Wiki FKKT - User contributions [en]

Programabilni sintetični biomolekulski kondenzati za nadzor celičnih procesov

2023-05-17T10:26:47Z

Anja Konjc: /* Modularna izgradnja sintetičnih kondenzatov v E. coli */

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41589-022-01252-8 Y. Dai, M. Farag, D. Lee, X. Zeng, K. Kim, H. in Son, X. Guo, J. Su, N. Peterson, L. You: Programmable synthetic biomolecular condensates for cellular control. ''Nat. Chem. Biol''. '''2023''', ''19(4)'', str. 518-528.]
==Uvod==
Kompartmentalizacija predstavlja eno ključnih vlog pri razvoju evkariontske celice. Znotrajcelični organeli oz. kompartmenti, obdani iz lipidno membrano, omogočajo ustvarjanje lokalnih pogojev za določen celični proces. Poleg klasičnih organelov so v celici prisotni tudi prehodni, začasni skupki nagnetenih molekul, ki sicer spominjajo na membranske organele, le da niso obdani z lipidno membrano. Imenujemo jih biomolekulski kondenzati in nastanejo zaradi združevanja bioloških makromolekul (proteinov in nukleinskih kislin) [1]. Biomolekulski kondenzati sodelujejo v različnih celičnih procesih, od regulacije genov do regulacije celičnega stresa. Inženiring umetnih biomolekulskih kondenzatov omogoča boljše razumevanje organizacije le-teh in sintezo umetnih sistemov z novimi funkcijami [2]. Nastanek takih kondenzatov lahko poganja fazno ločevanje, povezano s perkolacijo/pronicanjem intrinzično neurejenih proteinov (PSCP) [3]. Intrinzično neurejeni proteini zaradi specifične aminokislinske sestave nimajo stalne tridimenzionalne strukture. V raztopini lahko hitro preklapljajo med različnimi energetskimi stanji [1]. Kondenzati lahko selektivno obogatijo ali osiromašijo biomolekule, kar omogoča nadzor nad celičnimi procesi. Sintetične kondenzate, ki jih tvorijo naravno prisotni intrinzično neurejeni proteini, spojeni z različnimi funkcionalnimi domenami, so uporabili za nadzor celične proliferacije. Do sedaj so preučevali različne vzorce, ki vodijo fazno ločbo intrinzično neurejenih proteinov. Raziskovalna skupina v tem članku [3] pa je sintetizirala funkcionalne biomolekulske kondenzate z upoštevanjem do sedaj znanih pravil nastanka tovrstnih skupkov za preučevanje njihovega delovanja v celicah, in kako jih lahko uporabimo za nadzorovanje celičnih procesov [3].

==Rezultati==
===Razvoj sintetičnih funkcionalnih kondenzatov===
Z razvojem sintetičnih kondenzatov so želeli nadzorovati sekvestracijo plazmidov (ločevanje plazmidne DNA) in transkripcijo. Zasnovali so sintetične intrinzično neurejene proteine (synIDP), ki so jih spojili skupaj s funkcionalnimi proteinskimi domenami. Raziskovali so različne dejavnike, ki prispevajo k nastanku kondenzatov. S pomočjo računalniškega modela so identificirali resilinu podobne polipeptide (RLP), kot potencialne molekule za nastanek kondenzatov. RLP izhajajo iz proteina resilin, ki ga najdemo v mušici ''Drosophila melanogaster''. Da bi dosegli plazmidno sekvestracijo, so spojili protein ParB, ki veže DNA, skupaj z RLP-ji. Protein ParB reagira s specifičnim zaporedjem DNA in rekrutira plazmid. Fuzija proteina ParB z RLP (fuzija RLP–DBD in RLP–DBD–DD) je omogočila lokalizacijo ciljnega plazmida [1].

===Modularna izgradnja sintetičnih kondenzatov v ''E. coli''===
Preučevanje izgradnje sintetičnih kondenzatov v ''E. coli'' je potekalo preko fuzije funkcionalnih domen (DBD in DD) na ponavljajoče se oktapeptide RLP divjega tipa (RLPWT). Fuzije RLPWT–DBD in RLPWT–DBD–DD tvorijo različne kondenzate, ki so jih opazili pri proučevanju s fluorescenčno mikroskopijo (konstrukte so spojili z monomernim GFP). Po indukciji ekspresije proteinov, se je s časom površina kondenzatov povečevala. Najhitreje so se oblikovali kondenzati fuzije RLPWT–DBD–DD, ki so tudi zasegli največ površine v primerjavi s fuzijo RLPWT–DBD in samim RLPWT. Za potrditev teh opažanj so uporabili diferencialno interferenčno kontrastno spektroskopijo (DIC), kjer so kondenzate neposredno opazovali (niso bili spojeni z mGFP kot pri fluorescenčni mikroskopiji). Tudi pri DIC so bila opažanja enaka. Izvedli so tudi poskuse ''in vitro'' ter ''in vivo'', kjer so kondenzate izpostavili različnim pogojem. S testom posedanja so določili količinski prispevek posamezne domene k ločevanju faz. Ugotovitve kažejo, da so prispevki posameznih domen k ločevanju faz podobni ''in vivo'' ter ''in vitro'' [3].

===Programiranje homotipskih in heterotipskih interakcij ločevanja faz===
Naslednja stopnja je bila programiranje nastanka kondenzatov in nadzorovanje njihovih fizikalnih lastnosti z uporabo synIDP. Po preučitvi odzivnosti synIDP na različne dejavnike, so ugotovili, da kondenzati, ki jih tvori RLPWT, občutljivi na soli, spremembe v koncentraciji proteinov ipd. Da bi se temu izognili, so spremenili porazdelitev nabitih aromatskih aminokislinskih ostankov v zaporedju synIDP. Grozdenje aromatskih aminokislinskih ostankov je povečajo moč posameznih interakcij in omejilo mobilnost posameznih segmentov v kondenzatu. Nasprotno se je ob porazdelitvi nasprotno nabitih aminokislinskih ostankov povečalo število elektrostatskih interakcij; zmanjšala se je koncentracija nasičenja, ki je potrebna za tvorbo kondenzata. Specifične modifikacije lahko vplivajo na koeficiente difuzije in mobilnost znotraj kondenzatov. Ugotovili so, da dodatek domene DD dodatno zmanjša koeficient difuzije, kar kaže njegov vpliv na fizikalne lastnosti kondenzata [3].
Potrdili so prispevek heterotipskih interakcij k spodbujanju ločevanja faz. Preučevali so vpliv elementa DNA, ki vsebuje ''parS'', na lastnosti kondenzatov. Prisotnost take DNA je vplivala na znižanje kritične koncentracije kondenzata, nastalega s fuzijo synIDP–dParB, kar je povzročilo ločitev faz in da je sintetični kondenzat ločil ciljno DNA. Povečanje števila mest ''parS'' na DNA je povzročilo nastanek večjih kondenzatov [3].

===Lastnosti sintetičnih kondenzatov z DNA===
Kondenzati imajo sposobnost sproženja asimetrične delitve plazmidov v ''E. coli''. Fuzija RLPWT–DBD–DD in zaporedje ''parS'' sta bila kodirana v dveh različnih kompatibilnih plazmidih. Celice ''E. coli'' so gojili z in brez indukcije IPTG, uporabljena je bila kanamicinska selekcija. Indukcija RLPWT–DBD–DD je značilno zmanjšala število celic, ki so vsebovale oba plazmida, kar so potrdili s konfokalno mikroskopijo. Opazili so tudi, da je bilo v tem primeru zaporedje ''parS'' daleč od mesta ori. Kondenzati ustvarijo prostorski predel, ki vodi v asimetrično delitev plazmidov. Slednje so dokazali z uporabo kinetičnega modela [3].

Veliko plazmidov se lahko med bakterijskimi populacijami prenašajo s konjugacijo. Raziskovalci so predpostavili, da bi sintetični kondenzati lahko onemogočali tak prenos genov. Hipotezo so tudi potrdili s pomočjo sintetičnega konjugacijskega sistema [3].

Preučevali so tudi vpliv kondenzatov na aktivacijo transkripcije. Uporabili so kinetični model za primerjavo učinkov različnih komponent na transkripcijo. Model je predvideval, da lahko prisotnost kondenzatov poveča učinkovitost transkripcije. Uporabili so mutirani transkripcijski faktor SoxS(R93A), ki se ne more vezati na specifično zaporedje DNA in nima sposobnosti vpliva na izražanje genov. Za namen raziskave so ustvarili plazmid, ki je vseboval konstitutivni promotor in mesto ''parS'', ki mu je sledilo tarčno zaporedje. S spojitvijo SoxS(R93A) s koaktivatorjem in tvorbo sintetičnega kondenzata so dosegli povečanje transkripcije. Opazili so namreč povečano izražanje rdečega fluorescenčnega proteina (RFP). Poleg tega so dokazali tudi, da je vključitev dodatnih vezavnih mest za ''parS'' na tarčnem plazmidu povečala izražanje genov. V primerjavi z običajno aktivacijo, ki je posredovana preko interakcije ključ-ključavnica, so ugotovili, da ima aktivacija transkripcije, ki je posredovana preko kondenzatov, večji vpliv na izražanje genov [3].

Študijo so razširili tudi na preučevanje učinkov, ki jih imajo sintetični kondenzati na aktivnosti v sesalskih celicah. Ustvarili so reporterski protein, ki je vseboval citrin fluorescentni protein, spojen z DHFR, ki vodi do razgradnje fuzijskega partnerja. Za nadzorovanje njegove aktivnosti so naredili fuzijo antiparalelne levcinske zadrge Czipper na N-koncu reporterskega proteina. Sintetizirali so sesalsko domeno synIDP, RLPS-Y, za nastanek sintetičnih kondenzatov. synIDP so spojili z drugo levcinsko zadrgo, Nzipper, da so lahko zagotovili nadzorovano združitev reporterskega proteina v kondenzate. V eksperimentih s celicami HEK293 so opazili, da je zaradi nastanka kondenzatov RLPS-Y-Nzipper prišlo do delne zaščite reporterskega proteina pred razgradnjo, kar je vodilo do ponovne fluorescence citrina. Pri celicah, ki so izražale samo RLPS-Y ali Nzipper, ni bilo razlike v fluorescenci (nezmožnost izražanja reporterskega proteina), medtem ko je sočasno izražanje RLPS-Y-Nzipper in reporterskega proteina omogočilo delno obnovitev fluorescence. S sintetičnimi kondenzati lahko tudi v sesalskih celicah uravnavamo aktivnost proteinov, tako da njihova uporaba predstavlja potencialno orodje za nadzor celičnih procesov [3].

==Zaključek==
V raziskavi [3] so predstavljeni novi načini nadzora celične aktivnosti. Prejšnje raziskave so slonele večinoma na principu »ključ-ključavnica«, pri čemer so uporabili proteine in ostale biomolekule, ki so bili ravno prave oblike za interakcije s specifičnimi tarčami. Vendar so dokazali, da celice ne morejo nadzorovati vseh procesov na tak način. Pakiranje biomolekulskih skupkov v celicah tvori obsežno in zapleteno mrežo biomolekul, tako da je posamezne mehanizme in interakcije težko nadzorovati s sledenjem ciljnim molekulam. Gensko kodirane synIDP, ki lahko preklapljajo med različnimi faznimi stanji, je moč uporabiti za načrtovanje funkcionalnih kondenzatov v živih celicah. S pomočjo takih biomolekularnih kondenzatov lahko raziskovalci ustvarijo kompartmente znotraj celic, ki ločujejo določene molekule od citosola. Te sintetične kondenzate se tako lahko uporablja za nadzorovanje celične aktivnosti. En primer uporabe je, da lahko z njihovo uporabo ustvarimo okolje znotraj celic, ki lahko selektivno obogati plazmide in s tem poveča učinkovitost transkripcije [3].

==Literatura==
[1] S. F. Banani, H. O. Lee, A. A. Hyman, M. K. Rosen: ''Biomolecular condensates: Organizers of cellular biochemistry''. '''2017''', ''18(5)'', str. 285-298.

[2] S. Do, C. Lee, T. Lee, D. N. Kim, Y. Shin: Engineering DNA-based synthetic condensates with programmable material properties, compositions, and functionalities. ''Sci. Adv.'' '''2022''', ''8(41)'', str. 1–15

[3] Y. Dai, M. Farag, D. Lee, X. Zeng, K. Kim, H. in Son, X. Guo, J. Su, N. Peterson, L. You: Programmable synthetic biomolecular condensates for cellular control. ''Nat. Chem. Biol''. '''2023''', ''19(4)'', str. 518-528.

Programabilni sintetični biomolekulski kondenzati za nadzor celičnih procesov

2023-05-17T10:22:11Z

Anja Konjc: /* Razvoj sintetičnih funkcionalnih kondenzatov */

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41589-022-01252-8 Y. Dai, M. Farag, D. Lee, X. Zeng, K. Kim, H. in Son, X. Guo, J. Su, N. Peterson, L. You: Programmable synthetic biomolecular condensates for cellular control. ''Nat. Chem. Biol''. '''2023''', ''19(4)'', str. 518-528.]
==Uvod==
Kompartmentalizacija predstavlja eno ključnih vlog pri razvoju evkariontske celice. Znotrajcelični organeli oz. kompartmenti, obdani iz lipidno membrano, omogočajo ustvarjanje lokalnih pogojev za določen celični proces. Poleg klasičnih organelov so v celici prisotni tudi prehodni, začasni skupki nagnetenih molekul, ki sicer spominjajo na membranske organele, le da niso obdani z lipidno membrano. Imenujemo jih biomolekulski kondenzati in nastanejo zaradi združevanja bioloških makromolekul (proteinov in nukleinskih kislin) [1]. Biomolekulski kondenzati sodelujejo v različnih celičnih procesih, od regulacije genov do regulacije celičnega stresa. Inženiring umetnih biomolekulskih kondenzatov omogoča boljše razumevanje organizacije le-teh in sintezo umetnih sistemov z novimi funkcijami [2]. Nastanek takih kondenzatov lahko poganja fazno ločevanje, povezano s perkolacijo/pronicanjem intrinzično neurejenih proteinov (PSCP) [3]. Intrinzično neurejeni proteini zaradi specifične aminokislinske sestave nimajo stalne tridimenzionalne strukture. V raztopini lahko hitro preklapljajo med različnimi energetskimi stanji [1]. Kondenzati lahko selektivno obogatijo ali osiromašijo biomolekule, kar omogoča nadzor nad celičnimi procesi. Sintetične kondenzate, ki jih tvorijo naravno prisotni intrinzično neurejeni proteini, spojeni z različnimi funkcionalnimi domenami, so uporabili za nadzor celične proliferacije. Do sedaj so preučevali različne vzorce, ki vodijo fazno ločbo intrinzično neurejenih proteinov. Raziskovalna skupina v tem članku [3] pa je sintetizirala funkcionalne biomolekulske kondenzate z upoštevanjem do sedaj znanih pravil nastanka tovrstnih skupkov za preučevanje njihovega delovanja v celicah, in kako jih lahko uporabimo za nadzorovanje celičnih procesov [3].

==Rezultati==
===Razvoj sintetičnih funkcionalnih kondenzatov===
Z razvojem sintetičnih kondenzatov so želeli nadzorovati sekvestracijo plazmidov (ločevanje plazmidne DNA) in transkripcijo. Zasnovali so sintetične intrinzično neurejene proteine (synIDP), ki so jih spojili skupaj s funkcionalnimi proteinskimi domenami. Raziskovali so različne dejavnike, ki prispevajo k nastanku kondenzatov. S pomočjo računalniškega modela so identificirali resilinu podobne polipeptide (RLP), kot potencialne molekule za nastanek kondenzatov. RLP izhajajo iz proteina resilin, ki ga najdemo v mušici ''Drosophila melanogaster''. Da bi dosegli plazmidno sekvestracijo, so spojili protein ParB, ki veže DNA, skupaj z RLP-ji. Protein ParB reagira s specifičnim zaporedjem DNA in rekrutira plazmid. Fuzija proteina ParB z RLP (fuzija RLP–DBD in RLP–DBD–DD) je omogočila lokalizacijo ciljnega plazmida [1].

===Modularna izgradnja sintetičnih kondenzatov v ''E. coli''===
Preučevanje izgradnje sintetičnih kondenzatov v ''E. coli'' je potekalo preko fuzije funkcionalnih domen (DBD in DD) na ponavljajoče se oktapeptide RLP divjega tipa (RLPWT). Fuzije RLPWT–DBD in RLPWT–DBD–DD tvorijo različne kondenzate, ki so jih opazili pri proučevanju s fluorescenčno mikroskopijo (konstrukte so spojili z monomernim GFP). Po indukciji ekspresije proteinov, se je s časom površina kondenzatov povečevala. Najhitreje so se oblikovali kondenzati fuzije RLPWT–DBD–DD, ki so tudi zasegli največ površine v primerjavi s fuzijo RLPWT–DBD in samim RLPWT. Za potrditev teh opažanj so uporabili diferencialno interferenčno kontrastno spektroskopijo (DIC), kjer so kondenzate neposredno opazovali (niso bili spojeni z mGFP kot pri fluorescenčni mikroskopiji). Tudi pri DIC so bila opažanja enaka. Izvedli so tudi poskuse in vitro ter in vitro, kjer so kondenzate izpostavili različnim pogojem. S testom posedanja so določili količinski prispevek posamezne domene k ločevanju faz. Ugotovitve kažejo, da so prispevki posameznih domen k ločevanju faz podobni ''in vivo'' ter ''in vitro'' [3].

===Programiranje homotipskih in heterotipskih interakcij ločevanja faz===
Naslednja stopnja je bila programiranje nastanka kondenzatov in nadzorovanje njihovih fizikalnih lastnosti z uporabo synIDP. Po preučitvi odzivnosti synIDP na različne dejavnike, so ugotovili, da kondenzati, ki jih tvori RLPWT, občutljivi na soli, spremembe v koncentraciji proteinov ipd. Da bi se temu izognili, so spremenili porazdelitev nabitih aromatskih aminokislinskih ostankov v zaporedju synIDP. Grozdenje aromatskih aminokislinskih ostankov je povečajo moč posameznih interakcij in omejilo mobilnost posameznih segmentov v kondenzatu. Nasprotno se je ob porazdelitvi nasprotno nabitih aminokislinskih ostankov povečalo število elektrostatskih interakcij; zmanjšala se je koncentracija nasičenja, ki je potrebna za tvorbo kondenzata. Specifične modifikacije lahko vplivajo na koeficiente difuzije in mobilnost znotraj kondenzatov. Ugotovili so, da dodatek domene DD dodatno zmanjša koeficient difuzije, kar kaže njegov vpliv na fizikalne lastnosti kondenzata [3].
Potrdili so prispevek heterotipskih interakcij k spodbujanju ločevanja faz. Preučevali so vpliv elementa DNA, ki vsebuje ''parS'', na lastnosti kondenzatov. Prisotnost take DNA je vplivala na znižanje kritične koncentracije kondenzata, nastalega s fuzijo synIDP–dParB, kar je povzročilo ločitev faz in da je sintetični kondenzat ločil ciljno DNA. Povečanje števila mest ''parS'' na DNA je povzročilo nastanek večjih kondenzatov [3].

===Lastnosti sintetičnih kondenzatov z DNA===
Kondenzati imajo sposobnost sproženja asimetrične delitve plazmidov v ''E. coli''. Fuzija RLPWT–DBD–DD in zaporedje ''parS'' sta bila kodirana v dveh različnih kompatibilnih plazmidih. Celice ''E. coli'' so gojili z in brez indukcije IPTG, uporabljena je bila kanamicinska selekcija. Indukcija RLPWT–DBD–DD je značilno zmanjšala število celic, ki so vsebovale oba plazmida, kar so potrdili s konfokalno mikroskopijo. Opazili so tudi, da je bilo v tem primeru zaporedje ''parS'' daleč od mesta ori. Kondenzati ustvarijo prostorski predel, ki vodi v asimetrično delitev plazmidov. Slednje so dokazali z uporabo kinetičnega modela [3].

Veliko plazmidov se lahko med bakterijskimi populacijami prenašajo s konjugacijo. Raziskovalci so predpostavili, da bi sintetični kondenzati lahko onemogočali tak prenos genov. Hipotezo so tudi potrdili s pomočjo sintetičnega konjugacijskega sistema [3].

Preučevali so tudi vpliv kondenzatov na aktivacijo transkripcije. Uporabili so kinetični model za primerjavo učinkov različnih komponent na transkripcijo. Model je predvideval, da lahko prisotnost kondenzatov poveča učinkovitost transkripcije. Uporabili so mutirani transkripcijski faktor SoxS(R93A), ki se ne more vezati na specifično zaporedje DNA in nima sposobnosti vpliva na izražanje genov. Za namen raziskave so ustvarili plazmid, ki je vseboval konstitutivni promotor in mesto ''parS'', ki mu je sledilo tarčno zaporedje. S spojitvijo SoxS(R93A) s koaktivatorjem in tvorbo sintetičnega kondenzata so dosegli povečanje transkripcije. Opazili so namreč povečano izražanje rdečega fluorescenčnega proteina (RFP). Poleg tega so dokazali tudi, da je vključitev dodatnih vezavnih mest za ''parS'' na tarčnem plazmidu povečala izražanje genov. V primerjavi z običajno aktivacijo, ki je posredovana preko interakcije ključ-ključavnica, so ugotovili, da ima aktivacija transkripcije, ki je posredovana preko kondenzatov, večji vpliv na izražanje genov [3].

Študijo so razširili tudi na preučevanje učinkov, ki jih imajo sintetični kondenzati na aktivnosti v sesalskih celicah. Ustvarili so reporterski protein, ki je vseboval citrin fluorescentni protein, spojen z DHFR, ki vodi do razgradnje fuzijskega partnerja. Za nadzorovanje njegove aktivnosti so naredili fuzijo antiparalelne levcinske zadrge Czipper na N-koncu reporterskega proteina. Sintetizirali so sesalsko domeno synIDP, RLPS-Y, za nastanek sintetičnih kondenzatov. synIDP so spojili z drugo levcinsko zadrgo, Nzipper, da so lahko zagotovili nadzorovano združitev reporterskega proteina v kondenzate. V eksperimentih s celicami HEK293 so opazili, da je zaradi nastanka kondenzatov RLPS-Y-Nzipper prišlo do delne zaščite reporterskega proteina pred razgradnjo, kar je vodilo do ponovne fluorescence citrina. Pri celicah, ki so izražale samo RLPS-Y ali Nzipper, ni bilo razlike v fluorescenci (nezmožnost izražanja reporterskega proteina), medtem ko je sočasno izražanje RLPS-Y-Nzipper in reporterskega proteina omogočilo delno obnovitev fluorescence. S sintetičnimi kondenzati lahko tudi v sesalskih celicah uravnavamo aktivnost proteinov, tako da njihova uporaba predstavlja potencialno orodje za nadzor celičnih procesov [3].

==Zaključek==
V raziskavi [3] so predstavljeni novi načini nadzora celične aktivnosti. Prejšnje raziskave so slonele večinoma na principu »ključ-ključavnica«, pri čemer so uporabili proteine in ostale biomolekule, ki so bili ravno prave oblike za interakcije s specifičnimi tarčami. Vendar so dokazali, da celice ne morejo nadzorovati vseh procesov na tak način. Pakiranje biomolekulskih skupkov v celicah tvori obsežno in zapleteno mrežo biomolekul, tako da je posamezne mehanizme in interakcije težko nadzorovati s sledenjem ciljnim molekulam. Gensko kodirane synIDP, ki lahko preklapljajo med različnimi faznimi stanji, je moč uporabiti za načrtovanje funkcionalnih kondenzatov v živih celicah. S pomočjo takih biomolekularnih kondenzatov lahko raziskovalci ustvarijo kompartmente znotraj celic, ki ločujejo določene molekule od citosola. Te sintetične kondenzate se tako lahko uporablja za nadzorovanje celične aktivnosti. En primer uporabe je, da lahko z njihovo uporabo ustvarimo okolje znotraj celic, ki lahko selektivno obogati plazmide in s tem poveča učinkovitost transkripcije [3].

==Literatura==
[1] S. F. Banani, H. O. Lee, A. A. Hyman, M. K. Rosen: ''Biomolecular condensates: Organizers of cellular biochemistry''. '''2017''', ''18(5)'', str. 285-298.

[2] S. Do, C. Lee, T. Lee, D. N. Kim, Y. Shin: Engineering DNA-based synthetic condensates with programmable material properties, compositions, and functionalities. ''Sci. Adv.'' '''2022''', ''8(41)'', str. 1–15

[3] Y. Dai, M. Farag, D. Lee, X. Zeng, K. Kim, H. in Son, X. Guo, J. Su, N. Peterson, L. You: Programmable synthetic biomolecular condensates for cellular control. ''Nat. Chem. Biol''. '''2023''', ''19(4)'', str. 518-528.

Programabilni sintetični biomolekulski kondenzati za nadzor celičnih procesov

2023-05-17T10:19:32Z

Anja Konjc: /* Uvod */

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41589-022-01252-8 Y. Dai, M. Farag, D. Lee, X. Zeng, K. Kim, H. in Son, X. Guo, J. Su, N. Peterson, L. You: Programmable synthetic biomolecular condensates for cellular control. ''Nat. Chem. Biol''. '''2023''', ''19(4)'', str. 518-528.]
==Uvod==
Kompartmentalizacija predstavlja eno ključnih vlog pri razvoju evkariontske celice. Znotrajcelični organeli oz. kompartmenti, obdani iz lipidno membrano, omogočajo ustvarjanje lokalnih pogojev za določen celični proces. Poleg klasičnih organelov so v celici prisotni tudi prehodni, začasni skupki nagnetenih molekul, ki sicer spominjajo na membranske organele, le da niso obdani z lipidno membrano. Imenujemo jih biomolekulski kondenzati in nastanejo zaradi združevanja bioloških makromolekul (proteinov in nukleinskih kislin) [1]. Biomolekulski kondenzati sodelujejo v različnih celičnih procesih, od regulacije genov do regulacije celičnega stresa. Inženiring umetnih biomolekulskih kondenzatov omogoča boljše razumevanje organizacije le-teh in sintezo umetnih sistemov z novimi funkcijami [2]. Nastanek takih kondenzatov lahko poganja fazno ločevanje, povezano s perkolacijo/pronicanjem intrinzično neurejenih proteinov (PSCP) [3]. Intrinzično neurejeni proteini zaradi specifične aminokislinske sestave nimajo stalne tridimenzionalne strukture. V raztopini lahko hitro preklapljajo med različnimi energetskimi stanji [1]. Kondenzati lahko selektivno obogatijo ali osiromašijo biomolekule, kar omogoča nadzor nad celičnimi procesi. Sintetične kondenzate, ki jih tvorijo naravno prisotni intrinzično neurejeni proteini, spojeni z različnimi funkcionalnimi domenami, so uporabili za nadzor celične proliferacije. Do sedaj so preučevali različne vzorce, ki vodijo fazno ločbo intrinzično neurejenih proteinov. Raziskovalna skupina v tem članku [3] pa je sintetizirala funkcionalne biomolekulske kondenzate z upoštevanjem do sedaj znanih pravil nastanka tovrstnih skupkov za preučevanje njihovega delovanja v celicah, in kako jih lahko uporabimo za nadzorovanje celičnih procesov [3].

==Rezultati==
===Razvoj sintetičnih funkcionalnih kondenzatov===
Z razvojem sintetičnih kondenzatov so želeli nadzorovati sekvestracijo plazmidov (ločevanje plazmidne DNA) in transkripcijo. Zasnovali so sintetične intrinzično urejene proteine (synIDP), ki so jih spojili skupaj s funkcionalnimi proteinskimi domenami. Raziskovali so različne dejavnike, ki prispevajo k nastanku kondenzatov. S pomočjo računalniškega modela so identificirali resilinu podobne polipeptide (RLP), kot potencialne molekule za nastanek kondenzatov. RLP izhajajo iz proteina resilin, ki ga najdemo v mušici ''Drosophila melanogaster''. Da bi dosegli plazmidno sekvestracijo, so spojili protein ParB, ki veže DNA, skupaj z RLP-ji. Protein ParB reagira s specifičnim zaporedjem DNA in rekrutira plazmid. Fuzija proteina ParB z RLP (fuzija RLP–DBD in RLP–DBD–DD) je omogočila lokalizacijo ciljnega plazmida [1].

===Modularna izgradnja sintetičnih kondenzatov v ''E. coli''===
Preučevanje izgradnje sintetičnih kondenzatov v ''E. coli'' je potekalo preko fuzije funkcionalnih domen (DBD in DD) na ponavljajoče se oktapeptide RLP divjega tipa (RLPWT). Fuzije RLPWT–DBD in RLPWT–DBD–DD tvorijo različne kondenzate, ki so jih opazili pri proučevanju s fluorescenčno mikroskopijo (konstrukte so spojili z monomernim GFP). Po indukciji ekspresije proteinov, se je s časom površina kondenzatov povečevala. Najhitreje so se oblikovali kondenzati fuzije RLPWT–DBD–DD, ki so tudi zasegli največ površine v primerjavi s fuzijo RLPWT–DBD in samim RLPWT. Za potrditev teh opažanj so uporabili diferencialno interferenčno kontrastno spektroskopijo (DIC), kjer so kondenzate neposredno opazovali (niso bili spojeni z mGFP kot pri fluorescenčni mikroskopiji). Tudi pri DIC so bila opažanja enaka. Izvedli so tudi poskuse in vitro ter in vitro, kjer so kondenzate izpostavili različnim pogojem. S testom posedanja so določili količinski prispevek posamezne domene k ločevanju faz. Ugotovitve kažejo, da so prispevki posameznih domen k ločevanju faz podobni ''in vivo'' ter ''in vitro'' [3].

===Programiranje homotipskih in heterotipskih interakcij ločevanja faz===
Naslednja stopnja je bila programiranje nastanka kondenzatov in nadzorovanje njihovih fizikalnih lastnosti z uporabo synIDP. Po preučitvi odzivnosti synIDP na različne dejavnike, so ugotovili, da kondenzati, ki jih tvori RLPWT, občutljivi na soli, spremembe v koncentraciji proteinov ipd. Da bi se temu izognili, so spremenili porazdelitev nabitih aromatskih aminokislinskih ostankov v zaporedju synIDP. Grozdenje aromatskih aminokislinskih ostankov je povečajo moč posameznih interakcij in omejilo mobilnost posameznih segmentov v kondenzatu. Nasprotno se je ob porazdelitvi nasprotno nabitih aminokislinskih ostankov povečalo število elektrostatskih interakcij; zmanjšala se je koncentracija nasičenja, ki je potrebna za tvorbo kondenzata. Specifične modifikacije lahko vplivajo na koeficiente difuzije in mobilnost znotraj kondenzatov. Ugotovili so, da dodatek domene DD dodatno zmanjša koeficient difuzije, kar kaže njegov vpliv na fizikalne lastnosti kondenzata [3].
Potrdili so prispevek heterotipskih interakcij k spodbujanju ločevanja faz. Preučevali so vpliv elementa DNA, ki vsebuje ''parS'', na lastnosti kondenzatov. Prisotnost take DNA je vplivala na znižanje kritične koncentracije kondenzata, nastalega s fuzijo synIDP–dParB, kar je povzročilo ločitev faz in da je sintetični kondenzat ločil ciljno DNA. Povečanje števila mest ''parS'' na DNA je povzročilo nastanek večjih kondenzatov [3].

===Lastnosti sintetičnih kondenzatov z DNA===
Kondenzati imajo sposobnost sproženja asimetrične delitve plazmidov v ''E. coli''. Fuzija RLPWT–DBD–DD in zaporedje ''parS'' sta bila kodirana v dveh različnih kompatibilnih plazmidih. Celice ''E. coli'' so gojili z in brez indukcije IPTG, uporabljena je bila kanamicinska selekcija. Indukcija RLPWT–DBD–DD je značilno zmanjšala število celic, ki so vsebovale oba plazmida, kar so potrdili s konfokalno mikroskopijo. Opazili so tudi, da je bilo v tem primeru zaporedje ''parS'' daleč od mesta ori. Kondenzati ustvarijo prostorski predel, ki vodi v asimetrično delitev plazmidov. Slednje so dokazali z uporabo kinetičnega modela [3].

Veliko plazmidov se lahko med bakterijskimi populacijami prenašajo s konjugacijo. Raziskovalci so predpostavili, da bi sintetični kondenzati lahko onemogočali tak prenos genov. Hipotezo so tudi potrdili s pomočjo sintetičnega konjugacijskega sistema [3].

Preučevali so tudi vpliv kondenzatov na aktivacijo transkripcije. Uporabili so kinetični model za primerjavo učinkov različnih komponent na transkripcijo. Model je predvideval, da lahko prisotnost kondenzatov poveča učinkovitost transkripcije. Uporabili so mutirani transkripcijski faktor SoxS(R93A), ki se ne more vezati na specifično zaporedje DNA in nima sposobnosti vpliva na izražanje genov. Za namen raziskave so ustvarili plazmid, ki je vseboval konstitutivni promotor in mesto ''parS'', ki mu je sledilo tarčno zaporedje. S spojitvijo SoxS(R93A) s koaktivatorjem in tvorbo sintetičnega kondenzata so dosegli povečanje transkripcije. Opazili so namreč povečano izražanje rdečega fluorescenčnega proteina (RFP). Poleg tega so dokazali tudi, da je vključitev dodatnih vezavnih mest za ''parS'' na tarčnem plazmidu povečala izražanje genov. V primerjavi z običajno aktivacijo, ki je posredovana preko interakcije ključ-ključavnica, so ugotovili, da ima aktivacija transkripcije, ki je posredovana preko kondenzatov, večji vpliv na izražanje genov [3].

Študijo so razširili tudi na preučevanje učinkov, ki jih imajo sintetični kondenzati na aktivnosti v sesalskih celicah. Ustvarili so reporterski protein, ki je vseboval citrin fluorescentni protein, spojen z DHFR, ki vodi do razgradnje fuzijskega partnerja. Za nadzorovanje njegove aktivnosti so naredili fuzijo antiparalelne levcinske zadrge Czipper na N-koncu reporterskega proteina. Sintetizirali so sesalsko domeno synIDP, RLPS-Y, za nastanek sintetičnih kondenzatov. synIDP so spojili z drugo levcinsko zadrgo, Nzipper, da so lahko zagotovili nadzorovano združitev reporterskega proteina v kondenzate. V eksperimentih s celicami HEK293 so opazili, da je zaradi nastanka kondenzatov RLPS-Y-Nzipper prišlo do delne zaščite reporterskega proteina pred razgradnjo, kar je vodilo do ponovne fluorescence citrina. Pri celicah, ki so izražale samo RLPS-Y ali Nzipper, ni bilo razlike v fluorescenci (nezmožnost izražanja reporterskega proteina), medtem ko je sočasno izražanje RLPS-Y-Nzipper in reporterskega proteina omogočilo delno obnovitev fluorescence. S sintetičnimi kondenzati lahko tudi v sesalskih celicah uravnavamo aktivnost proteinov, tako da njihova uporaba predstavlja potencialno orodje za nadzor celičnih procesov [3].

==Zaključek==
V raziskavi [3] so predstavljeni novi načini nadzora celične aktivnosti. Prejšnje raziskave so slonele večinoma na principu »ključ-ključavnica«, pri čemer so uporabili proteine in ostale biomolekule, ki so bili ravno prave oblike za interakcije s specifičnimi tarčami. Vendar so dokazali, da celice ne morejo nadzorovati vseh procesov na tak način. Pakiranje biomolekulskih skupkov v celicah tvori obsežno in zapleteno mrežo biomolekul, tako da je posamezne mehanizme in interakcije težko nadzorovati s sledenjem ciljnim molekulam. Gensko kodirane synIDP, ki lahko preklapljajo med različnimi faznimi stanji, je moč uporabiti za načrtovanje funkcionalnih kondenzatov v živih celicah. S pomočjo takih biomolekularnih kondenzatov lahko raziskovalci ustvarijo kompartmente znotraj celic, ki ločujejo določene molekule od citosola. Te sintetične kondenzate se tako lahko uporablja za nadzorovanje celične aktivnosti. En primer uporabe je, da lahko z njihovo uporabo ustvarimo okolje znotraj celic, ki lahko selektivno obogati plazmide in s tem poveča učinkovitost transkripcije [3].

==Literatura==
[1] S. F. Banani, H. O. Lee, A. A. Hyman, M. K. Rosen: ''Biomolecular condensates: Organizers of cellular biochemistry''. '''2017''', ''18(5)'', str. 285-298.

[2] S. Do, C. Lee, T. Lee, D. N. Kim, Y. Shin: Engineering DNA-based synthetic condensates with programmable material properties, compositions, and functionalities. ''Sci. Adv.'' '''2022''', ''8(41)'', str. 1–15

[3] Y. Dai, M. Farag, D. Lee, X. Zeng, K. Kim, H. in Son, X. Guo, J. Su, N. Peterson, L. You: Programmable synthetic biomolecular condensates for cellular control. ''Nat. Chem. Biol''. '''2023''', ''19(4)'', str. 518-528.

Programabilni sintetični biomolekulski kondenzati za nadzor celičnih procesov

2023-05-17T10:16:32Z

Anja Konjc: /* Uvod */

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41589-022-01252-8 Y. Dai, M. Farag, D. Lee, X. Zeng, K. Kim, H. in Son, X. Guo, J. Su, N. Peterson, L. You: Programmable synthetic biomolecular condensates for cellular control. ''Nat. Chem. Biol''. '''2023''', ''19(4)'', str. 518-528.]
==Uvod==
Kompartmentalizacija predstavlja eno ključnih vlog pri razvoju evkariontske celice. Znotrajcelični organeli oz. kompartmenti, obdani iz lipidno membrano, omogočajo ustvarjanje lokalnih pogojev za določen celični proces. Poleg klasičnih organelov so v celici prisotni tudi prehodni, začasni skupki nagnetenih molekul, ki sicer spominjajo na membranske organele, le da niso obdani z lipidno membrano. Imenujemo jih biomolekulski kondenzati in nastanejo zaradi združevanja bioloških makromolekul (proteinov in nukleinskih kislin) [1]. Biomolekulski kondenzati sodelujejo v različnih celičnih procesih, od regulacije genov do regulacije celičnega stresa. Inženiring umetnih biomolekulskih kondenzatov omogoča boljše razumevanje organizacije le-teh in sintezo umetnih sistemov z novimi funkcijami [2]. Nastanek takih kondenzatov lahko poganja fazno ločevanje, povezano s perkolacijo/pronicanjem intrinzično neurejenih proteinov (PSCP) [3]. Intrinzično neurejeni proteini zaradi specifične aminokislinske sestave nimajo stalne tridimenzionalne strukture. V raztopini lahko hitro preklapljajo med različnimi energetskimi stanji [1]. Kondenzati lahko selektivno obogatijo ali osiromašijo biomolekule, kar omogoča nadzor nad celičnimi procesi. Sintetične kondenzate, ki jih tvorijo naravno prisotni intrinzično urejeni proteini, spojeni z različnimi funkcionalnimi domenami, so uporabili za nadzor celične proliferacije. Do sedaj so preučevali različne vzorce, ki vodijo fazno ločbo intrinzično neurejenih proteinov. Raziskovalna skupina v tem članku [3] pa je sintetizirala funkcionalne biomolekulske kondenzate z upoštevanjem do sedaj znanih pravil nastanka tovrstnih skupkov za preučevanje njihovega delovanja v celicah, in kako jih lahko uporabimo za nadzorovanje celičnih procesov [3].

==Rezultati==
===Razvoj sintetičnih funkcionalnih kondenzatov===
Z razvojem sintetičnih kondenzatov so želeli nadzorovati sekvestracijo plazmidov (ločevanje plazmidne DNA) in transkripcijo. Zasnovali so sintetične intrinzično urejene proteine (synIDP), ki so jih spojili skupaj s funkcionalnimi proteinskimi domenami. Raziskovali so različne dejavnike, ki prispevajo k nastanku kondenzatov. S pomočjo računalniškega modela so identificirali resilinu podobne polipeptide (RLP), kot potencialne molekule za nastanek kondenzatov. RLP izhajajo iz proteina resilin, ki ga najdemo v mušici ''Drosophila melanogaster''. Da bi dosegli plazmidno sekvestracijo, so spojili protein ParB, ki veže DNA, skupaj z RLP-ji. Protein ParB reagira s specifičnim zaporedjem DNA in rekrutira plazmid. Fuzija proteina ParB z RLP (fuzija RLP–DBD in RLP–DBD–DD) je omogočila lokalizacijo ciljnega plazmida [1].

===Modularna izgradnja sintetičnih kondenzatov v ''E. coli''===
Preučevanje izgradnje sintetičnih kondenzatov v ''E. coli'' je potekalo preko fuzije funkcionalnih domen (DBD in DD) na ponavljajoče se oktapeptide RLP divjega tipa (RLPWT). Fuzije RLPWT–DBD in RLPWT–DBD–DD tvorijo različne kondenzate, ki so jih opazili pri proučevanju s fluorescenčno mikroskopijo (konstrukte so spojili z monomernim GFP). Po indukciji ekspresije proteinov, se je s časom površina kondenzatov povečevala. Najhitreje so se oblikovali kondenzati fuzije RLPWT–DBD–DD, ki so tudi zasegli največ površine v primerjavi s fuzijo RLPWT–DBD in samim RLPWT. Za potrditev teh opažanj so uporabili diferencialno interferenčno kontrastno spektroskopijo (DIC), kjer so kondenzate neposredno opazovali (niso bili spojeni z mGFP kot pri fluorescenčni mikroskopiji). Tudi pri DIC so bila opažanja enaka. Izvedli so tudi poskuse in vitro ter in vitro, kjer so kondenzate izpostavili različnim pogojem. S testom posedanja so določili količinski prispevek posamezne domene k ločevanju faz. Ugotovitve kažejo, da so prispevki posameznih domen k ločevanju faz podobni ''in vivo'' ter ''in vitro'' [3].

===Programiranje homotipskih in heterotipskih interakcij ločevanja faz===
Naslednja stopnja je bila programiranje nastanka kondenzatov in nadzorovanje njihovih fizikalnih lastnosti z uporabo synIDP. Po preučitvi odzivnosti synIDP na različne dejavnike, so ugotovili, da kondenzati, ki jih tvori RLPWT, občutljivi na soli, spremembe v koncentraciji proteinov ipd. Da bi se temu izognili, so spremenili porazdelitev nabitih aromatskih aminokislinskih ostankov v zaporedju synIDP. Grozdenje aromatskih aminokislinskih ostankov je povečajo moč posameznih interakcij in omejilo mobilnost posameznih segmentov v kondenzatu. Nasprotno se je ob porazdelitvi nasprotno nabitih aminokislinskih ostankov povečalo število elektrostatskih interakcij; zmanjšala se je koncentracija nasičenja, ki je potrebna za tvorbo kondenzata. Specifične modifikacije lahko vplivajo na koeficiente difuzije in mobilnost znotraj kondenzatov. Ugotovili so, da dodatek domene DD dodatno zmanjša koeficient difuzije, kar kaže njegov vpliv na fizikalne lastnosti kondenzata [3].
Potrdili so prispevek heterotipskih interakcij k spodbujanju ločevanja faz. Preučevali so vpliv elementa DNA, ki vsebuje ''parS'', na lastnosti kondenzatov. Prisotnost take DNA je vplivala na znižanje kritične koncentracije kondenzata, nastalega s fuzijo synIDP–dParB, kar je povzročilo ločitev faz in da je sintetični kondenzat ločil ciljno DNA. Povečanje števila mest ''parS'' na DNA je povzročilo nastanek večjih kondenzatov [3].

===Lastnosti sintetičnih kondenzatov z DNA===
Kondenzati imajo sposobnost sproženja asimetrične delitve plazmidov v ''E. coli''. Fuzija RLPWT–DBD–DD in zaporedje ''parS'' sta bila kodirana v dveh različnih kompatibilnih plazmidih. Celice ''E. coli'' so gojili z in brez indukcije IPTG, uporabljena je bila kanamicinska selekcija. Indukcija RLPWT–DBD–DD je značilno zmanjšala število celic, ki so vsebovale oba plazmida, kar so potrdili s konfokalno mikroskopijo. Opazili so tudi, da je bilo v tem primeru zaporedje ''parS'' daleč od mesta ori. Kondenzati ustvarijo prostorski predel, ki vodi v asimetrično delitev plazmidov. Slednje so dokazali z uporabo kinetičnega modela [3].

