnih organov in tudi gamet. Vse to kaže,da imajo tako pridobljene enofaktorske celice enako pluripotentnost kot embrionalne matične celice. Raziskave so bile narejene tako na miših kot na človeških odraslih živčnih matičnih celicah.<br /> <br /> <br /> ==Reprogramiranje celic, ki endogeno ne izražajo reprogramirajočih faktorjev== <br /> Kot vidimo, lahko za reprogramiranje odraslih živčnih matičnih celic (NSC) uporabimo samo Oct4 in Klf4. Ampak te celice že endogeno izražajo Sox2. Ugotovili pa so, da Oct4 in Klf4 zadostujeta tudi za reprogramiranje mišjih embrionalnih fibroblastov (MEF).<br /> <br /> ===Reprogramiranje brez uporabe c-Myc=== <br /> Reprogramiranje celic lahko izboljšajo molekule, ki sodelujejo v organizaciji kromatina. Učinkovitost lahko rahlo povečajo (2-5-krat) inhibitorji DNA metiltransferaze ter histon deacetilaze (HDAC). Primer takšnih inhibitorjev so 5`-azacitidin (5-azaC) in valproična kislina (VPA). Iz tega lahko sklepamo, da so spremembe kromatina ključni korak pri reprogramiranju fibroblastov v pluripotentne celice.<br /> Ta sklep je bil uporabljen pri reprogramiranju MEF brez uporabe c-Myc, ki drugače poteka z zelo majhno učinkovitostjo - inducira se manj kot 0,001% celic. Če pa poleg treh faktorjev dodamo tudi 5`-azacitidin oz. VPA, lahko to učinkovitost povečamo. Izkazalo se je, da 5`-azacitidin poveča učinkovitost 3-krat, VPA pa tudi do 50-krat. Pri tem VPA ne vpliva na spremembo iPSC – te ostanejo podobne mišjim embrionalnim matičnim celicam (MESC).<br /> <br /> ===Reprogramiranje brez uporabe Sox2=== <br /> Yan Shi in sodelavci so ugotovili, da je možno tudi reprogramiranje MEF z uporabo samo dveh faktorjev – Oct4 in Klf4. V poskusih, ki so jih izvedli na MEF, so ugotovili, da najbolj uspešno lahko nadomestijo Sox2 z uporabo kombinacije dveh molekul – BIX-01294 (BIX) in BayK8644 (BayK).<br /> BIX deluje na epigenetskem nivoju in ima široko območje aktivnosti. Zato so naredili poskus, katerega namen je bil odkriti še dodatne molekule, ki bi lahko izboljšale delovanje BIX in specificirale delovanje na izražanje Sox2. V osnovno gojišče so dodali BIX po virusni transdukciji celic z Oct4/Klf4 ter takšne celice obdelovali z različnimi molekulami. Ugotovili so, da je bila najuspešnejša kombinacija BIX in BayK. Ta kombinacija je povečala število kolonij, ki so bile morfološko zelo podobne MESC. BayK nima nikakršnega učinka na reprogramiranje v odsotnosit BIX in ne deluje na epigenetskem nivoju, ampak na prenos signala. To je prva molekula, za katero se je izkazalo, da vpliva na reprogramiranje, ne deluje pa na epigenetskem nivoju. Takšna molekula bi lahko delovala bolj specifično kot molekule, ki delujejo direktno na spremembo DNA in histonov (BIX, VPA in 5`-azacitidin).<br /> <br /> ===Dediferenciacija celic z reaktivacijo Oct-3/4 gena===<br /> Lahko naredimo še en korak dalje, namreč nadomestimo lahko tudi uporabo Oct4.<br /> Ker BIX-01294 omogoča reprogramiranje NPC s Klf4/Sox2/c-Myc, sklepamo, da lahko v tem primeru nadomesti uporabo Oct4.<br /> Oct-3/4 gen se izraža med gametogenezo in v zgodnjih embrionalnih celicah, kjer ima pomembno vlogo pri vzdrževanju pluripotentnosti. Med diferenciacijo celic pride do inhibicije tega gena. V tem procesu pomembno vlogo igra G9a histon metil transferaza (HMTaza) - vključena je v deacetilacijo histonov v regiji promotorja, lahko di- ali tri-metilira Lys 9 na histonu 3 (H3K9), ter na promotor prinese ''de novo'' DNA metilaze. Slednja vloga je zelo pomembna, ker so ugotovili, da je ravno ''de novo'' metilacija ključna ovira za z Oct-3/4 posredovano dediferenciacijo.<br /> BIX-01294 inhibira G9a HMTazo in na ta način omogoča ponovno izražanje Oct-3/4 v že diferenciranih celicah.<br /> <br /> ==Viri==<br /> *Yan Shi ''et al.'' Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic Fibroblasts by Oct4 and Klf4 with Small-Molecule Compounds. ''Cell Press'', 2008, letn.3, str. 568-574<br /> *Kubicek S. ''et al.'' Reversal of H3K9me2 by a Small-Molecule Inhibitor for the G9a Histone Methyltransferase. ''Molecular Cell'', 2007, letn.25, str. 473-481<br /> *Feldman N. ''et al.'' G9a-mediated irreversible epigenetic inactivation of Oct-3/4 during early embryogenesis. ''Nature Cell Biology'', 2006, letn.8, št.2<br /> *Jeong Beom Kim ''et al.'', Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors, ''Nature'', 2008, letn. 454 št. 7204, str. 646-651<br /> *Su-YiTsai ''et al.'', Oct4 and Klf4 Reprogram Dermal Papilla Cells Into Induced Pluripotent Stem Cells, ''StemCells'', 2010, letn. 28, št. 2, str. 221-228<br /> *Jeong Beom Kim ''et al.'', Oct4-Induced Pluripotency in Adult Neural Stem Cells, ''Cell'', 2009, letn. 136, št. 3, str. 411-419<br /> *Wikipedia, Induced pluripotent stem cells, 2.5.2013, citirano [25.5.2013]</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Reprogramiranje_z_dvema_faktorjema&diff=8062 2013-05-27T17:44:41Z

<p>AnaGrom: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Inducirane pluripotentne matične celice (iPSCs) so proizvedene iz že diferenciranih celic z dediferenciacijo. Nastanek induciranih pluripotentnih celic je mogoč z izražanjem določenih transkripcijskih faktorjev. Seznam je na začetku obsegal 24 faktorjev, ki pa so ga uspeli skrčiti na le štiri faktorje. <br /> <br /> ==Faktorji==<br /> Pri iPSCs največkrat omenjajo Yamanaka faktorje Oct4, c-Myc, Klf4 in Sox2, poimenovanih po njihovem odkritelju. Izražanje teh štirih faktorjev je zadostno za pridobitev induciranih pluripotentnih celic. Težnja po odkritju metode, ki bi potrdila, da je tudi manj faktorjev zadostnih za zagotovitev pluripotentnosti celic je bila velika zaradi vsaj dveh razlogov. Manj vključujočih faktorjev bi pomenilo tudi manj tveganj in manj komplikacij. Hkrati pa so želeli izključiti onkogene faktorje, kot sta Klf4 in c-Myc. Z raziskavami so potrdili, da sta dovolj tudi le dva od Yamanaka faktorjev, katerih izbira ni poljubna.<br /> Delovanje faktorjev Klf4, Oct4 in Sox2 je kooperativno, delujejo na iste tarčne gene. C-Myc pa deluje na povsem druge tarčne gene in tu ni v povezavi z ostalimi faktorji. Že to nakazuje na večjo možnost zamenjave faktorja c-Myc, kot pa katerega od ostalih faktorjev, ki so v sodelovanju in vplivajo na iste gene.<br /> <br /> *'''Oct4'''<br /> Oct4 (Octamer-binding transcription factor 4). Oct4 je pri ljudeh kodiran z genom ''POU5F1''. Regulacija tega gena je zelo pomembna pri vzdrževanju stanja pluripotentnosti. Prevelika ali premajhna količina Oct4 povzroči diferenciacijo celice, kar pomeni izgubo pluripotentnosti. Faktorja Oct4 in Klf4 sta dovolj za pridobitev iPSCs.<br /> *'''Sox2'''<br /> SRY (sex determining region Y) box 2 ali Sox2. Primarna vloga faktorja Sox2 je vpliv na izražanje Oct4. Faktorja tvorita heterodimer in se kooperativno vežeta na DNA na nepalindromskih zaporedjih. S tem aktivirata faktorje za zagotovitev pluripotentnosti. Sox2 pa vpliva tudi na tarčni gen ''Nanog'', ki je povezan s pluripotentnostjo. Kombinacija dveh faktorjev Sox2 in Oct4 je bila pri človeških fibroblastih ugotovljena za primerno in zadostno pri zagotavljanju pluripotentnosti iPSCs. Izguba pluripotentnosti pri faktorju Sox2 in Oct4 je regulirana s hipermetilacijo nekaterih vezavnih mest Sox2 in Oct4 v moških zarodnih celicah.<br /> *'''c-Myc'''<br /> c-Myc ima vlogo pri nastanku iPSCs, saj sodeluje pri acetilaciji histonov. Lastnost tega faktorja je, da je onkogen. Temu je tudi sledil trend, da se odkrije način proizvajanja iPSCs pri katerih omenjenega faktorja ne bi bilo potrebno izraziti/uporabiti.<br /> *'''Klf4'''<br /> Kruppel-like factor 4, je pri ljudeh zapisan z genom ''KLF4''. V četverki faktorjev za pluripotentnost celic so ga uspeli nadomestiti.<br /> <br /> ==Reprogramiranje celic, ki endogeno že izražajo enega ali več faktorjev== <br /> Prvi način, kako pridobiti iPS celice brez uporabe c-Myc in Klf4, je uporaba celic, ki ta dva faktorja izražajo endogeno.<br /> <br /> ===Reprogramiranje odraslih živčnih matičnih celic z uporabo dveh faktorjev=== <br /> Odrasle živčne matične celice so se izkazale kot primerne, saj endogeno izražajo višje ravni Sox2 in c-Myc, kot pa zarodne matične celice. Izražajo tudi Klf4. Višje izražanje Sox2 naj bi zagotavljalo matičnost in jo pomagalo vzdrževati. Predvideva se, da Sox2 nadzira izražanje Oct4. Živčne matične celice se lahko razvijejo v astrocite, oligodendrocite in nevrone. Lahko jih izoliramo iz zarodka, odraslega ali ''post mortem''. Izmed petnajstih preizkušenih kombinacij so iPS celice nastale le pri parih Oct4 in Kfl4 ter paru Oct4 in c-Myc. Par Oct4 in Kfl4 se je izkazal kot potencialno zanimiv, ker za njegovo pripravo ni potreben c-Myc ter tako ne povzroča nastanka tumorjev v potomcih in tako iPS celice približuje klinični uporabi. Raziskava je bila najprej izvedena na mišjih živčnih matičnih celicah, nato pa so metodo kot uspešno potrdili še na človeških živčnih matičnih celicah.<br /> ===Reprogramiranje celic dermalne papile z uporabo dveh faktorjev=== <br /> Živčne matične celice so težje dostopne, za njihovo pridobitev so včasih potrebni invazivni postopki. Kot alternativa se ponujajo celice dermalne papile, specializirani fibroblasti. Nahajajo se v koži na meji med dermisom in epidermisom. So lažje dostopni in tudi zanje je bilo ugotovljeno, da endogeno izražajo Sox2 in c-Myc ter Klf4. Raziskava je pokazala, da jih je možno dediferncirati z uporabo štiri, treh Oct4, Klf4 in c-Myc brez endogeno izraženega Sox2, ter dveh faktorjev, in sicer Oct4 in Klf4. Časi, potrebni za dediferenciacijo s štirimi, tremi in dvema faktorjema, so primerljivi s časi, potrebnimi za dedifernciacijo odraslih živčnih matičnih celic. Se pa iPS celice, pridobljene iz dermalnih papil, razlikujejo od iPS celic, pridobljenih iz odraslih živčnih matičnih celic, v tem, da imajo promoter za faktor Nanog hipometiliran.<br /> ===Reprogramiranje mišjih odraslih živčnih matičnih celic z uporabo enega faktorja===<br /> Ker je bilo ugotovljeno, da odrasle živčne matične celice izražajo tri izmed štirih faktorjev, vse razen Oct4, so raziskovalci poskusili pridobiti iPS celice samo z ekspresijo Oct4. Že od samega začetka raziskovanja faktorjev, ki ločujejo embrionalne celice od ostalih celic, ki niso pluripotentne, se na podlagi profila izražanja zdi, da ima Oct4 glavno vlogo pri pluripotentnosti celic. Odrasle živčne matične celice so po indukciji Oct4 z retrovirusom postale iPS celice po štirih do petih tednih, izkoristek pa je bil v primerjavi s tistimi, pridobljenimi z dvema faktorjema (Oct4 in Klf4) slabši za desetkrat. Southern blot analiza je pokazala, da enofaktorske celice (Oct4) vsebujejo dve ali pet virusnih integracij, medtem ko so dvofaktorske(Oct4 in Klf4) in štirifaktorske (Oct4, Kfl4, Sox2 in c-Myc) vsebovale po sedem virusnih integracij. To pomeni, da je pri enofaktorskih celicah manjši poseg v sam genom celic in s tem tudi manjše tveganje za neželene posledice. Pluripotentnost je bila v nadaljevanju potrjena z nastankom teratomov po indukciji enofaktorskih celic v golo miš in mikroinjeciranjem v mišje blastociste, kjer so enofaktorske celice prispevale k nastanku vseh treh zarodnih plasti, številnih organov in tudi gamet. Vse to kaže,da imajo tako pridobljene enofaktorske celice enako pluripotentnost kot embrionalne matične celice. Raziskave so bile narejene tako na miših kot na človeških odraslih živčnih matičnih celicah.<br /> <br /> <br /> ==Reprogramiranje celic, ki endogeno ne izražajo reprogramirajočih faktorjev== <br /> Kot vidimo, lahko za reprogramiranje odraslih živčnih matičnih celic (NSC) uporabimo samo Oct4 in Klf4. Ampak te celice že endogeno izražajo Sox2. Ugotovili pa so, da Oct4 in Klf4 zadostujeta tudi za reprogramiranje mišjih embrionalnih fibroblastov (MEF).<br /> <br /> ===Reprogramiranje brez uporabe c-Myc=== <br /> Reprogramiranje celic lahko izboljšajo molekule, ki sodelujejo v organizaciji kromatina. Učinkovitost lahko rahlo povečajo (2-5-krat) inhibitorji DNA metiltransferaze ter histon deacetilaze (HDAC). Primer takšnih inhibitorjev so 5`-azacitidin (5-azaC) in valproična kislina (VPA). Iz tega lahko sklepamo, da so spremembe kromatina ključni korak pri reprogramiranju fibroblastov v pluripotentne celice.<br /> Ta sklep je bil uporabljen pri reprogramiranju MEF brez uporabe c-Myc, ki drugače poteka z zelo majhno učinkovitostjo - inducira se manj kot 0,001% celic. Če pa poleg treh faktorjev dodamo tudi 5`-azacitidin oz. VPA lahko to učinkovitost povečamo. Izkazalo se je da 5`-azacitidin poveča učinkovitost 3-krat, VPA pa tudi do 50-krat. Pri tem VPA ne vpliva na spremembo iPSC – te ostanejo podobne mišjim embrionalnim matičnim celicam (MESC).<br /> <br /> ===Reprogramiranje brez uporabe Sox2=== <br /> Yan Shi in sodelavci so ugotovili, da je možno tudi reprogramiranje MEF z uporabo samo dveh faktorjev – Oct4 in Klf4. V poskusih, ki so jih izvedli na MEF, so ugotovili, da najbolj uspešno lahko nadomestijo Sox2 z uporabo kombinacije dveh molekul – BIX-01294 (BIX) in BayK8644 (BayK).<br /> BIX deluje na epigenetskem nivoju in ima široko območje aktivnosti. Zato so naredili poskus, katerega namen je bil odkriti še dodatne molekule, ki bi lahko izboljšale delovanje BIX in specificirale delovanje na izražanje Sox2. V osnovno gojišče so dodali BIX po virusni transdukciji celic z Oct4/Klf4 ter takšne celice obdelovali z različnimi molekulami. Ugotovili so, da je bila najbolj uspešna kombinacija BIX in BayK. Ta kombinacija je povečala število kolonij, ki so bile morfološko zelo podobne MESC. BayK nima nikakršnega učinka na reprogramiranje v odsotnosit BIX in ne deluje na epigenetskem nivoju, ampak na prenos signala. To je prva molekula za katero se je izkazalo da vpliva na reprogramiranje, ne deluje pa na epigenetskem nivoju. Takšna molekula bi lahko delovala bolj specifično kot pa molekule, ki delujejo direktno na spremembo DNA in histonov (BIX, VPA in 5`-azacitidin).<br /> <br /> ===Dediferenciacija celic z reaktivacijo Oct-3/4 gena===<br /> Lahko naredimo še en korak dalje, namreč nadomestimo lahko tudi uporabo Oct4.<br /> Ker BIX-01294 omogoča reprogramiranje NPC z Klf4/Sox2/c-Myc sklepamo, da lahko v tem primeru nadomesti uporabo Oct4.<br /> Oct-3/4 gen se izraža med gametogenezo in v zgodnjih embrionalnih celicah, kjer ima pomembno vlogo pri vzdrževanju pluripotentnosti. Med diferenciacijo celic pride do inhibicije tega gena. V tem procesu pomembno vlogo igra G9a histon metil transferaza (HMTaza) - vključena je v deacetilacijo histonov v regiji promotorja, lahko di- ali tri-metilira Lys 9 na histonu 3 (H3K9) ter na promotor prinese ''de novo'' DNA metilaze. Slednja vloga je zelo pomembna, ker so ugotovili, da je ravno ''de novo'' metilacija ključna ovira za z Oct-3/4 posredovano dediferenciacijo.<br /> BIX-01294 inhibira G9a HMTazo in na ta način omogoča ponovno izražanje Oct-3/4 v že diferenciranih celicah.<br /> <br /> ==Viri==<br /> *Yan Shi ''et al.'' Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic Fibroblasts by Oct4 and Klf4 with Small-Molecule Compounds. ''Cell Press'', 2008, letn.3, str. 568-574<br /> *Kubicek S. ''et al.'' Reversal of H3K9me2 by a Small-Molecule Inhibitor for the G9a Histone Methyltransferase. ''Molecular Cell'', 2007, letn.25, str. 473-481<br /> *Feldman N. ''et al.'' G9a-mediated irreversible epigenetic inactivation of Oct-3/4 during early embryogenesis. ''Nature Cell Biology'', 2006, letn.8, št.2<br /> *Jeong Beom Kim ''et al.'', Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors, ''Nature'', 2008, letn. 454 št. 7204, str. 646-651<br /> *Su-YiTsai ''et al.'', Oct4 and Klf4 Reprogram Dermal Papilla Cells Into Induced Pluripotent Stem Cells, ''StemCells'', 2010, letn. 28, št. 2, str. 221-228<br /> *Jeong Beom Kim ''et al.'', Oct4-Induced Pluripotency in Adult Neural Stem Cells, ''Cell'', 2009, letn. 136, št. 3, str. 411-419<br /> *Wikipedia, Induced pluripotent stem cells, 2.5.2013, citirano [25.5.2013]</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Reprogramiranje_z_dvema_faktorjema&diff=8061 2013-05-27T17:37:46Z

<p>AnaGrom: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Inducirane pluripotentne matične celice (iPSCs) so proizvedene iz že diferenciranih celic z dediferenciacijo. Nastanek induciranih pluripotentnih celic je mogoč z izražanjem določenih transkripcijskih faktorjev. Seznam je na začetku obsegal 24 faktorjev, ki pa so ga uspeli skrčiti na le štiri faktorje. <br /> <br /> ==Faktorji==<br /> Pri iPSCs največkrat omenjajo Yamanaka faktorje Oct4, c-Myc, Klf4 in Sox2, poimenovanih po njihovem odkritelju. Izražanje teh štirih faktorjev je zadostno za pridobitev induciranih pluripotentnih celic. Težnja po odkritju metode, ki bi potrdila, da je tudi manj faktorjev zadostnih za zagotovitev pluripotentnosti celic je bila velika zaradi vsaj dveh razlogov. Manj vključujočih faktorjev bi pomenilo tudi manj tveganj in manj komplikacij. Hkrati pa so želeli izključiti onkogene faktorje, kot sta Klf4 in c-Myc. Z raziskavami so potrdili, da sta dovolj tudi le dva od Yamanaka faktorjev, katerih izbira ni poljubna.<br /> Delovanje faktorjev Klf4, Oct4 in Sox2 je kooperativno, delujejo na iste tarčne gene. C-Myc pa deluje na povsem druge tarčne gene in tu ni v povezavi z ostalimi faktorji. Že to nakazuje na večjo možnost zamenjave faktorja c-Myc, kot pa katerega od ostalih faktorjev, ki so v sodelovanju in vplivajo na iste gene.<br /> <br /> *'''Oct4'''<br /> Oct4 (Octamer-binding transcription factor 4). Oct4 je pri ljudeh kodiran z genom ''POU5F1''. Regulacija tega gena je zelo pomembna pri vzdrževanju stanja pluripotentnosti. Prevelika ali premajhna količina Oct4 povzroči diferenciacijo celice, kar pomeni izgubo pluripotentnosti. Faktorja Oct4 in Klf4 sta dovolj za pridobitev iPSCs.<br /> *'''Sox2'''<br /> SRY (sex determining region Y) box 2 ali Sox2. Primarna vloga faktorja Sox2 je vpliv na izražanje Oct4. Faktorja tvorita heterodimer in se kooperativno vežeta na DNA na nepalindromskih zaporedjih. S tem aktivirata faktorje za zagotovitev pluripotentnosti. Sox2 pa vpliva tudi na tarčni gen ''Nanog'', ki je povezan s pluripotentnostjo. Kombinacija dveh faktorjev Sox2 in Oct4 je bila pri človeških fibroblastih ugotovljena za primerno in zadostno pri zagotavljanju pluripotentnosti iPSCs. Izguba pluripotentnosti pri faktorju Sox2 in Oct4 je regulirana s hipermetilacijo nekaterih vezavnih mest Sox2 in Oct4 v moških zarodnih celicah.<br /> *'''c-Myc'''<br /> c-Myc ima vlogo pri nastanku iPSCs, saj sodeluje pri acetilaciji histonov. Lastnost tega faktorja je, da je onkogen. Temu je tudi sledil trend, da se odkrije način proizvajanja iPSCs pri katerih omenjenega faktorja ne bi bilo potrebno izraziti/uporabiti.<br /> *'''Klf4'''<br /> Kruppel-like factor 4, je pri ljudeh zapisan z genom ''KLF4''. V četverki faktorjev za pluripotentnost celic so ga uspeli nadomestiti.<br /> <br /> ==Reprogramiranje celic, ki endogeno že izražajo enega ali več faktorjev== <br /> Prvi način, kako pridobiti iPS celice brez uporabe c-Myc in Klf4, je uporaba celic, ki ta dva faktorja izražajo endogeno.<br /> <br /> ===Reprogramiranje odraslih živčnih matičnih celic z uporabo dveh faktorjev=== <br /> Odrasle živčne matične celice so se izkazale kot primerne, saj endogeno izražajo višje ravni Sox2 in c-Myc, kot pa zarodne matične celice. Izražajo tudi Klf4. Višje izražanje Sox2 naj bi zagotavljalo matičnost in jo pomagalo vzdrževati. Predvideva se, da Sox2 nadzira izražanje Oct4. Živčne matične celice se lahko razvijejo v astrocite, oligodendrocite in nevrone. Lahko jih izoliramo iz zarodka, odraslega ali ''post mortem''. Izmed petnajstih preizkušenih kombinacij so iPS celice nastale le pri parih Oct4 in Kfl4 ter paru Oct4 in c-Myc. Par Oct4 in Kfl4 se je izkazal kot potencialno zanimiv, ker za njegovo pripravo ni potreben c-Myc ter tako ne povzroča nastanka tumorjev v potomcih in tako iPS celice približuje klinični uporabi. Raziskava je bila najprej izvedena na mišjih živčnih matičnih celicah, nato pa so metodo kot uspešno potrdili še na človeških živčnih matičnih celicah.<br /> ===Reprogramiranje celic dermalne papile z uporabo dveh faktorjev=== <br /> Živčne matične celice so težje dostopne, za njihovo pridobitev so včasih potrebni invazivni postopki. Kot alternativa se ponujajo celice dermalne papile, specializirani fibroblasti. Nahajajo se v koži na meji med dermisom in epidermisom. So lažje dostopni in tudi zanje je bilo ugotovljeno, da endogeno izražajo Sox2 in c-Myc ter Klf4. Raziskava je pokazala, da jih je možno dediferncirati z uporabo štiri, treh Oct4, Klf4 in c-Myc brez endogeno izraženega Sox2, ter dveh faktorjev, in sicer Oct4 in Klf4. Časi, potrebni za dediferenciacijo s štirimi, tremi in dvema faktorjema, so primerljivi s časi, potrebnimi za dedifernciacijo odraslih živčnih matičnih celic. Se pa iPS celice, pridobljene iz dermalnih papil, razlikujejo od iPS celic, pridobljenih iz odraslih živčnih matičnih celic, v tem, da imajo promoter za faktor Nanog hipometiliran.<br /> ===Reprogramiranje mišjih odraslih živčnih matičnih celic z uporabo enega faktorja===<br /> Ker je bilo ugotovljeno, da odrasle živčne matične celice izražajo tri izmed štirih faktorjev, vse razen Oct4, so raziskovalci poskusili pridobiti iPS celice samo z ekspresijo Oct4. Že od samega začetka raziskovanja faktorjev, ki ločujejo embrionalne celice od ostalih celic, ki niso pluripotentne, se na podlagi profila izražanja zdi, da ima Oct4 glavno vlogo pri pluripotentnosti celic. Odrasle živčne matične celice so po indukciji Oct4 z retrovirusom postale iPS celice po štirih do petih tednih, izkoristek pa je bil v primerjavi s tistimi, pridobljenimi z dvema faktorjema (Oct4 in Klf4) slabši za desetkrat. Southern blot analiza je pokazala, da enofaktorske celice (Oct4) vsebujejo dve ali pet virusnih integracij, medtem ko so dvofaktorske(Oct4 in Klf4) in štirifaktorske (Oct4, Kfl4, Sox2 in c-Myc) vsebovale po sedem virusnih integracij. To pomeni, da je pri enofaktorskih celicah manjši poseg v sam genom celic in s tem tudi manjše tveganje za neželene posledice. Pluripotentnost je bila v nadaljevanju potrjena z nastankom teratomov po indukciji enofaktorskih celic v golo miš in mikroinjeciranjem v mišje blastociste, kjer so enofaktorske celice prispevale k nastanku vseh treh zarodnih plasti, številnih organov in tudi gamet. Vse to kaže,da imajo tako pridobljene enofaktorske celice enako pluripotentnost kot embrionalne matične celice. Raziskave so bile narejene tako na miših kot na človeških odraslih živčnih matičnih celicah.<br /> <br /> <br /> ==Reprogramiranje celic, ki endogeno ne izražajo reprogramirajočih faktorjev== <br /> Kot vidimo, lahko za reprogramiranje odraslih živčnih matičnih celic (NSC) uporabimo samo Oct4 in Klf4. Ampak te celice že endogeno izražajo Sox2. Ugotovili pa so, da Oct4 in Klf4 zadostujeta tudi za reprogramiranje mišjih embrionalnih fibroblastov (MEF).<br /> <br /> ===Reprogramiranje brez uporabe c-Myc=== <br /> Reprogramiranje celic lahko izboljšajo molekule, ki sodelujejo v organizaciji kromatina. Učinkovitost lahko rahlo povečajo (2-5-krat) inhibitorji DNA metiltransferaze ter histon deacetilaze (HDAC). Primer takšnih inhibitorjev so 5`-azacitidin (5-azaC) in valproična kislina (VPA). Iz tega lahko sklepamo, da so spremembe kromatina ključni korak pri reprogramiranju fibroblastov v pluripotentne celice.<br /> Ta sklep je bil uporabljen pri reprogramiranju MEF brez uporabe c-Myc, ki drugače poteka z zelo majhno učinkovitostjo - inducira se manj kot 0,001% celic. Če pa poleg treh faktorjev dodamo tudi 5`-azacitidin oz. VPA lahko to učinkovitost povečamo. Izkazalo se je da 5`-azacitidin poveča učinkovitost 3-krat, VPA pa tudi do 50-krat. Pri tem VPA ne vpliva na spremembo iPSC – te ostanejo podobne mišjim embrionalnim matičnim celicam (MESC).<br /> <br /> ===Reprogramiranje brez uporabe Sox2=== <br /> Yan Shi in sodelavci so ugotovili, da je možno tudi reprogramiranje MEF z uporabo samo dveh faktorjev – Oct4 in Klf4. V poskusih, ki so jih izvedli na MEF, so ugotovili, da najbolj uspešno lahko nadomestijo Sox2 z uporabo kombinacije dveh molekul – BIX-01294 (BIX) in BayK8644 (BayK).<br /> BIX deluje na epigenetskem nivoju in ima široko območje aktivnosti. Zato so naredili poskus, katerega namen je bil odkriti še dodatne molekule, ki bi lahko izboljšale delovanje BIX in specificirale delovanje na izražanje Sox2. V osnovno gojišče so dodali BIX po virusni transdukciji celic z Oct4/Klf4 ter takšne celice obdelovali z različnimi molekulami. Ugotovili so, da je bila najbolj uspešna kombinacija BIX in BayK. Ta kombinacija je povečala število kolonij, ki so bile morfološko zelo podobne MESC. BayK nima nikakršnega učinka na reprogramiranje v odsotnosit BIX in ne deluje na epigenetskem nivoju, ampak na prenos signala. To je prva molekula za katero se je izkazalo da vpliva na reprogramiranje, ne deluje pa na epigenetskem nivoju. Takšna molekula bi lahko delovala bolj specifično kot pa molekule, ki delujejo direktno na spremembo DNA in histonov (BIX, VPA in 5`-azacitidin).<br /> <br /> ===Dediferenciacija celic z reaktivacijo Oct-3/4 gena===<br /> Lahko naredimo še en korak dalje, namreč nadomestimo lahko tudi uporabo Oct4.<br /> Ker BIX-01294 omogoča reprogramiranje NPC z Klf4/Sox2/c-Myc sklepamo da lahko v tem primeru nadomesti uporabo Oct4.<br /> Oct-3/4 gen se izraža med gametogenezo in v zgodnjih embrionalnih celicah, kjer ima pomembno vlogo pri vzdrževanju pluripotentnosti. Med diferenciacijo celic pride do inhibicije tega gena. V tem procesu pomembno vlogo igra G9a histon metil transferaza (HMTaza) - vključena je v deacetilacijo histonov v regiji promotorja, lahko di- ali tri-metilira Lys 9 na histonu 3 (H3K9) ter na promotor prinese de novo DNA metilaze. Slednja vloga je zelo pomembna, ker so ugotovili da je ravno de novo metilacija ključna ovira za z Oct-3/4 posredovano dediferenciacijo.<br /> BIX-01294 inhibira G9a HMTazo in na ta način omogoča ponovno izražanje Oct-3/4 v že diferenciranih celicah.<br /> <br /> ==Viri==<br /> *Yan Shi ''et al.'' Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic Fibroblasts by Oct4 and Klf4 with Small-Molecule Compounds. ''Cell Press'', 2008, letn.3, str. 568-574<br /> *Kubicek S. ''et al.'' Reversal of H3K9me2 by a Small-Molecule Inhibitor for the G9a Histone Methyltransferase. ''Molecular Cell'', 2007, letn.25, str. 473-481<br /> *Feldman N. ''et al.'' G9a-mediated irreversible epigenetic inactivation of Oct-3/4 during early embryogenesis. ''Nature Cell Biology'', 2006, letn.8, št.2<br /> *Jeong Beom Kim ''et al.'', Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors, ''Nature'', 2008, letn. 454 št. 7204, str. 646-651<br /> *Su-YiTsai ''et al.'', Oct4 and Klf4 Reprogram Dermal Papilla Cells Into Induced Pluripotent Stem Cells, ''StemCells'', 2010, letn. 28, št. 2, str. 221-228<br /> *Jeong Beom Kim ''et al.'', Oct4-Induced Pluripotency in Adult Neural Stem Cells, ''Cell'', 2009, letn. 136, št. 3, str. 411-419<br /> *Wikipedia, Induced pluripotent stem cells, 2.5.2013, citirano [25.5.2013]</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Reprogramiranje_z_dvema_faktorjema&diff=8060 2013-05-27T17:28:11Z

