Wiki FKKT - User contributions [en]

Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu

2023-05-14T17:57:36Z

Anagodesa: /* Konstrukcija sRNA in plazmidov v sistemu z reporterjem AmCyan */

"Povzeto po članku [https://aiche.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/btpr.3324 Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324.]”

== Uvod ==

Nekodirajoče bakterijske RNA, med katere spada mala RNA (sRNA – angl. small) postajajo pomembno orodje v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, ker omogočajo regulacijo izražanje genov brez popolnega izbijta gena. Z nepopolnim parjenjem baz se sRNA veže na mRNA, pogosto v bližino ribosom-vezavnega mesta (RBS) ali pa prepreči/ojača vezavo na ribosom preko drugih mehanizmov [1,2].
Tehnologija sRNA se uporablja za detekcijo metabolnega stanja, uravnovešenja metabolnih poti, za kontrolo izražanja toksinov, za izboljšanje izkoristka in zmanjšanja količine stranskih produktov [1].
Večina aplikacij sRNA se izvaja v živih celicah. Vendar ima tak pristop kar nekaj pomanjkljivosti kot so kompleksnost sistema, selektivna indukcija, naravna variabilnost, težave pri standardizaciji in neponovljivost rezultatov. Zato se razvija brezcelične sisteme (cell-free systems – CFS), ki vsebujejo celično komponente in vitro. Delo v brezceličnih sistemih je bolj fleksibilno, možen je večji nadzor nad modifikacijami transkripcije/translacije, lahko se proizvede večje količine produktov, višja je toleranca za toksične substrate/produkte/intermediate, lažje je čiščenje produktov [1].
Tannaiche et al so se ukvarjali z ugotavljanjem vpliva sRNA na izražanje fluorescenčnega barvila Anemonia majano cyan (''AmCyan'') ter encima diaforaza. Razvili so sRNA, ki poleg utišanja genov omogoča tudi prekomerno izražanje tarčnega proteina, kar do tedaj še ni bilo zabeleženo. Testiranje so najprej izvedli in vivo, vendar so zaradi nekonsistentnih rezultatov prešli na brezcelični sistem [1].

== Konstrukcija sRNA in plazmidov v sistemu z reporterjem ''AmCyan'' ==
'''Sintetični konstrukt sRNA''' je dolg 48 nukleotidov in je sestavljen iz treh delov. Zaporedje na 5' koncu tvori lasnično zanko, s čemer stabilizira RNA in omogoča interakcijo sRNA-mRNA (14 nk). Temu sledi 20 nukleotidov dolgo protismerno zaporedje za tarčno mRNA. Na 3' koncu sRNA je še terminator v obliki lasnične zanke (14 nk). Naredili so 12 različnih konstruktov sRNA, ki ciljajo različne dele ''AmCyan'' mRNA[1].

'''Plazmidi za testiranja sistema z reporterjem ''AmCyan'''''
Uporabili so štiri različne plazmide. Prvi je pART15-C1 in vsebuje zapis za reporterski ''AmCyan'' pod inducibilnim arabinoznim promotorjem. Drugi uporabljen plazmid je pART15-C2, ki ima zapis za reporter ''AmCyan'' pod kontrolo promotorja tetraciklinskegain omogoča relativno določitev izražanja sRNA. Plazmid pART15-C1-LacZ ima sRNA konstrukt substituiran z lacZ in omogoča modro-beli test po transformaciji bakterij. Zadnji plazmid je pART15-AS, ki vsebuje gen za reporter ''AmCyan'' pod kontrolo arabinoznega promotorja in zaporedje za sRNA pod kontrolo tetracikilinskega promotorja [1].
Sestavljanje konstrukta je potekalo s sestavljanjem po Gibosonu in gama-PCR.

== Optimizacija indukcije s plazmidom pART15-C1 in -C2 (in vivo) ==
Za oceno izražanja reporterja ''AmCyan'' in sRNA v odvisnosti od koncentracije induktorjev so uporabili kontrolna plazmida pART15-C1 in pART15-C2 in z njima transfecirali sev ''Escehrichia coli'' 10-beta. Merili so fluorescenco ''AmCyan'' pri različni koncentracijah induktorjev arabinoze (Ara) in anhidrotetraciklina (ATc) [1].
Med koncentracijo Ara oz. ATc in intenziteto fluorescence je bil opažen linearen odnos. S tem so pokazali, da se izražanje fluorescentnega reporterja in sRNA uravnava čez široko koncentracijsko območje induktorjev [1].

== Vpliv sRNA na izražanje reporterja ''AmCyan'' (in vivo) ==

Testirali so 12 različnih protismernih zaporedji s transformacijo seva ''E. coli'' 10- beta s plazmidom pART15-AS in merili fluorescenco celic v treh časovnih točkah (6, 18, 29 h) [1].
V prvem in vivo sistemu so pokazali, da je ciljanje RBS in prvih 20 baz mRNA reporterja ''AmCyan'' povzročilo signifikantno znižanje izražanja do 10% v 29 urah. Še bolj signifikantno znižanje izražanja reporterja je bilo prisotno pri ciljanju visoko-energijskega stebelnega dela sekundarne strukture mRNA (asB430), kjer so v šestih urah dosegli 25% utišanje. Ostale sRNA, ki ciljajo druge regije iniciacije translacija so dosegle signifikantno znižanja izražanja šele po dolgem času gojenja. Ciljanje visoko-energijskega stebla, ki je bolj oddaljen od mesta začetka translacije (asB407 in asB539) je v nekaterih primerih signifikantno znižalo fluorescenco, v drugih pa ne. Pri poskusu z asB606, ki cilja nizko-energijsko steblo, so izmerili signifikantno povišanje fluorescence pri 18h, vendar pri 29h signifikantnega povišanja ni bilo več prisotnega [1].
Čeprav so v in vivo sitemu dokazali nekaj signifikantnih sprememb izražanja reporterskega proteina, so rezultati zelo variirali, kar je verjetno posledica kompleksnosti živih celic. Zato so poskuse nadaljevali v brezceličnem sistemu [1].

== Brezcelični sistem (CFS) ==

Brezcelični sistem so pripravili s sonifikacijo celice, ki so bile predhodno transformirane s plazmidom pART15-AS in nato inducirali izraženje z Ara in ATc. Tako kot in vivo so najprej potrdili, da je odnos med intenziteto fluorescence in koncentracijo induktorjev (Ara in ATc) linearen. Indukcija je bila dosežena po 24h, maksimum pa je fluorescenca dosegla po 96 urah. Rezultati so bili v CFS veliko bolj konsistentni kot in vivo, poleg tega pa je bilo prisotnih več signifikantnih rezultatov [1].

=== Vpliv sRNA na izražanje reporterja ''AmCyan'' ===

Ciljanje RBS v sistemu CFS ni povzročilo znižanja fluorescence, ciljanje prvih 20 nk pa je ravni izražanja znižalo bolj kot in vivo. S ciljanjem sekundarnih struktur mRNA so dosegli še močnejše utišanje; ciljanje visoko-energijskega stebla je povzročilo kar 65% utišanje, ciljanje 3' konca mRNA (asB701) pa je utišalo izražanje za kar 70% (in vivo le 19%). Pri ciljanju nizko-energijskega stebla (asB606) pa so dobili presenetljive rezultate, ki drugje v literaturi niso zabeleženi, in sicer je prišlo do signifikantnega zvišanja fluorescence za več kot 66%. Pri ciljanju drugega dela nizko-energijskega stebla (asB615) se je fluorescenca znižala [1].

=== Vpliv sRNA, odvisne od Hfq, na izražanje reporterja ''AmCyan'' ===
Nadaljnjo jih je zanimalo, ali lahko rezultate reproducirajo z uporabo sRNA, ki je odvisna od Hfq. V ostalih poskusih so namreč uporabljali sintetično sRNA, ki ni odvisna od Hfn. Uporabili so naravno pristno sRNA MicC, ki je vpletena v utišanje proteina zunanje membrane OmpC v ''E. coli'' in izkazuje visoke ravni utišanja genov. Protein Hfq deluje kot RNA šaperon MicC [1].
K ogrodju MicC so dodali ista protismerna zaporedja kot pri od-Hfq-neodvisni sRNA. Ciljanje prvih 20 nk mRNA s MicC-asB1 je vodilo v znižanje fluorescence, ki je bilo večje kot pri uporabi od-Hfq-neodvisne asRNA. Pri testiranju z MicC-asB606 ni bilo spremembe fluorescence, medtem ko je bilo pri sintetičnem ogrodju zvišanje flourescence kar 65%. Ciljanje RBS z MicC-asRBS je povzročilo zvišanje flourescence, kar se ne sklada z objavljenimi rezultati drugih v vivo študij, vendar so v nadaljevanju študije tudi ta pojav pojasnili [1].

== Določanje mehanizma delovanja sRNA asB606 in MicC-asRBS z NUPACK in catRAPID ==

Za določanje mehanizma, ki povzroči prekomerno izražanje z asB606 sRNA, so za analizo uporabili program NUPACK, s katerim se lahko načrtuje in analizira strukture ter sisteme nukleinskih kislin [1,3]. Ugotovili so, da se asB606 veže na bazne pare 606-615 na ''AmCyan'' mRNA, ki tvorijo začetni del stebla-zanke zaščitenega 3' konca. To mesto pa je tudi prepoznavno mesto za RNaza E, ki po prepoznavi cepi ''AmCyan'' mRNA. Vezava sRNA na to mesto oteži prepoznavo mRNA z RNazo E in s tem prepreči cepitev in posledično podaljša razpolovno dobo mRNA, kar vodi v zvišanje izražanja ''AmCyan'' in povišanja fluorescence. Vezavni potencial med RNazo E in ''AmCyan'' mRNA, določen s programom catRAPID, je bil v regiji 500-600 visok, kar pa še dodatno podpira teorijo, da sRNA asB606 zakrije prepoznavno mesto za RNazo E [1].
Z analizo NUPACK so analizirali tudi zvišano izražanje z MicC-asRBS, kjer takšnih rezultatov niso pričakovali. V nativni ''AmCyan'' mRNA je 5' konec zvit v stebelno sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo. Vezava MicC-asRNA na mRNA prepreči nastanek takšne sekundarne strukture, s tem pa “sprosti” RBS in omogoči vezavo na ribosom [1].

== Regulacija izražnja diaforaze s sRNA in vitro ==
Diaforaza je topna NAD(P)H dehidrogenaza, ki je vpletena v nastanek NADH in NADPH v anaerobnih pogojih [1]. Uporablja se v sinteznih encimskih poteh za produkcijo kemikalij visokih vrednosti, zato je zvišano izražanje tega encima tudi zanimivo in uporabno [1].
Z uporabo catRAPID so predvideli vezavna mesta za RNazo E na diaforazni mRNA in identificirali štiri tarčna mesta za sRNA, ki se nahajajo v bližini stebelnih zank in vezava, na katera bi lahko povzročilo zvišano izražanje [1].
Protismerna zaporedja, ki so bila del sRNA, so klonirali v plazmid pBAD-LIC in z njim transformirali sev ''E.coli'' BL21 Star (DE3). Brezcelični sistem so naredili s hkratno sonifikacijo kultur ''E.coli'' , ene, ki vsebuje zapis za diaforazo in druge z rekobinanitim plazmidom pBAD-AS [1].
Dva konstrukta (as410, as528) sta signifiakntno povečal izražanje diaforaze, en je dosegel nesignifikantno povečanje izražanja (as510), zadnji pa je v enem replikat povišal izražanje, v drugih pa ni imel vpliva (as490) [1].
Čeprav so vsi konstrukti vsebovali protismerno zaporedje, ki cilja vezavno mesto za RNazo E na diaforazono mRNA, so bili vplivi konstruktov raznoliki. Rezultati so lahko posledica prisotnosti več vezavnih mest za RNazo E, poleg tega pa uporabljen sev E.coli lahko metabolizira induktor Ara in s tem zniža izražanje sRNA [1].

== Zaključek ==
Naravne in sintetične sRNA imajo velik potencial v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, saj omogočajo regulacijo izražanja genov brez popolnega izbitja gena, preko induciranega izražanja sRNA pa se lahko uvede še večji nadzor nad regulacijo izražanja tarčenga gena. So majhne, kar omogoča izražanje več sRNA iz istega plazmida. Tannaiche et al so prvič pokazali, da s sRNA lahko selektivno tudi zvišamo izražanje tarčnega gena v CFS. Poleg tega pa so pokazali, da se lahko sRNA prilagodi na različne sisteme in na regulacijo različnih proteinov [1].

== Literatura ==
[1] Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324. doi:10.1002/btpr.3324

[2] Storz G, Vogel J, Wassarman, K M. Regulation by Small RNAs in Bacteria: Expanding Frontiers. Molecular Cell. 2011. 43(6), 880–891.doi:10.1016/j.molcel.2011.08.022

[3] NUPACK. https://www.nupack.org (nazadnje dostopano 14. 5. 2023 dostopano)

Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu

2023-05-14T17:36:49Z

Anagodesa: /* Literatura */

"Povzeto po članku [https://aiche.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/btpr.3324 Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324.]”

== Uvod ==

Nekodirajoče bakterijske RNA, med katere spada mala RNA (sRNA – angl. small) postajajo pomembno orodje v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, ker omogočajo regulacijo izražanje genov brez popolnega izbijta gena. Z nepopolnim parjenjem baz se sRNA veže na mRNA, pogosto v bližino ribosom-vezavnega mesta (RBS) ali pa prepreči/ojača vezavo na ribosom preko drugih mehanizmov [1,2].
Tehnologija sRNA se uporablja za detekcijo metabolnega stanja, uravnovešenja metabolnih poti, za kontrolo izražanja toksinov, za izboljšanje izkoristka in zmanjšanja količine stranskih produktov [1].
Večina aplikacij sRNA se izvaja v živih celicah. Vendar ima tak pristop kar nekaj pomanjkljivosti kot so kompleksnost sistema, selektivna indukcija, naravna variabilnost, težave pri standardizaciji in neponovljivost rezultatov. Zato se razvija brezcelične sisteme (cell-free systems – CFS), ki vsebujejo celično komponente in vitro. Delo v brezceličnih sistemih je bolj fleksibilno, možen je večji nadzor nad modifikacijami transkripcije/translacije, lahko se proizvede večje količine produktov, višja je toleranca za toksične substrate/produkte/intermediate, lažje je čiščenje produktov [1].
Tannaiche et al so se ukvarjali z ugotavljanjem vpliva sRNA na izražanje fluorescenčnega barvila Anemonia majano cyan (''AmCyan'') ter encima diaforaza. Razvili so sRNA, ki poleg utišanja genov omogoča tudi prekomerno izražanje tarčnega proteina, kar do tedaj še ni bilo zabeleženo. Testiranje so najprej izvedli in vivo, vendar so zaradi nekonsistentnih rezultatov prešli na brezcelični sistem [1].

== Konstrukcija sRNA in plazmidov v sistemu z reporterjem ''AmCyan'' ==
'''Sintetični konstrukt sRNA''' je dolg 48 nukleotidov in je sestavljen iz treh delov. Zaporedje na 5' koncu tvori steblo-zanko, s čemer stabilizira RNA in omogoča interakcijo sRNA-mRNA (14 nk). Temu sledi 20 nukleotidov dolgo protismerno zaporedje za tarčno mRNA. Na 3' koncu sRNA je še terminator v obliki stebla-zanke (14 nk). Naredili so 12 različnih konstruktov sRNA, ki ciljajo različne dele ''AmCyan'' mRNA[1].

'''Plazmidi za testiranja sistema z reporterjem ''AmCyan'''''
Uporabili so štiri različne plazmide. Prvi je pART15-C1 in vsebuje zapis za reporterski ''AmCyan'' pod inducibilnim arabinoznim promotorjem. Drugi uporabljen plazmid je pART15-C2, ki ima zapis za reporter ''AmCyan'' pod kontrolo promotorja tetraciklinskegain omogoča relativno določitev izražanja sRNA. Plazmid pART15-C1-LacZ ima sRNA konstrukt substituiran z lacZ in omogoča modro-beli test po transformaciji bakterij. Zadnji plazmid je pART15-AS, ki vsebuje gen za reporter ''AmCyan'' pod kontrolo arabinoznega promotorja in zaporedje za sRNA pod kontrolo tetracikilinskega promotorja [1].
Sestavljanje konstrukta je potekalo s sestavljanjem po Gibosonu in gama-PCR.

== Optimizacija indukcije s plazmidom pART15-C1 in -C2 (in vivo) ==
Za oceno izražanja reporterja ''AmCyan'' in sRNA v odvisnosti od koncentracije induktorjev so uporabili kontrolna plazmida pART15-C1 in pART15-C2 in z njima transfecirali sev ''Escehrichia coli'' 10-beta. Merili so fluorescenco ''AmCyan'' pri različni koncentracijah induktorjev arabinoze (Ara) in anhidrotetraciklina (ATc) [1].
Med koncentracijo Ara oz. ATc in intenziteto fluorescence je bil opažen linearen odnos. S tem so pokazali, da se izražanje fluorescentnega reporterja in sRNA uravnava čez široko koncentracijsko območje induktorjev [1].

== Vpliv sRNA na izražanje reporterja ''AmCyan'' (in vivo) ==

Testirali so 12 različnih protismernih zaporedji s transformacijo seva ''E. coli'' 10- beta s plazmidom pART15-AS in merili fluorescenco celic v treh časovnih točkah (6, 18, 29 h) [1].
V prvem in vivo sistemu so pokazali, da je ciljanje RBS in prvih 20 baz mRNA reporterja ''AmCyan'' povzročilo signifikantno znižanje izražanja do 10% v 29 urah. Še bolj signifikantno znižanje izražanja reporterja je bilo prisotno pri ciljanju visoko-energijskega stebelnega dela sekundarne strukture mRNA (asB430), kjer so v šestih urah dosegli 25% utišanje. Ostale sRNA, ki ciljajo druge regije iniciacije translacija so dosegle signifikantno znižanja izražanja šele po dolgem času gojenja. Ciljanje visoko-energijskega stebla, ki je bolj oddaljen od mesta začetka translacije (asB407 in asB539) je v nekaterih primerih signifikantno znižalo fluorescenco, v drugih pa ne. Pri poskusu z asB606, ki cilja nizko-energijsko steblo, so izmerili signifikantno povišanje fluorescence pri 18h, vendar pri 29h signifikantnega povišanja ni bilo več prisotnega [1].
Čeprav so v in vivo sitemu dokazali nekaj signifikantnih sprememb izražanja reporterskega proteina, so rezultati zelo variirali, kar je verjetno posledica kompleksnosti živih celic. Zato so poskuse nadaljevali v brezceličnem sistemu [1].

== Brezcelični sistem (CFS) ==

Brezcelični sistem so pripravili s sonifikacijo celice, ki so bile predhodno transformirane s plazmidom pART15-AS in nato inducirali izraženje z Ara in ATc. Tako kot in vivo so najprej potrdili, da je odnos med intenziteto fluorescence in koncentracijo induktorjev (Ara in ATc) linearen. Indukcija je bila dosežena po 24h, maksimum pa je fluorescenca dosegla po 96 urah. Rezultati so bili v CFS veliko bolj konsistentni kot in vivo, poleg tega pa je bilo prisotnih več signifikantnih rezultatov [1].

=== Vpliv sRNA na izražanje reporterja ''AmCyan'' ===

Ciljanje RBS v sistemu CFS ni povzročilo znižanja fluorescence, ciljanje prvih 20 nk pa je ravni izražanja znižalo bolj kot in vivo. S ciljanjem sekundarnih struktur mRNA so dosegli še močnejše utišanje; ciljanje visoko-energijskega stebla je povzročilo kar 65% utišanje, ciljanje 3' konca mRNA (asB701) pa je utišalo izražanje za kar 70% (in vivo le 19%). Pri ciljanju nizko-energijskega stebla (asB606) pa so dobili presenetljive rezultate, ki drugje v literaturi niso zabeleženi, in sicer je prišlo do signifikantnega zvišanja fluorescence za več kot 66%. Pri ciljanju drugega dela nizko-energijskega stebla (asB615) se je fluorescenca znižala [1].

=== Vpliv sRNA, odvisne od Hfq, na izražanje reporterja ''AmCyan'' ===
Nadaljnjo jih je zanimalo, ali lahko rezultate reproducirajo z uporabo sRNA, ki je odvisna od Hfq. V ostalih poskusih so namreč uporabljali sintetično sRNA, ki ni odvisna od Hfn. Uporabili so naravno pristno sRNA MicC, ki je vpletena v utišanje proteina zunanje membrane OmpC v ''E. coli'' in izkazuje visoke ravni utišanja genov. Protein Hfq deluje kot RNA šaperon MicC [1].
K ogrodju MicC so dodali ista protismerna zaporedja kot pri od-Hfq-neodvisni sRNA. Ciljanje prvih 20 nk mRNA s MicC-asB1 je vodilo v znižanje fluorescence, ki je bilo večje kot pri uporabi od-Hfq-neodvisne asRNA. Pri testiranju z MicC-asB606 ni bilo spremembe fluorescence, medtem ko je bilo pri sintetičnem ogrodju zvišanje flourescence kar 65%. Ciljanje RBS z MicC-asRBS je povzročilo zvišanje flourescence, kar se ne sklada z objavljenimi rezultati drugih v vivo študij, vendar so v nadaljevanju študije tudi ta pojav pojasnili [1].

== Določanje mehanizma delovanja sRNA asB606 in MicC-asRBS z NUPACK in catRAPID ==

Za določanje mehanizma, ki povzroči prekomerno izražanje z asB606 sRNA, so za analizo uporabili program NUPACK, s katerim se lahko načrtuje in analizira strukture ter sisteme nukleinskih kislin [1,3]. Ugotovili so, da se asB606 veže na bazne pare 606-615 na ''AmCyan'' mRNA, ki tvorijo začetni del stebla-zanke zaščitenega 3' konca. To mesto pa je tudi prepoznavno mesto za RNaza E, ki po prepoznavi cepi ''AmCyan'' mRNA. Vezava sRNA na to mesto oteži prepoznavo mRNA z RNazo E in s tem prepreči cepitev in posledično podaljša razpolovno dobo mRNA, kar vodi v zvišanje izražanja ''AmCyan'' in povišanja fluorescence. Vezavni potencial med RNazo E in ''AmCyan'' mRNA, določen s programom catRAPID, je bil v regiji 500-600 visok, kar pa še dodatno podpira teorijo, da sRNA asB606 zakrije prepoznavno mesto za RNazo E [1].
Z analizo NUPACK so analizirali tudi zvišano izražanje z MicC-asRBS, kjer takšnih rezultatov niso pričakovali. V nativni ''AmCyan'' mRNA je 5' konec zvit v stebelno sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo. Vezava MicC-asRNA na mRNA prepreči nastanek takšne sekundarne strukture, s tem pa “sprosti” RBS in omogoči vezavo na ribosom [1].

== Regulacija izražnja diaforaze s sRNA in vitro ==
Diaforaza je topna NAD(P)H dehidrogenaza, ki je vpletena v nastanek NADH in NADPH v anaerobnih pogojih [1]. Uporablja se v sinteznih encimskih poteh za produkcijo kemikalij visokih vrednosti, zato je zvišano izražanje tega encima tudi zanimivo in uporabno [1].
Z uporabo catRAPID so predvideli vezavna mesta za RNazo E na diaforazni mRNA in identificirali štiri tarčna mesta za sRNA, ki se nahajajo v bližini stebelnih zank in vezava, na katera bi lahko povzročilo zvišano izražanje [1].
Protismerna zaporedja, ki so bila del sRNA, so klonirali v plazmid pBAD-LIC in z njim transformirali sev ''E.coli'' BL21 Star (DE3). Brezcelični sistem so naredili s hkratno sonifikacijo kultur ''E.coli'' , ene, ki vsebuje zapis za diaforazo in druge z rekobinanitim plazmidom pBAD-AS [1].
Dva konstrukta (as410, as528) sta signifiakntno povečal izražanje diaforaze, en je dosegel nesignifikantno povečanje izražanja (as510), zadnji pa je v enem replikat povišal izražanje, v drugih pa ni imel vpliva (as490) [1].
Čeprav so vsi konstrukti vsebovali protismerno zaporedje, ki cilja vezavno mesto za RNazo E na diaforazono mRNA, so bili vplivi konstruktov raznoliki. Rezultati so lahko posledica prisotnosti več vezavnih mest za RNazo E, poleg tega pa uporabljen sev E.coli lahko metabolizira induktor Ara in s tem zniža izražanje sRNA [1].

== Zaključek ==
Naravne in sintetične sRNA imajo velik potencial v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, saj omogočajo regulacijo izražanja genov brez popolnega izbitja gena, preko induciranega izražanja sRNA pa se lahko uvede še večji nadzor nad regulacijo izražanja tarčenga gena. So majhne, kar omogoča izražanje več sRNA iz istega plazmida. Tannaiche et al so prvič pokazali, da s sRNA lahko selektivno tudi zvišamo izražanje tarčnega gena v CFS. Poleg tega pa so pokazali, da se lahko sRNA prilagodi na različne sisteme in na regulacijo različnih proteinov [1].

== Literatura ==
[1] Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324. doi:10.1002/btpr.3324

[2] Storz G, Vogel J, Wassarman, K M. Regulation by Small RNAs in Bacteria: Expanding Frontiers. Molecular Cell. 2011. 43(6), 880–891.doi:10.1016/j.molcel.2011.08.022

[3] NUPACK. https://www.nupack.org (nazadnje dostopano 14. 5. 2023 dostopano)

Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu

2023-05-14T17:36:37Z

Anagodesa: /* Regulacija izražnja diaforaze s sRNA in vitro */

"Povzeto po članku [https://aiche.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/btpr.3324 Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324.]”