Veliko plazmidov se lahko med bakterijskimi populacijami prenašajo s konjugacijo. Raziskovalci so predpostavili, da bi sintetični kondenzati lahko onemogočali tak prenos genov. Hipotezo so tudi potrdili s pomočjo sintetičnega konjugacijskega sistema [3].

Preučevali so tudi vpliv kondenzatov na aktivacijo transkripcije. Uporabili so kinetični model za primerjavo učinkov različnih komponent na transkripcijo. Model je predvideval, da lahko prisotnost kondenzatov poveča učinkovitost transkripcije. Uporabili so mutirani transkripcijski faktor SoxS(R93A), ki se ne more vezati na specifično zaporedje DNA in nima sposobnosti vpliva na izražanje genov. Za namen raziskave so ustvarili plazmid, ki je vseboval konstitutivni promotor in mesto ''parS'', ki mu je sledilo tarčno zaporedje. S spojitvijo SoxS(R93A) s koaktivatorjem in tvorbo sintetičnega kondenzata so dosegli povečanje transkripcije. Opazili so namreč povečano izražanje rdečega fluorescenčnega proteina (RFP). Poleg tega so dokazali tudi, da je vključitev dodatnih vezavnih mest za ''parS'' na tarčnem plazmidu povečala izražanje genov. V primerjavi z običajno aktivacijo, ki je posredovana preko interakcije ključ-ključavnica, so ugotovili, da ima aktivacija transkripcije, ki je posredovana preko kondenzatov, večji vpliv na izražanje genov [3].

Študijo so razširili tudi na preučevanje učinkov, ki jih imajo sintetični kondenzati na aktivnosti v sesalskih celicah. Ustvarili so reporterski protein, ki je vseboval citrin fluorescentni protein, spojen z DHFR, ki vodi do razgradnje fuzijskega partnerja. Za nadzorovanje njegove aktivnosti so naredili fuzijo antiparalelne levcinske zadrge Czipper na N-koncu reporterskega proteina. Sintetizirali so sesalsko domeno synIDP, RLPS-Y, za nastanek sintetičnih kondenzatov. synIDP so spojili z drugo levcinsko zadrgo, Nzipper, da so lahko zagotovili nadzorovano združitev reporterskega proteina v kondenzate. V eksperimentih s celicami HEK293 so opazili, da je zaradi nastanka kondenzatov RLPS-Y-Nzipper prišlo do delne zaščite reporterskega proteina pred razgradnjo, kar je vodilo do ponovne fluorescence citrina. Pri celicah, ki so izražale samo RLPS-Y ali Nzipper, ni bilo razlike v fluorescenci (nezmožnost izražanja reporterskega proteina), medtem ko je sočasno izražanje RLPS-Y-Nzipper in reporterskega proteina omogočilo delno obnovitev fluorescence. S sintetičnimi kondenzati lahko tudi v sesalskih celicah uravnavamo aktivnost proteinov, tako da njihova uporaba predstavlja potencialno orodje za nadzor celičnih procesov [3].

==Zaključek==
V raziskavi [3] so predstavljeni novi načini nadzora celične aktivnosti. Prejšnje raziskave so slonele večinoma na principu »ključ-ključavnica«, pri čemer so uporabili proteine in ostale biomolekule, ki so bili ravno prave oblike za interakcije s specifičnimi tarčami. Vendar so dokazali, da celice ne morejo nadzorovati vseh procesov na tak način. Pakiranje biomolekulskih skupkov v celicah tvori obsežno in zapleteno mrežo biomolekul, tako da je posamezne mehanizme in interakcije težko nadzorovati s sledenjem ciljnim molekulam. Gensko kodirane synIDP, ki lahko preklapljajo med različnimi faznimi stanji, je moč uporabiti za načrtovanje funkcionalnih kondenzatov v živih celicah. S pomočjo takih biomolekularnih kondenzatov lahko raziskovalci ustvarijo kompartmente znotraj celic, ki ločujejo določene molekule od citosola. Te sintetične kondenzate se tako lahko uporablja za nadzorovanje celične aktivnosti. En primer uporabe je, da lahko z njihovo uporabo ustvarimo okolje znotraj celic, ki lahko selektivno obogati plazmide in s tem poveča učinkovitost transkripcije [3].

==Literatura==
[1] S. F. Banani, H. O. Lee, A. A. Hyman, M. K. Rosen: ''Biomolecular condensates: Organizers of cellular biochemistry''. '''2017''', ''18(5)'', str. 285-298.

[2] S. Do, C. Lee, T. Lee, D. N. Kim, Y. Shin: Engineering DNA-based synthetic condensates with programmable material properties, compositions, and functionalities. ''Sci. Adv.'' '''2022''', ''8(41)'', str. 1–15

[3] Y. Dai, M. Farag, D. Lee, X. Zeng, K. Kim, H. in Son, X. Guo, J. Su, N. Peterson, L. You: Programmable synthetic biomolecular condensates for cellular control. ''Nat. Chem. Biol''. '''2023''', ''19(4)'', str. 518-528.

Programabilni sintetični biomolekulski kondenzati za nadzor celičnih procesov

2023-05-17T10:14:47Z

Anja Konjc: /* Uvod */

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41589-022-01252-8 Y. Dai, M. Farag, D. Lee, X. Zeng, K. Kim, H. in Son, X. Guo, J. Su, N. Peterson, L. You: Programmable synthetic biomolecular condensates for cellular control. ''Nat. Chem. Biol''. '''2023''', ''19(4)'', str. 518-528.]
==Uvod==
Kompartmentalizacija predstavlja eno ključnih vlog pri razvoju evkariontske celice. Znotrajcelični organeli oz. kompartmenti, obdani iz lipidno membrano, omogočajo ustvarjanje lokalnih pogojev za določen celični proces. Poleg klasičnih organelov so v celici prisotni tudi prehodni, začasni skupki nagnetenih molekul, ki sicer spominjajo na membranske organele, le da niso obdani z lipidno membrano. Imenujemo jih biomolekulski kondenzati in nastanejo zaradi združevanja bioloških makromolekul (proteinov in nukleinskih kislin) [1]. Biomolekulski kondenzati sodelujejo v različnih celičnih procesih, od regulacije genov do regulacije celičnega stresa. Inženiring umetnih biomolekulskih kondenzatov omogoča boljše razumevanje organizacije le-teh in sintezo umetnih sistemov z novimi funkcijami [2] Nastanek takih kondenzatov lahko poganja fazno ločevanje, povezano s perkolacijo/pronicanjem intrinzično neurejenih proteinov (PSCP) [3]. Intrinzično neurejeni proteini zaradi specifične aminokislinske sestave nimajo stalne tridimenzionalne strukture. V raztopini lahko hitro preklapljajo med različnimi energetskimi stanji [1]. Kondenzati lahko selektivno obogatijo ali osiromašijo biomolekule, kar omogoča nadzor nad celičnimi procesi. Sintetične kondenzate, ki jih tvorijo naravno prisotni intrinzično urejeni proteini, spojeni z različnimi funkcionalnimi domenami, so uporabili za nadzor celične proliferacije. Do sedaj so preučevali različne vzorce, ki vodijo fazno ločbo intrinzično neurejenih proteinov. Raziskovalna skupina v tem članku [3] pa je sintetizirala funkcionalne biomolekulske kondenzate z upoštevanjem do sedaj znanih pravil nastanka tovrstnih skupkov za preučevanje njihovega delovanja v celicah, in kako jih lahko uporabimo za nadzorovanje celičnih procesov [3].

==Rezultati==
===Razvoj sintetičnih funkcionalnih kondenzatov===
Z razvojem sintetičnih kondenzatov so želeli nadzorovati sekvestracijo plazmidov (ločevanje plazmidne DNA) in transkripcijo. Zasnovali so sintetične intrinzično urejene proteine (synIDP), ki so jih spojili skupaj s funkcionalnimi proteinskimi domenami. Raziskovali so različne dejavnike, ki prispevajo k nastanku kondenzatov. S pomočjo računalniškega modela so identificirali resilinu podobne polipeptide (RLP), kot potencialne molekule za nastanek kondenzatov. RLP izhajajo iz proteina resilin, ki ga najdemo v mušici ''Drosophila melanogaster''. Da bi dosegli plazmidno sekvestracijo, so spojili protein ParB, ki veže DNA, skupaj z RLP-ji. Protein ParB reagira s specifičnim zaporedjem DNA in rekrutira plazmid. Fuzija proteina ParB z RLP (fuzija RLP–DBD in RLP–DBD–DD) je omogočila lokalizacijo ciljnega plazmida [1].

===Modularna izgradnja sintetičnih kondenzatov v ''E. coli''===
Preučevanje izgradnje sintetičnih kondenzatov v ''E. coli'' je potekalo preko fuzije funkcionalnih domen (DBD in DD) na ponavljajoče se oktapeptide RLP divjega tipa (RLPWT). Fuzije RLPWT–DBD in RLPWT–DBD–DD tvorijo različne kondenzate, ki so jih opazili pri proučevanju s fluorescenčno mikroskopijo (konstrukte so spojili z monomernim GFP). Po indukciji ekspresije proteinov, se je s časom površina kondenzatov povečevala. Najhitreje so se oblikovali kondenzati fuzije RLPWT–DBD–DD, ki so tudi zasegli največ površine v primerjavi s fuzijo RLPWT–DBD in samim RLPWT. Za potrditev teh opažanj so uporabili diferencialno interferenčno kontrastno spektroskopijo (DIC), kjer so kondenzate neposredno opazovali (niso bili spojeni z mGFP kot pri fluorescenčni mikroskopiji). Tudi pri DIC so bila opažanja enaka. Izvedli so tudi poskuse in vitro ter in vitro, kjer so kondenzate izpostavili različnim pogojem. S testom posedanja so določili količinski prispevek posamezne domene k ločevanju faz. Ugotovitve kažejo, da so prispevki posameznih domen k ločevanju faz podobni ''in vivo'' ter ''in vitro'' [3].

===Programiranje homotipskih in heterotipskih interakcij ločevanja faz===
Naslednja stopnja je bila programiranje nastanka kondenzatov in nadzorovanje njihovih fizikalnih lastnosti z uporabo synIDP. Po preučitvi odzivnosti synIDP na različne dejavnike, so ugotovili, da kondenzati, ki jih tvori RLPWT, občutljivi na soli, spremembe v koncentraciji proteinov ipd. Da bi se temu izognili, so spremenili porazdelitev nabitih aromatskih aminokislinskih ostankov v zaporedju synIDP. Grozdenje aromatskih aminokislinskih ostankov je povečajo moč posameznih interakcij in omejilo mobilnost posameznih segmentov v kondenzatu. Nasprotno se je ob porazdelitvi nasprotno nabitih aminokislinskih ostankov povečalo število elektrostatskih interakcij; zmanjšala se je koncentracija nasičenja, ki je potrebna za tvorbo kondenzata. Specifične modifikacije lahko vplivajo na koeficiente difuzije in mobilnost znotraj kondenzatov. Ugotovili so, da dodatek domene DD dodatno zmanjša koeficient difuzije, kar kaže njegov vpliv na fizikalne lastnosti kondenzata [3].
Potrdili so prispevek heterotipskih interakcij k spodbujanju ločevanja faz. Preučevali so vpliv elementa DNA, ki vsebuje ''parS'', na lastnosti kondenzatov. Prisotnost take DNA je vplivala na znižanje kritične koncentracije kondenzata, nastalega s fuzijo synIDP–dParB, kar je povzročilo ločitev faz in da je sintetični kondenzat ločil ciljno DNA. Povečanje števila mest ''parS'' na DNA je povzročilo nastanek večjih kondenzatov [3].

===Lastnosti sintetičnih kondenzatov z DNA===
Kondenzati imajo sposobnost sproženja asimetrične delitve plazmidov v ''E. coli''. Fuzija RLPWT–DBD–DD in zaporedje ''parS'' sta bila kodirana v dveh različnih kompatibilnih plazmidih. Celice ''E. coli'' so gojili z in brez indukcije IPTG, uporabljena je bila kanamicinska selekcija. Indukcija RLPWT–DBD–DD je značilno zmanjšala število celic, ki so vsebovale oba plazmida, kar so potrdili s konfokalno mikroskopijo. Opazili so tudi, da je bilo v tem primeru zaporedje ''parS'' daleč od mesta ori. Kondenzati ustvarijo prostorski predel, ki vodi v asimetrično delitev plazmidov. Slednje so dokazali z uporabo kinetičnega modela [3].

Veliko plazmidov se lahko med bakterijskimi populacijami prenašajo s konjugacijo. Raziskovalci so predpostavili, da bi sintetični kondenzati lahko onemogočali tak prenos genov. Hipotezo so tudi potrdili s pomočjo sintetičnega konjugacijskega sistema [3].

Preučevali so tudi vpliv kondenzatov na aktivacijo transkripcije. Uporabili so kinetični model za primerjavo učinkov različnih komponent na transkripcijo. Model je predvideval, da lahko prisotnost kondenzatov poveča učinkovitost transkripcije. Uporabili so mutirani transkripcijski faktor SoxS(R93A), ki se ne more vezati na specifično zaporedje DNA in nima sposobnosti vpliva na izražanje genov. Za namen raziskave so ustvarili plazmid, ki je vseboval konstitutivni promotor in mesto ''parS'', ki mu je sledilo tarčno zaporedje. S spojitvijo SoxS(R93A) s koaktivatorjem in tvorbo sintetičnega kondenzata so dosegli povečanje transkripcije. Opazili so namreč povečano izražanje rdečega fluorescenčnega proteina (RFP). Poleg tega so dokazali tudi, da je vključitev dodatnih vezavnih mest za ''parS'' na tarčnem plazmidu povečala izražanje genov. V primerjavi z običajno aktivacijo, ki je posredovana preko interakcije ključ-ključavnica, so ugotovili, da ima aktivacija transkripcije, ki je posredovana preko kondenzatov, večji vpliv na izražanje genov [3].

Študijo so razširili tudi na preučevanje učinkov, ki jih imajo sintetični kondenzati na aktivnosti v sesalskih celicah. Ustvarili so reporterski protein, ki je vseboval citrin fluorescentni protein, spojen z DHFR, ki vodi do razgradnje fuzijskega partnerja. Za nadzorovanje njegove aktivnosti so naredili fuzijo antiparalelne levcinske zadrge Czipper na N-koncu reporterskega proteina. Sintetizirali so sesalsko domeno synIDP, RLPS-Y, za nastanek sintetičnih kondenzatov. synIDP so spojili z drugo levcinsko zadrgo, Nzipper, da so lahko zagotovili nadzorovano združitev reporterskega proteina v kondenzate. V eksperimentih s celicami HEK293 so opazili, da je zaradi nastanka kondenzatov RLPS-Y-Nzipper prišlo do delne zaščite reporterskega proteina pred razgradnjo, kar je vodilo do ponovne fluorescence citrina. Pri celicah, ki so izražale samo RLPS-Y ali Nzipper, ni bilo razlike v fluorescenci (nezmožnost izražanja reporterskega proteina), medtem ko je sočasno izražanje RLPS-Y-Nzipper in reporterskega proteina omogočilo delno obnovitev fluorescence. S sintetičnimi kondenzati lahko tudi v sesalskih celicah uravnavamo aktivnost proteinov, tako da njihova uporaba predstavlja potencialno orodje za nadzor celičnih procesov [3].

==Zaključek==
V raziskavi [3] so predstavljeni novi načini nadzora celične aktivnosti. Prejšnje raziskave so slonele večinoma na principu »ključ-ključavnica«, pri čemer so uporabili proteine in ostale biomolekule, ki so bili ravno prave oblike za interakcije s specifičnimi tarčami. Vendar so dokazali, da celice ne morejo nadzorovati vseh procesov na tak način. Pakiranje biomolekulskih skupkov v celicah tvori obsežno in zapleteno mrežo biomolekul, tako da je posamezne mehanizme in interakcije težko nadzorovati s sledenjem ciljnim molekulam. Gensko kodirane synIDP, ki lahko preklapljajo med različnimi faznimi stanji, je moč uporabiti za načrtovanje funkcionalnih kondenzatov v živih celicah. S pomočjo takih biomolekularnih kondenzatov lahko raziskovalci ustvarijo kompartmente znotraj celic, ki ločujejo določene molekule od citosola. Te sintetične kondenzate se tako lahko uporablja za nadzorovanje celične aktivnosti. En primer uporabe je, da lahko z njihovo uporabo ustvarimo okolje znotraj celic, ki lahko selektivno obogati plazmide in s tem poveča učinkovitost transkripcije [3].

==Literatura==
[1] S. F. Banani, H. O. Lee, A. A. Hyman, M. K. Rosen: ''Biomolecular condensates: Organizers of cellular biochemistry''. '''2017''', ''18(5)'', str. 285-298.

[2] S. Do, C. Lee, T. Lee, D. N. Kim, Y. Shin: Engineering DNA-based synthetic condensates with programmable material properties, compositions, and functionalities. ''Sci. Adv.'' '''2022''', ''8(41)'', str. 1–15

[3] Y. Dai, M. Farag, D. Lee, X. Zeng, K. Kim, H. in Son, X. Guo, J. Su, N. Peterson, L. You: Programmable synthetic biomolecular condensates for cellular control. ''Nat. Chem. Biol''. '''2023''', ''19(4)'', str. 518-528.

Programabilni sintetični biomolekulski kondenzati za nadzor celičnih procesov

2023-05-17T09:10:40Z

Anja Konjc: /* Modularna izgradnja sintetičnih kondenzatov v E. coli */

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41589-022-01252-8 Y. Dai, M. Farag, D. Lee, X. Zeng, K. Kim, H. in Son, X. Guo, J. Su, N. Peterson, L. You: Programmable synthetic biomolecular condensates for cellular control. ''Nat. Chem. Biol''. '''2023''', ''19(4)'', str. 518-528.]
==Uvod==
Kompartmentalizacija predstavlja eno ključnih vlog pri razvoju evkariontske celice. Znotrajcelični organeli oz. kompartmenti, obdani iz lipidno membrano, omogočajo ustvarjanje lokalnih pogojev za določen celični proces. Poleg klasičnih organelov so v celici prisotni tudi prehodni, začasni skupki nagnetenih molekul, ki sicer spominjajo na membranske organele, le da niso obdani z lipidno membrano. Imenujemo jih biomolekulski kondenzati in nastanejo zaradi združevanja bioloških makromolekul (proteinov in nukleinskih kislin) [1]. Biomolekulski kondenzati sodelujejo v različnih celičnih procesih, od regulacije genov do regulacije celičnega stresa. Inženiring umetnih biomlekulskih kondenzatov omogoča boljše razumevanje organizacije le-teh in sintezo umetnih sistemov z novimi funkcijami [2] Nastanek takih kondenzatov lahko poganja fazno ločevanje, povezano s perkolacijo/pronicanjem intrinzično neurejenih proteinov (PSCP) [3]. Intrinzično neurejeni proteini zaradi specifične aminokislinske sestave nimajo stalne tridimenzionalne strukture. V raztopini lahko hitro preklapljajo med različnimi energetskimi stanji [1]. Kondenzati lahko selektivno obogatijo ali osiromašijo biomolekule, kar omogoča nadzor nad celičnimi procesi. Sintetične kondenzate, ki jih tvorijo naravno prisotni intrinzično urejeni proteini, spojeni z različnimi funkcionalnimi domenami, so uporabili za nadzor celične proliferacije. Do sedaj so preučevali različne vzorce, ki vodijo fazno ločbo intrinzično neurejenih proteinov. Raziskovalna skupina v tem članku [3] pa je sintetizirala funkcionalne biomolekulske kondenzate z upoštevanjem do sedaj znanih pravil nastanka tovrstnih skupkov za preučevanje njihovega delovanja v celicah, in kako jih lahko uporabimo za nadzorovanje celičnih procesov [3].

==Rezultati==
===Razvoj sintetičnih funkcionalnih kondenzatov===
Z razvojem sintetičnih kondenzatov so želeli nadzorovati sekvestracijo plazmidov (ločevanje plazmidne DNA) in transkripcijo. Zasnovali so sintetične intrinzično urejene proteine (synIDP), ki so jih spojili skupaj s funkcionalnimi proteinskimi domenami. Raziskovali so različne dejavnike, ki prispevajo k nastanku kondenzatov. S pomočjo računalniškega modela so identificirali resilinu podobne polipeptide (RLP), kot potencialne molekule za nastanek kondenzatov. RLP izhajajo iz proteina resilin, ki ga najdemo v mušici ''Drosophila melanogaster''. Da bi dosegli plazmidno sekvestracijo, so spojili protein ParB, ki veže DNA, skupaj z RLP-ji. Protein ParB reagira s specifičnim zaporedjem DNA in rekrutira plazmid. Fuzija proteina ParB z RLP (fuzija RLP–DBD in RLP–DBD–DD) je omogočila lokalizacijo ciljnega plazmida [1].

===Modularna izgradnja sintetičnih kondenzatov v ''E. coli''===
Preučevanje izgradnje sintetičnih kondenzatov v ''E. coli'' je potekalo preko fuzije funkcionalnih domen (DBD in DD) na ponavljajoče se oktapeptide RLP divjega tipa (RLPWT). Fuzije RLPWT–DBD in RLPWT–DBD–DD tvorijo različne kondenzate, ki so jih opazili pri proučevanju s fluorescenčno mikroskopijo (konstrukte so spojili z monomernim GFP). Po indukciji ekspresije proteinov, se je s časom površina kondenzatov povečevala. Najhitreje so se oblikovali kondenzati fuzije RLPWT–DBD–DD, ki so tudi zasegli največ površine v primerjavi s fuzijo RLPWT–DBD in samim RLPWT. Za potrditev teh opažanj so uporabili diferencialno interferenčno kontrastno spektroskopijo (DIC), kjer so kondenzate neposredno opazovali (niso bili spojeni z mGFP kot pri fluorescenčni mikroskopiji). Tudi pri DIC so bila opažanja enaka. Izvedli so tudi poskuse in vitro ter in vitro, kjer so kondenzate izpostavili različnim pogojem. S testom posedanja so določili količinski prispevek posamezne domene k ločevanju faz. Ugotovitve kažejo, da so prispevki posameznih domen k ločevanju faz podobni ''in vivo'' ter ''in vitro'' [3].

===Programiranje homotipskih in heterotipskih interakcij ločevanja faz===
Naslednja stopnja je bila programiranje nastanka kondenzatov in nadzorovanje njihovih fizikalnih lastnosti z uporabo synIDP. Po preučitvi odzivnosti synIDP na različne dejavnike, so ugotovili, da kondenzati, ki jih tvori RLPWT, občutljivi na soli, spremembe v koncentraciji proteinov ipd. Da bi se temu izognili, so spremenili porazdelitev nabitih aromatskih aminokislinskih ostankov v zaporedju synIDP. Grozdenje aromatskih aminokislinskih ostankov je povečajo moč posameznih interakcij in omejilo mobilnost posameznih segmentov v kondenzatu. Nasprotno se je ob porazdelitvi nasprotno nabitih aminokislinskih ostankov povečalo število elektrostatskih interakcij; zmanjšala se je koncentracija nasičenja, ki je potrebna za tvorbo kondenzata. Specifične modifikacije lahko vplivajo na koeficiente difuzije in mobilnost znotraj kondenzatov. Ugotovili so, da dodatek domene DD dodatno zmanjša koeficient difuzije, kar kaže njegov vpliv na fizikalne lastnosti kondenzata [3].
Potrdili so prispevek heterotipskih interakcij k spodbujanju ločevanja faz. Preučevali so vpliv elementa DNA, ki vsebuje ''parS'', na lastnosti kondenzatov. Prisotnost take DNA je vplivala na znižanje kritične koncentracije kondenzata, nastalega s fuzijo synIDP–dParB, kar je povzročilo ločitev faz in da je sintetični kondenzat ločil ciljno DNA. Povečanje števila mest ''parS'' na DNA je povzročilo nastanek večjih kondenzatov [3].

===Lastnosti sintetičnih kondenzatov z DNA===
Kondenzati imajo sposobnost sproženja asimetrične delitve plazmidov v ''E. coli''. Fuzija RLPWT–DBD–DD in zaporedje ''parS'' sta bila kodirana v dveh različnih kompatibilnih plazmidih. Celice ''E. coli'' so gojili z in brez indukcije IPTG, uporabljena je bila kanamicinska selekcija. Indukcija RLPWT–DBD–DD je značilno zmanjšala število celic, ki so vsebovale oba plazmida, kar so potrdili s konfokalno mikroskopijo. Opazili so tudi, da je bilo v tem primeru zaporedje ''parS'' daleč od mesta ori. Kondenzati ustvarijo prostorski predel, ki vodi v asimetrično delitev plazmidov. Slednje so dokazali z uporabo kinetičnega modela [3].

Veliko plazmidov se lahko med bakterijskimi populacijami prenašajo s konjugacijo. Raziskovalci so predpostavili, da bi sintetični kondenzati lahko onemogočali tak prenos genov. Hipotezo so tudi potrdili s pomočjo sintetičnega konjugacijskega sistema [3].

Preučevali so tudi vpliv kondenzatov na aktivacijo transkripcije. Uporabili so kinetični model za primerjavo učinkov različnih komponent na transkripcijo. Model je predvideval, da lahko prisotnost kondenzatov poveča učinkovitost transkripcije. Uporabili so mutirani transkripcijski faktor SoxS(R93A), ki se ne more vezati na specifično zaporedje DNA in nima sposobnosti vpliva na izražanje genov. Za namen raziskave so ustvarili plazmid, ki je vseboval konstitutivni promotor in mesto ''parS'', ki mu je sledilo tarčno zaporedje. S spojitvijo SoxS(R93A) s koaktivatorjem in tvorbo sintetičnega kondenzata so dosegli povečanje transkripcije. Opazili so namreč povečano izražanje rdečega fluorescenčnega proteina (RFP). Poleg tega so dokazali tudi, da je vključitev dodatnih vezavnih mest za ''parS'' na tarčnem plazmidu povečala izražanje genov. V primerjavi z običajno aktivacijo, ki je posredovana preko interakcije ključ-ključavnica, so ugotovili, da ima aktivacija transkripcije, ki je posredovana preko kondenzatov, večji vpliv na izražanje genov [3].

Študijo so razširili tudi na preučevanje učinkov, ki jih imajo sintetični kondenzati na aktivnosti v sesalskih celicah. Ustvarili so reporterski protein, ki je vseboval citrin fluorescentni protein, spojen z DHFR, ki vodi do razgradnje fuzijskega partnerja. Za nadzorovanje njegove aktivnosti so naredili fuzijo antiparalelne levcinske zadrge Czipper na N-koncu reporterskega proteina. Sintetizirali so sesalsko domeno synIDP, RLPS-Y, za nastanek sintetičnih kondenzatov. synIDP so spojili z drugo levcinsko zadrgo, Nzipper, da so lahko zagotovili nadzorovano združitev reporterskega proteina v kondenzate. V eksperimentih s celicami HEK293 so opazili, da je zaradi nastanka kondenzatov RLPS-Y-Nzipper prišlo do delne zaščite reporterskega proteina pred razgradnjo, kar je vodilo do ponovne fluorescence citrina. Pri celicah, ki so izražale samo RLPS-Y ali Nzipper, ni bilo razlike v fluorescenci (nezmožnost izražanja reporterskega proteina), medtem ko je sočasno izražanje RLPS-Y-Nzipper in reporterskega proteina omogočilo delno obnovitev fluorescence. S sintetičnimi kondenzati lahko tudi v sesalskih celicah uravnavamo aktivnost proteinov, tako da njihova uporaba predstavlja potencialno orodje za nadzor celičnih procesov [3].

==Zaključek==
V raziskavi [3] so predstavljeni novi načini nadzora celične aktivnosti. Prejšnje raziskave so slonele večinoma na principu »ključ-ključavnica«, pri čemer so uporabili proteine in ostale biomolekule, ki so bili ravno prave oblike za interakcije s specifičnimi tarčami. Vendar so dokazali, da celice ne morejo nadzorovati vseh procesov na tak način. Pakiranje biomolekulskih skupkov v celicah tvori obsežno in zapleteno mrežo biomolekul, tako da je posamezne mehanizme in interakcije težko nadzorovati s sledenjem ciljnim molekulam. Gensko kodirane synIDP, ki lahko preklapljajo med različnimi faznimi stanji, je moč uporabiti za načrtovanje funkcionalnih kondenzatov v živih celicah. S pomočjo takih biomolekularnih kondenzatov lahko raziskovalci ustvarijo kompartmente znotraj celic, ki ločujejo določene molekule od citosola. Te sintetične kondenzate se tako lahko uporablja za nadzorovanje celične aktivnosti. En primer uporabe je, da lahko z njihovo uporabo ustvarimo okolje znotraj celic, ki lahko selektivno obogati plazmide in s tem poveča učinkovitost transkripcije [3].

==Literatura==
[1] S. F. Banani, H. O. Lee, A. A. Hyman, M. K. Rosen: ''Biomolecular condensates: Organizers of cellular biochemistry''. '''2017''', ''18(5)'', str. 285-298.

[2] S. Do, C. Lee, T. Lee, D. N. Kim, Y. Shin: Engineering DNA-based synthetic condensates with programmable material properties, compositions, and functionalities. ''Sci. Adv.'' '''2022''', ''8(41)'', str. 1–15

[3] Y. Dai, M. Farag, D. Lee, X. Zeng, K. Kim, H. in Son, X. Guo, J. Su, N. Peterson, L. You: Programmable synthetic biomolecular condensates for cellular control. ''Nat. Chem. Biol''. '''2023''', ''19(4)'', str. 518-528.

Programabilni sintetični biomolekulski kondenzati za nadzor celičnih procesov

2023-05-17T08:43:15Z

Anja Konjc: /* Razvoj sintetičnih funkcionalnih kondenzatov */

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41589-022-01252-8 Y. Dai, M. Farag, D. Lee, X. Zeng, K. Kim, H. in Son, X. Guo, J. Su, N. Peterson, L. You: Programmable synthetic biomolecular condensates for cellular control. ''Nat. Chem. Biol''. '''2023''', ''19(4)'', str. 518-528.]
==Uvod==
Kompartmentalizacija predstavlja eno ključnih vlog pri razvoju evkariontske celice. Znotrajcelični organeli oz. kompartmenti, obdani iz lipidno membrano, omogočajo ustvarjanje lokalnih pogojev za določen celični proces. Poleg klasičnih organelov so v celici prisotni tudi prehodni, začasni skupki nagnetenih molekul, ki sicer spominjajo na membranske organele, le da niso obdani z lipidno membrano. Imenujemo jih biomolekulski kondenzati in nastanejo zaradi združevanja bioloških makromolekul (proteinov in nukleinskih kislin) [1]. Biomolekulski kondenzati sodelujejo v različnih celičnih procesih, od regulacije genov do regulacije celičnega stresa. Inženiring umetnih biomlekulskih kondenzatov omogoča boljše razumevanje organizacije le-teh in sintezo umetnih sistemov z novimi funkcijami [2] Nastanek takih kondenzatov lahko poganja fazno ločevanje, povezano s perkolacijo/pronicanjem intrinzično neurejenih proteinov (PSCP) [3]. Intrinzično neurejeni proteini zaradi specifične aminokislinske sestave nimajo stalne tridimenzionalne strukture. V raztopini lahko hitro preklapljajo med različnimi energetskimi stanji [1]. Kondenzati lahko selektivno obogatijo ali osiromašijo biomolekule, kar omogoča nadzor nad celičnimi procesi. Sintetične kondenzate, ki jih tvorijo naravno prisotni intrinzično urejeni proteini, spojeni z različnimi funkcionalnimi domenami, so uporabili za nadzor celične proliferacije. Do sedaj so preučevali različne vzorce, ki vodijo fazno ločbo intrinzično neurejenih proteinov. Raziskovalna skupina v tem članku [3] pa je sintetizirala funkcionalne biomolekulske kondenzate z upoštevanjem do sedaj znanih pravil nastanka tovrstnih skupkov za preučevanje njihovega delovanja v celicah, in kako jih lahko uporabimo za nadzorovanje celičnih procesov [3].

==Rezultati==
===Razvoj sintetičnih funkcionalnih kondenzatov===
Z razvojem sintetičnih kondenzatov so želeli nadzorovati sekvestracijo plazmidov (ločevanje plazmidne DNA) in transkripcijo. Zasnovali so sintetične intrinzično urejene proteine (synIDP), ki so jih spojili skupaj s funkcionalnimi proteinskimi domenami. Raziskovali so različne dejavnike, ki prispevajo k nastanku kondenzatov. S pomočjo računalniškega modela so identificirali resilinu podobne polipeptide (RLP), kot potencialne molekule za nastanek kondenzatov. RLP izhajajo iz proteina resilin, ki ga najdemo v mušici ''Drosophila melanogaster''. Da bi dosegli plazmidno sekvestracijo, so spojili protein ParB, ki veže DNA, skupaj z RLP-ji. Protein ParB reagira s specifičnim zaporedjem DNA in rekrutira plazmid. Fuzija proteina ParB z RLP (fuzija RLP–DBD in RLP–DBD–DD) je omogočila lokalizacijo ciljnega plazmida [1].

===Modularna izgradnja sintetičnih kondenzatov v ''E. coli''===
Preučevanje izgradnje sintetičnih kondenzatov v ''E. coli'' je potekalo preko fuzije funkcionalnih domen (DBD in DD) na ponavljajoče se oktapeptide RLP divjega tipa (RLPWT). Fuzije RLPWT–DBD in RLPWT–DBD–DD tvorijo različne kondenzate, ki so jih opazili pri proučevanju s fluorescenčno mikroskopijo (konstrukte so spojili z monomernim GFP). Po indukciji ekspresije proteinov, se je s časom površina kondenzatov povečevala. Najhitreje so se oblikovali kondenzati fuzije RLPWT–DBD–DD, ki so tudi zasegli največ površine v primerjavi s fuzijo RLPWT–DBD in samim RLPWT. Za potrditev teh opažanj so uporabili diferencialno interferenčno kontrastno spektroskopijo (DIC), kjer so kondenzate neposredno opazovali (niso bili spojeni z mGFP kot pri fluorescenčni mikroskopiji). Tudi pri DIC so bila opažanja enaka. Izvedli so tudi poskuse in vitro ter in vitro, kjer so kondenzate izpostavili različnim pogojem. S testom posedanja so določili količinski prispevek posamezne domene k ločevanju faz. Ugotovitve kažejo, da so prispevki posameznih domen k ločevanju faz podobni in vitro ter in vitro [3].

===Programiranje homotipskih in heterotipskih interakcij ločevanja faz===
Naslednja stopnja je bila programiranje nastanka kondenzatov in nadzorovanje njihovih fizikalnih lastnosti z uporabo synIDP. Po preučitvi odzivnosti synIDP na različne dejavnike, so ugotovili, da kondenzati, ki jih tvori RLPWT, občutljivi na soli, spremembe v koncentraciji proteinov ipd. Da bi se temu izognili, so spremenili porazdelitev nabitih aromatskih aminokislinskih ostankov v zaporedju synIDP. Grozdenje aromatskih aminokislinskih ostankov je povečajo moč posameznih interakcij in omejilo mobilnost posameznih segmentov v kondenzatu. Nasprotno se je ob porazdelitvi nasprotno nabitih aminokislinskih ostankov povečalo število elektrostatskih interakcij; zmanjšala se je koncentracija nasičenja, ki je potrebna za tvorbo kondenzata. Specifične modifikacije lahko vplivajo na koeficiente difuzije in mobilnost znotraj kondenzatov. Ugotovili so, da dodatek domene DD dodatno zmanjša koeficient difuzije, kar kaže njegov vpliv na fizikalne lastnosti kondenzata [3].
Potrdili so prispevek heterotipskih interakcij k spodbujanju ločevanja faz. Preučevali so vpliv elementa DNA, ki vsebuje ''parS'', na lastnosti kondenzatov. Prisotnost take DNA je vplivala na znižanje kritične koncentracije kondenzata, nastalega s fuzijo synIDP–dParB, kar je povzročilo ločitev faz in da je sintetični kondenzat ločil ciljno DNA. Povečanje števila mest ''parS'' na DNA je povzročilo nastanek večjih kondenzatov [3].

===Lastnosti sintetičnih kondenzatov z DNA===
Kondenzati imajo sposobnost sproženja asimetrične delitve plazmidov v ''E. coli''. Fuzija RLPWT–DBD–DD in zaporedje ''parS'' sta bila kodirana v dveh različnih kompatibilnih plazmidih. Celice ''E. coli'' so gojili z in brez indukcije IPTG, uporabljena je bila kanamicinska selekcija. Indukcija RLPWT–DBD–DD je značilno zmanjšala število celic, ki so vsebovale oba plazmida, kar so potrdili s konfokalno mikroskopijo. Opazili so tudi, da je bilo v tem primeru zaporedje ''parS'' daleč od mesta ori. Kondenzati ustvarijo prostorski predel, ki vodi v asimetrično delitev plazmidov. Slednje so dokazali z uporabo kinetičnega modela [3].

Veliko plazmidov se lahko med bakterijskimi populacijami prenašajo s konjugacijo. Raziskovalci so predpostavili, da bi sintetični kondenzati lahko onemogočali tak prenos genov. Hipotezo so tudi potrdili s pomočjo sintetičnega konjugacijskega sistema [3].

Preučevali so tudi vpliv kondenzatov na aktivacijo transkripcije. Uporabili so kinetični model za primerjavo učinkov različnih komponent na transkripcijo. Model je predvideval, da lahko prisotnost kondenzatov poveča učinkovitost transkripcije. Uporabili so mutirani transkripcijski faktor SoxS(R93A), ki se ne more vezati na specifično zaporedje DNA in nima sposobnosti vpliva na izražanje genov. Za namen raziskave so ustvarili plazmid, ki je vseboval konstitutivni promotor in mesto ''parS'', ki mu je sledilo tarčno zaporedje. S spojitvijo SoxS(R93A) s koaktivatorjem in tvorbo sintetičnega kondenzata so dosegli povečanje transkripcije. Opazili so namreč povečano izražanje rdečega fluorescenčnega proteina (RFP). Poleg tega so dokazali tudi, da je vključitev dodatnih vezavnih mest za ''parS'' na tarčnem plazmidu povečala izražanje genov. V primerjavi z običajno aktivacijo, ki je posredovana preko interakcije ključ-ključavnica, so ugotovili, da ima aktivacija transkripcije, ki je posredovana preko kondenzatov, večji vpliv na izražanje genov [3].

Študijo so razširili tudi na preučevanje učinkov, ki jih imajo sintetični kondenzati na aktivnosti v sesalskih celicah. Ustvarili so reporterski protein, ki je vseboval citrin fluorescentni protein, spojen z DHFR, ki vodi do razgradnje fuzijskega partnerja. Za nadzorovanje njegove aktivnosti so naredili fuzijo antiparalelne levcinske zadrge Czipper na N-koncu reporterskega proteina. Sintetizirali so sesalsko domeno synIDP, RLPS-Y, za nastanek sintetičnih kondenzatov. synIDP so spojili z drugo levcinsko zadrgo, Nzipper, da so lahko zagotovili nadzorovano združitev reporterskega proteina v kondenzate. V eksperimentih s celicami HEK293 so opazili, da je zaradi nastanka kondenzatov RLPS-Y-Nzipper prišlo do delne zaščite reporterskega proteina pred razgradnjo, kar je vodilo do ponovne fluorescence citrina. Pri celicah, ki so izražale samo RLPS-Y ali Nzipper, ni bilo razlike v fluorescenci (nezmožnost izražanja reporterskega proteina), medtem ko je sočasno izražanje RLPS-Y-Nzipper in reporterskega proteina omogočilo delno obnovitev fluorescence. S sintetičnimi kondenzati lahko tudi v sesalskih celicah uravnavamo aktivnost proteinov, tako da njihova uporaba predstavlja potencialno orodje za nadzor celičnih procesov [3].

==Zaključek==
V raziskavi [3] so predstavljeni novi načini nadzora celične aktivnosti. Prejšnje raziskave so slonele večinoma na principu »ključ-ključavnica«, pri čemer so uporabili proteine in ostale biomolekule, ki so bili ravno prave oblike za interakcije s specifičnimi tarčami. Vendar so dokazali, da celice ne morejo nadzorovati vseh procesov na tak način. Pakiranje biomolekulskih skupkov v celicah tvori obsežno in zapleteno mrežo biomolekul, tako da je posamezne mehanizme in interakcije težko nadzorovati s sledenjem ciljnim molekulam. Gensko kodirane synIDP, ki lahko preklapljajo med različnimi faznimi stanji, je moč uporabiti za načrtovanje funkcionalnih kondenzatov v živih celicah. S pomočjo takih biomolekularnih kondenzatov lahko raziskovalci ustvarijo kompartmente znotraj celic, ki ločujejo določene molekule od citosola. Te sintetične kondenzate se tako lahko uporablja za nadzorovanje celične aktivnosti. En primer uporabe je, da lahko z njihovo uporabo ustvarimo okolje znotraj celic, ki lahko selektivno obogati plazmide in s tem poveča učinkovitost transkripcije [3].

==Literatura==
[1] S. F. Banani, H. O. Lee, A. A. Hyman, M. K. Rosen: ''Biomolecular condensates: Organizers of cellular biochemistry''. '''2017''', ''18(5)'', str. 285-298.

[2] S. Do, C. Lee, T. Lee, D. N. Kim, Y. Shin: Engineering DNA-based synthetic condensates with programmable material properties, compositions, and functionalities. ''Sci. Adv.'' '''2022''', ''8(41)'', str. 1–15

[3] Y. Dai, M. Farag, D. Lee, X. Zeng, K. Kim, H. in Son, X. Guo, J. Su, N. Peterson, L. You: Programmable synthetic biomolecular condensates for cellular control. ''Nat. Chem. Biol''. '''2023''', ''19(4)'', str. 518-528.

Programabilni sintetični biomolekulski kondenzati za nadzor celičnih procesov

2023-05-17T05:26:32Z

Anja Konjc: /* Uvod */

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41589-022-01252-8 Y. Dai, M. Farag, D. Lee, X. Zeng, K. Kim, H. in Son, X. Guo, J. Su, N. Peterson, L. You: Programmable synthetic biomolecular condensates for cellular control. ''Nat. Chem. Biol''. '''2023''', ''19(4)'', str. 518-528.]
==Uvod==
Kompartmentalizacija predstavlja eno ključnih vlog pri razvoju evkariontske celice. Znotrajcelični organeli oz. kompartmenti, obdani iz lipidno membrano, omogočajo ustvarjanje lokalnih pogojev za določen celični proces. Poleg klasičnih organelov so v celici prisotni tudi prehodni, začasni skupki nagnetenih molekul, ki sicer spominjajo na membranske organele, le da niso obdani z lipidno membrano. Imenujemo jih biomolekulski kondenzati in nastanejo zaradi združevanja bioloških makromolekul (proteinov in nukleinskih kislin) [1]. Biomolekulski kondenzati sodelujejo v različnih celičnih procesih, od regulacije genov do regulacije celičnega stresa. Inženiring umetnih biomlekulskih kondenzatov omogoča boljše razumevanje organizacije le-teh in sintezo umetnih sistemov z novimi funkcijami [2] Nastanek takih kondenzatov lahko poganja fazno ločevanje, povezano s perkolacijo/pronicanjem intrinzično neurejenih proteinov (PSCP) [3]. Intrinzično neurejeni proteini zaradi specifične aminokislinske sestave nimajo stalne tridimenzionalne strukture. V raztopini lahko hitro preklapljajo med različnimi energetskimi stanji [1]. Kondenzati lahko selektivno obogatijo ali osiromašijo biomolekule, kar omogoča nadzor nad celičnimi procesi. Sintetične kondenzate, ki jih tvorijo naravno prisotni intrinzično urejeni proteini, spojeni z različnimi funkcionalnimi domenami, so uporabili za nadzor celične proliferacije. Do sedaj so preučevali različne vzorce, ki vodijo fazno ločbo intrinzično neurejenih proteinov. Raziskovalna skupina v tem članku [3] pa je sintetizirala funkcionalne biomolekulske kondenzate z upoštevanjem do sedaj znanih pravil nastanka tovrstnih skupkov za preučevanje njihovega delovanja v celicah, in kako jih lahko uporabimo za nadzorovanje celičnih procesov [3].