<p>AnaGrom: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Inducirane pluripotentne matične celice (iPSCs) so proizvedene iz že diferenciranih celic z dediferenciacijo. Nastanek induciranih pluripotentnih celic je mogoč z izražanjem določenih transkripcijskih faktorjev. Seznam je na začetku obsegal 24 faktorjev, ki pa so ga uspeli skrčiti na le štiri faktorje. <br /> <br /> ==Faktorji==<br /> Pri iPSCs največkrat omenjajo Yamanaka faktorje Oct4, c-Myc, Klf4 in Sox2, poimenovanih po njihovem odkritelju. Izražanje teh štirih faktorjev je zadostno za pridobitev induciranih pluripotentnih celic. Težnja po odkritju metode, ki bi potrdila, da je tudi manj faktorjev zadostnih za zagotovitev pluripotentnosti celic je bila velika zaradi vsaj dveh razlogov. Manj vključujočih faktorjev bi pomenilo tudi manj tveganj in manj komplikacij. Hkrati pa so želeli izključiti onkogene faktorje, kot sta Klf4 in c-Myc. Z raziskavami so potrdili, da sta dovolj tudi le dva od Yamanaka faktorjev, katerih izbira ni poljubna.<br /> Delovanje faktorjev Klf4, Oct4 in Sox2 je kooperativno, delujejo na iste tarčne gene. C-Myc pa deluje na povsem druge tarčne gene in tu ni v povezavi z ostalimi faktorji. Že to nakazuje na večjo možnost zamenjave faktorja c-Myc, kot pa katerega od ostalih faktorjev, ki so v sodelovanju in vplivajo na iste gene.<br /> <br /> *'''Oct4'''<br /> Oct4 (Octamer-binding transcription factor 4). Oct4 je pri ljudeh kodiran z genom ''POU5F1''. Regulacija tega gena je zelo pomembna pri vzdrževanju stanja pluripotentnosti. Prevelika ali premajhna količina Oct4 povzroči diferenciacijo celice, kar pomeni izgubo pluripotentnosti. Faktorja Oct4 in Klf4 sta dovolj za pridobitev iPSCs.<br /> *'''Sox2'''<br /> SRY (sex determining region Y) box 2 ali Sox2. Primarna vloga faktorja Sox2 je vpliv na izražanje Oct4. Faktorja tvorita heterodimer in se kooperativno vežeta na DNA na nepalindromskih zaporedjih. S tem aktivirata faktorje za zagotovitev pluripotentnosti. Sox2 pa vpliva tudi na tarčni gen ''Nanog'', ki je povezan s pluripotentnostjo. Kombinacija dveh faktorjev Sox2 in Oct4 je bila pri človeških fibroblastih ugotovljena za primerno in zadostno pri zagotavljanju pluripotentnosti iPSCs. Izguba pluripotentnosti pri faktorju Sox2 in Oct4 je regulirana s hipermetilacijo nekaterih vezavnih mest Sox2 in Oct4 v moških zarodnih celicah.<br /> *'''c-Myc'''<br /> c-Myc ima vlogo pri nastanku iPSCs, saj sodeluje pri acetilaciji histonov. Lastnost tega faktorja je, da je onkogen. Temu je tudi sledil trend, da se odkrije način proizvajanja iPSCs pri katerih omenjenega faktorja ne bi bilo potrebno izraziti/uporabiti.<br /> *'''Klf4'''<br /> Kruppel-like factor 4, je pri ljudeh zapisan z genom ''KLF4''. V četverki faktorjev za pluripotentnost celic so ga uspeli nadomestiti.<br /> <br /> ==Reprogramiranje celic, ki endogeno že izražajo enega ali več faktorjev== <br /> Prvi način, kako pridobiti iPS celice brez uporabe c-Myc in Klf4, je uporaba celic, ki ta dva faktorja izražajo endogeno.<br /> <br /> ===Reprogramiranje odraslih živčnih matičnih celic z uporabo dveh faktorjev=== <br /> Odrasle živčne matične celice so se izkazale kot primerne, saj endogeno izražajo višje ravni Sox2 in c-Myc, kot pa zarodne matične celice. Izražajo tudi Klf4. Višje izražanje Sox2 naj bi zagotavljalo matičnost in jo pomagalo vzdrževati. Predvideva se, da Sox2 nadzira izražanje Oct4. Živčne matične celice se lahko razvijejo v astrocite, oligodendrocite in nevrone. Lahko jih izoliramo iz zarodka, odraslega ali post mortem. Izmed petnajstih preizkušenih kombinacij so iPS celice nastale le pri parih Oct4 in Kfl4 ter paru Oct4 in c-Myc. Par Oct4 in Kfl4 se je izkazal kot potencialno zanimiv, ker za njegovo pripravo ni potreben c-Myc ter tako ne povzroča nastanka tumorjev v potomcih in tako iPS celice približuje klinični uporabi. Raziskava je bila najprej izvedena na mišjih živčnih matičnih celicah, nato pa so metodo kot uspešno potrdili še na človeških živčnih matičnih celicah.<br /> ===Reprogramiranje celic dermalne papile z uporabo dveh faktorjev=== <br /> Živčne matične celice so težje dostopne, za njihovo pridobitev so včasih potrebni invazivni postopki. Kot alternativa se ponujajo celice dermalne papile, specializirani fibroblasti. Nahajajo se v koži na meji med dermisom in epidermisom. So lažje dostopni in tudi zanje je bilo ugotovljeno, da endogeno izražajo Sox2 in c-Myc ter Klf4. Raziskava je pokazala, da jih je možno dediferncirati z uporabo štiri, treh Oct4, Klf4 in c-Myc brez endogeno izraženega Sox2, ter dveh faktorjev, in sicer Oct4 in Klf4. Časi, potrebni za dediferenciacijo s štirimi, tremi in dvema faktorjema, so primerljivi s časi, potrebnimi za dedifernciacijo odraslih živčnih matičnih celic. Se pa iPS celice, pridobljene iz dermalnih papil, razlikujejo od iPS celic, pridobljenih iz odraslih živčnih matičnih celic, v tem, da imajo promoter za faktor Nanog hipometiliran.<br /> ===Reprogramiranje mišjih odraslih živčnih matičnih celic z uporabo enega faktorja===<br /> Ker je bilo ugotovljeno, da odrasle živčne matične celice izražajo tri izmed štirih faktorjev, vse razen Oct4, so raziskovalci poskusili pridobiti iPS celice samo z ekspresijo Oct4. Že od samega začetka raziskovanja faktorjev, ki ločujejo embrionalne celice od ostalih celic, ki niso pluripotentne, se na podlagi profila izražanja zdi, da ima Oct4 glavno vlogo pri pluripotentnosti celic. Odrasle živčne matične celice so po indukciji Oct4 z retrovirusom postale iPS celice po štirih do petih tednih, izkoristek pa je bil v primerjavi s tistimi, pridobljenimi z dvema faktorjema (Oct4 in Klf4) slabši za desetkrat. Southern blot analiza je pokazala, da enofaktorske celice (Oct4) vsebujejo dve ali pet virusnih integracij, medtem ko so dvofaktorske(Oct4 in Klf4) in štirifaktorske (Oct4, Kfl4, Sox2 in c-Myc) vsebovale po sedem virusnih integracij. To pomeni, da je pri enofaktorskih celicah manjši poseg v sam genom celic in s tem tudi manjše tveganje za neželene posledice. Pluripotentnost je bila v nadaljevanju potrjena z nastankom teratomov po indukciji enofaktorskih celic v golo miš in mikroinjeciranjem v mišje blastociste, kjer so enofaktorske celice prispevale k nastanku vseh treh zarodnih plasti, številnih organov in tudi gamet. Vse to kaže,da imajo tako pridobljene enofaktorske celice enako pluripotentnost kot embrionalne matične celice. Raziskave so bile narejene tako na miših kot na človeških odraslih živčnih matičnih celicah.<br /> <br /> <br /> ==Reprogramiranje celic, ki endogeno ne izražajo reprogramirajočih faktorjev== <br /> Kot vidimo, lahko za reprogramiranje odraslih živčnih matičnih celic (NSC) uporabimo samo Oct4 in Klf4. Ampak te celice že endogeno izražajo Sox2. Ugotovili pa so, da Oct4 in Klf4 zadostujeta tudi za reprogramiranje mišjih embrionalnih fibroblastov (MEF).<br /> <br /> ===Reprogramiranje brez uporabe c-Myc=== <br /> Reprogramiranje celic lahko izboljšajo molekule, ki sodelujejo v organizaciji kromatina. Učinkovitost lahko rahlo povečajo (2-5-krat) inhibitorji DNA metiltransferaze ter histon deacetilaze (HDAC). Primer takšnih inhibitorjev so 5`-azacitidin (5-azaC) in valproična kislina (VPA). Iz tega lahko sklepamo, da so spremembe kromatina ključni korak pri reprogramiranju fibroblastov v pluripotentne celice.<br /> Ta sklep je bil uporabljen pri reprogramiranju MEF brez uporabe c-Myc, ki drugače poteka z zelo majhno učinkovitostjo - inducira se manj kot 0,001% celic. Če pa poleg treh faktorjev dodamo tudi 5`-azacitidin oz. VPA lahko to učinkovitost povečamo. Izkazalo se je da 5`-azacitidin poveča učinkovitost 3-krat, VPA pa tudi do 50-krat. Pri tem VPA ne vpliva na spremembo iPSC – te ostanejo podobne mišjim embrionalnim matičnim celicam (MESC).<br /> <br /> ===Reprogramiranje brez uporabe Sox2=== <br /> Yan Shi in sodelavci so ugotovili, da je možno tudi reprogramiranje MEF z uporabo samo dveh faktorjev – Oct4 in Klf4. V poskusih, ki so jih izvedli na MEF, so ugotovili, da najbolj uspešno lahko nadomestijo Sox2 z uporabo kombinacije dveh molekul – BIX-01294 (BIX) in BayK8644 (BayK).<br /> BIX deluje na epigenetskem nivoju in ima široko območje aktivnosti. Zato so naredili poskus, katerega namen je bil odkriti še dodatne molekule, ki bi lahko izboljšale delovanje BIX in specificirale delovanje na izražanje Sox2. V osnovno gojišče so dodali BIX po virusni transdukciji celic z Oct4/Klf4 ter takšne celice obdelovali z različnimi molekulami. Ugotovili so, da je bila najbolj uspešna kombinacija BIX in BayK. Ta kombinacija je povečala število kolonij, ki so bile morfološko zelo podobne MESC. BayK nima nikakršnega učinka na reprogramiranje v odsotnosit BIX in ne deluje na epigenetskem nivoju, ampak na prenos signala. To je prva molekula za katero se je izkazalo da vpliva na reprogramiranje, ne deluje pa na epigenetskem nivoju. Takšna molekula bi lahko delovala bolj specifično kot pa molekule, ki delujejo direktno na spremembo DNA in histonov (BIX, VPA in 5`-azacitidin).<br /> <br /> ===Dediferenciacija celic z reaktivacijo Oct-3/4 gena===<br /> Lahko naredimo še en korak dalje, namreč nadomestimo lahko tudi uporabo Oct4.<br /> Ker BIX-01294 omogoča reprogramiranje NPC z Klf4/Sox2/c-Myc sklepamo da lahko v tem primeru nadomesti uporabo Oct4.<br /> Oct-3/4 gen se izraža med gametogenezo in v zgodnjih embrionalnih celicah, kjer ima pomembno vlogo pri vzdrževanju pluripotentnosti. Med diferenciacijo celic pride do inhibicije tega gena. V tem procesu pomembno vlogo igra G9a histon metil transferaza (HMTaza) - vključena je v deacetilacijo histonov v regiji promotorja, lahko di- ali tri-metilira Lys 9 na histonu 3 (H3K9) ter na promotor prinese de novo DNA metilaze. Slednja vloga je zelo pomembna, ker so ugotovili da je ravno de novo metilacija ključna ovira za z Oct-3/4 posredovano dediferenciacijo.<br /> BIX-01294 inhibira G9a HMTazo in na ta način omogoča ponovno izražanje Oct-3/4 v že diferenciranih celicah.<br /> <br /> ==Viri==<br /> *Yan Shi ''et al.'' Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic Fibroblasts by Oct4 and Klf4 with Small-Molecule Compounds. ''Cell Press'', 2008, letn.3, str. 568-574<br /> *Kubicek S. ''et al.'' Reversal of H3K9me2 by a Small-Molecule Inhibitor for the G9a Histone Methyltransferase. ''Molecular Cell'', 2007, letn.25, str. 473-481<br /> *Feldman N. ''et al.'' G9a-mediated irreversible epigenetic inactivation of Oct-3/4 during early embryogenesis. ''Nature Cell Biology'', 2006, letn.8, št.2<br /> *Jeong Beom Kim ''et al.'', Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors, ''Nature'', 2008, letn. 454 št. 7204, str. 646-651<br /> *Su-YiTsai ''et al.'', Oct4 and Klf4 Reprogram Dermal Papilla Cells Into Induced Pluripotent Stem Cells, ''StemCells'', 2010, letn. 28, št. 2, str. 221-228<br /> *Jeong Beom Kim ''et al.'', Oct4-Induced Pluripotency in Adult Neural Stem Cells, ''Cell'', 2009, letn. 136, št. 3, str. 411-419<br /> *Wikipedia, Induced pluripotent stem cells, 2.5.2013, citirano [25.5.2013]</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Reprogramiranje_z_dvema_faktorjema&diff=8057 2013-05-27T16:40:40Z

<p>AnaGrom: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Inducirane pluripotentne matične celice (iPSCs) so proizvedene iz že diferenciranih celic z dediferenciacijo. Nastanek induciranih pluripotentnih celic je mogoč z izražanjem določenih transkripcijskih faktorjev. Seznam je na začetku obsegal 24 faktorjev, ki pa so ga uspeli skrčiti na le štiri faktorje. <br /> <br /> ==Faktorji==<br /> Pri iPSCs največkrat omenjajo Yamanaka faktorje Oct4, c-Myc, Klf4 in Sox2, poimenovanih po njihovem odkritelju. Izražanje teh štirih faktorjev je zadostno za pridobitev induciranih pluripotentnih celic. Težnja po odkritju metode, ki bi potrdila, da je tudi manj faktorjev zadostnih za zagotovitev pluripotentnosti celic je bila velika zaradi vsaj dveh razlogov. Manj vključujočih faktorjev bi pomenilo tudi manj tveganj in manj komplikacij. Hkrati pa so želeli izključiti onkogene faktorje, kot sta Klf4 in c-Myc. Z raziskavami so potrdili, da sta dovolj tudi le dva od Yamanaka faktorjev, katerih izbira ni poljubna.<br /> Delovanje faktorjev Klf4, Oct4 in Sox2 je kooperativno, delujejo na iste tarčne gene. C-Myc pa deluje na povsem druge tarčne gene in tu ni v povezavi z ostalimi faktorji. Že to nakazuje na večjo možnost zamenjave faktorja c-Myc, kot pa katerega od ostalih faktorjev, ki so v sodelovanju in vplivajo na iste gene.<br /> <br /> *'''Oct4'''<br /> Oct4 (Octamer-binding transcription factor 4). Oct4 je pri ljudeh kodiran z genom ''POU5F1''. Regulacija tega gena je zelo pomembna pri vzdrževanju stanja pluripotentnosti. Prevelika ali premajhna količina Oct4 povzroči diferenciacijo celice, kar pomeni izgubo pluripotentnosti. Faktorja Oct4 in Klf4 sta dovolj za pridobitev iPSCs.<br /> *'''Sox2'''<br /> SRY (sex determining region Y) box 2 ali Sox2. Primarna vloga faktorja Sox2 je vpliv na izražanje Oct4. Faktorja tvorita heterodimer in se kooperativno vežeta na DNA na nepalindromskih zaporedjih. S tem aktivirata faktorje za zagotovitev pluripotentnosti. Sox2 pa vpliva tudi na tarčni gen ''Nanog'', ki je povezan s pluripotentnostjo. Kombinacija dveh faktorjev Sox2 in Oct4 je bila pri človeških fibroblastih ugotovljena za primerno in zadostno pri zagotavljanju pluripotentnosti iPSCs. Izguba pluripotentnosti pri faktorju Sox2 in Oct4 je regulirana s hipermetilacijo nekaterih vezavnih mest Sox2 in Oct4 v moških zarodnih celicah.<br /> *'''c-Myc'''<br /> c-Myc ima vlogo pri nastanku iPSCs, saj sodeluje pri acetilaciji histonov. Lastnost tega faktorja je, da je onkogen. Temu je tudi sledil trend, da se odkrije način proizvajanja iPSCs pri katerih omenjenega faktorja ne bi bilo potrebno izraziti/uporabiti.<br /> *'''Klf4'''<br /> Kruppel-like factor 4, je pri ljudeh zapisan z genom KLF4. V četverki faktorjev za pluripotentnost celic so ga uspeli nadomestiti.<br /> <br /> ==Reprogramiranje celic, ki endogeno že izražajo enega ali več faktorjev== <br /> Prvi način, kako pridobiti iPS celice brez uporabe c-Myc in Klf4, je uporaba celic, ki ta dva faktorja izražajo endogeno.<br /> <br /> ===Reprogramiranje odraslih živčnih matičnih celic z uporabo dveh faktorjev=== <br /> Odrasle živčne matične celice so se izkazale kot primerne, saj endogeno izražajo višje ravni Sox2 in c-Myc, kot pa zarodne matične celice. Izražajo tudi Klf4. Višje izražanje Sox2 naj bi zagotavljalo matičnost in jo pomagalo vzdrževati. Predvideva se, da Sox2 nadzira izražanje Oct4. Živčne matične celice se lahko razvijejo v astrocite, oligodendrocite in nevrone. Lahko jih izoliramo iz zarodka, odraslega ali post mortem. Izmed petnajstih preizkušenih kombinacij so iPS celice nastale le pri parih Oct4 in Kfl4 ter paru Oct4 in c-Myc. Par Oct4 in Kfl4 se je izkazal kot potencialno zanimiv, ker za njegovo pripravo ni potreben c-Myc ter tako ne povzroča nastanka tumorjev v potomcih in tako iPS celice približuje klinični uporabi. Raziskava je bila najprej izvedena na mišjih živčnih matičnih celicah, nato pa so metodo kot uspešno potrdili še na človeških živčnih matičnih celicah.<br /> ===Reprogramiranje celic dermalne papile z uporabo dveh faktorjev=== <br /> Živčne matične celice so težje dostopne, za njihovo pridobitev so včasih potrebni invazivni postopki. Kot alternativa se ponujajo celice dermalne papile, specializirani fibroblasti. Nahajajo se v koži na meji med dermisom in epidermisom. So lažje dostopni in tudi zanje je bilo ugotovljeno, da endogeno izražajo Sox2 in c-Myc ter Klf4. Raziskava je pokazala, da jih je možno dediferncirati z uporabo štiri, treh Oct4, Klf4 in c-Myc brez endogeno izraženega Sox2, ter dveh faktorjev, in sicer Oct4 in Klf4. Časi, potrebni za dediferenciacijo s štirimi, tremi in dvema faktorjema, so primerljivi s časi, potrebnimi za dedifernciacijo odraslih živčnih matičnih celic. Se pa iPS celice, pridobljene iz dermalnih papil, razlikujejo od iPS celic, pridobljenih iz odraslih živčnih matičnih celic, v tem, da imajo promoter za faktor Nanog hipometiliran.<br /> ===Reprogramiranje mišjih odraslih živčnih matičnih celic z uporabo enega faktorja===<br /> Ker je bilo ugotovljeno, da odrasle živčne matične celice izražajo tri izmed štirih faktorjev, vse razen Oct4, so raziskovalci poskusili pridobiti iPS celice samo z ekspresijo Oct4. Že od samega začetka raziskovanja faktorjev, ki ločujejo embrionalne celice od ostalih celic, ki niso pluripotentne, se na podlagi profila izražanja zdi, da ima Oct4 glavno vlogo pri pluripotentnosti celic. Odrasle živčne matične celice so po indukciji Oct4 z retrovirusom postale iPS celice po štirih do petih tednih, izkoristek pa je bil v primerjavi s tistimi, pridobljenimi z dvema faktorjema (Oct4 in Klf4) slabši za desetkrat. Southern blot analiza je pokazala, da enofaktorske celice (Oct4) vsebujejo dve ali pet virusnih integracij, medtem ko so dvofaktorske(Oct4 in Klf4) in štirifaktorske (Oct4, Kfl4, Sox2 in c-Myc) vsebovale po sedem virusnih integracij. To pomeni, da je pri enofaktorskih celicah manjši poseg v sam genom celic in s tem tudi manjše tveganje za neželene posledice. Pluripotentnost je bila v nadaljevanju potrjena z nastankom teratomov po indukciji enofaktorskih celic v golo miš in mikroinjeciranjem v mišje blastociste, kjer so enofaktorske celice prispevale k nastanku vseh treh zarodnih plasti, številnih organov in tudi gamet. Vse to kaže,da imajo tako pridobljene enofaktorske celice enako pluripotentnost kot embrionalne matične celice. Raziskave so bile narejene tako na miših kot na človeških odraslih živčnih matičnih celicah.<br /> <br /> <br /> ==Reprogramiranje celic, ki endogeno ne izražajo reprogramirajočih faktorjev== <br /> Kot vidimo, lahko za reprogramiranje odraslih živčnih matičnih celic (NSC) uporabimo samo Oct4 in Klf4. Ampak te celice že endogeno izražajo Sox2. Ugotovili pa so, da Oct4 in Klf4 zadostujeta tudi za reprogramiranje mišjih embrionalnih fibroblastov (MEF).<br /> <br /> ===Reprogramiranje brez uporabe c-Myc=== <br /> Reprogramiranje celic lahko izboljšajo molekule, ki sodelujejo v organizaciji kromatina. Učinkovitost lahko rahlo povečajo (2-5-krat) inhibitorji DNA metiltransferaze ter histon deacetilaze (HDAC). Primer takšnih inhibitorjev so 5`-azacitidin (5-azaC) in valproična kislina (VPA). Iz tega lahko sklepamo, da so spremembe kromatina ključni korak pri reprogramiranju fibroblastov v pluripotentne celice.<br /> Ta sklep je bil uporabljen pri reprogramiranju MEF brez uporabe c-Myc, ki drugače poteka z zelo majhno učinkovitostjo - inducira se manj kot 0,001% celic. Če pa poleg treh faktorjev dodamo tudi 5`-azacitidin oz. VPA lahko to učinkovitost povečamo. Izkazalo se je da 5`-azacitidin poveča učinkovitost 3-krat, VPA pa tudi do 50-krat. Pri tem VPA ne vpliva na spremembo iPSC – te ostanejo podobne mišjim embrionalnim matičnim celicam (MESC).<br /> <br /> ===Reprogramiranje brez uporabe Sox2=== <br /> Yan Shi in sodelavci so ugotovili, da je možno tudi reprogramiranje MEF z uporabo samo dveh faktorjev – Oct4 in Klf4. V poskusih, ki so jih izvedli na MEF, so ugotovili, da najbolj uspešno lahko nadomestijo Sox2 z uporabo kombinacije dveh molekul – BIX-01294 (BIX) in BayK8644 (BayK).<br /> BIX deluje na epigenetskem nivoju in ima široko območje aktivnosti. Zato so naredili poskus, katerega namen je bil odkriti še dodatne molekule, ki bi lahko izboljšale delovanje BIX in specificirale delovanje na izražanje Sox2. V osnovno gojišče so dodali BIX po virusni transdukciji celic z Oct4/Klf4 ter takšne celice obdelovali z različnimi molekulami. Ugotovili so, da je bila najbolj uspešna kombinacija BIX in BayK. Ta kombinacija je povečala število kolonij, ki so bile morfološko zelo podobne MESC. BayK nima nikakršnega učinka na reprogramiranje v odsotnosit BIX in ne deluje na epigenetskem nivoju, ampak na prenos signala. To je prva molekula za katero se je izkazalo da vpliva na reprogramiranje, ne deluje pa na epigenetskem nivoju. Takšna molekula bi lahko delovala bolj specifično kot pa molekule, ki delujejo direktno na spremembo DNA in histonov (BIX, VPA in 5`-azacitidin).<br /> <br /> ===Dediferenciacija celic z reaktivacijo Oct-3/4 gena===<br /> Lahko naredimo še en korak dalje, namreč nadomestimo lahko tudi uporabo Oct4.<br /> Ker BIX-01294 omogoča reprogramiranje NPC z Klf4/Sox2/c-Myc sklepamo da lahko v tem primeru nadomesti uporabo Oct4.<br /> Oct-3/4 gen se izraža med gametogenezo in v zgodnjih embrionalnih celicah, kjer ima pomembno vlogo pri vzdrževanju pluripotentnosti. Med diferenciacijo celic pride do inhibicije tega gena. V tem procesu pomembno vlogo igra G9a histon metil transferaza (HMTaza) - vključena je v deacetilacijo histonov v regiji promotorja, lahko di- ali tri-metilira Lys 9 na histonu 3 (H3K9) ter na promotor prinese de novo DNA metilaze. Slednja vloga je zelo pomembna, ker so ugotovili da je ravno de novo metilacija ključna ovira za z Oct-3/4 posredovano dediferenciacijo.<br /> BIX-01294 inhibira G9a HMTazo in na ta način omogoča ponovno izražanje Oct-3/4 v že diferenciranih celicah.<br /> <br /> ==Viri==<br /> *Yan Shi ''et al.'' Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic Fibroblasts by Oct4 and Klf4 with Small-Molecule Compounds. ''Cell Press'', 2008, letn.3, str. 568-574<br /> *Kubicek S. ''et al.'' Reversal of H3K9me2 by a Small-Molecule Inhibitor for the G9a Histone Methyltransferase. ''Molecular Cell'', 2007, letn.25, str. 473-481<br /> *Feldman N. ''et al.'' G9a-mediated irreversible epigenetic inactivation of Oct-3/4 during early embryogenesis. ''Nature Cell Biology'', 2006, letn.8, št.2<br /> *Jeong Beom Kim ''et al.'', Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors, ''Nature'', 2008, letn. 454 št. 7204, str. 646-651<br /> *Su-YiTsai ''et al.'', Oct4 and Klf4 Reprogram Dermal Papilla Cells Into Induced Pluripotent Stem Cells, ''StemCells'', 2010, letn. 28, št. 2, str. 221-228<br /> *Jeong Beom Kim ''et al.'', Oct4-Induced Pluripotency in Adult Neural Stem Cells, ''Cell'', 2009, letn. 136, št. 3, str. 411-419<br /> *Wikipedia, Induced pluripotent stem cells, 2.5.2013, citirano [25.5.2013]</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Reprogramiranje_z_dvema_faktorjema&diff=8056 2013-05-27T16:37:32Z

