https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=AnaKodra 2026-04-21T21:33:09Z User contributions MediaWiki 1.39.3 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Priprava_tumor_ciljajo%C4%8Dih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_du%C5%A1ikov(II)_oksid&diff=21828 2023-04-16T16:07:26Z

<p>AnaKodra: /* Zaključek */</p> <hr /> <div>Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']<br /> <br /> ==Uvod==<br /> V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu [1]. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO [2]. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju [3].<br /> <br /> ==Princip delovanja stikalnega sistema==<br /> Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.<br /> Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ&lt;sup&gt;54&lt;/sup&gt; podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno [4]. <br /> <br /> Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja [5]. <br /> <br /> Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P&lt;sub&gt;''norV''&lt;/sub&gt; iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja P&lt;sub&gt;''norV''&lt;/sub&gt;. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P&lt;sub&gt;''lacIq''&lt;/sub&gt;. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla reniformis'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo [3]. <br /> <br /> NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal [3].<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vitro''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Delovanje stikalnega sistema so najprej potrdili ''in vitro''. V ta namen so kot vir NO uporabili mešanico dietilentriamin/NO, ki so jo pri različnih koncentracijah dodali v gojišče. Transformirane bakerije so gojili 16 h pri 37°C, dodali substrat za Rluc8 in izmerili intenziteto bioluminiscence. Le-to so nato normirali glede na izmerjeno optično gostoto pri 600 nm in potrdili, da pri višjih koncentracijah NO dobljen signal narašča. Kot negativno kontrolo so uporabili bakterije, ki so jih transformirali samo s plazmidom pSRluc8. V tem primeru bioluminiscence niso zaznali niti pri najvišjih koncentracijah NO, kar pomeni, da do izražanje Rluc8 ni prišlo. To se je ujemalo s pričakovanji, saj bakterije niso vsebovale zapisa za FimE, ki bi lahko invertiral promotorsko zaporedje v ''fimS'' [3]. <br /> <br /> V nadaljevanju so želeli preveriti, ali je aktivacija stikalnega sistema ireverzibilna. V ta namen so bakterije čez noč gojili v gojišču z znano koncentracijo dietilentriamina/NO in jih nato naslednji dan prenesli v gojišče, kjer NO ni bil prisoten. V naslednjih 72 urah so odvzemali vzorce in merili intenziteto bioluminiscence ter jo ponovno normirali glede na OD600. Dobljen signal je bil približno 200-krat močnejši kot pri negativni kontroli. To je potrdilo, da je stikalni sistem ireverzibilno v aktivnem stanju tudi po izgubi stimulacije z NO. Poleg tega se aktivno stanje stikalnega sistema prenaša s celično delitvijo na hčerinske celice [3]. <br /> <br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vivo''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Za in vivo eksperimente so uporabili Balb/C miši, ki so jim v podkožje implantirali tumorske celice linije CT-26. Najprej so želeli preveriti, ali bakterije ''S''. Typhimurium, transformirane s plazmidoma pSRluc8 in pFimE, specifično kolonizirajo tumorje in sprožijo imunski odziv v miših. V miši so injicirali 1*10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; CFU bakterij in miši čez 1, 3, 5, 7 ali 11 dni evtanazirali. V izoliranih tumorjih so določili število bakterij ''S''. Typhimurium naredili primerjavo s tremi zdravimi organi (pljuča, vranica, jetra), ki so služili kot kontrola selektivnosti kolonizacije. Že prvi dan po injiciranju bakterij je bilo njihovo število v tumorjih približno 10 000-krat višje kot v kontrolnih organih. Z podaljševanjem časa med injiciranjem bakterij in evtanazijo miši je število bakterij v tumorju in kontrolnih organih padalo, vendar je bilo tudi na 11. dan v tumorju število bakterij višje [3]. <br /> <br /> Sprožitev imunskega odziva v miši so določali z merjenjem koncentracije provnetnih citokinov IFN-γ, TNF-α in IL-1β v tumorskem tkivu. V ta namen so uporabili test ELISA. Meritve so izvajali 1,3,5 in 7 dni po injiciranju bakterij. Kot negativno kontrolo so v miši injicirali PBS. Koncentracija TNF-α in IL-1β je bila višja kot pri negativni kontroli že po enem dnevu, medtem ko je bila koncentracija IFN-γ višja od negativne kontrole šele po treh dneh. S časom so koncentracije vseh treh citokinov padale, vendar so bile tudi na sedmi dan še vedno višje kot pri negativni kontroli [3]. <br /> <br /> Nato so želeli preveriti, ali je možno stikalni sistem uporabiti za tarčno ''in vivo'' dostavo genov na mesto tumorja. V ta namen so miši injicirali s plazmidoma pSRluc8 in pFimE ali zgolj z pSRluc8 (negativna kontrola). Pred meritvijo intenzitete bioluminiscence so mišim injicirali tudi koelenterazin. Intenziteta bioluminiscence na mestu tumorja je naraščala do sedmega dneva po injiciranju bakterij transformiranih z obema plazmidoma. Razlika v primerjavi z negativno kontrolo je bila v tem časovnem intervalu statistično signifikantna. To pomeni, da je stikalni sistem ostal aktiven oz. da je prišlo do izražanja reporterskega gena tudi, ko so koncentracije provnetnih citokinov že začele upadati [3].<br /> <br /> Nazadnje so želeli preveriti še, ali je NO v tumorskem mikrookolju posledica delovanja inducibilne NO sintaze. Tri dni pred injiciranjem bakterij, transformiranih z obema plazmidoma, so začeli mišim vsakodnevno intraperitonalno vnašati inhibitor iNOS, imenovan 1400W dihidroklorid. Inhibitor so vsakodnevno vnašali tudi po injiciranju bakterij. Kot kontrolo so uporabili miši, ki so jim injicirali bakterije, ne pa tudi inhibitorja. Bioluminiscenčni signal so merili 3, 5, 7 in 9 dni po injeciranju bakterij. Vse dni merjenja je bila ntenziteta bioluminiscence višja pri miših brez inhibitorja iNOS. S tem so potrdili, da je inducibilna NO sintaza sintetizirala NO, ki je aktiviral stikalni sistem [3].<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so v organizmu ''Salmonella enterica'' podvrsti ''enterica'' serotipu Typhimurioum zasnovali stikalni sistem, ki se odziva na NO. Funkcionalnost stikalnega sistema so potrdili ''in vitro'', kjer se je odzival na kemijski vir NO, ki je sprožil ireverzibilno aktivacijo stikalnega sistema. Aktivacija se je ohranila tudi po odvzemu NO iz gojišča, pri celični delitvi pa se je prenesla na hčerinske celice. ''In vivo'' so potrdili, da ''S''. Typhimurioum, ki nosijo zapis za stikalni sistem, specifično kolonizirajo tumorsko tkivo. Stikalni sistem se je v tem primeru specifično aktiviral z NO, ki ga je sintetizirala inducibilna NO sintaza. Rezultati raziskave namigujejo, da bi v prihodnosti lahko izkoristili NO kot inducer za tarčno dostavo genov oz. proteinov, ki jih zapisujejo, do mesta tumorjev. Na ta način se nam odpira možnost za razvoj novih dostavnih sistemov za zdravljenje raka [3].<br /> <br /> ==Viri==<br /> [1] M. T.-Q. Duong, Y. Qin, S.-H. You, J.-J. Min: Bacteria-Cancer Interactions: Bacteria-Based Cancer Therapy. Exp Mol Med 2019, 51, 1–15.<br /> <br /> [2] Q. Xue, Y. Yan, R. Zhang, H. Xiong: Regulation of INOS on Immune Cells and Its Role in Diseases. Int J Mol Sci 2018, 19, 3805.<br /> <br /> [3] Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.<br /> <br /> [4] A. M. Gardner, C. R. Gessner, P. R. Gardner: Regulation of the Nitric Oxide Reduction Operon (NorRVW) in Escherichia Coli. Journal of Biological Chemistry 2003, 278, 10081–10086.<br /> <br /> [5] W. R. Schwan: Regulation of Fim Genes in Uropathogenic Escherichia Coli. World J Clin Infect Dis 2011, 1, 17.</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Priprava_tumor_ciljajo%C4%8Dih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_du%C5%A1ikov(II)_oksid&diff=21827 2023-04-16T16:07:12Z

<p>AnaKodra: /* Viri */</p> <hr /> <div>Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']<br /> <br /> ==Uvod==<br /> V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu [1]. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO [2]. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju [3].<br /> <br /> ==Princip delovanja stikalnega sistema==<br /> Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.<br /> Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ&lt;sup&gt;54&lt;/sup&gt; podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno [4]. <br /> <br /> Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja [5]. <br /> <br /> Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P&lt;sub&gt;''norV''&lt;/sub&gt; iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja P&lt;sub&gt;''norV''&lt;/sub&gt;. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P&lt;sub&gt;''lacIq''&lt;/sub&gt;. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla reniformis'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo [3]. <br /> <br /> NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal [3].<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vitro''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Delovanje stikalnega sistema so najprej potrdili ''in vitro''. V ta namen so kot vir NO uporabili mešanico dietilentriamin/NO, ki so jo pri različnih koncentracijah dodali v gojišče. Transformirane bakerije so gojili 16 h pri 37°C, dodali substrat za Rluc8 in izmerili intenziteto bioluminiscence. Le-to so nato normirali glede na izmerjeno optično gostoto pri 600 nm in potrdili, da pri višjih koncentracijah NO dobljen signal narašča. Kot negativno kontrolo so uporabili bakterije, ki so jih transformirali samo s plazmidom pSRluc8. V tem primeru bioluminiscence niso zaznali niti pri najvišjih koncentracijah NO, kar pomeni, da do izražanje Rluc8 ni prišlo. To se je ujemalo s pričakovanji, saj bakterije niso vsebovale zapisa za FimE, ki bi lahko invertiral promotorsko zaporedje v ''fimS'' [3]. <br /> <br /> V nadaljevanju so želeli preveriti, ali je aktivacija stikalnega sistema ireverzibilna. V ta namen so bakterije čez noč gojili v gojišču z znano koncentracijo dietilentriamina/NO in jih nato naslednji dan prenesli v gojišče, kjer NO ni bil prisoten. V naslednjih 72 urah so odvzemali vzorce in merili intenziteto bioluminiscence ter jo ponovno normirali glede na OD600. Dobljen signal je bil približno 200-krat močnejši kot pri negativni kontroli. To je potrdilo, da je stikalni sistem ireverzibilno v aktivnem stanju tudi po izgubi stimulacije z NO. Poleg tega se aktivno stanje stikalnega sistema prenaša s celično delitvijo na hčerinske celice [3]. <br /> <br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vivo''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Za in vivo eksperimente so uporabili Balb/C miši, ki so jim v podkožje implantirali tumorske celice linije CT-26. Najprej so želeli preveriti, ali bakterije ''S''. Typhimurium, transformirane s plazmidoma pSRluc8 in pFimE, specifično kolonizirajo tumorje in sprožijo imunski odziv v miših. V miši so injicirali 1*10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; CFU bakterij in miši čez 1, 3, 5, 7 ali 11 dni evtanazirali. V izoliranih tumorjih so določili število bakterij ''S''. Typhimurium naredili primerjavo s tremi zdravimi organi (pljuča, vranica, jetra), ki so služili kot kontrola selektivnosti kolonizacije. Že prvi dan po injiciranju bakterij je bilo njihovo število v tumorjih približno 10 000-krat višje kot v kontrolnih organih. Z podaljševanjem časa med injiciranjem bakterij in evtanazijo miši je število bakterij v tumorju in kontrolnih organih padalo, vendar je bilo tudi na 11. dan v tumorju število bakterij višje [3]. <br /> <br /> Sprožitev imunskega odziva v miši so določali z merjenjem koncentracije provnetnih citokinov IFN-γ, TNF-α in IL-1β v tumorskem tkivu. V ta namen so uporabili test ELISA. Meritve so izvajali 1,3,5 in 7 dni po injiciranju bakterij. Kot negativno kontrolo so v miši injicirali PBS. Koncentracija TNF-α in IL-1β je bila višja kot pri negativni kontroli že po enem dnevu, medtem ko je bila koncentracija IFN-γ višja od negativne kontrole šele po treh dneh. S časom so koncentracije vseh treh citokinov padale, vendar so bile tudi na sedmi dan še vedno višje kot pri negativni kontroli [3]. <br /> <br /> Nato so želeli preveriti, ali je možno stikalni sistem uporabiti za tarčno ''in vivo'' dostavo genov na mesto tumorja. V ta namen so miši injicirali s plazmidoma pSRluc8 in pFimE ali zgolj z pSRluc8 (negativna kontrola). Pred meritvijo intenzitete bioluminiscence so mišim injicirali tudi koelenterazin. Intenziteta bioluminiscence na mestu tumorja je naraščala do sedmega dneva po injiciranju bakterij transformiranih z obema plazmidoma. Razlika v primerjavi z negativno kontrolo je bila v tem časovnem intervalu statistično signifikantna. To pomeni, da je stikalni sistem ostal aktiven oz. da je prišlo do izražanja reporterskega gena tudi, ko so koncentracije provnetnih citokinov že začele upadati [3].<br /> <br /> Nazadnje so želeli preveriti še, ali je NO v tumorskem mikrookolju posledica delovanja inducibilne NO sintaze. Tri dni pred injiciranjem bakterij, transformiranih z obema plazmidoma, so začeli mišim vsakodnevno intraperitonalno vnašati inhibitor iNOS, imenovan 1400W dihidroklorid. Inhibitor so vsakodnevno vnašali tudi po injiciranju bakterij. Kot kontrolo so uporabili miši, ki so jim injicirali bakterije, ne pa tudi inhibitorja. Bioluminiscenčni signal so merili 3, 5, 7 in 9 dni po injeciranju bakterij. Vse dni merjenja je bila ntenziteta bioluminiscence višja pri miših brez inhibitorja iNOS. S tem so potrdili, da je inducibilna NO sintaza sintetizirala NO, ki je aktiviral stikalni sistem [3].<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so v organizmu ''Salmonella enterica'' podvrsti ''enterica'' serotipu Typhimurioum zasnovali stikalni sistem, ki se odziva na NO. Funkcionalnost stikalnega sistema so potrdili ''in vitro'', kjer se je odzival na kemijski vir NO, ki je sprožil ireverzibilno aktivacijo stikalnega sistema. Aktivacija se je ohranila tudi po odvzemu NO iz gojišča, pri celični delitvi pa se je prenesla na hčerinske celice. ''In vivo'' so potrdili, da ''S''. Typhimurioum, ki nosijo zapis za stikalni sistem, specifično kolonizirajo tumorsko tkivo. Stikalni sistem se je v tem primeru specifično aktiviral z NO, ki ga je sintetizirala inducibilna NO sintaza. Rezultati raziskave namigujejo, da bi v prihodnosti lahko izkoristili NO kot inducer za tarčno dostavo genov oz. proteinov, ki jih zapisujejo, do mesta tumorjev. Na ta način se nam odpira možnost za razvoj novih dostavnih sistemov za zdravljenje raka.<br /> <br /> ==Viri==<br /> [1] M. T.-Q. Duong, Y. Qin, S.-H. You, J.-J. Min: Bacteria-Cancer Interactions: Bacteria-Based Cancer Therapy. Exp Mol Med 2019, 51, 1–15.<br /> <br /> [2] Q. Xue, Y. Yan, R. Zhang, H. Xiong: Regulation of INOS on Immune Cells and Its Role in Diseases. Int J Mol Sci 2018, 19, 3805.<br /> <br /> [3] Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.<br /> <br /> [4] A. M. Gardner, C. R. Gessner, P. R. Gardner: Regulation of the Nitric Oxide Reduction Operon (NorRVW) in Escherichia Coli. Journal of Biological Chemistry 2003, 278, 10081–10086.<br /> <br /> [5] W. R. Schwan: Regulation of Fim Genes in Uropathogenic Escherichia Coli. World J Clin Infect Dis 2011, 1, 17.</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Priprava_tumor_ciljajo%C4%8Dih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_du%C5%A1ikov(II)_oksid&diff=21826 2023-04-16T16:06:38Z