==Rezultati==
===Razvoj sintetičnih funkcionalnih kondenzatov===
Z razvojem sintetičnih kondenzatov so želeli nadzorovati sekvestracijo plazmidov (ločevanje plazmidne DNA) in transkripcijo. Zasnovali so sintetične intrinzično urejene proteine (synIDP), ki so jih spojili skupaj s funkcionalnimi proteinskimi domenami. Raziskovali so različne dejavnike, ki prispevajo k nastanku kondenzatov. S pomočjo računalniškega modela so identificirali reslinu podobne polipeptide (RLP), kot potencialne molekule za nastanek kondenzatov. RLP izhajajo iz proteina reslin, ki ga najdemo v mušici ''Drosophila melanogaster''. Da bi dosegli plazmidno sekvestracijo, so spojili protein ParB, ki veže DNA, skupaj z RLP-ji. Protein ParB reagira s specifičnim zaporedjem DNA in rekrutira plazmid. Fuzija proteina ParB z RLP (fuzija RLP–DBD in RLP–DBD–DD) je omogočila lokalizacijo ciljnega plazmida [1].

===Modularna izgradnja sintetičnih kondenzatov v ''E. coli''===
Preučevanje izgradnje sintetičnih kondenzatov v ''E. coli'' je potekalo preko fuzije funkcionalnih domen (DBD in DD) na ponavljajoče se oktapeptide RLP divjega tipa (RLPWT). Fuzije RLPWT–DBD in RLPWT–DBD–DD tvorijo različne kondenzate, ki so jih opazili pri proučevanju s fluorescenčno mikroskopijo (konstrukte so spojili z monomernim GFP). Po indukciji ekspresije proteinov, se je s časom površina kondenzatov povečevala. Najhitreje so se oblikovali kondenzati fuzije RLPWT–DBD–DD, ki so tudi zasegli največ površine v primerjavi s fuzijo RLPWT–DBD in samim RLPWT. Za potrditev teh opažanj so uporabili diferencialno interferenčno kontrastno spektroskopijo (DIC), kjer so kondenzate neposredno opazovali (niso bili spojeni z mGFP kot pri fluorescenčni mikroskopiji). Tudi pri DIC so bila opažanja enaka. Izvedli so tudi poskuse in vitro ter in vitro, kjer so kondenzate izpostavili različnim pogojem. S testom posedanja so določili količinski prispevek posamezne domene k ločevanju faz. Ugotovitve kažejo, da so prispevki posameznih domen k ločevanju faz podobni in vitro ter in vitro [3].

===Programiranje homotipskih in heterotipskih interakcij ločevanja faz===
Naslednja stopnja je bila programiranje nastanka kondenzatov in nadzorovanje njihovih fizikalnih lastnosti z uporabo synIDP. Po preučitvi odzivnosti synIDP na različne dejavnike, so ugotovili, da kondenzati, ki jih tvori RLPWT, občutljivi na soli, spremembe v koncentraciji proteinov ipd. Da bi se temu izognili, so spremenili porazdelitev nabitih aromatskih aminokislinskih ostankov v zaporedju synIDP. Grozdenje aromatskih aminokislinskih ostankov je povečajo moč posameznih interakcij in omejilo mobilnost posameznih segmentov v kondenzatu. Nasprotno se je ob porazdelitvi nasprotno nabitih aminokislinskih ostankov povečalo število elektrostatskih interakcij; zmanjšala se je koncentracija nasičenja, ki je potrebna za tvorbo kondenzata. Specifične modifikacije lahko vplivajo na koeficiente difuzije in mobilnost znotraj kondenzatov. Ugotovili so, da dodatek domene DD dodatno zmanjša koeficient difuzije, kar kaže njegov vpliv na fizikalne lastnosti kondenzata [3].
Potrdili so prispevek heterotipskih interakcij k spodbujanju ločevanja faz. Preučevali so vpliv elementa DNA, ki vsebuje ''parS'', na lastnosti kondenzatov. Prisotnost take DNA je vplivala na znižanje kritične koncentracije kondenzata, nastalega s fuzijo synIDP–dParB, kar je povzročilo ločitev faz in da je sintetični kondenzat ločil ciljno DNA. Povečanje števila mest ''parS'' na DNA je povzročilo nastanek večjih kondenzatov [3].

===Lastnosti sintetičnih kondenzatov z DNA===
Kondenzati imajo sposobnost sproženja asimetrične delitve plazmidov v ''E. coli''. Fuzija RLPWT–DBD–DD in zaporedje ''parS'' sta bila kodirana v dveh različnih kompatibilnih plazmidih. Celice ''E. coli'' so gojili z in brez indukcije IPTG, uporabljena je bila kanamicinska selekcija. Indukcija RLPWT–DBD–DD je značilno zmanjšala število celic, ki so vsebovale oba plazmida, kar so potrdili s konfokalno mikroskopijo. Opazili so tudi, da je bilo v tem primeru zaporedje ''parS'' daleč od mesta ori. Kondenzati ustvarijo prostorski predel, ki vodi v asimetrično delitev plazmidov. Slednje so dokazali z uporabo kinetičnega modela [3].

Veliko plazmidov se lahko med bakterijskimi populacijami prenašajo s konjugacijo. Raziskovalci so predpostavili, da bi sintetični kondenzati lahko onemogočali tak prenos genov. Hipotezo so tudi potrdili s pomočjo sintetičnega konjugacijskega sistema [3].

Preučevali so tudi vpliv kondenzatov na aktivacijo transkripcije. Uporabili so kinetični model za primerjavo učinkov različnih komponent na transkripcijo. Model je predvideval, da lahko prisotnost kondenzatov poveča učinkovitost transkripcije. Uporabili so mutirani transkripcijski faktor SoxS(R93A), ki se ne more vezati na specifično zaporedje DNA in nima sposobnosti vpliva na izražanje genov. Za namen raziskave so ustvarili plazmid, ki je vseboval konstitutivni promotor in mesto ''parS'', ki mu je sledilo tarčno zaporedje. S spojitvijo SoxS(R93A) s koaktivatorjem in tvorbo sintetičnega kondenzata so dosegli povečanje transkripcije. Opazili so namreč povečano izražanje rdečega fluorescenčnega proteina (RFP). Poleg tega so dokazali tudi, da je vključitev dodatnih vezavnih mest za ''parS'' na tarčnem plazmidu povečala izražanje genov. V primerjavi z običajno aktivacijo, ki je posredovana preko interakcije ključ-ključavnica, so ugotovili, da ima aktivacija transkripcije, ki je posredovana preko kondenzatov, večji vpliv na izražanje genov [3].

Študijo so razširili tudi na preučevanje učinkov, ki jih imajo sintetični kondenzati na aktivnosti v sesalskih celicah. Ustvarili so reporterski protein, ki je vseboval citrin fluorescentni protein, spojen z DHFR, ki vodi do razgradnje fuzijskega partnerja. Za nadzorovanje njegove aktivnosti so naredili fuzijo antiparalelne levcinske zadrge Czipper na N-koncu reporterskega proteina. Sintetizirali so sesalsko domeno synIDP, RLPS-Y, za nastanek sintetičnih kondenzatov. synIDP so spojili z drugo levcinsko zadrgo, Nzipper, da so lahko zagotovili nadzorovano združitev reporterskega proteina v kondenzate. V eksperimentih s celicami HEK293 so opazili, da je zaradi nastanka kondenzatov RLPS-Y-Nzipper prišlo do delne zaščite reporterskega proteina pred razgradnjo, kar je vodilo do ponovne fluorescence citrina. Pri celicah, ki so izražale samo RLPS-Y ali Nzipper, ni bilo razlike v fluorescenci (nezmožnost izražanja reporterskega proteina), medtem ko je sočasno izražanje RLPS-Y-Nzipper in reporterskega proteina omogočilo delno obnovitev fluorescence. S sintetičnimi kondenzati lahko tudi v sesalskih celicah uravnavamo aktivnost proteinov, tako da njihova uporaba predstavlja potencialno orodje za nadzor celičnih procesov [3].

==Zaključek==
V raziskavi [3] so predstavljeni novi načini nadzora celične aktivnosti. Prejšnje raziskave so slonele večinoma na principu »ključ-ključavnica«, pri čemer so uporabili proteine in ostale biomolekule, ki so bili ravno prave oblike za interakcije s specifičnimi tarčami. Vendar so dokazali, da celice ne morejo nadzorovati vseh procesov na tak način. Pakiranje biomolekulskih skupkov v celicah tvori obsežno in zapleteno mrežo biomolekul, tako da je posamezne mehanizme in interakcije težko nadzorovati s sledenjem ciljnim molekulam. Gensko kodirane synIDP, ki lahko preklapljajo med različnimi faznimi stanji, je moč uporabiti za načrtovanje funkcionalnih kondenzatov v živih celicah. S pomočjo takih biomolekularnih kondenzatov lahko raziskovalci ustvarijo kompartmente znotraj celic, ki ločujejo določene molekule od citosola. Te sintetične kondenzate se tako lahko uporablja za nadzorovanje celične aktivnosti. En primer uporabe je, da lahko z njihovo uporabo ustvarimo okolje znotraj celic, ki lahko selektivno obogati plazmide in s tem poveča učinkovitost transkripcije [3].

==Literatura==
[1] S. F. Banani, H. O. Lee, A. A. Hyman, M. K. Rosen: ''Biomolecular condensates: Organizers of cellular biochemistry''. '''2017''', ''18(5)'', str. 285-298.

[2] S. Do, C. Lee, T. Lee, D. N. Kim, Y. Shin: Engineering DNA-based synthetic condensates with programmable material properties, compositions, and functionalities. ''Sci. Adv.'' '''2022''', ''8(41)'', str. 1–15

[3] Y. Dai, M. Farag, D. Lee, X. Zeng, K. Kim, H. in Son, X. Guo, J. Su, N. Peterson, L. You: Programmable synthetic biomolecular condensates for cellular control. ''Nat. Chem. Biol''. '''2023''', ''19(4)'', str. 518-528.

Programabilni sintetični biomolekulski kondenzati za nadzor celičnih procesov

2023-05-16T04:37:10Z

Anja Konjc:

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41589-022-01252-8 Y. Dai, M. Farag, D. Lee, X. Zeng, K. Kim, H. in Son, X. Guo, J. Su, N. Peterson, L. You: Programmable synthetic biomolecular condensates for cellular control. ''Nat. Chem. Biol''. '''2023''', ''19(4)'', str. 518-528.]
==Uvod==
Kompartmentalizacija predstavlja eno ključnih vlog pri razvoju evkariontske celice. Znotrajcelični organeli oz. kompartmenti, obdani iz lipidno membrano, omogočajo ustvarjanje lokalnih pogojev za določen celični proces. Poleg klasičnih organelov so v celici prisotni tudi prehodni, začasni skupki nahnetenih molekul, ki sicer spominjajo na membranske organele, le da niso obdani z lipidno membrano. Imenujemo jih biomolekulski kondenzati in nastanejo zaradi združevanja bioloških makromolekul (proteinov in nukleinskih kislin) [1]. Biomolekulski kondenzati sodelujejo v različnih celičnih procesih, od regulacije genov do regulacije celičnega stresa. Inženiring umetnih biomlekulskih kondenzatov omogoča boljše razumevanje organizacije le-teh in sintezo umetnih sistemov z novimi funkcijami [2] Nastanek takih kondenzatov lahko poganja fazno ločevanje, povezano s perkolacijo/pronicanjem intrinzično neurejenih proteinov (PSCP) [3]. Intrinzično neurejeni proteini zaradi specifične aminokislinske sestave nimajo stalne tridimenzionalne strukture. V raztopini lahko hitro preklapljajo med različnimi energetskimi stanji [1]. Kondenzati lahko selektivno obogatijo ali osiromašijo biomolekule, kar omogoča nadzor nad celičnimi procesi. Sintetične kondenzate, ki jih tvorijo naravno prisotni intrinzično urejeni proteini, spojeni z različnimi funkcionalnimi domenami, so uporabili za nadzor celične proliferacije. Do sedaj so preučevali različne vzorce, ki vodijo fazno ločbo intrinzično neurejenih proteinov. Raziskovalna skupina v tem članku [3] pa je sintetizirala funkcionalne biomolekulske kondenzate z upoštevanjem do sedaj znanih pravil nastanka tovrstnih skupkov za preučevanje njihovega delovanja v celicah, in kako jih lahko uporabimo za nadzorovanje celičnih procesov [3].

==Rezultati==
===Razvoj sintetičnih funkcionalnih kondenzatov===
Z razvojem sintetičnih kondenzatov so želeli nadzorovati sekvestracijo plazmidov (ločevanje plazmidne DNA) in transkripcijo. Zasnovali so sintetične intrinzično urejene proteine (synIDP), ki so jih spojili skupaj s funkcionalnimi proteinskimi domenami. Raziskovali so različne dejavnike, ki prispevajo k nastanku kondenzatov. S pomočjo računalniškega modela so identificirali reslinu podobne polipeptide (RLP), kot potencialne molekule za nastanek kondenzatov. RLP izhajajo iz proteina reslin, ki ga najdemo v mušici ''Drosophila melanogaster''. Da bi dosegli plazmidno sekvestracijo, so spojili protein ParB, ki veže DNA, skupaj z RLP-ji. Protein ParB reagira s specifičnim zaporedjem DNA in rekrutira plazmid. Fuzija proteina ParB z RLP (fuzija RLP–DBD in RLP–DBD–DD) je omogočila lokalizacijo ciljnega plazmida [1].

===Modularna izgradnja sintetičnih kondenzatov v ''E. coli''===
Preučevanje izgradnje sintetičnih kondenzatov v ''E. coli'' je potekalo preko fuzije funkcionalnih domen (DBD in DD) na ponavljajoče se oktapeptide RLP divjega tipa (RLPWT). Fuzije RLPWT–DBD in RLPWT–DBD–DD tvorijo različne kondenzate, ki so jih opazili pri proučevanju s fluorescenčno mikroskopijo (konstrukte so spojili z monomernim GFP). Po indukciji ekspresije proteinov, se je s časom površina kondenzatov povečevala. Najhitreje so se oblikovali kondenzati fuzije RLPWT–DBD–DD, ki so tudi zasegli največ površine v primerjavi s fuzijo RLPWT–DBD in samim RLPWT. Za potrditev teh opažanj so uporabili diferencialno interferenčno kontrastno spektroskopijo (DIC), kjer so kondenzate neposredno opazovali (niso bili spojeni z mGFP kot pri fluorescenčni mikroskopiji). Tudi pri DIC so bila opažanja enaka. Izvedli so tudi poskuse in vitro ter in vitro, kjer so kondenzate izpostavili različnim pogojem. S testom posedanja so določili količinski prispevek posamezne domene k ločevanju faz. Ugotovitve kažejo, da so prispevki posameznih domen k ločevanju faz podobni in vitro ter in vitro [3].

===Programiranje homotipskih in heterotipskih interakcij ločevanja faz===
Naslednja stopnja je bila programiranje nastanka kondenzatov in nadzorovanje njihovih fizikalnih lastnosti z uporabo synIDP. Po preučitvi odzivnosti synIDP na različne dejavnike, so ugotovili, da kondenzati, ki jih tvori RLPWT, občutljivi na soli, spremembe v koncentraciji proteinov ipd. Da bi se temu izognili, so spremenili porazdelitev nabitih aromatskih aminokislinskih ostankov v zaporedju synIDP. Grozdenje aromatskih aminokislinskih ostankov je povečajo moč posameznih interakcij in omejilo mobilnost posameznih segmentov v kondenzatu. Nasprotno se je ob porazdelitvi nasprotno nabitih aminokislinskih ostankov povečalo število elektrostatskih interakcij; zmanjšala se je koncentracija nasičenja, ki je potrebna za tvorbo kondenzata. Specifične modifikacije lahko vplivajo na koeficiente difuzije in mobilnost znotraj kondenzatov. Ugotovili so, da dodatek domene DD dodatno zmanjša koeficient difuzije, kar kaže njegov vpliv na fizikalne lastnosti kondenzata [3].
Potrdili so prispevek heterotipskih interakcij k spodbujanju ločevanja faz. Preučevali so vpliv elementa DNA, ki vsebuje ''parS'', na lastnosti kondenzatov. Prisotnost take DNA je vplivala na znižanje kritične koncentracije kondenzata, nastalega s fuzijo synIDP–dParB, kar je povzročilo ločitev faz in da je sintetični kondenzat ločil ciljno DNA. Povečanje števila mest ''parS'' na DNA je povzročilo nastanek večjih kondenzatov [3].

===Lastnosti sintetičnih kondenzatov z DNA===
Kondenzati imajo sposobnost sproženja asimetrične delitve plazmidov v ''E. coli''. Fuzija RLPWT–DBD–DD in zaporedje ''parS'' sta bila kodirana v dveh različnih kompatibilnih plazmidih. Celice ''E. coli'' so gojili z in brez indukcije IPTG, uporabljena je bila kanamicinska selekcija. Indukcija RLPWT–DBD–DD je značilno zmanjšala število celic, ki so vsebovale oba plazmida, kar so potrdili s konfokalno mikroskopijo. Opazili so tudi, da je bilo v tem primeru zaporedje ''parS'' daleč od mesta ori. Kondenzati ustvarijo prostorski predel, ki vodi v asimetrično delitev plazmidov. Slednje so dokazali z uporabo kinetičnega modela [3].

Veliko plazmidov se lahko med bakterijskimi populacijami prenašajo s konjugacijo. Raziskovalci so predpostavili, da bi sintetični kondenzati lahko onemogočali tak prenos genov. Hipotezo so tudi potrdili s pomočjo sintetičnega konjugacijskega sistema [3].

Preučevali so tudi vpliv kondenzatov na aktivacijo transkripcije. Uporabili so kinetični model za primerjavo učinkov različnih komponent na transkripcijo. Model je predvideval, da lahko prisotnost kondenzatov poveča učinkovitost transkripcije. Uporabili so mutirani transkripcijski faktor SoxS(R93A), ki se ne more vezati na specifično zaporedje DNA in nima sposobnosti vpliva na izražanje genov. Za namen raziskave so ustvarili plazmid, ki je vseboval konstitutivni promotor in mesto ''parS'', ki mu je sledilo tarčno zaporedje. S spojitvijo SoxS(R93A) s koaktivatorjem in tvorbo sintetičnega kondenzata so dosegli povečanje transkripcije. Opazili so namreč povečano izražanje rdečega fluorescenčnega proteina (RFP). Poleg tega so dokazali tudi, da je vključitev dodatnih vezavnih mest za ''parS'' na tarčnem plazmidu povečala izražanje genov. V primerjavi z običajno aktivacijo, ki je posredovana preko interakcije ključ-ključavnica, so ugotovili, da ima aktivacija transkripcije, ki je posredovana preko kondenzatov, večji vpliv na izražanje genov [3].

Študijo so razširili tudi na preučevanje učinkov, ki jih imajo sintetični kondenzati na aktivnosti v sesalskih celicah. Ustvarili so reporterski protein, ki je vseboval citrin fluorescentni protein, spojen z DHFR, ki vodi do razgradnje fuzijskega partnerja. Za nadzorovanje njegove aktivnosti so naredili fuzijo antiparalelne levcinske zadrge Czipper na N-koncu reporterskega proteina. Sintetizirali so sesalsko domeno synIDP, RLPS-Y, za nastanek sintetičnih kondenzatov. synIDP so spojili z drugo levcinsko zadrgo, Nzipper, da so lahko zagotovili nadzorovano združitev reporterskega proteina v kondenzate. V eksperimentih s celicami HEK293 so opazili, da je zaradi nastanka kondenzatov RLPS-Y-Nzipper prišlo do delne zaščite reporterskega proteina pred razgradnjo, kar je vodilo do ponovne fluorescence citrina. Pri celicah, ki so izražale samo RLPS-Y ali Nzipper, ni bilo razlike v fluorescenci (nezmožnost izražanja reporterskega proteina), medtem ko je sočasno izražanje RLPS-Y-Nzipper in reporterskega proteina omogočilo delno obnovitev fluorescence. S sintetičnimi kondenzati lahko tudi v sesalskih celicah uravnavamo aktivnost proteinov, tako da njihova uporaba predstavlja potencialno orodje za nadzor celičnih procesov [3].

==Zaključek==
V raziskavi [3] so predstavljeni novi načini nadzora celične aktivnosti. Prejšnje raziskave so slonele večinoma na principu »ključ-ključavnica«, pri čemer so uporabili proteine in ostale biomolekule, ki so bili ravno prave oblike za interakcije s specifičnimi tarčami. Vendar so dokazali, da celice ne morejo nadzorovati vseh procesov na tak način. Pakiranje biomolekulskih skupkov v celicah tvori obsežno in zapleteno mrežo biomolekul, tako da je posamezne mehanizme in interakcije težko nadzorovati s sledenjem ciljnim molekulam. Gensko kodirane synIDP, ki lahko preklapljajo med različnimi faznimi stanji, je moč uporabiti za načrtovanje funkcionalnih kondenzatov v živih celicah. S pomočjo takih biomolekularnih kondenzatov lahko raziskovalci ustvarijo kompartmente znotraj celic, ki ločujejo določene molekule od citosola. Te sintetične kondenzate se tako lahko uporablja za nadzorovanje celične aktivnosti. En primer uporabe je, da lahko z njihovo uporabo ustvarimo okolje znotraj celic, ki lahko selektivno obogati plazmide in s tem poveča učinkovitost transkripcije [3].

==Literatura==
[1] S. F. Banani, H. O. Lee, A. A. Hyman, M. K. Rosen: ''Biomolecular condensates: Organizers of cellular biochemistry''. '''2017''', ''18(5)'', str. 285-298.

[2] S. Do, C. Lee, T. Lee, D. N. Kim, Y. Shin: Engineering DNA-based synthetic condensates with programmable material properties, compositions, and functionalities. ''Sci. Adv.'' '''2022''', ''8(41)'', str. 1–15

[3] Y. Dai, M. Farag, D. Lee, X. Zeng, K. Kim, H. in Son, X. Guo, J. Su, N. Peterson, L. You: Programmable synthetic biomolecular condensates for cellular control. ''Nat. Chem. Biol''. '''2023''', ''19(4)'', str. 518-528.

Seminarji SB 2022/23

2023-05-16T04:32:20Z

Anja Konjc:

V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_tumor_ciljajočih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_dušikov(II)_oksid Priprava tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljeni_ribocim%2C_ki_signale_nativnih_RNA_pove%C5%BEe_z_ortogonalnimi_proteinskimi_izhodnimi_signali Razcepljeni ribocim, ki signale nativnih RNA poveže z ortogonalnimi proteinskimi izhodnimi signali] (Ajda Beltram)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_nadzor_%C5%A1tevila_plazmidov_v_celici_%28Tulip%29 Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)] (Gregor Strniša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Skupnostna_znanost_je_na%C4%8Drtovala_ribosome_s_koristnimi_fenotipi Skupnostna znanost je načrtovala ribosome s koristnimi fenotipi] (Tanja Gošnjak)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pristop_sintezne_biologije_za_načrtovanje_kandidata_za_cepivo_proti_delta_različici_SARSCoV2_je_razkril_prekinitev_favoriziranega_para_kodonov_kot_boljšo_strategijo_pred_uporabo_redkih_kodonov Pristop sintezne biologije za načrtovanje kandidata za cepivo proti delta različici SARS-CoV-2 je razkril prekinitev favoriziranega para kodonov kot boljšo strategijo pred uporabo redkih kodonov] (Stefanija Ivanova)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Dvosmerni_hibridni_eritritol_–_inducibilni_promotor_za_sintezno_biologijo_v_Yarrowia_lipolytica Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v ''Yarrowia lipolytica''] (Maša Andoljšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Utišanje_izražanja_genov_s_strukturo_definirano_zankasto_strukturo_male_nekodirajoče_RNA_s_programiranimi_regulatornimi_aktivnostmi Utišanje izražanja genov s strukturno definirano zankasto strukturo male nekodirajoče RNA s programiranimi regulatornimi aktivnostmi] (Nika Bedrač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izbolj%C5%A1anje_evolucijske_stabilnosti_obremenjujo%C4%8Dih_in_toksi%C4%8Dnih_funkcij_v_E.coli_z_diferenciacijskim_genetskim_vezjem_posredovanim_z_integrazo Izboljšanje evolucijske stabilnosti obremenjujočih in toksičnih funkcij v E.coli z diferenciacijskim genetskim vezjem posredovanim z integrazo] (Nika Banovšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_sintetična_mala_RNA%2C_ki_promovira_prekomerno_izražanje_proteinov_v_brezceličnem_sistemu Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brez-celičnem sistemu] (Ana Godeša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_kontrolo_hitrosti_rasti_celic%2C_ki_zmanj%C5%A1uje_breme_aktivacije_genov Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov] (Neža Ribnikar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biohibridne_membrane_za_odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_iz_vode Biohibridne membrane za odstranjevanje težkih kovin iz vode] (Tadej Uršič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_CIVT-SELEX_za_izbiro_aptamerov_kot_genskih_delov_za_regulacijo_genetskih_vezij_v_brezceličnem_sistemu Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu] (Klemen Kunej)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_Cyborg_bakterij_preko_intracelularne_hidrogelacije Inženiring Cyborg bakterij preko intracelularne hidrogelacije] (Eva Oven)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezovanje_celi%C4%8Dne_komunikacije_z_optogenetiko:_implementacija_svetlobno_inducibilnega_medceli%C4%8Dnega_sistema_v_kvasovkah Povezovanje celične komunikacije z optogenetiko: implementacija svetlobno inducibilnega medceličnega sistema v kvasovkah] (Nika Perko)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_sinteti%C4%8Dni_biomolekulski_kondenzati_za_nadzor_celi%C4%8Dnih_procesov Programabilni sintetični biomolekulski kondenzati za nadzor celičnih procesov] (Anja Konjc)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NETLANTIS NETLANTIS] (Maša Gabrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BINANOX BINANOX] (Vivian Nemanič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CoBiota CoBiota] (Petra Sintič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sporadicate Sporadicate] (Gašper Možina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FISHERLY FISHERLY] (Lucija Pišek)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].

Seminarji SB 2022/23

2023-05-16T04:31:38Z

Anja Konjc:

V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_tumor_ciljajočih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_dušikov(II)_oksid Priprava tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljeni_ribocim%2C_ki_signale_nativnih_RNA_pove%C5%BEe_z_ortogonalnimi_proteinskimi_izhodnimi_signali Razcepljeni ribocim, ki signale nativnih RNA poveže z ortogonalnimi proteinskimi izhodnimi signali] (Ajda Beltram)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_nadzor_%C5%A1tevila_plazmidov_v_celici_%28Tulip%29 Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)] (Gregor Strniša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Skupnostna_znanost_je_na%C4%8Drtovala_ribosome_s_koristnimi_fenotipi Skupnostna znanost je načrtovala ribosome s koristnimi fenotipi] (Tanja Gošnjak)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pristop_sintezne_biologije_za_načrtovanje_kandidata_za_cepivo_proti_delta_različici_SARSCoV2_je_razkril_prekinitev_favoriziranega_para_kodonov_kot_boljšo_strategijo_pred_uporabo_redkih_kodonov Pristop sintezne biologije za načrtovanje kandidata za cepivo proti delta različici SARS-CoV-2 je razkril prekinitev favoriziranega para kodonov kot boljšo strategijo pred uporabo redkih kodonov] (Stefanija Ivanova)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Dvosmerni_hibridni_eritritol_–_inducibilni_promotor_za_sintezno_biologijo_v_Yarrowia_lipolytica Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v ''Yarrowia lipolytica''] (Maša Andoljšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Utišanje_izražanja_genov_s_strukturo_definirano_zankasto_strukturo_male_nekodirajoče_RNA_s_programiranimi_regulatornimi_aktivnostmi Utišanje izražanja genov s strukturno definirano zankasto strukturo male nekodirajoče RNA s programiranimi regulatornimi aktivnostmi] (Nika Bedrač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izbolj%C5%A1anje_evolucijske_stabilnosti_obremenjujo%C4%8Dih_in_toksi%C4%8Dnih_funkcij_v_E.coli_z_diferenciacijskim_genetskim_vezjem_posredovanim_z_integrazo Izboljšanje evolucijske stabilnosti obremenjujočih in toksičnih funkcij v E.coli z diferenciacijskim genetskim vezjem posredovanim z integrazo] (Nika Banovšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_sintetična_mala_RNA%2C_ki_promovira_prekomerno_izražanje_proteinov_v_brezceličnem_sistemu Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brez-celičnem sistemu] (Ana Godeša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_kontrolo_hitrosti_rasti_celic%2C_ki_zmanj%C5%A1uje_breme_aktivacije_genov Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov] (Neža Ribnikar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biohibridne_membrane_za_odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_iz_vode Biohibridne membrane za odstranjevanje težkih kovin iz vode] (Tadej Uršič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_CIVT-SELEX_za_izbiro_aptamerov_kot_genskih_delov_za_regulacijo_genetskih_vezij_v_brezceličnem_sistemu Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu] (Klemen Kunej)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_Cyborg_bakterij_preko_intracelularne_hidrogelacije Inženiring Cyborg bakterij preko intracelularne hidrogelacije] (Eva Oven)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezovanje_celi%C4%8Dne_komunikacije_z_optogenetiko:_implementacija_svetlobno_inducibilnega_medceli%C4%8Dnega_sistema_v_kvasovkah Povezovanje celične komunikacije z optogenetiko: implementacija svetlobno inducibilnega medceličnega sistema v kvasovkah] (Nika Perko)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_sinteti%C4%8Dni_biomolekulski_kondenzati_za_nadzor_celi%C4%8Dnih_procesov] Programabilni sintetični biomolekulski kondenzati za nadzor celičnih procesov (Anja Konjc)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NETLANTIS NETLANTIS] (Maša Gabrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BINANOX BINANOX] (Vivian Nemanič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CoBiota CoBiota] (Petra Sintič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sporadicate Sporadicate] (Gašper Možina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FISHERLY FISHERLY] (Lucija Pišek)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].

Programabilni sintetični biomolekulski kondenzati za nadzor celičnih procesov

2023-05-16T04:29:42Z

Anja Konjc: New page: ==Uvod== Kompartmentalizacija predstavlja eno ključnih vlog pri razvoju evkariontske celice. Znotrajcelični organeli oz. kompartmenti, obdani iz lipidno membrano, omogočajo ustvarjanje ...

==Uvod==
Kompartmentalizacija predstavlja eno ključnih vlog pri razvoju evkariontske celice. Znotrajcelični organeli oz. kompartmenti, obdani iz lipidno membrano, omogočajo ustvarjanje lokalnih pogojev za določen celični proces. Poleg klasičnih organelov so v celici prisotni tudi prehodni, začasni skupki nahnetenih molekul, ki sicer spominjajo na membranske organele, le da niso obdani z lipidno membrano. Imenujemo jih biomolekulski kondenzati in nastanejo zaradi združevanja bioloških makromolekul (proteinov in nukleinskih kislin) [1]. Biomolekulski kondenzati sodelujejo v različnih celičnih procesih, od regulacije genov do regulacije celičnega stresa. Inženiring umetnih biomlekulskih kondenzatov omogoča boljše razumevanje organizacije le-teh in sintezo umetnih sistemov z novimi funkcijami [2] Nastanek takih kondenzatov lahko poganja fazno ločevanje, povezano s perkolacijo/pronicanjem intrinzično neurejenih proteinov (PSCP) [3]. Intrinzično neurejeni proteini zaradi specifične aminokislinske sestave nimajo stalne tridimenzionalne strukture. V raztopini lahko hitro preklapljajo med različnimi energetskimi stanji [1]. Kondenzati lahko selektivno obogatijo ali osiromašijo biomolekule, kar omogoča nadzor nad celičnimi procesi. Sintetične kondenzate, ki jih tvorijo naravno prisotni intrinzično urejeni proteini, spojeni z različnimi funkcionalnimi domenami, so uporabili za nadzor celične proliferacije. Do sedaj so preučevali različne vzorce, ki vodijo fazno ločbo intrinzično neurejenih proteinov. Raziskovalna skupina v tem članku [3] pa je sintetizirala funkcionalne biomolekulske kondenzate z upoštevanjem do sedaj znanih pravil nastanka tovrstnih skupkov za preučevanje njihovega delovanja v celicah, in kako jih lahko uporabimo za nadzorovanje celičnih procesov [3].

==Rezultati==
===Razvoj sintetičnih funkcionalnih kondenzatov===
Z razvojem sintetičnih kondenzatov so želeli nadzorovati sekvestracijo plazmidov (ločevanje plazmidne DNA) in transkripcijo. Zasnovali so sintetične intrinzično urejene proteine (synIDP), ki so jih spojili skupaj s funkcionalnimi proteinskimi domenami. Raziskovali so različne dejavnike, ki prispevajo k nastanku kondenzatov. S pomočjo računalniškega modela so identificirali reslinu podobne polipeptide (RLP), kot potencialne molekule za nastanek kondenzatov. RLP izhajajo iz proteina reslin, ki ga najdemo v mušici ''Drosophila melanogaster''. Da bi dosegli plazmidno sekvestracijo, so spojili protein ParB, ki veže DNA, skupaj z RLP-ji. Protein ParB reagira s specifičnim zaporedjem DNA in rekrutira plazmid. Fuzija proteina ParB z RLP (fuzija RLP–DBD in RLP–DBD–DD) je omogočila lokalizacijo ciljnega plazmida [1].

===Modularna izgradnja sintetičnih kondenzatov v ''E. coli''===
Preučevanje izgradnje sintetičnih kondenzatov v ''E. coli'' je potekalo preko fuzije funkcionalnih domen (DBD in DD) na ponavljajoče se oktapeptide RLP divjega tipa (RLPWT). Fuzije RLPWT–DBD in RLPWT–DBD–DD tvorijo različne kondenzate, ki so jih opazili pri proučevanju s fluorescenčno mikroskopijo (konstrukte so spojili z monomernim GFP). Po indukciji ekspresije proteinov, se je s časom površina kondenzatov povečevala. Najhitreje so se oblikovali kondenzati fuzije RLPWT–DBD–DD, ki so tudi zasegli največ površine v primerjavi s fuzijo RLPWT–DBD in samim RLPWT. Za potrditev teh opažanj so uporabili diferencialno interferenčno kontrastno spektroskopijo (DIC), kjer so kondenzate neposredno opazovali (niso bili spojeni z mGFP kot pri fluorescenčni mikroskopiji). Tudi pri DIC so bila opažanja enaka. Izvedli so tudi poskuse in vitro ter in vitro, kjer so kondenzate izpostavili različnim pogojem. S testom posedanja so določili količinski prispevek posamezne domene k ločevanju faz. Ugotovitve kažejo, da so prispevki posameznih domen k ločevanju faz podobni in vitro ter in vitro [3].

===Programiranje homotipskih in heterotipskih interakcij ločevanja faz===
Naslednja stopnja je bila programiranje nastanka kondenzatov in nadzorovanje njihovih fizikalnih lastnosti z uporabo synIDP. Po preučitvi odzivnosti synIDP na različne dejavnike, so ugotovili, da kondenzati, ki jih tvori RLPWT, občutljivi na soli, spremembe v koncentraciji proteinov ipd. Da bi se temu izognili, so spremenili porazdelitev nabitih aromatskih aminokislinskih ostankov v zaporedju synIDP. Grozdenje aromatskih aminokislinskih ostankov je povečajo moč posameznih interakcij in omejilo mobilnost posameznih segmentov v kondenzatu. Nasprotno se je ob porazdelitvi nasprotno nabitih aminokislinskih ostankov povečalo število elektrostatskih interakcij; zmanjšala se je koncentracija nasičenja, ki je potrebna za tvorbo kondenzata. Specifične modifikacije lahko vplivajo na koeficiente difuzije in mobilnost znotraj kondenzatov. Ugotovili so, da dodatek domene DD dodatno zmanjša koeficient difuzije, kar kaže njegov vpliv na fizikalne lastnosti kondenzata [3].
Potrdili so prispevek heterotipskih interakcij k spodbujanju ločevanja faz. Preučevali so vpliv elementa DNA, ki vsebuje ''parS'', na lastnosti kondenzatov. Prisotnost take DNA je vplivala na znižanje kritične koncentracije kondenzata, nastalega s fuzijo synIDP–dParB, kar je povzročilo ločitev faz in da je sintetični kondenzat ločil ciljno DNA. Povečanje števila mest ''parS'' na DNA je povzročilo nastanek večjih kondenzatov [3].

===Lastnosti sintetičnih kondenzatov z DNA===
Kondenzati imajo sposobnost sproženja asimetrične delitve plazmidov v ''E. coli''. Fuzija RLPWT–DBD–DD in zaporedje ''parS'' sta bila kodirana v dveh različnih kompatibilnih plazmidih. Celice ''E. coli'' so gojili z in brez indukcije IPTG, uporabljena je bila kanamicinska selekcija. Indukcija RLPWT–DBD–DD je značilno zmanjšala število celic, ki so vsebovale oba plazmida, kar so potrdili s konfokalno mikroskopijo. Opazili so tudi, da je bilo v tem primeru zaporedje ''parS'' daleč od mesta ori. Kondenzati ustvarijo prostorski predel, ki vodi v asimetrično delitev plazmidov. Slednje so dokazali z uporabo kinetičnega modela [3].

Veliko plazmidov se lahko med bakterijskimi populacijami prenašajo s konjugacijo. Raziskovalci so predpostavili, da bi sintetični kondenzati lahko onemogočali tak prenos genov. Hipotezo so tudi potrdili s pomočjo sintetičnega konjugacijskega sistema [3].

Preučevali so tudi vpliv kondenzatov na aktivacijo transkripcije. Uporabili so kinetični model za primerjavo učinkov različnih komponent na transkripcijo. Model je predvideval, da lahko prisotnost kondenzatov poveča učinkovitost transkripcije. Uporabili so mutirani transkripcijski faktor SoxS(R93A), ki se ne more vezati na specifično zaporedje DNA in nima sposobnosti vpliva na izražanje genov. Za namen raziskave so ustvarili plazmid, ki je vseboval konstitutivni promotor in mesto ''parS'', ki mu je sledilo tarčno zaporedje. S spojitvijo SoxS(R93A) s koaktivatorjem in tvorbo sintetičnega kondenzata so dosegli povečanje transkripcije. Opazili so namreč povečano izražanje rdečega fluorescenčnega proteina (RFP). Poleg tega so dokazali tudi, da je vključitev dodatnih vezavnih mest za ''parS'' na tarčnem plazmidu povečala izražanje genov. V primerjavi z običajno aktivacijo, ki je posredovana preko interakcije ključ-ključavnica, so ugotovili, da ima aktivacija transkripcije, ki je posredovana preko kondenzatov, večji vpliv na izražanje genov [3].

Študijo so razširili tudi na preučevanje učinkov, ki jih imajo sintetični kondenzati na aktivnosti v sesalskih celicah. Ustvarili so reporterski protein, ki je vseboval citrin fluorescentni protein, spojen z DHFR, ki vodi do razgradnje fuzijskega partnerja. Za nadzorovanje njegove aktivnosti so naredili fuzijo antiparalelne levcinske zadrge Czipper na N-koncu reporterskega proteina. Sintetizirali so sesalsko domeno synIDP, RLPS-Y, za nastanek sintetičnih kondenzatov. synIDP so spojili z drugo levcinsko zadrgo, Nzipper, da so lahko zagotovili nadzorovano združitev reporterskega proteina v kondenzate. V eksperimentih s celicami HEK293 so opazili, da je zaradi nastanka kondenzatov RLPS-Y-Nzipper prišlo do delne zaščite reporterskega proteina pred razgradnjo, kar je vodilo do ponovne fluorescence citrina. Pri celicah, ki so izražale samo RLPS-Y ali Nzipper, ni bilo razlike v fluorescenci (nezmožnost izražanja reporterskega proteina), medtem ko je sočasno izražanje RLPS-Y-Nzipper in reporterskega proteina omogočilo delno obnovitev fluorescence. S sintetičnimi kondenzati lahko tudi v sesalskih celicah uravnavamo aktivnost proteinov, tako da njihova uporaba predstavlja potencialno orodje za nadzor celičnih procesov [3].

==Zaključek==
V raziskavi [3] so predstavljeni novi načini nadzora celične aktivnosti. Prejšnje raziskave so slonele večinoma na principu »ključ-ključavnica«, pri čemer so uporabili proteine in ostale biomolekule, ki so bili ravno prave oblike za interakcije s specifičnimi tarčami. Vendar so dokazali, da celice ne morejo nadzorovati vseh procesov na tak način. Pakiranje biomolekulskih skupkov v celicah tvori obsežno in zapleteno mrežo biomolekul, tako da je posamezne mehanizme in interakcije težko nadzorovati s sledenjem ciljnim molekulam. Gensko kodirane synIDP, ki lahko preklapljajo med različnimi faznimi stanji, je moč uporabiti za načrtovanje funkcionalnih kondenzatov v živih celicah. S pomočjo takih biomolekularnih kondenzatov lahko raziskovalci ustvarijo kompartmente znotraj celic, ki ločujejo določene molekule od citosola. Te sintetične kondenzate se tako lahko uporablja za nadzorovanje celične aktivnosti. En primer uporabe je, da lahko z njihovo uporabo ustvarimo okolje znotraj celic, ki lahko selektivno obogati plazmide in s tem poveča učinkovitost transkripcije [3].

==Literatura==
[1] S. F. Banani, H. O. Lee, A. A. Hyman, M. K. Rosen: ''Biomolecular condensates: Organizers of cellular biochemistry''. '''2017''', ''18(5)'', str. 285-298.

[2] S. Do, C. Lee, T. Lee, D. N. Kim, Y. Shin: Engineering DNA-based synthetic condensates with programmable material properties, compositions, and functionalities. ''Sci. Adv.'' '''2022''', ''8(41)'', str. 1–15

[3] Y. Dai, M. Farag, D. Lee, X. Zeng, K. Kim, H. in Son, X. Guo, J. Su, N. Peterson, L. You: Programmable synthetic biomolecular condensates for cellular control. ''Nat. Chem. Biol''. '''2023''', ''19(4)'', str. 518-528.

Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina

2020-05-05T12:26:08Z

Anja Konjc: /* Nastanek jedra */

Kompleksi portalnih proteinov so posebne strukture, ki so se razvile pri dsDNA bakteriofagih iz reda ''Caudiovirales''. Virusi tega reda večinoma vsebujejo ikozaedrično kapsido. Portalni protein, razporejen v obliki dodekamernega obroča, igra posebno vlogo pri uspešnosti virusne okužbe, saj je ključnega pomena pri sestavljanju bakteriofaga, pakiranju bakteriofagne DNA in dostavi DNA gostiteljski celici. Tak dodekamerni obroč, namreč pomaga tudi pri povezovanju repnih proteinov s kapsido, kar omogoča uspešen prenos virusnega genoma. Portalni proteini so zaradi svoje dinamične vloge precej plastični, pri vsaki fazi sestavljanja bakteriofaga pride do nekaterih konformacijskih sprememb. Znano je, da pri različnih baketriofagih, portalni protein predstavlja nepogrešljiv del v večini faz procesa sestavljanju fagnih delcev.

==Sestavljanje bakteriofaga==

Sestavljanje fagnih delcev lahko razdelimo na štiri ključne faze, in sicer:
# nastanek jedra,
# oblikovanje prokapside, ki vsebuje ogrodne proteine,
# pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture,
# sklopitev repnih proteinov.

Portalni protein igra pomembno vlogo v fazi 1, 3 in 4. Pri sestavljanju bakteriofaga so poleg portalnega proteina bolj pomembni še plaščni ter ogrodni proteini.

===Nastanek jedra===

Portalni protein deluje kot nekakšen kanal za DNA. Vendar je najprej potrebno, da se monomeri sestavijo v kompleks portalnega proteina (v nadaljevanju je kompleks omenjen tudi samo kot portalni protein) in vgradijo v eno oglišče prokapside. V prvi fazi mora priti do združitve portalnega proteina in ogrodnih proteinov skupaj s plaščnimi v ikozaedrično prokapsido. Taka prokapsida je sestavljena iz pentamerov in heksamerov, ki vsebujejo dodekamerni portalni protein. Nastanek tega kompleksa je odvisen predvsem od ogrodnih proteinov.

