Wiki FKKT - User contributions [en]

Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici

2021-04-06T13:06:46Z

Andrej Race:

== Odpornost pšenice proti pegavosti Septoria tritici ==

Listna bolezen pegavosti Septoria tritici (''ang.'' Septoria tritici blotch (STB)), ki jo povzroča gliva ''Zymoseptoria tritici'', bistveno vpliva na pridelek na nekaterih največjih območjih, kjer pridelujejo pšenico. Do danes je bilo kartiranih 22 glavnih genov za odpornost proti STB (imenovanih ''Stb'') v pšenici 1, ki omogočajo kvalitativno odpornost. Kvalitativna odpornost je ponavadi monogenska, specifična za genotip in netrajna. Za večino genov Stb se je izkazalo da so učinkovite proti manjšini avirulentnih izolatov ''Z. tritici'' 2.

Kloniranje prvega gena ''Stb'' (''Stb6'') je pred kratkim pokazalo, da kodira s steno povezan receptor, ki daje gen-za-gen tip odpornosti proti izolatom, ki nosijo ujemajoči se gen AvrStb6 1. Še en gen, ki je še posebej zanimiv, je ''Stb16q'', ki je bil učinkovit proti vsem doslej testiranih izolatih ''Z. tritici''2. V tem članku so ta gen klonirali in analizirali iz sintetične heksaploidne pšenice (SHW), ki je odporna na STB 1. SHW so umetno ustvarjeni plodni hibridi med tetraploidno pšenico in diploidnim sorodnikom pšenice. S tem se omogoči prenos agronomsko pomembnih genov iz divjih sorodnikov na navadno pšenico 3.

==Rezulatati==
===Kartiranje ''Stb16q''===

Z uporabo QTL (''ang.'' Quantitative Trait Loci) analize odpornosti dupliranih haplotipov križanja SHW TA4152-19 z dovzetno linijo ND495 na ''Z. tritici'' so ugotovili, da je gen na lokusu ''Stb16q'', ali gen, ki je direktno povezan z njim odgovoren za fenotipsko varijacijo 1,4. Primerjali so sekvenco z referenčno genetsko karto visoke gostote in opazili, da se 5 mikrosatelitnih markerjev skupaj deduje s ''Stb16q''. Markerje so uporabili da iščejo rekombinacijske dogodke pri 1305 imunih in 675 dovzetnih rastlinah s čimer so omejili ''Stb16q'' na 272 kb interval, z zapisom za dva gena ''Crk6'' in ''Unk1'' 1.

Da bi jim preverili funkcijo, primerjali so sekvence teh genov v odpornih in dovzetnih sevih. Ugotovili so, da so vsi sevi, ki vsebujejo ali ''Crk6'' ali ''Unk1'' haplotip iz TA4152-19, odporni na ''Z. tritici'', dokler jih dovzeten sev ND495 ne vsebuje. Po tem so preverjali fenotipe 310 družin mutageniziranih TA4152-19 in opazili, da so dovzetne rastline vsebovale škodljivo mutacijo S508F v kinazni aktivacijski zanki ''Crk6'', medtem ko v genu ''Unk1'' niso opazili mutacije. Ugotovili so da je homozigotnost te mutacije povzročila dovzetnost, kar dokazuje da gen ''Crk6'' predstavlja ''Stb16q''. Na koncu so še stabilno transformirali dovzetni sev Courtot z genomsko sekvenco ''Crk6'' in T2 generacijo okužili z 11 sevi Z. tritici. Opazili so da so vse rastline, ki so vsebovale transgen, bile odporne na vse seve. Na podlagi tega so sklenili da ''Crk6'' omogoča odpornost širokega spektra proti Z. tritici 1.

===Funkcija ''Stb16q''===

''Stb16q'' kodira receptorju podobno kinazo bogato s cisteini, transmembranski protein z dvema ekstracelularnima DUF26 domenama in intracelularno serin/treonin protein kinazno domeno. Na osnovi aminokislinske ohranjenosti DUF26 domene med ''Gnk2'' in ''Stb16q'' proteinom, predpostavljajo da ''Stb16q'' veže apoplastično manozo, ki prihaja iz glive ali rastline in s tem aktivira imunski odziv. Imunski odziv prepreči širjenje glive pred vhodom skozi stomatno režo, ali v njeni votlini, pri čemer ne ubije patogena. Člani CRK familije, med katere sovpada ''Stb16q'', so pokazali vlogo v odpornosti proti patogenih pri drugih rastlinah. Pri ''Arabidopsis'' so tudi dobro preučeni, ampak odsotnost ortologov onemogoča predpostavljanje mehanizma reakcije 1.

===Razširjenost in uporabnost ''Stb16q''===

Analizirali so zastopanost otpornega haplotipa ''Stb16q'' in ga opazili samo pri SHW. Od 805 vzorkcev iz osnovne zbirke pšenic in sort iz glavnih območji za proizvodnjo pšenice, je otporen alel imelo samo 6 sort. ''Stb16q'' verjetno izvira iz sevov ''Ae. tauschii'' pri Kaspijskem jezeru in je pred kratkim vnesen v SHW z rejskihmi programi. Ugotovili so tudi to, da ''Stb16q'' ne daje dovzetnosti za druge bolezni, s čimer so pokazali, da je gen uporaben za vzrejo 1.

==Zaključek in pomisleki==

V članku so pokazali, da ''Stb16q'' omogoča odpornim SHW odpornost širokega spektra proti vseh preverjenih sevih ''Z. tritici'' tudi, če ne moremo izključiti, da imajo ti sevi druge obrambne mehanizme proti tem patogenu. Z druge strani odsotnost ''Stb16q'' iz gojenih sort pšenice nakazuje, da za patogen ni bilo selekcijskega pritiska, kaj je verjetno tudi razlog za odpornost širokega spektra. To pomeni, da je treba ta gen skrbno uporabiti z drugimi kvalitativnimi ali kvantitativnimi odpornostmi za vzrejo trajnih sort pšenice, odpornih na širok spekter ''Z. tritici'' 1.

==Literatura==
1. Saintenac, C. ''et al.'' A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch. Nat. Commun. 12, 1–10 (2021).

2. Brown, J. K. M., Chartrain, L., Lasserre-Zuber, P. & Saintenac, C. Genetics of resistance to Zymoseptoria tritici and applications to wheat breeding. Fungal Genet. Biol. 79, 33–41 (2015).

3. Li, A., Liu, D., Yang, W., Kishii, M. & Mao, L. Synthetic Hexaploid Wheat: Yesterday, Today, and Tomorrow. Engineering vol. 4 552–558 (2018).

4. Kearsey, M. J. & Farquhar, A. G. L. QTL analysis in plants; where are we now? Heredity (Edinb). 80, 137–142 (1998).

Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici

2021-04-05T23:04:32Z

Andrej Race: /* Zaključek in pomisleki */

== Odpornost pšenice proti pegavosti Septoria tritici ==

Listna bolezen pegavosti Septoria tritici (''ang.'' Septoria tritici blotch (STB)), ki jo povzroča gliva ''Zymoseptoria tritici'', bistveno vpliva na pridelek na nekaterih največjih območjih, kjer pridelujejo pšenico. Do danes je bilo kartiranih 22 glavnih genov za odpornost proti STB (imenovanih ''Stb'') v pšenici 1, ki omogočajo kvalitativno odpornost. Kvalitativna odpornost je ponavadi monogenska, specifična za genotip in netrajna. Za večino genov Stb se je izkazalo da so učinkovite proti manjšini avirulentnih izolatov ''Z. tritici'' 2.

Kloniranje prvega gena ''Stb'' (''Stb6'') je pred kratkim pokazalo, da kodira s steno povezan receptor, ki daje gen-za-gen tip odpornosti proti izolatom, ki nosijo ujemajoči se gen AvrStb6 1. Še en gen, ki je še posebej zanimiv, je ''Stb16q'', ki je bil učinkovit proti vsem doslej testiranih izolatih ''Z. tritici''2. V tem članku so ta gen klonirali in analizirali iz sintetične heksaploidne pšenice (SHW), ki je odporna na STB 1. SHW so umetno ustvarjeni plodni hibridi med tetraploidno pšenico in diploidnim sorodnikom pšenice. S tem se omogoči prenos agronomsko pomembnih genov iz divjih sorodnikov na navadno pšenico 3.

==Rezulatati==
===Kartiranje ''Stb16q''===

Z uporabo QTL (''ang.'' Quantitative Trait Loci) analize odpornosti dupliranih haplotipov križanja SHW TA4152-19 z dovzetno linijo ND495 na ''Z. tritici'' so ugotovili, da je gen na lokusu ''Stb16q'', ali gen, ki je direktno povezan z njim odgovoren za fenotipsko varijacijo 1,4. Primerjali so sekvenco z referenčno genetsko karto visoke gostote in opazili, da se 5 mikrosatelitnih markerjev skupaj deduje s ''Stb16q''. Markerje so uporabili da iščejo rekombinacijske dogodke pri 1305 imunih in 675 dovzetnih rastlinah s čimer so omejili ''Stb16q'' na 272 kb interval, z zapisom za dva gena ''Crk6'' in ''Unk1'' 1.

Da bi jim preverili funkcijo, primerjali so sekvence teh genov v odpornih in dovzetnih sevih. Ugotovili so, da so vsi sevi, ki vsebujejo ali ''Crk6'' ali ''Unk1'' haplotip iz TA4152-19, odporni na ''Z. tritici'', dokler jih dovzeten sev ND495 ne vsebuje. Po tem so preverjali fenotipe 310 družin mutageniziranih TA4152-19 in opazili, da so dovzetne rastline vsebovale škodljivo mutacijo S508F v kinazni aktivacijski zanki ''Crk6'', medtem ko v genu ''Unk1'' niso opazili mutacije. Ugotovili so da je homozigotnost te mutacije povzročila dovzetnost, kar dokazuje da gen ''Crk6'' predstavlja ''Stb16q''. Na koncu so še stabilno transformirali dovzetni sev Courtot z genomsko sekvenco ''Crk6'' in T2 generacijo okužili z 11 sevi Z. tritici. Opazili so da so vse rastline, ki so vsebovale transgen, bile odporne na vse seve. Na podlagi tega so sklenili da ''Crk6'' omogoča odpornost širokega spektra proti Z. tritici 1.

===Funkcija ''Stb16q''===

''Stb16q'' kodira receptorju podobno kinazo bogato s cisteini, transmembranski protein z dvema ekstracelularnima DUF26 domenama in intracelularno serin/treonin protein kinazno domeno. Na osnovi aminokislinske ohranjenosti DUF26 domene med ''Gnk2'' in ''Stb16q'' proteinom, predpostavljajo da ''Stb16q'' veže apoplastično manozo, ki prihaja iz glive ali rastline in s tem aktivira imunski odziv. Imunski odziv prepreči širjenje glive pred vhodom skozi stomatno režo, ali v njeni votlini, pri čemer ne ubije patogena. Člani CRK familije, med katere sovpada ''Stb16q'', so pokazali vlogo v odpornosti proti patogenih pri drugih rastlinah. Pri ''Arabidopsis'' so tudi dobro preučeni, ampak odsotnost ortologov onemogoča predpostavljanje mehanizma reakcije 1.

===Razširjenost in uporabnost ''Stb16q''===

Analizirali so zastopanost otpornega haplotipa ''Stb16q'' in ga opazili samo pri SHW. Od 805 vzorkcev iz osnovne zbirke pšenic in sort iz glavnih območji za proizvodnjo pšenice, je otporen alel imelo samo 6 sort. ''Stb16q'' verjetno izvira iz sevov ''Ae. tauschii'' pri Kaspijskem jezeru in je pred kratkim vnesen v SHW z rejskihmi programi. Ugotovili so tudi to, da ''Stb16q'' ne daje dovzetnosti za druge bolezni, s čimer so pokazali, da je gen uporaben za vzrejo 1.

==Zaključek in pomisleki==

V članku so pokazali, da ''Stb16q'' omogoča odpornim SHW odpornost širokega spektra proti vseh preverjenih sevih ''Z. tritici'' tudi, če ne moremo izključiti, da imajo ti sevi druge obrambne mehanizme proti tem patogenu. Z druge strani odsotnost ''Stb16q'' iz gojenih sort pšenice nakazuje, da za patogen ni bilo selekcijskega pritiska, kaj je verjetno tudi razlog za odpornost širokega spektra. To pomeni, da je treba ta gen skrbno uporabiti z drugimi kvalitativnimi ali kvantitativnimi odpornostmi za vzrejo trajnih sort pšenice, odpornih na širok spekter ''Z. tritici'' 1.

==Literatura==
1. Saintenac, C. ''et al.'' A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch. Nat. Commun. 12, 1–10 (2021).

2. Brown, J. K. M., Chartrain, L., Lasserre-Zuber, P. & Saintenac, C. Genetics of resistance to Zymoseptoria tritici and applications to wheat breeding. Fungal Genet. Biol. 79, 33–41 (2015).

3. Li, A., Liu, D., Yang, W., Kishii, M. & Mao, L. Synthetic Hexaploid Wheat: Yesterday, Today, and Tomorrow. Engineering vol. 4 552–558 (2018).

4. Kearsey, M. J. & Farquhar, A. G. L. QTL analysis in plants; where are we now? Heredity (Edinb). 80, 137–142 (1998).

Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici

2021-04-05T22:56:01Z

Andrej Race: /* Zaključek in pomisleki */

== Odpornost pšenice proti pegavosti Septoria tritici ==

Listna bolezen pegavosti Septoria tritici (''ang.'' Septoria tritici blotch (STB)), ki jo povzroča gliva ''Zymoseptoria tritici'', bistveno vpliva na pridelek na nekaterih največjih območjih, kjer pridelujejo pšenico. Do danes je bilo kartiranih 22 glavnih genov za odpornost proti STB (imenovanih ''Stb'') v pšenici 1, ki omogočajo kvalitativno odpornost. Kvalitativna odpornost je ponavadi monogenska, specifična za genotip in netrajna. Za večino genov Stb se je izkazalo da so učinkovite proti manjšini avirulentnih izolatov ''Z. tritici'' 2.

Kloniranje prvega gena ''Stb'' (''Stb6'') je pred kratkim pokazalo, da kodira s steno povezan receptor, ki daje gen-za-gen tip odpornosti proti izolatom, ki nosijo ujemajoči se gen AvrStb6 1. Še en gen, ki je še posebej zanimiv, je ''Stb16q'', ki je bil učinkovit proti vsem doslej testiranih izolatih ''Z. tritici''2. V tem članku so ta gen klonirali in analizirali iz sintetične heksaploidne pšenice (SHW), ki je odporna na STB 1. SHW so umetno ustvarjeni plodni hibridi med tetraploidno pšenico in diploidnim sorodnikom pšenice. S tem se omogoči prenos agronomsko pomembnih genov iz divjih sorodnikov na navadno pšenico 3.

==Rezulatati==
===Kartiranje ''Stb16q''===

Z uporabo QTL (''ang.'' Quantitative Trait Loci) analize odpornosti dupliranih haplotipov križanja SHW TA4152-19 z dovzetno linijo ND495 na ''Z. tritici'' so ugotovili, da je gen na lokusu ''Stb16q'', ali gen, ki je direktno povezan z njim odgovoren za fenotipsko varijacijo 1,4. Primerjali so sekvenco z referenčno genetsko karto visoke gostote in opazili, da se 5 mikrosatelitnih markerjev skupaj deduje s ''Stb16q''. Markerje so uporabili da iščejo rekombinacijske dogodke pri 1305 imunih in 675 dovzetnih rastlinah s čimer so omejili ''Stb16q'' na 272 kb interval, z zapisom za dva gena ''Crk6'' in ''Unk1'' 1.

Da bi jim preverili funkcijo, primerjali so sekvence teh genov v odpornih in dovzetnih sevih. Ugotovili so, da so vsi sevi, ki vsebujejo ali ''Crk6'' ali ''Unk1'' haplotip iz TA4152-19, odporni na ''Z. tritici'', dokler jih dovzeten sev ND495 ne vsebuje. Po tem so preverjali fenotipe 310 družin mutageniziranih TA4152-19 in opazili, da so dovzetne rastline vsebovale škodljivo mutacijo S508F v kinazni aktivacijski zanki ''Crk6'', medtem ko v genu ''Unk1'' niso opazili mutacije. Ugotovili so da je homozigotnost te mutacije povzročila dovzetnost, kar dokazuje da gen ''Crk6'' predstavlja ''Stb16q''. Na koncu so še stabilno transformirali dovzetni sev Courtot z genomsko sekvenco ''Crk6'' in T2 generacijo okužili z 11 sevi Z. tritici. Opazili so da so vse rastline, ki so vsebovale transgen, bile odporne na vse seve. Na podlagi tega so sklenili da ''Crk6'' omogoča odpornost širokega spektra proti Z. tritici 1.

===Funkcija ''Stb16q''===

''Stb16q'' kodira receptorju podobno kinazo bogato s cisteini, transmembranski protein z dvema ekstracelularnima DUF26 domenama in intracelularno serin/treonin protein kinazno domeno. Na osnovi aminokislinske ohranjenosti DUF26 domene med ''Gnk2'' in ''Stb16q'' proteinom, predpostavljajo da ''Stb16q'' veže apoplastično manozo, ki prihaja iz glive ali rastline in s tem aktivira imunski odziv. Imunski odziv prepreči širjenje glive pred vhodom skozi stomatno režo, ali v njeni votlini, pri čemer ne ubije patogena. Člani CRK familije, med katere sovpada ''Stb16q'', so pokazali vlogo v odpornosti proti patogenih pri drugih rastlinah. Pri ''Arabidopsis'' so tudi dobro preučeni, ampak odsotnost ortologov onemogoča predpostavljanje mehanizma reakcije 1.

===Razširjenost in uporabnost ''Stb16q''===

Analizirali so zastopanost otpornega haplotipa ''Stb16q'' in ga opazili samo pri SHW. Od 805 vzorkcev iz osnovne zbirke pšenic in sort iz glavnih območji za proizvodnjo pšenice, je otporen alel imelo samo 6 sort. ''Stb16q'' verjetno izvira iz sevov ''Ae. tauschii'' pri Kaspijskem jezeru in je pred kratkim vnesen v SHW z rejskihmi programi. Ugotovili so tudi to, da ''Stb16q'' ne daje dovzetnosti za druge bolezni, s čimer so pokazali, da je gen uporaben za vzrejo 1.

==Zaključek in pomisleki==

V članku so pokazali, da ''Stb16q'' omogoča odpornim SHW odpornost širokega spektra proti vseh preverjenih sevih ''Z. tritici'' tudi, če ne moremo izključiti, da imajo ti sevi druge obrambne mehanizme proti tem patogenu. Z druge strani, odsotnost ''Stb16q'' iz gojenih sort pšenice nakazuje, da za patogen ni bilo selekcijskega pritiska, kaj je verjetno tudi razlog za odpornost širokega spektra. To pomeni, da je treba ta gen skrbno uporabiti z drugimi kvalitativnimi ali kvantitativnimi odpornostmi za vzrejo trajnih sort pšenice, odpornih na širok spekter ''Z. tritici'' 1.

==Literatura==
1. Saintenac, C. ''et al.'' A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch. Nat. Commun. 12, 1–10 (2021).

2. Brown, J. K. M., Chartrain, L., Lasserre-Zuber, P. & Saintenac, C. Genetics of resistance to Zymoseptoria tritici and applications to wheat breeding. Fungal Genet. Biol. 79, 33–41 (2015).

3. Li, A., Liu, D., Yang, W., Kishii, M. & Mao, L. Synthetic Hexaploid Wheat: Yesterday, Today, and Tomorrow. Engineering vol. 4 552–558 (2018).

4. Kearsey, M. J. & Farquhar, A. G. L. QTL analysis in plants; where are we now? Heredity (Edinb). 80, 137–142 (1998).

Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici

2021-04-05T22:46:17Z

Andrej Race: /* Funkcija Stb16q */

== Odpornost pšenice proti pegavosti Septoria tritici ==

Listna bolezen pegavosti Septoria tritici (''ang.'' Septoria tritici blotch (STB)), ki jo povzroča gliva ''Zymoseptoria tritici'', bistveno vpliva na pridelek na nekaterih največjih območjih, kjer pridelujejo pšenico. Do danes je bilo kartiranih 22 glavnih genov za odpornost proti STB (imenovanih ''Stb'') v pšenici 1, ki omogočajo kvalitativno odpornost. Kvalitativna odpornost je ponavadi monogenska, specifična za genotip in netrajna. Za večino genov Stb se je izkazalo da so učinkovite proti manjšini avirulentnih izolatov ''Z. tritici'' 2.

Kloniranje prvega gena ''Stb'' (''Stb6'') je pred kratkim pokazalo, da kodira s steno povezan receptor, ki daje gen-za-gen tip odpornosti proti izolatom, ki nosijo ujemajoči se gen AvrStb6 1. Še en gen, ki je še posebej zanimiv, je ''Stb16q'', ki je bil učinkovit proti vsem doslej testiranih izolatih ''Z. tritici''2. V tem članku so ta gen klonirali in analizirali iz sintetične heksaploidne pšenice (SHW), ki je odporna na STB 1. SHW so umetno ustvarjeni plodni hibridi med tetraploidno pšenico in diploidnim sorodnikom pšenice. S tem se omogoči prenos agronomsko pomembnih genov iz divjih sorodnikov na navadno pšenico 3.

==Rezulatati==
===Kartiranje ''Stb16q''===

Z uporabo QTL (''ang.'' Quantitative Trait Loci) analize odpornosti dupliranih haplotipov križanja SHW TA4152-19 z dovzetno linijo ND495 na ''Z. tritici'' so ugotovili, da je gen na lokusu ''Stb16q'', ali gen, ki je direktno povezan z njim odgovoren za fenotipsko varijacijo 1,4. Primerjali so sekvenco z referenčno genetsko karto visoke gostote in opazili, da se 5 mikrosatelitnih markerjev skupaj deduje s ''Stb16q''. Markerje so uporabili da iščejo rekombinacijske dogodke pri 1305 imunih in 675 dovzetnih rastlinah s čimer so omejili ''Stb16q'' na 272 kb interval, z zapisom za dva gena ''Crk6'' in ''Unk1'' 1.

Da bi jim preverili funkcijo, primerjali so sekvence teh genov v odpornih in dovzetnih sevih. Ugotovili so, da so vsi sevi, ki vsebujejo ali ''Crk6'' ali ''Unk1'' haplotip iz TA4152-19, odporni na ''Z. tritici'', dokler jih dovzeten sev ND495 ne vsebuje. Po tem so preverjali fenotipe 310 družin mutageniziranih TA4152-19 in opazili, da so dovzetne rastline vsebovale škodljivo mutacijo S508F v kinazni aktivacijski zanki ''Crk6'', medtem ko v genu ''Unk1'' niso opazili mutacije. Ugotovili so da je homozigotnost te mutacije povzročila dovzetnost, kar dokazuje da gen ''Crk6'' predstavlja ''Stb16q''. Na koncu so še stabilno transformirali dovzetni sev Courtot z genomsko sekvenco ''Crk6'' in T2 generacijo okužili z 11 sevi Z. tritici. Opazili so da so vse rastline, ki so vsebovale transgen, bile odporne na vse seve. Na podlagi tega so sklenili da ''Crk6'' omogoča odpornost širokega spektra proti Z. tritici 1.

===Funkcija ''Stb16q''===

''Stb16q'' kodira receptorju podobno kinazo bogato s cisteini, transmembranski protein z dvema ekstracelularnima DUF26 domenama in intracelularno serin/treonin protein kinazno domeno. Na osnovi aminokislinske ohranjenosti DUF26 domene med ''Gnk2'' in ''Stb16q'' proteinom, predpostavljajo da ''Stb16q'' veže apoplastično manozo, ki prihaja iz glive ali rastline in s tem aktivira imunski odziv. Imunski odziv prepreči širjenje glive pred vhodom skozi stomatno režo, ali v njeni votlini, pri čemer ne ubije patogena. Člani CRK familije, med katere sovpada ''Stb16q'', so pokazali vlogo v odpornosti proti patogenih pri drugih rastlinah. Pri ''Arabidopsis'' so tudi dobro preučeni, ampak odsotnost ortologov onemogoča predpostavljanje mehanizma reakcije 1.

===Razširjenost in uporabnost ''Stb16q''===

Analizirali so zastopanost otpornega haplotipa ''Stb16q'' in ga opazili samo pri SHW. Od 805 vzorkcev iz osnovne zbirke pšenic in sort iz glavnih območji za proizvodnjo pšenice, je otporen alel imelo samo 6 sort. ''Stb16q'' verjetno izvira iz sevov ''Ae. tauschii'' pri Kaspijskem jezeru in je pred kratkim vnesen v SHW z rejskihmi programi. Ugotovili so tudi to, da ''Stb16q'' ne daje dovzetnosti za druge bolezni, s čimer so pokazali, da je gen uporaben za vzrejo 1.

==Zaključek in pomisleki==

V članku so pokazali da ''Stb16q'' omogoča odpornim SHW odpornost širokega spektra proti vseh preverjenih sevih ''Z. tritici'', tudi če ne moremo izključiti, da imajo ti sevi druge obrambne mehanizme proti tem patogenu. S druge strani, odsotnost ''Stb16q'' iz gojenih sort pšenice ukazuje, da ni bilo selekcijskega pritiska na patogen, kaj je verjetno tudi razlog za odpornost širokega spektra. To pomeni, da je treba ta gen skrbno uporabiti z drugimi kvalitativnimi ali kvantitativnimi odpornostmi za vzrejo trajnih sort pšenice, odpornih na širok spekter ''Z. tritici'' 1.

==Literatura==
1. Saintenac, C. ''et al.'' A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch. Nat. Commun. 12, 1–10 (2021).

2. Brown, J. K. M., Chartrain, L., Lasserre-Zuber, P. & Saintenac, C. Genetics of resistance to Zymoseptoria tritici and applications to wheat breeding. Fungal Genet. Biol. 79, 33–41 (2015).

3. Li, A., Liu, D., Yang, W., Kishii, M. & Mao, L. Synthetic Hexaploid Wheat: Yesterday, Today, and Tomorrow. Engineering vol. 4 552–558 (2018).

4. Kearsey, M. J. & Farquhar, A. G. L. QTL analysis in plants; where are we now? Heredity (Edinb). 80, 137–142 (1998).

Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici

2021-04-05T22:34:22Z

Andrej Race:

== Odpornost pšenice proti pegavosti Septoria tritici ==

Listna bolezen pegavosti Septoria tritici (''ang.'' Septoria tritici blotch (STB)), ki jo povzroča gliva ''Zymoseptoria tritici'', bistveno vpliva na pridelek na nekaterih največjih območjih, kjer pridelujejo pšenico. Do danes je bilo kartiranih 22 glavnih genov za odpornost proti STB (imenovanih ''Stb'') v pšenici 1, ki omogočajo kvalitativno odpornost. Kvalitativna odpornost je ponavadi monogenska, specifična za genotip in netrajna. Za večino genov Stb se je izkazalo da so učinkovite proti manjšini avirulentnih izolatov ''Z. tritici'' 2.

Kloniranje prvega gena ''Stb'' (''Stb6'') je pred kratkim pokazalo, da kodira s steno povezan receptor, ki daje gen-za-gen tip odpornosti proti izolatom, ki nosijo ujemajoči se gen AvrStb6 1. Še en gen, ki je še posebej zanimiv, je ''Stb16q'', ki je bil učinkovit proti vsem doslej testiranih izolatih ''Z. tritici''2. V tem članku so ta gen klonirali in analizirali iz sintetične heksaploidne pšenice (SHW), ki je odporna na STB 1. SHW so umetno ustvarjeni plodni hibridi med tetraploidno pšenico in diploidnim sorodnikom pšenice. S tem se omogoči prenos agronomsko pomembnih genov iz divjih sorodnikov na navadno pšenico 3.

==Rezulatati==
===Kartiranje ''Stb16q''===

Z uporabo QTL (''ang.'' Quantitative Trait Loci) analize odpornosti dupliranih haplotipov križanja SHW TA4152-19 z dovzetno linijo ND495 na ''Z. tritici'' so ugotovili, da je gen na lokusu ''Stb16q'', ali gen, ki je direktno povezan z njim odgovoren za fenotipsko varijacijo 1,4. Primerjali so sekvenco z referenčno genetsko karto visoke gostote in opazili, da se 5 mikrosatelitnih markerjev skupaj deduje s ''Stb16q''. Markerje so uporabili da iščejo rekombinacijske dogodke pri 1305 imunih in 675 dovzetnih rastlinah s čimer so omejili ''Stb16q'' na 272 kb interval, z zapisom za dva gena ''Crk6'' in ''Unk1'' 1.

Da bi jim preverili funkcijo, primerjali so sekvence teh genov v odpornih in dovzetnih sevih. Ugotovili so, da so vsi sevi, ki vsebujejo ali ''Crk6'' ali ''Unk1'' haplotip iz TA4152-19, odporni na ''Z. tritici'', dokler jih dovzeten sev ND495 ne vsebuje. Po tem so preverjali fenotipe 310 družin mutageniziranih TA4152-19 in opazili, da so dovzetne rastline vsebovale škodljivo mutacijo S508F v kinazni aktivacijski zanki ''Crk6'', medtem ko v genu ''Unk1'' niso opazili mutacije. Ugotovili so da je homozigotnost te mutacije povzročila dovzetnost, kar dokazuje da gen ''Crk6'' predstavlja ''Stb16q''. Na koncu so še stabilno transformirali dovzetni sev Courtot z genomsko sekvenco ''Crk6'' in T2 generacijo okužili z 11 sevi Z. tritici. Opazili so da so vse rastline, ki so vsebovale transgen, bile odporne na vse seve. Na podlagi tega so sklenili da ''Crk6'' omogoča odpornost širokega spektra proti Z. tritici 1.

===Funkcija ''Stb16q''===

''Stb16q'' kodira receptorju podobno kinazo bogato s cisteini, transmembranski protein z dvemi ekstracelularnimi DUF26 domenami in intracelularno serin/treonin protein kinazno domeno. Na osnovi aminokislinske ohranjenosti DUF26 domene med ''Gnk2'' in ''Stb16q'' proteinom, predpostavljajo da ''Stb16q'' veže apoplastično manozo, ki izhaja iz glive ali rastline s čem aktivira imunski odziv. Imunski odziv prepreči širjenje glive pred vhodom skozi stomatno režo, ali v njeni votlini, pri čemer ne ubije patogena. Člani CRK familije, med katere sovpada ''Stb16q'', so pokazali vlogo v odpornosti proti patogenih pri drugih rastlinah. Pri ''Arabidopsis'' so tudi dobro preučeni, ampak odsotnost ortologov onemogoča predpostavljanje mehanizma reakcije 1.

===Razširjenost in uporabnost ''Stb16q''===

Analizirali so zastopanost otpornega haplotipa ''Stb16q'' in ga opazili samo pri SHW. Od 805 vzorkcev iz osnovne zbirke pšenic in sort iz glavnih območji za proizvodnjo pšenice, je otporen alel imelo samo 6 sort. ''Stb16q'' verjetno izvira iz sevov ''Ae. tauschii'' pri Kaspijskem jezeru in je pred kratkim vnesen v SHW z rejskihmi programi. Ugotovili so tudi to, da ''Stb16q'' ne daje dovzetnosti za druge bolezni, s čimer so pokazali, da je gen uporaben za vzrejo 1.

==Zaključek in pomisleki==

V članku so pokazali da ''Stb16q'' omogoča odpornim SHW odpornost širokega spektra proti vseh preverjenih sevih ''Z. tritici'', tudi če ne moremo izključiti, da imajo ti sevi druge obrambne mehanizme proti tem patogenu. S druge strani, odsotnost ''Stb16q'' iz gojenih sort pšenice ukazuje, da ni bilo selekcijskega pritiska na patogen, kaj je verjetno tudi razlog za odpornost širokega spektra. To pomeni, da je treba ta gen skrbno uporabiti z drugimi kvalitativnimi ali kvantitativnimi odpornostmi za vzrejo trajnih sort pšenice, odpornih na širok spekter ''Z. tritici'' 1.

==Literatura==
1. Saintenac, C. ''et al.'' A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch. Nat. Commun. 12, 1–10 (2021).

2. Brown, J. K. M., Chartrain, L., Lasserre-Zuber, P. & Saintenac, C. Genetics of resistance to Zymoseptoria tritici and applications to wheat breeding. Fungal Genet. Biol. 79, 33–41 (2015).

3. Li, A., Liu, D., Yang, W., Kishii, M. & Mao, L. Synthetic Hexaploid Wheat: Yesterday, Today, and Tomorrow. Engineering vol. 4 552–558 (2018).

4. Kearsey, M. J. & Farquhar, A. G. L. QTL analysis in plants; where are we now? Heredity (Edinb). 80, 137–142 (1998).

Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici

2021-04-05T22:26:24Z

Andrej Race: /* Kartiranje Stb16q */

== Odpornost pšenice proti pegavosti Septoria tritici ==

Listna bolezen pegavosti Septoria tritici (''ang.'' Septoria tritici blotch (STB)), ki jo povzroča gliva ''Zymoseptoria tritici'', bistveno vpliva na pridelek na nekaterih največjih območjih, kjer pridelujejo pšenico. Do danes je bilo kartiranih 22 glavnih genov za odpornost proti STB (imenovanih ''Stb'') v pšenici 1, ki omogočajo kvalitativno odpornost. Kvalitativna odpornost je ponavadi monogenska, specifična za genotip in netrajna. Za večino genov Stb se je izkazalo da so učinkovite proti manjšini avirulentnih izolatov ''Z. tritici'' 2.

Kloniranje prvega gena ''Stb'' (''Stb6'') je pred kratkim pokazalo, da kodira s steno povezan receptor, ki daje gen-za-gen tip odpornosti proti izolatom, ki nosijo ujemajoči se gen AvrStb6 1. Še en gen, ki je še posebej zanimiv, je ''Stb16q'', ki je bil učinkovit proti vsem doslej testiranih izolatih ''Z. tritici''2. V tem članku so ta gen klonirali in analizirali iz sintetične heksaploidne pšenice (SHW), ki je odporna na STB 1. SHW so umetno ustvarjeni plodni hibridi med tetraploidno pšenico in diploidnim sorodnikom pšenice. S tem se omogoči prenos agronomsko pomembnih genov iz divjih sorodnikov na navadno pšenico 3.

==Rezulatati==
===Kartiranje ''Stb16q''===

Z uporabo QTL (''ang.'' Quantitative Trait Loci) analize odpornosti dupliranih haplotipov križanja SHW TA4152-19 z dovzetno linijo ND495 na ''Z. tritici'' so ugotovili, da je gen na lokusu ''Stb16q'', ali gen, ki je direktno povezan z njim odgovoren za fenotipsko varijacijo 1,4. Primerjali so sekvenco z referenčno genetsko karto visoke gostote in opazili, da se 5 mikrosatelitnih markerjev skupaj deduje s ''Stb16q''. Markerje so uporabili da iščejo rekombinacijske dogodke pri 1305 imunih in 675 dovzetnih rastlinah s čimer so omejili ''Stb16q'' na 272 kb interval, z zapisom za dva gena ''Crk6'' in ''Unk1'' 1.

Da bi ugotovili funkcijo genov, so primerjali sekvence teh genov v odpornih in dovzetnih sevih. Ugotovili so, da so vsi sevi, ki vsebujejo ali ''Crk6'' ali ''Unk1'' haplotip iz TA4152-19, odporni na ''Z. tritici'', dokler jih dovzeten sev ND495 ne vsebuje. Po tem so preverjali fenotipe 310 družin mutageniziranih TA4152-19 in opazili, da so dovzetne rastline vsebovale škodljivo mutacijo S508F v kinazni aktivacijski zanki ''Crk6'', medtem ko v genu ''Unk1'' niso opazili mutacije. Ugotovili so da je homozigotnost te mutacije povzročila dovzetnost, kar dokazuje da gen ''Crk6'' predstavlja ''Stb16q''. Na koncu so še stabilno transformirali dovzetni sev Courtot z genomsko sekvenco ''Crk6'' in T2 generacijo okužili z 11 sevi Z. tritici. Opazili so da so vse rastline, ki so vsebovale transgen, bile odporne na vse seve. Na podlagi tega so sklenili da ''Crk6'' omogoča odpornost širokega spektra proti Z. tritici 1.

===Funkcija ''Stb16q''===

''Stb16q'' kodira receptorju podobno kinazo bogato s cisteini, transmembranski protein z dvemi ekstracelularnimi DUF26 domenami in intracelularno serin/treonin protein kinazno domeno. Na osnovi aminokislinske ohranjenosti DUF26 domene med ''Gnk2'' in ''Stb16q'' proteinom, predpostavljajo da ''Stb16q'' veže apoplastično manozo, ki izhaja iz glive ali rastline s čem aktivira imunski odziv. Imunski odziv prepreči širjenje glive pred vhodom skozi stomatno režo, ali v njeni votlini, pri čemer ne ubije patogena. Člani CRK familije, med katere sovpada ''Stb16q'', so pokazali vlogo v odpornosti proti patogenih pri drugih rastlinah. Pri ''Arabidopsis'' so tudi dobro preučeni, ampak odsotnost ortologov onemogoča predpostavljanje mehanizma reakcije 1.

===Razširjenost in uporabnost ''Stb16q''===

Analizirali so zastopanost otpornega haplotipa ''Stb16q'' in ga opazili samo pri SHW. Od 805 vzorkcev iz osnovne zbirke pšenic in sort iz glavnih območji za proizvodnjo pšenice, je otporen alel imelo samo 6 sort. ''Stb16q'' verjetno izvira iz sevov ''Ae. tauschii'' pri Kaspijskem jezeru in je pred kratkim vnesen v SHW z rejskihmi programi. Ugotovili so tudi to, da ''Stb16q'' ne daje dovzetnosti za druge bolezni, s čimer so pokazali, da je gen uporaben za vzrejo 1.

==Zaključek in pomisleki==

V članku so pokazali da ''Stb16q'' omogoča odpornim SHW odpornost širokega spektra proti vseh preverjenih sevih ''Z. tritici'', tudi če ne moremo izključiti, da imajo ti sevi druge obrambne mehanizme proti tem patogenu. S druge strani, odsotnost ''Stb16q'' iz gojenih sort pšenice ukazuje, da ni bilo selekcijskega pritiska na patogen, kaj je verjetno tudi razlog za odpornost širokega spektra. To pomeni, da je treba ta gen skrbno uporabiti z drugimi kvalitativnimi ali kvantitativnimi odpornostmi za vzrejo trajnih sort pšenice, odpornih na širok spekter ''Z. tritici'' 1.

==Literatura==
1. Saintenac, C. ''et al.'' A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch. Nat. Commun. 12, 1–10 (2021).

2. Brown, J. K. M., Chartrain, L., Lasserre-Zuber, P. & Saintenac, C. Genetics of resistance to Zymoseptoria tritici and applications to wheat breeding. Fungal Genet. Biol. 79, 33–41 (2015).

3. Li, A., Liu, D., Yang, W., Kishii, M. & Mao, L. Synthetic Hexaploid Wheat: Yesterday, Today, and Tomorrow. Engineering vol. 4 552–558 (2018).

4. Kearsey, M. J. & Farquhar, A. G. L. QTL analysis in plants; where are we now? Heredity (Edinb). 80, 137–142 (1998).

Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici

2021-04-05T22:08:59Z

Andrej Race:

== Odpornost pšenice proti pegavosti Septoria tritici ==

Listna bolezen pegavosti Septoria tritici (''ang.'' Septoria tritici blotch (STB)), ki jo povzroča gliva ''Zymoseptoria tritici'', bistveno vpliva na pridelek na nekaterih največjih območjih, kjer pridelujejo pšenico. Do danes je bilo kartiranih 22 glavnih genov za odpornost proti STB (imenovanih ''Stb'') v pšenici 1, ki omogočajo kvalitativno odpornost. Kvalitativna odpornost je ponavadi monogenska, specifična za genotip in netrajna. Za večino genov Stb se je izkazalo da so učinkovite proti manjšini avirulentnih izolatov ''Z. tritici'' 2.

Kloniranje prvega gena ''Stb'' (''Stb6'') je pred kratkim pokazalo, da kodira s steno povezan receptor, ki daje gen-za-gen tip odpornosti proti izolatom, ki nosijo ujemajoči se gen AvrStb6 1. Še en gen, ki je še posebej zanimiv, je ''Stb16q'', ki je bil učinkovit proti vsem doslej testiranih izolatih ''Z. tritici''2. V tem članku so ta gen klonirali in analizirali iz sintetične heksaploidne pšenice (SHW), ki je odporna na STB 1. SHW so umetno ustvarjeni plodni hibridi med tetraploidno pšenico in diploidnim sorodnikom pšenice. S tem se omogoči prenos agronomsko pomembnih genov iz divjih sorodnikov na navadno pšenico 3.

==Rezulatati==
===Kartiranje ''Stb16q''===

Z uporabo QTL (''ang.'' Quantitative Trait Loci) analize odpornosti dupliranih haplotipov križanja SHW TA4152-19 z dovzetno linijo ND495 na ''Z. tritici'' so ugotovili, da je gen na lokusu ''Stb16q'', ali gen, ki je direktno povezan z njim odgovoren za fenotipsko varijacijo 1,4. Primerjali so sekvenco z referenčno genetsko karto visoke gostote in so opazili so da se 5 mikrosatelitnih markerjev skupaj deduje s ''Stb16q''. Markerje so uporabili da iščejo rekombinacijske dogodke pri 1305 imunih in 675 dovzetnih rastlin s čem so omejili ''Stb16q'' na 272 kb interval, z zapisom za dva gena ''Crk6'' in ''Unk1'' 1.

Kako bi preverili funkcijo genov, primerjali so sekvence teh genov v odpornih in dovzetnih sevih. Ugotovili so da so vsi sevi, ki vsebujejo ali ''Crk6'' ali ''Unk1'' haplotip iz TA4152-19, odporni na ''Z. tritici'', dokler jih dovzeten sev ND495 ne vsebuje. Po tem so preverjali fenotipe 310 družin mutageniziranih TA4152-19 in opazili da so dovzetne rastline vsebovale škodljivo mutacijo S508F v kinazni aktivacijski zanki ''Crk6'', medtem ko v genu ''Unk1'' niso opazili mutacije. Ugotovili so da je homozigotnost te mutacije povzročila dovzetnost, kar dokazuje da gen ''Crk6'' predstavlja ''Stb16q''. Na koncu so še stabilno transformirali dovzetni sev Courtot z genomsko sekvenco ''Crk6'' in T2 generacijo okužili z 11 sevi Z. tritici. Opazili so da so vse rastline, ki so vsebovale transgen, bile odporne na vse seve, s čem so sklenili da ''Crk6'' omogoča odpornost širokega spektra proti Z. tritici 1.

===Funkcija ''Stb16q''===

''Stb16q'' kodira receptorju podobno kinazo bogato s cisteini, transmembranski protein z dvemi ekstracelularnimi DUF26 domenami in intracelularno serin/treonin protein kinazno domeno. Na osnovi aminokislinske ohranjenosti DUF26 domene med ''Gnk2'' in ''Stb16q'' proteinom, predpostavljajo da ''Stb16q'' veže apoplastično manozo, ki izhaja iz glive ali rastline s čem aktivira imunski odziv. Imunski odziv prepreči širjenje glive pred vhodom skozi stomatno režo, ali v njeni votlini, pri čemer ne ubije patogena. Člani CRK familije, med katere sovpada ''Stb16q'', so pokazali vlogo v odpornosti proti patogenih pri drugih rastlinah. Pri ''Arabidopsis'' so tudi dobro preučeni, ampak odsotnost ortologov onemogoča predpostavljanje mehanizma reakcije 1.

===Razširjenost in uporabnost ''Stb16q''===

Analizirali so zastopanost otpornega haplotipa ''Stb16q'' in ga opazili samo pri SHW. Od 805 vzorkcev iz osnovne zbirke pšenic in sort iz glavnih območji za proizvodnjo pšenice, je otporen alel imelo samo 6 sort. ''Stb16q'' verjetno izvira iz sevov ''Ae. tauschii'' pri Kaspijskem jezeru in je pred kratkim vnesen v SHW z rejskihmi programi. Ugotovili so tudi to, da ''Stb16q'' ne daje dovzetnosti za druge bolezni, s čimer so pokazali, da je gen uporaben za vzrejo 1.

==Zaključek in pomisleki==

V članku so pokazali da ''Stb16q'' omogoča odpornim SHW odpornost širokega spektra proti vseh preverjenih sevih ''Z. tritici'', tudi če ne moremo izključiti, da imajo ti sevi druge obrambne mehanizme proti tem patogenu. S druge strani, odsotnost ''Stb16q'' iz gojenih sort pšenice ukazuje, da ni bilo selekcijskega pritiska na patogen, kaj je verjetno tudi razlog za odpornost širokega spektra. To pomeni, da je treba ta gen skrbno uporabiti z drugimi kvalitativnimi ali kvantitativnimi odpornostmi za vzrejo trajnih sort pšenice, odpornih na širok spekter ''Z. tritici'' 1.

==Literatura==
1. Saintenac, C. ''et al.'' A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch. Nat. Commun. 12, 1–10 (2021).

2. Brown, J. K. M., Chartrain, L., Lasserre-Zuber, P. & Saintenac, C. Genetics of resistance to Zymoseptoria tritici and applications to wheat breeding. Fungal Genet. Biol. 79, 33–41 (2015).

3. Li, A., Liu, D., Yang, W., Kishii, M. & Mao, L. Synthetic Hexaploid Wheat: Yesterday, Today, and Tomorrow. Engineering vol. 4 552–558 (2018).

4. Kearsey, M. J. & Farquhar, A. G. L. QTL analysis in plants; where are we now? Heredity (Edinb). 80, 137–142 (1998).

Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici

2021-04-05T22:03:19Z

Andrej Race: New page: == Odpornost pšenice proti madežev Septoria tritici == Listna bolezen madežev Septoria tritici (''ang.'' Septoria tritici blotch (STB)), ki jo povzroča gliva ''Zymoseptoria tritici'',...

== Odpornost pšenice proti madežev Septoria tritici ==

Listna bolezen madežev Septoria tritici (''ang.'' Septoria tritici blotch (STB)), ki jo povzroča gliva ''Zymoseptoria tritici'', bistveno vpliva na donos na nekaterih največjih območjih, kjer pridelujejo pšenico. Do danes je bilo kartiranih 22 glavnih genov za odpornost proti STB (imenovanih ''Stb'') v pšenici 1, ki omogočajo kvalitativno odpornost. Kvalitativna odpornost je ponavadi monogenska, specifična za genotip in netrajna. Za večino genov Stb se je izkazalo da so učinkovite proti manjšini avirulentnih izolatov ''Z. tritici'' 2.