== Uvod ==

Nekodirajoče bakterijske RNA, med katere spada mala RNA (sRNA – angl. small) postajajo pomembno orodje v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, ker omogočajo regulacijo izražanje genov brez popolnega izbijta gena. Z nepopolnim parjenjem baz se sRNA veže na mRNA, pogosto v bližino ribosom-vezavnega mesta (RBS) ali pa prepreči/ojača vezavo na ribosom preko drugih mehanizmov [1,2].
Tehnologija sRNA se uporablja za detekcijo metabolnega stanja, uravnovešenja metabolnih poti, za kontrolo izražanja toksinov, za izboljšanje izkoristka in zmanjšanja količine stranskih produktov [1].
Večina aplikacij sRNA se izvaja v živih celicah. Vendar ima tak pristop kar nekaj pomanjkljivosti kot so kompleksnost sistema, selektivna indukcija, naravna variabilnost, težave pri standardizaciji in neponovljivost rezultatov. Zato se razvija brezcelične sisteme (cell-free systems – CFS), ki vsebujejo celično komponente in vitro. Delo v brezceličnih sistemih je bolj fleksibilno, možen je večji nadzor nad modifikacijami transkripcije/translacije, lahko se proizvede večje količine produktov, višja je toleranca za toksične substrate/produkte/intermediate, lažje je čiščenje produktov [1].
Tannaiche et al so se ukvarjali z ugotavljanjem vpliva sRNA na izražanje fluorescenčnega barvila Anemonia majano cyan (''AmCyan'') ter encima diaforaza. Razvili so sRNA, ki poleg utišanja genov omogoča tudi prekomerno izražanje tarčnega proteina, kar do tedaj še ni bilo zabeleženo. Testiranje so najprej izvedli in vivo, vendar so zaradi nekonsistentnih rezultatov prešli na brezcelični sistem [1].

== Konstrukcija sRNA in plazmidov v sistemu z reporterjem ''AmCyan'' ==
'''Sintetični konstrukt sRNA''' je dolg 48 nukleotidov in je sestavljen iz treh delov. Zaporedje na 5' koncu tvori steblo-zanko, s čemer stabilizira RNA in omogoča interakcijo sRNA-mRNA (14 nk). Temu sledi 20 nukleotidov dolgo protismerno zaporedje za tarčno mRNA. Na 3' koncu sRNA je še terminator v obliki stebla-zanke (14 nk). Naredili so 12 različnih konstruktov sRNA, ki ciljajo različne dele ''AmCyan'' mRNA[1].

'''Plazmidi za testiranja sistema z reporterjem ''AmCyan'''''
Uporabili so štiri različne plazmide. Prvi je pART15-C1 in vsebuje zapis za reporterski ''AmCyan'' pod inducibilnim arabinoznim promotorjem. Drugi uporabljen plazmid je pART15-C2, ki ima zapis za reporter ''AmCyan'' pod kontrolo promotorja tetraciklinskegain omogoča relativno določitev izražanja sRNA. Plazmid pART15-C1-LacZ ima sRNA konstrukt substituiran z lacZ in omogoča modro-beli test po transformaciji bakterij. Zadnji plazmid je pART15-AS, ki vsebuje gen za reporter ''AmCyan'' pod kontrolo arabinoznega promotorja in zaporedje za sRNA pod kontrolo tetracikilinskega promotorja [1].
Sestavljanje konstrukta je potekalo s sestavljanjem po Gibosonu in gama-PCR.

== Optimizacija indukcije s plazmidom pART15-C1 in -C2 (in vivo) ==
Za oceno izražanja reporterja ''AmCyan'' in sRNA v odvisnosti od koncentracije induktorjev so uporabili kontrolna plazmida pART15-C1 in pART15-C2 in z njima transfecirali sev ''Escehrichia coli'' 10-beta. Merili so fluorescenco ''AmCyan'' pri različni koncentracijah induktorjev arabinoze (Ara) in anhidrotetraciklina (ATc) [1].
Med koncentracijo Ara oz. ATc in intenziteto fluorescence je bil opažen linearen odnos. S tem so pokazali, da se izražanje fluorescentnega reporterja in sRNA uravnava čez široko koncentracijsko območje induktorjev [1].

== Vpliv sRNA na izražanje reporterja ''AmCyan'' (in vivo) ==

Testirali so 12 različnih protismernih zaporedji s transformacijo seva ''E. coli'' 10- beta s plazmidom pART15-AS in merili fluorescenco celic v treh časovnih točkah (6, 18, 29 h) [1].
V prvem in vivo sistemu so pokazali, da je ciljanje RBS in prvih 20 baz mRNA reporterja ''AmCyan'' povzročilo signifikantno znižanje izražanja do 10% v 29 urah. Še bolj signifikantno znižanje izražanja reporterja je bilo prisotno pri ciljanju visoko-energijskega stebelnega dela sekundarne strukture mRNA (asB430), kjer so v šestih urah dosegli 25% utišanje. Ostale sRNA, ki ciljajo druge regije iniciacije translacija so dosegle signifikantno znižanja izražanja šele po dolgem času gojenja. Ciljanje visoko-energijskega stebla, ki je bolj oddaljen od mesta začetka translacije (asB407 in asB539) je v nekaterih primerih signifikantno znižalo fluorescenco, v drugih pa ne. Pri poskusu z asB606, ki cilja nizko-energijsko steblo, so izmerili signifikantno povišanje fluorescence pri 18h, vendar pri 29h signifikantnega povišanja ni bilo več prisotnega [1].
Čeprav so v in vivo sitemu dokazali nekaj signifikantnih sprememb izražanja reporterskega proteina, so rezultati zelo variirali, kar je verjetno posledica kompleksnosti živih celic. Zato so poskuse nadaljevali v brezceličnem sistemu [1].

== Brezcelični sistem (CFS) ==

Brezcelični sistem so pripravili s sonifikacijo celice, ki so bile predhodno transformirane s plazmidom pART15-AS in nato inducirali izraženje z Ara in ATc. Tako kot in vivo so najprej potrdili, da je odnos med intenziteto fluorescence in koncentracijo induktorjev (Ara in ATc) linearen. Indukcija je bila dosežena po 24h, maksimum pa je fluorescenca dosegla po 96 urah. Rezultati so bili v CFS veliko bolj konsistentni kot in vivo, poleg tega pa je bilo prisotnih več signifikantnih rezultatov [1].

=== Vpliv sRNA na izražanje reporterja ''AmCyan'' ===

Ciljanje RBS v sistemu CFS ni povzročilo znižanja fluorescence, ciljanje prvih 20 nk pa je ravni izražanja znižalo bolj kot in vivo. S ciljanjem sekundarnih struktur mRNA so dosegli še močnejše utišanje; ciljanje visoko-energijskega stebla je povzročilo kar 65% utišanje, ciljanje 3' konca mRNA (asB701) pa je utišalo izražanje za kar 70% (in vivo le 19%). Pri ciljanju nizko-energijskega stebla (asB606) pa so dobili presenetljive rezultate, ki drugje v literaturi niso zabeleženi, in sicer je prišlo do signifikantnega zvišanja fluorescence za več kot 66%. Pri ciljanju drugega dela nizko-energijskega stebla (asB615) se je fluorescenca znižala [1].

=== Vpliv sRNA, odvisne od Hfq, na izražanje reporterja ''AmCyan'' ===
Nadaljnjo jih je zanimalo, ali lahko rezultate reproducirajo z uporabo sRNA, ki je odvisna od Hfq. V ostalih poskusih so namreč uporabljali sintetično sRNA, ki ni odvisna od Hfn. Uporabili so naravno pristno sRNA MicC, ki je vpletena v utišanje proteina zunanje membrane OmpC v ''E. coli'' in izkazuje visoke ravni utišanja genov. Protein Hfq deluje kot RNA šaperon MicC [1].
K ogrodju MicC so dodali ista protismerna zaporedja kot pri od-Hfq-neodvisni sRNA. Ciljanje prvih 20 nk mRNA s MicC-asB1 je vodilo v znižanje fluorescence, ki je bilo večje kot pri uporabi od-Hfq-neodvisne asRNA. Pri testiranju z MicC-asB606 ni bilo spremembe fluorescence, medtem ko je bilo pri sintetičnem ogrodju zvišanje flourescence kar 65%. Ciljanje RBS z MicC-asRBS je povzročilo zvišanje flourescence, kar se ne sklada z objavljenimi rezultati drugih v vivo študij, vendar so v nadaljevanju študije tudi ta pojav pojasnili [1].

== Določanje mehanizma delovanja sRNA asB606 in MicC-asRBS z NUPACK in catRAPID ==

Za določanje mehanizma, ki povzroči prekomerno izražanje z asB606 sRNA, so za analizo uporabili program NUPACK, s katerim se lahko načrtuje in analizira strukture ter sisteme nukleinskih kislin [1,3]. Ugotovili so, da se asB606 veže na bazne pare 606-615 na ''AmCyan'' mRNA, ki tvorijo začetni del stebla-zanke zaščitenega 3' konca. To mesto pa je tudi prepoznavno mesto za RNaza E, ki po prepoznavi cepi ''AmCyan'' mRNA. Vezava sRNA na to mesto oteži prepoznavo mRNA z RNazo E in s tem prepreči cepitev in posledično podaljša razpolovno dobo mRNA, kar vodi v zvišanje izražanja ''AmCyan'' in povišanja fluorescence. Vezavni potencial med RNazo E in ''AmCyan'' mRNA, določen s programom catRAPID, je bil v regiji 500-600 visok, kar pa še dodatno podpira teorijo, da sRNA asB606 zakrije prepoznavno mesto za RNazo E [1].
Z analizo NUPACK so analizirali tudi zvišano izražanje z MicC-asRBS, kjer takšnih rezultatov niso pričakovali. V nativni ''AmCyan'' mRNA je 5' konec zvit v stebelno sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo. Vezava MicC-asRNA na mRNA prepreči nastanek takšne sekundarne strukture, s tem pa “sprosti” RBS in omogoči vezavo na ribosom [1].

== Regulacija izražnja diaforaze s sRNA in vitro ==
Diaforaza je topna NAD(P)H dehidrogenaza, ki je vpletena v nastanek NADH in NADPH v anaerobnih pogojih [1]. Uporablja se v sinteznih encimskih poteh za produkcijo kemikalij visokih vrednosti, zato je zvišano izražanje tega encima tudi zanimivo in uporabno [1].
Z uporabo catRAPID so predvideli vezavna mesta za RNazo E na diaforazni mRNA in identificirali štiri tarčna mesta za sRNA, ki se nahajajo v bližini stebelnih zank in vezava, na katera bi lahko povzročilo zvišano izražanje [1].
Protismerna zaporedja, ki so bila del sRNA, so klonirali v plazmid pBAD-LIC in z njim transformirali sev ''E.coli'' BL21 Star (DE3). Brezcelični sistem so naredili s hkratno sonifikacijo kultur ''E.coli'' , ene, ki vsebuje zapis za diaforazo in druge z rekobinanitim plazmidom pBAD-AS [1].
Dva konstrukta (as410, as528) sta signifiakntno povečal izražanje diaforaze, en je dosegel nesignifikantno povečanje izražanja (as510), zadnji pa je v enem replikat povišal izražanje, v drugih pa ni imel vpliva (as490) [1].
Čeprav so vsi konstrukti vsebovali protismerno zaporedje, ki cilja vezavno mesto za RNazo E na diaforazono mRNA, so bili vplivi konstruktov raznoliki. Rezultati so lahko posledica prisotnosti več vezavnih mest za RNazo E, poleg tega pa uporabljen sev E.coli lahko metabolizira induktor Ara in s tem zniža izražanje sRNA [1].

== Zaključek ==
Naravne in sintetične sRNA imajo velik potencial v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, saj omogočajo regulacijo izražanja genov brez popolnega izbitja gena, preko induciranega izražanja sRNA pa se lahko uvede še večji nadzor nad regulacijo izražanja tarčenga gena. So majhne, kar omogoča izražanje več sRNA iz istega plazmida. Tannaiche et al so prvič pokazali, da s sRNA lahko selektivno tudi zvišamo izražanje tarčnega gena v CFS. Poleg tega pa so pokazali, da se lahko sRNA prilagodi na različne sisteme in na regulacijo različnih proteinov [1].

== Literatura ==
[1] Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324. doi:10.1002/btpr.3324

[2] Storz G, Vogel J, Wassarman, K M. Regulation by Small RNAs in Bacteria: Expanding Frontiers. Molecular Cell. 2011. 43(6), 880–891.doi:10.1016/j.molcel.2011.08.022

[3] NUPACK. https://www.nupack.org (nazadnje dostopano 14. 5. 2023 dostopano)

[4] AG Scientific: Diaohorase Enzymes – Why are they? https://agscientific.com/blog/all-about-diaphorase-enzymes.html (nazadnje dostopano 14.5.2023)

Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu

2023-05-14T17:31:47Z

Anagodesa: /* Določanje mehanizma delovanja sRNA asB606 in MicC-asRBS z NUPACK in catRAPID */

"Povzeto po članku [https://aiche.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/btpr.3324 Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324.]”

== Uvod ==

Nekodirajoče bakterijske RNA, med katere spada mala RNA (sRNA – angl. small) postajajo pomembno orodje v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, ker omogočajo regulacijo izražanje genov brez popolnega izbijta gena. Z nepopolnim parjenjem baz se sRNA veže na mRNA, pogosto v bližino ribosom-vezavnega mesta (RBS) ali pa prepreči/ojača vezavo na ribosom preko drugih mehanizmov [1,2].
Tehnologija sRNA se uporablja za detekcijo metabolnega stanja, uravnovešenja metabolnih poti, za kontrolo izražanja toksinov, za izboljšanje izkoristka in zmanjšanja količine stranskih produktov [1].
Večina aplikacij sRNA se izvaja v živih celicah. Vendar ima tak pristop kar nekaj pomanjkljivosti kot so kompleksnost sistema, selektivna indukcija, naravna variabilnost, težave pri standardizaciji in neponovljivost rezultatov. Zato se razvija brezcelične sisteme (cell-free systems – CFS), ki vsebujejo celično komponente in vitro. Delo v brezceličnih sistemih je bolj fleksibilno, možen je večji nadzor nad modifikacijami transkripcije/translacije, lahko se proizvede večje količine produktov, višja je toleranca za toksične substrate/produkte/intermediate, lažje je čiščenje produktov [1].
Tannaiche et al so se ukvarjali z ugotavljanjem vpliva sRNA na izražanje fluorescenčnega barvila Anemonia majano cyan (''AmCyan'') ter encima diaforaza. Razvili so sRNA, ki poleg utišanja genov omogoča tudi prekomerno izražanje tarčnega proteina, kar do tedaj še ni bilo zabeleženo. Testiranje so najprej izvedli in vivo, vendar so zaradi nekonsistentnih rezultatov prešli na brezcelični sistem [1].

== Konstrukcija sRNA in plazmidov v sistemu z reporterjem ''AmCyan'' ==
'''Sintetični konstrukt sRNA''' je dolg 48 nukleotidov in je sestavljen iz treh delov. Zaporedje na 5' koncu tvori steblo-zanko, s čemer stabilizira RNA in omogoča interakcijo sRNA-mRNA (14 nk). Temu sledi 20 nukleotidov dolgo protismerno zaporedje za tarčno mRNA. Na 3' koncu sRNA je še terminator v obliki stebla-zanke (14 nk). Naredili so 12 različnih konstruktov sRNA, ki ciljajo različne dele ''AmCyan'' mRNA[1].

'''Plazmidi za testiranja sistema z reporterjem ''AmCyan'''''
Uporabili so štiri različne plazmide. Prvi je pART15-C1 in vsebuje zapis za reporterski ''AmCyan'' pod inducibilnim arabinoznim promotorjem. Drugi uporabljen plazmid je pART15-C2, ki ima zapis za reporter ''AmCyan'' pod kontrolo promotorja tetraciklinskegain omogoča relativno določitev izražanja sRNA. Plazmid pART15-C1-LacZ ima sRNA konstrukt substituiran z lacZ in omogoča modro-beli test po transformaciji bakterij. Zadnji plazmid je pART15-AS, ki vsebuje gen za reporter ''AmCyan'' pod kontrolo arabinoznega promotorja in zaporedje za sRNA pod kontrolo tetracikilinskega promotorja [1].
Sestavljanje konstrukta je potekalo s sestavljanjem po Gibosonu in gama-PCR.

== Optimizacija indukcije s plazmidom pART15-C1 in -C2 (in vivo) ==
Za oceno izražanja reporterja ''AmCyan'' in sRNA v odvisnosti od koncentracije induktorjev so uporabili kontrolna plazmida pART15-C1 in pART15-C2 in z njima transfecirali sev ''Escehrichia coli'' 10-beta. Merili so fluorescenco ''AmCyan'' pri različni koncentracijah induktorjev arabinoze (Ara) in anhidrotetraciklina (ATc) [1].
Med koncentracijo Ara oz. ATc in intenziteto fluorescence je bil opažen linearen odnos. S tem so pokazali, da se izražanje fluorescentnega reporterja in sRNA uravnava čez široko koncentracijsko območje induktorjev [1].

== Vpliv sRNA na izražanje reporterja ''AmCyan'' (in vivo) ==

Testirali so 12 različnih protismernih zaporedji s transformacijo seva ''E. coli'' 10- beta s plazmidom pART15-AS in merili fluorescenco celic v treh časovnih točkah (6, 18, 29 h) [1].
V prvem in vivo sistemu so pokazali, da je ciljanje RBS in prvih 20 baz mRNA reporterja ''AmCyan'' povzročilo signifikantno znižanje izražanja do 10% v 29 urah. Še bolj signifikantno znižanje izražanja reporterja je bilo prisotno pri ciljanju visoko-energijskega stebelnega dela sekundarne strukture mRNA (asB430), kjer so v šestih urah dosegli 25% utišanje. Ostale sRNA, ki ciljajo druge regije iniciacije translacija so dosegle signifikantno znižanja izražanja šele po dolgem času gojenja. Ciljanje visoko-energijskega stebla, ki je bolj oddaljen od mesta začetka translacije (asB407 in asB539) je v nekaterih primerih signifikantno znižalo fluorescenco, v drugih pa ne. Pri poskusu z asB606, ki cilja nizko-energijsko steblo, so izmerili signifikantno povišanje fluorescence pri 18h, vendar pri 29h signifikantnega povišanja ni bilo več prisotnega [1].
Čeprav so v in vivo sitemu dokazali nekaj signifikantnih sprememb izražanja reporterskega proteina, so rezultati zelo variirali, kar je verjetno posledica kompleksnosti živih celic. Zato so poskuse nadaljevali v brezceličnem sistemu [1].

== Brezcelični sistem (CFS) ==

Brezcelični sistem so pripravili s sonifikacijo celice, ki so bile predhodno transformirane s plazmidom pART15-AS in nato inducirali izraženje z Ara in ATc. Tako kot in vivo so najprej potrdili, da je odnos med intenziteto fluorescence in koncentracijo induktorjev (Ara in ATc) linearen. Indukcija je bila dosežena po 24h, maksimum pa je fluorescenca dosegla po 96 urah. Rezultati so bili v CFS veliko bolj konsistentni kot in vivo, poleg tega pa je bilo prisotnih več signifikantnih rezultatov [1].

=== Vpliv sRNA na izražanje reporterja ''AmCyan'' ===

Ciljanje RBS v sistemu CFS ni povzročilo znižanja fluorescence, ciljanje prvih 20 nk pa je ravni izražanja znižalo bolj kot in vivo. S ciljanjem sekundarnih struktur mRNA so dosegli še močnejše utišanje; ciljanje visoko-energijskega stebla je povzročilo kar 65% utišanje, ciljanje 3' konca mRNA (asB701) pa je utišalo izražanje za kar 70% (in vivo le 19%). Pri ciljanju nizko-energijskega stebla (asB606) pa so dobili presenetljive rezultate, ki drugje v literaturi niso zabeleženi, in sicer je prišlo do signifikantnega zvišanja fluorescence za več kot 66%. Pri ciljanju drugega dela nizko-energijskega stebla (asB615) se je fluorescenca znižala [1].

=== Vpliv sRNA, odvisne od Hfq, na izražanje reporterja ''AmCyan'' ===
Nadaljnjo jih je zanimalo, ali lahko rezultate reproducirajo z uporabo sRNA, ki je odvisna od Hfq. V ostalih poskusih so namreč uporabljali sintetično sRNA, ki ni odvisna od Hfn. Uporabili so naravno pristno sRNA MicC, ki je vpletena v utišanje proteina zunanje membrane OmpC v ''E. coli'' in izkazuje visoke ravni utišanja genov. Protein Hfq deluje kot RNA šaperon MicC [1].
K ogrodju MicC so dodali ista protismerna zaporedja kot pri od-Hfq-neodvisni sRNA. Ciljanje prvih 20 nk mRNA s MicC-asB1 je vodilo v znižanje fluorescence, ki je bilo večje kot pri uporabi od-Hfq-neodvisne asRNA. Pri testiranju z MicC-asB606 ni bilo spremembe fluorescence, medtem ko je bilo pri sintetičnem ogrodju zvišanje flourescence kar 65%. Ciljanje RBS z MicC-asRBS je povzročilo zvišanje flourescence, kar se ne sklada z objavljenimi rezultati drugih v vivo študij, vendar so v nadaljevanju študije tudi ta pojav pojasnili [1].

== Določanje mehanizma delovanja sRNA asB606 in MicC-asRBS z NUPACK in catRAPID ==

Za določanje mehanizma, ki povzroči prekomerno izražanje z asB606 sRNA, so za analizo uporabili program NUPACK, s katerim se lahko načrtuje in analizira strukture ter sisteme nukleinskih kislin [1,3]. Ugotovili so, da se asB606 veže na bazne pare 606-615 na ''AmCyan'' mRNA, ki tvorijo začetni del stebla-zanke zaščitenega 3' konca. To mesto pa je tudi prepoznavno mesto za RNaza E, ki po prepoznavi cepi ''AmCyan'' mRNA. Vezava sRNA na to mesto oteži prepoznavo mRNA z RNazo E in s tem prepreči cepitev in posledično podaljša razpolovno dobo mRNA, kar vodi v zvišanje izražanja ''AmCyan'' in povišanja fluorescence. Vezavni potencial med RNazo E in ''AmCyan'' mRNA, določen s programom catRAPID, je bil v regiji 500-600 visok, kar pa še dodatno podpira teorijo, da sRNA asB606 zakrije prepoznavno mesto za RNazo E [1].
Z analizo NUPACK so analizirali tudi zvišano izražanje z MicC-asRBS, kjer takšnih rezultatov niso pričakovali. V nativni ''AmCyan'' mRNA je 5' konec zvit v stebelno sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo. Vezava MicC-asRNA na mRNA prepreči nastanek takšne sekundarne strukture, s tem pa “sprosti” RBS in omogoči vezavo na ribosom [1].

== Regulacija izražnja diaforaze s sRNA in vitro ==
Diaforaza je topna NAD(P)H dehidrogenaza, ki je vpletena v nastanek NADH in NADPH v anaerobnih pogojih [1,4]. Uporablja se v sinteznih encimskih poteh za produkcijo visoko-vrednih kemikalij, zato je zvišano izražanje tega encima tudi zanimivo in uporabno [1].
Z uporabo catRAPID so predvideli vezavna mesta za RNazo E na diaforazni mRNA in identificirali štiri tarčna mesta za sRNA, ki se nahajajo v bližini stebelnih zank in vezava, na katera bi lahko povzročilo zvišano izražanje [1].
Protismerna zaporedja, ki so bila del sRNA, so klonirali v plazmid pBAD-LIC in z njim transformirali sev ''E.coli'' BL21 Star (DE3). Brezcelični sistem so naredili s hkratno sonifikacijo kultur ''E.coli'' , ene, ki vsebuje zapis za diaforazo in druge z rekobinanitim plazmidom pBAD-AS [1].
Dva konstrukta (as410, as528) sta signifiakntno povečal izražanje diaforaze, en je dosegel zelo nizko povečanje (as510), zadnji pa je v enem replikat povišal izražanje, v drugih pa ni imel vpliva (as490) [1].
Čeprav so vsi konstrukti vsebovali protismerno zaporedje, ki cilja vezavno mesto za RNazo E na diaforazono mRNA, so bili vplivi konstruktov raznoliki. Rezultati so lahko posledica prisotnosti več vezavnih mest za RNazo E, poleg tega pa uporabljen sev E.coli lahko metabolizira induktor Ara in s tem zniža izražanje sRNA [1].

== Zaključek ==
Naravne in sintetične sRNA imajo velik potencial v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, saj omogočajo regulacijo izražanja genov brez popolnega izbitja gena, preko induciranega izražanja sRNA pa se lahko uvede še večji nadzor nad regulacijo izražanja tarčenga gena. So majhne, kar omogoča izražanje več sRNA iz istega plazmida. Tannaiche et al so prvič pokazali, da s sRNA lahko selektivno tudi zvišamo izražanje tarčnega gena v CFS. Poleg tega pa so pokazali, da se lahko sRNA prilagodi na različne sisteme in na regulacijo različnih proteinov [1].

== Literatura ==
[1] Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324. doi:10.1002/btpr.3324

[2] Storz G, Vogel J, Wassarman, K M. Regulation by Small RNAs in Bacteria: Expanding Frontiers. Molecular Cell. 2011. 43(6), 880–891.doi:10.1016/j.molcel.2011.08.022

[3] NUPACK. https://www.nupack.org (nazadnje dostopano 14. 5. 2023 dostopano)

[4] AG Scientific: Diaohorase Enzymes – Why are they? https://agscientific.com/blog/all-about-diaphorase-enzymes.html (nazadnje dostopano 14.5.2023)

Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu

2023-05-14T17:29:28Z

Anagodesa: /* Brezcelični sistem (CFS) */

"Povzeto po članku [https://aiche.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/btpr.3324 Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324.]”