Ko se oblikujejo dodekamerni obroči, le-ti sodelujejo kot iniciatorji nadaljnjega sestavljanja. Znano je, da prisotnost portalnega proteina pri sestavljanju kapside pri nekaterih bakteriofagih poveča izkoristek le-tega procesa sestavljanja. Ojedritev pri bakteriofagih poteka različno, v vsakem primeru pa pride do tega, da se ogrodni protein nahaja na notranji strani prokapside.

Znano je, da portalni protein ni nujen za izgradnjo prokapsid. Njegova prisotnost postane ključnega pomena pri pakiranju DNA, saj le-ta proces ne more poteči v njegovi odsotnosti. Le bakteriofagi, ki torej vsebujejo tak kompleks lahko zapakirajo ustrezno količino DNA in tako uspešno delujejo.

===Oblikovanje prokapside===

V tej fazi pride do izgradnje nezrele ikozaedrične kapside. Ogrodni proteini se še nahajajo znotraj prokapside. V prokapsidi se nahajajo tudi posebni proteini, ki kasneje pomagajo pri sprostitvi DNA.

===Pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture===

Sledi pakiranje DNA in zorenje prokapside. Ob tem se iz notranjosti prokapside sprostijo ogrodni proteini. Ti se lahko razgradijo (pri bakteriofagih lambda, T4, HK97 in herpes virusih) ali se ponovno uporabijo za sestavljanje fagnih delcev. Virusna DNA se selektivno veže na virusne terminaze, nato pa se dostavi v kapsido skozi portalni kompleks. Proces pakiranja je natančneje razložen spodaj (glej DNA pakirajoči motor bakteriofagov).

===Sklopitev repnih proteinov===

Po končanem pakiranju DNA je glavo nastajajočega bakteriofaga potrebno še ustrezno zapreti. Pri tem sodelujejo čepni proteini, ki interagirajo s portalnim proteinom in preprečijo, da bi DNA zapustila kapsido. Na koncu se na te proteine dodajo še repni proteini, ki se polimerizirajo. Le-ti imajo pomembno vlogo pri prepoznavanju celičnih receptorjev.

==Zgradba portalnega proteina==

Strukturno so portalni proteini dodekamerni obroči (12 podenot) in so del ikozaederične kapside. Vsaka kapsida ima na enem izmed svojih dvanajstih oglišč, ki je stičišče petih ploskev, prisoten portalni dodekamerni obroč. Je središče za pritrditev repa in proteinov, ki omogočijo zaprtje virusnega delca.

Čeprav se monomeri portalnih proteinov različnih virusov precej razlikujejo po velikosti (od 0,4 do 1 Mda), si vsi delijo podobno zvitje kljub zelo nizki podobnosti primarnega aminokislinskega zaporedja. Ta je običajno zgolj okrog 12 %. Tako funkcija portalnih proteinov temelji predvsem na njihovem zvitju in strukturi.

Zanimivo je opažanje, da ''in vitro'' obstajajo različne oligomerne oblike (11-meri, 12-meri in 13-meri). Kar nakazuje na to, da so monomeri portalnih proteinov zgrajeni, tako da se lahko prilagodijo znatnim strukturnim spremembam. Strukturno je ta plastičnost lahko pojasnjena s prisotnostjo pozitivno in negativno nabitih zaplat na protomerih portala, ki interagirajo preko elektrostatskih sil in delujejo kot molekularni magneti. Posledično je možen nastanek različnih oligomerov.

Vsak monomer in tudi celoten dodekamer ima vsaj štiri, nekateri pa pet značilnih regij.

===Regija sodček===

Portalni obroči imajo lahko dodatno regijo sodček, ki je pritrjen na krono in se razširja v notranjost kapside. Prisoten je pri bakteriofagih T4 in P22. Pri P22 je prisoten le pri popolnoma dozorelih virusih. Gre za vijačno strukturo. Regija sodček pri posameznem monomeru portalnega proteina vsebuje eno alfa vijačnico. Pri bakteriofagih P22 je ta dolga kar 125 aminokislin. V tej regiji je najpogostejša aminokislina glutamin (17 %), ki je tudi pogost aminokislinski ostanek pri DNA vezavnih proteinih.

===Regija krona===

Regija krona je širok konec (če ni prisotne regije sodček) portalnega proteinskega kompleksa in sega v notranjost virusne kapside. Sestavljena je iz alfa vijačnic. Poleg regije krilo, s katero je fleksibilno povezana, gre za najbolj variabilno regijo portalnega proteina.

===Regija krilo===

Regija krilo omogoča tesno povezavo s kapsido in ogrodnimi proteini. Štrli navzven iz centralne osi. Najdaljša alfa vijačnica v domeni predstavlja hrbetenico krila. Na obrobju pa ima alfa/beta podzvitje. Ploščata površina krila je prevladujoče negativno nabita. To prepreči vezavo DNA na portal. Velikosti domene krila lahko segajo od 33 kDa (HK97-podobni virusi) pa vse do 80 kDa (P22). Povezano je s steblom preko fleksibilne zanke. Gre za neurejen element prisoten pri poznanih kompleksih nekaterih fagov. Zanke vsakega od protomerov prodirajo proti centru portalnega kanala in tako ustvarijo zožitev v obroču. Ta ima ključno vlogo pri preprečevanju uhajanja DNA pri pakiranju.

===Regija steblo===

Tako kot pecelj je tudi regija steblo strogo urejena. Tipično ga sestavljata dve alfa vijačnici in zunanje zanke. Alfa vijačnice, ki tvorijo steblo so glede na center kanala zasukane za kot od 30° do 50°, odvisno za kateri virus gre. Mutacije v vijačnici stebla imajo velik vpliv na DNA pakiranje. Pri P22 spremenjeni aminokislinski ostanki 105-132 rezultirajo v prekomernem pakiranju. Ravno obratno pa se zgodi pri SPP1, pri katerem mutacije povzročijo ustavitev pakiranja.

===Regija pecelj===

Domena pecelj je izpostavljena zunanjosti kapside. Vključena je v vezavo terminaze in predstavlja mesto za interakcijo z adapterskimi proteini. Je strogo urejena. Predstavlja začetni del kanala za DNA pakiranje. Pri portalnem kompleksu bakteriofaga T4 pozitivne aminokisline obdajajo dno regije pecelj in so najverjetneje vpletene v ujetje DNA ob pričetku translokacije virusnega genoma.

==DNA pakirajoči motor bakteriofagov==

Da se v kapsidi bakteriofagov na omejenem volumnu razporedi negativno nabita DNA, je potrebno usklajeno delovanje portalnega proteina s terminaznim kompleksom, ki ga sestavljata mala in velika terminazna podenota. Terminazni kompleks in portalni protein skupaj tvorita molekulski motor, ki pretvarja kemijsko energijo, ki se sprosti pri hidrolizi ATP, v fizično gibanje molekul, zaradi česar pride do vstavitve DNA v prokapsido. DNA se v prokapsido vstavi s hitrostmi do ∼1,800 bp na sekundo in v korakih po 2 bp/ATP. Preko kanala premera 30 Å, ki ga tvori portalni protein, se v prokapsido translocira linearen genom, kjer se zelo tesno pakira v kompaktno strukturo. DNA pakirajoči motor bakteriofagov je najmočnejši do zdaj poznani molekulski motor in generira ogromne sile (do 60 pN), ki so ključne za pakiranje DNA proti ogromnim elektrostatskim odbojnim silam in neugodni entropiji.

Oligomer male terminaze prepozna genomsko DNA tako, da se veže na specifična zaporedja ''pac'' oz. ''cos'', na kompleks male terminaze in DNA se naloži velika terminaza in nato se celoten kompleks naloži na portalni protein. Velika terminaza interagira z regijo pecelj portalnega proteina in oligomerizira, pri čemer tvori pentamerni obroč. Sestavljena je iz endonukleazne C-končne domene, ki je odgovorna za cepitev DNA, ter ATPazne N-končne domene, ki s hidrolizo ATP prispeva energijo za pakiranje DNA. Številni bakteriofagi podvojujejo genom po principu kotalečega se kroga in tvorijo dolge konkatemere. Prepoznavanje DNA in njena cepitev pa se med različnimi bakteriofagi razlikuje. Pri nekaterih bakteriofagih, kot so P22, T4 in SPP1, pride do začetne nespecifične cepitve blizu prepoznavnega mesta ''pac'' (angl. packaging recognition site). Ko je kapsida polna, se pakiranje genoma konča in pride do nespecifične cepitve DNA. Da ti bakteriofagi zagotovijo, da vsaka kapsida vsebuje celoten genom, je zanje značilna terminalno redundančna DNA. Drug mehanizem, do katerega pride npr. pri bakteriofagih λ, HK97 in P2, pa je cepitev na specifičnih kohezivnih končnih mestih (''cos''), tako da se celoten genom nahaja med dvema ''cos'' cepitvenima mestoma. Bakteriofag φ29 pa ne potrebuje cepitve, saj je njegov genom že končne dolžine. Posebnost bakteriofaga φ29 je tudi, da za pakiranje DNA potrebuje šest molekul pRNA (pakirajoča RNA), ki so dolge 174 nukleotidov, in katerih sekundarna struktura je ključna za pakiranje DNA ter imajo homologno vlogo kot mala terminaza, potrebne pa so tudi za nalaganje ATPaznega dela motorja.

===Strukturne spremembe portalnega proteina pri pakiranju genoma===

Ko so preučevali strukturne spremembe portalnega proteina bakteriofaga P22 pri pakiranju DNA, so ugotovili, da pakiranje DNA inducira prehod nezrelega asimetričnega portalnega proteina v zrel simetričen kompaktnejši portalni protein, pri čemer pride do povečanja premera osrednjega kanala s 25 Å na 40 Å, medtem ko se celoten premer portalnega proteina zmanjša z 200 Å na 170 Å. Samo prvotna oblika, ki je prisotna v nezrelem bakteriofagu, pa je sposobna pakiranja DNA.

Regija sodček zaradi pakiranja genoma spremeni konformacijo iz nestrukturirane v alfa vijačno in zaznava pritisk v kapsidi. Do največje strukturne spremembe pride na C-končnem delu regije sodček, ki v zreli obliki sega precej bolj v notranjost kapside. Med pakiranjem DNA pride zaradi prevladovanja negativno nabitih aminokislinskih ostankov na zunanji površini regije sodček do odboja med DNA in negativnimi ostanki, zato se ta regija iztegne. Ta strukturna sprememba je najverjetneje ključna za injiciranje genoma ob infekciji.

Strukturna sprememba se zaradi visokega pritiska prenese iz regije sodček na regiji pecelj in krilo, in posledično pride do preureditve simetrije portalnega proteina iz petdelne v šestdelno. Ta preureditev simetrije predstavlja signal za terminacijo pakiranja in vodi v zmanjšanje vezavne afinitete za veliko terminazo, kar upočasni translokacijo DNA in pospeši nukleazno aktivnost velike terminaze. Velika in mala terminaza se ob zaključku pakiranja DNA sprostita z nascentnega bakteriofaga, zato v zrelem bakteriofagu nista prisotni.

==Viri==

P. E. Prevelige, J. R. Cortines: Phage Assembly and the Special Role of the Portal Protein. ''Curr. Opin. Virol.'' '''2018''', ''31'', 66–73.

V. B. Rao, M. Feiss: The Bacteriophage DNA Packaging Motor. ''Annu. Rev. Genet.'' '''2008''', ''42'', 647–681.

C. L. Dedeo, G. Cingolani, C. M. Teschke: Portal Protein: The Orchestrator of Capsid Assembly for the DsDNA Tailed Bacteriophages and Herpesviruses. ''Annu. Rev. Virol.'' '''2019''', ''6'', 141–160.

R. K. Lokareddy, R. S. Sankhala, A. Roy, P. V. Afonine, T. Motwani, C. M. Teschke, K. N. Parent, G. Cingolani: Portal Protein Functions Akin to a DNA-Sensor That Couples Genome-Packaging to Icosahedral Capsid Maturation. ''Nat. Commun.'' '''2017''', ''8''.

A. A. Aksyuk, M. G. Rossmann: Bacteriophage Assembly. ''Viruses''. '''2011''', ''3'', 172–203.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina

2020-05-05T09:07:21Z

Anja Konjc: /* Nastanek jedra */

Kompleksi portalnih proteinov so posebne strukture, ki so se razvile pri dsDNA bakteriofagih iz reda ''Caudiovirales''. Virusi tega reda večinoma vsebujejo ikozaedrično kapsido. Portalni protein, razporejen v obliki dodekamernega obroča, igra posebno vlogo pri uspešnosti virusne okužbe, saj je ključnega pomena pri sestavljanju bakteriofaga, pakiranju bakteriofagne DNA in dostavi DNA gostiteljski celici. Tak dodekamerni obroč, namreč pomaga tudi pri povezovanju repnih proteinov s kapsido, kar omogoča uspešen prenos virusnega genoma. Portalni proteini so zaradi svoje dinamične vloge precej plastični, pri vsaki fazi sestavljanja bakteriofaga pride do nekaterih konformacijskih sprememb. Znano je, da pri različnih baketriofagih, portalni protein predstavlja nepogrešljiv del v večini faz procesa sestavljanju fagnih delcev.

==Sestavljanje bakteriofaga==

Sestavljanje fagnih delcev lahko razdelimo na štiri ključne faze, in sicer:
# nastanek jedra,
# oblikovanje prokapside, ki vsebuje ogrodne proteine,
# pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture,
# sklopitev repnih proteinov.

Portalni protein igra pomembno vlogo v fazi 1, 3 in 4. Pri sestavljanju bakteriofaga so poleg portalnega proteina bolj pomembni še plaščni ter ogrodni proteini.

===Nastanek jedra===

Portalni protein deluje kot nekakšen kanal za DNA. Vendar je najprej potrebno, da se monomeri sestavijo v kompleks portalnega proteina (v nadaljevanju je kompleks omenjen tudi samo kot portalni protein) in vgradijo v eno oglišče prokapside. V prvi fazi mora priti do združitve portalnega proteina in ogrodnih proteinov skupaj s plaščnimi v ikozaedrično prokapsido. Taka prokapsida je sestavljena iz pentamerov in heksamerov, ki vsebujejo dodekamerni portalni protein. Nastanek tega kompleksa je odvisen predvsem od ogrodnih proteinov.

Ko se oblikujejo dodekamerni obroči, le-ti sodelujejo kot iniciatorji nadaljnjega sestavljanja. Znano je, da prisotnost portalnega proteina pri sestavljanju kapside pri nekaterih bakteriofagih poveča izkoristek le-tega procesa sestavljanja. Ojedritev pri bakteriofagih poteka različno, v vsakem primeru pa pride do tega, da se ogrodni protein nahaja na notranji strani prokapside.

Znano je, da ni nujen za izgradnjo prokapsid. Njegova prisotnost postane ključnega pomena pri pakiranju DNA, saj le-ta proces ne more poteči v njegovi odsotnosti. Le bakteriofagi, ki torej vsebujejo tak kompleks lahko zapakirajo ustrezno količino DNA in tako uspešno delujejo.

===Oblikovanje prokapside===

V tej fazi pride do izgradnje nezrele ikozaedrične kapside. Ogrodni proteini se še nahajajo znotraj prokapside. V prokapsidi se nahajajo tudi posebni proteini, ki kasneje pomagajo pri sprostitvi DNA.

===Pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture===

Sledi pakiranje DNA in zorenje prokapside. Ob tem se iz notranjosti prokapside sprostijo ogrodni proteini. Ti se lahko razgradijo (pri bakteriofagih lambda, T4, HK97 in herpes virusih) ali se ponovno uporabijo za sestavljanje fagnih delcev. Virusna DNA se selektivno veže na virusne terminaze, nato pa se dostavi v kapsido skozi portalni kompleks. Proces pakiranja je natančneje razložen spodaj (glej DNA pakirajoči motor bakteriofagov).

===Sklopitev repnih proteinov===

Po končanem pakiranju DNA je glavo nastajajočega bakteriofaga potrebno še ustrezno zapreti. Pri tem sodelujejo čepni proteini, ki interagirajo s portalnim proteinom in preprečijo, da bi DNA zapustila kapsido. Na koncu se na te proteine dodajo še repni proteini, ki se polimerizirajo. Le-ti imajo pomembno vlogo pri prepoznavanju celičnih receptorjev.

==Zgradba portalnega proteina==

Strukturno so portalni proteini dodekamerni obroči (12 podenot) in so del ikozaederične kapside. Vsaka kapsida ima na enem izmed svojih dvanajstih oglišč, ki je stičišče petih ploskev, prisoten portalni dodekamerni obroč. Je središče za pritrditev repa in proteinov, ki omogočijo zaprtje virusnega delca.

Čeprav se monomeri portalnih proteinov različnih virusov precej razlikujejo po velikosti (od 0,4 do 1 Mda), si vsi delijo podobno zvitje kljub zelo nizki podobnosti primarnega aminokislinskega zaporedja. Ta je običajno zgolj okrog 12 %. Tako funkcija portalnih proteinov temelji predvsem na njihovem zvitju in strukturi.

Zanimivo je opažanje, da ''in vitro'' obstajajo različne oligomerne oblike (11-meri, 12-meri in 13-meri). Kar nakazuje na to, da so monomeri portalnih proteinov zgrajeni, tako da se lahko prilagodijo znatnim strukturnim spremembam. Strukturno je ta plastičnost lahko pojasnjena s prisotnostjo pozitivno in negativno nabitih zaplat na protomerih portala, ki interagirajo preko elektrostatskih sil in delujejo kot molekularni magneti. Posledično je možen nastanek različnih oligomerov.

Vsak monomer in tudi celoten dodekamer ima vsaj štiri, nekateri pa pet značilnih regij.

===Regija sodček===

Portalni obroči imajo lahko dodatno regijo sodček, ki je pritrjen na krono in se razširja v notranjost kapside. Prisoten je pri bakteriofagih T4 in P22. Pri P22 je prisoten le pri popolnoma dozorelih virusih. Gre za vijačno strukturo. Regija sodček pri posameznem monomeru portalnega proteina vsebuje eno alfa vijačnico. Pri bakteriofagih P22 je ta dolga kar 125 aminokislin. V tej regiji je najpogostejša aminokislina glutamin (17 %), ki je tudi pogost aminokislinski ostanek pri DNA vezavnih proteinih.

===Regija krona===

Regija krona je širok konec (če ni prisotne regije sodček) portalnega proteinskega kompleksa in sega v notranjost virusne kapside. Sestavljena je iz alfa vijačnic. Poleg regije krilo, s katero je fleksibilno povezana, gre za najbolj variabilno regijo portalnega proteina.

===Regija krilo===

Regija krilo omogoča tesno povezavo s kapsido in ogrodnimi proteini. Štrli navzven iz centralne osi. Najdaljša alfa vijačnica v domeni predstavlja hrbetenico krila. Na obrobju pa ima alfa/beta podzvitje. Ploščata površina krila je prevladujoče negativno nabita. To prepreči vezavo DNA na portal. Velikosti domene krila lahko segajo od 33 kDa (HK97-podobni virusi) pa vse do 80 kDa (P22). Povezano je s steblom preko fleksibilne zanke. Gre za neurejen element prisoten pri poznanih kompleksih nekaterih fagov. Zanke vsakega od protomerov prodirajo proti centru portalnega kanala in tako ustvarijo zožitev v obroču. Ta ima ključno vlogo pri preprečevanju uhajanja DNA pri pakiranju.

===Regija steblo===

Tako kot pecelj je tudi regija steblo strogo urejena. Tipično ga sestavljata dve alfa vijačnici in zunanje zanke. Alfa vijačnice, ki tvorijo steblo so glede na center kanala zasukane za kot od 30° do 50°, odvisno za kateri virus gre. Mutacije v vijačnici stebla imajo velik vpliv na DNA pakiranje. Pri P22 spremenjeni aminokislinski ostanki 105-132 rezultirajo v prekomernem pakiranju. Ravno obratno pa se zgodi pri SPP1, pri katerem mutacije povzročijo ustavitev pakiranja.

===Regija pecelj===

Domena pecelj je izpostavljena zunanjosti kapside. Vključena je v vezavo terminaze in predstavlja mesto za interakcijo z adapterskimi proteini. Je strogo urejena. Predstavlja začetni del kanala za DNA pakiranje. Pri portalnem kompleksu bakteriofaga T4 pozitivne aminokisline obdajajo dno regije pecelj in so najverjetneje vpletene v ujetje DNA ob pričetku translokacije virusnega genoma.

==DNA pakirajoči motor bakteriofagov==

Da se v kapsidi bakteriofagov na omejenem volumnu razporedi negativno nabita DNA, je potrebno usklajeno delovanje portalnega proteina s terminaznim kompleksom, ki ga sestavljata mala in velika terminazna podenota. Terminazni kompleks in portalni protein skupaj tvorita molekulski motor, ki pretvarja kemijsko energijo, ki se sprosti pri hidrolizi ATP, v fizično gibanje molekul, zaradi česar pride do vstavitve DNA v prokapsido. DNA se v prokapsido vstavi s hitrostmi do ∼1,800 bp na sekundo in v korakih po 2 bp/ATP. Preko kanala premera 30 Å, ki ga tvori portalni protein, se v prokapsido translocira linearen genom, kjer se zelo tesno pakira v kompaktno strukturo. DNA pakirajoči motor bakteriofagov je najmočnejši do zdaj poznani molekulski motor in generira ogromne sile (do 60 pN), ki so ključne za pakiranje DNA proti ogromnim elektrostatskim odbojnim silam in neugodni entropiji.

Oligomer male terminaze prepozna genomsko DNA tako, da se veže na specifična zaporedja ''pac'' oz. ''cos'', na kompleks male terminaze in DNA se naloži velika terminaza in nato se celoten kompleks naloži na portalni protein. Velika terminaza interagira z regijo pecelj portalnega proteina in oligomerizira, pri čemer tvori pentamerni obroč. Sestavljena je iz endonukleazne C-končne domene, ki je odgovorna za cepitev DNA, ter ATPazne N-končne domene, ki s hidrolizo ATP prispeva energijo za pakiranje DNA. Številni bakteriofagi podvojujejo genom po principu kotalečega se kroga in tvorijo dolge konkatemere. Prepoznavanje DNA in njena cepitev pa se med različnimi bakteriofagi razlikuje. Pri nekaterih bakteriofagih, kot so P22, T4 in SPP1, pride do začetne nespecifične cepitve blizu prepoznavnega mesta ''pac'' (angl. packaging recognition site). Ko je kapsida polna, se pakiranje genoma konča in pride do nespecifične cepitve DNA. Da ti bakteriofagi zagotovijo, da vsaka kapsida vsebuje celoten genom, je zanje značilna terminalno redundančna DNA. Drug mehanizem, do katerega pride npr. pri bakteriofagih λ, HK97 in P2, pa je cepitev na specifičnih kohezivnih končnih mestih (''cos''), tako da se celoten genom nahaja med dvema ''cos'' cepitvenima mestoma. Bakteriofag φ29 pa ne potrebuje cepitve, saj je njegov genom že končne dolžine. Posebnost bakteriofaga φ29 je tudi, da za pakiranje DNA potrebuje šest molekul pRNA (pakirajoča RNA), ki so dolge 174 nukleotidov, in katerih sekundarna struktura je ključna za pakiranje DNA ter imajo homologno vlogo kot mala terminaza, potrebne pa so tudi za nalaganje ATPaznega dela motorja.

===Strukturne spremembe portalnega proteina pri pakiranju genoma===

Ko so preučevali strukturne spremembe portalnega proteina bakteriofaga P22 pri pakiranju DNA, so ugotovili, da pakiranje DNA inducira prehod nezrelega asimetričnega portalnega proteina v zrel simetričen kompaktnejši portalni protein, pri čemer pride do povečanja premera osrednjega kanala s 25 Å na 40 Å, medtem ko se celoten premer portalnega proteina zmanjša z 200 Å na 170 Å. Samo prvotna oblika, ki je prisotna v nezrelem bakteriofagu, pa je sposobna pakiranja DNA.

Regija sodček zaradi pakiranja genoma spremeni konformacijo iz nestrukturirane v alfa vijačno in zaznava pritisk v kapsidi. Do največje strukturne spremembe pride na C-končnem delu regije sodček, ki v zreli obliki sega precej bolj v notranjost kapside. Med pakiranjem DNA pride zaradi prevladovanja negativno nabitih aminokislinskih ostankov na zunanji površini regije sodček do odboja med DNA in negativnimi ostanki, zato se ta regija iztegne. Ta strukturna sprememba je najverjetneje ključna za injiciranje genoma ob infekciji.

Strukturna sprememba se zaradi visokega pritiska prenese iz regije sodček na regiji pecelj in krilo, in posledično pride do preureditve simetrije portalnega proteina iz petdelne v šestdelno. Ta preureditev simetrije predstavlja signal za terminacijo pakiranja in vodi v zmanjšanje vezavne afinitete za veliko terminazo, kar upočasni translokacijo DNA in pospeši nukleazno aktivnost velike terminaze. Velika in mala terminaza se ob zaključku pakiranja DNA sprostita z nascentnega bakteriofaga, zato v zrelem bakteriofagu nista prisotni.

==Viri==

P. E. Prevelige, J. R. Cortines: Phage Assembly and the Special Role of the Portal Protein. ''Curr. Opin. Virol.'' '''2018''', ''31'', 66–73.

V. B. Rao, M. Feiss: The Bacteriophage DNA Packaging Motor. ''Annu. Rev. Genet.'' '''2008''', ''42'', 647–681.

C. L. Dedeo, G. Cingolani, C. M. Teschke: Portal Protein: The Orchestrator of Capsid Assembly for the DsDNA Tailed Bacteriophages and Herpesviruses. ''Annu. Rev. Virol.'' '''2019''', ''6'', 141–160.

R. K. Lokareddy, R. S. Sankhala, A. Roy, P. V. Afonine, T. Motwani, C. M. Teschke, K. N. Parent, G. Cingolani: Portal Protein Functions Akin to a DNA-Sensor That Couples Genome-Packaging to Icosahedral Capsid Maturation. ''Nat. Commun.'' '''2017''', ''8''.

A. A. Aksyuk, M. G. Rossmann: Bacteriophage Assembly. ''Viruses''. '''2011''', ''3'', 172–203.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina

2020-05-05T07:13:50Z

Anja Konjc:

Kompleksi portalnih proteinov so posebne strukture, ki so se razvile pri dsDNA bakteriofagih iz reda ''Caudiovirales''. Virusi tega reda večinoma vsebujejo ikozaedrično kapsido. Portalni protein, razporejen v obliki dodekamernega obroča, igra posebno vlogo pri uspešnosti virusne okužbe, saj je ključnega pomena pri sestavljanju bakteriofaga, pakiranju bakteriofagne DNA in dostavi DNA gostiteljski celici. Tak dodekamerni obroč, namreč pomaga tudi pri povezovanju repnih proteinov s kapsido, kar omogoča uspešen prenos virusnega genoma. Portalni proteini so zaradi svoje dinamične vloge precej plastični, pri vsaki fazi sestavljanja bakteriofaga pride do nekaterih konformacijskih sprememb. Znano je, da pri različnih baketriofagih, portalni protein predstavlja nepogrešljiv del v večini faz procesa sestavljanju fagnih delcev.

==Sestavljanje bakteriofaga==

Sestavljanje fagnih delcev lahko razdelimo na štiri ključne faze, in sicer:
# nastanek jedra,
# oblikovanje prokapside, ki vsebuje ogrodne proteine,
# pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture,
# sklopitev repnih proteinov.

Portalni protein igra pomembno vlogo v fazi 1, 3 in 4. Pri sestavljanju bakteriofaga so poleg portalnega proteina bolj pomembni še plaščni ter ogrodni proteini.

===Nastanek jedra===

Portalni protein deluje kot nekakšen kanal za DNA. Vendar je najprej potrebno, da se monomeri sestavijo v kompleks portalnega proteina (v nadaljevanju omenjeni tudi samo kot portalni protein) in vgradijo v eno oglišče prokapside. V prvi fazi mora priti do združitve portalnega proteina in ogrodnih proteinov skupaj s plaščnimi v ikozaedrično prokapsido. Taka prokapsida je sestavljena iz pentamerov in heksamerov, ki vsebujejo dodekamerni portalni protein. Nastanek tega kompleksa je odvisen predvsem od ogrodnih proteinov.

Ko se oblikujejo dodekamerni obroči, le-ti sodelujejo kot iniciatorji nadaljnjega sestavljanja. Znano je, da prisotnost portalnega proteina pri sestavljanju kapside pri nekaterih bakteriofagih poveča izkoristek le-tega procesa sestavljanja. Ojedritev pri bakteriofagih poteka različno, v vsakem primeru pa pride do tega, da se ogrodni protein nahaja na notranji strani prokapside.

Znano je, da ni nujen za izgradnjo prokapsid. Njegova prisotnost postane ključnega pomena pri pakiranju DNA, saj le-ta proces ne more poteči v njegovi odsotnosti. Le bakteriofagi, ki torej vsebujejo tak kompleks lahko zapakirajo ustrezno količino DNA in tako uspešno delujejo.

===Oblikovanje prokapside===

V tej fazi pride do izgradnje nezrele ikozaedrične kapside. Ogrodni proteini se še nahajajo znotraj prokapside. V prokapsidi se nahajajo tudi posebni proteini, ki kasneje pomagajo pri sprostitvi DNA.

===Pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture===

Sledi pakiranje DNA in zorenje prokapside. Ob tem se iz notranjosti prokapside sprostijo ogrodni proteini. Ti se lahko razgradijo (pri bakteriofagih lambda, T4, HK97 in herpes virusih) ali se ponovno uporabijo za sestavljanje fagnih delcev. Virusna DNA se selektivno veže na virusne terminaze, nato pa se dostavi v kapsido skozi portalni kompleks. Proces pakiranja je natančneje razložen spodaj (glej DNA pakirajoči motor bakteriofagov).

===Sklopitev repnih proteinov===

Po končanem pakiranju DNA je glavo nastajajočega bakteriofaga potrebno še ustrezno zapreti. Pri tem sodelujejo čepni proteini, ki interagirajo s portalnim proteinom in preprečijo, da bi DNA zapustila kapsido. Na koncu se na te proteine dodajo še repni proteini, ki se polimerizirajo. Le-ti imajo pomembno vlogo pri prepoznavanju celičnih receptorjev.

==Zgradba portalnega proteina==

Strukturno so portalni proteini dodekamerni obroči (12 podenot) in so del ikozaederične kapside. Vsaka kapsida ima na enem izmed svojih dvanajstih oglišč, ki je stičišče petih ploskev, prisoten portalni dodekamerni obroč. Je središče za pritrditev repa in proteinov, ki omogočijo zaprtje virusnega delca.

Čeprav se monomeri portalnih proteinov različnih virusov precej razlikujejo po velikosti (od 0,4 do 1 Mda), si vsi delijo podobno zvitje kljub zelo nizki podobnosti primarnega aminokislinskega zaporedja. Ta je običajno zgolj okrog 12 %. Tako funkcija portalnih proteinov temelji predvsem na njihovem zvitju in strukturi.

Zanimivo je opažanje, da ''in vitro'' obstajajo različne oligomerne oblike (11-meri, 12-meri in 13-meri). Kar nakazuje na to, da so monomeri portalnih proteinov zgrajeni, tako da se lahko prilagodijo znatnim strukturnim spremembam. Strukturno je ta plastičnost lahko pojasnjena s prisotnostjo pozitivno in negativno nabitih zaplat na protomerih portala, ki interagirajo preko elektrostatskih sil in delujejo kot molekularni magneti. Posledično je možen nastanek različnih oligomerov.

Vsak monomer in tudi celoten dodekamer ima vsaj štiri, nekateri pa pet značilnih regij.

===Regija sodček===

Portalni obroči imajo lahko dodatno regijo sodček, ki je pritrjen na krono in se razširja v notranjost kapside. Prisoten je pri bakteriofagih T4 in P22. Pri P22 je prisoten le pri popolnoma dozorelih virusih. Gre za vijačno strukturo. Regija sodček pri posameznem monomeru portalnega proteina vsebuje eno alfa vijačnico. Pri bakteriofagih P22 je ta dolga kar 125 aminokislin. V tej regiji je najpogostejša aminokislina glutamin (17 %), ki je tudi pogost aminokislinski ostanek pri DNA vezavnih proteinih.

===Regija krona===

Regija krona je širok konec (če ni prisotne regije sodček) portalnega proteinskega kompleksa in sega v notranjost virusne kapside. Sestavljena je iz alfa vijačnic. Poleg regije krilo, s katero je fleksibilno povezana, gre za najbolj variabilno regijo portalnega proteina.

===Regija krilo===

Regija krilo omogoča tesno povezavo s kapsido in ogrodnimi proteini. Štrli navzven iz centralne osi. Najdaljša alfa vijačnica v domeni predstavlja hrbetenico krila. Na obrobju pa ima alfa/beta podzvitje. Ploščata površina krila je prevladujoče negativno nabita. To prepreči vezavo DNA na portal. Velikosti domene krila lahko segajo od 33 kDa (HK97-podobni virusi) pa vse do 80 kDa (P22). Povezano je s steblom preko fleksibilne zanke. Gre za neurejen element prisoten pri poznanih kompleksih nekaterih fagov. Zanke vsakega od protomerov prodirajo proti centru portalnega kanala in tako ustvarijo zožitev v obroču. Ta ima ključno vlogo pri preprečevanju uhajanja DNA pri pakiranju.

===Regija steblo===

Tako kot pecelj je tudi regija steblo strogo urejena. Tipično ga sestavljata dve alfa vijačnici in zunanje zanke. Alfa vijačnice, ki tvorijo steblo so glede na center kanala zasukane za kot od 30° do 50°, odvisno za kateri virus gre. Mutacije v vijačnici stebla imajo velik vpliv na DNA pakiranje. Pri P22 spremenjeni aminokislinski ostanki 105-132 rezultirajo v prekomernem pakiranju. Ravno obratno pa se zgodi pri SPP1, pri katerem mutacije povzročijo ustavitev pakiranja.

===Regija pecelj===

Domena pecelj je izpostavljena zunanjosti kapside. Vključena je v vezavo terminaze in predstavlja mesto za interakcijo z adapterskimi proteini. Je strogo urejena. Predstavlja začetni del kanala za DNA pakiranje. Pri portalnem kompleksu bakteriofaga T4 pozitivne aminokisline obdajajo dno regije pecelj in so najverjetneje vpletene v ujetje DNA ob pričetku translokacije virusnega genoma.

==DNA pakirajoči motor bakteriofagov==

Da se v kapsidi bakteriofagov na omejenem volumnu razporedi negativno nabita DNA, je potrebno usklajeno delovanje portalnega proteina s terminaznim kompleksom, ki ga sestavljata mala in velika terminazna podenota. Terminazni kompleks in portalni protein skupaj tvorita molekulski motor, ki pretvarja kemijsko energijo, ki se sprosti pri hidrolizi ATP, v fizično gibanje molekul, zaradi česar pride do vstavitve DNA v prokapsido. DNA se v prokapsido vstavi s hitrostmi do ∼1,800 bp na sekundo in v korakih po 2 bp/ATP. Preko kanala premera 30 Å, ki ga tvori portalni protein, se v prokapsido translocira linearen genom, kjer se zelo tesno pakira v kompaktno strukturo. DNA pakirajoči motor bakteriofagov je najmočnejši do zdaj poznani molekulski motor in generira ogromne sile (do 60 pN), ki so ključne za pakiranje DNA proti ogromnim elektrostatskim odbojnim silam in neugodni entropiji.

Oligomer male terminaze prepozna genomsko DNA tako, da se veže na specifična zaporedja ''pac'' oz. ''cos'', na kompleks male terminaze in DNA se naloži velika terminaza in nato se celoten kompleks naloži na portalni protein. Velika terminaza interagira z regijo pecelj portalnega proteina in oligomerizira, pri čemer tvori pentamerni obroč. Sestavljena je iz endonukleazne C-končne domene, ki je odgovorna za cepitev DNA, ter ATPazne N-končne domene, ki s hidrolizo ATP prispeva energijo za pakiranje DNA. Številni bakteriofagi podvojujejo genom po principu kotalečega se kroga in tvorijo dolge konkatemere. Prepoznavanje DNA in njena cepitev pa se med različnimi bakteriofagi razlikuje. Pri nekaterih bakteriofagih, kot so P22, T4 in SPP1, pride do začetne nespecifične cepitve blizu prepoznavnega mesta ''pac'' (angl. packaging recognition site). Ko je kapsida polna, se pakiranje genoma konča in pride do nespecifične cepitve DNA. Da ti bakteriofagi zagotovijo, da vsaka kapsida vsebuje celoten genom, je zanje značilna terminalno redundančna DNA. Drug mehanizem, do katerega pride npr. pri bakteriofagih λ, HK97 in P2, pa je cepitev na specifičnih kohezivnih končnih mestih (''cos''), tako da se celoten genom nahaja med dvema ''cos'' cepitvenima mestoma. Bakteriofag φ29 pa ne potrebuje cepitve, saj je njegov genom že končne dolžine. Posebnost bakteriofaga φ29 je tudi, da za pakiranje DNA potrebuje šest molekul pRNA (pakirajoča RNA), ki so dolge 174 nukleotidov, in katerih sekundarna struktura je ključna za pakiranje DNA ter imajo homologno vlogo kot mala terminaza, potrebne pa so tudi za nalaganje ATPaznega dela motorja.

===Strukturne spremembe portalnega proteina pri pakiranju genoma===

Ko so preučevali strukturne spremembe portalnega proteina bakteriofaga P22 pri pakiranju DNA, so ugotovili, da pakiranje DNA inducira prehod nezrelega asimetričnega portalnega proteina v zrel simetričen kompaktnejši portalni protein, pri čemer pride do povečanja premera osrednjega kanala s 25 Å na 40 Å, medtem ko se celoten premer portalnega proteina zmanjša z 200 Å na 170 Å. Samo prvotna oblika, ki je prisotna v nezrelem bakteriofagu, pa je sposobna pakiranja DNA.

Regija sodček zaradi pakiranja genoma spremeni konformacijo iz nestrukturirane v alfa vijačno in zaznava pritisk v kapsidi. Do največje strukturne spremembe pride na C-končnem delu regije sodček, ki v zreli obliki sega precej bolj v notranjost kapside. Med pakiranjem DNA pride zaradi prevladovanja negativno nabitih aminokislinskih ostankov na zunanji površini regije sodček do odboja med DNA in negativnimi ostanki, zato se ta regija iztegne. Ta strukturna sprememba je najverjetneje ključna za injiciranje genoma ob infekciji.

Strukturna sprememba se zaradi visokega pritiska prenese iz regije sodček na regiji pecelj in krilo, in posledično pride do preureditve simetrije portalnega proteina iz petdelne v šestdelno. Ta preureditev simetrije predstavlja signal za terminacijo pakiranja in vodi v zmanjšanje vezavne afinitete za veliko terminazo, kar upočasni translokacijo DNA in pospeši nukleazno aktivnost velike terminaze. Velika in mala terminaza se ob zaključku pakiranja DNA sprostita z nascentnega bakteriofaga, zato v zrelem bakteriofagu nista prisotni.

==Viri==

P. E. Prevelige, J. R. Cortines: Phage Assembly and the Special Role of the Portal Protein. ''Curr. Opin. Virol.'' '''2018''', ''31'', 66–73.

V. B. Rao, M. Feiss: The Bacteriophage DNA Packaging Motor. ''Annu. Rev. Genet.'' '''2008''', ''42'', 647–681.

C. L. Dedeo, G. Cingolani, C. M. Teschke: Portal Protein: The Orchestrator of Capsid Assembly for the DsDNA Tailed Bacteriophages and Herpesviruses. ''Annu. Rev. Virol.'' '''2019''', ''6'', 141–160.

R. K. Lokareddy, R. S. Sankhala, A. Roy, P. V. Afonine, T. Motwani, C. M. Teschke, K. N. Parent, G. Cingolani: Portal Protein Functions Akin to a DNA-Sensor That Couples Genome-Packaging to Icosahedral Capsid Maturation. ''Nat. Commun.'' '''2017''', ''8''.

A. A. Aksyuk, M. G. Rossmann: Bacteriophage Assembly. ''Viruses''. '''2011''', ''3'', 172–203.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina

2020-05-05T07:10:23Z

Anja Konjc:

Kompleksi portalnih proteinov so posebne strukture, ki so se razvile pri dsDNA bakteriofagih iz reda ''Caudiovirales''. Virusi tega reda večinoma vsebujejo ikozaedrično kapsido. Portalni protein, razporejen v obliki dodekamernega obroča, igra posebno vlogo pri uspešnosti virusne okužbe, saj je ključnega pomena pri sestavljanju bakteriofaga, pakiranju bakteriofagne DNA in dostavi DNA gostiteljski celici. Tak dodekamerni obroč, namreč pomaga tudi pri povezovanju repnih proteinov s kapsido, kar omogoča uspešen prenos virusnega genoma. Portalni proteini so zaradi svoje dinamične vloge precej plastični, pri vsaki fazi sestavljanja bakteriofaga pride do nekaterih konformacijskih sprememb. Znano je, da pri različnih baketriofagih, portalni protein predstavlja nepogrešljiv del v večini faz procesa sestavljanju fagnih delcev.

==Sestavljanje bakteriofaga==

Sestavljanje fagnih delcev lahko razdelimo na štiri ključne faze, in sicer:
# nastanek jedra,
# oblikovanje prokapside, ki vsebuje ogrodne proteine,
# pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture,
# sklopitev repnih proteinov.

Portalni protein igra pomembno vlogo v fazi 1, 3 in 4. Pri sestavljanju bakteriofaga so poleg portalnega proteina bolj pomembni še plaščni ter ogrodni proteini.

===Nastanek jedra===

Portalni protein deluje kot nekakšen kanal za DNA. Vendar je najprej potrebno, da se monomeri sestavijo v kompleks portalnega proteina (v nadaljevanju omenjeni tudi samo kot portalni protein) in vgradijo v eno oglišče prokapside. V prvi fazi mora priti do združitve portalnega proteina in ogrodnih proteinov skupaj s plaščnimi v ikozaedrično prokapsido. Taka prokapsida je sestavljena iz pentamerov in heksamerov, ki vsebujejo dodekamerni portalni protein. Nastanek tega kompleksa je odvisen predvsem od ogrodnih proteinov.

Ko se oblikujejo dodekamerni obroči, le-ti sodelujejo kot iniciatorji nadaljnjega sestavljanja. Znano je, da prisotnost portalnega proteina pri sestavljanju kapside pri nekaterih bakteriofagih poveča izkoristek le-tega procesa sestavljanja. Ojedritev pri bakteriofagih poteka različno, v vsakem primeru pa pride do tega, da se ogrodni protein nahaja na notranji strani prokapside.

Znano je, da ni nujen za izgradnjo prokapsid. Njegova prisotnost postane ključnega pomena pri pakiranju DNA, saj le-ta proces ne more poteči v njegovi odsotnosti. Le bakteriofagi, ki torej vsebujejo tak kompleks lahko zapakirajo ustrezno količino DNA in tako uspešno delujejo.

===Oblikovanje prokapside===

V tej fazi pride do izgradnje nezrele ikozaedrične kapside. Ogrodni proteini se še nahajajo znotraj prokapside. V prokapsidi se nahajajo tudi posebni proteini, ki kasneje pomagajo pri sprostitvi DNA.

===Pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture===

Sledi pakiranje DNA in zorenje prokapside. Ob tem se iz notranjosti prokapside sprostijo ogrodni proteini. Ti se lahko razgradijo (pri bakteriofagih lambda, T4, HK97 in herpes virusih) ali se ponovno uporabijo za sestavljanje fagnih delcev. Virusna DNA se selektivno veže na virusne terminaze, nato pa se dostavi v kapsido skozi portalni kompleks. Proces pakiranja je natančneje razložen spodaj (glej DNA pakirajoči motor bakteriofagov).