<p>AnaKodra: /* Rezultati */</p> <hr /> <div>Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']<br /> <br /> ==Uvod==<br /> V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu [1]. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO [2]. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju [3].<br /> <br /> ==Princip delovanja stikalnega sistema==<br /> Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.<br /> Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ&lt;sup&gt;54&lt;/sup&gt; podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno [4]. <br /> <br /> Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja [5]. <br /> <br /> Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P&lt;sub&gt;''norV''&lt;/sub&gt; iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja P&lt;sub&gt;''norV''&lt;/sub&gt;. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P&lt;sub&gt;''lacIq''&lt;/sub&gt;. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla reniformis'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo [3]. <br /> <br /> NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal [3].<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vitro''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Delovanje stikalnega sistema so najprej potrdili ''in vitro''. V ta namen so kot vir NO uporabili mešanico dietilentriamin/NO, ki so jo pri različnih koncentracijah dodali v gojišče. Transformirane bakerije so gojili 16 h pri 37°C, dodali substrat za Rluc8 in izmerili intenziteto bioluminiscence. Le-to so nato normirali glede na izmerjeno optično gostoto pri 600 nm in potrdili, da pri višjih koncentracijah NO dobljen signal narašča. Kot negativno kontrolo so uporabili bakterije, ki so jih transformirali samo s plazmidom pSRluc8. V tem primeru bioluminiscence niso zaznali niti pri najvišjih koncentracijah NO, kar pomeni, da do izražanje Rluc8 ni prišlo. To se je ujemalo s pričakovanji, saj bakterije niso vsebovale zapisa za FimE, ki bi lahko invertiral promotorsko zaporedje v ''fimS'' [3]. <br /> <br /> V nadaljevanju so želeli preveriti, ali je aktivacija stikalnega sistema ireverzibilna. V ta namen so bakterije čez noč gojili v gojišču z znano koncentracijo dietilentriamina/NO in jih nato naslednji dan prenesli v gojišče, kjer NO ni bil prisoten. V naslednjih 72 urah so odvzemali vzorce in merili intenziteto bioluminiscence ter jo ponovno normirali glede na OD600. Dobljen signal je bil približno 200-krat močnejši kot pri negativni kontroli. To je potrdilo, da je stikalni sistem ireverzibilno v aktivnem stanju tudi po izgubi stimulacije z NO. Poleg tega se aktivno stanje stikalnega sistema prenaša s celično delitvijo na hčerinske celice [3]. <br /> <br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vivo''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Za in vivo eksperimente so uporabili Balb/C miši, ki so jim v podkožje implantirali tumorske celice linije CT-26. Najprej so želeli preveriti, ali bakterije ''S''. Typhimurium, transformirane s plazmidoma pSRluc8 in pFimE, specifično kolonizirajo tumorje in sprožijo imunski odziv v miših. V miši so injicirali 1*10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; CFU bakterij in miši čez 1, 3, 5, 7 ali 11 dni evtanazirali. V izoliranih tumorjih so določili število bakterij ''S''. Typhimurium naredili primerjavo s tremi zdravimi organi (pljuča, vranica, jetra), ki so služili kot kontrola selektivnosti kolonizacije. Že prvi dan po injiciranju bakterij je bilo njihovo število v tumorjih približno 10 000-krat višje kot v kontrolnih organih. Z podaljševanjem časa med injiciranjem bakterij in evtanazijo miši je število bakterij v tumorju in kontrolnih organih padalo, vendar je bilo tudi na 11. dan v tumorju število bakterij višje [3]. <br /> <br /> Sprožitev imunskega odziva v miši so določali z merjenjem koncentracije provnetnih citokinov IFN-γ, TNF-α in IL-1β v tumorskem tkivu. V ta namen so uporabili test ELISA. Meritve so izvajali 1,3,5 in 7 dni po injiciranju bakterij. Kot negativno kontrolo so v miši injicirali PBS. Koncentracija TNF-α in IL-1β je bila višja kot pri negativni kontroli že po enem dnevu, medtem ko je bila koncentracija IFN-γ višja od negativne kontrole šele po treh dneh. S časom so koncentracije vseh treh citokinov padale, vendar so bile tudi na sedmi dan še vedno višje kot pri negativni kontroli [3]. <br /> <br /> Nato so želeli preveriti, ali je možno stikalni sistem uporabiti za tarčno ''in vivo'' dostavo genov na mesto tumorja. V ta namen so miši injicirali s plazmidoma pSRluc8 in pFimE ali zgolj z pSRluc8 (negativna kontrola). Pred meritvijo intenzitete bioluminiscence so mišim injicirali tudi koelenterazin. Intenziteta bioluminiscence na mestu tumorja je naraščala do sedmega dneva po injiciranju bakterij transformiranih z obema plazmidoma. Razlika v primerjavi z negativno kontrolo je bila v tem časovnem intervalu statistično signifikantna. To pomeni, da je stikalni sistem ostal aktiven oz. da je prišlo do izražanja reporterskega gena tudi, ko so koncentracije provnetnih citokinov že začele upadati [3].<br /> <br /> Nazadnje so želeli preveriti še, ali je NO v tumorskem mikrookolju posledica delovanja inducibilne NO sintaze. Tri dni pred injiciranjem bakterij, transformiranih z obema plazmidoma, so začeli mišim vsakodnevno intraperitonalno vnašati inhibitor iNOS, imenovan 1400W dihidroklorid. Inhibitor so vsakodnevno vnašali tudi po injiciranju bakterij. Kot kontrolo so uporabili miši, ki so jim injicirali bakterije, ne pa tudi inhibitorja. Bioluminiscenčni signal so merili 3, 5, 7 in 9 dni po injeciranju bakterij. Vse dni merjenja je bila ntenziteta bioluminiscence višja pri miših brez inhibitorja iNOS. S tem so potrdili, da je inducibilna NO sintaza sintetizirala NO, ki je aktiviral stikalni sistem [3].<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so v organizmu ''Salmonella enterica'' podvrsti ''enterica'' serotipu Typhimurioum zasnovali stikalni sistem, ki se odziva na NO. Funkcionalnost stikalnega sistema so potrdili ''in vitro'', kjer se je odzival na kemijski vir NO, ki je sprožil ireverzibilno aktivacijo stikalnega sistema. Aktivacija se je ohranila tudi po odvzemu NO iz gojišča, pri celični delitvi pa se je prenesla na hčerinske celice. ''In vivo'' so potrdili, da ''S''. Typhimurioum, ki nosijo zapis za stikalni sistem, specifično kolonizirajo tumorsko tkivo. Stikalni sistem se je v tem primeru specifično aktiviral z NO, ki ga je sintetizirala inducibilna NO sintaza. Rezultati raziskave namigujejo, da bi v prihodnosti lahko izkoristili NO kot inducer za tarčno dostavo genov oz. proteinov, ki jih zapisujejo, do mesta tumorjev. Na ta način se nam odpira možnost za razvoj novih dostavnih sistemov za zdravljenje raka.<br /> <br /> ==Viri==<br /> [1] Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.<br /> <br /> [2] M. T.-Q. Duong, Y. Qin, S.-H. You, J.-J. Min: Bacteria-Cancer Interactions: Bacteria-Based Cancer Therapy. Exp Mol Med 2019, 51, 1–15.<br /> <br /> [3] Q. Xue, Y. Yan, R. Zhang, H. Xiong: Regulation of INOS on Immune Cells and Its Role in Diseases. Int J Mol Sci 2018, 19, 3805.<br /> <br /> [4] A. M. Gardner, C. R. Gessner, P. R. Gardner: Regulation of the Nitric Oxide Reduction Operon (NorRVW) in Escherichia Coli. Journal of Biological Chemistry 2003, 278, 10081–10086.<br /> <br /> [5] W. R. Schwan: Regulation of Fim Genes in Uropathogenic Escherichia Coli. World J Clin Infect Dis 2011, 1, 17.</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Priprava_tumor_ciljajo%C4%8Dih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_du%C5%A1ikov(II)_oksid&diff=21825 2023-04-16T16:06:01Z

<p>AnaKodra: /* Princip delovanja stikalnega sistema */</p> <hr /> <div>Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']<br /> <br /> ==Uvod==<br /> V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu [1]. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO [2]. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju [3].<br /> <br /> ==Princip delovanja stikalnega sistema==<br /> Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.<br /> Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ&lt;sup&gt;54&lt;/sup&gt; podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno [4]. <br /> <br /> Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja [5]. <br /> <br /> Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P&lt;sub&gt;''norV''&lt;/sub&gt; iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja P&lt;sub&gt;''norV''&lt;/sub&gt;. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P&lt;sub&gt;''lacIq''&lt;/sub&gt;. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla reniformis'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo [3]. <br /> <br /> NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal [3].<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vitro''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Delovanje stikalnega sistema so najprej potrdili ''in vitro''. V ta namen so kot vir NO uporabili mešanico dietilentriamin/NO, ki so jo pri različnih koncentracijah dodali v gojišče. Transformirane bakerije so gojili 16 h pri 37°C, dodali substrat za Rluc8 in izmerili intenziteto bioluminiscence. Le-to so nato normirali glede na izmerjeno optično gostoto pri 600 nm in potrdili, da pri višjih koncentracijah NO dobljen signal narašča. Kot negativno kontrolo so uporabili bakterije, ki so jih transformirali samo s plazmidom pSRluc8. V tem primeru bioluminiscence niso zaznali niti pri najvišjih koncentracijah NO, kar pomeni, da do izražanje Rluc8 ni prišlo. To se je ujemalo s pričakovanji, saj bakterije niso vsebovale zapisa za FimE, ki bi lahko invertiral promotorsko zaporedje v ''fimS''. <br /> <br /> V nadaljevanju so želeli preveriti, ali je aktivacija stikalnega sistema ireverzibilna. V ta namen so bakterije čez noč gojili v gojišču z znano koncentracijo dietilentriamina/NO in jih nato naslednji dan prenesli v gojišče, kjer NO ni bil prisoten. V naslednjih 72 urah so odvzemali vzorce in merili intenziteto bioluminiscence ter jo ponovno normirali glede na OD600. Dobljen signal je bil približno 200-krat močnejši kot pri negativni kontroli. To je potrdilo, da je stikalni sistem ireverzibilno v aktivnem stanju tudi po izgubi stimulacije z NO. Poleg tega se aktivno stanje stikalnega sistema prenaša s celično delitvijo na hčerinske celice. <br /> <br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vivo''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Za in vivo eksperimente so uporabili Balb/C miši, ki so jim v podkožje implantirali tumorske celice linije CT-26. Najprej so želeli preveriti, ali bakterije ''S''. Typhimurium, transformirane s plazmidoma pSRluc8 in pFimE, specifično kolonizirajo tumorje in sprožijo imunski odziv v miših. V miši so injicirali 1*10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; CFU bakterij in miši čez 1, 3, 5, 7 ali 11 dni evtanazirali. V izoliranih tumorjih so določili število bakterij ''S''. Typhimurium naredili primerjavo s tremi zdravimi organi (pljuča, vranica, jetra), ki so služili kot kontrola selektivnosti kolonizacije. Že prvi dan po injiciranju bakterij je bilo njihovo število v tumorjih približno 10 000-krat višje kot v kontrolnih organih. Z podaljševanjem časa med injiciranjem bakterij in evtanazijo miši je število bakterij v tumorju in kontrolnih organih padalo, vendar je bilo tudi na 11. dan v tumorju število bakterij višje. <br /> <br /> Sprožitev imunskega odziva v miši so določali z merjenjem koncentracije provnetnih citokinov IFN-γ, TNF-α in IL-1β v tumorskem tkivu. V ta namen so uporabili test ELISA. Meritve so izvajali 1,3,5 in 7 dni po injiciranju bakterij. Kot negativno kontrolo so v miši injicirali PBS. Koncentracija TNF-α in IL-1β je bila višja kot pri negativni kontroli že po enem dnevu, medtem ko je bila koncentracija IFN-γ višja od negativne kontrole šele po treh dneh. S časom so koncentracije vseh treh citokinov padale, vendar so bile tudi na sedmi dan še vedno višje kot pri negativni kontroli. <br /> <br /> Nato so želeli preveriti, ali je možno stikalni sistem uporabiti za tarčno ''in vivo'' dostavo genov na mesto tumorja. V ta namen so miši injicirali s plazmidoma pSRluc8 in pFimE ali zgolj z pSRluc8 (negativna kontrola). Pred meritvijo intenzitete bioluminiscence so mišim injicirali tudi koelenterazin. Intenziteta bioluminiscence na mestu tumorja je naraščala do sedmega dneva po injiciranju bakterij transformiranih z obema plazmidoma. Razlika v primerjavi z negativno kontrolo je bila v tem časovnem intervalu statistično signifikantna. To pomeni, da je stikalni sistem ostal aktiven oz. da je prišlo do izražanja reporterskega gena tudi, ko so koncentracije provnetnih citokinov že začele upadati.<br /> <br /> Nazadnje so želeli preveriti še, ali je NO v tumorskem mikrookolju posledica delovanja inducibilne NO sintaze. Tri dni pred injiciranjem bakterij, transformiranih z obema plazmidoma, so začeli mišim vsakodnevno intraperitonalno vnašati inhibitor iNOS, imenovan 1400W dihidroklorid. Inhibitor so vsakodnevno vnašali tudi po injiciranju bakterij. Kot kontrolo so uporabili miši, ki so jim injicirali bakterije, ne pa tudi inhibitorja. Bioluminiscenčni signal so merili 3, 5, 7 in 9 dni po injeciranju bakterij. Vse dni merjenja je bila ntenziteta bioluminiscence višja pri miših brez inhibitorja iNOS. S tem so potrdili, da je inducibilna NO sintaza sintetizirala NO, ki je aktiviral stikalni sistem.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so v organizmu ''Salmonella enterica'' podvrsti ''enterica'' serotipu Typhimurioum zasnovali stikalni sistem, ki se odziva na NO. Funkcionalnost stikalnega sistema so potrdili ''in vitro'', kjer se je odzival na kemijski vir NO, ki je sprožil ireverzibilno aktivacijo stikalnega sistema. Aktivacija se je ohranila tudi po odvzemu NO iz gojišča, pri celični delitvi pa se je prenesla na hčerinske celice. ''In vivo'' so potrdili, da ''S''. Typhimurioum, ki nosijo zapis za stikalni sistem, specifično kolonizirajo tumorsko tkivo. Stikalni sistem se je v tem primeru specifično aktiviral z NO, ki ga je sintetizirala inducibilna NO sintaza. Rezultati raziskave namigujejo, da bi v prihodnosti lahko izkoristili NO kot inducer za tarčno dostavo genov oz. proteinov, ki jih zapisujejo, do mesta tumorjev. Na ta način se nam odpira možnost za razvoj novih dostavnih sistemov za zdravljenje raka.<br /> <br /> ==Viri==<br /> [1] Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.<br /> <br /> [2] M. T.-Q. Duong, Y. Qin, S.-H. You, J.-J. Min: Bacteria-Cancer Interactions: Bacteria-Based Cancer Therapy. Exp Mol Med 2019, 51, 1–15.<br /> <br /> [3] Q. Xue, Y. Yan, R. Zhang, H. Xiong: Regulation of INOS on Immune Cells and Its Role in Diseases. Int J Mol Sci 2018, 19, 3805.<br /> <br /> [4] A. M. Gardner, C. R. Gessner, P. R. Gardner: Regulation of the Nitric Oxide Reduction Operon (NorRVW) in Escherichia Coli. Journal of Biological Chemistry 2003, 278, 10081–10086.<br /> <br /> [5] W. R. Schwan: Regulation of Fim Genes in Uropathogenic Escherichia Coli. World J Clin Infect Dis 2011, 1, 17.</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Priprava_tumor_ciljajo%C4%8Dih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_du%C5%A1ikov(II)_oksid&diff=21824 2023-04-16T16:05:26Z

