https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=AnaMaklinWiki FKKT - User contributions [en]2026-04-05T17:05:50ZUser contributionsMediaWiki 1.39.3https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Popolna_biosinteza_hondroitin_sulfata_v_E._coli&diff=18579Popolna biosinteza hondroitin sulfata v E. coli2021-04-20T17:56:35Z<p>AnaMaklin: /* Literatura */</p>
<hr />
<div>==Uvod==<br />
Glikozaminoglikani (GAG) so dolge verige nerazvejanih polisaharidov, ki so del zunajceličnega matriksa. Sestavljeni so iz ponavljajočih se disaharidnih enot povezanih z glikozidno vezjo [1]. So pomembne biološke molekule, ki se pridobivajo z izolacijo iz živalskih tkiv. Eden najpogostejših GAG-ov pri človeku, hondroitin sulfat (CS), se v medicini uporablja za zdravljenje osteoartritisa. Zaradi variabilnosti mesta sulfatacije in velikosti polimerov, možnosti kontaminacij ter netrajnosti pridobivanja GAG-ov iz živalskih virov, so se avtorji članka odločili za mikrobno proizvodnjo CS v ''E. coli'' [1, 2].<br />
<br />
==Proizvodnji sistem==<br />
Biosinteza CS v ''E.coli'' zahteva 3 komponente: prekurzor hondroitin, donor sulfatne skupine 3′-fosfoadenozin-5′-fosfosulfat (PAPS) in hondroitin sulfotransferazo. Od 11 metabolnih korakov za sintezo hondroitina, je 9 že prisotnih v klasičnih sevih ''E.coli''. Encima za preostala 2 koraka, UDP-N-acetilglukozamin-/UDP-glukozamin-4-epimeraza in hondroitin sintaza, vsebuje sev ''E.coli'' K4, zato so ga izbrali za proizvodnjo CS. Sev K4 proizvaja fruktoziliran hondroitin kot sestavni del polisaharidne kapsule [2]. To je pri sintezi hondroitin sulfata nezaželjeno, zato so s homologno rekombinacijo Lambda Red izbrisali zapis za fruktozil transferazo (Δ''kfoE'') [2, 3]. V sev K4 so na mesto ''LacZ'' vstavili še zapis za T7 RNA polimerazo, da so dobili E. coli Δ''kfoE'' (DE3) [2]. Ključni encim, ki katalizira sulfatacijo hondroitina, hondroitin sulfotransferaza, je živalskega izvora in se nahaja Golgijevem aparatu (GA). Zapis za hondroitin-4-O-sulfotransferazo (Sw) so v celice ''E.coli'' K4 Δ''kfoE'' (DE3) vstavili s plazmidom pETM6-Sw [2].<br />
<br />
==Rezultati in optimizacija proizvodnje==<br />
Donor sulfatne skupine PAPS nastaja v biosintezni poti cisteina/metionina, ki poteka v skoraj vseh celicah. Kljub temu, v sevu ''E. coli'' Δ''kfoE'' (DE3) pETM6-Sw ni prišlo do sinteze CS. Encim PAPS reduktaza (cysH) zmanjšuje koncentracijo PAPS-a v celici in s sulfotransferazo tekmuje za substrat. S homologno rekombinacijo Lambda Red so uvedli delecijo zapisa za PAPS reduktazo Δ''cysH''. V ''E. coli'' Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3) pETM6-Sw so dosegli 19 % sulfatacijo hondroitina, kar je manj kot pri CS izoliranem iz živalskih tkiv. Nasprotno pa je dodatno izražanje genov, ki sodelujejo pri nastanku PAPS, ''cysDN'', ''cysC'' in ''cysQ'', močno zmanjšalo sulfatacijo hondroitina [2].<br />
<br />
V nadaljevanju so poskusili povečati aktivnost sulfotransferaze. Ker struktura encima ni znana, so naredili homologni model strukture Sw na osnovi predhodno razrešene strukture sulfotransferazne domene olefin sintaze iz ''Synechococcus''. Uporabili so spletni program PROSS, ki je predlagal tri variante Sw z večimi mutacijami v zaporedju: SM1, SM2, in SM4. Zapise za variante so vstavili v celice ''E. coli'' Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3), da bi potrdili vpliv mutacij v proizvodnjem sistemu. Z izražanjem SM1 in SM4 so dobili podoben rezultat kot pri Sw, medtem ko so pri SM2 dobili 3× večji delež sulfatacije [2].<br />
<br />
Pogoji rasti in indukcije imajo pomemben vpliv na biosintezo mikrobnih produktov. Celice K4 Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3) pETM6-Sw so gojili in inducirali z IPTG pri različnih fazah rasti. Primerjali so indukcijo pri različnih OD600 (0,6 in 1), koncentracijah IPTG (0,5 in 1 mM) ter temperaturah izražanja (37, 20, 16 °C). Največji delež sulfatacije so dobili pri OD600 1, z 0,5 ali 1 mM IPTG, izražanje 12 h na 20 °C in pri OD600 0,6, z 1 mM IPTG in izražanje 24 h na 16 °C. Z optimizacijo indukcije so dosegli izboljšanje sulfatacije CS iz 19 na 23 % [2].<br />
<br />
Divji tip ''E. coli'' K4 izvaža fruktoziliran hondroitin preko membranskega ABC transporterja. V predhodnih raziskavah so ugotovili, da se večina nesulfatiranega hondroitina prenese v medij [2, 4]. CS se ne nahaja v mediju, temveč v celoti ostane v znotrajceličnem prostoru. Čeprav so v prejšnih stopnjah optimizacije izboljšali znotrajcelično sulfatacijo, se veliko hondroitina prenese iz celice. Izvoz nesulfatiranega hondroitina in sulfatacija hondroitina sta dva tekmovalna procesa. Da bi zmanjšali vpliv transportne aktivnosti na znotrajcelično sulfatacijo, so s pomočjo CRISPRi naredili represijo genov transporterja. ABC transporter sestavljajo 4 proteini, KpsT, KpsM, KpsD in KpsE [2]. Naredili so 5 distančnikov, ki ciljajo ''kpsT'' in ''kpsM'' (dT1, dT2, dT3, dM1 in dM2) in jih sklonirali v CRISPRi plazmid pdCas9, s katerim so nato transforimirali celice ''E. coli'' K4 Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3) pETM6-Sw [2, 5]. Najboljše se je obnesla varianta s pdCas9-dM1, saj se je izvoz zmanjšal za 60 %. Sulfatacija hondroitina pri tem sevu se je povečala 3× na 55 % [2].<br />
<br />
==Zaključek==<br />
<br />
V eksperimentu, opisanem v članku, so v celice ''E. coli'' K4 uspešno vključili zapis za sulfotransferazo in uvedli potrebne delecije za biosintezo hondroitin sulfata. Z dodatno optimizacijo so dosegli končno 55 % sulfatacijo hondroitina, kar je blizu 70 % sulfataciji pri živalih. Gre za bolj trajnostno proizvodnjo, katere glavna prednost je, da za razliko od živalskega CS, mikrobni CS poleg 4-O- ne vsebuje še 6-O-sulfatiranega izomera CS [2].<br />
<br />
==Literatura==<br />
<br />
# Köwitsch, A., Zhou G., Groth T.: Medical application of glycosaminoglycans: a review. ''J Tissue Eng Regen Med''. '''2017''', 12. <br />
# Badri, A., ''et al''.: Complete biosynthesis of a sulfated chondroitin in Escherichia coli. ''Nature communications''. '''2021''', 12.<br />
# Datsenko, A. K., Wanner, L. B.: One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. ''PNAS''. '''2000''', 12.<br />
# He, W (2017). Metabolic Engineering and Applied Enzymology for the Preparation of Nutraceutical/Pharmaceutical Chondroitin Sulfate. PhD thesis, Rensselaer Polytechnic Insitute.<br />
# Bikard, D., ''et al''.: Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. ''Nucleic Acids Research''. '''2013''', 15.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Popolna_biosinteza_hondroitin_sulfata_v_E._coli&diff=18578Popolna biosinteza hondroitin sulfata v E. coli2021-04-20T17:54:40Z<p>AnaMaklin: </p>
<hr />
<div>==Uvod==<br />
Glikozaminoglikani (GAG) so dolge verige nerazvejanih polisaharidov, ki so del zunajceličnega matriksa. Sestavljeni so iz ponavljajočih se disaharidnih enot povezanih z glikozidno vezjo [1]. So pomembne biološke molekule, ki se pridobivajo z izolacijo iz živalskih tkiv. Eden najpogostejših GAG-ov pri človeku, hondroitin sulfat (CS), se v medicini uporablja za zdravljenje osteoartritisa. Zaradi variabilnosti mesta sulfatacije in velikosti polimerov, možnosti kontaminacij ter netrajnosti pridobivanja GAG-ov iz živalskih virov, so se avtorji članka odločili za mikrobno proizvodnjo CS v ''E. coli'' [1, 2].<br />
<br />
==Proizvodnji sistem==<br />
Biosinteza CS v ''E.coli'' zahteva 3 komponente: prekurzor hondroitin, donor sulfatne skupine 3′-fosfoadenozin-5′-fosfosulfat (PAPS) in hondroitin sulfotransferazo. Od 11 metabolnih korakov za sintezo hondroitina, je 9 že prisotnih v klasičnih sevih ''E.coli''. Encima za preostala 2 koraka, UDP-N-acetilglukozamin-/UDP-glukozamin-4-epimeraza in hondroitin sintaza, vsebuje sev ''E.coli'' K4, zato so ga izbrali za proizvodnjo CS. Sev K4 proizvaja fruktoziliran hondroitin kot sestavni del polisaharidne kapsule [2]. To je pri sintezi hondroitin sulfata nezaželjeno, zato so s homologno rekombinacijo Lambda Red izbrisali zapis za fruktozil transferazo (Δ''kfoE'') [2, 3]. V sev K4 so na mesto ''LacZ'' vstavili še zapis za T7 RNA polimerazo, da so dobili E. coli Δ''kfoE'' (DE3) [2]. Ključni encim, ki katalizira sulfatacijo hondroitina, hondroitin sulfotransferaza, je živalskega izvora in se nahaja Golgijevem aparatu (GA). Zapis za hondroitin-4-O-sulfotransferazo (Sw) so v celice ''E.coli'' K4 Δ''kfoE'' (DE3) vstavili s plazmidom pETM6-Sw [2].<br />
<br />
==Rezultati in optimizacija proizvodnje==<br />
Donor sulfatne skupine PAPS nastaja v biosintezni poti cisteina/metionina, ki poteka v skoraj vseh celicah. Kljub temu, v sevu ''E. coli'' Δ''kfoE'' (DE3) pETM6-Sw ni prišlo do sinteze CS. Encim PAPS reduktaza (cysH) zmanjšuje koncentracijo PAPS-a v celici in s sulfotransferazo tekmuje za substrat. S homologno rekombinacijo Lambda Red so uvedli delecijo zapisa za PAPS reduktazo Δ''cysH''. V ''E. coli'' Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3) pETM6-Sw so dosegli 19 % sulfatacijo hondroitina, kar je manj kot pri CS izoliranem iz živalskih tkiv. Nasprotno pa je dodatno izražanje genov, ki sodelujejo pri nastanku PAPS, ''cysDN'', ''cysC'' in ''cysQ'', močno zmanjšalo sulfatacijo hondroitina [2].<br />
<br />
V nadaljevanju so poskusili povečati aktivnost sulfotransferaze. Ker struktura encima ni znana, so naredili homologni model strukture Sw na osnovi predhodno razrešene strukture sulfotransferazne domene olefin sintaze iz ''Synechococcus''. Uporabili so spletni program PROSS, ki je predlagal tri variante Sw z večimi mutacijami v zaporedju: SM1, SM2, in SM4. Zapise za variante so vstavili v celice ''E. coli'' Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3), da bi potrdili vpliv mutacij v proizvodnjem sistemu. Z izražanjem SM1 in SM4 so dobili podoben rezultat kot pri Sw, medtem ko so pri SM2 dobili 3× večji delež sulfatacije [2].<br />
<br />
Pogoji rasti in indukcije imajo pomemben vpliv na biosintezo mikrobnih produktov. Celice K4 Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3) pETM6-Sw so gojili in inducirali z IPTG pri različnih fazah rasti. Primerjali so indukcijo pri različnih OD600 (0,6 in 1), koncentracijah IPTG (0,5 in 1 mM) ter temperaturah izražanja (37, 20, 16 °C). Največji delež sulfatacije so dobili pri OD600 1, z 0,5 ali 1 mM IPTG, izražanje 12 h na 20 °C in pri OD600 0,6, z 1 mM IPTG in izražanje 24 h na 16 °C. Z optimizacijo indukcije so dosegli izboljšanje sulfatacije CS iz 19 na 23 % [2].<br />
<br />
Divji tip ''E. coli'' K4 izvaža fruktoziliran hondroitin preko membranskega ABC transporterja. V predhodnih raziskavah so ugotovili, da se večina nesulfatiranega hondroitina prenese v medij [2, 4]. CS se ne nahaja v mediju, temveč v celoti ostane v znotrajceličnem prostoru. Čeprav so v prejšnih stopnjah optimizacije izboljšali znotrajcelično sulfatacijo, se veliko hondroitina prenese iz celice. Izvoz nesulfatiranega hondroitina in sulfatacija hondroitina sta dva tekmovalna procesa. Da bi zmanjšali vpliv transportne aktivnosti na znotrajcelično sulfatacijo, so s pomočjo CRISPRi naredili represijo genov transporterja. ABC transporter sestavljajo 4 proteini, KpsT, KpsM, KpsD in KpsE [2]. Naredili so 5 distančnikov, ki ciljajo ''kpsT'' in ''kpsM'' (dT1, dT2, dT3, dM1 in dM2) in jih sklonirali v CRISPRi plazmid pdCas9, s katerim so nato transforimirali celice ''E. coli'' K4 Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3) pETM6-Sw [2, 5]. Najboljše se je obnesla varianta s pdCas9-dM1, saj se je izvoz zmanjšal za 60 %. Sulfatacija hondroitina pri tem sevu se je povečala 3× na 55 % [2].<br />
<br />
==Zaključek==<br />
<br />
V eksperimentu, opisanem v članku, so v celice ''E. coli'' K4 uspešno vključili zapis za sulfotransferazo in uvedli potrebne delecije za biosintezo hondroitin sulfata. Z dodatno optimizacijo so dosegli končno 55 % sulfatacijo hondroitina, kar je blizu 70 % sulfataciji pri živalih. Gre za bolj trajnostno proizvodnjo, katere glavna prednost je, da za razliko od živalskega CS, mikrobni CS poleg 4-O- ne vsebuje še 6-O-sulfatiranega izomera CS [2].<br />
<br />
==Literatura==<br />
<br />
# Köwitsch, A., Zhou G., Groth T.: Medical application of glycosaminoglycans: a review. J Tissue Eng Regen Med. 2017, 12. <br />
# Badri, A., ''et al''.: Complete biosynthesis of a sulfated chondroitin in Escherichia coli. Nature communications. 2021, 12.<br />
# Datsenko, A. K., Wanner, L. B.: One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. PNAS. 2000, 12.<br />
# He, W (2017). Metabolic Engineering and Applied Enzymology for the Preparation of Nutraceutical/Pharmaceutical Chondroitin Sulfate. PhD thesis, Rensselaer Polytechnic Insitute.<br />
# Bikard, D., ''et al''.: Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic Acids Research. 2013, 15.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2021&diff=18577MBT seminarji 20212021-04-20T17:39:18Z<p>AnaMaklin: </p>
<hr />
<div>Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].<br />
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.<br />
<br />
Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).<br />
<br />
Način vnosa:<br />
<br />
The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.)<br><br />
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br />
<br />
----<br />
<br />
<br />
Naslovi odobrenih člankov po temah:<br />
<br />
'''Farmacevtsko pomembni proteini'''<br><br />
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)<br />
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)<br />
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)<br />
<br />
'''Cepiva'''<br><br />
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.)<br><br />
# An AMA1/MSP1<sub>19</sub> Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.)<br><br />
<br />
'''Gensko spremenjene rastline'''<br><br />
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)<br />
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)<br />
<br />
'''Gensko spremenjene živali in celične linije'''<br><br />
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)<br />
# Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse (H. Li ''et. al''; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117(52), 2021; https://doi.org/10.1073/pnas.2003991117). [[Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.]] Matija Ruparčič (8.4.)<br />
<br />
'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti'''<br><br />
# Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. (T. Walter ''et. al.''; Microorganisms 8(6), 2020; https://doi.org/10.3390/microorganisms8060866). [[Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum]]. Saša Slabe (14.4.)<br />
# Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from ''Pseudomonas nitroreducens'' Jin1. (Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5). [[Učinkovita biosinteza vanilina iz izoevgenola z uporabo rekombinantne izoevgenol monooksigenaze Jin1 iz bakterije Pseudomonas nitroreducens]]. Luka Gnidovec (15.4.)<br />
# One-pot production of butyl butyrate from glucose using a cognate “diamond-shaped” ''E. coli'' consortium (J. P. Sinumvayo "et. al"; Bioresources and Bioprocessing 8, 2021; https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-021-00372-8#Sec9). [[Proizvodnja butil butirata iz glukoze z uporabo "diamantnega" konzorcija E. coli]] Liza Ulčakar (15.4.)<br />
<br />
'''Biotehnološki polimeri'''<br><br />
# Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors (S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” ''J. Biotechnol.'', vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001). [[Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi]] Anže Karlek (21.4.)<br />
# Complete biosynthesis of a sulfated chondroitin in ''Escherichia coli'' (Badri, A., ''et al''; Nature communications 12 (2021); https://doi.org/10.1038/s41467-021-21692-5). [[Popolna biosinteza hondroitin sulfata v E. coli]] Ana Maklin (22.4.) <br />
# Optimization of cultivation medium and cyclic fed-batch fermentation strategy for enhanced polyhydroxyalkanoate production by Bacillus thuringiensis using a glucose-rich hydrolyzate (Singh et al. Bioresour. Bioprocess. (2021) 8:11, https://doi.org/10.1186/s40643-021-00361-x) [[Optimizacija fermentacijske proizvodnje PHA-bioplastike z b. thuringiensis in z glukozo bogatimi hidrolizati]] Urban Hribar (22.4.)<br />
<br />
'''Biotehnološko pridobljeni encimi'''<br><br />
# Urška Fajdiga (5.5.)<br />
# Mirsad Mešić (6.5.)<br />
# Martina Lokar (6.5.)<br />
<br />
'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji'''<br><br />
# Jerneja Nimac (12.5.)<br />
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)<br />
# Klementina Polanec (13.5.)<br />
# Ernestina Lavrih (13.5.)<br />
<br />
'''Biomasa in biogoriva'''<br><br />
# Željka Erić (19.5.)<br />
# Karin Dobravc Škof (20.5.)<br />
# Katja Doberšek (20.5.)<br />
<br />
'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija'''<br><br />
# Almina Tahirović (26.5.)<br />
# Eva Keber (27.5.)<br />
# Nina Lukančič (27.5.)</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2021&diff=18576MBT seminarji 20212021-04-20T17:38:57Z<p>AnaMaklin: </p>
<hr />
<div>Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].<br />
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.<br />
<br />
Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).<br />
<br />
Način vnosa:<br />
<br />
The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.)<br><br />
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br />
<br />
----<br />
<br />
<br />
Naslovi odobrenih člankov po temah:<br />
<br />
'''Farmacevtsko pomembni proteini'''<br><br />
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)<br />
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)<br />
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)<br />
<br />
'''Cepiva'''<br><br />
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.)<br><br />
# An AMA1/MSP1<sub>19</sub> Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.)<br><br />
<br />
'''Gensko spremenjene rastline'''<br><br />
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)<br />
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)<br />
<br />
'''Gensko spremenjene živali in celične linije'''<br><br />
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)<br />
# Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse (H. Li ''et. al''; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117(52), 2021; https://doi.org/10.1073/pnas.2003991117). [[Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.]] Matija Ruparčič (8.4.)<br />
<br />
'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti'''<br><br />
# Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. (T. Walter ''et. al.''; Microorganisms 8(6), 2020; https://doi.org/10.3390/microorganisms8060866). [[Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum]]. Saša Slabe (14.4.)<br />
# Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from ''Pseudomonas nitroreducens'' Jin1. (Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5). [[Učinkovita biosinteza vanilina iz izoevgenola z uporabo rekombinantne izoevgenol monooksigenaze Jin1 iz bakterije Pseudomonas nitroreducens]]. Luka Gnidovec (15.4.)<br />
# One-pot production of butyl butyrate from glucose using a cognate “diamond-shaped” ''E. coli'' consortium (J. P. Sinumvayo "et. al"; Bioresources and Bioprocessing 8, 2021; https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-021-00372-8#Sec9). [[Proizvodnja butil butirata iz glukoze z uporabo "diamantnega" konzorcija E. coli]] Liza Ulčakar (15.4.)<br />
<br />
'''Biotehnološki polimeri'''<br><br />
# Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors (S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” ''J. Biotechnol.'', vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001). [[Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi]] Anže Karlek (21.4.)<br />
# Complete biosynthesis of a sulfated chondroitin in ''Escherichia coli'' (Badri, A., ''et al''; Nature communications 12 (2021); https://doi.org/10.1038/s41467-021-21692-5). [[Popolna biosinteza hondroitin sulfata v ''E. coli'']] Ana Maklin (22.4.) <br />
# Optimization of cultivation medium and cyclic fed-batch fermentation strategy for enhanced polyhydroxyalkanoate production by Bacillus thuringiensis using a glucose-rich hydrolyzate (Singh et al. Bioresour. Bioprocess. (2021) 8:11, https://doi.org/10.1186/s40643-021-00361-x) [[Optimizacija fermentacijske proizvodnje PHA-bioplastike z b. thuringiensis in z glukozo bogatimi hidrolizati]] Urban Hribar (22.4.)<br />
<br />
'''Biotehnološko pridobljeni encimi'''<br><br />
# Urška Fajdiga (5.5.)<br />
# Mirsad Mešić (6.5.)<br />
# Martina Lokar (6.5.)<br />
<br />
'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji'''<br><br />
# Jerneja Nimac (12.5.)<br />
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)<br />
# Klementina Polanec (13.5.)<br />
# Ernestina Lavrih (13.5.)<br />
<br />
'''Biomasa in biogoriva'''<br><br />
# Željka Erić (19.5.)<br />
# Karin Dobravc Škof (20.5.)<br />
# Katja Doberšek (20.5.)<br />
<br />
'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija'''<br><br />
# Almina Tahirović (26.5.)<br />
# Eva Keber (27.5.)<br />
# Nina Lukančič (27.5.)</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Popolna_biosinteza_hondroitin_sulfata_v_E._coli&diff=18575Popolna biosinteza hondroitin sulfata v E. coli2021-04-20T17:38:15Z<p>AnaMaklin: New page: ==Uvod== Glikozaminoglikani (GAG) so dolge verige nerazvejanih polisaharidov, ki so del zunajceličnega matriksa. Sestavljeni so iz ponavljajočih se disaharidnih enot povezanih z glikozid...</p>
<hr />
<div>==Uvod==<br />
Glikozaminoglikani (GAG) so dolge verige nerazvejanih polisaharidov, ki so del zunajceličnega matriksa. Sestavljeni so iz ponavljajočih se disaharidnih enot povezanih z glikozidno vezjo [1]. So pomembne biološke molekule, ki se pridobivajo z izolacijo iz živalskih tkiv. Eden najpogostejših GAG-ov pri človeku, hondroitin sulfat (CS), se v medicini uporablja za zdravljenje osteoartritisa. Zaradi variabilnosti mesta sulfatacije in velikosti polimerov, možnosti kontaminacij ter netrajnosti pridobivanja GAG-ov iz živalskih virov, so se avtorji članka odločili za mikrobno proizvodnjo CS v ''E. coli'' [1, 2].<br />
<br />
==Proizvodnji sistem==<br />
Biosinteza CS v ''E.coli'' zahteva 3 komponente: prekurzor hondroitin, donor sulfatne skupine 3′-fosfoadenozin-5′-fosfosulfat (PAPS) in hondroitin sulfotransferazo. Od 11 metabolnih korakov za sintezo hondroitina, je 9 že prisotnih v klasičnih sevih ''E.coli''. Encima za preostala 2 koraka, UDP-N-acetilglukozamin-/UDP-glukozamin-4-epimeraza in hondroitin sintaza, vsebuje sev ''E.coli'' K4, zato so ga izbrali za proizvodnjo CS. Sev K4 proizvaja fruktoziliran hondroitin kot sestavni del polisaharidne kapsule [2]. Fruktozilacija hondroitina je pri sintezi hondroitin sulfata nezaželjena, zato so s homologno rekombinacijo Lambda Red izbrisali zapis za fruktozil transferazo (Δ''kfoE'') [2, 3]. V sev K4 so na mesto ''LacZ'' vstavili še zapis za T7 RNA polimerazo, da so dobili E. coli Δ''kfoE'' (DE3) [2]. Ključni encim, ki katalizira sulfatacijo hondroitina, hondroitin sulfotransferaza, je živalskega izvora in se nahaja Golgijevem aparatu (GA). Zapis za hondroitin-4-O-sulfotransferazo (Sw) so v celice ''E.coli'' K4 Δ''kfoE'' (DE3) vstavili s plazmidom pETM6-Sw [2].<br />
<br />
==Rezultati in optimizacija proizvodnje==<br />