===Sklopitev repnih proteinov===

Po končanem pakiranju DNA je glavo nastajajočega bakteriofaga potrebno še ustrezno zapreti. Pri tem sodelujejo čepni proteini, ki interagirajo s portalnim proteinom in preprečijo, da bi DNA zapustila kapsido. Na koncu se na te proteine dodajo še repni proteini, ki se polimerizirajo. Le-ti imajo pomembno vlogo pri prepoznavanju celičnih receptorjev.

==Zgradba portalnega proteina==

Strukturno so portalni proteini dodekamerni obroči (12 podenot) in so del ikozaederične kapside. Vsaka kapsida ima na enem izmed svojih dvanajstih oglišč, ki je stičišče petih ploskev, prisoten portalni dodekamerni obroč. Je središče za pritrditev repa in proteinov, ki omogočijo zaprtje virusnega delca.

Čeprav se monomeri portalnih proteinov različnih virusov precej razlikujejo po velikosti (od 0,4 do 1 Mda), si vsi delijo podobno zvitje kljub zelo nizki podobnosti primarnega aminokislinskega zaporedja. Ta je običajno zgolj okrog 12 %. Tako funkcija portalnih proteinov temelji predvsem na njihovem zvitju in strukturi.

Zanimivo je opažanje, da ''in vitro'' obstajajo različne oligomerne oblike (11-meri, 12-meri in 13-meri). Kar nakazuje na to, da so monomeri portalnih proteinov zgrajeni, tako da se lahko prilagodijo znatnim strukturnim spremembam. Strukturno je ta plastičnost lahko pojasnjena s prisotnostjo pozitivno in negativno nabitih zaplat na protomerih portala, ki interagirajo preko elektrostatskih sil in delujejo kot molekularni magneti. Posledično je možen nastanek različnih oligomerov.

Vsak monomer in tudi celoten dodekamer ima vsaj štiri, nekateri pa pet značilnih regij.

===Regija sodček===

Portalni obroči imajo lahko dodatno regijo sodček, ki je pritrjen na krono in se razširja v notranjost kapside. Prisoten je pri bakteriofagih T4 in P22. Pri P22 je prisoten le pri popolnoma dozorelih virusih. Gre za vijačno strukturo. Regija sodček pri posameznem monomeru portalnega proteina vsebuje eno alfa vijačnico. Pri bakteriofagih P22 je ta dolga kar 125 aminokislin. V tej regiji je najpogostejša aminokislina glutamin (17 %), ki je tudi pogost aminokislinski ostanek pri DNA vezavnih proteinih.

===Regija krona===

Regija krona je širok konec (če ni prisotne regije sodček) portalnega proteinskega kompleksa in sega v notranjost virusne kapside. Sestavljena je iz alfa vijačnic. Poleg regije krilo, s katero je fleksibilno povezana, gre za najbolj variabilno regijo portalnega proteina.

===Regija krilo===

Regija krilo omogoča tesno povezavo s kapsido in ogrodnimi proteini. Štrli navzven iz centralne osi. Najdaljša alfa vijačnica v domeni predstavlja hrbetenico krila. Na obrobju pa ima alfa/beta podzvitje. Ploščata površina krila je prevladujoče negativno nabita. To prepreči vezavo DNA na portal. Velikosti domene krila lahko segajo od 33 kDa (HK97-podobni virusi) pa vse do 80 kDa (P22). Povezano je s steblom preko fleksibilne zanke. Gre za neurejen element prisoten pri poznanih kompleksih nekaterih fagov. Zanke vsakega od protomerov prodirajo proti centru portalnega kanala in tako ustvarijo zožitev v obroču. Ta ima ključno vlogo pri preprečevanju uhajanja DNA pri pakiranju.

===Regija steblo===

Tako kot pecelj je tudi regija steblo strogo urejena. Tipično ga sestavljata dve alfa vijačnici in zunanje zanke. Alfa vijačnice, ki tvorijo steblo so glede na center kanala zasukane za kot od 30° do 50°, odvisno za kateri virus gre. Mutacije v vijačnici stebla imajo velik vpliv na DNA pakiranje. Pri P22 spremenjeni aminokislinski ostanki 105-132 rezultirajo v prekomernem pakiranju. Ravno obratno pa se zgodi pri SPP1, pri katerem mutacije povzročijo ustavitev pakiranja.

===Regija pecelj===

Domena pecelj je izpostavljena zunanjosti kapside. Vključena je v vezavo terminaze in predstavlja mesto za interakcijo z adapterskimi proteini. Je strogo urejena. Predstavlja začetni del kanala za DNA pakiranje. Pri portalnem kompleksu bakteriofaga T4 pozitivne aminokisline obdajajo dno regije pecelj in so najverjetneje vpletene v ujetje DNA ob pričetku translokacije virusnega genoma.

==DNA pakirajoči motor bakteriofagov==

Da se v kapsidi bakteriofagov na omejenem volumnu razporedi negativno nabita DNA, je potrebno usklajeno delovanje portalnega proteina s terminaznim kompleksom, ki ga sestavljata mala in velika terminazna podenota. Terminazni kompleks in portalni protein skupaj tvorita molekulski motor, ki pretvarja kemijsko energijo, ki se sprosti pri hidrolizi ATP, v fizično gibanje molekul, zaradi česar pride do vstavitve DNA v prokapsido. DNA se v prokapsido vstavi s hitrostmi do ∼1,800 bp na sekundo in v korakih po 2 bp/ATP. Preko kanala premera 30 Å, ki ga tvori portalni protein, se v prokapsido translocira linearen genom, kjer se zelo tesno pakira v kompaktno strukturo. DNA pakirajoči motor bakteriofagov je najmočnejši do zdaj poznani molekulski motor in generira ogromne sile (do 60 pN), ki so ključne za pakiranje DNA proti ogromnim elektrostatskim odbojnim silam in neugodni entropiji.

Oligomer male terminaze prepozna genomsko DNA tako, da se veže na specifična zaporedja ''pac'' oz. ''cos'', na kompleks male terminaze in DNA se naloži velika terminaza in nato se celoten kompleks naloži na portalni protein. Velika terminaza interagira z regijo pecelj portalnega proteina in oligomerizira, pri čemer tvori pentamerni obroč. Sestavljena je iz endonukleazne C-končne domene, ki je odgovorna za cepitev DNA, ter ATPazne N-končne domene, ki s hidrolizo ATP prispeva energijo za pakiranje DNA. Številni bakteriofagi podvojujejo genom po principu kotalečega se kroga in tvorijo dolge konkatemere. Prepoznavanje DNA in njena cepitev pa se med različnimi bakteriofagi razlikuje. Pri nekaterih bakteriofagih, kot so P22, T4 in SPP1, pride do začetne nespecifične cepitve blizu prepoznavnega mesta ''pac'' (angl. packaging recognition site). Ko je kapsida polna, se pakiranje genoma konča in pride do nespecifične cepitve DNA. Da ti bakteriofagi zagotovijo, da vsaka kapsida vsebuje celoten genom, je zanje značilna terminalno redundančna DNA. Drug mehanizem, do katerega pride npr. pri bakteriofagih λ, HK97 in P2, pa je cepitev na specifičnih kohezivnih končnih mestih (''cos''), tako da se celoten genom nahaja med dvema ''cos'' cepitvenima mestoma. Bakteriofag φ29 pa ne potrebuje cepitve, saj je njegov genom že končne dolžine. Posebnost bakteriofaga φ29 je tudi, da za pakiranje DNA potrebuje šest molekul pRNA (pakirajoča RNA), ki so dolge 174 nukleotidov, in katerih sekundarna struktura je ključna za pakiranje DNA ter imajo homologno vlogo kot mala terminaza, potrebne pa so tudi za nalaganje ATPaznega dela motorja.

===Strukturne spremembe portalnega proteina pri pakiranju genoma===

Ko so preučevali strukturne spremembe portalnega proteina bakteriofaga P22 pri pakiranju DNA, so ugotovili, da pakiranje DNA inducira prehod nezrelega asimetričnega portalnega proteina v zrel simetričen kompaktnejši portalni protein, pri čemer pride do povečanja premera osrednjega kanala s 25 Å na 40 Å, medtem ko se celoten premer portalnega proteina zmanjša z 200 Å na 170 Å. Samo prvotna oblika, ki je prisotna v nezrelem bakteriofagu, pa je sposobna pakiranja DNA.

Regija sodček zaradi pakiranja genoma spremeni konformacijo iz nestrukturirane v alfa vijačno in zaznava pritisk v kapsidi. Do največje strukturne spremembe pride na C-končnem delu regije sodček, ki v zreli obliki sega precej bolj v notranjost kapside. Med pakiranjem DNA pride zaradi prevladovanja negativno nabitih aminokislinskih ostankov na zunanji površini regije sodček do odboja med DNA in negativnimi ostanki, zato se ta regija iztegne. Ta strukturna sprememba je najverjetneje ključna za injiciranje genoma ob infekciji.

Strukturna sprememba se zaradi visokega pritiska prenese iz regije sodček na regiji pecelj in krilo, in posledično pride do preureditve simetrije portalnega proteina iz petdelne v šestdelno. Ta preureditev simetrije predstavlja signal za terminacijo pakiranja in vodi v zmanjšanje vezavne afinitete za veliko terminazo, kar upočasni translokacijo DNA in pospeši nukleazno aktivnost velike terminaze. Velika in mala terminaza se ob zaključku pakiranja DNA sprostita z nascentnega bakteriofaga, zato v zrelem bakteriofagu nista prisotni.

==Viri==

P. E. Prevelige, J. R. Cortines: Phage Assembly and the Special Role of the Portal Protein. ''Curr. Opin. Virol.'' '''2018''', ''31'', 66–73.

V. B. Rao, M. Feiss: The Bacteriophage DNA Packaging Motor. ''Annu. Rev. Genet.'' '''2008''', ''42'', 647–681.

C. L. Dedeo, G. Cingolani, C. M. Teschke: Portal Protein: The Orchestrator of Capsid Assembly for the DsDNA Tailed Bacteriophages and Herpesviruses. ''Annu. Rev. Virol.'' '''2019''', ''6'', 141–160.

R. K. Lokareddy, R. S. Sankhala, A. Roy, P. V. Afonine, T. Motwani, C. M. Teschke, K. N. Parent, G. Cingolani: Portal Protein Functions Akin to a DNA-Sensor That Couples Genome-Packaging to Icosahedral Capsid Maturation. ''Nat. Commun.'' '''2017''', ''8''.

A. A. Aksyuk, M. G. Rossmann: Bacteriophage Assembly. ''Viruses''. '''2011''', ''3'', 172–203.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina

2020-05-05T06:10:53Z

Anja Konjc:

Kompleksi portalnih proteinov so posebne strukture, ki so se razvile pri dsDNA bakteriofagih iz reda ''Caudiovirales''. Ti kompleksi, razporejeni v obliki dodekamernih obročev, igrajo posebno vlogo pri uspešnosti virusne okužbe, saj so ključnega pomena pri sestavljanju bakteriofaga, pakiranju bakteriofagne DNA in dostavi DNA gostiteljski celici.

==Sestavljanje bakteriofaga==

Sestavljanje fagnih delcev lahko razdelimo na štiri ključne faze, in sicer:
# nastanek jedra,
# oblikovanje prokapside, ki vsebuje ogrodne proteine,
# pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture,
# sklopitev repnih proteinov.

Portalni protein igra pomembno vlogo v fazi 1, 3 in 4. Pri sestavljanju bakteriofaga so poleg portalnega proteina bolj pomembni še plaščni ter ogrodni proteini.

===Nastanek jedra===

Portalni protein deluje kot nekakšen kanal za DNA. Vendar je najprej potrebno, da se monomeri sestavijo v kompleks portalnega proteina (v nadaljevanju omenjeni tudi samo kot portalni protein) in vgradijo v eno oglišče prokapside. V prvi fazi mora priti do združitve portalnega proteina in ogrodnih proteinov skupaj s plaščnimi v ikozaedrično prokapsido. Taka prokapsida je sestavljena iz pentamerov in heksamerov, ki vsebujejo dodekamerni portalni protein. Nastanek tega kompleksa je odvisen predvsem od ogrodnih proteinov.

Ko se oblikujejo dodekamerni obroči, le-ti sodelujejo kot iniciatorji nadaljnjega sestavljanja. Znano je, da prisotnost portalnega proteina pri sestavljanju kapside pri nekaterih bakteriofagih poveča izkoristek le-tega procesa sestavljanja. Ojedritev pri bakteriofagih poteka različno, v vsakem primeru pa pride do tega, da se ogrodni protein nahaja na notranji strani prokapside.

Znano je, da ni nujen za izgradnjo prokapsid. Njegova prisotnost postane ključnega pomena pri pakiranju DNA, saj le-ta proces ne more poteči v njegovi odsotnosti. Le bakteriofagi, ki torej vsebujejo tak kompleks lahko zapakirajo ustrezno količino DNA in tako uspešno delujejo.

===Oblikovanje prokapside===

V tej fazi pride do izgradnje nezrele ikozaedrične kapside. Ogrodni proteini se še nahajajo znotraj prokapside. V prokapsidi se nahajajo tudi posebni proteini, ki kasneje pomagajo pri sprostitvi DNA.

===Pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture===

Sledi pakiranje DNA in zorenje prokapside. Ob tem se iz notranjosti prokapside sprostijo ogrodni proteini. Ti se lahko razgradijo (pri bakteriofagih lambda, T4, HK97 in herpes virusih) ali se ponovno uporabijo za sestavljanje fagnih delcev. Virusna DNA se selektivno veže na virusne terminaze, nato pa se dostavi v kapsido skozi portalni kompleks. Proces pakiranja je natančneje razložen spodaj (glej DNA pakirajoči motor bakteriofagov).

===Sklopitev repnih proteinov===

Po končanem pakiranju DNA je glavo nastajajočega bakteriofaga potrebno še ustrezno zapreti. Pri tem sodelujejo čepni proteini, ki interagirajo s portalnim proteinom in preprečijo, da bi DNA zapustila kapsido. Na koncu se na te proteine dodajo še repni proteini, ki se polimerizirajo. Le-ti imajo pomembno vlogo pri prepoznavanju celičnih receptorjev.

==Zgradba portalnega proteina==

Strukturno so portalni proteini dodekamerni obroči (12 podenot) in so del ikozaederične kapside. Vsaka kapsida ima na enem izmed svojih dvanajstih oglišč, ki je stičišče petih ploskev, prisoten portalni dodekamerni obroč. Je središče za pritrditev repa in proteinov, ki omogočijo zaprtje virusnega delca.

Čeprav se monomeri portalnih proteinov različnih virusov precej razlikujejo po velikosti (od 0,4 do 1 Mda), si vsi delijo podobno zvitje kljub zelo nizki podobnosti primarnega aminokislinskega zaporedja. Ta je običajno zgolj okrog 12 %. Tako funkcija portalnih proteinov temelji predvsem na njihovem zvitju in strukturi.

Zanimivo je opažanje, da ''in vitro'' obstajajo različne oligomerne oblike (11-meri, 12-meri in 13-meri). Kar nakazuje na to, da so monomeri portalnih proteinov zgrajeni, tako da se lahko prilagodijo znatnim strukturnim spremembam. Strukturno je ta plastičnost lahko pojasnjena s prisotnostjo pozitivno in negativno nabitih zaplat na protomerih portala, ki interagirajo preko elektrostatskih sil in delujejo kot molekularni magneti. Posledično je možen nastanek različnih oligomerov.

Vsak monomer in tudi celoten dodekamer ima vsaj štiri, nekateri pa pet značilnih regij.

===Regija sodček===

Portalni obroči imajo lahko dodatno regijo sodček, ki je pritrjen na krono in se razširja v notranjost kapside. Prisoten je pri bakteriofagih T4 in P22. Pri P22 je prisoten le pri popolnoma dozorelih virusih. Gre za vijačno strukturo. Regija sodček pri posameznem monomeru portalnega proteina vsebuje eno alfa vijačnico. Pri bakteriofagih P22 je ta dolga kar 125 aminokislin. V tej regiji je najpogostejša aminokislina glutamin (17 %), ki je tudi pogost aminokislinski ostanek pri DNA vezavnih proteinih.

===Regija krona===

Regija krona je širok konec (če ni prisotne regije sodčka) portalnega proteinskega kompleksa in sega v notranjost virusne kapside. Sestavljena je iz alfa vijačnic. Poleg regije krilo, s katero je fleksibilno povezana, gre za najbolj variabilno regijo portalnega proteina.

===Regija krilo===

Regija krilo mogoča tesno povezavo s kapsido in ogrodnimi proteini. Štrli navzven iz centralne osi. Najdaljša alfa vijačnica v domeni predstavlja hrbetenico krila. Na obrobju pa ima alfa/beta podzvitje. Ploščata površina krila je prevladujoče negativno nabita. To prepreči vezavo DNA na portal. Velikosti domene krila lahko segajo od 33 kDa (HK97-podobni virusi) pa vse do 80 kDa (P22). Povezano je s steblom preko fleksibilne zanke. Gre za neurejen element prisoten pri poznanih kompleksih nekaterih fagov. Zanke vsakega od protomerov prodirajo proti centru portalnega kanala in tako ustvarijo zožitev v obroču. Ta ima ključno vlogo pri preprečevanju uhajanja DNA pri pakiranju.

===Regija steblo===

Tako kot pecelj je tudi regija steblo strogo urejena. Tipično ga sestavljata dve alfa vijačnici in zunanje zanke. Alfa vijačnice, ki tvorijo steblo so glede na center kanala zasukane za kot od 30° do 50°, odvisno za kateri virus gre. Mutacije v vijačnici stebla imajo velik vpliv na DNA pakiranje. Pri P22 spremenjeni aminokislinski ostanki 105-132 rezultirajo v prekomernem pakiranju. Ravno obratno pa se zgodi pri SPP1, pri katerem mutacije povzročijo ustavitev pakiranja.

===Regija pecelj===

Domena pecelj je izpostavljena zunanjosti kapside. Vključena je v vezavo terminaze in predstavlja mesto za interakcijo z adapterskimi proteini. Je strogo urejena. Predstavlja začetni del kanala za DNA pakiranje. Pri portalnem kompleksu bakteriofaga T4 pozitivne aminokisline obdajajo dno regije pecelj in so najverjetneje vpletene v ujetje DNA ob pričetku translokacije virusnega genoma.

==DNA pakirajoči motor bakteriofagov==

Da se v kapsidi bakteriofagov na omejenem volumnu razporedi negativno nabita DNA, je potrebno usklajeno delovanje portalnega proteina s terminaznim kompleksom, ki ga sestavljata mala in velika terminazna podenota. Terminazni kompleks in portalni protein skupaj tvorita molekulski motor, ki pretvarja kemijsko energijo, ki se sprosti pri hidrolizi ATP, v fizično gibanje molekul, zaradi česar pride do vstavitve DNA v prokapsido. DNA se v prokapsido vstavi s hitrostmi do ∼1,800 bp na sekundo in v korakih po 2 bp/ATP. Preko kanala premera 30 Å, ki ga tvori portalni protein, se v prokapsido translocira linearen genom, kjer se zelo tesno pakira v kompaktno strukturo. DNA pakirajoči motor bakteriofagov je najmočnejši do zdaj poznani molekulski motor in generira ogromne sile (do 60 pN), ki so ključne za pakiranje DNA proti ogromnim elektrostatskim odbojnim silam in neugodni entropiji.

Oligomer male terminaze prepozna genomsko DNA tako, da se veže na specifična zaporedja ''pac'' oz. ''cos'', na kompleks male terminaze in DNA se naloži velika terminaza in nato se celoten kompleks naloži na portalni protein. Velika terminaza interagira z regijo pecelj portalnega proteina in oligomerizira, pri čemer tvori pentamerni obroč. Sestavljena je iz endonukleazne C-končne domene, ki je odgovorna za cepitev DNA, ter ATPazne N-končne domene, ki s hidrolizo ATP prispeva energijo za pakiranje DNA. Številni bakteriofagi podvojujejo genom po principu kotalečega se kroga in tvorijo dolge konkatemere. Prepoznavanje DNA in njena cepitev pa se med različnimi bakteriofagi razlikuje. Pri nekaterih bakteriofagih, kot so P22, T4 in SPP1, pride do začetne nespecifične cepitve blizu prepoznavnega mesta ''pac'' (angl. packaging recognition site). Ko je kapsida polna, se pakiranje genoma konča in pride do nespecifične cepitve DNA. Da ti bakteriofagi zagotovijo, da vsaka kapsida vsebuje celoten genom, je zanje značilna terminalno redundančna DNA. Drug mehanizem, do katerega pride npr. pri bakteriofagih λ, HK97 in P2, pa je cepitev na specifičnih kohezivnih končnih mestih (''cos''), tako da se celoten genom nahaja med dvema ''cos'' cepitvenima mestoma. Bakteriofag φ29 pa ne potrebuje cepitve, saj je njegov genom že končne dolžine. Posebnost bakteriofaga φ29 je tudi, da za pakiranje DNA potrebuje šest molekul pRNA (pakirajoča RNA), ki so dolge 174 nukleotidov, in katerih sekundarna struktura je ključna za pakiranje DNA ter imajo homologno vlogo kot mala terminaza, potrebne pa so tudi za nalaganje ATPaznega dela motorja.

===Strukturne spremembe portalnega proteina pri pakiranju genoma===

Ko so preučevali strukturne spremembe portalnega proteina bakteriofaga P22 pri pakiranju DNA, so ugotovili, da pakiranje DNA inducira prehod nezrelega asimetričnega portalnega proteina v zrel simetričen kompaktnejši portalni protein, pri čemer pride do povečanja premera osrednjega kanala s 25 Å na 40 Å, medtem ko se celoten premer portalnega proteina zmanjša z 200 Å na 170 Å. Samo prvotna oblika, ki je prisotna v nezrelem bakteriofagu, pa je sposobna pakiranja DNA.

Regija sodček zaradi pakiranja genoma spremeni konformacijo iz nestrukturirane v alfa vijačno in zaznava pritisk v kapsidi. Do največje strukturne spremembe pride na C-končnem delu regije sodček, ki v zreli obliki sega precej bolj v notranjost kapside. Med pakiranjem DNA pride zaradi prevladovanja negativno nabitih aminokislinskih ostankov na zunanji površini regije sodček do odboja med DNA in negativnimi ostanki, zato se ta regija iztegne. Ta strukturna sprememba je najverjetneje ključna za injiciranje genoma ob infekciji.

Strukturna sprememba se zaradi visokega pritiska prenese iz regije sodček na regiji pecelj in krilo, in posledično pride do preureditve simetrije portalnega proteina iz petdelne v šestdelno. Ta preureditev simetrije predstavlja signal za terminacijo pakiranja in vodi v zmanjšanje vezavne afinitete za veliko terminazo, kar upočasni translokacijo DNA in pospeši nukleazno aktivnost velike terminaze. Velika in mala terminaza se ob zaključku pakiranja DNA sprostita z nascentnega bakteriofaga, zato v zrelem bakteriofagu nista prisotni.

==Viri==

P. E. Prevelige, J. R. Cortines: Phage Assembly and the Special Role of the Portal Protein. ''Curr. Opin. Virol.'' '''2018''', ''31'', 66–73.

V. B. Rao, M. Feiss: The Bacteriophage DNA Packaging Motor. ''Annu. Rev. Genet.'' '''2008''', ''42'', 647–681.

C. L. Dedeo, G. Cingolani, C. M. Teschke: Portal Protein: The Orchestrator of Capsid Assembly for the DsDNA Tailed Bacteriophages and Herpesviruses. ''Annu. Rev. Virol.'' '''2019''', ''6'', 141–160.

R. K. Lokareddy, R. S. Sankhala, A. Roy, P. V. Afonine, T. Motwani, C. M. Teschke, K. N. Parent, G. Cingolani: Portal Protein Functions Akin to a DNA-Sensor That Couples Genome-Packaging to Icosahedral Capsid Maturation. ''Nat. Commun.'' '''2017''', ''8''.

A. A. Aksyuk, M. G. Rossmann: Bacteriophage Assembly. ''Viruses''. '''2011''', ''3'', 172–203.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina

2020-05-05T02:18:05Z

Anja Konjc: /* Sestavljanje bakteriofaga */

Kompleksi portalnih proteinov so posebne strukture, ki so se razvile pri dsDNA bakteriofagih iz reda ''Caudiovirales''. Ti kompleksi, razporejeni v obliki dodekamernih obročev, igrajo posebno vlogo pri uspešnosti virusne okužbe, saj so ključnega pomena pri sestavljanju bakteriofaga, pakiranju bakteriofagne DNA in dostavi DNA gostiteljski celici.

==Sestavljanje bakteriofaga==

Sestavljanje fagnih delcev lahko razdelimo na štiri ključne faze, in sicer:
# nastanek jedra
# oblikovanje prokapside, ki vsebuje ogrodne proteine
# pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture
# sklopitev repnih proteinov.

Portalni protein igra pomembno vlogo v fazi 1, 3, in 4. Pri sestavljanju bakteriofaga so poleg portalnega proteina bolj pomembni še plaščni ter ogrodni proteini.

===Nastanek jedra===

Portalni protein deluje kot nekakšen kanal za DNA. Vendar je najprej potrebno, da se monomeri sestavijo v kompleks portalnega proteina (v nadaljevanju omenjeni tudi samo kot portalni protein) in vgradijo v eno oglišče prokapside. V prvi fazi mora priti do združitve portalnega proteina in ogrodnih proteinov skupaj s plaščnimi v ikozaedrično prokapsido. Taka prokapsida je sestavljena iz pentamerov in heksamerov, ki vsebujejo dodekamerni portalni protein. Nastanek tega kompleksa je odvisen predvsem od ogrodnih proteinov.

Ko se oblikujejo dodekamerni obroči, le-ti sodelujejo kot iniciatorji nadaljnjega sestavljanja. Znano je, da prisotnost portalnega proteina pri sestavljanju kapside pri nekaterih bakteriofagih poveča izkoristek le-tega procesa sestavljanja. Ojedritev pri bakteriofagih poteka različno, v vsakem primeru pa pride do tega, da se ogrodni protein nahaja na notranji strani prokapside.

Znano je, da ni nujen za izgradnjo prokapsid. Njegova prisotnost postane ključnega pomena pri pakiranju DNA, saj le-ta proces ne more poteči v njegovi odsotnosti. Le bakteriofagi, ki torej vsebujejo tak kompleks lahko zapakirajo ustrezno količino DNA in tako uspešno delujejo.

===Oblikovanje prokapside===

V tej fazi pride do izgradnje nezrele ikozaedrične kapside. Ogrodni proteini se še nahajajo znotraj prokapside. V prokapsidi se nahajajo tudi posebni proteini, ki kasneje pomagajo pri sprostitvi DNA.

===Pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture===

Sledi pakiranje DNA in zorenje prokapside. Ob tem se iz notranjosti prokapside sprostijo ogrodni proteini. Ti se lahko razgradijo (pri bakteriofagih lambda, T4, HK97 in herpes virusih) ali se ponovno uporabijo za sestavljanje fagnih delcev. Virusna DNA se selektivno veže na virusne terminaze, nato pa se dostavi v kapsido skozi portalni kompleks. Proces pakiranja je natančneje razložen spodaj (glej DNA pakirajoči motor bakteriofagov).

===Sklopitev repnih proteinov===

Po končanem pakiranju DNA je glavo nastajajočega bakteriofaga potrebno še ustrezno zapreti. Pri tem sodelujejo čepni proteini, ki interagirajo s portalnim proteinom in preprečijo, da bi DNA zapustila kapsido. Na koncu se na te proteine dodajo še repni proteini, ki se polimerizirajo. Le-ti imajo pomembno vlogo pri prepoznavanju celičnih receptorjev.

==Zgradba kompleksa portalnega proteina==

Strukturno so kompleksi portalnih proteinov dodekamerni obroči (12 podenot) in so del ikozaederične kapside. Vsaka kapsida ima na enem izmed svojih dvanajstih oglišč, ki je stičišče petih ploskev, prisoten portalni dodekamerni obroč. Je središče za pritrditev repa in proteinov, ki omogočijo zaprtje virusnega delca.

Čeprav se monomeri portalnih proteinov različnih virusov precej razlikujejo po velikosti (od 0,4 do 1 Mda), si vsi delijo podobno zvitje kljub zelo nizki podobnosti primarnega aminokislinskega zaporedja. Ta je običajno zgolj okrog 12%. Tako funkcija portalnih proteinov temelji predvsem na njihovem zvitju in strukturi.

Zanimivo je opažanje, da ''in vitro'' obstajajo različne oligomerne oblike (11-meri, 12-meri in 13-meri). Kar nakazuje na to, da so monomeri portalnih proteinov zgrajeni, tako da se lahko prilagodijo znatnim strukturnim spremembam. Strukturno je ta plastičnost lahko pojasnjena s prisotnostjo pozitivno in negativno nabitih zaplat na protomerih portala, ki interagirajo preko elektrostatskih sil in delujejo kot molekularni magneti. Posledično je možen nastanek različnih oligomerov.

Vsak monomer in tudi celoten dodekamer ima vsaj štiri, nekateri pa pet značilnih regij.

===Regija sodčka===

Portalni obroči imajo lahko dodatno regijo sodčka, ki je pritrjen na krono in se razširja v notranjost kapside. Prisoten je pri bakteriofagih T4 in P22. Pri P22 je prisoten le pri popolnoma dozorelih virusih. Gre za vijačno strukturo. Regija sodčka pri posameznem monomeru portalnega proteina vsebuje eno alfa vijačnico. Pri bakteriofagih P22 je ta dolga kar 125 aminokislin. V tej regiji je najpogostejša aminokislina glutamin (17%), ki je tudi pogost aminokislinski ostanek pri DNA vezavnih proteinih.

===Regija krone===

Regija krone je širok konec (če ni prisotne regije sodčka) portalnega proteinskega kompleksa in sega v notranjost virusne kapside. Sestavljena je iz alfa vijačnic. Poleg regije krila, s katero je fleksibilno povezana, gre za najbolj variabilno regijo portalnega proteina.

===Regija krila===

Regija krila mogoča tesno povezavo s kapsido in ogrodnimi proteini. Štrli navzven iz centralne osi. Najdaljša alfa vijačnica v domeni predstavlja hrbetenico krila. Na obrobju pa ima alfa/beta podzvitje. Ploščata površina krila je prevladujoče negativno nabita. To prepreči vezavo DNA na portal. Velikosti domene krila lahko segajo od 33 kDa (HK97-podobni virusi) pa vse do 80 kDa (P22). Povezano je s steblom preko fleksibilne zanke. Gre za neurejen element prisoten pri poznanih kompleksih nekaterih fagov. Zanke vsakega od protomerov prodirajo proti centru portalnega kanala in tako ustvarijo zožitev v obroču. Ta ima ključno vlogo pri preprečevanju uhajanja DNA pri pakiranju.

===Regija stebla===

Tako kot pecelj je tudi regija stebla strogo urejena. Tipično ga sestavljata dve alfa vijačnici in zunanje zanke. Alfa vijačnice, ki tvorijo steblo so glede na center kanala zasukane za kot od 30° do 50°, odvisno za kateri virus gre. Mutacije v vijačnici stebla imajo velik vpliv na DNA pakiranje. Pri P22 spremenjeni aminokislinski ostanki 105-132 rezultirajo v prekomernem pakiranju. Ravno obratno pa se zgodi pri SPP1, pri katerem mutacije povzročijo ustavitev pakiranja.

===Regija peclja===

Domena peclja je izpostavljena zunanjosti kapside. Vključena je v vezavo terminaze in predstavlja mesto za interakcijo z adapterskimi proteini. Je strogo urejena. Predstavlja začetni del kanala za DNA pakiranje. Pri portalnem kompleksu bakteriofaga T4 pozitivne aminokisline obdajajo dno regije peclja in so najverjetneje vpletene v ujetje DNA ob pričetku translokacije virusnega genoma.

==DNA pakirajoči motor bakteriofagov==

Da se v kapsidi bakteriofagov na omejenem volumnu razporedi negativno nabita DNA, je potrebno usklajeno delovanje portalnega proteina s terminaznim kompleksom, ki ga sestavljata mala in velika terminazna podenota. Terminazni kompleks in portalni protein skupaj tvorita molekulski motor, ki pretvarja kemijsko energijo, ki se sprosti pri hidrolizi ATP, v fizično gibanje molekul, zaradi česar pride do vstavitve DNA v prokapsido. DNA se v prokapsido vstavi s hitrostmi do ∼1,800 bp na sekundo in v korakih po 2 bp/ATP. Preko kanala premera 30 Å, ki ga tvori portalni protein, se v prokapsido translocira linearen genom, kjer se zelo tesno pakira v kompaktno strukturo. DNA pakirajoči motor bakteriofagov je najmočnejši do zdaj poznani molekulski motor in generira ogromne sile (do 60 pN). Tako velike sile so ključne za pakiranje DNA proti ogromnim elektrostatskim odbojnim silam in neugodni entropiji.

Mala terminazna podenota prepozna genomsko DNA, na kompleks male terminaze in DNA se naloži velika terminaza in nato se celoten kompleks naloži na portalni protein. Velika terminaza interagira z regijo pecelj portalnega proteina in oligomerizira, pri čemer tvori pentamerni obroč. Sestavljena je iz endonukleazne C-končne domene, ki je odgovorna za cepitev DNA, ter ATPazne N-končne domene, ki prispeva energijo za pakiranje DNA. Številni bakteriofagi podvojujejo genom po principu kotalečega se kroga in tvorijo dolge konkatemere. Prepoznavanje DNA in njena cepitev pa se med različnimi bakteriofagi razlikuje. Pri nekaterih bakteriofagih, kot so P22, T4 in SPP1, pride do začetne nespecifične cepitve blizu prepoznavnega mesta ''pac'' (angl. packaging recognition site). Ko je kapsida polna, se pakiranje genoma konča in pride do nespecifične cepitve DNA. Da ti bakteriofagi zagotovijo, da vsaka kapsida vsebuje celoten genom, je zanje značilna terminalno redundančna DNA. Drug mehanizem, do katerega pride pri bakteriofagih λ, HK97 in P2, pa je cepitev na specifičnih kohezivnih končnih mestih (''cos''), tako da se celoten genom nahaja med dvema ''cos'' cepitvenima mestoma. Bakteriofag φ29 pa ne potrebuje cepitve, saj je njegov genom že končne dolžine. Posebnost bakteriofaga φ29 je tudi, da za pakiranje DNA potrebuje šest molekul pRNA (pakirajoča RNA), ki so dolge 174 nukleotidov, in katerih sekundarna struktura je ključna za pakiranje DNA ter imajo homologno vlogo kot mala terminaza, potrebne pa so tudi za nalaganje ATPaznega dela motorja.

===Strukturne spremembe portalnega proteina pri pakiranju genoma===

Ko so preučevali strukturne spremembe portalnega proteina bakteriofaga P22 pri pakiranju DNA, so ugotovili, da pakiranje DNA inducira prehod nezrelega asimetričnega portalnega proteina v zrel simetričen kompaktnejši portalni protein, pri čemer pride do povečanja premera osrednjega kanala s 25 Å na 40 Å, medtem ko se celoten premer portalnega proteina zmanjša z 200 Å na 170 Å. Samo prvotna oblika, ki je prisotna v nezrelem bakteriofagu, pa je sposobna pakiranja DNA.

Regija sodček zaradi pakiranja genoma spremeni konformacijo iz nestrukturirane v alfa vijačno in zaznava pritisk v kapsidi. Do največje strukturne spremembe pride na C-končnem delu regije sodček, ki v zreli obliki sega precej bolj v notranjost kapside. Med pakiranjem DNA pride zaradi prevladovanja negativno nabitih aminokislinskih ostankov na zunanji površini regije sodček do odboja med DNA in negativnimi ostanki, zato se ta regija iztegne. Ta strukturna sprememba je najverjetneje ključna za injiciranje genoma ob infekciji.

Strukturna sprememba se zaradi visokega pritiska prenese iz regije sodček na regiji pecelj in krilo, in posledično pride do preureditve simetrije portalnega proteina iz petdelne v šestdelno. Ta preureditev simetrije predstavlja signal za terminacijo pakiranja in vodi v zmanjšanje vezavne afinitete za veliko terminazo, kar upočasni translokacijo DNA in pospeši nukleazno aktivnost velike terminaze. Velika in mala terminaza se ob zaključku pakiranja DNA sprostita z nascentnega bakteriofaga, zato v zrelem bakteriofagu nista prisotni.
==Viri==

P. E. Prevelige, J. R. Cortines: Phage Assembly and the Special Role of the Portal Protein. ''Curr. Opin. Virol.'' '''2018''', ''31'', 66–73.

V. B. Rao, M. Feiss: The Bacteriophage DNA Packaging Motor. ''Annu. Rev. Genet.'' '''2008''', ''42'', 647–681.

C. L. Dedeo, G. Cingolani, C. M. Teschke: Portal Protein: The Orchestrator of Capsid Assembly for the DsDNA Tailed Bacteriophages and Herpesviruses. ''Annu. Rev. Virol.'' '''2019''', ''6'', 141–160.

R. K. Lokareddy, R. S. Sankhala, A. Roy, P. V. Afonine, T. Motwani, C. M. Teschke, K. N. Parent, G. Cingolani: Portal Protein Functions Akin to a DNA-Sensor That Couples Genome-Packaging to Icosahedral Capsid Maturation. ''Nat. Commun.'' '''2017''', ''8''.

A. A. Aksyuk, M. G. Rossmann: Bacteriophage Assembly. ''Viruses''. '''2011''', ''3'', 172–203.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina

2020-05-05T02:16:05Z

Anja Konjc: /* Pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture */

Kompleksi portalnih proteinov so posebne strukture, ki so se razvile pri dsDNA bakteriofagih iz reda ''Caudiovirales''. Ti kompleksi, razporejeni v obliki dodekamernih obročev, igrajo posebno vlogo pri uspešnosti virusne okužbe, saj so ključnega pomena pri sestavljanju bakteriofaga, pakiranju bakteriofagne DNA in dostavi DNA gostiteljski celici.

==Sestavljanje bakteriofaga==

Sestavljanje fagnih delcev lahko razdelimo na štiri ključne faze, in sicer:
#1. nastanek jedra
#2. oblikovanje prokapside, ki vsebuje ogrodne proteine
#3. pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture
#4. sklopitev repnih proteinov.

Portalni protein igra pomembno vlogo v fazi 1, 3, in 4. Pri sestavljanju bakteriofaga so poleg portalnega proteina bolj pomembni še plaščni ter ogrodni proteini.

===Nastanek jedra===

Portalni protein deluje kot nekakšen kanal za DNA. Vendar je najprej potrebno, da se monomeri sestavijo v kompleks portalnega proteina (v nadaljevanju omenjeni tudi samo kot portalni protein) in vgradijo v eno oglišče prokapside. V prvi fazi mora priti do združitve portalnega proteina in ogrodnih proteinov skupaj s plaščnimi v ikozaedrično prokapsido. Taka prokapsida je sestavljena iz pentamerov in heksamerov, ki vsebujejo dodekamerni portalni protein. Nastanek tega kompleksa je odvisen predvsem od ogrodnih proteinov.

Ko se oblikujejo dodekamerni obroči, le-ti sodelujejo kot iniciatorji nadaljnjega sestavljanja. Znano je, da prisotnost portalnega proteina pri sestavljanju kapside pri nekaterih bakteriofagih poveča izkoristek le-tega procesa sestavljanja. Ojedritev pri bakteriofagih poteka različno, v vsakem primeru pa pride do tega, da se ogrodni protein nahaja na notranji strani prokapside.

Znano je, da ni nujen za izgradnjo prokapsid. Njegova prisotnost postane ključnega pomena pri pakiranju DNA, saj le-ta proces ne more poteči v njegovi odsotnosti. Le bakteriofagi, ki torej vsebujejo tak kompleks lahko zapakirajo ustrezno količino DNA in tako uspešno delujejo.

===Oblikovanje prokapside===

V tej fazi pride do izgradnje nezrele ikozaedrične kapside. Ogrodni proteini se še nahajajo znotraj prokapside. V prokapsidi se nahajajo tudi posebni proteini, ki kasneje pomagajo pri sprostitvi DNA.

===Pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture===

Sledi pakiranje DNA in zorenje prokapside. Ob tem se iz notranjosti prokapside sprostijo ogrodni proteini. Ti se lahko razgradijo (pri bakteriofagih lambda, T4, HK97 in herpes virusih) ali se ponovno uporabijo za sestavljanje fagnih delcev. Virusna DNA se selektivno veže na virusne terminaze, nato pa se dostavi v kapsido skozi portalni kompleks. Proces pakiranja je natančneje razložen spodaj (glej DNA pakirajoči motor bakteriofagov).

===Sklopitev repnih proteinov===

Po končanem pakiranju DNA je glavo nastajajočega bakteriofaga potrebno še ustrezno zapreti. Pri tem sodelujejo čepni proteini, ki interagirajo s portalnim proteinom in preprečijo, da bi DNA zapustila kapsido. Na koncu se na te proteine dodajo še repni proteini, ki se polimerizirajo. Le-ti imajo pomembno vlogo pri prepoznavanju celičnih receptorjev.

==Zgradba kompleksa portalnega proteina==

Strukturno so kompleksi portalnih proteinov dodekamerni obroči (12 podenot) in so del ikozaederične kapside. Vsaka kapsida ima na enem izmed svojih dvanajstih oglišč, ki je stičišče petih ploskev, prisoten portalni dodekamerni obroč. Je središče za pritrditev repa in proteinov, ki omogočijo zaprtje virusnega delca.

Čeprav se monomeri portalnih proteinov različnih virusov precej razlikujejo po velikosti (od 0,4 do 1 Mda), si vsi delijo podobno zvitje kljub zelo nizki podobnosti primarnega aminokislinskega zaporedja. Ta je običajno zgolj okrog 12%. Tako funkcija portalnih proteinov temelji predvsem na njihovem zvitju in strukturi.

Zanimivo je opažanje, da ''in vitro'' obstajajo različne oligomerne oblike (11-meri, 12-meri in 13-meri). Kar nakazuje na to, da so monomeri portalnih proteinov zgrajeni, tako da se lahko prilagodijo znatnim strukturnim spremembam. Strukturno je ta plastičnost lahko pojasnjena s prisotnostjo pozitivno in negativno nabitih zaplat na protomerih portala, ki interagirajo preko elektrostatskih sil in delujejo kot molekularni magneti. Posledično je možen nastanek različnih oligomerov.

Vsak monomer in tudi celoten dodekamer ima vsaj štiri, nekateri pa pet značilnih regij.

===Regija sodčka===

Portalni obroči imajo lahko dodatno regijo sodčka, ki je pritrjen na krono in se razširja v notranjost kapside. Prisoten je pri bakteriofagih T4 in P22. Pri P22 je prisoten le pri popolnoma dozorelih virusih. Gre za vijačno strukturo. Regija sodčka pri posameznem monomeru portalnega proteina vsebuje eno alfa vijačnico. Pri bakteriofagih P22 je ta dolga kar 125 aminokislin. V tej regiji je najpogostejša aminokislina glutamin (17%), ki je tudi pogost aminokislinski ostanek pri DNA vezavnih proteinih.

===Regija krone===

Regija krone je širok konec (če ni prisotne regije sodčka) portalnega proteinskega kompleksa in sega v notranjost virusne kapside. Sestavljena je iz alfa vijačnic. Poleg regije krila, s katero je fleksibilno povezana, gre za najbolj variabilno regijo portalnega proteina.

===Regija krila===

Regija krila mogoča tesno povezavo s kapsido in ogrodnimi proteini. Štrli navzven iz centralne osi. Najdaljša alfa vijačnica v domeni predstavlja hrbetenico krila. Na obrobju pa ima alfa/beta podzvitje. Ploščata površina krila je prevladujoče negativno nabita. To prepreči vezavo DNA na portal. Velikosti domene krila lahko segajo od 33 kDa (HK97-podobni virusi) pa vse do 80 kDa (P22). Povezano je s steblom preko fleksibilne zanke. Gre za neurejen element prisoten pri poznanih kompleksih nekaterih fagov. Zanke vsakega od protomerov prodirajo proti centru portalnega kanala in tako ustvarijo zožitev v obroču. Ta ima ključno vlogo pri preprečevanju uhajanja DNA pri pakiranju.