Kloniranje prvega gena ''Stb'' (''Stb6'') je pred kratkim pokazalo, da kodira s steno povezan receptor, ki daje gen-za-gen tip odpornosti proti izolatom, ki nosijo ujemajoči se gen AvrStb6 1. Še en gen, ki je še posebej zanimiv, je ''Stb16q'', ki je bil učinkovit proti vsem doslej testiranim izolatom ''Z. tritici''2. V tem članku so ta gen klonirali in analizirali iz sintetične heksaploidne pšenice (SHW), ki je odporna na STB 1. SHW so umetno ustvarjeni plodni hibridi med tetraploidno pšenico in diploidnim sorodnikom pšenice s čem se omogoči prenos agronomsko pomembnih genov iz divjih sorodnikov na navadno pšenico 3.

==Rezulatati==
===Kartiranje ''Stb16q''===

Z uporabo QTL (''ang.'' Quantitative Trait Loci) analize odpornosti dupliranih haplotipov križanja SHW TA4152-19 z dovzetno linijo ND495 na ''Z. tritici'' so ugotovili da je gen na lokusu ''Stb16q'', ali gen, ki je direktno povezan z njim odgovoren za fenotipsko varijacijo 1,4. Primerjali so sekvenco z referenčno genetsko karto visoke gostote in so opazili so da se 5 mikrosatelitnih markerjev skupaj deduje s ''Stb16q''. Markerje so uporabili da iščejo rekombinacijske dogodke pri 1305 imunih in 675 dovzetnih rastlin s čem so omejili ''Stb16q'' na 272 kb interval, z zapisom za dva gena ''Crk6'' in ''Unk1'' 1.

Kako bi preverili funkcijo genov, primerjali so sekvence teh genov v odpornih in dovzetnih sevih. Ugotovili so da so vsi sevi, ki vsebujejo ali ''Crk6'' ali ''Unk1'' haplotip iz TA4152-19, odporni na ''Z. tritici'', dokler jih dovzeten sev ND495 ne vsebuje. Po tem so preverjali fenotipe 310 družin mutageniziranih TA4152-19 in opazili da so dovzetne rastline vsebovale škodljivo mutacijo S508F v kinazni aktivacijski zanki ''Crk6'', medtem ko v genu ''Unk1'' niso opazili mutacije. Ugotovili so da je homozigotnost te mutacije povzročila dovzetnost, kar dokazuje da gen ''Crk6'' predstavlja ''Stb16q''. Na koncu so še stabilno transformirali dovzetni sev Courtot z genomsko sekvenco ''Crk6'' in T2 generacijo okužili z 11 sevi Z. tritici. Opazili so da so vse rastline, ki so vsebovale transgen, bile odporne na vse seve, s čem so sklenili da ''Crk6'' omogoča odpornost širokega spektra proti Z. tritici 1.

===Funkcija ''Stb16q''===

''Stb16q'' kodira receptorju podobno kinazo bogato s cisteini, transmembranski protein z dvemi ekstracelularnimi DUF26 domenami in intracelularno serin/treonin protein kinazno domeno. Na osnovi aminokislinske ohranjenosti DUF26 domene med ''Gnk2'' in ''Stb16q'' proteinom, predpostavljajo da ''Stb16q'' veže apoplastično manozo, ki izhaja iz glive ali rastline s čem aktivira imunski odziv. Imunski odziv prepreči širjenje glive pred vhodom skozi stomatno režo, ali v njeni votlini, pri čemer ne ubije patogena. Člani CRK familije, med katere sovpada ''Stb16q'', so pokazali vlogo v odpornosti proti patogenih pri drugih rastlinah. Pri ''Arabidopsis'' so tudi dobro preučeni, ampak odsotnost ortologov onemogoča predpostavljanje mehanizma reakcije 1.

===Razširjenost in uporabnost ''Stb16q''===

Analizirali so zastopanost otpornega haplotipa ''Stb16q'' in ga opazili samo pri SHW. Od 805 vzorkcev iz osnovne zbirke pšenic in sort iz glavnih območji za proizvodnjo pšenice, je otporen alel imelo samo 6 sort. ''Stb16q'' verjetno izvira iz sevov ''Ae. tauschii'' pri Kaspijskem jezeru in je pred kratkim vnesen v SHW z rejskihmi programi. Ugotovili so tudi to, da ''Stb16q'' ne daje dovzetnosti za druge bolezni, s čimer so pokazali, da je gen uporaben za vzrejo 1.

==Zaključek in pomisleki==

V članku so pokazali da ''Stb16q'' omogoča odpornim SHW odpornost širokega spektra proti vseh preverjenih sevih ''Z. tritici'', tudi če ne moremo izključiti, da imajo ti sevi druge obrambne mehanizme proti tem patogenu. S druge strani, odsotnost ''Stb16q'' iz gojenih sort pšenice ukazuje, da ni bilo selekcijskega pritiska na patogen, kaj je verjetno tudi razlog za odpornost širokega spektra. To pomeni, da je treba ta gen skrbno uporabiti z drugimi kvalitativnimi ali kvantitativnimi odpornostmi za vzrejo trajnih sort pšenice, odpornih na širok spekter ''Z. tritici'' 1.

==Literatura==
1. Saintenac, C. ''et al.'' A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch. Nat. Commun. 12, 1–10 (2021).

2. Brown, J. K. M., Chartrain, L., Lasserre-Zuber, P. & Saintenac, C. Genetics of resistance to Zymoseptoria tritici and applications to wheat breeding. Fungal Genet. Biol. 79, 33–41 (2015).

3. Li, A., Liu, D., Yang, W., Kishii, M. & Mao, L. Synthetic Hexaploid Wheat: Yesterday, Today, and Tomorrow. Engineering vol. 4 552–558 (2018).

4. Kearsey, M. J. & Farquhar, A. G. L. QTL analysis in plants; where are we now? Heredity (Edinb). 80, 137–142 (1998).

MBT seminarji 2021

2021-04-05T22:02:55Z

Andrej Race:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.) 
# An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)
# Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Saša Slabe (14.4.)
# Luka Gnidovec (15.4.)
# Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Anže Karlek (21.4.)
# Ana Maklin (22.4.)
# Urban Hribar (22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Urška Fajdiga (5.5.)
# Mirsad Mešić (6.5.)
# Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Jerneja Nimac (12.5.)
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Klementina Polanec (13.5.)
# Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Željka Erić (19.5.)
# Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Katja Doberšek (20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# Almina Tahirović (26.5.)
# Eva Keber (27.5.)
# Nina Lukančič (27.5.)

Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini daje odpornost pšenice proti širokemu spektru madežev Septoria tritici

2021-04-05T22:01:31Z

Andrej Race:

Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini daje odpornost pšenice proti širokemu spektru madežev Septoria tritici

2021-04-05T22:01:07Z

Andrej Race:

== Odpornost pšenice proti madežev Septoria tritici ==

Listna bolezen madežev Septoria tritici (''ang.'' Septoria tritici blotch (STB)), ki jo povzroča gliva ''Zymoseptoria tritici'', bistveno vpliva na donos na nekaterih največjih območjih, kjer pridelujejo pšenico. Do danes je bilo kartiranih 22 glavnih genov za odpornost proti STB (imenovanih ''Stb'') v pšenici 1, ki omogočajo kvalitativno odpornost. Kvalitativna odpornost je ponavadi monogenska, specifična za genotip in netrajna. Za večino genov Stb se je izkazalo da so učinkovite proti manjšini avirulentnih izolatov ''Z. tritici'' 2.

Kloniranje prvega gena ''Stb'' (''Stb6'') je pred kratkim pokazalo, da kodira s steno povezan receptor, ki daje gen-za-gen tip odpornosti proti izolatom, ki nosijo ujemajoči se gen AvrStb6 1. Še en gen, ki je še posebej zanimiv, je ''Stb16q'', ki je bil učinkovit proti vsem doslej testiranim izolatom ''Z. tritici''2. V tem članku so ta gen klonirali in analizirali iz sintetične heksaploidne pšenice (SHW), ki je odporna na STB 1. SHW so umetno ustvarjeni plodni hibridi med tetraploidno pšenico in diploidnim sorodnikom pšenice s čem se omogoči prenos agronomsko pomembnih genov iz divjih sorodnikov na navadno pšenico 3.

==Rezulatati==
===Kartiranje ''Stb16q''===

Z uporabo QTL (''ang.'' Quantitative Trait Loci) analize odpornosti dupliranih haplotipov križanja SHW TA4152-19 z dovzetno linijo ND495 na ''Z. tritici'' so ugotovili da je gen na lokusu ''Stb16q'', ali gen, ki je direktno povezan z njim odgovoren za fenotipsko varijacijo 1,4. Primerjali so sekvenco z referenčno genetsko karto visoke gostote in so opazili so da se 5 mikrosatelitnih markerjev skupaj deduje s ''Stb16q''. Markerje so uporabili da iščejo rekombinacijske dogodke pri 1305 imunih in 675 dovzetnih rastlin s čem so omejili ''Stb16q'' na 272 kb interval, z zapisom za dva gena ''Crk6'' in ''Unk1'' 1.

Kako bi preverili funkcijo genov, primerjali so sekvence teh genov v odpornih in dovzetnih sevih. Ugotovili so da so vsi sevi, ki vsebujejo ali ''Crk6'' ali ''Unk1'' haplotip iz TA4152-19, odporni na ''Z. tritici'', dokler jih dovzeten sev ND495 ne vsebuje. Po tem so preverjali fenotipe 310 družin mutageniziranih TA4152-19 in opazili da so dovzetne rastline vsebovale škodljivo mutacijo S508F v kinazni aktivacijski zanki ''Crk6'', medtem ko v genu ''Unk1'' niso opazili mutacije. Ugotovili so da je homozigotnost te mutacije povzročila dovzetnost, kar dokazuje da gen ''Crk6'' predstavlja ''Stb16q''. Na koncu so še stabilno transformirali dovzetni sev Courtot z genomsko sekvenco ''Crk6'' in T2 generacijo okužili z 11 sevi Z. tritici. Opazili so da so vse rastline, ki so vsebovale transgen, bile odporne na vse seve, s čem so sklenili da ''Crk6'' omogoča odpornost širokega spektra proti Z. tritici 1.

===Funkcija ''Stb16q''===

''Stb16q'' kodira receptorju podobno kinazo bogato s cisteini, transmembranski protein z dvemi ekstracelularnimi DUF26 domenami in intracelularno serin/treonin protein kinazno domeno. Na osnovi aminokislinske ohranjenosti DUF26 domene med ''Gnk2'' in ''Stb16q'' proteinom, predpostavljajo da ''Stb16q'' veže apoplastično manozo, ki izhaja iz glive ali rastline s čem aktivira imunski odziv. Imunski odziv prepreči širjenje glive pred vhodom skozi stomatno režo, ali v njeni votlini, pri čemer ne ubije patogena. Člani CRK familije, med katere sovpada ''Stb16q'', so pokazali vlogo v odpornosti proti patogenih pri drugih rastlinah. Pri ''Arabidopsis'' so tudi dobro preučeni, ampak odsotnost ortologov onemogoča predpostavljanje mehanizma reakcije 1.

===Razširjenost in uporabnost ''Stb16q''===

Analizirali so zastopanost otpornega haplotipa ''Stb16q'' in ga opazili samo pri SHW. Od 805 vzorkcev iz osnovne zbirke pšenic in sort iz glavnih območji za proizvodnjo pšenice, je otporen alel imelo samo 6 sort. ''Stb16q'' verjetno izvira iz sevov ''Ae. tauschii'' pri Kaspijskem jezeru in je pred kratkim vnesen v SHW z rejskihmi programi. Ugotovili so tudi to, da Stb16q ne daje dovzetnosti za druge bolezni, s čimer so pokazali, da je gen uporaben za vzrejo 1.

==Zaključek in pomisleki==

V članku so pokazali da ''Stb16q'' omogoča odpornim SHW odpornost širokega spektra proti vseh preverjenih sevih ''Z. tritici'', tudi če ne moremo izključiti, da imajo ti sevi druge obrambne mehanizme proti tem patogenu. S druge strani, odsotnost ''Stb16q'' iz gojenih sort pšenice ukazuje, da ni bilo selekcijskega pritiska na patogen, kaj je verjetno tudi razlog za odpornost širokega spektra. To pomeni, da je treba ta gen skrbno uporabiti z drugimi kvalitativnimi ali kvantitativnimi odpornostmi za vzrejo trajnih sort pšenice, odpornih na širok spekter ''Z. tritici'' 1.

==Literatura==
1. Saintenac, C. ''et al.'' A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch. Nat. Commun. 12, 1–10 (2021).

2. Brown, J. K. M., Chartrain, L., Lasserre-Zuber, P. & Saintenac, C. Genetics of resistance to Zymoseptoria tritici and applications to wheat breeding. Fungal Genet. Biol. 79, 33–41 (2015).

3. Li, A., Liu, D., Yang, W., Kishii, M. & Mao, L. Synthetic Hexaploid Wheat: Yesterday, Today, and Tomorrow. Engineering vol. 4 552–558 (2018).

4. Kearsey, M. J. & Farquhar, A. G. L. QTL analysis in plants; where are we now? Heredity (Edinb). 80, 137–142 (1998).

Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini daje odpornost pšenice proti širokemu spektru madežev Septoria tritici

2021-04-05T21:56:01Z

Andrej Race:

== Odpornost pšenice proti madežev Septoria tritici ==

Listna bolezen madežev Septoria tritici (''ang.'' Septoria tritici blotch (STB)), ki jo povzroča gliva ''Zymoseptoria tritici'', bistveno vpliva na donos na nekaterih največjih območjih, kjer pridelujejo pšenico. Do danes je bilo kartiranih 22 glavnih genov za odpornost proti STB (imenovanih ''Stb'') v pšenici 1, ki omogočajo kvalitativno odpornost. Kvalitativna odpornost je ponavadi monogenska, specifična za genotip in netrajna. Za večino genov Stb se je izkazalo da so učinkovite proti manjšini avirulentnih izolatov ''Z. tritici'' 2.

Kloniranje prvega gena ''Stb'' (''Stb6'') je pred kratkim pokazalo, da kodira s steno povezan receptor, ki daje gen-za-gen tip odpornosti proti izolatom, ki nosijo ujemajoči se gen AvrStb6 1. Še en gen, ki je še posebej zanimiv, je ''Stb16q'', ki je bil učinkovit proti vsem doslej testiranim izolatom ''Z. tritici''2. V tem članku so ta gen klonirali in analizirali iz sintetične heksaploidne pšenice (SHW), ki je odporna na STB 1. SHW so umetno ustvarjeni plodni hibridi med tetraploidno pšenico in diploidnim sorodnikom pšenice s čem se omogoči prenos agronomsko pomembnih genov iz divjih sorodnikov na navadno pšenico 3.

==Rezulatati==
===Kartiranje ''Stb16q''===

Z uporabo QTL (''ang.'' Quantitative Trait Loci) analize odpornosti dupliranih haplotipov križanja SHW TA4152-19 z dovzetno linijo ND495 na ''Z. tritici'' so ugotovili da je gen na lokusu ''Stb16q'', ali gen, ki je direktno povezan z njim odgovoren za fenotipsko varijacijo 1,4. Primerjali so sekvenco z referenčno genetsko karto visoke gostote in so opazili so da se 5 mikrosatelitnih markerjev skupaj deduje s ''Stb16q''. Markerje so uporabili da iščejo rekombinacijske dogodke pri 1305 imunih in 675 dovzetnih rastlin s čem so omejili ''Stb16q'' na 272 kb interval, z zapisom za dva gena ''Crk6'' in ''Unk1'' 1.

Kako bi preverili funkcijo genov, primerjali so sekvence teh genov v odpornih in dovzetnih sevih. Ugotovili so da so vsi sevi, ki vsebujejo ali ''Crk6'' ali ''Unk1'' haplotip iz TA4152-19, odporni na ''Z. tritici'', dokler jih dovzeten sev ND495 ne vsebuje. Po tem so preverjali fenotipe 310 družin mutageniziranih TA4152-19 in opazili da so dovzetne rastline vsebovale škodljivo mutacijo S508F v kinazni aktivacijski zanki ''Crk6'', medtem ko v genu ''Unk1'' niso opazili mutacije. Ugotovili so da je homozigotnost te mutacije povzročila dovzetnost, kar dokazuje da gen ''Crk6'' predstavlja ''Stb16q''. Na koncu so še stabilno transformirali dovzetni sev Courtot z genomsko sekvenco ''Crk6'' in T2 generacijo okužili z 11 sevi Z. tritici. Opazili so da so vse rastline, ki so vsebovale transgen, bile odporne na vse seve, s čem so sklenili da ''Crk6'' omogoča odpornost širokega spektra proti Z. tritici 1.

===Funkcija ''Stb16q''===

''Stb16q'' kodira receptorju podobno kinazo bogato s cisteini, transmembranski protein z dvemi ekstracelularnimi DUF26 domenami in intracelularno serin/treonin protein kinazno domeno. Na osnovi aminokislinske ohranjenosti DUF26 domene med ''Gnk2'' in ''Stb16q'' proteinom, predpostavljajo da ''Stb16q'' veže apoplastično manozo, ki izhaja iz glive ali rastline s čem aktivira imunski odziv. Imunski odziv prepreči širjenje glive pred vhodom skozi stomatno režo, ali v njeni votlini, pri čemer ne ubije patogena. Člani CRK familije, med katere sovpada ''Stb16q'', so pokazali vlogo v odpornosti proti patogenih pri drugih rastlinah. Pri ''Arabidopsis'' so tudi dobro preučeni, ampak odsotnost ortologov onemogoča predpostavljanje mehanizma reakcije 1.

===Razširjenost in uporabnost ''Stb16q''===

Analizirali so zastopanost otpornega haplotipa ''Stb16q'' in opazili so ga samo pri SHW. Od 805 vzorkov iz osnovne zbirke pšenic in sort iz glavnih območji za proizvodnjo pšenice, otporen alel so imele samo 6 sort. ''Stb16q'' verjetno izvira iz sevov ''Ae. tauschii'' pri Kaspijskem jezeru in je pred kratkim vnesen v SHW z rejskihmi programi. Preverili so tudi da ''Stb16q'' ne daje dovzetnosti za druge bolezni, s čem so pokazali da je gen uporaben za vzrejo 1.

==Zaključek in pomisleki==

V članku so pokazali da ''Stb16q'' omogoča odpornim SHW odpornost širokega spektra proti vseh preverjenih sevih ''Z. tritici'', tudi če ne moremo izključiti, da imajo ti sevi druge obrambne mehanizme proti tem patogenu. S druge strani, odsotnost ''Stb16q'' iz gojenih sort pšenice ukazuje, da ni bilo selekcijskega pritiska na patogen, kaj je verjetno tudi razlog za odpornost širokega spektra. To pomeni, da je treba ta gen skrbno uporabiti z drugimi kvalitativnimi ali kvantitativnimi odpornostmi za vzrejo trajnih sort pšenice, odpornih na širok spekter ''Z. tritici'' 1.

==Literatura==
1. Saintenac, C. ''et al.'' A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch. Nat. Commun. 12, 1–10 (2021).

2. Brown, J. K. M., Chartrain, L., Lasserre-Zuber, P. & Saintenac, C. Genetics of resistance to Zymoseptoria tritici and applications to wheat breeding. Fungal Genet. Biol. 79, 33–41 (2015).

3. Li, A., Liu, D., Yang, W., Kishii, M. & Mao, L. Synthetic Hexaploid Wheat: Yesterday, Today, and Tomorrow. Engineering vol. 4 552–558 (2018).

4. Kearsey, M. J. & Farquhar, A. G. L. QTL analysis in plants; where are we now? Heredity (Edinb). 80, 137–142 (1998).

Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini daje odpornost pšenice proti širokemu spektru madežev Septoria tritici

2021-04-05T21:24:44Z

Andrej Race:

== Odpornost pšenice proti madežev Septoria tritici ==

Listna bolezen madežev Septoria tritici (''ang.'' Septoria tritici blotch (STB)), ki jo povzroča gliva ''Zymoseptoria tritici'', bistveno vpliva na donos na nekaterih največjih območjih, kjer pridelujejo pšenico. Do danes je bilo kartiranih 22 glavnih genov za odpornost proti STB (imenovanih ''Stb'') v pšenici 1, ki omogočajo kvalitetno odpornost. Kvalitativna odpornost je ponavadi monogenska, specifična za genotip in netrajna. Za večino genov Stb se je izkazalo da so učinkovite proti manjšini avirulentnih izolatov ''Z. tritici'' 2.

Kloniranje prvega gena ''Stb'' (''Stb6'') je pred kratkim pokazalo, da kodira s steno povezan receptor, ki daje gen-za-gen tip odpornosti proti izolatom, ki nosijo ujemajoči se gen AvrStb6 1. Še en gen, ki je še posebej zanimiv, je ''Stb16q'', ki je bil učinkovit proti vsem doslej testiranim izolatom ''Z. tritici''2. V tem članku so ta gen klonirali in analizirali iz sintetične heksaploidne pšenice (SHW), ki je odporna na STB 1. SHW so umetno ustvarjeni plodni hibridi med tetraploidno pšenico in diploidnim sorodnikom pšenice s čem se omogoči prenos agronomsko pomembnih genov iz divjih sorodnikov na navadno pšenico 3.

==Rezulatati==
===Kartiranje ''Stb16q''===

Z uporabo QTL (''ang.'' Quantitative Trait Loci) analize odpornosti dupliranih haplotipov križanja SHW TA4152-19 z dovzetno linijo ND495 na ''Z. tritici'' so ugotovili da je gen na lokusu ''Stb16q'', ali gen, ki je direktno povezan z njim odgovoren za fenotipsko varijacijo 1,4. Primerjali so sekvenco z referenčno genetsko karto visoke gostote in so opazili so da se 5 mikrosatelitnih markerjev skupaj deduje s ''Stb16q''. Markerje so uporabili da iščejo rekombinacijske dogodke pri 1305 imunih in 675 dovzetnih rastlin s čem so omejili ''Stb16q'' na 272 kb interval, z zapisom za dva gena ''Crk6'' in ''Unk1'' 1.

Kako bi preverili funkcijo genov, primerjali so sekvence teh genov v odpornih in dovzetnih sevih. Ugotovili so da so vsi sevi, ki vsebujejo ali ''Crk6'' ali ''Unk1'' haplotip iz TA4152-19, odporni na ''Z. tritici'', dokler jih dovzeten sev ND495 ne vsebuje. Po tem so preverjali fenotipe 310 družin mutageniziranih TA4152-19 in opazili da so dovzetne rastline vsebovale škodljivo mutacijo S508F v kinazni aktivacijski zanki ''Crk6'', medtem ko v genu ''Unk1'' niso opazili mutacije. Ugotovili so da je homozigotnost te mutacije povzročila dovzetnost, kar dokazuje da gen ''Crk6'' predstavlja ''Stb16q''. Na koncu so še stabilno transformirali dovzetni sev Courtot z genomsko sekvenco ''Crk6'' in T2 generacijo okužili z 11 sevi Z. tritici. Opazili so da so vse rastline, ki so vsebovale transgen, bile odporne na vse seve, s čem so sklenili da ''Crk6'' omogoča odpornost širokega spektra proti Z. tritici 1.

===Funkcija ''Stb16q''===

''Stb16q'' kodira receptorju podobno kinazo bogato s cisteini, transmembranski protein z dvemi ekstracelularnimi DUF26 domenami in intracelularno serin/treonin protein kinazno domeno. Na osnovi aminokislinske ohranjenosti DUF26 domene med ''Gnk2'' in ''Stb16q'' proteinom, predpostavljajo da ''Stb16q'' veže apoplastično manozo, ki izhaja iz glive ali rastline s čem aktivira imunski odziv. Imunski odziv prepreči širjenje glive pred vhodom skozi stomatno režo, ali v njeni votlini, pri čemer ne ubije patogena. Člani CRK familije, med katere sovpada ''Stb16q'', so pokazali vlogo v odpornosti proti patogenih pri drugih rastlinah. Pri Arabidopsis so tudi dobro preučeni, ampak odsotnost ortologov onemogoča predpostavljanje mehanizma reakcije 1.

===Razširjenost in uporabnost ''Stb16q''===

Analizirali so zastopanost otpornega haplotipa ''Stb16q'' in opazili so ga samo pri SHW. Od 805 vzorkov iz osnovne zbirke pšenic in sort iz glavnih območji za proizvodnjo pšenice, otporen alel so imele samo 6 sort. ''Stb16q'' je verjetno izvirajo iz sevov ''Ae. tauschii'' pri Kaspijskem jezeru, pri čemer je gen pred kratkim vnesen v SHW v rejskih programih. Preverili so tudi da ''Stb16q'' ne daje dovzetnosti za druge bolezni, s čem so pokazali da je gen uporaben za vzrejo 1.

==Zaključek in pomisleki==

V članku so pokazali da ''Stb16q'' omogoča odpornim SHW odpornost širokega spektra proti vseh preverjenih sevih ''Z. tritici'', tudi če ne moremo izključiti, da imajo ti sevi druge obrambne mehanizme proti tem patogenu. S druge strani, odsotnost ''Stb16q'' iz gojenih sort pšenice ukazuje, da ni bilo selekcijskega pritiska na patogen, kaj je verjetno tudi razlog za odpornost širokega spektra. To pomeni, da je treba ta gen skrbno uporabiti z drugimi kvalitativnimi ali kvantitativnimi odpornostmi za vzrejo trajnih sort pšenice, odpornih na širok spekter ''Z. tritici'' 1.

==Literatura==
1. Saintenac, C. ''et al.'' A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch. Nat. Commun. 12, 1–10 (2021).

2. Brown, J. K. M., Chartrain, L., Lasserre-Zuber, P. & Saintenac, C. Genetics of resistance to Zymoseptoria tritici and applications to wheat breeding. Fungal Genet. Biol. 79, 33–41 (2015).

3. Li, A., Liu, D., Yang, W., Kishii, M. & Mao, L. Synthetic Hexaploid Wheat: Yesterday, Today, and Tomorrow. Engineering vol. 4 552–558 (2018).

4. Kearsey, M. J. & Farquhar, A. G. L. QTL analysis in plants; where are we now? Heredity (Edinb). 80, 137–142 (1998).

Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini daje odpornost pšenice proti širokemu spektru madežev Septoria tritici

2021-04-05T21:16:31Z

Andrej Race:

== Odpornost pšenice proti madežev Septoria tritici ==

Listna bolezen madežev Septoria tritici (''ang.'' Septoria tritici blotch (STB)), ki jo povzroča gliva Zymoseptoria tritici, bistveno vpliva na donos na nekaterih največjih območjih, kjer pridelujejo pšenico. Do danes je bilo kartiranih 22 glavnih genov za odpornost proti STB (imenovanih Stb) v pšenici 1, ki omogočajo kvalitetno odpornost. Kvalitativna odpornost je ponavadi monogenska, specifična za genotip in netrajna. Za večino genov Stb se je izkazalo da so učinkovite proti manjšini avirulentnih izolatov Z. tritici 2.

Kloniranje prvega gena Stb (Stb6) je pred kratkim pokazalo, da kodira s steno povezan receptor, ki daje gen-za-gen tip odpornosti proti izolatom, ki nosijo ujemajoči se gen AvrStb6 1. Še en gen, ki je še posebej zanimiv, je Stb16q, ki je bil učinkovit proti vsem doslej testiranim izolatom Z. tritici2. V tem članku so ta gen klonirali in analizirali iz sintetične heksaploidne pšenice (SHW), ki je odporna na STB 1. SHW so umetno ustvarjeni plodni hibridi med tetraploidno pšenico in diploidnim sorodnikom pšenice s čem se omogoči prenos agronomsko pomembnih genov iz divjih sorodnikov na navadno pšenico 3.

==Rezulatati==
===Kartiranje Stb16q===

Z uporabo QTL (‘’ang.'' Quantitative Trait Loci) analize odpornosti dupliranih haplotipov križanja SHW TA4152-19 z dovzetno linijo ND495 na Z. tritici so ugotovili da je gen na lokusu Stb16q, ali gen, ki je direktno povezan z njim odgovoren za fenotipsko varijacijo 1,4. Primerjali so sekvenco z referenčno genetsko karto visoke gostote in so opazili so da se 5 mikrosatelitnih markerjev skupaj deduje s Stb16q. Markerje so uporabili da iščejo rekombinacijske dogodke pri 1305 imunih in 675 dovzetnih rastlin s čem so omejili Stb16q na 272 kb interval, z zapisom za dva gena Crk6 in Unk1 1.

Kako bi preverili funkcijo genov, primerjali so sekvence teh genov v odpornih in dovzetnih sevih. Ugotovili so da so vsi sevi, ki vsebujejo ali Crk6 ali Unk1 haplotip iz TA4152-19, odporni na Z. tritici, dokler jih dovzeten sev ND495 ne vsebuje. Po tem so preverjali fenotipe 310 družin mutageniziranih TA4152-19 in opazili da so dovzetne rastline vsebovale škodljivo mutacijo S508F v kinazni aktivacijski zanki Crk6, medtem ko v genu Unk1 niso opazili mutacije. Ugotovili so da je homozigotnost te mutacije povzročila dovzetnost, kar dokazuje da gen Crk6 predstavlja Stb16q. Na koncu so še stabilno transformirali dovzetni sev Courtot z genomsko sekvenco Crk6 in T2 generacijo okužili z 11 sevi Z. tritici. Opazili so da so vse rastline, ki so vsebovale transgen, bile odporne na vse seve, s čem so sklenili da Crk6 omogoča odpornost širokega spektra proti Z. tritici 1.

===Funkcija Stb16q===

Stb16q kodira receptorju podobno kinazo bogato s cisteini, transmembranski protein z dvemi ekstracelularnimi DUF26 domenami in intracelularno serin/treonin protein kinazno domeno. Na osnovi aminokislinske ohranjenosti DUF26 domene med Gnk2 in Stb16q proteinom, predpostavljajo da Stb16q veže apoplastično manozo, ki izhaja iz glive ali rastline s čem aktivira imunski odziv. Imunski odziv prepreči širjenje glive pred vhodom skozi stomatno režo, ali v njeni votlini, pri čemer ne ubije patogena. Člani CRK familije, med katere sovpada Stb16q, so pokazali vlogo v odpornosti proti patogenih pri drugih rastlinah. Pri Arabidopsis so tudi dobro preučeni, ampak odsotnost ortologov onemogoča predpostavljanje mehanizma reakcije 1.

===Razširjenost in uporabnost Stb16q===

Analizirali so zastopanost otpornega haplotipa Stb16q in opazili so ga samo pri SHW. Od 805 vzorkov iz osnovne zbirke pšenic in sort iz glavnih območji za proizvodnjo pšenice, otporen alel so imele samo 6 sort. Stb16q je verjetno izvirajo iz sevov Ae. tauschii pri Kaspijskem jezeru, pri čemer je gen pred kratkim vnesen v SHW v rejskih programih. Preverili so tudi da Stb16q ne daje dovzetnosti za druge bolezni, s čem so pokazali da je gen uporaben za vzrejo 1.

==Zaključek in pomisleki==

V članku so pokazali da Stb16q omogoča odpornim SHW odpornost širokega spektra proti vseh preverjenih sevih Z. tritici, tudi če ne moremo izključiti, da imajo ti sevi druge obrambne mehanizme proti tem patogenu. S druge strani, odsotnost Stb16q iz gojenih sort pšenice ukazuje, da ni bilo selekcijskega pritiska na patogen, kaj je verjetno tudi razlog za odpornost širokega spektra. To pomeni, da je treba ta gen skrbno uporabiti z drugimi kvalitativnimi ali kvantitativnimi odpornostmi za vzrejo trajnih sort pšenice, odpornih na širok spekter Z. tritici 1.

==Literatura==
1. Saintenac, C. et al. A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch. Nat. Commun. 12, 1–10 (2021).

2. Brown, J. K. M., Chartrain, L., Lasserre-Zuber, P. & Saintenac, C. Genetics of resistance to Zymoseptoria tritici and applications to wheat breeding. Fungal Genet. Biol. 79, 33–41 (2015).

3. Li, A., Liu, D., Yang, W., Kishii, M. & Mao, L. Synthetic Hexaploid Wheat: Yesterday, Today, and Tomorrow. Engineering vol. 4 552–558 (2018).

4. Kearsey, M. J. & Farquhar, A. G. L. QTL analysis in plants; where are we now? Heredity (Edinb). 80, 137–142 (1998).

Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini daje odpornost pšenice proti širokemu spektru madežev Septoria tritici

2021-04-05T21:15:38Z

Andrej Race: /* Rezulatati */

== Odpornost pšenice proti madežev Septoria tritici ==

Listna bolezen madežev Septoria tritici (''ang.'' Septoria tritici blotch (STB)), ki jo povzroča gliva Zymoseptoria tritici, bistveno vpliva na donos na nekaterih največjih območjih, kjer pridelujejo pšenico. Do danes je bilo kartiranih 22 glavnih genov za odpornost proti STB (imenovanih Stb) v pšenici 1/sup>, ki omogočajo kvalitetno odpornost. Kvalitativna odpornost je ponavadi monogenska, specifična za genotip in netrajna. Za večino genov Stb se je izkazalo da so učinkovite proti manjšini avirulentnih izolatov Z. tritici 2.

Kloniranje prvega gena Stb (Stb6) je pred kratkim pokazalo, da kodira s steno povezan receptor, ki daje gen-za-gen tip odpornosti proti izolatom, ki nosijo ujemajoči se gen AvrStb6 1. Še en gen, ki je še posebej zanimiv, je Stb16q, ki je bil učinkovit proti vsem doslej testiranim izolatom Z. tritici2. V tem članku so ta gen klonirali in analizirali iz sintetične heksaploidne pšenice (SHW), ki je odporna na STB 1. SHW so umetno ustvarjeni plodni hibridi med tetraploidno pšenico in diploidnim sorodnikom pšenice s čem se omogoči prenos agronomsko pomembnih genov iz divjih sorodnikov na navadno pšenico 3.

==Rezulatati==
===Kartiranje Stb16q===

Z uporabo QTL (‘’ang.'' Quantitative Trait Loci) analize odpornosti dupliranih haplotipov križanja SHW TA4152-19 z dovzetno linijo ND495 na Z. tritici so ugotovili da je gen na lokusu Stb16q, ali gen, ki je direktno povezan z njim odgovoren za fenotipsko varijacijo 1,4. Primerjali so sekvenco z referenčno genetsko karto visoke gostote in so opazili so da se 5 mikrosatelitnih markerjev skupaj deduje s Stb16q. Markerje so uporabili da iščejo rekombinacijske dogodke pri 1305 imunih in 675 dovzetnih rastlin s čem so omejili Stb16q na 272 kb interval, z zapisom za dva gena Crk6 in Unk1 1.

Kako bi preverili funkcijo genov, primerjali so sekvence teh genov v odpornih in dovzetnih sevih. Ugotovili so da so vsi sevi, ki vsebujejo ali Crk6 ali Unk1 haplotip iz TA4152-19, odporni na Z. tritici, dokler jih dovzeten sev ND495 ne vsebuje. Po tem so preverjali fenotipe 310 družin mutageniziranih TA4152-19 in opazili da so dovzetne rastline vsebovale škodljivo mutacijo S508F v kinazni aktivacijski zanki Crk6, medtem ko v genu Unk1 niso opazili mutacije. Ugotovili so da je homozigotnost te mutacije povzročila dovzetnost, kar dokazuje da gen Crk6 predstavlja Stb16q. Na koncu so še stabilno transformirali dovzetni sev Courtot z genomsko sekvenco Crk6 in T2 generacijo okužili z 11 sevi Z. tritici. Opazili so da so vse rastline, ki so vsebovale transgen, bile odporne na vse seve, s čem so sklenili da Crk6 omogoča odpornost širokega spektra proti Z. tritici 1.

===Funkcija Stb16q===

Stb16q kodira receptorju podobno kinazo bogato s cisteini, transmembranski protein z dvemi ekstracelularnimi DUF26 domenami in intracelularno serin/treonin protein kinazno domeno. Na osnovi aminokislinske ohranjenosti DUF26 domene med Gnk2 in Stb16q proteinom, predpostavljajo da Stb16q veže apoplastično manozo, ki izhaja iz glive ali rastline s čem aktivira imunski odziv. Imunski odziv prepreči širjenje glive pred vhodom skozi stomatno režo, ali v njeni votlini, pri čemer ne ubije patogena. Člani CRK familije, med katere sovpada Stb16q, so pokazali vlogo v odpornosti proti patogenih pri drugih rastlinah. Pri Arabidopsis so tudi dobro preučeni, ampak odsotnost ortologov onemogoča predpostavljanje mehanizma reakcije 1.

===Razširjenost in uporabnost Stb16q===

Analizirali so zastopanost otpornega haplotipa Stb16q in opazili so ga samo pri SHW. Od 805 vzorkov iz osnovne zbirke pšenic in sort iz glavnih območji za proizvodnjo pšenice, otporen alel so imele samo 6 sort. Stb16q je verjetno izvirajo iz sevov Ae. tauschii pri Kaspijskem jezeru, pri čemer je gen pred kratkim vnesen v SHW v rejskih programih. Preverili so tudi da Stb16q ne daje dovzetnosti za druge bolezni, s čem so pokazali da je gen uporaben za vzrejo 1.

==Zaključek in pomisleki==

V članku so pokazali da Stb16q omogoča odpornim SHW odpornost širokega spektra proti vseh preverjenih sevih Z. tritici, tudi če ne moremo izključiti, da imajo ti sevi druge obrambne mehanizme proti tem patogenu. S druge strani, odsotnost Stb16q iz gojenih sort pšenice ukazuje, da ni bilo selekcijskega pritiska na patogen, kaj je verjetno tudi razlog za odpornost širokega spektra. To pomeni, da je treba ta gen skrbno uporabiti z drugimi kvalitativnimi ali kvantitativnimi odpornostmi za vzrejo trajnih sort pšenice, odpornih na širok spekter Z. tritici 1.

==Literatura==
1. Saintenac, C. et al. A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch. Nat. Commun. 12, 1–10 (2021).

2. Brown, J. K. M., Chartrain, L., Lasserre-Zuber, P. & Saintenac, C. Genetics of resistance to Zymoseptoria tritici and applications to wheat breeding. Fungal Genet. Biol. 79, 33–41 (2015).

3. Li, A., Liu, D., Yang, W., Kishii, M. & Mao, L. Synthetic Hexaploid Wheat: Yesterday, Today, and Tomorrow. Engineering vol. 4 552–558 (2018).

4. Kearsey, M. J. & Farquhar, A. G. L. QTL analysis in plants; where are we now? Heredity (Edinb). 80, 137–142 (1998).

Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini daje odpornost pšenice proti širokemu spektru madežev Septoria tritici

2021-04-05T21:15:13Z

Andrej Race:

== Odpornost pšenice proti madežev Septoria tritici ==

Listna bolezen madežev Septoria tritici (''ang.'' Septoria tritici blotch (STB)), ki jo povzroča gliva Zymoseptoria tritici, bistveno vpliva na donos na nekaterih največjih območjih, kjer pridelujejo pšenico. Do danes je bilo kartiranih 22 glavnih genov za odpornost proti STB (imenovanih Stb) v pšenici 1/sup>, ki omogočajo kvalitetno odpornost. Kvalitativna odpornost je ponavadi monogenska, specifična za genotip in netrajna. Za večino genov Stb se je izkazalo da so učinkovite proti manjšini avirulentnih izolatov Z. tritici 2.

Kloniranje prvega gena Stb (Stb6) je pred kratkim pokazalo, da kodira s steno povezan receptor, ki daje gen-za-gen tip odpornosti proti izolatom, ki nosijo ujemajoči se gen AvrStb6 1. Še en gen, ki je še posebej zanimiv, je Stb16q, ki je bil učinkovit proti vsem doslej testiranim izolatom Z. tritici2. V tem članku so ta gen klonirali in analizirali iz sintetične heksaploidne pšenice (SHW), ki je odporna na STB 1. SHW so umetno ustvarjeni plodni hibridi med tetraploidno pšenico in diploidnim sorodnikom pšenice s čem se omogoči prenos agronomsko pomembnih genov iz divjih sorodnikov na navadno pšenico 3.

==Rezulatati==
===Kartiranje Stb16q===

Z uporabo QTL (‘’ang.'' Quantitative Trait Loci) analize odpornosti dupliranih haplotipov križanja SHW TA4152-19 z dovzetno linijo ND495 na Z. tritici so ugotovili da je gen na lokusu Stb16q, ali gen, ki je direktno povezan z njim odgovoren za fenotipsko varijacijo 1,4. Primerjali so sekvenco z referenčno genetsko karto visoke gostote in so opazili so da se 5 mikrosatelitnih markerjev skupaj deduje s Stb16q. Markerje so uporabili da iščejo rekombinacijske dogodke pri 1305 imunih in 675 dovzetnih rastlin s čem so omejili Stb16q na 272 kb interval, z zapisom za dva gena Crk6 in Unk1 1.

Kako bi preverili funkcijo genov, primerjali so sekvence teh genov v odpornih in dovzetnih sevih. Ugotovili so da so vsi sevi, ki vsebujejo ali Crk6 ali Unk1 haplotip iz TA4152-19, odporni na Z. tritici, dokler jih dovzeten sev ND495 ne vsebuje. Po tem so preverjali fenotipe 310 družin mutageniziranih TA4152-19 in opazili da so dovzetne rastline vsebovale škodljivo mutacijo S508F v kinazni aktivacijski zanki Crk6, medtem ko v genu Unk1 niso opazili mutacije. Ugotovili so da je homozigotnost te mutacije povzročila dovzetnost, kar dokazuje da gen Crk6 predstavlja Stb16q. Na koncu so še stabilno transformirali dovzetni sev Courtot z genomsko sekvenco Crk6 in T2 generacijo okužili z 11 sevi Z. tritici. Opazili so da so vse rastline, ki so vsebovale transgen, bile odporne na vse seve, s čem so sklenili da Crk6 omogoča odpornost širokega spektra proti Z. tritici 1.

===Funkcija Stb16q===

Stb16q kodira receptorju podobno kinazo bogato s cisteini, transmembranski protein z dvemi ekstracelularnimi DUF26 domenami in intracelularno serin/treonin protein kinazno domeno. Na osnovi aminokislinske ohranjenosti DUF26 domene med Gnk2 in Stb16q proteinom, predpostavljajo da Stb16q veže apoplastično manozo, ki izhaja iz glive ali rastline s čem aktivira imunski odziv. Imunski odziv prepreči širjenje glive pred vhodom skozi stomatno režo, ali v njeni votlini, pri čemer ne ubije patogena. Člani CRK familije, med katere sovpada Stb16q, so pokazali vlogo v odpornosti proti patogenih pri drugih rastlinah. Pri Arabidopsis so tudi dobro preučeni, ampak odsotnost ortologov onemogoča predpostavljanje mehanizma reakcije 1.

===Razširjenost in uporabnost Stb16q===

Analizirali so zastopanost otpornega haplotipa Stb16q in opazili so ga samo pri SHW. Od 805 vzorkov iz osnovne zbirke pšenic in sort iz glavnih območji za proizvodnjo pšenice, otporen alel so imele samo 6 sort. Stb16q je verjetno izvirajo iz sevov Ae. tauschii pri Kaspijskem jezeru, pri čemer je gen pred kratkim vnesen v SHW v rejskih programih. Preverili so tudi da Stb16q ne daje dovzetnosti za druge bolezni, s čem so pokazali da je gen uporaben za vzrejo 1.

==Zaključek in pomisleki==

V članku so pokazali da Stb16q omogoča odpornim SHW odpornost širokega spektra proti vseh preverjenih sevih Z. tritici, tudi če ne moremo izključiti, da imajo ti sevi druge obrambne mehanizme proti tem patogenu. S druge strani, odsotnost Stb16q iz gojenih sort pšenice ukazuje, da ni bilo selekcijskega pritiska na patogen, kaj je verjetno tudi razlog za odpornost širokega spektra. To pomeni, da je treba ta gen skrbno uporabiti z drugimi kvalitativnimi ali kvantitativnimi odpornostmi za vzrejo trajnih sort pšenice, odpornih na širok spekter Z. tritici 1.

==Literatura==
1. Saintenac, C. et al. A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch. Nat. Commun. 12, 1–10 (2021).

2. Brown, J. K. M., Chartrain, L., Lasserre-Zuber, P. & Saintenac, C. Genetics of resistance to Zymoseptoria tritici and applications to wheat breeding. Fungal Genet. Biol. 79, 33–41 (2015).

3. Li, A., Liu, D., Yang, W., Kishii, M. & Mao, L. Synthetic Hexaploid Wheat: Yesterday, Today, and Tomorrow. Engineering vol. 4 552–558 (2018).

4. Kearsey, M. J. & Farquhar, A. G. L. QTL analysis in plants; where are we now? Heredity (Edinb). 80, 137–142 (1998).

Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini daje odpornost pšenice proti širokemu spektru madežev Septoria tritici

2021-04-05T20:57:54Z

Andrej Race:

== Odpornost pšenice proti madežev Septoria tritici ==

Listna bolezen madežev Septoria tritici (''ang.'' Septoria tritici blotch (STB)), ki jo povzroča gliva Zymoseptoria tritici, bistveno vpliva na donos na nekaterih največjih območjih, kjer pridelujejo pšenico. Do danes je bilo kartiranih 22 glavnih genov za odpornost proti STB (imenovanih Stb) v pšenici 1/sup>, ki omogočajo kvalitetno odpornost. Kvalitativna odpornost je ponavadi monogenska, specifična za genotip in netrajna. Za večino genov Stb se je izkazalo da so učinkovite proti manjšini avirulentnih izolatov Z. tritici 2.

Kloniranje prvega gena Stb (Stb6) je pred kratkim pokazalo, da kodira s steno povezan receptor, ki daje gen-za-gen tip odpornosti proti izolatom, ki nosijo ujemajoči se gen AvrStb6 1. Še en gen, ki je še posebej zanimiv, je Stb16q, ki je bil učinkovit proti vsem doslej testiranim izolatom Z. tritici2. V tem članku so ta gen klonirali in analizirali iz sintetične heksaploidne pšenice (SHW), ki je odporna na STB 1. SHW so umetno ustvarjeni plodni hibridi med tetraploidno pšenico in diploidnim sorodnikom pšenice s čem se omogoči prenos agronomsko pomembnih genov iz divjih sorodnikov na navadno pšenico 3.

Z uporabo QTL (‘’ang.'' Quantitative Trait Loci) analize odpornosti dupliranih haplotipov križanja SHW TA4152-19 z dovzetno linijo ND495 na Z. tritici so ugotovili da je gen na lokusu Stb16q, ali gen, ki je direktno povezan z njim odgovoren za fenotipsko varijacijo 1,4. Primerjali so sekvenco z referenčno genetsko karto visoke gostote in so opazili so da se 5 mikrosatelitnih markerjev skupaj deduje s Stb16q. Markerje so uporabili da iščejo rekombinacijske dogodke pri 1305 imunih in 675 dovzetnih rastlin s čem so omejili Stb16q na 272 kb interval, z zapisom za dva gena Crk6 in Unk1 1.