Donor sulfatne skupine PAPS, ki je potreben za sulfatacijo hondroitina, nastaja v biosintezni poti cisteina/metionina, ki poteka v skoraj vseh celicah. Kljub temu, v sevu ''E. coli'' Δ''kfoE'' (DE3) pETM6- Sw ni prišlo do sinteze CS. Ugotovili so, da encim PAPS reduktaza (cysH), zmanjšuje koncentracijo PAPS-a v celici in s sulfotransferazo tekmuje za substrat. S pomočjo homologne rekombinacije Lambda Red so uvedli delecijo zapisa za PAPS reduktazo Δ''cysH''. V ''E. coli'' Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3) pETM6-Sw so dosegli 19 % sulfatacijo hondroitina, kar je manj kot pri CS izoliranem iz živalskih tkiv. Nasprotno pa je dodatno izražanje genov, ki sodelujejo pri nastanku PAPS, ''cysDN'', ''cysC'' in ''cysQ'', močno zmanjšalo sulfatacijo hondroitina [2].<br />
V nadaljevanju so poskusili povečati aktivnost sulfotransferaze. Ker struktura encima ni znana, so naredili homologni model strukture sulfotransferaze Sw na osnovi predhodno razrešene strukture sulfotransferazne domene olefin sintaze iz ''Synechococcus''. Uporabili so spletni program PROSS, ki je predlagal tri variante Sw z večimi mutacijami v zaporedju: SM1, SM2, in SM4. Zapise za variante sulfotransferaze so vstavili v celice ''E. coli'' Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3), da bi potrdili vpliv mutacij v in vivo proizvodnjem sistemu. Z izražanjem SM1 in SM4 so dobili podoben delež sulfatacije kot pri Sw, medtem ko so pri SM2 dobili kar 3× večji delež sulfatacije [2].<br />
<br />
Pogoji rasti in indukcije imajo pomemben vpliv na biosintezo mikrobnih produktov. Celice K4 Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3) pETM6-Sw so gojili in inducirali z IPTG pri različnih fazah rasti. Primerjali so indukcijo pri različnih OD600 (0,6 in 1), različne koncentracije IPTG (0,5 in 1 mM) ter temperature izražanja (37, 20, 16 °C). Največji delež sulfatacije so dobili pri OD600 1, z 0,5 ali 1 mM IPTG, izražanje 12 h na 20 °C in pri OD600 0,6, z 1 mM IPTG in izražanje 24 h na 16 °C. Z optimizacijo indukcije so dosegli izboljšanje sulfatacije CS iz 19 na 23 % [2].<br />
<br />
Divji tip ''E. coli'' K4 izvaža fruktoziliran hondroitin preko membranskega ABC transporterja. V predhodnih raziskavah so ugotovili, da se večina nesulfatiranega hondroitina prenese v medij [2, 4]. Avtorji tega članka, so ugotovili, da se CS ne nahaja v mediju, temveč v celoti ostane v znotrajceličnem prostoru. Čeprav so v prejšnih stopnjah optimizacije izboljšali znotrajcelično sulfatacijo, se večina hondroitina prenese iz celice v nesulfatirani obliki. Izvoz nesulfatiranega hondroitina in sulfatacija hondroitina sta dva tekmovalna procesa. Da bi zmanjšali vpliv transportne aktivnosti na znotrajcelično sulfatacijo, so s pomočjo CRISPRi naredili represijo genov transporterja. ABC transporter sestavljajo 4 proteini, KpsT, KpsM, KpsD in KpsE [2]. Naredili so 5 distančnikov, ki ciljajo ''kpsT'' in ''kpsM'' (dT1, dT2, dT3, dM1 in dM2) in jih sklonirali v CRISPRi plazmid pdCas9, s katerim so nato transforimirali celice ''E. coli'' K4 Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3) pETM6-Sw [2, 5]. Najboljše se je obnesla varianta s pdCas9-dM1, saj se je izvoz zmanjšal kar za 60 %. Sulfatacija hondroitina pri tem sevu se je povečala 3× na 55 % [2].<br />
<br />
==Zaključek==<br />
<br />
V eksperimentu, opisanem v članku, so v celice ''E. coli'' K4 uspešno vključili zapis za sulfotransferazo in uvedli potrebne delecije za biosintezo hondroitin sulfata. Z dodatno optimizacijo so dosegli končno 55 % sulfatacijo hondroitina, kar je blizu 70 % sulfataciji pri živalih. Gre za bolj trajnostno proizvodnjo, katere glavna prednost je, da za razliko od živalskega CS, mikrobni CS poleg 4-O- ne vsebuje še 6-O-sulfatiranega izomera CS.<br />
<br />
==Literatura==<br />
<br />
# Köwitsch, A., Zhou G., Groth T.: Medical application of glycosaminoglycans: a review. J Tissue Eng Regen Med. 2017, 12. <br />
# Badri, A., ''et al''.: Complete biosynthesis of a sulfated chondroitin in Escherichia coli. Nature communications. 2021, 12.<br />
# Datsenko, A. K., Wanner, L. B.: One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. PNAS. 2000, 12.<br />
# He, W (2017). Metabolic Engineering and Applied Enzymology for the Preparation of Nutraceutical/Pharmaceutical Chondroitin Sulfate. PhD thesis, Rensselaer Polytechnic Insitute.<br />
# Bikard, D., ''et al''.: Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic Acids Research. 2013, 15.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2021&diff=18574MBT seminarji 20212021-04-20T17:37:37Z<p>AnaMaklin: </p>
<hr />
<div>Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].<br />
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.<br />
<br />
Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).<br />
<br />
Način vnosa:<br />
<br />
The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.)<br><br />
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br />
<br />
----<br />
<br />
<br />
Naslovi odobrenih člankov po temah:<br />
<br />
'''Farmacevtsko pomembni proteini'''<br><br />
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)<br />
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)<br />
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)<br />
<br />
'''Cepiva'''<br><br />
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.)<br><br />
# An AMA1/MSP1<sub>19</sub> Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.)<br><br />
<br />
'''Gensko spremenjene rastline'''<br><br />
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)<br />
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)<br />
<br />
'''Gensko spremenjene živali in celične linije'''<br><br />
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)<br />
# Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse (H. Li ''et. al''; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117(52), 2021; https://doi.org/10.1073/pnas.2003991117). [[Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.]] Matija Ruparčič (8.4.)<br />
<br />
'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti'''<br><br />
# Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. (T. Walter ''et. al.''; Microorganisms 8(6), 2020; https://doi.org/10.3390/microorganisms8060866). [[Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum]]. Saša Slabe (14.4.)<br />
# Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from ''Pseudomonas nitroreducens'' Jin1. (Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5). [[Učinkovita biosinteza vanilina iz izoevgenola z uporabo rekombinantne izoevgenol monooksigenaze Jin1 iz bakterije Pseudomonas nitroreducens]]. Luka Gnidovec (15.4.)<br />
# One-pot production of butyl butyrate from glucose using a cognate “diamond-shaped” ''E. coli'' consortium (J. P. Sinumvayo "et. al"; Bioresources and Bioprocessing 8, 2021; https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-021-00372-8#Sec9). [[Proizvodnja butil butirata iz glukoze z uporabo "diamantnega" konzorcija E. coli]] Liza Ulčakar (15.4.)<br />
<br />
'''Biotehnološki polimeri'''<br><br />
# Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors (S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” ''J. Biotechnol.'', vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001). [[Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi]] Anže Karlek (21.4.)<br />
# Complete biosynthesis of a sulfated chondroitin in ''Escherichia coli'' (Badri, A., ''et al''; Nature communications 12 (2021); https://doi.org/10.1038/s41467-021-21692-5). [[Popolna biosinteza hondroitin sulfata v E. coli]] Ana Maklin (22.4.) <br />
# Optimization of cultivation medium and cyclic fed-batch fermentation strategy for enhanced polyhydroxyalkanoate production by Bacillus thuringiensis using a glucose-rich hydrolyzate (Singh et al. Bioresour. Bioprocess. (2021) 8:11, https://doi.org/10.1186/s40643-021-00361-x) [[Optimizacija fermentacijske proizvodnje PHA-bioplastike z b. thuringiensis in z glukozo bogatimi hidrolizati]] Urban Hribar (22.4.)<br />
<br />
'''Biotehnološko pridobljeni encimi'''<br><br />
# Urška Fajdiga (5.5.)<br />
# Mirsad Mešić (6.5.)<br />
# Martina Lokar (6.5.)<br />
<br />
'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji'''<br><br />
# Jerneja Nimac (12.5.)<br />
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)<br />
# Klementina Polanec (13.5.)<br />
# Ernestina Lavrih (13.5.)<br />
<br />
'''Biomasa in biogoriva'''<br><br />
# Željka Erić (19.5.)<br />
# Karin Dobravc Škof (20.5.)<br />
# Katja Doberšek (20.5.)<br />
<br />
'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija'''<br><br />
# Almina Tahirović (26.5.)<br />
# Eva Keber (27.5.)<br />
# Nina Lukančič (27.5.)</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Povezava&diff=18573Povezava2021-04-20T17:33:22Z<p>AnaMaklin: </p>
<hr />
<div>==Uvod==<br />
Glikozaminoglikani (GAG) so dolge verige nerazvejanih polisaharidov, ki so del zunajceličnega matriksa. Sestavljeni so iz ponavljajočih se disaharidnih enot povezanih z glikozidno vezjo [1]. So pomembne biološke molekule, ki se pridobivajo z izolacijo iz živalskih tkiv. Eden najpogostejših GAG-ov pri človeku, hondroitin sulfat (CS), se v medicini uporablja za zdravljenje osteoartritisa. Zaradi variabilnosti mesta sulfatacije in velikosti polimerov, možnosti kontaminacij ter netrajnosti pridobivanja GAG-ov iz živalskih virov, so se avtorji članka odločili za mikrobno proizvodnjo CS v ''E. coli'' [1, 2].<br />
<br />
==Proizvodnji sistem==<br />
Biosinteza CS v ''E.coli'' zahteva 3 komponente: prekurzor hondroitin, donor sulfatne skupine 3′-fosfoadenozin-5′-fosfosulfat (PAPS) in hondroitin sulfotransferazo. Od 11 metabolnih korakov za sintezo hondroitina, je 9 že prisotnih v klasičnih sevih ''E.coli''. Encima za preostala 2 koraka, UDP-N-acetilglukozamin-/UDP-glukozamin-4-epimeraza in hondroitin sintaza, vsebuje sev ''E.coli'' K4, zato so ga izbrali za proizvodnjo CS. Sev K4 proizvaja fruktoziliran hondroitin kot sestavni del polisaharidne kapsule [2]. Fruktozilacija hondroitina je pri sintezi hondroitin sulfata nezaželjena, zato so s homologno rekombinacijo Lambda Red izbrisali zapis za fruktozil transferazo (Δ''kfoE'') [2, 3]. V sev K4 so na mesto ''LacZ'' vstavili še zapis za T7 RNA polimerazo, da so dobili E. coli Δ''kfoE'' (DE3) [2]. Ključni encim, ki katalizira sulfatacijo hondroitina, hondroitin sulfotransferaza, je živalskega izvora in se nahaja Golgijevem aparatu (GA). Zapis za hondroitin-4-O-sulfotransferazo (Sw) so v celice ''E.coli'' K4 Δ''kfoE'' (DE3) vstavili s plazmidom pETM6-Sw [2].<br />
<br />
==Rezultati in optimizacija proizvodnje==<br />
Donor sulfatne skupine PAPS, ki je potreben za sulfatacijo hondroitina, nastaja v biosintezni poti cisteina/metionina, ki poteka v skoraj vseh celicah. Kljub temu, v sevu ''E. coli'' Δ''kfoE'' (DE3) pETM6- Sw ni prišlo do sinteze CS. Ugotovili so, da encim PAPS reduktaza (cysH), zmanjšuje koncentracijo PAPS-a v celici in s sulfotransferazo tekmuje za substrat. S pomočjo homologne rekombinacije Lambda Red so uvedli delecijo zapisa za PAPS reduktazo Δ''cysH''. V ''E. coli'' Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3) pETM6-Sw so dosegli 19 % sulfatacijo hondroitina, kar je manj kot pri CS izoliranem iz živalskih tkiv. Nasprotno pa je dodatno izražanje genov, ki sodelujejo pri nastanku PAPS, ''cysDN'', ''cysC'' in ''cysQ'', močno zmanjšalo sulfatacijo hondroitina [2].<br />
V nadaljevanju so poskusili povečati aktivnost sulfotransferaze. Ker struktura encima ni znana, so naredili homologni model strukture sulfotransferaze Sw na osnovi predhodno razrešene strukture sulfotransferazne domene olefin sintaze iz ''Synechococcus''. Uporabili so spletni program PROSS, ki je predlagal tri variante Sw z večimi mutacijami v zaporedju: SM1, SM2, in SM4. Zapise za variante sulfotransferaze so vstavili v celice ''E. coli'' Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3), da bi potrdili vpliv mutacij v in vivo proizvodnjem sistemu. Z izražanjem SM1 in SM4 so dobili podoben delež sulfatacije kot pri Sw, medtem ko so pri SM2 dobili kar 3× večji delež sulfatacije [2].<br />
<br />
Pogoji rasti in indukcije imajo pomemben vpliv na biosintezo mikrobnih produktov. Celice K4 Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3) pETM6-Sw so gojili in inducirali z IPTG pri različnih fazah rasti. Primerjali so indukcijo pri različnih OD600 (0,6 in 1), različne koncentracije IPTG (0,5 in 1 mM) ter temperature izražanja (37, 20, 16 °C). Največji delež sulfatacije so dobili pri OD600 1, z 0,5 ali 1 mM IPTG, izražanje 12 h na 20 °C in pri OD600 0,6, z 1 mM IPTG in izražanje 24 h na 16 °C. Z optimizacijo indukcije so dosegli izboljšanje sulfatacije CS iz 19 na 23 % [2].<br />
<br />
Divji tip ''E. coli'' K4 izvaža fruktoziliran hondroitin preko membranskega ABC transporterja. V predhodnih raziskavah so ugotovili, da se večina nesulfatiranega hondroitina prenese v medij [2, 4]. Avtorji tega članka, so ugotovili, da se CS ne nahaja v mediju, temveč v celoti ostane v znotrajceličnem prostoru. Čeprav so v prejšnih stopnjah optimizacije izboljšali znotrajcelično sulfatacijo, se večina hondroitina prenese iz celice v nesulfatirani obliki. Izvoz nesulfatiranega hondroitina in sulfatacija hondroitina sta dva tekmovalna procesa. Da bi zmanjšali vpliv transportne aktivnosti na znotrajcelično sulfatacijo, so s pomočjo CRISPRi naredili represijo genov transporterja. ABC transporter sestavljajo 4 proteini, KpsT, KpsM, KpsD in KpsE [2]. Naredili so 5 distančnikov, ki ciljajo ''kpsT'' in ''kpsM'' (dT1, dT2, dT3, dM1 in dM2) in jih sklonirali v CRISPRi plazmid pdCas9, s katerim so nato transforimirali celice ''E. coli'' K4 Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3) pETM6-Sw [2, 5]. Najboljše se je obnesla varianta s pdCas9-dM1, saj se je izvoz zmanjšal kar za 60 %. Sulfatacija hondroitina pri tem sevu se je povečala 3× na 55 % [2].<br />
<br />
==Zaključek==<br />
<br />
V eksperimentu, opisanem v članku, so v celice ''E. coli'' K4 uspešno vključili zapis za sulfotransferazo in uvedli potrebne delecije za biosintezo hondroitin sulfata. Z dodatno optimizacijo so dosegli končno 55 % sulfatacijo hondroitina, kar je blizu 70 % sulfataciji pri živalih. Gre za bolj trajnostno proizvodnjo, katere glavna prednost je, da za razliko od živalskega CS, mikrobni CS poleg 4-O- ne vsebuje še 6-O-sulfatiranega izomera CS.<br />
<br />
==Literatura==<br />
<br />
# Köwitsch, A., Zhou G., Groth T.: Medical application of glycosaminoglycans: a review. J Tissue Eng Regen Med. 2017, 12. <br />
# Badri, A., ''et al''.: Complete biosynthesis of a sulfated chondroitin in Escherichia coli. Nature communications. 2021, 12.<br />
# Datsenko, A. K., Wanner, L. B.: One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. PNAS. 2000, 12.<br />
# He, W (2017). Metabolic Engineering and Applied Enzymology for the Preparation of Nutraceutical/Pharmaceutical Chondroitin Sulfate. PhD thesis, Rensselaer Polytechnic Insitute.<br />
# Bikard, D., ''et al''.: Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic Acids Research. 2013, 15.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Povezava&diff=18572Povezava2021-04-20T17:31:21Z<p>AnaMaklin: </p>
<hr />
<div>==Uvod==<br />
Glikozaminoglikani (GAG) so dolge verige nerazvejanih polisaharidov, ki so del zunajceličnega matriksa. Sestavljeni so iz ponavljajočih se disaharidnih enot povezanih z glikozidno vezjo [1]. So pomembne biološke molekule, ki se pridobivajo z izolacijo iz živalskih tkiv. Eden najpogostejših GAG-ov pri človeku, hondroitin sulfat (CS), se v medicini uporablja za zdravljenje osteoartritisa. Zaradi variabilnosti mesta sulfatacije in velikosti polimerov, možnosti kontaminacij ter netrajnosti pridobivanja GAG-ov iz živalskih virov, so se avtorji članka odločili za mikrobno proizvodnjo CS v ''E. coli'' [1, 2].<br />
<br />
==Proizvodnji sistem==<br />
Biosinteza CS v ''E.coli'' zahteva 3 komponente: prekurzor hondroitin, donor sulfatne skupine 3′-fosfoadenozin-5′-fosfosulfat (PAPS) in hondroitin sulfotransferazo. Od 11 metabolnih korakov za sintezo hondroitina, je 9 že prisotnih v klasičnih sevih ''E.coli''. Encima za preostala 2 koraka, UDP-N-acetilglukozamin-/UDP-glukozamin-4-epimeraza in hondroitin sintaza, vsebuje sev ''E.coli'' K4, zato so ga izbrali za proizvodnjo CS. Sev K4 proizvaja fruktoziliran hondroitin kot sestavni del polisaharidne kapsule [2]. Fruktozilacija hondroitina je pri sintezi hondroitin sulfata nezaželjena, zato so s homologno rekombinacijo Lambda Red izbrisali zapis za fruktozil transferazo (Δ''kfoE'') [2, 3]. V sev K4 so na mesto ''LacZ'' vstavili še zapis za T7 RNA polimerazo, da so dobili E. coli Δ''kfoE'' (DE3) [2]. Ključni encim, ki katalizira sulfatacijo hondroitina, hondroitin sulfotransferaza, je živalskega izvora in se nahaja Golgijevem aparatu (GA). Zapis za hondroitin-4-O-sulfotransferazo (Sw) so v celice ''E.coli'' K4 Δ''kfoE'' (DE3) vstavili s plazmidom pETM6-Sw [2].<br />
<br />
==Rezultati in optimizacija proizvodnje==<br />
Donor sulfatne skupine PAPS, ki je potreben za sulfatacijo hondroitina, nastaja v biosintezni poti cisteina/metionina, ki poteka v skoraj vseh celicah. Kljub temu, v sevu ''E. coli'' Δ''kfoE'' (DE3) pETM6- Sw ni prišlo do sinteze CS. Ugotovili so, da encim PAPS reduktaza (cysH), zmanjšuje koncentracijo PAPS-a v celici in s sulfotransferazo tekmuje za substrat. S pomočjo homologne rekombinacije Lambda Red so uvedli delecijo zapisa za PAPS reduktazo Δ''cysH''. V ''E. coli'' Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3) pETM6-Sw so dosegli 19 % sulfatacijo hondroitina, kar je manj kot pri CS izoliranem iz živalskih tkiv. Nasprotno pa je dodatno izražanje genov, ki sodelujejo pri nastanku PAPS, ''cysDN'', ''cysC'' in ''cysQ'', močno zmanjšalo sulfatacijo hondroitina [2].<br />
V nadaljevanju so poskusili povečati aktivnost sulfotransferaze. Ker struktura encima ni znana, so naredili homologni model strukture sulfotransferaze Sw na osnovi predhodno razrešene strukture sulfotransferazne domene olefin sintaze iz ''Synechococcus''. Uporabili so spletni program PROSS, ki je predlagal tri variante Sw z večimi mutacijami v zaporedju: SM1, SM2, in SM4. Zapise za variante sulfotransferaze so vstavili v celice ''E. coli'' Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3), da bi potrdili vpliv mutacij v in vivo proizvodnjem sistemu. Z izražanjem SM1 in SM4 so dobili podoben delež sulfatacije kot pri Sw, medtem ko so pri SM2 dobili kar 3× večji delež sulfatacije [2].<br />
<br />
Pogoji rasti in indukcije imajo pomemben vpliv na biosintezo mikrobnih produktov. Celice K4 Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3) pETM6-Sw so gojili in inducirali z IPTG pri različnih fazah rasti. Primerjali so indukcijo pri različnih OD600 (0,6 in 1), različne koncentracije IPTG (0,5 in 1 mM) ter temperature izražanja (37, 20, 16 °C). Največji delež sulfatacije so dobili pri OD600 1, z 0,5 ali 1 mM IPTG, izražanje 12 h na 20 °C in pri OD600 0,6, z 1 mM IPTG in izražanje 24 h na 16 °C. Z optimizacijo indukcije so dosegli izboljšanje sulfatacije CS iz 19 na 23 % [2].<br />
<br />
Divji tip ''E. coli'' K4 izvaža fruktoziliran hondroitin preko membranskega ABC transporterja. V predhodnih raziskavah so ugotovili, da se večina nesulfatiranega hondroitina prenese v medij [2, 4]. Avtorji tega članka, so ugotovili, da se CS ne nahaja v mediju, temveč v celoti ostane v znotrajceličnem prostoru. Čeprav so v prejšnih stopnjah optimizacije izboljšali znotrajcelično sulfatacijo, se večina hondroitina prenese iz celice v nesulfatirani obliki. Izvoz nesulfatiranega hondroitina in sulfatacija hondroitina sta dva tekmovalna procesa. Da bi zmanjšali vpliv transportne aktivnosti na znotrajcelično sulfatacijo, so s pomočjo CRISPRi naredili represijo genov transporterja. ABC transporter sestavljajo 4 proteini, KpsT, KpsM, KpsD in KpsE [2]. Naredili so 5 distančnikov, ki ciljajo kpsT in kpsM (dT1, dT2, dT3, dM1 in dM2) in jih sklonirali v CRISPRi plazmid pdCas9, s katerim so nato transforimirali celice ''E. coli'' K4 Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3) pETM6-Sw [2, 5]. Najboljše se je obnesla varianta s pdCas9-dM1, saj se je izvoz zmanjšal kar za 60 %. Sulfatacija hondroitina pri tem sevu se je povečala 3× na 55 % [2].<br />
<br />
==Zaključek==<br />
<br />
V eksperimentu, opisanem v članku, so v celice ''E. coli'' K4 uspešno vključili zapis za sulfotransferazo in uvedli potrebne delecije za biosintezo hondroitin sulfata. Z dodatno optimizacijo so dosegli končno 55 % sulfatacijo hondroitina, kar je blizu 70 % sulfataciji pri živalih. Gre za bolj trajnostno proizvodnjo, katere glavna prednost je, da za razliko od živalskega CS, mikrobni CS poleg 4-O- ne vsebuje še 6-O-sulfatiranega izomera CS.<br />
<br />
==Literatura==<br />
<br />
# Köwitsch, A., Zhou G., Groth T.: Medical application of glycosaminoglycans: a review. J Tissue Eng Regen Med. 2017, 12. <br />
# Badri, A., ''et al''.: Complete biosynthesis of a sulfated chondroitin in Escherichia coli. Nature communications. 2021, 12.<br />
# Datsenko, A. K., Wanner, L. B.: One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. PNAS. 2000, 12.<br />
# He, W (2017). Metabolic Engineering and Applied Enzymology for the Preparation of Nutraceutical/Pharmaceutical Chondroitin Sulfate. PhD thesis, Rensselaer Polytechnic Insitute.<br />
# Bikard, D., ''et al''.: Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic Acids Research. 2013, 15.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Povezava&diff=18571Povezava2021-04-20T17:25:59Z<p>AnaMaklin: New page: ==UVOD== Glikozaminoglikani (GAG) so dolge verige nerazvejanih polisaharidov, ki so del zunajceličnega matriksa. Sestavljeni so iz ponavljajočih se disaharidnih enot povezanih z glikozid...</p>
<hr />
<div>==UVOD==<br />
Glikozaminoglikani (GAG) so dolge verige nerazvejanih polisaharidov, ki so del zunajceličnega matriksa. Sestavljeni so iz ponavljajočih se disaharidnih enot povezanih z glikozidno vezjo [1]. So pomembne biološke molekule, ki se pridobivajo z izolacijo iz živalskih tkiv. Eden najpogostejših GAG-ov pri človeku, hondroitin sulfat (CS), se v medicini uporablja za zdravljenje osteoartritisa. Zaradi variabilnosti mesta sulfatacije in velikosti polimerov, možnosti kontaminacij ter netrajnosti pridobivanja GAG-ov iz živalskih virov, so se avtorji članka odločili za mikrobno proizvodnjo CS v E. coli [1, 2].<br />
<br />
==PROIZVODNJI SISTEM==<br />
Biosinteza CS v E.coli zahteva 3 komponente: prekurzor hondroitin, donor sulfatne skupine 3′-fosfoadenozin-5′-fosfosulfat (PAPS) in hondroitin sulfotransferazo. Od 11 metabolnih korakov za sintezo hondroitina, je 9 že prisotnih v klasičnih sevih E.coli. Encima za preostala 2 koraka, UDP-N-acetilglukozamin-/UDP-glukozamin-4-epimeraza in hondroitin sintaza, vsebuje sev E.coli K4, zato so ga izbrali za proizvodnjo CS. Sev K4 proizvaja fruktoziliran hondroitin kot sestavni del polisaharidne kapsule [2]. Fruktozilacija hondroitina je pri sintezi hondroitin sulfata nezaželjena, zato so s homologno rekombinacijo Lambda Red izbrisali zapis za fruktozil transferazo (ΔkfoE) [2, 3]. V sev K4 so na mesto LacZ vstavili še zapis za T7 RNA polimerazo, da so dobili E. coli ΔkfoE (DE3) [2]. Ključni encim, ki katalizira sulfatacijo hondroitina, hondroitin sulfotransferaza, je živalskega izvora in se nahaja Golgijevem aparatu (GA). Zapis za hondroitin-4-O-sulfotransferazo (Sw) so v celice E.coli K4 ΔkfoE (DE3) vstavili s plazmidom pETM6-Sw [2].<br />
<br />
==REZULTATI IN OPTIMIZACIJA PROIZVODNJE==<br />