<p>AnaKodra: /* Uvod */</p> <hr /> <div>Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']<br /> <br /> ==Uvod==<br /> V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu [1]. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO [2]. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju [3].<br /> <br /> ==Princip delovanja stikalnega sistema==<br /> Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.<br /> Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ&lt;sup&gt;54&lt;/sup&gt; podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno. <br /> <br /> Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja. <br /> <br /> Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P&lt;sub&gt;''norV''&lt;/sub&gt; iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja P&lt;sub&gt;''norV''&lt;/sub&gt;. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P&lt;sub&gt;''lacIq''&lt;/sub&gt;. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla reniformis'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo. <br /> <br /> NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vitro''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Delovanje stikalnega sistema so najprej potrdili ''in vitro''. V ta namen so kot vir NO uporabili mešanico dietilentriamin/NO, ki so jo pri različnih koncentracijah dodali v gojišče. Transformirane bakerije so gojili 16 h pri 37°C, dodali substrat za Rluc8 in izmerili intenziteto bioluminiscence. Le-to so nato normirali glede na izmerjeno optično gostoto pri 600 nm in potrdili, da pri višjih koncentracijah NO dobljen signal narašča. Kot negativno kontrolo so uporabili bakterije, ki so jih transformirali samo s plazmidom pSRluc8. V tem primeru bioluminiscence niso zaznali niti pri najvišjih koncentracijah NO, kar pomeni, da do izražanje Rluc8 ni prišlo. To se je ujemalo s pričakovanji, saj bakterije niso vsebovale zapisa za FimE, ki bi lahko invertiral promotorsko zaporedje v ''fimS''. <br /> <br /> V nadaljevanju so želeli preveriti, ali je aktivacija stikalnega sistema ireverzibilna. V ta namen so bakterije čez noč gojili v gojišču z znano koncentracijo dietilentriamina/NO in jih nato naslednji dan prenesli v gojišče, kjer NO ni bil prisoten. V naslednjih 72 urah so odvzemali vzorce in merili intenziteto bioluminiscence ter jo ponovno normirali glede na OD600. Dobljen signal je bil približno 200-krat močnejši kot pri negativni kontroli. To je potrdilo, da je stikalni sistem ireverzibilno v aktivnem stanju tudi po izgubi stimulacije z NO. Poleg tega se aktivno stanje stikalnega sistema prenaša s celično delitvijo na hčerinske celice. <br /> <br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vivo''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Za in vivo eksperimente so uporabili Balb/C miši, ki so jim v podkožje implantirali tumorske celice linije CT-26. Najprej so želeli preveriti, ali bakterije ''S''. Typhimurium, transformirane s plazmidoma pSRluc8 in pFimE, specifično kolonizirajo tumorje in sprožijo imunski odziv v miših. V miši so injicirali 1*10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; CFU bakterij in miši čez 1, 3, 5, 7 ali 11 dni evtanazirali. V izoliranih tumorjih so določili število bakterij ''S''. Typhimurium naredili primerjavo s tremi zdravimi organi (pljuča, vranica, jetra), ki so služili kot kontrola selektivnosti kolonizacije. Že prvi dan po injiciranju bakterij je bilo njihovo število v tumorjih približno 10 000-krat višje kot v kontrolnih organih. Z podaljševanjem časa med injiciranjem bakterij in evtanazijo miši je število bakterij v tumorju in kontrolnih organih padalo, vendar je bilo tudi na 11. dan v tumorju število bakterij višje. <br /> <br /> Sprožitev imunskega odziva v miši so določali z merjenjem koncentracije provnetnih citokinov IFN-γ, TNF-α in IL-1β v tumorskem tkivu. V ta namen so uporabili test ELISA. Meritve so izvajali 1,3,5 in 7 dni po injiciranju bakterij. Kot negativno kontrolo so v miši injicirali PBS. Koncentracija TNF-α in IL-1β je bila višja kot pri negativni kontroli že po enem dnevu, medtem ko je bila koncentracija IFN-γ višja od negativne kontrole šele po treh dneh. S časom so koncentracije vseh treh citokinov padale, vendar so bile tudi na sedmi dan še vedno višje kot pri negativni kontroli. <br /> <br /> Nato so želeli preveriti, ali je možno stikalni sistem uporabiti za tarčno ''in vivo'' dostavo genov na mesto tumorja. V ta namen so miši injicirali s plazmidoma pSRluc8 in pFimE ali zgolj z pSRluc8 (negativna kontrola). Pred meritvijo intenzitete bioluminiscence so mišim injicirali tudi koelenterazin. Intenziteta bioluminiscence na mestu tumorja je naraščala do sedmega dneva po injiciranju bakterij transformiranih z obema plazmidoma. Razlika v primerjavi z negativno kontrolo je bila v tem časovnem intervalu statistično signifikantna. To pomeni, da je stikalni sistem ostal aktiven oz. da je prišlo do izražanja reporterskega gena tudi, ko so koncentracije provnetnih citokinov že začele upadati.<br /> <br /> Nazadnje so želeli preveriti še, ali je NO v tumorskem mikrookolju posledica delovanja inducibilne NO sintaze. Tri dni pred injiciranjem bakterij, transformiranih z obema plazmidoma, so začeli mišim vsakodnevno intraperitonalno vnašati inhibitor iNOS, imenovan 1400W dihidroklorid. Inhibitor so vsakodnevno vnašali tudi po injiciranju bakterij. Kot kontrolo so uporabili miši, ki so jim injicirali bakterije, ne pa tudi inhibitorja. Bioluminiscenčni signal so merili 3, 5, 7 in 9 dni po injeciranju bakterij. Vse dni merjenja je bila ntenziteta bioluminiscence višja pri miših brez inhibitorja iNOS. S tem so potrdili, da je inducibilna NO sintaza sintetizirala NO, ki je aktiviral stikalni sistem.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so v organizmu ''Salmonella enterica'' podvrsti ''enterica'' serotipu Typhimurioum zasnovali stikalni sistem, ki se odziva na NO. Funkcionalnost stikalnega sistema so potrdili ''in vitro'', kjer se je odzival na kemijski vir NO, ki je sprožil ireverzibilno aktivacijo stikalnega sistema. Aktivacija se je ohranila tudi po odvzemu NO iz gojišča, pri celični delitvi pa se je prenesla na hčerinske celice. ''In vivo'' so potrdili, da ''S''. Typhimurioum, ki nosijo zapis za stikalni sistem, specifično kolonizirajo tumorsko tkivo. Stikalni sistem se je v tem primeru specifično aktiviral z NO, ki ga je sintetizirala inducibilna NO sintaza. Rezultati raziskave namigujejo, da bi v prihodnosti lahko izkoristili NO kot inducer za tarčno dostavo genov oz. proteinov, ki jih zapisujejo, do mesta tumorjev. Na ta način se nam odpira možnost za razvoj novih dostavnih sistemov za zdravljenje raka.<br /> <br /> ==Viri==<br /> [1] Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.<br /> <br /> [2] M. T.-Q. Duong, Y. Qin, S.-H. You, J.-J. Min: Bacteria-Cancer Interactions: Bacteria-Based Cancer Therapy. Exp Mol Med 2019, 51, 1–15.<br /> <br /> [3] Q. Xue, Y. Yan, R. Zhang, H. Xiong: Regulation of INOS on Immune Cells and Its Role in Diseases. Int J Mol Sci 2018, 19, 3805.<br /> <br /> [4] A. M. Gardner, C. R. Gessner, P. R. Gardner: Regulation of the Nitric Oxide Reduction Operon (NorRVW) in Escherichia Coli. Journal of Biological Chemistry 2003, 278, 10081–10086.<br /> <br /> [5] W. R. Schwan: Regulation of Fim Genes in Uropathogenic Escherichia Coli. World J Clin Infect Dis 2011, 1, 17.</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Priprava_tumor_ciljajo%C4%8Dih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_du%C5%A1ikov(II)_oksid&diff=21823 2023-04-15T19:30:49Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']<br /> <br /> ==Uvod==<br /> V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju.<br /> <br /> ==Princip delovanja stikalnega sistema==<br /> Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.<br /> Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ&lt;sup&gt;54&lt;/sup&gt; podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno. <br /> <br /> Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja. <br /> <br /> Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P&lt;sub&gt;''norV''&lt;/sub&gt; iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja P&lt;sub&gt;''norV''&lt;/sub&gt;. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P&lt;sub&gt;''lacIq''&lt;/sub&gt;. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla reniformis'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo. <br /> <br /> NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vitro''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Delovanje stikalnega sistema so najprej potrdili ''in vitro''. V ta namen so kot vir NO uporabili mešanico dietilentriamin/NO, ki so jo pri različnih koncentracijah dodali v gojišče. Transformirane bakerije so gojili 16 h pri 37°C, dodali substrat za Rluc8 in izmerili intenziteto bioluminiscence. Le-to so nato normirali glede na izmerjeno optično gostoto pri 600 nm in potrdili, da pri višjih koncentracijah NO dobljen signal narašča. Kot negativno kontrolo so uporabili bakterije, ki so jih transformirali samo s plazmidom pSRluc8. V tem primeru bioluminiscence niso zaznali niti pri najvišjih koncentracijah NO, kar pomeni, da do izražanje Rluc8 ni prišlo. To se je ujemalo s pričakovanji, saj bakterije niso vsebovale zapisa za FimE, ki bi lahko invertiral promotorsko zaporedje v ''fimS''. <br /> <br /> V nadaljevanju so želeli preveriti, ali je aktivacija stikalnega sistema ireverzibilna. V ta namen so bakterije čez noč gojili v gojišču z znano koncentracijo dietilentriamina/NO in jih nato naslednji dan prenesli v gojišče, kjer NO ni bil prisoten. V naslednjih 72 urah so odvzemali vzorce in merili intenziteto bioluminiscence ter jo ponovno normirali glede na OD600. Dobljen signal je bil približno 200-krat močnejši kot pri negativni kontroli. To je potrdilo, da je stikalni sistem ireverzibilno v aktivnem stanju tudi po izgubi stimulacije z NO. Poleg tega se aktivno stanje stikalnega sistema prenaša s celično delitvijo na hčerinske celice. <br /> <br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vivo''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Za in vivo eksperimente so uporabili Balb/C miši, ki so jim v podkožje implantirali tumorske celice linije CT-26. Najprej so želeli preveriti, ali bakterije ''S''. Typhimurium, transformirane s plazmidoma pSRluc8 in pFimE, specifično kolonizirajo tumorje in sprožijo imunski odziv v miših. V miši so injicirali 1*10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; CFU bakterij in miši čez 1, 3, 5, 7 ali 11 dni evtanazirali. V izoliranih tumorjih so določili število bakterij ''S''. Typhimurium naredili primerjavo s tremi zdravimi organi (pljuča, vranica, jetra), ki so služili kot kontrola selektivnosti kolonizacije. Že prvi dan po injiciranju bakterij je bilo njihovo število v tumorjih približno 10 000-krat višje kot v kontrolnih organih. Z podaljševanjem časa med injiciranjem bakterij in evtanazijo miši je število bakterij v tumorju in kontrolnih organih padalo, vendar je bilo tudi na 11. dan v tumorju število bakterij višje. <br /> <br /> Sprožitev imunskega odziva v miši so določali z merjenjem koncentracije provnetnih citokinov IFN-γ, TNF-α in IL-1β v tumorskem tkivu. V ta namen so uporabili test ELISA. Meritve so izvajali 1,3,5 in 7 dni po injiciranju bakterij. Kot negativno kontrolo so v miši injicirali PBS. Koncentracija TNF-α in IL-1β je bila višja kot pri negativni kontroli že po enem dnevu, medtem ko je bila koncentracija IFN-γ višja od negativne kontrole šele po treh dneh. S časom so koncentracije vseh treh citokinov padale, vendar so bile tudi na sedmi dan še vedno višje kot pri negativni kontroli. <br /> <br /> Nato so želeli preveriti, ali je možno stikalni sistem uporabiti za tarčno ''in vivo'' dostavo genov na mesto tumorja. V ta namen so miši injicirali s plazmidoma pSRluc8 in pFimE ali zgolj z pSRluc8 (negativna kontrola). Pred meritvijo intenzitete bioluminiscence so mišim injicirali tudi koelenterazin. Intenziteta bioluminiscence na mestu tumorja je naraščala do sedmega dneva po injiciranju bakterij transformiranih z obema plazmidoma. Razlika v primerjavi z negativno kontrolo je bila v tem časovnem intervalu statistično signifikantna. To pomeni, da je stikalni sistem ostal aktiven oz. da je prišlo do izražanja reporterskega gena tudi, ko so koncentracije provnetnih citokinov že začele upadati.<br /> <br /> Nazadnje so želeli preveriti še, ali je NO v tumorskem mikrookolju posledica delovanja inducibilne NO sintaze. Tri dni pred injiciranjem bakterij, transformiranih z obema plazmidoma, so začeli mišim vsakodnevno intraperitonalno vnašati inhibitor iNOS, imenovan 1400W dihidroklorid. Inhibitor so vsakodnevno vnašali tudi po injiciranju bakterij. Kot kontrolo so uporabili miši, ki so jim injicirali bakterije, ne pa tudi inhibitorja. Bioluminiscenčni signal so merili 3, 5, 7 in 9 dni po injeciranju bakterij. Vse dni merjenja je bila ntenziteta bioluminiscence višja pri miših brez inhibitorja iNOS. S tem so potrdili, da je inducibilna NO sintaza sintetizirala NO, ki je aktiviral stikalni sistem.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so v organizmu ''Salmonella enterica'' podvrsti ''enterica'' serotipu Typhimurioum zasnovali stikalni sistem, ki se odziva na NO. Funkcionalnost stikalnega sistema so potrdili ''in vitro'', kjer se je odzival na kemijski vir NO, ki je sprožil ireverzibilno aktivacijo stikalnega sistema. Aktivacija se je ohranila tudi po odvzemu NO iz gojišča, pri celični delitvi pa se je prenesla na hčerinske celice. ''In vivo'' so potrdili, da ''S''. Typhimurioum, ki nosijo zapis za stikalni sistem, specifično kolonizirajo tumorsko tkivo. Stikalni sistem se je v tem primeru specifično aktiviral z NO, ki ga je sintetizirala inducibilna NO sintaza. Rezultati raziskave namigujejo, da bi v prihodnosti lahko izkoristili NO kot inducer za tarčno dostavo genov oz. proteinov, ki jih zapisujejo, do mesta tumorjev. Na ta način se nam odpira možnost za razvoj novih dostavnih sistemov za zdravljenje raka.<br /> <br /> ==Viri==<br /> [1] Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.<br /> <br /> [2] M. T.-Q. Duong, Y. Qin, S.-H. You, J.-J. Min: Bacteria-Cancer Interactions: Bacteria-Based Cancer Therapy. Exp Mol Med 2019, 51, 1–15.<br /> <br /> [3] Q. Xue, Y. Yan, R. Zhang, H. Xiong: Regulation of INOS on Immune Cells and Its Role in Diseases. Int J Mol Sci 2018, 19, 3805.<br /> <br /> [4] A. M. Gardner, C. R. Gessner, P. R. Gardner: Regulation of the Nitric Oxide Reduction Operon (NorRVW) in Escherichia Coli. Journal of Biological Chemistry 2003, 278, 10081–10086.<br /> <br /> [5] W. R. Schwan: Regulation of Fim Genes in Uropathogenic Escherichia Coli. World J Clin Infect Dis 2011, 1, 17.</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Priprava_tumor_ciljajo%C4%8Dih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_du%C5%A1ikov(II)_oksid&diff=21822 2023-04-15T19:28:54Z

<p>AnaKodra: /* Princip delovanja stikalnega sistema */</p> <hr /> <div>Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']<br /> <br /> ==Uvod==<br /> V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju.<br /> <br /> ==Princip delovanja stikalnega sistema==<br /> Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.<br /> Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ&lt;sup&gt;54&lt;/sup&gt; podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno. <br /> <br /> Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja. <br /> <br /> Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P&lt;sub&gt;''norV''&lt;/sub&gt; iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja P&lt;sub&gt;''norV''&lt;/sub&gt;. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P&lt;sub&gt;''lacIq''&lt;/sub&gt;. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo. <br /> <br /> NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vitro''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Delovanje stikalnega sistema so najprej potrdili ''in vitro''. V ta namen so kot vir NO uporabili mešanico dietilentriamin/NO, ki so jo pri različnih koncentracijah dodali v gojišče. Transformirane bakerije so gojili 16 h pri 37°C, dodali substrat za Rluc8 in izmerili intenziteto bioluminiscence. Le-to so nato normirali glede na izmerjeno optično gostoto pri 600 nm in potrdili, da pri višjih koncentracijah NO dobljen signal narašča. Kot negativno kontrolo so uporabili bakterije, ki so jih transformirali samo s plazmidom pSRluc8. V tem primeru bioluminiscence niso zaznali niti pri najvišjih koncentracijah NO, kar pomeni, da do izražanje Rluc8 ni prišlo. To se je ujemalo s pričakovanji, saj bakterije niso vsebovale zapisa za FimE, ki bi lahko invertiral promotorsko zaporedje v ''fimS''. <br /> <br /> V nadaljevanju so želeli preveriti, ali je aktivacija stikalnega sistema ireverzibilna. V ta namen so bakterije čez noč gojili v gojišču z znano koncentracijo dietilentriamina/NO in jih nato naslednji dan prenesli v gojišče, kjer NO ni bil prisoten. V naslednjih 72 urah so odvzemali vzorce in merili intenziteto bioluminiscence ter jo ponovno normirali glede na OD600. Dobljen signal je bil približno 200-krat močnejši kot pri negativni kontroli. To je potrdilo, da je stikalni sistem ireverzibilno v aktivnem stanju tudi po izgubi stimulacije z NO. Poleg tega se aktivno stanje stikalnega sistema prenaša s celično delitvijo na hčerinske celice. <br /> <br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vivo''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Za in vivo eksperimente so uporabili Balb/C miši, ki so jim v podkožje implantirali tumorske celice linije CT-26. Najprej so želeli preveriti, ali bakterije ''S''. Typhimurium, transformirane s plazmidoma pSRluc8 in pFimE, specifično kolonizirajo tumorje in sprožijo imunski odziv v miših. V miši so injicirali 1*10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; CFU bakterij in miši čez 1, 3, 5, 7 ali 11 dni evtanazirali. V izoliranih tumorjih so določili število bakterij ''S''. Typhimurium naredili primerjavo s tremi zdravimi organi (pljuča, vranica, jetra), ki so služili kot kontrola selektivnosti kolonizacije. Že prvi dan po injiciranju bakterij je bilo njihovo število v tumorjih približno 10 000-krat višje kot v kontrolnih organih. Z podaljševanjem časa med injiciranjem bakterij in evtanazijo miši je število bakterij v tumorju in kontrolnih organih padalo, vendar je bilo tudi na 11. dan v tumorju število bakterij višje. <br /> <br /> Sprožitev imunskega odziva v miši so določali z merjenjem koncentracije provnetnih citokinov IFN-γ, TNF-α in IL-1β v tumorskem tkivu. V ta namen so uporabili test ELISA. Meritve so izvajali 1,3,5 in 7 dni po injiciranju bakterij. Kot negativno kontrolo so v miši injicirali PBS. Koncentracija TNF-α in IL-1β je bila višja kot pri negativni kontroli že po enem dnevu, medtem ko je bila koncentracija IFN-γ višja od negativne kontrole šele po treh dneh. S časom so koncentracije vseh treh citokinov padale, vendar so bile tudi na sedmi dan še vedno višje kot pri negativni kontroli. <br /> <br /> Nato so želeli preveriti, ali je možno stikalni sistem uporabiti za tarčno ''in vivo'' dostavo genov na mesto tumorja. V ta namen so miši injicirali s plazmidoma pSRluc8 in pFimE ali zgolj z pSRluc8 (negativna kontrola). Pred meritvijo intenzitete bioluminiscence so mišim injicirali tudi koelenterazin. Intenziteta bioluminiscence na mestu tumorja je naraščala do sedmega dneva po injiciranju bakterij transformiranih z obema plazmidoma. Razlika v primerjavi z negativno kontrolo je bila v tem časovnem intervalu statistično signifikantna. To pomeni, da je stikalni sistem ostal aktiven oz. da je prišlo do izražanja reporterskega gena tudi, ko so koncentracije provnetnih citokinov že začele upadati.<br /> <br /> Nazadnje so želeli preveriti še, ali je NO v tumorskem mikrookolju posledica delovanja inducibilne NO sintaze. Tri dni pred injiciranjem bakterij, transformiranih z obema plazmidoma, so začeli mišim vsakodnevno intraperitonalno vnašati inhibitor iNOS, imenovan 1400W dihidroklorid. Inhibitor so vsakodnevno vnašali tudi po injiciranju bakterij. Kot kontrolo so uporabili miši, ki so jim injicirali bakterije, ne pa tudi inhibitorja. Bioluminiscenčni signal so merili 3, 5, 7 in 9 dni po injeciranju bakterij. Vse dni merjenja je bila ntenziteta bioluminiscence višja pri miših brez inhibitorja iNOS. S tem so potrdili, da je inducibilna NO sintaza sintetizirala NO, ki je aktiviral stikalni sistem.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so v organizmu ''Salmonella enterica'' podvrsti ''enterica'' serotipu Typhimurioum zasnovali stikalni sistem, ki se odziva na NO. Funkcionalnost stikalnega sistema so potrdili ''in vitro'', kjer se je odzival na kemijski vir NO, ki je sprožil ireverzibilno aktivacijo stikalnega sistema. Aktivacija se je ohranila tudi po odvzemu NO iz gojišča, pri celični delitvi pa se je prenesla na hčerinske celice. ''In vivo'' so potrdili, da ''S''. Typhimurioum, ki nosijo zapis za stikalni sistem, specifično kolonizirajo tumorsko tkivo. Stikalni sistem se je v tem primeru specifično aktiviral z NO, ki ga je sintetizirala inducibilna NO sintaza. Rezultati raziskave namigujejo, da bi v prihodnosti lahko izkoristili NO kot inducer za tarčno dostavo genov oz. proteinov, ki jih zapisujejo, do mesta tumorjev. Na ta način se nam odpira možnost za razvoj novih dostavnih sistemov za zdravljenje raka.<br /> <br /> ==Viri==<br /> [1] Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.<br /> <br /> [2] M. T.-Q. Duong, Y. Qin, S.-H. You, J.-J. Min: Bacteria-Cancer Interactions: Bacteria-Based Cancer Therapy. Exp Mol Med 2019, 51, 1–15.<br /> <br /> [3] Q. Xue, Y. Yan, R. Zhang, H. Xiong: Regulation of INOS on Immune Cells and Its Role in Diseases. Int J Mol Sci 2018, 19, 3805.<br /> <br /> [4] A. M. Gardner, C. R. Gessner, P. R. Gardner: Regulation of the Nitric Oxide Reduction Operon (NorRVW) in Escherichia Coli. Journal of Biological Chemistry 2003, 278, 10081–10086.<br /> <br /> [5] W. R. Schwan: Regulation of Fim Genes in Uropathogenic Escherichia Coli. World J Clin Infect Dis 2011, 1, 17.</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Priprava_tumor_ciljajo%C4%8Dih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_du%C5%A1ikov(II)_oksid&diff=21821 2023-04-15T19:28:08Z