== Uvod ==

Nekodirajoče bakterijske RNA, med katere spada mala RNA (sRNA – angl. small) postajajo pomembno orodje v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, ker omogočajo regulacijo izražanje genov brez popolnega izbijta gena. Z nepopolnim parjenjem baz se sRNA veže na mRNA, pogosto v bližino ribosom-vezavnega mesta (RBS) ali pa prepreči/ojača vezavo na ribosom preko drugih mehanizmov [1,2].
Tehnologija sRNA se uporablja za detekcijo metabolnega stanja, uravnovešenja metabolnih poti, za kontrolo izražanja toksinov, za izboljšanje izkoristka in zmanjšanja količine stranskih produktov [1].
Večina aplikacij sRNA se izvaja v živih celicah. Vendar ima tak pristop kar nekaj pomanjkljivosti kot so kompleksnost sistema, selektivna indukcija, naravna variabilnost, težave pri standardizaciji in neponovljivost rezultatov. Zato se razvija brezcelične sisteme (cell-free systems – CFS), ki vsebujejo celično komponente in vitro. Delo v brezceličnih sistemih je bolj fleksibilno, možen je večji nadzor nad modifikacijami transkripcije/translacije, lahko se proizvede večje količine produktov, višja je toleranca za toksične substrate/produkte/intermediate, lažje je čiščenje produktov [1].
Tannaiche et al so se ukvarjali z ugotavljanjem vpliva sRNA na izražanje fluorescenčnega barvila Anemonia majano cyan (''AmCyan'') ter encima diaforaza. Razvili so sRNA, ki poleg utišanja genov omogoča tudi prekomerno izražanje tarčnega proteina, kar do tedaj še ni bilo zabeleženo. Testiranje so najprej izvedli in vivo, vendar so zaradi nekonsistentnih rezultatov prešli na brezcelični sistem [1].

== Konstrukcija sRNA in plazmidov v sistemu z reporterjem ''AmCyan'' ==
'''Sintetični konstrukt sRNA''' je dolg 48 nukleotidov in je sestavljen iz treh delov. Zaporedje na 5' koncu tvori steblo-zanko, s čemer stabilizira RNA in omogoča interakcijo sRNA-mRNA (14 nk). Temu sledi 20 nukleotidov dolgo protismerno zaporedje za tarčno mRNA. Na 3' koncu sRNA je še terminator v obliki stebla-zanke (14 nk). Naredili so 12 različnih konstruktov sRNA, ki ciljajo različne dele ''AmCyan'' mRNA[1].

'''Plazmidi za testiranja sistema z reporterjem ''AmCyan'''''
Uporabili so štiri različne plazmide. Prvi je pART15-C1 in vsebuje zapis za reporterski ''AmCyan'' pod inducibilnim arabinoznim promotorjem. Drugi uporabljen plazmid je pART15-C2, ki ima zapis za reporter ''AmCyan'' pod kontrolo promotorja tetraciklinskegain omogoča relativno določitev izražanja sRNA. Plazmid pART15-C1-LacZ ima sRNA konstrukt substituiran z lacZ in omogoča modro-beli test po transformaciji bakterij. Zadnji plazmid je pART15-AS, ki vsebuje gen za reporter ''AmCyan'' pod kontrolo arabinoznega promotorja in zaporedje za sRNA pod kontrolo tetracikilinskega promotorja [1].
Sestavljanje konstrukta je potekalo s sestavljanjem po Gibosonu in gama-PCR.

== Optimizacija indukcije s plazmidom pART15-C1 in -C2 (in vivo) ==
Za oceno izražanja reporterja ''AmCyan'' in sRNA v odvisnosti od koncentracije induktorjev so uporabili kontrolna plazmida pART15-C1 in pART15-C2 in z njima transfecirali sev ''Escehrichia coli'' 10-beta. Merili so fluorescenco ''AmCyan'' pri različni koncentracijah induktorjev arabinoze (Ara) in anhidrotetraciklina (ATc) [1].
Med koncentracijo Ara oz. ATc in intenziteto fluorescence je bil opažen linearen odnos. S tem so pokazali, da se izražanje fluorescentnega reporterja in sRNA uravnava čez široko koncentracijsko območje induktorjev [1].

== Vpliv sRNA na izražanje reporterja ''AmCyan'' (in vivo) ==

Testirali so 12 različnih protismernih zaporedji s transformacijo seva ''E. coli'' 10- beta s plazmidom pART15-AS in merili fluorescenco celic v treh časovnih točkah (6, 18, 29 h) [1].
V prvem in vivo sistemu so pokazali, da je ciljanje RBS in prvih 20 baz mRNA reporterja ''AmCyan'' povzročilo signifikantno znižanje izražanja do 10% v 29 urah. Še bolj signifikantno znižanje izražanja reporterja je bilo prisotno pri ciljanju visoko-energijskega stebelnega dela sekundarne strukture mRNA (asB430), kjer so v šestih urah dosegli 25% utišanje. Ostale sRNA, ki ciljajo druge regije iniciacije translacija so dosegle signifikantno znižanja izražanja šele po dolgem času gojenja. Ciljanje visoko-energijskega stebla, ki je bolj oddaljen od mesta začetka translacije (asB407 in asB539) je v nekaterih primerih signifikantno znižalo fluorescenco, v drugih pa ne. Pri poskusu z asB606, ki cilja nizko-energijsko steblo, so izmerili signifikantno povišanje fluorescence pri 18h, vendar pri 29h signifikantnega povišanja ni bilo več prisotnega [1].
Čeprav so v in vivo sitemu dokazali nekaj signifikantnih sprememb izražanja reporterskega proteina, so rezultati zelo variirali, kar je verjetno posledica kompleksnosti živih celic. Zato so poskuse nadaljevali v brezceličnem sistemu [1].

== Brezcelični sistem (CFS) ==

Brezcelični sistem so pripravili s sonifikacijo celice, ki so bile predhodno transformirane s plazmidom pART15-AS in nato inducirali izraženje z Ara in ATc. Tako kot in vivo so najprej potrdili, da je odnos med intenziteto fluorescence in koncentracijo induktorjev (Ara in ATc) linearen. Indukcija je bila dosežena po 24h, maksimum pa je fluorescenca dosegla po 96 urah. Rezultati so bili v CFS veliko bolj konsistentni kot in vivo, poleg tega pa je bilo prisotnih več signifikantnih rezultatov [1].

=== Vpliv sRNA na izražanje reporterja ''AmCyan'' ===

Ciljanje RBS v sistemu CFS ni povzročilo znižanja fluorescence, ciljanje prvih 20 nk pa je ravni izražanja znižalo bolj kot in vivo. S ciljanjem sekundarnih struktur mRNA so dosegli še močnejše utišanje; ciljanje visoko-energijskega stebla je povzročilo kar 65% utišanje, ciljanje 3' konca mRNA (asB701) pa je utišalo izražanje za kar 70% (in vivo le 19%). Pri ciljanju nizko-energijskega stebla (asB606) pa so dobili presenetljive rezultate, ki drugje v literaturi niso zabeleženi, in sicer je prišlo do signifikantnega zvišanja fluorescence za več kot 66%. Pri ciljanju drugega dela nizko-energijskega stebla (asB615) se je fluorescenca znižala [1].

=== Vpliv sRNA, odvisne od Hfq, na izražanje reporterja ''AmCyan'' ===
Nadaljnjo jih je zanimalo, ali lahko rezultate reproducirajo z uporabo sRNA, ki je odvisna od Hfq. V ostalih poskusih so namreč uporabljali sintetično sRNA, ki ni odvisna od Hfn. Uporabili so naravno pristno sRNA MicC, ki je vpletena v utišanje proteina zunanje membrane OmpC v ''E. coli'' in izkazuje visoke ravni utišanja genov. Protein Hfq deluje kot RNA šaperon MicC [1].
K ogrodju MicC so dodali ista protismerna zaporedja kot pri od-Hfq-neodvisni sRNA. Ciljanje prvih 20 nk mRNA s MicC-asB1 je vodilo v znižanje fluorescence, ki je bilo večje kot pri uporabi od-Hfq-neodvisne asRNA. Pri testiranju z MicC-asB606 ni bilo spremembe fluorescence, medtem ko je bilo pri sintetičnem ogrodju zvišanje flourescence kar 65%. Ciljanje RBS z MicC-asRBS je povzročilo zvišanje flourescence, kar se ne sklada z objavljenimi rezultati drugih v vivo študij, vendar so v nadaljevanju študije tudi ta pojav pojasnili [1].

== Določanje mehanizma delovanja sRNA asB606 in MicC-asRBS z NUPACK in catRAPID ==

Za določanje mehanizma, ki povzroči prekomerno izražanje z asB606 sRNA, so za analizo uporabili program NUPACK, s katerim se lahko načrtuje in analizira strukture ter sisteme nukleinskih kislin [1,3]. Ugotovili so, da se asB606 veže na bazne pare 606-615 na ''AmCyan'' mRNA, ki tvorijo začetni del stebla-zanke zaščitenega 3' konca To mesto pa je tudi prepoznavno mesto za RNaza E, ki po prepoznavi cepi ''AmCyan'' mRNA. Vezava sRNA na to mesto oteži prepoznavo mRNA z RNazo E in s tem prepreči cepitev in posledično podaljša razpolovno dobo mRNA, kar vodi v zvišanje izražanja ''AmCyan'' in povišanja fluorescence. Vezavni potencial med RNazo E in ''AmCyan'' mRNA, določen s programom catRAPID, je bil v regiji 500-600 visok, kar pa še dodatno podpira teorijo, da sRNA asB606 zakrije prepoznavno mesto za RNazo E [1].
Z analizo NUPACK so analizirali tudi zvišano izražanje z MicC-asRBS, kjer takšnih rezultatov niso pričakovali. V nativni ''AmCyan'' mRNA je 5' konec zvit v stebelno sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo. Vezava MicC-asRNA na mRNA prepreči nastanek takšne sekundarne strukture, s tem pa “sprosti” RBS in omogoči vezavo na ribosom [1].

== Regulacija izražnja diaforaze s sRNA in vitro ==
Diaforaza je topna NAD(P)H dehidrogenaza, ki je vpletena v nastanek NADH in NADPH v anaerobnih pogojih [1,4]. Uporablja se v sinteznih encimskih poteh za produkcijo visoko-vrednih kemikalij, zato je zvišano izražanje tega encima tudi zanimivo in uporabno [1].
Z uporabo catRAPID so predvideli vezavna mesta za RNazo E na diaforazni mRNA in identificirali štiri tarčna mesta za sRNA, ki se nahajajo v bližini stebelnih zank in vezava, na katera bi lahko povzročilo zvišano izražanje [1].
Protismerna zaporedja, ki so bila del sRNA, so klonirali v plazmid pBAD-LIC in z njim transformirali sev ''E.coli'' BL21 Star (DE3). Brezcelični sistem so naredili s hkratno sonifikacijo kultur ''E.coli'' , ene, ki vsebuje zapis za diaforazo in druge z rekobinanitim plazmidom pBAD-AS [1].
Dva konstrukta (as410, as528) sta signifiakntno povečal izražanje diaforaze, en je dosegel zelo nizko povečanje (as510), zadnji pa je v enem replikat povišal izražanje, v drugih pa ni imel vpliva (as490) [1].
Čeprav so vsi konstrukti vsebovali protismerno zaporedje, ki cilja vezavno mesto za RNazo E na diaforazono mRNA, so bili vplivi konstruktov raznoliki. Rezultati so lahko posledica prisotnosti več vezavnih mest za RNazo E, poleg tega pa uporabljen sev E.coli lahko metabolizira induktor Ara in s tem zniža izražanje sRNA [1].

== Zaključek ==
Naravne in sintetične sRNA imajo velik potencial v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, saj omogočajo regulacijo izražanja genov brez popolnega izbitja gena, preko induciranega izražanja sRNA pa se lahko uvede še večji nadzor nad regulacijo izražanja tarčenga gena. So majhne, kar omogoča izražanje več sRNA iz istega plazmida. Tannaiche et al so prvič pokazali, da s sRNA lahko selektivno tudi zvišamo izražanje tarčnega gena v CFS. Poleg tega pa so pokazali, da se lahko sRNA prilagodi na različne sisteme in na regulacijo različnih proteinov [1].

== Literatura ==
[1] Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324. doi:10.1002/btpr.3324

[2] Storz G, Vogel J, Wassarman, K M. Regulation by Small RNAs in Bacteria: Expanding Frontiers. Molecular Cell. 2011. 43(6), 880–891.doi:10.1016/j.molcel.2011.08.022

[3] NUPACK. https://www.nupack.org (nazadnje dostopano 14. 5. 2023 dostopano)

[4] AG Scientific: Diaohorase Enzymes – Why are they? https://agscientific.com/blog/all-about-diaphorase-enzymes.html (nazadnje dostopano 14.5.2023)

Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu

2023-05-14T17:27:38Z

Anagodesa: /* Optimizacija indukcije s plazmidom pART15-C1 in -C2 (in vivo) */

"Povzeto po članku [https://aiche.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/btpr.3324 Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324.]”

== Uvod ==

Nekodirajoče bakterijske RNA, med katere spada mala RNA (sRNA – angl. small) postajajo pomembno orodje v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, ker omogočajo regulacijo izražanje genov brez popolnega izbijta gena. Z nepopolnim parjenjem baz se sRNA veže na mRNA, pogosto v bližino ribosom-vezavnega mesta (RBS) ali pa prepreči/ojača vezavo na ribosom preko drugih mehanizmov [1,2].
Tehnologija sRNA se uporablja za detekcijo metabolnega stanja, uravnovešenja metabolnih poti, za kontrolo izražanja toksinov, za izboljšanje izkoristka in zmanjšanja količine stranskih produktov [1].
Večina aplikacij sRNA se izvaja v živih celicah. Vendar ima tak pristop kar nekaj pomanjkljivosti kot so kompleksnost sistema, selektivna indukcija, naravna variabilnost, težave pri standardizaciji in neponovljivost rezultatov. Zato se razvija brezcelične sisteme (cell-free systems – CFS), ki vsebujejo celično komponente in vitro. Delo v brezceličnih sistemih je bolj fleksibilno, možen je večji nadzor nad modifikacijami transkripcije/translacije, lahko se proizvede večje količine produktov, višja je toleranca za toksične substrate/produkte/intermediate, lažje je čiščenje produktov [1].
Tannaiche et al so se ukvarjali z ugotavljanjem vpliva sRNA na izražanje fluorescenčnega barvila Anemonia majano cyan (''AmCyan'') ter encima diaforaza. Razvili so sRNA, ki poleg utišanja genov omogoča tudi prekomerno izražanje tarčnega proteina, kar do tedaj še ni bilo zabeleženo. Testiranje so najprej izvedli in vivo, vendar so zaradi nekonsistentnih rezultatov prešli na brezcelični sistem [1].

== Konstrukcija sRNA in plazmidov v sistemu z reporterjem ''AmCyan'' ==
'''Sintetični konstrukt sRNA''' je dolg 48 nukleotidov in je sestavljen iz treh delov. Zaporedje na 5' koncu tvori steblo-zanko, s čemer stabilizira RNA in omogoča interakcijo sRNA-mRNA (14 nk). Temu sledi 20 nukleotidov dolgo protismerno zaporedje za tarčno mRNA. Na 3' koncu sRNA je še terminator v obliki stebla-zanke (14 nk). Naredili so 12 različnih konstruktov sRNA, ki ciljajo različne dele ''AmCyan'' mRNA[1].

'''Plazmidi za testiranja sistema z reporterjem ''AmCyan'''''
Uporabili so štiri različne plazmide. Prvi je pART15-C1 in vsebuje zapis za reporterski ''AmCyan'' pod inducibilnim arabinoznim promotorjem. Drugi uporabljen plazmid je pART15-C2, ki ima zapis za reporter ''AmCyan'' pod kontrolo promotorja tetraciklinskegain omogoča relativno določitev izražanja sRNA. Plazmid pART15-C1-LacZ ima sRNA konstrukt substituiran z lacZ in omogoča modro-beli test po transformaciji bakterij. Zadnji plazmid je pART15-AS, ki vsebuje gen za reporter ''AmCyan'' pod kontrolo arabinoznega promotorja in zaporedje za sRNA pod kontrolo tetracikilinskega promotorja [1].
Sestavljanje konstrukta je potekalo s sestavljanjem po Gibosonu in gama-PCR.

== Optimizacija indukcije s plazmidom pART15-C1 in -C2 (in vivo) ==
Za oceno izražanja reporterja ''AmCyan'' in sRNA v odvisnosti od koncentracije induktorjev so uporabili kontrolna plazmida pART15-C1 in pART15-C2 in z njima transfecirali sev ''Escehrichia coli'' 10-beta. Merili so fluorescenco ''AmCyan'' pri različni koncentracijah induktorjev arabinoze (Ara) in anhidrotetraciklina (ATc) [1].
Med koncentracijo Ara oz. ATc in intenziteto fluorescence je bil opažen linearen odnos. S tem so pokazali, da se izražanje fluorescentnega reporterja in sRNA uravnava čez široko koncentracijsko območje induktorjev [1].

== Vpliv sRNA na izražanje reporterja ''AmCyan'' (in vivo) ==

Testirali so 12 različnih protismernih zaporedji s transformacijo seva ''E. coli'' 10- beta s plazmidom pART15-AS in merili fluorescenco celic v treh časovnih točkah (6, 18, 29 h) [1].
V prvem in vivo sistemu so pokazali, da je ciljanje RBS in prvih 20 baz mRNA reporterja ''AmCyan'' povzročilo signifikantno znižanje izražanja do 10% v 29 urah. Še bolj signifikantno znižanje izražanja reporterja je bilo prisotno pri ciljanju visoko-energijskega stebelnega dela sekundarne strukture mRNA (asB430), kjer so v šestih urah dosegli 25% utišanje. Ostale sRNA, ki ciljajo druge regije iniciacije translacija so dosegle signifikantno znižanja izražanja šele po dolgem času gojenja. Ciljanje visoko-energijskega stebla, ki je bolj oddaljen od mesta začetka translacije (asB407 in asB539) je v nekaterih primerih signifikantno znižalo fluorescenco, v drugih pa ne. Pri poskusu z asB606, ki cilja nizko-energijsko steblo, so izmerili signifikantno povišanje fluorescence pri 18h, vendar pri 29h signifikantnega povišanja ni bilo več prisotnega [1].
Čeprav so v in vivo sitemu dokazali nekaj signifikantnih sprememb izražanja reporterskega proteina, so rezultati zelo variirali, kar je verjetno posledica kompleksnosti živih celic. Zato so poskuse nadaljevali v brezceličnem sistemu [1].

== Brezcelični sistem (CFS) ==

CFS sistem so pripravili s sonifikacijo celice, ki so bile predhodno transformirane s plazmidom pART15-AS in nato inducirali izraženje z Ara in ATc. Tako kot in vivo so najprej potrdili, da je odnos med intenziteto fluorescence in koncentracijo induktorja (Ara in ATc) linearen. Indukcija je bila dosežena po 24h, maksimum pa je fluorescenca dosegla po 96 urah. Rezultati so bili v CFS veliko bolj konsistentni kot in vivo, poleg tega pa je bilo prisotnih več signifikantnih rezultatov [1].

=== Vpliv sRNA na izražanje reporterja ''AmCyan'' ===

Ciljanje RBS v sistemu CFS ni povzročilo znižanja fluorescence, ciljanje prvih 20 nk pa je ravni izražanja znižalo bolj kot in vivo. S ciljanjem sekundarnih struktur mRNA so dosegli še močnejše utišanje; ciljanje visoko-energijskega stebla je povzročilo kar 65% utišanje, ciljanje 3' konca mRNA (asB701) pa je utišalo izražanje za kar 70% (in vivo le 19%). Pri ciljanju nizko-energijskega stebla (asB606) pa so dobili presenetljive rezultate, ki drugje v literaturi niso zabeleženi, in sicer je prišlo do signifikantnega zvišanja fluorescence za več kot 66%. Pri ciljanju drugega dela nizko-energijskega stebla (asB615) se je fluorescenca znižala [1].

=== Vpliv sRNA, odvisne od Hfq, na izražanje reporterja ''AmCyan'' ===
Nadaljnjo jih je zanimalo, ali lahko rezultate reproducirajo z uporabo sRNA, ki je odvisna od Hfq. V ostalih poskusih so namreč uporabljali sintetično sRNA, ki ni odvisna od Hfn. Uporabili so naravno pristno sRNA MicC, ki je vpletena v utišanje proteina zunanje membrane OmpC v ''E. coli'' in izkazuje visoke ravni utišanja genov. Protein Hfq deluje kot RNA šaperon MicC [1].
K ogrodju MicC so dodali ista protismerna zaporedja kot pri od-Hfq-neodvisni sRNA. Ciljanje prvih 20 nk mRNA s MicC-asB1 je vodilo v znižanje fluorescence, ki je bilo večje kot pri uporabi od-Hfq-neodvisne asRNA. Pri testiranju z MicC-asB606 ni bilo spremembe fluorescence, medtem ko je bilo pri sintetičnem ogrodju zvišanje flourescence kar 65%. Ciljanje RBS z MicC-asRBS je povzročilo zvišanje flourescence, kar se ne sklada z objavljenimi rezultati drugih v vivo študij, vendar so v nadaljevanju študije tudi ta pojav pojasnili [1].

== Določanje mehanizma delovanja sRNA asB606 in MicC-asRBS z NUPACK in catRAPID ==

Za določanje mehanizma, ki povzroči prekomerno izražanje z asB606 sRNA, so za analizo uporabili program NUPACK, s katerim se lahko načrtuje in analizira strukture ter sisteme nukleinskih kislin [1,3]. Ugotovili so, da se asB606 veže na bazne pare 606-615 na ''AmCyan'' mRNA, ki tvorijo začetni del stebla-zanke zaščitenega 3' konca To mesto pa je tudi prepoznavno mesto za RNaza E, ki po prepoznavi cepi ''AmCyan'' mRNA. Vezava sRNA na to mesto oteži prepoznavo mRNA z RNazo E in s tem prepreči cepitev in posledično podaljša razpolovno dobo mRNA, kar vodi v zvišanje izražanja ''AmCyan'' in povišanja fluorescence. Vezavni potencial med RNazo E in ''AmCyan'' mRNA, določen s programom catRAPID, je bil v regiji 500-600 visok, kar pa še dodatno podpira teorijo, da sRNA asB606 zakrije prepoznavno mesto za RNazo E [1].
Z analizo NUPACK so analizirali tudi zvišano izražanje z MicC-asRBS, kjer takšnih rezultatov niso pričakovali. V nativni ''AmCyan'' mRNA je 5' konec zvit v stebelno sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo. Vezava MicC-asRNA na mRNA prepreči nastanek takšne sekundarne strukture, s tem pa “sprosti” RBS in omogoči vezavo na ribosom [1].

== Regulacija izražnja diaforaze s sRNA in vitro ==
Diaforaza je topna NAD(P)H dehidrogenaza, ki je vpletena v nastanek NADH in NADPH v anaerobnih pogojih [1,4]. Uporablja se v sinteznih encimskih poteh za produkcijo visoko-vrednih kemikalij, zato je zvišano izražanje tega encima tudi zanimivo in uporabno [1].
Z uporabo catRAPID so predvideli vezavna mesta za RNazo E na diaforazni mRNA in identificirali štiri tarčna mesta za sRNA, ki se nahajajo v bližini stebelnih zank in vezava, na katera bi lahko povzročilo zvišano izražanje [1].
Protismerna zaporedja, ki so bila del sRNA, so klonirali v plazmid pBAD-LIC in z njim transformirali sev ''E.coli'' BL21 Star (DE3). Brezcelični sistem so naredili s hkratno sonifikacijo kultur ''E.coli'' , ene, ki vsebuje zapis za diaforazo in druge z rekobinanitim plazmidom pBAD-AS [1].
Dva konstrukta (as410, as528) sta signifiakntno povečal izražanje diaforaze, en je dosegel zelo nizko povečanje (as510), zadnji pa je v enem replikat povišal izražanje, v drugih pa ni imel vpliva (as490) [1].
Čeprav so vsi konstrukti vsebovali protismerno zaporedje, ki cilja vezavno mesto za RNazo E na diaforazono mRNA, so bili vplivi konstruktov raznoliki. Rezultati so lahko posledica prisotnosti več vezavnih mest za RNazo E, poleg tega pa uporabljen sev E.coli lahko metabolizira induktor Ara in s tem zniža izražanje sRNA [1].

== Zaključek ==
Naravne in sintetične sRNA imajo velik potencial v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, saj omogočajo regulacijo izražanja genov brez popolnega izbitja gena, preko induciranega izražanja sRNA pa se lahko uvede še večji nadzor nad regulacijo izražanja tarčenga gena. So majhne, kar omogoča izražanje več sRNA iz istega plazmida. Tannaiche et al so prvič pokazali, da s sRNA lahko selektivno tudi zvišamo izražanje tarčnega gena v CFS. Poleg tega pa so pokazali, da se lahko sRNA prilagodi na različne sisteme in na regulacijo različnih proteinov [1].

== Literatura ==
[1] Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324. doi:10.1002/btpr.3324

[2] Storz G, Vogel J, Wassarman, K M. Regulation by Small RNAs in Bacteria: Expanding Frontiers. Molecular Cell. 2011. 43(6), 880–891.doi:10.1016/j.molcel.2011.08.022

[3] NUPACK. https://www.nupack.org (nazadnje dostopano 14. 5. 2023 dostopano)

[4] AG Scientific: Diaohorase Enzymes – Why are they? https://agscientific.com/blog/all-about-diaphorase-enzymes.html (nazadnje dostopano 14.5.2023)

Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu

2023-05-14T17:27:13Z

Anagodesa: /* Konstrukcija sRNA in plazmidov v sistemu z reporterjem AmCyan */

"Povzeto po članku [https://aiche.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/btpr.3324 Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324.]”