<p>AnaGrom: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Inducirane pluripotentne matične celice (iPSCs) so proizvedene iz že diferenciranih celic z dediferenciacijo. Nastanek induciranih pluripotentnih celic je mogoč z izražanjem določenih transkripcijskih faktorjev. Seznam je na začetku obsegal 24 faktorjev, ki pa so ga uspeli skrčiti na le štiri faktorje. <br /> <br /> ==Faktorji==<br /> Pri iPSCs največkrat omenjajo Yamanaka faktorje Oct4, c-Myc, Klf4 in Sox2, poimenovanih po njihovem odkritelju. Izražanje teh štirih faktorjev je zadostno za pridobitev induciranih pluripotentnih celic. Težnja po odkritju metode, ki bi potrdila, da je tudi manj faktorjev zadostnih za zagotovitev pluripotentnosti celic je bila velika zaradi vsaj dveh razlogov. Manj vključujočih faktorjev bi pomenilo tudi manj tveganj in manj komplikacij. Hkrati pa so želeli izključiti onkogene faktorje, kot sta Klf4 in c-Myc. Z raziskavami so potrdili, da sta dovolj tudi le dva od Yamanaka faktorjev, katerih izbira ni poljubna.<br /> Delovanje faktorjev Klf4, Oct4 in Sox2 je kooperativno, delujejo na iste tarčne gene. C-Myc pa deluje na povsem druge tarčne gene in tu ni v povezavi z ostalimi faktorji. Že to nakazuje na večjo možnost zamenjave faktorja c-Myc, kot pa katerega od ostalih faktorjev, ki so v sodelovanju in vplivajo na iste gene.<br /> <br /> *'''Oct4'''<br /> Oct4 (Octamer-binding transcription factor 4). Oct4 je pri ljudeh kodiran z genom ''POU5F1''. Regulacija tega gena je zelo pomembna pri vzdrževanju stanja pluripotentnosti. Prevelika ali premajhna količina Oct4 povzroči diferenciacijo celice, kar pomeni izgubo pluripotentnosti. Faktorja Oct4 in Klf4 sta dovolj za pridobitev iPSCs.<br /> *'''Sox2'''<br /> SRY (sex determining region Y) box 2 ali Sox2. Primarna vloga faktorja Sox2 je vpliv na izražanje Oct4. Faktorja tvorita heterodimer in se kooperativno vežeta na DNA na nepalindromskih zaporedjih. S tem aktivirata faktorje za zagotovitev pluripotentnosti. Sox2 pa vpliva tudi na tarčni gen Nanog, ki je povezan s pluripotentnostjo. Kombinacija dveh faktorjev Sox2 in Oct4 je bila pri človeških fibroblastih ugotovljena za primerno in zadostno pri zagotavljanju pluripotentnosti iPSCs. Izguba pluripotentnosti pri faktorju Sox2 in Oct4 je regulirana s hipermetilacijo nekaterih vezavnih mest Sox2 in Oct4 v moških zarodnih celicah.<br /> *'''c-Myc'''<br /> c-Myc ima vlogo pri nastanku iPSCs, saj sodeluje pri acetilaciji histonov. Lastnost tega faktorja je, da je onkogen. Temu je tudi sledil trend, da se odkrije način proizvajanja iPSCs pri katerih omenjenega faktorja ne bi bilo potrebno izraziti/uporabiti.<br /> *'''Klf4'''<br /> Kruppel-like factor 4, je pri ljudeh zapisan z genom KLF4. V četverki faktorjev za pluripotentnost celic so ga uspeli nadomestiti.<br /> <br /> ==Reprogramiranje celic, ki endogeno že izražajo enega ali več faktorjev== <br /> Prvi način, kako pridobiti iPS celice brez uporabe c-Myc in Klf4, je uporaba celic, ki ta dva faktorja izražajo endogeno.<br /> <br /> ===Reprogramiranje odraslih živčnih matičnih celic z uporabo dveh faktorjev=== <br /> Odrasle živčne matične celice so se izkazale kot primerne, saj endogeno izražajo višje ravni Sox2 in c-Myc, kot pa zarodne matične celice. Izražajo tudi Klf4. Višje izražanje Sox2 naj bi zagotavljalo matičnost in jo pomagalo vzdrževati. Predvideva se, da Sox2 nadzira izražanje Oct4. Živčne matične celice se lahko razvijejo v astrocite, oligodendrocite in nevrone. Lahko jih izoliramo iz zarodka, odraslega ali post mortem. Izmed petnajstih preizkušenih kombinacij so iPS celice nastale le pri parih Oct4 in Kfl4 ter paru Oct4 in c-Myc. Par Oct4 in Kfl4 se je izkazal kot potencialno zanimiv, ker za njegovo pripravo ni potreben c-Myc ter tako ne povzroča nastanka tumorjev v potomcih in tako iPS celice približuje klinični uporabi. Raziskava je bila najprej izvedena na mišjih živčnih matičnih celicah, nato pa so metodo kot uspešno potrdili še na človeških živčnih matičnih celicah.<br /> ===Reprogramiranje celic dermalne papile z uporabo dveh faktorjev=== <br /> Živčne matične celice so težje dostopne, za njihovo pridobitev so včasih potrebni invazivni postopki. Kot alternativa se ponujajo celice dermalne papile, specializirani fibroblasti. Nahajajo se v koži na meji med dermisom in epidermisom. So lažje dostopni in tudi zanje je bilo ugotovljeno, da endogeno izražajo Sox2 in c-Myc ter Klf4. Raziskava je pokazala, da jih je možno dediferncirati z uporabo štiri, treh Oct4, Klf4 in c-Myc brez endogeno izraženega Sox2, ter dveh faktorjev, in sicer Oct4 in Klf4. Časi, potrebni za dediferenciacijo s štirimi, tremi in dvema faktorjema, so primerljivi s časi, potrebnimi za dedifernciacijo odraslih živčnih matičnih celic. Se pa iPS celice, pridobljene iz dermalnih papil, razlikujejo od iPS celic, pridobljenih iz odraslih živčnih matičnih celic, v tem, da imajo promoter za faktor Nanog hipometiliran.<br /> ===Reprogramiranje mišjih odraslih živčnih matičnih celic z uporabo enega faktorja===<br /> Ker je bilo ugotovljeno, da odrasle živčne matične celice izražajo tri izmed štirih faktorjev, vse razen Oct4, so raziskovalci poskusili pridobiti iPS celice samo z ekspresijo Oct4. Že od samega začetka raziskovanja faktorjev, ki ločujejo embrionalne celice od ostalih celic, ki niso pluripotentne, se na podlagi profila izražanja zdi, da ima Oct4 glavno vlogo pri pluripotentnosti celic. Odrasle živčne matične celice so po indukciji Oct4 z retrovirusom postale iPS celice po štirih do petih tednih, izkoristek pa je bil v primerjavi s tistimi, pridobljenimi z dvema faktorjema (Oct4 in Klf4) slabši za desetkrat. Southern blot analiza je pokazala, da enofaktorske celice (Oct4) vsebujejo dve ali pet virusnih integracij, medtem ko so dvofaktorske(Oct4 in Klf4) in štirifaktorske (Oct4, Kfl4, Sox2 in c-Myc) vsebovale po sedem virusnih integracij. To pomeni, da je pri enofaktorskih celicah manjši poseg v sam genom celic in s tem tudi manjše tveganje za neželene posledice. Pluripotentnost je bila v nadaljevanju potrjena z nastankom teratomov po indukciji enofaktorskih celic v golo miš in mikroinjeciranjem v mišje blastociste, kjer so enofaktorske celice prispevale k nastanku vseh treh zarodnih plasti, številnih organov in tudi gamet. Vse to kaže,da imajo tako pridobljene enofaktorske celice enako pluripotentnost kot embrionalne matične celice. Raziskave so bile narejene tako na miših kot na človeških odraslih živčnih matičnih celicah.<br /> <br /> <br /> ==Reprogramiranje celic, ki endogeno ne izražajo reprogramirajočih faktorjev== <br /> Kot vidimo, lahko za reprogramiranje odraslih živčnih matičnih celic (NSC) uporabimo samo Oct4 in Klf4. Ampak te celice že endogeno izražajo Sox2. Ugotovili pa so, da Oct4 in Klf4 zadostujeta tudi za reprogramiranje mišjih embrionalnih fibroblastov (MEF).<br /> <br /> ===Reprogramiranje brez uporabe c-Myc=== <br /> Reprogramiranje celic lahko izboljšajo molekule, ki sodelujejo v organizaciji kromatina. Učinkovitost lahko rahlo povečajo (2-5-krat) inhibitorji DNA metiltransferaze ter histon deacetilaze (HDAC). Primer takšnih inhibitorjev so 5`-azacitidin (5-azaC) in valproična kislina (VPA). Iz tega lahko sklepamo, da so spremembe kromatina ključni korak pri reprogramiranju fibroblastov v pluripotentne celice.<br /> Ta sklep je bil uporabljen pri reprogramiranju MEF brez uporabe c-Myc, ki drugače poteka z zelo majhno učinkovitostjo - inducira se manj kot 0,001% celic. Če pa poleg treh faktorjev dodamo tudi 5`-azacitidin oz. VPA lahko to učinkovitost povečamo. Izkazalo se je da 5`-azacitidin poveča učinkovitost 3-krat, VPA pa tudi do 50-krat. Pri tem VPA ne vpliva na spremembo iPSC – te ostanejo podobne mišjim embrionalnim matičnim celicam (MESC).<br /> <br /> ===Reprogramiranje brez uporabe Sox2=== <br /> Yan Shi in sodelavci so ugotovili, da je možno tudi reprogramiranje MEF z uporabo samo dveh faktorjev – Oct4 in Klf4. V poskusih, ki so jih izvedli na MEF, so ugotovili, da najbolj uspešno lahko nadomestijo Sox2 z uporabo kombinacije dveh molekul – BIX-01294 (BIX) in BayK8644 (BayK).<br /> BIX deluje na epigenetskem nivoju in ima široko območje aktivnosti. Zato so naredili poskus, katerega namen je bil odkriti še dodatne molekule, ki bi lahko izboljšale delovanje BIX in specificirale delovanje na izražanje Sox2. V osnovno gojišče so dodali BIX po virusni transdukciji celic z Oct4/Klf4 ter takšne celice obdelovali z različnimi molekulami. Ugotovili so, da je bila najbolj uspešna kombinacija BIX in BayK. Ta kombinacija je povečala število kolonij, ki so bile morfološko zelo podobne MESC. BayK nima nikakršnega učinka na reprogramiranje v odsotnosit BIX in ne deluje na epigenetskem nivoju, ampak na prenos signala. To je prva molekula za katero se je izkazalo da vpliva na reprogramiranje, ne deluje pa na epigenetskem nivoju. Takšna molekula bi lahko delovala bolj specifično kot pa molekule, ki delujejo direktno na spremembo DNA in histonov (BIX, VPA in 5`-azacitidin).<br /> <br /> ===Dediferenciacija celic z reaktivacijo Oct-3/4 gena===<br /> Lahko naredimo še en korak dalje, namreč nadomestimo lahko tudi uporabo Oct4.<br /> Ker BIX-01294 omogoča reprogramiranje NPC z Klf4/Sox2/c-Myc sklepamo da lahko v tem primeru nadomesti uporabo Oct4.<br /> Oct-3/4 gen se izraža med gametogenezo in v zgodnjih embrionalnih celicah, kjer ima pomembno vlogo pri vzdrževanju pluripotentnosti. Med diferenciacijo celic pride do inhibicije tega gena. V tem procesu pomembno vlogo igra G9a histon metil transferaza (HMTaza) - vključena je v deacetilacijo histonov v regiji promotorja, lahko di- ali tri-metilira Lys 9 na histonu 3 (H3K9) ter na promotor prinese de novo DNA metilaze. Slednja vloga je zelo pomembna, ker so ugotovili da je ravno de novo metilacija ključna ovira za z Oct-3/4 posredovano dediferenciacijo.<br /> BIX-01294 inhibira G9a HMTazo in na ta način omogoča ponovno izražanje Oct-3/4 v že diferenciranih celicah.<br /> <br /> ==Viri==<br /> *Yan Shi ''et al.'' Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic Fibroblasts by Oct4 and Klf4 with Small-Molecule Compounds. ''Cell Press'', 2008, letn.3, str. 568-574<br /> *Kubicek S. ''et al.'' Reversal of H3K9me2 by a Small-Molecule Inhibitor for the G9a Histone Methyltransferase. ''Molecular Cell'', 2007, letn.25, str. 473-481<br /> *Feldman N. ''et al.'' G9a-mediated irreversible epigenetic inactivation of Oct-3/4 during early embryogenesis. ''Nature Cell Biology'', 2006, letn.8, št.2<br /> *Jeong Beom Kim ''et al.'', Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors, ''Nature'', 2008, letn. 454 št. 7204, str. 646-651<br /> *Su-YiTsai ''et al.'', Oct4 and Klf4 Reprogram Dermal Papilla Cells Into Induced Pluripotent Stem Cells, ''StemCells'', 2010, letn. 28, št. 2, str. 221-228<br /> *Jeong Beom Kim ''et al.'', Oct4-Induced Pluripotency in Adult Neural Stem Cells, ''Cell'', 2009, letn. 136, št. 3, str. 411-419<br /> *Wikipedia, Induced pluripotent stem cells, 2.5.2013, citirano [25.5.2013]</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Reprogramiranje_z_dvema_faktorjema&diff=8055 2013-05-27T16:36:39Z

<p>AnaGrom: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Inducirane pluripotentne matične celice (iPSCs) so proizvedene iz že diferenciranih celic z dediferenciacijo. Nastanek induciranih pluripotentnih celic je mogoč z izražanjem določenih transkripcijskih faktorjev. Seznam je na začetku obsegal 24 faktorjev, ki pa so ga uspeli skrčiti na le štiri faktorje. <br /> <br /> ==Faktorji==<br /> Pri iPSCs največkrat omenjajo Yamanaka faktorje Oct4, c-Myc, Klf4 in Sox2, poimenovanih po njihovem odkritelju. Izražanje teh štirih faktorjev je zadostno za pridobitev induciranih pluripotentnih celic. Težnja po odkritju metode, ki bi potrdila, da je tudi manj faktorjev zadostnih za zagotovitev pluripotentnosti celic je bila velika zaradi vsaj dveh razlogov. Manj vključujočih faktorjev bi pomenilo tudi manj tveganj in manj komplikacij. Hkrati pa so želeli izključiti onkogene faktorje, kot sta Klf4 in c-Myc. Z raziskavami so potrdili, da sta dovolj tudi le dva od Yamanaka faktorjev, katerih izbira ni poljubna.<br /> Delovanje faktorjev Klf4, Oct4 in Sox2 je kooperativno, delujejo na iste tarčne gene. C-Myc pa deluje na povsem druge tarčne gene in tu ni v povezavi z ostalimi faktorji. Že to nakazuje na večjo možnost zamenjave faktorja c-Myc, kot pa katerega od ostalih faktorjev, ki so v sodelovanju in vplivajo na iste gene.<br /> <br /> *'''Oct4'''<br /> Oct4 (Octamer-binding transcription factor 4). Oct4 je pri ljudeh kodiran z genom ''POU5F1''. Regulacija tega gena je zelo pomembna pri vzdrževanju stanja pluripotentnosti. Prevelika ali premajhna količina Oct4 povzroči diferenciacijo celice, kar pomeni izgubo pluripotentnosti. Faktorja Oct4 in Klf4 sta dovolj za pridobitev iPSCs.<br /> *'''Sox2'''<br /> SRY (sex determining region Y) box 2 ali Sox2. Primarna vloga faktorja Sox2 je vpliv na izražanje Oct4. Faktorja tvorita heterodimer in se kooperativno vežeta na DNA na nepalindromskih zaporedjih. S tem aktivirata faktorje za zagotovitev pluripotentnosti. Sox2 pa vpliva tudi na tarčni gen Nanog, ki je povezan s pluripotentnostjo. Kombinacija dveh faktorjev Sox2 in Oct4 je bila pri človeških fibroblastih ugotovljena za primerno in zadostno pri zagotavljanju pluripotentnosti iPSCs. Izguba pluripotentnosti pri faktorju Sox2 in Oct4 je regulirana s hipermetilacijo nekaterih vezavnih mest Sox2 in Oct4 v moških zarodnih celicah.<br /> *'''c-Myc'''<br /> c-Myc ima vlogo pri nastanku iPSCs, saj sodeluje pri acetilaciji histonov. Lastnost tega faktorja je, da je onkogen. Temu je tudi sledil trend, da se odkrije način proizvajanja iPSCs pri katerih omenjenega faktorja ne bi bilo potrebno izraziti/uporabiti.<br /> *'''Klf4'''<br /> Kruppel-like factor 4, je pri ljudeh zapisan z genom KLF4. V četverki faktorjev za pluripotentnost celic so ga uspeli nadomestiti.<br /> <br /> ==Reprogramiranje celic, ki endogeno že izražajo enega ali več faktorjev== <br /> Prvi način, kako pridobiti iPS celice brez uporabe c-Myc in Klf4, je uporaba celic, ki ta dva faktorja izražajo endogeno<br /> <br /> ===Reprogramiranje odraslih živčnih matičnih celic z uporabo dveh faktorjev=== <br /> Odrasle živčne matične celice so se izkazale kot primerne, saj endogeno izražajo višje ravni Sox2 in c-Myc, kot pa zarodne matične celice. Izražajo tudi Klf4. Višje izražanje Sox2 naj bi zagotavljalo matičnost in jo pomagalo vzdrževati. Predvideva se, da Sox2 nadzira izražanje Oct4. Živčne matične celice se lahko razvijejo v astrocite, oligodendrocite in nevrone. Lahko jih izoliramo iz zarodka, odraslega ali post mortem. Izmed petnajstih preizkušenih kombinacij so iPS celice nastale le pri parih Oct4 in Kfl4 ter paru Oct4 in c-Myc. Par Oct4 in Kfl4 se je izkazal kot potencialno zanimiv, ker za njegovo pripravo ni potreben c-Myc ter tako ne povzroča nastanka tumorjev v potomcih in tako iPS celice približuje klinični uporabi. Raziskava je bila najprej izvedena na mišjih živčnih matičnih celicah, nato pa so metodo kot uspešno potrdili še na človeških živčnih matičnih celicah.<br /> ===Reprogramiranje celic dermalne papile z uporabo dveh faktorjev=== <br /> Živčne matične celice so težje dostopne, za njihovo pridobitev so včasih potrebni invazivni postopki. Kot alternativa se ponujajo celice dermalne papile, specializirani fibroblasti. Nahajajo se v koži na meji med dermisom in epidermisom. So lažje dostopni in tudi zanje je bilo ugotovljeno, da endogeno izražajo Sox2 in c-Myc ter Klf4. Raziskava je pokazala, da jih je možno dediferncirati z uporabo štiri, treh Oct4, Klf4 in c-Myc brez endogeno izraženega Sox2, ter dveh faktorjev, in sicer Oct4 in Klf4. Časi, potrebni za dediferenciacijo s štirimi, tremi in dvema faktorjema, so primerljivi s časi, potrebnimi za dedifernciacijo odraslih živčnih matičnih celic. Se pa iPS celice, pridobljene iz dermalnih papil, razlikujejo od iPS celic, pridobljenih iz odraslih živčnih matičnih celic, v tem, da imajo promoter za faktor Nanog hipometiliran.<br /> ===Reprogramiranje mišjih odraslih živčnih matičnih celic z uporabo enega faktorja===<br /> Ker je bilo ugotovljeno, da odrasle živčne matične celice izražajo tri izmed štirih faktorjev, vse razen Oct4, so raziskovalci poskusili pridobiti iPS celice samo z ekspresijo Oct4. Že od samega začetka raziskovanja faktorjev, ki ločujejo embrionalne celice od ostalih celic, ki niso pluripotentne, se na podlagi profila izražanja zdi, da ima Oct4 glavno vlogo pri pluripotentnosti celic. Odrasle živčne matične celice so po indukciji Oct4 z retrovirusom postale iPS celice po štirih do petih tednih, izkoristek pa je bil v primerjavi s tistimi, pridobljenimi z dvema faktorjema (Oct4 in Klf4) slabši za desetkrat. Southern blot analiza je pokazala, da enofaktorske celice (Oct4) vsebujejo dve ali pet virusnih integracij, medtem ko so dvofaktorske(Oct4 in Klf4) in štirifaktorske (Oct4, Kfl4, Sox2 in c-Myc) vsebovale po sedem virusnih integracij. To pomeni, da je pri enofaktorskih celicah manjši poseg v sam genom celic in s tem tudi manjše tveganje za neželene posledice. Pluripotentnost je bila v nadaljevanju potrjena z nastankom teratomov po indukciji enofaktorskih celic v golo miš in mikroinjeciranjem v mišje blastociste, kjer so enofaktorske celice prispevale k nastanku vseh treh zarodnih plasti, številnih organov in tudi gamet. Vse to kaže,da imajo tako pridobljene enofaktorske celice enako pluripotentnost kot embrionalne matične celice. Raziskave so bile narejene tako na miših kot na človeških odraslih živčnih matičnih celicah.<br /> <br /> <br /> ==Reprogramiranje celic, ki endogeno ne izražajo reprogramirajočih faktorjev== <br /> Kot vidimo, lahko za reprogramiranje odraslih živčnih matičnih celic (NSC) uporabimo samo Oct4 in Klf4. Ampak te celice že endogeno izražajo Sox2. Ugotovili pa so, da Oct4 in Klf4 zadostujeta tudi za reprogramiranje mišjih embrionalnih fibroblastov (MEF).<br /> <br /> ===Reprogramiranje brez uporabe c-Myc=== <br /> Reprogramiranje celic lahko izboljšajo molekule, ki sodelujejo v organizaciji kromatina. Učinkovitost lahko rahlo povečajo (2-5-krat) inhibitorji DNA metiltransferaze ter histon deacetilaze (HDAC). Primer takšnih inhibitorjev so 5`-azacitidin (5-azaC) in valproična kislina (VPA). Iz tega lahko sklepamo, da so spremembe kromatina ključni korak pri reprogramiranju fibroblastov v pluripotentne celice.<br /> Ta sklep je bil uporabljen pri reprogramiranju MEF brez uporabe c-Myc, ki drugače poteka z zelo majhno učinkovitostjo - inducira se manj kot 0,001% celic. Če pa poleg treh faktorjev dodamo tudi 5`-azacitidin oz. VPA lahko to učinkovitost povečamo. Izkazalo se je da 5`-azacitidin poveča učinkovitost 3-krat, VPA pa tudi do 50-krat. Pri tem VPA ne vpliva na spremembo iPSC – te ostanejo podobne mišjim embrionalnim matičnim celicam (MESC).<br /> <br /> ===Reprogramiranje brez uporabe Sox2=== <br /> Yan Shi in sodelavci so ugotovili, da je možno tudi reprogramiranje MEF z uporabo samo dveh faktorjev – Oct4 in Klf4. V poskusih, ki so jih izvedli na MEF, so ugotovili, da najbolj uspešno lahko nadomestijo Sox2 z uporabo kombinacije dveh molekul – BIX-01294 (BIX) in BayK8644 (BayK).<br /> BIX deluje na epigenetskem nivoju in ima široko območje aktivnosti. Zato so naredili poskus, katerega namen je bil odkriti še dodatne molekule, ki bi lahko izboljšale delovanje BIX in specificirale delovanje na izražanje Sox2. V osnovno gojišče so dodali BIX po virusni transdukciji celic z Oct4/Klf4 ter takšne celice obdelovali z različnimi molekulami. Ugotovili so, da je bila najbolj uspešna kombinacija BIX in BayK. Ta kombinacija je povečala število kolonij, ki so bile morfološko zelo podobne MESC. BayK nima nikakršnega učinka na reprogramiranje v odsotnosit BIX in ne deluje na epigenetskem nivoju, ampak na prenos signala. To je prva molekula za katero se je izkazalo da vpliva na reprogramiranje, ne deluje pa na epigenetskem nivoju. Takšna molekula bi lahko delovala bolj specifično kot pa molekule, ki delujejo direktno na spremembo DNA in histonov (BIX, VPA in 5`-azacitidin).<br /> <br /> ===Dediferenciacija celic z reaktivacijo Oct-3/4 gena===<br /> Lahko naredimo še en korak dalje, namreč nadomestimo lahko tudi uporabo Oct4.<br /> Ker BIX-01294 omogoča reprogramiranje NPC z Klf4/Sox2/c-Myc sklepamo da lahko v tem primeru nadomesti uporabo Oct4.<br /> Oct-3/4 gen se izraža med gametogenezo in v zgodnjih embrionalnih celicah, kjer ima pomembno vlogo pri vzdrževanju pluripotentnosti. Med diferenciacijo celic pride do inhibicije tega gena. V tem procesu pomembno vlogo igra G9a histon metil transferaza (HMTaza) - vključena je v deacetilacijo histonov v regiji promotorja, lahko di- ali tri-metilira Lys 9 na histonu 3 (H3K9) ter na promotor prinese de novo DNA metilaze. Slednja vloga je zelo pomembna, ker so ugotovili da je ravno de novo metilacija ključna ovira za z Oct-3/4 posredovano dediferenciacijo.<br /> BIX-01294 inhibira G9a HMTazo in na ta način omogoča ponovno izražanje Oct-3/4 v že diferenciranih celicah.<br /> <br /> ==Viri==<br /> *Yan Shi ''et al.'' Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic Fibroblasts by Oct4 and Klf4 with Small-Molecule Compounds. ''Cell Press'', 2008, letn.3, str. 568-574<br /> *Kubicek S. ''et al.'' Reversal of H3K9me2 by a Small-Molecule Inhibitor for the G9a Histone Methyltransferase. ''Molecular Cell'', 2007, letn.25, str. 473-481<br /> *Feldman N. ''et al.'' G9a-mediated irreversible epigenetic inactivation of Oct-3/4 during early embryogenesis. ''Nature Cell Biology'', 2006, letn.8, št.2<br /> *Jeong Beom Kim ''et al.'', Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors, ''Nature'', 2008, letn. 454 št. 7204, str. 646-651<br /> *Su-YiTsai ''et al.'', Oct4 and Klf4 Reprogram Dermal Papilla Cells Into Induced Pluripotent Stem Cells, ''StemCells'', 2010, letn. 28, št. 2, str. 221-228<br /> *Jeong Beom Kim ''et al.'', Oct4-Induced Pluripotency in Adult Neural Stem Cells, ''Cell'', 2009, letn. 136, št. 3, str. 411-419<br /> *Wikipedia, Induced pluripotent stem cells, 2.5.2013, citirano [25.5.2013]</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Reprogramiranje_celic&diff=7953 2013-03-26T13:36:22Z