<p>AnaKodra: /* Princip delovanja stikalnega sistema */</p> <hr /> <div>Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']<br /> <br /> ==Uvod==<br /> V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju.<br /> <br /> ==Princip delovanja stikalnega sistema==<br /> Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.<br /> Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ&lt;sup&gt;54&lt;/sup&gt; podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno. <br /> <br /> Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja. <br /> <br /> Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P&lt;sub&gt;norV&lt;/sub&gt; iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja P&lt;sub&gt;''norV''&lt;/sub&gt;. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P&lt;sub&gt;''lacIq''&lt;/sub&gt;. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo. <br /> <br /> NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vitro''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Delovanje stikalnega sistema so najprej potrdili ''in vitro''. V ta namen so kot vir NO uporabili mešanico dietilentriamin/NO, ki so jo pri različnih koncentracijah dodali v gojišče. Transformirane bakerije so gojili 16 h pri 37°C, dodali substrat za Rluc8 in izmerili intenziteto bioluminiscence. Le-to so nato normirali glede na izmerjeno optično gostoto pri 600 nm in potrdili, da pri višjih koncentracijah NO dobljen signal narašča. Kot negativno kontrolo so uporabili bakterije, ki so jih transformirali samo s plazmidom pSRluc8. V tem primeru bioluminiscence niso zaznali niti pri najvišjih koncentracijah NO, kar pomeni, da do izražanje Rluc8 ni prišlo. To se je ujemalo s pričakovanji, saj bakterije niso vsebovale zapisa za FimE, ki bi lahko invertiral promotorsko zaporedje v ''fimS''. <br /> <br /> V nadaljevanju so želeli preveriti, ali je aktivacija stikalnega sistema ireverzibilna. V ta namen so bakterije čez noč gojili v gojišču z znano koncentracijo dietilentriamina/NO in jih nato naslednji dan prenesli v gojišče, kjer NO ni bil prisoten. V naslednjih 72 urah so odvzemali vzorce in merili intenziteto bioluminiscence ter jo ponovno normirali glede na OD600. Dobljen signal je bil približno 200-krat močnejši kot pri negativni kontroli. To je potrdilo, da je stikalni sistem ireverzibilno v aktivnem stanju tudi po izgubi stimulacije z NO. Poleg tega se aktivno stanje stikalnega sistema prenaša s celično delitvijo na hčerinske celice. <br /> <br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vivo''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Za in vivo eksperimente so uporabili Balb/C miši, ki so jim v podkožje implantirali tumorske celice linije CT-26. Najprej so želeli preveriti, ali bakterije ''S''. Typhimurium, transformirane s plazmidoma pSRluc8 in pFimE, specifično kolonizirajo tumorje in sprožijo imunski odziv v miših. V miši so injicirali 1*10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; CFU bakterij in miši čez 1, 3, 5, 7 ali 11 dni evtanazirali. V izoliranih tumorjih so določili število bakterij ''S''. Typhimurium naredili primerjavo s tremi zdravimi organi (pljuča, vranica, jetra), ki so služili kot kontrola selektivnosti kolonizacije. Že prvi dan po injiciranju bakterij je bilo njihovo število v tumorjih približno 10 000-krat višje kot v kontrolnih organih. Z podaljševanjem časa med injiciranjem bakterij in evtanazijo miši je število bakterij v tumorju in kontrolnih organih padalo, vendar je bilo tudi na 11. dan v tumorju število bakterij višje. <br /> <br /> Sprožitev imunskega odziva v miši so določali z merjenjem koncentracije provnetnih citokinov IFN-γ, TNF-α in IL-1β v tumorskem tkivu. V ta namen so uporabili test ELISA. Meritve so izvajali 1,3,5 in 7 dni po injiciranju bakterij. Kot negativno kontrolo so v miši injicirali PBS. Koncentracija TNF-α in IL-1β je bila višja kot pri negativni kontroli že po enem dnevu, medtem ko je bila koncentracija IFN-γ višja od negativne kontrole šele po treh dneh. S časom so koncentracije vseh treh citokinov padale, vendar so bile tudi na sedmi dan še vedno višje kot pri negativni kontroli. <br /> <br /> Nato so želeli preveriti, ali je možno stikalni sistem uporabiti za tarčno ''in vivo'' dostavo genov na mesto tumorja. V ta namen so miši injicirali s plazmidoma pSRluc8 in pFimE ali zgolj z pSRluc8 (negativna kontrola). Pred meritvijo intenzitete bioluminiscence so mišim injicirali tudi koelenterazin. Intenziteta bioluminiscence na mestu tumorja je naraščala do sedmega dneva po injiciranju bakterij transformiranih z obema plazmidoma. Razlika v primerjavi z negativno kontrolo je bila v tem časovnem intervalu statistično signifikantna. To pomeni, da je stikalni sistem ostal aktiven oz. da je prišlo do izražanja reporterskega gena tudi, ko so koncentracije provnetnih citokinov že začele upadati.<br /> <br /> Nazadnje so želeli preveriti še, ali je NO v tumorskem mikrookolju posledica delovanja inducibilne NO sintaze. Tri dni pred injiciranjem bakterij, transformiranih z obema plazmidoma, so začeli mišim vsakodnevno intraperitonalno vnašati inhibitor iNOS, imenovan 1400W dihidroklorid. Inhibitor so vsakodnevno vnašali tudi po injiciranju bakterij. Kot kontrolo so uporabili miši, ki so jim injicirali bakterije, ne pa tudi inhibitorja. Bioluminiscenčni signal so merili 3, 5, 7 in 9 dni po injeciranju bakterij. Vse dni merjenja je bila ntenziteta bioluminiscence višja pri miših brez inhibitorja iNOS. S tem so potrdili, da je inducibilna NO sintaza sintetizirala NO, ki je aktiviral stikalni sistem.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so v organizmu ''Salmonella enterica'' podvrsti ''enterica'' serotipu Typhimurioum zasnovali stikalni sistem, ki se odziva na NO. Funkcionalnost stikalnega sistema so potrdili ''in vitro'', kjer se je odzival na kemijski vir NO, ki je sprožil ireverzibilno aktivacijo stikalnega sistema. Aktivacija se je ohranila tudi po odvzemu NO iz gojišča, pri celični delitvi pa se je prenesla na hčerinske celice. ''In vivo'' so potrdili, da ''S''. Typhimurioum, ki nosijo zapis za stikalni sistem, specifično kolonizirajo tumorsko tkivo. Stikalni sistem se je v tem primeru specifično aktiviral z NO, ki ga je sintetizirala inducibilna NO sintaza. Rezultati raziskave namigujejo, da bi v prihodnosti lahko izkoristili NO kot inducer za tarčno dostavo genov oz. proteinov, ki jih zapisujejo, do mesta tumorjev. Na ta način se nam odpira možnost za razvoj novih dostavnih sistemov za zdravljenje raka.<br /> <br /> ==Viri==<br /> [1] Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.<br /> <br /> [2] M. T.-Q. Duong, Y. Qin, S.-H. You, J.-J. Min: Bacteria-Cancer Interactions: Bacteria-Based Cancer Therapy. Exp Mol Med 2019, 51, 1–15.<br /> <br /> [3] Q. Xue, Y. Yan, R. Zhang, H. Xiong: Regulation of INOS on Immune Cells and Its Role in Diseases. Int J Mol Sci 2018, 19, 3805.<br /> <br /> [4] A. M. Gardner, C. R. Gessner, P. R. Gardner: Regulation of the Nitric Oxide Reduction Operon (NorRVW) in Escherichia Coli. Journal of Biological Chemistry 2003, 278, 10081–10086.<br /> <br /> [5] W. R. Schwan: Regulation of Fim Genes in Uropathogenic Escherichia Coli. World J Clin Infect Dis 2011, 1, 17.</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Priprava_tumor_ciljajo%C4%8Dih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_du%C5%A1ikov(II)_oksid&diff=21820 2023-04-15T19:26:01Z

<p>AnaKodra: New page: Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 &#039;&#039;Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tu...</p> <hr /> <div>Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']<br /> <br /> ==Uvod==<br /> V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju.<br /> <br /> ==Princip delovanja stikalnega sistema==<br /> Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.<br /> Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ&lt;sup&gt;54&lt;/sup&gt; podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno. <br /> <br /> Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja. <br /> <br /> Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P&lt;sub&gt;norV&lt;/sub&gt; iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja PnorV. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P&lt;sub&gt;lacIq&lt;/sub&gt;. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo. <br /> <br /> NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vitro''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Delovanje stikalnega sistema so najprej potrdili ''in vitro''. V ta namen so kot vir NO uporabili mešanico dietilentriamin/NO, ki so jo pri različnih koncentracijah dodali v gojišče. Transformirane bakerije so gojili 16 h pri 37°C, dodali substrat za Rluc8 in izmerili intenziteto bioluminiscence. Le-to so nato normirali glede na izmerjeno optično gostoto pri 600 nm in potrdili, da pri višjih koncentracijah NO dobljen signal narašča. Kot negativno kontrolo so uporabili bakterije, ki so jih transformirali samo s plazmidom pSRluc8. V tem primeru bioluminiscence niso zaznali niti pri najvišjih koncentracijah NO, kar pomeni, da do izražanje Rluc8 ni prišlo. To se je ujemalo s pričakovanji, saj bakterije niso vsebovale zapisa za FimE, ki bi lahko invertiral promotorsko zaporedje v ''fimS''. <br /> <br /> V nadaljevanju so želeli preveriti, ali je aktivacija stikalnega sistema ireverzibilna. V ta namen so bakterije čez noč gojili v gojišču z znano koncentracijo dietilentriamina/NO in jih nato naslednji dan prenesli v gojišče, kjer NO ni bil prisoten. V naslednjih 72 urah so odvzemali vzorce in merili intenziteto bioluminiscence ter jo ponovno normirali glede na OD600. Dobljen signal je bil približno 200-krat močnejši kot pri negativni kontroli. To je potrdilo, da je stikalni sistem ireverzibilno v aktivnem stanju tudi po izgubi stimulacije z NO. Poleg tega se aktivno stanje stikalnega sistema prenaša s celično delitvijo na hčerinske celice. <br /> <br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vivo''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Za in vivo eksperimente so uporabili Balb/C miši, ki so jim v podkožje implantirali tumorske celice linije CT-26. Najprej so želeli preveriti, ali bakterije ''S''. Typhimurium, transformirane s plazmidoma pSRluc8 in pFimE, specifično kolonizirajo tumorje in sprožijo imunski odziv v miših. V miši so injicirali 1*10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; CFU bakterij in miši čez 1, 3, 5, 7 ali 11 dni evtanazirali. V izoliranih tumorjih so določili število bakterij ''S''. Typhimurium naredili primerjavo s tremi zdravimi organi (pljuča, vranica, jetra), ki so služili kot kontrola selektivnosti kolonizacije. Že prvi dan po injiciranju bakterij je bilo njihovo število v tumorjih približno 10 000-krat višje kot v kontrolnih organih. Z podaljševanjem časa med injiciranjem bakterij in evtanazijo miši je število bakterij v tumorju in kontrolnih organih padalo, vendar je bilo tudi na 11. dan v tumorju število bakterij višje. <br /> <br /> Sprožitev imunskega odziva v miši so določali z merjenjem koncentracije provnetnih citokinov IFN-γ, TNF-α in IL-1β v tumorskem tkivu. V ta namen so uporabili test ELISA. Meritve so izvajali 1,3,5 in 7 dni po injiciranju bakterij. Kot negativno kontrolo so v miši injicirali PBS. Koncentracija TNF-α in IL-1β je bila višja kot pri negativni kontroli že po enem dnevu, medtem ko je bila koncentracija IFN-γ višja od negativne kontrole šele po treh dneh. S časom so koncentracije vseh treh citokinov padale, vendar so bile tudi na sedmi dan še vedno višje kot pri negativni kontroli. <br /> <br /> Nato so želeli preveriti, ali je možno stikalni sistem uporabiti za tarčno ''in vivo'' dostavo genov na mesto tumorja. V ta namen so miši injicirali s plazmidoma pSRluc8 in pFimE ali zgolj z pSRluc8 (negativna kontrola). Pred meritvijo intenzitete bioluminiscence so mišim injicirali tudi koelenterazin. Intenziteta bioluminiscence na mestu tumorja je naraščala do sedmega dneva po injiciranju bakterij transformiranih z obema plazmidoma. Razlika v primerjavi z negativno kontrolo je bila v tem časovnem intervalu statistično signifikantna. To pomeni, da je stikalni sistem ostal aktiven oz. da je prišlo do izražanja reporterskega gena tudi, ko so koncentracije provnetnih citokinov že začele upadati.<br /> <br /> Nazadnje so želeli preveriti še, ali je NO v tumorskem mikrookolju posledica delovanja inducibilne NO sintaze. Tri dni pred injiciranjem bakterij, transformiranih z obema plazmidoma, so začeli mišim vsakodnevno intraperitonalno vnašati inhibitor iNOS, imenovan 1400W dihidroklorid. Inhibitor so vsakodnevno vnašali tudi po injiciranju bakterij. Kot kontrolo so uporabili miši, ki so jim injicirali bakterije, ne pa tudi inhibitorja. Bioluminiscenčni signal so merili 3, 5, 7 in 9 dni po injeciranju bakterij. Vse dni merjenja je bila ntenziteta bioluminiscence višja pri miših brez inhibitorja iNOS. S tem so potrdili, da je inducibilna NO sintaza sintetizirala NO, ki je aktiviral stikalni sistem.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so v organizmu ''Salmonella enterica'' podvrsti ''enterica'' serotipu Typhimurioum zasnovali stikalni sistem, ki se odziva na NO. Funkcionalnost stikalnega sistema so potrdili ''in vitro'', kjer se je odzival na kemijski vir NO, ki je sprožil ireverzibilno aktivacijo stikalnega sistema. Aktivacija se je ohranila tudi po odvzemu NO iz gojišča, pri celični delitvi pa se je prenesla na hčerinske celice. ''In vivo'' so potrdili, da ''S''. Typhimurioum, ki nosijo zapis za stikalni sistem, specifično kolonizirajo tumorsko tkivo. Stikalni sistem se je v tem primeru specifično aktiviral z NO, ki ga je sintetizirala inducibilna NO sintaza. Rezultati raziskave namigujejo, da bi v prihodnosti lahko izkoristili NO kot inducer za tarčno dostavo genov oz. proteinov, ki jih zapisujejo, do mesta tumorjev. Na ta način se nam odpira možnost za razvoj novih dostavnih sistemov za zdravljenje raka.<br /> <br /> ==Viri==<br /> [1] Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.<br /> <br /> [2] M. T.-Q. Duong, Y. Qin, S.-H. You, J.-J. Min: Bacteria-Cancer Interactions: Bacteria-Based Cancer Therapy. Exp Mol Med 2019, 51, 1–15.<br /> <br /> [3] Q. Xue, Y. Yan, R. Zhang, H. Xiong: Regulation of INOS on Immune Cells and Its Role in Diseases. Int J Mol Sci 2018, 19, 3805.<br /> <br /> [4] A. M. Gardner, C. R. Gessner, P. R. Gardner: Regulation of the Nitric Oxide Reduction Operon (NorRVW) in Escherichia Coli. Journal of Biological Chemistry 2003, 278, 10081–10086.<br /> <br /> [5] W. R. Schwan: Regulation of Fim Genes in Uropathogenic Escherichia Coli. World J Clin Infect Dis 2011, 1, 17.</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2022/23&diff=21819 2023-04-15T19:25:40Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_tumor_ciljajočih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_dušikov(II)_oksid Priprava tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)<br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)<br /> <br /> <br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2022/23&diff=21818 2023-04-15T19:23:33Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_Priprava_tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)<br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)<br /> <br /> <br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2022/23&diff=21817 2023-04-15T19:23:12Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava Priprava tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)<br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)<br /> <br /> <br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2022/23&diff=21816 2023-04-15T19:22:50Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)<br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)<br /> <br /> <br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2022/23&diff=21815 2023-04-15T19:21:34Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ Priprava tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)<br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)<br /> <br /> <br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2022/23&diff=21814 2023-04-15T19:21:13Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ Osnovanje tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)<br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)<br /> <br /> <br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2022/23&diff=21813 2023-04-15T19:21:03Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ Osnovanje tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II)_oksid] (Ana Kodra)<br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)<br /> <br /> <br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2022/23&diff=21812 2023-04-15T19:19:42Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ Osnovanje_tumor_ciljajo%C4%8Dih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_du%C5%A1ikov(II)_oksid] (Ana Kodra)<br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)<br /> <br /> <br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2022/23&diff=21811 2023-04-15T19:18:17Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Osnovanje_tumor_ciljajo%C4%8Dih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_du%C5%A1ikov(II)_oksid] (Ana Kodra)<br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)<br /> <br /> <br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Osnovanje_tumor_ciljajo%C4%8Dih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_du%C5%A1ikov(II)_oks&diff=21810 2023-04-15T19:16:42Z

<p>AnaKodra: New page: Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 &#039;&#039;Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tu...</p> <hr /> <div>Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']<br /> <br /> ==Uvod==<br /> V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju.<br /> <br /> ==Princip delovanja stikalnega sistema==<br /> Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.<br /> Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ&lt;sup&gt;54&lt;/sup&gt; podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno. <br /> <br /> Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja. <br /> <br /> Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P&lt;sub&gt;norV&lt;/sub&gt; iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja PnorV. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P&lt;sub&gt;lacIq&lt;/sub&gt;. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo. <br /> <br /> NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vitro''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Delovanje stikalnega sistema so najprej potrdili ''in vitro''. V ta namen so kot vir NO uporabili mešanico dietilentriamin/NO, ki so jo pri različnih koncentracijah dodali v gojišče. Transformirane bakerije so gojili 16 h pri 37°C, dodali substrat za Rluc8 in izmerili intenziteto bioluminiscence. Le-to so nato normirali glede na izmerjeno optično gostoto pri 600 nm in potrdili, da pri višjih koncentracijah NO dobljen signal narašča. Kot negativno kontrolo so uporabili bakterije, ki so jih transformirali samo s plazmidom pSRluc8. V tem primeru bioluminiscence niso zaznali niti pri najvišjih koncentracijah NO, kar pomeni, da do izražanje Rluc8 ni prišlo. To se je ujemalo s pričakovanji, saj bakterije niso vsebovale zapisa za FimE, ki bi lahko invertiral promotorsko zaporedje v ''fimS''. <br /> <br /> V nadaljevanju so želeli preveriti, ali je aktivacija stikalnega sistema ireverzibilna. V ta namen so bakterije čez noč gojili v gojišču z znano koncentracijo dietilentriamina/NO in jih nato naslednji dan prenesli v gojišče, kjer NO ni bil prisoten. V naslednjih 72 urah so odvzemali vzorce in merili intenziteto bioluminiscence ter jo ponovno normirali glede na OD600. Dobljen signal je bil približno 200-krat močnejši kot pri negativni kontroli. To je potrdilo, da je stikalni sistem ireverzibilno v aktivnem stanju tudi po izgubi stimulacije z NO. Poleg tega se aktivno stanje stikalnega sistema prenaša s celično delitvijo na hčerinske celice. <br /> <br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vivo''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Za in vivo eksperimente so uporabili Balb/C miši, ki so jim v podkožje implantirali tumorske celice linije CT-26. Najprej so želeli preveriti, ali bakterije ''S''. Typhimurium, transformirane s plazmidoma pSRluc8 in pFimE, specifično kolonizirajo tumorje in sprožijo imunski odziv v miših. V miši so injicirali 1*10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; CFU bakterij in miši čez 1, 3, 5, 7 ali 11 dni evtanazirali. V izoliranih tumorjih so določili število bakterij ''S''. Typhimurium naredili primerjavo s tremi zdravimi organi (pljuča, vranica, jetra), ki so služili kot kontrola selektivnosti kolonizacije. Že prvi dan po injiciranju bakterij je bilo njihovo število v tumorjih približno 10 000-krat višje kot v kontrolnih organih. Z podaljševanjem časa med injiciranjem bakterij in evtanazijo miši je število bakterij v tumorju in kontrolnih organih padalo, vendar je bilo tudi na 11. dan v tumorju število bakterij višje. <br /> <br /> Sprožitev imunskega odziva v miši so določali z merjenjem koncentracije provnetnih citokinov IFN-γ, TNF-α in IL-1β v tumorskem tkivu. V ta namen so uporabili test ELISA. Meritve so izvajali 1,3,5 in 7 dni po injiciranju bakterij. Kot negativno kontrolo so v miši injicirali PBS. Koncentracija TNF-α in IL-1β je bila višja kot pri negativni kontroli že po enem dnevu, medtem ko je bila koncentracija IFN-γ višja od negativne kontrole šele po treh dneh. S časom so koncentracije vseh treh citokinov padale, vendar so bile tudi na sedmi dan še vedno višje kot pri negativni kontroli. <br /> <br /> Nato so želeli preveriti, ali je možno stikalni sistem uporabiti za tarčno ''in vivo'' dostavo genov na mesto tumorja. V ta namen so miši injicirali s plazmidoma pSRluc8 in pFimE ali zgolj z pSRluc8 (negativna kontrola). Pred meritvijo intenzitete bioluminiscence so mišim injicirali tudi koelenterazin. Intenziteta bioluminiscence na mestu tumorja je naraščala do sedmega dneva po injiciranju bakterij transformiranih z obema plazmidoma. Razlika v primerjavi z negativno kontrolo je bila v tem časovnem intervalu statistično signifikantna. To pomeni, da je stikalni sistem ostal aktiven oz. da je prišlo do izražanja reporterskega gena tudi, ko so koncentracije provnetnih citokinov že začele upadati.<br /> <br /> Nazadnje so želeli preveriti še, ali je NO v tumorskem mikrookolju posledica delovanja inducibilne NO sintaze. Tri dni pred injiciranjem bakterij, transformiranih z obema plazmidoma, so začeli mišim vsakodnevno intraperitonalno vnašati inhibitor iNOS, imenovan 1400W dihidroklorid. Inhibitor so vsakodnevno vnašali tudi po injiciranju bakterij. Kot kontrolo so uporabili miši, ki so jim injicirali bakterije, ne pa tudi inhibitorja. Bioluminiscenčni signal so merili 3, 5, 7 in 9 dni po injeciranju bakterij. Vse dni merjenja je bila ntenziteta bioluminiscence višja pri miših brez inhibitorja iNOS. S tem so potrdili, da je inducibilna NO sintaza sintetizirala NO, ki je aktiviral stikalni sistem.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so v organizmu ''Salmonella enterica'' podvrsti ''enterica'' serotipu Typhimurioum zasnovali stikalni sistem, ki se odziva na NO. Funkcionalnost stikalnega sistema so potrdili ''in vitro'', kjer se je odzival na kemijski vir NO, ki je sprožil ireverzibilno aktivacijo stikalnega sistema. Aktivacija se je ohranila tudi po odvzemu NO iz gojišča, pri celični delitvi pa se je prenesla na hčerinske celice. ''In vivo'' so potrdili, da ''S''. Typhimurioum, ki nosijo zapis za stikalni sistem, specifično kolonizirajo tumorsko tkivo. Stikalni sistem se je v tem primeru specifično aktiviral z NO, ki ga je sintetizirala inducibilna NO sintaza. Rezultati raziskave namigujejo, da bi v prihodnosti lahko izkoristili NO kot inducer za tarčno dostavo genov oz. proteinov, ki jih zapisujejo, do mesta tumorjev. Na ta način se nam odpira možnost za razvoj novih dostavnih sistemov za zdravljenje raka.<br /> <br /> ==Viri==<br /> [1] Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.<br /> <br /> [2] M. T.-Q. Duong, Y. Qin, S.-H. You, J.-J. Min: Bacteria-Cancer Interactions: Bacteria-Based Cancer Therapy. Exp Mol Med 2019, 51, 1–15.<br /> <br /> [3] Q. Xue, Y. Yan, R. Zhang, H. Xiong: Regulation of INOS on Immune Cells and Its Role in Diseases. Int J Mol Sci 2018, 19, 3805.<br /> <br /> [4] A. M. Gardner, C. R. Gessner, P. R. Gardner: Regulation of the Nitric Oxide Reduction Operon (NorRVW) in Escherichia Coli. Journal of Biological Chemistry 2003, 278, 10081–10086.<br /> <br /> [5] W. R. Schwan: Regulation of Fim Genes in Uropathogenic Escherichia Coli. World J Clin Infect Dis 2011, 1, 17.</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2022/23&diff=21809 2023-04-15T19:15:59Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Osnovanje_tumor_ciljajočih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_dušikov(II)_oks] (Ana Kodra)<br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)<br /> <br /> <br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2022/23&diff=21808 2023-04-15T19:13:43Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Osnovanje_tumor_ciljajočih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_dušikov(II)_oksid] (Ana Kodra)<br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)<br /> <br /> <br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2022/23&diff=21807 2023-04-15T19:10:31Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/GENETSKO PROGRAMIRANJE TUMOR CILJAJOČIH BAKTERIJ S STIKALNIM SISTEMOM, KI SE ODZIVA NA DUŠIKOV(II) OKSID] (Ana Kodra<br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)<br /> <br /> <br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User_talk:AnaKodra&diff=21806 2023-04-15T19:07:52Z