== Uvod ==

Nekodirajoče bakterijske RNA, med katere spada mala RNA (sRNA – angl. small) postajajo pomembno orodje v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, ker omogočajo regulacijo izražanje genov brez popolnega izbijta gena. Z nepopolnim parjenjem baz se sRNA veže na mRNA, pogosto v bližino ribosom-vezavnega mesta (RBS) ali pa prepreči/ojača vezavo na ribosom preko drugih mehanizmov [1,2].
Tehnologija sRNA se uporablja za detekcijo metabolnega stanja, uravnovešenja metabolnih poti, za kontrolo izražanja toksinov, za izboljšanje izkoristka in zmanjšanja količine stranskih produktov [1].
Večina aplikacij sRNA se izvaja v živih celicah. Vendar ima tak pristop kar nekaj pomanjkljivosti kot so kompleksnost sistema, selektivna indukcija, naravna variabilnost, težave pri standardizaciji in neponovljivost rezultatov. Zato se razvija brezcelične sisteme (cell-free systems – CFS), ki vsebujejo celično komponente in vitro. Delo v brezceličnih sistemih je bolj fleksibilno, možen je večji nadzor nad modifikacijami transkripcije/translacije, lahko se proizvede večje količine produktov, višja je toleranca za toksične substrate/produkte/intermediate, lažje je čiščenje produktov [1].
Tannaiche et al so se ukvarjali z ugotavljanjem vpliva sRNA na izražanje fluorescenčnega barvila Anemonia majano cyan (''AmCyan'') ter encima diaforaza. Razvili so sRNA, ki poleg utišanja genov omogoča tudi prekomerno izražanje tarčnega proteina, kar do tedaj še ni bilo zabeleženo. Testiranje so najprej izvedli in vivo, vendar so zaradi nekonsistentnih rezultatov prešli na brezcelični sistem [1].

== Konstrukcija sRNA in plazmidov v sistemu z reporterjem ''AmCyan'' ==
'''Sintetični konstrukt sRNA''' je dolg 48 nukleotidov in je sestavljen iz treh delov. Zaporedje na 5' koncu tvori steblo-zanko, s čemer stabilizira RNA in omogoča interakcijo sRNA-mRNA (14 nk). Temu sledi 20 nukleotidov dolgo protismerno zaporedje za tarčno mRNA. Na 3' koncu sRNA je še terminator v obliki stebla-zanke (14 nk). Naredili so 12 različnih konstruktov sRNA, ki ciljajo različne dele ''AmCyan'' mRNA[1].

'''Plazmidi za testiranja sistema z reporterjem ''AmCyan'''''
Uporabili so štiri različne plazmide. Prvi je pART15-C1 in vsebuje zapis za reporterski ''AmCyan'' pod inducibilnim arabinoznim promotorjem. Drugi uporabljen plazmid je pART15-C2, ki ima zapis za reporter ''AmCyan'' pod kontrolo promotorja tetraciklinskegain omogoča relativno določitev izražanja sRNA. Plazmid pART15-C1-LacZ ima sRNA konstrukt substituiran z lacZ in omogoča modro-beli test po transformaciji bakterij. Zadnji plazmid je pART15-AS, ki vsebuje gen za reporter ''AmCyan'' pod kontrolo arabinoznega promotorja in zaporedje za sRNA pod kontrolo tetracikilinskega promotorja [1].
Sestavljanje konstrukta je potekalo s sestavljanjem po Gibosonu in gama-PCR.

== Optimizacija indukcije s plazmidom pART15-C1 in -C2 (in vivo) ==
Za oceno izražanja reporterja ''AmCyan'' in sRNA v odvisnosti od koncentracije induktorjev so uporabili kontrolna plazmida pART15-C1 in pART15-C2 in z njima transfecirali sev ''Escehrichia coli'' 10-beta. Merili so fluorescenco ''AmCyan'' pri različni koncentracijah induktorjev arabinoze (Ara) in anhidrotetraciklina (ATc) [1].
Med koncentracijo Ara oz. ATc in intenziteto fluorescence je bil opažen linearen odnos. S tem so pokazali, da se izražanje fluorescentnega reporterja in sRNA uravnava čez široko koncentarcijsko območje induktorjev [1].

== Vpliv sRNA na izražanje reporterja ''AmCyan'' (in vivo) ==

Testirali so 12 različnih protismernih zaporedji s transformacijo seva ''E. coli'' 10- beta s plazmidom pART15-AS in merili fluorescenco celic v treh časovnih točkah (6, 18, 29 h) [1].
V prvem in vivo sistemu so pokazali, da je ciljanje RBS in prvih 20 baz mRNA reporterja ''AmCyan'' povzročilo signifikantno znižanje izražanja do 10% v 29 urah. Še bolj signifikantno znižanje izražanja reporterja je bilo prisotno pri ciljanju visoko-energijskega stebelnega dela sekundarne strukture mRNA (asB430), kjer so v šestih urah dosegli 25% utišanje. Ostale sRNA, ki ciljajo druge regije iniciacije translacija so dosegle signifikantno znižanja izražanja šele po dolgem času gojenja. Ciljanje visoko-energijskega stebla, ki je bolj oddaljen od mesta začetka translacije (asB407 in asB539) je v nekaterih primerih signifikantno znižalo fluorescenco, v drugih pa ne. Pri poskusu z asB606, ki cilja nizko-energijsko steblo, so izmerili signifikantno povišanje fluorescence pri 18h, vendar pri 29h signifikantnega povišanja ni bilo več prisotnega [1].
Čeprav so v in vivo sitemu dokazali nekaj signifikantnih sprememb izražanja reporterskega proteina, so rezultati zelo variirali, kar je verjetno posledica kompleksnosti živih celic. Zato so poskuse nadaljevali v brezceličnem sistemu [1].

== Brezcelični sistem (CFS) ==

CFS sistem so pripravili s sonifikacijo celice, ki so bile predhodno transformirane s plazmidom pART15-AS in nato inducirali izraženje z Ara in ATc. Tako kot in vivo so najprej potrdili, da je odnos med intenziteto fluorescence in koncentracijo induktorja (Ara in ATc) linearen. Indukcija je bila dosežena po 24h, maksimum pa je fluorescenca dosegla po 96 urah. Rezultati so bili v CFS veliko bolj konsistentni kot in vivo, poleg tega pa je bilo prisotnih več signifikantnih rezultatov [1].

=== Vpliv sRNA na izražanje reporterja ''AmCyan'' ===

Ciljanje RBS v sistemu CFS ni povzročilo znižanja fluorescence, ciljanje prvih 20 nk pa je ravni izražanja znižalo bolj kot in vivo. S ciljanjem sekundarnih struktur mRNA so dosegli še močnejše utišanje; ciljanje visoko-energijskega stebla je povzročilo kar 65% utišanje, ciljanje 3' konca mRNA (asB701) pa je utišalo izražanje za kar 70% (in vivo le 19%). Pri ciljanju nizko-energijskega stebla (asB606) pa so dobili presenetljive rezultate, ki drugje v literaturi niso zabeleženi, in sicer je prišlo do signifikantnega zvišanja fluorescence za več kot 66%. Pri ciljanju drugega dela nizko-energijskega stebla (asB615) se je fluorescenca znižala [1].

=== Vpliv sRNA, odvisne od Hfq, na izražanje reporterja ''AmCyan'' ===
Nadaljnjo jih je zanimalo, ali lahko rezultate reproducirajo z uporabo sRNA, ki je odvisna od Hfq. V ostalih poskusih so namreč uporabljali sintetično sRNA, ki ni odvisna od Hfn. Uporabili so naravno pristno sRNA MicC, ki je vpletena v utišanje proteina zunanje membrane OmpC v ''E. coli'' in izkazuje visoke ravni utišanja genov. Protein Hfq deluje kot RNA šaperon MicC [1].
K ogrodju MicC so dodali ista protismerna zaporedja kot pri od-Hfq-neodvisni sRNA. Ciljanje prvih 20 nk mRNA s MicC-asB1 je vodilo v znižanje fluorescence, ki je bilo večje kot pri uporabi od-Hfq-neodvisne asRNA. Pri testiranju z MicC-asB606 ni bilo spremembe fluorescence, medtem ko je bilo pri sintetičnem ogrodju zvišanje flourescence kar 65%. Ciljanje RBS z MicC-asRBS je povzročilo zvišanje flourescence, kar se ne sklada z objavljenimi rezultati drugih v vivo študij, vendar so v nadaljevanju študije tudi ta pojav pojasnili [1].

== Določanje mehanizma delovanja sRNA asB606 in MicC-asRBS z NUPACK in catRAPID ==

Za določanje mehanizma, ki povzroči prekomerno izražanje z asB606 sRNA, so za analizo uporabili program NUPACK, s katerim se lahko načrtuje in analizira strukture ter sisteme nukleinskih kislin [1,3]. Ugotovili so, da se asB606 veže na bazne pare 606-615 na ''AmCyan'' mRNA, ki tvorijo začetni del stebla-zanke zaščitenega 3' konca To mesto pa je tudi prepoznavno mesto za RNaza E, ki po prepoznavi cepi ''AmCyan'' mRNA. Vezava sRNA na to mesto oteži prepoznavo mRNA z RNazo E in s tem prepreči cepitev in posledično podaljša razpolovno dobo mRNA, kar vodi v zvišanje izražanja ''AmCyan'' in povišanja fluorescence. Vezavni potencial med RNazo E in ''AmCyan'' mRNA, določen s programom catRAPID, je bil v regiji 500-600 visok, kar pa še dodatno podpira teorijo, da sRNA asB606 zakrije prepoznavno mesto za RNazo E [1].
Z analizo NUPACK so analizirali tudi zvišano izražanje z MicC-asRBS, kjer takšnih rezultatov niso pričakovali. V nativni ''AmCyan'' mRNA je 5' konec zvit v stebelno sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo. Vezava MicC-asRNA na mRNA prepreči nastanek takšne sekundarne strukture, s tem pa “sprosti” RBS in omogoči vezavo na ribosom [1].

== Regulacija izražnja diaforaze s sRNA in vitro ==
Diaforaza je topna NAD(P)H dehidrogenaza, ki je vpletena v nastanek NADH in NADPH v anaerobnih pogojih [1,4]. Uporablja se v sinteznih encimskih poteh za produkcijo visoko-vrednih kemikalij, zato je zvišano izražanje tega encima tudi zanimivo in uporabno [1].
Z uporabo catRAPID so predvideli vezavna mesta za RNazo E na diaforazni mRNA in identificirali štiri tarčna mesta za sRNA, ki se nahajajo v bližini stebelnih zank in vezava, na katera bi lahko povzročilo zvišano izražanje [1].
Protismerna zaporedja, ki so bila del sRNA, so klonirali v plazmid pBAD-LIC in z njim transformirali sev ''E.coli'' BL21 Star (DE3). Brezcelični sistem so naredili s hkratno sonifikacijo kultur ''E.coli'' , ene, ki vsebuje zapis za diaforazo in druge z rekobinanitim plazmidom pBAD-AS [1].
Dva konstrukta (as410, as528) sta signifiakntno povečal izražanje diaforaze, en je dosegel zelo nizko povečanje (as510), zadnji pa je v enem replikat povišal izražanje, v drugih pa ni imel vpliva (as490) [1].
Čeprav so vsi konstrukti vsebovali protismerno zaporedje, ki cilja vezavno mesto za RNazo E na diaforazono mRNA, so bili vplivi konstruktov raznoliki. Rezultati so lahko posledica prisotnosti več vezavnih mest za RNazo E, poleg tega pa uporabljen sev E.coli lahko metabolizira induktor Ara in s tem zniža izražanje sRNA [1].

== Zaključek ==
Naravne in sintetične sRNA imajo velik potencial v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, saj omogočajo regulacijo izražanja genov brez popolnega izbitja gena, preko induciranega izražanja sRNA pa se lahko uvede še večji nadzor nad regulacijo izražanja tarčenga gena. So majhne, kar omogoča izražanje več sRNA iz istega plazmida. Tannaiche et al so prvič pokazali, da s sRNA lahko selektivno tudi zvišamo izražanje tarčnega gena v CFS. Poleg tega pa so pokazali, da se lahko sRNA prilagodi na različne sisteme in na regulacijo različnih proteinov [1].

== Literatura ==
[1] Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324. doi:10.1002/btpr.3324

[2] Storz G, Vogel J, Wassarman, K M. Regulation by Small RNAs in Bacteria: Expanding Frontiers. Molecular Cell. 2011. 43(6), 880–891.doi:10.1016/j.molcel.2011.08.022

[3] NUPACK. https://www.nupack.org (nazadnje dostopano 14. 5. 2023 dostopano)

[4] AG Scientific: Diaohorase Enzymes – Why are they? https://agscientific.com/blog/all-about-diaphorase-enzymes.html (nazadnje dostopano 14.5.2023)

Seminarji SB 2022/23

2023-05-14T11:11:09Z

Anagodesa:

V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br>
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_tumor_ciljajočih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_dušikov(II)_oksid Priprava tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljeni_ribocim%2C_ki_signale_nativnih_RNA_pove%C5%BEe_z_ortogonalnimi_proteinskimi_izhodnimi_signali Razcepljeni ribocim, ki signale nativnih RNA poveže z ortogonalnimi proteinskimi izhodnimi signali] (Ajda Beltram)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_nadzor_%C5%A1tevila_plazmidov_v_celici_%28Tulip%29 Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)] (Gregor Strniša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Skupnostna_znanost_je_na%C4%8Drtovala_ribosome_s_koristnimi_fenotipi Skupnostna znanost je načrtovala ribosome s koristnimi fenotipi] (Tanja Gošnjak)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pristop_sintezne_biologije_za_načrtovanje_kandidata_za_cepivo_proti_delta_različici_SARSCoV2_je_razkril_prekinitev_favoriziranega_para_kodonov_kot_boljšo_strategijo_pred_uporabo_redkih_kodonov Pristop sintezne biologije za načrtovanje kandidata za cepivo proti delta različici SARS-CoV-2 je razkril prekinitev favoriziranega para kodonov kot boljšo strategijo pred uporabo redkih kodonov] (Stefanija Ivanova)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Dvosmerni_hibridni_eritritol_–_inducibilni_promotor_za_sintezno_biologijo_v_Yarrowia_lipolytica Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v ''Yarrowia lipolytica''] (Maša Andoljšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Utišanje_izražanja_genov_s_strukturo_definirano_zankasto_strukturo_male_nekodirajoče_RNA_s_programiranimi_regulatornimi_aktivnostmi Utišanje izražanja genov s strukturno definirano zankasto strukturo male nekodirajoče RNA s programiranimi regulatornimi aktivnostmi] (Nika Bedrač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izbolj%C5%A1anje_evolucijske_stabilnosti_obremenjujo%C4%8Dih_in_toksi%C4%8Dnih_funkcij_v_E.coli_z_diferenciacijskim_genetskim_vezjem_posredovanim_z_integrazo Izboljšanje evolucijske stabilnosti obremenjujočih in toksičnih funkcij v E.coli z diferenciacijskim genetskim vezjem posredovanim z integrazo] (Nika Banovšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_sintetična_mala_RNA%2C_ki_promovira_prekomerno_izražanje_proteinov_v_brezceličnem_sistemu Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brez-celičnem sistemu] (Ana Godeša)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NETLANTIS NETLANTIS] (Maša Gabrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BINANOX BINANOX] (Vivian Nemanič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CoBiota CoBiota] (Petra Sintič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sporadicate Sporadicate] (Gašper Možina)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].

Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu

2023-05-14T09:54:00Z

Anagodesa:

"Povzeto po članku [https://aiche.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/btpr.3324 Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324.]”

== Uvod ==

Nekodirajoče bakterijske RNA, med katere spada mala RNA (sRNA – angl. small) postajajo pomembno orodje v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, ker omogočajo regulacijo izražanje genov brez popolnega izbijta gena. Z nepopolnim parjenjem baz se sRNA veže na mRNA, pogosto v bližino ribosom-vezavnega mesta (RBS) ali pa prepreči/ojača vezavo na ribosom preko drugih mehanizmov [1,2].
Tehnologija sRNA se uporablja za detekcijo metabolnega stanja, uravnovešenja metabolnih poti, za kontrolo izražanja toksinov, za izboljšanje izkoristka in zmanjšanja količine stranskih produktov [1].
Večina aplikacij sRNA se izvaja v živih celicah. Vendar ima tak pristop kar nekaj pomanjkljivosti kot so kompleksnost sistema, selektivna indukcija, naravna variabilnost, težave pri standardizaciji in neponovljivost rezultatov. Zato se razvija brezcelične sisteme (cell-free systems – CFS), ki vsebujejo celično komponente in vitro. Delo v brezceličnih sistemih je bolj fleksibilno, možen je večji nadzor nad modifikacijami transkripcije/translacije, lahko se proizvede večje količine produktov, višja je toleranca za toksične substrate/produkte/intermediate, lažje je čiščenje produktov [1].
Tannaiche et al so se ukvarjali z ugotavljanjem vpliva sRNA na izražanje fluorescenčnega barvila Anemonia majano cyan (''AmCyan'') ter encima diaforaza. Razvili so sRNA, ki poleg utišanja genov omogoča tudi prekomerno izražanje tarčnega proteina, kar do tedaj še ni bilo zabeleženo. Testiranje so najprej izvedli in vivo, vendar so zaradi nekonsistentnih rezultatov prešli na brezcelični sistem [1].

== Konstrukcija sRNA in plazmidov v sistemu z reporterjem ''AmCyan'' ==
'''Sintetični konstrukt sRNA''' je dolg 48 nukleotidov in je sestavljen iz treh delov. Zaporedje na 5' koncu tvori steblo-zanko, s čemer stabilizira RNA in omogoča interakcijo sRNA-mRNA (14 nk). Temu sledi 20 nukleotidov dolgo protismerno zaporedje za tarčno mRNA. Na 3' koncu sRNA je še terminator v obliki stebla-zanke (14 nk). Naredili so 12 različnih konstruktov sRNA, ki ciljajo različne dele ''AmCyan'' mRNA[1].

'''Plazmidi za testiranja sistema z reporterjem ''AmCyan'''''
Uporabili so štiri različne plazmide. Prvi je pART15-C1 in vsebuje zapis za reporterski ''AmCyan'' pod inducibilnim promotorjem PBAD. Drugi uporabljen plazmid je pART15-C2, ki ima zapis za reporter ''AmCyan'' pod kontrolo promotorja PLtetO-1 in omogoča relativno določitev izražanja sRNA. Plazmid pART15-C1-LacZ ima sRNA konstrukt substituiran z lacZ in omogoča modro-beli test po transformaciji bakterij. Zadnji plazmid je pART15-AS, ki vsebuje gen za reporter ''AmCyan'' pod kontrolo promotorja PBAD in zaporedje za sRNA pod kontrolo promotorja PLtet-O [1].
Sestavljanje konstrukta je potekalo s sestavljanjem po Gibosonu in gama-PCR.

== Optimizacija indukcije s plazmidom pART15-C1 in -C2 (in vivo) ==
Za oceno izražanja reporterja ''AmCyan'' in sRNA v odvisnosti od koncentracije induktorjev so uporabili kontrolna plazmida pART15-C1 in pART15-C2 in z njima transfecirali sev ''Escehrichia coli'' 10-beta. Merili so fluorescenco ''AmCyan'' pri različni koncentracijah induktorjev arabinoze (Ara) in anhidrotetraciklina (ATc) [1].
Med koncentracijo Ara oz. ATc in intenziteto fluorescence je bil opažen linearen odnos. S tem so pokazali, da se izražanje fluorescentnega reporterja in sRNA uravnava čez široko koncentarcijsko območje induktorjev [1].

== Vpliv sRNA na izražanje reporterja ''AmCyan'' (in vivo) ==

Testirali so 12 različnih protismernih zaporedji s transformacijo seva ''E. coli'' 10- beta s plazmidom pART15-AS in merili fluorescenco celic v treh časovnih točkah (6, 18, 29 h) [1].
V prvem in vivo sistemu so pokazali, da je ciljanje RBS in prvih 20 baz mRNA reporterja ''AmCyan'' povzročilo signifikantno znižanje izražanja do 10% v 29 urah. Še bolj signifikantno znižanje izražanja reporterja je bilo prisotno pri ciljanju visoko-energijskega stebelnega dela sekundarne strukture mRNA (asB430), kjer so v šestih urah dosegli 25% utišanje. Ostale sRNA, ki ciljajo druge regije iniciacije translacija so dosegle signifikantno znižanja izražanja šele po dolgem času gojenja. Ciljanje visoko-energijskega stebla, ki je bolj oddaljen od mesta začetka translacije (asB407 in asB539) je v nekaterih primerih signifikantno znižalo fluorescenco, v drugih pa ne. Pri poskusu z asB606, ki cilja nizko-energijsko steblo, so izmerili signifikantno povišanje fluorescence pri 18h, vendar pri 29h signifikantnega povišanja ni bilo več prisotnega [1].
Čeprav so v in vivo sitemu dokazali nekaj signifikantnih sprememb izražanja reporterskega proteina, so rezultati zelo variirali, kar je verjetno posledica kompleksnosti živih celic. Zato so poskuse nadaljevali v brezceličnem sistemu [1].

== Brezcelični sistem (CFS) ==

CFS sistem so pripravili s sonifikacijo celice, ki so bile predhodno transformirane s plazmidom pART15-AS in nato inducirali izraženje z Ara in ATc. Tako kot in vivo so najprej potrdili, da je odnos med intenziteto fluorescence in koncentracijo induktorja (Ara in ATc) linearen. Indukcija je bila dosežena po 24h, maksimum pa je fluorescenca dosegla po 96 urah. Rezultati so bili v CFS veliko bolj konsistentni kot in vivo, poleg tega pa je bilo prisotnih več signifikantnih rezultatov [1].

=== Vpliv sRNA na izražanje reporterja ''AmCyan'' ===

Ciljanje RBS v sistemu CFS ni povzročilo znižanja fluorescence, ciljanje prvih 20 nk pa je ravni izražanja znižalo bolj kot in vivo. S ciljanjem sekundarnih struktur mRNA so dosegli še močnejše utišanje; ciljanje visoko-energijskega stebla je povzročilo kar 65% utišanje, ciljanje 3' konca mRNA (asB701) pa je utišalo izražanje za kar 70% (in vivo le 19%). Pri ciljanju nizko-energijskega stebla (asB606) pa so dobili presenetljive rezultate, ki drugje v literaturi niso zabeleženi, in sicer je prišlo do signifikantnega zvišanja fluorescence za več kot 66%. Pri ciljanju drugega dela nizko-energijskega stebla (asB615) se je fluorescenca znižala [1].

=== Vpliv sRNA, odvisne od Hfq, na izražanje reporterja ''AmCyan'' ===
Nadaljnjo jih je zanimalo, ali lahko rezultate reproducirajo z uporabo sRNA, ki je odvisna od Hfq. V ostalih poskusih so namreč uporabljali sintetično sRNA, ki ni odvisna od Hfn. Uporabili so naravno pristno sRNA MicC, ki je vpletena v utišanje proteina zunanje membrane OmpC v ''E. coli'' in izkazuje visoke ravni utišanja genov. Protein Hfq deluje kot RNA šaperon MicC [1].
K ogrodju MicC so dodali ista protismerna zaporedja kot pri od-Hfq-neodvisni sRNA. Ciljanje prvih 20 nk mRNA s MicC-asB1 je vodilo v znižanje fluorescence, ki je bilo večje kot pri uporabi od-Hfq-neodvisne asRNA. Pri testiranju z MicC-asB606 ni bilo spremembe fluorescence, medtem ko je bilo pri sintetičnem ogrodju zvišanje flourescence kar 65%. Ciljanje RBS z MicC-asRBS je povzročilo zvišanje flourescence, kar se ne sklada z objavljenimi rezultati drugih v vivo študij, vendar so v nadaljevanju študije tudi ta pojav pojasnili [1].

== Določanje mehanizma delovanja sRNA asB606 in MicC-asRBS z NUPACK in catRAPID ==

Za določanje mehanizma, ki povzroči prekomerno izražanje z asB606 sRNA, so za analizo uporabili program NUPACK, s katerim se lahko načrtuje in analizira strukture ter sisteme nukleinskih kislin [1,3]. Ugotovili so, da se asB606 veže na bazne pare 606-615 na ''AmCyan'' mRNA, ki tvorijo začetni del stebla-zanke zaščitenega 3' konca To mesto pa je tudi prepoznavno mesto za RNaza E, ki po prepoznavi cepi ''AmCyan'' mRNA. Vezava sRNA na to mesto oteži prepoznavo mRNA z RNazo E in s tem prepreči cepitev in posledično podaljša razpolovno dobo mRNA, kar vodi v zvišanje izražanja ''AmCyan'' in povišanja fluorescence. Vezavni potencial med RNazo E in ''AmCyan'' mRNA, določen s programom catRAPID, je bil v regiji 500-600 visok, kar pa še dodatno podpira teorijo, da sRNA asB606 zakrije prepoznavno mesto za RNazo E [1].
Z analizo NUPACK so analizirali tudi zvišano izražanje z MicC-asRBS, kjer takšnih rezultatov niso pričakovali. V nativni ''AmCyan'' mRNA je 5' konec zvit v stebelno sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo. Vezava MicC-asRNA na mRNA prepreči nastanek takšne sekundarne strukture, s tem pa “sprosti” RBS in omogoči vezavo na ribosom [1].

== Regulacija izražnja diaforaze s sRNA in vitro ==
Diaforaza je topna NAD(P)H dehidrogenaza, ki je vpletena v nastanek NADH in NADPH v anaerobnih pogojih [1,4]. Uporablja se v sinteznih encimskih poteh za produkcijo visoko-vrednih kemikalij, zato je zvišano izražanje tega encima tudi zanimivo in uporabno [1].
Z uporabo catRAPID so predvideli vezavna mesta za RNazo E na diaforazni mRNA in identificirali štiri tarčna mesta za sRNA, ki se nahajajo v bližini stebelnih zank in vezava, na katera bi lahko povzročilo zvišano izražanje [1].
Protismerna zaporedja, ki so bila del sRNA, so klonirali v plazmid pBAD-LIC in z njim transformirali sev ''E.coli'' BL21 Star (DE3). Brezcelični sistem so naredili s hkratno sonifikacijo kultur ''E.coli'' , ene, ki vsebuje zapis za diaforazo in druge z rekobinanitim plazmidom pBAD-AS [1].
Dva konstrukta (as410, as528) sta signifiakntno povečal izražanje diaforaze, en je dosegel zelo nizko povečanje (as510), zadnji pa je v enem replikat povišal izražanje, v drugih pa ni imel vpliva (as490) [1].
Čeprav so vsi konstrukti vsebovali protismerno zaporedje, ki cilja vezavno mesto za RNazo E na diaforazono mRNA, so bili vplivi konstruktov raznoliki. Rezultati so lahko posledica prisotnosti več vezavnih mest za RNazo E, poleg tega pa uporabljen sev E.coli lahko metabolizira induktor Ara in s tem zniža izražanje sRNA [1].