<p>AnaGrom: /* Skupine */</p> <hr /> <div>Seminarji pri predmetu Molekularna biologija bodo v študijskem letu 2012/13 povezani s temo Reprogramiranje celic. Pri tem ne bomo obravnavali (samo) izbrisa metilacijskih vzorcev na DNA, kar je reprogramiranje v osnovi pomenilo, pač pa se bomo ukvarjali s pripravo induciranih pluripotentnih celic. Pogosto postopek imenujejo dediferenciacija. Pri tem odraslo, diferencirano somatsko celico z biokemijskimi in molekularnobiološkimi pristopi spremenimo na tak način, da postane zelo podobna izvornim celicam. Pridobi torej sposobnost, da se ponovno diferencira v veliko različnih tipov odraslih celic. Za osnovne raziskave na tem področju so podelili Nobelovo nagrado za fiziologijo oz. medicino za leto 2012 japonskemu raziskovalcu Šinju Jamanaku, ki je prve take celice pripravil leta 2006. Gre torej za precej novo področje v celični molekularni biologiji.<br /> <br /> V nadaljevanju so navedena nekatera izhodišča oz. naslovi referatov, ki jih bomo izvedli ob koncu semestra. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se bistveno odmakniti od tega, kar je predlagano. Preverite, ali se morebitne spremembe, ki jih želite vnesti, ne dotikajo teme koga drugega. Prekrivanja med referati naj bo čim manj.<br /> <br /> <br /> <br /> Vsako temo obdelata dva ali največ trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min.<br /> <br /> Tema je v osnovi precej celičnobiološko naravnana. Vseeno pa izpostavite tiste elemente, ki so biokemijski, torej katere so ključne biološke molekule, ki so potrebne, da procesi tečejo v smeri dediferenciacije, s katerimi drugimi molekulami interagirajo, katere molekularnobiološke tehnike so uporabili raziskovalci, kako delujejo transkripcijski faktorji ipd. V seznamu tem so (razen pri prvih dveh) navedeni članki, ki naj vam služijo kot izhodišče za pripravo. Članki so pisani zelo strokovno, zato si boste morali pomagati še z drugimi viri, ki jih poiščite sami.<br /> <br /> Vse skupine morajo objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 27.5. opolnoči. Predstavitve seminarjev 1 - 4 bodo 29.5., 5 - 8 31.5., 9 - 12 5.6. in 13 - 15 7.6.2013. Vsaka skupina ima torej za predstavitev 14-18 minut časa, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki-strani uporabite zavihek 'discussion'). <br /> <br /> # Biokemijske značilnosti izvornih celic - pregled<br /> # Epigenetsko reprogramiranje - pregled<br /> # Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami (Science 2005) - http://www.sciencemag.org/content/309/5739/1369<br /> # Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Cell 2006) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867406009767<br /> # Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice (Nature 2007) - http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05934.html in http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7151/full/nature05944.html /tema za 3 študente/<br /> # Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Science 2007) - http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1920<br /> # Prve človeške inducirane pluripotentne celice (Cell in Science 2007) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867407014717 in http://www.sciencemag.org/content/318/5858/1917 /tema za 3 študente/<br /> # Brezvirusni način priprave iPSC (Science 2008) - http://www.sciencemag.org/content/322/5903/945 in http://www.sciencemag.org/content/322/5903/949 /tema za 3 študente/<br /> # Reprogramiranje z dvema faktorjema (Nature 2008) - http://www.nature.com/nature/journal/v454/n7204/full/nature07061.html<br /> # Reprogramiranje s transpozicijo (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html<br /> # Kloniranje miši iz iPSC (Nature 2009) - http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08267.html in http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7260/full/nature08310.html /za 3 študente/<br /> # Tumorigenost iPSC (Stem Cells 2009) - http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/stem.37/full<br /> # Reprogramiranje z miRNA (Cell Stem Cell 2011) - http://download.cell.com/cell-stem-cell/pdf/PIIS1934590911002219.pdf<br /> # Alternativni pristopi za pripravo iPSC (Nature Rev. Gen. 2011) - https://www.salk.edu/labs/belmonte/pubs/2011/2011-216-nrg.gonzalez.pdf /za 1-2 študenta/<br /> # Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC (Curr. Opinion Gen. Develop. 2012) - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959437X12001037 /za 1-2 študenta/<br /> <br /> <br /> == Skupine ==<br /> <br /> <br /> Skupine za projektno nalogo - po 1 - 3 za vsako temo (imena in priimke vpišite v oklepaj za naslovom teme): <br /> <br /> <br /> # Biokemijske značilnosti izvornih celic<br /> # Epigenetsko reprogramiranje (Karmen Belšak, Maša Mohar)<br /> # Reprogramiranje somatskih celic po fuziji z embrionalnimi izvornimi celicami <br /> # Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov (Ana Kunšek, Nastja Pirman)<br /> # Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice /za 3 študente/<br /> # Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših (Špela Tomaž, Zala Gluhić, Ajda Rojc)<br /> # Prve človeške inducirane pluripotentne celice (Dejan Marjanovič, Suzana Semič)<br /> # Brezvirusni način priprave iPSC /za 3 študente/(Griša Prinčič, Erik Mršnik)<br /> # Reprogramiranje z dvema faktorjema (Samo Zakotnik, Ana Grom, Mirjana Malnar)<br /> # Reprogramiranje s transpozicijo (Barbara Dušak, Sara Lorbek) <br /> # Kloniranje miši iz iPSC /za 3 študente/ (Ellen Malovrh, Ana Potočnik, Rok Razpotnik)<br /> # Tumorigenost iPSC (Urška Navodnik, Ana Remžgar)<br /> # Reprogramiranje z miRNA (Monika Biasizzo, Katja Leben, Estera Merljak)<br /> # Alternativni pristopi za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/ (Urška Rauter)<br /> # Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC /za 1-2 študenta/ (Aleksander Benčič)<br /> <br /> <br /> Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte naslednji oznaki: [[Category:SEM]] [[Category:BMB]] <br /> <br /> Kako so bili urejeni seminarji lani, si lahko ogledate na strani [[RNA-interferenca]], kjer boste našli tudi dodatne informacije za bolj poglobljeno učenje Molekularne biologije na to temo.</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO2_Povzetki_seminarjev_2012&diff=7625 2013-01-04T17:50:43Z