Donor sulfatne skupine PAPS, ki je potreben za sulfatacijo hondroitina, nastaja v biosintezni poti cisteina/metionina, ki poteka v skoraj vseh celicah. Kljub temu, v sevu E. coli ΔkfoE (DE3) pETM6- Sw ni prišlo do sinteze CS. Ugotovili so, da encim PAPS reduktaza (cysH), zmanjšuje koncentracijo PAPS-a v celici in s sulfotransferazo tekmuje za substrat. S pomočjo homologne rekombinacije Lambda Red so uvedli delecijo zapisa za PAPS reduktazo ΔcysH. V E. coli ΔkfoE ΔcysH (DE3) pETM6-Sw so dosegli 19 % sulfatacijo hondroitina, kar je manj kot pri CS izoliranem iz živalskih tkiv. Nasprotno pa je dodatno izražanje genov, ki sodelujejo pri nastanku PAPS, cysDN, cysC in cysQ, močno zmanjšalo sulfatacijo hondroitina [2].<br />
V nadaljevanju so poskusili povečati aktivnost sulfotransferaze. Ker struktura encima ni znana, so naredili homologni model strukture sulfotransferaze Sw na osnovi predhodno razrešene strukture sulfotransferazne domene olefin sintaze iz Synechococcus. Uporabili so spletni program PROSS, ki je predlagal tri variante Sw z večimi mutacijami v zaporedju: SM1, SM2, in SM4. Zapise za variante sulfotransferaze so vstavili v celice E. coli ΔkfoE ΔcysH (DE3), da bi potrdili vpliv mutacij v in vivo proizvodnjem sistemu. Z izražanjem SM1 in SM4 so dobili podoben delež sulfatacije kot pri Sw, medtem ko so pri SM2 dobili kar 3× večji delež sulfatacije [2].<br />
<br />
Pogoji rasti in indukcije imajo pomemben vpliv na biosintezo mikrobnih produktov. Celice K4 ΔkfoE ΔcysH (DE3) pETM6-Sw so gojili in inducirali z IPTG pri različnih fazah rasti. Primerjali so indukcijo pri različnih OD600 (0,6 in 1), različne koncentracije IPTG (0,5 in 1 mM) ter temperature izražanja (37, 20, 16 °C). Največji delež sulfatacije so dobili pri OD600 1, z 0,5 ali 1 mM IPTG, izražanje 12 h na 20 °C in pri OD600 0,6, z 1 mM IPTG in izražanje 24 h na 16 °C. Z optimizacijo indukcije so v E. coli K4 ΔkfoE ΔcysH (DE3) pETM6-Sw dosegli izboljšanje sulfatacije CS iz 19 na 23 % [2].<br />
<br />
Divji tip E. coli K4 izvaža fruktoziliran hondroitin preko membranskega ABC transporterja. V predhodnih raziskavah so ugotovili, da se večina nesulfatiranega hondroitina prenese v medij [2, 4]. Avtorji tega članka, so ugotovili, da se CS ne nahaja v mediju, temveč v celoti ostane v znotrajceličnem prostoru. Čeprav so v prejšnih stopnjah optimizacije izboljšali znotrajcelično sulfatacijo, se večina hondroitina prenese iz celice v nesulfatirani obliki. Izvoz nesulfatiranega hondroitina in sulfatacija hondroitina sta dva tekmovalna procesa. Da bi zmanjšali vpliv transportne aktivnosti na znotrajcelično sulfatacijo, so s pomočjo CRISPRi naredili represijo genov transporterja. ABC transporter sestavljajo 4 proteini, KpsT, KpsM, KpsD in KpsE [2]. Naredili so 5 distančnikov, ki ciljajo kpsT in kpsM (dT1, dT2, dT3, dM1 in dM2) in jih sklonirali v CRISPRi plazmid pdCas9, s katerim so nato transforimirali celice E. coli K4 ΔkfoE ΔcysH (DE3) pETM6-Sw [2, 5]. Najboljše se je obnesla varianta s pdCas9-dM1, saj se je izvoz zmanjšal kar za 60 %. Sulfatacija hondroitina pri tem sevu se je povečala 3× na 55 % [2].<br />
<br />
==ZAKLJUČEK==<br />
<br />
V eksperimentu, opisanem v članku, so v celice E. coli K4 uspešno vključili zapis za sulfotransferazo in uvedli potrebne delecije za biosintezo hondroitin sulfata. Z dodatno optimizacijo so dosegli končno 55 % sulfatacijo hondroitina, kar je blizu 70 % sulfataciji pri živalih. Gre za bolj trajnostno proizvodnjo, katere glavna prednost je, da za razliko od živalskega CS, mikrobni CS poleg 4-O- ne vsebuje še 6-O-sulfatiranega izomera CS.<br />
<br />
==LITERATURA==<br />
<br />
# Köwitsch, A., Zhou G., Groth T.: Medical application of glycosaminoglycans: a review. J Tissue Eng Regen Med. 2017, 12. <br />
# Badri, A., et al.: Complete biosynthesis of a sulfated chondroitin in Escherichia coli. Nature communications. 2021, 12.<br />
# Datsenko, A. K., Wanner, L. B.: One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. PNAS. 2000, 12.<br />
# He, W (2017). Metabolic Engineering and Applied Enzymology for the Preparation of Nutraceutical/Pharmaceutical Chondroitin Sulfate. PhD thesis, Rensselaer Polytechnic Insitute.<br />
# Bikard, D., et al.: Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic Acids Research. 2013, 15.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2021&diff=18570MBT seminarji 20212021-04-20T17:21:52Z<p>AnaMaklin: </p>
<hr />
<div>Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].<br />
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.<br />
<br />
Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).<br />
<br />
Način vnosa:<br />
<br />
The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.)<br><br />
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br />
<br />
----<br />
<br />
<br />
Naslovi odobrenih člankov po temah:<br />
<br />
'''Farmacevtsko pomembni proteini'''<br><br />
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)<br />
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)<br />
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)<br />
<br />
'''Cepiva'''<br><br />
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.)<br><br />
# An AMA1/MSP1<sub>19</sub> Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.)<br><br />
<br />
'''Gensko spremenjene rastline'''<br><br />
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)<br />
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)<br />
<br />
'''Gensko spremenjene živali in celične linije'''<br><br />
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)<br />
# Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse (H. Li ''et. al''; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117(52), 2021; https://doi.org/10.1073/pnas.2003991117). [[Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.]] Matija Ruparčič (8.4.)<br />
<br />
'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti'''<br><br />
# Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. (T. Walter ''et. al.''; Microorganisms 8(6), 2020; https://doi.org/10.3390/microorganisms8060866). [[Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum]]. Saša Slabe (14.4.)<br />
# Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from ''Pseudomonas nitroreducens'' Jin1. (Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5). [[Učinkovita biosinteza vanilina iz izoevgenola z uporabo rekombinantne izoevgenol monooksigenaze Jin1 iz bakterije Pseudomonas nitroreducens]]. Luka Gnidovec (15.4.)<br />
# One-pot production of butyl butyrate from glucose using a cognate “diamond-shaped” ''E. coli'' consortium (J. P. Sinumvayo "et. al"; Bioresources and Bioprocessing 8, 2021; https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-021-00372-8#Sec9). [[Proizvodnja butil butirata iz glukoze z uporabo "diamantnega" konzorcija E. coli]] Liza Ulčakar (15.4.)<br />
<br />
'''Biotehnološki polimeri'''<br><br />
# Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors (S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” ''J. Biotechnol.'', vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001). [[Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi]] Anže Karlek (21.4.)<br />
# Complete biosynthesis of a sulfated chondroitin in ''Escherichia coli'' (Badri, A., ''et al''; Nature communications 12 (2021); https://doi.org/10.1038/s41467-021-21692-5). [[povezava]] Ana Maklin (22.4.) <br />
# Optimization of cultivation medium and cyclic fed-batch fermentation strategy for enhanced polyhydroxyalkanoate production by Bacillus thuringiensis using a glucose-rich hydrolyzate (Singh et al. Bioresour. Bioprocess. (2021) 8:11, https://doi.org/10.1186/s40643-021-00361-x) [[Optimizacija fermentacijske proizvodnje PHA-bioplastike z b. thuringiensis in z glukozo bogatimi hidrolizati]] Urban Hribar (22.4.)<br />
<br />
'''Biotehnološko pridobljeni encimi'''<br><br />
# Urška Fajdiga (5.5.)<br />
# Mirsad Mešić (6.5.)<br />
# Martina Lokar (6.5.)<br />
<br />
'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji'''<br><br />
# Jerneja Nimac (12.5.)<br />
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)<br />
# Klementina Polanec (13.5.)<br />
# Ernestina Lavrih (13.5.)<br />
<br />
'''Biomasa in biogoriva'''<br><br />
# Željka Erić (19.5.)<br />
# Karin Dobravc Škof (20.5.)<br />
# Katja Doberšek (20.5.)<br />
<br />
'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija'''<br><br />
# Almina Tahirović (26.5.)<br />
# Eva Keber (27.5.)<br />
# Nina Lukančič (27.5.)</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2021&diff=18569MBT seminarji 20212021-04-20T17:17:19Z<p>AnaMaklin: </p>
<hr />
<div>Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].<br />
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.<br />
<br />
Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).<br />
<br />
Način vnosa:<br />
<br />
The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.)<br><br />
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br />
<br />
----<br />
<br />
<br />
Naslovi odobrenih člankov po temah:<br />
<br />
'''Farmacevtsko pomembni proteini'''<br><br />
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)<br />
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)<br />
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)<br />
<br />
'''Cepiva'''<br><br />
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.)<br><br />
# An AMA1/MSP1<sub>19</sub> Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.)<br><br />
<br />
'''Gensko spremenjene rastline'''<br><br />
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)<br />
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)<br />
<br />
'''Gensko spremenjene živali in celične linije'''<br><br />
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)<br />
# Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse (H. Li ''et. al''; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117(52), 2021; https://doi.org/10.1073/pnas.2003991117). [[Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.]] Matija Ruparčič (8.4.)<br />
<br />
'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti'''<br><br />
# Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. (T. Walter ''et. al.''; Microorganisms 8(6), 2020; https://doi.org/10.3390/microorganisms8060866). [[Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum]]. Saša Slabe (14.4.)<br />
# Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from ''Pseudomonas nitroreducens'' Jin1. (Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5). [[Učinkovita biosinteza vanilina iz izoevgenola z uporabo rekombinantne izoevgenol monooksigenaze Jin1 iz bakterije Pseudomonas nitroreducens]]. Luka Gnidovec (15.4.)<br />
# One-pot production of butyl butyrate from glucose using a cognate “diamond-shaped” ''E. coli'' consortium (J. P. Sinumvayo "et. al"; Bioresources and Bioprocessing 8, 2021; https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-021-00372-8#Sec9). [[Proizvodnja butil butirata iz glukoze z uporabo "diamantnega" konzorcija E. coli]] Liza Ulčakar (15.4.)<br />
<br />
'''Biotehnološki polimeri'''<br><br />
# Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors (S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” ''J. Biotechnol.'', vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001). [[Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi]] Anže Karlek (21.4.)<br />
# Complete biosynthesis of a sulfated chondroitin in ''Escherichia coli'' (Badri, A., ''et al''; Nature communications 12 (2021); https://doi.org/10.1038/s41467-021-21692-5). [[Popolna biosinteza hondroitin sulfata v ''E. coli'']] Ana Maklin (22.4.) <br />
# Optimization of cultivation medium and cyclic fed-batch fermentation strategy for enhanced polyhydroxyalkanoate production by Bacillus thuringiensis using a glucose-rich hydrolyzate (Singh et al. Bioresour. Bioprocess. (2021) 8:11, https://doi.org/10.1186/s40643-021-00361-x) [[Optimizacija fermentacijske proizvodnje PHA-bioplastike z b. thuringiensis in z glukozo bogatimi hidrolizati]] Urban Hribar (22.4.)<br />
<br />
'''Biotehnološko pridobljeni encimi'''<br><br />
# Urška Fajdiga (5.5.)<br />
# Mirsad Mešić (6.5.)<br />
# Martina Lokar (6.5.)<br />
<br />
'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji'''<br><br />
# Jerneja Nimac (12.5.)<br />
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)<br />
# Klementina Polanec (13.5.)<br />
# Ernestina Lavrih (13.5.)<br />
<br />
'''Biomasa in biogoriva'''<br><br />
# Željka Erić (19.5.)<br />
# Karin Dobravc Škof (20.5.)<br />
# Katja Doberšek (20.5.)<br />
<br />
'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija'''<br><br />
# Almina Tahirović (26.5.)<br />
# Eva Keber (27.5.)<br />
# Nina Lukančič (27.5.)</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2021&diff=18568MBT seminarji 20212021-04-20T17:07:55Z<p>AnaMaklin: </p>
<hr />
<div>Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].<br />
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.<br />
<br />
Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).<br />
<br />
Način vnosa:<br />
<br />
The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.)<br><br />
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br />
<br />
----<br />
<br />
<br />
Naslovi odobrenih člankov po temah:<br />
<br />
'''Farmacevtsko pomembni proteini'''<br><br />
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)<br />
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)<br />
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)<br />
<br />
'''Cepiva'''<br><br />
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.)<br><br />
# An AMA1/MSP1<sub>19</sub> Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.)<br><br />
<br />
'''Gensko spremenjene rastline'''<br><br />
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)<br />
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)<br />
<br />
'''Gensko spremenjene živali in celične linije'''<br><br />
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)<br />
# Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse (H. Li ''et. al''; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117(52), 2021; https://doi.org/10.1073/pnas.2003991117). [[Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.]] Matija Ruparčič (8.4.)<br />
<br />
'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti'''<br><br />
# Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. (T. Walter ''et. al.''; Microorganisms 8(6), 2020; https://doi.org/10.3390/microorganisms8060866). [[Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum]]. Saša Slabe (14.4.)<br />
# Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from ''Pseudomonas nitroreducens'' Jin1. (Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5). [[Učinkovita biosinteza vanilina iz izoevgenola z uporabo rekombinantne izoevgenol monooksigenaze Jin1 iz bakterije Pseudomonas nitroreducens]]. Luka Gnidovec (15.4.)<br />
# One-pot production of butyl butyrate from glucose using a cognate “diamond-shaped” ''E. coli'' consortium (J. P. Sinumvayo "et. al"; Bioresources and Bioprocessing 8, 2021; https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-021-00372-8#Sec9). [[Proizvodnja butil butirata iz glukoze z uporabo "diamantnega" konzorcija E. coli]] Liza Ulčakar (15.4.)<br />
<br />
'''Biotehnološki polimeri'''<br><br />
# Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors (S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” ''J. Biotechnol.'', vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001). [[Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi]] Anže Karlek (21.4.)<br />
# Complete biosynthesis of a sulfated chondroitin in ''Escherichia coli'' (Badri, A., ''et al''; Nature communications 12 (2021); https://doi.org/10.1038/s41467-021-21692-5). [[Popolna biosinteza hondroitin sulfata v ''E. coli'']] Ana Maklin (22.4.)<br />
# Optimization of cultivation medium and cyclic fed-batch fermentation strategy for enhanced polyhydroxyalkanoate production by Bacillus thuringiensis using a glucose-rich hydrolyzate (Singh et al. Bioresour. Bioprocess. (2021) 8:11, https://doi.org/10.1186/s40643-021-00361-x) [[Optimizacija fermentacijske proizvodnje PHA-bioplastike z b. thuringiensis in z glukozo bogatimi hidrolizati]] Urban Hribar (22.4.)<br />
<br />
'''Biotehnološko pridobljeni encimi'''<br><br />
# Urška Fajdiga (5.5.)<br />
# Mirsad Mešić (6.5.)<br />
# Martina Lokar (6.5.)<br />
<br />
'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji'''<br><br />
# Jerneja Nimac (12.5.)<br />
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)<br />
# Klementina Polanec (13.5.)<br />
# Ernestina Lavrih (13.5.)<br />
<br />
'''Biomasa in biogoriva'''<br><br />
# Željka Erić (19.5.)<br />
# Karin Dobravc Škof (20.5.)<br />
# Katja Doberšek (20.5.)<br />
<br />
'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija'''<br><br />
# Almina Tahirović (26.5.)<br />
# Eva Keber (27.5.)<br />
# Nina Lukančič (27.5.)</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2021&diff=18567MBT seminarji 20212021-04-20T17:07:01Z<p>AnaMaklin: </p>
<hr />
<div>Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].<br />
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.<br />
<br />
Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).<br />
<br />
Način vnosa:<br />
<br />
The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.)<br><br />
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br />
<br />
----<br />
<br />
<br />
Naslovi odobrenih člankov po temah:<br />
<br />
'''Farmacevtsko pomembni proteini'''<br><br />
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)<br />
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)<br />
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)<br />
<br />
'''Cepiva'''<br><br />
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.)<br><br />
# An AMA1/MSP1<sub>19</sub> Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.)<br><br />
<br />
'''Gensko spremenjene rastline'''<br><br />
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)<br />
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)<br />
<br />
'''Gensko spremenjene živali in celične linije'''<br><br />
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)<br />
# Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse (H. Li ''et. al''; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117(52), 2021; https://doi.org/10.1073/pnas.2003991117). [[Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.]] Matija Ruparčič (8.4.)<br />
<br />
'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti'''<br><br />
# Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. (T. Walter ''et. al.''; Microorganisms 8(6), 2020; https://doi.org/10.3390/microorganisms8060866). [[Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum]]. Saša Slabe (14.4.)<br />
# Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from ''Pseudomonas nitroreducens'' Jin1. (Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5). [[Učinkovita biosinteza vanilina iz izoevgenola z uporabo rekombinantne izoevgenol monooksigenaze Jin1 iz bakterije Pseudomonas nitroreducens]]. Luka Gnidovec (15.4.)<br />
# One-pot production of butyl butyrate from glucose using a cognate “diamond-shaped” ''E. coli'' consortium (J. P. Sinumvayo "et. al"; Bioresources and Bioprocessing 8, 2021; https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-021-00372-8#Sec9). [[Proizvodnja butil butirata iz glukoze z uporabo "diamantnega" konzorcija E. coli]] Liza Ulčakar (15.4.)<br />
<br />
'''Biotehnološki polimeri'''<br><br />
# Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors (S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” ''J. Biotechnol.'', vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001). [[Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi]] Anže Karlek (21.4.)<br />
# Complete biosynthesis of a sulfated chondroitin in ''Escherichia coli'' (Badri, A., ''et al''; Nature communications 12 (2021); https://doi.org/10.1038/s41467-021-21692-5). [Popolna biosinteza hondroitin sulfata v ''E. coli''] Ana Maklin (22.4.)<br />
# Optimization of cultivation medium and cyclic fed-batch fermentation strategy for enhanced polyhydroxyalkanoate production by Bacillus thuringiensis using a glucose-rich hydrolyzate (Singh et al. Bioresour. Bioprocess. (2021) 8:11, https://doi.org/10.1186/s40643-021-00361-x) [[Optimizacija fermentacijske proizvodnje PHA-bioplastike z b. thuringiensis in z glukozo bogatimi hidrolizati]] Urban Hribar (22.4.)<br />
<br />
'''Biotehnološko pridobljeni encimi'''<br><br />
# Urška Fajdiga (5.5.)<br />
# Mirsad Mešić (6.5.)<br />
# Martina Lokar (6.5.)<br />
<br />
'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji'''<br><br />
# Jerneja Nimac (12.5.)<br />
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)<br />
# Klementina Polanec (13.5.)<br />
# Ernestina Lavrih (13.5.)<br />
<br />
'''Biomasa in biogoriva'''<br><br />
# Željka Erić (19.5.)<br />
# Karin Dobravc Škof (20.5.)<br />
# Katja Doberšek (20.5.)<br />
<br />
'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija'''<br><br />
# Almina Tahirović (26.5.)<br />
# Eva Keber (27.5.)<br />
# Nina Lukančič (27.5.)</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2021&diff=18566MBT seminarji 20212021-04-20T17:03:46Z<p>AnaMaklin: </p>
<hr />
<div>Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].<br />
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.<br />
<br />
Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).<br />
<br />
Način vnosa:<br />
<br />
The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.)<br><br />
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br />
<br />
----<br />
<br />
<br />
Naslovi odobrenih člankov po temah:<br />
<br />
'''Farmacevtsko pomembni proteini'''<br><br />
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)<br />
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)<br />
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)<br />
<br />
'''Cepiva'''<br><br />
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.)<br><br />
# An AMA1/MSP1<sub>19</sub> Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.)<br><br />
<br />
'''Gensko spremenjene rastline'''<br><br />
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)<br />
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)<br />
<br />
'''Gensko spremenjene živali in celične linije'''<br><br />
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)<br />
# Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse (H. Li ''et. al''; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117(52), 2021; https://doi.org/10.1073/pnas.2003991117). [[Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.]] Matija Ruparčič (8.4.)<br />
<br />
'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti'''<br><br />
# Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. (T. Walter ''et. al.''; Microorganisms 8(6), 2020; https://doi.org/10.3390/microorganisms8060866). [[Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum]]. Saša Slabe (14.4.)<br />
# Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from ''Pseudomonas nitroreducens'' Jin1. (Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5). [[Učinkovita biosinteza vanilina iz izoevgenola z uporabo rekombinantne izoevgenol monooksigenaze Jin1 iz bakterije Pseudomonas nitroreducens]]. Luka Gnidovec (15.4.)<br />