Kako bi ugotovili funkcijo genov, primerjali so sekvence teh genov v odpornih in dovzetnih sevih. Ugotovili so da so vsi sevi, ki vsebujejo ali Crk6 ali Unk1 haplotip iz TA4152-19, odporni na Z. tritici, dokler jih dovzeten sev ND495 ne vsebuje. Po tem so preverjali fenotipe 310 družin mutageniziranih TA4152-19 in opazili da so dovzetne rastline vsebovale škodljivo mutacijo S508F v kinazni aktivacijski zanki Crk6, medtem ko v genu Unk1 niso opazili mutacije. Ugotovili so da je homozigotnost te mutacije povzročila dovzetnost, kar dokazuje da gen Crk6 predstavlja Stb16q. Na koncu so še stabilno transformirali dovzetni sev Courtot z genomsko sekvenco Crk6 in T2 generacijo okužili z 11 sevi Z. tritici. Opazili so da so vse rastline, ki so vsebovale transgen, bile odporne na vse seve, s čem so sklenili da Crk6 omogoča odpornost širokega spektra proti Z. tritici 1.

Izražanje Stb16q so predvsem opazili v listih TA4152-19, pri čemer se raven zvišala en dan po inokulaciji z Z. tritici. Stb16q kodira receptorju podobno kinazo bogato s cisteini, transmembranski protein z dvemi ekstracelularnimi DUF26 domenami in intracelularno serin/treonin protein kinazno domeno. Na osnovi aminokislinske ohranjenosti DUF26 domene med Gnk2 in Stb16q proteinom, predpostavljajo da Stb16q veže apoplastično manozo, ki izhaja iz glive ali rastline s čem aktivira imunski odziv. Imunski odziv prepreči širjenje glive pred vhodom skozi stomatno režo, ali v njeni votlini, pri čemer ne ubije patogena. Člani CRK familije, med katere sovpada Stb16q, so pokazali vlogo v odpornosti proti patogenih pri drugih rastlinah. Pri Arabidopsis so tudi dobro preučeni, ampak odsotnost ortologov onemogoča predpostavljanje mehanizma reakcije 1.

Analizirali so zastopanost otpornega haplotipa Stb16q in opazili so ga samo pri SHW. Od 805 vzorkov iz osnovne zbirke pšenic in sort iz glavnih območji za proizvodnjo pšenice, otporen alel so imele samo 6 sort. Stb16q je verjetno izvirajo iz sevov Ae. tauschii pri Kaspijskem jezeru, pri čemer je gen pred kratkim vnesen v SHW v rejskih programih. Preverili so tudi da Stb16q ne daje dovzetnosti za druge bolezni, s čem so pokazali da je gen uporaben za vzrejo 1.

==Zaključek in pomisleki==

V članku so pokazali da Stb16q omogoča odpornim SHW odpornost širokega spektra proti vseh preverjenih sevih Z. tritici, tudi če ne moremo izključiti, da imajo ti sevi druge obrambne mehanizme proti tem patogenu. S druge strani, odsotnost Stb16q iz gojenih sort pšenice ukazuje, da ni bilo selekcijskega pritiska na patogen, kaj je verjetno tudi razlog za odpornost širokega spektra. To pomeni, da je treba ta gen skrbno uporabiti z drugimi kvalitativnimi ali kvantitativnimi odpornostmi za vzrejo trajnih sort pšenice, odpornih na širok spekter Z. tritici 1.

==Literatura==
1. Saintenac, C. et al. A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch. Nat. Commun. 12, 1–10 (2021).

2. Brown, J. K. M., Chartrain, L., Lasserre-Zuber, P. & Saintenac, C. Genetics of resistance to Zymoseptoria tritici and applications to wheat breeding. Fungal Genet. Biol. 79, 33–41 (2015).

3. Li, A., Liu, D., Yang, W., Kishii, M. & Mao, L. Synthetic Hexaploid Wheat: Yesterday, Today, and Tomorrow. Engineering vol. 4 552–558 (2018).

4. Kearsey, M. J. & Farquhar, A. G. L. QTL analysis in plants; where are we now? Heredity (Edinb). 80, 137–142 (1998).

Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini daje odpornost pšenice proti širokemu spektru madežev Septoria tritici

2021-04-05T20:56:04Z

Andrej Race: New page: == Listna bolezen madežev Septoria tritici (''ang.'' Septoria tritici blotch (STB)), ki jo povzroča gliva Zymoseptoria tritici, bistveno vpliva na donos na nekaterih največjih območj...

==

Listna bolezen madežev Septoria tritici (''ang.'' Septoria tritici blotch (STB)), ki jo povzroča gliva Zymoseptoria tritici, bistveno vpliva na donos na nekaterih največjih območjih, kjer pridelujejo pšenico. Do danes je bilo kartiranih 22 glavnih genov za odpornost proti STB (imenovanih Stb) v pšenici 1/sup>, ki omogočajo kvalitetno odpornost. Kvalitativna odpornost je ponavadi monogenska, specifična za genotip in netrajna. Za večino genov Stb se je izkazalo da so učinkovite proti manjšini avirulentnih izolatov Z. tritici 2.

Kloniranje prvega gena Stb (Stb6) je pred kratkim pokazalo, da kodira s steno povezan receptor, ki daje gen-za-gen tip odpornosti proti izolatom, ki nosijo ujemajoči se gen AvrStb6 1. Še en gen, ki je še posebej zanimiv, je Stb16q, ki je bil učinkovit proti vsem doslej testiranim izolatom Z. tritici2. V tem članku so ta gen klonirali in analizirali iz sintetične heksaploidne pšenice (SHW), ki je odporna na STB 1. SHW so umetno ustvarjeni plodni hibridi med tetraploidno pšenico in diploidnim sorodnikom pšenice s čem se omogoči prenos agronomsko pomembnih genov iz divjih sorodnikov na navadno pšenico 3.

Z uporabo QTL (‘’ang.'' Quantitative Trait Loci) analize odpornosti dupliranih haplotipov križanja SHW TA4152-19 z dovzetno linijo ND495 na Z. tritici so ugotovili da je gen na lokusu Stb16q, ali gen, ki je direktno povezan z njim odgovoren za fenotipsko varijacijo 1,4. Primerjali so sekvenco z referenčno genetsko karto visoke gostote in so opazili so da se 5 mikrosatelitnih markerjev skupaj deduje s Stb16q. Markerje so uporabili da iščejo rekombinacijske dogodke pri 1305 imunih in 675 dovzetnih rastlin s čem so omejili Stb16q na 272 kb interval, z zapisom za dva gena Crk6 in Unk1 1.

Kako bi ugotovili funkcijo genov, primerjali so sekvence teh genov v odpornih in dovzetnih sevih. Ugotovili so da so vsi sevi, ki vsebujejo ali Crk6 ali Unk1 haplotip iz TA4152-19, odporni na Z. tritici, dokler jih dovzeten sev ND495 ne vsebuje. Po tem so preverjali fenotipe 310 družin mutageniziranih TA4152-19 in opazili da so dovzetne rastline vsebovale škodljivo mutacijo S508F v kinazni aktivacijski zanki Crk6, medtem ko v genu Unk1 niso opazili mutacije. Ugotovili so da je homozigotnost te mutacije povzročila dovzetnost, kar dokazuje da gen Crk6 predstavlja Stb16q. Na koncu so še stabilno transformirali dovzetni sev Courtot z genomsko sekvenco Crk6 in T2 generacijo okužili z 11 sevi Z. tritici. Opazili so da so vse rastline, ki so vsebovale transgen, bile odporne na vse seve, s čem so sklenili da Crk6 omogoča odpornost širokega spektra proti Z. tritici 1.

Izražanje Stb16q so predvsem opazili v listih TA4152-19, pri čemer se raven zvišala en dan po inokulaciji z Z. tritici. Stb16q kodira receptorju podobno kinazo bogato s cisteini, transmembranski protein z dvemi ekstracelularnimi DUF26 domenami in intracelularno serin/treonin protein kinazno domeno. Na osnovi aminokislinske ohranjenosti DUF26 domene med Gnk2 in Stb16q proteinom, predpostavljajo da Stb16q veže apoplastično manozo, ki izhaja iz glive ali rastline s čem aktivira imunski odziv. Imunski odziv prepreči širjenje glive pred vhodom skozi stomatno režo, ali v njeni votlini, pri čemer ne ubije patogena. Člani CRK familije, med katere sovpada Stb16q, so pokazali vlogo v odpornosti proti patogenih pri drugih rastlinah. Pri Arabidopsis so tudi dobro preučeni, ampak odsotnost ortologov onemogoča predpostavljanje mehanizma reakcije 1.

Analizirali so zastopanost otpornega haplotipa Stb16q in opazili so ga samo pri SHW. Od 805 vzorkov iz osnovne zbirke pšenic in sort iz glavnih območji za proizvodnjo pšenice, otporen alel so imele samo 6 sort. Stb16q je verjetno izvirajo iz sevov Ae. tauschii pri Kaspijskem jezeru, pri čemer je gen pred kratkim vnesen v SHW v rejskih programih. Preverili so tudi da Stb16q ne daje dovzetnosti za druge bolezni, s čem so pokazali da je gen uporaben za vzrejo 1.
V članku so pokazali da Stb16q omogoča odpornim SHW odpornost širokega spektra proti vseh preverjenih sevih Z. tritici, tudi če ne moremo izključiti, da imajo ti sevi druge obrambne mehanizme proti tem patogenu. S druge strani, odsotnost Stb16q iz gojenih sort pšenice ukazuje, da ni bilo selekcijskega pritiska na patogen, kaj je verjetno tudi razlog za odpornost širokega spektra. To pomeni, da je treba ta gen skrbno uporabiti z drugimi kvalitativnimi ali kvantitativnimi odpornostmi za vzrejo trajnih sort pšenice, odpornih na širok spekter Z. tritici 1.

==Literatura==
1. Saintenac, C. et al. A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch. Nat. Commun. 12, 1–10 (2021).
2. Brown, J. K. M., Chartrain, L., Lasserre-Zuber, P. & Saintenac, C. Genetics of resistance to Zymoseptoria tritici and applications to wheat breeding. Fungal Genet. Biol. 79, 33–41 (2015).
3. Li, A., Liu, D., Yang, W., Kishii, M. & Mao, L. Synthetic Hexaploid Wheat: Yesterday, Today, and Tomorrow. Engineering vol. 4 552–558 (2018).
4. Kearsey, M. J. & Farquhar, A. G. L. QTL analysis in plants; where are we now? Heredity (Edinb). 80, 137–142 (1998).

MBT seminarji 2021

2021-04-05T20:42:52Z

Andrej Race:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.) 
# An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini daje odpornost pšenice proti širokemu spektru madežev Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)
# Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Saša Slabe (14.4.)
# Luka Gnidovec (15.4.)
# Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Anže Karlek (21.4.)
# Ana Maklin (22.4.)
# Urban Hribar (22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Urška Fajdiga (5.5.)
# Mirsad Mešić (6.5.)
# Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Jerneja Nimac (12.5.)
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Klementina Polanec (13.5.)
# Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Željka Erić (19.5.)
# Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Katja Doberšek (20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# Almina Tahirović (26.5.)
# Eva Keber (27.5.)
# Nina Lukančič (27.5.)

MBT seminarji 2021

2021-04-05T20:42:11Z

Andrej Race:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.) 
# An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi: 10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini daje odpornost pšenice proti širokemu spektru madežev Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)
# Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Saša Slabe (14.4.)
# Luka Gnidovec (15.4.)
# Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Anže Karlek (21.4.)
# Ana Maklin (22.4.)
# Urban Hribar (22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Urška Fajdiga (5.5.)
# Mirsad Mešić (6.5.)
# Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Jerneja Nimac (12.5.)
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Klementina Polanec (13.5.)
# Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Željka Erić (19.5.)
# Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Katja Doberšek (20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# Almina Tahirović (26.5.)
# Eva Keber (27.5.)
# Nina Lukančič (27.5.)

Rezultati kliničnih testiranj proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)

2021-03-25T08:06:24Z

Andrej Race: /* Povečana učinkovitost z daljšim intervalom med odmerki */

=== Zasnova kliničnih študij in učinkovitost ===
AstraZeneca je 7.12.2020 objavila rezultate 4 kliničnih študij svojega cepiva AZD1222. Te so vključevale 17.177 udeležencev v Veliki Britaniji, Braziliji in Južni Afriki. Rezultati so pokazali 76-odstotno učinkovitost cepiva in 67-odstotno zmanjšanja prenosa virusa. Dne 22. marca 2021 so objavili rezultate tretje faze klinične študije v ZDA, kjer trdijo, da je učinkovitost cepiva 79 %, čeprav neodvisna komisija zdravstvenih strokovnjakov trdi da je do 10 % manjša.

=== Povečana učinkovitost z daljšim intervalom med odmerki ===
Opazili so, da je učinkovitost večja (90 %) pri osebah, ki so sprejele polovično prvo dozo. Do tega pride verjetno zato, ker manjša prva doza omogoča hitrejši razvoj spominskih imunskih celic, pri čemer to lahko dosežemo tudi z večjim intervalom med odmerki. Ugotovitev, da je 12-tedenski interval med odmerki najuspešnejši, podpira to hipotezo.

=== Varnost in stranski učinki ===
Poleg običajnih stranskih učinkov, ki se pojavljajo tudi po cepljenju z drugimi cepivi, se je pri tem pojavilo še možno povečano tveganje za nastanek krvnih strdkov. Evropska agencija za zdravila (EMA) je objavila, da te povezave ni, vendar je cepivo lahko povezano z zelo redkimi primeri nastanka krvnih strdkov, povezanih z trombocitopenijo. Pri 20 milijonov cepljenih v Veliki Britaniji in v Evropski gospodarski regiji so zabeležili 25 primerov te bolezni. Odbor je menil, da dokazana učinkovitost cepiva pri preprečevanju hospitalizacije in smrti zaradi COVID-19 odtehta zelo majhno verjetnost za razvoj te redke bolezni.

== Viri ==
# Callaway, E. Oxford Covid Vaccine Results Puzzle Scientists. Nature 588 (2020).
# COVID-19 Vaccine AstraZeneca: benefits still outweigh the risks despite possible link to rare blood clots with low blood platelets | European Medicines Agency. https://www.ema.europa.eu/en/news/covid-19-vaccine-astrazeneca-benefits-still-outweigh-risks-despite-possible-link-rare-blood-clots.
# Voysey, M. ''et al.'' Single Dose Administration, And The Influence Of The Timing Of The Booster Dose On Immunogenicity and Efficacy Of ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222) Vaccine. SSRN Electron. J. (2021) doi:10.2139/ssrn.3777268.
# Federal Health Officials Say AstraZeneca Vaccine Trial May Have Relied on ‘Outdated Information’ - The New York Times. https://www.nytimes.com/live/2021/03/22/world/covid-vaccine-coronavirus-cases.
# AZD1222 US Phase III trial met primary efficacy endpoint in preventing COVID-19 at interim analysis. https://www.astrazeneca.com/media-centre/press-releases/2021/astrazeneca-us-vaccine-trial-met-primary-endpoint.html.

Rezultati kliničnih testiranj proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)

2021-03-25T08:05:50Z

Andrej Race: /* Zasnova kliničnih študij in učinkovitost */

=== Zasnova kliničnih študij in učinkovitost ===
AstraZeneca je 7.12.2020 objavila rezultate 4 kliničnih študij svojega cepiva AZD1222. Te so vključevale 17.177 udeležencev v Veliki Britaniji, Braziliji in Južni Afriki. Rezultati so pokazali 76-odstotno učinkovitost cepiva in 67-odstotno zmanjšanja prenosa virusa. Dne 22. marca 2021 so objavili rezultate tretje faze klinične študije v ZDA, kjer trdijo, da je učinkovitost cepiva 79 %, čeprav neodvisna komisija zdravstvenih strokovnjakov trdi da je do 10 % manjša.

=== Povečana učinkovitost z daljšim intervalom med odmerki ===
Opazili so, da je učinkovitost večja (90 %) pri osebah, ki so prejele polovično prvo dozo. Do tega pride verjetno zato, ker manjša prva doza omogoča hitrejši razvoj spominskih imunskih celic, pri čemer to lahko dosežemo tudi z večjim intervalom med odmerki. Ugotovitev, da je 12-tedenski interval med odmerki najuspešnejši, podpira to hipotezo.

=== Varnost in stranski učinki ===
Poleg običajnih stranskih učinkov, ki se pojavljajo tudi po cepljenju z drugimi cepivi, se je pri tem pojavilo še možno povečano tveganje za nastanek krvnih strdkov. Evropska agencija za zdravila (EMA) je objavila, da te povezave ni, vendar je cepivo lahko povezano z zelo redkimi primeri nastanka krvnih strdkov, povezanih z trombocitopenijo. Pri 20 milijonov cepljenih v Veliki Britaniji in v Evropski gospodarski regiji so zabeležili 25 primerov te bolezni. Odbor je menil, da dokazana učinkovitost cepiva pri preprečevanju hospitalizacije in smrti zaradi COVID-19 odtehta zelo majhno verjetnost za razvoj te redke bolezni.

== Viri ==
# Callaway, E. Oxford Covid Vaccine Results Puzzle Scientists. Nature 588 (2020).
# COVID-19 Vaccine AstraZeneca: benefits still outweigh the risks despite possible link to rare blood clots with low blood platelets | European Medicines Agency. https://www.ema.europa.eu/en/news/covid-19-vaccine-astrazeneca-benefits-still-outweigh-risks-despite-possible-link-rare-blood-clots.
# Voysey, M. ''et al.'' Single Dose Administration, And The Influence Of The Timing Of The Booster Dose On Immunogenicity and Efficacy Of ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222) Vaccine. SSRN Electron. J. (2021) doi:10.2139/ssrn.3777268.
# Federal Health Officials Say AstraZeneca Vaccine Trial May Have Relied on ‘Outdated Information’ - The New York Times. https://www.nytimes.com/live/2021/03/22/world/covid-vaccine-coronavirus-cases.
# AZD1222 US Phase III trial met primary efficacy endpoint in preventing COVID-19 at interim analysis. https://www.astrazeneca.com/media-centre/press-releases/2021/astrazeneca-us-vaccine-trial-met-primary-endpoint.html.

Rezultati kliničnih testiranj proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)

2021-03-24T15:54:01Z

Andrej Race: /* Viri */

=== Zasnova kliničnih študij in učinkovitost ===
Astrazeneca je 7.12.2021 objavila rezultate 4 klinična študija, ki so vključevale 17.177 udeležencev v Veliki Britaniji, Braziliji in Južni Afriki, svojega cepiva AZD1222. Rezultati so pokazali učinkovitost cepiva od 70% in znake zmanjšanja prenosa od 67%. 22. marta so objavili rezultate tretje faze kliničnega študija v ZDA, kje trdijo da je učinkovitost cepiva 79%, čeprav neodvisna komisija zdravstvenih strokovnjakov trdi da je do 10% manjša.

=== Povečana učinkovitost z daljšim intervalom med odmerki ===
Opazili so da je učinkovitost večja (90%) pri osebkih, ki so sprejeli polovično prvo dozo. Do tega pride verjetno ker manjša prva doza omogoča hitrejše razvijanje spominskih imunskih celic, pri čemer to lahko dosežemo tudi z večjim intervalom med odmerki. Ugotovitev, da je 12-tedenski interval med odmerki najuspešnejši, podpira to hipotezo.

=== Varnost in stranski učinki ===
Poleg običajnih stranskih učinkov, povezanih z drugimi cepivi, pojavila se možnost za tveganje za nastanek krvnih strdkov. EMA je objavila da te povezave ni, vendar je cepivo lahko povezano z zelo redkimi primeri krvnih strdkov, povezanih z trombocitopenijo. Pri 20 milionov cepljenih v Britaniji in Evropski Ekonomski Regiji, zabeležili so 25 primerov te bolezni. Odbor je menil, da dokazana učinkovitost cepiva pri preprečevanju hospitalizacije in smrti zaradi COVID-19 odtehta zelo majhno verjetnost za razvoj teh redkih bolezni.

== Viri ==
# Callaway, E. Oxford Covid Vaccine Results Puzzle Scientists. Nature 588 (2020).
# COVID-19 Vaccine AstraZeneca: benefits still outweigh the risks despite possible link to rare blood clots with low blood platelets | European Medicines Agency. https://www.ema.europa.eu/en/news/covid-19-vaccine-astrazeneca-benefits-still-outweigh-risks-despite-possible-link-rare-blood-clots.
# Voysey, M. ''et al.'' Single Dose Administration, And The Influence Of The Timing Of The Booster Dose On Immunogenicity and Efficacy Of ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222) Vaccine. SSRN Electron. J. (2021) doi:10.2139/ssrn.3777268.
# Federal Health Officials Say AstraZeneca Vaccine Trial May Have Relied on ‘Outdated Information’ - The New York Times. https://www.nytimes.com/live/2021/03/22/world/covid-vaccine-coronavirus-cases.
# AZD1222 US Phase III trial met primary efficacy endpoint in preventing COVID-19 at interim analysis. https://www.astrazeneca.com/media-centre/press-releases/2021/astrazeneca-us-vaccine-trial-met-primary-endpoint.html.

Rezultati kliničnih testiranj proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)

2021-03-24T15:53:30Z

Andrej Race: /* Viri */

=== Zasnova kliničnih študij in učinkovitost ===
Astrazeneca je 7.12.2021 objavila rezultate 4 klinična študija, ki so vključevale 17.177 udeležencev v Veliki Britaniji, Braziliji in Južni Afriki, svojega cepiva AZD1222. Rezultati so pokazali učinkovitost cepiva od 70% in znake zmanjšanja prenosa od 67%. 22. marta so objavili rezultate tretje faze kliničnega študija v ZDA, kje trdijo da je učinkovitost cepiva 79%, čeprav neodvisna komisija zdravstvenih strokovnjakov trdi da je do 10% manjša.

=== Povečana učinkovitost z daljšim intervalom med odmerki ===
Opazili so da je učinkovitost večja (90%) pri osebkih, ki so sprejeli polovično prvo dozo. Do tega pride verjetno ker manjša prva doza omogoča hitrejše razvijanje spominskih imunskih celic, pri čemer to lahko dosežemo tudi z večjim intervalom med odmerki. Ugotovitev, da je 12-tedenski interval med odmerki najuspešnejši, podpira to hipotezo.

=== Varnost in stranski učinki ===
Poleg običajnih stranskih učinkov, povezanih z drugimi cepivi, pojavila se možnost za tveganje za nastanek krvnih strdkov. EMA je objavila da te povezave ni, vendar je cepivo lahko povezano z zelo redkimi primeri krvnih strdkov, povezanih z trombocitopenijo. Pri 20 milionov cepljenih v Britaniji in Evropski Ekonomski Regiji, zabeležili so 25 primerov te bolezni. Odbor je menil, da dokazana učinkovitost cepiva pri preprečevanju hospitalizacije in smrti zaradi COVID-19 odtehta zelo majhno verjetnost za razvoj teh redkih bolezni.

== Viri ==
# Callaway, E. Oxford Covid Vaccine Results Puzzle Scientists. Nature 588 (2020).
# COVID-19 Vaccine AstraZeneca: benefits still outweigh the risks despite possible link to rare blood clots with low blood platelets | European Medicines Agency. https://www.ema.europa.eu/en/news/covid-19-vaccine-astrazeneca-benefits-still-outweigh-risks-despite-possible-link-rare-blood-clots.
# Voysey, M. "et al." Single Dose Administration, And The Influence Of The Timing Of The Booster Dose On Immunogenicity and Efficacy Of ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222) Vaccine. SSRN Electron. J. (2021) doi:10.2139/ssrn.3777268.
# Federal Health Officials Say AstraZeneca Vaccine Trial May Have Relied on ‘Outdated Information’ - The New York Times. https://www.nytimes.com/live/2021/03/22/world/covid-vaccine-coronavirus-cases.
# AZD1222 US Phase III trial met primary efficacy endpoint in preventing COVID-19 at interim analysis. https://www.astrazeneca.com/media-centre/press-releases/2021/astrazeneca-us-vaccine-trial-met-primary-endpoint.html.

Rezultati kliničnih testiranj proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)

2021-03-24T15:53:01Z

Andrej Race: /* Viri */

=== Zasnova kliničnih študij in učinkovitost ===
Astrazeneca je 7.12.2021 objavila rezultate 4 klinična študija, ki so vključevale 17.177 udeležencev v Veliki Britaniji, Braziliji in Južni Afriki, svojega cepiva AZD1222. Rezultati so pokazali učinkovitost cepiva od 70% in znake zmanjšanja prenosa od 67%. 22. marta so objavili rezultate tretje faze kliničnega študija v ZDA, kje trdijo da je učinkovitost cepiva 79%, čeprav neodvisna komisija zdravstvenih strokovnjakov trdi da je do 10% manjša.

=== Povečana učinkovitost z daljšim intervalom med odmerki ===
Opazili so da je učinkovitost večja (90%) pri osebkih, ki so sprejeli polovično prvo dozo. Do tega pride verjetno ker manjša prva doza omogoča hitrejše razvijanje spominskih imunskih celic, pri čemer to lahko dosežemo tudi z večjim intervalom med odmerki. Ugotovitev, da je 12-tedenski interval med odmerki najuspešnejši, podpira to hipotezo.

=== Varnost in stranski učinki ===
Poleg običajnih stranskih učinkov, povezanih z drugimi cepivi, pojavila se možnost za tveganje za nastanek krvnih strdkov. EMA je objavila da te povezave ni, vendar je cepivo lahko povezano z zelo redkimi primeri krvnih strdkov, povezanih z trombocitopenijo. Pri 20 milionov cepljenih v Britaniji in Evropski Ekonomski Regiji, zabeležili so 25 primerov te bolezni. Odbor je menil, da dokazana učinkovitost cepiva pri preprečevanju hospitalizacije in smrti zaradi COVID-19 odtehta zelo majhno verjetnost za razvoj teh redkih bolezni.

== Viri ==
# Callaway, E. Oxford Covid Vaccine Results Puzzle Scientists. Nature 588 (2020).
# COVID-19 Vaccine AstraZeneca: benefits still outweigh the risks despite possible link to rare blood clots with low blood platelets | European Medicines Agency. https://www.ema.europa.eu/en/news/covid-19-vaccine-astrazeneca-benefits-still-outweigh-risks-despite-possible-link-rare-blood-clots.
# Voysey, M. et al. Single Dose Administration, And The Influence Of The Timing Of The Booster Dose On Immunogenicity and Efficacy Of ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222) Vaccine. SSRN Electron. J. (2021) doi:10.2139/ssrn.3777268.
# Federal Health Officials Say AstraZeneca Vaccine Trial May Have Relied on ‘Outdated Information’ - The New York Times. https://www.nytimes.com/live/2021/03/22/world/covid-vaccine-coronavirus-cases.
# AZD1222 US Phase III trial met primary efficacy endpoint in preventing COVID-19 at interim analysis. https://www.astrazeneca.com/media-centre/press-releases/2021/astrazeneca-us-vaccine-trial-met-primary-endpoint.html.

Rezultati kliničnih testiranj proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)

2021-03-24T15:50:35Z

Andrej Race: New page: === Zasnova kliničnih študij in učinkovitost === Astrazeneca je 7.12.2021 objavila rezultate 4 klinična študija, ki so vključevale 17.177 udeležencev v Veliki Britaniji, Braziliji i...

=== Zasnova kliničnih študij in učinkovitost ===
Astrazeneca je 7.12.2021 objavila rezultate 4 klinična študija, ki so vključevale 17.177 udeležencev v Veliki Britaniji, Braziliji in Južni Afriki, svojega cepiva AZD1222. Rezultati so pokazali učinkovitost cepiva od 70% in znake zmanjšanja prenosa od 67%. 22. marta so objavili rezultate tretje faze kliničnega študija v ZDA, kje trdijo da je učinkovitost cepiva 79%, čeprav neodvisna komisija zdravstvenih strokovnjakov trdi da je do 10% manjša.

=== Povečana učinkovitost z daljšim intervalom med odmerki ===
Opazili so da je učinkovitost večja (90%) pri osebkih, ki so sprejeli polovično prvo dozo. Do tega pride verjetno ker manjša prva doza omogoča hitrejše razvijanje spominskih imunskih celic, pri čemer to lahko dosežemo tudi z večjim intervalom med odmerki. Ugotovitev, da je 12-tedenski interval med odmerki najuspešnejši, podpira to hipotezo.

=== Varnost in stranski učinki ===
Poleg običajnih stranskih učinkov, povezanih z drugimi cepivi, pojavila se možnost za tveganje za nastanek krvnih strdkov. EMA je objavila da te povezave ni, vendar je cepivo lahko povezano z zelo redkimi primeri krvnih strdkov, povezanih z trombocitopenijo. Pri 20 milionov cepljenih v Britaniji in Evropski Ekonomski Regiji, zabeležili so 25 primerov te bolezni. Odbor je menil, da dokazana učinkovitost cepiva pri preprečevanju hospitalizacije in smrti zaradi COVID-19 odtehta zelo majhno verjetnost za razvoj teh redkih bolezni.

== Viri ==
1. Callaway, E. Oxford Covid Vaccine Results Puzzle Scientists. Nature 588 (2020).
2. COVID-19 Vaccine AstraZeneca: benefits still outweigh the risks despite possible link to rare blood clots with low blood platelets | European Medicines Agency. https://www.ema.europa.eu/en/news/covid-19-vaccine-astrazeneca-benefits-still-outweigh-risks-despite-possible-link-rare-blood-clots.
3. Voysey, M. et al. Single Dose Administration, And The Influence Of The Timing Of The Booster Dose On Immunogenicity and Efficacy Of ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222) Vaccine. SSRN Electron. J. (2021) doi:10.2139/ssrn.3777268.
4. Federal Health Officials Say AstraZeneca Vaccine Trial May Have Relied on ‘Outdated Information’ - The New York Times. https://www.nytimes.com/live/2021/03/22/world/covid-vaccine-coronavirus-cases.
5. AZD1222 US Phase III trial met primary efficacy endpoint in preventing COVID-19 at interim analysis. https://www.astrazeneca.com/media-centre/press-releases/2021/astrazeneca-us-vaccine-trial-met-primary-endpoint.html.

Protikovidna cepiva

2021-03-24T15:43:13Z

Andrej Race:

študentski seminar pri predmetu Molekularna biotehnologija 2020/21 
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo 
Magistrski študij Biokemija 

Seminar pripravljajo študentje 1. in 2. letnika magistrskega študija. Kratki povzetki morajo biti napisani na taki ravni zahtevnosti, da so razumljivi širši javnosti. Predstavitve seminarjev (6 oz. 12 minut) imajo splošen uvod in strokovno nadaljevanje. Vsebina temelji na javno dostopnih podatkih v času priprave seminarja. Po zadnji seminarski predstavitvi bomo predvidoma izdali zbornih povzetkov, ki bo vključeval tudi slikovne razlage. Poleg tega seminarja morajo študentje pripraviti tudi daljšo predstavitev teme iz znanstvene literature.

Razpored predstavitev:

# [[Molekularnobiološke značilnosti SARS-CoV-2 in aktualni mutanti (južnoafriški, britanski, nigerijski,...)]] - 11.3. (12 min) 
# [[Interakcija SARS-CoV-2 s tarčno celico]] - 11.3. (6 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca Moderna (mRNA)]] - 18.3. (12 min) 
# [[Rezultati kliničnih testiranj cepiva proizvajalca Moderna (mRNA) ]] - 18.3.(6 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)]] - 25.3. (12 min) 
# [[Rezultati kliničnih testiranj proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)]] - 25.3. (6 min) 
# Značilnosti cepiva proizvajalca Pfizer / BioNTech (mRNA) - 1.4. (12 min) 
# Rezultati kliničnih testiranj cepiva proizvajalca Pfizer / BioNTech (mRNA) - 1.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva proizvajalca Johnson&Johnson / Jennsen (Ad26) - 8.4. (6 min) 
# Opuščena cepiva: Merck (IAVI, Themix), Imperial College London, Univ. of Queensland - 8.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Sputnik V (Gamaleya) (Ad26, Ad5) - 15.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva CanSino (Ad5) - 15.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiv Sinopharm in Sinovac (inaktivirano) - 22.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Bharat Biotech (inaktivirano) - 22.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Novavax (proteinsko) - 6.5. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Vector Institute (proteinsko) - 6.5. (6 min) 
# Značilnosti cepiva EpiVacCorona (peptidno) - 13.5. (6 min) 
nerazporejeno:
# Značilnosti cepiva Zyadus Cadilla (DNA) - 13.5. 
# Značilnosti cepiva COVAXX / UBI (peptidno) - 20.5.

MBT seminarji 2021

2021-03-11T09:05:50Z

Andrej Race:

Robusten in občutljiv sintetični senzor za spremljanje transkripcijskega izhoda signalne mreže citokininov in planta

2020-05-18T19:41:48Z

Andrej Race:

''Povzeto po članku:'' [https://plantphysiol.org/content/161/3/1066 E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.]

Citokinini so razred fitohormonov, ki spodbujajo delitev celic v rastlinskih koreninah in poganjkih. Vključeni so predvsem v rasti in diferenciaciji celic, vplivajo pa tudi na apikalno prevlado, rast aksialinih brstov in staranje listov [1]. Citokinini sprožijo signalno kaskado večstopenjske fosforilacije (MSP). To pot sproži vezava citokinina na CHASE domeno hibridne histidin senzor kinaze. Posledično pride do avtofosforilacije receptorja na His ostanku in nadaljnji prenos fosfatne skupine na Asp ostanek v domeni oddajnika. Fosfat se nato prenese na fosfotransferni protein, ki se translocira v jedro in lahko nato fosforilira regulatorje odziva (ARR) tipa B. ARR so družina transkripcijskih faktorjev, ki sovpadajo v tip A, B ali C. Pripadniki razreda tipa B se vežejo na promotorje ciljnih genov preko njihove Myb-podobne DNA-vezavne domene in aktivirajo transkripcijo, medtem ko ARR-ji tipa A in tipa C zavirajo signalno aktivnost. Hkrati so ARR tipa A glavna tarča aktiviranih ARR tipa B, kar vzpostavi negativno povratno zanko na signalno pot. Opisano pot lahko tudi aktivirajo citokinin neodvisne kinaze 1 (CKI1) [2], [3].

==Analiza vpliva citokininov==
Največja težava, ki nastane pri raziskovanju vloge MSP, je da citokinini imajo kompleksno biosintezo, transport in razgradnjo, kar oteži določevanje distribucije aktivnih citokininov v rastlinah. Poleg tega, MSP lahko aktivirajo druge od citokininov neodvisne kinaze kot so CKI1. Zaradi tega je najboljši pristop vizualizacije transkripcijskega izražanja MSP s sintetičnim reporterjem, ki razkrije mesta delovanja med razvojem divjega tipa. ARR tipa B se vežejo na 9bp veliko sekvenco, ki ima ohranjeno 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' zaporedje. To ohranjeno zaporedje je omogočilo razvoj dvokomponentnega signalnega senzorja (TCS) z ponavljajočimi 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' vezavnimi mesti. Transgenske rastline, ki vsebujejo TCS promotor z zapisom za GFP (TCS::GFP), so omogočile ugotovitev novih, kot tudi boljše razumevanje že znanih vlog citokininov, ampak so se srečale z nekaterimi težavami. Izražanje s pomočjo TCS je šibko v nekaterih delih rastline kje imamo že zabeleženo vlogo citokininov in izražanje GFP se postopoma zniža z zvišanjem generacije, verjetno zaradi vtišanja ponavljajočih se sekvenc TCS. Zaradi tega so v tem članku razvili izboljšano različico TCSn::GFP, ki se izogiba tem težavam in omogoča močnejši signal. TCS so predvsem optimizirali s spremembo števila vezavnih mest, spremembo faze in spremembo baz med motivi [2].

==Razvoj TCSn==
===Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS===
Analizirali so različna zaporedja TCS vezana z minimalnim 35S promotorjem in zaporedjem za luciferazo, ki so jih prehodno vstavili v primarne mezofilske protoplaste Arabidopsis thaliane z agronifiltracijo. Osnovna biokocka je vsebovala 4 motiva 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' ločenimi z poljubno izbranimi sosednjimi nukleotidi. Biokocke so narejene tako da vsebujejo motive smernih in inverznih ponovitev v vseh možnih orientaciah. Torej, tandemska ponovitev, glava na glavo in rep na rep. Pri 4 ponovitvah niso opazili bistvene razlike v primerjavi z kontorlo, med tem ko se minimalno izražanje pojavilo komaj po 8ih ponovitah. TCS s 16 ponovitev je omogočila podoben signal kot pri luciferazi vezani na ARR6 promotor, ki je sestavljen na osnovi 5' regulativne regije enega izmed ARR tipa A genov. Največje izražanje reporterja so opazili pri 24 ponovitvah motiva, kar nakazuje na močen kooperativni efekt med transkripcijskimi faktorji. Nadaljnje zvišanje števila motivov je imelo inhibitorni vpliv. Tako je zaporedje z 24 motivov bilo izbrano in dobilo ime TCS [2], [4]. Kooperacija ARR-jev tipa B je tudi bila dokazana ''in planta'' [5].

===Določanje vpliva sosednjih baz===
Naslednje so raziskali kako sprememba baz motiva in sosednjih baz vpliva na izražanje reporterja. Razvili so različice TCS, TCS*, ki vsebuje mutacije v motivu in TCSfm, ki vsebuje mutacije v sosednjih bazah. Ugotovili so da so promotorji postali neobčutljivi na citokinine in da je verjetno ''in vitro'' določen motiv 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' nezadosten za prepoznavo z ARR tipa B ''in vivo''. Zaradi tega je potrebno še optimizirati sosednje baze, kako bi izboljšali TCS [2].

===Določanje razdalje med motivi===
Testirali so še različice TCS, ki ima 9bp parov razdalje, z različnimi razdaljami med motivi in preverili njen vpliv na izražanje. Različica z 7bp razdalje je pokazala znižanje v aktivnosti, dokler je različica z 11 bp pokazala močnejšo aktivnost. To se sklada z dejstvom da DNA rabi 11 bp da naredi obrat v heliksu v njeni B konformaciji in da faziranje vezavnih mest s tem številom bp na splošno omogoča največjo aktivnost transkripcijskih faktorjev [2].

===Optimizacija s pomočjo bioinformatske analize===
Kako bi ugotovili katera vezavna mesta se nahajajo v divjih tipih Arabidopsis thaliane in s tem ugotovili kako da zvišajo izražanje in se izognejo vtišanju TCS, analizirali so vezavna mesta za ARR tipa B. Analizirali so 3kbp sekvenco navzgor od prepisanega zaporedja kot tudi prepisano zaporedje ARR tipa A genov, ker se tam ponavadi nahaja cis-regulativno zaporedje in iskali zaporedje 5'-(A/G)GAT(C/T)-3'. Čeprav je to zaporedje bolj pogosto v analiziranih sekvencah, še vedno bi se najdlo vsakič na 108bp v naključni DNA. Zaradi tega so zvišali specifičnost tako da so iskali motive, ki so odaljeni vsaj 6 bp, ker je dolžina samega motiva 5bp in ne več kot 30bp, ker so iskali motive v gručah. Ugotovili so da se motivi nahajajo na 7 do 14bp en od drugega v povprečju in da se smerne in inverzne ponovitve pojavijo enako pogosto. Dodanih je bilo po 3 bp na vsak konec iskanih motivov (poglej podpoglavlje Določanje faze). Sekvence, ki jih spremlja podaljšek 5', 5'-A-3' in/ali 3' podaljšek, 5'-T-3' se pojavljajo pogosteje. Ugotovili so tudi da se sekvenca 5'-AA(A/G)GAT(C/T)TT-3' izredno bolj pogosto nahaja v tarčnih genov citokininov v primerjavi z kontrolnimi geni. Na osnovi teh informacij ustvarili so 12 motivov (Tabela 1). Ti sintetični motivi so bili naključno združeni, da so dobili sintetično zaporedje, ki vsebuje 24 vezavnih mest v vseh mogočih orientacijah (poglej podpoglavje Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS). S tem razvojem so omogočili da je izražanje reporterskega gena bolj enakomerno in da ne pride do vtišanja zaradi monotonosti [2].

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 1: Motivi uporabljeni v TCSn'''
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|zaporedje
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT

|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |2
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GAGAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |3
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |4
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |5
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTAT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |6
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |7
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |8
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |9
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |10
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |11
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GTTGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |12
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |ATGGGATCTTG
|}

==Specifičnost in občutljivost TCSn==
Kako bi preverili občutljivost in specifičnost TCSn, transficirali so protoplaste z TCSn konjugirano z luciferazo. Ugotovili so da se pojavi večji signal v primerjavi z TCS in da ne pride do nespecifičnega izražanja v prisotnosti nekaterih drugih fitohormonov. Kotransfekcija z ojačevalci MSP, kot so CKI1 in ARR tipa B je zvišala izražanje reporterja, medtem ko je kotransfekcija z ARR tipa A, torej inhibitorji MSP, znižala izražanje. Pri nekaterih ojačevalcih je prišlo do ojačanja signala v primerjavi z TSC, dokler je pri drugih ostalo isto. Specifičnost je tudi preverjena z transkripcijskimi faktorji, ki imajo podobno vezavno zaporedje kot ARR tipa B in ugotovljeno je da ne aktivirajo izražanje niti TCS niti TCSn. Do aktivacije pride tudi v monokaličnicah zaradi podobnosti ARR tipa B genov pri vseh rastlinah. Analizirali so še izražanje reporterja v rastlinah, ki so bile transficirane z konstruktom TCSn::GFP in ugotovili da pride do močnejšega signala v primerjavi z tistimi rastlinami, ki so transficirane z TCS::GFP ARR5::GFP. V sadikah teh rastlin so inducirali CKI1 in ARR10:SRDX, ARR tipa B konjugiran z represorjem fosforilacije, ki vtiša MSP. V tistih z induciranim CKI1 je zabeležena vseprisotna aktivnost reporterja, dokler je v tistih z ekspresijo ARR10:SRDX zabeleženo utišanje GFP-ja. S temi analizami so potrdili da TSCn specifično izraža aktivnost MSP. Poleg tega, po treh generacijah transgenih rastlin ni bilo opaziti zmanjšanja ravni GFP, kar kaže, da za razliko od TCS::GFP, TCSn::GFP ni podvržen vtišanju transgena [2].

==Vzorci izražanja TCSn::GFP==
Trasfekcija rastlin z TCSn::GFP je pokazala izražanje reporterja, ki se sklada z že znanimi vlogami citokininov. Poleg tega, za razliko od TCS::GFP, ekspresija TCSn::GFP je aktivna še v poznih stadijih ženske embriogeneze. V primerjavi z TCS::GFP, signal je bistveno slabši v suspenzorskih celicah in celic, ki nastanejo iz njih, dokler je signal močnejši pri provaskularnih in bodočih celicah meristema poganjka. Do tega pride, verjetno ker niti en promotor ni optimiziran da ga aktivirajo vsi ARR tipa B enako. TCS lahko odraža boljše pogoje vezave za skupino ARR tipa B, izraženih v suspenzorskih celicah, medtem ko se v vseh drugih tkivih zdi, da TCSn zagotavlja boljše pogoje. V drugih regijah je na splošno izražanje kvalitativno enako, ampak bolj močno kot v primerjavi z TCS::GFP [2].

==Zaključek==
Razvoj od TCS odvisne ekspresije reporterskih genov je omogočil izboljšanje do takrat znanih modelov in odkritje ne znanih funkcij citokininov. Ampak, pri njihovoj uporabi pride do težav. Zaradi tega je razvit TCSn, ki za razliko od TCS, ima večjo občutljivost na citokinine, bolj izbalansiran odgovor na različne ARR-je tipa B in ni podvržen vtišanju zaradi monotonosti sekvence. To bo tudi olajšalo prekrižanje TCSn::GFP linije z različnimi drugimi linijami in omogočilo raziskanje manj znanih vlog MSP [2].

==Viri==
[1] J. J. Kieber, ‘Tribute to Folke Skoog: Recent Advances in our Understanding of Cytokinin Biology’, J. Plant Growth Regul., vol. 21, no. 1, pp. 1–2, Mar. 2002, doi: 10.1007/s003440010059.

[2] E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.

[3] C. E. Hutchison and J. J. Kieber, ‘Cytokinin Signaling in Arabidopsis’, Plant Cell, vol. 14, no. suppl 1, pp. S47–S59, May 2002, doi: 10.1105/tpc.010444.

[4] B. Müller and J. Sheen, ‘Cytokinin and auxin interplay in root stem-cell specification during early embryogenesis’, Nature, vol. 453, no. 7198, pp. 1094–1097, Jun. 2008, doi: 10.1038/nature06943.

[5] M. Veerabagu et al., ‘The Arabidopsis B-type response regulator 18 homomerizes and positively regulates cytokinin responses’, Plant J. Cell Mol. Biol., vol. 72, no. 5, pp. 721–731, Dec. 2012, doi: 10.1111/j.1365-313X.2012.05101.x.

Robusten in občutljiv sintetični senzor za spremljanje transkripcijskega izhoda signalne mreže citokininov in planta

2020-05-18T18:16:20Z

Andrej Race:

''Povzeto po članku:'' [https://plantphysiol.org/content/161/3/1066 E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.]

Citokinini so razred fitohormonov, ki spodbujajo delitev celic v rastlinskih koreninah in poganjkih. Vključeni so predvsem v rasti in diferenciaciji celic, vplivajo pa tudi na apikalno prevlado, rast aksialinih brstov in staranje listov [1]. Citokinini sprožijo signalno kaskado večstopenjske fosforilacije (MSP). To pot sproži vezava citokinina na CHASE domeno hibridne histidin senzor kinaze. Posledično pride do avtofosforilacije receptorja na His ostanku in nadaljnji prenos fosfatne skupine na Asp ostanek v domeni oddajnika. Fosfat se nato prenese na fosfotransferni protein, ki se translocira v jedro in lahko nato fosforilira regulatorje odziva (ARR) tipa B. ARR so družina transkripcijskih faktorjev, ki sovpadajo v tip A, B ali C. Pripadniki razreda tipa B se vežejo na promotorje ciljnih genov preko njihove Myb-podobne DNA-vezavne domene in aktivirajo transkripcijo, medtem ko ARR-ji tipa A in tipa C zavirajo signalno aktivnost. Hkrati so ARR tipa A glavna tarča aktiviranih ARR tipa B, kar vzpostavi negativno povratno zanko na signalno pot. Opisano pot lahko tudi aktivirajo citokinin neodvisne kinaze 1 (CKI1) [2], [3].