== Zaključek ==
Naravne in sintetične sRNA imajo velik potencial v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, saj omogočajo regulacijo izražanja genov brez popolnega izbitja gena, preko induciranega izražanja sRNA pa se lahko uvede še večji nadzor nad regulacijo izražanja tarčenga gena. So majhne, kar omogoča izražanje več sRNA iz istega plazmida. Tannaiche et al so prvič pokazali, da s sRNA lahko selektivno tudi zvišamo izražanje tarčnega gena v CFS. Poleg tega pa so pokazali, da se lahko sRNA prilagodi na različne sisteme in na regulacijo različnih proteinov [1].

== Literatura ==
[1] Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324. doi:10.1002/btpr.3324

[2] Storz G, Vogel J, Wassarman, K M. Regulation by Small RNAs in Bacteria: Expanding Frontiers. Molecular Cell. 2011. 43(6), 880–891.doi:10.1016/j.molcel.2011.08.022

[3] NUPACK. https://www.nupack.org (nazadnje dostopano 14. 5. 2023 dostopano)

[4] AG Scientific: Diaohorase Enzymes – Why are they? https://agscientific.com/blog/all-about-diaphorase-enzymes.html (nazadnje dostopano 14.5.2023)

Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu

2023-05-13T17:59:18Z

Anagodesa:

"Povzeto po članku [https://aiche.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/btpr.3324 Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324.]”

== Uvod ==

Nekodirajoče bakterijske RNA, med katere spada mala RNA (sRNA – angl. small) postajajo pomembno orodje v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, ker omogočajo regulacijo izražanje genov brez popolnega izbijta gena. Z nepopolnim parjenjem baz se sRNA veže na mRNA, pogosto v bližino ribosom-vezavnega mesta (RBS) ali pa prepreči/ojačajo vezavo na ribosom preko drugih mehanizmov [1,2].
Tehnologija sRNA se uporablja za detekcijo metabolnega stanja, uravnovešenja metabolnih poti, za kontrolo izražanja toksinov, za izboljšanje izkoristka in zmanjšanja količine stranskih produktov [1].
Večina aplikacij sRNA se izvaja v živih celicah. Vendar ima tak pristop kar nekaj pomanjkljivosti kot so kompleksnost sistema, selektivna indukcija, naravna variabilnost, težave pri standardizaciji in neponovljivost rezultatov. Zato se razvija brezcelične sisteme (cell-free systems – CFS), ki vsebujejo celično komponente in vitro. Z uporabo CSF se izognemo kompleksnosti živih celic, zato je delo v takih sistemih bolj fleksibilno, možen je večji nadzor nad modifikacijami transkripcije/translacije, lahko se proizvede večje količine produktov, višja je toleranca za toksične substrate/produkte/intermediate, lažje čiščenje produktov [1].
Tannaiche et al so se ukvarjali z ugotavljanjem vpliva sRNA na izražanje fluorescenčnega barvila Anemonia majano cyan (AmCyan) ter encima diaforaza. Razvili so sRNA, ki poleg utišanja genov omogoča tudi prekomerno izražanje tarčnega proteina, kar do tedaj še ni bilo zabeleženo. Testiranje so najprej izvedli in vivo, vendar so zaradi nekonsistentnih rezultatov prešli na brezcelični sistem [1].

== Konstrukcija sRNA in plazmidov v sistemu z reporterjem AmCyan ==
'''Sintetični konstrukt sRNA''' je dolg 48 nukleotidov in je sestavljen iz treh delov. Zaporedje na 5' koncu tvori steblo-zanko, s čemer stabilizira RNA in omogoča interakcijo sRNA-mRNA (14 nk). Temu sledi 20 nukleotidov dolgo protismerno zaporedje za tarčno mRNA, ki cilja različne dele AmCyan. Na 3' koncu sRNA je še terminator v obliki stebla-zanke (14 nk) [1].

'''Plazmidi za testiranja sistema z reporterjem AmCyan'''
Uporabili so štiri različne plazmide. Prvi je pART15-C1 vsebuje zapis za reporterski AmCyan pod inducibilnim promotrojem PBAD. Drugi uporabljen plazmid je pART15-C2, ki ima zapis za reporter AmCyan pod kontrolo promotorja PLtetO-1 in omogoča relativno določitev izražanja sRNA. Plazmid pART15-C1-LacZ ima sRNA konstrukt substituiran z lacZ in omogoča modro-beli test po transformaciji bakterij. Zadnji plazmid je pART15-AS, ki vsebuje gen za reporter AmCyan pod kontrolo promotorja PBAD in zaporedje za sRNA pod kontrolo promotorja PLtet-O [1].
Sestavljanje konstrukta je potekalo sestavljanjem po Gibosonu in gama-PCR.

== Optimizacija indukcije s plazmidom pART15-C1 in -C2 (in vivo) ==
Za oceno izražanja reporterja AmCyan in sRNA v odvisnosti od koncentracije induktorjev so uporabili dva kontrolna plazmida: pART15-C1 in pART15-C2 in z njima transfecirali sev ''Escehrichia coli'' 10-beta. Merili so fluorescenco AmCyan pri različni koncentracijah induktorjev arabinoze (Ara) in anhidrotetraciklina (ATc) [1].
Med koncentracijo Ara oz. ATc in intenziteto fluorescence je bil opažen linearen odnos. S tem so pokazali, da se izražanje fluorescentnega reporterja in sRNA uravnava čez široko koncentarcijsko območje induktorjev [1].

== Vpliv sRNA na izražanje reporterja AmCyan (in vivo) ==

Testirali so 12 različnih protismernih zaporedji s transformacijo seva ''E. coli'' 10- beta s plazmidom pART15-AS in merili fluorescenco celic v treh časovnih točkah (6, 18, 29 h) [1].
V prvem in vivo sistemu so pokazali, da je ciljanje RBS in prvih 20 baz mRNA reporterja AmCyan povzročilo signifikantno znižanje izražanja do 10% v 29 urah. Še bolj signifikantno znižanje izražanja reporterja je bilo prisotno pri ciljanju visoko-energijskega stebelnega dela sekundarne strukture mRNA (asB430), kjer so v šestih urah dosegli 25% utišanje. Ostale sRNA, ki ciljajo druge regije iniciacije translacija so dosegle signifikantno znižanja izražanja šele po dolgem času gojenja. Ciljanje visoko-energijskega stebla, ki je bolj oddaljen od mesta začetka translacije (asB407 in asB539) je v nekaterih primerih signifikantno znižalo fluorescenco, v drugih pa ne. Pri poskusu z asB606, ki cilja nizko-energijsko steblo, so izmerili signifikantno povišanje fluorescence pri 18h, vendar pri 29h signifikantnega povišanja ni bilo več prisotnega [1].
Čeprav so v in vivo sitemu dokazali nekaj signifikantnih sprememb izražanja reporterskega proteina, so rezultati zelo variirali, kar je verjetno posledica kompleksnosti živih celic. Zato so poskuse nadaljevali v brezceličnem sistemu [1].

== Brezcelični sistem (CFS) ==

CFS sistem so pripravili s sonifikacijo celice, ki so bile predhodno transformirane s plazmidom pART15-AS nato inducirali izraženje z Ara in ATc. Tako kot in vivo so najprej potrdili, da je odnos med intenziteto fluorescence in koncentracijo induktorja (Ara in ATc) linearen. Indukcija je bila dosežena po 24h, maksimum pa je fluorescenca dosegla po 96 urah. Podatki o fluorescenci so bili v CFS veliko bolj konsistentni kot in vivo, poleg tega pa je bilo prisotnih več signifikantnih rezultatov [1].

=== Vpliv sRNA na izražanje reporterja AmCyan ===

Ciljanje RBS v sistemu CFS ni povzročilo znižanja fluorescence, ciljanje prvih 20 nk pa je ravni izražanja znižalo bolj kot in vivo. S ciljanjem sekundarnih struktur mRNA so dosegli še močnejše utišanje; ciljanje visoko-energijskega stebla je povzročilo kar 65% utišanje, ciljanje 3' konca mRNA (asB701) pa je utišalo izražanje za kar 70% (in vivo le 19%). Pri ciljanju nizko-energijskega stebla (asB606) pa so dobili presenetljive rezultate, ki drugje v literaturi niso zabeleženi, in sicer je prišlo do signifikantnega zvišanja fluorescence za več kot 66%. Pri ciljanju drugega dela nizko-energijskega stebla (asB615) se je fluorescenca znižala [1].

=== Vpliv sRNA, odvisne od Hfq, na izražanje reporterja AmCyan ===
Nadaljnjo jih je zanimalo, ali lahko rezultate reproducirajo z uporabo sRNA, ki je odvisna od Hfq. V ostalih poskusih so namreč uporabljali sintetično sRNA, ki ni odvisna od Hfn. Uporabili so naravno pristno sRNA MicC, ki je vpletena v utišanje proteina zunanje membrane OmpC v ''E. coli'' in izkazuje visoke ravni utišanja genov. Protein Hfq deluje kot RNA šaperon MicC [1].
K ogrodju MicC so dodali ista protismerna zaporedja kot pri od-Hfq-neodvisni sRNA. Ciljanje prvih 20 nk mRNA s MicC-asB1 je vodilo v znižanje fluorescence, ki je bilo večje kot pri uporabi od-Hfq-neodvisne asRNA. Pri testiranju z MicC-asB606 ni bilo spremembe fluorescence, medtem ko je bilo pri sintetičnem ogrodju zvišanje flourescence kar 65%. Ciljanje RBS z MicC-asRBS je povzročilo zvišanje flourescence, kar se ne sklada z objavljenimi rezultati drugih v vivo študij, vendar so v nadaljevanju študije tudi ta pojav pojasnili [1].

== Določanje mehanizma delovanja sRNA asB606 in MicC-asRBS z NUPACK in catRAPID ==

Za določanje mehanizma, ki povzroči prekomerno izražanje z asB606 sRNA, so za analizo uporabili program NUPACK, ki se uporablja za analizo načrtovanje struktur ter sistemov nukleinskih kislin [1,3]. Ugotovili so, da se asB606 veže na bazne bare 606-615 na AmCyan mRNA, ki tvorijo začetni del stebla-zanke zaščitenega 3' konca in je tudi prepoznavno mesto za RNaza E, ki po prepoznavi tudi cepi AmCyan mRNA. Vezava sRNA na to mesto oteži prepoznavo mRNA z RNazo E in s tem prepreči cepitev in posledično podaljša razpolovno dobo mRNA, kar vodi v zvišanje izražanja AmCyan in povišanja fluorescence. Vezavni potencial med RNazo E in AmCyan mRNA, določen s programom catRAPID, je bil v regiji 500-600 visok, kar pa še dodatno podpira teorijo, da sRNA asB606 zakrije prepoznavno mesto za RNazo E [1].
Z analizo NUPACK so analizirali tudi zvišano izražanje z MicC-asRBS, kjer takšnih rezultatov niso pričakovali. V nativni AmCyan mRNA je 5' konec zvit v stebelno sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo. Vezava MicC-asRNA na mRNA preprči nastanek takšne sekundarne strukture, s tem pa “sprosti” RBS in omogoči vezavo na ribosom [1].

== Regulacija izražnja diaforaze s sRNA in vitro ==
Diaforaza (DI) je topna NAD(P)H dehidrogenaza, ki je vpletena v nastanek NADH in NADPH v anaerobnih pogojih [1,4]. Uporablja se v sinteznih encimskih poteh za produkcijo visoko-vrednih kemikalij, zato je zvišano izražanje tega encima tudi zanimivo in uporabno [1].
Z uporabo catRAPID so predvideli vezavna mesta za RNazo E na diaforazni mRNA in identificirali štiri tarčna mesta za sRNA, ki se nahajajo v bližini stebelnih zank in vezava, na katera bi lahko povzročilo zvišano izražanje [1].
Protismerna zaporedja, ki so bila del sRNA, so klonirali v plazmid pBAD-LIC in z njim transformirali sev ''E.coli'' BL21 Star (DE3). Brezcelični sistem so naredili s hkratno sonifikacijo kultur ''E.coli'' , ene, ki vsebuje zapis za diaforazo in druge z rekobinanitim plazmidom pBAD-AS [1].
Dva konstrukta (as410, as528) sta signifiakntno povečal izražanje diaforaze, en je dosegel zelo nizko povečanje (as510), zadnji pa je v enem replikat povišal izražanje, v drugih pa ni imel vpliva (as490) [1].
Čeprav so vsi konstrukti vsebovali protismerno zaporedje, ki cilja vezavno mesto za RNazo E na diaforazono mRNA, so bili vplivi konstruktov raznoliki. Rezultati so lahko posledica prisotnosti več vezavnih mest za RNazo E, poleg tega pa uporabljen sev E.coli lahko metabolizira induktor Ara in s tem zniža izražanje sRNA [1].

== Zaključek ==
Naravne in sintetične sRNA imajo velik potencial v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, saj omogočajo regulacijo izražanja genov brez popolnega izbitja gena, preko induciranega izražanja sRNA pa se lahko uvede še večji nadzor nad regulacijo izražanja tarčenga gena. So majhne, kar omogoča izražanje več sRNA iz istega plazmida. Tannaiche et al so prvič pokazali, da s sRNA lahko selektivno tudi zvišamo izražanje tarčnega gena v CFS. Poleg tega pa so pokazali, da se lahko sRNA prilagodi na različne sisteme in na regulacijo različnih proteinov [1].

== Literatura ==
[1] Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324. doi:10.1002/btpr.3324

[2] Storz G, Vogel J, Wassarman, K M. Regulation by Small RNAs in Bacteria: Expanding Frontiers. Molecular Cell. 2011. 43(6), 880–891.doi:10.1016/j.molcel.2011.08.022

[3] NUPACK. https://www.nupack.org (nazadnje dostopano 14. 5. 2023 dostopano)

[4] AG Scientific: Diaohorase Enzymes – Why are they? https://agscientific.com/blog/all-about-diaphorase-enzymes.html (nazadnje dostopano 14.5.2023)

Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu

2023-05-13T11:13:26Z

Anagodesa:

"Povzeto po članku [https://aiche.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/btpr.3324 Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324.]”

== Uvod ==

Nekodirajoče bakterijske RNA, med katere spada mala RNA (sRNA – angl. small) postajajo pomembno orodje v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, ker omogočajo regulacijo izražanje genov brez popolnega izbijta gena. Z nepopolnim parjenjem baz se sRNA veže na mRNA, pogosto v bližino ribosom-vezavnega mesta (RBS) ali pa prepreči/ojačajo vezavo na ribosom preko drugih mehanizmov [1,2] .
Tehnologija sRNA se uporablja za detekcijo metabolnega stanja, uravnovešenja metabolnih poti, za kontrolo izražanja toksinov, za izboljšanje izkoristka in zmanjšanja količine stranskih produktov [1].
Večina aplikacij sRNA se izvaja v živih celicah. Vendar ima tak pristop kar nekaj pomanjkljivosti kot so kompleksnost sistema, selektivna indukcija, naravna variabilnost, težave pri standardizaciji in neponovljivost rezultatov. Zato se razvija brezcelične sisteme (cell-free systems – CFS), ki vsebujejo celično komponente in vitro. Z uporabo CSF se izognemo kompleksnosti živih celic, zato je delo v takih sistemih bolj fleksibilno, možen je večji nadzor nad modifikacijami transkripcije/translacije, lahko se proizvede večje količine produktov, višja je toleranca za toksične substrate/produkte/intermediate, lažje čiščenje produktov [1].
V članku Tannaiche et al so se ukvarjali z ugotavljanjem vpliva sRNA na izražanje fluorescenčnega barvila Anemoina majano cyan (AmCyan) ter encima diaforaza. Razvili so sRNA, ki poleg utišanja genov omogoča tudi prekomerno izražanje tarčnega proteina, kar do tedaj še ni bilo zabeleženo. Testiranje so najprej izvedli in vivo, vendar so zaradi nekonsistentnih rezultatov prešli na brezcelični sistem [1].

== Konstrukcija sRNA in plazmidov v sistemu z reporterjem AmCyan ==
'''Sintetični konstrukt sRNA''' je dolg 48 nukleotidov in je sestavljen iz treh delov. Zaporedje na 5' koncu tvori steblo-zanko, s čemer stabilizira RNA in omogoča interakcijo sRNA-mRNA (14 nk). Temu sledi 20 nukleotidov dolgo protismerno zaporedje za tarčno mRNA, ki cilja različne dele AmCyan. Na 3' koncu sRNA je še terminator v obliki stebla-zanke (14 nk) [1].

'''Plazmidi za testiranja sistema z reporterjem AmCyan'''
Uporabili so štiri različne plazmide. Prvi je pART15-C1 vsebuje zapis za reporterski fluorescenčni protein Anemoina majano cyan (AmCyan) pod inducibilnim promotrojem PBAD. Drugi uporabljen plazmid je pART15-C2, ki ima zapis za reporter AmCyan pod kontrolo promotorja PLtetO-1 in omogoča relativno določitev izražanja sRNA. Plazmid pART15-C1-LacZ ima sRNA konstrukt substituiran z lacZ in omogoča modro-beli test po transformaciji bakterij. Zadnji plazmid je pART15-AS, ki vsebuje gen za reporter AmCyan pod kontrolo promotorja PBAD in zaporedje za sRNA pod kontrolo promotorja PLtet-O [1].
Sestavljanje konstrukta je potekalo sestavljanjem po Gibosonu in gama-PCR.

== Optimizacija indukcije s plazmidom pART15-C1 in -C2 (in vivo) ==
Za oceno izražanja reporterja AmCyan in sRNA v odvisnosti od koncentracije induktorjev so uporabili dva kontrolna plazmida: pART15-C1 in pART15-C2 in z njima transfecirali sev ''Escehrichia coli'' 10-beta. Merili so fluorescenco AmCyan pri različni koncentracijah induktorjev arabinoze (Ara) in anhidrotetraciklina (ATc) [1].
Med koncentracijo Ara oz. ATc in intenziteto fluorescence je bil opažen linearen odnos. S tem so pokazali, da se izražanje fluorescentnega reporterja in sRNA uravnava čez široko koncentarcijsko območje induktorjev [1].

== Vpliv sRNA na izražanje reporterja AmCyan (in vivo) ==

Testirali so 12 različnih protismernih zaporedji s transformacijo seva ''E. coli'' 10- beta s plazmidom pART15-AS in merili fluorescenco celic v treh časovnih točkah (6, 18, 29 h) [1].
V prvem in vivo sistemu so pokazali, da je ciljanje RBS in prvih 20 baz mRNA reporterja AmCyan povzročilo signifikantno znižanje izražanja do 10% v 29 urah. Še bolj signifikantno znižanje izražanja reporterja je bilo prisotno pri ciljanju visoko-energijskega stebelnega dela sekundarne strukture mRNA (asB430), kjer so v šestih urah dosegli 25% utišanje. Ostale sRNA, ki ciljajo druge regije iniciacije translacija so dosegle signifikantno znižanja izražanja šele po dolgem času gojenja. Ciljanje visoko-energijskega stebla, ki je bolj oddaljen od mesta začetka translacije (asB407 in asB539) je v nekaterih primerih signifikantno znižalo fluorescenco, v drugih pa ne. Pri poskusu z asB606, ki cilja nizko-energijsko steblo, so izmerili signifikantno povišanje fluorescence pri 18h, vendar pri 29h signifikantnega povišanja ni bilo več prisotnega [1].
Čeprav so v in vivo sitemu dokazali nekaj signifikantnih sprememb izražanja reporterskega proteina, so rezultati zelo variirali, kar je verjetno posledica kompleksnosti živih celic. Zato so poskuse nadaljevali v brezceličnem sistemu [1].

== Brezcelični sistem (CFS) ==

CFS sistem so pripravili s sonifikacijo celice, ki so bile predhodno transformirane s plazmidom pART15-AS nato inducirali izraženje z Ara in ATc. Tako kot in vivo so najprej potrdili, da je odnos med intenziteto fluorescence in koncentracijo induktorja (Ara in ATc) linearen. Indukcija je bila dosežena po 24h, maksimum pa je fluorescenca dosegla po 96 urah. Podatki o fluorescenci so bili v CFS veliko bolj konsistentni kot in vivo, poleg tega pa je bilo prisotnih več signifikantnih rezultatov [1].

=== Vpliv sRNA na izražanje reporterja AmCyan ===

Ciljanje RBS v sistemu CFS ni povzročilo znižanja fluorescence, ciljanje prvih 20 nk pa je ravni izražanja znižalo bolj kot in vivo. S ciljanjem sekundarnih struktur mRNA so dosegli še močnejše utišanje; ciljanje visoko-energijskega stebla je povzročilo kar 65% utišanje, ciljanje 3' konca mRNA (asB701) pa je utišalo izražanje za kar 70% (in vivo le 19%). Pri ciljanju nizko-energijskega stebla (asB606) pa so dobili presenetljive rezultate, ki drugje v literaturi niso zabeleženi, in sicer je prišlo do signifikantnega zvišanja fluorescence za več kot 66%. Pri ciljanju drugega dela nizko-energijskega stebla (asB615) se je fluorescenca znižala [1].

=== Vpliv sRNA, odvisne od Hfq, na izražanje reporterja AmCyan ===
Nadaljnjo jih je zanimalo, ali lahko rezultate reproducirajo z uporabo sRNA, ki je odvisna od Hfq. V ostalih poskusih so namreč uporabljali sintetično sRNA, ki ni odvisna od Hfn. Uporabili so naravno pristno sRNA MicC, ki je vpletena v utišanje proteina zunanje membrane OmpC v ''E. coli'' in izkazuje visoke ravni utišanja genov. Protein Hfq deluje kot RNA šaperon MicC [1].
K ogrodju MicC so dodali ista protismerna zaporedja kot pri od-Hfq-neodvisni sRNA. Ciljanje prvih 20 nk mRNA s MicC-asB1 je vodilo v znižanje fluorescence, ki je bilo večje kot pri uporabi od-Hfq-neodvisne asRNA. Pri testiranju z MicC-asB606 ni bilo spremembe fluorescence, medtem ko je bilo pri sintetičnem ogrodju zvišanje flourescence kar 65%. Ciljanje RBS z MicC-asRBS je povzročilo zvišanje flourescence, kar se ne sklada z objavljenimi rezultati drugih v vivo študij, vendar so v nadaljevanju študije tudi ta pojav pojasnili [1].

== Določanje mehanizma delovanja sRNA asB606 in MicC-asRBS z NUPACK in catRAPID ==

Za določanje mehanizma, ki povzroči prekomerno izražanje z asB606 sRNA, so za analizo uporabili program NUPACK, ki se uporablja za analizo načrtovanje struktur ter sistemov nukleinskih kislin [1,3]. Ugotovili so, da se asB606 veže na bazne bare 606-615 na AmCyan mRNA, ki tvorijo začetni del stebla-zanke zaščitenega 3' konca in je tudi prepoznavno mesto za RNaza E, ki po prepoznavi tudi cepi AmCyan mRNA. Vezava sRNA na to mesto oteži prepoznavo mRNA z RNazo E in s tem prepreči cepitev in posledično podaljša razpolovno dobo mRNA, kar vodi v zvišanje izražanja AmCyan in povišanja fluorescence. Vezavni potencial med RNazo E in AmCyan mRNA, določen s programom catRAPID, je bil v regiji 500-600 visok, kar pa še dodatno podpira teorijo, da sRNA asB606 zakrije prepoznavno mesto za RNazo E [1].
Z analizo NUPACK so analizirali tudi zvišano izražanje z MicC-asRBS, kjer takšnih rezultatov niso pričakovali. V nativni AmCyan mRNA je 5' konec zvit v stebelno sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo. Vezava MicC-asRNA na mRNA preprči nastanek takšne sekundarne strukture, s tem pa “sprosti” RBS in omogoči vezavo na ribosom [1].

== Regulacija izražnja diaforaze s sRNA in vitro ==
Diaforaza (DI) je topna NAD(P)H dehidrogenaza, ki je vpletena v nastanek NADH in NADPH v anaerobnih pogojih [1,4]. Uporablja se v sinteznih encimskih poteh za produkcijo visoko-vrednih kemikalij, zato je zvišano izražanje tega encima tudi zanimivo in uporabno [1].
Z uporabo catRAPID so predvideli vezavna mesta za RNazo E na diaforazni mRNA in identificirali štiri tarčna mesta za sRNA, ki se nahajajo v bližini stebelnih zank in vezava, na katera bi lahko povzročilo zvišano izražanje [1].
Protismerna zaporedja, ki so bila del sRNA, so klonirali v plazmid pBAD-LIC in z njim transformirali sev ''E.coli'' BL21 Star (DE3). Brezcelični sistem so naredili s hkratno sonifikacijo kultur ''E.coli'' , ene, ki vsebuje zapis za diaforazo in druge z rekobinanitim plazmidom pBAD-AS [1].
Dva konstrukta (as410, as528) sta signifiakntno povečal izražanje diaforaze, en je dosegel zelo nizko povečanje (as510), zadnji pa je v enem replikat povišal izražanje, v drugih pa ni imel vpliva (as490) [1].
Čeprav so vsi konstrukti vsebovali protismerno zaporedje, ki cilja vezavno mesto za RNazo E na diaforazono mRNA, so bili vplivi konstruktov raznoliki. Rezultati so lahko posledica prisotnosti več vezavnih mest za RNazo E, poleg tega pa uporabljen sev E.coli lahko metabolizira induktor Ara in s tem zniža izražanje sRNA [1].

== Zaključek ==
Naravne in sintetične sRNA imajo velik potencial v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, saj omogočajo regulacijo izražanja genov brez popolnega izbitja gena, preko induciranega izražanja sRNA pa se lahko uvede še večji nadzor nad regulacijo izražanja tarčenga gena. So majhne, kar omogoča izražanje več sRNA iz istega plazmida. Tannaiche et al so prvič pokazali, da s sRNA lahko selektivno tudi zvišamo izražanje tarčnega gena v CFS. Poleg tega pa so pokazali, da se lahko sRNA prilagodi na različne sisteme in na regulacijo različnih proteinov [1].