<p>AnaGrom: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2012/2013 */</p> <hr /> <div>== Biokemija- Povzetki seminarjev 2012/2013 ==<br /> Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2012 stran]<br /> <br /> ===Griša Prinčič: Vpliv T3SS sekretov na odziv gostiteljske celice ===<br /> <br /> S pomočjo EM je bilo mogoče podrobneje prepoznati in opisati tip III sekrecijski sistem in njegove komponente. Identificirali so vsaj pet različnih strukturnih komponent, njihovo proteinsko sestavo in delovanje.Več kot 20 različnih proteinov (YopD, YopB, YscF, YscP, YscR, YscS, YscT, YscU, YscV...) je potrebnih za učinkovito funkcioniranje T3SS-a, od katerih jih veliko kaže sekvenčno podobnost pri različnih vrstah. T3SS je sestavljen iz: igelnega dela , ki sestoji iz sekvenčno različnega proteina in tvori zvonasto ali filamentozno strukturo, zunajmembranskega kompleksa, znotrajmembranskega kompleksa in regulatornih komponent.<br /> <br /> Efektorji, ki jih bakterija »dostavi« v celico modulirajo različne signalne poti. Blokirajo lahko MAPK in MAPKK (ospF, YopJ), kar zavre imunski odziv celice in prepreči vnetne procese. Pospešijo ali upočasnijo ubiquitinacijo (Cif in CHBP), za kar koristnost in učinkovitost še ni znana. Blokirajo majhne GTP-aze (IbpA), kar povzroči spremembe v aktinskem citoskeletu in moten membranski transport. Nekatere bakterije se v gostiteljski celisi razmnožujejo s pomočjo vakuol. SifA in SseJ sta bakterijska proteina, ki omogočata učinkovito tvorjenje tovrstnih struktur. Nekateri efektorji motijo tudi sintezo maščobnih kislin, nekateri poškodujejo pomembne celične strukture kot je na primer golgijev aparat. Vsi bakterijski efektorji delujejo na principu kovalentne modifikacije, torej trajno spremenijo strukturo in s tem inaktivirajo proteine – preprečijo kaskadno verigo.<br /> <br /> ===Erik Janežič: Hippo signalna pot in matične celice ===<br /> <br /> <br /> Hippo signalna pot je ena glavnih regulatornih sistemov, ki preprečujejo tumorogenezo, nadzorujejo rast organov in sodelujejo pri diferneciaciji in vzdrževanju stalne gostote zarodnih celic. Hippo, drugače imenovana tudi Salvador/warts/hippo (SWH), je dobila takšno ime, ker mutacije v mehanizmu peljejo do preraščanja tkiva, kar lahko s tujko imenujemo »Hippopotamus «like phenotype. Prvič je bila opazovana v vinski mušici Drosophilia in večina ključnih raziskav je potekala prav na tem modelnem organizmu. Znanje pridobljeno z opazovanjem mehanizma mušic pa lahko direktno prenesemo tudi na lastnosti Hippo signalizacije sesalcev. Študije so namreč pokazale, da imajo vse ključne komponente pri mušici direktne ortologe v sesalcih in drugih organizmih. Smiselen se zdi sklep, da je bila Hippo signalna pot v veliki meri takšna kakor jo poznamo danes, prisotna že v prvih večceličnih organizmih,kar je tudi logično saj je pravilna diferenciacija in usmerjanje celic ključnega pomena za nastanke funkcionalnih celičnih enot (organov). <br /> V preteklem desetletju s številne raziskave s Hippo področja zagotovile dobro poznavanje osrednje kinazne kaskade, katere funkcija je inaktivacija oziroma aktivacija YAP/TAZ transkripcijskih kofaktorjev proteinov družine TEA. Pri Hippo signalizaciji poleg osrednje kaskade sodelujejo tudi številni membranski in citoskeletni proteini, ki imajo veliko funkcij tudi pri kontaktni inhibiciji. Ogromno eksperimentalnih dokazov kaže neposredno povezanost nepravilnega delovanja Hippo signalizacije in nastankom raka, kar je verjetno razlog za intenzivne raziskave na tem področju v današnjem času.<br /> <br /> <br /> ===Dejan Marjanovič: Vpliv in delovanje vimentina v celični signalizaciji in pomen poznavanja teh mehanizmov===<br /> <br /> <br /> Vimentina, glavni predstavnik intermediarnih filamentov (IF) , je izražen v normalnih mezenhimskih celicah, in je znano, da ohrani celovitost celic in zagotavlja odpornost proti stresu. Povečano koncentracijo vimentina, so poročali v različnih rakavih epitelih, vključno raka prostate, tumorjev prebavil, tumorjev centralnega živčnega sistema, raka dojke, pljučnega raka in druge vrste raka. Prekomerno izražanje vimentina v raku je povezano tudi z večjo rastjo tumorja, vendar je vloga vimentina v napredovanju raka še vedno nejasna.<br /> Na podlagi njegovega prekomernega izražanja v rakavih obolenjih in njegovo vlogo pri posredovanju v različnih tumorgenih dogodkih, vimentin služi kot privlačen cilj za zdravljenje raka. Poleg tega naj bi raziskave, usmerjene k pojasnjevanju vloge vimentina v različnih signalnih poteh, odpirale številne nove pristope za razvoj obetavnih zdravil za zdravljenje.<br /> <br /> Ker pa je moje širše področje signalizacija,se bom bolj podrobno usmeril za signalizacijske poti, razjasnitev številnih mehanizmov in vmesnih sodelujočih proteinov, encimov itd. Vimentin je znan po tem, da interagira z velikim številom proteinov in sodeluje v različnih celičnih funkcijah. Poleg tega vimentin sodeluje tudi v številnih drugih procesih, ki vključujejo oblikovanje kompleksov z več signalnimi molekulami in drugimi proteini. <br /> <br /> Iz te študije je razvidno, da vimentin ne deluje le kot ogrodni protein, temveč tudi posreduje pri večih poteh sporočanja in v celičnih procesih. Prav tako bi bilo zanimivo izvedeti, druge funkcije vimentina v jedru in morebitne vloge pri posredovanju v procesih celičnega cikla. Poleg tega bi lahko zunajcelični vimentin sodeloval pri posredovanje pri več signalnih procesih z vezavo na specifične receptorje, ki jih je treba še raziskati.<br /> <br /> <br /> ===Estera Merljak: Vpliv PKM2 na rakave celice===<br /> <br /> <br /> Piruvat kinaza M2 (PKM2) ima zelo pomembno vlogo pri rakavih celicah. je ena izmed oblik piruvat kinaze, ki katalizira pretvorbo fosfoenolpiruvata (PEP) v piruvat, pri čemer se fosfatna skupina iz PEP prenese na ADP ter s tem dobimo ATP. PKM2 je v izražena v celicah, ki se hitro delijo, kot so zarodne in rakave celice. Izražanje omogoča veliko transkripcijskih faktrojev, posebno pomembni pa so transkripcijski faktorji iz družine heterogenih jedernih ribonukleoproteinov (hnRNPs), ki dajejo prednost sintezi PKM2 z neposrednim vplivanjem na mRNA. <br /> Vpliv PKM2 na celičen metabolizem je zelo pomembna, saj lahko v celici prehaja med neaktivno dimerno obliko in aktivno tetramerno obliko, kar privede do različnih produktov. Aktivnost PKM2 je regulirana s strani mnogih snovi, med drugim intermediatov glikolize, ki lahko povečajo ali zmanjšajo aktivnost piruvat kinaze M2. Prav tako na aktivnost vplivajo razne post-translacijske spremembe aminokislin v samem proteinu, ki so rezultat kompleksnih reakcij v celici. S takimi procesi celica regulira sintezo energije in sintezo drugih prekurzorjev za množitev celic. <br /> Poznavanje teh procesov ima velik medicinski pomen, saj lahko pripelje do oznajdbe specifičnih zdravil za zdravljenje raka, ki bi napadale in uničile le rakave celice, zdravih pa ne.<br /> <br /> <br /> ===Maja Kostanjevec: Mehanizmi zaznavanja glukoze v evkariontskih celicah===<br /> <br /> <br /> Glukoza je pomemben vir energije, ki ureja marsikatero metabolno pot. Njena vloga se razlikuje od celice do celice glede na to, kakšne naloge opravlja. Posledično so se v evoluciji razvili različni mehanizmi njenega zaznavanja in prenosa signalov. <br /> <br /> Preučevanje zaznavnih mehanizmov glukoze je zapleteno, saj ima poleg hranilne vloge tudi signalno, ki pa jo včasih težko ločimo od ostalih procesov, v katerih sodeluje. Trenutno so najbolj raziskani mehanizmi v kvasovkah, saj gre za najenostavnejše evkarionte. V njih so odkrili štiri različne signalne poti: glavno represivno pot, cAMP pot ter inducirani poti, ki sta odvisni od senzorjev Snf3 in Rgt2 oz. od fosforilacije.<br /> <br /> Veliko bolj zahtevna je regulacija glukoze v rastlinah. V njih skrbi za izražanje različnih genov, ki urejajo procese fotosinteze, metabolizma, rasti… V modelni rastlini Arabidopisis thaliana so bili raziskani trije različni mehanizmi zaznavanja. Prvi je odvisen od heksokinaze in represira fotosintetske gene, drugi je od heksokinaze neodvisen in vsebuje še neznan receptor ter tretji, ki temelji na procesu glikolize in njenih vmesnih produktov.<br /> <br /> Zaznavanje glukoze pri sesalcih ima posebne lastnosti, ki se razlikujejo tako od tistih v kvasovkah kot v rastlinah. Ti mehanizmi so najbolje preučeni v beta celicah Langerhansovih otočkov trebušne slinavke, ki skrbijo za izločanje inzulina. Znano je, da je pri tem potreben obsežen metabolizem glukoze, kot glavni mediator pa nastopa ATP.<br /> <br /> ===Julija Mazej: Metabolizem glukoze v živčnih celicah===<br /> <br /> Glukoza je preferenčno gorivo za možganske celice. Čeprav možgani predstavljajo le 2% celotne telesne mase, za svoje delovanje porabijo kar 25% zaužite glukoze. Možganske celice lahko kot energijski substrat uporabijo tudi: laktat, piruvat, glutamin in glutamat. Kakršnakoli ovira pri energijski oskrbi, je zelo rizična in se lahko konča z nezavestjo ali celo komo v manj kot 10 sekundah. V izogib takšnemu izidu so nekatere celice sposobne nadomestiti primanjkljaj energije oz. ATP z intenzivnejšo glikolizo. To velja za nevroglijalne celice, ki z glikolizo proizvajajo laktat. Vendar pa povišana glikoliza nima enakega vpliva na vse živčne celice. Nevroni zaradi povišane glikolize manj glukoze oksidirajo po pentoza-fosfatni poti, ki tam sicer poteka v normalnih razmerah. Ta metabolična pot je za nevrone zelo pomembna, ker se pri pretvorbi glukoza-6-fosfata v ribozo-5-fosfat regenerira NADPH. To je pomemben antioksidant, ki regenerira reduciran glutation in tako varuje nevrone pred poškodbami, zaradi reaktivnih kisikovih spojin. Glikolizo v nevro celicah stimulirajo hipoksični pogoji, nevrotoksične snovi, mutacije v respiratorni verigi.. Anomalije v metabolizmu glukoze so prisotne v mnogih nevrodegenerativnih boleznih, npr. Alzheimerjevi, Parkinsonovi, Huntingtonovi bolezni. Tu se kaže aplikativen pomen raziskav povezanih z metabolizmom glukoze v možganih. Velik problem pri razumevanju metabolizma v živčnih celicah predstavljajo nepojasnjene interakcije med glija celicami in nevroni .<br /> <br /> ===Jernej Pušnik: Uravnavanje metabolizma z acetilacijo proteinov===<br /> <br /> V svoji seminarski nalogi bom predstavil pomen posttranslacijske modifikacije-acetilacije pri uravnavanju celotnega celičnega metabolizma. Kot že verjetno vsi veste, je večina reakcij, ki so del neke metabolne poti, kataliziranih z encimi. Ti pa so v osnovi proteinske makromolekule, sestavljene iz dvajsetih različnih aminokislin. Ena izmed teh aminokislin je lizin in vsebuje dve amino skupini. S prvo se povezuje v peptidno vez, druga, ki se nahaja na koncu ogljikovodikove verige pa je tarča acetilacije. Ko se acetilna skupina enkrat veže na lizinski ostanek, to povzroči določene spremembe v strukturi proteinske molekule, s tem pa se tudi spremeni encimska aktivnost. Na ta način so regulirani skoraj vsi encimi metabolizma. V seminarju sem opisal kako pride do same acetilacije in deacetilacije, da je pri tem potrebna prisotnost določenih encimov, kako se spremeni delovanje encimov delujočih v glikolizi, glukoneogenezi, citratnem ciklu, oksidaciji maščobnih kislin, oksidaciji aminokislin in ciklu sečnine. Ker je acetilacija tako razširjena modifikacija pri nadzorovanju metabolizma, imajo raziskave na tem področju velik potencial za odkritje novih terapevtskih pristopov k zdravljenju bolezni srca in ožilja, diabetesa, debelosti, itd.<br /> <br /> ===Rok Razpotnik: Metabolizem rakastih celic in njegova regulacija===<br /> <br /> V dani seminarski nalogi bom predstavil osnovne lastnosti rakavih celic, tipe celic, ki se nahajajo v tumorskem mikrookolju, ter podrobneje predstavil nekatere osnovne lastnosti metabolizma rakastih celic ter njene regulacije. Mutacije onkogenov in tumor supresorskih genov povzročijo spremembe v signalizacijskih poteh, katere povzročijo spremembe metabolizma rakastega tkiva. Metabolizem deluje v prid celični rasti, intenzivni celični delitvi, zaviranju apoptoze itd. Sam metabolizem rakastih celicah temelji na treh osnovnih temeljih: povečani produkciji energije, zadostni biosintezi potrebnih makromolekul in vzdrževanju redoks stanja. Da izpolnjujejo vse tri pogoje se rakaste celice poslužujejo mnogih regulacij metabolizma, z različnimi strateškimi potmi, npr. proteoliza skeletnih mišic, lipoliza maščobnega tkiva, intratumorna simbioza med laktat-proizvajajočimi in laktat-porabnimi celicami, upočasnevanje glikolize in usmerjanje intermediatov v pentoza fosfatno pot itd. Ker pa je mikrookolje, ki obkroža rakasto tkivo zelo dinamično, je za rakaste celice značilna metabolična fleksibilnost. Raziskave in razumevanje metabolične fleksibilnosti bi doprinesle k novim možnim strategijam zdravljenja. Učinek na reguliran metabolizem rakastega tkiva, bi imel ogromen vpliv na viabilnost rakastega tkiva, saj je metabolizem sklopljen s številnimi lastnostmi rakastih celic.<br /> <br /> ===Ajda Rojc: Metabolizem skeletnih mišic===<br /> <br /> Mišice so največji porabnik energije v telesu, saj nam omogočajo vrsto različnih dejavnosti pri katerih se porablja energija. V našem telesu potekata dva različna sistema metabolizma – anaerobni in aerobni. Pri anaerobnem metabolizmu imata pomembno vlogo kreatin fosfat in glikogen. Zaloge ATP je v mišicah zelo malo, zato takoj nastopi cepitev visokoenergetskih vezi v kreatin fosfatu. Po porabi te energije se v glikolizi razgradi glikogen, ki se pri pomanjkanju kisika v mišicah namesto v piruvat, pretvori v laktat in to povzroča bolečine v mišicah. Druga vrsta metabolizma pa deluje kadar je kisika dovolj in to je aerobni metabolizem. Poleg glukoze se pri tej vrsti presnove razgrajujejo tudi maščobne kisline, ki se v β-oksidaciji reducirajo do vodika in acetil-CoA, ta pa vstopi v Krebsov cikel, kjer se proizvede energija ATP. Večja razpoložljivost maščobnih kislin vpliva na nalaganje znotrajmišičnega prostega Pi in AMP med vadbo. Pi in AMP sta odgovorna za regulacijo encima glikogen fosforilaze, ki cepi glikogen. Torej, če se njune koncentracije znižajo pride do manjšega števila cepitev glikogena na glukozo. Pri znatnem povišanju dostopnosti maščobnih kislin je glikogen fosforilaza inhibirana. To je le eden od načinov regulacije substratov v mišičnem metabolizmu. Domnevajo, da je oksidacija maščob regulirana s podobnimi faktorji (npr. adrenalin, Ca2+, ADP, AMP, Pi; AMPK, pH, acetil-CoA) kot razgradnja ogljikovih hidratov, vendar je glede tega, kako te faktorji vplivajo na regulacijo maščobnih kislin in oksidacijo maščob ter kaj je njihova vloga še veliko nejasnosti.<br /> <br /> ===Janez Meden: NADH-fumarat reduktaza - primerna tarča za zdravljenje s kemoterapijo===<br /> <br /> Celično dihanje je sestavljeno iz glikolize, citratnega ciklusa in verige za prenos elektronov. Večina energije nastane, v obliki ATP pri zadnji stopnji celičnega dihanja, torej pri prenosu elektronov skozi komplekse I, II, III, IV in nastanku ATP-ja v kompleksu V – ATP-sintazi. Zadnja stopnja pa je mogoča le v prisotnosti O2.<br /> Pa vendar življenje obstaja tudi v hipoksičnem okolju. Posebna oblika energijskega metabolizma, ki je značilno za nekatere bakterije, notranje zajedavce in školjke ter celo rakave celice je fumaratsko dihanje. Ta način metabolizma omogoča nekoliko boljši izkoristek energije. Pri njem sodelujeta le dva kompleksa I in II. Kompleks II je povezan s citratnim ciklusom – TCA in verigo za prenos elektronov. Prenašalec med kompleksoma je kvinon z nizkim redoks potencialom, kot je npr. rodokvinon pri A. suum, ali pa menakvinon, znan kot vitamin K.<br /> Z razumevanjem mehanizma fumaratskega dihanja bi lahko razvili zdravila, ki bi inhibirala ali celo onemogočila delovanje tega mehanizma. Primerna tarča novih zdravil bi lahko bila Fp podenota kompleksa II ali pa bi zdravilo lahko delovalo tudi kot kompetitivni inhibitor kvinona.<br /> <br /> ===Ana Kunšek: Večfunkcionalnost akonitaze===<br /> <br /> Akonitaza je protein, ki katalizira drugo stopnjo Krebsovega cikla, torej pretvorbo citrata v izocitrat. Vendar je tudi eden izmed &quot;moonlighting&quot; proteinov, torej proteinov, ki imajo poleg glavne tudi druge funkcije. Prav zato, ker ima toliko funkcij je njena vloga v celici še toliko bolj pomembna, nepravilno delovanje pa lahko pripelje tudi do pojava diabetesa in miopatije. <br /> <br /> Akonitaza poleg kataliziranja omenjene pretvorbe citrata v izocitrat pomaga tudi pri uravnavanju koncentracije železa v celici, stabilizaciji oz. destabilizaciji mitohondrijske DNA ter pri odgovoru na oksidativni stres. Pri uravnavanju koncentracije železa se veže na mRNA in s tem zaustavi sintezo feritina (proteina, ki veže železo) ter s tem pomaga pri uravnavanju homeostaze. Mitohondrijsko DNA destabilizira, kar ji pomaga za lažje podvojevanje, pri oksidativnem stresu pa je ključni faktor pri uravnavanju pravilnega pH-ja v celici, brez katerega encimi ne morejo pravilni delovati.<br /> <br /> Že samo s temi funkcijami smo ugotovili, da je akonitaza zelo pomembna v našem življenju, vendar verjetno še vedno ne poznamo vseh njenih funkcij, saj je odkrivanje &quot;moonlighting&quot; proteinov in njihovih ostalih funkcij zelo težko in zahteva veliko eksperimentalnega dela. Vendar bi lahko z vedenjem vseh funkcij proteinov iznašli tudi takšna zdravila, ki stranskih učinkov ne bi imela, saj bi zablokirala ali pospešila sintezo le tistega proteina, za katerega je to potrebno in ne bi s tem vplivala tudi na ostale funkcije proteina v organizmu.<br /> <br /> ===Tomaž Rozmarič: Warburg in Crabtree efekt===<br /> <br /> Znanstveniki so ugotovili, da rakave celice, kljub prisotnosti kisika, ne izvajajo aerobnih procesov. Namesto tega so se usmerile v glikolizo. Temu se reče Warburg efekt. Kaj so rakave celice s tem pridobile, še ni čisto raziskano. Obstajajo pa hipoteze, da so zaradi tega veliko bolj invazivne, se sposobne deliti pri nizkih koncentracijah kisika in se izogniti apoptozi. Warburgov efekt je reguliran na večih stopnjah metabolne poti, s prekomerno izraženimi in prekomerno aktivnimi encimi, ki vzpodbujajo glikolizo ter inhibicijo proteinov, ki spodbujajo aerobni metabolizem.<br /> Zraven Warburgovega efekta poznamo še Crabtree efekt. Ta mehanizem rakavi celici omogoča preklop na aerobni metabolizem pri pomanjkanju glukoze in obratno pri velikih koncentracijah. Brez poznavanja obeh mehanizmov in prekinitvi obeh hkrati je uspešnost zdravljenja raka zelo majhna. <br /> Znanstveniki so našli vrsto kvasovke, ki ima skoraj identični metabolizem, kot ga ima rakava in je Crabtree pozitivna. Pri nizkih koncentracijah glukoze izvaja anaerobni metabolizem, v prisotnosti visoke koncentracije pa aerobni. Zaradi navedenih lastnosti je idealna za študijo rakavih celic.<br /> Ko bodo znanstveniki natančno proučili Warburg in Crabtree efekt, se bodo lahko razvila tarčna zdravila, katera bi bistveno izboljšala kakovost našega življenja.<br /> <br /> <br /> ===Erik Mršnik: Adrenolevkodistrofija===<br /> <br /> X-vezana adrenolevkodistrofija je precej redka bolezen, ki pa ima zelo hude posledice. Te v večini primerov vodijo v zgodnjo smrt. Z razumevanjem biokemijskega in genetskega ozadja te bolezni so v zadnjih letih naredili velik korak naprej v odkrivanju in preprečevanju te bolezni. <br /> V osnovi gre za napako (mutacije so v večini primerov dedne - 90 %) na genu ABCD1, kar se odraža na ALDP (adrenolevkodistrofični protein), ki je peroksisomalni transportni protein. Če ne deluje, je otežena oziroma onemogočena β-oksidacija VLCFAs (dolgih maščobnih kislin), ki se nabirajo v tkivih in povzročajo velike težave v delovanju možganov in živčevja ter nadledvične žleze. Bolezen se odraža v različnih fenotipih, ki prizadenejo predvsem moške (otroke in moške srednjih let), ženske so navadno le prenašalke, lahko pa se tudi pri njih izrazijo blažji simptomi. Če se bolezen odkrije že v zgodnji fazi, je možnost pomoči večja. Predvsem uspešna je presaditev krvotvronih matičnih celic. Velikokrat pregledajo že dojenčke (t.i. newborn screening), za katere vejo (zaradi dednosti), da so podvrženi tej bolezni, kar bistveno pripomore k pravilnemu pristopu pri izbiri terapije.<br /> <br /> ===Katja Leben: Tia-maščobne kisline===<br /> <br /> Tia-maščobne kisline so umetno sintetizirane nasičene maščobne kisline, ki se od ostalih razlikujejo po vsebnosti heterogenega žveplovega atoma. Zaradi posebnega metabolizma – žveplov atom preprečuje za maščobe običajno β-oksidacijo – in zadostnih podobnosti z naravnimi maščobnimi kislinami so nekatere tia-maščobne kisline široko farmakološko uporabne, saj imajo veliko različnih aplikativnih vplivov na bio sisteme.<br /> <br /> Katabolizem tia-maščobnih kislin do β-oksidacije poteka običajno, ko pa se žveplov atom približa aktivnemu mestu se proces ustavi. Pri 4-tiamaščobnih kislinah pride do inhibicije drugega encima v obratu β-oksidacije, kar negativno vpliva na metabolizem maščobnih kislin, med tem, ko 3-tia-maščobne kisline sploh ne morejo vstopiti v β-oksidacijo in se razgradijo po ω-oksidativni poti. Vse sode nasičene tia-maščobne kisline se po nekaj obratih β pretvorijo v 4-tia-maščobne kisline, zato tudi reagirajo enako, vse lihe nasičene tia-maščobne kisline pa se z β-oksidacijo lahko pretvorijo v 3-tia-maščobne kisline in nato reagirajo enako.<br /> Zaradi posebnega metabolizma so tia-maščobne kisline uporabili tudi za proučevanje delovanja in regulacijie različnih celičnih procesov povezanih z metabolizmom lipidov. Njihov vpliv je močno odvisen od lege žveplovega atoma v ogljikovem skeletu. Tako 4-tia-maščobne kisline zavirajo oksidacijo maščobnih kislin, 3-tia-maščobne kisline pa jo pospešujejo, kar je zaželjeno pri regulaciji bolezenskih stanj, ko je v celici povečana količina maščobnih kislin.<br /> <br /> Biološki odzivi na tia-maščobne kisline obsegajo vpliv na transkripcijski faktor PPARα (peroksisom proliferator aktiviran receptor), mitohondrijsko proliferacijo, antiadipoznost, antioksidativne lastnosti, zmanjšanje proliferacije hitro delečih se celic in celično diferenciacijo. Zadnje raziskave kažejo, da tia-maščobne kisline niso škodljive za naš organizem tudi ob dolgotrajnem uživanju in bi se torej lahko uporabljale kot zdravila.<br /> <br /> ===Ana Cirnski: Peroksisomalna razgradnja maščobnih kislin===<br /> <br /> Maščobne kisline se razgrajujejo do enostavnejših snovi v procesu, imenovanem β-oksidacija. Ta poteka v mitohondriju, pa tudi v peroksisomu. Peroksisomalna in mitohondrijska β-oksidacija se poleg kraja, kjer poteka razgradnja, razlikujeta še v encimih, ki reakcije katalizirajo in v substratih, ki se oksidirajo.<br /> <br /> Rastline razgrajujejo tudi take maščobne kisline, ki jih živali in ljudje ne moremo. Za razliko od nas, lahko maščobne kisline popolnoma razgradijo (saj so peroksisomi edino mesto razgradnje), mi pa v peroksisomih razgrajujemo le zelo dolge maščobne kisline do ustreznih intermediatov, ki se dokončno razgradijo v mitohondriju.<br /> <br /> Oksidacija nenasičenih maščobnih kislin v višje razvitih rastlinah je pomembna za proizvodnjo mnogih spojin, med njimi so bioaktivne molekule, imenovane oksilipini. Mednje spadajo tudi jasmonska kislina in njeni derivati, ki so pomembne signalne molekule in sodelujejo pri obrambi, komunikaciji, signalizaciji in odgovoru na različne biotske in abiotske stresorje. Povzročajo tudi staranje rastline in odpadanje listov.<br /> <br /> Jasmonska kislina se sintetizira v oktadekanojski poti iz α-linolenske kisline (18:3). Pretvorba se začne v kloroplastu, kjer se pretvori v 12-okso-fitodienojsko kislino (OPDA). Ta potuje v peroksisom, kjer nastane oksofitoenojska kislina (OPC:8), ki vstopi v β-oksidacijo in se oksidira v jasmonsko kislino.<br /> <br /> Danes se jasmonska kislina in njeni derivati že uporabljajo v aplikativni znanosti.<br /> <br /> ===Zala Gluhić : Hiperamoniemija===<br /> <br /> Hiperamoniemija je povišana koncentracija v krvi raztopljenega amoniaka. Lahko je posledica motene presnove v ciklu sečnine (na primer zaradi nepravilnega delovanja katerega izmed encimov) – ali pa gre za pridobljeno motnjo zaradi jetrnih bolezni (npr. jetrna odpoved). <br /> Amoniak je še posebno škodljiv za možgane. V krvi raztopljen amoniak prestopa možgansko-žilno pregrado in kadar je njegova koncentracija previsoka, lahko pride do nepopravljive škode pri razvoju centralnega živčnega sistema ali do možganskega edema. Ker v možganih ni vseh za cikel sečnine potrebnih encimov, imajo glavo nalogo pri odstranjevanju odvečnega amoniaka astrociti, vrsta nevroglijskih celic. Koncentracije uravnavajo s pomočjo sinteze glutamina. V primeru hiperamoniemije pride v njih do številnih morfoloških sprememb in sprememb v izražanju različnih proteinov (npr. spremembe v aktivnosti prenašalcev EAAT1 in 2, izražanju GFAP proteinov itd.). Prekomerno sintezo glutamina je mogoče uravnavati z MSO (metionin sulfoksimidom).<br /> <br /> ===Bojana Lazović : Novi farmakološki šaperoni za zdravljenje fenilketonurije===<br /> <br /> Fenilketonurija (PKU) je redka avtosomno recesivna genska bolezen do katere pride, če je okvarjen jetrni encim fenilalanin-4-hidroksilaza (PAH), ki je odgovoren za pretvorbo fenilalanina v tirozin. Ker tako ne more prihajati do razgradnje fenilalanina, se le ta akumulira v telesu in spremeni v fenilpiruvat. To ima toksičen učinek na telo, posebej možgane, saj se pri teh bolnikih lahko razvije težka umska zaostalost. Bolniki se lahko temu izognejo tako, da se že od rojstva držijo stroge diete, po kateri se lahko prehranjujejo le z nebeljakovinsko hrano (sadje in zelenjava). Ostale esencialne aminokisline dobijo v obliki praška, ki vsebuje vse AK razen fenilalanina. Toda raziskave kažejo, da taka dieta pogosto vodi v podhranjenost in psihološke težave bolnikov. Pred nekaj leti je na tržišče prišlo zdravilo Kuvan oz. sintetični naravni kofaktor encima PAH, katerega pomanjkanje je lahko razlog bolezni. Njegova draga sinteza in pri določenih genotipih PKU, slaba učinkovitost, pa je znanstvenike spodbudila k iskanju novih sintetičnih kofaktorjev encima PAH, ki hkrati delujejo kot farmakološki šaperoni. V raziskavi, ki jo opisujem so odkrili dva nova farmakološka šaperona primerna za zdravljenje PKU.<br /> <br /> ===Matic Kovačič : Sirtuin 3 ob dieti spodbuja cikel sečnine in oksidacijo maščobnih kislin ===<br /> Pri dieti ali stradanju pridobimo s hrano veliko manj ali nič energije, zato mora telo dobiti iz svojih zalo, kar naredi z metabolizmom aminokislin in maščobnih kislin. Pri oksidaciji aminokislin dobimo amoniak, ki se mora zaradi svoje toksičnosti v ciklu sečnine pretvoriti v sečnino. V seminarski nalogi bom predstavil vpliv proteina Sirtuin 3 (Sirt3) na povečano delovanje cikla sečnine in metabolizma maščobnih kislin. Sirt3 je encim deacetilaza, ki se nahaja v mitohondriju in s svojim delovanjem vpliva na veliko mitohondrijskih encimov. Mutacije ali odsotnost tega proteina ima za organizem smrtne posledice, zaradi nepravilnega delovanja cikla sečnine in tudi drugih procesov. Povedal bom še nekaj o napaki cikla sečnine, ki jo povzroči pomanjkanje encima ornitin transkarbamoilaze in kakšne posledice ima lahko to na organizem.<br /> <br /> ===Špela Tomaž: Inhibicija fotosinteze===<br /> Čeprav je svetloba bistvena za reakcije fotosinteze, ima nanje tudi uničujoče učinke. Predvsem sta inhibiciji fotosinteze izpostavljena fotosistema II in I, pri katerih lahko intenzivne osvetlitve povzročijo strukturne in funkcijske okvare. Ena izmed aktualnih hipotez o mehanizmu fotoinhibicije fotosistema II (PSII) predvideva dvostopenjski sistem. V prvem koraku je udeležen kompleks, ki v fotosintezi cepi vodo (OEC) – z absorpcijo svetlobe nizkih valovnih dolžin pride do njegovih poškodb, ki omogočijo drugi korak inhibicije. V tem delu se inhibira reakcijski center fotosistema, na kar vpliva svetloba daljših valovnih dolžin. Posledično se tvorijo škodljive reaktivne kisikove spojine (ROS). Proces svetlobnega delovanja sproži popravljalne mehanizme poškodovanih struktur. Fotoinhibicija PSII je pogosta, saj so fototrofi čez dan razmeroma konstantno osvetljeni. Popravljalni cikel PSII je tako pogosto aktiviran in skrbi za to, da ne pride do ustavitve fotosinteze. ROS zavirajo obnovitev aparatov in so na nek način glavni krivci okvar zaradi fotoinhibicije. Sodelujejo tudi v inhibiciji fotosistema I (PSI), ki pa je dosti redkejša in je pogojena s posebnimi razmerami. Njegova regeneracija ni najbolj učinkovita, zato je njegova okvara toliko bolj usodna. Seveda pa so fototrofi razvili mnoge mehanizme različnih oblik, ki fotosisteme ščitijo. Fotoinhibicija je regulirana tudi z mnogimi zunanjimi in notranjimi vplivi na organizem.<br /> <br /> ===Monika Biasizzo: Mitohondrijski razklopni proteini===<br /> Oksidativna fosforilacija je sklopljen proces prenosa protonov skozi notranjo mitohondrijsko membrano (ob prenosu elektronov po dihalni verigi) in sintezo ATP. Mitohondrijski razklopni protein pa ta proces razklopijo s prenosom protonov nazaj v mitohondrijski matriks in s tem znižajo protonski gradient. Poznamo več različnih razklopnih proteinov (UCP), ki so si med seboj bolj ali manj podobni. Prvi odkriti je bil UCP1 – termogenin, ki ima pomembno vlogo v termogenezi in s tem pri vzdrževanju stalne telesne temperature pri sesalcih. UCP2 in UCP3 sta 60-70% homologna UCP1, vendar v celici ne opravljata funkcije termogeneze.<br /> <br /> Mehanizem prenosa protonov skozi notranjo mitohondrijsko membrano s pomočjo UCP še ni pojasnjen, vendar obstajajo trije predlagani modeli: flip-flop model, model s kofaktorjem in kompetetivni model.<br /> <br /> UCP2 ima pomembno vlogo pri zmanjševanju nastanka reaktivnih kisikovih spojin (ROS). Nastanek ROS je eksponentno odvisen od protonskega gradienta. UCP2 z blago razklopitvijo nekoliko zmanjša protonski gradient, tako da sinteza ATP še vedno nemoteno poteka in s tem tudi zmanjša nastanek ROS. UCP3 je pristonem predvsem v skeletnih mišicah, kjer ima prav tako kot UCP2 pomembno vlogo pri zmanjševanju nastanka ROS, še posebej med športno aktivnostjo.<br /> <br /> Regulacija UCP poteka na več različnih nivojih. Aktivnost UCP je regulirana z manjšimi molekulami, kot no di- in trinukleotidi (npr. GDP), ki inhibirajo UCP in maščobnimi kislinami, ki UCP aktivirajo. Regulacija pa poteka tudi na nivoju razgradnje, za katero predvidevajo, da poteka s citosolnim proteosomom, vendar mehanizem še ni pojasnjen.<br /> <br /> ===Nastja Pirman: Mitohondrij, center celične apoptoze===<br /> Mitohondrij je organel vrvohodec, ki izvaja tako življenske kot smrtne funkcije. Njegova najpomembnejša lastnost je membranska prepustnost, ki odloča, ali se bodo procesi pričeli izvajati v korist ali škodo celice. Na mitohondrijevo odločitev vplivajo inter- in intracelularni faktorji in kot njihova podmnožica tudi stresi.<br /> Ko stres preseže mejo, se sproži eden od treh tipov programirane smrti: apoptoza, avtofagija (ki ne vodi nujno do smrti) in nekroza. Osredotočimo se na človeško apoptozo, kjer družina Bcl-2 proteinov z značilnim BH zaporedjem prejema z apoptozo povezane signale. Deli se na antiapoptotske in proapoptoske proteine, ki z medsebojno kombinacijo in z multimerizacijo posredujejo sporočilo mitohondrijskim ionskim kanalom.<br /> Če signal narekuje apoptozo, se bosta z apoptozo povezana kanala MAC in mPTP široko odprla, spustila Cyt c v citosol in depolarizirala membrano. Koncentracija kalcija sodeluje s procesom. V tem kjučnem koraku se porušita membranski potencial in metabolizem.<br /> Kaspaze-9 v kompleksu z Apaf1 in izpuščenim Cyt c (apoptosom) tačas v citosolu začnejo s kaskadno proteolitsko aktivacijo citosolnih proteinov. <br /> Apoptotski mehanizem ni popoln. Napake povzročijo raka ali bolezenska stanja, ki jih ne bomo mogli zavreti z učinkovinami, dokler ne poznamo vseh povezav med deli mehanizma.<br /> <br /> ===Barbara Dušak: Sinteza bakterijske celične stene ===<br /> Bakterijske celična stena je sestavljene iz peptidoglkianskih verig, ki se med seboj povezujejo s kratkimi peptidi. Peptidoglikan je veriga N-acetilglukozamina in N-acetilmuramične kisline, povezanih z β(1,4)-glikozidno vezjo, N-acetilmuraminska kislina pa ima vezan še peptid. <br /> <br /> Sinteza stene je kompleksen proces, ki poteka v treh delih. Najprej se v citosolu sintetizirajo osnovne komponente stene, reakcije katalizirajoi encimi družine Mur. Nato pride do vezave komponent na undekaprenil fosfat in transporta preko membrane, na koncu pa še do sinteze peptidoglikana in vgradnje v že obstoječo celično stene. Verige nastajajo v procesu transglikozilacije, peptidne povezave pa v procesu transpeptidacije. Ta dva procesa katalizirajo encimi družine PBP (penicillin binding proteins), ki se delijo v več razredov glede na katiltično aktivnost in velikost. <br /> Za vgradnjo nove verige v celično steno, se morajo nekatere vezi tudi razcepiti, za kar so potrebne še dodatne hidrolaze, rast celične stene pa poleg vseh teh encimov uravnava tudi citoskelet, ki določa obliko celice. Obstaja tudi več teorij, kako naj bi vgradnja potekala, temlejiijo pa na tem, da se trdnost stene med samim procesom ne sme zmanjšati.<br /> <br /> ===Matej Vrhovnik: Biosinteza škroba, saharoza kot substrat za sintezo zelo razvejanih komponent škroba ===<br /> Škrob je rastlinski rezervni polisaharid, za živa bitja pa eden izmed glavnih virov ogljikovih hidratov v hrani, hkrati pa je zelo lahko razgradljiv. Nahaja se v kloroplastih, kjer se skladišči le za kratek čas, da poteši energijske potrebe rastline, ko fotosinteza ne poteka, ali v amiloplastih za daljše obdobje. Zgrajen je iz glukoz, ki se povezujejo z α(1-4)glikozidno vezjov amilozo in iz amilopketina α(1-6) vezi med razvejitvami. Nastane iz odvečnih energijsko bogatih molekul, ki se ustvarijo pri fotosintezi. Na ta način rastlina shrani energijo oziroma energijsko bogate molekule za prihodnje generacije. Škrob sintetizira škrobosintaza, ki lahko nalaga glukoze na nereducirajoči konec verige, lahko pa tudi na reducirajoči, polisahardi pa nastaja tako, da se na dekstrin, oziroma verigo glukoz pripenjajo nove ADP-glukoze. Sinteza je uravnavana z ADP-glukoza pirofosforilazo. Od vsake vrste rastlin posebi je odvisno kakšen škrob nastaja v njej, zelo se razlikujejo v razmerju amiloza:amilopektin, % razvejanosti in dolžini stranskih verig. V raziskavi so odkrili, da je vir glukoze za škrob lahko tudi saharoza. Ta kot substrat vpliva na obliko molekul škroba: molekule amilopektina so veliko bolj razvejane, pri razpadu škroba ob prisotnosti encima α-amilaze pa ostajajo zelo dolgi skupki α-omejeni dekstrini, ki se ne morejo razgraditi. <br /> Molekule škroba se ob prisotnosti pravih encimov in proteinov začnejo zvijat v dvojne helikse, ti pa so sestavljeni skupaj v urejene enote, ki sestavljajo škrobno zrno.<br /> <br /> ===Jakob Gašper Lavrenčič: Sinteza rastlinske celične stene===<br /> Rastlinaska celična stena je najpogostejši biomaterial na svetu, gradijo jo predvsem polisaharidi, izmed katerih prevladuje predvsem celuloza. Sinteza strukturnih polisaharidov poteka z vezavo sladkornih enot na nastajajočo verigo z α(1-4) glikozidno vezjo, s pomočjo večjih encimskih kompleksov. V zadnjih letih je prišlo do večjih prebojev v razumevanju delovanja teh encimov in načina odlaganja nastajajočih polisaharidov na celično plazmalemo. <br /> Celuloza je linearni polisaharid, ki predstavlja osnovno ogrodje rastlinskih celičnih sten. Celulozne verige so med seboj povezane z hemicelulozo in pektinom, kar povečuje trdnost in odpornost celične stene. Celulozne verige se med seboj povezujejo v mikrofibrile, s tem povečajo svojo trdnost. Sinteza celuloze poteka z pomočjo membranskega encimskega kompleksa znanega kot rozetni terminalni kompleks (RTC), ki se nahaja na celični plazmalemi. Čeprav je bil odkrit v 70-ih letih prejšnjega stoletja so do večjih prebojev v razumevanju njegove strukture in delovanja prišli komaj v zadnjem desetletju. Kljub temu ostajaj še veliko neznanega o poteku sinteze celuloze in njenemu vgrajevanju v celično steno.<br /> Za razliko od celuloze so pektini in hemiceluloze zelo razvejane molekule, katerih sinteza poteka v Golgijevem aparatu. Njihova naloga je, da zamrežijo celulozne mikrofibrile med seboj in z drugimi komponentami celične stene, kot so lignini. Njihova sinteza še ni povsem znana, zato je predmet različnih raziskav.<br /> <br /> ===Mirjana Malnar: Vloga PPAR in leptina v metabolizmu lipidov===<br /> Metabolizem lipidov je lahko reguliran na ravni izražanja genov. Pri tem so pomembni receptorji, aktivirani s proliferatorjem peroksisomov (PPAR). To so od liganda odvisni transkripcijski faktorji, ki glede na vnos hrane/energije regulirajo izražanje genov, ki kodirajo encime odgovorne za metabolizem vnesenih energetskih molekul. Primeri so PPARα, ki stimulira katabolizem lipidov in PPAR, ki stimulira sintezo lipidov ter adipogenezo. Glede na količino nastalega maščobnega tkiva, to izloča hormone, torej deluje kot endokrini organ. Ti hormoni se imenujejo adipokini. Primer je leptin, ki vpliva na center za apetit v hipotalamusu. S tem regulira vnos hrane v organizem. Pomemben je tudi pri preprečevanju debelosti, ker zmanjša učinkovitost signala inzulina na maščobno tkivo in na ta način prepreči lipogenezo po obroku. Leptin posredno pospeši oksidacijo maščobnih kislin in nastanek ketonskih telesc, zavre pa lipogenezo, sintezo TG in holesterola. Poleg tega leptin stimulira delovanje PPARα in PPAR, ti pa povečajo sintezo vezavnih proteinov maščobnih kislin (FABP). Ti proteini prenašajo maščobne kisline do raznih organelov, odvisno od namena – v mitohondrije, kjer se oksidirajo, do ER, kjer poteka reesterifikacija, do lipidnih kapljic, ki služijo shranjevanju. <br /> Če pride do okvare v mehanizmu delovanja PPAR ali leptina so lahko posledice različne bolezni. Primeri takih bolezni so metabolni sindrom, dislipidemija, inzulinska rezistenca, debelost, diabetes. PPAR so vse bolj aktualne tarče za zdravljenje teh bolezni.<br /> <br /> <br /> ===Samo Zakotnik:Sinteza polinenasičenih maščobnih kislin in njihova vloga===<br /> V svojem seminarju bom govoril o sintezi n vlogi PUFA - polyunsaturated fatty acid. Gre za biološko zelo pomembno skupino maščobnih kislin. PUFA so ključne za pravilno delovanje celičnih membran, so pomembni prekurzorji za signalne molekule, kot so fosfotidilinositol 4,5-bisfosfat (PIP2), jasmonska kislina in steroidni hormoni. Za človeka sta α-linolenska kislina in linolna kislina esencialni kislini, saj ju ne more sintetizirati sam. Glavni vir PUFA so morski sadeži, ki pa zaradi onesnaževanja in prekomernega izlova izginjajo. Posledično številne raziskovalne skupine iščejo alternativni vir sinteze PUFA. Kot primeren kandidat so se izkazale kvasovke Saccharomyces cerevisiae, na primeru katerih bom predstavil verigo za sintezo PUFA. Na modelu rastline Arabidopsis thaliana pa bom prikazal vlogo PUFA v rastlini in posledice, kaj se zgodi, če prekinemo sintezo PUFA na različnih točkah. PUFA pa so pomembne tudi za embrionalni razvoj in za razvoj centralnega živčevja, zato jih dodajajo prehrani namenjeni dojenčkom (mleko v prahu).<br /> <br /> <br /> ===Ellen Malovrh: Hem, železo in staranje===<br /> Hem je kompleksna organska molekula, sestavljena iz protoporfirinskega obroča (heterocikličen sistem iz 4 pirolovih obročev) in koordinacijsko vezanega železovega iona. Biosinteza hema poteka v mitohondrijih in citosolu celic, v osmih encimsko kataliziranih reakcijah. Zadnjo reakcijo katalizira metaloencim ferokelataza, ki v protoporfirinski obroč vgradi Fe2+ ion. <br /> <br /> Kot proteinska prostetična skupina hem sodeluje pri številnih procesih, npr. pri prenašanju kisika in CO2, redoks reakcijah v elektronski prenašalni verigi in regulaciji celičnega metabolizma. Novo področje raziskav pa nakazuje, da je pomanjkanje hema tesno povezano tudi s procesom staranja in nevrodegenerativnimi boleznimi. Inhibicija sinteze hema v celicah povzroči zmanjšano prisotnost kompleksa IV v elektronski prenašalni verigi in posledično motnje v delovanju mitohondrijev, oksidativen stres, motnje v homeostazi železa in propadanje celic. Vse to so tudi karakteristične lastnosti staranja in Alzheimerjeve bolezni. Prihodnje raziskave na tem področju, ki bi utemeljile potek reakcij in metabolnih poti, v katerih sodelujeta hem in železo, bi morda lahko omogočile razvoj novih načinov zdravljenja pomanjkanja železa in starostnih bolezni.<br /> <br /> <br /> ===Suzana Semič: Lesch-Nyhanov sindrom===<br /> Lesch-Nyhanov sindrom ali s kratico LNS je redka dedna motnja presnove purina, ki se deduje X-vezano recesivno in se pojavlja pri enem od 380.000 osebkov moškega spola. Bolezen sta prvič prepoznala in klinično dokazala študent medicine Michael Lesch in mentor, pediater Bill Nyhan. Svoje ugotovitve sta objavila v letu 1964. <br /> Bolezen se pojavi zaradi napake v presnovi purinskih baz v reciklažni poti, povzroča pa jo pomanjkanje encima hipoksantin-gvanin-fosforibozil transferaza(GPRT). Zaradi pomanjkanja tega encima se purinski bazi gvanin in hipoksantin pretvarjata v sečno kislino, kar pa privede do hiperurikemije (zvečana koncentracija sečne kisline v krvi), uričnega artitisa, ledvičnih kamnov in odpovedi ledvic. Vse te motnje pa spremljajo še nevrološki problemi, tj. mentalna zaostalost, abnormalni gibi telesa in nagnjenost k samopoškodbam. Vzroki za kopičenje sečne kisline so dobro znani in jih je mogoče zdraviti z zdravili, kot je alopurinol. Razlogi za nevrološke motnje pa so bolj zapleteni. Študije le teh so pokazale, da gre pri LNS za zmanjšano raven dopamina v bazalnih ganglijih, vendar bo potrebno še kar nekaj raziskav o tem, kako vpliva GPRT na dopaminski sistem in zakaj se pojavijo motnje, kot so težnja k samopoškodovanju in mentalna zaostalost.<br /> <br /> <br /> ===Sara Lorbek: Glutaminska odvisnost rakavih celic===<br /> Glutamin je pogojno esencialna aminokislina, ki je za obstoj rakavih celic ključnega pomena. Ima pomembno vlogo v sintezi nukleotidov, neesencialnih aminokislin in sodeluje pri vstopu esencialnih aminokislin v celico. Poleg tega je od prisotnosti glutamina odvisna sinteza glutationa- pomembnega antioksidanta. V rakavi celici je glutamin pomemben vir energije in prekurzorjev za biosintezo celici lastnih molekul, brez katerih se ne bi mogla deliti, bi oslabela in prej ali slej propadla. Mitohondrijski encim, glutaminaza, je v rakavih celicah eden izmed najpomembnejših, zato je tudi njegova aktivnost v primerjavi z zdravimi celicami povečana. Glutaminaza katalizira reakcijo pretvorbe glutamina v glutamat. To je prva stopnja, ki je potrebna za vse nadaljne reakcije pridobivanja energije in nastanka intermediatov, ki so uporabni v različnih biokemijskih sintezah. Rakava celica mora metabolizem prilagoditi svojim potrebam po energiji in sintezi proteinov, nukleotidov,... skratka vseh biomolekul, ki jih potrebuje za preživetje in pospešeno delitev. Na prilagoditev metabolnih poti glutamina pomembno vplivajo: HIF-1, mTORC in onkogen c-Myc. Zanje je značilno, da so v rakavih celicah prisotni v višji koncentraciji oz. v aktivnejši obliki kot v zdravih celicah, njihovo delovanje sem podrobneje opisala v seminarski nalogi. Odkar so raziskovalci bolje spoznali vpliv glutamina na rast in razvoj rakavih celic, so zasnovali tudi nekaj učinkovitih terapij. Le-te temeljijo na različnih metabolnih poteh glutamina in so se izkazale za precej učinkovite v boju proti raku, kar še dodatno potrjuje nenadomestljivost glutamina v tumorskih celicah. Pomembnejše molekule, ki zavirajo rast in proliferacijo s svojim vplivom na presnovo glutamina, in njihove tarče, sem prav tako vključila v svojo seminarsko nalogo, ki vas bo prepričala, da je glutamin na mnogih področjih ena izmed najpomembnejših molekul za rakavo celico.<br /> <br /> <br /> ===Ana Grom: Sinteza, mehanizem delovanja in vloga glukokortikoidov v metabolizmu===<br /> Glukokortikoidi so vrsta steroidnih hormonov, ki se v telesu začnejo sproščati kot odziv na stresno situacijo iz okolice. Njihov najvidnejši predstavnik je kortizol. Glukokortikoide sprošča skorja nadledvične žleze, ki pa je predhodno stimulirana preko HPA poti (hipotalamus, hipofiza, nadledvična žleza) in hormonov, ki jih posamezen element poti sprošča. Molekula, iz katere nastanejo vsi steroidni hormoni, pa je holesterol. Sintetizirani glukokortikoidi (kortizol) nato delujejo z negativno povratno zanko na delovanje HPA poti. Inhibirajo tako izločanje hormona iz hipotalamusa kot tudi hormona, ki se izloča iz hipofize. Velik pomen pa imajo glukokortikoidi na metabolizem nekaterih molekul. Vezani na svoje receptorje namreč vstopajo v jedra celic, kjer se vežejo na tarčne gene znotraj molekule DNA. Glukokortikoidi tako lahko vplivajo na transkripcijo teh genov. Eden takih genov je gen za PEPCK (fosfoenolpiruvat karboksi kinazo), ki je eden ključnih encimov v glukoneogenezi, sintezi glukoze de novo. Povišana koncentracija glukokortikoidov stimulira transkripcijo PEPCK, kar se odraža v povišani koncentraciji encima PEPCK in stimuliranju glukoneogeneze. Raven glukokortikoidov pa je možno uravnavati. Encim, ki je najbolj pod drobnogledom znanstvenikov v zadnjem obdobju, je tako 11β-hidroksisteroid dehidrogenaza tipa 1. Predstavlja obetavno tarčo za zdravljenje posledic nepravilnega delovanja glukokortikoidov, saj je encim, ki pretvarja neaktivno obliko kortizona v aktivno obliko kortizola.</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO2_Seminar_2012&diff=7624 2013-01-04T17:40:13Z