# One-pot production of butyl butyrate from glucose using a cognate “diamond-shaped” ''E. coli'' consortium (J. P. Sinumvayo "et. al"; Bioresources and Bioprocessing 8, 2021; https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-021-00372-8#Sec9). [[Proizvodnja butil butirata iz glukoze z uporabo "diamantnega" konzorcija E. coli]] Liza Ulčakar (15.4.)<br />
<br />
'''Biotehnološki polimeri'''<br><br />
# Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors (S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” ''J. Biotechnol.'', vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001). [[Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi]] Anže Karlek (21.4.)<br />
# Complete biosynthesis of a sulfated chondroitin in ''Escherichia coli'' (Badri, A., ''et al''; Nature communications 12 (2021); https://doi.org/10.1038/s41467-021-21692-5). [[Popolna biosinteza hondroitin sulfata v ''E. coli'']] Ana Maklin (22.4.)<br />
# Optimization of cultivation medium and cyclic fed-batch fermentation strategy for enhanced polyhydroxyalkanoate production by Bacillus thuringiensis using a glucose-rich hydrolyzate (Singh et al. Bioresour. Bioprocess. (2021) 8:11, https://doi.org/10.1186/s40643-021-00361-x) [[Optimizacija fermentacijske proizvodnje PHA-bioplastike z b. thuringiensis in z glukozo bogatimi hidrolizati]] Urban Hribar (22.4.)<br />
<br />
'''Biotehnološko pridobljeni encimi'''<br><br />
# Urška Fajdiga (5.5.)<br />
# Mirsad Mešić (6.5.)<br />
# Martina Lokar (6.5.)<br />
<br />
'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji'''<br><br />
# Jerneja Nimac (12.5.)<br />
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)<br />
# Klementina Polanec (13.5.)<br />
# Ernestina Lavrih (13.5.)<br />
<br />
'''Biomasa in biogoriva'''<br><br />
# Željka Erić (19.5.)<br />
# Karin Dobravc Škof (20.5.)<br />
# Katja Doberšek (20.5.)<br />
<br />
'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija'''<br><br />
# Almina Tahirović (26.5.)<br />
# Eva Keber (27.5.)<br />
# Nina Lukančič (27.5.)</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16808ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T21:18:02Z<p>AnaMaklin: </p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki.<br />
<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1, 2]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB). Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [3].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkoristi in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1, 2]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja, sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]) [4].<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Agr sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein AgrB procesira prepeptid AgrD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo, naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo AgrC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije AgrC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina AgrA. Dimer AgrA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Agr, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [3]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [4]. Molekula AIP preko dvokomponentnega detekcijskega sistema AgrC/AgrA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [5, 6]. Izbira takšne aktivne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki, kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin, celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja AgrC za detekcijo [4, 5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V celice ''L. reuteri'', so želeli vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, AgrC/AgrA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so združevali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina in izločanje endolizina iz celice ter čim boljša učinkovitost uničevanja''C. difficile''. Po uspešnem izražanju konstukta z zapisom za cel endolizin CD27L so testirali delovanje in učinkovitost endolizina. <br />
<br />
Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 (''C. difficile'' spada v kategorijo 2). Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Celični lizati z dodanim endolizinom so imeli nižjo celično gostoto. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM, kjer so opazili spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Genetski material so preko plazmida pTRKH3 vnašali z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''. V literaturi je zapisanih veliko različnih protokolov elektroporacije za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub številnim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016 .<br />
Za uspešno transformacijo je potrebno uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi [4, 7]. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'', so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, z dodatnim zapisom za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om s protitelesi anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna [4].<br />
<br />
=== Izražanje AgrAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel AgrAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Delovanje vezja so želeli preveriti preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi sprožil dimerizacijo AgrA, ta pa bi induciral sintezo reporterskega proteina mClover3 pod kontrolo promotorja Agr ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). <br />
<br />
Tudi v primeru izražanja AgrAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlogi za slabo izražanje so slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov AgrA in AgrC v celici [4].<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja Agr ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, AgrAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature [4].<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' [4].<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Molecular characterization of a ''Clostridium difficile'' bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. ''Journal of Bacteriology''. 2008, 20, 6734–6740.<br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# A. Fernandez, ''et al''. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by ''Lactococcus lactis''. ''Applied and Environmental Microbiology''. 2008, 75, 869–871. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-generation probiotics targeting ''Clostridium difficile'' through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16807ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T21:13:54Z<p>AnaMaklin: /* Izražanje ArgAC v L. reuteri */</p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki.<br />
<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1, 2]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB). Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [3].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkoristi in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1, 2]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja, sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]) [4].<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo, naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [3]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [4]. Molekula AIP preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [5, 6]. Izbira takšne aktivne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki, kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin, celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [4, 5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V celice ''L. reuteri'', so želeli vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so združevali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina in izločanje endolizina iz celice ter čim boljša učinkovitost uničevanja''C. difficile''. Po uspešnem izražanju konstukta z zapisom za cel endolizin CD27L so testirali delovanje in učinkovitost endolizina. <br />
<br />
Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 (''C. difficile'' spada v kategorijo 2). Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Celični lizati z dodanim endolizinom so imeli nižjo celično gostoto. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM, kjer so opazili spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Genetski material so preko plazmida pTRKH3 vnašali z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''. V literaturi je zapisanih veliko različnih protokolov elektroporacije za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub številnim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016 .<br />
Za uspešno transformacijo je potrebno uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi [4, 7]. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'', so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, z dodatnim zapisom za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om s protitelesi anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna [4].<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Delovanje vezja so želeli preveriti preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi sprožil dimerizacijo ArgA, ta pa bi induciral sintezo reporterskega proteina mClover3 pod kontrolo promotorja Arg ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). <br />
<br />
Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlogi za slabo izražanje so slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov ArgA in ArgC v celici [4].<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja Arg ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature [4].<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' [4].<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Molecular characterization of a ''Clostridium difficile'' bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. ''Journal of Bacteriology''. 2008, 20, 6734–6740.<br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# A. Fernandez, ''et al''. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by ''Lactococcus lactis''. ''Applied and Environmental Microbiology''. 2008, 75, 869–871. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-generation probiotics targeting ''Clostridium difficile'' through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16806ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T21:13:32Z<p>AnaMaklin: /* Izražanje ArgAC v L. reuteri */</p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki.<br />
<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1, 2]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB). Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [3].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkoristi in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1, 2]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja, sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]) [4].<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo, naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [3]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [4]. Molekula AIP preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [5, 6]. Izbira takšne aktivne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki, kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin, celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [4, 5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V celice ''L. reuteri'', so želeli vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so združevali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina in izločanje endolizina iz celice ter čim boljša učinkovitost uničevanja''C. difficile''. Po uspešnem izražanju konstukta z zapisom za cel endolizin CD27L so testirali delovanje in učinkovitost endolizina. <br />
<br />
Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 (''C. difficile'' spada v kategorijo 2). Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Celični lizati z dodanim endolizinom so imeli nižjo celično gostoto. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM, kjer so opazili spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Genetski material so preko plazmida pTRKH3 vnašali z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''. V literaturi je zapisanih veliko različnih protokolov elektroporacije za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub številnim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016 .<br />
Za uspešno transformacijo je potrebno uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi [4, 7]. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'', so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, z dodatnim zapisom za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om s protitelesi anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna [4].<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Delovanje vezja so želeli preveriti preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi sprožil dimerizacijo ArgA, ta pa bi induciral sintezo reporterskega proteina mClover3 pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). <br />
<br />
Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlogi za slabo izražanje so slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov ArgA in ArgC v celici [4].<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja Arg ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature [4].<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' [4].<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Molecular characterization of a ''Clostridium difficile'' bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. ''Journal of Bacteriology''. 2008, 20, 6734–6740.<br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# A. Fernandez, ''et al''. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by ''Lactococcus lactis''. ''Applied and Environmental Microbiology''. 2008, 75, 869–871. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-generation probiotics targeting ''Clostridium difficile'' through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16805ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T21:06:25Z<p>AnaMaklin: </p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki.<br />
<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1, 2]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB). Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [3].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkoristi in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1, 2]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja, sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]) [4].<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo, naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [3]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [4]. Molekula AIP preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [5, 6]. Izbira takšne aktivne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki, kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin, celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [4, 5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V celice ''L. reuteri'', so želeli vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so združevali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina in izločanje endolizina iz celice ter čim boljša učinkovitost uničevanja''C. difficile''. Po uspešnem izražanju konstukta z zapisom za cel endolizin CD27L so testirali delovanje in učinkovitost endolizina. <br />
<br />
Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 (''C. difficile'' spada v kategorijo 2). Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Celični lizati z dodanim endolizinom so imeli nižjo celično gostoto. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM, kjer so opazili spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Genetski material so preko plazmida pTRKH3 vnašali z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''. V literaturi je zapisanih veliko različnih protokolov elektroporacije za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub številnim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016 .<br />
Za uspešno transformacijo je potrebno uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi [4, 7]. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'', so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, z dodatnim zapisom za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om s protitelesi anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna [4].<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Delovanje vezja so želeli preveriti preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi sprožil dimerizacijo ArgA, ta pa bi induciral sintezo reporterskega proteina mClover3 pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). <br />
<br />
Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlogi za slabo izražanje so slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov ArgA in ArgC v celici [4].<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature [4].<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' [4].<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Molecular characterization of a ''Clostridium difficile'' bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. ''Journal of Bacteriology''. 2008, 20, 6734–6740.<br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# A. Fernandez, ''et al''. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by ''Lactococcus lactis''. ''Applied and Environmental Microbiology''. 2008, 75, 869–871. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-generation probiotics targeting ''Clostridium difficile'' through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16804ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T21:04:12Z<p>AnaMaklin: </p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1, 2]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB). Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [3].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkoristi in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1, 2]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja, sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]) [4].<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo, naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [3]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [4]. Molekula AIP preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [5, 6]. Izbira takšne aktivne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki, kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin, celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [4, 5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V celice ''L. reuteri'', so želeli vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so združevali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina in izločanje endolizina iz celice ter čim boljša učinkovitost uničevanja''C. difficile''. Po uspešnem izražanju konstukta z zapisom za cel endolizin CD27L so testirali delovanje in učinkovitost endolizina. <br />
<br />
Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 (''C. difficile'' spada v kategorijo 2). Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Celični lizati z dodanim endolizinom so imeli nižjo celično gostoto. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM, kjer so opazili spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Genetski material so preko plazmida pTRKH3 vnašali z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''. V literaturi je zapisanih veliko različnih protokolov elektroporacije za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub številnim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016 .<br />
Za uspešno transformacijo je potrebno uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi [4, 7]. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'', so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, z dodatnim zapisom za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om s protitelesi anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna [4].<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Delovanje vezja so želeli preveriti preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi sprožil dimerizacijo ArgA, ta pa bi induciral sintezo reporterskega proteina mClover3 pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). <br />
<br />
Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlogi za slabo izražanje so slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov ArgA in ArgC v celici [4].<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature [4].<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' [4].<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Molecular characterization of a ''Clostridium difficile'' bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. ''Journal of Bacteriology''. 2008, 20, 6734–6740.<br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# A. Fernandez, ''et al''. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by ''Lactococcus lactis''. ''Applied and Environmental Microbiology''. 2008, 75, 869–871. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-generation probiotics targeting ''Clostridium difficile'' through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16796ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T19:02:56Z<p>AnaMaklin: /* Zaključek */</p>
<hr />
<div><font size=+1 color=#666666>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford</font><br/><br />
<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1, 2]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB). Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [3].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkoristi in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1, 2]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja, sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]) [4].<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo, naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [3]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [4]. Molekula AIP preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [5, 6]. Izbira takšne aktivne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki, kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin, celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [4, 5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V celice ''L. reuteri'', so želeli vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so združevali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina in izločanje endolizina iz celice ter čim boljša učinkovitost uničevanja''C. difficile''. Po uspešnem izražanju konstukta z zapisom za cel endolizin CD27L so testirali delovanje in učinkovitost endolizina. <br />
<br />
Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 (''C. difficile'' spada v kategorijo 2). Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Celični lizati z dodanim endolizinom so imeli nižjo celično gostoto. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM, kjer so opazili spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Genetski material so preko plazmida pTRKH3 vnašali z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''. V literaturi je zapisanih veliko različnih protokolov elektroporacije za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub številnim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016 .<br />