== Literatura ==
[1] Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324. doi:10.1002/btpr.3324

[2] Storz G, Vogel J, Wassarman, K M. Regulation by Small RNAs in Bacteria: Expanding Frontiers. Molecular Cell. 2011. 43(6), 880–891.doi:10.1016/j.molcel.2011.08.022

[3] NUPACK. https://www.nupack.org (nazadnje dostopano 14. 5. 2023 dostopano)

[4] AG Scientific: Diaohorase Enzymes – Why are they? https://agscientific.com/blog/all-about-diaphorase-enzymes.html (nazadnje dostopano 14.5.2023)

Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu

2023-05-13T11:12:57Z

Anagodesa:

"Povzeto po članku [https://aiche.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/btpr.3324 Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324.]”

== Uvod ==

Nekodirajoče bakterijske RNA, med katere spada mala RNA (sRNA – angl. small) postajajo pomembno orodje v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, ker omogočajo regulacijo izražanje genov brez popolnega izbijta gena. Z nepopolnim parjenjem baz se sRNA veže na mRNA, pogosto v bližino ribosom-vezavnega mesta (RBS) ali pa prepreči/ojačajo vezavo na ribosom preko drugih mehanizmov [1,2] .
Tehnologija sRNA se uporablja za detekcijo metabolnega stanja, uravnovešenja metabolnih poti, za kontrolo izražanja toksinov, za izboljšanje izkoristka in zmanjšanja količine stranskih produktov [1].
Večina aplikacij sRNA se izvaja v živih celicah. Vendar ima tak pristop kar nekaj pomanjkljivosti kot so kompleksnost sistema, selektivna indukcija, naravna variabilnost, težave pri standardizaciji in neponovljivost rezultatov. Zato se razvija brezcelične sisteme (cell-free systems – CFS), ki vsebujejo celično komponente in vitro. Z uporabo CSF se izognemo kompleksnosti živih celic, zato je delo v takih sistemih bolj fleksibilno, možen je večji nadzor nad modifikacijami transkripcije/translacije, lahko se proizvede večje količine produktov, višja je toleranca za toksične substrate/produkte/intermediate, lažje čiščenje produktov [1].
V članku Tannaiche et al so se ukvarjali z ugotavljanjem vpliva sRNA na izražanje fluorescenčnega barvila Anemoina majano cyan (AmCyan) ter encima diaforaza. Razvili so sRNA, ki poleg utišanja genov omogoča tudi prekomerno izražanje tarčnega proteina, kar do tedaj še ni bilo zabeleženo. Testiranje so najprej izvedli in vivo, vendar so zaradi nekonsistentnih rezultatov prešli na brezcelični sistem [1].

== Konstrukcija sRNA in plazmidov v sistemu z reporterjem AmCyan ==
'''Sintetični konstrukt sRNA''' je dolg 48 nukleotidov in je sestavljen iz treh delov. Zaporedje na 5' koncu tvori steblo-zanko, s čemer stabilizira RNA in omogoča interakcijo sRNA-mRNA (14 nk). Temu sledi 20 nukleotidov dolgo protismerno zaporedje za tarčno mRNA, ki cilja različne dele AmCyan. Na 3' koncu sRNA je še terminator v obliki stebla-zanke (14 nk) [1].

'''Plazmidi za testiranja sistema z reporterjem AmCyan'''
Uporabili so štiri različne plazmide. Prvi je pART15-C1 vsebuje zapis za reporterski fluorescenčni protein Anemoina majano cyan (AmCyan) pod inducibilnim promotrojem PBAD. Drugi uporabljen plazmid je pART15-C2, ki ima zapis za reporter AmCyan pod kontrolo promotorja PLtetO-1 in omogoča relativno določitev izražanja sRNA. Plazmid pART15-C1-LacZ ima sRNA konstrukt substituiran z lacZ in omogoča modro-beli test po transformaciji bakterij. Zadnji plazmid je pART15-AS, ki vsebuje gen za reporter AmCyan pod kontrolo promotorja PBAD in zaporedje za sRNA pod kontrolo promotorja PLtet-O [1].
Sestavljanje konstrukta je potekalo sestavljanjem po Gibosonu in gama-PCR.

== Optimizacija indukcije s plazmidom pART15-C1 in -C2 (in vivo sistem) ==
Za oceno izražanja reporterja AmCyan in sRNA v odvisnosti od koncentracije induktorjev so uporabili dva kontrolna plazmida: pART15-C1 in pART15-C2 in z njima transfecirali sev ''Escehrichia coli'' 10-beta. Merili so fluorescenco AmCyan pri različni koncentracijah induktorjev arabinoze (Ara) in anhidrotetraciklina (ATc) [1].
Med koncentracijo Ara oz. ATc in intenziteto fluorescence je bil opažen linearen odnos. S tem so pokazali, da se izražanje fluorescentnega reporterja in sRNA uravnava čez široko koncentarcijsko območje induktorjev [1].

== Vpliv sRNA na izražanje reporterja AmCyan (in vivo) ==

Testirali so 12 različnih protismernih zaporedji s transformacijo seva ''E. coli'' 10- beta s plazmidom pART15-AS in merili fluorescenco celic v treh časovnih točkah (6, 18, 29 h) [1].
V prvem in vivo sistemu so pokazali, da je ciljanje RBS in prvih 20 baz mRNA reporterja AmCyan povzročilo signifikantno znižanje izražanja do 10% v 29 urah. Še bolj signifikantno znižanje izražanja reporterja je bilo prisotno pri ciljanju visoko-energijskega stebelnega dela sekundarne strukture mRNA (asB430), kjer so v šestih urah dosegli 25% utišanje. Ostale sRNA, ki ciljajo druge regije iniciacije translacija so dosegle signifikantno znižanja izražanja šele po dolgem času gojenja. Ciljanje visoko-energijskega stebla, ki je bolj oddaljen od mesta začetka translacije (asB407 in asB539) je v nekaterih primerih signifikantno znižalo fluorescenco, v drugih pa ne. Pri poskusu z asB606, ki cilja nizko-energijsko steblo, so izmerili signifikantno povišanje fluorescence pri 18h, vendar pri 29h signifikantnega povišanja ni bilo več prisotnega [1].
Čeprav so v in vivo sitemu dokazali nekaj signifikantnih sprememb izražanja reporterskega proteina, so rezultati zelo variirali, kar je verjetno posledica kompleksnosti živih celic. Zato so poskuse nadaljevali v brezceličnem sistemu [1].

== Brezcelični sistem (CFS) ==

CFS sistem so pripravili s sonifikacijo celice, ki so bile predhodno transformirane s plazmidom pART15-AS nato inducirali izraženje z Ara in ATc. Tako kot in vivo so najprej potrdili, da je odnos med intenziteto fluorescence in koncentracijo induktorja (Ara in ATc) linearen. Indukcija je bila dosežena po 24h, maksimum pa je fluorescenca dosegla po 96 urah. Podatki o fluorescenci so bili v CFS veliko bolj konsistentni kot in vivo, poleg tega pa je bilo prisotnih več signifikantnih rezultatov [1].

=== Vpliv sRNA na izražanje reporterja AmCyan ===

Ciljanje RBS v sistemu CFS ni povzročilo znižanja fluorescence, ciljanje prvih 20 nk pa je ravni izražanja znižalo bolj kot in vivo. S ciljanjem sekundarnih struktur mRNA so dosegli še močnejše utišanje; ciljanje visoko-energijskega stebla je povzročilo kar 65% utišanje, ciljanje 3' konca mRNA (asB701) pa je utišalo izražanje za kar 70% (in vivo le 19%). Pri ciljanju nizko-energijskega stebla (asB606) pa so dobili presenetljive rezultate, ki drugje v literaturi niso zabeleženi, in sicer je prišlo do signifikantnega zvišanja fluorescence za več kot 66%. Pri ciljanju drugega dela nizko-energijskega stebla (asB615) se je fluorescenca znižala [1].

=== Vpliv sRNA, odvisne od Hfq, na izražanje reporterja AmCyan ===
Nadaljnjo jih je zanimalo, ali lahko rezultate reproducirajo z uporabo sRNA, ki je odvisna od Hfq. V ostalih poskusih so namreč uporabljali sintetično sRNA, ki ni odvisna od Hfn. Uporabili so naravno pristno sRNA MicC, ki je vpletena v utišanje proteina zunanje membrane OmpC v ''E. coli'' in izkazuje visoke ravni utišanja genov. Protein Hfq deluje kot RNA šaperon MicC [1].
K ogrodju MicC so dodali ista protismerna zaporedja kot pri od-Hfq-neodvisni sRNA. Ciljanje prvih 20 nk mRNA s MicC-asB1 je vodilo v znižanje fluorescence, ki je bilo večje kot pri uporabi od-Hfq-neodvisne asRNA. Pri testiranju z MicC-asB606 ni bilo spremembe fluorescence, medtem ko je bilo pri sintetičnem ogrodju zvišanje flourescence kar 65%. Ciljanje RBS z MicC-asRBS je povzročilo zvišanje flourescence, kar se ne sklada z objavljenimi rezultati drugih v vivo študij, vendar so v nadaljevanju študije tudi ta pojav pojasnili [1].

== Določanje mehanizma delovanja sRNA asB606 in MicC-asRBS z NUPACK in catRAPID ==

Za določanje mehanizma, ki povzroči prekomerno izražanje z asB606 sRNA, so za analizo uporabili program NUPACK, ki se uporablja za analizo načrtovanje struktur ter sistemov nukleinskih kislin [1,3]. Ugotovili so, da se asB606 veže na bazne bare 606-615 na AmCyan mRNA, ki tvorijo začetni del stebla-zanke zaščitenega 3' konca in je tudi prepoznavno mesto za RNaza E, ki po prepoznavi tudi cepi AmCyan mRNA. Vezava sRNA na to mesto oteži prepoznavo mRNA z RNazo E in s tem prepreči cepitev in posledično podaljša razpolovno dobo mRNA, kar vodi v zvišanje izražanja AmCyan in povišanja fluorescence. Vezavni potencial med RNazo E in AmCyan mRNA, določen s programom catRAPID, je bil v regiji 500-600 visok, kar pa še dodatno podpira teorijo, da sRNA asB606 zakrije prepoznavno mesto za RNazo E [1].
Z analizo NUPACK so analizirali tudi zvišano izražanje z MicC-asRBS, kjer takšnih rezultatov niso pričakovali. V nativni AmCyan mRNA je 5' konec zvit v stebelno sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo. Vezava MicC-asRNA na mRNA preprči nastanek takšne sekundarne strukture, s tem pa “sprosti” RBS in omogoči vezavo na ribosom [1].

== Regulacija izražnja diaforaze s sRNA in vitro ==
Diaforaza (DI) je topna NAD(P)H dehidrogenaza, ki je vpletena v nastanek NADH in NADPH v anaerobnih pogojih [1,4]. Uporablja se v sinteznih encimskih poteh za produkcijo visoko-vrednih kemikalij, zato je zvišano izražanje tega encima tudi zanimivo in uporabno [1].
Z uporabo catRAPID so predvideli vezavna mesta za RNazo E na diaforazni mRNA in identificirali štiri tarčna mesta za sRNA, ki se nahajajo v bližini stebelnih zank in vezava, na katera bi lahko povzročilo zvišano izražanje [1].
Protismerna zaporedja, ki so bila del sRNA, so klonirali v plazmid pBAD-LIC in z njim transformirali sev ''E.coli'' BL21 Star (DE3). Brezcelični sistem so naredili s hkratno sonifikacijo kultur ''E.coli'' , ene, ki vsebuje zapis za diaforazo in druge z rekobinanitim plazmidom pBAD-AS [1].
Dva konstrukta (as410, as528) sta signifiakntno povečal izražanje diaforaze, en je dosegel zelo nizko povečanje (as510), zadnji pa je v enem replikat povišal izražanje, v drugih pa ni imel vpliva (as490) [1].
Čeprav so vsi konstrukti vsebovali protismerno zaporedje, ki cilja vezavno mesto za RNazo E na diaforazono mRNA, so bili vplivi konstruktov raznoliki. Rezultati so lahko posledica prisotnosti več vezavnih mest za RNazo E, poleg tega pa uporabljen sev E.coli lahko metabolizira induktor Ara in s tem zniža izražanje sRNA [1].

== Zaključek ==
Naravne in sintetične sRNA imajo velik potencial v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, saj omogočajo regulacijo izražanja genov brez popolnega izbitja gena, preko induciranega izražanja sRNA pa se lahko uvede še večji nadzor nad regulacijo izražanja tarčenga gena. So majhne, kar omogoča izražanje več sRNA iz istega plazmida. Tannaiche et al so prvič pokazali, da s sRNA lahko selektivno tudi zvišamo izražanje tarčnega gena v CFS. Poleg tega pa so pokazali, da se lahko sRNA prilagodi na različne sisteme in na regulacijo različnih proteinov [1].

== Literatura ==
[1] Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324. doi:10.1002/btpr.3324

[2] Storz G, Vogel J, Wassarman, K M. Regulation by Small RNAs in Bacteria: Expanding Frontiers. Molecular Cell. 2011. 43(6), 880–891.doi:10.1016/j.molcel.2011.08.022

[3] NUPACK. https://www.nupack.org (nazadnje dostopano 14. 5. 2023 dostopano)

[4] AG Scientific: Diaohorase Enzymes – Why are they? https://agscientific.com/blog/all-about-diaphorase-enzymes.html (nazadnje dostopano 14.5.2023)

Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu

2023-05-13T11:03:57Z

Anagodesa:

"Povzeto po članku [https://aiche.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/btpr.3324 Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324.]”

== Uvod ==

Nekodirajoče bakterijske RNA, med katere spada mala RNA (sRNA – angl. small) postajajo pomembno orodje v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, ker omogočajo regulacijo izražanje genov brez popolnega izbijta gena. Z nepopolnim parjenjem baz se sRNA veže na mRNA, pogosto v bližino ribosom-vezavnega mesta (RBS) ali pa prepreči/ojačajo vezavo na ribosom preko drugih mehanizmov [1,2] .
Tehnologija sRNA se uporablja za detekcijo metabolnega stanja, uravnovešenja metabolnih poti, za kontrolo izražanja toksinov, za izboljšanje izkoristka in zmanjšanja količine stranskih produktov [1].
Večina aplikacij sRNA se izvaja v živih celicah. Vendar ima tak pristop kar nekaj pomanjkljivosti kot so kompleksnost sistema, selektivna indukcija, naravna variabilnost, težave pri standardizaciji in neponovljivost rezultatov. Zato se razvija brezcelične sisteme (cell-free systems – CFS), ki vsebujejo celično komponente in vitro. Z uporabo CSF se izognemo kompleksnosti živih celic, zato je delo v takih sistemih bolj fleksibilno, možen je večji nadzor nad modifikacijami transkripcije/translacije, lahko se proizvede večje količine produktov, višja je toleranca za toksične substrate/produkte/intermediate, lažje čiščenje produktov [1].
V članku Tannaiche et al so se ukvarjali z ugotavljanjem vpliva sRNA na izražanje fluorescenčnega barvila Anemoina majano cyan (AmCyan) ter encima diaforaza. Razvili so sRNA, ki poleg utišanja genov omogoča tudi prekomerno izražanje tarčnega proteina, kar do tedaj še ni bilo zabeleženo. Testiranje so najprej izvedli in vivo, vendar so zaradi nekonsistentnih rezultatov prešli na brezcelični sistem [1].

== Konstrukcija sRNA in plazmidov v sistemu z reporterjem AmCyan ==
Sintetični konstrukt sRNA je dolg 48 nukleotidov in je sestavljen iz treh delov. Zaporedje na 5' koncu tvori steblo-zanko, s čemer stabilizira RNA in omogoča interakcijo sRNA-mRNA (14 nk). Temu sledi 20 nukleotidov dolgo protismerno zaporedje za tarčno mRNA, ki cilja različne dele AmCyan. Na 3' koncu sRNA je še terminator v obliki stebla-zanke (14 nk) [1].

Uporabljeni plazmidi za testiranja sistema z reporterjem AmCyan
Uporabili so štiri različne plazmide. Prvi je pART15-C1 vsebuje zapis za reporterski fluorescenčni protein Anemoina majano cyan (AmCyan) pod inducibilnim promotrojem PBAD. Drugi uporabljen plazmid je pART15-C2, ki ima zapis za reporter AmCyan pod kontrolo promotorja PLtetO-1 in omogoča relativno določitev izražanja sRNA. Plazmid pART15-C1-LacZ ima sRNA konstrukt substituiran z lacZ in omogoča belo modri test po transformaciji bakterij. Zadnji plazmid je pART15-AS, ki vsebuje gen za reporter AmCyan pod kontrolo promotorja PBAD in zaporedje za sRNA pod kontrolo promotorja PLtet-O [1].
Sestavljanje konstrukta je potekalo z Gibbosonovim kloniranjem in gama-PCR.

== Optimizacija indukcije s plazmidom pART15-C1 in -C2 (in vivo sistem) ==
Za oceno izražanja reporterja AmCyan in sRNA v odvisnosti od koncentracije induktorjev so uporabili dva kontrolna plazmida: pART15-C1 in pART15-C2 in z njima transfecirali sev E. coli 10-. Merili so fluorescenco AmCyan pri različni koncentracijah induktorjev arabinoze (Ara) in anhidrotetraciklina (ATc) [1].
Med koncentracijo Ara oz. ATc in intenziteto fluorescence je bil opažen linearen odnos. S tem so pokazali, da se izražanje fluorescentnega reporterja in sRNA uravnava čez široko območje z uporabo omenjenih induktorjev [1].
S pretočno citometrijo so ocenili homogenost indukcije v celičnih populacijah pri različnih koncentracijah induktorjev Ara in ATc [1].

== Vpliv sRNA na izražanje reporterja AmCyan (in vivo) ==

Testirali so 12 različnih protismernih zaporedji s transformacijo seva E. coli 10- beta s plazmidom pART15-AS in merili fluorescenco celic v treh časovnih točkah (6, 18, 29 h) [1].
V prvem in vivo sistemu so pokazali, da je ciljanje RBS in prvih 20 baz mRNA reporterja AmCyan povzročilo signifikantno znižanje izražanja do 10% v 29 urah. Še bolj signifikantno znižanje izražanja reporterja je bilo prisotno pri ciljanju visoko-energijskega stebelnega dela sekundarne strukture mRNA (asB430), kjer so v šestih urah dosegli 25% utišanje. Ostale sRNA, ki ciljajo druge regije iniciacije translacija so dosegle signifikantno znižanja izražanja šele po dolgem času gojenja. Ciljanje visoko-energijskega stebla, ki je bolj oddaljen od mesta začetka translacije (asB407 in asB539) je v nekaterih primerih signifikantno znižalo fluorescenco, v drugih pa ne. Pri poskusu z asB606, ki cilja nizko-energijsko steblo, so izmerili signifikantno povišanje fluorescence pri 18h, vendar pri 29h signifikantnega povišanja ni bilo več prisotnega [1].
Čeprav so v in vivo sitemu dokazali nekaj signifikantnih sprememb izražanja reporterskega proteina, so rezultati zelo variirali, kar je verjetno posledica kompleksnosti živih celic. Zato so poskuse nadaljevali v brezceličnem sistemu [1].

== Brezcelični sistem (CFS) ==

CFS sistem so pripravili s sonifikacijo celice, ki so bile predhodno transformirane s plazmidom pART15-AS nato inducirali izraženje z Ara in ATc. Tako kot in vivo so najprej potrdili, da je odnos med intenziteto fluorescence in koncentracijo induktorja (Ara in ATc) linearen. Indukcija je bila dosežena po 24h, maksimum pa je fluorescenca dosegla po 96 urah. Podatki o fluorescenci so bili v CFS veliko bolj konsistentni kot in vivo, poleg tega pa je bilo prisotnih več signifikantnih rezultatov [1].

=== Vpliv sRNA na izražanje reporterja AmCyan v v brezceličnem sistemu ===

Ciljanje RBS v sistemu CFS ni povzročilo znižanja fluorescence, ciljanje prvih 20 nk pa je ravni izražanja znižalo bolj kot in vivo. S ciljanjem sekundarnih struktur mRNA so dosegli še močnejše utišanje; ciljanje visoko-energijskega stebla je povzročilo kar 65% utišanje , ciljanje 3' konca mRNA (asB701) pa je utišalo izražanje za kar 70% (in vivo le 19%). Pri ciljanju nizko-energijskega stebla (asB606) pa so dobili presenetljive rezultate, ki drugje v literaturi niso zabeleženi, in sicer je prišlo do signifikantnega zvišanja fluorescence za več kot 66%. Pri ciljanju drugega dela nizko-energijskega stebla (asB615) se je fluorescenca znižala [1].

=== Vpliv sRNA, odvisne od Hfq, na izražanje reporterja AmCyan ===
Nadaljnjo jih je zanimalo, ali lahko rezultate reproducirajo z uporabo sRNA, ki je odvisna od Hfq. V ostalih poskusih so namreč uporabljali sintetično sRNA, ki ni odvisna od Hfn. Uporabili so naravno pristno sRNA MicC, ki je vpletena v utišanje proteina zunanje membrane OmpC v E. coli in izkazuje visoke ravni utišanja genov. Protein Hfq deluje kot RNA šaperon MicC [1].
K ogrodju MicC so dodali ista protismerna zaporedja kot pri od-Hfq-neodvisni sRNA. Ciljanje prvih 20 nk mRNA s MicC-asB1 je vodilo v znižanje fluorescence, ki je bilo večje kot pri uporabi od-Hfq-neodvisne asRNA. Pri testiranju z MicC-asB606 ni bilo spremembe fluorescence, medtem ko je bilo pri sintetičnem ogrodju zvišanje flourescence kar 65%. Ciljanje RBS z MicC-asRBS je povzročilo zvišanje flourescence, kar se ne sklada z objavljenimi rezultati drugih v vivo študij, vendar so v nadaljevanju študije tudi ta pojav pojasnili [1].

== Določanje mehanizma delovanja sRNA asB606 z NUPACK in catRAPID ==

Za določanje mehanizma, ki povzroči prekomerno ekspresijo z asB606 sRNA, so za analizo uporabili program NUPACK, ki se uporablja za analizo načrtovanje struktur ter sistemov nukleinskih kislin [1,3]. Ugotovili so, da se asB606 veže na bazne bare 606-615 na AmCyan mRNA, ki tvorijo začetni del stebla-zanke zaščitenega 3' konca in je tudi prepoznavno mesto za RNaza E, ki po prepoznavi tudi cepi AmCyan mRNA. Vezava sRNA na to mesto oteži prepoznavo mRNA z RNazo E in s tem prepreči cepitev in posledično podaljša razpolovno dobo mRNA, kar vodi v zvišanje izražanja AmCyan in povišanja fluorescence. Vezavni potencial med RNazo E in AmCyan mRNA, določen s programom catRAPID, je bil v regiji 500-600 visok, kar pa še dodatno podpira teorijo, da sRNA asB606 zakrije prepoznavno mesto za RNazo E [1].
Z analizo NUPACK so analizirali tudi zvišano izražanje z MicC-asRBS, kjer takšnih rezultatov niso pričakovali. V nativni AmCyan mRNA je 5' konec zvit v stebelno sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo. Vezava MicC-asRNA na mRNA preprči nastanek takšne sekundarne strukture, s tem pa “sprosti” RBS in omogoči vezavo na ribosom [1].

== Regulacija izražnja diaforaze s sRNA in vitro ==
Diaforaza (DI) je topna NAD(P)H dehidrogenaza, ki je vpletena v nastanek NADH in NADPH v anaerobnih pogojih [1,4]. Uporablja se v sinteznih encimskih poteh za produkcijo visoko-vrednih kemikalij. Zato je zvišano izražanje tega encima tudi zanimivo in uporabno [1].
Z uporabo catRAPID so predvideli vezavna mesta za RNazo E na diaforazni mRNA in identificirali štiri tarčna mesta za sRNA, ki se nahajajo v bližini stebelnih zank in vezava, na katera bi lahko povzročilo zvišano izražanje [1].
Protismerna zaporedja, ki so bila del sRNA, so klonirali v plazmid pBAD-LIC in z njim transformirali sev E.coli BL21 Star (DE3). Brezcelični sistem so naredili s hkratno sonifikacijo kultur E.coli , ene, ki vsebuje zapis za diaforazo in druge z rekobinanitim plazmidom pBAD-AS [1].
Dva konstrukta (as410, as528) sta signifiakntno povečal izražanje diaforaze, en je dosegel zelo nizko povečanje (as510), zadnji pa je v enem replikat povišal izražanje, v drugih pa ni imel vpliva (as490) [1].
Čeprav so vsi konstrukti vsebovali protismerno zaporedje, ki cilja vezavno mesto za RNazo E na diaforazono mRNA, so bili vplivi konstruktov raznoliki. Rezultati so lahko posledica prisotnosti več vezavnih mest za RNazo E, poleg tega pa uporabljen sev E.coli lahko metabolizira induktor Ara in s tem zniža izražanje sRNA [1].

== Zaključek ==
Naravne in sintetične sRNA imajo velik potencial v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, saj omogočajo regulacijo izražanja genov brez popolnega izbitja gena, preko induciranega izražanja sRNA pa se lahko uvede še večji nadzor nad regulacijo izražanja tarčenga gena. So majhne, kar omogoča izražanje več sRNA iz istega plazmida. Tannaiche et al so prvič pokazali, da s sRNA lahko selektivno tudi zvišamo izražanje tarčnega gena v CFS. Poleg tega pa so pokazali, da se lahko sRNA prilagodi na različne sisteme in na regulacijo različnih proteinov [1].

== Literatura ==
[1] Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324. doi:10.1002/btpr.3324

[2] Storz G, Vogel J, Wassarman, K M. Regulation by Small RNAs in Bacteria: Expanding Frontiers. Molecular Cell. 2011. 43(6), 880–891.doi:10.1016/j.molcel.2011.08.022

[3] NUPACK. https://www.nupack.org (nazadnje dostopano 14. 5. 2023 dostopano)

[4] AG Scientific: Diaohorase Enzymes – Why are they? https://agscientific.com/blog/all-about-diaphorase-enzymes.html (nazadnje dostopano 14.5.2023)

Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu

2023-05-12T13:28:08Z

Anagodesa: /* Vpliv sRNA, odvisne od Hfq, na izražanje reporterja AmCyan */

"Povzeto po članku [https://aiche.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/btpr.3324 Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324.]”