<p>AnaKodra: New page: &#039;&#039;&#039;GENETSKO PROGRAMIRANJE TUMOR CILJAJOČIH BAKTERIJ S STIKALNIM SISTEMOM, KI SE ODZIVA NA DUŠIKOV(II) OKSID&#039;&#039;&#039; Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 &#039;&#039;Y. Qin, S.-H...</p> <hr /> <div>'''GENETSKO PROGRAMIRANJE TUMOR CILJAJOČIH BAKTERIJ S STIKALNIM SISTEMOM, KI SE ODZIVA NA DUŠIKOV(II) OKSID'''<br /> <br /> Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']<br /> <br /> ==Uvod==<br /> V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju.<br /> <br /> ==Princip delovanja stikalnega sistema==<br /> Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.<br /> Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ&lt;sup&gt;54&lt;/sup&gt; podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno. <br /> <br /> Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja. <br /> <br /> Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P&lt;sub&gt;norV&lt;/sub&gt; iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja PnorV. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P&lt;sub&gt;lacIq&lt;/sub&gt;. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo. <br /> <br /> NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vitro''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Delovanje stikalnega sistema so najprej potrdili ''in vitro''. V ta namen so kot vir NO uporabili mešanico dietilentriamin/NO, ki so jo pri različnih koncentracijah dodali v gojišče. Transformirane bakerije so gojili 16 h pri 37°C, dodali substrat za Rluc8 in izmerili intenziteto bioluminiscence. Le-to so nato normirali glede na izmerjeno optično gostoto pri 600 nm in potrdili, da pri višjih koncentracijah NO dobljen signal narašča. Kot negativno kontrolo so uporabili bakterije, ki so jih transformirali samo s plazmidom pSRluc8. V tem primeru bioluminiscence niso zaznali niti pri najvišjih koncentracijah NO, kar pomeni, da do izražanje Rluc8 ni prišlo. To se je ujemalo s pričakovanji, saj bakterije niso vsebovale zapisa za FimE, ki bi lahko invertiral promotorsko zaporedje v ''fimS''. <br /> <br /> V nadaljevanju so želeli preveriti, ali je aktivacija stikalnega sistema ireverzibilna. V ta namen so bakterije čez noč gojili v gojišču z znano koncentracijo dietilentriamina/NO in jih nato naslednji dan prenesli v gojišče, kjer NO ni bil prisoten. V naslednjih 72 urah so odvzemali vzorce in merili intenziteto bioluminiscence ter jo ponovno normirali glede na OD600. Dobljen signal je bil približno 200-krat močnejši kot pri negativni kontroli. To je potrdilo, da je stikalni sistem ireverzibilno v aktivnem stanju tudi po izgubi stimulacije z NO. Poleg tega se aktivno stanje stikalnega sistema prenaša s celično delitvijo na hčerinske celice. <br /> <br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vivo''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Za in vivo eksperimente so uporabili Balb/C miši, ki so jim v podkožje implantirali tumorske celice linije CT-26. Najprej so želeli preveriti, ali bakterije ''S''. Typhimurium, transformirane s plazmidoma pSRluc8 in pFimE, specifično kolonizirajo tumorje in sprožijo imunski odziv v miših. V miši so injicirali 1*10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; CFU bakterij in miši čez 1, 3, 5, 7 ali 11 dni evtanazirali. V izoliranih tumorjih so določili število bakterij ''S''. Typhimurium naredili primerjavo s tremi zdravimi organi (pljuča, vranica, jetra), ki so služili kot kontrola selektivnosti kolonizacije. Že prvi dan po injiciranju bakterij je bilo njihovo število v tumorjih približno 10 000-krat višje kot v kontrolnih organih. Z podaljševanjem časa med injiciranjem bakterij in evtanazijo miši je število bakterij v tumorju in kontrolnih organih padalo, vendar je bilo tudi na 11. dan v tumorju število bakterij višje. <br /> <br /> Sprožitev imunskega odziva v miši so določali z merjenjem koncentracije provnetnih citokinov IFN-γ, TNF-α in IL-1β v tumorskem tkivu. V ta namen so uporabili test ELISA. Meritve so izvajali 1,3,5 in 7 dni po injiciranju bakterij. Kot negativno kontrolo so v miši injicirali PBS. Koncentracija TNF-α in IL-1β je bila višja kot pri negativni kontroli že po enem dnevu, medtem ko je bila koncentracija IFN-γ višja od negativne kontrole šele po treh dneh. S časom so koncentracije vseh treh citokinov padale, vendar so bile tudi na sedmi dan še vedno višje kot pri negativni kontroli. <br /> <br /> Nato so želeli preveriti, ali je možno stikalni sistem uporabiti za tarčno ''in vivo'' dostavo genov na mesto tumorja. V ta namen so miši injicirali s plazmidoma pSRluc8 in pFimE ali zgolj z pSRluc8 (negativna kontrola). Pred meritvijo intenzitete bioluminiscence so mišim injicirali tudi koelenterazin. Intenziteta bioluminiscence na mestu tumorja je naraščala do sedmega dneva po injiciranju bakterij transformiranih z obema plazmidoma. Razlika v primerjavi z negativno kontrolo je bila v tem časovnem intervalu statistično signifikantna. To pomeni, da je stikalni sistem ostal aktiven oz. da je prišlo do izražanja reporterskega gena tudi, ko so koncentracije provnetnih citokinov že začele upadati.<br /> <br /> Nazadnje so želeli preveriti še, ali je NO v tumorskem mikrookolju posledica delovanja inducibilne NO sintaze. Tri dni pred injiciranjem bakterij, transformiranih z obema plazmidoma, so začeli mišim vsakodnevno intraperitonalno vnašati inhibitor iNOS, imenovan 1400W dihidroklorid. Inhibitor so vsakodnevno vnašali tudi po injiciranju bakterij. Kot kontrolo so uporabili miši, ki so jim injicirali bakterije, ne pa tudi inhibitorja. Bioluminiscenčni signal so merili 3, 5, 7 in 9 dni po injeciranju bakterij. Vse dni merjenja je bila ntenziteta bioluminiscence višja pri miših brez inhibitorja iNOS. S tem so potrdili, da je inducibilna NO sintaza sintetizirala NO, ki je aktiviral stikalni sistem.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so v organizmu ''Salmonella enterica'' podvrsti ''enterica'' serotipu Typhimurioum zasnovali stikalni sistem, ki se odziva na NO. Funkcionalnost stikalnega sistema so potrdili ''in vitro'', kjer se je odzival na kemijski vir NO, ki je sprožil ireverzibilno aktivacijo stikalnega sistema. Aktivacija se je ohranila tudi po odvzemu NO iz gojišča, pri celični delitvi pa se je prenesla na hčerinske celice. ''In vivo'' so potrdili, da ''S''. Typhimurioum, ki nosijo zapis za stikalni sistem, specifično kolonizirajo tumorsko tkivo. Stikalni sistem se je v tem primeru specifično aktiviral z NO, ki ga je sintetizirala inducibilna NO sintaza. Rezultati raziskave namigujejo, da bi v prihodnosti lahko izkoristili NO kot inducer za tarčno dostavo genov oz. proteinov, ki jih zapisujejo, do mesta tumorjev. Na ta način se nam odpira možnost za razvoj novih dostavnih sistemov za zdravljenje raka.<br /> <br /> ==Viri==<br /> [1] Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.<br /> <br /> [2] M. T.-Q. Duong, Y. Qin, S.-H. You, J.-J. Min: Bacteria-Cancer Interactions: Bacteria-Based Cancer Therapy. Exp Mol Med 2019, 51, 1–15.<br /> <br /> [3] Q. Xue, Y. Yan, R. Zhang, H. Xiong: Regulation of INOS on Immune Cells and Its Role in Diseases. Int J Mol Sci 2018, 19, 3805.<br /> <br /> [4] A. M. Gardner, C. R. Gessner, P. R. Gardner: Regulation of the Nitric Oxide Reduction Operon (NorRVW) in Escherichia Coli. Journal of Biological Chemistry 2003, 278, 10081–10086.<br /> <br /> [5] W. R. Schwan: Regulation of Fim Genes in Uropathogenic Escherichia Coli. World J Clin Infect Dis 2011, 1, 17.</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:AnaKodra&diff=21805 2023-04-15T19:05:33Z

<p>AnaKodra: /* =Viri */</p> <hr /> <div>'''GENETSKO PROGRAMIRANJE TUMOR CILJAJOČIH BAKTERIJ S STIKALNIM SISTEMOM, KI SE ODZIVA NA DUŠIKOV(II) OKSID'''<br /> <br /> Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']<br /> <br /> ==Uvod==<br /> V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju.<br /> <br /> ==Princip delovanja stikalnega sistema==<br /> Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.<br /> Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ&lt;sup&gt;54&lt;/sup&gt; podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno. <br /> <br /> Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja. <br /> <br /> Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P&lt;sub&gt;norV&lt;/sub&gt; iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja PnorV. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P&lt;sub&gt;lacIq&lt;/sub&gt;. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo. <br /> <br /> NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vitro''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Delovanje stikalnega sistema so najprej potrdili ''in vitro''. V ta namen so kot vir NO uporabili mešanico dietilentriamin/NO, ki so jo pri različnih koncentracijah dodali v gojišče. Transformirane bakerije so gojili 16 h pri 37°C, dodali substrat za Rluc8 in izmerili intenziteto bioluminiscence. Le-to so nato normirali glede na izmerjeno optično gostoto pri 600 nm in potrdili, da pri višjih koncentracijah NO dobljen signal narašča. Kot negativno kontrolo so uporabili bakterije, ki so jih transformirali samo s plazmidom pSRluc8. V tem primeru bioluminiscence niso zaznali niti pri najvišjih koncentracijah NO, kar pomeni, da do izražanje Rluc8 ni prišlo. To se je ujemalo s pričakovanji, saj bakterije niso vsebovale zapisa za FimE, ki bi lahko invertiral promotorsko zaporedje v ''fimS''. <br /> <br /> V nadaljevanju so želeli preveriti, ali je aktivacija stikalnega sistema ireverzibilna. V ta namen so bakterije čez noč gojili v gojišču z znano koncentracijo dietilentriamina/NO in jih nato naslednji dan prenesli v gojišče, kjer NO ni bil prisoten. V naslednjih 72 urah so odvzemali vzorce in merili intenziteto bioluminiscence ter jo ponovno normirali glede na OD600. Dobljen signal je bil približno 200-krat močnejši kot pri negativni kontroli. To je potrdilo, da je stikalni sistem ireverzibilno v aktivnem stanju tudi po izgubi stimulacije z NO. Poleg tega se aktivno stanje stikalnega sistema prenaša s celično delitvijo na hčerinske celice. <br /> <br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vivo''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Za in vivo eksperimente so uporabili Balb/C miši, ki so jim v podkožje implantirali tumorske celice linije CT-26. Najprej so želeli preveriti, ali bakterije ''S''. Typhimurium, transformirane s plazmidoma pSRluc8 in pFimE, specifično kolonizirajo tumorje in sprožijo imunski odziv v miših. V miši so injicirali 1*10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; CFU bakterij in miši čez 1, 3, 5, 7 ali 11 dni evtanazirali. V izoliranih tumorjih so določili število bakterij ''S''. Typhimurium naredili primerjavo s tremi zdravimi organi (pljuča, vranica, jetra), ki so služili kot kontrola selektivnosti kolonizacije. Že prvi dan po injiciranju bakterij je bilo njihovo število v tumorjih približno 10 000-krat višje kot v kontrolnih organih. Z podaljševanjem časa med injiciranjem bakterij in evtanazijo miši je število bakterij v tumorju in kontrolnih organih padalo, vendar je bilo tudi na 11. dan v tumorju število bakterij višje. <br /> <br /> Sprožitev imunskega odziva v miši so določali z merjenjem koncentracije provnetnih citokinov IFN-γ, TNF-α in IL-1β v tumorskem tkivu. V ta namen so uporabili test ELISA. Meritve so izvajali 1,3,5 in 7 dni po injiciranju bakterij. Kot negativno kontrolo so v miši injicirali PBS. Koncentracija TNF-α in IL-1β je bila višja kot pri negativni kontroli že po enem dnevu, medtem ko je bila koncentracija IFN-γ višja od negativne kontrole šele po treh dneh. S časom so koncentracije vseh treh citokinov padale, vendar so bile tudi na sedmi dan še vedno višje kot pri negativni kontroli. <br /> <br /> Nato so želeli preveriti, ali je možno stikalni sistem uporabiti za tarčno ''in vivo'' dostavo genov na mesto tumorja. V ta namen so miši injicirali s plazmidoma pSRluc8 in pFimE ali zgolj z pSRluc8 (negativna kontrola). Pred meritvijo intenzitete bioluminiscence so mišim injicirali tudi koelenterazin. Intenziteta bioluminiscence na mestu tumorja je naraščala do sedmega dneva po injiciranju bakterij transformiranih z obema plazmidoma. Razlika v primerjavi z negativno kontrolo je bila v tem časovnem intervalu statistično signifikantna. To pomeni, da je stikalni sistem ostal aktiven oz. da je prišlo do izražanja reporterskega gena tudi, ko so koncentracije provnetnih citokinov že začele upadati.<br /> <br /> Nazadnje so želeli preveriti še, ali je NO v tumorskem mikrookolju posledica delovanja inducibilne NO sintaze. Tri dni pred injiciranjem bakterij, transformiranih z obema plazmidoma, so začeli mišim vsakodnevno intraperitonalno vnašati inhibitor iNOS, imenovan 1400W dihidroklorid. Inhibitor so vsakodnevno vnašali tudi po injiciranju bakterij. Kot kontrolo so uporabili miši, ki so jim injicirali bakterije, ne pa tudi inhibitorja. Bioluminiscenčni signal so merili 3, 5, 7 in 9 dni po injeciranju bakterij. Vse dni merjenja je bila ntenziteta bioluminiscence višja pri miših brez inhibitorja iNOS. S tem so potrdili, da je inducibilna NO sintaza sintetizirala NO, ki je aktiviral stikalni sistem.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so v organizmu ''Salmonella enterica'' podvrsti ''enterica'' serotipu Typhimurioum zasnovali stikalni sistem, ki se odziva na NO. Funkcionalnost stikalnega sistema so potrdili ''in vitro'', kjer se je odzival na kemijski vir NO, ki je sprožil ireverzibilno aktivacijo stikalnega sistema. Aktivacija se je ohranila tudi po odvzemu NO iz gojišča, pri celični delitvi pa se je prenesla na hčerinske celice. ''In vivo'' so potrdili, da ''S''. Typhimurioum, ki nosijo zapis za stikalni sistem, specifično kolonizirajo tumorsko tkivo. Stikalni sistem se je v tem primeru specifično aktiviral z NO, ki ga je sintetizirala inducibilna NO sintaza. Rezultati raziskave namigujejo, da bi v prihodnosti lahko izkoristili NO kot inducer za tarčno dostavo genov oz. proteinov, ki jih zapisujejo, do mesta tumorjev. Na ta način se nam odpira možnost za razvoj novih dostavnih sistemov za zdravljenje raka.<br /> <br /> ==Viri==<br /> [1] Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.<br /> <br /> [2] M. T.-Q. Duong, Y. Qin, S.-H. You, J.-J. Min: Bacteria-Cancer Interactions: Bacteria-Based Cancer Therapy. Exp Mol Med 2019, 51, 1–15.<br /> <br /> [3] Q. Xue, Y. Yan, R. Zhang, H. Xiong: Regulation of INOS on Immune Cells and Its Role in Diseases. Int J Mol Sci 2018, 19, 3805.<br /> <br /> [4] A. M. Gardner, C. R. Gessner, P. R. Gardner: Regulation of the Nitric Oxide Reduction Operon (NorRVW) in Escherichia Coli. Journal of Biological Chemistry 2003, 278, 10081–10086.<br /> <br /> [5] W. R. Schwan: Regulation of Fim Genes in Uropathogenic Escherichia Coli. World J Clin Infect Dis 2011, 1, 17.</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:AnaKodra&diff=21804 2023-04-15T19:05:19Z