==Analiza vpliva citokininov==
Največja težava, ki nastane pri raziskovanju vloge MSP, je da citokinini imajo kompleksno biosintezo, transport in razgradnjo, kar oteži določevanje distribucije aktivnih citokininov v rastlinah. Poleg tega, MSP lahko aktivirajo druge od citokininov neodvisne kinaze kot so CKI1. Zaradi tega je najboljši pristop vizualizacije transkripcijskega izražanja MSP s sintetičnim reporterjem, ki razkrije mesta delovanja med razvojem divjega tipa. ARR tipa B se vežejo na 9bp veliko sekvenco, ki ima ohranjeno 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' zaporedje. To ohranjeno zaporedje je omogočilo razvoj dvokomponentnega signalnega senzorja (TCS) z ponavljajočimi 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' vezavnimi mesti. Transgenske rastline, ki vsebujejo TCS promotor z zapisom za GFP (TCS::GFP), so omogočile ugotovitev novih, kot tudi boljše razumevanje že znanih vlog citokininov, ampak so se srečale z nekaterimi težavami. Izražanje s pomočjo TCS je šibko v nekaterih delih rastline kje imamo že zabeleženo vlogo citokininov in izražanje GFP se postopoma zniža z zvišanjem generacije, verjetno zaradi vtišanja ponavljajočih se sekvenc TCS. Zaradi tega so v tem članku razvili izboljšano različico TCSn::GFP, ki se izogiba tem težavam in omogoča močnejši signal. TCS so predvsem optimizirali s spremembo števila vezavnih mest, spremembo faze in spremembo baz med motivi [2].

==Razvoj TCSn==
===Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS===
Analizirali so različna zaporedja TCS vezana z minimalnim 35S promotorjem in zaporedjem za luciferazo, ki so jih prehodno vstavili v primarne mezofilske protoplaste Arabidopsis thaliane z agronifiltracijo. Osnovna biokocka je vsebovala 4 motiva 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' ločenimi z poljubno izbranimi sosednjimi nukleotidi. Biokocke so narejene tako da vsebujejo motive smernih in inverznih ponovitev v vseh možnih orientaciah. Torej, tandemska ponovitev, glava na glavo in rep na rep. Pri 4 ponovitvah niso opazili bistvene razlike v primerjavi z kontorlo, med tem ko se minimalno izražanje pojavilo komaj po 8ih ponovitah. TCS s 16 ponovitev je omogočila podoben signal kot pri luciferazi vezani na ARR6 promotor, ki je sestavljen na osnovi 5' regulativne regije enega izmed ARR tipa A genov. Največje izražanje reporterja so opazili pri 24 ponovitvah motiva, kar nakazuje na močen kooperativni efekt med transkripcijskimi faktorji. Nadaljnje zvišanje števila motivov je imelo inhibitorni vpliv. Tako je zaporedje z 24 motivov bilo izbrano in dobilo ime TCS [2], [4]. Kooperacija ARR-jev tipa B je tudi bila dokazana ''in planta'' [5].

===Določanje vpliva sosednjih baz===
Naslednje so raziskali kako sprememba baz motiva in sosednjih baz vpliva na izražanje reporterja. Razvili so različice TCS, TCS*, ki vsebuje mutacije v motivu in TCSfm, ki vsebuje mutacije v sosednjih bazah. Ugotovili so da so promotorji postali neobčutljivi na citokinine in da je verjetno ''in vitro'' določen motiv 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' nezadosten za prepoznavo z ARR tipa B ''in vivo''. Zaradi tega je potrebno še optimizirati sosednje baze, kako bi izboljšali TCS [2].

===Določanje razdalje med motivi===
Testirali so še različice TCS, ki ima 9bp parov razdalje, z različnimi razdaljami med motivi in preverili njen vpliv na izražanje. Različica z 7bp razdalje je pokazala znižanje v aktivnosti, dokler je različica z 11 bp pokazala močnejšo aktivnost. To se sklada z dejstvom da DNA rabi 11 bp da naredi obrat v heliksu v njeni B konformaciji in da faziranje vezavnih mest s tem številom bp na splošno omogoča največjo aktivnost transkripcijskih faktorjev [2].

===Optimizacija s pomočjo bioinformatske analize===
Kako bi ugotovili katera vezavna mesta se nahajajo v divjih tipih Arabidopsis thaliane in s tem ugotovili kako da zvišajo izražanje in se izognejo vtišanju TCS, analizirali so vezavna mesta za ARR tipa B. Analizirali so 3kbp sekvenco navzgor od prepisanega zaporedja kot tudi prepisano zaporedje ARR tipa A genov, ker se tam ponavadi nahaja cis-regulativno zaporedje in iskali zaporedje 5'-(A/G)GAT(C/T)-3'. Čeprav je to zaporedje bolj pogosto v analiziranih sekvencah, še vedno bi se najdlo vsakič na 108bp v naključni DNA. Zaradi tega so zvišali specifičnost tako da so iskali motive, ki so odaljeni vsaj 6 bp, ker je dolžina samega motiva 5bp in ne več kot 30bp, ker so iskali motive v gručah. Ugotovili so da se motivi nahajajo na 7 do 14bp en od drugega v povprečju in da se smerne in inverzne ponovitve pojavijo enako pogosto. Dodanih je bilo po 3 bp na vsak konec iskanih motivov (poglej podpoglavlje Določanje faze). Sekvence, ki jih spremlja podaljšek 5', 5'-A-3' in/ali 3' podaljšek, 5'-T-3' se pojavljajo pogosteje. Ugotovili so tudi da se sekvenca 5'-AA(A/G)GAT(C/T)TT-3' izredno bolj pogosto nahaja v tarčnih genov citokininov v primerjavi z kontrolnimi geni. Na osnovi teh informacij ustvarili so 12 motivov (Tabela 1). Ti sintetični motivi so bili naključno združeni, da so dobili sintetično zaporedje, ki vsebuje 24 vezavnih mest v vseh mogočih orientacijah (poglej podpoglavje Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS). S tem razvojem so omogočili da je izražanje reporterskega gena bolj enakomerno in da ne pride do vtišanja zaradi monotonosti [2].

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 1: Motivi uporabljeni v TCSn'''
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|zaporedje
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT

|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |2
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GAGAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |3
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |4
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |5
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTAT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |6
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |7
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |8
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |9
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |10
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |11
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GTTGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |12
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |ATGGGATCTTG
|}

==Specifičnost in občutljivost TCSn==
Kako bi preverili občutljivost in specifičnost TCSn, transficirali so protoplaste z TCSn konjugirano z luciferazo. Ugotovili so da se pojavi večji signal v primerjavi z TCS in da ne pride do nespecifičnega izražanja v prisotnosti nekaterih drugih fitohormonov. Kotransfekcija z ojačevalci MSP, kot so CKI1 in ARR tipa B je zvišala izražanje reporterja, medtem ko je kotransfekcija z ARR tipa A, torej inhibitorji MSP, znižala izražanje. Pri nekaterih ojačevalcih je prišlo do ojačanja signala v primerjavi z TSC, dokler je pri drugih ostalo isto. Specifičnost je tudi preverjena z transkripcijskimi faktorji, ki imajo podobno vezavno zaporedje kot ARR tipa B in ugotovljeno je da ne aktivirajo izražanje niti TCS niti TCSn. Do aktivacije pride tudi v monokaličnicah zaradi podobnosti ARR tipa B genov pri vseh rastlinah. Analizirali so še izražanje reporterja v rastlinah, ki so bile transficirane z konstruktom TCSn::GFP in ugotovili da pride do močnejšega signala v primerjavi z tistimi rastlinami, ki so transficirane z TCS::GFP ARR5::GFP. V sadikah teh rastlin so inducirali CKI1 in ARR10:SRDX, ARR tipa B konjugiran z represorjem fosforilacije, ki vtiša MSP. V tistih z induciranim CKI1 je zabeležena vseprisotna aktivnost reporterja, dokler je v tistih z ekspresijo ARR10:SRDX zabeleženo utišanje GFP-ja. S temi analizami so potrdili da TSCn specifično izraža aktivnost MSP. Poleg tega, po treh generacijah transgenih rastlin ni bilo opaziti zmanjšanja ravni GFP, kar kaže, da za razliko od TCS::GFP, TCSn::GFP ni podvržen vtišanju transgena [2].

==Vzorci izražanja TCSn::GFP==
Trasfekcija rastlin z TCSn::GFP je pokazala izražanje reporterja, ki se sklada z že znanimi vlogami citokininov. Poleg tega, za razliko od TCS::GFP, ekspresija TCSn::GFP je aktivna še v poznih stadijih ženske embriogeneze. V primerjavi z TCS::GFP, signal je bistveno slabši v suspenzorskih celicah in celic, ki nastanejo iz njih, dokler je signal močnejši pri provaskularnih in bodočih celicah meristema poganjka. Do tega pride, verjetno ker niti en promotor ni optimiziran da ga aktivirajo vsi ARR tipa B enako. TCS lahko odraža boljše pogoje vezave za skupino ARR tipa B, izraženih v suspenzorskih celicah, medtem ko se v vseh drugih tkivih zdi, da TCSn zagotavlja boljše pogoje. V drugih regijah je na splošno izražanje kvalitativno enako, ampak bolj močno kot v primerjavi z TCS::GFP [2].

==Zaključek==
Razvoj od TCS odvisne ekspresije reporterskih genov je omogočil izboljšanje do takrat znanih modelov in odkritje ne znanih funkcij citokininov. Ampak, pri njihovoj uporabi pride do težav. Zaradi tega je razvit TCSn, ki za razliko od TCS, ima večjo občutljivost na citokinine, bolj izbalansiran odgovor na različne ARR-je tipa B in ni podvržen vtišanju zaradi monotonosti sekvence. To bo tudi olajšalo ukrštanje TCSn::GFP linije z različnimi drugimi linijami in omogočilo raziskanje manj znanih vlog MSP [2].

==Viri==
[1] J. J. Kieber, ‘Tribute to Folke Skoog: Recent Advances in our Understanding of Cytokinin Biology’, J. Plant Growth Regul., vol. 21, no. 1, pp. 1–2, Mar. 2002, doi: 10.1007/s003440010059.

[2] E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.

[3] C. E. Hutchison and J. J. Kieber, ‘Cytokinin Signaling in Arabidopsis’, Plant Cell, vol. 14, no. suppl 1, pp. S47–S59, May 2002, doi: 10.1105/tpc.010444.

[4] B. Müller and J. Sheen, ‘Cytokinin and auxin interplay in root stem-cell specification during early embryogenesis’, Nature, vol. 453, no. 7198, pp. 1094–1097, Jun. 2008, doi: 10.1038/nature06943.

[5] M. Veerabagu et al., ‘The Arabidopsis B-type response regulator 18 homomerizes and positively regulates cytokinin responses’, Plant J. Cell Mol. Biol., vol. 72, no. 5, pp. 721–731, Dec. 2012, doi: 10.1111/j.1365-313X.2012.05101.x.

Robusten in občutljiv sintetični senzor za spremljanje transkripcijskega izhoda signalne mreže citokininov in planta

2020-05-18T16:41:46Z

Andrej Race:

''Povzeto po članku:'' [https://plantphysiol.org/content/161/3/1066 E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.]

Citokinini so razred fitohormonov, ki spodbujajo delitev celic v rastlinskih koreninah in poganjkih. Vključeni so predvsem v rasti in diferenciaciji celic, vplivajo pa tudi na apikalno prevlado, rast aksialinih brstov in staranje listov [1]. Citokinini sprožijo signalno kaskado večstopenjske fosforilacije (MSP). To pot sproži vezava citokinina na CHASE domeno hibridne histidin senzor kinaze. Posledično pride do avtofosforilacije receptorja na His ostanku in nadaljnji prenos fosfatne skupine na Asp ostanek v domeni oddajnika. Fosfat se nato prenese na fosfotransferni protein, ki se translocira v jedro in lahko nato fosforilira regulatorje odziva (ARR) tipa B. ARR so družina transkripcijskih faktorjev, ki sovpadajo v tip A, B ali C. Pripadniki razreda tipa B se vežejo na promotorje ciljnih genov preko njihove Myb-podobne DNA-vezavne domene in aktivirajo transkripcijo, medtem ko ARR-ji tipa A in tipa C zavirajo signalno aktivnost. Hkrati so ARR tipa A glavna tarča aktiviranih ARR tipa B, kar vzpostavi negativno povratno zanko na signalno pot. Opisano pot lahko tudi aktivirajo citokinin neodvisne kinaze 1 (CKI1) [2], [3].

==Analiza vpliva citokininov==
Največja težava, ki nastane pri raziskovanju vloge MSP, je da citokinini imajo kompleksno biosintezo, transport in razgradnjo, kar oteži določevanje distribucije aktivnih citokininov v rastlinah. Poleg tega, MSP lahko aktivirajo druge od citokininov neodvisne kinaze kot so CKI1. Zaradi tega je najboljši pristop vizualizacije transkripcijskega izražanja MSP s sintetičnim reporterjem, ki razkrije mesta delovanja med razvojem divjega tipa. ARR tipa B se vežejo na 9bp veliko sekvenco, ki ima ohranjeno 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' zaporedje. To ohranjeno zaporedje je omogočilo razvoj dvokomponentnega signalnega senzorja (TCS) z ponavljajočimi 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' vezavnimi mesti. Transgenske rastline, ki vsebujejo TCS promotor z zapisom za GFP (TCS::GFP), so omogočile ugotovitev novih, kot tudi boljše razumevanje že znanih vlog citokininov, ampak so se srečale z nekaterimi težavami. Izražanje s pomočjo TCS je šibko v nekaterih delih rastline kje imamo že zabeleženo vlogo citokininov in izražanje GFP se postopoma zniža z zvišanjem generacije, verjetno zaradi vtišanja ponavljajočih se sekvenc TCS. Zaradi tega so v tem članku razvili izboljšano različico TCSn::GFP, ki se izogiba tem težavam in omogoča močnejši signal. TCS so predvsem optimizirali s spremembo števila vezavnih mest, spremembo faze in spremembo baz med motivi [2].

==Razvoj TCSn==
===Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS===
Analizirali so različna zaporedja TCS vezana z minimalnim 35S promotorjem in zaporedjem za luciferazo, ki so jih prehodno vstavili v primarne mezofilske protoplaste Arabidopsis thaliane z agronifiltracijo. Osnovna biokocka je vsebovala 4 motiva 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' ločenimi z poljubno izbranimi sosednjimi nukleotidi. Biokocke so narejene tako da vsebujejo motive smernih in inverznih ponovitev v vseh možnih orientaciah. Torej, tandemska ponovitev, glava na glavo in rep na rep. Pri 4 ponovitvah niso opazili bistvene razlike v primerjavi z kontorlo, med tem ko se minimalno izražanje pojavilo komaj po 8ih ponovitah. TCS s 16 ponovitev je omogočila podoben signal kot pri luciferazi vezani na ARR6 promotor, ki je sestavljen na osnovi 5' regulativne regije enega izmed ARR tipa A genov. Največje izražanje reporterja so opazili pri 24 ponovitvah motiva, kar nakazuje na močen kooperativni efekt med transkripcijskimi faktorji. Nadaljnje zvišanje števila motivov je imelo inhibitorni vpliv. Tako je zaporedje z 24 motivov bilo izbrano in dobilo ime TCS [2], [4]. Kooperacija ARR-jev tipa B je tudi bila dokazana ''in planta'' [5].

===Določanje faze===
Naslednje so raziskali kako sprememba baz motiva in sosednjih baz vpliva na izražanje reporterja. Razvili so različice TCS, TCS*, ki vsebuje mutacije v motivu in TCSfm, ki vsebuje mutacije v sosednjih bazah. Ugotovili so da so promotorji postali neobčutljivi na citokinine in da je verjetno ''in vitro'' določen motiv 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' nezadosten za prepoznavo z ARR tipa B ''in vivo''. Zaradi tega je potrebno še optimizirati sosednje baze, kako bi izboljšali TCS [2].

===Določanje razdalje med motivi===
Testirali so še različice TCS, ki ima 9bp parov razdalje, z različnimi razdaljami med motivi in preverili njen vpliv na izražanje. Različica z 7bp razdalje je pokazala znižanje v aktivnosti, dokler je različica z 11 bp pokazala močnejšo aktivnost. To se sklada z dejstvom da DNA rabi 11 bp da naredi obrat v heliksu v njeni B konformaciji in da faziranje vezavnih mest s tem številom bp na splošno omogoča največjo aktivnost transkripcijskih faktorjev [2].

===Optimizacija s pomočjo bioinformatske analize===
Kako bi ugotovili katera vezavna mesta se nahajajo v divjih tipih Arabidopsis thaliane in s tem ugotovili kako da zvišajo izražanje in se izognejo vtišanju TCS, analizirali so vezavna mesta za ARR tipa B. Analizirali so 3kbp sekvenco navzgor od prepisanega zaporedja kot tudi prepisano zaporedje ARR tipa A genov, ker se tam ponavadi nahaja cis-regulativno zaporedje in iskali zaporedje 5'-(A/G)GAT(C/T)-3'. Čeprav je to zaporedje bolj pogosto v analiziranih sekvencah, še vedno bi se najdlo vsakič na 108bp v naključni DNA. Zaradi tega so zvišali specifičnost tako da so iskali motive, ki so odaljeni vsaj 6 bp, ker je dolžina samega motiva 5bp in ne več kot 30bp, ker so iskali motive v gručah. Ugotovili so da se motivi nahajajo na 7 do 14bp en od drugega v povprečju in da se smerne in inverzne ponovitve pojavijo enako pogosto. Dodanih je bilo po 3 bp na vsak konec iskanih motivov (poglej podpoglavlje Določanje faze). Sekvence, ki jih spremlja podaljšek 5', 5'-A-3' in/ali 3' podaljšek, 5'-T-3' se pojavljajo pogosteje. Ugotovili so tudi da se sekvenca 5'-AA(A/G)GAT(C/T)TT-3' izredno bolj pogosto nahaja v tarčnih genov citokininov v primerjavi z kontrolnimi geni. Na osnovi teh informacij ustvarili so 12 motivov (Tabela 1). Ti sintetični motivi so bili naključno združeni, da so dobili sintetično zaporedje, ki vsebuje 24 vezavnih mest v vseh mogočih orientacijah (poglej podpoglavje Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS). S tem razvojem so omogočili da je izražanje reporterskega gena bolj enakomerno in da ne pride do vtišanja zaradi monotonosti [2].

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 1: Motivi uporabljeni v TCSn'''
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|zaporedje
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT

|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |2
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GAGAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |3
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |4
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |5
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTAT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |6
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |7
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |8
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |9
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |10
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |11
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GTTGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |12
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |ATGGGATCTTG
|}

==Specifičnost in občutljivost TCSn==
Kako bi preverili občutljivost in specifičnost TCSn, transficirali so protoplaste z TCSn konjugirano z luciferazo. Ugotovili so da se pojavi večji signal v primerjavi z TCS in da ne pride do nespecifičnega izražanja v prisotnosti nekaterih drugih fitohormonov. Kotransfekcija z ojačevalci MSP, kot so CKI1 in ARR tipa B je zvišala izražanje reporterja, medtem ko je kotransfekcija z ARR tipa A, torej inhibitorji MSP, znižala izražanje. Pri nekaterih ojačevalcih je prišlo do ojačanja signala v primerjavi z TSC, dokler je pri drugih ostalo isto. Specifičnost je tudi preverjena z transkripcijskimi faktorji, ki imajo podobno vezavno zaporedje kot ARR tipa B in ugotovljeno je da ne aktivirajo izražanje niti TCS niti TCSn. Do aktivacije pride tudi v monokaličnicah zaradi podobnosti ARR tipa B genov pri vseh rastlinah. Analizirali so še izražanje reporterja v rastlinah, ki so bile transficirane z konstruktom TCSn::GFP in ugotovili da pride do močnejšega signala v primerjavi z tistimi rastlinami, ki so transficirane z TCS::GFP ARR5::GFP. V sadikah teh rastlin so inducirali CKI1 in ARR10:SRDX, ARR tipa B konjugiran z represorjem fosforilacije, ki vtiša MSP. V tistih z induciranim CKI1 je zabeležena vseprisotna aktivnost reporterja, dokler je v tistih z ekspresijo ARR10:SRDX zabeleženo utišanje GFP-ja. S temi analizami so potrdili da TSCn specifično izraža aktivnost MSP. Poleg tega, po treh generacijah transgenih rastlin ni bilo opaziti zmanjšanja ravni GFP, kar kaže, da za razliko od TCS::GFP, TCSn::GFP ni podvržen vtišanju transgena [2].

==Vzorci izražanja TCSn::GFP==
Trasfekcija rastlin z TCSn::GFP je pokazala izražanje reporterja, ki se sklada z že znanimi vlogami citokininov. Poleg tega, za razliko od TCS::GFP, ekspresija TCSn::GFP je aktivna še v poznih stadijih ženske embriogeneze. V primerjavi z TCS::GFP, signal je bistveno slabši v suspenzorskih celicah in celic, ki nastanejo iz njih, dokler je signal močnejši pri provaskularnih in bodočih celicah meristema poganjka. Do tega pride, verjetno ker niti en promotor ni optimiziran da ga aktivirajo vsi ARR tipa B enako. TCS lahko odraža boljše pogoje vezave za skupino ARR tipa B, izraženih v suspenzorskih celicah, medtem ko se v vseh drugih tkivih zdi, da TCSn zagotavlja boljše pogoje. V drugih regijah je na splošno izražanje kvalitativno enako, ampak bolj močno kot v primerjavi z TCS::GFP [2].

==Zaključek==
Razvoj od TCS odvisne ekspresije reporterskih genov je omogočil izboljšanje do takrat znanih modelov in odkritje ne znanih funkcij citokininov. Ampak, pri njihovoj uporabi pride do težav. Zaradi tega je razvit TCSn, ki za razliko od TCS, ima večjo občutljivost na citokinine, bolj izbalansiran odgovor na različne ARR-je tipa B in ni podvržen vtišanju zaradi monotonosti sekvence. To bo tudi olajšalo ukrštanje TCSn::GFP linije z različnimi drugimi linijami in omogočilo raziskanje manj znanih vlog MSP [2].

==Viri==
[1] J. J. Kieber, ‘Tribute to Folke Skoog: Recent Advances in our Understanding of Cytokinin Biology’, J. Plant Growth Regul., vol. 21, no. 1, pp. 1–2, Mar. 2002, doi: 10.1007/s003440010059.

[2] E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.

[3] C. E. Hutchison and J. J. Kieber, ‘Cytokinin Signaling in Arabidopsis’, Plant Cell, vol. 14, no. suppl 1, pp. S47–S59, May 2002, doi: 10.1105/tpc.010444.

[4] B. Müller and J. Sheen, ‘Cytokinin and auxin interplay in root stem-cell specification during early embryogenesis’, Nature, vol. 453, no. 7198, pp. 1094–1097, Jun. 2008, doi: 10.1038/nature06943.

[5] M. Veerabagu et al., ‘The Arabidopsis B-type response regulator 18 homomerizes and positively regulates cytokinin responses’, Plant J. Cell Mol. Biol., vol. 72, no. 5, pp. 721–731, Dec. 2012, doi: 10.1111/j.1365-313X.2012.05101.x.

Robusten in občutljiv sintetični senzor za spremljanje transkripcijskega izhoda signalne mreže citokininov in planta

2020-05-18T15:40:04Z

Andrej Race:

''Povzeto po članku:'' [https://plantphysiol.org/content/161/3/1066 E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.]

Citokinini so razred fitohormonov, ki spodbujajo delitev celic v rastlinskih koreninah in poganjkih. Vključeni so predvsem v rasti in diferenciaciji celic, vplivajo pa tudi na apikalno prevlado, rast aksialinih brstov in staranje listov [1]. Citokinini sprožijo signalno kaskado večstopenjske fosforilacije (MSP). To pot sproži vezava citokinina na CHASE domeno hibridne histidin senzor kinaze. Posledično pride do avtofosforilacije receptorja na His ostanku in nadaljnji prenos fosfatne skupine na Asp ostanek v domeni oddajnika. Fosfat se nato prenese na fosfotransferni protein, ki se translocira v jedro in lahko nato fosforilira regulatorje odziva (ARR) tipa B. ARR so družina transkripcijskih faktorjev, ki sovpadajo v tip A, B ali C. Pripadniki razreda tipa B se vežejo na promotorje ciljnih genov preko njihove Myb-podobne DNA-vezavne domene in aktivirajo transkripcijo, medtem ko ARR-ji tipa A in tipa C zavirajo signalno aktivnost. Hkrati so ARR tipa A glavna tarča aktiviranih ARR tipa B, kar vzpostavi negativno povratno zanko na signalno pot. Opisano pot lahko tudi aktivirajo citokinin neodvisne kinaze 1 (CKI1) [2], [3].

==Analiza vpliva citokininov==
Največja težava, ki nastane pri raziskovanju vloge MSP, je da citokinini imajo kompleksno biosintezo, transport in razgradnjo, kar oteži določevanje distribucije aktivnih citokininov v rastlinah. Poleg tega, MSP lahko aktivirajo druge od citokininov neodvisne kinaze kot so CKI1. Zaradi tega je najboljši pristop vizualizacije transkripcijskega izražanja MSP s sintetičnim reporterjem, ki razkrije mesta delovanja med razvojem divjega tipa. ARR tipa B se vežejo na 9bp veliko sekvenco, ki ima ohranjeno 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' zaporedje. To ohranjeno zaporedje je omogočilo razvoj dvokomponentnega signalnega senzorja (TCS) z ponavljajočimi 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' vezavnimi mesti. Transgenske rastline, ki vsebujejo TCS promotor z zapisom za GFP (TCS::GFP), so omogočile ugotovitev novih, kot tudi boljše razumevanje že znanih vlog citokininov, ampak so se srečale z nekaterimi težavami. Izražanje s pomočjo TCS je šibko v nekaterih delih rastline kje imamo že zabeleženo vlogo citokininov in izražanje GFP se postopoma zniža z zvišanjem generacije, verjetno zaradi vtišanja ponavljajočih se sekvenc TCS. Zaradi tega so v tem članku razvili izboljšano različico TCSn::GFP, ki se izogiba tem težavam in omogoča močnejši signal. TCS so predvsem optimizirali s spremembo števila vezavnih mest, spremembo faze in spremembo baz med motivi [2].

==Razvoj TCSn==
===Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS===
Analizirali so različna zaporedja TCS vezana z minimalnim 35S promotorjem in zaporedjem za luciferazo, ki so jih prehodno vstavili v primarne mezofilske protoplaste Arabidopsis thaliane z agronifiltracijo. Osnovna biokocka je vsebovala 4 motiva 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' ločenimi z poljubno izbranimi sosednjimi nukleotidi. Biokocke so narejene tako da vsebujejo motive smernih in inverznih ponovitev v vseh možnih orientaciah. Torej, tandemska ponovitev, glava na glavo in rep na rep. Pri 4 ponovitvah niso opazili bistvene razlike v primerjavi z kontorlo, med tem ko se minimalno izražanje pojavilo komaj po 8ih ponovitah. TCS s 16 ponovitev je omogočila podoben signal kot pri luciferazi vezani na ARR6 promotor, ki je sestavljen na osnovi 5' regulativne regije enega izmed ARR tipa A genov. Največje izražanje reporterja so opazili pri 24 ponovitvah motiva, kar nakazuje na močen kooperativni efekt med transkripcijskimi faktorji. Nadaljnje zvišanje števila motivov je imelo inhibitorni vpliv. Tako je zaporedje z 24 motivov bilo izbrano in dobilo ime TCS [2], [4]. Kooperacija ARR-jev tipa B je tudi bila dokazana ''in planta'' [5].

===Določanje faze===
Naslednje so raziskali kako sprememba baz motiva in sosednjih baz vpliva na izražanje reporterja. Razvili so različice TCS, TCS*, ki vsebuje mutacije v motivu in TCSfm, ki vsebuje mutacije v sosednjih bazah. Ugotovili so da so promotorji postali neobčutljivi na citokinine in da je verjetno ''in vitro'' določen motiv 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' nezadosten za prepoznavo z ARR tipa B ''in vivo''. Zaradi tega je potrebno še optimizirati sosednje baze, kako bi izboljšali TCS [2].

===Določanje razdalja med motivi===
Testirali so še različice TCS, ki ima 9bp parov razdalje, z različnimi razdaljami med motivi in preverili njen vpliv na izražanje. Različica z 7bp razdalje je pokazala znižanje v aktivnosti, dokler je različica z 11 bp pokazala močnejšo aktivnost. To se sklada z dejstvom da DNA rabi 11 bp da naredi obrat v heliksu v njeni B konformaciji in da faziranje vezavnih mest s tem številom bp na splošno omogoča največjo aktivnost transkripcijskih faktorjev [2].

===Optimizacija s pomočjo bioinformatske analize===
Kako bi ugotovili katera vezavna mesta se nahajajo v divjih tipih Arabidopsis thaliane in s tem ugotovili kako da zvišajo izražanje in se izognejo vtišanju TCS, analizirali so vezavna mesta za ARR tipa B. Analizirali so 3kbp sekvenco navzgor od prepisanega zaporedja kot tudi prepisano zaporedje ARR tipa A genov, ker se tam ponavadi nahaja cis-regulativno zaporedje in iskali zaporedje 5'-(A/G)GAT(C/T)-3'. Čeprav je to zaporedje bolj pogosto v analiziranih sekvencah, še vedno bi se najdlo vsakič na 108bp v naključni DNA. Zaradi tega so zvišali specifičnost tako da so iskali motive, ki so odaljeni vsaj 6 bp, ker je dolžina samega motiva 5bp in ne več kot 30bp, ker so iskali motive v gručah. Ugotovili so da se motivi nahajajo na 7 do 14bp en od drugega v povprečju in da se smerne in inverzne ponovitve pojavijo enako pogosto. Dodanih je bilo po 3 bp na vsak konec iskanih motivov (poglej podpoglavlje Določanje faze). Sekvence, ki jih spremlja podaljšek 5', 5'-A-3' in/ali 3' podaljšek, 5'-T-3' se pojavljajo pogosteje. Ugotovili so tudi da se sekvenca 5'-AA(A/G)GAT(C/T)TT-3' izredno bolj pogosto nahaja v tarčnih genov citokininov v primerjavi z kontrolnimi geni. Na osnovi teh informacij ustvarili so 12 motivov (Tabela 1). Ti sintetični motivi so bili naključno združeni, da so dobili sintetično zaporedje, ki vsebuje 24 vezavnih mest v vseh mogočih orientacijah (poglej podpoglavje Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS). S tem razvojem so omogočili da je izražanje reporterskega gena bolj enakomerno in da ne pride do vtišanja zaradi monotonosti [2].

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 1: Motivi uporabljeni v TCSn'''
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|zaporedje
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT

|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |2
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GAGAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |3
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |4
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |5
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTAT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |6
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |7
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |8
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |9
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |10
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |11
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GTTGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |12
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |ATGGGATCTTG
|}

==Specifičnost in občutljivost TCSn==
Kako bi preverili občutljivost in specifičnost TCSn, transficirali so protoplaste z TCSn konjugirano z luciferazo. Ugotovili so da se pojavi večji signal v primerjavi z TCS in da ne pride do nespecifičnega izražanja v prisotnosti nekaterih drugih fitohormonov. Kotransfekcija z ojačevalci MSP, kot so CKI1 in ARR tipa B je zvišala izražanje reporterja, medtem ko je kotransfekcija z ARR tipa A, torej inhibitorji MSP, znižala izražanje. Pri nekaterih ojačevalcih je prišlo do ojačanja signala v primerjavi z TSC, dokler je pri drugih ostalo isto. Specifičnost je tudi preverjena z transkripcijskimi faktorji, ki imajo podobno vezavno zaporedje kot ARR tipa B in ugotovljeno je da ne aktivirajo izražanje niti TCS niti TCSn. Do aktivacije pride tudi v monokaličnicah zaradi podobnosti ARR tipa B genov pri vseh rastlinah. Analizirali so še izražanje reporterja v rastlinah, ki so bile transficirane z konstruktom TCSn::GFP in ugotovili da pride do močnejšega signala v primerjavi z tistimi rastlinami, ki so transficirane z TCS::GFP ARR5::GFP. V sadikah teh rastlin so inducirali CKI1 in ARR10:SRDX, ARR tipa B konjugiran z represorjem fosforilacije, ki vtiša MSP. V tistih z induciranim CKI1 je zabeležena vseprisotna aktivnost reporterja, dokler je v tistih z ekspresijo ARR10:SRDX zabeleženo utišanje GFP-ja. S temi analizami so potrdili da TSCn specifično izraža aktivnost MSP. Poleg tega, po treh generacijah transgenih rastlin ni bilo opaziti zmanjšanja ravni GFP, kar kaže, da za razliko od TCS::GFP, TCSn::GFP ni podvržen vtišanju transgena [2].

==Vzorci izražanja TCSn::GFP==
Trasfekcija rastlin z TCSn::GFP je pokazala izražanje reporterja, ki se sklada z že znanimi vlogami citokininov. Poleg tega, za razliko od TCS::GFP, ekspresija TCSn::GFP je aktivna še v poznih stadijih ženske embriogeneze. V primerjavi z TCS::GFP, signal je bistveno slabši v suspenzorskih celicah in celic, ki nastanejo iz njih, dokler je signal močnejši pri provaskularnih in bodočih celicah meristema poganjka. Do tega pride, verjetno ker niti en promotor ni optimiziran da ga aktivirajo vsi ARR tipa B enako. TCS lahko odraža boljše pogoje vezave za skupino ARR tipa B, izraženih v suspenzorskih celicah, medtem ko se v vseh drugih tkivih zdi, da TCSn zagotavlja boljše pogoje. V drugih regijah je na splošno izražanje kvalitativno enako, ampak bolj močno kot v primerjavi z TCS::GFP [2].

==Zaključek==
Razvoj od TCS odvisne ekspresije reporterskih genov je omogočil izboljšanje do takrat znanih modelov in odkritje ne znanih funkcij citokininov. Ampak, pri njihovoj uporabi pride do težav. Zaradi tega je razvit TCSn, ki za razliko od TCS, ima večjo občutljivost na citokinine, bolj izbalansiran odgovor na različne ARR-je tipa B in ni podvržen vtišanju zaradi monotonosti sekvence. To bo tudi olajšalo ukrštanje TCSn::GFP linije z različnimi drugimi linijami in omogočilo raziskanje manj znanih vlog MSP [2].

==Viri==
[1] J. J. Kieber, ‘Tribute to Folke Skoog: Recent Advances in our Understanding of Cytokinin Biology’, J. Plant Growth Regul., vol. 21, no. 1, pp. 1–2, Mar. 2002, doi: 10.1007/s003440010059.

[2] E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.

[3] C. E. Hutchison and J. J. Kieber, ‘Cytokinin Signaling in Arabidopsis’, Plant Cell, vol. 14, no. suppl 1, pp. S47–S59, May 2002, doi: 10.1105/tpc.010444.

[4] B. Müller and J. Sheen, ‘Cytokinin and auxin interplay in root stem-cell specification during early embryogenesis’, Nature, vol. 453, no. 7198, pp. 1094–1097, Jun. 2008, doi: 10.1038/nature06943.

[5] M. Veerabagu et al., ‘The Arabidopsis B-type response regulator 18 homomerizes and positively regulates cytokinin responses’, Plant J. Cell Mol. Biol., vol. 72, no. 5, pp. 721–731, Dec. 2012, doi: 10.1111/j.1365-313X.2012.05101.x.

Robusten in občutljiv sintetični senzor za spremljanje transkripcijskega izhoda signalne mreže citokininov in planta

2020-05-17T22:49:40Z

Andrej Race:

''Povzeto po članku:'' [https://plantphysiol.org/content/161/3/1066 E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.]

Citokinini so razred fitohormonov, ki spodbujajo delitev celic v rastlinskih koreninah in poganjkih. Vključeni so predvsem v rasti in diferenciaciji celic, vplivajo pa tudi na apikalno prevlado, rast aksialinih brstov in staranje listov [1]. Citokinini sprožijo signalno kaskado večstopenjske fosforilacije (MSP). To pot sproži vezava citokinina na CHASE domeno hibridne histidin senzor kinaze. Posledično pride do avtofosforilacije receptorja na His ostanku in nadaljnji prenos fosfatne skupine na Asp ostanek v domeni oddajnika. Fosfat se nato prenese na fosfotransferni protein, ki se translocira v jedro in lahko nato fosforilira regulatorje odziva (ARR) tipa B. ARR so družina transkripcijskih faktorjev, ki sovpadajo v tip A, B ali C. Pripadniki razreda tipa B se vežejo na promotorje ciljnih genov preko njihove Myb-podobne DNA-vezavne domene in aktivirajo transkripcijo, medtem ko ARR-ji tipa A in tipa C zavirajo signalno aktivnost. Hkrati so ARR tipa A glavna tarča aktiviranih ARR tipa B, kar vzpostavi negativno povratno zanko na signalno pot. Opisano pot lahko tudi aktivirajo citokinin neodvisne kinaze 1 (CKI1) [2], [3].

==Analiza vpliva citokininov==
Največja težava, ki nastane pri raziskovanju vloge MSP, je da citokinini imajo kompleksno biosintezo, transport in razgradnjo, kar oteži določevanje distribucije aktivnih citokininov v rastlinah. Poleg tega, MSP lahko aktivirajo druge od citokininov neodvisne kinaze kot so CKI1. Zaradi tega je najboljši pristop vizualizacije transkripcijskega izražanja MSP s sintetičnim reporterjem, ki razkrije mesta delovanja med razvojem divjega tipa. ARR tipa B se vežejo na 9bp veliko sekvenco, ki ima ohranjeno 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' zaporedje. To ohranjeno zaporedje je omogočilo razvoj dvokomponentnega signalnega senzorja (TCS) z ponavljajočimi 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' vezavnimi mesti. Transgenske rastline, ki vsebujejo TCS promotor z zapisom za GFP (TCS::GFP), so omogočile ugotovitev novih, kot tudi boljše razumevanje že znanih vlog citokininov, ampak so se srečale z nekaterimi težavami. Izražanje s pomočjo TCS je šibko v nekaterih delih rastline kje imamo že imamo zabeleženo vlogo citokininov in izražanje GFP se postopoma zniža z zvišanjem generacije, verjetno zaradi vtišanja ponavljajočih se sekvenc TCS. Zaradi tega so v tem članku razvili izboljšano različico TCSn::GFP, ki se izogiba tem težavam in omogoča močnejši signal. TCS so predvsem optimizirali s spremembo števila vezavnih mest, spremembo faze in spremembo baz med motivi [2].

==Razvoj TCSn==
===Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS===
Analizirali so različna zaporedja TCS vezana z minimalnim 35S promotorjem in zaporedjem za luciferazo, ki so jih prehodno vstavili v primarne mezofilske protoplaste Arabidopsis thaliane z agronifiltracijo. Osnovna biokocka je vsebovala 4 motiva 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' ločenimi z poljubno izbranimi sosednjimi nukleotidi. Biokocke so narejene tako da vsebujejo motive smernih in inverznih ponovitev v vseh možnih orientaciah. Torej, tandemska ponovitev, glava na glavo in rep na rep. Pri 4 ponovitvah niso opazili bistvene razlike v primerjavi z kontorlo, med tem ko se minimalno izražanje pojavilo komaj po 8ih ponovitah. TCS s 16 ponovitev je omogočila podoben signal kot pri luciferazi vezani na ARR6 promotor, ki je sestavljen na osnovi 5' regulativne regije enega izmed ARR tipa A genov. Največje izražanje reporterja so opazili pri 24 ponovitvah motiva, kar nakazuje na močen kooperativni efekt med transkripcijskimi faktorji. Nadaljnje zvišanje števila motivov je imelo inhibitorni vpliv. Tako je zaporedje z 24 motivov bilo izbrano in dobilo ime TCS [2], [4]. Kooperacija ARR-jev tipa B je tudi bila dokazana ''in planta'' [5].

===Določanje faze===
Naslednje so raziskali kako sprememba baz motiva in sosednjih baz vpliva na izražanje reporterja. Razvili so različice TCS, TCS*, ki vsebuje mutacije v motivu in TCSfm, ki vsebuje mutacije v sosednjih bazah. Ugotovili so da so promotorji postali neobčutljivi na citokinine in da je verjetno ''in vitro'' določen motiv 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' nezadosten za prepoznavo z ARR tipa B ''in vivo''. Zaradi tega je potrebno še optimizirati sosednje baze, kako bi izboljšali TCS [2].

===Določanje razdalja med motivi===
Testirali so še različice TCS, ki ima 9bp parov razdalje, z različnimi razdaljami med motivi in preverili njen vpliv na izražanje. Različica z 7bp razdalje je pokazala znižanje v aktivnosti, dokler je različica z 11 bp pokazala močnejšo aktivnost. To se sklada z dejstvom da DNA rabi 11 bp da naredi obrat v heliksu v njeni B konformaciji in da faziranje vezavnih mest s tem številom bp na splošno omogoča največjo aktivnost transkripcijskih faktorjev [2].

===Optimizacija s pomočjo bioinformatske analize===
Kako bi ugotovili katera vezavna mesta se nahajajo v divjih tipih Arabidopsis thaliane in s tem ugotovili kako da zvišajo izražanje in se izognejo vtišanju TCS, analizirali so vezavna mesta za ARR tipa B. Analizirali so 3kbp sekvenco navzgor od prepisanega zaporedja kot tudi prepisano zaporedje ARR tipa A genov, ker se tam ponavadi nahaja cis-regulativno zaporedje in iskali zaporedje 5'-(A/G)GAT(C/T)-3'. Čeprav je to zaporedje bolj pogosto v analiziranih sekvencah, še vedno bi se najdlo vsakič na 108bp v naključni DNA. Zaradi tega so zvišali specifičnost tako da so iskali motive, ki so odaljeni vsaj 6 bp, ker je dolžina samega motiva 5bp in ne več kot 30bp, ker so iskali motive v gručah. Ugotovili so da se motivi nahajajo na 7 do 14bp en od drugega v povprečju in da se smerne in inverzne ponovitve pojavijo enako pogosto. Dodanih je bilo po 3 bp na vsak konec iskanih motivov (poglej podpoglavlje Določanje faze). Sekvence, ki jih spremlja podaljšek 5', 5'-A-3' in/ali 3' podaljšek, 5'-T-3' se pojavljajo pogosteje. Ugotovili so tudi da se sekvenca 5'-AA(A/G)GAT(C/T)TT-3' izredno bolj pogosto nahaja v tarčnih genov citokininov v primerjavi z kontrolnimi geni. Na osnovi teh informacij ustvarili so 12 motivov (Tabela 1). Ti sintetični motivi so bili naključno združeni, da so dobili sintetično zaporedje, ki vsebuje 24 vezavnih mest v vseh mogočih orientacijah (poglej podpoglavje Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS). S tem razvojem so omogočili da je izražanje reporterskega gena bolj enakomerno in da ne pride do vtišanja zaradi monotonosti [2].

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 1: Motivi uporabljeni v TCSn'''
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|zaporedje
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT

|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |2
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GAGAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |3
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |4
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |5
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTAT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |6
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |7
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |8
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |9
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |10
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |11
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GTTGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |12
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |ATGGGATCTTG
|}

==Specifičnost in občutljivost TCSn==
Kako bi preverili občutljivost in specifičnost TCSn, transficirali so protoplaste z TCSn konjugirano z luciferazo. Ugotovili so da se pojavi večji signal v primerjavi z TCS in da ne pride do nespecifičnega izražanja v prisotnosti nekaterih drugih fitohormonov. Kotransfekcija z ojačevalci MSP, kot so CKI1 in ARR tipa B je zvišala izražanje reporterja, medtem ko je kotransfekcija z ARR tipa A, torej inhibitorji MSP, znižala izražanje. Pri nekaterih ojačevalcih je prišlo do ojačanja signala v primerjavi z TSC, dokler je pri drugih ostalo isto. Specifičnost je tudi preverjena z transkripcijskimi faktorji, ki imajo podobno vezavno zaporedje kot ARR tipa B in ugotovljeno je da ne aktivirajo izražanje niti TCS niti TCSn. Do aktivacije pride tudi v monokaličnicah zaradi podobnosti ARR tipa B genov pri vseh rastlinah. Analizirali so še izražanje reporterja v rastlinah, ki so bile transficirane z konstruktom TCSn::GFP in ugotovili da pride do močnejšega signala v primerjavi z tistimi rastlinami, ki so transficirane z TCS::GFP ARR5::GFP. V sadikah teh rastlin so inducirali CKI1 in ARR10:SRDX, ARR tipa B konjugiran z represorjem fosforilacije, ki vtiša MSP. V tistih z induciranim CKI1 je zabeležena vseprisotna aktivnost reporterja, dokler je v tistih z ekspresijo ARR10:SRDX zabeleženo utišanje GFP-ja. S temi analizami so potrdili da TSCn specifično izraža aktivnost MSP. Poleg tega, po treh generacijah transgenih rastlin ni bilo opaziti zmanjšanja ravni GFP, kar kaže, da za razliko od TCS::GFP, TCSn::GFP ni podvržen vtišanju transgena [2].

==Vzorci izražanja TCSn::GFP==
Trasfekcija rastlin z TCSn::GFP je pokazala izražanje reporterja, ki se sklada z že znanimi vlogami citokininov. Poleg tega, za razliko od TCS::GFP, ekspresija TCSn::GFP je aktivna še v poznih stadijih ženske embriogeneze. V primerjavi z TCS::GFP, signal je bistveno slabši v suspenzorskih celicah in celic, ki nastanejo iz njih, dokler je signal močnejši pri provaskularnih in bodočih celicah meristema poganjka. Do tega pride, verjetno ker niti en promotor ni optimiziran da ga aktivirajo vsi ARR tipa B enako. TCS lahko odraža boljše pogoje vezave za skupino ARR tipa B, izraženih v suspenzorskih celicah, medtem ko se v vseh drugih tkivih zdi, da TCSn zagotavlja boljše pogoje. V drugih regijah je na splošno izražanje kvalitativno enako, ampak bolj močno kot v primerjavi z TCS::GFP [2].

==Zaključek==
Razvoj od TCS odvisne ekspresije reporterskih genov je omogočil izboljšanje do takrat znanih modelov in odkritje ne znanih funkcij citokininov. Ampak, pri njihovoj uporabi pride do težav. Zaradi tega je razvit TCSn, ki za razliko od TCS, ima večjo občutljivost na citokinine, bolj izbalansiran odgovor na različne ARR-je tipa B in ni podvržen vtišanju zaradi monotonosti sekvence. To bo tudi olajšalo ukrštanje TCSn::GFP linije z različnimi drugimi linijami in omogočilo raziskanje manj znanih vlog MSP [2].

==Viri==
[1] J. J. Kieber, ‘Tribute to Folke Skoog: Recent Advances in our Understanding of Cytokinin Biology’, J. Plant Growth Regul., vol. 21, no. 1, pp. 1–2, Mar. 2002, doi: 10.1007/s003440010059.

[2] E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.

[3] C. E. Hutchison and J. J. Kieber, ‘Cytokinin Signaling in Arabidopsis’, Plant Cell, vol. 14, no. suppl 1, pp. S47–S59, May 2002, doi: 10.1105/tpc.010444.

[4] B. Müller and J. Sheen, ‘Cytokinin and auxin interplay in root stem-cell specification during early embryogenesis’, Nature, vol. 453, no. 7198, pp. 1094–1097, Jun. 2008, doi: 10.1038/nature06943.