== Uvod ==

Nekodirajoče bakterijske RNA, med katere spada protismerna RNA (asRNA – antisense) in mala RNA (sRNA – small) postajajo pomembno orodje v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, ker omogočajo regulacijo izražanje genov brez popolnega izbijta gena. Z nepopolnim parjenjem baz se sRNA vežejo na mRNA, pogosto v bližino ribosom-vezavnega mesta (RBS) ali pa preprečijo oz. ojačajo vezavno na ribosom preko drugih mehanizmov [1,2] .
Tehnologija asRNA oz. sRNA se uporablja za detekcijo metabolnega stanja, uravnovešenje metabolnih poti, za kontrolo izražanja toksinov, za izboljšanje izkoristka in zmanjšanja količine stranskih produktov [1].
Večina aplikacij asRNA se izvaja v živih celicah. Vendar ima tak pristop kar nekaj pomanjkljivosti kot so kompleksnost živih celic, selektivna indukcija, naravna variabilnost, težave pri standardizaciji in neponovljivost rezultatov. Zato se razvija brezcelične sisteme (cell-free systems – CFS), ki vsebujejo celično komponente in vitro. Z uporabo CSF se izognemo kompleksnosti živih celic, zato je delo v takih sistemih bolj fleksibilno, možen je večji nadzor nad modifikacijami transkripcije/translacije, lahko se proizvede večje količine produktov, višja toleranca za toksične substrate/produkte/intermediate, lažje čiščenje produktov [1].
V članku Tannaiche et al so se ukvarjali z ugotavljanjem funkcije sRNA, neodvisne od Hfq, ki cilja različne dele mRNA fluorescenčnega barvila Anemoina majano cyan (AmCyan) ter encima diaforaza. Razvili so sRNA, ki poleg utišanja genov omogoča tudi prekomerno izražanje tarčnega proteina, kar do tedaj še ni bilo zabeleženo. Testiranje so najprej izvedli in vivo, vendar so zaradi nekonsistentnih rezultatov prešli na brezcelični sistem [1].

== Konstrukcija sRNA in plazmidov v sistemu z reporterjem AmCyan ==
Sintetični konstrukt sRNA je dolg 48 nukleotidov in je sestavljen iz treh delov. Zaporedje na 5' koncu tvori steblo-zanko, s čemer stabilizira RNA in omogoča interakcijo sRNA-mRNA (14 nk). Temu sledi 20 nukleotidov dolgo protismerno zaporedje za tarčno mRNA, ki cilja različne dele AmCyan. Na 3' koncu sRNA je še terminator v obliki stebla-zanke (14 nk) [1].

Uporabljeni plazmidi za testiranja sistema z reporterjem AmCyan
Uporabili so štiri različne plazmide. Prvi je pART15-C1 vsebuje zapis za reporterski fluorescenčni protein Anemoina majano cyan (AmCyan) pod inducibilnim promotrojem PBAD. Drugi uporabljen plazmid je pART15-C2, ki ima zapis za reporter AmCyan pod kontrolo promotorja PLtetO-1 in omogoča relativno določitev izražanja sRNA. Plazmid pART15-C1-LacZ ima sRNA konstrukt substituiran z lacZ in omogoča belo modri test po transformaciji bakterij. Zadnji plazmid je pART15-AS, ki vsebuje gen za reporter AmCyan pod kontrolo promotorja PBAD in zaporedje za sRNA pod kontrolo promotorja PLtet-O [1].
Sestavljanje konstrukta je potekalo z Gibbosonovim kloniranjem in gama-PCR.

== Optimizacija indukcije s plazmidom pART15-C1 in -C2 (in vivo sistem) ==
Za oceno izražanja reporterja AmCyan in sRNA v odvisnosti od koncentracije induktorjev so uporabili dva kontrolna plazmida: pART15-C1 in pART15-C2 in z njima transfecirali sev E. coli 10-. Merili so fluorescenco AmCyan pri različni koncentracijah induktorjev arabinoze (Ara) in anhidrotetraciklina (ATc) [1].
Med koncentracijo Ara oz. ATc in intenziteto fluorescence je bil opažen linearen odnos. S tem so pokazali, da se izražanje fluorescentnega reporterja in sRNA uravnava čez široko območje z uporabo omenjenih induktorjev [1].
S pretočno citometrijo so ocenili homogenost indukcije v celičnih populacijah pri različnih koncentracijah induktorjev Ara in ATc [1].

== Vpliv sRNA na izražanje reporterja AmCyan (in vivo) ==

Testirali so 12 različnih protismernih zaporedji s transformacijo seva E. coli 10- beta s plazmidom pART15-AS in merili fluorescenco celic v treh časovnih točkah (6, 18, 29 h) [1].
V prvem in vivo sistemu so pokazali, da je ciljanje RBS in prvih 20 baz mRNA reporterja AmCyan povzročilo signifikantno znižanje izražanja do 10% v 29 urah. Še bolj signifikantno znižanje izražanja reporterja je bilo prisotno pri ciljanju visoko-energijskega stebelnega dela sekundarne strukture mRNA (asB430), kjer so v šestih urah dosegli 25% utišanje. Ostale sRNA, ki ciljajo druge regije iniciacije translacija so dosegle signifikantno znižanja izražanja šele po dolgem času gojenja. Ciljanje visoko-energijskega stebla, ki je bolj oddaljen od mesta začetka translacije (asB407 in asB539) je v nekaterih primerih signifikantno znižalo fluorescenco, v drugih pa ne. Pri poskusu z asB606, ki cilja nizko-energijsko steblo, so izmerili signifikantno povišanje fluorescence pri 18h, vendar pri 29h signifikantnega povišanja ni bilo več prisotnega [1].
Čeprav so v in vivo sitemu dokazali nekaj signifikantnih sprememb izražanja reporterskega proteina, so rezultati zelo variirali, kar je verjetno posledica kompleksnosti živih celic. Zato so poskuse nadaljevali v brezceličnem sistemu [1].

== Brezcelični sistem (CFS) ==

CFS sistem so pripravili s sonifikacijo celice, ki so bile predhodno transformirane s plazmidom pART15-AS nato inducirali izraženje z Ara in ATc. Tako kot in vivo so najprej potrdili, da je odnos med intenziteto fluorescence in koncentracijo induktorja (Ara in ATc) linearen. Indukcija je bila dosežena po 24h, maksimum pa je fluorescenca dosegla po 96 urah. Podatki o fluorescenci so bili v CFS veliko bolj konsistentni kot in vivo, poleg tega pa je bilo prisotnih več signifikantnih rezultatov [1].

=== Vpliv sRNA na izražanje reporterja AmCyan v v brezceličnem sistemu ===

Ciljanje RBS v sistemu CFS ni povzročilo znižanja fluorescence, ciljanje prvih 20 nk pa je ravni izražanja znižalo bolj kot in vivo. S ciljanjem sekundarnih struktur mRNA so dosegli še močnejše utišanje; ciljanje visoko-energijskega stebla je povzročilo kar 65% utišanje , ciljanje 3' konca mRNA (asB701) pa je utišalo izražanje za kar 70% (in vivo le 19%). Pri ciljanju nizko-energijskega stebla (asB606) pa so dobili presenetljive rezultate, ki drugje v literaturi niso zabeleženi, in sicer je prišlo do signifikantnega zvišanja fluorescence za več kot 66%. Pri ciljanju drugega dela nizko-energijskega stebla (asB615) se je fluorescenca znižala [1].

=== Vpliv sRNA, odvisne od Hfq, na izražanje reporterja AmCyan ===
Nadaljnjo jih je zanimalo, ali lahko rezultate reproducirajo z uporabo sRNA, ki je odvisna od Hfq. V ostalih poskusih so namreč uporabljali sintetično sRNA, ki ni odvisna od Hfn. Uporabili so naravno pristno sRNA MicC, ki je vpletena v utišanje proteina zunanje membrane OmpC v E. coli in izkazuje visoke ravni utišanja genov. Protein Hfq deluje kot RNA šaperon MicC [1].
K ogrodju MicC so dodali ista protismerna zaporedja kot pri od-Hfq-neodvisni sRNA. Ciljanje prvih 20 nk mRNA s MicC-asB1 je vodilo v znižanje fluorescence, ki je bilo večje kot pri uporabi od-Hfq-neodvisne asRNA. Pri testiranju z MicC-asB606 ni bilo spremembe fluorescence, medtem ko je bilo pri sintetičnem ogrodju zvišanje flourescence kar 65%. Ciljanje RBS z MicC-asRBS je povzročilo zvišanje flourescence, kar se ne sklada z objavljenimi rezultati drugih v vivo študij, vendar so v nadaljevanju študije tudi ta pojav pojasnili [1].

== Določanje mehanizma delovanja sRNA asB606 z NUPACK in catRAPID ==

Za določanje mehanizma, ki povzroči prekomerno ekspresijo z asB606 sRNA, so za analizo uporabili program NUPACK, ki se uporablja za analizo načrtovanje struktur ter sistemov nukleinskih kislin [1,3]. Ugotovili so, da se asB606 veže na bazne bare 606-615 na AmCyan mRNA, ki tvorijo začetni del stebla-zanke zaščitenega 3' konca in je tudi prepoznavno mesto za RNaza E, ki po prepoznavi tudi cepi AmCyan mRNA. Vezava sRNA na to mesto oteži prepoznavo mRNA z RNazo E in s tem prepreči cepitev in posledično podaljša razpolovno dobo mRNA, kar vodi v zvišanje izražanja AmCyan in povišanja fluorescence. Vezavni potencial med RNazo E in AmCyan mRNA, določen s programom catRAPID, je bil v regiji 500-600 visok, kar pa še dodatno podpira teorijo, da sRNA asB606 zakrije prepoznavno mesto za RNazo E [1].
Z analizo NUPACK so analizirali tudi zvišano izražanje z MicC-asRBS, kjer takšnih rezultatov niso pričakovali. V nativni AmCyan mRNA je 5' konec zvit v stebelno sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo. Vezava MicC-asRNA na mRNA preprči nastanek takšne sekundarne strukture, s tem pa “sprosti” RBS in omogoči vezavo na ribosom [1].

== Regulacija izražnja diaforaze s sRNA in vitro ==
Diaforaza (DI) je topna NAD(P)H dehidrogenaza, ki je vpletena v nastanek NADH in NADPH v anaerobnih pogojih [1,4]. Uporablja se v sinteznih encimskih poteh za produkcijo visoko-vrednih kemikalij. Zato je zvišano izražanje tega encima tudi zanimivo in uporabno [1].
Z uporabo catRAPID so predvideli vezavna mesta za RNazo E na diaforazni mRNA in identificirali štiri tarčna mesta za sRNA, ki se nahajajo v bližini stebelnih zank in vezava, na katera bi lahko povzročilo zvišano izražanje [1].
Protismerna zaporedja, ki so bila del sRNA, so klonirali v plazmid pBAD-LIC in z njim transformirali sev E.coli BL21 Star (DE3). Brezcelični sistem so naredili s hkratno sonifikacijo kultur E.coli , ene, ki vsebuje zapis za diaforazo in druge z rekobinanitim plazmidom pBAD-AS [1].
Dva konstrukta (as410, as528) sta signifiakntno povečal izražanje diaforaze, en je dosegel zelo nizko povečanje (as510), zadnji pa je v enem replikat povišal izražanje, v drugih pa ni imel vpliva (as490) [1].
Čeprav so vsi konstrukti vsebovali protismerno zaporedje, ki cilja vezavno mesto za RNazo E na diaforazono mRNA, so bili vplivi konstruktov raznoliki. Rezultati so lahko posledica prisotnosti več vezavnih mest za RNazo E, poleg tega pa uporabljen sev E.coli lahko metabolizira induktor Ara in s tem zniža izražanje sRNA [1].

== Zaključek ==
Naravne in sintetične sRNA imajo velik potencial v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, saj omogočajo regulacijo izražanja genov brez popolnega izbitja gena, preko induciranega izražanja sRNA pa se lahko uvede še večji nadzor nad regulacijo izražanja tarčenga gena. So majhne, kar omogoča izražanje več sRNA iz istega plazmida. Tannaiche et al so prvič pokazali, da s sRNA lahko selektivno tudi zvišamo izražanje tarčnega gena v CFS. Poleg tega pa so pokazali, da se lahko sRNA prilagodi na različne sisteme in na regulacijo različnih proteinov [1].

== Literatura ==
[1] Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324. doi:10.1002/btpr.3324

[2] Storz G, Vogel J, Wassarman, K M. Regulation by Small RNAs in Bacteria: Expanding Frontiers. Molecular Cell. 2011. 43(6), 880–891.doi:10.1016/j.molcel.2011.08.022

[3] NUPACK. https://www.nupack.org (nazadnje dostopano 14. 5. 2023 dostopano)

[4] AG Scientific: Diaohorase Enzymes – Why are they? https://agscientific.com/blog/all-about-diaphorase-enzymes.html (nazadnje dostopano 14.5.2023)

Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu

2023-05-12T13:27:51Z

Anagodesa: /* Vpliv sRNA na izražanje reporterja AmCyan v v brezceličnem sistemu */

"Povzeto po članku [https://aiche.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/btpr.3324 Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324.]”

== Uvod ==

Nekodirajoče bakterijske RNA, med katere spada protismerna RNA (asRNA – antisense) in mala RNA (sRNA – small) postajajo pomembno orodje v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, ker omogočajo regulacijo izražanje genov brez popolnega izbijta gena. Z nepopolnim parjenjem baz se sRNA vežejo na mRNA, pogosto v bližino ribosom-vezavnega mesta (RBS) ali pa preprečijo oz. ojačajo vezavno na ribosom preko drugih mehanizmov [1,2] .
Tehnologija asRNA oz. sRNA se uporablja za detekcijo metabolnega stanja, uravnovešenje metabolnih poti, za kontrolo izražanja toksinov, za izboljšanje izkoristka in zmanjšanja količine stranskih produktov [1].
Večina aplikacij asRNA se izvaja v živih celicah. Vendar ima tak pristop kar nekaj pomanjkljivosti kot so kompleksnost živih celic, selektivna indukcija, naravna variabilnost, težave pri standardizaciji in neponovljivost rezultatov. Zato se razvija brezcelične sisteme (cell-free systems – CFS), ki vsebujejo celično komponente in vitro. Z uporabo CSF se izognemo kompleksnosti živih celic, zato je delo v takih sistemih bolj fleksibilno, možen je večji nadzor nad modifikacijami transkripcije/translacije, lahko se proizvede večje količine produktov, višja toleranca za toksične substrate/produkte/intermediate, lažje čiščenje produktov [1].
V članku Tannaiche et al so se ukvarjali z ugotavljanjem funkcije sRNA, neodvisne od Hfq, ki cilja različne dele mRNA fluorescenčnega barvila Anemoina majano cyan (AmCyan) ter encima diaforaza. Razvili so sRNA, ki poleg utišanja genov omogoča tudi prekomerno izražanje tarčnega proteina, kar do tedaj še ni bilo zabeleženo. Testiranje so najprej izvedli in vivo, vendar so zaradi nekonsistentnih rezultatov prešli na brezcelični sistem [1].

== Konstrukcija sRNA in plazmidov v sistemu z reporterjem AmCyan ==
Sintetični konstrukt sRNA je dolg 48 nukleotidov in je sestavljen iz treh delov. Zaporedje na 5' koncu tvori steblo-zanko, s čemer stabilizira RNA in omogoča interakcijo sRNA-mRNA (14 nk). Temu sledi 20 nukleotidov dolgo protismerno zaporedje za tarčno mRNA, ki cilja različne dele AmCyan. Na 3' koncu sRNA je še terminator v obliki stebla-zanke (14 nk) [1].

Uporabljeni plazmidi za testiranja sistema z reporterjem AmCyan
Uporabili so štiri različne plazmide. Prvi je pART15-C1 vsebuje zapis za reporterski fluorescenčni protein Anemoina majano cyan (AmCyan) pod inducibilnim promotrojem PBAD. Drugi uporabljen plazmid je pART15-C2, ki ima zapis za reporter AmCyan pod kontrolo promotorja PLtetO-1 in omogoča relativno določitev izražanja sRNA. Plazmid pART15-C1-LacZ ima sRNA konstrukt substituiran z lacZ in omogoča belo modri test po transformaciji bakterij. Zadnji plazmid je pART15-AS, ki vsebuje gen za reporter AmCyan pod kontrolo promotorja PBAD in zaporedje za sRNA pod kontrolo promotorja PLtet-O [1].
Sestavljanje konstrukta je potekalo z Gibbosonovim kloniranjem in gama-PCR.

== Optimizacija indukcije s plazmidom pART15-C1 in -C2 (in vivo sistem) ==
Za oceno izražanja reporterja AmCyan in sRNA v odvisnosti od koncentracije induktorjev so uporabili dva kontrolna plazmida: pART15-C1 in pART15-C2 in z njima transfecirali sev E. coli 10-. Merili so fluorescenco AmCyan pri različni koncentracijah induktorjev arabinoze (Ara) in anhidrotetraciklina (ATc) [1].
Med koncentracijo Ara oz. ATc in intenziteto fluorescence je bil opažen linearen odnos. S tem so pokazali, da se izražanje fluorescentnega reporterja in sRNA uravnava čez široko območje z uporabo omenjenih induktorjev [1].
S pretočno citometrijo so ocenili homogenost indukcije v celičnih populacijah pri različnih koncentracijah induktorjev Ara in ATc [1].

== Vpliv sRNA na izražanje reporterja AmCyan (in vivo) ==

Testirali so 12 različnih protismernih zaporedji s transformacijo seva E. coli 10- beta s plazmidom pART15-AS in merili fluorescenco celic v treh časovnih točkah (6, 18, 29 h) [1].
V prvem in vivo sistemu so pokazali, da je ciljanje RBS in prvih 20 baz mRNA reporterja AmCyan povzročilo signifikantno znižanje izražanja do 10% v 29 urah. Še bolj signifikantno znižanje izražanja reporterja je bilo prisotno pri ciljanju visoko-energijskega stebelnega dela sekundarne strukture mRNA (asB430), kjer so v šestih urah dosegli 25% utišanje. Ostale sRNA, ki ciljajo druge regije iniciacije translacija so dosegle signifikantno znižanja izražanja šele po dolgem času gojenja. Ciljanje visoko-energijskega stebla, ki je bolj oddaljen od mesta začetka translacije (asB407 in asB539) je v nekaterih primerih signifikantno znižalo fluorescenco, v drugih pa ne. Pri poskusu z asB606, ki cilja nizko-energijsko steblo, so izmerili signifikantno povišanje fluorescence pri 18h, vendar pri 29h signifikantnega povišanja ni bilo več prisotnega [1].
Čeprav so v in vivo sitemu dokazali nekaj signifikantnih sprememb izražanja reporterskega proteina, so rezultati zelo variirali, kar je verjetno posledica kompleksnosti živih celic. Zato so poskuse nadaljevali v brezceličnem sistemu [1].

== Brezcelični sistem (CFS) ==

CFS sistem so pripravili s sonifikacijo celice, ki so bile predhodno transformirane s plazmidom pART15-AS nato inducirali izraženje z Ara in ATc. Tako kot in vivo so najprej potrdili, da je odnos med intenziteto fluorescence in koncentracijo induktorja (Ara in ATc) linearen. Indukcija je bila dosežena po 24h, maksimum pa je fluorescenca dosegla po 96 urah. Podatki o fluorescenci so bili v CFS veliko bolj konsistentni kot in vivo, poleg tega pa je bilo prisotnih več signifikantnih rezultatov [1].

=== Vpliv sRNA na izražanje reporterja AmCyan v v brezceličnem sistemu ===

Ciljanje RBS v sistemu CFS ni povzročilo znižanja fluorescence, ciljanje prvih 20 nk pa je ravni izražanja znižalo bolj kot in vivo. S ciljanjem sekundarnih struktur mRNA so dosegli še močnejše utišanje; ciljanje visoko-energijskega stebla je povzročilo kar 65% utišanje , ciljanje 3' konca mRNA (asB701) pa je utišalo izražanje za kar 70% (in vivo le 19%). Pri ciljanju nizko-energijskega stebla (asB606) pa so dobili presenetljive rezultate, ki drugje v literaturi niso zabeleženi, in sicer je prišlo do signifikantnega zvišanja fluorescence za več kot 66%. Pri ciljanju drugega dela nizko-energijskega stebla (asB615) se je fluorescenca znižala [1].

== Vpliv sRNA, odvisne od Hfq, na izražanje reporterja AmCyan ==
Nadaljnjo jih je zanimalo, ali lahko rezultate reproducirajo z uporabo sRNA, ki je odvisna od Hfq. V ostalih poskusih so namreč uporabljali sintetično sRNA, ki ni odvisna od Hfn. Uporabili so naravno pristno sRNA MicC, ki je vpletena v utišanje proteina zunanje membrane OmpC v E. coli in izkazuje visoke ravni utišanja genov. Protein Hfq deluje kot RNA šaperon MicC [1].
K ogrodju MicC so dodali ista protismerna zaporedja kot pri od-Hfq-neodvisni sRNA. Ciljanje prvih 20 nk mRNA s MicC-asB1 je vodilo v znižanje fluorescence, ki je bilo večje kot pri uporabi od-Hfq-neodvisne asRNA. Pri testiranju z MicC-asB606 ni bilo spremembe fluorescence, medtem ko je bilo pri sintetičnem ogrodju zvišanje flourescence kar 65%. Ciljanje RBS z MicC-asRBS je povzročilo zvišanje flourescence, kar se ne sklada z objavljenimi rezultati drugih v vivo študij, vendar so v nadaljevanju študije tudi ta pojav pojasnili [1].

== Določanje mehanizma delovanja sRNA asB606 z NUPACK in catRAPID ==

Za določanje mehanizma, ki povzroči prekomerno ekspresijo z asB606 sRNA, so za analizo uporabili program NUPACK, ki se uporablja za analizo načrtovanje struktur ter sistemov nukleinskih kislin [1,3]. Ugotovili so, da se asB606 veže na bazne bare 606-615 na AmCyan mRNA, ki tvorijo začetni del stebla-zanke zaščitenega 3' konca in je tudi prepoznavno mesto za RNaza E, ki po prepoznavi tudi cepi AmCyan mRNA. Vezava sRNA na to mesto oteži prepoznavo mRNA z RNazo E in s tem prepreči cepitev in posledično podaljša razpolovno dobo mRNA, kar vodi v zvišanje izražanja AmCyan in povišanja fluorescence. Vezavni potencial med RNazo E in AmCyan mRNA, določen s programom catRAPID, je bil v regiji 500-600 visok, kar pa še dodatno podpira teorijo, da sRNA asB606 zakrije prepoznavno mesto za RNazo E [1].
Z analizo NUPACK so analizirali tudi zvišano izražanje z MicC-asRBS, kjer takšnih rezultatov niso pričakovali. V nativni AmCyan mRNA je 5' konec zvit v stebelno sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo. Vezava MicC-asRNA na mRNA preprči nastanek takšne sekundarne strukture, s tem pa “sprosti” RBS in omogoči vezavo na ribosom [1].

== Regulacija izražnja diaforaze s sRNA in vitro ==
Diaforaza (DI) je topna NAD(P)H dehidrogenaza, ki je vpletena v nastanek NADH in NADPH v anaerobnih pogojih [1,4]. Uporablja se v sinteznih encimskih poteh za produkcijo visoko-vrednih kemikalij. Zato je zvišano izražanje tega encima tudi zanimivo in uporabno [1].
Z uporabo catRAPID so predvideli vezavna mesta za RNazo E na diaforazni mRNA in identificirali štiri tarčna mesta za sRNA, ki se nahajajo v bližini stebelnih zank in vezava, na katera bi lahko povzročilo zvišano izražanje [1].
Protismerna zaporedja, ki so bila del sRNA, so klonirali v plazmid pBAD-LIC in z njim transformirali sev E.coli BL21 Star (DE3). Brezcelični sistem so naredili s hkratno sonifikacijo kultur E.coli , ene, ki vsebuje zapis za diaforazo in druge z rekobinanitim plazmidom pBAD-AS [1].
Dva konstrukta (as410, as528) sta signifiakntno povečal izražanje diaforaze, en je dosegel zelo nizko povečanje (as510), zadnji pa je v enem replikat povišal izražanje, v drugih pa ni imel vpliva (as490) [1].
Čeprav so vsi konstrukti vsebovali protismerno zaporedje, ki cilja vezavno mesto za RNazo E na diaforazono mRNA, so bili vplivi konstruktov raznoliki. Rezultati so lahko posledica prisotnosti več vezavnih mest za RNazo E, poleg tega pa uporabljen sev E.coli lahko metabolizira induktor Ara in s tem zniža izražanje sRNA [1].

== Zaključek ==
Naravne in sintetične sRNA imajo velik potencial v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, saj omogočajo regulacijo izražanja genov brez popolnega izbitja gena, preko induciranega izražanja sRNA pa se lahko uvede še večji nadzor nad regulacijo izražanja tarčenga gena. So majhne, kar omogoča izražanje več sRNA iz istega plazmida. Tannaiche et al so prvič pokazali, da s sRNA lahko selektivno tudi zvišamo izražanje tarčnega gena v CFS. Poleg tega pa so pokazali, da se lahko sRNA prilagodi na različne sisteme in na regulacijo različnih proteinov [1].

== Literatura ==
[1] Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324. doi:10.1002/btpr.3324

[2] Storz G, Vogel J, Wassarman, K M. Regulation by Small RNAs in Bacteria: Expanding Frontiers. Molecular Cell. 2011. 43(6), 880–891.doi:10.1016/j.molcel.2011.08.022

[3] NUPACK. https://www.nupack.org (nazadnje dostopano 14. 5. 2023 dostopano)

[4] AG Scientific: Diaohorase Enzymes – Why are they? https://agscientific.com/blog/all-about-diaphorase-enzymes.html (nazadnje dostopano 14.5.2023)

User:Anagodesa

2023-05-12T13:25:45Z

Anagodesa: User:Anagodesa moved to Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu

#REDIRECT [[Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu]]

Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu

2023-05-12T13:25:45Z

Anagodesa: User:Anagodesa moved to Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu

"Povzeto po članku [https://aiche.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/btpr.3324 Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324.]”