<p>AnaKodra: /* =Viri */</p> <hr /> <div>'''GENETSKO PROGRAMIRANJE TUMOR CILJAJOČIH BAKTERIJ S STIKALNIM SISTEMOM, KI SE ODZIVA NA DUŠIKOV(II) OKSID'''<br /> <br /> Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']<br /> <br /> ==Uvod==<br /> V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju.<br /> <br /> ==Princip delovanja stikalnega sistema==<br /> Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.<br /> Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ&lt;sup&gt;54&lt;/sup&gt; podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno. <br /> <br /> Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja. <br /> <br /> Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P&lt;sub&gt;norV&lt;/sub&gt; iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja PnorV. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P&lt;sub&gt;lacIq&lt;/sub&gt;. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo. <br /> <br /> NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vitro''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Delovanje stikalnega sistema so najprej potrdili ''in vitro''. V ta namen so kot vir NO uporabili mešanico dietilentriamin/NO, ki so jo pri različnih koncentracijah dodali v gojišče. Transformirane bakerije so gojili 16 h pri 37°C, dodali substrat za Rluc8 in izmerili intenziteto bioluminiscence. Le-to so nato normirali glede na izmerjeno optično gostoto pri 600 nm in potrdili, da pri višjih koncentracijah NO dobljen signal narašča. Kot negativno kontrolo so uporabili bakterije, ki so jih transformirali samo s plazmidom pSRluc8. V tem primeru bioluminiscence niso zaznali niti pri najvišjih koncentracijah NO, kar pomeni, da do izražanje Rluc8 ni prišlo. To se je ujemalo s pričakovanji, saj bakterije niso vsebovale zapisa za FimE, ki bi lahko invertiral promotorsko zaporedje v ''fimS''. <br /> <br /> V nadaljevanju so želeli preveriti, ali je aktivacija stikalnega sistema ireverzibilna. V ta namen so bakterije čez noč gojili v gojišču z znano koncentracijo dietilentriamina/NO in jih nato naslednji dan prenesli v gojišče, kjer NO ni bil prisoten. V naslednjih 72 urah so odvzemali vzorce in merili intenziteto bioluminiscence ter jo ponovno normirali glede na OD600. Dobljen signal je bil približno 200-krat močnejši kot pri negativni kontroli. To je potrdilo, da je stikalni sistem ireverzibilno v aktivnem stanju tudi po izgubi stimulacije z NO. Poleg tega se aktivno stanje stikalnega sistema prenaša s celično delitvijo na hčerinske celice. <br /> <br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vivo''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Za in vivo eksperimente so uporabili Balb/C miši, ki so jim v podkožje implantirali tumorske celice linije CT-26. Najprej so želeli preveriti, ali bakterije ''S''. Typhimurium, transformirane s plazmidoma pSRluc8 in pFimE, specifično kolonizirajo tumorje in sprožijo imunski odziv v miših. V miši so injicirali 1*10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; CFU bakterij in miši čez 1, 3, 5, 7 ali 11 dni evtanazirali. V izoliranih tumorjih so določili število bakterij ''S''. Typhimurium naredili primerjavo s tremi zdravimi organi (pljuča, vranica, jetra), ki so služili kot kontrola selektivnosti kolonizacije. Že prvi dan po injiciranju bakterij je bilo njihovo število v tumorjih približno 10 000-krat višje kot v kontrolnih organih. Z podaljševanjem časa med injiciranjem bakterij in evtanazijo miši je število bakterij v tumorju in kontrolnih organih padalo, vendar je bilo tudi na 11. dan v tumorju število bakterij višje. <br /> <br /> Sprožitev imunskega odziva v miši so določali z merjenjem koncentracije provnetnih citokinov IFN-γ, TNF-α in IL-1β v tumorskem tkivu. V ta namen so uporabili test ELISA. Meritve so izvajali 1,3,5 in 7 dni po injiciranju bakterij. Kot negativno kontrolo so v miši injicirali PBS. Koncentracija TNF-α in IL-1β je bila višja kot pri negativni kontroli že po enem dnevu, medtem ko je bila koncentracija IFN-γ višja od negativne kontrole šele po treh dneh. S časom so koncentracije vseh treh citokinov padale, vendar so bile tudi na sedmi dan še vedno višje kot pri negativni kontroli. <br /> <br /> Nato so želeli preveriti, ali je možno stikalni sistem uporabiti za tarčno ''in vivo'' dostavo genov na mesto tumorja. V ta namen so miši injicirali s plazmidoma pSRluc8 in pFimE ali zgolj z pSRluc8 (negativna kontrola). Pred meritvijo intenzitete bioluminiscence so mišim injicirali tudi koelenterazin. Intenziteta bioluminiscence na mestu tumorja je naraščala do sedmega dneva po injiciranju bakterij transformiranih z obema plazmidoma. Razlika v primerjavi z negativno kontrolo je bila v tem časovnem intervalu statistično signifikantna. To pomeni, da je stikalni sistem ostal aktiven oz. da je prišlo do izražanja reporterskega gena tudi, ko so koncentracije provnetnih citokinov že začele upadati.<br /> <br /> Nazadnje so želeli preveriti še, ali je NO v tumorskem mikrookolju posledica delovanja inducibilne NO sintaze. Tri dni pred injiciranjem bakterij, transformiranih z obema plazmidoma, so začeli mišim vsakodnevno intraperitonalno vnašati inhibitor iNOS, imenovan 1400W dihidroklorid. Inhibitor so vsakodnevno vnašali tudi po injiciranju bakterij. Kot kontrolo so uporabili miši, ki so jim injicirali bakterije, ne pa tudi inhibitorja. Bioluminiscenčni signal so merili 3, 5, 7 in 9 dni po injeciranju bakterij. Vse dni merjenja je bila ntenziteta bioluminiscence višja pri miših brez inhibitorja iNOS. S tem so potrdili, da je inducibilna NO sintaza sintetizirala NO, ki je aktiviral stikalni sistem.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so v organizmu ''Salmonella enterica'' podvrsti ''enterica'' serotipu Typhimurioum zasnovali stikalni sistem, ki se odziva na NO. Funkcionalnost stikalnega sistema so potrdili ''in vitro'', kjer se je odzival na kemijski vir NO, ki je sprožil ireverzibilno aktivacijo stikalnega sistema. Aktivacija se je ohranila tudi po odvzemu NO iz gojišča, pri celični delitvi pa se je prenesla na hčerinske celice. ''In vivo'' so potrdili, da ''S''. Typhimurioum, ki nosijo zapis za stikalni sistem, specifično kolonizirajo tumorsko tkivo. Stikalni sistem se je v tem primeru specifično aktiviral z NO, ki ga je sintetizirala inducibilna NO sintaza. Rezultati raziskave namigujejo, da bi v prihodnosti lahko izkoristili NO kot inducer za tarčno dostavo genov oz. proteinov, ki jih zapisujejo, do mesta tumorjev. Na ta način se nam odpira možnost za razvoj novih dostavnih sistemov za zdravljenje raka.<br /> <br /> ==Viri=<br /> [1] Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.<br /> <br /> [2] M. T.-Q. Duong, Y. Qin, S.-H. You, J.-J. Min: Bacteria-Cancer Interactions: Bacteria-Based Cancer Therapy. Exp Mol Med 2019, 51, 1–15.<br /> <br /> [3] Q. Xue, Y. Yan, R. Zhang, H. Xiong: Regulation of INOS on Immune Cells and Its Role in Diseases. Int J Mol Sci 2018, 19, 3805.<br /> <br /> [4] A. M. Gardner, C. R. Gessner, P. R. Gardner: Regulation of the Nitric Oxide Reduction Operon (NorRVW) in Escherichia Coli. Journal of Biological Chemistry 2003, 278, 10081–10086.<br /> <br /> [5] W. R. Schwan: Regulation of Fim Genes in Uropathogenic Escherichia Coli. World J Clin Infect Dis 2011, 1, 17.</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:AnaKodra&diff=21803 2023-04-15T19:05:03Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>'''GENETSKO PROGRAMIRANJE TUMOR CILJAJOČIH BAKTERIJ S STIKALNIM SISTEMOM, KI SE ODZIVA NA DUŠIKOV(II) OKSID'''<br /> <br /> Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']<br /> <br /> ==Uvod==<br /> V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju.<br /> <br /> ==Princip delovanja stikalnega sistema==<br /> Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.<br /> Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ&lt;sup&gt;54&lt;/sup&gt; podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno. <br /> <br /> Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja. <br /> <br /> Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P&lt;sub&gt;norV&lt;/sub&gt; iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja PnorV. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P&lt;sub&gt;lacIq&lt;/sub&gt;. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo. <br /> <br /> NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vitro''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Delovanje stikalnega sistema so najprej potrdili ''in vitro''. V ta namen so kot vir NO uporabili mešanico dietilentriamin/NO, ki so jo pri različnih koncentracijah dodali v gojišče. Transformirane bakerije so gojili 16 h pri 37°C, dodali substrat za Rluc8 in izmerili intenziteto bioluminiscence. Le-to so nato normirali glede na izmerjeno optično gostoto pri 600 nm in potrdili, da pri višjih koncentracijah NO dobljen signal narašča. Kot negativno kontrolo so uporabili bakterije, ki so jih transformirali samo s plazmidom pSRluc8. V tem primeru bioluminiscence niso zaznali niti pri najvišjih koncentracijah NO, kar pomeni, da do izražanje Rluc8 ni prišlo. To se je ujemalo s pričakovanji, saj bakterije niso vsebovale zapisa za FimE, ki bi lahko invertiral promotorsko zaporedje v ''fimS''. <br /> <br /> V nadaljevanju so želeli preveriti, ali je aktivacija stikalnega sistema ireverzibilna. V ta namen so bakterije čez noč gojili v gojišču z znano koncentracijo dietilentriamina/NO in jih nato naslednji dan prenesli v gojišče, kjer NO ni bil prisoten. V naslednjih 72 urah so odvzemali vzorce in merili intenziteto bioluminiscence ter jo ponovno normirali glede na OD600. Dobljen signal je bil približno 200-krat močnejši kot pri negativni kontroli. To je potrdilo, da je stikalni sistem ireverzibilno v aktivnem stanju tudi po izgubi stimulacije z NO. Poleg tega se aktivno stanje stikalnega sistema prenaša s celično delitvijo na hčerinske celice. <br /> <br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vivo''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Za in vivo eksperimente so uporabili Balb/C miši, ki so jim v podkožje implantirali tumorske celice linije CT-26. Najprej so želeli preveriti, ali bakterije ''S''. Typhimurium, transformirane s plazmidoma pSRluc8 in pFimE, specifično kolonizirajo tumorje in sprožijo imunski odziv v miših. V miši so injicirali 1*10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; CFU bakterij in miši čez 1, 3, 5, 7 ali 11 dni evtanazirali. V izoliranih tumorjih so določili število bakterij ''S''. Typhimurium naredili primerjavo s tremi zdravimi organi (pljuča, vranica, jetra), ki so služili kot kontrola selektivnosti kolonizacije. Že prvi dan po injiciranju bakterij je bilo njihovo število v tumorjih približno 10 000-krat višje kot v kontrolnih organih. Z podaljševanjem časa med injiciranjem bakterij in evtanazijo miši je število bakterij v tumorju in kontrolnih organih padalo, vendar je bilo tudi na 11. dan v tumorju število bakterij višje. <br /> <br /> Sprožitev imunskega odziva v miši so določali z merjenjem koncentracije provnetnih citokinov IFN-γ, TNF-α in IL-1β v tumorskem tkivu. V ta namen so uporabili test ELISA. Meritve so izvajali 1,3,5 in 7 dni po injiciranju bakterij. Kot negativno kontrolo so v miši injicirali PBS. Koncentracija TNF-α in IL-1β je bila višja kot pri negativni kontroli že po enem dnevu, medtem ko je bila koncentracija IFN-γ višja od negativne kontrole šele po treh dneh. S časom so koncentracije vseh treh citokinov padale, vendar so bile tudi na sedmi dan še vedno višje kot pri negativni kontroli. <br /> <br /> Nato so želeli preveriti, ali je možno stikalni sistem uporabiti za tarčno ''in vivo'' dostavo genov na mesto tumorja. V ta namen so miši injicirali s plazmidoma pSRluc8 in pFimE ali zgolj z pSRluc8 (negativna kontrola). Pred meritvijo intenzitete bioluminiscence so mišim injicirali tudi koelenterazin. Intenziteta bioluminiscence na mestu tumorja je naraščala do sedmega dneva po injiciranju bakterij transformiranih z obema plazmidoma. Razlika v primerjavi z negativno kontrolo je bila v tem časovnem intervalu statistično signifikantna. To pomeni, da je stikalni sistem ostal aktiven oz. da je prišlo do izražanja reporterskega gena tudi, ko so koncentracije provnetnih citokinov že začele upadati.<br /> <br /> Nazadnje so želeli preveriti še, ali je NO v tumorskem mikrookolju posledica delovanja inducibilne NO sintaze. Tri dni pred injiciranjem bakterij, transformiranih z obema plazmidoma, so začeli mišim vsakodnevno intraperitonalno vnašati inhibitor iNOS, imenovan 1400W dihidroklorid. Inhibitor so vsakodnevno vnašali tudi po injiciranju bakterij. Kot kontrolo so uporabili miši, ki so jim injicirali bakterije, ne pa tudi inhibitorja. Bioluminiscenčni signal so merili 3, 5, 7 in 9 dni po injeciranju bakterij. Vse dni merjenja je bila ntenziteta bioluminiscence višja pri miših brez inhibitorja iNOS. S tem so potrdili, da je inducibilna NO sintaza sintetizirala NO, ki je aktiviral stikalni sistem.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so v organizmu ''Salmonella enterica'' podvrsti ''enterica'' serotipu Typhimurioum zasnovali stikalni sistem, ki se odziva na NO. Funkcionalnost stikalnega sistema so potrdili ''in vitro'', kjer se je odzival na kemijski vir NO, ki je sprožil ireverzibilno aktivacijo stikalnega sistema. Aktivacija se je ohranila tudi po odvzemu NO iz gojišča, pri celični delitvi pa se je prenesla na hčerinske celice. ''In vivo'' so potrdili, da ''S''. Typhimurioum, ki nosijo zapis za stikalni sistem, specifično kolonizirajo tumorsko tkivo. Stikalni sistem se je v tem primeru specifično aktiviral z NO, ki ga je sintetizirala inducibilna NO sintaza. Rezultati raziskave namigujejo, da bi v prihodnosti lahko izkoristili NO kot inducer za tarčno dostavo genov oz. proteinov, ki jih zapisujejo, do mesta tumorjev. Na ta način se nam odpira možnost za razvoj novih dostavnih sistemov za zdravljenje raka.<br /> <br /> ==Viri=<br /> [1] Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.<br /> [2] M. T.-Q. Duong, Y. Qin, S.-H. You, J.-J. Min: Bacteria-Cancer Interactions: Bacteria-Based Cancer Therapy. Exp Mol Med 2019, 51, 1–15.<br /> [3] Q. Xue, Y. Yan, R. Zhang, H. Xiong: Regulation of INOS on Immune Cells and Its Role in Diseases. Int J Mol Sci 2018, 19, 3805.<br /> [4] A. M. Gardner, C. R. Gessner, P. R. Gardner: Regulation of the Nitric Oxide Reduction Operon (NorRVW) in Escherichia Coli. Journal of Biological Chemistry 2003, 278, 10081–10086.<br /> [5] W. R. Schwan: Regulation of Fim Genes in Uropathogenic Escherichia Coli. World J Clin Infect Dis 2011, 1, 17.</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:AnaKodra&diff=21802 2023-04-15T19:04:06Z

<p>AnaKodra: /* Rezultati */</p> <hr /> <div>'''GENETSKO PROGRAMIRANJE TUMOR CILJAJOČIH BAKTERIJ S STIKALNIM SISTEMOM, KI SE ODZIVA NA DUŠIKOV(II) OKSID'''<br /> <br /> Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']<br /> <br /> ==Uvod==<br /> V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju.<br /> <br /> ==Princip delovanja stikalnega sistema==<br /> Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.<br /> Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ&lt;sup&gt;54&lt;/sup&gt; podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno. <br /> <br /> Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja. <br /> <br /> Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P&lt;sub&gt;norV&lt;/sub&gt; iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja PnorV. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P&lt;sub&gt;lacIq&lt;/sub&gt;. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo. <br /> <br /> NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vitro''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Delovanje stikalnega sistema so najprej potrdili ''in vitro''. V ta namen so kot vir NO uporabili mešanico dietilentriamin/NO, ki so jo pri različnih koncentracijah dodali v gojišče. Transformirane bakerije so gojili 16 h pri 37°C, dodali substrat za Rluc8 in izmerili intenziteto bioluminiscence. Le-to so nato normirali glede na izmerjeno optično gostoto pri 600 nm in potrdili, da pri višjih koncentracijah NO dobljen signal narašča. Kot negativno kontrolo so uporabili bakterije, ki so jih transformirali samo s plazmidom pSRluc8. V tem primeru bioluminiscence niso zaznali niti pri najvišjih koncentracijah NO, kar pomeni, da do izražanje Rluc8 ni prišlo. To se je ujemalo s pričakovanji, saj bakterije niso vsebovale zapisa za FimE, ki bi lahko invertiral promotorsko zaporedje v ''fimS''. <br /> <br /> V nadaljevanju so želeli preveriti, ali je aktivacija stikalnega sistema ireverzibilna. V ta namen so bakterije čez noč gojili v gojišču z znano koncentracijo dietilentriamina/NO in jih nato naslednji dan prenesli v gojišče, kjer NO ni bil prisoten. V naslednjih 72 urah so odvzemali vzorce in merili intenziteto bioluminiscence ter jo ponovno normirali glede na OD600. Dobljen signal je bil približno 200-krat močnejši kot pri negativni kontroli. To je potrdilo, da je stikalni sistem ireverzibilno v aktivnem stanju tudi po izgubi stimulacije z NO. Poleg tega se aktivno stanje stikalnega sistema prenaša s celično delitvijo na hčerinske celice. <br /> <br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vivo''&lt;/u&gt;<br /> <br /> Za in vivo eksperimente so uporabili Balb/C miši, ki so jim v podkožje implantirali tumorske celice linije CT-26. Najprej so želeli preveriti, ali bakterije ''S''. Typhimurium, transformirane s plazmidoma pSRluc8 in pFimE, specifično kolonizirajo tumorje in sprožijo imunski odziv v miših. V miši so injicirali 1*10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; CFU bakterij in miši čez 1, 3, 5, 7 ali 11 dni evtanazirali. V izoliranih tumorjih so določili število bakterij ''S''. Typhimurium naredili primerjavo s tremi zdravimi organi (pljuča, vranica, jetra), ki so služili kot kontrola selektivnosti kolonizacije. Že prvi dan po injiciranju bakterij je bilo njihovo število v tumorjih približno 10 000-krat višje kot v kontrolnih organih. Z podaljševanjem časa med injiciranjem bakterij in evtanazijo miši je število bakterij v tumorju in kontrolnih organih padalo, vendar je bilo tudi na 11. dan v tumorju število bakterij višje. <br /> <br /> Sprožitev imunskega odziva v miši so določali z merjenjem koncentracije provnetnih citokinov IFN-γ, TNF-α in IL-1β v tumorskem tkivu. V ta namen so uporabili test ELISA. Meritve so izvajali 1,3,5 in 7 dni po injiciranju bakterij. Kot negativno kontrolo so v miši injicirali PBS. Koncentracija TNF-α in IL-1β je bila višja kot pri negativni kontroli že po enem dnevu, medtem ko je bila koncentracija IFN-γ višja od negativne kontrole šele po treh dneh. S časom so koncentracije vseh treh citokinov padale, vendar so bile tudi na sedmi dan še vedno višje kot pri negativni kontroli. <br /> <br /> Nato so želeli preveriti, ali je možno stikalni sistem uporabiti za tarčno ''in vivo'' dostavo genov na mesto tumorja. V ta namen so miši injicirali s plazmidoma pSRluc8 in pFimE ali zgolj z pSRluc8 (negativna kontrola). Pred meritvijo intenzitete bioluminiscence so mišim injicirali tudi koelenterazin. Intenziteta bioluminiscence na mestu tumorja je naraščala do sedmega dneva po injiciranju bakterij transformiranih z obema plazmidoma. Razlika v primerjavi z negativno kontrolo je bila v tem časovnem intervalu statistično signifikantna. To pomeni, da je stikalni sistem ostal aktiven oz. da je prišlo do izražanja reporterskega gena tudi, ko so koncentracije provnetnih citokinov že začele upadati.<br /> <br /> Nazadnje so želeli preveriti še, ali je NO v tumorskem mikrookolju posledica delovanja inducibilne NO sintaze. Tri dni pred injiciranjem bakterij, transformiranih z obema plazmidoma, so začeli mišim vsakodnevno intraperitonalno vnašati inhibitor iNOS, imenovan 1400W dihidroklorid. Inhibitor so vsakodnevno vnašali tudi po injiciranju bakterij. Kot kontrolo so uporabili miši, ki so jim injicirali bakterije, ne pa tudi inhibitorja. Bioluminiscenčni signal so merili 3, 5, 7 in 9 dni po injeciranju bakterij. Vse dni merjenja je bila ntenziteta bioluminiscence višja pri miših brez inhibitorja iNOS. S tem so potrdili, da je inducibilna NO sintaza sintetizirala NO, ki je aktiviral stikalni sistem.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so v organizmu ''Salmonella enterica'' podvrsti ''enterica'' serotipu Typhimurioum zasnovali stikalni sistem, ki se odziva na NO. Funkcionalnost stikalnega sistema so potrdili ''in vitro'', kjer se je odzival na kemijski vir NO, ki je sprožil ireverzibilno aktivacijo stikalnega sistema. Aktivacija se je ohranila tudi po odvzemu NO iz gojišča, pri celični delitvi pa se je prenesla na hčerinske celice. ''In vivo'' so potrdili, da ''S''. Typhimurioum, ki nosijo zapis za stikalni sistem, specifično kolonizirajo tumorsko tkivo. Stikalni sistem se je v tem primeru specifično aktiviral z NO, ki ga je sintetizirala inducibilna NO sintaza. Rezultati raziskave namigujejo, da bi v prihodnosti lahko izkoristili NO kot inducer za tarčno dostavo genov oz. proteinov, ki jih zapisujejo, do mesta tumorjev. Na ta način se nam odpira možnost za razvoj novih dostavnih sistemov za zdravljenje raka.</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:AnaKodra&diff=21801 2023-04-15T19:03:45Z