[5] M. Veerabagu et al., ‘The Arabidopsis B-type response regulator 18 homomerizes and positively regulates cytokinin responses’, Plant J. Cell Mol. Biol., vol. 72, no. 5, pp. 721–731, Dec. 2012, doi: 10.1111/j.1365-313X.2012.05101.x.

Robusten in občutljiv sintetični senzor za spremljanje transkripcijskega izhoda signalne mreže citokininov in planta

2020-05-17T22:49:19Z

Andrej Race:

''Povzeto po članku:'' [https://plantphysiol.org/content/161/3/1066 E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.]

Citokinini so razred fitohormonov, ki spodbujajo delitev celic v rastlinskih koreninah in poganjkih. Vključeni so predvsem v rasti in diferenciaciji celic, vplivajo pa tudi na apikalno prevlado, rast aksialinih brstov in staranje listov [1]. Citokinini sprožijo signalno kaskado večstopenjske fosforilacije (MSP). To pot sproži vezava citokinina na CHASE domeno hibridne histidin senzor kinaze. Posledično pride do avtofosforilacije receptorja na His ostanku in nadaljnji prenos fosfatne skupine na Asp ostanek v domeni oddajnika. Fosfat se nato prenese na fosfotransferni protein, ki se translocira v jedro in lahko nato fosforilira regulatorje odziva (ARR) tipa B. ARR so družina transkripcijskih faktorjev, ki sovpadajo v tip A, B ali C. Pripadniki razreda tipa B se vežejo na promotorje ciljnih genov preko njihove Myb-podobne DNA-vezavne domene in aktivirajo transkripcijo, medtem ko ARR-ji tipa A in tipa C zavirajo signalno aktivnost. Hkrati so ARR tipa A glavna tarča aktiviranih ARR tipa B, kar vzpostavi negativno povratno zanko na signalno pot. Opisano pot lahko tudi aktivirajo citokinin neodvisne kinaze 1 (CKI1) [2], [3].

==Analiza vpliva citokininov==
Največja težava, ki nastane pri raziskovanju vloge MSP, je da citokinini imajo kompleksno biosintezo, transport in razgradnjo, kar oteži določevanje distribucije aktivnih citokininov v rastlinah. Poleg tega, MSP lahko aktivirajo druge od citokininov neodvisne kinaze kot so CKI1. Zaradi tega je najboljši pristop vizualizacije transkripcijskega izražanja MSP s sintetičnim reporterjem, ki razkrije mesta delovanja med razvojem divjega tipa. ARR tipa B se vežejo na 9bp veliko sekvenco, ki ima ohranjeno 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' zaporedje. To ohranjeno zaporedje je omogočilo razvoj dvokomponentnega signalnega senzorja (TCS) z ponavljajočimi 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' vezavnimi mesti. Transgenske rastline, ki vsebujejo TCS promotor z zapisom za GFP (TCS::GFP), so omogočile ugotovitev novih, kot tudi boljše razumevanje že znanih vlog citokininov, ampak so se srečale z nekaterimi težavami. Izražanje s pomočjo TCS je šibko v nekaterih delih rastline kje imamo že imamo zabeleženo vlogo citokininov in izražanje GFP se postopoma zniža z zvišanjem generacije, verjetno zaradi vtišanja ponavljajočih se sekvenc TCS. Zaradi tega so v tem članku razvili izboljšano različico TCSn::GFP, ki se izogiba tem težavam in omogoča močnejši signal. TCS so predvsem optimizirali s spremembo števila vezavnih mest, spremembo faze in spremembo baz med motivi [2].

==Razvoj TCSn==
===Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS===
Analizirali so različna zaporedja TCS vezana z minimalnim 35S promotorjem in zaporedjem za luciferazo, ki so jih prehodno vstavili v primarne mezofilske protoplaste Arabidopsis thaliane z agronifiltracijo. Osnovna biokocka je vsebovala 4 motiva 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' ločenimi z poljubno izbranimi sosednjimi nukleotidi. Biokocke so narejene tako da vsebujejo motive smernih in inverznih ponovitev v vseh možnih orientaciah. Torej, tandemska ponovitev, glava na glavo in rep na rep. Pri 4 ponovitvah niso opazili bistvene razlike v primerjavi z kontorlo, med tem ko se minimalno izražanje pojavilo komaj po 8ih ponovitah. TCS s 16 ponovitev je omogočila podoben signal kot pri luciferazi vezani na ARR6 promotor, ki je sestavljen na osnovi 5' regulativne regije enega izmed ARR tipa A genov. Največje izražanje reporterja so opazili pri 24 ponovitvah motiva, kar nakazuje na močen kooperativni efekt med transkripcijskimi faktorji. Nadaljnje zvišanje števila motivov je imelo inhibitorni vpliv. Tako je zaporedje z 24 motivov bilo izbrano in dobilo ime TCS [2], [4]. Kooperacija ARR-jev tipa B je tudi bila dokazana ''in planta'' [5].

===Določanje faze===
Naslednje so raziskali kako sprememba baz motiva in sosednjih baz vpliva na izražanje reporterja. Razvili so različice TCS, TCS*, ki vsebuje mutacije v motivu in TCSfm, ki vsebuje mutacije v sosednjih bazah. Ugotovili so da so promotorji postali neobčutljivi na citokinine in da je verjetno ''in vitro'' določen motiv 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' nezadosten za prepoznavo z ARR tipa B ''in vivo''. Zaradi tega je potrebno še optimizirati sosednje baze, kako bi izboljšali TCS [2].

===Določanje razdalja med motivi===
Testirali so še različice TCS, ki ima 9bp parov razdalje, z različnimi razdaljami med motivi in preverili njen vpliv na izražanje. Različica z 7bp razdalje je pokazala znižanje v aktivnosti, dokler je različica z 11 bp pokazala močnejšo aktivnost. To se sklada z dejstvom da DNA rabi 11 bp da naredi obrat v heliksu v njeni B konformaciji in da faziranje vezavnih mest s tem številom bp na splošno omogoča največjo aktivnost transkripcijskih faktorjev [2].

===Optimizacija s pomočjo bioinformatske analize===
Kako bi ugotovili katera vezavna mesta se nahajajo v divjih tipih Arabidopsis thaliane in s tem ugotovili kako da zvišajo izražanje in se izognejo vtišanju TCS, analizirali so vezavna mesta za ARR tipa B. Analizirali so 3kbp sekvenco navzgor od prepisanega zaporedja kot tudi prepisano zaporedje ARR tipa A genov, ker se tam ponavadi nahaja cis-regulativno zaporedje in iskali zaporedje 5'-(A/G)GAT(C/T)-3'. Čeprav je to zaporedje bolj pogosto v analiziranih sekvencah, še vedno bi se najdlo vsakič na 108bp v naključni DNA. Zaradi tega so zvišali specifičnost tako da so iskali motive, ki so odaljeni vsaj 6 bp, ker je dolžina samega motiva 5bp in ne več kot 30bp, ker so iskali motive v gručah. Ugotovili so da se motivi nahajajo na 7 do 14bp en od drugega v povprečju in da se smerne in inverzne ponovitve pojavijo enako pogosto. Dodanih je bilo po 3 bp na vsak konec iskanih motivov (poglej podpoglavlje Določanje faze). Sekvence, ki jih spremlja podaljšek 5', 5'-A-3' in/ali 3' podaljšek, 5'-T-3' se pojavljajo pogosteje. Ugotovili so tudi da se sekvenca 5'-AA(A/G)GAT(C/T)TT-3' izredno bolj pogosto nahaja v tarčnih genov citokininov v primerjavi z kontrolnimi geni. Na osnovi teh informacij ustvarili so 12 motivov (Tabela 1). Ti sintetični motivi so bili naključno združeni, da so dobili sintetično zaporedje, ki vsebuje 24 vezavnih mest v vseh mogočih orientacijah (poglej podpoglavje Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS). S tem razvojem so omogočili da je izražanje reporterskega gena bolj enakomerno in da ne pride do vtišanja zaradi monotonosti [2].

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 1: Motivi uporabljeni v TCSn'''
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|zaporedje
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT

|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |2
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GAGAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |3
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |4
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |5
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTAT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |6
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |7
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |8
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |9
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |10
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |11
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GTTGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |12
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |ATGGGATCTTG
|}

==Specifičnost in občutljivost TCSn==
Kako bi preverili občutljivost in specifičnost TCSn, transficirali so protoplaste z TCSn konjugirano z luciferazo. Ugotovili so da se pojavi večji signal v primerjavi z TCS in da ne pride do nespecifičnega izražanja v prisotnosti nekaterih drugih fitohormonov. Kotransfekcija z ojačevalci MSP, kot so CKI1 in ARR tipa B je zvišala izražanje reporterja, medtem ko je kotransfekcija z ARR tipa A, torej inhibitorji MSP, znižala izražanje. Pri nekaterih ojačevalcih je prišlo do ojačanja signala v primerjavi z TSC, dokler je pri drugih ostalo isto. Specifičnost je tudi preverjena z transkripcijskimi faktorji, ki imajo podobno vezavno zaporedje kot ARR tipa B in ugotovljeno je da ne aktivirajo izražanje niti TCS niti TCSn. Do aktivacije pride tudi v monokaličnicah zaradi podobnosti ARR tipa B genov pri vseh rastlinah. Analizirali so še izražanje reporterja v rastlinah, ki so bile transficirane z konstruktom TCSn::GFP in ugotovili da pride do močnejšega signala v primerjavi z tistimi rastlinami, ki so transficirane z TCS::GFP ARR5::GFP. V sadikah teh rastlin so inducirali CKI1 in ARR10:SRDX, ARR tipa B protein konjugiran z represorjem fosforilacije, ki vtiša MSP. V tistih z induciranim CKI1 je zabeležena vseprisotna aktivnost reporterja, dokler je v tistih z ekspresijo ARR10:SRDX zabeleženo utišanje GFP-ja. S temi analizami so potrdili da TSCn specifično izraža aktivnost MSP. Poleg tega, po treh generacijah transgenih rastlin ni bilo opaziti zmanjšanja ravni GFP, kar kaže, da za razliko od TCS::GFP, TCSn::GFP ni podvržen vtišanju transgena [2].

==Vzorci izražanja TCSn::GFP==
Trasfekcija rastlin z TCSn::GFP je pokazala izražanje reporterja, ki se sklada z že znanimi vlogami citokininov. Poleg tega, za razliko od TCS::GFP, ekspresija TCSn::GFP je aktivna še v poznih stadijih ženske embriogeneze. V primerjavi z TCS::GFP, signal je bistveno slabši v suspenzorskih celicah in celic, ki nastanejo iz njih, dokler je signal močnejši pri provaskularnih in bodočih celicah meristema poganjka. Do tega pride, verjetno ker niti en promotor ni optimiziran da ga aktivirajo vsi ARR tipa B enako. TCS lahko odraža boljše pogoje vezave za skupino ARR tipa B, izraženih v suspenzorskih celicah, medtem ko se v vseh drugih tkivih zdi, da TCSn zagotavlja boljše pogoje. V drugih regijah je na splošno izražanje kvalitativno enako, ampak bolj močno kot v primerjavi z TCS::GFP [2].

==Zaključek==
Razvoj od TCS odvisne ekspresije reporterskih genov je omogočil izboljšanje do takrat znanih modelov in odkritje ne znanih funkcij citokininov. Ampak, pri njihovoj uporabi pride do težav. Zaradi tega je razvit TCSn, ki za razliko od TCS, ima večjo občutljivost na citokinine, bolj izbalansiran odgovor na različne ARR-je tipa B in ni podvržen vtišanju zaradi monotonosti sekvence. To bo tudi olajšalo ukrštanje TCSn::GFP linije z različnimi drugimi linijami in omogočilo raziskanje manj znanih vlog MSP [2].

==Viri==
[1] J. J. Kieber, ‘Tribute to Folke Skoog: Recent Advances in our Understanding of Cytokinin Biology’, J. Plant Growth Regul., vol. 21, no. 1, pp. 1–2, Mar. 2002, doi: 10.1007/s003440010059.

[2] E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.

[3] C. E. Hutchison and J. J. Kieber, ‘Cytokinin Signaling in Arabidopsis’, Plant Cell, vol. 14, no. suppl 1, pp. S47–S59, May 2002, doi: 10.1105/tpc.010444.

[4] B. Müller and J. Sheen, ‘Cytokinin and auxin interplay in root stem-cell specification during early embryogenesis’, Nature, vol. 453, no. 7198, pp. 1094–1097, Jun. 2008, doi: 10.1038/nature06943.

[5] M. Veerabagu et al., ‘The Arabidopsis B-type response regulator 18 homomerizes and positively regulates cytokinin responses’, Plant J. Cell Mol. Biol., vol. 72, no. 5, pp. 721–731, Dec. 2012, doi: 10.1111/j.1365-313X.2012.05101.x.

Robusten in občutljiv sintetični senzor za spremljanje transkripcijskega izhoda signalne mreže citokininov in planta

2020-05-17T22:46:28Z

Andrej Race:

''Povzeto po članku:'' [https://plantphysiol.org/content/161/3/1066 E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.]

Citokinini so razred fitohormonov, ki spodbujajo delitev celic v rastlinskih koreninah in poganjkih. Vključeni so predvsem v rasti in diferenciaciji celic, vplivajo pa tudi na apikalno prevlado, rast aksialinih brstov in staranje listov [1]. Citokinini sprožijo signalno kaskado večstopenjske fosforilacije (MSP). To pot sproži vezava citokinina na CHASE domeno hibridne histidin senzor kinaze. Posledično pride do avtofosforilacije receptorja na His ostanku in nadaljnji prenos fosfatne skupine na Asp ostanek v domeni oddajnika. Fosfat se nato prenese na fosfotransferni protein, ki se translocira v jedro in lahko nato fosforilira regulatorje odziva (ARR) tipa B. ARR so družina transkripcijskih faktorjev, ki sovpadajo v tip A, B ali C. Pripadniki razreda tipa B se vežejo na promotorje ciljnih genov preko njihove Myb-podobne DNA-vezavne domene in aktivirajo transkripcijo, medtem ko ARR-ji tipa A in tipa C zavirajo signalno aktivnost. Hkrati so ARR tipa A glavna tarča aktiviranih ARR tipa B, kar vzpostavi negativno povratno zanko na signalno pot. Opisano pot lahko tudi aktivirajo citokinin neodvisne kinaze 1 (CKI1) [2], [3].

==Analiza vpliva citokininov==
Največja težava, ki nastane pri raziskovanju vloge MSP, je da citokinini imajo kompleksno biosintezo, transport in razgradnjo, kar oteži določevanje distribucije aktivnih citokininov v rastlinah. Poleg tega, MSP lahko aktivirajo druge od citokininov neodvisne kinaze kot so CKI1. Zaradi tega je najboljši pristop vizualizacije transkripcijskega izražanja MSP s sintetičnim reporterjem, ki razkrije mesta delovanja med razvojem divjega tipa. ARR tipa B se vežejo na 9bp veliko sekvenco, ki ima ohranjeno 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' zaporedje. To ohranjeno zaporedje je omogočilo razvoj dvokomponentnega signalnega senzorja (TCS) z ponavljajočimi 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' vezavnimi mesti. Transgenske rastline, ki vsebujejo TCS promotor z zapisom za GFP (TCS::GFP), so omogočile ugotovitev novih, kot tudi boljše razumevanje že znanih vlog citokininov, ampak so se srečale z nekaterimi težavami. Izražanje s pomočjo TCS je šibko v nekaterih delih rastline kje imamo že imamo zabeleženo vlogo citokininov in izražanje GFP se postopoma zniža z zvišanjem generacije, verjetno zaradi vtišanja ponavljajočih se sekvenc TCS. Zaradi tega so v tem članku razvili izboljšano različico TCSn::GFP, ki se izogiba tem težavam in omogoča močnejši signal. TCS so predvsem optimizirali s spremembo števila vezavnih mest, spremembo faze in spremembo baz med motivi [2].

==Razvoj TCSn==
===Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS===
Analizirali so različna zaporedja TCS vezana z minimalnim 35S promotorjem in zaporedjem za luciferazo, ki so jih prehodno vstavili v primarne mezofilske protoplaste Arabidopsis thaliane z agronifiltracijo. Osnovna biokocka je vsebovala 4 motiva 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' ločenimi z poljubno izbranimi sosednjimi nukleotidi. Biokocke so narejene tako da vsebujejo motive smernih in inverznih ponovitev v vseh možnih orientaciah. Torej, tandemska ponovitev, glava na glavo in rep na rep. Pri 4 ponovitvah niso opazili bistvene razlike v primerjavi z kontorlo, med tem ko se minimalno izražanje pojavilo komaj po 8ih ponovitah. TCS s 16 ponovitev je omogočila podoben signal kot pri luciferazi vezani na ARR6 promotor, ki je sestavljen na osnovi 5' regulativne regije enega izmed ARR tipa A genov. Največje izražanje reporterja so opazili pri 24 ponovitvah motiva, kar nakazuje na močen kooperativni efekt med transkripcijskimi faktorji. Nadaljnje zvišanje števila motivov je imelo inhibitorni vpliv. Tako je zaporedje z 24 motivov bilo izbrano in dobilo ime TCS [2], [4]. Kooperacija ARR-jev tipa B je tudi bila dokazana ''in planta'' [5].

===Določanje faze===
Naslednje so raziskali kako sprememba baz motiva in sosednjih baz vpliva na izražanje reporterja. Razvili so različice TCS, TCS*, ki vsebuje mutacije v motivu in TCSfm, ki vsebuje mutacije v sosednjih bazah. Ugotovili so da so promotorji postali neobčutljivi na citokinine in da je verjetno ''in vitro'' določen motiv 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' nezadosten za prepoznavo z ARR tipa B ''in vivo''. Zaradi tega je potrebno še optimizirati sosednje baze, kako bi izboljšali TCS [2].

===Določanje razdalja med motivi===
Testirali so še različice TCS, ki ima 9bp parov razdalje, z različnimi razdaljami med motivi in preverili njen vpliv na izražanje. Različica z 7bp razdalje je pokazala znižanje v aktivnosti, dokler je različica z 11 bp pokazala močnejšo aktivnost. To se sklada z dejstvom da DNA rabi 11 bp da naredi obrat v heliksu v njeni B konformaciji in da faziranje vezavnih mest s tem številom bp na splošno omogoča največjo aktivnost transkripcijskih faktorjev [2].

===Optimizacija s pomočjo bioinformatske analize===
Kako bi ugotovili katera vezavna mesta se nahajajo v divjih tipih Arabidopsis thaliane in s tem ugotovili kako da zvišajo izražanje in se izognejo vtišanju TCS, analizirali so vezavna mesta za ARR tipa B. Analizirali so 3kbp sekvenco navzgor od prepisanega zaporedja kot tudi prepisano zaporedje ARR tipa A genov, ker se tam ponavadi nahaja cis-regulativno zaporedje in iskali zaporedje 5'-(A/G)GAT(C/T)-3'. Čeprav je to zaporedje bolj pogosto v analiziranih sekvencah, še vedno bi se najdlo vsakič na 108bp v naključni DNA. Zaradi tega so zvišali specifičnost tako da so iskali motive, ki so odaljeni vsaj 6 bp, ker je dolžina samega motiva 5bp in ne več kot 30bp, ker so iskali motive v gručah. Ugotovili so da se motivi nahajajo na 7 do 14bp en od drugega v povprečju in da se smerne in inverzne ponovitve pojavijo enako pogosto. Dodanih je bilo po 3 bp na vsak konec iskanih motivov (poglej podpoglavlje Določanje faze). Sekvence, ki jih spremlja podaljšek 5', 5'-A-3' in/ali 3' podaljšek, 5'-T-3' se pojavljajo pogosteje. Ugotovili so tudi da se sekvenca 5'-AA(A/G)GAT(C/T)TT-3' izredno bolj pogosto nahaja v tarčnih genov citokininov v primerjavi z kontrolnimi geni. Na osnovi teh informacij ustvarili so 12 motivov (Tabela 1). Ti sintetični motivi so bili naključno združeni, da so dobili sintetično zaporedje, ki vsebuje 24 vezavnih mest v vseh mogočih orientacijah (poglej podpoglavje Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS). S tem razvojem so omogočili da je izražanje reporterskega gena bolj enakomerno in da ne pride do vtišanja zaradi monotonosti [2].

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 1: Motivi uporabljeni v TCSn'''
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|zaporedje
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT

|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |2
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GAGAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |3
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |4
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |5
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTAT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |6
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |7
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |8
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |9
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |10
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |11
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GTTGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |12
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |ATGGGATCTTG
|}

==Specifičnost in občutljivost TCSn==
Kako bi preverili občutljivost in specifičnost TCSn, transficirali so protoplaste z TCSn konjugirano z luciferazo. Ugotovili so da se pojavi večji signal v primerjavi z TCS in da ne pride do nespecifičnega izražanja v prisotnosti nekaterih drugih fitohormonov. Kotransfekcija z ojačevalci MSP, kot so CKI1 in ARR tipa B je zvišala izražanje reporterja, medtem ko je kotransfekcija z ARR tipa A, torej inhibitorji MSP, znižala izražanje. Pri nekaterih ojačevalcih je prišlo do ojačanja signala v primerjavi z TSC, dokler je pri drugih ostalo isto. Specifičnost je tudi preverjena z transkripcijskimi faktorji, ki imajo podobno vezavno zaporedje kot ARR tipa B in ugotovljeno je da ne aktivirajo izražanje niti TCS niti TCSn. Do aktivacije pride tudi v monokaličnicah zaradi podobnosti ARR tipa B genov pri vseh rastlinah. Analizirali so še izražanje reporterja v rastlinah, ki so bile transficirane z konstruktom TCSn::GFP in ugotovili da pride do močnejšega signala v primerjavi z tistimi rastlinami, ki so transficirane z TCS::GFP ARR5::GFP. V sadikah teh rastlin so inducirali CKI1 in ARR10:SRDX, ARR tipa B protein konjugiran z represorjem fosforilacije, ki vtiša MSP. V tistih z induciranim CKI1 je zabeležena vseprisotna aktivnost reporterja, dokler je v tistih z ekspresijo ARR10:SRDX zabeleženo utišanje GFP-ja. S temi analizami so potrdili da TSC specifično izraža aktivnost MSP. Poleg tega, po treh generacijah transgenih rastlin ni bilo opaziti zmanjšanja ravni GFP, kar kaže, da za razliko od TCS::GFP, TCSn::GFP ni podvržen vtišanju transgena [2].

==Vzorci izražanja TCSn::GFP==
Trasfekcija rastlin z TCSn::GFP je pokazala izražanje reporterja, ki se sklada z že znanimi vlogami citokininov. Poleg tega, za razliko od TCS::GFP, ekspresija TCSn::GFP je aktivna še v poznih stadijih ženske embriogeneze. V primerjavi z TCS::GFP, signal je bistveno slabši v suspenzorskih celicah in celic, ki nastanejo iz njih, dokler je signal močnejši pri provaskularnih in bodočih celicah meristema poganjka. Do tega pride, verjetno ker niti en promotor ni optimiziran da ga aktivirajo vsi ARR tipa B enako. TCS lahko odraža boljše pogoje vezave za skupino ARR tipa B, izraženih v suspenzorskih celicah, medtem ko se v vseh drugih tkivih zdi, da TCSn zagotavlja boljše pogoje. V drugih regijah je na splošno izražanje kvalitativno enako, ampak bolj močno kot v primerjavi z TCS::GFP [2].

==Zaključek==
Razvoj od TCS odvisne ekspresije reporterskih genov je omogočil izboljšanje do takrat znanih modelov in odkritje ne znanih funkcij citokininov. Ampak, pri njihovoj uporabi pride do težav. Zaradi tega je razvit TCSn, ki za razliko od TCS, ima večjo občutljivost na citokinine, bolj izbalansiran odgovor na različne ARR-je tipa B in ni podvržen vtišanju zaradi monotonosti sekvence. To bo tudi olajšalo ukrštanje TCSn::GFP linije z različnimi drugimi linijami in omogočilo raziskanje manj znanih vlog MSP [2].

==Viri==
[1] J. J. Kieber, ‘Tribute to Folke Skoog: Recent Advances in our Understanding of Cytokinin Biology’, J. Plant Growth Regul., vol. 21, no. 1, pp. 1–2, Mar. 2002, doi: 10.1007/s003440010059.

[2] E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.

[3] C. E. Hutchison and J. J. Kieber, ‘Cytokinin Signaling in Arabidopsis’, Plant Cell, vol. 14, no. suppl 1, pp. S47–S59, May 2002, doi: 10.1105/tpc.010444.

[4] B. Müller and J. Sheen, ‘Cytokinin and auxin interplay in root stem-cell specification during early embryogenesis’, Nature, vol. 453, no. 7198, pp. 1094–1097, Jun. 2008, doi: 10.1038/nature06943.

[5] M. Veerabagu et al., ‘The Arabidopsis B-type response regulator 18 homomerizes and positively regulates cytokinin responses’, Plant J. Cell Mol. Biol., vol. 72, no. 5, pp. 721–731, Dec. 2012, doi: 10.1111/j.1365-313X.2012.05101.x.

Robusten in občutljiv sintetični senzor za spremljanje transkripcijskega izhoda signalne mreže citokininov in planta

2020-05-17T22:10:01Z

Andrej Race:

''Povzeto po članku:'' [https://plantphysiol.org/content/161/3/1066 E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.]

Citokinini so razred fitohormonov, ki spodbujajo delitev celic v rastlinskih koreninah in poganjkih. Vključeni so predvsem v rasti in diferenciaciji celic, vplivajo pa tudi na apikalno prevlado, rast aksialinih brstov in staranje listov [1]. Citokinini sprožijo signalno kaskado večstopenjske fosforilacije (MSP). To pot sproži vezava citokinina na CHASE domeno hibridne histidin senzor kinaze. Posledično pride do avtofosforilacije receptorja na His ostanku in nadaljnji prenos fosfatne skupine na Asp ostanek v domeni oddajnika. Fosfat se nato prenese na fosfotransferni protein, ki se translocira v jedro in lahko nato fosforilira regulatorje odziva (ARR) tipa B. ARR so družina transkripcijskih faktorjev, ki sovpadajo v tip A, B ali C. Pripadniki razreda tipa B se vežejo na promotorje ciljnih genov preko njihove Myb-podobne DNA-vezavne domene in aktivirajo transkripcijo, medtem ko ARR-ji tipa A in tipa C zavirajo signalno aktivnost. Hkrati so ARR tipa A glavna tarča aktiviranih ARR tipa B, kar vzpostavi negativno povratno zanko na signalno pot. Opisano pot lahko tudi aktivirajo citokinin neodvisne kinaze 1 (CKI1) [2], [3].

==Analiza vpliva citokininov==
Največja težava, ki nastane pri raziskovanju vloge MSP, je da citokinini imajo kompleksno biosintezo, transport in razgradnjo, kar oteži določevanje distribucije aktivnih citokininov v rastlinah. Poleg tega, MSP lahko aktivirajo druge od citokininov neodvisne kinaze kot so CKI1. Zaradi tega je najboljši pristop vizualizacije transkripcijskega izražanja MSP s sintetičnim reporterjem, ki razkrije mesta delovanja med razvojem divjega tipa. ARR tipa B se vežejo na 9bp veliko sekvenco, ki ima ohranjeno 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' zaporedje. To ohranjeno zaporedje je omogočilo razvoj dvokomponentnega signalnega senzorja (TCS) z ponavljajočimi 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' vezavnimi mesti. Transgenske rastline, ki vsebujejo TCS promotor z zapisom za GFP (TCS::GFP), so omogočile ugotovitev novih, kot tudi boljše razumevanje že znanih vlog citokininov, ampak so se srečale z nekaterimi težavami. Izražanje s pomočjo TCS je šibko v nekaterih delih rastline kje imamo že imamo zabeleženo vlogo citokininov in izražanje GFP se postopoma zniža z zvišanjem generacije, verjetno zaradi vtišanja ponavljajočih se sekvenc TCS. Zaradi tega so v tem članku razvili izboljšano različico TCSn::GFP, ki se izogiba tem težavam in omogoča močnejši signal. TCS so predvsem optimizirali s spremembo števila vezavnih mest, spremembo faze in spremembo baz med motivi [2].

==Razvoj TCSn==
===Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS===
Analizirali so različna zaporedja TCS vezana z minimalnim 35S promotorjem in zaporedjem za luciferazo, ki so jih prehodno vstavili v primarne mezofilske protoplaste Arabidopsis thaliane z agronifiltracijo. Osnovna biokocka je vsebovala 4 motiva 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' ločenimi z poljubno izbranimi sosednjimi nukleotidi. Biokocke so narejene tako da vsebujejo motive smernih in inverznih ponovitev v vseh možnih orientaciah. Torej, tandemska ponovitev, glava na glavo in rep na rep. Pri 4 ponovitvah niso opazili bistvene razlike v primerjavi z kontorlo, med tem ko se minimalno izražanje pojavilo komaj po 8ih ponovitah. TCS s 16 ponovitev je omogočila podoben signal kot pri luciferazi vezani na ARR6 promotor, ki je sestavljen na osnovi 5' regulativne regije enega izmed ARR tipa A genov. Največje izražanje reporterja so opazili pri 24 ponovitvah motiva, kar nakazuje na močen kooperativni efekt med transkripcijskimi faktorji. Nadaljnje zvišanje števila motivov je imelo inhibitorni vpliv. Tako je zaporedje z 24 motivov bilo izbrano in dobilo ime TCS [2], [4]. Kooperacija ARR-jev tipa B je tudi bila dokazana ''in planta'' [5].

===Določanje faze===
Naslednje so raziskali kako sprememba baz motiva in sosednjih baz vpliva na izražanje reporterja. Razvili so različice TCS, TCS*, ki vsebuje mutacije v motivu in TCSfm, ki vsebuje mutacije v sosednjih bazah. Ugotovili so da so promotorji postali neobčutljivi na citokinine in da je verjetno ''in vitro'' določen motiv 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' nezadosten za prepoznavo z ARR tipa B ''in vivo''. Zaradi tega je potrebno še optimizirati sosednje baze, kako bi izboljšali TCS [2].

===Določanje razdalja med motivi===
Testirali so še različice TCS, ki ima 9bp parov razdalje, z različnimi razdaljami med motivi in preverili njen vpliv na izražanje. Različica z 7bp razdalje je pokazala znižanje v aktivnosti, dokler je različica z 11 bp pokazala močnejšo aktivnost. To se sklada z dejstvom da DNA rabi 11 bp da naredi obrat v heliksu v njeni B konformaciji in da faziranje vezavnih mest s tem številom bp na splošno omogoča največjo aktivnost transkripcijskih faktorjev [2].

===Optimizacija s pomočjo bioinformatske analize===
Kako bi ugotovili katera vezavna mesta se nahajajo v divjih tipih Arabidopsis thaliane in s tem ugotovili kako da zvišajo izražanje in se izognejo vtišanju TCS, analizirali so vezavna mesta za ARR tipa B. Analizirali so 3kbp sekvenco navzgor od prepisanega zaporedja kot tudi prepisano zaporedje ARR tipa A genov, ker se tam ponavadi nahaja cis-regulativno zaporedje in iskali zaporedje 5'-(A/G)GAT(C/T)-3'. Čeprav je to zaporedje bolj pogosto v analiziranih sekvencah, še vedno bi se najdlo vsakič na 108bp v naključni DNA. Zaradi tega so zvišali specifičnost tako da so iskali motive, ki so odaljeni vsaj 6 bp, ker je dolžina samega motiva 5bp in ne več kot 30bp, ker so iskali motive v gručah. Ugotovili so da se motivi nahajajo na 7 do 14bp en od drugega v povprečju in da se smerne in inverzne ponovitve pojavijo enako pogosto. Dodanih je bilo po 3 bp na vsak konec iskanih motivov (poglej podpoglavlje Določanje faze). Sekvence, ki jih spremlja podaljšek 5', 5'-A-3' in/ali 3' podaljšek, 5'-T-3' se pojavljajo pogosteje. Ugotovili so tudi da se sekvenca 5'-AA(A/G)GAT(C/T)TT-3' izredno bolj pogosto nahaja v tarčnih genov citokininov v primerjavi z kontrolnimi geni. Na osnovi teh informacij ustvarili so 12 motivov (Tabela 1). Ti sintetični motivi so bili naključno združeni, da so dobili sintetično zaporedje, ki vsebuje 24 vezavnih mest v vseh mogočih orientacijah (poglej podpoglavje Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS). S tem razvojem so omogočili da je izražanje reporterskega gena bolj enakomerno in da ne pride do vtišanja zaradi monotonosti [2].

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 1: Motivi uporabljeni v TCSn'''
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|zaporedje
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT

|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |2
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GAGAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |3
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |4
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |5
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTAT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |6
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |7
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |8
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |9
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |10
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |11
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GTTGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |12
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |ATGGGATCTTG
|}

==Specifičnost in občutljivost TCSn==
Kako bi preverili občutljivost in specifičnost TCSn, transficirali so protoplaste z TCSn konjugirano z luciferazo. Ugotovili so da se pojavi večji signal v primerjavi z TCS in da ne pride do nespecifičnega izražanja v prisotnosti nekaterih drugih fitohormonov. Kotransfekcija z ojačevalci MSP, kot so CKI1 in ARR tipa B je zvišala izražanje reporterja, medtem ko je kotransfekcija z ARR tipa A, torej inhibitorji MSP, znižala izražanje. Pri nekaterih ojačevalcih je prišlo do ojačanja signala v primerjavi z TSC, dokler je pri drugih ostalo isto. Specifičnost je tudi preverjena z transkripcijskimi faktorji, ki imajo podobno vezavno zaporedje kot ARR tipa B in ugotovljeno je da ne aktivirajo izražanje niti TCS niti TCSn. Do aktivacije pride tudi v monokaličnicah zaradi podobnosti ARR tipa B genov pri vseh rastlinah. Analizirali so še izražanje reporterja v rastlinah, ki so bile transficirane z konstruktom TCSn::GFP in ugotovili da pride do močnejšega signala v primerjavi z tistimi rastlinami, ki so transficirane z TCS::GFP ARR5::GFP. V sadikah teh rastlin so inducirali CKI1 in ARR10:SRDX, ARR tipa B protein konjugiran z represorjem fosforilacije, ki vtiša MSP. V tistih z induciranim CKI1 je zabeležena vseprisotna aktivnost reporterja, dokler je v tistih z ekspresijo ARR10:SRDX zabeleženo utišanje GFP-ja. S temi analizami so potrdili da TSC specifično izraža aktivnost MSP. Poleg tega, po treh generacijah transgenih rastlin ni bilo opaziti zmanjšanja ravni GFP, kar kaže, da za razliko od TCS::GFP, TCSn::GFP ni podvržen vtišanju transgena [2].

==Vzorci izražanja TCSn::GFP==
Trasfekcija rastlin z TCSn::GFP je pokazala izražanje reporterja, ki se sklada z že znanimi vlogami citokininov. Poleg tega, za razliko od TCS::GFP, ekspresija TCSn::GFP je aktivna še v poznih stadijih ženske embriogeneze. V primerjavi z TCS::GFP, signal je bistveno slabši v suspenzorskih celicah in celic, ki nastanejo iz njih, dokler je signal močnejši pri provaskularnih in bodočih celicah meristema poganjka. Do tega pride, verjetno ker niti en promotor ni optimiziran da ga aktivirajo vsi ARR tipa B enako. TCS lahko odraža boljše pogoje vezave za skupino ARR tipa B, izraženih v suspenzorskih celicah, medtem ko se v vseh drugih tkivih zdi, da TCSn zagotavlja boljše pogoje. V drugih regijah je na splošno izražanje kvalitativno enako, ampak bolj močno kot v primerjavi z TCS::GFP [2].

==Zaključek==
Razvoj od TCS odvisne ekspresije reporterskih genov je omogočil izboljšanje do takrat znanih modelov in odkritje ne znanih funkcij citokininov. Ampak, pri njihovoj uporabi pride do težav. Zaradi tega je razvit TCSn, ki za razliko od TCS, ima večjo občutljivost na citokinine, bolj izbalansiran odgovor na različne ARR-je tipa B in ni podvžen vtišanju zaradi monotonosti sekvence. To bo tudi olajšalo ukrštanje TCSn::GFP linije z različnimi drugimi linijami in omogočilo raziskanje manj znanih vlog MSP [2].

==Viri==
[1] J. J. Kieber, ‘Tribute to Folke Skoog: Recent Advances in our Understanding of Cytokinin Biology’, J. Plant Growth Regul., vol. 21, no. 1, pp. 1–2, Mar. 2002, doi: 10.1007/s003440010059.

[2] E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.

[3] C. E. Hutchison and J. J. Kieber, ‘Cytokinin Signaling in Arabidopsis’, Plant Cell, vol. 14, no. suppl 1, pp. S47–S59, May 2002, doi: 10.1105/tpc.010444.

[4] B. Müller and J. Sheen, ‘Cytokinin and auxin interplay in root stem-cell specification during early embryogenesis’, Nature, vol. 453, no. 7198, pp. 1094–1097, Jun. 2008, doi: 10.1038/nature06943.

[5] M. Veerabagu et al., ‘The Arabidopsis B-type response regulator 18 homomerizes and positively regulates cytokinin responses’, Plant J. Cell Mol. Biol., vol. 72, no. 5, pp. 721–731, Dec. 2012, doi: 10.1111/j.1365-313X.2012.05101.x.

Seminarji SB 2019/20

2020-05-17T22:03:14Z

Andrej Race:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinhronizirani_cikli_lize_bakterijskih_celic_za_in_vivo_dostavo_terapevtikov Sinhronizirani cikli lize bakterijskih celic za ''in vivo'' dostavo terapevtikov](Milica Janković) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_pot_fiksacije_ogljikovega_dioksida Sintezna pot fiksacije ogljikovega dioksida] (Ana Obaha) 
6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_brezcelično_sintezno_biologijo_na_osnovi_E.coli Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E.coli''] (Ajda Lenardič) 
7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Engineering_Customized_Cell_Sensing_and_Response_Behaviors_Using_Synthetic_Notch_Receptors Engineering Customized Cell Sensing and Response Behaviors Using Synthetic Notch Receptors] (Jelena Štrbac) 
8 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
9 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_sistema_s_proteinskimi_logi%C4%8Dnimi_vrati_na_povr%C5%A1ini_lipidnih_membran Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran] (Uroš Prešern) 
10 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kompleksno_celi%C4%8Dno_logi%C4%8Dno_ra%C4%8Dunanje_z_RNA-napravami Kompleksno celično logično računanje z RNA-napravami] (Peter Škrinjar) 
11 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Daljinsko_upravljanje_s_sesalskimi_celicami%2C_na_podlagi_temperaturno_reguliranih_genetskih_stikal_s_svetlobno-toplotnimi_utripi Daljinsko upravljanje s sesalskimi celicami, na podlagi temperaturno reguliranih genetskih stikal s svetlobno-toplotnimi utripi] (Luka Gregorič) 
12 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacija_na_osnovi_DNA_v_populacijah_sinteticnih_protocelic Komunikacija na osnovi DNA v populacijah sintetičnih protocelic] (Urban Hribar) 
13 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovanje_mikrobnih_konzorcijev_z_dolo%C4%8Denimi_dru%C5%BEbenimi_interakcijami Načrtovanje mikrobnih konzorcijev z določenimi družbenimi interakcijami] (Jerneja Nimac) 
14 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Sistem za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
15 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetski_programi_zgrajeni_iz_več_plasti_logičnih_vrat_v_posameznih_celicah Genetski programi zgrajeni iz več plasti logičnih vrat v posameznih celicah] (Daria Latysheva) 
16 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 
17 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vpliv_sinteznih_metabolnih_poti_glikolata_na_produktivnost_rastlin Vpliv sinteznih metabolnih poti glikolata na produktivnost rastlin] (Ines Medved) 
18 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/A_synthetic_biology_approach_to_transform_Yarrowia_Lypolytica_into_a_competitive_biotechnological_producer_of_%CE%B2-carotene: A synthetic biology approach to transform Yarrowia Lypolytica into a competitive biotechnological producer of β-carotene] (Željka Erić) 
19 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 
20 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Shranjevanje_digitalnih_podatkov_v_DNA Shranjevanje digitalnih podatkov v DNA] (Samo Purič) 
21 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Robusten_in_občutljiv_sintetični_senzor_za_spremljanje_transkripcijskega_izhoda_signalne_mreže_citokininov_in_planta Robusten in občutljiv sintetični senzor za spremljanje transkripcijskega izhoda signalne mreže citokininov in planta] (Andrej Race) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 
6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Antihipertenzivni_probiotik_-_nov_pristop_zni%C5%BEevanja_krvnega_tlaka Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka] (Nika Testen) 
7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 
8 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ALiVE_%E2%80%93_analiza_%C5%BEivih_celic_z_vezikularnim_izvozom ALiVE – analiza živih celic z vezikularnim izvozom] (Sara Korošec) 
9 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NoTox_%E2%80%93_sistem_za_prepre%C4%8Devanje_botulinskih_izbruhov NoToX-sistem za preprečevanje botulinskih izbruhov] (Patricija Miklavc) 
10[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/To_bee...Hornet_to_bee,_ali_uporaba_bakterij_za_boj_proti_invazivni_vrsti To bee...Hornet to bee, ali uporaba bakterij za boj proti invazivni vrsti] (Primož Bembič) 

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 Tanja Zupan 
2 Lana Vogrinec 
3 Luka Lavrič 
4 Vesna Podgrajšek 

21.4. 
1 Žiga Vičič 
2 Tina Turel 
3 Anže Jenko 
4 Dunia Sahir 

22.4. 
1 Milica Janković 
2 Nika Testen 
3 Ana Obaha 
4 Ana Maklin 

5.5. 
1 Ajda Lenardič 
2 Jelena Štrbac 
3 Andreja Habič 
4 Uroš Prešern 

6.5. 
1 Sara Korošec 
2 Peter Škrinjar 
3 Luka Gregorič 
4 Urban Hribar 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 Katja Doberšek 
3 Daria Latysheva 
4 Veronika Razpotnik 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 Benjamin Malovrh 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Seminarji SB 2019/20

2020-05-17T22:02:19Z

Andrej Race:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinhronizirani_cikli_lize_bakterijskih_celic_za_in_vivo_dostavo_terapevtikov Sinhronizirani cikli lize bakterijskih celic za ''in vivo'' dostavo terapevtikov](Milica Janković) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_pot_fiksacije_ogljikovega_dioksida Sintezna pot fiksacije ogljikovega dioksida] (Ana Obaha) 
6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_brezcelično_sintezno_biologijo_na_osnovi_E.coli Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E.coli''] (Ajda Lenardič) 
7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Engineering_Customized_Cell_Sensing_and_Response_Behaviors_Using_Synthetic_Notch_Receptors Engineering Customized Cell Sensing and Response Behaviors Using Synthetic Notch Receptors] (Jelena Štrbac) 
8 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
9 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_sistema_s_proteinskimi_logi%C4%8Dnimi_vrati_na_povr%C5%A1ini_lipidnih_membran Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran] (Uroš Prešern) 
10 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kompleksno_celi%C4%8Dno_logi%C4%8Dno_ra%C4%8Dunanje_z_RNA-napravami Kompleksno celično logično računanje z RNA-napravami] (Peter Škrinjar) 
11 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Daljinsko_upravljanje_s_sesalskimi_celicami%2C_na_podlagi_temperaturno_reguliranih_genetskih_stikal_s_svetlobno-toplotnimi_utripi Daljinsko upravljanje s sesalskimi celicami, na podlagi temperaturno reguliranih genetskih stikal s svetlobno-toplotnimi utripi] (Luka Gregorič) 
12 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacija_na_osnovi_DNA_v_populacijah_sinteticnih_protocelic Komunikacija na osnovi DNA v populacijah sintetičnih protocelic] (Urban Hribar) 
13 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovanje_mikrobnih_konzorcijev_z_dolo%C4%8Denimi_dru%C5%BEbenimi_interakcijami Načrtovanje mikrobnih konzorcijev z določenimi družbenimi interakcijami] (Jerneja Nimac) 
14 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Sistem za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
15 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetski_programi_zgrajeni_iz_več_plasti_logičnih_vrat_v_posameznih_celicah Genetski programi zgrajeni iz več plasti logičnih vrat v posameznih celicah] (Daria Latysheva) 
16 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 
17 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vpliv_sinteznih_metabolnih_poti_glikolata_na_produktivnost_rastlin Vpliv sinteznih metabolnih poti glikolata na produktivnost rastlin] (Ines Medved) 
18 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/A_synthetic_biology_approach_to_transform_Yarrowia_Lypolytica_into_a_competitive_biotechnological_producer_of_%CE%B2-carotene: A synthetic biology approach to transform Yarrowia Lypolytica into a competitive biotechnological producer of β-carotene] (Željka Erić) 
19 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 
20 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Shranjevanje_digitalnih_podatkov_v_DNA Shranjevanje digitalnih podatkov v DNA] (Samo Purič) 
21 [http://http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Robusten_in_občutljiv_sintetični_senzor_za_spremljanje_transkripcijskega_izhoda_signalne_mreže_citokininov_in_planta Robusten in občutljiv sintetični senzor za spremljanje transkripcijskega izhoda signalne mreže citokininov in planta] (Andrej Race) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 
6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Antihipertenzivni_probiotik_-_nov_pristop_zni%C5%BEevanja_krvnega_tlaka Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka] (Nika Testen) 
7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 
8 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ALiVE_%E2%80%93_analiza_%C5%BEivih_celic_z_vezikularnim_izvozom ALiVE – analiza živih celic z vezikularnim izvozom] (Sara Korošec) 
9 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NoTox_%E2%80%93_sistem_za_prepre%C4%8Devanje_botulinskih_izbruhov NoToX-sistem za preprečevanje botulinskih izbruhov] (Patricija Miklavc) 
10[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/To_bee...Hornet_to_bee,_ali_uporaba_bakterij_za_boj_proti_invazivni_vrsti To bee...Hornet to bee, ali uporaba bakterij za boj proti invazivni vrsti] (Primož Bembič) 

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 Tanja Zupan 
2 Lana Vogrinec 
3 Luka Lavrič 
4 Vesna Podgrajšek 

21.4. 
1 Žiga Vičič 
2 Tina Turel 
3 Anže Jenko 
4 Dunia Sahir 

22.4. 
1 Milica Janković 
2 Nika Testen 
3 Ana Obaha 
4 Ana Maklin 

5.5. 
1 Ajda Lenardič 
2 Jelena Štrbac 
3 Andreja Habič 
4 Uroš Prešern 

6.5. 
1 Sara Korošec 
2 Peter Škrinjar 
3 Luka Gregorič 
4 Urban Hribar 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 Katja Doberšek 
3 Daria Latysheva 
4 Veronika Razpotnik 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 Benjamin Malovrh 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Seminarji SB 2019/20

2020-05-17T21:59:41Z

Andrej Race:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinhronizirani_cikli_lize_bakterijskih_celic_za_in_vivo_dostavo_terapevtikov Sinhronizirani cikli lize bakterijskih celic za ''in vivo'' dostavo terapevtikov](Milica Janković) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_pot_fiksacije_ogljikovega_dioksida Sintezna pot fiksacije ogljikovega dioksida] (Ana Obaha) 
6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_brezcelično_sintezno_biologijo_na_osnovi_E.coli Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E.coli''] (Ajda Lenardič) 
7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Engineering_Customized_Cell_Sensing_and_Response_Behaviors_Using_Synthetic_Notch_Receptors Engineering Customized Cell Sensing and Response Behaviors Using Synthetic Notch Receptors] (Jelena Štrbac) 
8 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
9 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_sistema_s_proteinskimi_logi%C4%8Dnimi_vrati_na_povr%C5%A1ini_lipidnih_membran Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran] (Uroš Prešern) 
10 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kompleksno_celi%C4%8Dno_logi%C4%8Dno_ra%C4%8Dunanje_z_RNA-napravami Kompleksno celično logično računanje z RNA-napravami] (Peter Škrinjar) 
11 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Daljinsko_upravljanje_s_sesalskimi_celicami%2C_na_podlagi_temperaturno_reguliranih_genetskih_stikal_s_svetlobno-toplotnimi_utripi Daljinsko upravljanje s sesalskimi celicami, na podlagi temperaturno reguliranih genetskih stikal s svetlobno-toplotnimi utripi] (Luka Gregorič) 
12 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacija_na_osnovi_DNA_v_populacijah_sinteticnih_protocelic Komunikacija na osnovi DNA v populacijah sintetičnih protocelic] (Urban Hribar) 
13 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovanje_mikrobnih_konzorcijev_z_dolo%C4%8Denimi_dru%C5%BEbenimi_interakcijami Načrtovanje mikrobnih konzorcijev z določenimi družbenimi interakcijami] (Jerneja Nimac) 
14 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Sistem za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
15 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetski_programi_zgrajeni_iz_več_plasti_logičnih_vrat_v_posameznih_celicah Genetski programi zgrajeni iz več plasti logičnih vrat v posameznih celicah] (Daria Latysheva) 
16 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 
17 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vpliv_sinteznih_metabolnih_poti_glikolata_na_produktivnost_rastlin Vpliv sinteznih metabolnih poti glikolata na produktivnost rastlin] (Ines Medved) 
18 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/A_synthetic_biology_approach_to_transform_Yarrowia_Lypolytica_into_a_competitive_biotechnological_producer_of_%CE%B2-carotene: A synthetic biology approach to transform Yarrowia Lypolytica into a competitive biotechnological producer of β-carotene] (Željka Erić) 
19 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 
20 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Shranjevanje_digitalnih_podatkov_v_DNA Shranjevanje digitalnih podatkov v DNA] (Samo Purič) 
21 [http://http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Robusten_in_ob%C4%8Dutljiv_sinteti%C4%8Dni_senzor_za_spremljanje_transkripcijskega_izhoda_signalne_mre%C5%BEe_citokininov_in_planta Robusten in ob%C4%8Dutljiv sinteti%C4%8Dni senzor za spremljanje transkripcijskega izhoda signalne mre%C5%BEe citokininov in planta]

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 
6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Antihipertenzivni_probiotik_-_nov_pristop_zni%C5%BEevanja_krvnega_tlaka Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka] (Nika Testen) 
7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 
8 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ALiVE_%E2%80%93_analiza_%C5%BEivih_celic_z_vezikularnim_izvozom ALiVE – analiza živih celic z vezikularnim izvozom] (Sara Korošec) 
9 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NoTox_%E2%80%93_sistem_za_prepre%C4%8Devanje_botulinskih_izbruhov NoToX-sistem za preprečevanje botulinskih izbruhov] (Patricija Miklavc) 
10[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/To_bee...Hornet_to_bee,_ali_uporaba_bakterij_za_boj_proti_invazivni_vrsti To bee...Hornet to bee, ali uporaba bakterij za boj proti invazivni vrsti] (Primož Bembič) 

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 Tanja Zupan 
2 Lana Vogrinec 
3 Luka Lavrič 
4 Vesna Podgrajšek 

21.4. 
1 Žiga Vičič 
2 Tina Turel 
3 Anže Jenko 
4 Dunia Sahir 

22.4. 
1 Milica Janković 
2 Nika Testen 
3 Ana Obaha 
4 Ana Maklin 

5.5. 
1 Ajda Lenardič 
2 Jelena Štrbac 
3 Andreja Habič 
4 Uroš Prešern 

6.5. 
1 Sara Korošec 
2 Peter Škrinjar 
3 Luka Gregorič 
4 Urban Hribar 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 Katja Doberšek 
3 Daria Latysheva 
4 Veronika Razpotnik 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 Benjamin Malovrh 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Robusten in občutljiv sintetični senzor za spremljanje transkripcijskega izhoda signalne mreže citokininov in planta

2020-05-17T21:52:48Z

Andrej Race:

''Povzeto po članku:'' [https://plantphysiol.org/content/161/3/1066 E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.]