<p>AnaGrom: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>== Novice za študente ==<br /> [https://www.google.com/calendar/embed?src=94r835uhlqu6sornlvmnldb5d0%40group.calendar.google.com&amp;ctz=Europe/Belgrade &lt;font color=red&gt;Razpored izpitnih rokov in kolokvijev ter nekaterih kolokvijev iz vaj&lt;/font&gt;]<br /> <br /> = Biokemijski seminar =<br /> Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak petek od 9:00 do 12:00.<br /> <br /> Ocena seminarjev predstavlja 30% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> {| {{table}}<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Ime Priimek'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Tema*'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Naslov seminarja'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 1'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 2'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 3'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum oddaje'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum recenzije'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum predstavitve'''<br /> |-<br /> | Erik Kristian Janežič||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0962892412000694 Hippo signalna pot in matične celice ]||Filip Mihalič||Matic Kovačič||Jernej Pušnik||19.10.2012||23.10.2012||26.10.2012<br /> |-<br /> | Dejan Marjanovič||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014482707001450 Vpliv in delovanje vimentina v celični signalizaciji in pomen poznavanja teh mehanizmov]||Samo Zakotnik||Zala Gluhić||Rok Razpotnik||19.10.2012||23.10.2012||26.10.2012<br /> |-<br /> | Griša Prinčič||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000411001149 Vpliv T3SS sekretov na odziv gostiteljske celice]||Mirjana Malnar||Bojana Lazović||Ajda Rojc||19.10.2012||23.10.2012||26.10.2012<br /> |-<br /> | Maja Kostanjevec||14||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000401018059# Mehanizmi zaznavanja glukoze v evkariontskih celicah]||Sara Lorbek||Nastja Pirman||Tomaž Rozmarič||26.10.2012||05.11.2012||09.11.2012<br /> |-<br /> | Julija Mazej||14||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0968000409002072 Metabolizem glukoze v živčnih celicah]||Ellen Malovrh||Špela Tomaž||Ana Kunšek||26.10.2012||05.11.2012||09.11.2012<br /> |-<br /> | Estera Merljak||14||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S096800041200059X Vloga PKM2 v rakavih celicah]||Suzana Semič||Monika Biasizzo||Janez Meden||26.10.2012||05.11.2012||09.11.2012<br /> |-<br /> | Jernej Pušnik||15||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000410001702 Uravnavanje metabolnih poti z acetilacijo proteinov]||Katarina Tolar||Jakob Gašper Lavrenčič||Ana Cirnski||05.11.2012||09.11.2012||16.11.2012<br /> |-<br /> | Rok Razpotnik||15||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304419X12000534 Metabolizem rakastih celic in njegova regulacija]||Aleksander Benčič||Barbara Dušak||Erik Mršnik||05.11.2012||09.11.2012||16.11.2012<br /> |-<br /> | Ajda Rojc||15||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S001448271000282X Metabolizem skeletnih mišic]||Ana Grom||Matej Vrhovnik||Katja Leben||05.11.2012||09.11.2012||16.11.2012<br /> |-<br /> | Tomaž Rozmarič||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272810006869 Crabtree in Warburg efekt: izvor energije rakavih celic]||Erik Kristian Janežič||Filip Mihalič||Matic Kovačič||09.11.2012||16.11.2012||23.11.2012<br /> |-<br /> | Ana Kunšek||16||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0968000406000843 Večfunkcionalnost akonitaze]||Dejan Marjanovič||Samo Zakotnik||Zala Gluhić||09.11.2012||16.11.2012||23.11.2012<br /> |-<br /> | Janez Meden||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304416511003059 NADH-fumarat reduktaza - primerna tarča za zdravljenje s kemoterapijo]||Griša Prinčič||Mirjana Malnar||Bojana Lazović||09.11.2012||16.11.2012||23.11.2012<br /> |-<br /> | Ana Cirnski||17||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0163782701000224 Peroksisomalna razgradnja maščobnih kislin]||Maja Kostanjevec||Sara Lorbek||Nastja Pirman||16.11.2012||23.11.2012||30.11.2012<br /> |-<br /> | Erik Mršnik||17||[http://www.nature.com/nrneurol/journal/v3/n3/full/ncpneuro0421.html Adrenolevkodistrofija]||Julija Mazej||Ellen Malovrh||Špela Tomaž||16.11.2012||23.11.2012||30.11.2012<br /> |-<br /> | Katja Leben||17||[http://journals.lww.com/co-lipidology/Abstract/2002/06000/Metabolic_effects_of_thia_fatty_acids.10.aspx Tio maščobne kisline]||Estera Merljak||Suzana Semič||Monika Biasizzo||16.11.2012||23.11.2012||30.11.2012<br /> |-<br /> | Matic Kovačič||18||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276511000037# Sirtuin 3 ob dieti spodbuja cikel sečnine in oksidacijo maščobnih kislin]||Jernej Pušnik||Katarina Tolar||Jakob Gašper Lavrenčič||23.11.2012||30.11.2012||07.12.2012<br /> |-<br /> | Zala Gluhić||18||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165017307001439# Hiperamoniemija]||Rok Razpotnik||Aleksander Benčič||Barbara Dušak||23.11.2012||30.11.2012||07.12.2012<br /> |-<br /> | Bojana Lazović||18||[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22246293 Novi farmakološki šaperoni za zdravljenje fenilketonurije]||Ajda Rojc||Ana Grom||Matej Vrhovnik||23.11.2012||30.11.2012||07.12.2012<br /> |-<br /> | Nastja Pirman||19||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S096800040500335X Mitohondrij, center celične apoptoze]||Tomaž Rozmarič||Erik Kristian Janežič||Filip Mihalič||30.11.2012||07.12.2012||14.12.2012<br /> |-<br /> | Špela Tomaž||19||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S001085450700183X Inhibicija fotosinteze]||Ana Kunšek||Dejan Marjanovič||Samo Zakotnik||30.11.2012||07.12.2012||14.12.2012<br /> |-<br /> | Monika Biasizzo||19||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0968000409002138 Mitohondrijski razklopni proteini]||Janez Meden||Griša Prinčič||Mirjana Malnar||30.11.2012||07.12.2012||14.12.2012<br /> |-<br /> | Jakob Gašper Lavrenčič||20||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369526606001506 Sinteza rastlinske celične stene]||Ana Cirnski||Maja Kostanjevec||Sara Lorbek||07.12.2012||14.12.2012||21.12.2012<br /> |-<br /> | Barbara Dušak||20||[http://mmbr.asm.org/content/69/4/585.full Sinteza bakterijske celične stene]||Erik Mršnik||Julija Mazej||Ellen Malovrh||07.12.2012||14.12.2012||21.12.2012<br /> |-<br /> | Matej Vrhovnik||20||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0008621503003185 Biosinteza škroba; saharoza kot substrat za sintezo zelo razvejanih komponent škroba]||Katja Leben||Estera Merljak||Suzana Semič||07.12.2012||14.12.2012||21.12.2012<br /> |-<br /> | Filip Mihalič||21||Moj izbrani naslov||Matic Kovačič||Jernej Pušnik||Katarina Tolar||17.12.2012||21.12.2012||04.01.2013<br /> |-<br /> | Samo Zakotnik||21||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000402021680 Sinteza polinenasičenih maščobnih kislin in njihova vloga]||Zala Gluhić||Rok Razpotnik||Aleksander Benčič||17.12.2012||21.12.2012||04.01.2013<br /> |-<br /> | Mirjana Malnar||21||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000409001418 Vloga PPAR in leptina v metabolizmu lipidov]||Bojana Lazović||Ajda Rojc||Ana Grom||17.12.2012||21.12.2012||04.01.2013<br /> |-<br /> | Sara Lorbek||22||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000410000915 Glutaminska odvisnost rakavih celic]||Nastja Pirman||Tomaž Rozmarič||Erik Kristian Janežič||21.12.2012||04.01.2013||11.01.2013<br /> |-<br /> | Ellen Malovrh||22||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1568163704000121 Hem, železo in staranje]||Špela Tomaž||Ana Kunšek||Dejan Marjanovič||21.12.2012||04.01.2013||11.01.2013<br /> |-<br /> | Suzana Semič||22||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165017399000946 Lesch-Nyhanov sindrom]||Monika Biasizzo||Janez Meden||Griša Prinčič||21.12.2012||04.01.2013||11.01.2013<br /> |-<br /> | Katarina Tolar||23||Moj izbrani naslov||Jakob Gašper Lavrenčič||Ana Cirnski||Maja Kostanjevec||04.01.2013||11.01.2013||18.01.2013<br /> |-<br /> | Aleksander Benčič||23||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S1043276009001532# Vpliv spolnih steroidov na oblikovanje skeleta]||Barbara Dušak||Erik Mršnik||Julija Mazej||04.01.2013||11.01.2013||18.01.2013<br /> |-<br /> | Ana Grom||23||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0303720707002109 Sinteza, mehanizem delovanja in vloga glukokortikoidov v metabolizmu]||Matej Vrhovnik||Katja Leben||Estera Merljak||04.01.2013||11.01.2013||18.01.2013<br /> |}<br /> <br /> *številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju (peta izdaja), v katerega naj izbrana tema spada<br /> <br /> == Gradivo za predavanja ==<br /> Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/<br /> username: bio2<br /> password: samozame<br /> <br /> ==Naloga==<br /> '''Vaša naloga za seminar je:&lt;br&gt;'''<br /> Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti članek iz revije [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS], če tam ne najdete primerne teme, lahko izberete tudi pregledni članek iz kakšne druge revije, ki ima faktor vpliva nad 5. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! <br /> <br /> Za pripravo seminarja velja naslednje:&lt;br&gt;<br /> * [[BIO2 Povzetki seminarjev 2012|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom. <br /> * Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-9 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed), vsebovati mora najmanj tri slike. &lt;font color=red&gt;Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. &lt;/font&gt;<br /> * Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli vsakemu od recenzentov in docentu (docentu ga pošljite po e-pošti).<br /> * Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte avtorju in Gunčarju.<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25-30 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.<br /> * Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.<br /> * Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku!<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dHc2d2pCbDBWNzl5VHZaQUk1SG1HeVE6MA recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dDZZOVVFNkwxb0JMeUFaMGltOVQ4aHc6MA mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).<br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO2_Seminar_2012&diff=7485 2012-12-24T21:34:40Z

<p>AnaGrom: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>== Novice za študente ==<br /> [https://www.google.com/calendar/embed?src=94r835uhlqu6sornlvmnldb5d0%40group.calendar.google.com&amp;ctz=Europe/Belgrade &lt;font color=red&gt;Razpored izpitnih rokov in kolokvijev ter nekaterih kolokvijev iz vaj&lt;/font&gt;]<br /> <br /> = Biokemijski seminar =<br /> Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak petek od 9:00 do 12:00.<br /> <br /> Ocena seminarjev predstavlja 30% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> {| {{table}}<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Ime Priimek'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Tema*'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Naslov seminarja'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 1'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 2'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 3'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum oddaje'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum recenzije'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum predstavitve'''<br /> |-<br /> | Erik Kristian Janežič||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0962892412000694 Hippo signalna pot in matične celice ]||Filip Mihalič||Matic Kovačič||Jernej Pušnik||19.10.2012||23.10.2012||26.10.2012<br /> |-<br /> | Dejan Marjanovič||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014482707001450 Vpliv in delovanje vimentina v celični signalizaciji in pomen poznavanja teh mehanizmov]||Samo Zakotnik||Zala Gluhić||Rok Razpotnik||19.10.2012||23.10.2012||26.10.2012<br /> |-<br /> | Griša Prinčič||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000411001149 Vpliv T3SS sekretov na odziv gostiteljske celice]||Mirjana Malnar||Bojana Lazović||Ajda Rojc||19.10.2012||23.10.2012||26.10.2012<br /> |-<br /> | Maja Kostanjevec||14||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000401018059# Mehanizmi zaznavanja glukoze v evkariontskih celicah]||Sara Lorbek||Nastja Pirman||Tomaž Rozmarič||26.10.2012||05.11.2012||09.11.2012<br /> |-<br /> | Julija Mazej||14||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0968000409002072 Metabolizem glukoze v živčnih celicah]||Ellen Malovrh||Špela Tomaž||Ana Kunšek||26.10.2012||05.11.2012||09.11.2012<br /> |-<br /> | Estera Merljak||14||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S096800041200059X Vloga PKM2 v rakavih celicah]||Suzana Semič||Monika Biasizzo||Janez Meden||26.10.2012||05.11.2012||09.11.2012<br /> |-<br /> | Jernej Pušnik||15||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000410001702 Uravnavanje metabolnih poti z acetilacijo proteinov]||Katarina Tolar||Jakob Gašper Lavrenčič||Ana Cirnski||05.11.2012||09.11.2012||16.11.2012<br /> |-<br /> | Rok Razpotnik||15||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304419X12000534 Metabolizem rakastih celic in njegova regulacija]||Aleksander Benčič||Barbara Dušak||Erik Mršnik||05.11.2012||09.11.2012||16.11.2012<br /> |-<br /> | Ajda Rojc||15||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S001448271000282X Metabolizem skeletnih mišic]||Ana Grom||Matej Vrhovnik||Katja Leben||05.11.2012||09.11.2012||16.11.2012<br /> |-<br /> | Tomaž Rozmarič||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272810006869 Crabtree in Warburg efekt: izvor energije rakavih celic]||Erik Kristian Janežič||Filip Mihalič||Matic Kovačič||09.11.2012||16.11.2012||23.11.2012<br /> |-<br /> | Ana Kunšek||16||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0968000406000843 Večfunkcionalnost akonitaze]||Dejan Marjanovič||Samo Zakotnik||Zala Gluhić||09.11.2012||16.11.2012||23.11.2012<br /> |-<br /> | Janez Meden||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304416511003059 NADH-fumarat reduktaza - primerna tarča za zdravljenje s kemoterapijo]||Griša Prinčič||Mirjana Malnar||Bojana Lazović||09.11.2012||16.11.2012||23.11.2012<br /> |-<br /> | Ana Cirnski||17||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0163782701000224 Peroksisomalna razgradnja maščobnih kislin]||Maja Kostanjevec||Sara Lorbek||Nastja Pirman||16.11.2012||23.11.2012||30.11.2012<br /> |-<br /> | Erik Mršnik||17||[http://www.nature.com/nrneurol/journal/v3/n3/full/ncpneuro0421.html Adrenolevkodistrofija]||Julija Mazej||Ellen Malovrh||Špela Tomaž||16.11.2012||23.11.2012||30.11.2012<br /> |-<br /> | Katja Leben||17||[http://journals.lww.com/co-lipidology/Abstract/2002/06000/Metabolic_effects_of_thia_fatty_acids.10.aspx Tio maščobne kisline]||Estera Merljak||Suzana Semič||Monika Biasizzo||16.11.2012||23.11.2012||30.11.2012<br /> |-<br /> | Matic Kovačič||18||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276511000037# Sirtuin 3 ob dieti spodbuja cikel sečnine in oksidacijo maščobnih kislin]||Jernej Pušnik||Katarina Tolar||Jakob Gašper Lavrenčič||23.11.2012||30.11.2012||07.12.2012<br /> |-<br /> | Zala Gluhić||18||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165017307001439# Hiperamoniemija]||Rok Razpotnik||Aleksander Benčič||Barbara Dušak||23.11.2012||30.11.2012||07.12.2012<br /> |-<br /> | Bojana Lazović||18||[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22246293 Novi farmakološki šaperoni za zdravljenje fenilketonurije]||Ajda Rojc||Ana Grom||Matej Vrhovnik||23.11.2012||30.11.2012||07.12.2012<br /> |-<br /> | Nastja Pirman||19||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S096800040500335X Mitohondrij, center celične apoptoze]||Tomaž Rozmarič||Erik Kristian Janežič||Filip Mihalič||30.11.2012||07.12.2012||14.12.2012<br /> |-<br /> | Špela Tomaž||19||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S001085450700183X Inhibicija fotosinteze]||Ana Kunšek||Dejan Marjanovič||Samo Zakotnik||30.11.2012||07.12.2012||14.12.2012<br /> |-<br /> | Monika Biasizzo||19||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0968000409002138 Mitohondrijski razklopni proteini]||Janez Meden||Griša Prinčič||Mirjana Malnar||30.11.2012||07.12.2012||14.12.2012<br /> |-<br /> | Jakob Gašper Lavrenčič||20||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369526606001506 Sinteza rastlinske celične stene]||Ana Cirnski||Maja Kostanjevec||Sara Lorbek||07.12.2012||14.12.2012||21.12.2012<br /> |-<br /> | Barbara Dušak||20||[http://mmbr.asm.org/content/69/4/585.full Sinteza bakterijske celične stene]||Erik Mršnik||Julija Mazej||Ellen Malovrh||07.12.2012||14.12.2012||21.12.2012<br /> |-<br /> | Matej Vrhovnik||20||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0008621503003185 Biosinteza škroba; saharoza kot substrat za sintezo zelo razvejanih komponent škroba]||Katja Leben||Estera Merljak||Suzana Semič||07.12.2012||14.12.2012||21.12.2012<br /> |-<br /> | Filip Mihalič||21||Moj izbrani naslov||Matic Kovačič||Jernej Pušnik||Katarina Tolar||17.12.2012||21.12.2012||04.01.2013<br /> |-<br /> | Samo Zakotnik||21||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000402021680 Sinteza polinenasičenih maščobnih kislin in njihova vloga]||Zala Gluhić||Rok Razpotnik||Aleksander Benčič||17.12.2012||21.12.2012||04.01.2013<br /> |-<br /> | Mirjana Malnar||21||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000409001418 Vloga PPPAR in leptina v metabolizmu lipidov]||Bojana Lazović||Ajda Rojc||Ana Grom||17.12.2012||21.12.2012||04.01.2013<br /> |-<br /> | Sara Lorbek||22||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000410000915 Glutaminska odvisnost rakavih celic]||Nastja Pirman||Tomaž Rozmarič||Erik Kristian Janežič||21.12.2012||04.01.2013||11.01.2013<br /> |-<br /> | Ellen Malovrh||22||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1568163704000121 Hem, železo in staranje]||Špela Tomaž||Ana Kunšek||Dejan Marjanovič||21.12.2012||04.01.2013||11.01.2013<br /> |-<br /> | Suzana Semič||22||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165017399000946 Lesch-Nyhanov sindrom]||Monika Biasizzo||Janez Meden||Griša Prinčič||21.12.2012||04.01.2013||11.01.2013<br /> |-<br /> | Katarina Tolar||23||Moj izbrani naslov||Jakob Gašper Lavrenčič||Ana Cirnski||Maja Kostanjevec||04.01.2013||11.01.2013||18.01.2013<br /> |-<br /> | Aleksander Benčič||23||Moj izbrani naslov||Barbara Dušak||Erik Mršnik||Julija Mazej||04.01.2013||11.01.2013||18.01.2013<br /> |-<br /> | Ana Grom||23||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0303720707002109 Vloga glukokortikoidov v metabolizmu]||Matej Vrhovnik||Katja Leben||Estera Merljak||04.01.2013||11.01.2013||18.01.2013<br /> |}<br /> <br /> *številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju (peta izdaja), v katerega naj izbrana tema spada<br /> <br /> == Gradivo za predavanja ==<br /> Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/<br /> username: bio2<br /> password: samozame<br /> <br /> ==Naloga==<br /> '''Vaša naloga za seminar je:&lt;br&gt;'''<br /> Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti članek iz revije [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS], če tam ne najdete primerne teme, lahko izberete tudi pregledni članek iz kakšne druge revije, ki ima faktor vpliva nad 5. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! <br /> <br /> Za pripravo seminarja velja naslednje:&lt;br&gt;<br /> * [[BIO2 Povzetki seminarjev 2012|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom. <br /> * Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-9 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed), vsebovati mora najmanj tri slike. &lt;font color=red&gt;Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. &lt;/font&gt;<br /> * Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli vsakemu od recenzentov in docentu (docentu ga pošljite po e-pošti).<br /> * Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte avtorju in Gunčarju.<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25-30 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.<br /> * Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.<br /> * Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku!<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dHc2d2pCbDBWNzl5VHZaQUk1SG1HeVE6MA recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dDZZOVVFNkwxb0JMeUFaMGltOVQ4aHc6MA mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).<br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO1_Povzetki_seminarjev&diff=6902 2012-03-13T20:31:30Z