Za uspešno transformacijo je potrebno uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi [4, 7]. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'', so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, z dodatnim zapisom za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om s protitelesi anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna [4].<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Delovanje vezja so želeli preveriti preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi sprožil dimerizacijo ArgA, ta pa bi induciral sintezo reporterskega proteina mClover3 pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). <br />
<br />
Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlogi za slabo izražanje so slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov ArgA in ArgC v celici [4].<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature [4].<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' [4].<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Molecular characterization of a ''Clostridium difficile'' bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. ''Journal of Bacteriology''. 2008, 20, 6734–6740.<br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# A. Fernandez, ''et al''. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by ''Lactococcus lactis''. ''Applied and Environmental Microbiology''. 2008, 75, 869–871. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-generation probiotics targeting ''Clostridium difficile'' through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16795ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T19:02:40Z<p>AnaMaklin: /* Vpogled v zdravilo */</p>
<hr />
<div><font size=+1 color=#666666>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford</font><br/><br />
<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1, 2]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB). Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [3].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkoristi in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1, 2]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja, sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]) [4].<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo, naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [3]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [4]. Molekula AIP preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [5, 6]. Izbira takšne aktivne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki, kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin, celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [4, 5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V celice ''L. reuteri'', so želeli vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so združevali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina in izločanje endolizina iz celice ter čim boljša učinkovitost uničevanja''C. difficile''. Po uspešnem izražanju konstukta z zapisom za cel endolizin CD27L so testirali delovanje in učinkovitost endolizina. <br />
<br />
Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 (''C. difficile'' spada v kategorijo 2). Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Celični lizati z dodanim endolizinom so imeli nižjo celično gostoto. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM, kjer so opazili spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Genetski material so preko plazmida pTRKH3 vnašali z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''. V literaturi je zapisanih veliko različnih protokolov elektroporacije za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub številnim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016 .<br />
Za uspešno transformacijo je potrebno uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi [4, 7]. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'', so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, z dodatnim zapisom za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om s protitelesi anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna [4].<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Delovanje vezja so želeli preveriti preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi sprožil dimerizacijo ArgA, ta pa bi induciral sintezo reporterskega proteina mClover3 pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). <br />
<br />
Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlogi za slabo izražanje so slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov ArgA in ArgC v celici [4].<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature [4].<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' [4].<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Molecular characterization of a ''Clostridium difficile'' bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. ''Journal of Bacteriology''. 2008, 20, 6734–6740.<br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# A. Fernandez, ''et al''. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by ''Lactococcus lactis''. ''Applied and Environmental Microbiology''. 2008, 75, 869–871. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-generation probiotics targeting ''Clostridium difficile'' through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16794ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T19:01:47Z<p>AnaMaklin: /* Izražanje ArgAC v L. reuteri */</p>
<hr />
<div><font size=+1 color=#666666>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford</font><br/><br />
<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1, 2]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB). Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [3].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkoristi in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1, 2]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja, sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]) [4].<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo, naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [3]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [4]. Molekula AIP preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [5, 6]. Izbira takšne aktivne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki, kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin, celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [4, 5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V celice ''L. reuteri'', so želeli vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so združevali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina in izločanje endolizina iz celice ter čim boljša učinkovitost uničevanja''C. difficile''. Po uspešnem izražanju konstukta z zapisom za cel endolizin CD27L so testirali delovanje in učinkovitost endolizina. <br />
<br />
Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 (''C. difficile'' spada v kategorijo 2). Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Celični lizati z dodanim endolizinom so imeli nižjo celično gostoto. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM, kjer so opazili spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Genetski material so preko plazmida pTRKH3 vnašali z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''. V literaturi je zapisanih veliko različnih protokolov elektroporacije za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub številnim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016 .<br />
Za uspešno transformacijo je potrebno uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi [4, 7]. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'', so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, z dodatnim zapisom za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om s protitelesi anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna [4].<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Delovanje vezja so želeli preveriti preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi sprožil dimerizacijo ArgA, ta pa bi induciral sintezo reporterskega proteina mClover3 pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). <br />
<br />
Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlogi za slabo izražanje so slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov ArgA in ArgC v celici [4].<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature [4].<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' [4].<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Molecular characterization of a ''Clostridium difficile'' bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. ''Journal of Bacteriology''. 2008, 20, 6734–6740.<br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# A. Fernandez, ''et al''. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by ''Lactococcus lactis''. ''Applied and Environmental Microbiology''. 2008, 75, 869–871. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-generation probiotics targeting ''Clostridium difficile'' through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16793ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T19:00:49Z<p>AnaMaklin: /* Prenos konstruktov v L. reuteri */</p>
<hr />
<div><font size=+1 color=#666666>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford</font><br/><br />
<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1, 2]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB). Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [3].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkoristi in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1, 2]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja, sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]) [4].<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo, naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [3]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [4]. Molekula AIP preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [5, 6]. Izbira takšne aktivne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki, kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin, celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [4, 5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V celice ''L. reuteri'', so želeli vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so združevali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina in izločanje endolizina iz celice ter čim boljša učinkovitost uničevanja''C. difficile''. Po uspešnem izražanju konstukta z zapisom za cel endolizin CD27L so testirali delovanje in učinkovitost endolizina. <br />
<br />
Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 (''C. difficile'' spada v kategorijo 2). Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Celični lizati z dodanim endolizinom so imeli nižjo celično gostoto. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM, kjer so opazili spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Genetski material so preko plazmida pTRKH3 vnašali z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''. V literaturi je zapisanih veliko različnih protokolov elektroporacije za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub številnim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016 .<br />
Za uspešno transformacijo je potrebno uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi [4, 7]. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'', so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, z dodatnim zapisom za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om s protitelesi anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna [4].<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. <br />
<br />
Delovanje vezja so želeli preveriti preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi sprožil dimerizacijo ArgA, ta pa bi induciral sintezo reporterskega proteina mClover3 pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). <br />
<br />
Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlogi za slabo izražanje so slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov ArgA in ArgC v celici [4].<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature [4].<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' [4].<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Molecular characterization of a ''Clostridium difficile'' bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. ''Journal of Bacteriology''. 2008, 20, 6734–6740.<br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# A. Fernandez, ''et al''. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by ''Lactococcus lactis''. ''Applied and Environmental Microbiology''. 2008, 75, 869–871. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-generation probiotics targeting ''Clostridium difficile'' through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16792ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T18:49:07Z<p>AnaMaklin: /* Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v E. coli) */</p>
<hr />
<div><font size=+1 color=#666666>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford</font><br/><br />
<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1, 2]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB). Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [3].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkoristi in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1, 2]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja, sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]) [4].<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo, naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [3]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [4]. Molekula AIP preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [5, 6]. Izbira takšne aktivne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki, kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin, celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [4, 5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V celice ''L. reuteri'', so želeli vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so združevali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina in izločanje endolizina iz celice ter čim boljša učinkovitost uničevanja''C. difficile''. Po uspešnem izražanju konstukta z zapisom za cel endolizin CD27L so testirali delovanje in učinkovitost endolizina. <br />
<br />
Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 (''C. difficile'' spada v kategorijo 2). Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Celični lizati z dodanim endolizinom so imeli nižjo celično gostoto. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM, kjer so opazili spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016 .<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi [4, 7]. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna [4].<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Delovanje vezja so želeli preveriti preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). <br />
<br />
Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici [4].<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature [4].<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' [4].<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Molecular characterization of a ''Clostridium difficile'' bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. ''Journal of Bacteriology''. 2008, 20, 6734–6740.<br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# A. Fernandez, ''et al''. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by ''Lactococcus lactis''. ''Applied and Environmental Microbiology''. 2008, 75, 869–871. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-generation probiotics targeting ''Clostridium difficile'' through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16791ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T18:45:18Z<p>AnaMaklin: /* Komponente sistema ProQuorum */</p>
<hr />
<div><font size=+1 color=#666666>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford</font><br/><br />
<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1, 2]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB). Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [3].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkoristi in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1, 2]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja, sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]) [4].<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo, naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [3]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [4]. Molekula AIP preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [5, 6]. Izbira takšne aktivne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki, kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin, celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [4, 5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V celice ''L. reuteri'', so želeli vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so združevali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Po uspešnem izražanju konstukta z zapisom za cel endolizin CD27L je sledilo testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. <br />
<br />
Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 (''C. difficile'' spada v kategorijo 2). Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Celični lizati z dodanim endolizinom so imeli nižjo celično gostoto. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM, kjer se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016 .<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi [4, 7]. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna [4].<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Delovanje vezja so želeli preveriti preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). <br />
<br />
Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici [4].<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature [4].<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' [4].<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Molecular characterization of a ''Clostridium difficile'' bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. ''Journal of Bacteriology''. 2008, 20, 6734–6740.<br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# A. Fernandez, ''et al''. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by ''Lactococcus lactis''. ''Applied and Environmental Microbiology''. 2008, 75, 869–871. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-generation probiotics targeting ''Clostridium difficile'' through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16790ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T18:43:46Z<p>AnaMaklin: /* Izbira "šasije" */</p>
<hr />
<div><font size=+1 color=#666666>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford</font><br/><br />
<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1, 2]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB). Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [3].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkoristi in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1, 2]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja, sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]) [4].<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo, naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [3]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [4]. Molekula AIP preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [5, 6]. Izbira takšne aktivne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki, kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin, celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [4, 5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Po uspešnem izražanju konstukta z zapisom za cel endolizin CD27L je sledilo testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. <br />
<br />
Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 (''C. difficile'' spada v kategorijo 2). Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Celični lizati z dodanim endolizinom so imeli nižjo celično gostoto. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM, kjer se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016 .<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi [4, 7]. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna [4].<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Delovanje vezja so želeli preveriti preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). <br />
<br />
Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici [4].<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature [4].<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' [4].<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Molecular characterization of a ''Clostridium difficile'' bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. ''Journal of Bacteriology''. 2008, 20, 6734–6740.<br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# A. Fernandez, ''et al''. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by ''Lactococcus lactis''. ''Applied and Environmental Microbiology''. 2008, 75, 869–871. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-generation probiotics targeting ''Clostridium difficile'' through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16789ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T18:42:00Z<p>AnaMaklin: /* Detekcijski/regulatorni sistem */</p>
<hr />
<div><font size=+1 color=#666666>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford</font><br/><br />
<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1, 2]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB). Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [3].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkoristi in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1, 2]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja, sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]) [4].<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo, naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [3]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [4]. Molekula AIP preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [5, 6]. Izbira takšne aktivne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [4, 5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Po uspešnem izražanju konstukta z zapisom za cel endolizin CD27L je sledilo testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. <br />
<br />
Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 (''C. difficile'' spada v kategorijo 2). Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Celični lizati z dodanim endolizinom so imeli nižjo celično gostoto. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM, kjer se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016 .<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi [4, 7]. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna [4].<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Delovanje vezja so želeli preveriti preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). <br />
<br />
Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici [4].<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature [4].<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' [4].<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Molecular characterization of a ''Clostridium difficile'' bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. ''Journal of Bacteriology''. 2008, 20, 6734–6740.<br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# A. Fernandez, ''et al''. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by ''Lactococcus lactis''. ''Applied and Environmental Microbiology''. 2008, 75, 869–871. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-generation probiotics targeting ''Clostridium difficile'' through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16788ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T18:37:58Z<p>AnaMaklin: /* ProQuorum */</p>