<p>AnaKodra: /* Rezultati */</p> <hr /> <div>'''GENETSKO PROGRAMIRANJE TUMOR CILJAJOČIH BAKTERIJ S STIKALNIM SISTEMOM, KI SE ODZIVA NA DUŠIKOV(II) OKSID'''<br /> <br /> Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']<br /> <br /> ==Uvod==<br /> V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju.<br /> <br /> ==Princip delovanja stikalnega sistema==<br /> Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.<br /> Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ&lt;sup&gt;54&lt;/sup&gt; podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno. <br /> <br /> Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja. <br /> <br /> Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P&lt;sub&gt;norV&lt;/sub&gt; iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja PnorV. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P&lt;sub&gt;lacIq&lt;/sub&gt;. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo. <br /> <br /> NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vitro''&lt;/u&gt;<br /> Delovanje stikalnega sistema so najprej potrdili ''in vitro''. V ta namen so kot vir NO uporabili mešanico dietilentriamin/NO, ki so jo pri različnih koncentracijah dodali v gojišče. Transformirane bakerije so gojili 16 h pri 37°C, dodali substrat za Rluc8 in izmerili intenziteto bioluminiscence. Le-to so nato normirali glede na izmerjeno optično gostoto pri 600 nm in potrdili, da pri višjih koncentracijah NO dobljen signal narašča. Kot negativno kontrolo so uporabili bakterije, ki so jih transformirali samo s plazmidom pSRluc8. V tem primeru bioluminiscence niso zaznali niti pri najvišjih koncentracijah NO, kar pomeni, da do izražanje Rluc8 ni prišlo. To se je ujemalo s pričakovanji, saj bakterije niso vsebovale zapisa za FimE, ki bi lahko invertiral promotorsko zaporedje v ''fimS''. <br /> <br /> V nadaljevanju so želeli preveriti, ali je aktivacija stikalnega sistema ireverzibilna. V ta namen so bakterije čez noč gojili v gojišču z znano koncentracijo dietilentriamina/NO in jih nato naslednji dan prenesli v gojišče, kjer NO ni bil prisoten. V naslednjih 72 urah so odvzemali vzorce in merili intenziteto bioluminiscence ter jo ponovno normirali glede na OD600. Dobljen signal je bil približno 200-krat močnejši kot pri negativni kontroli. To je potrdilo, da je stikalni sistem ireverzibilno v aktivnem stanju tudi po izgubi stimulacije z NO. Poleg tega se aktivno stanje stikalnega sistema prenaša s celično delitvijo na hčerinske celice. <br /> <br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vivo''&lt;/u&gt;<br /> Za in vivo eksperimente so uporabili Balb/C miši, ki so jim v podkožje implantirali tumorske celice linije CT-26. Najprej so želeli preveriti, ali bakterije ''S''. Typhimurium, transformirane s plazmidoma pSRluc8 in pFimE, specifično kolonizirajo tumorje in sprožijo imunski odziv v miših. V miši so injicirali 1*10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; CFU bakterij in miši čez 1, 3, 5, 7 ali 11 dni evtanazirali. V izoliranih tumorjih so določili število bakterij ''S''. Typhimurium naredili primerjavo s tremi zdravimi organi (pljuča, vranica, jetra), ki so služili kot kontrola selektivnosti kolonizacije. Že prvi dan po injiciranju bakterij je bilo njihovo število v tumorjih približno 10 000-krat višje kot v kontrolnih organih. Z podaljševanjem časa med injiciranjem bakterij in evtanazijo miši je število bakterij v tumorju in kontrolnih organih padalo, vendar je bilo tudi na 11. dan v tumorju število bakterij višje. <br /> <br /> Sprožitev imunskega odziva v miši so določali z merjenjem koncentracije provnetnih citokinov IFN-γ, TNF-α in IL-1β v tumorskem tkivu. V ta namen so uporabili test ELISA. Meritve so izvajali 1,3,5 in 7 dni po injiciranju bakterij. Kot negativno kontrolo so v miši injicirali PBS. Koncentracija TNF-α in IL-1β je bila višja kot pri negativni kontroli že po enem dnevu, medtem ko je bila koncentracija IFN-γ višja od negativne kontrole šele po treh dneh. S časom so koncentracije vseh treh citokinov padale, vendar so bile tudi na sedmi dan še vedno višje kot pri negativni kontroli. <br /> <br /> Nato so želeli preveriti, ali je možno stikalni sistem uporabiti za tarčno ''in vivo'' dostavo genov na mesto tumorja. V ta namen so miši injicirali s plazmidoma pSRluc8 in pFimE ali zgolj z pSRluc8 (negativna kontrola). Pred meritvijo intenzitete bioluminiscence so mišim injicirali tudi koelenterazin. Intenziteta bioluminiscence na mestu tumorja je naraščala do sedmega dneva po injiciranju bakterij transformiranih z obema plazmidoma. Razlika v primerjavi z negativno kontrolo je bila v tem časovnem intervalu statistično signifikantna. To pomeni, da je stikalni sistem ostal aktiven oz. da je prišlo do izražanja reporterskega gena tudi, ko so koncentracije provnetnih citokinov že začele upadati.<br /> <br /> Nazadnje so želeli preveriti še, ali je NO v tumorskem mikrookolju posledica delovanja inducibilne NO sintaze. Tri dni pred injiciranjem bakterij, transformiranih z obema plazmidoma, so začeli mišim vsakodnevno intraperitonalno vnašati inhibitor iNOS, imenovan 1400W dihidroklorid. Inhibitor so vsakodnevno vnašali tudi po injiciranju bakterij. Kot kontrolo so uporabili miši, ki so jim injicirali bakterije, ne pa tudi inhibitorja. Bioluminiscenčni signal so merili 3, 5, 7 in 9 dni po injeciranju bakterij. Vse dni merjenja je bila ntenziteta bioluminiscence višja pri miših brez inhibitorja iNOS. S tem so potrdili, da je inducibilna NO sintaza sintetizirala NO, ki je aktiviral stikalni sistem. <br /> <br /> ==Zaključek==<br /> V članku so v organizmu ''Salmonella enterica'' podvrsti ''enterica'' serotipu Typhimurioum zasnovali stikalni sistem, ki se odziva na NO. Funkcionalnost stikalnega sistema so potrdili ''in vitro'', kjer se je odzival na kemijski vir NO, ki je sprožil ireverzibilno aktivacijo stikalnega sistema. Aktivacija se je ohranila tudi po odvzemu NO iz gojišča, pri celični delitvi pa se je prenesla na hčerinske celice. ''In vivo'' so potrdili, da ''S''. Typhimurioum, ki nosijo zapis za stikalni sistem, specifično kolonizirajo tumorsko tkivo. Stikalni sistem se je v tem primeru specifično aktiviral z NO, ki ga je sintetizirala inducibilna NO sintaza. Rezultati raziskave namigujejo, da bi v prihodnosti lahko izkoristili NO kot inducer za tarčno dostavo genov oz. proteinov, ki jih zapisujejo, do mesta tumorjev. Na ta način se nam odpira možnost za razvoj novih dostavnih sistemov za zdravljenje raka.</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:AnaKodra&diff=21800 2023-04-15T18:57:18Z

<p>AnaKodra: /* Rezultati */</p> <hr /> <div>'''GENETSKO PROGRAMIRANJE TUMOR CILJAJOČIH BAKTERIJ S STIKALNIM SISTEMOM, KI SE ODZIVA NA DUŠIKOV(II) OKSID'''<br /> <br /> Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']<br /> <br /> ==Uvod==<br /> V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju.<br /> <br /> ==Princip delovanja stikalnega sistema==<br /> Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.<br /> Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ&lt;sup&gt;54&lt;/sup&gt; podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno. <br /> <br /> Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja. <br /> <br /> Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P&lt;sub&gt;norV&lt;/sub&gt; iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja PnorV. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P&lt;sub&gt;lacIq&lt;/sub&gt;. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo. <br /> <br /> NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> &lt;u&gt;Rezultati ''in vitro''&lt;/u&gt;</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:AnaKodra&diff=21799 2023-04-15T18:56:17Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>'''GENETSKO PROGRAMIRANJE TUMOR CILJAJOČIH BAKTERIJ S STIKALNIM SISTEMOM, KI SE ODZIVA NA DUŠIKOV(II) OKSID'''<br /> <br /> Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']<br /> <br /> ==Uvod==<br /> V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju.<br /> <br /> ==Princip delovanja stikalnega sistema==<br /> Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.<br /> Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ&lt;sup&gt;54&lt;/sup&gt; podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno. <br /> <br /> Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja. <br /> <br /> Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P&lt;sub&gt;norV&lt;/sub&gt; iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja PnorV. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P&lt;sub&gt;lacIq&lt;/sub&gt;. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo. <br /> <br /> NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.<br /> <br /> ==Rezultati==<br /> {{underline|Rezultati ''in vitro''}}</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:AnaKodra&diff=21798 2023-04-15T18:54:17Z

<p>AnaKodra: /* Princip delovanja stikalnega sistema */</p> <hr /> <div>'''GENETSKO PROGRAMIRANJE TUMOR CILJAJOČIH BAKTERIJ S STIKALNIM SISTEMOM, KI SE ODZIVA NA DUŠIKOV(II) OKSID'''<br /> <br /> Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']<br /> <br /> ==Uvod==<br /> V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju.<br /> <br /> ==Princip delovanja stikalnega sistema==<br /> Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.<br /> Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ&lt;sup&gt;54&lt;/sup&gt; podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno. <br /> <br /> Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja. <br /> <br /> Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P&lt;sub&gt;norV&lt;/sub&gt; iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja PnorV. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P&lt;sub&gt;lacIq&lt;/sub&gt;. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo. <br /> <br /> NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:AnaKodra&diff=21797 2023-04-15T18:53:04Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>'''GENETSKO PROGRAMIRANJE TUMOR CILJAJOČIH BAKTERIJ S STIKALNIM SISTEMOM, KI SE ODZIVA NA DUŠIKOV(II) OKSID'''<br /> <br /> Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']<br /> <br /> ==Uvod==<br /> V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju.<br /> <br /> ==Princip delovanja stikalnega sistema==<br /> Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.<br /> Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ&lt;sup&gt;54&lt;/sup&gt; podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno. <br /> Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja. <br /> Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P&lt;sub&gt;norV&lt;/sub&gt; iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja PnorV. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P&lt;sub&gt;lacIq&lt;/sub&gt;. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo. <br /> NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:AnaKodra&diff=21796 2023-04-15T18:48:23Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>'''GENETSKO PROGRAMIRANJE TUMOR CILJAJOČIH BAKTERIJ S STIKALNIM SISTEMOM, KI SE ODZIVA NA DUŠIKOV(II) OKSID'''<br /> <br /> Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']<br /> <br /> ==Uvod==<br /> V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju.<br /> <br /> ==Princip delovanja stikalnega sistema==<br /> Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.<br /> Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana norV in norW, sta del operona norRVW, kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ54 podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno. <br /> Operon fim so odkrili v patogenem sevu E. coli, ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano fimS. FimS vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja fimS se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje fimS proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje fimS samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja. <br /> Za pripravo bakterij S. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor PnorV iz operona norRVW ter rekombinazo FimE in zaporedje fimS iz operona fim. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja PnorV. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja PlacIq. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma Renilla, imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju fimS, ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo. <br /> NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju fimS, kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:AnaKodra&diff=21795 2023-04-15T18:44:10Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>'''GENETSKO PROGRAMIRANJE TUMOR CILJAJOČIH BAKTERIJ S STIKALNIM SISTEMOM, KI SE ODZIVA NA DUŠIKOV(II) OKSID'''<br /> <br /> Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']<br /> <br /> ==Uvod==<br /> V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju.</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:AnaKodra&diff=21794 2023-04-15T18:41:48Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>'''GENETSKO PROGRAMIRANJE TUMOR CILJAJOČIH BAKTERIJ S STIKALNIM SISTEMOM, KI SE ODZIVA NA DUŠIKOV(II) OKSID'''<br /> <br /> Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']<br /> <br /> ==Uvod==</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:AnaKodra&diff=21793 2023-04-15T18:41:23Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>'''GENETSKO PROGRAMIRANJE TUMOR CILJAJOČIH BAKTERIJ S STIKALNIM SISTEMOM, KI SE ODZIVA NA DUŠIKOV(II) OKSID'''<br /> <br /> Povzeto po članku [https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/266 ''Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.'']</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:AnaKodra&diff=21792 2023-04-15T18:39:28Z

<p>AnaKodra: New page: &#039;&#039;&#039;GENETSKO PROGRAMIRANJE TUMOR CILJAJOČIH BAKTERIJ S STIKALNIM SISTEMOM, KI SE ODZIVA NA DUŠIKOV(II) OKSID&#039;&#039;&#039;</p> <hr /> <div>'''GENETSKO PROGRAMIRANJE TUMOR CILJAJOČIH BAKTERIJ S STIKALNIM SISTEMOM, KI SE ODZIVA NA DUŠIKOV(II) OKSID'''</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20282 2022-04-24T09:08:00Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>Neža Lanišek: Uvod, Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji<br /> <br /> Ana Marija Kodra: Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah, Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka<br /> <br /> Gašper Možina:</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20274 2022-04-23T21:17:07Z