<p>AnaGrom: </p> <hr /> <div>== Gregor Gunčar: Sintetični DNA vezavni proteini ==<br /> Povzetek- 200 besed<br /> ejksfjksadnfjkdsaf adhsk fhdsajklf kjldsah fsadh fhjklsadh jfkhads jklfhads jkfaljkfh jklsdahf jkdsah fljkdsah fjklsadh fjkhdsa jkflhasd ljfhk<br /> <br /> == Ana Cirnski: TAL efektorji - proteini, ki urejajo gene ==<br /> TAL (transcription activator – like) efektorji so regulatorni proteini, ki vplivajo na delovanje RNA polimeraze pri prepisovanju DNA. Z vezavnimi domenami se vežejo na specifična zaporedja baz na dvojni vijačnici in tako uravnavajo hitrost sinteze proteinov. Najbolj znani regulatorni proteini so motiv cinkovega prsta, motiv levcinske zadrge in motiv vijačnica – obrat – vijačnica.<br /> <br /> TAL efektorje so odkrili v bakteriji vrste Xanthomonas, ki jih je uporabljala za reprogramiranje gostiteljskih celic, tako da so te sintetizirale proteine, ki so ustrezali bakteriji.<br /> <br /> Domena TAL efektorja, ki se veže na DNA vsebuje 1-35 TAL ponovitev. Vsaka ponovitev je specifična za en bazni par na DNA in vsebuje 33-35 aminokislin (zadnja je okrnjena na 20 aminokislin), ki so vedno na istem mestu. Izjema sta mesti 12 in 13, znani tudi kot RVD mesti (repeat variable diresidues), ki določata specifičnost med efektorjem in DNA verigo.<br /> <br /> TAL efektorji se med seboj ločijo po aminokislinskem zaporedju in številu njihovih ponovitev. Od teh lastnosti je odvisna specifičnost efektorja.<br /> Za prepoznavo specifičnih mest na DNA sta odgovorni RVD mesti, ki določata, kam se bo efektor vezal. Obstaja tudi posebna koda po kateri se en par aminokislin veže na določen nukleotid. TAL ponovitve nimajo medsebojnega vpliva zato jih je lažje sestavljati in tako spremeniti efektor.<br /> Uporabljajo se lahko kot umetni restrikcijski encimi (TALEN) za dvoverižne prekinitve DNA (DSB – [double–strand breaks]), kar povzroči v celici popravljalne mehanizme in vodi do sprememb v genskem zapisu. Lahko pa tudi kot transkripcijski faktor (dTALE) za vklapljanje in izklapljanje genov.<br /> <br /> Čeprav je o TAL efektorjih še veliko neznanega, kažejo možnosti za široko uporabo na področju biotehnologije in genetike za izboljševanje lastnosti živil in zdravljenje nekaterih bolezni (HIV).<br /> <br /> == Griša Prinčič: DNK nanotehnologija ==<br /> Nanotehnologija je ustvarjanje in inženiring funkcionalnih sistemov na atomskem in molekularnem nivoju. DNK nanotehnologija je veja nanotehnologije, ki izkorišča strukturne in kemijske lastnosti DNK molekule ter iz nje sestavlja strukture, ki ne nosijo informacijskega zapisa in so v velikosti do nekaj 100 nanometrov. Najpomembnejši del pri sintezi DNK makromolekul je optimizirano zaporedje nukleinskih kislin. Sekundarno strukturo lahko tvori več različnih zaporedij baz, vendar bo velika večina teh zaporedij imela tudi negativne medsebojne interakcije, kar bi lahko privedlo do spremembe v obliki sekundarne strukture. DNK molekula ima sposobnost samosestavljanja (self-assembly). Pod določenimi pogoji lahko enotno daljšo verigo DNK pripravimo do zvijanja (folding) oz. tvorbe določene (želene) strukture.<br /> <br /> V seminarski nalogi se bom osredotočil predvsem na razvoj tako imenovanih nanorobotov, ki služijo kot specializiran dostavni sistem signalnih molekul do celic v človeškem telesu. Ob aktivaciji receptorja se kapsula odpre in na mesto dostavi signalne ali druge molekule.<br /> <br /> Pripravljeni so bili nanoroboti v obliki heksagonalnega »soda«, ki so sposobni prepoznati okvarjene ali rakaste celice s pomočjo aptamernega receptorja, ki služi tudi kot »ključavnični mehanizem«. Učinkovitost prepoznavanja celic in »ključavničnega mehanizma« je bila preizkušena na šestih vrstah rakastih celic. Celic Burkitt-ovega limfoma nanoroboti niso prepoznali (se niso aktivirali), pri ostalih petih vzorcih je bila aktivacija potrjena.<br /> <br /> == Bojana Lazović: Vloga prionov pri preživetju divjih kvasovk ==<br /> Kvasovke imajo pomembno vlogo pri odkrivanju in spoznavanju lastnosti prionov. Raziskave na njih lahko močno pomagajo tudi pri razumevanju prionskih bolezni, ki se pojavljajo pri ljudeh.<br /> Znano je, da je velika posebnost prionov ta, da se lahko razmnožujejo brez DNK zapisa. Znanstveniki so pri raziskavah na laboratorijskih kulturah kvasovk prišli do pomembnih ugotovitev, glede vloge prionov pri dedovanju v kvasovkah. Razne konformacije proteinov v teh celicah imajo pomembno vlogo pri epigenetskem dedovanju, to je dedovanju, ki ni odvisno od zapisa na DNK verigi. S svojim delovanjem ustvarjajo dedne fenotipske lastnosti, njihova raznolikost pa spodbuja preživetje v spreminjajočih se okoljih in vpliva na razvoj novih lastnosti. Toda te lastnosti so potrdili le v laboratorijskih kulturah. Zato se je porajalo vprašanje, če enako velja tudi v naravi oz. za »divje« vrste kvasovk ali so ugotovljene značilnosti le umetno vzpodbujene v laboratoriju. Iz tega razloga so biokemično testirali okoli 700 različnih sevov vrste kvasovk Saccharomyce, da bi ugotovili če imajo prisotne prione. Rezultati so potrdili prejšnje raziskave. Tako so potrdili tezo, da prioni v splošnem urejajo nekatere dedne lastnosti v naravi, na način ki korenito poveča sposobnost prilagajanja.<br /> <br /> == Vesna Radić: Odziv imunskega sistema z IFN-λ ==<br /> Imunost je sposobnost obrambe telesa pred tujimi oz. škodljivimi snovmi, ki jih imenujemo tudi antigeni. Ko se ti pojavijo v telesu, jih imunski sistem prepozna in se odzove tako, da jih skuša uničiti na različne načine.<br /> IFN lambda že dolgo veljajo kot pomembno orožje v imunskem sistemu v obrambi proti virusom, bakterija, parazitom in tudi tumorom. So namreč interferoni, saj so zmožni posegati v razmnoževanje in delovanje patogenov. Interferoni so celične beljakovine sposobne komuniciranja med celicami in tako na razne načine sprožitve delovanja imunskega sistema. IFN-λ so del razreda II citokinov. Lambda je podoben α, saj oba delujeta proti virusom. Razlika med njima je ta, da IFN-α lahko proizvedejo vse celice, ki imajo jedro, IFN-λ pa le nekaj določenih celic. Makrofagi proizvajajo IFN-λ za odziv na virusne in/ali bakterijske okužbe. Citokin IFN lambda se ustvari predvsem iz limfocita CD8+ T – spominske celice. T celice se aktivirajo ob prisotnosti že znanega antigena če ne pa živijo v neaktivnem stanju, ko se pa znova srečajo z že znanim antigenom, sprostijo IFN-λ. <br /> Regulacija sproščanja IFN-λ še ni povsem znana; na podlagi novih študij izvemo, da se lahko sprostijo tudi brez aktivacije pri kontaktu z antigeni. Prav tako so odkrili tudi, da imajo ti interferoni pomembno vlogo pri zdravljenju hepatitisa B in C, astme in raka.<br /> == Julija Mazej: Pretvorba HDL v LDL preko CETP molekule ==<br /> Lipoproteini so raznovrstni delci, sestavljeni iz proteinskega in holesterolnega dela. Na podlagi deleža proteinov in holesterola v posameznem delcu ločimo 5 vrst lipoproteinov: hilomikrone, LDL,HDL,VLDL in IDS. V seminarju se bom omejila na dva, ki imata še posebej veliko vlogo pri transportu holesterola po krvni plazmi. HDL je lipoprotein visoke gostote in ima prevladujoč proteinski del. Znan je tudi kot dober holesterol, saj prenaša presežni holesterol iz celic do jeter, kjer poteče razgradnja. LDL pa je lipoprotein, ki prenaša holesterol v obratni smeri. V kolikor ima celica dovolj holesterola, se prične ta kopičiti na stenah žil, kar vodi do kardiovaskularnih bolezni. Pred kratkim so znanstveniki odkrili mehanizem pretvorbe dobrega holesterola v slab holesterol, preko majhne molekule CETP. Molekula deluje kot most med obema lipoproteinoma in prečrpa holesterol iz HDL v LDL. To odkritje daje nove perspektive na področju zdravljenja kardiovaskularnih bolezni, ki so glavni vzrok bolezni in prezgodnje smrti v Evropski Uniji in razvitem svetu. Učinkovito zdravilo, bi torej moralo inhibirati delovanje CETP molekule. Po rezultatih raziskave medicinske univerze na Dunaju, pa takšno zdravilo nebi pomagalo pacientom z ledvično odpovedjo. Pri nekaterih pacientih na dializi so namreč izsledili nefunkcionalen HDL. Spregovorila bom tudi o nastanku &quot;ultra slabega&quot; LDL, pri starejših in obolelih za diabetesom tipa 2.<br /> <br /> == Ana Grom: Visokotehnološko odkrivanje rakavih celic dojk ==<br /> Rak na dojkah je v današnjem svetu kar velik problem pri ženskah. Metode, ki se uporabljajo za zaznavo le tega, pa niso dovršene. Vsaka od njih (mamografija, ultrazvok, magnetna resonanca in druge) ima kakšno slabo lastnost. Metode, ki bi bila zdravju popolnoma neškodljiva, nezmotljiva, kratkotrajna in cenovno lahko dostopna še ni odkrita. Zato so znanstveniki prišli na idejo, da bi poizkusili z nanodelci detektirati rakave celice. Najprej so si izbrali Her2 protein (Human epidermal growth factor receptor 2), ki bo tarča teh nanodelcev. Za protein so predhodno vedeli, da se v 30% rakavih celic dojk čezmerno izraža. Da bi se magnetni nanodelci usmerili proti rakavim celicam in nanje tudi vezali, so ustvarili nanodelce povezane s protitelesi za Her2 protein. Nato, ko bi se nanodelci vezali na celice, pa bi s posebnimi občutljivimi napravami zaznavali te nanodelce in s tem tudi rakave celice v telesu. Poskusi, ki so jih izvedli, da bi potrdili svoja predvidevanja so bili zelo spodbudni. Uspelo jim je dokazati, da se nanodelci resnično v večji meri vežejo na celice, ki imajo več Her2 receptorjev (rakave celice). Nekaj izmed metod, s katerimi so prišli do teh rezultatov, bom tudi sama predstavila.</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO1-seminar-2012&diff=6900 2012-03-12T17:50:12Z

<p>AnaGrom: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>= Temelji biokemije- seminar =<br /> <br /> Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak ponedeljek od 10:00 do 11:30.<br /> <br /> Ocena seminarjev predstavlja ??% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> {| border=&quot;1&quot; cellpadding=&quot;4&quot; cellspacing=&quot;0&quot; style=&quot;border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;&quot; <br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Ime in priimek'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Naslov seminarja'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Link'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Rok za oddajo'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Rok za recenzijo'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum predstavitve'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 1'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 2'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 3'''<br /> |-<br /> | Ana Cirnski||TAL efektorji - proteini za urejanje genov||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/01/120105141141.htm povezava]||29.02.||02.03.||05.03.||Matej Prevc||Ana Grom||Erik Mršnik<br /> |-<br /> | Griša Prinčič||DNK nanoroboti||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120216144238.htm povezava]||29.02.||02.03.||05.03.||Katja Leben||Jernej Pušnik||Maja Kostanjevec<br /> |-<br /> | Bojana Lazović||Vloga prionov pri preživetju in razvoju kvasovk||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120215142817.htm povezava]||29.02.||02.03.||05.03.||Matic Urlep||Špela Tomaž||Sandra Zupančič<br /> |-<br /> | Vesna Radić||Odziv imunskega sistema z IFN-λ || [http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120209135106.htm povezava]||07.03.||09.03.||12.03.||Ana Grom||Katarina Tolar||Ana Cirnski<br /> |-<br /> | Julija Mazej||Pretvorba HDL v LDL preko CETP molekule||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120221165941.htm povezava]||07.03.||09.03.||12.03.||Aleksander Benčič||Mirana Krim Godler||Bojana Lazović<br /> |-<br /> | Matej Prevc||Moj naslov||povezava||07.03.||09.03.||12.03.||Jan Taškar||Zala Gluhić||Špela Tomaž<br /> |-<br /> | Erik Kristian Janežič||Študije golih krtovskih podgan ||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120223182512.htm povezava]||14.03.||16.03.||19.03.||Griša Prinčič||Rok Razpotnik||Matic Urlep<br /> |-<br /> | Ana Grom||Visokotehnološko zaznavanje rakavih celic dojk||[http://www.sciencedaily.com/releases/2011/10/111028082715.htm povezava]||14.03.||16.03.||19.03.||Matic Kovačič||Jan Taškar||Katja Leben<br /> |-<br /> | Robert Berger||Svetlobno stikalo za bolečino|| [http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120222093506.htm povezava]||14.03.||16.03.||19.03.||Sara Bitenc||Rok Babič||Ajda Rojc<br /> |-<br /> | Filip Mihalič||Moj naslov||povezava||14.03.||16.03.||19.03.||Matej Vrhovnik||Dejan Marjanovič||Vesna Radić<br /> |-<br /> | Samo Zakotnik||Staranje in telomere||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120227152612.htm povezava]||19.03.||22.03.||26.03.||Ana Kunšek||Tomaž Rozmarič||Ana Grom<br /> |-<br /> | Špela Tomaž||Specifično gibanje motornega proteina Dineina||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/01/120113210652.htm povezava]||19.03.||22.03.||26.03.||Erik Kristian Janežič||Matej Prevc||Rok Babič<br /> |-<br /> | Katarina Tolar||Moj naslov||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120227152819.htm povezava]||19.03.||22.03.||26.03.||Alenka Mikuž||Sara Bitenc||Monika Biasizzo<br /> |-<br /> | Zala Gluhić||Rubisco aktivaza|| [http://www.sciencedaily.com/releases/2011/11/111108104620.htm povezava] ||19.03.||22.03.||26.03.||Luka Krmpotić||Aleksander Benčič||Nastja Pirman<br /> |-<br /> | Veronika Furlan||Moj naslov||povezava||21.03.||26.03.||02.04.||Špela Tomaž||Katja Leben||Sara Bitenc<br /> |-<br /> | Nastja Pirman||Moj naslov||povezava||21.03.||26.03.||02.04.||Jernej Pušnik||Sandra Zupančič||Estera Merljak<br /> |-<br /> | Barbara Dušak||Kako encimi RNA polimeraze regulirajo ekspresijo genov|| [http://www.sciencedaily.com/releases/2012/03/120301143743.htm povezava] ||21.03.||26.03.||02.04.||Rok Babič||Bojana Lazović||Rok Razpotnik<br /> |-<br /> | Rok Razpotnik||Mikrobna produkcija biogoriv||[http://www.sciencedaily.com/releases/2011/09/110927134254.htm povezava]||21.03.||26.03.||02.04.||Ajda Rojc||Veronika Furlan||Luka Krmpotić<br /> |-<br /> | Erik Mršnik||Sintetični protein Oct4 amplificira gene matičnih celic||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120216133922.htm povezava]||04.04.||11.04.||16.04.||Ana Cirnski||Julija Mazej||Filip Mihalič<br /> |-<br /> | Matic Kovačič||Zakaj stres povzroča poškodbe DNA||[http://www.sciencedaily.com/releases/2011/08/110821141135.htm povezava]||04.04.||11.04.||16.04.||Bojana Lazović||Samo Zakotnik||Aleksander Benčič<br /> |-<br /> | Matej Vrhovnik||Moj naslov||povezava||04.04.||11.04.||16.04.||Mirana Krim Godler||Luka Krmpotić||Erik Kristian Janežič<br /> |-<br /> | Andreja Kukovec||Moj naslov||povezava||04.04.||11.04.||16.04.||Monika Biasizzo||Ellen Malovrh||Bojan Juloski<br /> |-<br /> | Rok Babič||Moj naslov||povezava||11.04.||16.04.||23.04.||Tomaž Rozmarič||Matej Vrhovnik||Ellen Malovrh<br /> |-<br /> | Sara Bitenc||Možganski parazit Toxoplasma gondii in njegov vpliv na &quot;možgansko kemijo&quot;||[http://www.sciencedaily.com/releases/2011/11/111104102125.htm povezava]||11.04.||16.04.||23.04.||Sandra Zupančič||Matic Urlep||Matic Kovačič<br /> |-<br /> | Jan Taškar||Pridobivanje elektrike s stratosferskimi bakterijami||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120221212614.htm povezava]||11.04.||16.04.||23.04.||Jakob Gašper Lavrenčič||Alenka Mikuž||Tomaž Rozmarič<br /> |-<br /> | Bojan Juloski||Moj naslov||povezava||11.04.||16.04.||23.04.||Erik Mršnik||Robert Berger||Katarina Tolar<br /> |-<br /> | Monika Biasizzo||Moj naslov||povezava||19.04.||26.04.||07.05.||Ellen Malovrh||Ajda Rojc||Alenka Mikuž<br /> |-<br /> | Katja Leben||Zdravljenje raka s siRNA in njena dostava do celice||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120227094331.htm povezava]||19.04.||26.04.||07.05.||Maja Kostanjevec||Matic Kovačič||Janez Meden<br /> |-<br /> | Maja Kostanjevec||Moj naslov||povezava||19.04.||26.04.||07.05.||Barbara Dušak||Jakob Gašper Lavrenčič||Matej Vrhovnik<br /> |-<br /> | Matic Urlep||Moj naslov||povezava||19.04.||26.04.||07.05.||Katarina Tolar||Vesna Radić||Mirjana Malnar<br /> |-<br /> | Tomaž Rozmarič||Moj naslov||povezava||26.04.||07.05.||14.05.||Veronika Furlan||Ana Kunšek||Andreja Kukovec<br /> |-<br /> | Mirjana Malnar||Moj naslov||povezava||26.04.||07.05.||14.05.||Janez Meden||Erik Kristian Janežič||Veronika Furlan<br /> |-<br /> | Luka Krmpotić||Moj naslov||povezava||26.04.||07.05.||14.05.||Vesna Radić||Monika Biasizzo||Ana Kunšek<br /> |-<br /> | Ellen Malovrh||Dolgoživi jedrni proteini in njihov vpliv na celično staranje||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120203180905.htm povezava]||26.04.||07.05.||14.05.||Julija Mazej||Janez Meden||Mirana Krim Godler<br /> |-<br /> | Aleksander Benčič||S1P1 receptorji in njihov vpliv na multiplo sklerozo ter ostale bolezni||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120216143957.htm povezava]||07.05.||14.05.||21.05.||Zala Gluhić||Griša Prinčič||Julija Mazej<br /> |-<br /> | Jakob Gašper Lavrenčič||Bio-sončne celice||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120202092246.htm]||07.05.||14.05.||21.05.||Dejan Marjanovič||Estera Merljak||Jernej Pušnik<br /> |-<br /> | Dejan Marjanovič||Moj naslov||povezava||07.05.||14.05.||21.05.||Rok Razpotnik||Erik Mršnik||Samo Zakotnik<br /> |-<br /> | Mirana Krim Godler||Moj naslov||povezava||07.05.||14.05.||21.05.||Samo Zakotnik||Nastja Pirman||Matej Prevc<br /> |-<br /> | Ana Kunšek||Moj naslov||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120219143049.htm povezava]||14.05.||21.05.||28.05.||Estera Merljak||Mirjana Malnar||Jan Taškar<br /> |-<br /> | Sandra Zupančič||Moj naslov||povezava||14.05.||21.05.||28.05.||Filip Mihalič||Maja Kostanjevec||Zala Gluhić<br /> |-<br /> | Ajda Rojc||Moj naslov||povezava||14.05.||21.05.||28.05.||Mirjana Malnar||Barbara Dušak||Jakob Gašper Lavrenčič<br /> |-<br /> | Jernej Pušnik||Moj naslov||povezava||14.05.||21.05.||28.05.||Nastja Pirman||Andreja Kukovec||Griša Prinčič<br /> |-<br /> | Estera Merljak||Odpiranje ionskih kanalčkov s pomočjo svetlobe||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120228101710.htm povezava]||21.05.||28.05.||04.06.||Andreja Kukovec||Bojan Juloski||Barbara Dušak<br /> |-<br /> | Alenka Mikuž||Odkriti novi krvni skupini||[http://www.nature.com/ng/journal/v44/n2/abs/ng.1069.html povezava]||21.05.||28.05.||04.06.||Bojan Juloski||Ana Cirnski||Robert Berger<br /> |-<br /> | Janez Meden||Poprava DNA pri oskidativni škodi||[http://www.sciencedaily.com/releases/2011/12/111227153752.htm]||21.05.||28.05.||04.06.||Robert Berger||Filip Mihalič||Dejan Marjanovič<br /> |}<br /> <br /> ==Naloga==<br /> * samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2011. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka morate za seminar uporabiti še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino. <br /> * naslov izbrane teme in link do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo <br /> * [[BIO1 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom. <br /> * Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 1800 do 2000 besed), vsebovati mora najmanj eno sliko. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!<br /> * Seminar oddajte do roka za oddajo vsakemu od recenzentov (docentu ga pošljite po e-pošti v formatu .doc ali .docx).<br /> * Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 18 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava- 4 minute. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo vsak vsaj dve vprašanji.<br /> * En dan pred predstavitvijo oddajte končno verzijo doc. Gunčarju po e-mailu, v subject napišite TBK2012 in pripnite datoteko, ki ima ime v obliki TBK2012-Ime-Priimek.docx. Na dan predstavitve morate docentu oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.<br /> * Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dFM2SktfM3Q4VU1wNUQzdU45OTlWVXc6MA recenzentsko poročilo]] na spletu.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dEozRlMwVDh0NDBmSmd2VnV0TUwtVGc6MA mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> <br /> ==Faktor vpliva==<br /> Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&amp;base=JCR COBISS-u]. V polje &quot;Naslov revije&quot; vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&amp;source=web&amp;cd=6&amp;sqi=2&amp;ved=0CEUQFjAF&amp;url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&amp;rct=j&amp;q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&amp;ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&amp;usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&amp;sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&amp;cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).<br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO1-seminar-2012&diff=6889 2012-03-07T22:07:11Z