<hr />
<div><font size=+1 color=#666666>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford</font><br/><br />
<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1, 2]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB). Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [3].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkoristi in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1, 2]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja, sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]) [4].<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju populacije in celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki povzročata vnetje črevesne sluznice in sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [3]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [4]. Molekula AIP nato preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [5, 6]. Izbira takšne zdravilne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [4, 5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Po uspešnem izražanju konstukta z zapisom za cel endolizin CD27L je sledilo testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. <br />
<br />
Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 (''C. difficile'' spada v kategorijo 2). Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Celični lizati z dodanim endolizinom so imeli nižjo celično gostoto. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM, kjer se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016 .<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi [4, 7]. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna [4].<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Delovanje vezja so želeli preveriti preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). <br />
<br />
Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici [4].<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature [4].<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' [4].<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Molecular characterization of a ''Clostridium difficile'' bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. ''Journal of Bacteriology''. 2008, 20, 6734–6740.<br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# A. Fernandez, ''et al''. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by ''Lactococcus lactis''. ''Applied and Environmental Microbiology''. 2008, 75, 869–871. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-generation probiotics targeting ''Clostridium difficile'' through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16787ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T18:36:51Z<p>AnaMaklin: /* Okužba s Clostridioides difficile */</p>
<hr />
<div><font size=+1 color=#666666>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford</font><br/><br />
<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1, 2]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB). Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [3].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkoristi in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1, 2]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja in sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]) [4].<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju populacije in celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki povzročata vnetje črevesne sluznice in sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [3]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [4]. Molekula AIP nato preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [5, 6]. Izbira takšne zdravilne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [4, 5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Po uspešnem izražanju konstukta z zapisom za cel endolizin CD27L je sledilo testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. <br />
<br />
Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 (''C. difficile'' spada v kategorijo 2). Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Celični lizati z dodanim endolizinom so imeli nižjo celično gostoto. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM, kjer se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016 .<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi [4, 7]. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna [4].<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Delovanje vezja so želeli preveriti preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). <br />
<br />
Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici [4].<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature [4].<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' [4].<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Molecular characterization of a ''Clostridium difficile'' bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. ''Journal of Bacteriology''. 2008, 20, 6734–6740.<br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# A. Fernandez, ''et al''. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by ''Lactococcus lactis''. ''Applied and Environmental Microbiology''. 2008, 75, 869–871. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-generation probiotics targeting ''Clostridium difficile'' through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16778ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T16:32:15Z<p>AnaMaklin: </p>
<hr />
<div><font size=+1 color=#666666>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford</font><br/><br />
<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1, 2]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB), značilna za veliko družino klostridijskih toksinov. Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [3].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkorisit in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1, 2]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja in sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]) [4].<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju populacije in celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki povzročata vnetje črevesne sluznice in sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [3]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [4]. Molekula AIP nato preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [5, 6]. Izbira takšne zdravilne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [4, 5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Po uspešnem izražanju konstukta z zapisom za cel endolizin CD27L je sledilo testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. <br />
<br />
Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 (''C. difficile'' spada v kategorijo 2). Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Celični lizati z dodanim endolizinom so imeli nižjo celično gostoto. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM, kjer se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016 .<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi [4, 7]. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna [4].<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Delovanje vezja so želeli preveriti preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). <br />
<br />
Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici [4].<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature [4].<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' [4].<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Molecular characterization of a ''Clostridium difficile'' bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. ''Journal of Bacteriology''. 2008, 20, 6734–6740.<br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# A. Fernandez, ''et al''. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by ''Lactococcus lactis''. ''Applied and Environmental Microbiology''. 2008, 75, 869–871. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-generation probiotics targeting ''Clostridium difficile'' through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16777ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T16:28:07Z<p>AnaMaklin: /* Izražanje ArgAC v L. reuteri */</p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1, 2]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB), značilna za veliko družino klostridijskih toksinov. Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [3].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkorisit in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1, 2]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja in sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]) [4].<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju populacije in celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki povzročata vnetje črevesne sluznice in sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [3]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [4]. Molekula AIP nato preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [5, 6]. Izbira takšne zdravilne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [4, 5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Po uspešnem izražanju konstukta z zapisom za cel endolizin CD27L je sledilo testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. <br />
<br />
Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 (''C. difficile'' spada v kategorijo 2). Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Celični lizati z dodanim endolizinom so imeli nižjo celično gostoto. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM, kjer se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016 .<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi [4, 7]. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna [4].<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Delovanje vezja so želeli preveriti preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). <br />
<br />
Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici [4].<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature [4].<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' [4].<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Molecular characterization of a ''Clostridium difficile'' bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. ''Journal of Bacteriology''. 2008, 20, 6734–6740.<br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# A. Fernandez, ''et al''. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by ''Lactococcus lactis''. ''Applied and Environmental Microbiology''. 2008, 75, 869–871. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-generation probiotics targeting ''Clostridium difficile'' through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16776ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T16:27:17Z<p>AnaMaklin: /* Prenos konstruktov v L. reuteri */</p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1, 2]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB), značilna za veliko družino klostridijskih toksinov. Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [3].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkorisit in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1, 2]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja in sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]) [4].<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju populacije in celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki povzročata vnetje črevesne sluznice in sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [3]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [4]. Molekula AIP nato preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [5, 6]. Izbira takšne zdravilne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [4, 5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Po uspešnem izražanju konstukta z zapisom za cel endolizin CD27L je sledilo testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. <br />
<br />
Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 (''C. difficile'' spada v kategorijo 2). Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Celični lizati z dodanim endolizinom so imeli nižjo celično gostoto. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM, kjer se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016 .<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi [4, 7]. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna [4].<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Delovanje vezja so želeli preveriti preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici [4].<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature [4].<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' [4].<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Molecular characterization of a ''Clostridium difficile'' bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. ''Journal of Bacteriology''. 2008, 20, 6734–6740.<br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# A. Fernandez, ''et al''. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by ''Lactococcus lactis''. ''Applied and Environmental Microbiology''. 2008, 75, 869–871. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-generation probiotics targeting ''Clostridium difficile'' through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16774ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T16:23:39Z<p>AnaMaklin: /* Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v E. coli) */</p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1, 2]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB), značilna za veliko družino klostridijskih toksinov. Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [3].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkorisit in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1, 2]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja in sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]) [4].<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju populacije in celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki povzročata vnetje črevesne sluznice in sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [3]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [4]. Molekula AIP nato preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [5, 6]. Izbira takšne zdravilne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [4, 5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Po uspešnem izražanju konstukta z zapisom za cel endolizin CD27L je sledilo testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. <br />
<br />
Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 (''C. difficile'' spada v kategorijo 2). Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Celični lizati z dodanim endolizinom so imeli nižjo celično gostoto. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM, kjer se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016 .<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi [4, 7]. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna [4].<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Po uspešni tranformaciji celic ''L. reuteri'' s konstruktom ArgAC so želeli preveriti delovanje sistema preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici [4].<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature [4].<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' [4].<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Molecular characterization of a ''Clostridium difficile'' bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. ''Journal of Bacteriology''. 2008, 20, 6734–6740.<br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# A. Fernandez, ''et al''. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by ''Lactococcus lactis''. ''Applied and Environmental Microbiology''. 2008, 75, 869–871. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-generation probiotics targeting ''Clostridium difficile'' through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16773ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T16:15:40Z<p>AnaMaklin: /* ProQuorum */</p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1, 2]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB), značilna za veliko družino klostridijskih toksinov. Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [3].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkorisit in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1, 2]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja in sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]) [4].<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju populacije in celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki povzročata vnetje črevesne sluznice in sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [3]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [4]. Molekula AIP nato preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [5, 6]. Izbira takšne zdravilne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [4, 5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Testirali so izražanje in delovanje 3 različnih konstruktov endolizina: Dundee-CD27L, CD27L in CD27L1-179. Najprej so naredili teste delovanja endolizina na celicah ''E. coli'' s pET28A ekspresijskim vektorjem. Najbolje se je izražala verzija s celim endolizinom CD27L.<br />
<br />
Sledilo je testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 in ne na celicah ''C. difficile'', ki spadajo v kategorijo 2. Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Ugotovili so, da ima CD27L celotne dolžine večjo učinkovitost uničevanja celic kot skrajšana verzija. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM. Pri celicah ''C. difficile'' izpostavljenim endolizinu CD27L se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
Rezultati titracije z naraščajočimi koncentracijami endolizina CD27L so pokazali, da je merljivi učinek endolizina na kulturo ''B. subtilis'' v LB gojišču pri koncentracijah večjih kot 0,2 mg/mL. Ta podatek so uporabili za določitev kinetičnih konstant, ki so jih kasneje uporabili v matematičnih modelih. V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016 .<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi [4, 7]. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna [4].<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Po uspešni tranformaciji celic ''L. reuteri'' s konstruktom ArgAC so želeli preveriti delovanje sistema preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici [4].<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature [4].<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' [4].<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Molecular characterization of a ''Clostridium difficile'' bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. ''Journal of Bacteriology''. 2008, 20, 6734–6740.<br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# A. Fernandez, ''et al''. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by ''Lactococcus lactis''. ''Applied and Environmental Microbiology''. 2008, 75, 869–871. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-generation probiotics targeting ''Clostridium difficile'' through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16772ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T16:15:03Z<p>AnaMaklin: </p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1, 2]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB), značilna za veliko družino klostridijskih toksinov. Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [3].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkorisit in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1, 2]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja in sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]).<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju populacije in celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki povzročata vnetje črevesne sluznice in sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [3]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [4]. Molekula AIP nato preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [5, 6]. Izbira takšne zdravilne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [4, 5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Testirali so izražanje in delovanje 3 različnih konstruktov endolizina: Dundee-CD27L, CD27L in CD27L1-179. Najprej so naredili teste delovanja endolizina na celicah ''E. coli'' s pET28A ekspresijskim vektorjem. Najbolje se je izražala verzija s celim endolizinom CD27L.<br />
<br />
Sledilo je testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 in ne na celicah ''C. difficile'', ki spadajo v kategorijo 2. Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Ugotovili so, da ima CD27L celotne dolžine večjo učinkovitost uničevanja celic kot skrajšana verzija. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM. Pri celicah ''C. difficile'' izpostavljenim endolizinu CD27L se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
Rezultati titracije z naraščajočimi koncentracijami endolizina CD27L so pokazali, da je merljivi učinek endolizina na kulturo ''B. subtilis'' v LB gojišču pri koncentracijah večjih kot 0,2 mg/mL. Ta podatek so uporabili za določitev kinetičnih konstant, ki so jih kasneje uporabili v matematičnih modelih. V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016 .<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi [4, 7]. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna [4].<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Po uspešni tranformaciji celic ''L. reuteri'' s konstruktom ArgAC so želeli preveriti delovanje sistema preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici [4].<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature [4].<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' [4].<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Molecular characterization of a ''Clostridium difficile'' bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. ''Journal of Bacteriology''. 2008, 20, 6734–6740.<br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# A. Fernandez, ''et al''. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by ''Lactococcus lactis''. ''Applied and Environmental Microbiology''. 2008, 75, 869–871. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-generation probiotics targeting ''Clostridium difficile'' through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16771ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T16:11:29Z<p>AnaMaklin: /* Viri */</p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB), značilna za veliko družino klostridijskih toksinov. Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [2].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkorisit in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja in sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]).<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju populacije in celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki povzročata vnetje črevesne sluznice in sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [2]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [3]. Molekula AIP nato preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [4]. Izbira takšne zdravilne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [3,5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Testirali so izražanje in delovanje 3 različnih konstruktov endolizina: Dundee-CD27L, CD27L in CD27L1-179. Najprej so naredili teste delovanja endolizina na celicah ''E. coli'' s pET28A ekspresijskim vektorjem. Najbolje se je izražala verzija s celim endolizinom CD27L.<br />