== Uvod ==

Nekodirajoče bakterijske RNA, med katere spada protismerna RNA (asRNA – antisense) in mala RNA (sRNA – small) postajajo pomembno orodje v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, ker omogočajo regulacijo izražanje genov brez popolnega izbijta gena. Z nepopolnim parjenjem baz se sRNA vežejo na mRNA, pogosto v bližino ribosom-vezavnega mesta (RBS) ali pa preprečijo oz. ojačajo vezavno na ribosom preko drugih mehanizmov [1,2] .
Tehnologija asRNA oz. sRNA se uporablja za detekcijo metabolnega stanja, uravnovešenje metabolnih poti, za kontrolo izražanja toksinov, za izboljšanje izkoristka in zmanjšanja količine stranskih produktov [1].
Večina aplikacij asRNA se izvaja v živih celicah. Vendar ima tak pristop kar nekaj pomanjkljivosti kot so kompleksnost živih celic, selektivna indukcija, naravna variabilnost, težave pri standardizaciji in neponovljivost rezultatov. Zato se razvija brezcelične sisteme (cell-free systems – CFS), ki vsebujejo celično komponente in vitro. Z uporabo CSF se izognemo kompleksnosti živih celic, zato je delo v takih sistemih bolj fleksibilno, možen je večji nadzor nad modifikacijami transkripcije/translacije, lahko se proizvede večje količine produktov, višja toleranca za toksične substrate/produkte/intermediate, lažje čiščenje produktov [1].
V članku Tannaiche et al so se ukvarjali z ugotavljanjem funkcije sRNA, neodvisne od Hfq, ki cilja različne dele mRNA fluorescenčnega barvila Anemoina majano cyan (AmCyan) ter encima diaforaza. Razvili so sRNA, ki poleg utišanja genov omogoča tudi prekomerno izražanje tarčnega proteina, kar do tedaj še ni bilo zabeleženo. Testiranje so najprej izvedli in vivo, vendar so zaradi nekonsistentnih rezultatov prešli na brezcelični sistem [1].

== Konstrukcija sRNA in plazmidov v sistemu z reporterjem AmCyan ==
Sintetični konstrukt sRNA je dolg 48 nukleotidov in je sestavljen iz treh delov. Zaporedje na 5' koncu tvori steblo-zanko, s čemer stabilizira RNA in omogoča interakcijo sRNA-mRNA (14 nk). Temu sledi 20 nukleotidov dolgo protismerno zaporedje za tarčno mRNA, ki cilja različne dele AmCyan. Na 3' koncu sRNA je še terminator v obliki stebla-zanke (14 nk) [1].

Uporabljeni plazmidi za testiranja sistema z reporterjem AmCyan
Uporabili so štiri različne plazmide. Prvi je pART15-C1 vsebuje zapis za reporterski fluorescenčni protein Anemoina majano cyan (AmCyan) pod inducibilnim promotrojem PBAD. Drugi uporabljen plazmid je pART15-C2, ki ima zapis za reporter AmCyan pod kontrolo promotorja PLtetO-1 in omogoča relativno določitev izražanja sRNA. Plazmid pART15-C1-LacZ ima sRNA konstrukt substituiran z lacZ in omogoča belo modri test po transformaciji bakterij. Zadnji plazmid je pART15-AS, ki vsebuje gen za reporter AmCyan pod kontrolo promotorja PBAD in zaporedje za sRNA pod kontrolo promotorja PLtet-O [1].
Sestavljanje konstrukta je potekalo z Gibbosonovim kloniranjem in gama-PCR.

== Optimizacija indukcije s plazmidom pART15-C1 in -C2 (in vivo sistem) ==
Za oceno izražanja reporterja AmCyan in sRNA v odvisnosti od koncentracije induktorjev so uporabili dva kontrolna plazmida: pART15-C1 in pART15-C2 in z njima transfecirali sev E. coli 10-. Merili so fluorescenco AmCyan pri različni koncentracijah induktorjev arabinoze (Ara) in anhidrotetraciklina (ATc) [1].
Med koncentracijo Ara oz. ATc in intenziteto fluorescence je bil opažen linearen odnos. S tem so pokazali, da se izražanje fluorescentnega reporterja in sRNA uravnava čez široko območje z uporabo omenjenih induktorjev [1].
S pretočno citometrijo so ocenili homogenost indukcije v celičnih populacijah pri različnih koncentracijah induktorjev Ara in ATc [1].

== Vpliv sRNA na izražanje reporterja AmCyan (in vivo) ==

Testirali so 12 različnih protismernih zaporedji s transformacijo seva E. coli 10- beta s plazmidom pART15-AS in merili fluorescenco celic v treh časovnih točkah (6, 18, 29 h) [1].
V prvem in vivo sistemu so pokazali, da je ciljanje RBS in prvih 20 baz mRNA reporterja AmCyan povzročilo signifikantno znižanje izražanja do 10% v 29 urah. Še bolj signifikantno znižanje izražanja reporterja je bilo prisotno pri ciljanju visoko-energijskega stebelnega dela sekundarne strukture mRNA (asB430), kjer so v šestih urah dosegli 25% utišanje. Ostale sRNA, ki ciljajo druge regije iniciacije translacija so dosegle signifikantno znižanja izražanja šele po dolgem času gojenja. Ciljanje visoko-energijskega stebla, ki je bolj oddaljen od mesta začetka translacije (asB407 in asB539) je v nekaterih primerih signifikantno znižalo fluorescenco, v drugih pa ne. Pri poskusu z asB606, ki cilja nizko-energijsko steblo, so izmerili signifikantno povišanje fluorescence pri 18h, vendar pri 29h signifikantnega povišanja ni bilo več prisotnega [1].
Čeprav so v in vivo sitemu dokazali nekaj signifikantnih sprememb izražanja reporterskega proteina, so rezultati zelo variirali, kar je verjetno posledica kompleksnosti živih celic. Zato so poskuse nadaljevali v brezceličnem sistemu [1].

== Brezcelični sistem (CFS) ==

CFS sistem so pripravili s sonifikacijo celice, ki so bile predhodno transformirane s plazmidom pART15-AS nato inducirali izraženje z Ara in ATc. Tako kot in vivo so najprej potrdili, da je odnos med intenziteto fluorescence in koncentracijo induktorja (Ara in ATc) linearen. Indukcija je bila dosežena po 24h, maksimum pa je fluorescenca dosegla po 96 urah. Podatki o fluorescenci so bili v CFS veliko bolj konsistentni kot in vivo, poleg tega pa je bilo prisotnih več signifikantnih rezultatov [1].

== Vpliv sRNA na izražanje reporterja AmCyan v v brezceličnem sistemu ==

Ciljanje RBS v sistemu CFS ni povzročilo znižanja fluorescence, ciljanje prvih 20 nk pa je ravni izražanja znižalo bolj kot in vivo. S ciljanjem sekundarnih struktur mRNA so dosegli še močnejše utišanje; ciljanje visoko-energijskega stebla je povzročilo kar 65% utišanje , ciljanje 3' konca mRNA (asB701) pa je utišalo izražanje za kar 70% (in vivo le 19%). Pri ciljanju nizko-energijskega stebla (asB606) pa so dobili presenetljive rezultate, ki drugje v literaturi niso zabeleženi, in sicer je prišlo do signifikantnega zvišanja fluorescence za več kot 66%. Pri ciljanju drugega dela nizko-energijskega stebla (asB615) se je fluorescenca znižala [1].

== Vpliv sRNA, odvisne od Hfq, na izražanje reporterja AmCyan ==
Nadaljnjo jih je zanimalo, ali lahko rezultate reproducirajo z uporabo sRNA, ki je odvisna od Hfq. V ostalih poskusih so namreč uporabljali sintetično sRNA, ki ni odvisna od Hfn. Uporabili so naravno pristno sRNA MicC, ki je vpletena v utišanje proteina zunanje membrane OmpC v E. coli in izkazuje visoke ravni utišanja genov. Protein Hfq deluje kot RNA šaperon MicC [1].
K ogrodju MicC so dodali ista protismerna zaporedja kot pri od-Hfq-neodvisni sRNA. Ciljanje prvih 20 nk mRNA s MicC-asB1 je vodilo v znižanje fluorescence, ki je bilo večje kot pri uporabi od-Hfq-neodvisne asRNA. Pri testiranju z MicC-asB606 ni bilo spremembe fluorescence, medtem ko je bilo pri sintetičnem ogrodju zvišanje flourescence kar 65%. Ciljanje RBS z MicC-asRBS je povzročilo zvišanje flourescence, kar se ne sklada z objavljenimi rezultati drugih v vivo študij, vendar so v nadaljevanju študije tudi ta pojav pojasnili [1].

== Določanje mehanizma delovanja sRNA asB606 z NUPACK in catRAPID ==

Za določanje mehanizma, ki povzroči prekomerno ekspresijo z asB606 sRNA, so za analizo uporabili program NUPACK, ki se uporablja za analizo načrtovanje struktur ter sistemov nukleinskih kislin [1,3]. Ugotovili so, da se asB606 veže na bazne bare 606-615 na AmCyan mRNA, ki tvorijo začetni del stebla-zanke zaščitenega 3' konca in je tudi prepoznavno mesto za RNaza E, ki po prepoznavi tudi cepi AmCyan mRNA. Vezava sRNA na to mesto oteži prepoznavo mRNA z RNazo E in s tem prepreči cepitev in posledično podaljša razpolovno dobo mRNA, kar vodi v zvišanje izražanja AmCyan in povišanja fluorescence. Vezavni potencial med RNazo E in AmCyan mRNA, določen s programom catRAPID, je bil v regiji 500-600 visok, kar pa še dodatno podpira teorijo, da sRNA asB606 zakrije prepoznavno mesto za RNazo E [1].
Z analizo NUPACK so analizirali tudi zvišano izražanje z MicC-asRBS, kjer takšnih rezultatov niso pričakovali. V nativni AmCyan mRNA je 5' konec zvit v stebelno sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo. Vezava MicC-asRNA na mRNA preprči nastanek takšne sekundarne strukture, s tem pa “sprosti” RBS in omogoči vezavo na ribosom [1].

== Regulacija izražnja diaforaze s sRNA in vitro ==
Diaforaza (DI) je topna NAD(P)H dehidrogenaza, ki je vpletena v nastanek NADH in NADPH v anaerobnih pogojih [1,4]. Uporablja se v sinteznih encimskih poteh za produkcijo visoko-vrednih kemikalij. Zato je zvišano izražanje tega encima tudi zanimivo in uporabno [1].
Z uporabo catRAPID so predvideli vezavna mesta za RNazo E na diaforazni mRNA in identificirali štiri tarčna mesta za sRNA, ki se nahajajo v bližini stebelnih zank in vezava, na katera bi lahko povzročilo zvišano izražanje [1].
Protismerna zaporedja, ki so bila del sRNA, so klonirali v plazmid pBAD-LIC in z njim transformirali sev E.coli BL21 Star (DE3). Brezcelični sistem so naredili s hkratno sonifikacijo kultur E.coli , ene, ki vsebuje zapis za diaforazo in druge z rekobinanitim plazmidom pBAD-AS [1].
Dva konstrukta (as410, as528) sta signifiakntno povečal izražanje diaforaze, en je dosegel zelo nizko povečanje (as510), zadnji pa je v enem replikat povišal izražanje, v drugih pa ni imel vpliva (as490) [1].
Čeprav so vsi konstrukti vsebovali protismerno zaporedje, ki cilja vezavno mesto za RNazo E na diaforazono mRNA, so bili vplivi konstruktov raznoliki. Rezultati so lahko posledica prisotnosti več vezavnih mest za RNazo E, poleg tega pa uporabljen sev E.coli lahko metabolizira induktor Ara in s tem zniža izražanje sRNA [1].

== Zaključek ==
Naravne in sintetične sRNA imajo velik potencial v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, saj omogočajo regulacijo izražanja genov brez popolnega izbitja gena, preko induciranega izražanja sRNA pa se lahko uvede še večji nadzor nad regulacijo izražanja tarčenga gena. So majhne, kar omogoča izražanje več sRNA iz istega plazmida. Tannaiche et al so prvič pokazali, da s sRNA lahko selektivno tudi zvišamo izražanje tarčnega gena v CFS. Poleg tega pa so pokazali, da se lahko sRNA prilagodi na različne sisteme in na regulacijo različnih proteinov [1].

== Literatura ==
[1] Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324. doi:10.1002/btpr.3324

[2] Storz G, Vogel J, Wassarman, K M. Regulation by Small RNAs in Bacteria: Expanding Frontiers. Molecular Cell. 2011. 43(6), 880–891.doi:10.1016/j.molcel.2011.08.022

[3] NUPACK. https://www.nupack.org (nazadnje dostopano 14. 5. 2023 dostopano)

[4] AG Scientific: Diaohorase Enzymes – Why are they? https://agscientific.com/blog/all-about-diaphorase-enzymes.html (nazadnje dostopano 14.5.2023)

Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu

2023-05-12T13:23:40Z

Anagodesa: New page: "Povzeto po članku [https://aiche.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/btpr.3324 Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protei...

"Povzeto po članku [https://aiche.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/btpr.3324 Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324.]”

== Uvod ==

Nekodirajoče bakterijske RNA, med katere spada protismerna RNA (asRNA – antisense) in mala RNA (sRNA – small) postajajo pomembno orodje v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, ker omogočajo regulacijo izražanje genov brez popolnega izbijta gena. Z nepopolnim parjenjem baz se sRNA vežejo na mRNA, pogosto v bližino ribosom-vezavnega mesta (RBS) ali pa preprečijo oz. ojačajo vezavno na ribosom preko drugih mehanizmov [1,2] .
Tehnologija asRNA oz. sRNA se uporablja za detekcijo metabolnega stanja, uravnovešenje metabolnih poti, za kontrolo izražanja toksinov, za izboljšanje izkoristka in zmanjšanja količine stranskih produktov [1].
Večina aplikacij asRNA se izvaja v živih celicah. Vendar ima tak pristop kar nekaj pomanjkljivosti kot so kompleksnost živih celic, selektivna indukcija, naravna variabilnost, težave pri standardizaciji in neponovljivost rezultatov. Zato se razvija brezcelične sisteme (cell-free systems – CFS), ki vsebujejo celično komponente in vitro. Z uporabo CSF se izognemo kompleksnosti živih celic, zato je delo v takih sistemih bolj fleksibilno, možen je večji nadzor nad modifikacijami transkripcije/translacije, lahko se proizvede večje količine produktov, višja toleranca za toksične substrate/produkte/intermediate, lažje čiščenje produktov [1].
V članku Tannaiche et al so se ukvarjali z ugotavljanjem funkcije sRNA, neodvisne od Hfq, ki cilja različne dele mRNA fluorescenčnega barvila Anemoina majano cyan (AmCyan) ter encima diaforaza. Razvili so sRNA, ki poleg utišanja genov omogoča tudi prekomerno izražanje tarčnega proteina, kar do tedaj še ni bilo zabeleženo. Testiranje so najprej izvedli in vivo, vendar so zaradi nekonsistentnih rezultatov prešli na brezcelični sistem [1].

== Konstrukcija sRNA in plazmidov v sistemu z reporterjem AmCyan ==
Sintetični konstrukt sRNA je dolg 48 nukleotidov in je sestavljen iz treh delov. Zaporedje na 5' koncu tvori steblo-zanko, s čemer stabilizira RNA in omogoča interakcijo sRNA-mRNA (14 nk). Temu sledi 20 nukleotidov dolgo protismerno zaporedje za tarčno mRNA, ki cilja različne dele AmCyan. Na 3' koncu sRNA je še terminator v obliki stebla-zanke (14 nk) [1].

Uporabljeni plazmidi za testiranja sistema z reporterjem AmCyan
Uporabili so štiri različne plazmide. Prvi je pART15-C1 vsebuje zapis za reporterski fluorescenčni protein Anemoina majano cyan (AmCyan) pod inducibilnim promotrojem PBAD. Drugi uporabljen plazmid je pART15-C2, ki ima zapis za reporter AmCyan pod kontrolo promotorja PLtetO-1 in omogoča relativno določitev izražanja sRNA. Plazmid pART15-C1-LacZ ima sRNA konstrukt substituiran z lacZ in omogoča belo modri test po transformaciji bakterij. Zadnji plazmid je pART15-AS, ki vsebuje gen za reporter AmCyan pod kontrolo promotorja PBAD in zaporedje za sRNA pod kontrolo promotorja PLtet-O [1].
Sestavljanje konstrukta je potekalo z Gibbosonovim kloniranjem in gama-PCR.

== Optimizacija indukcije s plazmidom pART15-C1 in -C2 (in vivo sistem) ==
Za oceno izražanja reporterja AmCyan in sRNA v odvisnosti od koncentracije induktorjev so uporabili dva kontrolna plazmida: pART15-C1 in pART15-C2 in z njima transfecirali sev E. coli 10-. Merili so fluorescenco AmCyan pri različni koncentracijah induktorjev arabinoze (Ara) in anhidrotetraciklina (ATc) [1].
Med koncentracijo Ara oz. ATc in intenziteto fluorescence je bil opažen linearen odnos. S tem so pokazali, da se izražanje fluorescentnega reporterja in sRNA uravnava čez široko območje z uporabo omenjenih induktorjev [1].
S pretočno citometrijo so ocenili homogenost indukcije v celičnih populacijah pri različnih koncentracijah induktorjev Ara in ATc [1].

== Vpliv sRNA na izražanje reporterja AmCyan (in vivo) ==

Testirali so 12 različnih protismernih zaporedji s transformacijo seva E. coli 10- beta s plazmidom pART15-AS in merili fluorescenco celic v treh časovnih točkah (6, 18, 29 h) [1].
V prvem in vivo sistemu so pokazali, da je ciljanje RBS in prvih 20 baz mRNA reporterja AmCyan povzročilo signifikantno znižanje izražanja do 10% v 29 urah. Še bolj signifikantno znižanje izražanja reporterja je bilo prisotno pri ciljanju visoko-energijskega stebelnega dela sekundarne strukture mRNA (asB430), kjer so v šestih urah dosegli 25% utišanje. Ostale sRNA, ki ciljajo druge regije iniciacije translacija so dosegle signifikantno znižanja izražanja šele po dolgem času gojenja. Ciljanje visoko-energijskega stebla, ki je bolj oddaljen od mesta začetka translacije (asB407 in asB539) je v nekaterih primerih signifikantno znižalo fluorescenco, v drugih pa ne. Pri poskusu z asB606, ki cilja nizko-energijsko steblo, so izmerili signifikantno povišanje fluorescence pri 18h, vendar pri 29h signifikantnega povišanja ni bilo več prisotnega [1].
Čeprav so v in vivo sitemu dokazali nekaj signifikantnih sprememb izražanja reporterskega proteina, so rezultati zelo variirali, kar je verjetno posledica kompleksnosti živih celic. Zato so poskuse nadaljevali v brezceličnem sistemu [1].

== Brezcelični sistem (CFS) ==

CFS sistem so pripravili s sonifikacijo celice, ki so bile predhodno transformirane s plazmidom pART15-AS nato inducirali izraženje z Ara in ATc. Tako kot in vivo so najprej potrdili, da je odnos med intenziteto fluorescence in koncentracijo induktorja (Ara in ATc) linearen. Indukcija je bila dosežena po 24h, maksimum pa je fluorescenca dosegla po 96 urah. Podatki o fluorescenci so bili v CFS veliko bolj konsistentni kot in vivo, poleg tega pa je bilo prisotnih več signifikantnih rezultatov [1].

== Vpliv sRNA na izražanje reporterja AmCyan v v brezceličnem sistemu ==

Ciljanje RBS v sistemu CFS ni povzročilo znižanja fluorescence, ciljanje prvih 20 nk pa je ravni izražanja znižalo bolj kot in vivo. S ciljanjem sekundarnih struktur mRNA so dosegli še močnejše utišanje; ciljanje visoko-energijskega stebla je povzročilo kar 65% utišanje , ciljanje 3' konca mRNA (asB701) pa je utišalo izražanje za kar 70% (in vivo le 19%). Pri ciljanju nizko-energijskega stebla (asB606) pa so dobili presenetljive rezultate, ki drugje v literaturi niso zabeleženi, in sicer je prišlo do signifikantnega zvišanja fluorescence za več kot 66%. Pri ciljanju drugega dela nizko-energijskega stebla (asB615) se je fluorescenca znižala [1].

== Vpliv sRNA, odvisne od Hfq, na izražanje reporterja AmCyan ==
Nadaljnjo jih je zanimalo, ali lahko rezultate reproducirajo z uporabo sRNA, ki je odvisna od Hfq. V ostalih poskusih so namreč uporabljali sintetično sRNA, ki ni odvisna od Hfn. Uporabili so naravno pristno sRNA MicC, ki je vpletena v utišanje proteina zunanje membrane OmpC v E. coli in izkazuje visoke ravni utišanja genov. Protein Hfq deluje kot RNA šaperon MicC [1].
K ogrodju MicC so dodali ista protismerna zaporedja kot pri od-Hfq-neodvisni sRNA. Ciljanje prvih 20 nk mRNA s MicC-asB1 je vodilo v znižanje fluorescence, ki je bilo večje kot pri uporabi od-Hfq-neodvisne asRNA. Pri testiranju z MicC-asB606 ni bilo spremembe fluorescence, medtem ko je bilo pri sintetičnem ogrodju zvišanje flourescence kar 65%. Ciljanje RBS z MicC-asRBS je povzročilo zvišanje flourescence, kar se ne sklada z objavljenimi rezultati drugih v vivo študij, vendar so v nadaljevanju študije tudi ta pojav pojasnili [1].

== Določanje mehanizma delovanja sRNA asB606 z NUPACK in catRAPID ==

Za določanje mehanizma, ki povzroči prekomerno ekspresijo z asB606 sRNA, so za analizo uporabili program NUPACK, ki se uporablja za analizo načrtovanje struktur ter sistemov nukleinskih kislin [1,3]. Ugotovili so, da se asB606 veže na bazne bare 606-615 na AmCyan mRNA, ki tvorijo začetni del stebla-zanke zaščitenega 3' konca in je tudi prepoznavno mesto za RNaza E, ki po prepoznavi tudi cepi AmCyan mRNA. Vezava sRNA na to mesto oteži prepoznavo mRNA z RNazo E in s tem prepreči cepitev in posledično podaljša razpolovno dobo mRNA, kar vodi v zvišanje izražanja AmCyan in povišanja fluorescence. Vezavni potencial med RNazo E in AmCyan mRNA, določen s programom catRAPID, je bil v regiji 500-600 visok, kar pa še dodatno podpira teorijo, da sRNA asB606 zakrije prepoznavno mesto za RNazo E [1].
Z analizo NUPACK so analizirali tudi zvišano izražanje z MicC-asRBS, kjer takšnih rezultatov niso pričakovali. V nativni AmCyan mRNA je 5' konec zvit v stebelno sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo. Vezava MicC-asRNA na mRNA preprči nastanek takšne sekundarne strukture, s tem pa “sprosti” RBS in omogoči vezavo na ribosom [1].

== Regulacija izražnja diaforaze s sRNA in vitro ==
Diaforaza (DI) je topna NAD(P)H dehidrogenaza, ki je vpletena v nastanek NADH in NADPH v anaerobnih pogojih [1,4]. Uporablja se v sinteznih encimskih poteh za produkcijo visoko-vrednih kemikalij. Zato je zvišano izražanje tega encima tudi zanimivo in uporabno [1].
Z uporabo catRAPID so predvideli vezavna mesta za RNazo E na diaforazni mRNA in identificirali štiri tarčna mesta za sRNA, ki se nahajajo v bližini stebelnih zank in vezava, na katera bi lahko povzročilo zvišano izražanje [1].
Protismerna zaporedja, ki so bila del sRNA, so klonirali v plazmid pBAD-LIC in z njim transformirali sev E.coli BL21 Star (DE3). Brezcelični sistem so naredili s hkratno sonifikacijo kultur E.coli , ene, ki vsebuje zapis za diaforazo in druge z rekobinanitim plazmidom pBAD-AS [1].
Dva konstrukta (as410, as528) sta signifiakntno povečal izražanje diaforaze, en je dosegel zelo nizko povečanje (as510), zadnji pa je v enem replikat povišal izražanje, v drugih pa ni imel vpliva (as490) [1].
Čeprav so vsi konstrukti vsebovali protismerno zaporedje, ki cilja vezavno mesto za RNazo E na diaforazono mRNA, so bili vplivi konstruktov raznoliki. Rezultati so lahko posledica prisotnosti več vezavnih mest za RNazo E, poleg tega pa uporabljen sev E.coli lahko metabolizira induktor Ara in s tem zniža izražanje sRNA [1].

== Zaključek ==
Naravne in sintetične sRNA imajo velik potencial v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, saj omogočajo regulacijo izražanja genov brez popolnega izbitja gena, preko induciranega izražanja sRNA pa se lahko uvede še večji nadzor nad regulacijo izražanja tarčenga gena. So majhne, kar omogoča izražanje več sRNA iz istega plazmida. Tannaiche et al so prvič pokazali, da s sRNA lahko selektivno tudi zvišamo izražanje tarčnega gena v CFS. Poleg tega pa so pokazali, da se lahko sRNA prilagodi na različne sisteme in na regulacijo različnih proteinov [1].

== Literatura ==
[1] Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324. doi:10.1002/btpr.3324

[2] Storz G, Vogel J, Wassarman, K M. Regulation by Small RNAs in Bacteria: Expanding Frontiers. Molecular Cell. 2011. 43(6), 880–891.doi:10.1016/j.molcel.2011.08.022

[3] NUPACK. https://www.nupack.org (nazadnje dostopano 14. 5. 2023 dostopano)

[4] AG Scientific: Diaohorase Enzymes – Why are they? https://agscientific.com/blog/all-about-diaphorase-enzymes.html (nazadnje dostopano 14.5.2023)