<p>AnaGrom: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>= Temelji biokemije- seminar =<br /> <br /> Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak ponedeljek od 10:00 do 11:30.<br /> <br /> Ocena seminarjev predstavlja ??% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> {| border=&quot;1&quot; cellpadding=&quot;4&quot; cellspacing=&quot;0&quot; style=&quot;border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;&quot; <br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Ime in priimek'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Naslov seminarja'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Link'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Rok za oddajo'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Rok za recenzijo'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum predstavitve'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 1'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 2'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 3'''<br /> |-<br /> | Ana Cirnski||TAL efektorji - proteini za urejanje genov||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/01/120105141141.htm povezava]||29.02.||02.03.||05.03.||Matej Prevc||Ana Grom||Erik Mršnik<br /> |-<br /> | Griša Prinčič||DNK nanoroboti||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120216144238.htm povezava]||29.02.||02.03.||05.03.||Katja Leben||Jernej Pušnik||Maja Kostanjevec<br /> |-<br /> | Bojana Lazović||Vloga prionov pri preživetju in razvoju kvasovk||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120215142817.htm povezava]||29.02.||02.03.||05.03.||Matic Urlep||Špela Tomaž||Sandra Zupančič<br /> |-<br /> | Vesna Radić||Odziv imunskega sistema z IFN-λ || [http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120209135106.htm povezava]||07.03.||09.03.||12.03.||Ana Grom||Katarina Tolar||Ana Cirnski<br /> |-<br /> | Julija Mazej||Pretvorba HDL v LDL preko CETP molekule||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120221165941.htm povezava]||07.03.||09.03.||12.03.||Aleksander Benčič||Mirana Krim Godler||Bojana Lazović<br /> |-<br /> | Matej Prevc||Moj naslov||povezava||07.03.||09.03.||12.03.||Jan Taškar||Zala Gluhić||Špela Tomaž<br /> |-<br /> | Erik Kristian Janežič||Študije golih krtovskih podgan ||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120223182512.htm povezava]||14.03.||16.03.||19.03.||Griša Prinčič||Rok Razpotnik||Matic Urlep<br /> |-<br /> | Ana Grom||Visokotehnološko zaznavanje rakavih celic||[http://www.sciencedaily.com/releases/2011/10/111028082715.htm povezava]||14.03.||16.03.||19.03.||Matic Kovačič||Jan Taškar||Katja Leben<br /> |-<br /> | Robert Berger||Moj naslov||povezava||14.03.||16.03.||19.03.||Sara Bitenc||Rok Babič||Ajda Rojc<br /> |-<br /> | Filip Mihalič||Moj naslov||povezava||14.03.||16.03.||19.03.||Matej Vrhovnik||Dejan Marjanovič||Vesna Radić<br /> |-<br /> | Samo Zakotnik||Staranje in telomere||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120227152612.htm povezava]||19.03.||22.03.||26.03.||Ana Kunšek||Tomaž Rozmarič||Ana Grom<br /> |-<br /> | Špela Tomaž||Moj naslov||povezava||19.03.||22.03.||26.03.||Erik Kristian Janežič||Matej Prevc||Rok Babič<br /> |-<br /> | Katarina Tolar||Moj naslov||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120227152819.htm povezava]||19.03.||22.03.||26.03.||Alenka Mikuž||Sara Bitenc||Monika Biasizzo<br /> |-<br /> | Zala Gluhić||Moj naslov||povezava||19.03.||22.03.||26.03.||Luka Krmpotić||Aleksander Benčič||Nastja Pirman<br /> |-<br /> | Veronika Furlan||Moj naslov||povezava||21.03.||26.03.||02.04.||Špela Tomaž||Katja Leben||Sara Bitenc<br /> |-<br /> | Nastja Pirman||Moj naslov||povezava||21.03.||26.03.||02.04.||Jernej Pušnik||Sandra Zupančič||Estera Merljak<br /> |-<br /> | Barbara Dušak||Kako encimi RNA polimeraze regulirajo ekspresijo genov|| [http://www.sciencedaily.com/releases/2012/03/120301143743.htm povezava] ||21.03.||26.03.||02.04.||Rok Babič||Bojana Lazović||Rok Razpotnik<br /> |-<br /> | Rok Razpotnik||Mikrobna produkcija biogoriv||[http://www.sciencedaily.com/releases/2011/09/110927134254.htm povezava]||21.03.||26.03.||02.04.||Ajda Rojc||Veronika Furlan||Luka Krmpotić<br /> |-<br /> | Erik Mršnik||Moj naslov||povezava||04.04.||11.04.||16.04.||Ana Cirnski||Julija Mazej||Filip Mihalič<br /> |-<br /> | Matic Kovačič||Zakaj stres povzroča poškodbe DNA||[http://www.sciencedaily.com/releases/2011/08/110821141135.htm povezava]||04.04.||11.04.||16.04.||Bojana Lazović||Samo Zakotnik||Aleksander Benčič<br /> |-<br /> | Matej Vrhovnik||Moj naslov||povezava||04.04.||11.04.||16.04.||Mirana Krim Godler||Luka Krmpotić||Erik Kristian Janežič<br /> |-<br /> | Andreja Kukovec||Moj naslov||povezava||04.04.||11.04.||16.04.||Monika Biasizzo||Ellen Malovrh||Bojan Juloski<br /> |-<br /> | Rok Babič||Moj naslov||povezava||11.04.||16.04.||23.04.||Tomaž Rozmarič||Matej Vrhovnik||Ellen Malovrh<br /> |-<br /> | Sara Bitenc||Možganski parazit Toxoplasma gondii in njegov vpliv na &quot;možgansko kemijo&quot;||[http://www.sciencedaily.com/releases/2011/11/111104102125.htm povezava]||11.04.||16.04.||23.04.||Sandra Zupančič||Matic Urlep||Matic Kovačič<br /> |-<br /> | Jan Taškar||Pridobivanje elektrike s stratosferskimi bakterijami||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120221212614.htm povezava]||11.04.||16.04.||23.04.||Jakob Gašper Lavrenčič||Alenka Mikuž||Tomaž Rozmarič<br /> |-<br /> | Bojan Juloski||Moj naslov||povezava||11.04.||16.04.||23.04.||Erik Mršnik||Robert Berger||Katarina Tolar<br /> |-<br /> | Monika Biasizzo||Moj naslov||povezava||19.04.||26.04.||07.05.||Ellen Malovrh||Ajda Rojc||Alenka Mikuž<br /> |-<br /> | Katja Leben||Zdravljenje raka s siRNA in njena dostava do celice||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120216144238.htm povezava]||19.04.||26.04.||07.05.||Maja Kostanjevec||Matic Kovačič||Janez Meden<br /> |-<br /> | Maja Kostanjevec||Moj naslov||povezava||19.04.||26.04.||07.05.||Barbara Dušak||Jakob Gašper Lavrenčič||Matej Vrhovnik<br /> |-<br /> | Matic Urlep||Moj naslov||povezava||19.04.||26.04.||07.05.||Katarina Tolar||Vesna Radić||Mirjana Malnar<br /> |-<br /> | Tomaž Rozmarič||Moj naslov||povezava||26.04.||07.05.||14.05.||Veronika Furlan||Ana Kunšek||Andreja Kukovec<br /> |-<br /> | Mirjana Malnar||Moj naslov||povezava||26.04.||07.05.||14.05.||Janez Meden||Erik Kristian Janežič||Veronika Furlan<br /> |-<br /> | Luka Krmpotić||Moj naslov||povezava||26.04.||07.05.||14.05.||Vesna Radić||Monika Biasizzo||Ana Kunšek<br /> |-<br /> | Ellen Malovrh||Dolgoživi jedrni proteini in njihov vpliv na celično staranje||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120203180905.htm povezava]||26.04.||07.05.||14.05.||Julija Mazej||Janez Meden||Mirana Krim Godler<br /> |-<br /> | Aleksander Benčič||S1P1 receptorji in njihov vpliv na multiplo sklerozo ter ostale bolezni||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120216143957.htm povezava]||07.05.||14.05.||21.05.||Zala Gluhić||Griša Prinčič||Julija Mazej<br /> |-<br /> | Jakob Gašper Lavrenčič||Bio-sončne celice||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120202092246.htm]||07.05.||14.05.||21.05.||Dejan Marjanovič||Estera Merljak||Jernej Pušnik<br /> |-<br /> | Dejan Marjanovič||Moj naslov||povezava||07.05.||14.05.||21.05.||Rok Razpotnik||Erik Mršnik||Samo Zakotnik<br /> |-<br /> | Mirana Krim Godler||Moj naslov||povezava||07.05.||14.05.||21.05.||Samo Zakotnik||Nastja Pirman||Matej Prevc<br /> |-<br /> | Ana Kunšek||Moj naslov||povezava||14.05.||21.05.||28.05.||Estera Merljak||Mirjana Malnar||Jan Taškar<br /> |-<br /> | Sandra Zupančič||Moj naslov||povezava||14.05.||21.05.||28.05.||Filip Mihalič||Maja Kostanjevec||Zala Gluhić<br /> |-<br /> | Ajda Rojc||Moj naslov||povezava||14.05.||21.05.||28.05.||Mirjana Malnar||Barbara Dušak||Jakob Gašper Lavrenčič<br /> |-<br /> | Jernej Pušnik||Moj naslov||povezava||14.05.||21.05.||28.05.||Nastja Pirman||Andreja Kukovec||Griša Prinčič<br /> |-<br /> | Estera Merljak||Odpiranje ionskih kanalčkov s pomočjo svetlobe||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120228101710.htm povezava]||21.05.||28.05.||04.06.||Andreja Kukovec||Bojan Juloski||Barbara Dušak<br /> |-<br /> | Alenka Mikuž||Odkriti novi krvni skupini||[http://www.nature.com/ng/journal/v44/n2/abs/ng.1069.html povezava]||21.05.||28.05.||04.06.||Bojan Juloski||Ana Cirnski||Robert Berger<br /> |-<br /> | Janez Meden||Moj naslov||povezava||21.05.||28.05.||04.06.||Robert Berger||Filip Mihalič||Dejan Marjanovič<br /> |}<br /> <br /> ==Naloga==<br /> * samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2011. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka morate za seminar uporabiti še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino. <br /> * naslov izbrane teme in link do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo <br /> * [[BIO1 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom. <br /> * Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 1800 do 2000 besed), vsebovati mora najmanj eno sliko. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!<br /> * Seminar oddajte do roka za oddajo vsakemu od recenzentov (docentu ga pošljite po e-pošti v formatu .doc ali .docx).<br /> * Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 18 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava- 4 minute. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo vsak vsaj dve vprašanji.<br /> * En dan pred predstavitvijo oddajte končno verzijo doc. Gunčarju po e-mailu, v subject napišite TBK2012 in pripnite datoteko, ki ima ime v obliki TBK2012-Ime-Priimek.docx. Na dan predstavitve morate docentu oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.<br /> * Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dFM2SktfM3Q4VU1wNUQzdU45OTlWVXc6MA recenzentsko poročilo]] na spletu.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dEozRlMwVDh0NDBmSmd2VnV0TUwtVGc6MA mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> <br /> ==Faktor vpliva==<br /> Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&amp;base=JCR COBISS-u]. V polje &quot;Naslov revije&quot; vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&amp;source=web&amp;cd=6&amp;sqi=2&amp;ved=0CEUQFjAF&amp;url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&amp;rct=j&amp;q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&amp;ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&amp;usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&amp;sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&amp;cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).<br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO1-seminar-2012&diff=6882 2012-03-06T20:08:48Z

<p>AnaGrom: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>= Temelji biokemije- seminar =<br /> <br /> Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak ponedeljek od 10:00 do 11:30.<br /> <br /> Ocena seminarjev predstavlja ??% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> {| border=&quot;1&quot; cellpadding=&quot;4&quot; cellspacing=&quot;0&quot; style=&quot;border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;&quot; <br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Ime in priimek'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Naslov seminarja'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Link'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Rok za oddajo'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Rok za recenzijo'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum predstavitve'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 1'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 2'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 3'''<br /> |-<br /> | Ana Cirnski||TAL efektorji - proteini za urejanje genov||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/01/120105141141.htm povezava]||29.02.||02.03.||05.03.||Matej Prevc||Ana Grom||Erik Mršnik<br /> |-<br /> | Griša Prinčič||DNK nanoroboti||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120216144238.htm povezava]||29.02.||02.03.||05.03.||Katja Leben||Jernej Pušnik||Maja Kostanjevec<br /> |-<br /> | Bojana Lazović||Vloga prionov pri preživetju in razvoju kvasovk||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120215142817.htm povezava]||29.02.||02.03.||05.03.||Matic Urlep||Špela Tomaž||Sandra Zupančič<br /> |-<br /> | Vesna Radić||Odziv imunskega sistema z IFN-λ || [http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120209135106.htm povezava]||07.03.||09.03.||12.03.||Ana Grom||Katarina Tolar||Ana Cirnski<br /> |-<br /> | Julija Mazej||Pretvorba HDL v LDL preko CETP molekule||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120221165941.htm povezava]||07.03.||09.03.||12.03.||Aleksander Benčič||Mirana Krim Godler||Bojana Lazović<br /> |-<br /> | Matej Prevc||Moj naslov||povezava||07.03.||09.03.||12.03.||Jan Taškar||Zala Gluhić||Špela Tomaž<br /> |-<br /> | Erik Kristian Janežič||Študije golih krtovskih podgan ||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120223182512.htm povezava]||14.03.||16.03.||19.03.||Griša Prinčič||Rok Razpotnik||Matic Urlep<br /> |-<br /> | Ana Grom||Merjenje koncentracije sladkorja preko solz||[http://www.sciencedaily.com/releases/2011/11/111109111532.htm povezava]||14.03.||16.03.||19.03.||Matic Kovačič||Jan Taškar||Katja Leben<br /> |-<br /> | Robert Berger||Moj naslov||povezava||14.03.||16.03.||19.03.||Sara Bitenc||Rok Babič||Ajda Rojc<br /> |-<br /> | Filip Mihalič||Moj naslov||povezava||14.03.||16.03.||19.03.||Matej Vrhovnik||Dejan Marjanovič||Vesna Radić<br /> |-<br /> | Samo Zakotnik||Moj naslov||povezava||19.03.||22.03.||26.03.||Ana Kunšek||Tomaž Rozmarič||Ana Grom<br /> |-<br /> | Špela Tomaž||Moj naslov||povezava||19.03.||22.03.||26.03.||Erik Kristian Janežič||Matej Prevc||Rok Babič<br /> |-<br /> | Katarina Tolar||Moj naslov||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120227152819.htm povezava]||19.03.||22.03.||26.03.||Alenka Mikuž||Sara Bitenc||Monika Biasizzo<br /> |-<br /> | Zala Gluhić||Moj naslov||povezava||19.03.||22.03.||26.03.||Luka Krmpotić||Aleksander Benčič||Nastja Pirman<br /> |-<br /> | Veronika Furlan||Moj naslov||povezava||21.03.||26.03.||02.04.||Špela Tomaž||Katja Leben||Sara Bitenc<br /> |-<br /> | Nastja Pirman||Moj naslov||povezava||21.03.||26.03.||02.04.||Jernej Pušnik||Sandra Zupančič||Estera Merljak<br /> |-<br /> | Barbara Dušak||Moj naslov||povezava||21.03.||26.03.||02.04.||Rok Babič||Bojana Lazović||Rok Razpotnik<br /> |-<br /> | Rok Razpotnik||Mikrobna produkcija biogoriv||[http://www.sciencedaily.com/releases/2011/09/110927134254.htm povezava]||21.03.||26.03.||02.04.||Ajda Rojc||Veronika Furlan||Luka Krmpotić<br /> |-<br /> | Erik Mršnik||Moj naslov||povezava||04.04.||11.04.||16.04.||Ana Cirnski||Julija Mazej||Filip Mihalič<br /> |-<br /> | Matic Kovačič||Zakaj stres povzroča poškodbe DNA||[http://www.sciencedaily.com/releases/2011/08/110821141135.htm povezava]||04.04.||11.04.||16.04.||Bojana Lazović||Samo Zakotnik||Aleksander Benčič<br /> |-<br /> | Matej Vrhovnik||Moj naslov||povezava||04.04.||11.04.||16.04.||Mirana Krim Godler||Luka Krmpotić||Erik Kristian Janežič<br /> |-<br /> | Andreja Kukovec||Moj naslov||povezava||04.04.||11.04.||16.04.||Monika Biasizzo||Ellen Malovrh||Bojan Juloski<br /> |-<br /> | Rok Babič||Moj naslov||povezava||11.04.||16.04.||23.04.||Tomaž Rozmarič||Matej Vrhovnik||Ellen Malovrh<br /> |-<br /> | Sara Bitenc||Možganski parazit Toxoplasma gondii in njegov vpliv na &quot;možgansko kemijo&quot;||[http://www.sciencedaily.com/releases/2011/11/111104102125.htm povezava]||11.04.||16.04.||23.04.||Sandra Zupančič||Matic Urlep||Matic Kovačič<br /> |-<br /> | Jan Taškar||Pridobivanje elektrike s stratosferskimi bakterijami||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120221212614.htm povezava]||11.04.||16.04.||23.04.||Jakob Gašper Lavrenčič||Alenka Mikuž||Tomaž Rozmarič<br /> |-<br /> | Bojan Juloski||Moj naslov||povezava||11.04.||16.04.||23.04.||Erik Mršnik||Robert Berger||Katarina Tolar<br /> |-<br /> | Monika Biasizzo||Moj naslov||povezava||19.04.||26.04.||07.05.||Ellen Malovrh||Ajda Rojc||Alenka Mikuž<br /> |-<br /> | Katja Leben||Zdravljenje raka s siRNA in njena dostava do celice||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120216144238.htm povezava]||19.04.||26.04.||07.05.||Maja Kostanjevec||Matic Kovačič||Janez Meden<br /> |-<br /> | Maja Kostanjevec||Moj naslov||povezava||19.04.||26.04.||07.05.||Barbara Dušak||Jakob Gašper Lavrenčič||Matej Vrhovnik<br /> |-<br /> | Matic Urlep||Moj naslov||povezava||19.04.||26.04.||07.05.||Katarina Tolar||Vesna Radić||Mirjana Malnar<br /> |-<br /> | Tomaž Rozmarič||Moj naslov||povezava||26.04.||07.05.||14.05.||Veronika Furlan||Ana Kunšek||Andreja Kukovec<br /> |-<br /> | Mirjana Malnar||Moj naslov||povezava||26.04.||07.05.||14.05.||Janez Meden||Erik Kristian Janežič||Veronika Furlan<br /> |-<br /> | Luka Krmpotić||Moj naslov||povezava||26.04.||07.05.||14.05.||Vesna Radić||Monika Biasizzo||Ana Kunšek<br /> |-<br /> | Ellen Malovrh||Dolgoživi jedrni proteini in njihov vpliv na celično staranje||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120203180905.htm povezava]||26.04.||07.05.||14.05.||Julija Mazej||Janez Meden||Mirana Krim Godler<br /> |-<br /> | Aleksander Benčič||S1P1 receptorji in njihov vpliv na multiplo sklerozo ter ostale bolezni||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120216143957.htm povezava]||07.05.||14.05.||21.05.||Zala Gluhić||Griša Prinčič||Julija Mazej<br /> |-<br /> | Jakob Gašper Lavrenčič||Bio-sončne celice||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120202092246.htm]||07.05.||14.05.||21.05.||Dejan Marjanovič||Estera Merljak||Jernej Pušnik<br /> |-<br /> | Dejan Marjanovič||Moj naslov||povezava||07.05.||14.05.||21.05.||Rok Razpotnik||Erik Mršnik||Samo Zakotnik<br /> |-<br /> | Mirana Krim Godler||Moj naslov||povezava||07.05.||14.05.||21.05.||Samo Zakotnik||Nastja Pirman||Matej Prevc<br /> |-<br /> | Ana Kunšek||Moj naslov||povezava||14.05.||21.05.||28.05.||Estera Merljak||Mirjana Malnar||Jan Taškar<br /> |-<br /> | Sandra Zupančič||Moj naslov||povezava||14.05.||21.05.||28.05.||Filip Mihalič||Maja Kostanjevec||Zala Gluhić<br /> |-<br /> | Ajda Rojc||Moj naslov||povezava||14.05.||21.05.||28.05.||Mirjana Malnar||Barbara Dušak||Jakob Gašper Lavrenčič<br /> |-<br /> | Jernej Pušnik||Moj naslov||povezava||14.05.||21.05.||28.05.||Nastja Pirman||Andreja Kukovec||Griša Prinčič<br /> |-<br /> | Estera Merljak||Moj naslov||povezava||21.05.||28.05.||04.06.||Andreja Kukovec||Bojan Juloski||Barbara Dušak<br /> |-<br /> | Alenka Mikuž||Odkriti novi krvni skupini||[http://www.nature.com/ng/journal/v44/n2/abs/ng.1069.html povezava]||21.05.||28.05.||04.06.||Bojan Juloski||Ana Cirnski||Robert Berger<br /> |-<br /> | Janez Meden||Moj naslov||povezava||21.05.||28.05.||04.06.||Robert Berger||Filip Mihalič||Dejan Marjanovič<br /> |}<br /> <br /> ==Naloga==<br /> * samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2011. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka morate za seminar uporabiti še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino. <br /> * naslov izbrane teme in link do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo <br /> * [[BIO1 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom. <br /> * Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 1800 do 2000 besed), vsebovati mora najmanj eno sliko. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!<br /> * Seminar oddajte do roka za oddajo vsakemu od recenzentov (docentu ga pošljite po e-pošti v formatu .doc ali .docx).<br /> * Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 18 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava- 4 minute. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo vsak vsaj dve vprašanji.<br /> * En dan pred predstavitvijo oddajte končno verzijo doc. Gunčarju po e-mailu, v subject napišite TBK2012 in pripnite datoteko, ki ima ime v obliki TBK2012-Ime-Priimek.docx. Na dan predstavitve morate docentu oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.<br /> * Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dFM2SktfM3Q4VU1wNUQzdU45OTlWVXc6MA recenzentsko poročilo]] na spletu.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dEozRlMwVDh0NDBmSmd2VnV0TUwtVGc6MA mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> <br /> ==Faktor vpliva==<br /> Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&amp;base=JCR COBISS-u]. V polje &quot;Naslov revije&quot; vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&amp;source=web&amp;cd=6&amp;sqi=2&amp;ved=0CEUQFjAF&amp;url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&amp;rct=j&amp;q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&amp;ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&amp;usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&amp;sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&amp;cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).<br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

AnaGrom https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO1-seminar-2012&diff=6826 2012-02-26T17:06:41Z

<p>AnaGrom: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>= Temelji biokemije- seminar =<br /> <br /> Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak ponedeljek od 10:00 do 11:30.<br /> <br /> Ocena seminarjev predstavlja ??% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> {| border=&quot;1&quot; cellpadding=&quot;4&quot; cellspacing=&quot;0&quot; style=&quot;border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;&quot; <br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Ime in priimek'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Naslov seminarja'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Link'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Rok za oddajo'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Rok za recenzijo'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum predstavitve'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 1'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 2'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 3'''<br /> |-<br /> | Ana Cirnski||Struktura proteina za urejanje genov||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/01/120105175830.htm||29.02.||02.03.||05.03.||Matej Prevc||Ana Grom||Erik Mršnik<br /> |-<br /> | Griša Prinčič||DNK nanoroboti||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120216144238.htm povezava]||29.02.||02.03.||05.03.||Katja Leben||Jernej Pušnik||Maja Kostanjevec<br /> |-<br /> | Bojana Lazović||Vloga prionov pri preživetju in razvoju kvasovk||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120215142817.htm||29.02.||02.03.||05.03.||Matic Urlep||Špela Tomaž||Sandra Zupančič<br /> |-<br /> | Vesna Radić||Odziv imunskega sistema z IFN-λ || http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120209135106.htm||07.03.||09.03.||12.03.||Ana Grom||Katarina Tolar||Ana Cirnski<br /> |-<br /> | Julija Mazej||Pretvorba HDL v LDL preko CETP molekule||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120221165941.htm||07.03.||09.03.||12.03.||Aleksander Benčič||Mirana Krim Godler||Bojana Lazović<br /> |-<br /> | Matej Prevc||Moj naslov||povezava||07.03.||09.03.||12.03.||Jan Taškar||Zala Gluhić||Špela Tomaž<br /> |-<br /> | Erik Kristian Janežič||Moj naslov||povezava||14.03.||16.03.||19.03.||Griša Prinčič||Rok Razpotnik||Matej Vrhovnik<br /> |-<br /> | Ana Grom||Protein TFF3 in rak na dojkah||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120216094917.htm||14.03.||16.03.||19.03.||Matic Kovačič||Jan Taškar||Katja Leben<br /> |-<br /> | Robert Berger||Moj naslov||povezava||14.03.||16.03.||19.03.||Sara Bitenc||Rok Babič||Ajda Rojc<br /> |-<br /> | Filip Mihalič||Moj naslov||povezava||14.03.||16.03.||19.03.||Matej Vrhovnik||Dejan Marjanovič||Vesna Radić<br /> |-<br /> | Samo Zakotnik||Moj naslov||povezava||19.03.||22.03.||26.03.||Ana Kunšek||Tomaž Rozmarič||Ana Grom<br /> |-<br /> | Špela Tomaž||Moj naslov||povezava||19.03.||22.03.||26.03.||Erik Kristian Janežič||Matej Prevc||Rok Babič<br /> |-<br /> | Katarina Tolar||Moj naslov||povezava||19.03.||22.03.||26.03.||Alenka Mikuž||Sara Bitenc||Monika Biasizzo<br /> |-<br /> | Zala Gluhić||Moj naslov||povezava||19.03.||22.03.||26.03.||Luka Krmpotić||Aleksander Benčič||Nastja Pirman<br /> |-<br /> | Veronika Furlan||Moj naslov||povezava||21.03.||26.03.||02.04.||Špela Tomaž||Katja Leben||Sara Bitenc<br /> |-<br /> | Nastja Pirman||Moj naslov||povezava||21.03.||26.03.||02.04.||Jernej Pušnik||Sandra Zupančič||Estera Merljak<br /> |-<br /> | Barbara Dušak||Moj naslov||povezava||21.03.||26.03.||02.04.||Rok Babič||Bojana Lazović||Rok Razpotnik<br /> |-<br /> | Rok Razpotnik||Mikrobna produkcija biogoriv||http://www.sciencedaily.com/releases/2011/09/110927134254.htm||21.03.||26.03.||02.04.||Ajda Rojc||Veronika Furlan||Luka Krmpotić<br /> |-<br /> | Erik Mršnik||Moj naslov||povezava||04.04.||11.04.||16.04.||Ana Cirnski||Julija Mazej||Filip Mihalič<br /> |-<br /> | Matic Kovačič||Zakaj stres povzroča poškodbe DNA||[http://www.sciencedaily.com/releases/2011/08/110821141135.htm povezava]||04.04.||11.04.||16.04.||Bojana Lazović||Samo Zakotnik||Aleksander Benčič<br /> |-<br /> | Matej Vrhovnik||Moj naslov||povezava||04.04.||11.04.||16.04.||Mirana Krim Godler||Luka Krmpotić||Erik Kristian Janežič<br /> |-<br /> | Andreja Kukovec||Moj naslov||povezava||04.04.||11.04.||16.04.||Monika Biasizzo||Ellen Malovrh||Bojan Juloski<br /> |-<br /> | Rok Babič||Moj naslov||povezava||11.04.||16.04.||23.04.||Tomaž Rozmarič||Matej Vrhovnik||Ellen Malovrh<br /> |-<br /> | Sara Bitenc||Moj naslov||povezava||11.04.||16.04.||23.04.||Sandra Zupančič||Ajda Rojc||Matic Kovačič<br /> |-<br /> | Jan Taškar||Moj naslov||povezava||11.04.||16.04.||23.04.||Jakob Gašper Lavrenčič||Alenka Mikuž||Tomaž Rozmarič<br /> |-<br /> | Bojan Juloski||Moj naslov||povezava||11.04.||16.04.||23.04.||Erik Mršnik||Robert Berger||Katarina Tolar<br /> |-<br /> | Monika Biasizzo||Moj naslov||povezava||19.04.||26.04.||07.05.||Ellen Malovrh||Matic Urlep||Alenka Mikuž<br /> |-<br /> | Katja Leben||Moj naslov||povezava||19.04.||26.04.||07.05.||Maja Kostanjevec||Matic Kovačič||Janez Meden<br /> |-<br /> | Maja Kostanjevec||Moj naslov||povezava||19.04.||26.04.||07.05.||Barbara Dušak||Jakob Gašper Lavrenčič||Matic Urlep<br /> |-<br /> | Matic Urlep||Moj naslov||povezava||19.04.||26.04.||07.05.||Katarina Tolar||Vesna Radić||Mirjana Malnar<br /> |-<br /> | Tomaž Rozmarič||Moj naslov||povezava||26.04.||07.05.||14.05.||Veronika Furlan||Ana Kunšek||Andreja Kukovec<br /> |-<br /> | Mirjana Malnar||Moj naslov||povezava||26.04.||07.05.||14.05.||Janez Meden||Erik Kristian Janežič||Veronika Furlan<br /> |-<br /> | Luka Krmpotić||Moj naslov||povezava||26.04.||07.05.||14.05.||Vesna Radić||Monika Biasizzo||Ana Kunšek<br /> |-<br /> | Ellen Malovrh||Moj naslov||povezava||26.04.||07.05.||14.05.||Julija Mazej||Janez Meden||Mirana Krim Godler<br /> |-<br /> | Aleksander Benčič||Moj naslov||povezava||07.05.||14.05.||21.05.||Zala Gluhić||Griša Prinčič||Julija Mazej<br /> |-<br /> | Jakob Gašper Lavrenčič||Bio-sončne celice||[http://www.sciencedaily.com/releases/2012/02/120202092246.htm]||07.05.||14.05.||21.05.||Dejan Marjanovič||Estera Merljak||Jernej Pušnik<br /> |-<br /> | Dejan Marjanovič||Moj naslov||povezava||07.05.||14.05.||21.05.||Rok Razpotnik||Erik Mršnik||Samo Zakotnik<br /> |-<br /> | Mirana Krim Godler||Moj naslov||povezava||07.05.||14.05.||21.05.||Samo Zakotnik||Nastja Pirman||Matej Prevc<br /> |-<br /> | Ana Kunšek||Moj naslov||povezava||14.05.||21.05.||28.05.||Estera Merljak||Mirjana Malnar||Jan Taškar<br /> |-<br /> | Sandra Zupančič||Moj naslov||povezava||14.05.||21.05.||28.05.||Filip Mihalič||Maja Kostanjevec||Zala Gluhić<br /> |-<br /> | Ajda Rojc||Moj naslov||povezava||14.05.||21.05.||28.05.||Mirjana Malnar||Barbara Dušak||Jakob Gašper Lavrenčič<br /> |-<br /> | Jernej Pušnik||Moj naslov||povezava||14.05.||21.05.||28.05.||Nastja Pirman||Andreja Kukovec||Griša Prinčič<br /> |-<br /> | Estera Merljak||Moj naslov||povezava||21.05.||28.05.||04.06.||Andreja Kukovec||Bojan Juloski||Barbara Dušak<br /> |-<br /> | Alenka Mikuž||Moj naslov||povezava||21.05.||28.05.||04.06.||Bojan Juloski||Ana Cirnski||Robert Berger<br /> |-<br /> | Janez Meden||Moj naslov||povezava||21.05.||28.05.||04.06.||Robert Berger||Filip Mihalič||Dejan Marjanovič<br /> |}<br /> <br /> ==Naloga==<br /> * samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2011. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka morate za seminar uporabiti še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino. <br /> * naslov izbrane teme in link do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo <br /> * [[BIO1 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom. <br /> * Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 1800 do 2000 besed), vsebovati mora najmanj eno sliko. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!<br /> * Seminar oddajte do roka za oddajo vsakemu od recenzentov (docentu ga pošljite po e-pošti v formatu .doc ali .docx).<br /> * Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 15 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava- 7 minut. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo vsak vsaj dve vprašanji.<br /> * En dan pred predstavitvijo oddajte končno verzijo doc. Gunčarju po e-mailu, v subject napišite TB-seminar in pripnite datoteko, ki ima ime v obliki TB-2012-Ime-Priimek.docx. Na dan predstavitve morate docentu oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.<br /> * Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://spreadsheets.google.com/viewform?formkey=dFM2SktfM3Q4VU1wNUQzdU45OTlWVXc6MA recenzentsko poročilo]] na spletu.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://spreadsheets.google.com/viewform?formkey=dFd3TGhLV3ZSa2xsLVlmMVVUaEFURWc6MA mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> <br /> ==Faktor vpliva==<br /> Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&amp;base=JCR COBISS-u]. V polje &quot;Naslov revije&quot; vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&amp;source=web&amp;cd=6&amp;sqi=2&amp;ved=0CEUQFjAF&amp;url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&amp;rct=j&amp;q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&amp;ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&amp;usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&amp;sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&amp;cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).<br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

AnaGrom