<br />
Sledilo je testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 in ne na celicah ''C. difficile'', ki spadajo v kategorijo 2. Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Ugotovili so, da ima CD27L celotne dolžine večjo učinkovitost uničevanja celic kot skrajšana verzija. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM. Pri celicah ''C. difficile'' izpostavljenim endolizinu CD27L se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
Rezultati titracije z naraščajočimi koncentracijami endolizina CD27L so pokazali, da je merljivi učinek endolizina na kulturo ''B. subtilis'' v LB gojišču pri koncentracijah večjih kot 0,2 mg/mL. Ta podatek so uporabili za določitev kinetičnih konstant, ki so jih kasneje uporabili v matematičnih modelih. V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016.<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna.<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Po uspešni tranformaciji celic ''L. reuteri'' s konstruktom ArgAC so želeli preveriti delovanje sistema preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici.<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature.<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile''.<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Molecular characterization of a ''Clostridium difficile'' bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. ''Journal of Bacteriology''. 2008, 20, 6734–6740.<br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# A. Fernandez, ''et al''. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by ''Lactococcus lactis''. ''Applied and Environmental Microbiology''. 2008, 75, 869–871. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-generation probiotics targeting ''Clostridium difficile'' through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16770ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T16:10:16Z<p>AnaMaklin: /* Viri */</p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB), značilna za veliko družino klostridijskih toksinov. Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [2].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkorisit in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja in sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]).<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju populacije in celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki povzročata vnetje črevesne sluznice in sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [2]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [3]. Molekula AIP nato preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [4]. Izbira takšne zdravilne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [3,5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Testirali so izražanje in delovanje 3 različnih konstruktov endolizina: Dundee-CD27L, CD27L in CD27L1-179. Najprej so naredili teste delovanja endolizina na celicah ''E. coli'' s pET28A ekspresijskim vektorjem. Najbolje se je izražala verzija s celim endolizinom CD27L.<br />
<br />
Sledilo je testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 in ne na celicah ''C. difficile'', ki spadajo v kategorijo 2. Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Ugotovili so, da ima CD27L celotne dolžine večjo učinkovitost uničevanja celic kot skrajšana verzija. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM. Pri celicah ''C. difficile'' izpostavljenim endolizinu CD27L se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
Rezultati titracije z naraščajočimi koncentracijami endolizina CD27L so pokazali, da je merljivi učinek endolizina na kulturo ''B. subtilis'' v LB gojišču pri koncentracijah večjih kot 0,2 mg/mL. Ta podatek so uporabili za določitev kinetičnih konstant, ki so jih kasneje uporabili v matematičnih modelih. V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016.<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna.<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Po uspešni tranformaciji celic ''L. reuteri'' s konstruktom ArgAC so želeli preveriti delovanje sistema preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici.<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature.<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile''.<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-generation probiotics targeting ''Clostridium difficile'' through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.<br />
<br />
# M. J. Mayer, ''et al''. Molecular characterization of a ''Clostridium difficile'' bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. ''Journal of Bacteriology''. 2008, 20, 6734–6740.<br />
<br />
# A. Fernandez, ''et al''. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by ''Lactococcus lactis''. ''Applied and Environmental Microbiology''. 2008, 75, 869–871.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16769ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T16:05:23Z<p>AnaMaklin: /* Viri */</p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB), značilna za veliko družino klostridijskih toksinov. Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [2].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkorisit in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja in sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]).<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju populacije in celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki povzročata vnetje črevesne sluznice in sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [2]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [3]. Molekula AIP nato preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [4]. Izbira takšne zdravilne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [3,5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Testirali so izražanje in delovanje 3 različnih konstruktov endolizina: Dundee-CD27L, CD27L in CD27L1-179. Najprej so naredili teste delovanja endolizina na celicah ''E. coli'' s pET28A ekspresijskim vektorjem. Najbolje se je izražala verzija s celim endolizinom CD27L.<br />
<br />
Sledilo je testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 in ne na celicah ''C. difficile'', ki spadajo v kategorijo 2. Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Ugotovili so, da ima CD27L celotne dolžine večjo učinkovitost uničevanja celic kot skrajšana verzija. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM. Pri celicah ''C. difficile'' izpostavljenim endolizinu CD27L se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
Rezultati titracije z naraščajočimi koncentracijami endolizina CD27L so pokazali, da je merljivi učinek endolizina na kulturo ''B. subtilis'' v LB gojišču pri koncentracijah večjih kot 0,2 mg/mL. Ta podatek so uporabili za določitev kinetičnih konstant, ki so jih kasneje uporabili v matematičnih modelih. V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016.<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna.<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Po uspešni tranformaciji celic ''L. reuteri'' s konstruktom ArgAC so želeli preveriti delovanje sistema preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici.<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature.<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile''.<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-Generation Probiotics Targeting ''Clostridium Difficile'' through Precursor-Directed Antimicrobial Biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.<br />
<br />
Mayer, M. J., et al. “Molecular Characterization of a Clostridium Difficile Bacteriophage and Its Cloned Biologically Active Endolysin.” Journal of Bacteriology, vol. 190, no. 20, 2008, pp. 6734–6740., doi:10.1128/jb.00686-08.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16768ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T16:01:32Z<p>AnaMaklin: /* Viri */</p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB), značilna za veliko družino klostridijskih toksinov. Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [2].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkorisit in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja in sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]).<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju populacije in celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki povzročata vnetje črevesne sluznice in sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [2]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [3]. Molekula AIP nato preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [4]. Izbira takšne zdravilne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [3,5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Testirali so izražanje in delovanje 3 različnih konstruktov endolizina: Dundee-CD27L, CD27L in CD27L1-179. Najprej so naredili teste delovanja endolizina na celicah ''E. coli'' s pET28A ekspresijskim vektorjem. Najbolje se je izražala verzija s celim endolizinom CD27L.<br />
<br />
Sledilo je testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 in ne na celicah ''C. difficile'', ki spadajo v kategorijo 2. Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Ugotovili so, da ima CD27L celotne dolžine večjo učinkovitost uničevanja celic kot skrajšana verzija. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM. Pri celicah ''C. difficile'' izpostavljenim endolizinu CD27L se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
Rezultati titracije z naraščajočimi koncentracijami endolizina CD27L so pokazali, da je merljivi učinek endolizina na kulturo ''B. subtilis'' v LB gojišču pri koncentracijah večjih kot 0,2 mg/mL. Ta podatek so uporabili za določitev kinetičnih konstant, ki so jih kasneje uporabili v matematičnih modelih. V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016.<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna.<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Po uspešni tranformaciji celic ''L. reuteri'' s konstruktom ArgAC so želeli preveriti delovanje sistema preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici.<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature.<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile''.<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-Generation Probiotics Targeting ''Clostridium Difficile'' through Precursor-Directed Antimicrobial Biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of ''Lactobacillus'' by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16767ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T16:01:19Z<p>AnaMaklin: /* Viri */</p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB), značilna za veliko družino klostridijskih toksinov. Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [2].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkorisit in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja in sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]).<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju populacije in celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki povzročata vnetje črevesne sluznice in sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [2]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [3]. Molekula AIP nato preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [4]. Izbira takšne zdravilne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [3,5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Testirali so izražanje in delovanje 3 različnih konstruktov endolizina: Dundee-CD27L, CD27L in CD27L1-179. Najprej so naredili teste delovanja endolizina na celicah ''E. coli'' s pET28A ekspresijskim vektorjem. Najbolje se je izražala verzija s celim endolizinom CD27L.<br />
<br />
Sledilo je testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 in ne na celicah ''C. difficile'', ki spadajo v kategorijo 2. Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Ugotovili so, da ima CD27L celotne dolžine večjo učinkovitost uničevanja celic kot skrajšana verzija. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM. Pri celicah ''C. difficile'' izpostavljenim endolizinu CD27L se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
Rezultati titracije z naraščajočimi koncentracijami endolizina CD27L so pokazali, da je merljivi učinek endolizina na kulturo ''B. subtilis'' v LB gojišču pri koncentracijah večjih kot 0,2 mg/mL. Ta podatek so uporabili za določitev kinetičnih konstant, ki so jih kasneje uporabili v matematičnih modelih. V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016.<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna.<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Po uspešni tranformaciji celic ''L. reuteri'' s konstruktom ArgAC so želeli preveriti delovanje sistema preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici.<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature.<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile''.<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-Generation Probiotics Targeting ''Clostridium Difficile'' through Precursor-Directed Antimicrobial Biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of Lactobacillus by electroporation. ''Methods Mol. Biol''. 1995, 47, 201-208.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16766ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T16:00:15Z<p>AnaMaklin: /* Prenos konstruktov v L. reuteri */</p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB), značilna za veliko družino klostridijskih toksinov. Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [2].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkorisit in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja in sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]).<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju populacije in celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki povzročata vnetje črevesne sluznice in sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [2]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [3]. Molekula AIP nato preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [4]. Izbira takšne zdravilne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [3,5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Testirali so izražanje in delovanje 3 različnih konstruktov endolizina: Dundee-CD27L, CD27L in CD27L1-179. Najprej so naredili teste delovanja endolizina na celicah ''E. coli'' s pET28A ekspresijskim vektorjem. Najbolje se je izražala verzija s celim endolizinom CD27L.<br />
<br />
Sledilo je testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 in ne na celicah ''C. difficile'', ki spadajo v kategorijo 2. Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Ugotovili so, da ima CD27L celotne dolžine večjo učinkovitost uničevanja celic kot skrajšana verzija. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM. Pri celicah ''C. difficile'' izpostavljenim endolizinu CD27L se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
Rezultati titracije z naraščajočimi koncentracijami endolizina CD27L so pokazali, da je merljivi učinek endolizina na kulturo ''B. subtilis'' v LB gojišču pri koncentracijah večjih kot 0,2 mg/mL. Ta podatek so uporabili za določitev kinetičnih konstant, ki so jih kasneje uporabili v matematičnih modelih. V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016.<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6]. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna.<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Po uspešni tranformaciji celic ''L. reuteri'' s konstruktom ArgAC so želeli preveriti delovanje sistema preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici.<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature.<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile''.<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-Generation Probiotics Targeting ''Clostridium Difficile'' through Precursor-Directed Antimicrobial Biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16765ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T15:58:53Z<p>AnaMaklin: /* Izbira "šasije" */</p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB), značilna za veliko družino klostridijskih toksinov. Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [2].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkorisit in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja in sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]).<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju populacije in celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki povzročata vnetje črevesne sluznice in sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [2]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [3]. Molekula AIP nato preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [4]. Izbira takšne zdravilne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [3,5].<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Testirali so izražanje in delovanje 3 različnih konstruktov endolizina: Dundee-CD27L, CD27L in CD27L1-179. Najprej so naredili teste delovanja endolizina na celicah ''E. coli'' s pET28A ekspresijskim vektorjem. Najbolje se je izražala verzija s celim endolizinom CD27L.<br />
<br />
Sledilo je testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 in ne na celicah ''C. difficile'', ki spadajo v kategorijo 2. Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Ugotovili so, da ima CD27L celotne dolžine večjo učinkovitost uničevanja celic kot skrajšana verzija. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM. Pri celicah ''C. difficile'' izpostavljenim endolizinu CD27L se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
Rezultati titracije z naraščajočimi koncentracijami endolizina CD27L so pokazali, da je merljivi učinek endolizina na kulturo ''B. subtilis'' v LB gojišču pri koncentracijah večjih kot 0,2 mg/mL. Ta podatek so uporabili za določitev kinetičnih konstant, ki so jih kasneje uporabili v matematičnih modelih. V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016.<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna.<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Po uspešni tranformaciji celic ''L. reuteri'' s konstruktom ArgAC so želeli preveriti delovanje sistema preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici.<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature.<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile''.<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-Generation Probiotics Targeting ''Clostridium Difficile'' through Precursor-Directed Antimicrobial Biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16764ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T15:58:18Z<p>AnaMaklin: /* Viri */</p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB), značilna za veliko družino klostridijskih toksinov. Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [2].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkorisit in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja in sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]).<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju populacije in celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki povzročata vnetje črevesne sluznice in sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [2]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [3]. Molekula AIP nato preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [4]. Izbira takšne zdravilne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo.<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Testirali so izražanje in delovanje 3 različnih konstruktov endolizina: Dundee-CD27L, CD27L in CD27L1-179. Najprej so naredili teste delovanja endolizina na celicah ''E. coli'' s pET28A ekspresijskim vektorjem. Najbolje se je izražala verzija s celim endolizinom CD27L.<br />
<br />
Sledilo je testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 in ne na celicah ''C. difficile'', ki spadajo v kategorijo 2. Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Ugotovili so, da ima CD27L celotne dolžine večjo učinkovitost uničevanja celic kot skrajšana verzija. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM. Pri celicah ''C. difficile'' izpostavljenim endolizinu CD27L se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
Rezultati titracije z naraščajočimi koncentracijami endolizina CD27L so pokazali, da je merljivi učinek endolizina na kulturo ''B. subtilis'' v LB gojišču pri koncentracijah večjih kot 0,2 mg/mL. Ta podatek so uporabili za določitev kinetičnih konstant, ki so jih kasneje uporabili v matematičnih modelih. V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016.<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna.<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Po uspešni tranformaciji celic ''L. reuteri'' s konstruktom ArgAC so želeli preveriti delovanje sistema preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici.<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature.<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile''.<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# M. J. Mayer ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.<br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-Generation Probiotics Targeting ''Clostridium Difficile'' through Precursor-Directed Antimicrobial Biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16763ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T15:57:38Z<p>AnaMaklin: /* Detekcijski/regulatorni sistem */</p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB), značilna za veliko družino klostridijskih toksinov. Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [2].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkorisit in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja in sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]).<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju populacije in celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki povzročata vnetje črevesne sluznice in sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [2]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile'' [3]. Molekula AIP nato preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [4]. Izbira takšne zdravilne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo.<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Testirali so izražanje in delovanje 3 različnih konstruktov endolizina: Dundee-CD27L, CD27L in CD27L1-179. Najprej so naredili teste delovanja endolizina na celicah ''E. coli'' s pET28A ekspresijskim vektorjem. Najbolje se je izražala verzija s celim endolizinom CD27L.<br />
<br />
Sledilo je testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 in ne na celicah ''C. difficile'', ki spadajo v kategorijo 2. Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Ugotovili so, da ima CD27L celotne dolžine večjo učinkovitost uničevanja celic kot skrajšana verzija. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM. Pri celicah ''C. difficile'' izpostavljenim endolizinu CD27L se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