Citokinini so razred fitohormonov, ki spodbujajo delitev celic v rastlinskih koreninah in poganjkih. Vključeni so predvsem v rasti in diferenciaciji celic, vplivajo pa tudi na apikalno prevlado, rast aksialinih brstov in staranje listov [1]. Citokinini sprožijo signalno kaskado večstopenjske fosforilacije (MSP). To pot sproži vezava citokinina na CHASE domeno hibridne histidin senzor kinaze. Posledično pride do avtofosforilacije receptorja na His ostanku in nadaljnji prenos fosfatne skupine na Asp ostanek v domeni oddajnika. Fosfat se nato prenese na fosfotransferni protein, ki se translocira v jedro in lahko nato fosforilira regulatorje odziva (ARR) tipa B. ARR so družina transkripcijskih faktorjev, ki sovpadajo v tip A, B ali C. Pripadniki razreda tipa B se vežejo na promotorje ciljnih genov preko njihove Myb-podobne DNA-vezavne domene in aktivirajo transkripcijo, medtem ko ARR-ji tipa A in tipa C zavirajo signalno aktivnost. Hkrati so ARR tipa A glavna tarča aktiviranih ARR-B, kar vzpostavi negativno povratno zanko na signalno pot. Opisano pot lahko tudi aktivirajo citokinin neodvisne kinaze 1 (CKI1) [2], [3].

==Analiza vpliva citokininov==
Največja težava, ki nastane pri raziskovanju vloge MSP, je da citokinini imajo kompleksno biosintezo, transport in razgradnjo, kar oteži določevanje distribucije aktivnih citokininov v rastlinah. Poleg tega, MSP lahko aktivirajo druge od citokininov neodvisne kinaze kot so CKI1. Zaradi tega je najboljši pristop vizualizacije transkripcijskega izražanja MSP s sintetičnim reporterjem, ki razkrije mesta delovanja med razvojem divjega tipa. ARR-B se vežejo na 9bp veliko sekvenco, ki ima ohranjeno 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' zaporedje. To ohranjeno zaporedje je omogočilo razvoj dvokomponentnega signalnega senzorja (TCS) z ponavljajočimi 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' vezavnimi mesti. Transgenske rastline, ki vsebujejo TCS promotor z zapisom za GFP (TCS::GFP), so omogočile ugotovitev novih, kot tudi boljše razumevanje že znanih vlog citokininov, ampak so se srečale z nekaterimi težavami. Izražanje s pomočjo TCS je šibko v nekaterih delih rastline kje imamo že imamo zabeleženo vlogo citokininov in izražanje GFP se postopoma zniža z zvišanjem generacije, verjetno zaradi vtišanja ponavljajočih se sekvenc TCS. Zaradi tega so v tem članku razvili izboljšano različico TCSn::GFP, ki se izogiba tem težavam in omogoča močnejši signal. TCS so predvsem optimizirali s spremembo števila vezavnih mest, spremembo faze in spremembo baz med motivi [2].

==Razvoj TCSn==
===Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS===
Analizirali so različna zaporedja TCS vezana z minimalnim 35S promotorjem in zaporedjem za luciferazo, ki so jih prehodno vstavili v primarne mezofilske protoplaste Arabidopsis thaliane z agronifiltracijo. Osnovna biokocka je vsebovala 4 motiva 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' ločenimi z poljubno izbranimi sosednjimi nukleotidi. Biokocke so narejene tako da vsebujejo motive smernih in inverznih ponovitev v vseh možnih orientaciah. Torej, tandemska ponovitev, glava na glavo in rep na rep. Pri 4 ponovitvah niso opazili bistvene razlike v primerjavi z kontorlo, med tem ko se minimalno izražanje pojavilo komaj po 8ih ponovitah. TCS s 16 ponovitev je omogočila podoben signal kot pri luciferazi vezani na ARR6 promotor, ki je sestavljen na osnovi 5' regulativne regije enega izmed ARR-A genov. Največje izražanje reporterja so opazili pri 24 ponovitvah motiva, kar nakazuje na močen kooperativni efekt med transkripcijskimi faktorji. Nadaljnje zvišanje števila motivov je imelo inhibitorni vpliv. Tako je zaporedje z 24 motivov bilo izbrano in dobilo ime TCS [2], [4]. Kooperacija ARR-jev tipa B je tudi bila dokazana ''in planta'' [5].

===Določanje faze===
Naslednje so raziskali kako sprememba baz motiva in sosednjih baz vpliva na izražanje reporterja. Razvili so različice TCS, TCS*, ki vsebuje mutacije v motivu in TCSfm, ki vsebuje mutacije v sosednjih bazah. Ugotovili so da so promotorji postali neobčutljivi na citokinine in da je verjetno ''in vitro'' določen motiv 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' nezadosten za prepoznavo z ARR-B ''in vivo''. Zaradi tega je potrebno še optimizirati sosednje baze, kako bi izboljšali TCS [2].

===Določanje razdalja med motivi===
Testirali so še različice TCS, ki ima 9bp parov razdalje, z različnimi razdaljami med motivi in preverili njen vpliv na izražanje. Različica z 7bp razdalje je pokazala znižanje v aktivnosti, dokler je različica z 11 bp pokazala močnejšo aktivnost. To se sklada z dejstvom da DNA rabi 11 bp da naredi obrat v heliksu v njeni B konformaciji in da faziranje vezavnih mest s tem številom bp na splošno omogoča največjo aktivnost transkripcijskih faktorjev [2].

===Optimizacija s pomočjo bioinformatske analize===
Kako bi ugotovili katera vezavna mesta se nahajajo v divjih tipih Arabidopsis thaliane in s tem ugotovili kako da zvišajo izražanje in se izognejo vtišanju TCS, analizirali so vezavna mesta za ARR-B. Analizirali so 3kbp sekvenco navzgor od prepisanega zaporedja kot tudi prepisano zaporedje ARR-A genov, ker se tam ponavadi nahaja cis-regulativno zaporedje in iskali zaporedje 5'-(A/G)GAT(C/T)-3'. Čeprav je to zaporedje bolj pogosto v analiziranih sekvencah, še vedno bi se najdlo vsakič na 108bp v naključni DNA. Zaradi tega so zvišali specifičnost tako da so iskali motive, ki so odaljeni vsaj 6 bp, ker je dolžina samega motiva 5bp in ne več kot 30bp, ker so iskali motive v gručah. Ugotovili so da se motivi nahajajo na 7 do 14bp en od drugega v povprečju in da se smerne in inverzne ponovitve pojavijo enako pogosto. Dodanih je bilo po 3 bp na vsak konec iskanih motivov (poglej podpoglavlje Določanje faze). Sekvence, ki jih spremlja podaljšek 5', 5'-A-3' in/ali 3' podaljšek, 5'-T-3' se pojavljajo pogosteje. Ugotovili so tudi da se sekvenca 5'-AA(A/G)GAT(C/T)TT-3' izredno bolj pogosto nahaja v tarčnih genov citokininov v primerjavi z kontrolnimi geni. Na osnovi teh informacij ustvarili so 12 motivov (Tabela 1). Ti sintetični motivi so bili naključno združeni, da so dobili sintetično zaporedje, ki vsebuje 24 vezavnih mest v vseh mogočih orientacijah (poglej podpoglavje Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS). S tem razvojem so omogočili da je izražanje reporterskega gena bolj enakomerno in da ne pride do vtišanja zaradi monotonosti [2].

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 1: Motivi uporabljeni v TCSn'''
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|zaporedje
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT

|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |2
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GAGAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |3
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |4
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |5
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTAT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |6
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |7
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |8
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |9
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |10
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |11
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GTTGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |12
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |ATGGGATCTTG
|}

==Specifičnost in občutljivost TCSn==
Kako bi preverili občutljivost in specifičnost TCSn, trasficirali so protoplaste z TCSn konjugirano z luciferazo. Ugotovili so da se pojavi večji signal v primerjavi z TCS in da ne pride do nespecifičnega izražanja v prisotnosti nekaterih drugih fitohormonov. Kotransfekcija z ojačevalci MSP, kot so CKI1 in ARR tipa B je zvišala izražanje reporterja, medtem ko je kotransfekcija z ARR tipa A, torej inhibitorji MSP, znižala izražanje. Pri nekaterih ojačevalcih je prišlo do ojačanja signala v primerjavi z TSC, dokler je pri drugih ostalo isto. Specifičnost je tudi preverjena z transkripcijskimi faktorji, ki imajo podobno vezavno zaporedje kot ARR tipa B in ugotovljeno je da ne aktivirajo izražanje niti TCS niti TCSn. Do aktivacije pride tudi v monokaličnicah zaradi podobnosti ARR tipa-B genov pri vseh rastlinah. Analizirali so še izražanje reporterja v rastlinah, ki so bile transficirane z konstruktom TCSn::GFP in ugotovili da pride do močnejšega signala v primerjavi z tistimi rastlinami, ki so transficirane z TCS::GFP ARR5::GFP. V sadikah teh rastlin so inducirali CKI1 in ARR10:SRDX, ARR tipa B protein konjugiran z represorjem fosforilacije, ki vtiša MSP. V tistih z induciranim CKI1 je zabeležena vseprisotna aktivnost reporterja, dokler je v tistih z ekspresijo ARR10:SRDX zabeleženo utišanje GFP-ja. S temi analizami so potrdili da TSC specifično izraža aktivnost MSP. Poleg tega, po treh generacijah transgenih rastlin ni bilo opaziti zmanjšanja ravni GFP, kar kaže, da za razliko od TCS::GFP, TCSn::GFP ni podvržen vtišanju transgena [2].

==Vzorci izražanja TCSn::GFP==
Trasfekcija rastlin z TCSn::GFP je pokazala izražanje reporterja, ki se sklada z že znanimi vlogami citokininov. Poleg tega, za razliko od TCS::GFP, ekspresija TCSn::GFP je aktivna še v poznih stadijih ženske embriogeneze. V primerjavi z TCS::GFP, signal je bistveno slabši v suspenzorskih celicah in celic, ki nastanejo iz njih, dokler je signal močnejši pri provaskularnih in bodočih celicah meristema poganjka. Do tega pride, verjetno ker niti en promotor ni optimiziran da ga aktivirajo vsi ARR tipa B enako. TCS lahko odraža boljše pogoje vezave za skupino ARR tipa B, izraženih v suspenzorskih celicah, medtem ko se v vseh drugih tkivih zdi, da TCSn zagotavlja boljše pogoje. V drugih regijah je na splošno izražanje kvalitativno enako, ampak bolj močno kot v primerjavi z TCS::GFP [2].

==Zaključek==
Razvoj od TCS odvisne ekspresije reporterskih genov je omogočil izboljšanje do takrat znanih modelov in odkritje ne znanih funkcij citokininov. Ampak, pri njihovoj uporabi pride do težav. Zaradi tega je razvit TCSn, ki za razliko od TCS, ima večjo občutljivost na citokinine, bolj izbalansiran odgovor na različne ARR-je tipa B in ni podvžen vtišanju zaradi monotonosti sekvence. To bo tudi olajšalo ukrštanje TCSn::GFP linije z različnimi drugimi linijami in omogočilo raziskanje manj znanih vlog MSP [2].

==Viri==
[1] J. J. Kieber, ‘Tribute to Folke Skoog: Recent Advances in our Understanding of Cytokinin Biology’, J. Plant Growth Regul., vol. 21, no. 1, pp. 1–2, Mar. 2002, doi: 10.1007/s003440010059.

[2] E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.

[3] C. E. Hutchison and J. J. Kieber, ‘Cytokinin Signaling in Arabidopsis’, Plant Cell, vol. 14, no. suppl 1, pp. S47–S59, May 2002, doi: 10.1105/tpc.010444.

[4] B. Müller and J. Sheen, ‘Cytokinin and auxin interplay in root stem-cell specification during early embryogenesis’, Nature, vol. 453, no. 7198, pp. 1094–1097, Jun. 2008, doi: 10.1038/nature06943.

[5] M. Veerabagu et al., ‘The Arabidopsis B-type response regulator 18 homomerizes and positively regulates cytokinin responses’, Plant J. Cell Mol. Biol., vol. 72, no. 5, pp. 721–731, Dec. 2012, doi: 10.1111/j.1365-313X.2012.05101.x.

Robusten in občutljiv sintetični senzor za spremljanje transkripcijskega izhoda signalne mreže citokininov in planta

2020-05-17T21:49:55Z

Andrej Race:

''Povzeto po članku:'' [https://plantphysiol.org/content/161/3/1066 E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.]

Citokinini so razred fitohormonov, ki spodbujajo delitev celic v rastlinskih koreninah in poganjkih. Vključeni so predvsem v rasti in diferenciaciji celic, vplivajo pa tudi na apikalno prevlado, rast aksialinih brstov in staranje listov [1]. Citokinini sprožijo signalno kaskado večstopenjske fosforilacije (MSP). To pot sproži vezava citokinina na CHASE domeno hibridne histidin senzor kinaze. Posledično pride do avtofosforilacije receptorja na His ostanku in nadaljnji prenos fosfatne skupine na Asp ostanek v domeni oddajnika. Fosfat se nato prenese na fosfotransferni protein, ki se translocira v jedro in lahko nato fosforilira regulatorje odziva (ARR) tipa B. ARR so družina transkripcijskih faktorjev, ki sovpadajo v tip A, B ali C. Pripadniki razreda tipa B se vežejo na promotorje ciljnih genov preko njihove Myb-podobne DNA-vezavne domene in aktivirajo transkripcijo, medtem ko ARR-ji tipa A in tipa C zavirajo signalno aktivnost. Hkrati so ARR tipa A glavna tarča aktiviranih ARR-B, kar vzpostavi negativno povratno zanko na signalno pot. Opisano pot lahko tudi aktivirajo citokinin neodvisne kinaze 1 (CKI1) [2], [3].

==Analiza vpliva citokininov==
Največja težava, ki nastane pri raziskovanju vloge MSP, je da citokinini imajo kompleksno biosintezo, transport in razgradnjo, kar oteži določevanje distribucije aktivnih citokininov v rastlinah. Poleg tega, MSP lahko aktivirajo druge od citokininov neodvisne kinaze kot so CKI1. Zaradi tega je najboljši pristop vizualizacije transkripcijskega izražanja MSP s sintetičnim reporterjem, ki razkrije mesta delovanja med razvojem divjega tipa. ARR-B se vežejo na 9bp veliko sekvenco, ki ima ohranjeno 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' zaporedje. To ohranjeno zaporedje je omogočilo razvoj dvokomponentnega signalnega senzorja (TCS) z ponavljajočimi 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' vezavnimi mesti. Transgenske rastline, ki vsebujejo TCS promotor z zapisom za GFP (TCS::GFP), so omogočile ugotovitev novih, kot tudi boljše razumevanje že znanih vlog citokininov, ampak so se srečale z nekaterimi težavami. Izražanje s pomočjo TCS je šibko v nekaterih delih rastline kje imamo že imamo zabeleženo vlogo citokininov in izražanje GFP se postopoma zniža z zvišanjem generacije, verjetno zaradi vtišanja ponavljajočih se sekvenc TCS. Zaradi tega so v tem članku razvili izboljšano različico TCSn::GFP, ki se izogiba tem težavam in omogoča močnejši signal. TCS so predvsem optimizirali s spremembo števila vezavnih mest, spremembo faze in spremembo baz med motivi [2].

==Razvoj TCSn==
===Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS===
Analizirali so različna zaporedja TCS vezana z minimalnim 35S promotorjem in zaporedjem za luciferazo, ki so jih prehodno vstavili v primarne mezofilske protoplaste Arabidopsis thaliane z agronifiltracijo. Osnovna biokocka je vsebovala 4 motiva 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' ločenimi z poljubno izbranimi sosednjimi nukleotidi. Biokocke so narejene tako da vsebujejo motive smernih in inverznih ponovitev v vseh možnih orientaciah. Torej, tandemska ponovitev, glava na glavo in rep na rep. Pri 4 ponovitvah niso opazili bistvene razlike v primerjavi z kontorlo, med tem ko se minimalno izražanje pojavilo komaj po 8ih ponovitah. TCS s 16 ponovitev je omogočila podoben signal kot pri luciferazi vezani na ARR6 promotor, ki je sestavljen na osnovi 5' regulativne regije enega izmed ARR-A genov. Največje izražanje reporterja so opazili pri 24 ponovitvah motiva, kar nakazuje na močen kooperativni efekt med transkripcijskimi faktorji. Nadaljnje zvišanje števila motivov je imelo inhibitorni vpliv. Tako je zaporedje z 24 motivov bilo izbrano in dobilo ime TCS [2], [4]. Kooperacija ARR-jev tipa B je tudi bila dokazana in planta [5].

===Določanje faze===
Naslednje so raziskali kako sprememba baz motiva in sosednjih baz vpliva na izražanje reporterja. Razvili so različice TCS, TCS*, ki vsebuje mutacije v motivu in TCSfm, ki vsebuje mutacije v sosednjih bazah. Ugotovili so da so promotorji postali neobčutljivi na citokinine in da je verjetno in vitro določen motiv 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' nezadosten za prepoznavo z ARR-B in vivo. Zaradi tega je potrebno še optimizirati sosednje baze, kako bi izboljšali TCS [2].

===Določanje razdalja med motivi===
Testirali so še različice TCS, ki ima 9bp parov razdalje, z različnimi razdaljami med motivi in preverili njen vpliv na izražanje. Različica z 7bp razdalje je pokazala znižanje v aktivnosti, dokler je različica z 11 bp pokazala močnejšo aktivnost. To se sklada z dejstvom da DNA rabi 11 bp da naredi obrat v heliksu v njeni B konformaciji in da faziranje vezavnih mest s tem številom bp na splošno omogoča največjo aktivnost transkripcijskih faktorjev [2].

===Optimizacija s pomočjo bioinformatske analize===
Kako bi ugotovili katera vezavna mesta se nahajajo v divjih tipih Arabidopsis thaliane in s tem ugotovili kako da zvišajo izražanje in se izognejo vtišanju TCS, analizirali so vezavna mesta za ARR-B. Analizirali so 3kbp sekvenco navzgor od prepisanega zaporedja kot tudi prepisano zaporedje ARR-A genov, ker se tam ponavadi nahaja cis-regulativno zaporedje in iskali zaporedje 5'-(A/G)GAT(C/T)-3'. Čeprav je to zaporedje bolj pogosto v analiziranih sekvencah, še vedno bi se najdlo vsakič na 108bp v naključni DNA. Zaradi tega so zvišali specifičnost tako da so iskali motive, ki so odaljeni vsaj 6 bp, ker je dolžina samega motiva 5bp in ne več kot 30bp, ker so iskali motive v gručah. Ugotovili so da se motivi nahajajo na 7 do 14bp en od drugega v povprečju in da se smerne in inverzne ponovitve pojavijo enako pogosto. Dodanih je bilo po 3 bp na vsak konec iskanih motivov (poglej podpoglavlje Določanje faze). Sekvence, ki jih spremlja podaljšek 5', 5'-A-3' in/ali 3' podaljšek, 5'-T-3' se pojavljajo pogosteje. Ugotovili so tudi da se sekvenca 5'-AA(A/G)GAT(C/T)TT-3' izredno bolj pogosto nahaja v tarčnih genov citokininov v primerjavi z kontrolnimi geni. Na osnovi teh informacij ustvarili so 12 motivov (Tabela 1). Ti sintetični motivi so bili naključno združeni, da so dobili sintetično zaporedje, ki vsebuje 24 vezavnih mest v vseh mogočih orientacijah (poglej podpoglavje Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS). S tem razvojem so omogočili da je izražanje reporterskega gena bolj enakomerno in da ne pride do vtišanja zaradi monotonosti [2].

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 1: Motivi uporabljeni v TCSn'''
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|zaporedje
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT

|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |2
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GAGAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |3
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |4
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |5
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTAT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |6
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |7
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |8
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |9
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |10
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |11
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GTTGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |12
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |ATGGGATCTTG
|}

==Specifičnost in občutljivost TCSn==
Kako bi preverili občutljivost in specifičnost TCSn, trasficirali so protoplaste z TCSn konjugirano z luciferazo. Ugotovili so da se pojavi večji signal v primerjavi z TCS in da ne pride do nespecifičnega izražanja v prisotnosti nekaterih drugih fitohormonov. Kotransfekcija z ojačevalci MSP, kot so CKI1 in ARR tipa B je zvišala izražanje reporterja, medtem ko je kotransfekcija z ARR tipa A, torej inhibitorji MSP, znižala izražanje. Pri nekaterih ojačevalcih je prišlo do ojačanja signala v primerjavi z TSC, dokler je pri drugih ostalo isto. Specifičnost je tudi preverjena z transkripcijskimi faktorji, ki imajo podobno vezavno zaporedje kot ARR tipa B in ugotovljeno je da ne aktivirajo izražanje niti TCS niti TCSn. Do aktivacije pride tudi v monokaličnicah zaradi podobnosti ARR tipa-B genov pri vseh rastlinah. Analizirali so še izražanje reporterja v rastlinah, ki so bile transficirane z konstruktom TCSn::GFP in ugotovili da pride do močnejšega signala v primerjavi z tistimi rastlinami, ki so transficirane z TCS::GFP ARR5::GFP. V sadikah teh rastlin so inducirali CKI1 in ARR10:SRDX, ARR tipa B protein konjugiran z represorjem fosforilacije, ki vtiša MSP. V tistih z induciranim CKI1 je zabeležena vseprisotna aktivnost reporterja, dokler je v tistih z ekspresijo ARR10:SRDX zabeleženo utišanje GFP-ja. S temi analizami so potrdili da TSC specifično izraža aktivnost MSP. Poleg tega, po treh generacijah transgenih rastlin ni bilo opaziti zmanjšanja ravni GFP, kar kaže, da za razliko od TCS::GFP, TCSn::GFP ni podvržen vtišanju transgena [2].

==Vzorci izražanja TCSn::GFP==
Trasfekcija rastlin z TCSn::GFP je pokazala izražanje reporterja, ki se sklada z že znanimi vlogami citokininov. Poleg tega, za razliko od TCS::GFP, ekspresija TCSn::GFP je aktivna še v poznih stadijih ženske embriogeneze. V primerjavi z TCS::GFP, signal je bistveno slabši v suspenzorskih celicah in celic, ki nastanejo iz njih, dokler je signal močnejši pri provaskularnih in bodočih celicah meristema poganjka. Do tega pride, verjetno ker niti en promotor ni optimiziran da ga aktivirajo vsi ARR tipa B enako. TCS lahko odraža boljše pogoje vezave za skupino ARR tipa B, izraženih v suspenzorskih celicah, medtem ko se v vseh drugih tkivih zdi, da TCSn zagotavlja boljše pogoje. V drugih regijah je na splošno izražanje kvalitativno enako, ampak bolj močno kot v primerjavi z TCS::GFP [2].

==Zaključek==
Razvoj od TCS odvisne ekspresije reporterskih genov je omogočil izboljšanje do takrat znanih modelov in odkritje ne znanih funkcij citokininov. Ampak, pri njihovoj uporabi pride do težav. Zaradi tega je razvit TCSn, ki za razliko od TCS, ima večjo občutljivost na citokinine, bolj izbalansiran odgovor na različne ARR-je tipa B in ni podvžen vtišanju zaradi monotonosti sekvence. To bo tudi olajšalo ukrštanje TCSn::GFP linije z različnimi drugimi linijami in omogočilo raziskanje manj znanih vlog MSP [2].

==Viri==
[1] J. J. Kieber, ‘Tribute to Folke Skoog: Recent Advances in our Understanding of Cytokinin Biology’, J. Plant Growth Regul., vol. 21, no. 1, pp. 1–2, Mar. 2002, doi: 10.1007/s003440010059.

[2] E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.

[3] C. E. Hutchison and J. J. Kieber, ‘Cytokinin Signaling in Arabidopsis’, Plant Cell, vol. 14, no. suppl 1, pp. S47–S59, May 2002, doi: 10.1105/tpc.010444.

[4] B. Müller and J. Sheen, ‘Cytokinin and auxin interplay in root stem-cell specification during early embryogenesis’, Nature, vol. 453, no. 7198, pp. 1094–1097, Jun. 2008, doi: 10.1038/nature06943.

[5] M. Veerabagu et al., ‘The Arabidopsis B-type response regulator 18 homomerizes and positively regulates cytokinin responses’, Plant J. Cell Mol. Biol., vol. 72, no. 5, pp. 721–731, Dec. 2012, doi: 10.1111/j.1365-313X.2012.05101.x.

Robusten in občutljiv sintetični senzor za spremljanje transkripcijskega izhoda signalne mreže citokininov in planta

2020-05-17T21:46:52Z

Andrej Race:

''Povzeto po članku:'' [E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.]

Citokinini so razred fitohormonov, ki spodbujajo delitev celic v rastlinskih koreninah in poganjkih. Vključeni so predvsem v rasti in diferenciaciji celic, vplivajo pa tudi na apikalno prevlado, rast aksialinih brstov in staranje listov [1]. Citokinini sprožijo signalno kaskado večstopenjske fosforilacije (MSP). To pot sproži vezava citokinina na CHASE domeno hibridne histidin senzor kinaze. Posledično pride do avtofosforilacije receptorja na His ostanku in nadaljnji prenos fosfatne skupine na Asp ostanek v domeni oddajnika. Fosfat se nato prenese na fosfotransferni protein, ki se translocira v jedro in lahko nato fosforilira regulatorje odziva (ARR) tipa B. ARR so družina transkripcijskih faktorjev, ki sovpadajo v tip A, B ali C. Pripadniki razreda tipa B se vežejo na promotorje ciljnih genov preko njihove Myb-podobne DNA-vezavne domene in aktivirajo transkripcijo, medtem ko ARR-ji tipa A in tipa C zavirajo signalno aktivnost. Hkrati so ARR tipa A glavna tarča aktiviranih ARR-B, kar vzpostavi negativno povratno zanko na signalno pot. Opisano pot lahko tudi aktivirajo citokinin neodvisne kinaze 1 (CKI1) [2], [3].

==Analiza vpliva citokininov==
Največja težava, ki nastane pri raziskovanju vloge MSP, je da citokinini imajo kompleksno biosintezo, transport in razgradnjo, kar oteži določevanje distribucije aktivnih citokininov v rastlinah. Poleg tega, MSP lahko aktivirajo druge od citokininov neodvisne kinaze kot so CKI1. Zaradi tega je najboljši pristop vizualizacije transkripcijskega izražanja MSP s sintetičnim reporterjem, ki razkrije mesta delovanja med razvojem divjega tipa. ARR-B se vežejo na 9bp veliko sekvenco, ki ima ohranjeno 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' zaporedje. To ohranjeno zaporedje je omogočilo razvoj dvokomponentnega signalnega senzorja (TCS) z ponavljajočimi 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' vezavnimi mesti. Transgenske rastline, ki vsebujejo TCS promotor z zapisom za GFP (TCS::GFP), so omogočile ugotovitev novih, kot tudi boljše razumevanje že znanih vlog citokininov, ampak so se srečale z nekaterimi težavami. Izražanje s pomočjo TCS je šibko v nekaterih delih rastline kje imamo že imamo zabeleženo vlogo citokininov in izražanje GFP se postopoma zniža z zvišanjem generacije, verjetno zaradi vtišanja ponavljajočih se sekvenc TCS. Zaradi tega so v tem članku razvili izboljšano različico TCSn::GFP, ki se izogiba tem težavam in omogoča močnejši signal. TCS so predvsem optimizirali s spremembo števila vezavnih mest, spremembo faze in spremembo baz med motivi [2].

==Razvoj TCSn==
===Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS===
Analizirali so različna zaporedja TCS vezana z minimalnim 35S promotorjem in zaporedjem za luciferazo, ki so jih prehodno vstavili v primarne mezofilske protoplaste Arabidopsis thaliane z agronifiltracijo. Osnovna biokocka je vsebovala 4 motiva 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' ločenimi z poljubno izbranimi sosednjimi nukleotidi. Biokocke so narejene tako da vsebujejo motive smernih in inverznih ponovitev v vseh možnih orientaciah. Torej, tandemska ponovitev, glava na glavo in rep na rep. Pri 4 ponovitvah niso opazili bistvene razlike v primerjavi z kontorlo, med tem ko se minimalno izražanje pojavilo komaj po 8ih ponovitah. TCS s 16 ponovitev je omogočila podoben signal kot pri luciferazi vezani na ARR6 promotor, ki je sestavljen na osnovi 5' regulativne regije enega izmed ARR-A genov. Največje izražanje reporterja so opazili pri 24 ponovitvah motiva, kar nakazuje na močen kooperativni efekt med transkripcijskimi faktorji. Nadaljnje zvišanje števila motivov je imelo inhibitorni vpliv. Tako je zaporedje z 24 motivov bilo izbrano in dobilo ime TCS [2], [4]. Kooperacija ARR-jev tipa B je tudi bila dokazana in planta [5].

===Določanje faze===
Naslednje so raziskali kako sprememba baz motiva in sosednjih baz vpliva na izražanje reporterja. Razvili so različice TCS, TCS*, ki vsebuje mutacije v motivu in TCSfm, ki vsebuje mutacije v sosednjih bazah. Ugotovili so da so promotorji postali neobčutljivi na citokinine in da je verjetno in vitro določen motiv 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' nezadosten za prepoznavo z ARR-B in vivo. Zaradi tega je potrebno še optimizirati sosednje baze, kako bi izboljšali TCS [2].

===Določanje razdalja med motivi===
Testirali so še različice TCS, ki ima 9bp parov razdalje, z različnimi razdaljami med motivi in preverili njen vpliv na izražanje. Različica z 7bp razdalje je pokazala znižanje v aktivnosti, dokler je različica z 11 bp pokazala močnejšo aktivnost. To se sklada z dejstvom da DNA rabi 11 bp da naredi obrat v heliksu v njeni B konformaciji in da faziranje vezavnih mest s tem številom bp na splošno omogoča največjo aktivnost transkripcijskih faktorjev [2].

===Optimizacija s pomočjo bioinformatske analize===
Kako bi ugotovili katera vezavna mesta se nahajajo v divjih tipih Arabidopsis thaliane in s tem ugotovili kako da zvišajo izražanje in se izognejo vtišanju TCS, analizirali so vezavna mesta za ARR-B. Analizirali so 3kbp sekvenco navzgor od prepisanega zaporedja kot tudi prepisano zaporedje ARR-A genov, ker se tam ponavadi nahaja cis-regulativno zaporedje in iskali zaporedje 5'-(A/G)GAT(C/T)-3'. Čeprav je to zaporedje bolj pogosto v analiziranih sekvencah, še vedno bi se najdlo vsakič na 108bp v naključni DNA. Zaradi tega so zvišali specifičnost tako da so iskali motive, ki so odaljeni vsaj 6 bp, ker je dolžina samega motiva 5bp in ne več kot 30bp, ker so iskali motive v gručah. Ugotovili so da se motivi nahajajo na 7 do 14bp en od drugega v povprečju in da se smerne in inverzne ponovitve pojavijo enako pogosto. Dodanih je bilo po 3 bp na vsak konec iskanih motivov (poglej podpoglavlje Določanje faze). Sekvence, ki jih spremlja podaljšek 5', 5'-A-3' in/ali 3' podaljšek, 5'-T-3' se pojavljajo pogosteje. Ugotovili so tudi da se sekvenca 5'-AA(A/G)GAT(C/T)TT-3' izredno bolj pogosto nahaja v tarčnih genov citokininov v primerjavi z kontrolnimi geni. Na osnovi teh informacij ustvarili so 12 motivov (Tabela 1). Ti sintetični motivi so bili naključno združeni, da so dobili sintetično zaporedje, ki vsebuje 24 vezavnih mest v vseh mogočih orientacijah (poglej podpoglavje Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS). S tem razvojem so omogočili da je izražanje reporterskega gena bolj enakomerno in da ne pride do vtišanja zaradi monotonosti [2].

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 1: Motivi uporabljeni v TCSn'''
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|zaporedje
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT

|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |2
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GAGAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |3
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |4
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |5
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTAT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |6
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |7
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |8
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |9
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |10
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |11
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GTTGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |12
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |ATGGGATCTTG
|}

==Specifičnost in občutljivost TCSn==
Kako bi preverili občutljivost in specifičnost TCSn, trasficirali so protoplaste z TCSn konjugirano z luciferazo. Ugotovili so da se pojavi večji signal v primerjavi z TCS in da ne pride do nespecifičnega izražanja v prisotnosti nekaterih drugih fitohormonov. Kotransfekcija z ojačevalci MSP, kot so CKI1 in ARR tipa B je zvišala izražanje reporterja, medtem ko je kotransfekcija z ARR tipa A, torej inhibitorji MSP, znižala izražanje. Pri nekaterih ojačevalcih je prišlo do ojačanja signala v primerjavi z TSC, dokler je pri drugih ostalo isto. Specifičnost je tudi preverjena z transkripcijskimi faktorji, ki imajo podobno vezavno zaporedje kot ARR tipa B in ugotovljeno je da ne aktivirajo izražanje niti TCS niti TCSn. Do aktivacije pride tudi v monokaličnicah zaradi podobnosti ARR tipa-B genov pri vseh rastlinah. Analizirali so še izražanje reporterja v rastlinah, ki so bile transficirane z konstruktom TCSn::GFP in ugotovili da pride do močnejšega signala v primerjavi z tistimi rastlinami, ki so transficirane z TCS::GFP ARR5::GFP. V sadikah teh rastlin so inducirali CKI1 in ARR10:SRDX, ARR tipa B protein konjugiran z represorjem fosforilacije, ki vtiša MSP. V tistih z induciranim CKI1 je zabeležena vseprisotna aktivnost reporterja, dokler je v tistih z ekspresijo ARR10:SRDX zabeleženo utišanje GFP-ja. S temi analizami so potrdili da TSC specifično izraža aktivnost MSP. Poleg tega, po treh generacijah transgenih rastlin ni bilo opaziti zmanjšanja ravni GFP, kar kaže, da za razliko od TCS::GFP, TCSn::GFP ni podvržen vtišanju transgena [2].

==Vzorci izražanja TCSn::GFP==
Trasfekcija rastlin z TCSn::GFP je pokazala izražanje reporterja, ki se sklada z že znanimi vlogami citokininov. Poleg tega, za razliko od TCS::GFP, ekspresija TCSn::GFP je aktivna še v poznih stadijih ženske embriogeneze. V primerjavi z TCS::GFP, signal je bistveno slabši v suspenzorskih celicah in celic, ki nastanejo iz njih, dokler je signal močnejši pri provaskularnih in bodočih celicah meristema poganjka. Do tega pride, verjetno ker niti en promotor ni optimiziran da ga aktivirajo vsi ARR tipa B enako. TCS lahko odraža boljše pogoje vezave za skupino ARR tipa B, izraženih v suspenzorskih celicah, medtem ko se v vseh drugih tkivih zdi, da TCSn zagotavlja boljše pogoje. V drugih regijah je na splošno izražanje kvalitativno enako, ampak bolj močno kot v primerjavi z TCS::GFP [2].

==Zaključek==
Razvoj od TCS odvisne ekspresije reporterskih genov je omogočil izboljšanje do takrat znanih modelov in odkritje ne znanih funkcij citokininov. Ampak, pri njihovoj uporabi pride do težav. Zaradi tega je razvit TCSn, ki za razliko od TCS, ima večjo občutljivost na citokinine, bolj izbalansiran odgovor na različne ARR-je tipa B in ni podvžen vtišanju zaradi monotonosti sekvence. To bo tudi olajšalo ukrštanje TCSn::GFP linije z različnimi drugimi linijami in omogočilo raziskanje manj znanih vlog MSP [2].

==Viri==
[1] J. J. Kieber, ‘Tribute to Folke Skoog: Recent Advances in our Understanding of Cytokinin Biology’, J. Plant Growth Regul., vol. 21, no. 1, pp. 1–2, Mar. 2002, doi: 10.1007/s003440010059.

[2] E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.

[3] C. E. Hutchison and J. J. Kieber, ‘Cytokinin Signaling in Arabidopsis’, Plant Cell, vol. 14, no. suppl 1, pp. S47–S59, May 2002, doi: 10.1105/tpc.010444.

[4] B. Müller and J. Sheen, ‘Cytokinin and auxin interplay in root stem-cell specification during early embryogenesis’, Nature, vol. 453, no. 7198, pp. 1094–1097, Jun. 2008, doi: 10.1038/nature06943.

[5] M. Veerabagu et al., ‘The Arabidopsis B-type response regulator 18 homomerizes and positively regulates cytokinin responses’, Plant J. Cell Mol. Biol., vol. 72, no. 5, pp. 721–731, Dec. 2012, doi: 10.1111/j.1365-313X.2012.05101.x.

Robusten in občutljiv sintetični senzor za spremljanje transkripcijskega izhoda signalne mreže citokininov in planta

2020-05-17T21:40:20Z

Andrej Race: New page: ''Povzeto po članku:'' [E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output ...

''Povzeto po članku:'' [E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.]

Citokinini so razred fitohormonov, ki spodbujajo delitev celic v rastlinskih koreninah in poganjkih. Vključeni so predvsem v rasti in diferenciaciji celic, vplivajo pa tudi na apikalno prevlado, rast aksialinih brstov in staranje listov [1]. Citokinini sprožijo signalno kaskado večstopenjske fosforilacije (MSP). To pot sproži vezava citokinina na CHASE domeno hibridne histidin senzor kinaze. Posledično pride do avtofosforilacije receptorja na His ostanku in nadaljnji prenos fosfatne skupine na Asp ostanek v domeni oddajnika. Fosfat se nato prenese na fosfotransferni protein, ki se translocira v jedro in lahko nato fosforilira regulatorje odziva (ARR) tipa B. ARR so družina transkripcijskih faktorjev, ki sovpadajo v tip A, B ali C. Pripadniki razreda tipa B se vežejo na promotorje ciljnih genov preko njihove Myb-podobne DNA-vezavne domene in aktivirajo transkripcijo, medtem ko ARR-ji tipa A in tipa C zavirajo signalno aktivnost. Hkrati so ARR tipa A glavna tarča aktiviranih ARR-B, kar vzpostavi negativno povratno zanko na signalno pot. Opisano pot lahko tudi aktivirajo citokinin neodvisne kinaze 1 (CKI1) [2], [3].

==Analiza vpliva citokininov==
Največja težava, ki nastane pri raziskovanju vloge MSP, je da citokinini imajo kompleksno biosintezo, transport in razgradnjo, kar oteži določevanje distribucije aktivnih citokininov v rastlinah. Poleg tega, MSP lahko aktivirajo druge od citokininov neodvisne kinaze kot so CKI1. Zaradi tega je najboljši pristop vizualizacije transkripcijskega izražanja MSP s sintetičnim reporterjem, ki razkrije mesta delovanja med razvojem divjega tipa. ARR-B se vežejo na 9bp veliko sekvenco, ki ima ohranjeno 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' zaporedje. To ohranjeno zaporedje je omogočilo razvoj dvokomponentnega signalnega senzorja (TCS) z ponavljajočimi 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' vezavnimi mesti. Transgenske rastline, ki vsebujejo TCS promotor z zapisom za GFP (TCS::GFP), so omogočile ugotovitev novih, kot tudi boljše razumevanje že znanih vlog citokininov, ampak so se srečale z nekaterimi težavami. Izražanje s pomočjo TCS je šibko v nekaterih delih rastline kje imamo že imamo zabeleženo vlogo citokininov in izražanje GFP se postopoma zniža z zvišanjem generacije, verjetno zaradi vtišanja ponavljajočih se sekvenc TCS. Zaradi tega so v tem članku razvili izboljšano različico TCSn::GFP, ki se izogiba tem težavam in omogoča močnejši signal. TCS so predvsem optimizirali s spremembo števila vezavnih mest, spremembo faze in spremembo baz med motivi [2].

==Razvoj TCSn==
===Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS===
Analizirali so različna zaporedja TCS vezana z minimalnim 35S promotorjem in zaporedjem za luciferazo, ki so jih prehodno vstavili v primarne mezofilske protoplaste Arabidopsis thaliane z agronifiltracijo. Osnovna biokocka je vsebovala 4 motiva 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' ločenimi z poljubno izbranimi sosednjimi nukleotidi. Biokocke so narejene tako da vsebujejo motive smernih in inverznih ponovitev v vseh možnih orientaciah. Torej, tandemska ponovitev, glava na glavo in rep na rep. Pri 4 ponovitvah niso opazili bistvene razlike v primerjavi z kontorlo, med tem ko se minimalno izražanje pojavilo komaj po 8ih ponovitah. TCS s 16 ponovitev je omogočila podoben signal kot pri luciferazi vezani na ARR6 promotor, ki je sestavljen na osnovi 5' regulativne regije enega izmed ARR-A genov. Največje izražanje reporterja so opazili pri 24 ponovitvah motiva, kar nakazuje na močen kooperativni efekt med transkripcijskimi faktorji. Nadaljnje zvišanje števila motivov je imelo inhibitorni vpliv. Tako je zaporedje z 24 motivov bilo izbrano in dobilo ime TCS [2], [4]. Kooperacija ARR-jev tipa B je tudi bila dokazana in planta [5].

===Določanje faze===
Naslednje so raziskali kako sprememba baz motiva in sosednjih baz vpliva na izražanje reporterja. Razvili so različice TCS, TCS*, ki vsebuje mutacije v motivu in TCSfm, ki vsebuje mutacije v sosednjih bazah. Ugotovili so da so promotorji postali neobčutljivi na citokinine in da je verjetno in vitro določen motiv 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' nezadosten za prepoznavo z ARR-B in vivo. Zaradi tega je potrebno še optimizirati sosednje baze, kako bi izboljšali TCS [2].

===Določanje razdalja med motivi===
Testirali so še različice TCS, ki ima 9bp parov razdalje, z različnimi razdaljami med motivi in preverili njen vpliv na izražanje. Različica z 7bp razdalje je pokazala znižanje v aktivnosti, dokler je različica z 11 bp pokazala močnejšo aktivnost. To se sklada z dejstvom da DNA rabi 11 bp da naredi obrat v heliksu v njeni B konformaciji in da faziranje vezavnih mest s tem številom bp na splošno omogoča največjo aktivnost transkripcijskih faktorjev [2].