===Regija stebla===

Tako kot pecelj je tudi regija stebla strogo urejena. Tipično ga sestavljata dve alfa vijačnici in zunanje zanke. Alfa vijačnice, ki tvorijo steblo so glede na center kanala zasukane za kot od 30° do 50°, odvisno za kateri virus gre. Mutacije v vijačnici stebla imajo velik vpliv na DNA pakiranje. Pri P22 spremenjeni aminokislinski ostanki 105-132 rezultirajo v prekomernem pakiranju. Ravno obratno pa se zgodi pri SPP1, pri katerem mutacije povzročijo ustavitev pakiranja.

===Regija peclja===

Domena peclja je izpostavljena zunanjosti kapside. Vključena je v vezavo terminaze in predstavlja mesto za interakcijo z adapterskimi proteini. Je strogo urejena. Predstavlja začetni del kanala za DNA pakiranje. Pri portalnem kompleksu bakteriofaga T4 pozitivne aminokisline obdajajo dno regije peclja in so najverjetneje vpletene v ujetje DNA ob pričetku translokacije virusnega genoma.

==DNA pakirajoči motor bakteriofagov==

Da se v kapsidi bakteriofagov na omejenem volumnu razporedi negativno nabita DNA, je potrebno usklajeno delovanje portalnega proteina s terminaznim kompleksom, ki ga sestavljata mala in velika terminazna podenota. Terminazni kompleks in portalni protein skupaj tvorita molekulski motor, ki pretvarja kemijsko energijo, ki se sprosti pri hidrolizi ATP, v fizično gibanje molekul, zaradi česar pride do vstavitve DNA v prokapsido. DNA se v prokapsido vstavi s hitrostmi do ∼1,800 bp na sekundo in v korakih po 2 bp/ATP. Preko kanala premera 30 Å, ki ga tvori portalni protein, se v prokapsido translocira linearen genom, kjer se zelo tesno pakira v kompaktno strukturo. DNA pakirajoči motor bakteriofagov je najmočnejši do zdaj poznani molekulski motor in generira ogromne sile (do 60 pN). Tako velike sile so ključne za pakiranje DNA proti ogromnim elektrostatskim odbojnim silam in neugodni entropiji.

Mala terminazna podenota prepozna genomsko DNA, na kompleks male terminaze in DNA se naloži velika terminaza in nato se celoten kompleks naloži na portalni protein. Velika terminaza interagira z regijo pecelj portalnega proteina in oligomerizira, pri čemer tvori pentamerni obroč. Sestavljena je iz endonukleazne C-končne domene, ki je odgovorna za cepitev DNA, ter ATPazne N-končne domene, ki prispeva energijo za pakiranje DNA. Številni bakteriofagi podvojujejo genom po principu kotalečega se kroga in tvorijo dolge konkatemere. Prepoznavanje DNA in njena cepitev pa se med različnimi bakteriofagi razlikuje. Pri nekaterih bakteriofagih, kot so P22, T4 in SPP1, pride do začetne nespecifične cepitve blizu prepoznavnega mesta ''pac'' (angl. packaging recognition site). Ko je kapsida polna, se pakiranje genoma konča in pride do nespecifične cepitve DNA. Da ti bakteriofagi zagotovijo, da vsaka kapsida vsebuje celoten genom, je zanje značilna terminalno redundančna DNA. Drug mehanizem, do katerega pride pri bakteriofagih λ, HK97 in P2, pa je cepitev na specifičnih kohezivnih končnih mestih (''cos''), tako da se celoten genom nahaja med dvema ''cos'' cepitvenima mestoma. Bakteriofag φ29 pa ne potrebuje cepitve, saj je njegov genom že končne dolžine. Posebnost bakteriofaga φ29 je tudi, da za pakiranje DNA potrebuje šest molekul pRNA (pakirajoča RNA), ki so dolge 174 nukleotidov, in katerih sekundarna struktura je ključna za pakiranje DNA ter imajo homologno vlogo kot mala terminaza, potrebne pa so tudi za nalaganje ATPaznega dela motorja.

===Strukturne spremembe portalnega proteina pri pakiranju genoma===

Ko so preučevali strukturne spremembe portalnega proteina bakteriofaga P22 pri pakiranju DNA, so ugotovili, da pakiranje DNA inducira prehod nezrelega asimetričnega portalnega proteina v zrel simetričen kompaktnejši portalni protein, pri čemer pride do povečanja premera osrednjega kanala s 25 Å na 40 Å, medtem ko se celoten premer portalnega proteina zmanjša z 200 Å na 170 Å. Samo prvotna oblika, ki je prisotna v nezrelem bakteriofagu, pa je sposobna pakiranja DNA.

Regija sodček zaradi pakiranja genoma spremeni konformacijo iz nestrukturirane v alfa vijačno in zaznava pritisk v kapsidi. Do največje strukturne spremembe pride na C-končnem delu regije sodček, ki v zreli obliki sega precej bolj v notranjost kapside. Med pakiranjem DNA pride zaradi prevladovanja negativno nabitih aminokislinskih ostankov na zunanji površini regije sodček do odboja med DNA in negativnimi ostanki, zato se ta regija iztegne. Ta strukturna sprememba je najverjetneje ključna za injiciranje genoma ob infekciji.

Strukturna sprememba se zaradi visokega pritiska prenese iz regije sodček na regiji pecelj in krilo, in posledično pride do preureditve simetrije portalnega proteina iz petdelne v šestdelno. Ta preureditev simetrije predstavlja signal za terminacijo pakiranja in vodi v zmanjšanje vezavne afinitete za veliko terminazo, kar upočasni translokacijo DNA in pospeši nukleazno aktivnost velike terminaze. Velika in mala terminaza se ob zaključku pakiranja DNA sprostita z nascentnega bakteriofaga, zato v zrelem bakteriofagu nista prisotni.
==Viri==

P. E. Prevelige, J. R. Cortines: Phage Assembly and the Special Role of the Portal Protein. ''Curr. Opin. Virol.'' '''2018''', ''31'', 66–73.

V. B. Rao, M. Feiss: The Bacteriophage DNA Packaging Motor. ''Annu. Rev. Genet.'' '''2008''', ''42'', 647–681.

C. L. Dedeo, G. Cingolani, C. M. Teschke: Portal Protein: The Orchestrator of Capsid Assembly for the DsDNA Tailed Bacteriophages and Herpesviruses. ''Annu. Rev. Virol.'' '''2019''', ''6'', 141–160.

R. K. Lokareddy, R. S. Sankhala, A. Roy, P. V. Afonine, T. Motwani, C. M. Teschke, K. N. Parent, G. Cingolani: Portal Protein Functions Akin to a DNA-Sensor That Couples Genome-Packaging to Icosahedral Capsid Maturation. ''Nat. Commun.'' '''2017''', ''8''.

A. A. Aksyuk, M. G. Rossmann: Bacteriophage Assembly. ''Viruses''. '''2011''', ''3'', 172–203.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina

2020-05-05T02:12:26Z

Anja Konjc: /* Pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture */

Kompleksi portalnih proteinov so posebne strukture, ki so se razvile pri dsDNA bakteriofagih iz reda ''Caudiovirales''. Ti kompleksi, razporejeni v obliki dodekamernih obročev, igrajo posebno vlogo pri uspešnosti virusne okužbe, saj so ključnega pomena pri sestavljanju bakteriofaga, pakiranju bakteriofagne DNA in dostavi DNA gostiteljski celici.

==Sestavljanje bakteriofaga==

Sestavljanje fagnih delcev lahko razdelimo na štiri ključne faze, in sicer:
#1. nastanek jedra
#2. oblikovanje prokapside, ki vsebuje ogrodne proteine
#3. pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture
#4. sklopitev repnih proteinov.

Portalni protein igra pomembno vlogo v fazi 1, 3, in 4. Pri sestavljanju bakteriofaga so poleg portalnega proteina bolj pomembni še plaščni ter ogrodni proteini.

===Nastanek jedra===

Portalni protein deluje kot nekakšen kanal za DNA. Vendar je najprej potrebno, da se monomeri sestavijo v kompleks portalnega proteina (v nadaljevanju omenjeni tudi samo kot portalni protein) in vgradijo v eno oglišče prokapside. V prvi fazi mora priti do združitve portalnega proteina in ogrodnih proteinov skupaj s plaščnimi v ikozaedrično prokapsido. Taka prokapsida je sestavljena iz pentamerov in heksamerov, ki vsebujejo dodekamerni portalni protein. Nastanek tega kompleksa je odvisen predvsem od ogrodnih proteinov.

Ko se oblikujejo dodekamerni obroči, le-ti sodelujejo kot iniciatorji nadaljnjega sestavljanja. Znano je, da prisotnost portalnega proteina pri sestavljanju kapside pri nekaterih bakteriofagih poveča izkoristek le-tega procesa sestavljanja. Ojedritev pri bakteriofagih poteka različno, v vsakem primeru pa pride do tega, da se ogrodni protein nahaja na notranji strani prokapside.

Znano je, da ni nujen za izgradnjo prokapsid. Njegova prisotnost postane ključnega pomena pri pakiranju DNA, saj le-ta proces ne more poteči v njegovi odsotnosti. Le bakteriofagi, ki torej vsebujejo tak kompleks lahko zapakirajo ustrezno količino DNA in tako uspešno delujejo.

===Oblikovanje prokapside===

V tej fazi pride do izgradnje nezrele ikozaedrične kapside. Ogrodni proteini se še nahajajo znotraj prokapside. V prokapsidi se nahajajo tudi posebni proteini, ki kasneje pomagajo pri sprostitvi DNA.

===Pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture===

Sledi pakiranje DNA in zorenje prokapside. Ob tem se iz notranjosti prokapside sprostijo ogrodni proteini. Ti se lahko razgradijo (pri bakteriofagih lambda, T4, HK97 in herpes virusih) ali se ponovno uporabijo za sestavljanje fagnih delcev. Virusna DNA se selektivno veže na virusne terminaze, nato pa se dostavi v kapsido skozi portalni kompleks. Proces pakiranja je natančneje razložen [[Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina:DNA pakirajoči motor bakteriofagov|spodaj]].

===Sklopitev repnih proteinov===

Po končanem pakiranju DNA je glavo nastajajočega bakteriofaga potrebno še ustrezno zapreti. Pri tem sodelujejo čepni proteini, ki interagirajo s portalnim proteinom in preprečijo, da bi DNA zapustila kapsido. Na koncu se na te proteine dodajo še repni proteini, ki se polimerizirajo. Le-ti imajo pomembno vlogo pri prepoznavanju celičnih receptorjev.

==Zgradba kompleksa portalnega proteina==

Strukturno so kompleksi portalnih proteinov dodekamerni obroči (12 podenot) in so del ikozaederične kapside. Vsaka kapsida ima na enem izmed svojih dvanajstih oglišč, ki je stičišče petih ploskev, prisoten portalni dodekamerni obroč. Je središče za pritrditev repa in proteinov, ki omogočijo zaprtje virusnega delca.

Čeprav se monomeri portalnih proteinov različnih virusov precej razlikujejo po velikosti (od 0,4 do 1 Mda), si vsi delijo podobno zvitje kljub zelo nizki podobnosti primarnega aminokislinskega zaporedja. Ta je običajno zgolj okrog 12%. Tako funkcija portalnih proteinov temelji predvsem na njihovem zvitju in strukturi.

Zanimivo je opažanje, da ''in vitro'' obstajajo različne oligomerne oblike (11-meri, 12-meri in 13-meri). Kar nakazuje na to, da so monomeri portalnih proteinov zgrajeni, tako da se lahko prilagodijo znatnim strukturnim spremembam. Strukturno je ta plastičnost lahko pojasnjena s prisotnostjo pozitivno in negativno nabitih zaplat na protomerih portala, ki interagirajo preko elektrostatskih sil in delujejo kot molekularni magneti. Posledično je možen nastanek različnih oligomerov.

Vsak monomer in tudi celoten dodekamer ima vsaj štiri, nekateri pa pet značilnih regij.

===Regija sodčka===

Portalni obroči imajo lahko dodatno regijo sodčka, ki je pritrjen na krono in se razširja v notranjost kapside. Prisoten je pri bakteriofagih T4 in P22. Pri P22 je prisoten le pri popolnoma dozorelih virusih. Gre za vijačno strukturo. Regija sodčka pri posameznem monomeru portalnega proteina vsebuje eno alfa vijačnico. Pri bakteriofagih P22 je ta dolga kar 125 aminokislin. V tej regiji je najpogostejša aminokislina glutamin (17%), ki je tudi pogost aminokislinski ostanek pri DNA vezavnih proteinih.

===Regija krone===

Regija krone je širok konec (če ni prisotne regije sodčka) portalnega proteinskega kompleksa in sega v notranjost virusne kapside. Sestavljena je iz alfa vijačnic. Poleg regije krila, s katero je fleksibilno povezana, gre za najbolj variabilno regijo portalnega proteina.

===Regija krila===

Regija krila mogoča tesno povezavo s kapsido in ogrodnimi proteini. Štrli navzven iz centralne osi. Najdaljša alfa vijačnica v domeni predstavlja hrbetenico krila. Na obrobju pa ima alfa/beta podzvitje. Ploščata površina krila je prevladujoče negativno nabita. To prepreči vezavo DNA na portal. Velikosti domene krila lahko segajo od 33 kDa (HK97-podobni virusi) pa vse do 80 kDa (P22). Povezano je s steblom preko fleksibilne zanke. Gre za neurejen element prisoten pri poznanih kompleksih nekaterih fagov. Zanke vsakega od protomerov prodirajo proti centru portalnega kanala in tako ustvarijo zožitev v obroču. Ta ima ključno vlogo pri preprečevanju uhajanja DNA pri pakiranju.

===Regija stebla===

Tako kot pecelj je tudi regija stebla strogo urejena. Tipično ga sestavljata dve alfa vijačnici in zunanje zanke. Alfa vijačnice, ki tvorijo steblo so glede na center kanala zasukane za kot od 30° do 50°, odvisno za kateri virus gre. Mutacije v vijačnici stebla imajo velik vpliv na DNA pakiranje. Pri P22 spremenjeni aminokislinski ostanki 105-132 rezultirajo v prekomernem pakiranju. Ravno obratno pa se zgodi pri SPP1, pri katerem mutacije povzročijo ustavitev pakiranja.

===Regija peclja===

Domena peclja je izpostavljena zunanjosti kapside. Vključena je v vezavo terminaze in predstavlja mesto za interakcijo z adapterskimi proteini. Je strogo urejena. Predstavlja začetni del kanala za DNA pakiranje. Pri portalnem kompleksu bakteriofaga T4 pozitivne aminokisline obdajajo dno regije peclja in so najverjetneje vpletene v ujetje DNA ob pričetku translokacije virusnega genoma.

==DNA pakirajoči motor bakteriofagov==

Da se v kapsidi bakteriofagov na omejenem volumnu razporedi negativno nabita DNA, je potrebno usklajeno delovanje portalnega proteina s terminaznim kompleksom, ki ga sestavljata mala in velika terminazna podenota. Terminazni kompleks in portalni protein skupaj tvorita molekulski motor, ki pretvarja kemijsko energijo, ki se sprosti pri hidrolizi ATP, v fizično gibanje molekul, zaradi česar pride do vstavitve DNA v prokapsido. DNA se v prokapsido vstavi s hitrostmi do ∼1,800 bp na sekundo in v korakih po 2 bp/ATP. Preko kanala premera 30 Å, ki ga tvori portalni protein, se v prokapsido translocira linearen genom, kjer se zelo tesno pakira v kompaktno strukturo. DNA pakirajoči motor bakteriofagov je najmočnejši do zdaj poznani molekulski motor in generira ogromne sile (do 60 pN). Tako velike sile so ključne za pakiranje DNA proti ogromnim elektrostatskim odbojnim silam in neugodni entropiji.

Mala terminazna podenota prepozna genomsko DNA, na kompleks male terminaze in DNA se naloži velika terminaza in nato se celoten kompleks naloži na portalni protein. Velika terminaza interagira z regijo pecelj portalnega proteina in oligomerizira, pri čemer tvori pentamerni obroč. Sestavljena je iz endonukleazne C-končne domene, ki je odgovorna za cepitev DNA, ter ATPazne N-končne domene, ki prispeva energijo za pakiranje DNA. Številni bakteriofagi podvojujejo genom po principu kotalečega se kroga in tvorijo dolge konkatemere. Prepoznavanje DNA in njena cepitev pa se med različnimi bakteriofagi razlikuje. Pri nekaterih bakteriofagih, kot so P22, T4 in SPP1, pride do začetne nespecifične cepitve blizu prepoznavnega mesta ''pac'' (angl. packaging recognition site). Ko je kapsida polna, se pakiranje genoma konča in pride do nespecifične cepitve DNA. Da ti bakteriofagi zagotovijo, da vsaka kapsida vsebuje celoten genom, je zanje značilna terminalno redundančna DNA. Drug mehanizem, do katerega pride pri bakteriofagih λ, HK97 in P2, pa je cepitev na specifičnih kohezivnih končnih mestih (''cos''), tako da se celoten genom nahaja med dvema ''cos'' cepitvenima mestoma. Bakteriofag φ29 pa ne potrebuje cepitve, saj je njegov genom že končne dolžine. Posebnost bakteriofaga φ29 je tudi, da za pakiranje DNA potrebuje šest molekul pRNA (pakirajoča RNA), ki so dolge 174 nukleotidov, in katerih sekundarna struktura je ključna za pakiranje DNA ter imajo homologno vlogo kot mala terminaza, potrebne pa so tudi za nalaganje ATPaznega dela motorja.

===Strukturne spremembe portalnega proteina pri pakiranju genoma===

Ko so preučevali strukturne spremembe portalnega proteina bakteriofaga P22 pri pakiranju DNA, so ugotovili, da pakiranje DNA inducira prehod nezrelega asimetričnega portalnega proteina v zrel simetričen kompaktnejši portalni protein, pri čemer pride do povečanja premera osrednjega kanala s 25 Å na 40 Å, medtem ko se celoten premer portalnega proteina zmanjša z 200 Å na 170 Å. Samo prvotna oblika, ki je prisotna v nezrelem bakteriofagu, pa je sposobna pakiranja DNA.

Regija sodček zaradi pakiranja genoma spremeni konformacijo iz nestrukturirane v alfa vijačno in zaznava pritisk v kapsidi. Do največje strukturne spremembe pride na C-končnem delu regije sodček, ki v zreli obliki sega precej bolj v notranjost kapside. Med pakiranjem DNA pride zaradi prevladovanja negativno nabitih aminokislinskih ostankov na zunanji površini regije sodček do odboja med DNA in negativnimi ostanki, zato se ta regija iztegne. Ta strukturna sprememba je najverjetneje ključna za injiciranje genoma ob infekciji.

Strukturna sprememba se zaradi visokega pritiska prenese iz regije sodček na regiji pecelj in krilo, in posledično pride do preureditve simetrije portalnega proteina iz petdelne v šestdelno. Ta preureditev simetrije predstavlja signal za terminacijo pakiranja in vodi v zmanjšanje vezavne afinitete za veliko terminazo, kar upočasni translokacijo DNA in pospeši nukleazno aktivnost velike terminaze. Velika in mala terminaza se ob zaključku pakiranja DNA sprostita z nascentnega bakteriofaga, zato v zrelem bakteriofagu nista prisotni.
==Viri==

P. E. Prevelige, J. R. Cortines: Phage Assembly and the Special Role of the Portal Protein. ''Curr. Opin. Virol.'' '''2018''', ''31'', 66–73.

V. B. Rao, M. Feiss: The Bacteriophage DNA Packaging Motor. ''Annu. Rev. Genet.'' '''2008''', ''42'', 647–681.

C. L. Dedeo, G. Cingolani, C. M. Teschke: Portal Protein: The Orchestrator of Capsid Assembly for the DsDNA Tailed Bacteriophages and Herpesviruses. ''Annu. Rev. Virol.'' '''2019''', ''6'', 141–160.

R. K. Lokareddy, R. S. Sankhala, A. Roy, P. V. Afonine, T. Motwani, C. M. Teschke, K. N. Parent, G. Cingolani: Portal Protein Functions Akin to a DNA-Sensor That Couples Genome-Packaging to Icosahedral Capsid Maturation. ''Nat. Commun.'' '''2017''', ''8''.

A. A. Aksyuk, M. G. Rossmann: Bacteriophage Assembly. ''Viruses''. '''2011''', ''3'', 172–203.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina

2020-05-05T02:08:50Z

Anja Konjc:

Kompleksi portalnih proteinov so posebne strukture, ki so se razvile pri dsDNA bakteriofagih iz reda ''Caudiovirales''. Ti kompleksi, razporejeni v obliki dodekamernih obročev, igrajo posebno vlogo pri uspešnosti virusne okužbe, saj so ključnega pomena pri sestavljanju bakteriofaga, pakiranju bakteriofagne DNA in dostavi DNA gostiteljski celici.

==Sestavljanje bakteriofaga==

Sestavljanje fagnih delcev lahko razdelimo na štiri ključne faze, in sicer:
#1. nastanek jedra
#2. oblikovanje prokapside, ki vsebuje ogrodne proteine
#3. pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture
#4. sklopitev repnih proteinov.

Portalni protein igra pomembno vlogo v fazi 1, 3, in 4. Pri sestavljanju bakteriofaga so poleg portalnega proteina bolj pomembni še plaščni ter ogrodni proteini.

===Nastanek jedra===

Portalni protein deluje kot nekakšen kanal za DNA. Vendar je najprej potrebno, da se monomeri sestavijo v kompleks portalnega proteina (v nadaljevanju omenjeni tudi samo kot portalni protein) in vgradijo v eno oglišče prokapside. V prvi fazi mora priti do združitve portalnega proteina in ogrodnih proteinov skupaj s plaščnimi v ikozaedrično prokapsido. Taka prokapsida je sestavljena iz pentamerov in heksamerov, ki vsebujejo dodekamerni portalni protein. Nastanek tega kompleksa je odvisen predvsem od ogrodnih proteinov.

Ko se oblikujejo dodekamerni obroči, le-ti sodelujejo kot iniciatorji nadaljnjega sestavljanja. Znano je, da prisotnost portalnega proteina pri sestavljanju kapside pri nekaterih bakteriofagih poveča izkoristek le-tega procesa sestavljanja. Ojedritev pri bakteriofagih poteka različno, v vsakem primeru pa pride do tega, da se ogrodni protein nahaja na notranji strani prokapside.

Znano je, da ni nujen za izgradnjo prokapsid. Njegova prisotnost postane ključnega pomena pri pakiranju DNA, saj le-ta proces ne more poteči v njegovi odsotnosti. Le bakteriofagi, ki torej vsebujejo tak kompleks lahko zapakirajo ustrezno količino DNA in tako uspešno delujejo.

===Oblikovanje prokapside===

V tej fazi pride do izgradnje nezrele ikozaedrične kapside. Ogrodni proteini se še nahajajo znotraj prokapside. V prokapsidi se nahajajo tudi posebni proteini, ki kasneje pomagajo pri sprostitvi DNA.

===Pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture===

Sledi pakiranje DNA in zorenje prokapside. Ob tem se iz notranjosti prokapside sprostijo ogrodni proteini. Ti se lahko razgradijo (pri bakteriofagih lambda, T4, HK97 in herpes virusih) ali se ponovno uporabijo za sestavljanje fagnih delcev. Virusna DNA se selektivno veže na virusne terminaze, nato pa se dostavi v kapsido skozi portalni kompleks. Proces pakiranja je natančneje razložen [[Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina|spodaj]].

===Sklopitev repnih proteinov===

Po končanem pakiranju DNA je glavo nastajajočega bakteriofaga potrebno še ustrezno zapreti. Pri tem sodelujejo čepni proteini, ki interagirajo s portalnim proteinom in preprečijo, da bi DNA zapustila kapsido. Na koncu se na te proteine dodajo še repni proteini, ki se polimerizirajo. Le-ti imajo pomembno vlogo pri prepoznavanju celičnih receptorjev.

==Zgradba kompleksa portalnega proteina==

Strukturno so kompleksi portalnih proteinov dodekamerni obroči (12 podenot) in so del ikozaederične kapside. Vsaka kapsida ima na enem izmed svojih dvanajstih oglišč, ki je stičišče petih ploskev, prisoten portalni dodekamerni obroč. Je središče za pritrditev repa in proteinov, ki omogočijo zaprtje virusnega delca.

Čeprav se monomeri portalnih proteinov različnih virusov precej razlikujejo po velikosti (od 0,4 do 1 Mda), si vsi delijo podobno zvitje kljub zelo nizki podobnosti primarnega aminokislinskega zaporedja. Ta je običajno zgolj okrog 12%. Tako funkcija portalnih proteinov temelji predvsem na njihovem zvitju in strukturi.

Zanimivo je opažanje, da ''in vitro'' obstajajo različne oligomerne oblike (11-meri, 12-meri in 13-meri). Kar nakazuje na to, da so monomeri portalnih proteinov zgrajeni, tako da se lahko prilagodijo znatnim strukturnim spremembam. Strukturno je ta plastičnost lahko pojasnjena s prisotnostjo pozitivno in negativno nabitih zaplat na protomerih portala, ki interagirajo preko elektrostatskih sil in delujejo kot molekularni magneti. Posledično je možen nastanek različnih oligomerov.

Vsak monomer in tudi celoten dodekamer ima vsaj štiri, nekateri pa pet značilnih regij.

===Regija sodčka===

Portalni obroči imajo lahko dodatno regijo sodčka, ki je pritrjen na krono in se razširja v notranjost kapside. Prisoten je pri bakteriofagih T4 in P22. Pri P22 je prisoten le pri popolnoma dozorelih virusih. Gre za vijačno strukturo. Regija sodčka pri posameznem monomeru portalnega proteina vsebuje eno alfa vijačnico. Pri bakteriofagih P22 je ta dolga kar 125 aminokislin. V tej regiji je najpogostejša aminokislina glutamin (17%), ki je tudi pogost aminokislinski ostanek pri DNA vezavnih proteinih.

===Regija krone===

Regija krone je širok konec (če ni prisotne regije sodčka) portalnega proteinskega kompleksa in sega v notranjost virusne kapside. Sestavljena je iz alfa vijačnic. Poleg regije krila, s katero je fleksibilno povezana, gre za najbolj variabilno regijo portalnega proteina.

===Regija krila===

Regija krila mogoča tesno povezavo s kapsido in ogrodnimi proteini. Štrli navzven iz centralne osi. Najdaljša alfa vijačnica v domeni predstavlja hrbetenico krila. Na obrobju pa ima alfa/beta podzvitje. Ploščata površina krila je prevladujoče negativno nabita. To prepreči vezavo DNA na portal. Velikosti domene krila lahko segajo od 33 kDa (HK97-podobni virusi) pa vse do 80 kDa (P22). Povezano je s steblom preko fleksibilne zanke. Gre za neurejen element prisoten pri poznanih kompleksih nekaterih fagov. Zanke vsakega od protomerov prodirajo proti centru portalnega kanala in tako ustvarijo zožitev v obroču. Ta ima ključno vlogo pri preprečevanju uhajanja DNA pri pakiranju.

===Regija stebla===

Tako kot pecelj je tudi regija stebla strogo urejena. Tipično ga sestavljata dve alfa vijačnici in zunanje zanke. Alfa vijačnice, ki tvorijo steblo so glede na center kanala zasukane za kot od 30° do 50°, odvisno za kateri virus gre. Mutacije v vijačnici stebla imajo velik vpliv na DNA pakiranje. Pri P22 spremenjeni aminokislinski ostanki 105-132 rezultirajo v prekomernem pakiranju. Ravno obratno pa se zgodi pri SPP1, pri katerem mutacije povzročijo ustavitev pakiranja.

===Regija peclja===

Domena peclja je izpostavljena zunanjosti kapside. Vključena je v vezavo terminaze in predstavlja mesto za interakcijo z adapterskimi proteini. Je strogo urejena. Predstavlja začetni del kanala za DNA pakiranje. Pri portalnem kompleksu bakteriofaga T4 pozitivne aminokisline obdajajo dno regije peclja in so najverjetneje vpletene v ujetje DNA ob pričetku translokacije virusnega genoma.

==DNA pakirajoči motor bakteriofagov==

Da se v kapsidi bakteriofagov na omejenem volumnu razporedi negativno nabita DNA, je potrebno usklajeno delovanje portalnega proteina s terminaznim kompleksom, ki ga sestavljata mala in velika terminazna podenota. Terminazni kompleks in portalni protein skupaj tvorita molekulski motor, ki pretvarja kemijsko energijo, ki se sprosti pri hidrolizi ATP, v fizično gibanje molekul, zaradi česar pride do vstavitve DNA v prokapsido. DNA se v prokapsido vstavi s hitrostmi do ∼1,800 bp na sekundo in v korakih po 2 bp/ATP. Preko kanala premera 30 Å, ki ga tvori portalni protein, se v prokapsido translocira linearen genom, kjer se zelo tesno pakira v kompaktno strukturo. DNA pakirajoči motor bakteriofagov je najmočnejši do zdaj poznani molekulski motor in generira ogromne sile (do 60 pN). Tako velike sile so ključne za pakiranje DNA proti ogromnim elektrostatskim odbojnim silam in neugodni entropiji.

Mala terminazna podenota prepozna genomsko DNA, na kompleks male terminaze in DNA se naloži velika terminaza in nato se celoten kompleks naloži na portalni protein. Velika terminaza interagira z regijo pecelj portalnega proteina in oligomerizira, pri čemer tvori pentamerni obroč. Sestavljena je iz endonukleazne C-končne domene, ki je odgovorna za cepitev DNA, ter ATPazne N-končne domene, ki prispeva energijo za pakiranje DNA. Številni bakteriofagi podvojujejo genom po principu kotalečega se kroga in tvorijo dolge konkatemere. Prepoznavanje DNA in njena cepitev pa se med različnimi bakteriofagi razlikuje. Pri nekaterih bakteriofagih, kot so P22, T4 in SPP1, pride do začetne nespecifične cepitve blizu prepoznavnega mesta ''pac'' (angl. packaging recognition site). Ko je kapsida polna, se pakiranje genoma konča in pride do nespecifične cepitve DNA. Da ti bakteriofagi zagotovijo, da vsaka kapsida vsebuje celoten genom, je zanje značilna terminalno redundančna DNA. Drug mehanizem, do katerega pride pri bakteriofagih λ, HK97 in P2, pa je cepitev na specifičnih kohezivnih končnih mestih (''cos''), tako da se celoten genom nahaja med dvema ''cos'' cepitvenima mestoma. Bakteriofag φ29 pa ne potrebuje cepitve, saj je njegov genom že končne dolžine. Posebnost bakteriofaga φ29 je tudi, da za pakiranje DNA potrebuje šest molekul pRNA (pakirajoča RNA), ki so dolge 174 nukleotidov, in katerih sekundarna struktura je ključna za pakiranje DNA ter imajo homologno vlogo kot mala terminaza, potrebne pa so tudi za nalaganje ATPaznega dela motorja.

===Strukturne spremembe portalnega proteina pri pakiranju genoma===

Ko so preučevali strukturne spremembe portalnega proteina bakteriofaga P22 pri pakiranju DNA, so ugotovili, da pakiranje DNA inducira prehod nezrelega asimetričnega portalnega proteina v zrel simetričen kompaktnejši portalni protein, pri čemer pride do povečanja premera osrednjega kanala s 25 Å na 40 Å, medtem ko se celoten premer portalnega proteina zmanjša z 200 Å na 170 Å. Samo prvotna oblika, ki je prisotna v nezrelem bakteriofagu, pa je sposobna pakiranja DNA.

Regija sodček zaradi pakiranja genoma spremeni konformacijo iz nestrukturirane v alfa vijačno in zaznava pritisk v kapsidi. Do največje strukturne spremembe pride na C-končnem delu regije sodček, ki v zreli obliki sega precej bolj v notranjost kapside. Med pakiranjem DNA pride zaradi prevladovanja negativno nabitih aminokislinskih ostankov na zunanji površini regije sodček do odboja med DNA in negativnimi ostanki, zato se ta regija iztegne. Ta strukturna sprememba je najverjetneje ključna za injiciranje genoma ob infekciji.

Strukturna sprememba se zaradi visokega pritiska prenese iz regije sodček na regiji pecelj in krilo, in posledično pride do preureditve simetrije portalnega proteina iz petdelne v šestdelno. Ta preureditev simetrije predstavlja signal za terminacijo pakiranja in vodi v zmanjšanje vezavne afinitete za veliko terminazo, kar upočasni translokacijo DNA in pospeši nukleazno aktivnost velike terminaze. Velika in mala terminaza se ob zaključku pakiranja DNA sprostita z nascentnega bakteriofaga, zato v zrelem bakteriofagu nista prisotni.
==Viri==

P. E. Prevelige, J. R. Cortines: Phage Assembly and the Special Role of the Portal Protein. ''Curr. Opin. Virol.'' '''2018''', ''31'', 66–73.

V. B. Rao, M. Feiss: The Bacteriophage DNA Packaging Motor. ''Annu. Rev. Genet.'' '''2008''', ''42'', 647–681.

C. L. Dedeo, G. Cingolani, C. M. Teschke: Portal Protein: The Orchestrator of Capsid Assembly for the DsDNA Tailed Bacteriophages and Herpesviruses. ''Annu. Rev. Virol.'' '''2019''', ''6'', 141–160.

R. K. Lokareddy, R. S. Sankhala, A. Roy, P. V. Afonine, T. Motwani, C. M. Teschke, K. N. Parent, G. Cingolani: Portal Protein Functions Akin to a DNA-Sensor That Couples Genome-Packaging to Icosahedral Capsid Maturation. ''Nat. Commun.'' '''2017''', ''8''.

A. A. Aksyuk, M. G. Rossmann: Bacteriophage Assembly. ''Viruses''. '''2011''', ''3'', 172–203.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Talk:Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina

2020-05-05T02:06:22Z

Anja Konjc:

'''Anja Konjc:''' Uvod, Sestavljanje bakteriofaga

'''Tina Logonder:''' Zgradba kompleksa portalnega proteina

'''Manca Osolin:''' DNA pakirajoči motor bakteriofagov, Strukturne spremembe portalnega proteina pri pakiranju genoma

Talk:Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina

2020-05-05T02:05:53Z

Anja Konjc:

'''Anja Konjc:''' Uvod, Sestavljanje bakteriofagov

'''Tina Logonder:''' Zgradba kompleksa portalnega proteina

'''Manca Osolin:''' DNA pakirajoči motor bakteriofagov, Strukturne spremembe portalnega proteina pri pakiranju genoma

Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina

2020-05-05T02:04:36Z

Anja Konjc:

Kompleksi portalnih proteinov so posebne strukture, ki so se razvile pri dsDNA bakteriofagih iz reda ''Caudiovirales''. Ti kompleksi, razporejeni v obliki dodekamernih obročev, igrajo posebno vlogo pri uspešnosti virusne okužbe, saj so ključnega pomena pri sestavljanju bakteriofaga, pakiranju bakteriofagne DNA in dostavi DNA gostiteljski celici.

==Sestavljanje bakteriofaga==

Sestavljanje fagnih delcev lahko razdelimo na štiri ključne faze, in sicer:
#1. nastanek jedra
#2. oblikovanje prokapside, ki vsebuje ogrodne proteine
#3. pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture
#4. sklopitev repnih proteinov.

Portalni protein igra pomembno vlogo v fazi 1, 3, in 4. Pri sestavljanju bakteriofaga so poleg portalnega proteina bolj pomembni še plaščni ter ogrodni proteini.

===Nastanek jedra===

Portalni protein deluje kot nekakšen kanal za DNA. Vendar je najprej potrebno, da se monomeri sestavijo v kompleks portalnega proteina (v nadaljevanju omenjeni tudi samo kot portalni protein) in vgradijo v eno oglišče prokapside. V prvi fazi mora priti do združitve portalnega proteina in ogrodnih proteinov skupaj s plaščnimi v ikozaedrično prokapsido. Taka prokapsida je sestavljena iz pentamerov in heksamerov, ki vsebujejo dodekamerni portalni protein. Nastanek tega kompleksa je odvisen predvsem od ogrodnih proteinov.

Ko se oblikujejo dodekamerni obroči, le-ti sodelujejo kot iniciatorji nadaljnjega sestavljanja. Znano je, da prisotnost portalnega proteina pri sestavljanju kapside pri nekaterih bakteriofagih poveča izkoristek le-tega procesa sestavljanja. Ojedritev pri bakteriofagih poteka različno, v vsakem primeru pa pride do tega, da se ogrodni protein nahaja na notranji strani prokapside.

Znano je, da ni nujen za izgradnjo prokapsid. Njegova prisotnost postane ključnega pomena pri pakiranju DNA, saj le-ta proces ne more poteči v njegovi odsotnosti. Le bakteriofagi, ki torej vsebujejo tak kompleks lahko zapakirajo ustrezno količino DNA in tako uspešno delujejo.

===Oblikovanje prokapside===

V tej fazi pride do izgradnje nezrele ikozaedrične kapside. Ogrodni proteini se še nahajajo znotraj prokapside. V prokapsidi se nahajajo tudi posebni proteini, ki kasneje pomagajo pri sprostitvi DNA.

===Pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture===

Sledi pakiranje DNA in zorenje prokapside. Ob tem se iz notranjosti prokapside sprostijo ogrodni proteini. Ti se lahko razgradijo (pri bakteriofagih lambda, T4, HK97 in herpes virusih) ali se ponovno uporabijo za sestavljanje fagnih delcev. Virusna DNA se selektivno veže na virusne terminaze, nato pa se dostavi v kapsido skozi portalni kompleks. Proces pakiranja je natančneje razložen spodaj.

===Sklopitev repnih proteinov===

Po končanem pakiranju DNA je glavo nastajajočega bakteriofaga potrebno še ustrezno zapreti. Pri tem sodelujejo čepni proteini, ki interagirajo s portalnim proteinom in preprečijo, da bi DNA zapustila kapsido. Na koncu se na te proteine dodajo še repni proteini, ki se polimerizirajo. Le-ti imajo pomembno vlogo pri prepoznavanju celičnih receptorjev.

==Zgradba kompleksa portalnega proteina==

Strukturno so kompleksi portalnih proteinov dodekamerni obroči (12 podenot) in so del ikozaederične kapside. Vsaka kapsida ima na enem izmed svojih dvanajstih oglišč, ki je stičišče petih ploskev, prisoten portalni dodekamerni obroč. Je središče za pritrditev repa in proteinov, ki omogočijo zaprtje virusnega delca.

Čeprav se monomeri portalnih proteinov različnih virusov precej razlikujejo po velikosti (od 0,4 do 1 Mda), si vsi delijo podobno zvitje kljub zelo nizki podobnosti primarnega aminokislinskega zaporedja. Ta je običajno zgolj okrog 12%. Tako funkcija portalnih proteinov temelji predvsem na njihovem zvitju in strukturi.

Zanimivo je opažanje, da ''in vitro'' obstajajo različne oligomerne oblike (11-meri, 12-meri in 13-meri). Kar nakazuje na to, da so monomeri portalnih proteinov zgrajeni, tako da se lahko prilagodijo znatnim strukturnim spremembam. Strukturno je ta plastičnost lahko pojasnjena s prisotnostjo pozitivno in negativno nabitih zaplat na protomerih portala, ki interagirajo preko elektrostatskih sil in delujejo kot molekularni magneti. Posledično je možen nastanek različnih oligomerov.

Vsak monomer in tudi celoten dodekamer ima vsaj štiri, nekateri pa pet značilnih regij.

===Regija sodčka===

Portalni obroči imajo lahko dodatno regijo sodčka, ki je pritrjen na krono in se razširja v notranjost kapside. Prisoten je pri bakteriofagih T4 in P22. Pri P22 je prisoten le pri popolnoma dozorelih virusih. Gre za vijačno strukturo. Regija sodčka pri posameznem monomeru portalnega proteina vsebuje eno alfa vijačnico. Pri bakteriofagih P22 je ta dolga kar 125 aminokislin. V tej regiji je najpogostejša aminokislina glutamin (17%), ki je tudi pogost aminokislinski ostanek pri DNA vezavnih proteinih.

===Regija krone===

Regija krone je širok konec (če ni prisotne regije sodčka) portalnega proteinskega kompleksa in sega v notranjost virusne kapside. Sestavljena je iz alfa vijačnic. Poleg regije krila, s katero je fleksibilno povezana, gre za najbolj variabilno regijo portalnega proteina.

===Regija krila===

Regija krila mogoča tesno povezavo s kapsido in ogrodnimi proteini. Štrli navzven iz centralne osi. Najdaljša alfa vijačnica v domeni predstavlja hrbetenico krila. Na obrobju pa ima alfa/beta podzvitje. Ploščata površina krila je prevladujoče negativno nabita. To prepreči vezavo DNA na portal. Velikosti domene krila lahko segajo od 33 kDa (HK97-podobni virusi) pa vse do 80 kDa (P22). Povezano je s steblom preko fleksibilne zanke. Gre za neurejen element prisoten pri poznanih kompleksih nekaterih fagov. Zanke vsakega od protomerov prodirajo proti centru portalnega kanala in tako ustvarijo zožitev v obroču. Ta ima ključno vlogo pri preprečevanju uhajanja DNA pri pakiranju.

===Regija stebla===

Tako kot pecelj je tudi regija stebla strogo urejena. Tipično ga sestavljata dve alfa vijačnici in zunanje zanke. Alfa vijačnice, ki tvorijo steblo so glede na center kanala zasukane za kot od 30° do 50°, odvisno za kateri virus gre. Mutacije v vijačnici stebla imajo velik vpliv na DNA pakiranje. Pri P22 spremenjeni aminokislinski ostanki 105-132 rezultirajo v prekomernem pakiranju. Ravno obratno pa se zgodi pri SPP1, pri katerem mutacije povzročijo ustavitev pakiranja.

===Regija peclja===

Domena peclja je izpostavljena zunanjosti kapside. Vključena je v vezavo terminaze in predstavlja mesto za interakcijo z adapterskimi proteini. Je strogo urejena. Predstavlja začetni del kanala za DNA pakiranje. Pri portalnem kompleksu bakteriofaga T4 pozitivne aminokisline obdajajo dno regije peclja in so najverjetneje vpletene v ujetje DNA ob pričetku translokacije virusnega genoma.

==DNA pakirajoči motor bakteriofagov==

Da se v kapsidi bakteriofagov na omejenem volumnu razporedi negativno nabita DNA, je potrebno usklajeno delovanje portalnega proteina s terminaznim kompleksom, ki ga sestavljata mala in velika terminazna podenota. Terminazni kompleks in portalni protein skupaj tvorita molekulski motor, ki pretvarja kemijsko energijo, ki se sprosti pri hidrolizi ATP, v fizično gibanje molekul, zaradi česar pride do vstavitve DNA v prokapsido. DNA se v prokapsido vstavi s hitrostmi do ∼1,800 bp na sekundo in v korakih po 2 bp/ATP. Preko kanala premera 30 Å, ki ga tvori portalni protein, se v prokapsido translocira linearen genom, kjer se zelo tesno pakira v kompaktno strukturo. DNA pakirajoči motor bakteriofagov je najmočnejši do zdaj poznani molekulski motor in generira ogromne sile (do 60 pN). Tako velike sile so ključne za pakiranje DNA proti ogromnim elektrostatskim odbojnim silam in neugodni entropiji.

Mala terminazna podenota prepozna genomsko DNA, na kompleks male terminaze in DNA se naloži velika terminaza in nato se celoten kompleks naloži na portalni protein. Velika terminaza interagira z regijo pecelj portalnega proteina in oligomerizira, pri čemer tvori pentamerni obroč. Sestavljena je iz endonukleazne C-končne domene, ki je odgovorna za cepitev DNA, ter ATPazne N-končne domene, ki prispeva energijo za pakiranje DNA. Številni bakteriofagi podvojujejo genom po principu kotalečega se kroga in tvorijo dolge konkatemere. Prepoznavanje DNA in njena cepitev pa se med različnimi bakteriofagi razlikuje. Pri nekaterih bakteriofagih, kot so P22, T4 in SPP1, pride do začetne nespecifične cepitve blizu prepoznavnega mesta ''pac'' (angl. packaging recognition site). Ko je kapsida polna, se pakiranje genoma konča in pride do nespecifične cepitve DNA. Da ti bakteriofagi zagotovijo, da vsaka kapsida vsebuje celoten genom, je zanje značilna terminalno redundančna DNA. Drug mehanizem, do katerega pride pri bakteriofagih λ, HK97 in P2, pa je cepitev na specifičnih kohezivnih končnih mestih (''cos''), tako da se celoten genom nahaja med dvema ''cos'' cepitvenima mestoma. Bakteriofag φ29 pa ne potrebuje cepitve, saj je njegov genom že končne dolžine. Posebnost bakteriofaga φ29 je tudi, da za pakiranje DNA potrebuje šest molekul pRNA (pakirajoča RNA), ki so dolge 174 nukleotidov, in katerih sekundarna struktura je ključna za pakiranje DNA ter imajo homologno vlogo kot mala terminaza, potrebne pa so tudi za nalaganje ATPaznega dela motorja.