Rezultati titracije z naraščajočimi koncentracijami endolizina CD27L so pokazali, da je merljivi učinek endolizina na kulturo ''B. subtilis'' v LB gojišču pri koncentracijah večjih kot 0,2 mg/mL. Ta podatek so uporabili za določitev kinetičnih konstant, ki so jih kasneje uporabili v matematičnih modelih. V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016.<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna.<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Po uspešni tranformaciji celic ''L. reuteri'' s konstruktom ArgAC so želeli preveriti delovanje sistema preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici.<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature.<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile''.<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-Generation Probiotics Targeting ''Clostridium Difficile'' through Precursor-Directed Antimicrobial Biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# M. J. Mayer ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16762ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T15:57:15Z<p>AnaMaklin: /* Detekcijski/regulatorni sistem */</p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB), značilna za veliko družino klostridijskih toksinov. Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [2].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkorisit in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja in sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]).<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju populacije in celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki povzročata vnetje črevesne sluznice in sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile'' [2]. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile''[3] Molekula AIP nato preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [4]. Izbira takšne zdravilne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo.<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Testirali so izražanje in delovanje 3 različnih konstruktov endolizina: Dundee-CD27L, CD27L in CD27L1-179. Najprej so naredili teste delovanja endolizina na celicah ''E. coli'' s pET28A ekspresijskim vektorjem. Najbolje se je izražala verzija s celim endolizinom CD27L.<br />
<br />
Sledilo je testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 in ne na celicah ''C. difficile'', ki spadajo v kategorijo 2. Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Ugotovili so, da ima CD27L celotne dolžine večjo učinkovitost uničevanja celic kot skrajšana verzija. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM. Pri celicah ''C. difficile'' izpostavljenim endolizinu CD27L se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
Rezultati titracije z naraščajočimi koncentracijami endolizina CD27L so pokazali, da je merljivi učinek endolizina na kulturo ''B. subtilis'' v LB gojišču pri koncentracijah večjih kot 0,2 mg/mL. Ta podatek so uporabili za določitev kinetičnih konstant, ki so jih kasneje uporabili v matematičnih modelih. V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016.<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna.<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Po uspešni tranformaciji celic ''L. reuteri'' s konstruktom ArgAC so želeli preveriti delovanje sistema preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici.<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature.<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile''.<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-Generation Probiotics Targeting ''Clostridium Difficile'' through Precursor-Directed Antimicrobial Biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# M. J. Mayer ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16761ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T15:56:01Z<p>AnaMaklin: /* Viri */</p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB), značilna za veliko družino klostridijskih toksinov. Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [2].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkorisit in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja in sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]).<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju populacije in celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki povzročata vnetje črevesne sluznice in sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile''. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile''. Molekula AIP nato preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira. Izbira takšne zdravilne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo.<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Testirali so izražanje in delovanje 3 različnih konstruktov endolizina: Dundee-CD27L, CD27L in CD27L1-179. Najprej so naredili teste delovanja endolizina na celicah ''E. coli'' s pET28A ekspresijskim vektorjem. Najbolje se je izražala verzija s celim endolizinom CD27L.<br />
<br />
Sledilo je testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 in ne na celicah ''C. difficile'', ki spadajo v kategorijo 2. Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Ugotovili so, da ima CD27L celotne dolžine večjo učinkovitost uničevanja celic kot skrajšana verzija. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM. Pri celicah ''C. difficile'' izpostavljenim endolizinu CD27L se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
Rezultati titracije z naraščajočimi koncentracijami endolizina CD27L so pokazali, da je merljivi učinek endolizina na kulturo ''B. subtilis'' v LB gojišču pri koncentracijah večjih kot 0,2 mg/mL. Ta podatek so uporabili za določitev kinetičnih konstant, ki so jih kasneje uporabili v matematičnih modelih. V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016.<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna.<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Po uspešni tranformaciji celic ''L. reuteri'' s konstruktom ArgAC so želeli preveriti delovanje sistema preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici.<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature.<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile''.<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-Generation Probiotics Targeting ''Clostridium Difficile'' through Precursor-Directed Antimicrobial Biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# M. J. Mayer ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16760ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T15:55:15Z<p>AnaMaklin: /* Okužba s Clostridioides difficile */</p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1]. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB), značilna za veliko družino klostridijskih toksinov. Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [2].<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkorisit in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja in sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]).<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju populacije in celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki povzročata vnetje črevesne sluznice in sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile''. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile''. Molekula AIP nato preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira. Izbira takšne zdravilne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo.<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Testirali so izražanje in delovanje 3 različnih konstruktov endolizina: Dundee-CD27L, CD27L in CD27L1-179. Najprej so naredili teste delovanja endolizina na celicah ''E. coli'' s pET28A ekspresijskim vektorjem. Najbolje se je izražala verzija s celim endolizinom CD27L.<br />
<br />
Sledilo je testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 in ne na celicah ''C. difficile'', ki spadajo v kategorijo 2. Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Ugotovili so, da ima CD27L celotne dolžine večjo učinkovitost uničevanja celic kot skrajšana verzija. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM. Pri celicah ''C. difficile'' izpostavljenim endolizinu CD27L se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
Rezultati titracije z naraščajočimi koncentracijami endolizina CD27L so pokazali, da je merljivi učinek endolizina na kulturo ''B. subtilis'' v LB gojišču pri koncentracijah večjih kot 0,2 mg/mL. Ta podatek so uporabili za določitev kinetičnih konstant, ki so jih kasneje uporabili v matematičnih modelih. V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016.<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna.<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Po uspešni tranformaciji celic ''L. reuteri'' s konstruktom ArgAC so želeli preveriti delovanje sistema preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici.<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature.<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile''.<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-Generation Probiotics Targeting ''Clostridium Difficile'' through Precursor-Directed Antimicrobial Biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# M. J. Mayer ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16759ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T15:42:10Z<p>AnaMaklin: /* Viri */</p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB), značilna za veliko družino klostridijskih toksinov. Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin.<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkorisit in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja in sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]).<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju populacije in celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki povzročata vnetje črevesne sluznice in sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile''. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile''. Molekula AIP nato preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira. Izbira takšne zdravilne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo.<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Testirali so izražanje in delovanje 3 različnih konstruktov endolizina: Dundee-CD27L, CD27L in CD27L1-179. Najprej so naredili teste delovanja endolizina na celicah ''E. coli'' s pET28A ekspresijskim vektorjem. Najbolje se je izražala verzija s celim endolizinom CD27L.<br />
<br />
Sledilo je testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 in ne na celicah ''C. difficile'', ki spadajo v kategorijo 2. Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Ugotovili so, da ima CD27L celotne dolžine večjo učinkovitost uničevanja celic kot skrajšana verzija. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM. Pri celicah ''C. difficile'' izpostavljenim endolizinu CD27L se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
Rezultati titracije z naraščajočimi koncentracijami endolizina CD27L so pokazali, da je merljivi učinek endolizina na kulturo ''B. subtilis'' v LB gojišču pri koncentracijah večjih kot 0,2 mg/mL. Ta podatek so uporabili za določitev kinetičnih konstant, ki so jih kasneje uporabili v matematičnih modelih. V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016.<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna.<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Po uspešni tranformaciji celic ''L. reuteri'' s konstruktom ArgAC so želeli preveriti delovanje sistema preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici.<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature.<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile''.<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# J. K. Spinler ''et al''. Next-Generation Probiotics Targeting ''Clostridium Difficile'' through Precursor-Directed Antimicrobial Biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.<br />
# M. J. Mayer ''et al''. Structure-based modification of a ''Clostridium difficile''-targeting endolysin affects activity and host range. ''Journal of bacteriology''. 2011, 193, 19.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16758ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T15:38:20Z<p>AnaMaklin: /* Viri */</p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB), značilna za veliko družino klostridijskih toksinov. Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin.<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkorisit in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja in sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]).<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju populacije in celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki povzročata vnetje črevesne sluznice in sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile''. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile''. Molekula AIP nato preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira. Izbira takšne zdravilne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo.<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Testirali so izražanje in delovanje 3 različnih konstruktov endolizina: Dundee-CD27L, CD27L in CD27L1-179. Najprej so naredili teste delovanja endolizina na celicah ''E. coli'' s pET28A ekspresijskim vektorjem. Najbolje se je izražala verzija s celim endolizinom CD27L.<br />
<br />
Sledilo je testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 in ne na celicah ''C. difficile'', ki spadajo v kategorijo 2. Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Ugotovili so, da ima CD27L celotne dolžine večjo učinkovitost uničevanja celic kot skrajšana verzija. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM. Pri celicah ''C. difficile'' izpostavljenim endolizinu CD27L se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
Rezultati titracije z naraščajočimi koncentracijami endolizina CD27L so pokazali, da je merljivi učinek endolizina na kulturo ''B. subtilis'' v LB gojišču pri koncentracijah večjih kot 0,2 mg/mL. Ta podatek so uporabili za določitev kinetičnih konstant, ki so jih kasneje uporabili v matematičnih modelih. V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016.<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna.<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Po uspešni tranformaciji celic ''L. reuteri'' s konstruktom ArgAC so želeli preveriti delovanje sistema preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici.<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature.<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile''.<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by ''Clostridium difficile'' is regulated through quorum signaling. ''mBio''. 2015, 6. <br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. ''Clostridium difficile'' infection. ''Am J Med Sci''. 2010, 340, 247–252. <br />
# J. K. Spinler et al. Next-Generation Probiotics Targeting ''Clostridium Difficile'' through Precursor-Directed Antimicrobial Biosynthesis. ''Infection and Immunity''. 2017, 85, 10.</div>AnaMaklinhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_oku%C5%BEbi_s_C._difficile&diff=16757ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile2020-04-20T15:31:16Z<p>AnaMaklin: /* Viri */</p>
<hr />
<div>ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s ''C. difficile'', ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem ''C. difficile'' za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice ''L. reuteri'' in tako naredili senzor za okužbo s ''C. difficile'', ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje ''C. difficile'' v telesu.<br />
Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford<br />
= Okužba s ''Clostridioides difficile'' =<br />
Bakterija ''Clostridioides difficile'' je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. ''C. difficile'' je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt. ''C. difficile'' ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB), značilna za veliko družino klostridijskih toksinov. Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin.<br />
== Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' ==<br />
Zdravljenje okužbe s ''C. difficile'' je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija ''C. difficile'' izkorisit in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.<br />
<br />
= ProQuorum =<br />
Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s ''C. difficile''. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice ''Lactobacillu reuteri''. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic ''C. difficile'' v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja in sproži se postopek za uničenje bakterij ''C. difficile'' ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183300 BBa_K3183300]).<br />
== Detekcijski/regulatorni sistem ==<br />
Bakterije ''C. difficile'' uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju populacije in celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki povzročata vnetje črevesne sluznice in sta odgovorna za simptome okužbe s ''C. difficile''. <br />
<br />
Sistem ProQuorum deluje tako, da celice ''L. reuteri'' preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij ''C. difficile''. Molekula AIP nato preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v ''L. reuteri'' inducira sintezo in sekrecijo za ''C. difficile'' specifičnega endolizina, ki cepi celično steno ''C. difficile''. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene ''C. difficile'' in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira. Izbira takšne zdravilne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic ''C. difficile'', hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.<br />
<br />
== Izbira "šasije" ==<br />
Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo ''Lactobacillus reuteri'', ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. ''Lactobacillus'' je rod, ki je že dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki (»safe-to-consume«), kar je bila dodatna prednost izbire. ''L. reuteri'' izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima ''L. reuteri'' intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin (antibiotiki proti ''C. difficile''), celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot ''C. difficile'' je tudi ''L. reuteri'' Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo.<br />
<br />
== Komponente sistema ProQuorum ==<br />
V šasijo, celice ''L. reuteri'', so morali vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) in zapis za endolizin CD27L ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183017 BBa_K3183017]). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183008 BBa_K3183008]), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije ''Lactococcus lactis'' in ''Lactobacillus johnsonii'', zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za ''Lactobacillus reuteri''. Posamezne biokocke so sestavljali z metodo "Gibson Assembly".<br />
Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za ''L. reuteri'', pTRKH3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183050 BBa_K3183050]).<br />
<br />
= Testiranje delovanja =<br />
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==<br />
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Testirali so izražanje in delovanje 3 različnih konstruktov endolizina: Dundee-CD27L, CD27L in CD27L1-179. Najprej so naredili teste delovanja endolizina na celicah ''E. coli'' s pET28A ekspresijskim vektorjem. Najbolje se je izražala verzija s celim endolizinom CD27L.<br />
<br />
Sledilo je testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina. Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1 in ne na celicah ''C. difficile'', ki spadajo v kategorijo 2. Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Ugotovili so, da ima CD27L celotne dolžine večjo učinkovitost uničevanja celic kot skrajšana verzija. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM. Pri celicah ''C. difficile'' izpostavljenim endolizinu CD27L se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja. <br />
<br />
Rezultati titracije z naraščajočimi koncentracijami endolizina CD27L so pokazali, da je merljivi učinek endolizina na kulturo ''B. subtilis'' v LB gojišču pri koncentracijah večjih kot 0,2 mg/mL. Ta podatek so uporabili za določitev kinetičnih konstant, ki so jih kasneje uporabili v matematičnih modelih. V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.<br />
<br />
== Prenos konstruktov v ''L. reuteri'' ==<br />
Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za ''Lactobacillus'' ''spp''.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za ''L. reuteri'', vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati ''L. reuteri'' tipa DSM20016.<br />
Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz ''L. lactis'', ne pa iz ''E. coli'', saj ima plazmid pridobljen iz ''L. lactis'' ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v ''L. lactis'' so uporabili drug sev ''L. reuteri'' 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela. <br />
=== Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' ===<br />
Izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183103 BBa_K3183103]). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v ''L. reuteri'' povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna.<br />
<br />
=== Izražanje ArgAC v ''L. reuteri'' ===<br />
Sestavljeni biodel ArgAC ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183102 BBa_K3183102]) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183004 BBa_K3183004]) in ArgC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183005 BBa_K3183005]) pa je bil spacer.<br />
Po uspešni tranformaciji celic ''L. reuteri'' s konstruktom ArgAC so želeli preveriti delovanje sistema preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 ([http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K3183104 BBa_K3183104]). Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v ''L. reuteri''. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici.<br />
<br />
Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3183003 BBa_K3183003]), saj v celicah ''L. reuteri'' niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature.<br />
<br />
= Vpogled v zdravilo =<br />
Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike ''L. reuteri'' in ''C. difficile'', da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju ''C. difficile'' in ''L. reuteri'' popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s ''C. difficile'', jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice ''C. difficile'' širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile''.<br />
<br />
<br />
= Zaključek =<br />
S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s ''C. difficile'' in dobra alternativa antibiotikom.<br />
<br />
<br />
= Viri =<br />
# iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford <br />
# C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by Clostridium difficile is regulated through quorum signaling. mBio. 2015, 6. <br />
# L. Heinlen, J. D. Ballard. Clostridium difficile infection. Am J Med Sci. 2010, 340, 247–252. <br />
# J. K. Spinler et al. Next-Generation Probiotics Targeting Clostridium Difficile through Precursor-Directed Antimicrobial Biosynthesis. Infection and Immunity. 2017, 85, 10.</div>AnaMaklin