===Optimizacija s pomočjo bioinformatske analize===
Kako bi ugotovili katera vezavna mesta se nahajajo v divjih tipih Arabidopsis thaliane in s tem ugotovili kako da zvišajo izražanje in se izognejo vtišanju TCS, analizirali so vezavna mesta za ARR-B. Analizirali so 3kbp sekvenco navzgor od prepisanega zaporedja kot tudi prepisano zaporedje ARR-A genov, ker se tam ponavadi nahaja cis-regulativno zaporedje in iskali zaporedje 5'-(A/G)GAT(C/T)-3'. Čeprav je to zaporedje bolj pogosto v analiziranih sekvencah, še vedno bi se najdlo vsakič na 108bp v naključni DNA. Zaradi tega so zvišali specifičnost tako da so iskali motive, ki so odaljeni vsaj 6 bp, ker je dolžina samega motiva 5bp in ne več kot 30bp, ker so iskali motive v gručah. Ugotovili so da se motivi nahajajo na 7 do 14bp en od drugega v povprečju in da se smerne in inverzne ponovitve pojavijo enako pogosto. Dodanih je bilo po 3 bp na vsak konec iskanih motivov (poglej podpoglavlje Določanje faze). Sekvence, ki jih spremlja podaljšek 5', 5'-A-3' in/ali 3' podaljšek, 5'-T-3' se pojavljajo pogosteje. Ugotovili so tudi da se sekvenca 5'-AA(A/G)GAT(C/T)TT-3' izredno bolj pogosto nahaja v tarčnih genov citokininov v primerjavi z kontrolnimi geni. Na osnovi teh informacij ustvarili so 12 motivov (Tabela 1). Ti sintetični motivi so bili naključno združeni, da so dobili sintetično zaporedje, ki vsebuje 24 vezavnih mest v vseh mogočih orientacijah (poglej podpoglavje Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS). S tem razvojem so omogočili da je izražanje reporterskega gena bolj enakomerno in da ne pride do vtišanja zaradi monotonosti [2].

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 1: Motivi uporabljeni v TCSn'''
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|zaporedje
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT

|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |2
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GAGAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |3
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |4
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |5
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTAT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |6
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |7
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |8
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |9
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |10
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |11
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GTTGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |12
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |ATGGGATCTTG
|}

==Specifičnost in občutljivost TCSn==
Kako bi preverili občutljivost in specifičnost TCSn, trasficirali so protoplaste z TCSn konjugirano z luciferazo. Ugotovili so da se pojavi večji signal v primerjavi z TCS in da ne pride do nespecifičnega izražanja v prisotnosti nekaterih drugih fitohormonov. Kotransfekcija z ojačevalci MSP, kot so CKI1 in ARR tipa B je zvišala izražanje reporterja, medtem ko je kotransfekcija z ARR tipa A, torej inhibitorji MSP, znižala izražanje. Pri nekaterih ojačevalcih je prišlo do ojačanja signala v primerjavi z TSC, dokler je pri drugih ostalo isto. Specifičnost je tudi preverjena z transkripcijskimi faktorji, ki imajo podobno vezavno zaporedje kot ARR tipa B in ugotovljeno je da ne aktivirajo izražanje niti TCS niti TCSn. Do aktivacije pride tudi v monokaličnicah zaradi podobnosti ARR tipa-B genov pri vseh rastlinah. Analizirali so še izražanje reporterja v rastlinah, ki so bile transficirane z konstruktom TCSn::GFP in ugotovili da pride do močnejšega signala v primerjavi z tistimi rastlinami, ki so transficirane z TCS::GFP ARR5::GFP. V sadikah teh rastlin so inducirali CKI1 in ARR10:SRDX, ARR tipa B protein konjugiran z represorjem fosforilacije, ki vtiša MSP. V tistih z induciranim CKI1 je zabeležena vseprisotna aktivnost reporterja, dokler je v tistih z ekspresijo ARR10:SRDX zabeleženo utišanje GFP-ja. S temi analizami so potrdili da TSC specifično izraža aktivnost MSP. Poleg tega, po treh generacijah transgenih rastlin ni bilo opaziti zmanjšanja ravni GFP, kar kaže, da za razliko od TCS::GFP, TCSn::GFP ni podvržen vtišanju transgena [2].

==Vzorci izražanja TCSn::GFP==
Trasfekcija rastlin z TCSn::GFP je pokazala izražanje reporterja, ki se sklada z že znanimi vlogami citokininov. Poleg tega, za razliko od TCS::GFP, ekspresija TCSn::GFP je aktivna še v poznih stadijih ženske embriogeneze. V primerjavi z TCS::GFP, signal je bistveno slabši v suspenzorskih celicah in celic, ki nastanejo iz njih, dokler je signal močnejši pri provaskularnih in bodočih celicah meristema poganjka. Do tega pride, verjetno ker niti en promotor ni optimiziran da ga aktivirajo vsi ARR tipa B enako. TCS lahko odraža boljše pogoje vezave za skupino ARR tipa B, izraženih v suspenzorskih celicah, medtem ko se v vseh drugih tkivih zdi, da TCSn zagotavlja boljše pogoje. V drugih regijah je na splošno izražanje kvalitativno enako, ampak bolj močno kot v primerjavi z TCS::GFP [2].

==Zaključek==
Razvoj od TCS odvisne ekspresije reporterskih genov je omogočil izboljšanje do takrat znanih modelov in odkritje ne znanih funkcij citokininov. Ampak, pri njihovoj uporabi pride do težav. Zaradi tega je razvit TCSn, ki za razliko od TCS, ima večjo občutljivost na citokinine, bolj izbalansiran odgovor na različne ARR-je tipa B in ni podvžen vtišanju zaradi monotonosti sekvence. To bo tudi olajšalo ukrštanje TCSn::GFP linije z različnimi drugimi linijami in omogočilo raziskanje manj znanih vlog MSP [2].

==Viri==
[1] J. J. Kieber, ‘Tribute to Folke Skoog: Recent Advances in our Understanding of Cytokinin Biology’, J. Plant Growth Regul., vol. 21, no. 1, pp. 1–2, Mar. 2002, doi: 10.1007/s003440010059.
[2] E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.
[3] C. E. Hutchison and J. J. Kieber, ‘Cytokinin Signaling in Arabidopsis’, Plant Cell, vol. 14, no. suppl 1, pp. S47–S59, May 2002, doi: 10.1105/tpc.010444.
[4] B. Müller and J. Sheen, ‘Cytokinin and auxin interplay in root stem-cell specification during early embryogenesis’, Nature, vol. 453, no. 7198, pp. 1094–1097, Jun. 2008, doi: 10.1038/nature06943.
[5] M. Veerabagu et al., ‘The Arabidopsis B-type response regulator 18 homomerizes and positively regulates cytokinin responses’, Plant J. Cell Mol. Biol., vol. 72, no. 5, pp. 721–731, Dec. 2012, doi: 10.1111/j.1365-313X.2012.05101.x.

Parvovirusi in sorodni ssDNA-virusi

2018-04-15T16:37:53Z

Andrej Race: /* Integracija AAV v gostiteljsko DNA */

==ssDNA virusi==
Virusi, ki vsebujejo enoverižno DNA so zelo razširjeni v okolju. Prisotni so v morski vodi, v sladki vodi, v sedimentih in v ekstremnih okoljih. Enoverižen genom, ki ga vsebujejo parvovirusi je negativno nabit.
Virusi ssDNA so razvili različne mehanizme za napad na celične genome, ki se pretežno razlikujejo med virusi, ki okužijo bakterije in evkarionte.

==Parvovirusi==
Virusi iz družine Parvoviridae so najenostavnejši živalski in človeški DNA virusi. Latinska beseda 'parvus' razlaga njihovo najbolj pomembno lastnost, da so majhni. Ta lastnost veliko vpliva na njihovo pomnoževanje, ki je v velikem odvisno od celičnih mehanizmov gostitelja.
Poznamo več kot 50 tipov parvovirusov, ki so razdeljeni v dve poddružini: Parvoviridae, ki okužijo vretenčarje in Densoviridae, ki so karakteristični za okužbo členonožcev in zuželk.
Poddružina Parvoviridae je nadalje razdeljena na pet rodov: amidovirusi, bokavirusi, dependovirusi, eritrovirusi in humani parvovirusi. Večina parvovirusov, kot so eritrovirusi, se podvojuje avtonomno, pri nekaterih pa virusno pomnoževanje ni možno brez sočasne prisotnosti virusov pomočnikov. Primer virusov, odvisnih od virusov pomočnikov so dependovirusi oz. adeno povezani virusi (AAV).

==Struktura parvovirusov==
Parvovirusi so majni, ikozaedrični virusi brez ovojnice, s premerom okrog 26 nm. Genom parvovirusa predstavlja linearna enovijačna DNA, velikosti približno 3 000 -5 000 baz. Svojo nukleinsko kislino virusi ščitijo s posebnim membranskim plaščom, kapsidom. Ta embalaža mora biti dovolj odporna, da zaščiti genom pred zunanjimi vplivi, ampak istočasno ustrezno labilna, da se lahko vsebina sprosti, ko pride v primerno okolje. Strukture kapsidov za več parvovirusov so bile določene z rentgensko kristalografijo in krioelektronsko mikroskopijo. Virusni proteini, VP1, VP2 in VP3, ki sestavljajo kapsido vsebujejo ohranjene in varijabilne regije (VR). Ohranjene regije so β-sodček in α-vijačni del. Biokemijske in strukturne raziskave kažejo da so ostanki v VR regijah zelo pomembni pri vezavi virusa na virusne receptorje in pri celotni virusni okužbi. Za površino kapsidov so značilne številne depresije in izbokline, ki pomagajo pri vezavi virusa na gostiteljsko celico. Proteinski plašč in nukleinska kislina skupa činijo nukleokapsid.
Nekateri parvorisusi so s časom formirali dodatno zaščito, v obliki dodatke lipidne opne.

==Vezava na gostiteljsko celico==
Različni virusi so razvili različne poti za okužbo gostiteljskih celic. Okužba celic je običajno večstopenjski proces, katerega je prvi korak vezava virusa na celično površino. Pritrditev virus na gostiteljsko celico je posredovana preko virusnih površinskih komponent (površine kapside), ki se vežejo na specifične molekule na površini gostiteljsko celice, kot so membranski proteini, lipidi ali ogljikovi hidrati.
Za identifikacijo kapsidnih aminokislinskih ostankov, ki prepoznajo receptorje na površini celične membrane so uporabljene analize vezave celic, transdukcijske analize in strukturni procesi. Analize so pokazale da obstajajo mesta v VR regijah kapside AAV, ki služijo kot vezavne regije, neodvisno od prepoznanega glikana.
Virusi prepoznajo glikane na površini kot primarne receptorje.
Adeno vezani virusi, oz. dependovirusi (AAV2, AAV3, AAV6 in AAV13) se vežejo na heparan sulfat preoteoglikan (HSPG). AAV1, AAV4 in AAV5 vežejo sialno kislino med okužbo celic, AAV9 pa N-vezavno galaktozo (GAL).
Glikan glikoforin je karakterističen za avtonomni parvorisus, bokavirus. B19 eritrovirus pa se veže na glikosfingolipidni eritroitni P antigen (glubosid Gb4) .
Vezavna mesta za glikane se prekrivajo z učinkovitostjo transdukcije in patogenosti virusov.

==Vstop virusa v okuženo celico==
Celica nalaga veliko ovir za vnos virusa. Kljub temu, virusi izkoriščajo temeljne celične procese da vstopijo i sprostijo svoj genski tovor. Vsi parvovirusi potrebujejo receptorsko posredovano endocitozo za okužbo celic. Po vezavi virusa na receptorje se virus obvije s klatrini, in na ta način formira klatrinski vezikel. Temu sledi vstop vezikla v celico, pot do zgodnjega endosoma in poznega endosoma. Klatrinski plašč se odstrani in se virus sprosti v citosol.
Ko so v notranjosti celice, kapside se spremenijo, pri čemer izpostavijo N končna dela kapsidnih proteina VP1 in VP2 in 3' konec virusnega genoma. Na kapside vpliva protealitična aktivnost proteasomov, in se takrat verjetno formira tretji kapsidni protein VP3. Izpostavljen N-končni del VP1 kapsidnega proteina bo služil kot jedrni lokalizacijski signal.
Virusi, ki se podvojujejo v jedru, potrebujejo mehanizme za prenos kapside in genoma do jedrnih por. V citoplazmi je prisoten citoskelet, čigave komponente virus izkorišča kot tire do jedra. Številni eksperimenti so pokazali da CPV (cannine parvovirus) kapside znotraj citoplazme potrebovali 3 do 6 ur da bi vstopile v jedro.
Prevoz do jedra so preprečili z depolimerizacijo mikrotubulov in blokiranjem motoričnega proteina mikrotubulov, dineina, ki prenaša tovor proti minus koncu mikrotubula, ki je v neposredni bližini jedra. S tem so ugotovili da so mikrotubuli in dineini ključni za prenos kapside virusa do jedra. Virus ssDNA je dovolj majhen da vstopi v jedro preko jedrsko pornog kompleksa (NPC). Večji, dsDNA virusi, pa potrebujejo importin za vstop v jedro.

==Vstop v jedro==
Transport kapsida je omogočen s pomočjo ATP in Ran-1 proteina. Tisti kapsidi, ki pridejo v celico imajo 20 do 30 nukleotidov izpostavljenih v obliki špange, kateri nastajajo zaradi končnih obrnjenih ponovitev. Končne obrnjene ponovitve, ali TIR (terminal inverted repeats), so sestavljene iz palindromskih sekvencah ki so večinoma enake s obe strani genoma. Ta izpostavljen del DNA služi kod začetni oligonukleotid s pomočjo katerega popravljalni encimi okužene celice pretvorijo ssDNA virusa v dsDNA, dsDNA virusa je potem pripravljena za transkripcijo in translacijo s pomočjo celičnih proteinov. TIR omogoča tudi istočasno sproščanje virusnega DNA brez razstavljanja kapsida.

==Ekspresija genov==
Genom je podeljen v dva dela, desna stran kodira strukturne proteine, leva pa regulatorne. Število promotorjev se razlikuje od vrste do vrste (od 1 do 3). Zaradi izredno majhne dolžine genoma, če je več promotorjev, oni se prekrivajo. Genom pravovirusov kodira regulatorne in strukturne proteine s prekrivajočim se sekvencami, kar je omogočeno s pomočjo alternativnega izrezovanja intronov oz. spajanja eksonov. Izražanje genov pa regulirajo proteini rep (naziv so dobili ker mutacija gena za izražanje tega proteina tudi onemogoča replikacijo virusne DNA) pri AAV in NS (non structural) pri samostojnih virusih. Večina regulatornih proteinov se ne vežejo direktno na DNA, ampak aktivirajo ali inhibirajo proteine v inficirani celici, kar povzroča manjše ali večje izražanje določenih genov na virusni DNA. Poleg tega, strukturni proteini so tudi pokazali da imajo vlogo v regulaciji gena.

AAV imajo značilno karakteristiko da v večini zdravih celicah nimajo sposobnost normalne aktivnosti translacije in transkripcije dokler celica ne pride v toksično okolje. Toksično okolje so lahko ekstremne temperature, UV radiacija ali kemijski kancerogeni, ampak najbolj učinkovit aktivator AAV so adenovirusi in herpsvirusi. Geni tistih virusov imajo več vlog za AAV. Ampak, vpliv tih genov ni nujen, AAV bo stabilno bival v celici dokler je celica zdrava, ko se pojavijo znaki poškodovanja celice replikacija AAV se aktivira in virus išče novega gostitelja. Pri translaciji AAV gena za VP2 lahko pride do leaky scanning (prepuščajočeg skeniranja) pri čemer se translacija ne začne na slabem začetnem ACG kodonu da bi potem nastal VP2, ampak na močnem AUG in nastane VP3.

==Replikacija==
ssDNA virusi uporabljajo tako imenovan “rolling hairpin” mehanizem za svojo replikacijo ( https://viralzone.expasy.org/resources/ssstrand_displacement.jpg ). Ta mehanizem ima dve specifične karakteristike. Prva je da se TIR lahko uporablja kot začetni oligonukleotid za začetek replikacije in druga je da ni zaostajajoče verige pri replikaciji. Replikacija je aktivna samo med S fazo celičnega cikla za samostojne viruse in v toksičnih pogojih za AAV. Aktivira je virusna endonukleaza rep pri AAV ali NS1 pri samostojnih virusih. Rep naredi zasek med kodirajočo regijo in TIR regijo na 5’ koncu. Ta zasek omogoča pomik verige in začetek translacije. Ko se en cikel replikacije konča virusi kateri imajo enake, ali podobne končne obrnjene ponovitve proizvajajo enako število ssDNA+ in ssDNA-. Tisti virusi ki nimajo podobne končne obrnjene ponovitve pa proizvajajo večinoma ssDNA- verige, dokler se ssDNA+ reciklira za nov cikel.

==Integracija AAV v gostiteljsko DNA==
AAV ima preferenco za določeno regijo na ljudskem kromosomu, AAVS1, ampak se tudi veže na druge regije ki imajo zavezujoči motiv za rep protein vključen v integracijo virusa. Ta motiv se tudi nahaja na delu v obliki špange AAV virusa in je sestavljen iz Rep-zavezujočeg mesta(RBS, rep-binding site) in končnega resolucijskega mesta (TRS, terminal resolution site). Rep protein ima sposobnost da veže istočasno TRS regijo AAV DNA in DNA gostitelja pri čemer privezuje oba genoma.

==Rakotvornost==
Za razliko od ostalih DNA virusov kateri lahko vzpostavijo stabilen odnos z gostiteljsko celico, parvovirusi niso pokazali rakotvorna dejstva, nasprotno, pokazili so tudi da lahko imajo preventivni efekt. Ta značilnost, predvsem dependovirusov, je omogočena zaradi toksične sredine v kateri se treba nahajati virus da bi prišlo do replikacije. To sredino lahko najdemo predvsem v transformiranih in kancerogenih celicah. Reprodukcija AAV bo imela negativen vpliv na te celice in s tem bo prispevala do upočasnitve tumorigeneze.

==Viri==
*Berns, K. I. (1990) ‘Parvovirus Replication’, MICROBIOLOGICAL REVIEWS, 54(3), pp. 316–329. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC372780/pdf/microrev00038-0114.pdf (Accessed: 12 April 2018).
*Grove, J. and Marsh, M. (2011) ‘The cell biology of receptor-mediated virus entry’, Journal of Cell Biology, 195(7), pp. 1071–1082. doi: 10.1083/jcb.201108131.
*Huang, L. Y., Halder, S. and Agbandje-Mckenna, M. (2014) ‘Parvovirus glycan interactions’, Current Opinion in Virology. Elsevier B.V., 7(1), pp. 108–118. doi: 10.1016/j.coviro.2014.05.007.
*Krupovic, M. and Forterre, P. (2015) ‘Single-stranded DNA viruses employ a variety of mechanisms for integration into host genomes’, Annals of the New York Academy of Sciences, 1341(1), pp. 41–53. doi: 10.1111/nyas.12675.
*Vihinen-Ranta, M., Suikkanen, S. and Parrish, C. R. (2004) ‘Pathways of cell infection by parvoviruses and adeno-associated viruses.’, Journal of virology. American Society for Microbiology, 78(13), pp. 6709–14. doi: 10.1128/JVI.78.13.6709-6714.2004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Parvovirusi in sorodni ssDNA-virusi

2018-04-15T16:35:05Z

Andrej Race: /* Integracija AAV v gostiteljsko DNA */

==ssDNA virusi==
Virusi, ki vsebujejo enoverižno DNA so zelo razširjeni v okolju. Prisotni so v morski vodi, v sladki vodi, v sedimentih in v ekstremnih okoljih. Enoverižen genom, ki ga vsebujejo parvovirusi je negativno nabit.
Virusi ssDNA so razvili različne mehanizme za napad na celične genome, ki se pretežno razlikujejo med virusi, ki okužijo bakterije in evkarionte.

==Parvovirusi==
Virusi iz družine Parvoviridae so najenostavnejši živalski in človeški DNA virusi. Latinska beseda 'parvus' razlaga njihovo najbolj pomembno lastnost, da so majhni. Ta lastnost veliko vpliva na njihovo pomnoževanje, ki je v velikem odvisno od celičnih mehanizmov gostitelja.
Poznamo več kot 50 tipov parvovirusov, ki so razdeljeni v dve poddružini: Parvoviridae, ki okužijo vretenčarje in Densoviridae, ki so karakteristični za okužbo členonožcev in zuželk.
Poddružina Parvoviridae je nadalje razdeljena na pet rodov: amidovirusi, bokavirusi, dependovirusi, eritrovirusi in humani parvovirusi. Večina parvovirusov, kot so eritrovirusi, se podvojuje avtonomno, pri nekaterih pa virusno pomnoževanje ni možno brez sočasne prisotnosti virusov pomočnikov. Primer virusov, odvisnih od virusov pomočnikov so dependovirusi oz. adeno povezani virusi (AAV).

==Struktura parvovirusov==
Parvovirusi so majni, ikozaedrični virusi brez ovojnice, s premerom okrog 26 nm. Genom parvovirusa predstavlja linearna enovijačna DNA, velikosti približno 3 000 -5 000 baz. Svojo nukleinsko kislino virusi ščitijo s posebnim membranskim plaščom, kapsidom. Ta embalaža mora biti dovolj odporna, da zaščiti genom pred zunanjimi vplivi, ampak istočasno ustrezno labilna, da se lahko vsebina sprosti, ko pride v primerno okolje. Strukture kapsidov za več parvovirusov so bile določene z rentgensko kristalografijo in krioelektronsko mikroskopijo. Virusni proteini, VP1, VP2 in VP3, ki sestavljajo kapsido vsebujejo ohranjene in varijabilne regije (VR). Ohranjene regije so β-sodček in α-vijačni del. Biokemijske in strukturne raziskave kažejo da so ostanki v VR regijah zelo pomembni pri vezavi virusa na virusne receptorje in pri celotni virusni okužbi. Za površino kapsidov so značilne številne depresije in izbokline, ki pomagajo pri vezavi virusa na gostiteljsko celico. Proteinski plašč in nukleinska kislina skupa činijo nukleokapsid.
Nekateri parvorisusi so s časom formirali dodatno zaščito, v obliki dodatke lipidne opne.

==Vezava na gostiteljsko celico==
Različni virusi so razvili različne poti za okužbo gostiteljskih celic. Okužba celic je običajno večstopenjski proces, katerega je prvi korak vezava virusa na celično površino. Pritrditev virus na gostiteljsko celico je posredovana preko virusnih površinskih komponent (površine kapside), ki se vežejo na specifične molekule na površini gostiteljsko celice, kot so membranski proteini, lipidi ali ogljikovi hidrati.
Za identifikacijo kapsidnih aminokislinskih ostankov, ki prepoznajo receptorje na površini celične membrane so uporabljene analize vezave celic, transdukcijske analize in strukturni procesi. Analize so pokazale da obstajajo mesta v VR regijah kapside AAV, ki služijo kot vezavne regije, neodvisno od prepoznanega glikana.
Virusi prepoznajo glikane na površini kot primarne receptorje.
Adeno vezani virusi, oz. dependovirusi (AAV2, AAV3, AAV6 in AAV13) se vežejo na heparan sulfat preoteoglikan (HSPG). AAV1, AAV4 in AAV5 vežejo sialno kislino med okužbo celic, AAV9 pa N-vezavno galaktozo (GAL).
Glikan glikoforin je karakterističen za avtonomni parvorisus, bokavirus. B19 eritrovirus pa se veže na glikosfingolipidni eritroitni P antigen (glubosid Gb4) .
Vezavna mesta za glikane se prekrivajo z učinkovitostjo transdukcije in patogenosti virusov.

==Vstop virusa v okuženo celico==
Celica nalaga veliko ovir za vnos virusa. Kljub temu, virusi izkoriščajo temeljne celične procese da vstopijo i sprostijo svoj genski tovor. Vsi parvovirusi potrebujejo receptorsko posredovano endocitozo za okužbo celic. Po vezavi virusa na receptorje se virus obvije s klatrini, in na ta način formira klatrinski vezikel. Temu sledi vstop vezikla v celico, pot do zgodnjega endosoma in poznega endosoma. Klatrinski plašč se odstrani in se virus sprosti v citosol.
Ko so v notranjosti celice, kapside se spremenijo, pri čemer izpostavijo N končna dela kapsidnih proteina VP1 in VP2 in 3' konec virusnega genoma. Na kapside vpliva protealitična aktivnost proteasomov, in se takrat verjetno formira tretji kapsidni protein VP3. Izpostavljen N-končni del VP1 kapsidnega proteina bo služil kot jedrni lokalizacijski signal.
Virusi, ki se podvojujejo v jedru, potrebujejo mehanizme za prenos kapside in genoma do jedrnih por. V citoplazmi je prisoten citoskelet, čigave komponente virus izkorišča kot tire do jedra. Številni eksperimenti so pokazali da CPV (cannine parvovirus) kapside znotraj citoplazme potrebovali 3 do 6 ur da bi vstopile v jedro.
Prevoz do jedra so preprečili z depolimerizacijo mikrotubulov in blokiranjem motoričnega proteina mikrotubulov, dineina, ki prenaša tovor proti minus koncu mikrotubula, ki je v neposredni bližini jedra. S tem so ugotovili da so mikrotubuli in dineini ključni za prenos kapside virusa do jedra. Virus ssDNA je dovolj majhen da vstopi v jedro preko jedrsko pornog kompleksa (NPC). Večji, dsDNA virusi, pa potrebujejo importin za vstop v jedro.

==Vstop v jedro==
Transport kapsida je omogočen s pomočjo ATP in Ran-1 proteina. Tisti kapsidi, ki pridejo v celico imajo 20 do 30 nukleotidov izpostavljenih v obliki špange, kateri nastajajo zaradi končnih obrnjenih ponovitev. Končne obrnjene ponovitve, ali TIR (terminal inverted repeats), so sestavljene iz palindromskih sekvencah ki so večinoma enake s obe strani genoma. Ta izpostavljen del DNA služi kod začetni oligonukleotid s pomočjo katerega popravljalni encimi okužene celice pretvorijo ssDNA virusa v dsDNA, dsDNA virusa je potem pripravljena za transkripcijo in translacijo s pomočjo celičnih proteinov. TIR omogoča tudi istočasno sproščanje virusnega DNA brez razstavljanja kapsida.

==Ekspresija genov==
Genom je podeljen v dva dela, desna stran kodira strukturne proteine, leva pa regulatorne. Število promotorjev se razlikuje od vrste do vrste (od 1 do 3). Zaradi izredno majhne dolžine genoma, če je več promotorjev, oni se prekrivajo. Genom pravovirusov kodira regulatorne in strukturne proteine s prekrivajočim se sekvencami, kar je omogočeno s pomočjo alternativnega izrezovanja intronov oz. spajanja eksonov. Izražanje genov pa regulirajo proteini rep (naziv so dobili ker mutacija gena za izražanje tega proteina tudi onemogoča replikacijo virusne DNA) pri AAV in NS (non structural) pri samostojnih virusih. Večina regulatornih proteinov se ne vežejo direktno na DNA, ampak aktivirajo ali inhibirajo proteine v inficirani celici, kar povzroča manjše ali večje izražanje določenih genov na virusni DNA. Poleg tega, strukturni proteini so tudi pokazali da imajo vlogo v regulaciji gena.

AAV imajo značilno karakteristiko da v večini zdravih celicah nimajo sposobnost normalne aktivnosti translacije in transkripcije dokler celica ne pride v toksično okolje. Toksično okolje so lahko ekstremne temperature, UV radiacija ali kemijski kancerogeni, ampak najbolj učinkovit aktivator AAV so adenovirusi in herpsvirusi. Geni tistih virusov imajo več vlog za AAV. Ampak, vpliv tih genov ni nujen, AAV bo stabilno bival v celici dokler je celica zdrava, ko se pojavijo znaki poškodovanja celice replikacija AAV se aktivira in virus išče novega gostitelja. Pri translaciji AAV gena za VP2 lahko pride do leaky scanning (prepuščajočeg skeniranja) pri čemer se translacija ne začne na slabem začetnem ACG kodonu da bi potem nastal VP2, ampak na močnem AUG in nastane VP3.

==Replikacija==
ssDNA virusi uporabljajo tako imenovan “rolling hairpin” mehanizem za svojo replikacijo ( https://viralzone.expasy.org/resources/ssstrand_displacement.jpg ). Ta mehanizem ima dve specifične karakteristike. Prva je da se TIR lahko uporablja kot začetni oligonukleotid za začetek replikacije in druga je da ni zaostajajoče verige pri replikaciji. Replikacija je aktivna samo med S fazo celičnega cikla za samostojne viruse in v toksičnih pogojih za AAV. Aktivira je virusna endonukleaza rep pri AAV ali NS1 pri samostojnih virusih. Rep naredi zasek med kodirajočo regijo in TIR regijo na 5’ koncu. Ta zasek omogoča pomik verige in začetek translacije. Ko se en cikel replikacije konča virusi kateri imajo enake, ali podobne končne obrnjene ponovitve proizvajajo enako število ssDNA+ in ssDNA-. Tisti virusi ki nimajo podobne končne obrnjene ponovitve pa proizvajajo večinoma ssDNA- verige, dokler se ssDNA+ reciklira za nov cikel.

==Integracija AAV v gostiteljsko DNA==
AAV ima preferenco za določeno regijo na ljudskem kromosomu, AAVS1, ampak se tudi veže na druge regije ki imajo zavezujoči motiv za rep protein vključen v integracijo virusa. Ta motiv se tudi nahaja na delu v obliki špange AAV virusa in je sestavljen iz Rep-zavezujočeg mesta(RBS, rep-binding site) in končneg resolucijskeg mesta (TRS, terminal resolution site). Rep protein ima sposobnost da veže istočasno TRS regijo AAV DNA in DNA gostitelja pri čemer privezuje oba genoma.

==Rakotvornost==
Za razliko od ostalih DNA virusov kateri lahko vzpostavijo stabilen odnos z gostiteljsko celico, parvovirusi niso pokazali rakotvorna dejstva, nasprotno, pokazili so tudi da lahko imajo preventivni efekt. Ta značilnost, predvsem dependovirusov, je omogočena zaradi toksične sredine v kateri se treba nahajati virus da bi prišlo do replikacije. To sredino lahko najdemo predvsem v transformiranih in kancerogenih celicah. Reprodukcija AAV bo imela negativen vpliv na te celice in s tem bo prispevala do upočasnitve tumorigeneze.

==Viri==
*Berns, K. I. (1990) ‘Parvovirus Replication’, MICROBIOLOGICAL REVIEWS, 54(3), pp. 316–329. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC372780/pdf/microrev00038-0114.pdf (Accessed: 12 April 2018).
*Grove, J. and Marsh, M. (2011) ‘The cell biology of receptor-mediated virus entry’, Journal of Cell Biology, 195(7), pp. 1071–1082. doi: 10.1083/jcb.201108131.
*Huang, L. Y., Halder, S. and Agbandje-Mckenna, M. (2014) ‘Parvovirus glycan interactions’, Current Opinion in Virology. Elsevier B.V., 7(1), pp. 108–118. doi: 10.1016/j.coviro.2014.05.007.
*Krupovic, M. and Forterre, P. (2015) ‘Single-stranded DNA viruses employ a variety of mechanisms for integration into host genomes’, Annals of the New York Academy of Sciences, 1341(1), pp. 41–53. doi: 10.1111/nyas.12675.
*Vihinen-Ranta, M., Suikkanen, S. and Parrish, C. R. (2004) ‘Pathways of cell infection by parvoviruses and adeno-associated viruses.’, Journal of virology. American Society for Microbiology, 78(13), pp. 6709–14. doi: 10.1128/JVI.78.13.6709-6714.2004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Parvovirusi in sorodni ssDNA-virusi

2018-04-14T23:31:56Z

Andrej Race: /* Replikacija */

==ssDNA virusi==
Virusi, ki vsebujejo enoverižno DNA so zelo razširjeni v okolju. Prisotni so v morski vodi, v sladki vodi, v sedimentih in v ekstremnih okoljih. Enoverižen genom, ki ga vsebujejo parvovirusi je negativno nabit.
Virusi ssDNA so razvili različne mehanizme za napad na celične genome, ki se pretežno razlikujejo med virusi, ki okužijo bakterije in evkarionte.

==Parvovirusi==
Virusi iz družine Parvoviridae so najenostavnejši živalski in človeški DNA virusi. Latinska beseda 'parvus' razlaga njihovo najbolj pomembno lastnost, da so majhni. Ta lastnost veliko vpliva na njihovo pomnoževanje, ki je v velikem odvisno od celičnih mehanizmov gostitelja.
Poznamo več kot 50 tipov parvovirusov, ki so razdeljeni v dve poddružini: Parvoviridae, ki okužijo vretenčarje in Densoviridae, ki so karakteristični za okužbo členonožcev in zuželk.
Poddružina Parvoviridae je nadalje razdeljena na pet rodov: amidovirusi, bokavirusi, dependovirusi, eritrovirusi in humani parvovirusi. Večina parvovirusov, kot so eritrovirusi, se podvojuje avtonomno, pri nekaterih pa virusno pomnoževanje ni možno brez sočasne prisotnosti virusov pomočnikov. Primer virusov, odvisnih od virusov pomočnikov so dependovirusi oz. adeno povezani virusi (AAV).

==Struktura parvovirusov==
Parvovirusi so majni, ikozaedrični virusi brez ovojnice, s premerom okrog 26 nm. Genom parvovirusa predstavlja linearna enovijačna DNA, velikosti približno 3 000 -5 000 baz. Svojo nukleinsko kislino virusi ščitijo s posebnim membranskim plaščom, kapsidom. Ta embalaža mora biti dovolj odporna, da zaščiti genom pred zunanjimi vplivi, ampak istočasno ustrezno labilna, da se lahko vsebina sprosti, ko pride v primerno okolje. Strukture kapsidov za več parvovirusov so bile določene z rentgensko kristalografijo in krioelektronsko mikroskopijo. Virusni proteini, VP1, VP2 in VP3, ki sestavljajo kapsido vsebujejo ohranjene in varijabilne regije (VR). Ohranjene regije so β-sodček in α-vijačni del. Biokemijske in strukturne raziskave kažejo da so ostanki v VR regijah zelo pomembni pri vezavi virusa na virusne receptorje in pri celotni virusni okužbi. Za površino kapsidov so značilne številne depresije in izbokline, ki pomagajo pri vezavi virusa na gostiteljsko celico. Proteinski plašč in nukleinska kislina skupa činijo nukleokapsid.
Nekateri parvorisusi so s časom formirali dodatno zaščito, v obliki dodatke lipidne opne.

==Vezava na gostiteljsko celico==
Različni virusi so razvili različne poti za okužbo gostiteljskih celic. Okužba celic je običajno večstopenjski proces, katerega je prvi korak vezava virusa na celično površino. Pritrditev virus na gostiteljsko celico je posredovana preko virusnih površinskih komponent (površine kapside), ki se vežejo na specifične molekule na površini gostiteljsko celice, kot so membranski proteini, lipidi ali ogljikovi hidrati.
Za identifikacijo kapsidnih aminokislinskih ostankov, ki prepoznajo receptorje na površini celične membrane so uporabljene analize vezave celic, transdukcijske analize in strukturni procesi. Analize so pokazale da obstajajo mesta v VR regijah kapside AAV, ki služijo kot vezavne regije, neodvisno od prepoznanega glikana.
Virusi prepoznajo glikane na površini kot primarne receptorje.
Adeno vezani virusi, oz. dependovirusi (AAV2, AAV3, AAV6 in AAV13) se vežejo na heparan sulfat preoteoglikan (HSPG). AAV1, AAV4 in AAV5 vežejo sialno kislino med okužbo celic, AAV9 pa N-vezavno galaktozo (GAL).
Glikan glikoforin je karakterističen za avtonomni parvorisus, bokavirus. B19 eritrovirus pa se veže na glikosfingolipidni eritroitni P antigen (glubosid Gb4) .
Vezavna mesta za glikane se prekrivajo z učinkovitostjo transdukcije in patogenosti virusov.

==Vstop virusa v okuženo celico==
Celica nalaga veliko ovir za vnos virusa. Kljub temu, virusi izkoriščajo temeljne celične procese da vstopijo i sprostijo svoj genski tovor. Vsi parvovirusi potrebujejo receptorsko posredovano endocitozo za okužbo celic. Po vezavi virusa na receptorje se virus obvije s klatrini, in na ta način formira klatrinski vezikel. Temu sledi vstop vezikla v celico, pot do zgodnjega endosoma in poznega endosoma. Klatrinski plašč se odstrani in se virus sprosti v citosol.
Ko so v notranjosti celice, kapside se spremenijo, pri čemer izpostavijo N končna dela kapsidnih proteina VP1 in VP2 in 3' konec virusnega genoma. Na kapside vpliva protealitična aktivnost proteasomov, in se takrat verjetno formira tretji kapsidni protein VP3. Izpostavljen N-končni del VP1 kapsidnega proteina bo služil kot jedrni lokalizacijski signal.
Virusi, ki se podvojujejo v jedru, potrebujejo mehanizme za prenos kapside in genoma do jedrnih por. V citoplazmi je prisoten citoskelet, čigave komponente virus izkorišča kot tire do jedra. Številni eksperimenti so pokazali da CPV (cannine parvovirus) kapside znotraj citoplazme potrebovali 3 do 6 ur da bi vstopile v jedro.
Prevoz do jedra so preprečili z depolimerizacijo mikrotubulov in blokiranjem motoričnega proteina mikrotubulov, dineina, ki prenaša tovor proti minus koncu mikrotubula, ki je v neposredni bližini jedra. S tem so ugotovili da so mikrotubuli in dineini ključni za prenos kapside virusa do jedra. Virus ssDNA je dovolj majhen da vstopi v jedro preko jedrsko pornog kompleksa (NPC). Večji, dsDNA virusi, pa potrebujejo importin za vstop v jedro.

==Vstop v jedro==
Transport kapsida je omogočen s pomočjo ATP in Ran-1 proteina. Tisti kapsidi, ki pridejo v celico imajo 20 do 30 nukleotidov izpostavljenih v obliki špange, kateri nastajajo zaradi končnih obrnjenih ponovitev. Končne obrnjene ponovitve, ali TIR (terminal inverted repeats), so sestavljene iz palindromskih sekvencah ki so večinoma enake s obe strani genoma. Ta izpostavljen del DNA služi kod začetni oligonukleotid s pomočjo katerega popravljalni encimi okužene celice pretvorijo ssDNA virusa v dsDNA, dsDNA virusa je potem pripravljena za transkripcijo in translacijo s pomočjo celičnih proteinov. TIR omogoča tudi istočasno sproščanje virusnega DNA brez razstavljanja kapsida.

==Ekspresija genov==
Genom je podeljen v dva dela, desna stran kodira strukturne proteine, leva pa regulatorne. Število promotorjev se razlikuje od vrste do vrste (od 1 do 3). Zaradi izredno majhne dolžine genoma, če je več promotorjev, oni se prekrivajo. Genom pravovirusov kodira regulatorne in strukturne proteine s prekrivajočim se sekvencami, kar je omogočeno s pomočjo alternativnega izrezovanja intronov oz. spajanja eksonov. Izražanje genov pa regulirajo proteini rep (naziv so dobili ker mutacija gena za izražanje tega proteina tudi onemogoča replikacijo virusne DNA) pri AAV in NS (non structural) pri samostojnih virusih. Večina regulatornih proteinov se ne vežejo direktno na DNA, ampak aktivirajo ali inhibirajo proteine v inficirani celici, kar povzroča manjše ali večje izražanje določenih genov na virusni DNA. Poleg tega, strukturni proteini so tudi pokazali da imajo vlogo v regulaciji gena.

AAV imajo značilno karakteristiko da v večini zdravih celicah nimajo sposobnost normalne aktivnosti translacije in transkripcije dokler celica ne pride v toksično okolje. Toksično okolje so lahko ekstremne temperature, UV radiacija ali kemijski kancerogeni, ampak najbolj učinkovit aktivator AAV so adenovirusi in herpsvirusi. Geni tistih virusov imajo več vlog za AAV. Ampak, vpliv tih genov ni nujen, AAV bo stabilno bival v celici dokler je celica zdrava, ko se pojavijo znaki poškodovanja celice replikacija AAV se aktivira in virus išče novega gostitelja. Pri translaciji AAV gena za VP2 lahko pride do leaky scanning (prepuščajočeg skeniranja) pri čemer se translacija ne začne na slabem začetnem ACG kodonu da bi potem nastal VP2, ampak na močnem AUG in nastane VP3.

==Replikacija==
ssDNA virusi uporabljajo tako imenovan “rolling hairpin” mehanizem za svojo replikacijo ( https://viralzone.expasy.org/resources/ssstrand_displacement.jpg ). Ta mehanizem ima dve specifične karakteristike. Prva je da se TIR lahko uporablja kot začetni oligonukleotid za začetek replikacije in druga je da ni zaostajajoče verige pri replikaciji. Replikacija je aktivna samo med S fazo celičnega cikla za samostojne viruse in v toksičnih pogojih za AAV. Aktivira je virusna endonukleaza rep pri AAV ali NS1 pri samostojnih virusih. Rep naredi zasek med kodirajočo regijo in TIR regijo na 5’ koncu. Ta zasek omogoča pomik verige in začetek translacije. Ko se en cikel replikacije konča virusi kateri imajo enake, ali podobne končne obrnjene ponovitve proizvajajo enako število ssDNA+ in ssDNA-. Tisti virusi ki nimajo podobne končne obrnjene ponovitve pa proizvajajo večinoma ssDNA- verige, dokler se ssDNA+ reciklira za nov cikel.

==Integracija AAV v gostiteljsko DNA==
AAV ima preferenco za določeno regijo na ljudskem kromosomu, AAVS1, ampak se tudi veže na druge regije ki imajo zavezujoči motiv za rep protein vključen v integracijo virusa. Ta motiv se tudi nahaja na delu v obliki špange AAV virusa in je sestavljen iz Rep-zavezujočeg mesta(RBS, rep-binding site) in končno resolucijsko mesto (TRS, terminal resolution site). Rep protein ima sposobnost da veže istočasno TRS regijo AAV DNA in DNA gostitelja pri čemer privezuje oba genoma.

==Rakotvornost==
Za razliko od ostalih DNA virusov kateri lahko vzpostavijo stabilen odnos z gostiteljsko celico, parvovirusi niso pokazali rakotvorna dejstva, nasprotno, pokazili so tudi da lahko imajo preventivni efekt. Ta značilnost, predvsem dependovirusov, je omogočena zaradi toksične sredine v kateri se treba nahajati virus da bi prišlo do replikacije. To sredino lahko najdemo predvsem v transformiranih in kancerogenih celicah. Reprodukcija AAV bo imela negativen vpliv na te celice in s tem bo prispevala do upočasnitve tumorigeneze.

==Viri==
*Berns, K. I. (1990) ‘Parvovirus Replication’, MICROBIOLOGICAL REVIEWS, 54(3), pp. 316–329. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC372780/pdf/microrev00038-0114.pdf (Accessed: 12 April 2018).
*Grove, J. and Marsh, M. (2011) ‘The cell biology of receptor-mediated virus entry’, Journal of Cell Biology, 195(7), pp. 1071–1082. doi: 10.1083/jcb.201108131.
*Huang, L. Y., Halder, S. and Agbandje-Mckenna, M. (2014) ‘Parvovirus glycan interactions’, Current Opinion in Virology. Elsevier B.V., 7(1), pp. 108–118. doi: 10.1016/j.coviro.2014.05.007.
*Krupovic, M. and Forterre, P. (2015) ‘Single-stranded DNA viruses employ a variety of mechanisms for integration into host genomes’, Annals of the New York Academy of Sciences, 1341(1), pp. 41–53. doi: 10.1111/nyas.12675.
*Vihinen-Ranta, M., Suikkanen, S. and Parrish, C. R. (2004) ‘Pathways of cell infection by parvoviruses and adeno-associated viruses.’, Journal of virology. American Society for Microbiology, 78(13), pp. 6709–14. doi: 10.1128/JVI.78.13.6709-6714.2004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Parvovirusi in sorodni ssDNA-virusi

2018-04-14T23:22:42Z

Andrej Race: /* Integracija AAV v gostiteljsko DNA */

==ssDNA virusi==
Virusi, ki vsebujejo enoverižno DNA so zelo razširjeni v okolju. Prisotni so v morski vodi, v sladki vodi, v sedimentih in v ekstremnih okoljih. Enoverižen genom, ki ga vsebujejo parvovirusi je negativno nabit.
Virusi ssDNA so razvili različne mehanizme za napad na celične genome, ki se pretežno razlikujejo med virusi, ki okužijo bakterije in evkarionte.

==Parvovirusi==
Virusi iz družine Parvoviridae so najenostavnejši živalski in človeški DNA virusi. Latinska beseda 'parvus' razlaga njihovo najbolj pomembno lastnost, da so majhni. Ta lastnost veliko vpliva na njihovo pomnoževanje, ki je v velikem odvisno od celičnih mehanizmov gostitelja.
Poznamo več kot 50 tipov parvovirusov, ki so razdeljeni v dve poddružini: Parvoviridae, ki okužijo vretenčarje in Densoviridae, ki so karakteristični za okužbo členonožcev in zuželk.
Poddružina Parvoviridae je nadalje razdeljena na pet rodov: amidovirusi, bokavirusi, dependovirusi, eritrovirusi in humani parvovirusi. Večina parvovirusov, kot so eritrovirusi, se podvojuje avtonomno, pri nekaterih pa virusno pomnoževanje ni možno brez sočasne prisotnosti virusov pomočnikov. Primer virusov, odvisnih od virusov pomočnikov so dependovirusi oz. adeno povezani virusi (AAV).

==Struktura parvovirusov==
Parvovirusi so majni, ikozaedrični virusi brez ovojnice, s premerom okrog 26 nm. Genom parvovirusa predstavlja linearna enovijačna DNA, velikosti približno 3 000 -5 000 baz. Svojo nukleinsko kislino virusi ščitijo s posebnim membranskim plaščom, kapsidom. Ta embalaža mora biti dovolj odporna, da zaščiti genom pred zunanjimi vplivi, ampak istočasno ustrezno labilna, da se lahko vsebina sprosti, ko pride v primerno okolje. Strukture kapsidov za več parvovirusov so bile določene z rentgensko kristalografijo in krioelektronsko mikroskopijo. Virusni proteini, VP1, VP2 in VP3, ki sestavljajo kapsido vsebujejo ohranjene in varijabilne regije (VR). Ohranjene regije so β-sodček in α-vijačni del. Biokemijske in strukturne raziskave kažejo da so ostanki v VR regijah zelo pomembni pri vezavi virusa na virusne receptorje in pri celotni virusni okužbi. Za površino kapsidov so značilne številne depresije in izbokline, ki pomagajo pri vezavi virusa na gostiteljsko celico. Proteinski plašč in nukleinska kislina skupa činijo nukleokapsid.
Nekateri parvorisusi so s časom formirali dodatno zaščito, v obliki dodatke lipidne opne.