===Strukturne spremembe portalnega proteina pri pakiranju genoma===

Ko so preučevali strukturne spremembe portalnega proteina bakteriofaga P22 pri pakiranju DNA, so ugotovili, da pakiranje DNA inducira prehod nezrelega asimetričnega portalnega proteina v zrel simetričen kompaktnejši portalni protein, pri čemer pride do povečanja premera osrednjega kanala s 25 Å na 40 Å, medtem ko se celoten premer portalnega proteina zmanjša z 200 Å na 170 Å. Samo prvotna oblika, ki je prisotna v nezrelem bakteriofagu, pa je sposobna pakiranja DNA.

Regija sodček zaradi pakiranja genoma spremeni konformacijo iz nestrukturirane v alfa vijačno in zaznava pritisk v kapsidi. Do največje strukturne spremembe pride na C-končnem delu regije sodček, ki v zreli obliki sega precej bolj v notranjost kapside. Med pakiranjem DNA pride zaradi prevladovanja negativno nabitih aminokislinskih ostankov na zunanji površini regije sodček do odboja med DNA in negativnimi ostanki, zato se ta regija iztegne. Ta strukturna sprememba je najverjetneje ključna za injiciranje genoma ob infekciji.

Strukturna sprememba se zaradi visokega pritiska prenese iz regije sodček na regiji pecelj in krilo, in posledično pride do preureditve simetrije portalnega proteina iz petdelne v šestdelno. Ta preureditev simetrije predstavlja signal za terminacijo pakiranja in vodi v zmanjšanje vezavne afinitete za veliko terminazo, kar upočasni translokacijo DNA in pospeši nukleazno aktivnost velike terminaze. Velika in mala terminaza se ob zaključku pakiranja DNA sprostita z nascentnega bakteriofaga, zato v zrelem bakteriofagu nista prisotni.
==Viri==

P. E. Prevelige, J. R. Cortines: Phage Assembly and the Special Role of the Portal Protein. ''Curr. Opin. Virol.'' '''2018''', ''31'', 66–73.

V. B. Rao, M. Feiss: The Bacteriophage DNA Packaging Motor. ''Annu. Rev. Genet.'' '''2008''', ''42'', 647–681.

C. L. Dedeo, G. Cingolani, C. M. Teschke: Portal Protein: The Orchestrator of Capsid Assembly for the DsDNA Tailed Bacteriophages and Herpesviruses. ''Annu. Rev. Virol.'' '''2019''', ''6'', 141–160.

R. K. Lokareddy, R. S. Sankhala, A. Roy, P. V. Afonine, T. Motwani, C. M. Teschke, K. N. Parent, G. Cingolani: Portal Protein Functions Akin to a DNA-Sensor That Couples Genome-Packaging to Icosahedral Capsid Maturation. ''Nat. Commun.'' '''2017''', ''8''.

A. A. Aksyuk, M. G. Rossmann: Bacteriophage Assembly. ''Viruses''. '''2011''', ''3'', 172–203.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina

2020-05-04T23:21:23Z

Anja Konjc:

Kompleksi portalnih proteinov so posebne strukture, ki so se razvile pri dsDNA bakteriofagih iz reda ''Caudiovirales''. Ti kompleksi, razporejeni v obliki dodekamernih obročev, igrajo posebno vlogo pri uspešnosti virusne okužbe, saj so ključnega pomena pri sestavljanju bakteriofaga, pakiranju bakteriofagne DNA in dostavi DNA gostiteljski celici.

==Zgradba kompleksa portalnega proteina==

Strukturno so kompleksi portalnih proteinov dodekamerni obroči (12 podenot) in so del ikozaederične kapside. Vsaka kapsida ima na enem izmed svojih dvanajstih oglišč, ki je stičišče petih ploskev, prisoten portalni dodekamerni obroč. Je središče za pritrditev repa in proteinov, ki omogočijo zaprtje virusnega delca.

Čeprav se monomeri portalnih proteinov različnih virusov precej razlikujejo po velikosti (od 0,4 do 1 Mda), si vsi delijo podobno zvitje kljub zelo nizki podobnosti primarnega aminokislinskega zaporedja. Ta je običajno zgolj okrog 12%. Tako funkcija portalnih proteinov temelji predvsem na njihovem zvitju in strukturi.

Zanimivo je opažanje, da ''in vitro'' obstajajo različne oligomerne oblike (11-meri, 12-meri in 13-meri). Kar nakazuje na to, da so monomeri portalnih proteinov zgrajeni, tako da se lahko prilagodijo znatnim strukturnim spremembam. Strukturno je ta plastičnost lahko pojasnjena s prisotnostjo pozitivno in negativno nabitih zaplat na protomerih portala, ki interagirajo preko elektrostatskih sil in delujejo kot molekularni magneti. Posledično je možen nastanek različnih oligomerov.

Vsak monomer in tudi celoten dodekamer ima vsaj štiri, nekateri pa pet značilnih regij.

===Regija sodčka===

Portalni obroči imajo lahko dodatno regijo sodčka, ki je pritrjen na krono in se razširja v notranjost kapside. Prisoten je pri bakteriofagih T4 in P22. Pri P22 je prisoten le pri popolnoma dozorelih virusih. Gre za vijačno strukturo. Regija sodčka pri posameznem monomeru portalnega proteina vsebuje eno alfa vijačnico. Pri bakteriofagih P22 je ta dolga kar 125 aminokislin. V tej regiji je najpogostejša aminokislina glutamin (17%), ki je tudi pogost aminokislinski ostanek pri DNA vezavnih proteinih.

===Regija krone===

Regija krone je širok konec (če ni prisotne regije sodčka) portalnega proteinskega kompleksa in sega v notranjost virusne kapside. Sestavljena je iz alfa vijačnic. Poleg regije krila, s katero je fleksibilno povezana, gre za najbolj variabilno regijo portalnega proteina.

===Regija krila===

Regija krila mogoča tesno povezavo s kapsido in ogrodnimi proteini. Štrli navzven iz centralne osi. Najdaljša alfa vijačnica v domeni predstavlja hrbetenico krila. Na obrobju pa ima alfa/beta podzvitje. Ploščata površina krila je prevladujoče negativno nabita. To prepreči vezavo DNA na portal. Velikosti domene krila lahko segajo od 33 kDa (HK97-podobni virusi) pa vse do 80 kDa (P22). Povezano je s steblom preko fleksibilne zanke. Gre za neurejen element prisoten pri poznanih kompleksih nekaterih fagov. Zanke vsakega od protomerov prodirajo proti centru portalnega kanala in tako ustvarijo zožitev v obroču. Ta ima ključno vlogo pri preprečevanju uhajanja DNA pri pakiranju.

===Regija stebla===

Tako kot pecelj je tudi regija stebla strogo urejena. Tipično ga sestavljata dve alfa vijačnici in zunanje zanke. Alfa vijačnice, ki tvorijo steblo so glede na center kanala zasukane za kot od 30° do 50°, odvisno za kateri virus gre. Mutacije v vijačnici stebla imajo velik vpliv na DNA pakiranje. Pri P22 spremenjeni aminokislinski ostanki 105-132 rezultirajo v prekomernem pakiranju. Ravno obratno pa se zgodi pri SPP1, pri katerem mutacije povzročijo ustavitev pakiranja.

===Regija peclja===

Domena peclja je izpostavljena zunanjosti kapside. Vključena je v vezavo terminaze in predstavlja mesto za interakcijo z adapterskimi proteini. Je strogo urejena. Predstavlja začetni del kanala za DNA pakiranje. Pri portalnem kompleksu bakteriofaga T4 pozitivne aminokisline obdajajo dno regije peclja in so najverjetneje vpletene v ujetje DNA ob pričetku translokacije virusnega genoma.

==DNA pakirajoči motor bakteriofagov==

Da se v kapsidi bakteriofagov na omejenem volumnu razporedi negativno nabita DNA, je potrebno usklajeno delovanje portalnega proteina s terminaznim kompleksom, ki ga sestavljata mala in velika terminazna podenota. Terminazni kompleks in portalni protein skupaj tvorita molekulski motor, ki pretvarja kemijsko energijo, ki se sprosti pri hidrolizi ATP, v fizično gibanje molekul, zaradi česar pride do vstavitve DNA v prokapsido. DNA se v prokapsido vstavi s hitrostmi do ∼1,800 bp na sekundo in v korakih po 2 bp/ATP. Preko kanala premera 30 Å, ki ga tvori portalni protein, se v prokapsido translocira linearen genom, kjer se zelo tesno pakira v kompaktno strukturo. DNA pakirajoči motor bakteriofagov je najmočnejši do zdaj poznani molekulski motor in generira ogromne sile (do 60 pN). Tako velike sile so ključne za pakiranje DNA proti ogromnim elektrostatskim odbojnim silam in neugodni entropiji.

Mala terminazna podenota prepozna genomsko DNA, na kompleks male terminaze in DNA se naloži velika terminaza in nato se celoten kompleks naloži na portalni protein. Velika terminaza interagira z regijo pecelj portalnega proteina in oligomerizira, pri čemer tvori pentamerni obroč. Sestavljena je iz endonukleazne C-končne domene, ki je odgovorna za cepitev DNA, ter ATPazne N-končne domene, ki prispeva energijo za pakiranje DNA. Številni bakteriofagi podvojujejo genom po principu kotalečega se kroga in tvorijo dolge konkatemere. Prepoznavanje DNA in njena cepitev pa se med različnimi bakteriofagi razlikuje. Pri nekaterih bakteriofagih, kot so P22, T4 in SPP1, pride do začetne nespecifične cepitve blizu prepoznavnega mesta ''pac'' (angl. packaging recognition site). Ko je kapsida polna, se pakiranje genoma konča in pride do nespecifične cepitve DNA. Da ti bakteriofagi zagotovijo, da vsaka kapsida vsebuje celoten genom, je zanje značilna terminalno redundančna DNA. Drug mehanizem, do katerega pride pri bakteriofagih λ, HK97 in P2, pa je cepitev na specifičnih kohezivnih končnih mestih (''cos''), tako da se celoten genom nahaja med dvema ''cos'' cepitvenima mestoma. Bakteriofag φ29 pa ne potrebuje cepitve, saj je njegov genom že končne dolžine. Posebnost bakteriofaga φ29 je tudi, da za pakiranje DNA potrebuje šest molekul pRNA (pakirajoča RNA), ki so dolge 174 nukleotidov, in katerih sekundarna struktura je ključna za pakiranje DNA ter imajo homologno vlogo kot mala terminaza, potrebne pa so tudi za nalaganje ATPaznega dela motorja.

===Strukturne spremembe portalnega proteina pri pakiranju genoma===

Ko so preučevali strukturne spremembe portalnega proteina bakteriofaga P22 pri pakiranju DNA, so ugotovili, da pakiranje DNA inducira prehod nezrelega asimetričnega portalnega proteina v zrel simetričen kompaktnejši portalni protein, pri čemer pride do povečanja premera osrednjega kanala s 25 Å na 40 Å, medtem ko se celoten premer portalnega proteina zmanjša z 200 Å na 170 Å. Samo prvotna oblika, ki je prisotna v nezrelem bakteriofagu, pa je sposobna pakiranja DNA.

Regija sodček zaradi pakiranja genoma spremeni konformacijo iz nestrukturirane v alfa vijačno in zaznava pritisk v kapsidi. Do največje strukturne spremembe pride na C-končnem delu regije sodček, ki v zreli obliki sega precej bolj v notranjost kapside. Med pakiranjem DNA pride zaradi prevladovanja negativno nabitih aminokislinskih ostankov na zunanji površini regije sodček do odboja med DNA in negativnimi ostanki, zato se ta regija iztegne. Ta strukturna sprememba je najverjetneje ključna za injiciranje genoma ob infekciji.

Strukturna sprememba se zaradi visokega pritiska prenese iz regije sodček na regiji pecelj in krilo, in posledično pride do preureditve simetrije portalnega proteina iz petdelne v šestdelno. Ta preureditev simetrije predstavlja signal za terminacijo pakiranja in vodi v zmanjšanje vezavne afinitete za veliko terminazo, kar upočasni translokacijo DNA in pospeši nukleazno aktivnost velike terminaze. Velika in mala terminaza se ob zaključku pakiranja DNA sprostita z nascentnega bakteriofaga, zato v zrelem bakteriofagu nista prisotni.
==Viri==

P. E. Prevelige, J. R. Cortines: Phage Assembly and the Special Role of the Portal Protein. ''Curr. Opin. Virol.'' '''2018''', ''31'', 66–73.

V. B. Rao, M. Feiss: The Bacteriophage DNA Packaging Motor. ''Annu. Rev. Genet.'' '''2008''', ''42'', 647–681.

C. L. Dedeo, G. Cingolani, C. M. Teschke: Portal Protein: The Orchestrator of Capsid Assembly for the DsDNA Tailed Bacteriophages and Herpesviruses. ''Annu. Rev. Virol.'' '''2019''', ''6'', 141–160.

R. K. Lokareddy, R. S. Sankhala, A. Roy, P. V. Afonine, T. Motwani, C. M. Teschke, K. N. Parent, G. Cingolani: Portal Protein Functions Akin to a DNA-Sensor That Couples Genome-Packaging to Icosahedral Capsid Maturation. ''Nat. Commun.'' '''2017''', ''8''.

A. A. Aksyuk, M. G. Rossmann: Bacteriophage Assembly. ''Viruses''. '''2011''', ''3'', 172–203.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina

2020-05-04T22:39:49Z

Anja Konjc:

Kompleksi portalnih proteinov so posebne strukture, ki so se razvile pri dsDNA bakteriofagih iz reda ''Caudiovirales''. Ti kompleksi, razporejeni v obliki dodekamernih obročev, igrajo posebno vlogo pri uspešnosti virusne okužbe, saj so ključnega pomena pri sestavljanju viriona, pakiranju bakteriofagne DNA in dostavi DNA gostiteljski celici.

==Zgradba kompleksa portalnega proteina==

Strukturno so kompleksi portalnih proteinov dodekamerni obroči (12 podenot) in so del ikozaederične kapside. Vsaka kapsida ima na enem izmed svojih dvanajstih oglišč, ki je stičišče petih ploskev, prisoten portalni dodekamerni obroč. Je središče za pritrditev repa in proteinov, ki omogočijo zaprtje virusnega delca.

Čeprav se monomeri portalnih proteinov različnih virusov precej razlikujejo po velikosti (od 0,4 do 1 Mda), si vsi delijo podobno zvitje kljub zelo nizki podobnosti primarnega aminokislinskega zaporedja. Ta je običajno zgolj okrog 12%. Tako funkcija portalnih proteinov temelji predvsem na njihovem zvitju in strukturi.

Zanimivo je opažanje, da ''in vitro'' obstajajo različne oligomerne oblike (11-meri, 12-meri in 13-meri). Kar nakazuje na to, da so monomeri portalnih proteinov zgrajeni, tako da se lahko prilagodijo znatnim strukturnim spremembam. Strukturno je ta plastičnost lahko pojasnjena s prisotnostjo pozitivno in negativno nabitih zaplat na protomerih portala, ki interagirajo preko elektrostatskih sil in delujejo kot molekularni magneti. Posledično je možen nastanek različnih oligomerov.

Vsak monomer in tudi celoten dodekamer ima vsaj štiri, nekateri pa pet značilnih regij.

===Regija sodčka===

Portalni obroči imajo lahko dodatno regijo sodčka, ki je pritrjen na krono in se razširja v notranjost kapside. Prisoten je pri bakteriofagih T4 in P22. Pri P22 je prisoten le pri popolnoma dozorelih virusih. Gre za vijačno strukturo. Regija sodčka pri posameznem monomeru portalnega proteina vsebuje eno alfa vijačnico. Pri bakteriofagih P22 je ta dolga kar 125 aminokislin. V tej regiji je najpogostejša aminokislina glutamin (17%), ki je tudi pogost aminokislinski ostanek pri DNA vezavnih proteinih.

===Regija krone===

Regija krone je širok konec (če ni prisotne regije sodčka) portalnega proteinskega kompleksa in sega v notranjost virusne kapside. Sestavljena je iz alfa vijačnic. Poleg regije krila, s katero je fleksibilno povezana, gre za najbolj variabilno regijo portalnega proteina.

===Regija krila===

Regija krila mogoča tesno povezavo s kapsido in ogrodnimi proteini. Štrli navzven iz centralne osi. Najdaljša alfa vijačnica v domeni predstavlja hrbetenico krila. Na obrobju pa ima alfa/beta podzvitje. Ploščata površina krila je prevladujoče negativno nabita. To prepreči vezavo DNA na portal. Velikosti domene krila lahko segajo od 33 kDa (HK97-podobni virusi) pa vse do 80 kDa (P22). Povezano je s steblom preko fleksibilne zanke. Gre za neurejen element prisoten pri poznanih kompleksih nekaterih fagov. Zanke vsakega od protomerov prodirajo proti centru portalnega kanala in tako ustvarijo zožitev v obroču. Ta ima ključno vlogo pri preprečevanju uhajanja DNA pri pakiranju.

===Regija stebla===

Tako kot pecelj je tudi regija stebla strogo urejena. Tipično ga sestavljata dve alfa vijačnici in zunanje zanke. Alfa vijačnice, ki tvorijo steblo so glede na center kanala zasukane za kot od 30° do 50°, odvisno za kateri virus gre. Mutacije v vijačnici stebla imajo velik vpliv na DNA pakiranje. Pri P22 spremenjeni aminokislinski ostanki 105-132 rezultirajo v prekomernem pakiranju. Ravno obratno pa se zgodi pri SPP1, pri katerem mutacije povzročijo ustavitev pakiranja.

===Regija peclja===

Domena peclja je izpostavljena zunanjosti kapside. Vključena je v vezavo terminaze in predstavlja mesto za interakcijo z adapterskimi proteini. Je strogo urejena. Predstavlja začetni del kanala za DNA pakiranje. Pri portalnem kompleksu bakteriofaga T4 pozitivne aminokisline obdajajo dno regije peclja in so najverjetneje vpletene v ujetje DNA ob pričetku translokacije virusnega genoma.

==DNA pakirajoči motor bakteriofagov==

Da se v kapsidi bakteriofagov na omejenem volumnu razporedi negativno nabita DNA, je potrebno usklajeno delovanje portalnega proteina s terminaznim kompleksom, ki ga sestavljata mala in velika terminazna podenota. Terminazni kompleks in portalni protein skupaj tvorita molekulski motor, ki pretvarja kemijsko energijo, ki se sprosti pri hidrolizi ATP, v fizično gibanje molekul, zaradi česar pride do vstavitve DNA v prokapsido. DNA se v prokapsido vstavi s hitrostmi do ∼1,800 bp na sekundo in v korakih po 2 bp/ATP. Preko kanala premera 30 Å, ki ga tvori portalni protein, se v prokapsido translocira linearen genom, kjer se zelo tesno pakira v kompaktno strukturo. DNA pakirajoči motor bakteriofagov je najmočnejši do zdaj poznani molekulski motor in generira ogromne sile (do 60 pN). Tako velike sile so ključne za pakiranje DNA proti ogromnim elektrostatskim odbojnim silam in neugodni entropiji.

Mala terminazna podenota prepozna genomsko DNA, na kompleks male terminaze in DNA se naloži velika terminaza in nato se celoten kompleks naloži na portalni protein. Velika terminaza interagira z regijo pecelj portalnega proteina in oligomerizira, pri čemer tvori pentamerni obroč. Sestavljena je iz endonukleazne C-končne domene, ki je odgovorna za cepitev DNA, ter ATPazne N-končne domene, ki prispeva energijo za pakiranje DNA. Številni bakteriofagi podvojujejo genom po principu kotalečega se kroga in tvorijo dolge konkatemere. Prepoznavanje DNA in njena cepitev pa se med različnimi bakteriofagi razlikuje. Pri nekaterih bakteriofagih, kot so P22, T4 in SPP1, pride do začetne nespecifične cepitve blizu prepoznavnega mesta ''pac'' (angl. packaging recognition site). Ko je kapsida polna, se pakiranje genoma konča in pride do nespecifične cepitve DNA. Da ti bakteriofagi zagotovijo, da vsaka kapsida vsebuje celoten genom, je zanje značilna terminalno redundančna DNA. Drug mehanizem, do katerega pride pri bakteriofagih λ, HK97 in P2, pa je cepitev na specifičnih kohezivnih končnih mestih (''cos''), tako da se celoten genom nahaja med dvema ''cos'' cepitvenima mestoma. Bakteriofag φ29 pa ne potrebuje cepitve, saj je njegov genom že končne dolžine. Posebnost bakteriofaga φ29 je tudi, da za pakiranje DNA potrebuje šest molekul pRNA (pakirajoča RNA), ki so dolge 174 nukleotidov, in katerih sekundarna struktura je ključna za pakiranje DNA ter imajo homologno vlogo kot mala terminaza, potrebne pa so tudi za nalaganje ATPaznega dela motorja.

===Strukturne spremembe portalnega proteina pri pakiranju genoma===

Ko so preučevali strukturne spremembe portalnega proteina bakteriofaga P22 pri pakiranju DNA, so ugotovili, da pakiranje DNA inducira prehod nezrelega asimetričnega portalnega proteina v zrel simetričen kompaktnejši portalni protein, pri čemer pride do povečanja premera osrednjega kanala s 25 Å na 40 Å, medtem ko se celoten premer portalnega proteina zmanjša z 200 Å na 170 Å. Samo prvotna oblika, ki je prisotna v nezrelem bakteriofagu, pa je sposobna pakiranja DNA.

Regija sodček zaradi pakiranja genoma spremeni konformacijo iz nestrukturirane v alfa vijačno in zaznava pritisk v kapsidi. Do največje strukturne spremembe pride na C-končnem delu regije sodček, ki v zreli obliki sega precej bolj v notranjost kapside. Med pakiranjem DNA pride zaradi prevladovanja negativno nabitih aminokislinskih ostankov na zunanji površini regije sodček do odboja med DNA in negativnimi ostanki, zato se ta regija iztegne. Ta strukturna sprememba je najverjetneje ključna za injiciranje genoma ob infekciji.

Strukturna sprememba se zaradi visokega pritiska prenese iz regije sodček na regiji pecelj in krilo, in posledično pride do preureditve simetrije portalnega proteina iz petdelne v šestdelno. Ta preureditev simetrije predstavlja signal za terminacijo pakiranja in vodi v zmanjšanje vezavne afinitete za veliko terminazo, kar upočasni translokacijo DNA in pospeši nukleazno aktivnost velike terminaze. Velika in mala terminaza se ob zaključku pakiranja DNA sprostita z nascentnega bakteriofaga, zato v zrelem bakteriofagu nista prisotni.
==Viri==

P. E. Prevelige, J. R. Cortines: Phage Assembly and the Special Role of the Portal Protein. ''Curr. Opin. Virol.'' '''2018''', ''31'', 66–73.

V. B. Rao, M. Feiss: The Bacteriophage DNA Packaging Motor. ''Annu. Rev. Genet.'' '''2008''', ''42'', 647–681.

C. L. Dedeo, G. Cingolani, C. M. Teschke: Portal Protein: The Orchestrator of Capsid Assembly for the DsDNA Tailed Bacteriophages and Herpesviruses. ''Annu. Rev. Virol.'' '''2019''', ''6'', 141–160.

R. K. Lokareddy, R. S. Sankhala, A. Roy, P. V. Afonine, T. Motwani, C. M. Teschke, K. N. Parent, G. Cingolani: Portal Protein Functions Akin to a DNA-Sensor That Couples Genome-Packaging to Icosahedral Capsid Maturation. ''Nat. Commun.'' '''2017''', ''8''.

A. A. Aksyuk, M. G. Rossmann: Bacteriophage Assembly. ''Viruses''. '''2011''', ''3'', 172–203.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina

2020-05-04T19:55:43Z

Anja Konjc:

Bakteriofagi

2020-03-12T21:50:23Z

Anja Konjc:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2019/20 obravnavajo različne vidike bakteriofagov, od njihove zgradbe in delovanja, do vloge v okolju in izrabe za zdravljenje. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si oglejte prosojnice v spletni učilnici - 3. teden marca. V okviru posameznih glavnih poglavij lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti (lahko tudi dva, če pa bi kakšno temo na vsak način rad obdelal en sam, mi prej pišite, da se pogovorimo glede vsebine in obsega). Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200-1800 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga 15-20 minut, temu pa bo sledila razprava (pribl. 5 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite le malo splošnega uvoda, ki naj ima za nalogo, da umesti vašo temo v kontekst problematike bakteriofagov.

Predvidena umestitev seminarjev v semestru je razvidna iz spletne učilnice, a zaenkrat ni mogoče zagotovo reči, da ne bo kakšnih sprememb zaradi ukrepov proti širjenju koronavirusa.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. 10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).

Spodnji seznam vključuje povezave do nekaterih preglednih člankov iz zadnjega obdobja, ki jih lahko uporabite za osnovo pri pripravi. Večinoma pa navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili 15-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro en za drugim - predvidoma po 8 na teden), tako da boste osnove hitro osvojili in jih ni treba ponavljati.

Poglavja za seminarje so:

'''STRUKTURA IN DELOVANJE FAGOV''' 
https://www.intechopen.com/books/bacteriophages-perspectives-and-future/bacteriophages-their-structural-organisation-and-function (poglavje, 2019) 
1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov 
2. Struktura kapsid in prokapsid 
3. Struktura konektorjev in repov 
4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6416446/ (pregledni, 2019) 
5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6209105/ (pregledni, 2018) 
6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1879625718300142?via% 
(pregledni, 2018) 
7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1570963919301888?via% 
(pregledni, 2020) 
8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave 

'''INTERAKCIJE in EKOLOGIJA''' 

https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm (pregledni, 2019) 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29523063 
9. Interakcija faga z bakterijo 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X19300031 (pregledni, 2019) 
10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi 

https://www.mdpi.com/2076-0817/8/3/100/htm (pregledni, 2019) 
11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (brez človeka - to je predhodna tema) 

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/08927014.2019.1613525 in https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32125643 
(pregledni, 2019+2020) 
12. Delovanje fagov na heterogene biofilme 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0966842X19300599?via% 
(pregledni, 2019) 
13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom 

https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11274-013-1358-5 (pregledni, 2013) 
14. Cianofagi 

'''UPORABA BAKTERIOFAGOV''' 

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2019.00513/full (pregledni, 2019) 
15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb 
16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh 
17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5371805/ 
(pregledni, 2017 - samo kratko poglavje o uporabi na rastlinah) 
18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0160412019305410 (pregledni, 2019) 
19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti 

https://www.aimspress.com/fileOther/PDF/microbiology/microbiol-05-04- 
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S095816691930093X?via%3Dihub 
(pregledni, 2019 + 2020) 
20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih 

https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm 
in https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166919301296?via%3Dihub 
(pregledni, 2019 + 2020) 
21. Biotehnološka izraba fagov 

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju.
Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.

0. Analiza bakteriofagov v smrekovem gozdu (Jana Dolenc, Tilen Deželak, Sonja Mavrič) 

1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov 
2. Struktura kapsid in prokapsid 
3. Struktura konektorjev in repov 
4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov 
5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda (Kim Glavič, Nastja Feguš, Nina Varda) 
6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni (Žiga Vičič, Dunia Sahir, Maja Globočnik) 
7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina (Anja Konjc, Tina Logonder, Manca Osolin) 
8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave (Tina Arnšek, Ana Babnik, Greta Junger) 
9. Interakcija faga z bakterijo (Anastasija Nechevska, Marjeta Milostnik) 
10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi (Michelle Oletič, Nika Vegelj, Rebeka Dajčman) 
11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (Lena Trnovec, Maja Kolar) 
12. Delovanje fagov na heterogene biofilme 
13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom (Žan Fortuna, Tevž Levstek) 
14. Cianofagi 
15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb (Maša Gabrič, Maša Andoljšek, Vivian Nemanič) 
16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh(Tim Nograšek, Jure Povšin, Sašo Jakob) 
17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje (Maja Mahorič, Ana Potočnik, Maja Trifkovič) 
18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin 
19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti 
20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih (Tadej Uršič, Teo Nograšek) 
21. Biotehnološka izraba fagov 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

BIO2 Povzetki seminarjev 2019

2019-11-30T01:20:27Z

Anja Konjc: /* Anja Konjc: SUPERKOMPLEKSI */

== Kim Glavič: ATP KOT SIGNALNA MOLEKULA ŽIVALI IN RASTLIN ==

Molekula ATP ni le temeljni vir energije za mnoge procese v celici, temveč tudi signalna molekula v zunajceličnem matriksu živali in rastlin. ATP, kot velika polarna molekula, se iz celic rastlin izloči s pomočjo eksocitotskih veziklov ali ATP prenašalcev. Iz živalskih celic pa s pomočjo eksocitotskih veziklov, ATP prenašalcev ali koneksonskih hemikanalčkov. Ob povečanih koncentracijah molekul ATP v zunajceličnem matriksu se te vežejo na ustrezne P2- receptorje. Po sprostitvi nazaj v matriks pa njihovo koncentracijo uravnavajo ekto-nukleotidaze. Na splošno aktivacija P2- receptorjev povzroči povišanje koncentracije kalcijevih ionov in dušikovega monoksida v citosolu celice ter nastanek reaktivnih kisikovih zvrsti v zunajceličnem matriksu. Kalcijevi ioni, dušikov monoksid in reaktivne kisikove zvrsti so sekundarni obveščevalci, ki so ključni za fiziološki odziv celice. Rastlinska ATP-signalizacija ima pomembno vlogo pri časovni regulaciji kalitve cvetnega prahu, rasti pelodne cevke, nastanku koreninskih gomoljev in zaznavanju ter posledično izogibanju oviram pri rasti korenin. Živalska ATP-signalizacija sodeluje pri nastanku imunskega odziva, prenosu živčnih signalov, celični smrti in regulaciji mnogih drugih procesov.

== Tevž Levstek: GLICINSKI TRANSPORTERJI KOT TERAPEVTSKE TARČE ==

Glicin je proteinogena aminokislina, ki opravlja tudi funkcijo signalne molekule, natančneje nevrotransmiterja. Najdemo ga v dveh vrstah sinaps: glicinergičnih, kjer je glavni nevrotransmiter in glutamatergičnih, kjer ima pomožno vlogo, saj pomaga glutamatu pri signaliziranju. Koncentracije glicina v medceličnini regulirajo glicinski transporterji, ki jih delimo na GlyT1 in GlyT2. Glicinergična sinapsa je inhibitorna, kar pomeni, da če glicin aktivira svoj receptor, posinaptično celico hiperpolarizira (še poveča raven kloridnih ionov v njej). V tej sinapsi GlyT1 zmanjšuje koncentracijo glicina, saj ga transportira v okoliške glia celice. GlyT2 po drugi strani pa zvišuje koncentracijo glicina, saj zbira razpršen glicin, ga reciklira in omogoči ponovno usmerjeno pošiljanje proti receptorjem. V glutamatergičnih sinapsah pa je glicin skupaj z glutamatom ekscitatorna signalna molekula. Če se glicin veže na protein NMDA, ki je na posinaptični membrani, mu s pozitivno alosterično modifikacijo olajša vezavo z glutamatom, ki odpre kationski kanalček in depolarizira celico. Tu regulira koncentracijo glicina le GlyT1, ki jo zmanjšuje, GlyT2 pa tu ne nastopa. Razumevanje delovanja obeh sinaps nam lahko omogoči sintezo novih zdravil, ki bi bolj učinkovito delovala proti nekaterim duševnim boleznim kot so shizofrenija, alkoholizem, obsesivno-kompulzivna motnja in še precej drugim. Ta zdravila najpogosteje inhibirajo delovanje GlyT1 in imajo veliko uspešnost pri glodalcih. Pri ljudeh pa na žalost še ni bilo dobrih rezultatov in na razvoj tovrstnega zdravila še čakamo.

== Ana Potočnik: FOSFATIDILSERIN KOT SIGNALNA MOLEKULA ==

Fosfatidilserin je glicerofosfolipid in pomemben gradnik celičnih membran. V zdravih in živečih celicah se nahaja izključno na notranji, citosolni strani fosfolipidnega dvosloja. To asimetrično razporeditev s pomočjo ATP vzpostavlja aminofosfolipidna translokaza. Poleg svoje strukturne vloge ima fosfatidilserin tudi pomembno funkcijo v mnogih signalizacijskih poteh. Kot signalna molekula sodeluje pri koagulaciji krvi, fagocitozi apoptoznih celic, celični fuziji in odlaganju mineralov v osteoblaste. Ključna lastnost fosfatidilserina kot signalne molekule je njegova negativno nabita polarna glava. Preko nje fosfatidilserin z drugimi signalnimi molekulami ali receptorji tvori elektrostatske ali stereospecifične interakcije. Sodeluje pri signalizaciji znotraj celice in tudi pri ekstracelularni signalizaciji. Ko sodeluje pri ekstracelularni signalizaciji, se nahaja tudi na ekstracelularni strani fosfolipidnega dvosloja. Prehod fosfatidilserina iz notranje na zunanjo stran uravnavajo skramblaze. Te so lahko aktivirane s pomočjo kaspaz, ki so encimi, prisotni v apoptozni celici. Med molekulami, ki se vežejo na fosfatidilserin, so najbolj preučevane tiste, ki za vezavo nanj uporabijo Gla domeno. Laktahedrin, ki je na fagocit vezan preko integrinov αvβ3, z vezavo na fosfatidilserin apoptozno celico pritrdi k makrofagu. Gas6 in protein S, ki se prav tako vežeta na fosfatidilserin, pa preko TAM receptorjev sprožita tirozinkinazno aktivnost. Aktivira se Rac1 in polimerizacija aktina sproži fagocitozo apoptozne celice. Izpostavljenost fosfatidilserina na ekstracelularni strani celice je zadosten signal makrofagu, da fagocitira celico. To nakazuje na pomembno vlogo fosfatidilserina kot signalne molekule.

== Tadej Uršič: TLR SIGNALIZACIJA IN NJENA VLOGA PRI REVMATIČNIH BOLEZNIH ==

Prirojeni imunski sistem predstavlja prvi obrambni mehanizem organizma. Celice prirojenega imunskega sistema izražajo receptorje, ki zaznavajo določene gradnike bakterij in virusov in pa molekule, ki nastanejo pri poškodbah samega organizma. Ti receptorji sprožijo signalne poti ki privedejo do odgovora organizma na vdor patogena. Ena od skupin teh receptorjev so TLR (Toll-Like Receptors). So integralni proteini za katere je značilna z levcini bogata ektodomena za prepoznavanje ligandov in pa TIR domena za navzdoljno signalizacijo. TLR-ji prepoznavajo komponente membran (lipide, lipopolisaharide, lipoproteini, …) in nukleinske kisline bakterij in virusov in kot odgovor sprožijo vnetno reakcijo. Če je le ta normalno regulirana le ta pripomore pri odpravi vdirajočih patogenov v organizem. Če pa pride do napak v regulaciji to lahko privede do kroničnega vnetja tkiva. Pri revmatičnih obolenjih, kot so na primer revmatoidni artritis, putiki, lymski artritis, lupus… , so odkrili večjo izraženost TLR-jev, kar je lahko glavni razlog za njihov nastanek. Znanstveniki sedaj testirajo razne inhibitorje TLR-jev ali pa njihovih adaptornih proteinov, kot potencialna zdravila za te bolezni.

== Nika Vegelj : FORMACIJA BIOFILMA V POVEZAVI S C-DI-GMP MOLEKULO ==

Za bakterijo, kot tudi za vsa ostala živa bitja je nujno, da se prilagajajo na spreminjanje življenjskih pogojev, saj jim to omogoča preživetje. Molekula c-di-GMP je sekundarni sporočevalev pri baktrerijah, ki regulira različne celične procese. C-di-GMP so prvič odkrili kot alosterični aktivator celulozne sintetaze v bakteriji Gluconacetobacter xylinum. Pri patogenih organizmih molekula c-di-GMP kontrolira virulentni odgovor, ki je povezan s quorum sensingom, procesom s katerim bakterije med seboj komunicirajo. Koncentracija molekule c-di-GMP je v celici regulirana s pomočjo encimov fosfodiesteraz in gvanilat ciklaz. C-di-GMP je sintetizirana znotraj celice iz dveh molekul GTP s pomočjo encima digvanilat ciklaze, ki na aktivni strani nosi domeno GGDEF. Razpad molekule pa omogoča encim fosfodiesteraza, ki nosi domeno EAL, ta omogoča, da molekula razpade na linearni nukleotid pGpG. Glavni namen raziskovanja molekule c-di-GMP ter njene vloge pri tvorbi biofilma, je bil, da bi ugotovili nove metode, ki bi preprečile nastanek biofilma in tako pozdravile z njim povezane bolezni. Cistična fibroza je ena izmed najpogostejših bolezni v evropi, za njo pa je odgovorna bakterija pseudomonas aeruginosa, ki s tvorbo biofilma povzroča kronično obolenje, saj antibiotiki ne delujejo direktno na biofilm. C-di-GMP je sekundarni sporočevalec pri bakterijah, ne pa tudi pri evkariontih in arhejah. Prav zato je tako zanimiv za znanstvenike, saj lahko z razvojem zdravil, ki bi vplivale na molekulo, razvili potencialna zdravila za kronične bolezni.

== Maja Kolar: BIOKEMIJSKA LOGIKA GLIKOLIZE ==
Čeprav glikoliza sprva zgleda zapletena in naključna, je v smislu zadovoljevanja vsem biokemijskim zahtevam ena najenostavnejših metabolnih poti. Pri načrtovanju poti se je treba zavedati kompromisov za zadovoljevanje različnim omejitvam, zato lahko skozi analizo vseh teoretično možnih poti ugotovimo katera je celici najugodnejša. Termodinamske omejitve vključujejo Gibbsovo prosto entalpijo reakcij, ki jo lahko izračunamo iz redoks potencialov in ugotovimo katere poti v metabolizmu so ender-/eksergonske. Pri encimskih mehanizmih moramo upoštevati aktivacijske skupine, ki pa lahko povečajo reaktivnost intermediatov, kar spada pod fizikalno-kemijske lastnosti intermediatov. Med njih štejemo tudi prepustnost skozi membrano, afiniteto do encimov in toksičnost. Slednjo celica izniči z izogibanjem reakcijskim potem ali sistemi endogene detoksifikacije kot je sistem glioksalaz za intermediat metilglioksal. Pri glikolizi se jim celica izogne z delitvijo elektronske prerazporeditve, kjer po podobnih poteh ne nastopajo toksične spojine. Preko energij vezi in elektronskih prerazporeditev lahko določimo kje na glikolizni poti bo nastajal ATP. Najobsežnejše zastopana je glikoliza Embden-Meyerhof-Parnas, vendar njene naravne alternative dokazujejo, da so skozi evolucijo različni organizmi kot so anaerobne/aerobne bakterije, termofili obravnavali določene zahteve kot bolj ali manj pomembne. Znanje različnih bioloških zahtev pa lahko prenesemo na metabolni inženiring, kjer iščemo učinkovite rešitve za proizvodnjo industrijsko iskanih metabolitov.

== Jure Povšin: VPLIV DIMETIL FUMARATA NA GAPDH IN AEROBNO GLIKOLIZO PRI MODULACIJI IMUNOSTI ==
Aktivirane imunske celice se po Warburgovi hipotezi osredotočijo na izvajanje aerobne glikolize namesto na izvajanje oksidativne fosforilacije, s čimer predstavljajo potencialno terapevtsko tarčo pri avtoimunski boleznih. Dimetil fumarat (DMF), je derivat od intermediarnega fumarata iz Krebsovega cikla. DMF je ester fumarne kisline ter imunomodulacijsko zdravilo, ki se uporablja za zdravljenje multiple skleroze in luskavice. Čeprav njegov terapevtski mehanizem zaenkrat ostaja še negotov, je znano, da DMF kovalentno spreminja ostanke cisteina v procesu, imenovanem succination. Preiskovanje aktivnost DMF-ja dodatno zapleta njegova hidroliza in vivo do monometil fumarata (MMF), ki lahko tudi sam modulira imunski odziv in vnetje tkiv. Kornberg in sodelavci so ugotovili , da DMF pri procesu, imenovanem succination, inaktivira katalitični cistein glikolitičnega encima gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) pri miših in ljudeh, tako in vitro kot in vivo. S tem navzdol uravnava aerobno glikolizo v aktiviranih mieloidnih in limfoidnih celicah, kar povrzoča njene protivnetne učinke. Rezultati znanstvenikov zagotavljajo mehanski vpogled v imunsko modulacijo z DMF in predstavljajo dokaz koncepta, da je aerobna glikoliza lahko zelo pomembna terapevtska tarča v avtoimunosti in da nas lahko nadaljnje raziskovanje pripelje do dolgo iskanih zdravil proti hudim avtoimunim boleznim.

== Manca Osolin: REGULACIJA METABOLIZMA GLUKOZE IN LAKTATA V MOŽGANIH ==
Aerobna glikoliza je proces razgradnje glukoze do laktata v prisotnosti kisika. Proces aerobne glikolize je med drugim značilen tudi za astrocite, posebne celice v možganih. Ker imajo nevroni večjo potrebo po energiji kot astrociti, vzdržujejo visok nivo oksidativnega metabolizma, medtem ko astrociti favorizirajo aerobno glikolizo in omejujejo oksidativno aktivnost. Številne raziskave so pokazale, da astrociti laktat, ki nastane v procesu aerobne glikolize, posredujejo nevronom. Ta koncept se imenuje ANLS hipoteza. Nevroni morajo vzdrževati ravnotežje med pentoza fosfatno potjo in glikolitično potjo, da dosežejo potrebe po energiji in da vzdržujejo antioksidativni potencial. Zato uporaba laktata kot oksidativnega substrata lahko zagotavlja ugoden način za nevrone, da proizvedejo visoke količine ATP med zaobidenjem glikolitične poti, saj tako varčujejo glukozo za pentoza fosfatno pot. Aerobna glikoliza, ki poteka v astrocitih in katere končni produkt je laktat, ima pomembno vlogo pri vzdrževanju nevronske aktivnosti. Laktat se prenese iz astrocitov v nevrone, da zadosti energijskim potrebam nevronov, prav tako pa laktat deluje tudi kot signalna molekula, ki regulira nevronske funkcije, kot so vzdražnost in plastičnost nevronov ter okrepitev spomina. V možganih se nahaja tudi posebna vrsta nevronov, ki na različne mehanizme zaznavajo spremembe koncentracije glukoze, kar jim omogoča prilagajanje na zunanje spremembe preko depolarizacije.

== Greta Junger: INTERMEDIATI CIKLA CITRONSKE KISLINE: SIGNALNE MOLEKULE POD KRINKO ==
Cikel citronske kisline je centralna metabolna pot, pri kateri se energetsko bogata molekula acetil-CoA oksidira ter svoje elektrone odda prenašalcem. Oksidacija je postopna in poteka preko več intermediatov. Za njih je dolgo časa veljalo, da je to njihova edina vloga, vendar pa se je ta domneva izkazala za napačno. Večina intermediatov cikla citronske kisline ima namreč večstransko vlogo, saj sodelujejo tako pri signalizaciji kot tudi regulaciji različnih procesov. Za delovanje α ketoglutarat-odvisnih dioksigenaz (2-OGDO) je nujno potreben α ketoglutarat. Zaradi podobne kemijske zgradbe se na 2-OGDO lahko vežeta tudi sukcinat in fumarat, ki pa encima ne aktivirata, pač pa delujeta kot kompetitivna inhibitorja. Kot taka lahko v celici ustvarita pseudo-hipoksično stanje ali pa posredno vplivata na spremembo demetilacije DNA in histonov. Poleg omenjenega imajo nekateri intermediati ključno vlogo tudi pri post-translacijski modifikaciji proteinov, natančneje acetilaciji, sukcinaciji in sukcinilaciji Lys in Cys ostankov. Za sukcinat in α ketoglutarat obstajata specifična GPC-receptorja - SUCNR1 in OXGR1. Fiziološki pomen SUCNR1, ki se med drugim nahaja v ledvicah, srčnem tkivu in očeh, je bolje raziskan od OXGR1O. Nedolgo nazaj so pojasnili tudi vlogo sukcinata pri nastanku reaktivnih kisikovih zvrsti in obratnega toka elektronov.