<p>AnaKodra: /* Viri */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.<br /> <br /> Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.<br /> <br /> '''Mehanizem retrotranspozicije LINE-1'''<br /> <br /> Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu &quot;na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije&quot; (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.<br /> <br /> '''Regulacija aktivnosti LINE-1'''<br /> <br /> Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.<br /> <br /> ==Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji==<br /> V predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 v tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.<br /> <br /> Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA v predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena v stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže v stopnji osemceličnega zarodka.<br /> <br /> Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je v predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.<br /> <br /> Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.<br /> <br /> N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.<br /> <br /> Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).<br /> <br /> ==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah==<br /> Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo. <br /> <br /> Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi regulatorna pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh se izražajo štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), samo tri Piwi proteine pa so identificirali pri miših (Miwi, Mili in Miwi2) in pri ''Drosophila melanogaster'' (Piwi, Aub in Ago3). piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 RNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Poleg tega lahko kompleks piRNA-Piwi reprimira aktivnost L1 tudi preko posredovanja pri de novo metilaciji DNA ter pri modifikaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Ni pa še bolj podrobno raziskano, kakšna je točna vloga piRNA-Piwi pri teh dveh procesih.<br /> <br /> Mehanizem direktne interakcije piRNA-Piwi z L1 mRNA je bil študiran na vinskih mušicah. Ključni sta bili opažanji, da (i) Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 RNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil in (ii) Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Po prepisu zaporedij za piRNA vsebuje RNA transkript zapise za več različnih piRNA hkrati. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' mestu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki se veže na Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.<br /> <br /> Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na post-transkripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi regulatorna pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT. <br /> <br /> ==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka==<br /> Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji. <br /> <br /> Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MeCP2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). Domneva se, da je dvojna vloga YY1 regulirana bodisi s posttranslacijskimi modifikacijami proteina (acetilacija) bodisi preko interakcij z različnimi kofaktorji. Ko YY1 deluje kot represor L1, se veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz.<br /> <br /> ==Viri==<br /> [1] Protasova, Maria Sergeevna, Tatiana Vladimirovna Andreeva, and Evgeny Ivanovich Rogaev. “Factors Regulating the Activity of LINE1 Retrotransposons.” Genes 12, no. 10 (2021): 1562. https://doi.org/10.3390/genes12101562.<br /> <br /> [2] Brennecke, Julius, Alexei A. Aravin, Alexander Stark, Monica Dus, Manolis Kellis, Ravi Sachidanandam, and Gregory J. Hannon. “Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila.” Cell 128, no. 6 (2007): 1089–1103. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.01.043.<br /> <br /> [3] Verheul, Thijs C., Levi van Hijfte, Elena Perenthaler, and Tahsin Stefan Barakat. “The Why of YY1: Mechanisms of Transcriptional Regulation by Yin Yang 1.” Frontiers in Cell and Developmental Biology 8 (2020). https://doi.org/10.3389/fcell.2020.592164. <br /> <br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20273 2022-04-23T21:15:15Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.<br /> <br /> Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.<br /> <br /> '''Mehanizem retrotranspozicije LINE-1'''<br /> <br /> Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu &quot;na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije&quot; (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.<br /> <br /> '''Regulacija aktivnosti LINE-1'''<br /> <br /> Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.<br /> <br /> ==Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji==<br /> V predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 v tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.<br /> <br /> Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA v predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena v stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže v stopnji osemceličnega zarodka.<br /> <br /> Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je v predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.<br /> <br /> Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.<br /> <br /> N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.<br /> <br /> Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).<br /> <br /> ==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah==<br /> Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo. <br /> <br /> Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi regulatorna pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh se izražajo štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), samo tri Piwi proteine pa so identificirali pri miših (Miwi, Mili in Miwi2) in pri ''Drosophila melanogaster'' (Piwi, Aub in Ago3). piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 RNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Poleg tega lahko kompleks piRNA-Piwi reprimira aktivnost L1 tudi preko posredovanja pri de novo metilaciji DNA ter pri modifikaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Ni pa še bolj podrobno raziskano, kakšna je točna vloga piRNA-Piwi pri teh dveh procesih.<br /> <br /> Mehanizem direktne interakcije piRNA-Piwi z L1 mRNA je bil študiran na vinskih mušicah. Ključni sta bili opažanji, da (i) Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 RNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil in (ii) Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Po prepisu zaporedij za piRNA vsebuje RNA transkript zapise za več različnih piRNA hkrati. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' mestu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki se veže na Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.<br /> <br /> Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na post-transkripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi regulatorna pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT. <br /> <br /> ==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka==<br /> Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji. <br /> <br /> Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MeCP2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). Domneva se, da je dvojna vloga YY1 regulirana bodisi s posttranslacijskimi modifikacijami proteina (acetilacija) bodisi preko interakcij z različnimi kofaktorji. Ko YY1 deluje kot represor L1, se veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz.<br /> <br /> ==Viri==<br /> [1] Protasova, Maria Sergeevna, Tatiana Vladimirovna Andreeva, and Evgeny Ivanovich Rogaev. “Factors Regulating the Activity of LINE1 Retrotransposons.” Genes 12, no. 10 (2021): 1562. https://doi.org/10.3390/genes12101562.<br /> <br /> [2] Brennecke, Julius, Alexei A. Aravin, Alexander Stark, Monica Dus, Manolis Kellis, Ravi Sachidanandam, and Gregory J. Hannon. “Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila.” Cell 128, no. 6 (2007): 1089–1103. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.01.043.<br /> <br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20265 2022-04-23T15:48:29Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.<br /> <br /> Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.<br /> <br /> '''Mehanizem retrotranspozicije LINE-1'''<br /> <br /> Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu &quot;na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije&quot; (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.<br /> <br /> '''Regulacija aktivnosti LINE-1'''<br /> <br /> Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.<br /> <br /> ==Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji==<br /> V predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 v tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.<br /> <br /> Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA v predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena v stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže v stopnji osemceličnega zarodka.<br /> <br /> Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je v predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.<br /> <br /> Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.<br /> <br /> N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.<br /> <br /> Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).<br /> <br /> ==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah==<br /> Za zarodne celice je značilna globalna demetilacija DNA. Aktivnost L1 je na nivoju transkripcije regulirana z de novo metilacijo. Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo. <br /> <br /> Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA, ki so dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh so prisotni štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), pri miših so bili identificirani zgolj trije (Miwi, Mili in Miwi2), pravtako ''Drosophila melanogaster'' izraža zgolj tri (Piwi, Aub in Ago3). <br /> piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 mRNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Mehanizem delovanja piRNA ter Piwi proteinov je bil študiran na vinskih mušicah. Znano je, da Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 mRNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil. Po drugi strani Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Skupki zapisov za piRNA se prepišejo v isti primarni transkript. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' koncu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki tvori kompleks z Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.<br /> Poleg direktne interakcije z L1 RNA je znano tudi, da kompleks piRNA-Piwi zniža aktivnost L1 preko posredovanja pri de novo DNA metilaciji ter pri metilaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Mehanizem, kako kompleks piRNA-Piwi sodeluje pri obeh procesih, še ni dodobra raziskan.<br /> <br /> Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na posttranskripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.<br /> <br /> ==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka==<br /> Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji.<br /> <br /> Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MePC2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). YY1 se namreč veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz. <br /> <br /> ==Viri==<br /> [1] Protasova, Maria Sergeevna, Tatiana Vladimirovna Andreeva, and Evgeny Ivanovich Rogaev. “Factors Regulating the Activity of LINE1 Retrotransposons.” Genes 12, no. 10 (2021): 1562. https://doi.org/10.3390/genes12101562.<br /> <br /> [2] Brennecke, Julius, Alexei A. Aravin, Alexander Stark, Monica Dus, Manolis Kellis, Ravi Sachidanandam, and Gregory J. Hannon. “Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila.” Cell 128, no. 6 (2007): 1089–1103. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.01.043.<br /> <br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20264 2022-04-23T15:46:26Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.<br /> <br /> Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.<br /> <br /> '''Mehanizem retrotranspozicije LINE-1'''<br /> <br /> Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu &quot;na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije&quot; (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.<br /> <br /> '''Regulacija aktivnosti LINE-1'''<br /> <br /> Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.<br /> <br /> ==Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji==<br /> V predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 v tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.<br /> <br /> Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA v predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena v stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže v stopnji osemceličnega zarodka.<br /> <br /> Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je v predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.<br /> <br /> Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.<br /> <br /> N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.<br /> <br /> Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).<br /> <br /> ==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah==<br /> Za zarodne celice je značilna globalna demetilacija DNA. Aktivnost L1 je na nivoju transkripcije regulirana z de novo metilacijo. Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo. <br /> <br /> Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA, ki so dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh so prisotni štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), pri miših so bili identificirani zgolj trije (Miwi, Mili in Miwi2), pravtako ''Drosophila melanogaster'' izraža zgolj tri (Piwi, Aub in Ago3). <br /> piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 mRNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Mehanizem delovanja piRNA ter Piwi proteinov je bil študiran na vinskih mušicah. Znano je, da Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 mRNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil. Po drugi strani Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Skupki zapisov za piRNA se prepišejo v isti primarni transkript. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' koncu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki tvori kompleks z Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.<br /> Poleg direktne interakcije z L1 RNA je znano tudi, da kompleks piRNA-Piwi zniža aktivnost L1 preko posredovanja pri de novo DNA metilaciji ter pri metilaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Mehanizem, kako kompleks piRNA-Piwi sodeluje pri obeh procesih, še ni dodobra raziskan.<br /> <br /> Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na posttranskripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.<br /> <br /> ==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka==<br /> Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji.<br /> <br /> Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MePC2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). YY1 se namreč veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz. <br /> <br /> ==Viri==<br /> [1] Protasova, Maria Sergeevna, Tatiana Vladimirovna Andreeva, and Evgeny Ivanovich Rogaev. “Factors Regulating the Activity of LINE1 Retrotransposons.” Genes 12, no. 10 (2021): 1562. https://doi.org/10.3390/genes12101562.<br /> <br /> [2] Brennecke, Julius, Alexei A. Aravin, Alexander Stark, Monica Dus, Manolis Kellis, Ravi Sachidanandam, and Gregory J. Hannon. “Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila.” Cell 128, no. 6 (2007): 1089–1103. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.01.043. <br /> <br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20263 2022-04-23T15:45:44Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.<br /> <br /> Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.<br /> <br /> '''Mehanizem retrotranspozicije LINE-1'''<br /> <br /> Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu &quot;na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije&quot; (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.<br /> <br /> '''Regulacija aktivnosti LINE-1'''<br /> <br /> Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.<br /> <br /> ==Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji==<br /> V predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 v tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.<br /> <br /> Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA v predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena v stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže v stopnji osemceličnega zarodka.<br /> <br /> Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je v predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.<br /> <br /> Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.<br /> <br /> N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.<br /> <br /> Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).<br /> <br /> ==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah==<br /> Za zarodne celice je značilna globalna demetilacija DNA. Aktivnost L1 je na nivoju transkripcije regulirana z de novo metilacijo. Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo. <br /> <br /> Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA, ki so dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh so prisotni štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), pri miših so bili identificirani zgolj trije (Miwi, Mili in Miwi2), pravtako ''Drosophila melanogaster'' izraža zgolj tri (Piwi, Aub in Ago3). <br /> piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 mRNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Mehanizem delovanja piRNA ter Piwi proteinov je bil študiran na vinskih mušicah. Znano je, da Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 mRNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil. Po drugi strani Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Skupki zapisov za piRNA se prepišejo v isti primarni transkript. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' koncu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki tvori kompleks z Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.<br /> Poleg direktne interakcije z L1 RNA je znano tudi, da kompleks piRNA-Piwi zniža aktivnost L1 preko posredovanja pri de novo DNA metilaciji ter pri metilaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Mehanizem, kako kompleks piRNA-Piwi sodeluje pri obeh procesih, še ni dodobra raziskan.<br /> <br /> Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na posttranskripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.<br /> <br /> ==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka==<br /> Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji.<br /> <br /> Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MePC2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). YY1 se namreč veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz. <br /> <br /> ==Viri==<br /> [1] Protasova, Maria Sergeevna, Tatiana Vladimirovna Andreeva, and Evgeny Ivanovich Rogaev. “Factors Regulating the Activity of LINE1 Retrotransposons.” Genes 12, no. 10 (2021): 1562. https://doi.org/10.3390/genes12101562.<br /> [2] Brennecke, Julius, Alexei A. Aravin, Alexander Stark, Monica Dus, Manolis Kellis, Ravi Sachidanandam, and Gregory J. Hannon. “Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila.” Cell 128, no. 6 (2007): 1089–1103. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.01.043. <br /> <br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20262 2022-04-23T15:43:29Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.<br /> <br /> Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.<br /> <br /> '''Mehanizem retrotranspozicije LINE-1'''<br /> <br /> Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu &quot;na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije&quot; (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.<br /> <br /> '''Regulacija aktivnosti LINE-1'''<br /> <br /> Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.<br /> <br /> ==Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji==<br /> V predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 v tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.<br /> <br /> Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA v predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena v stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže v stopnji osemceličnega zarodka.<br /> <br /> Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je v predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.<br /> <br /> Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.<br /> <br /> N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.<br /> <br /> Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).<br /> <br /> ==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah==<br /> Za zarodne celice je značilna globalna demetilacija DNA. Aktivnost L1 je na nivoju transkripcije regulirana z de novo metilacijo. Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo. <br /> Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA, ki so dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh so prisotni štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), pri miših so bili identificirani zgolj trije (Miwi, Mili in Miwi2), pravtako ''Drosophila melanogaster'' izraža zgolj tri (Piwi, Aub in Ago3). <br /> piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 mRNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Mehanizem delovanja piRNA ter Piwi proteinov je bil študiran na vinskih mušicah. Znano je, da Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 mRNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil. Po drugi strani Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Skupki zapisov za piRNA se prepišejo v isti primarni transkript. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' koncu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki tvori kompleks z Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.<br /> Poleg direktne interakcije z L1 RNA je znano tudi, da kompleks piRNA-Piwi zniža aktivnost L1 preko posredovanja pri de novo DNA metilaciji ter pri metilaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Mehanizem, kako kompleks piRNA-Piwi sodeluje pri obeh procesih, še ni dodobra raziskan.<br /> <br /> Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na posttranskripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.<br /> <br /> ==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka==<br /> Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji.<br /> <br /> Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MePC2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). YY1 se namreč veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz. <br /> <br /> ==Viri==<br /> [1] Protasova, Maria Sergeevna, Tatiana Vladimirovna Andreeva, and Evgeny Ivanovich Rogaev. “Factors Regulating the Activity of LINE1 Retrotransposons.” Genes 12, no. 10 (2021): 1562. https://doi.org/10.3390/genes12101562.<br /> [2] Brennecke, Julius, Alexei A. Aravin, Alexander Stark, Monica Dus, Manolis Kellis, Ravi Sachidanandam, and Gregory J. Hannon. “Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila.” Cell 128, no. 6 (2007): 1089–1103. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.01.043. <br /> <br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20261 2022-04-23T15:40:58Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.<br /> <br /> Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.<br /> <br /> '''Mehanizem retrotranspozicije LINE-1'''<br /> <br /> Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu &quot;na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije&quot; (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.<br /> <br /> '''Regulacija aktivnosti LINE-1'''<br /> <br /> Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.<br /> <br /> ==Regulacija LINE-1 v predimplantacijski stopnji==<br /> V predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 v tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.<br /> <br /> Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA v predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena v stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže v stopnji osemceličnega zarodka.<br /> <br /> Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je v predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.<br /> <br /> Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.<br /> <br /> N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.<br /> <br /> Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).<br /> <br /> ==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah==<br /> Za zarodne celice je značilna globalna demetilacija DNA. Aktivnost L1 je na nivoju transkripcije regulirana z de novo metilacijo. Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo. <br /> Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA, ki so dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh so prisotni štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), pri miših so bili identificirani zgolj trije (Miwi, Mili in Miwi2), pravtako ''Drosophila melanogaster'' izraža zgolj tri (Piwi, Aub in Ago3). <br /> piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 mRNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Mehanizem delovanja piRNA ter Piwi proteinov je bil študiran na vinskih mušicah. Znano je, da Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 mRNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil. Po drugi strani Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Skupki zapisov za piRNA se prepišejo v isti primarni transkript. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' koncu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki tvori kompleks z Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.<br /> Poleg direktne interakcije z L1 RNA je znano tudi, da kompleks piRNA-Piwi zniža aktivnost L1 preko posredovanja pri de novo DNA metilaciji ter pri metilaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Mehanizem, kako kompleks piRNA-Piwi sodeluje pri obeh procesih, še ni dodobra raziskan.<br /> <br /> Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na posttranskripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.<br /> <br /> ==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka==<br /> Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji.<br /> <br /> Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MePC2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). YY1 se namreč veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz. <br /> <br /> ==Viri==<br /> [1] Protasova, Maria Sergeevna, Tatiana Vladimirovna Andreeva, and Evgeny Ivanovich Rogaev. “Factors Regulating the Activity of LINE1 Retrotransposons.” Genes 12, no. 10 (2021): 1562. https://doi.org/10.3390/genes12101562. <br /> <br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20240 2022-04-22T19:26:05Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah ==<br /> Za zarodne celice je značilna globalna demetilacija DNA. Aktivnost L1 je na nivoju transkripcije regulirana z de novo metilacijo. Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo. <br /> Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA, ki so dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh so prisotni štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), pri miših so bili identificirani zgolj trije (Miwi, Mili in Miwi2), pravtako ''Drosophila melanogaster'' izraža zgolj tri (Piwi, Aub in Ago3). <br /> piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 mRNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Mehanizem delovanja piRNA ter Piwi proteinov je bil študiran na vinskih mušicah. Znano je, da Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 mRNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil. Po drugi strani Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Skupki zapisov za piRNA se prepišejo v isti primarni transkript. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' koncu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki tvori kompleks z Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.<br /> Poleg direktne interakcije z L1 RNA je znano tudi, da kompleks piRNA-Piwi zniža aktivnost L1 preko posredovanja pri de novo DNA metilaciji ter pri metilaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Mehanizem, kako kompleks piRNA-Piwi sodeluje pri obeh procesih, še ni dodobra raziskan.<br /> <br /> Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na posttranskripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.<br /> <br /> ==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka ==<br /> Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji.<br /> <br /> Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MePC2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). YY1 se namreč veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz. <br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20239 2022-04-22T19:23:53Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div><br /> ==='''Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah''' ===<br /> Za zarodne celice je značilna globalna demetilacija DNA. Aktivnost L1 je na nivoju transkripcije regulirana z de novo metilacijo. Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo. <br /> Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA, ki so dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh so prisotni štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), pri miših so bili identificirani zgolj trije (Miwi, Mili in Miwi2), pravtako ''Drosophila melanogaster'' izraža zgolj tri (Piwi, Aub in Ago3). <br /> piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 mRNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Mehanizem delovanja piRNA ter Piwi proteinov je bil študiran na vinskih mušicah. Znano je, da Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 mRNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil. Po drugi strani Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Skupki zapisov za piRNA se prepišejo v isti primarni transkript. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' koncu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki tvori kompleks z Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.<br /> Poleg direktne interakcije z L1 RNA je znano tudi, da kompleks piRNA-Piwi zniža aktivnost L1 preko posredovanja pri de novo DNA metilaciji ter pri metilaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Mehanizem, kako kompleks piRNA-Piwi sodeluje pri obeh procesih, še ni dodobra raziskan.<br /> <br /> Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na posttranskripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.<br /> <br /> ==='''Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka''' ===<br /> Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji.<br /> <br /> Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MePC2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). YY1 se namreč veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz. <br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Transpozicijski_elementi&diff=20237 2022-04-22T18:06:16Z

<p>AnaKodra: </p> <hr /> <div>Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2021/22 obravnavajo odkritje, mehanizem in vlogo transpozicijskih elementov pri prokariontih in evkariontih. Okvirni naslovi teme so navedeni na spodnjem seznamu.<br /> <br /> Vse teme temeljijo na preglednih člankih, kar pomeni, da obravnavajo zaključene teme, na katerih je bilo opravljenega že veliko dela. Zato je smiselno, da vsako temo obdelajo po trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200-1800 besed), ki ste jih uporabili.<br /> <br /> Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'. Predstavitev naj bo dolga 15-20 minut, temu pa bo sledila razprava (pribl. 5 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite le malo splošnega uvoda, ki naj zgolj umesti vašo temo v kontekst transpozicijskih elementov.<br /> <br /> Seminarske predstavitve bodo potekale predvidoma od 19.4. do 9.5. V tem času ne bo klasičnih predavanj, torej bodo tako ponedeljkovi kot torkovi termini namenjeni seminarjem.<br /> <br /> Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. 10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).<br /> <br /> Razdelitev seminarjev je potekala v okolju Google Drive, kjer so (bile) navedene povezave do izhodiščnih člankov, s katerimi lahko začnete iskanje literature. Večinoma navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili kvaliteten 15-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro en za drugim), tako da boste osnove hitro osvojili in jih ni treba ponavljati.<br /> <br /> Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: &lt;nowiki&gt;[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]&lt;/nowiki&gt;. Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularna_biologija_koronavirusov Molekularna biologija koronavirusov (2020/21)].<br /> <br /> <br /> Poglavja za seminarje so:<br /> <br /> # [[Odkritje transpozicijskih elementov pri bakterijah]] (Teja Spruk, Urša Štefan, Urša Zevnik) &lt;br&gt;<br /> # [[Klasifikacija transpozicijskih elementov in pregled načina delovanja]] (Klara Ažbe, Pia Trošt, Ana Maučec) &lt;br&gt;<br /> # [[Katalitični mehanizem transpozaz]] (Nuša Brdnik, Mark Loborec, Maj Priveršek) &lt;br&gt;<br /> # [[Transpozoni kot prenašalci odpornosti bakterij proti antibiotikom]] (Ana Kastelic, Lev Jošt, Gašper Struna) &lt;br&gt;<br /> <br /> ----<br /> <br /> # [[Pomen retroelementov v mikrobnih genomih]] (Ema Kavčič, Špela Rapuš, Ivana Vukšinić) &lt;br&gt;<br /> # [[Integracija transpozonov pri kvasovkah]] (Katja Resnik, Pia Špehar, Zarja Weingerl) &lt;br&gt;<br /> # [[Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje]] (Ana Kodra, Neža Lanišek, Gašper Možina) &lt;br&gt;<br /> # TE kot regulatorji transkripcije&lt;br&gt;<br /> <br /> ----<br /> <br /> # Interakcije transpozon – gostitelj&lt;br&gt;<br /> # Sodobni pogled na TE pri koruzi&lt;br&gt;<br /> # Vloga TE pri razvoju zarodka&lt;br&gt;<br /> # [[Transpozoni in rak]] (Maša Mencigar, Alliana Kolar, Klara Kočman) &lt;br&gt;<br /> <br /> ----<br /> <br /> # Uporabna vrednost transpozonov za gensko zdravljenje &lt;br&gt;<br /> # Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty&lt;br&gt;<br /> # Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska &lt;br&gt;<br /> # TE kot gonilo sprememb v genomu pšenice&lt;br&gt;<br /> <br /> ----<br /> <br /> # [[TE pri mentalnih boleznih]] (Tina Javeršek, Hana Glavnik, Jan Trebušak) &lt;br&gt;<br /> # TE pri vnetnih boleznih&lt;br&gt;<br /> <br /> ----<br /> <br /> # Preferenčna integracijska mesta retrotranspozona Tf1 v genomu kvasovke ''Schizosaccharomyces pombe''&lt;br&gt;</div>

AnaKodra https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20236 2022-04-22T18:04:17Z

<p>AnaKodra: New page: ==Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje== ===&#039;&#039;&#039;Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah&#039;&#039;&#039; === Za zarodne celice je značilna globalna demetilacija DNA. Aktivn...</p> <hr /> <div>==Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje==<br /> ==='''Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah''' ===<br /> Za zarodne celice je značilna globalna demetilacija DNA. Aktivnost L1 je na nivoju transkripcije regulirana z de novo metilacijo. Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo. <br /> Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA, ki so dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh so prisotni štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), pri miših so bili identificirani zgolj trije (Miwi, Mili in Miwi2), pravtako ''Drosophila melanogaster'' izraža zgolj tri (Piwi, Aub in Ago3). <br /> piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 mRNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Mehanizem delovanja piRNA ter Piwi proteinov je bil študiran na vinskih mušicah. Znano je, da Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 mRNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil. Po drugi strani Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Skupki zapisov za piRNA se prepišejo v isti primarni transkript. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' koncu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki tvori kompleks z Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.<br /> Poleg direktne interakcije z L1 RNA je znano tudi, da kompleks piRNA-Piwi zniža aktivnost L1 preko posredovanja pri de novo DNA metilaciji ter pri metilaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Mehanizem, kako kompleks piRNA-Piwi sodeluje pri obeh procesih, še ni dodobra raziskan.<br /> <br /> Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na posttranskripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

AnaKodra