==Vezava na gostiteljsko celico==
Različni virusi so razvili različne poti za okužbo gostiteljskih celic. Okužba celic je običajno večstopenjski proces, katerega je prvi korak vezava virusa na celično površino. Pritrditev virus na gostiteljsko celico je posredovana preko virusnih površinskih komponent (površine kapside), ki se vežejo na specifične molekule na površini gostiteljsko celice, kot so membranski proteini, lipidi ali ogljikovi hidrati.
Za identifikacijo kapsidnih aminokislinskih ostankov, ki prepoznajo receptorje na površini celične membrane so uporabljene analize vezave celic, transdukcijske analize in strukturni procesi. Analize so pokazale da obstajajo mesta v VR regijah kapside AAV, ki služijo kot vezavne regije, neodvisno od prepoznanega glikana.
Virusi prepoznajo glikane na površini kot primarne receptorje.
Adeno vezani virusi, oz. dependovirusi (AAV2, AAV3, AAV6 in AAV13) se vežejo na heparan sulfat preoteoglikan (HSPG). AAV1, AAV4 in AAV5 vežejo sialno kislino med okužbo celic, AAV9 pa N-vezavno galaktozo (GAL).
Glikan glikoforin je karakterističen za avtonomni parvorisus, bokavirus. B19 eritrovirus pa se veže na glikosfingolipidni eritroitni P antigen (glubosid Gb4) .
Vezavna mesta za glikane se prekrivajo z učinkovitostjo transdukcije in patogenosti virusov.

==Vstop virusa v okuženo celico==
Celica nalaga veliko ovir za vnos virusa. Kljub temu, virusi izkoriščajo temeljne celične procese da vstopijo i sprostijo svoj genski tovor. Vsi parvovirusi potrebujejo receptorsko posredovano endocitozo za okužbo celic. Po vezavi virusa na receptorje se virus obvije s klatrini, in na ta način formira klatrinski vezikel. Temu sledi vstop vezikla v celico, pot do zgodnjega endosoma in poznega endosoma. Klatrinski plašč se odstrani in se virus sprosti v citosol.
Ko so v notranjosti celice, kapside se spremenijo, pri čemer izpostavijo N končna dela kapsidnih proteina VP1 in VP2 in 3' konec virusnega genoma. Na kapside vpliva protealitična aktivnost proteasomov, in se takrat verjetno formira tretji kapsidni protein VP3. Izpostavljen N-končni del VP1 kapsidnega proteina bo služil kot jedrni lokalizacijski signal.
Virusi, ki se podvojujejo v jedru, potrebujejo mehanizme za prenos kapside in genoma do jedrnih por. V citoplazmi je prisoten citoskelet, čigave komponente virus izkorišča kot tire do jedra. Številni eksperimenti so pokazali da CPV (cannine parvovirus) kapside znotraj citoplazme potrebovali 3 do 6 ur da bi vstopile v jedro.
Prevoz do jedra so preprečili z depolimerizacijo mikrotubulov in blokiranjem motoričnega proteina mikrotubulov, dineina, ki prenaša tovor proti minus koncu mikrotubula, ki je v neposredni bližini jedra. S tem so ugotovili da so mikrotubuli in dineini ključni za prenos kapside virusa do jedra. Virus ssDNA je dovolj majhen da vstopi v jedro preko jedrsko pornog kompleksa (NPC). Večji, dsDNA virusi, pa potrebujejo importin za vstop v jedro.

==Vstop v jedro==
Transport kapsida je omogočen s pomočjo ATP in Ran-1 proteina. Tisti kapsidi, ki pridejo v celico imajo 20 do 30 nukleotidov izpostavljenih v obliki špange, kateri nastajajo zaradi končnih obrnjenih ponovitev. Končne obrnjene ponovitve, ali TIR (terminal inverted repeats), so sestavljene iz palindromskih sekvencah ki so večinoma enake s obe strani genoma. Ta izpostavljen del DNA služi kod začetni oligonukleotid s pomočjo katerega popravljalni encimi okužene celice pretvorijo ssDNA virusa v dsDNA, dsDNA virusa je potem pripravljena za transkripcijo in translacijo s pomočjo celičnih proteinov. TIR omogoča tudi istočasno sproščanje virusnega DNA brez razstavljanja kapsida.

==Ekspresija genov==
Genom je podeljen v dva dela, desna stran kodira strukturne proteine, leva pa regulatorne. Število promotorjev se razlikuje od vrste do vrste (od 1 do 3). Zaradi izredno majhne dolžine genoma, če je več promotorjev, oni se prekrivajo. Genom pravovirusov kodira regulatorne in strukturne proteine s prekrivajočim se sekvencami, kar je omogočeno s pomočjo alternativnega izrezovanja intronov oz. spajanja eksonov. Izražanje genov pa regulirajo proteini rep (naziv so dobili ker mutacija gena za izražanje tega proteina tudi onemogoča replikacijo virusne DNA) pri AAV in NS (non structural) pri samostojnih virusih. Večina regulatornih proteinov se ne vežejo direktno na DNA, ampak aktivirajo ali inhibirajo proteine v inficirani celici, kar povzroča manjše ali večje izražanje določenih genov na virusni DNA. Poleg tega, strukturni proteini so tudi pokazali da imajo vlogo v regulaciji gena.

AAV imajo značilno karakteristiko da v večini zdravih celicah nimajo sposobnost normalne aktivnosti translacije in transkripcije dokler celica ne pride v toksično okolje. Toksično okolje so lahko ekstremne temperature, UV radiacija ali kemijski kancerogeni, ampak najbolj učinkovit aktivator AAV so adenovirusi in herpsvirusi. Geni tistih virusov imajo več vlog za AAV. Ampak, vpliv tih genov ni nujen, AAV bo stabilno bival v celici dokler je celica zdrava, ko se pojavijo znaki poškodovanja celice replikacija AAV se aktivira in virus išče novega gostitelja. Pri translaciji AAV gena za VP2 lahko pride do leaky scanning (prepuščajočeg skeniranja) pri čemer se translacija ne začne na slabem začetnem ACG kodonu da bi potem nastal VP2, ampak na močnem AUG in nastane VP3.

==Replikacija==
ssDNA virusi uporabljajo tako imenovan “rolling hairpin” mehanizem za svojo replikacijo ( https://viralzone.expasy.org/resources/ssstrand_displacement.jpg ). Ta mehanizem ima dve specifične karakteristike. Prva je da se TIR lahko uporablja kot začetni oligonukleotid za začetek replikacije in druga je da ni zaostajajoče verige pri replikaciji. Replikacija je aktivna samo med S fazo celičnega cikla za samostojne viruse in v toksičnih pogojih za AAV. Aktivira je virusna endonukleaza rep pri AAV ali NS1 pri samostojnih virusih. Rep naredi zasek med kodirajočo regijo in regijo katera ustvarja “hairpin” na 5’ koncu. Ta zasek omogoča pomik verige in začetek translacije. Ko se en cikel replikacije konča virusi kateri imajo enake, ali podobne končne obrnjene ponovitve proizvajajo enako število ssDNA+ in ssDNA-. Tisti virusi ki nimajo podobne končne obrnjene ponovitve pa proizvajajo večinoma ssDNA- verige, dokler se ssDNA+ reciklira za nov cikel.

==Integracija AAV v gostiteljsko DNA==
AAV ima preferenco za določeno regijo na ljudskem kromosomu, AAVS1, ampak se tudi veže na druge regije ki imajo zavezujoči motiv za rep protein vključen v integracijo virusa. Ta motiv se tudi nahaja na delu v obliki špange AAV virusa in je sestavljen iz Rep-zavezujočeg mesta(RBS, rep-binding site) in končno resolucijsko mesto (TRS, terminal resolution site). Rep protein ima sposobnost da veže istočasno TRS regijo AAV DNA in DNA gostitelja pri čemer privezuje oba genoma.

==Rakotvornost==
Za razliko od ostalih DNA virusov kateri lahko vzpostavijo stabilen odnos z gostiteljsko celico, parvovirusi niso pokazali rakotvorna dejstva, nasprotno, pokazili so tudi da lahko imajo preventivni efekt. Ta značilnost, predvsem dependovirusov, je omogočena zaradi toksične sredine v kateri se treba nahajati virus da bi prišlo do replikacije. To sredino lahko najdemo predvsem v transformiranih in kancerogenih celicah. Reprodukcija AAV bo imela negativen vpliv na te celice in s tem bo prispevala do upočasnitve tumorigeneze.

==Viri==
*Berns, K. I. (1990) ‘Parvovirus Replication’, MICROBIOLOGICAL REVIEWS, 54(3), pp. 316–329. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC372780/pdf/microrev00038-0114.pdf (Accessed: 12 April 2018).
*Grove, J. and Marsh, M. (2011) ‘The cell biology of receptor-mediated virus entry’, Journal of Cell Biology, 195(7), pp. 1071–1082. doi: 10.1083/jcb.201108131.
*Huang, L. Y., Halder, S. and Agbandje-Mckenna, M. (2014) ‘Parvovirus glycan interactions’, Current Opinion in Virology. Elsevier B.V., 7(1), pp. 108–118. doi: 10.1016/j.coviro.2014.05.007.
*Krupovic, M. and Forterre, P. (2015) ‘Single-stranded DNA viruses employ a variety of mechanisms for integration into host genomes’, Annals of the New York Academy of Sciences, 1341(1), pp. 41–53. doi: 10.1111/nyas.12675.
*Vihinen-Ranta, M., Suikkanen, S. and Parrish, C. R. (2004) ‘Pathways of cell infection by parvoviruses and adeno-associated viruses.’, Journal of virology. American Society for Microbiology, 78(13), pp. 6709–14. doi: 10.1128/JVI.78.13.6709-6714.2004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Parvovirusi in sorodni ssDNA-virusi

2018-04-14T23:07:24Z

Andrej Race: /* Rakotvornost */

==ssDNA virusi==
Virusi, ki vsebujejo enoverižno DNA so zelo razširjeni v okolju. Prisotni so v morski vodi, v sladki vodi, v sedimentih in v ekstremnih okoljih. Enoverižen genom, ki ga vsebujejo parvovirusi je negativno nabit.
Virusi ssDNA so razvili različne mehanizme za napad na celične genome, ki se pretežno razlikujejo med virusi, ki okužijo bakterije in evkarionte.

==Parvovirusi==
Virusi iz družine Parvoviridae so najenostavnejši živalski in človeški DNA virusi. Latinska beseda 'parvus' razlaga njihovo najbolj pomembno lastnost, da so majhni. Ta lastnost veliko vpliva na njihovo pomnoževanje, ki je v velikem odvisno od celičnih mehanizmov gostitelja.
Poznamo več kot 50 tipov parvovirusov, ki so razdeljeni v dve poddružini: Parvoviridae, ki okužijo vretenčarje in Densoviridae, ki so karakteristični za okužbo členonožcev in zuželk.
Poddružina Parvoviridae je nadalje razdeljena na pet rodov: amidovirusi, bokavirusi, dependovirusi, eritrovirusi in humani parvovirusi. Večina parvovirusov, kot so eritrovirusi, se podvojuje avtonomno, pri nekaterih pa virusno pomnoževanje ni možno brez sočasne prisotnosti virusov pomočnikov. Primer virusov, odvisnih od virusov pomočnikov so dependovirusi oz. adeno povezani virusi (AAV).

==Struktura parvovirusov==
Parvovirusi so majni, ikozaedrični virusi brez ovojnice, s premerom okrog 26 nm. Genom parvovirusa predstavlja linearna enovijačna DNA, velikosti približno 3 000 -5 000 baz. Svojo nukleinsko kislino virusi ščitijo s posebnim membranskim plaščom, kapsidom. Ta embalaža mora biti dovolj odporna, da zaščiti genom pred zunanjimi vplivi, ampak istočasno ustrezno labilna, da se lahko vsebina sprosti, ko pride v primerno okolje. Strukture kapsidov za več parvovirusov so bile določene z rentgensko kristalografijo in krioelektronsko mikroskopijo. Virusni proteini, VP1, VP2 in VP3, ki sestavljajo kapsido vsebujejo ohranjene in varijabilne regije (VR). Ohranjene regije so β-sodček in α-vijačni del. Biokemijske in strukturne raziskave kažejo da so ostanki v VR regijah zelo pomembni pri vezavi virusa na virusne receptorje in pri celotni virusni okužbi. Za površino kapsidov so značilne številne depresije in izbokline, ki pomagajo pri vezavi virusa na gostiteljsko celico. Proteinski plašč in nukleinska kislina skupa činijo nukleokapsid.
Nekateri parvorisusi so s časom formirali dodatno zaščito, v obliki dodatke lipidne opne.

==Vezava na gostiteljsko celico==
Različni virusi so razvili različne poti za okužbo gostiteljskih celic. Okužba celic je običajno večstopenjski proces, katerega je prvi korak vezava virusa na celično površino. Pritrditev virus na gostiteljsko celico je posredovana preko virusnih površinskih komponent (površine kapside), ki se vežejo na specifične molekule na površini gostiteljsko celice, kot so membranski proteini, lipidi ali ogljikovi hidrati.
Za identifikacijo kapsidnih aminokislinskih ostankov, ki prepoznajo receptorje na površini celične membrane so uporabljene analize vezave celic, transdukcijske analize in strukturni procesi. Analize so pokazale da obstajajo mesta v VR regijah kapside AAV, ki služijo kot vezavne regije, neodvisno od prepoznanega glikana.
Virusi prepoznajo glikane na površini kot primarne receptorje.
Adeno vezani virusi, oz. dependovirusi (AAV2, AAV3, AAV6 in AAV13) se vežejo na heparan sulfat preoteoglikan (HSPG). AAV1, AAV4 in AAV5 vežejo sialno kislino med okužbo celic, AAV9 pa N-vezavno galaktozo (GAL).
Glikan glikoforin je karakterističen za avtonomni parvorisus, bokavirus. B19 eritrovirus pa se veže na glikosfingolipidni eritroitni P antigen (glubosid Gb4) .
Vezavna mesta za glikane se prekrivajo z učinkovitostjo transdukcije in patogenosti virusov.

==Vstop virusa v okuženo celico==
Celica nalaga veliko ovir za vnos virusa. Kljub temu, virusi izkoriščajo temeljne celične procese da vstopijo i sprostijo svoj genski tovor. Vsi parvovirusi potrebujejo receptorsko posredovano endocitozo za okužbo celic. Po vezavi virusa na receptorje se virus obvije s klatrini, in na ta način formira klatrinski vezikel. Temu sledi vstop vezikla v celico, pot do zgodnjega endosoma in poznega endosoma. Klatrinski plašč se odstrani in se virus sprosti v citosol.
Ko so v notranjosti celice, kapside se spremenijo, pri čemer izpostavijo N končna dela kapsidnih proteina VP1 in VP2 in 3' konec virusnega genoma. Na kapside vpliva protealitična aktivnost proteasomov, in se takrat verjetno formira tretji kapsidni protein VP3. Izpostavljen N-končni del VP1 kapsidnega proteina bo služil kot jedrni lokalizacijski signal.
Virusi, ki se podvojujejo v jedru, potrebujejo mehanizme za prenos kapside in genoma do jedrnih por. V citoplazmi je prisoten citoskelet, čigave komponente virus izkorišča kot tire do jedra. Številni eksperimenti so pokazali da CPV (cannine parvovirus) kapside znotraj citoplazme potrebovali 3 do 6 ur da bi vstopile v jedro.
Prevoz do jedra so preprečili z depolimerizacijo mikrotubulov in blokiranjem motoričnega proteina mikrotubulov, dineina, ki prenaša tovor proti minus koncu mikrotubula, ki je v neposredni bližini jedra. S tem so ugotovili da so mikrotubuli in dineini ključni za prenos kapside virusa do jedra. Virus ssDNA je dovolj majhen da vstopi v jedro preko jedrsko pornog kompleksa (NPC). Večji, dsDNA virusi, pa potrebujejo importin za vstop v jedro.

==Vstop v jedro==
Transport kapsida je omogočen s pomočjo ATP in Ran-1 proteina. Tisti kapsidi, ki pridejo v celico imajo 20 do 30 nukleotidov izpostavljenih v obliki špange, kateri nastajajo zaradi končnih obrnjenih ponovitev. Končne obrnjene ponovitve, ali TIR (terminal inverted repeats), so sestavljene iz palindromskih sekvencah ki so večinoma enake s obe strani genoma. Ta izpostavljen del DNA služi kod začetni oligonukleotid s pomočjo katerega popravljalni encimi okužene celice pretvorijo ssDNA virusa v dsDNA, dsDNA virusa je potem pripravljena za transkripcijo in translacijo s pomočjo celičnih proteinov. TIR omogoča tudi istočasno sproščanje virusnega DNA brez razstavljanja kapsida.

==Ekspresija genov==
Genom je podeljen v dva dela, desna stran kodira strukturne proteine, leva pa regulatorne. Število promotorjev se razlikuje od vrste do vrste (od 1 do 3). Zaradi izredno majhne dolžine genoma, če je več promotorjev, oni se prekrivajo. Genom pravovirusov kodira regulatorne in strukturne proteine s prekrivajočim se sekvencami, kar je omogočeno s pomočjo alternativnega izrezovanja intronov oz. spajanja eksonov. Izražanje genov pa regulirajo proteini rep (naziv so dobili ker mutacija gena za izražanje tega proteina tudi onemogoča replikacijo virusne DNA) pri AAV in NS (non structural) pri samostojnih virusih. Večina regulatornih proteinov se ne vežejo direktno na DNA, ampak aktivirajo ali inhibirajo proteine v inficirani celici, kar povzroča manjše ali večje izražanje določenih genov na virusni DNA. Poleg tega, strukturni proteini so tudi pokazali da imajo vlogo v regulaciji gena.

AAV imajo značilno karakteristiko da v večini zdravih celicah nimajo sposobnost normalne aktivnosti translacije in transkripcije dokler celica ne pride v toksično okolje. Toksično okolje so lahko ekstremne temperature, UV radiacija ali kemijski kancerogeni, ampak najbolj učinkovit aktivator AAV so adenovirusi in herpsvirusi. Geni tistih virusov imajo več vlog za AAV. Ampak, vpliv tih genov ni nujen, AAV bo stabilno bival v celici dokler je celica zdrava, ko se pojavijo znaki poškodovanja celice replikacija AAV se aktivira in virus išče novega gostitelja. Pri translaciji AAV gena za VP2 lahko pride do leaky scanning (prepuščajočeg skeniranja) pri čemer se translacija ne začne na slabem začetnem ACG kodonu da bi potem nastal VP2, ampak na močnem AUG in nastane VP3.

==Replikacija==
ssDNA virusi uporabljajo tako imenovan “rolling hairpin” mehanizem za svojo replikacijo ( https://viralzone.expasy.org/resources/ssstrand_displacement.jpg ). Ta mehanizem ima dve specifične karakteristike. Prva je da se TIR lahko uporablja kot začetni oligonukleotid za začetek replikacije in druga je da ni zaostajajoče verige pri replikaciji. Replikacija je aktivna samo med S fazo celičnega cikla za samostojne viruse in v toksičnih pogojih za AAV. Aktivira je virusna endonukleaza rep pri AAV ali NS1 pri samostojnih virusih. Rep naredi zasek med kodirajočo regijo in regijo katera ustvarja “hairpin” na 5’ koncu. Ta zasek omogoča pomik verige in začetek translacije. Ko se en cikel replikacije konča virusi kateri imajo enake, ali podobne končne obrnjene ponovitve proizvajajo enako število ssDNA+ in ssDNA-. Tisti virusi ki nimajo podobne končne obrnjene ponovitve pa proizvajajo večinoma ssDNA- verige, dokler se ssDNA+ reciklira za nov cikel.

==Integracija AAV v gostiteljsko DNA==
AAV ima preferenco za določeno regijo na ljudskem kromosomu, AAVS1, ampak se tudi veže na druge regije ki imajo zavezujoči motiv rep protein vključen v integracijo virusa. Ta motiv se tudi nahaja na delu v obliki špange AAV virusa in je sestavljen iz Rep-zavezujočeg mesta(RBS, rep-binding site) in končno resolucijsko mesto (TRS, terminal resolution site). Rep protein ima sposobnost da veže istočasno TRS regijo AAV DNA in DNA gostitelja pri čemer privezuje oba genoma.

==Rakotvornost==
Za razliko od ostalih DNA virusov kateri lahko vzpostavijo stabilen odnos z gostiteljsko celico, parvovirusi niso pokazali rakotvorna dejstva, nasprotno, pokazili so tudi da lahko imajo preventivni efekt. Ta značilnost, predvsem dependovirusov, je omogočena zaradi toksične sredine v kateri se treba nahajati virus da bi prišlo do replikacije. To sredino lahko najdemo predvsem v transformiranih in kancerogenih celicah. Reprodukcija AAV bo imela negativen vpliv na te celice in s tem bo prispevala do upočasnitve tumorigeneze.

==Viri==
*Berns, K. I. (1990) ‘Parvovirus Replication’, MICROBIOLOGICAL REVIEWS, 54(3), pp. 316–329. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC372780/pdf/microrev00038-0114.pdf (Accessed: 12 April 2018).
*Grove, J. and Marsh, M. (2011) ‘The cell biology of receptor-mediated virus entry’, Journal of Cell Biology, 195(7), pp. 1071–1082. doi: 10.1083/jcb.201108131.
*Huang, L. Y., Halder, S. and Agbandje-Mckenna, M. (2014) ‘Parvovirus glycan interactions’, Current Opinion in Virology. Elsevier B.V., 7(1), pp. 108–118. doi: 10.1016/j.coviro.2014.05.007.
*Krupovic, M. and Forterre, P. (2015) ‘Single-stranded DNA viruses employ a variety of mechanisms for integration into host genomes’, Annals of the New York Academy of Sciences, 1341(1), pp. 41–53. doi: 10.1111/nyas.12675.
*Vihinen-Ranta, M., Suikkanen, S. and Parrish, C. R. (2004) ‘Pathways of cell infection by parvoviruses and adeno-associated viruses.’, Journal of virology. American Society for Microbiology, 78(13), pp. 6709–14. doi: 10.1128/JVI.78.13.6709-6714.2004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Parvovirusi in sorodni ssDNA-virusi

2018-04-14T23:01:03Z

Andrej Race: /* Integracija AAV v gostiteljsko DNA */

==ssDNA virusi==
Virusi, ki vsebujejo enoverižno DNA so zelo razširjeni v okolju. Prisotni so v morski vodi, v sladki vodi, v sedimentih in v ekstremnih okoljih. Enoverižen genom, ki ga vsebujejo parvovirusi je negativno nabit.
Virusi ssDNA so razvili različne mehanizme za napad na celične genome, ki se pretežno razlikujejo med virusi, ki okužijo bakterije in evkarionte.

==Parvovirusi==
Virusi iz družine Parvoviridae so najenostavnejši živalski in človeški DNA virusi. Latinska beseda 'parvus' razlaga njihovo najbolj pomembno lastnost, da so majhni. Ta lastnost veliko vpliva na njihovo pomnoževanje, ki je v velikem odvisno od celičnih mehanizmov gostitelja.
Poznamo več kot 50 tipov parvovirusov, ki so razdeljeni v dve poddružini: Parvoviridae, ki okužijo vretenčarje in Densoviridae, ki so karakteristični za okužbo členonožcev in zuželk.
Poddružina Parvoviridae je nadalje razdeljena na pet rodov: amidovirusi, bokavirusi, dependovirusi, eritrovirusi in humani parvovirusi. Večina parvovirusov, kot so eritrovirusi, se podvojuje avtonomno, pri nekaterih pa virusno pomnoževanje ni možno brez sočasne prisotnosti virusov pomočnikov. Primer virusov, odvisnih od virusov pomočnikov so dependovirusi oz. adeno povezani virusi (AAV).

==Struktura parvovirusov==
Parvovirusi so majni, ikozaedrični virusi brez ovojnice, s premerom okrog 26 nm. Genom parvovirusa predstavlja linearna enovijačna DNA, velikosti približno 3 000 -5 000 baz. Svojo nukleinsko kislino virusi ščitijo s posebnim membranskim plaščom, kapsidom. Ta embalaža mora biti dovolj odporna, da zaščiti genom pred zunanjimi vplivi, ampak istočasno ustrezno labilna, da se lahko vsebina sprosti, ko pride v primerno okolje. Strukture kapsidov za več parvovirusov so bile določene z rentgensko kristalografijo in krioelektronsko mikroskopijo. Virusni proteini, VP1, VP2 in VP3, ki sestavljajo kapsido vsebujejo ohranjene in varijabilne regije (VR). Ohranjene regije so β-sodček in α-vijačni del. Biokemijske in strukturne raziskave kažejo da so ostanki v VR regijah zelo pomembni pri vezavi virusa na virusne receptorje in pri celotni virusni okužbi. Za površino kapsidov so značilne številne depresije in izbokline, ki pomagajo pri vezavi virusa na gostiteljsko celico. Proteinski plašč in nukleinska kislina skupa činijo nukleokapsid.
Nekateri parvorisusi so s časom formirali dodatno zaščito, v obliki dodatke lipidne opne.

==Vezava na gostiteljsko celico==
Različni virusi so razvili različne poti za okužbo gostiteljskih celic. Okužba celic je običajno večstopenjski proces, katerega je prvi korak vezava virusa na celično površino. Pritrditev virus na gostiteljsko celico je posredovana preko virusnih površinskih komponent (površine kapside), ki se vežejo na specifične molekule na površini gostiteljsko celice, kot so membranski proteini, lipidi ali ogljikovi hidrati.
Za identifikacijo kapsidnih aminokislinskih ostankov, ki prepoznajo receptorje na površini celične membrane so uporabljene analize vezave celic, transdukcijske analize in strukturni procesi. Analize so pokazale da obstajajo mesta v VR regijah kapside AAV, ki služijo kot vezavne regije, neodvisno od prepoznanega glikana.
Virusi prepoznajo glikane na površini kot primarne receptorje.
Adeno vezani virusi, oz. dependovirusi (AAV2, AAV3, AAV6 in AAV13) se vežejo na heparan sulfat preoteoglikan (HSPG). AAV1, AAV4 in AAV5 vežejo sialno kislino med okužbo celic, AAV9 pa N-vezavno galaktozo (GAL).
Glikan glikoforin je karakterističen za avtonomni parvorisus, bokavirus. B19 eritrovirus pa se veže na glikosfingolipidni eritroitni P antigen (glubosid Gb4) .
Vezavna mesta za glikane se prekrivajo z učinkovitostjo transdukcije in patogenosti virusov.

==Vstop virusa v okuženo celico==
Celica nalaga veliko ovir za vnos virusa. Kljub temu, virusi izkoriščajo temeljne celične procese da vstopijo i sprostijo svoj genski tovor. Vsi parvovirusi potrebujejo receptorsko posredovano endocitozo za okužbo celic. Po vezavi virusa na receptorje se virus obvije s klatrini, in na ta način formira klatrinski vezikel. Temu sledi vstop vezikla v celico, pot do zgodnjega endosoma in poznega endosoma. Klatrinski plašč se odstrani in se virus sprosti v citosol.
Ko so v notranjosti celice, kapside se spremenijo, pri čemer izpostavijo N končna dela kapsidnih proteina VP1 in VP2 in 3' konec virusnega genoma. Na kapside vpliva protealitična aktivnost proteasomov, in se takrat verjetno formira tretji kapsidni protein VP3. Izpostavljen N-končni del VP1 kapsidnega proteina bo služil kot jedrni lokalizacijski signal.
Virusi, ki se podvojujejo v jedru, potrebujejo mehanizme za prenos kapside in genoma do jedrnih por. V citoplazmi je prisoten citoskelet, čigave komponente virus izkorišča kot tire do jedra. Številni eksperimenti so pokazali da CPV (cannine parvovirus) kapside znotraj citoplazme potrebovali 3 do 6 ur da bi vstopile v jedro.
Prevoz do jedra so preprečili z depolimerizacijo mikrotubulov in blokiranjem motoričnega proteina mikrotubulov, dineina, ki prenaša tovor proti minus koncu mikrotubula, ki je v neposredni bližini jedra. S tem so ugotovili da so mikrotubuli in dineini ključni za prenos kapside virusa do jedra. Virus ssDNA je dovolj majhen da vstopi v jedro preko jedrsko pornog kompleksa (NPC). Večji, dsDNA virusi, pa potrebujejo importin za vstop v jedro.

==Vstop v jedro==
Transport kapsida je omogočen s pomočjo ATP in Ran-1 proteina. Tisti kapsidi, ki pridejo v celico imajo 20 do 30 nukleotidov izpostavljenih v obliki špange, kateri nastajajo zaradi končnih obrnjenih ponovitev. Končne obrnjene ponovitve, ali TIR (terminal inverted repeats), so sestavljene iz palindromskih sekvencah ki so večinoma enake s obe strani genoma. Ta izpostavljen del DNA služi kod začetni oligonukleotid s pomočjo katerega popravljalni encimi okužene celice pretvorijo ssDNA virusa v dsDNA, dsDNA virusa je potem pripravljena za transkripcijo in translacijo s pomočjo celičnih proteinov. TIR omogoča tudi istočasno sproščanje virusnega DNA brez razstavljanja kapsida.

==Ekspresija genov==
Genom je podeljen v dva dela, desna stran kodira strukturne proteine, leva pa regulatorne. Število promotorjev se razlikuje od vrste do vrste (od 1 do 3). Zaradi izredno majhne dolžine genoma, če je več promotorjev, oni se prekrivajo. Genom pravovirusov kodira regulatorne in strukturne proteine s prekrivajočim se sekvencami, kar je omogočeno s pomočjo alternativnega izrezovanja intronov oz. spajanja eksonov. Izražanje genov pa regulirajo proteini rep (naziv so dobili ker mutacija gena za izražanje tega proteina tudi onemogoča replikacijo virusne DNA) pri AAV in NS (non structural) pri samostojnih virusih. Večina regulatornih proteinov se ne vežejo direktno na DNA, ampak aktivirajo ali inhibirajo proteine v inficirani celici, kar povzroča manjše ali večje izražanje določenih genov na virusni DNA. Poleg tega, strukturni proteini so tudi pokazali da imajo vlogo v regulaciji gena.

AAV imajo značilno karakteristiko da v večini zdravih celicah nimajo sposobnost normalne aktivnosti translacije in transkripcije dokler celica ne pride v toksično okolje. Toksično okolje so lahko ekstremne temperature, UV radiacija ali kemijski kancerogeni, ampak najbolj učinkovit aktivator AAV so adenovirusi in herpsvirusi. Geni tistih virusov imajo več vlog za AAV. Ampak, vpliv tih genov ni nujen, AAV bo stabilno bival v celici dokler je celica zdrava, ko se pojavijo znaki poškodovanja celice replikacija AAV se aktivira in virus išče novega gostitelja. Pri translaciji AAV gena za VP2 lahko pride do leaky scanning (prepuščajočeg skeniranja) pri čemer se translacija ne začne na slabem začetnem ACG kodonu da bi potem nastal VP2, ampak na močnem AUG in nastane VP3.

==Replikacija==
ssDNA virusi uporabljajo tako imenovan “rolling hairpin” mehanizem za svojo replikacijo ( https://viralzone.expasy.org/resources/ssstrand_displacement.jpg ). Ta mehanizem ima dve specifične karakteristike. Prva je da se TIR lahko uporablja kot začetni oligonukleotid za začetek replikacije in druga je da ni zaostajajoče verige pri replikaciji. Replikacija je aktivna samo med S fazo celičnega cikla za samostojne viruse in v toksičnih pogojih za AAV. Aktivira je virusna endonukleaza rep pri AAV ali NS1 pri samostojnih virusih. Rep naredi zasek med kodirajočo regijo in regijo katera ustvarja “hairpin” na 5’ koncu. Ta zasek omogoča pomik verige in začetek translacije. Ko se en cikel replikacije konča virusi kateri imajo enake, ali podobne končne obrnjene ponovitve proizvajajo enako število ssDNA+ in ssDNA-. Tisti virusi ki nimajo podobne končne obrnjene ponovitve pa proizvajajo večinoma ssDNA- verige, dokler se ssDNA+ reciklira za nov cikel.

==Integracija AAV v gostiteljsko DNA==
AAV ima preferenco za določeno regijo na ljudskem kromosomu, AAVS1, ampak se tudi veže na druge regije ki imajo zavezujoči motiv rep protein vključen v integracijo virusa. Ta motiv se tudi nahaja na delu v obliki špange AAV virusa in je sestavljen iz Rep-zavezujočeg mesta(RBS, rep-binding site) in končno resolucijsko mesto (TRS, terminal resolution site). Rep protein ima sposobnost da veže istočasno TRS regijo AAV DNA in DNA gostitelja pri čemer privezuje oba genoma.

==Rakotvornost==
Za razliko od ostalih DNA virusov kateri lahko vzpostavijo stabilen odnos z gostiteljsko celico, parvovirusi niso pokazali rakotvorna dejstva, nasprotno, pokazili so tudi da lahko imajo preventivni efekt. Ta značilnost, predvsem dependovirusov, je omogočena zaradi toksične sredine v kateri se treba nahajati virus da bi prišlo do replikacije. To sredino lahko najdemo predvsem v transformiranih in kancerogenih celicah. Proliferacija AAV v teh celicah bo imela negativen vpliv.

==Viri==
*Berns, K. I. (1990) ‘Parvovirus Replication’, MICROBIOLOGICAL REVIEWS, 54(3), pp. 316–329. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC372780/pdf/microrev00038-0114.pdf (Accessed: 12 April 2018).
*Grove, J. and Marsh, M. (2011) ‘The cell biology of receptor-mediated virus entry’, Journal of Cell Biology, 195(7), pp. 1071–1082. doi: 10.1083/jcb.201108131.
*Huang, L. Y., Halder, S. and Agbandje-Mckenna, M. (2014) ‘Parvovirus glycan interactions’, Current Opinion in Virology. Elsevier B.V., 7(1), pp. 108–118. doi: 10.1016/j.coviro.2014.05.007.
*Krupovic, M. and Forterre, P. (2015) ‘Single-stranded DNA viruses employ a variety of mechanisms for integration into host genomes’, Annals of the New York Academy of Sciences, 1341(1), pp. 41–53. doi: 10.1111/nyas.12675.
*Vihinen-Ranta, M., Suikkanen, S. and Parrish, C. R. (2004) ‘Pathways of cell infection by parvoviruses and adeno-associated viruses.’, Journal of virology. American Society for Microbiology, 78(13), pp. 6709–14. doi: 10.1128/JVI.78.13.6709-6714.2004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Parvovirusi in sorodni ssDNA-virusi

2018-04-14T22:54:43Z

Andrej Race: /* Ekspresija genov */

==ssDNA virusi==
Virusi, ki vsebujejo enoverižno DNA so zelo razširjeni v okolju. Prisotni so v morski vodi, v sladki vodi, v sedimentih in v ekstremnih okoljih. Enoverižen genom, ki ga vsebujejo parvovirusi je negativno nabit.
Virusi ssDNA so razvili različne mehanizme za napad na celične genome, ki se pretežno razlikujejo med virusi, ki okužijo bakterije in evkarionte.

==Parvovirusi==
Virusi iz družine Parvoviridae so najenostavnejši živalski in človeški DNA virusi. Latinska beseda 'parvus' razlaga njihovo najbolj pomembno lastnost, da so majhni. Ta lastnost veliko vpliva na njihovo pomnoževanje, ki je v velikem odvisno od celičnih mehanizmov gostitelja.
Poznamo več kot 50 tipov parvovirusov, ki so razdeljeni v dve poddružini: Parvoviridae, ki okužijo vretenčarje in Densoviridae, ki so karakteristični za okužbo členonožcev in zuželk.
Poddružina Parvoviridae je nadalje razdeljena na pet rodov: amidovirusi, bokavirusi, dependovirusi, eritrovirusi in humani parvovirusi. Večina parvovirusov, kot so eritrovirusi, se podvojuje avtonomno, pri nekaterih pa virusno pomnoževanje ni možno brez sočasne prisotnosti virusov pomočnikov. Primer virusov, odvisnih od virusov pomočnikov so dependovirusi oz. adeno povezani virusi (AAV).

==Struktura parvovirusov==
Parvovirusi so majni, ikozaedrični virusi brez ovojnice, s premerom okrog 26 nm. Genom parvovirusa predstavlja linearna enovijačna DNA, velikosti približno 3 000 -5 000 baz. Svojo nukleinsko kislino virusi ščitijo s posebnim membranskim plaščom, kapsidom. Ta embalaža mora biti dovolj odporna, da zaščiti genom pred zunanjimi vplivi, ampak istočasno ustrezno labilna, da se lahko vsebina sprosti, ko pride v primerno okolje. Strukture kapsidov za več parvovirusov so bile določene z rentgensko kristalografijo in krioelektronsko mikroskopijo. Virusni proteini, VP1, VP2 in VP3, ki sestavljajo kapsido vsebujejo ohranjene in varijabilne regije (VR). Ohranjene regije so β-sodček in α-vijačni del. Biokemijske in strukturne raziskave kažejo da so ostanki v VR regijah zelo pomembni pri vezavi virusa na virusne receptorje in pri celotni virusni okužbi. Za površino kapsidov so značilne številne depresije in izbokline, ki pomagajo pri vezavi virusa na gostiteljsko celico. Proteinski plašč in nukleinska kislina skupa činijo nukleokapsid.
Nekateri parvorisusi so s časom formirali dodatno zaščito, v obliki dodatke lipidne opne.

==Vezava na gostiteljsko celico==
Različni virusi so razvili različne poti za okužbo gostiteljskih celic. Okužba celic je običajno večstopenjski proces, katerega je prvi korak vezava virusa na celično površino. Pritrditev virus na gostiteljsko celico je posredovana preko virusnih površinskih komponent (površine kapside), ki se vežejo na specifične molekule na površini gostiteljsko celice, kot so membranski proteini, lipidi ali ogljikovi hidrati.
Za identifikacijo kapsidnih aminokislinskih ostankov, ki prepoznajo receptorje na površini celične membrane so uporabljene analize vezave celic, transdukcijske analize in strukturni procesi. Analize so pokazale da obstajajo mesta v VR regijah kapside AAV, ki služijo kot vezavne regije, neodvisno od prepoznanega glikana.
Virusi prepoznajo glikane na površini kot primarne receptorje.
Adeno vezani virusi, oz. dependovirusi (AAV2, AAV3, AAV6 in AAV13) se vežejo na heparan sulfat preoteoglikan (HSPG). AAV1, AAV4 in AAV5 vežejo sialno kislino med okužbo celic, AAV9 pa N-vezavno galaktozo (GAL).
Glikan glikoforin je karakterističen za avtonomni parvorisus, bokavirus. B19 eritrovirus pa se veže na glikosfingolipidni eritroitni P antigen (glubosid Gb4) .
Vezavna mesta za glikane se prekrivajo z učinkovitostjo transdukcije in patogenosti virusov.

==Vstop virusa v okuženo celico==
Celica nalaga veliko ovir za vnos virusa. Kljub temu, virusi izkoriščajo temeljne celične procese da vstopijo i sprostijo svoj genski tovor. Vsi parvovirusi potrebujejo receptorsko posredovano endocitozo za okužbo celic. Po vezavi virusa na receptorje se virus obvije s klatrini, in na ta način formira klatrinski vezikel. Temu sledi vstop vezikla v celico, pot do zgodnjega endosoma in poznega endosoma. Klatrinski plašč se odstrani in se virus sprosti v citosol.
Ko so v notranjosti celice, kapside se spremenijo, pri čemer izpostavijo N končna dela kapsidnih proteina VP1 in VP2 in 3' konec virusnega genoma. Na kapside vpliva protealitična aktivnost proteasomov, in se takrat verjetno formira tretji kapsidni protein VP3. Izpostavljen N-končni del VP1 kapsidnega proteina bo služil kot jedrni lokalizacijski signal.
Virusi, ki se podvojujejo v jedru, potrebujejo mehanizme za prenos kapside in genoma do jedrnih por. V citoplazmi je prisoten citoskelet, čigave komponente virus izkorišča kot tire do jedra. Številni eksperimenti so pokazali da CPV (cannine parvovirus) kapside znotraj citoplazme potrebovali 3 do 6 ur da bi vstopile v jedro.
Prevoz do jedra so preprečili z depolimerizacijo mikrotubulov in blokiranjem motoričnega proteina mikrotubulov, dineina, ki prenaša tovor proti minus koncu mikrotubula, ki je v neposredni bližini jedra. S tem so ugotovili da so mikrotubuli in dineini ključni za prenos kapside virusa do jedra. Virus ssDNA je dovolj majhen da vstopi v jedro preko jedrsko pornog kompleksa (NPC). Večji, dsDNA virusi, pa potrebujejo importin za vstop v jedro.

==Vstop v jedro==
Transport kapsida je omogočen s pomočjo ATP in Ran-1 proteina. Tisti kapsidi, ki pridejo v celico imajo 20 do 30 nukleotidov izpostavljenih v obliki špange, kateri nastajajo zaradi končnih obrnjenih ponovitev. Končne obrnjene ponovitve, ali TIR (terminal inverted repeats), so sestavljene iz palindromskih sekvencah ki so večinoma enake s obe strani genoma. Ta izpostavljen del DNA služi kod začetni oligonukleotid s pomočjo katerega popravljalni encimi okužene celice pretvorijo ssDNA virusa v dsDNA, dsDNA virusa je potem pripravljena za transkripcijo in translacijo s pomočjo celičnih proteinov. TIR omogoča tudi istočasno sproščanje virusnega DNA brez razstavljanja kapsida.

==Ekspresija genov==
Genom je podeljen v dva dela, desna stran kodira strukturne proteine, leva pa regulatorne. Število promotorjev se razlikuje od vrste do vrste (od 1 do 3). Zaradi izredno majhne dolžine genoma, če je več promotorjev, oni se prekrivajo. Genom pravovirusov kodira regulatorne in strukturne proteine s prekrivajočim se sekvencami, kar je omogočeno s pomočjo alternativnega izrezovanja intronov oz. spajanja eksonov. Izražanje genov pa regulirajo proteini rep (naziv so dobili ker mutacija gena za izražanje tega proteina tudi onemogoča replikacijo virusne DNA) pri AAV in NS (non structural) pri samostojnih virusih. Večina regulatornih proteinov se ne vežejo direktno na DNA, ampak aktivirajo ali inhibirajo proteine v inficirani celici, kar povzroča manjše ali večje izražanje določenih genov na virusni DNA. Poleg tega, strukturni proteini so tudi pokazali da imajo vlogo v regulaciji gena.

AAV imajo značilno karakteristiko da v večini zdravih celicah nimajo sposobnost normalne aktivnosti translacije in transkripcije dokler celica ne pride v toksično okolje. Toksično okolje so lahko ekstremne temperature, UV radiacija ali kemijski kancerogeni, ampak najbolj učinkovit aktivator AAV so adenovirusi in herpsvirusi. Geni tistih virusov imajo več vlog za AAV. Ampak, vpliv tih genov ni nujen, AAV bo stabilno bival v celici dokler je celica zdrava, ko se pojavijo znaki poškodovanja celice replikacija AAV se aktivira in virus išče novega gostitelja. Pri translaciji AAV gena za VP2 lahko pride do leaky scanning (prepuščajočeg skeniranja) pri čemer se translacija ne začne na slabem začetnem ACG kodonu da bi potem nastal VP2, ampak na močnem AUG in nastane VP3.

==Replikacija==
ssDNA virusi uporabljajo tako imenovan “rolling hairpin” mehanizem za svojo replikacijo ( https://viralzone.expasy.org/resources/ssstrand_displacement.jpg ). Ta mehanizem ima dve specifične karakteristike. Prva je da se TIR lahko uporablja kot začetni oligonukleotid za začetek replikacije in druga je da ni zaostajajoče verige pri replikaciji. Replikacija je aktivna samo med S fazo celičnega cikla za samostojne viruse in v toksičnih pogojih za AAV. Aktivira je virusna endonukleaza rep pri AAV ali NS1 pri samostojnih virusih. Rep naredi zasek med kodirajočo regijo in regijo katera ustvarja “hairpin” na 5’ koncu. Ta zasek omogoča pomik verige in začetek translacije. Ko se en cikel replikacije konča virusi kateri imajo enake, ali podobne končne obrnjene ponovitve proizvajajo enako število ssDNA+ in ssDNA-. Tisti virusi ki nimajo podobne končne obrnjene ponovitve pa proizvajajo večinoma ssDNA- verige, dokler se ssDNA+ reciklira za nov cikel.

==Integracija AAV v gostiteljsko DNA==
AAV ima preferenco za določeno regijo na ljudskem kromosomu, AAVS1, ampak se tudi veže na druge regije ki imajo zavezujoči motiv rep protein vključen v integracijo virusa. Ta motiv se tudi nahaja na “hairpin” delu AAV virusa in je sestavljen iz Rep-zavezujočeg mesta(RBS, rep-binding site) in končno resolucijsko mesto (TRS, terminal resolution site). Rep protein ima sposobnost da veže istočasno TRS regijo AAV DNA in DNA gostitelja pri čemer privezuje oba genoma.

==Rakotvornost==
Za razliko od ostalih DNA virusov kateri lahko vzpostavijo stabilen odnos z gostiteljsko celico, parvovirusi niso pokazali rakotvorna dejstva, nasprotno, pokazili so tudi da lahko imajo preventivni efekt. Ta značilnost, predvsem dependovirusov, je omogočena zaradi toksične sredine v kateri se treba nahajati virus da bi prišlo do replikacije. To sredino lahko najdemo predvsem v transformiranih in kancerogenih celicah. Proliferacija AAV v teh celicah bo imela negativen vpliv.

==Viri==
*Berns, K. I. (1990) ‘Parvovirus Replication’, MICROBIOLOGICAL REVIEWS, 54(3), pp. 316–329. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC372780/pdf/microrev00038-0114.pdf (Accessed: 12 April 2018).
*Grove, J. and Marsh, M. (2011) ‘The cell biology of receptor-mediated virus entry’, Journal of Cell Biology, 195(7), pp. 1071–1082. doi: 10.1083/jcb.201108131.
*Huang, L. Y., Halder, S. and Agbandje-Mckenna, M. (2014) ‘Parvovirus glycan interactions’, Current Opinion in Virology. Elsevier B.V., 7(1), pp. 108–118. doi: 10.1016/j.coviro.2014.05.007.
*Krupovic, M. and Forterre, P. (2015) ‘Single-stranded DNA viruses employ a variety of mechanisms for integration into host genomes’, Annals of the New York Academy of Sciences, 1341(1), pp. 41–53. doi: 10.1111/nyas.12675.
*Vihinen-Ranta, M., Suikkanen, S. and Parrish, C. R. (2004) ‘Pathways of cell infection by parvoviruses and adeno-associated viruses.’, Journal of virology. American Society for Microbiology, 78(13), pp. 6709–14. doi: 10.1128/JVI.78.13.6709-6714.2004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]