== Oskar Nemec: Uravnavanje delovanja levkocitov z intermediati cikla citronske kisline ==
Glede na to, da je cikel citronske kisline (TCA) osnovno vozlišče (energijskega) metabolizma celic, je smiselno sklepati, da je aktivacija celic naravne imunosti in njihova regulacija s tem procesom povezana. Imunski odziv je namreč energijsko potraten proces in v veliki meri odvisen od mitohondrijskega metabolizma. Izkazalo se je, da intermediati TCA, kot so sukcinat, itakonat, citrat in fumarat, posredujejo ali uravnavajo pomembne funkcije mieloidnih celic (levkocitov) med okužbo in vnetjem. Aktivacija levkocitov, ki se zgodi v sklopu vnetnega procesa z vnetnimi dejavniki vodi v preoblikovanje cikla in kopičenje teh intermediatov v celici. Sukcinat ima vnetni učinek, ker povzroči stabilizacijo HIF-1 (hypoxia inducible factor 1), povečanje količine mROS (reaktivne kisikove zvrsti mitohondrija), postranslacijske modifikacije proteinov z sukcinilacijo in signalizacijo preko z G-proteinom sklopljenimi receptorji (klasična kaskada). Citrat prav tako spodbuja vnetni odziv, saj se zaradi njega sintetizirajo reaktivne kisikove in dušikove zvrsti ter prostaglandin E2. Itakonat pa ima protivnetno vlogo, saj zavira SDH in omeji vnetne učinke sukcinata, sposoben je pa tudi, v nasprotju s sukcinatom, sam ubiti patogene. Vloga fumarata v vnetnem procesu ni dokončno pojasnjena, znano pa je da povzroča med drugimi zmanjšanje količine ROS in tako zmanjša vnetni odziv.

== Teo Nograšek: GPR91: PREMIKANJE MEJA INTERMEDIATOV KREBSOVEGA CIKLA ==
Sukcinat je najbolj poznan kot intermediat Krebsovega cikla, vendar so novejše raziskave pokazale, da ima tudi pomembno funkcijo kot signalna molekula. Celice v hipoksiji sintetizirajo in izločajo sukcinat, ki se nato veže na receptor GPR91. GPR91 je najden v celicah jeter, krvnih celicah, maščobnih celicah, ledvičnih celicah in celicah mrežnice. V jetrih signal iz receptorja GPR91 vpliva na Itove celice, ki so zadolžene za izločanje kolagena pri poškodbi jeter. V mrežnici je GPR91 izražen v nevronskih celicah ganglijev in njegova aktivacija povzroči neovaskularizacijo. Aktivacija GPR91 v ledvicah povzroči povišanje krvnega tlaka preko renina. Povišan krvni tlak lahko povzroči hipertrofijo, na nastanek hipertrofije pa vpliva tudi sama vezava med sukcinatom in receptorjem GPR91 na srčnih mišičnih celicah, kar povzroči transkripcijo genov za nastanek hipertrofije. Poleg tega visoka koncentracija sukcinata povzroči apoptozo srčnih celic. Raziskave na področju zaviranja delovanja GPR91 bi lahko omilile zaplete, ki nastanejo pri transplantaciji, ker je bilo odkrito, da imajo pacienti po transplantaciji povišano količino sukcinata v krvi, kar vodi do zapletov.

== Ana Babnik: REGULACIJA OKSIDACIJE MAŠČOBNIH KISLIN V SKELETNIH MIŠICAH PRI AEROBNI VADBI ==
Krčenje mišic pri aerobni vadbi zahteva dodatno energijo, ki jo lahko celice pridobijo iz znotrajceličnih in telesnih virov glukoze in maščobnih kislin. Na izbiro substrata, ki se bo v večji meri porabljal za končno sintezo ATP, vplivata intenzivnost in trajanje vadbe. Oksidacija maščobnih kislin je regulirana z mnogimi prepletenimi signalnimi potmi in regulacijskimi mehanizmi, kateri pa še niso v celoti poznani. Glavni regulator vnosa maščobnih kislin v celico je CD1/SR-B2 (receptor čistilec B2), ki s svojo translokacijo iz veziklov na membrano in interakcijo s FABP olajša vnos maščobnih kislin v celico. Naslednja pomembna točka je prenos substratov v celico v obliki acil-CoA, pri čimer sodeluje CPT1, ki za prenos potrebuje prosti karnitin, na njegovo delovanje pa vpliva mnogo regulatorjev. Sama regulacija delovanja CPT1 pa je povezana tudi s celično homeostazo acetil-CoA in kot že omenjenega prostega karnitina, saj se ta pri presežkih v količini acetil-CoA porablja za nastanek acetilkarnitina. Regulatorni mehanizmi β-oksidacije dokazujejo, da se pri daljši oziroma vadbi z nižjo intenziteto za sintezo acetil-CoA (in nadaljnjo sintezo ATP) porabljajo predvsem maščobne kisline, medtem ko se pri bolj intenzivni vadbi porablja glukoza.

== Nastja Feguš: VEČDIMENZIONALNA VLOGA KETONSKIH TELES ==
Aceton, acetoacetat in D-β-hidroksibutirat so ketonska telesa. Bakterije, arheje in evkarionti jih uporabljamo kot alternativni vir energije. Pri sesalcih so ketonska telesa pomemben alternativni vir energije za možgane, srce in skeletne mišice. Ketosnka telesa na dan prispevajo med 5 % in 20 % energije. Tvorba ketonskih teles primarno poteka v jetrih, saj imajo le jetra in celice kolonskega epitela v črevesju izražen encim, ki katalizira prvo reakcijo nastanka ketonskih teles, vendar obstajajo tudi mehanizmi nehepatične sinteze ketonskih teles. Usoda ketonskih teles ni vedno oksidacija oziroma pretvorba v acetil-CoA, lahko se pretvorijo v različne intermediate, ki se lahko uporabijo v biosintezi sterolov in maščobnih kislin. Ketonska telesa so zelo dobri antioksidanti, njihova funkcija je zelo pomembna v možganih, kjer znižajo stopnjo celičnih poškodb nevronov. D-β-hidroksibutirat je epigenetski modifikator, saj direktno modificira lizinske ostanke histonov. D-β-hidroksibutirat je tudi pomembna signalna molekula. Je direkten inhibitor encimov razreda HDACs. Inhibicija teh encimov poveča acetilacijo encimov in inducira izražanje genov, ki zmanjšajo oksidativni stres. Prav tako se veže na dva različna z G proteinom povezana receptorja, preko te signalne poti zmanjša lipolizo, upočasni srčni utrip in zmanjša porabo energije.

== Maša Andoljšek: DOBRE STARE MAŠČOBE: POVEZAVA MED SIGNALIZACIJO LIPIDOV IN ŽIVLJENJSKO DOBO ==
Lipidi kot signalne molekule ali transkripcijski faktorji sodelujejo v procesih, ki podaljšujejo življenje. Večina raziskav poteka na glisti ''Caenorhabditis elegans'', saj ima kratko življenjsko dobo in se lahko genetsko manipulira. Obstajajo tri metode podaljševanja življenja, ki delujejo na več vrstah organizmov. Prva je inzulin signalirajoča pot, ki s pomočjo dafakronske kisline, holesterola in jedrnih receptorjev DAF-12 ter DAF-16, regulira življenjsko dobo in sproža avtofagijo. Drug način je dietna restrikcija, ki pa lahko poteka preko mutacije eat-2, preko razredčevanja hrane in preko občasnega postenja. Pri tem načinu sodeluje DAF-16, NHR-8 in NHR-64. Dietna restrikcija ima pozitivne vplive na zdravje. Zadnji način podaljšanja življenjske dobe je izrez signalov zarodne plasti, kar promovira lipolizo, metabolizem lipidov itd. Te raziskave kažejo, da je možna uporaba lipidov tudi za zdravljenje različnih bolezni, za kar pa se nekateri že uporabljajo. Pomembna je tudi akumulacija različnih molekul, na primer oleinske kisline pri staranju. Veda, ki se ukvarja s tem je lipodomika, ki preučuje metabolne poti lipidov in njihove strukture. Pri dalj živečih organizmih so strukturni lipidi v nasičenem stanju, lipidi v energijskih zalogah pa v nenasičenem stanju.

== Vivian Nemanič: VPLIV STRESA IN GLUKOKORTIKOIDOV NA PRENOS GLUTAMATA ==
Stres lahko opišemo kot nespecifičen odziv telesa na nek stresor, ki je lahko dogodek ali izkušnja, ki onemogoči posamezniku, da se bi odzval. Akuten in kroničen stres in s stresom povezana sprostitev glukokortikoidov lahko sproži spremembe v prefrontalnemu korteksu in v hipokampusu, saj povzroča spremembe v glutamatnih nevrotransmitorjih. Stres tudi dokazano povzroča kompleksne strukturne spremembe v različnih možganskih regijah. Glede na glutamatergično sinapso, ima lahko stres vpliv na plastičnost in sicer v pozitivnem smislu, da izboljša delovanje možganov, ali pa v slabem smislu, ko lahko vodi do psiholoških motenj. Vemo tudi to, da so s stresom povezane spremembe v različnih aspektih povezane z nevrotransmisijo oz. prenosom glutamata in z vlogo glukokortikoidov. Akutni stres ima generalni učinek na povečanje glutamatergične nevrotransmisije v prefrontalnem korteksu in drugih regijah, ki so povezane s spominom in učenjem ter vpliv na genimočne in negenomične spremembe na različnih straneh tridelne sinapse. Presinaptično sproščanje glutamata je povečano, če sodelujejo mineralokortikoidni in glukokortikoidni receptorji, saj ga oni regulirajo. Na postsinaptični strani akutni stres poveča ekspresijo in gostoto ionotropnih glutamat receptorjev (NDMA), kar vodi v sinaptično potenciranje. V nedavnih raziskavah poskušajo razumeti kako bi lahko mehanizmi, ki kontrolirajo funkcije glutamatne sinapse, lahko pomagali pri razvoju zdravil za različne duševne motnje.

== Lena Trnovec: KARBAMOILACIJA: MEHANIZMI IN POSLEDICE ==
Sečnina že več desetletij velja za relativno nestrupeno spojino. Že nekaj časa pa se nabirajo dokazi, ki podpirajo dejstvo, da post-translacijska modifikacija karbamoilacija, ki je neločljivo povezana s kopičenjem sečnine in odpovedjo ledvic, pripelje do mnogih bioloških in kliničnih posledic. Karbamoilacija proteinov je neencimska post-translacijska modifikacija, ki veže prosto aminsko skupino mnogih proteinov z izociansko kislino. Ta nastane pri disociaciji sečnine ali iz tiocianata, katerega razgradnjo usmerjajo mieloperoksidaze. Glede na vrsto spremenjene molekule (na primer kolagen, albumin, lipoprotein z nizko gostoto ali lipoprotein z visoko gostoto), ima karbamoilacija različne patofiziološke učinke. Karbamoilirani proteini naj bi bili povezani z aterosklerozo, presnovo maščob, motnjami imunskega sistema (kot je inhibicija klasične poti aktivacije komplementa, inhibicija od komplementa odvisne celične citotoksičnosti rituksimaba, zmanjšan oksidativni izbruh nevtrofilcev) in fibrozo jeter. Tako v in vitro kot in vivo raziskavah ima karbamoilacija škodljive posledice na vseh nivojih fiziologije, njena povezava z vnetjem in uremijo pa razsvetli faktorje tveganja pri bolnikih s kronično odpovedjo ledvic. Zmanjšanje stopnje karbamoilacije bi tako lahko bil zanimiv terapevtski pristop k zmanjšanju posledic bolezni ledvic. Obstaja mnogo možnosti za zmanjšanje stopnje karbamoilacije – prehranjevalni pristop (aminokislinska dopolnila), prilagoditev dialize in protivnetne terapije.

== Ana Vičič: VLOGA MITOHONDRIJA V TOKSIČNEM OKSIDATIVNEM STRESU ==
Do oksidativnega stresa v mitohondrijih pride, ko koncentracija oksidativnih zvrsti preseže kapaciteto mitohondrijskih antioksidativnih sistemov. V dihalni verigi nastajajo zelo reaktivni ROS-i, ki hitro po nastanku reagirajo z bližnjimi biološkimi makromolekulami in jih pri tem poškodujejo. Ker so biološke makromolekule, kot so mtDNA, kardiolipin, akonitaza, in UCP2, ključne za pravilno delovanje celice, imajo njihove poškodbe velike posledice, ki se lahko akumulirajo in nato odražajo v celični nekrozi in na nivoju človeškega organizma v nevrogenerativnih boleznih in staranju. Oksidacija mtDNA lahko vodi do napak v genskem zapisu za proteine in nukleinske kisline, ključne za delovanje celičnega dihanja. Oksidacija kardiolipina lahko sproži signalizacijo za celično apoptozo. ROS-i deaktivirajo encim akonitazo in s tem ovirajo potek Krebsovega cikla. Poleg tega se pri oksidaciji akonitaze sprostita Fe2+ in H2O2, ki tvorita proste nove proste radikale. ROS-i po mehanizmu ki še ni jasen, povzročajo razklop dihalne verige in sinteze ATP, torej tudi na ta način ovirajo energijski metabolizem celice. Zato da bi zmanjšali oksidativni stres v mitohondrijih, bi lahko vanje dodajali encimske ali ne encimske, naravne ali sintetične antioksidante. Ti zmanjšujejo koncentracijo ROS-ov v mitohondrijih in s tem zaščitijo pomembne biološke makromolekule. S tem, ko bi z antioksidanti povečali odpornost mitohondrija na oksidativni stres, bi zaščitili celico in celoten organizem.

== Maja Trifkovič: VPLIV MUTACIJ MITOHONDRIJSKE DNA NA DELOVANJE CELIC ==
Najpomembnejša naloga mitohondrijev je sintetiziranje ATP, ki ga celice potrebujejo za različne procese. Večina tega ATP se sintetizira pri procesu oksidativne fosforilacije, ki poteka s pomočjo proteinskih kompleksov na notranji membrani mitohondrija. Proteini, ki sestavljajo te komplekse, so kodirano tako z jedrno, kot tudi mitohondrijsko DNA (mtDNA). Ta je krožna in dvoverižna, poleg genov za že omenjenih 13 proteinov pa vsebuje še gene za 22 molekul tRNA in 2 molekuli rRNA. Najpogosteje mutacije mtDNA povzročijo nepravilnosti v zgradbi in delovanju enega izmed kompleksov elektronske prenašalne verige ali ATP sintaze, zaradi česar se sintetizira manj ATP, poveča koncentracija reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) in spremeni struktura mitohondrijev. Takšne spremembe najbolj vplivajo na celice, ki potrebujejo več energije (npr. mišične in živčne celice). Nekatere mutacije mtDNA se pojavijo pogosteje kot druge in povzročijo mitohondrijske bolezni, kot so na primer MELAS, MERRF, LHON, NARP in KSS, ki se večinoma izrazijo kot motnje v delovanju mišic (predvsem mišic oči in vek ali nenadzorovani gibi skeletnih mišic) ali živčnega sistema (največkrat optičnih živcev). Čeprav so bile številne mitohondrijske bolezni in mutacije, ki jih povzročajo, odkrite že pred nekaj časa in bile predmet številnih raziskav, nekaterih mehanizmov in posledic še ni mogoče natančno razložiti, prav tako za večino bolezni še ne poznamo zdravila.

== Anja Konjc: SUPERKOMPLEKSI ==
Elektronska prenašalna veriga je sestavljena iz petih kompleksov. Ti kompleksi se med seboj lahko združujejo v organizirane enote višjega reda, ki jim pravimo superkompleksi. Sestavljanje le-teh poteka v točno določenem vrstnem redu. Najprej se morajo namreč izgraditi posamezni kompleksi, šele potem lahko pride do njihovega združevanja. Pri tem sodelujejo posebni proteini (''ang''. »assembly factors«), ki imajo pomembno vlogo tudi pri stabilizaciji superkompleksov. Obstajata dve poti združitve kompleksov v superkomplekse. Razlikujeta se v vrstnem redu dodajanja podenot in po proteinih, ki pomagajo pri združevanju kompleksov. Še vedno ni čisto jasno, kaj je glavni razlog za nastanek superkompleksov, vendar se predvideva, da ima združevanje kompleksov več pozitivnih posledic. Tvorba superkompleksov naj bi izboljšala transport elektronov preko usmerjanja substrata. Poleg tega naj bi superkompleksi pomagali pri zmanjšanju proizvodnje reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS). Povezovanje v superkomplekse naj bi vplivalo tudi na komplekse same, saj bi se tako povečala stabilnost posameznih kompleksov. Med podenotami namreč obstajajo številne nekovalentne interakcije, kot je solni most. Proteini, ki pomagajo pri izgradnji kompleksov so povezani tudi s številnimi boleznimi. Če namreč pride do napak pri izgradnji posameznih kompleksov, to vpliva na potek oksidativne fosforilacije.

BIO2 Seminar 2019

2019-11-29T23:15:22Z

Anja Konjc: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
! ime in priimek !! poglavje !! naslov seminarja !! recenzent 1 !! recenzent 2 !! datum oddaje !! datum recenzije !! datum predstavitve
|-
! Tevž Levstek
| 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Glicinski transporterji kot terapevtske tarče] || Sašo Jakob || Andrej Špenko || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Ana Potočnik
| 12 || Fosfatidilserin kot signalna molekula || Marjeta Milostnik || Maja Mahorič || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Kim Glavič
| 12 || ATP kot signalna molekula živali in rastlin || Tina Logonder || Tim Nograšek || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Special:UserLogout&returnto=BIO2_Seminar_2019
! Nika Vegelj
| 12 || Formacija biofilma v povezavi s c-di-GMP signalizacijo. || Žan Fortuna || Nina Varda || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Tadej Uršič
| 12 || TLR signalizacija in njena vloga pri revmatičnih boleznih || Michelle Oletič || Tina Arnšek || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Natalija Razpotnik
| 12 || || Maša Gabrič || Timotej Zgonik || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Maja Kolar
| 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Biokemijska logika glikolize] || Tevž Levstek || Sašo Jakob || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Jure Povšin
| 14-15 || Vpliv dimetil fumarata na GAPDH in aerobno glikolizo pri modulaciji imunosti || Ana Potočnik || Marjeta Milostnik || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Manca Osolin
| 14-15 || Regulacija metabolizma glukoze in laktata v možganih || Kim Glavič || Tina Logonder || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Greta Junger
| 16 || Intermediati cikla citronske kisline: signalne molekule pod krinko || Nika Vegelj || Žan Fortuna || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Oskar Nemec
| 16 || Uravnavanje delovanja levkocitov z intermediati cikla citronske kisline || Tadej Uršič || Michelle Oletič || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Teo Nograšek
| 16 ||GPR91: Premikanje meja intermediatov Krebsovega cikla || Natalija Razpotnik || Maša Gabrič || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Ana Babnik
| 17 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Regulacija oksidacije maščobnih kislin v skeletnih mišicah pri aerobni vadbi] || Maja Kolar || Tevž Levstek || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Maša Andoljšek
| 17 || Dobre stare maščobe: Povezava med signalizacijo lipidov in življenjsko dobo || Jure Povšin || Ana Potočnik || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Nastja Feguš
| 17 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Večdimenzionalna vloga ketonskih teles] || Manca Osolin || Kim Glavič || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Vivian Nemanič
| 18 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Vpliv stresa in glukokortikoidov na prenos glutamata] || Greta Junger || Nika Vegelj || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
! Lena Trnovec
| 18 || Karbamoilacija: mehanizmi in posledice || Oskar Nemec || Tadej Uršič || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
! Sonja Gabrijelčič
| 18 || || Teo Nograšek || Natalija Razpotnik || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
| Maja Trifkovič || 19 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Vpliv mutacij mitohondrijske DNA na delovanje celic] || Ana Babnik || Maja Kolar || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Anja Konjc || 19 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Superkompleksi] || Maša Andoljšek || Jure Povšin || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Ana Vičič || 19 || Vloga mitohondrijev pri oksidativnem stresu || Nastja Feguš || Manca Osolin || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Andrej Špenko || 20 || || Vivian Nemanič || Greta Junger || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Maja Mahorič || 20 || Poti fiksacije ogljika pri avtotrofih || Lena Trnovec || Oskar Nemec || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Tim Nograšek || 20 || Tioredoksini in njihov vpliv pri sintezi ogljikovih hidratov || Sonja Gabrijelčič || Teo Nograšek || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Nina Varda || 21 || Biosinteza levkotriena B4 || Maja Trifkovič || Ana Babnik || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Tina Arnšek || 21 || || Anja Konjc || Maša Andoljšek || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Timotej Zgonik || 21 || Nadzor homeostaze lipidnega dvosloja || Ana Vičič || Nastja Feguš || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Sašo Jakob || 22 || || Andrej Špenko || Vivian Nemanič || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Marjeta Milostnik || 22 || || Maja Mahorič || Lena Trnovec || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Tina Logonder || 22 || Serin v rastlinah || Tim Nograšek || Sonja Gabrijelčič || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Žan Fortuna || 23 || || Nina Varda || Maja Trifkovič || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|-
| Michelle Oletič || 23 || || Tina Arnšek || Anja Konjc || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|-
| Maša Gabrič || 23 || || Timotej Zgonik || Ana Vičič || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|}

Dokončno razporeditev bom objavil naknadno.
*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2019|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Povzetki seminarjev 2019

2019-11-29T23:11:49Z

Anja Konjc:

== Kim Glavič: ATP KOT SIGNALNA MOLEKULA ŽIVALI IN RASTLIN ==

Molekula ATP ni le temeljni vir energije za mnoge procese v celici, temveč tudi signalna molekula v zunajceličnem matriksu živali in rastlin. ATP, kot velika polarna molekula, se iz celic rastlin izloči s pomočjo eksocitotskih veziklov ali ATP prenašalcev. Iz živalskih celic pa s pomočjo eksocitotskih veziklov, ATP prenašalcev ali koneksonskih hemikanalčkov. Ob povečanih koncentracijah molekul ATP v zunajceličnem matriksu se te vežejo na ustrezne P2- receptorje. Po sprostitvi nazaj v matriks pa njihovo koncentracijo uravnavajo ekto-nukleotidaze. Na splošno aktivacija P2- receptorjev povzroči povišanje koncentracije kalcijevih ionov in dušikovega monoksida v citosolu celice ter nastanek reaktivnih kisikovih zvrsti v zunajceličnem matriksu. Kalcijevi ioni, dušikov monoksid in reaktivne kisikove zvrsti so sekundarni obveščevalci, ki so ključni za fiziološki odziv celice. Rastlinska ATP-signalizacija ima pomembno vlogo pri časovni regulaciji kalitve cvetnega prahu, rasti pelodne cevke, nastanku koreninskih gomoljev in zaznavanju ter posledično izogibanju oviram pri rasti korenin. Živalska ATP-signalizacija sodeluje pri nastanku imunskega odziva, prenosu živčnih signalov, celični smrti in regulaciji mnogih drugih procesov.

== Tevž Levstek: GLICINSKI TRANSPORTERJI KOT TERAPEVTSKE TARČE ==

Glicin je proteinogena aminokislina, ki opravlja tudi funkcijo signalne molekule, natančneje nevrotransmiterja. Najdemo ga v dveh vrstah sinaps: glicinergičnih, kjer je glavni nevrotransmiter in glutamatergičnih, kjer ima pomožno vlogo, saj pomaga glutamatu pri signaliziranju. Koncentracije glicina v medceličnini regulirajo glicinski transporterji, ki jih delimo na GlyT1 in GlyT2. Glicinergična sinapsa je inhibitorna, kar pomeni, da če glicin aktivira svoj receptor, posinaptično celico hiperpolarizira (še poveča raven kloridnih ionov v njej). V tej sinapsi GlyT1 zmanjšuje koncentracijo glicina, saj ga transportira v okoliške glia celice. GlyT2 po drugi strani pa zvišuje koncentracijo glicina, saj zbira razpršen glicin, ga reciklira in omogoči ponovno usmerjeno pošiljanje proti receptorjem. V glutamatergičnih sinapsah pa je glicin skupaj z glutamatom ekscitatorna signalna molekula. Če se glicin veže na protein NMDA, ki je na posinaptični membrani, mu s pozitivno alosterično modifikacijo olajša vezavo z glutamatom, ki odpre kationski kanalček in depolarizira celico. Tu regulira koncentracijo glicina le GlyT1, ki jo zmanjšuje, GlyT2 pa tu ne nastopa. Razumevanje delovanja obeh sinaps nam lahko omogoči sintezo novih zdravil, ki bi bolj učinkovito delovala proti nekaterim duševnim boleznim kot so shizofrenija, alkoholizem, obsesivno-kompulzivna motnja in še precej drugim. Ta zdravila najpogosteje inhibirajo delovanje GlyT1 in imajo veliko uspešnost pri glodalcih. Pri ljudeh pa na žalost še ni bilo dobrih rezultatov in na razvoj tovrstnega zdravila še čakamo.

== Ana Potočnik: FOSFATIDILSERIN KOT SIGNALNA MOLEKULA ==

Fosfatidilserin je glicerofosfolipid in pomemben gradnik celičnih membran. V zdravih in živečih celicah se nahaja izključno na notranji, citosolni strani fosfolipidnega dvosloja. To asimetrično razporeditev s pomočjo ATP vzpostavlja aminofosfolipidna translokaza. Poleg svoje strukturne vloge ima fosfatidilserin tudi pomembno funkcijo v mnogih signalizacijskih poteh. Kot signalna molekula sodeluje pri koagulaciji krvi, fagocitozi apoptoznih celic, celični fuziji in odlaganju mineralov v osteoblaste. Ključna lastnost fosfatidilserina kot signalne molekule je njegova negativno nabita polarna glava. Preko nje fosfatidilserin z drugimi signalnimi molekulami ali receptorji tvori elektrostatske ali stereospecifične interakcije. Sodeluje pri signalizaciji znotraj celice in tudi pri ekstracelularni signalizaciji. Ko sodeluje pri ekstracelularni signalizaciji, se nahaja tudi na ekstracelularni strani fosfolipidnega dvosloja. Prehod fosfatidilserina iz notranje na zunanjo stran uravnavajo skramblaze. Te so lahko aktivirane s pomočjo kaspaz, ki so encimi, prisotni v apoptozni celici. Med molekulami, ki se vežejo na fosfatidilserin, so najbolj preučevane tiste, ki za vezavo nanj uporabijo Gla domeno. Laktahedrin, ki je na fagocit vezan preko integrinov αvβ3, z vezavo na fosfatidilserin apoptozno celico pritrdi k makrofagu. Gas6 in protein S, ki se prav tako vežeta na fosfatidilserin, pa preko TAM receptorjev sprožita tirozinkinazno aktivnost. Aktivira se Rac1 in polimerizacija aktina sproži fagocitozo apoptozne celice. Izpostavljenost fosfatidilserina na ekstracelularni strani celice je zadosten signal makrofagu, da fagocitira celico. To nakazuje na pomembno vlogo fosfatidilserina kot signalne molekule.

== Tadej Uršič: TLR SIGNALIZACIJA IN NJENA VLOGA PRI REVMATIČNIH BOLEZNIH ==

Prirojeni imunski sistem predstavlja prvi obrambni mehanizem organizma. Celice prirojenega imunskega sistema izražajo receptorje, ki zaznavajo določene gradnike bakterij in virusov in pa molekule, ki nastanejo pri poškodbah samega organizma. Ti receptorji sprožijo signalne poti ki privedejo do odgovora organizma na vdor patogena. Ena od skupin teh receptorjev so TLR (Toll-Like Receptors). So integralni proteini za katere je značilna z levcini bogata ektodomena za prepoznavanje ligandov in pa TIR domena za navzdoljno signalizacijo. TLR-ji prepoznavajo komponente membran (lipide, lipopolisaharide, lipoproteini, …) in nukleinske kisline bakterij in virusov in kot odgovor sprožijo vnetno reakcijo. Če je le ta normalno regulirana le ta pripomore pri odpravi vdirajočih patogenov v organizem. Če pa pride do napak v regulaciji to lahko privede do kroničnega vnetja tkiva. Pri revmatičnih obolenjih, kot so na primer revmatoidni artritis, putiki, lymski artritis, lupus… , so odkrili večjo izraženost TLR-jev, kar je lahko glavni razlog za njihov nastanek. Znanstveniki sedaj testirajo razne inhibitorje TLR-jev ali pa njihovih adaptornih proteinov, kot potencialna zdravila za te bolezni.

== Nika Vegelj : FORMACIJA BIOFILMA V POVEZAVI S C-DI-GMP MOLEKULO ==

Za bakterijo, kot tudi za vsa ostala živa bitja je nujno, da se prilagajajo na spreminjanje življenjskih pogojev, saj jim to omogoča preživetje. Molekula c-di-GMP je sekundarni sporočevalev pri baktrerijah, ki regulira različne celične procese. C-di-GMP so prvič odkrili kot alosterični aktivator celulozne sintetaze v bakteriji Gluconacetobacter xylinum. Pri patogenih organizmih molekula c-di-GMP kontrolira virulentni odgovor, ki je povezan s quorum sensingom, procesom s katerim bakterije med seboj komunicirajo. Koncentracija molekule c-di-GMP je v celici regulirana s pomočjo encimov fosfodiesteraz in gvanilat ciklaz. C-di-GMP je sintetizirana znotraj celice iz dveh molekul GTP s pomočjo encima digvanilat ciklaze, ki na aktivni strani nosi domeno GGDEF. Razpad molekule pa omogoča encim fosfodiesteraza, ki nosi domeno EAL, ta omogoča, da molekula razpade na linearni nukleotid pGpG. Glavni namen raziskovanja molekule c-di-GMP ter njene vloge pri tvorbi biofilma, je bil, da bi ugotovili nove metode, ki bi preprečile nastanek biofilma in tako pozdravile z njim povezane bolezni. Cistična fibroza je ena izmed najpogostejših bolezni v evropi, za njo pa je odgovorna bakterija pseudomonas aeruginosa, ki s tvorbo biofilma povzroča kronično obolenje, saj antibiotiki ne delujejo direktno na biofilm. C-di-GMP je sekundarni sporočevalec pri bakterijah, ne pa tudi pri evkariontih in arhejah. Prav zato je tako zanimiv za znanstvenike, saj lahko z razvojem zdravil, ki bi vplivale na molekulo, razvili potencialna zdravila za kronične bolezni.

== Maja Kolar: BIOKEMIJSKA LOGIKA GLIKOLIZE ==
Čeprav glikoliza sprva zgleda zapletena in naključna, je v smislu zadovoljevanja vsem biokemijskim zahtevam ena najenostavnejših metabolnih poti. Pri načrtovanju poti se je treba zavedati kompromisov za zadovoljevanje različnim omejitvam, zato lahko skozi analizo vseh teoretično možnih poti ugotovimo katera je celici najugodnejša. Termodinamske omejitve vključujejo Gibbsovo prosto entalpijo reakcij, ki jo lahko izračunamo iz redoks potencialov in ugotovimo katere poti v metabolizmu so ender-/eksergonske. Pri encimskih mehanizmih moramo upoštevati aktivacijske skupine, ki pa lahko povečajo reaktivnost intermediatov, kar spada pod fizikalno-kemijske lastnosti intermediatov. Med njih štejemo tudi prepustnost skozi membrano, afiniteto do encimov in toksičnost. Slednjo celica izniči z izogibanjem reakcijskim potem ali sistemi endogene detoksifikacije kot je sistem glioksalaz za intermediat metilglioksal. Pri glikolizi se jim celica izogne z delitvijo elektronske prerazporeditve, kjer po podobnih poteh ne nastopajo toksične spojine. Preko energij vezi in elektronskih prerazporeditev lahko določimo kje na glikolizni poti bo nastajal ATP. Najobsežnejše zastopana je glikoliza Embden-Meyerhof-Parnas, vendar njene naravne alternative dokazujejo, da so skozi evolucijo različni organizmi kot so anaerobne/aerobne bakterije, termofili obravnavali določene zahteve kot bolj ali manj pomembne. Znanje različnih bioloških zahtev pa lahko prenesemo na metabolni inženiring, kjer iščemo učinkovite rešitve za proizvodnjo industrijsko iskanih metabolitov.

== Jure Povšin: VPLIV DIMETIL FUMARATA NA GAPDH IN AEROBNO GLIKOLIZO PRI MODULACIJI IMUNOSTI ==
Aktivirane imunske celice se po Warburgovi hipotezi osredotočijo na izvajanje aerobne glikolize namesto na izvajanje oksidativne fosforilacije, s čimer predstavljajo potencialno terapevtsko tarčo pri avtoimunski boleznih. Dimetil fumarat (DMF), je derivat od intermediarnega fumarata iz Krebsovega cikla. DMF je ester fumarne kisline ter imunomodulacijsko zdravilo, ki se uporablja za zdravljenje multiple skleroze in luskavice. Čeprav njegov terapevtski mehanizem zaenkrat ostaja še negotov, je znano, da DMF kovalentno spreminja ostanke cisteina v procesu, imenovanem succination. Preiskovanje aktivnost DMF-ja dodatno zapleta njegova hidroliza in vivo do monometil fumarata (MMF), ki lahko tudi sam modulira imunski odziv in vnetje tkiv. Kornberg in sodelavci so ugotovili , da DMF pri procesu, imenovanem succination, inaktivira katalitični cistein glikolitičnega encima gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) pri miših in ljudeh, tako in vitro kot in vivo. S tem navzdol uravnava aerobno glikolizo v aktiviranih mieloidnih in limfoidnih celicah, kar povrzoča njene protivnetne učinke. Rezultati znanstvenikov zagotavljajo mehanski vpogled v imunsko modulacijo z DMF in predstavljajo dokaz koncepta, da je aerobna glikoliza lahko zelo pomembna terapevtska tarča v avtoimunosti in da nas lahko nadaljnje raziskovanje pripelje do dolgo iskanih zdravil proti hudim avtoimunim boleznim.

== Manca Osolin: REGULACIJA METABOLIZMA GLUKOZE IN LAKTATA V MOŽGANIH ==
Aerobna glikoliza je proces razgradnje glukoze do laktata v prisotnosti kisika. Proces aerobne glikolize je med drugim značilen tudi za astrocite, posebne celice v možganih. Ker imajo nevroni večjo potrebo po energiji kot astrociti, vzdržujejo visok nivo oksidativnega metabolizma, medtem ko astrociti favorizirajo aerobno glikolizo in omejujejo oksidativno aktivnost. Številne raziskave so pokazale, da astrociti laktat, ki nastane v procesu aerobne glikolize, posredujejo nevronom. Ta koncept se imenuje ANLS hipoteza. Nevroni morajo vzdrževati ravnotežje med pentoza fosfatno potjo in glikolitično potjo, da dosežejo potrebe po energiji in da vzdržujejo antioksidativni potencial. Zato uporaba laktata kot oksidativnega substrata lahko zagotavlja ugoden način za nevrone, da proizvedejo visoke količine ATP med zaobidenjem glikolitične poti, saj tako varčujejo glukozo za pentoza fosfatno pot. Aerobna glikoliza, ki poteka v astrocitih in katere končni produkt je laktat, ima pomembno vlogo pri vzdrževanju nevronske aktivnosti. Laktat se prenese iz astrocitov v nevrone, da zadosti energijskim potrebam nevronov, prav tako pa laktat deluje tudi kot signalna molekula, ki regulira nevronske funkcije, kot so vzdražnost in plastičnost nevronov ter okrepitev spomina. V možganih se nahaja tudi posebna vrsta nevronov, ki na različne mehanizme zaznavajo spremembe koncentracije glukoze, kar jim omogoča prilagajanje na zunanje spremembe preko depolarizacije.

== Greta Junger: INTERMEDIATI CIKLA CITRONSKE KISLINE: SIGNALNE MOLEKULE POD KRINKO ==
Cikel citronske kisline je centralna metabolna pot, pri kateri se energetsko bogata molekula acetil-CoA oksidira ter svoje elektrone odda prenašalcem. Oksidacija je postopna in poteka preko več intermediatov. Za njih je dolgo časa veljalo, da je to njihova edina vloga, vendar pa se je ta domneva izkazala za napačno. Večina intermediatov cikla citronske kisline ima namreč večstransko vlogo, saj sodelujejo tako pri signalizaciji kot tudi regulaciji različnih procesov. Za delovanje α ketoglutarat-odvisnih dioksigenaz (2-OGDO) je nujno potreben α ketoglutarat. Zaradi podobne kemijske zgradbe se na 2-OGDO lahko vežeta tudi sukcinat in fumarat, ki pa encima ne aktivirata, pač pa delujeta kot kompetitivna inhibitorja. Kot taka lahko v celici ustvarita pseudo-hipoksično stanje ali pa posredno vplivata na spremembo demetilacije DNA in histonov. Poleg omenjenega imajo nekateri intermediati ključno vlogo tudi pri post-translacijski modifikaciji proteinov, natančneje acetilaciji, sukcinaciji in sukcinilaciji Lys in Cys ostankov. Za sukcinat in α ketoglutarat obstajata specifična GPC-receptorja - SUCNR1 in OXGR1. Fiziološki pomen SUCNR1, ki se med drugim nahaja v ledvicah, srčnem tkivu in očeh, je bolje raziskan od OXGR1O. Nedolgo nazaj so pojasnili tudi vlogo sukcinata pri nastanku reaktivnih kisikovih zvrsti in obratnega toka elektronov.

== Oskar Nemec: Uravnavanje delovanja levkocitov z intermediati cikla citronske kisline ==
Glede na to, da je cikel citronske kisline (TCA) osnovno vozlišče (energijskega) metabolizma celic, je smiselno sklepati, da je aktivacija celic naravne imunosti in njihova regulacija s tem procesom povezana. Imunski odziv je namreč energijsko potraten proces in v veliki meri odvisen od mitohondrijskega metabolizma. Izkazalo se je, da intermediati TCA, kot so sukcinat, itakonat, citrat in fumarat, posredujejo ali uravnavajo pomembne funkcije mieloidnih celic (levkocitov) med okužbo in vnetjem. Aktivacija levkocitov, ki se zgodi v sklopu vnetnega procesa z vnetnimi dejavniki vodi v preoblikovanje cikla in kopičenje teh intermediatov v celici. Sukcinat ima vnetni učinek, ker povzroči stabilizacijo HIF-1 (hypoxia inducible factor 1), povečanje količine mROS (reaktivne kisikove zvrsti mitohondrija), postranslacijske modifikacije proteinov z sukcinilacijo in signalizacijo preko z G-proteinom sklopljenimi receptorji (klasična kaskada). Citrat prav tako spodbuja vnetni odziv, saj se zaradi njega sintetizirajo reaktivne kisikove in dušikove zvrsti ter prostaglandin E2. Itakonat pa ima protivnetno vlogo, saj zavira SDH in omeji vnetne učinke sukcinata, sposoben je pa tudi, v nasprotju s sukcinatom, sam ubiti patogene. Vloga fumarata v vnetnem procesu ni dokončno pojasnjena, znano pa je da povzroča med drugimi zmanjšanje količine ROS in tako zmanjša vnetni odziv.

== Teo Nograšek: GPR91: PREMIKANJE MEJA INTERMEDIATOV KREBSOVEGA CIKLA ==
Sukcinat je najbolj poznan kot intermediat Krebsovega cikla, vendar so novejše raziskave pokazale, da ima tudi pomembno funkcijo kot signalna molekula. Celice v hipoksiji sintetizirajo in izločajo sukcinat, ki se nato veže na receptor GPR91. GPR91 je najden v celicah jeter, krvnih celicah, maščobnih celicah, ledvičnih celicah in celicah mrežnice. V jetrih signal iz receptorja GPR91 vpliva na Itove celice, ki so zadolžene za izločanje kolagena pri poškodbi jeter. V mrežnici je GPR91 izražen v nevronskih celicah ganglijev in njegova aktivacija povzroči neovaskularizacijo. Aktivacija GPR91 v ledvicah povzroči povišanje krvnega tlaka preko renina. Povišan krvni tlak lahko povzroči hipertrofijo, na nastanek hipertrofije pa vpliva tudi sama vezava med sukcinatom in receptorjem GPR91 na srčnih mišičnih celicah, kar povzroči transkripcijo genov za nastanek hipertrofije. Poleg tega visoka koncentracija sukcinata povzroči apoptozo srčnih celic. Raziskave na področju zaviranja delovanja GPR91 bi lahko omilile zaplete, ki nastanejo pri transplantaciji, ker je bilo odkrito, da imajo pacienti po transplantaciji povišano količino sukcinata v krvi, kar vodi do zapletov.

== Ana Babnik: REGULACIJA OKSIDACIJE MAŠČOBNIH KISLIN V SKELETNIH MIŠICAH PRI AEROBNI VADBI ==
Krčenje mišic pri aerobni vadbi zahteva dodatno energijo, ki jo lahko celice pridobijo iz znotrajceličnih in telesnih virov glukoze in maščobnih kislin. Na izbiro substrata, ki se bo v večji meri porabljal za končno sintezo ATP, vplivata intenzivnost in trajanje vadbe. Oksidacija maščobnih kislin je regulirana z mnogimi prepletenimi signalnimi potmi in regulacijskimi mehanizmi, kateri pa še niso v celoti poznani. Glavni regulator vnosa maščobnih kislin v celico je CD1/SR-B2 (receptor čistilec B2), ki s svojo translokacijo iz veziklov na membrano in interakcijo s FABP olajša vnos maščobnih kislin v celico. Naslednja pomembna točka je prenos substratov v celico v obliki acil-CoA, pri čimer sodeluje CPT1, ki za prenos potrebuje prosti karnitin, na njegovo delovanje pa vpliva mnogo regulatorjev. Sama regulacija delovanja CPT1 pa je povezana tudi s celično homeostazo acetil-CoA in kot že omenjenega prostega karnitina, saj se ta pri presežkih v količini acetil-CoA porablja za nastanek acetilkarnitina. Regulatorni mehanizmi β-oksidacije dokazujejo, da se pri daljši oziroma vadbi z nižjo intenziteto za sintezo acetil-CoA (in nadaljnjo sintezo ATP) porabljajo predvsem maščobne kisline, medtem ko se pri bolj intenzivni vadbi porablja glukoza.

== Nastja Feguš: VEČDIMENZIONALNA VLOGA KETONSKIH TELES ==
Aceton, acetoacetat in D-β-hidroksibutirat so ketonska telesa. Bakterije, arheje in evkarionti jih uporabljamo kot alternativni vir energije. Pri sesalcih so ketonska telesa pomemben alternativni vir energije za možgane, srce in skeletne mišice. Ketosnka telesa na dan prispevajo med 5 % in 20 % energije. Tvorba ketonskih teles primarno poteka v jetrih, saj imajo le jetra in celice kolonskega epitela v črevesju izražen encim, ki katalizira prvo reakcijo nastanka ketonskih teles, vendar obstajajo tudi mehanizmi nehepatične sinteze ketonskih teles. Usoda ketonskih teles ni vedno oksidacija oziroma pretvorba v acetil-CoA, lahko se pretvorijo v različne intermediate, ki se lahko uporabijo v biosintezi sterolov in maščobnih kislin. Ketonska telesa so zelo dobri antioksidanti, njihova funkcija je zelo pomembna v možganih, kjer znižajo stopnjo celičnih poškodb nevronov. D-β-hidroksibutirat je epigenetski modifikator, saj direktno modificira lizinske ostanke histonov. D-β-hidroksibutirat je tudi pomembna signalna molekula. Je direkten inhibitor encimov razreda HDACs. Inhibicija teh encimov poveča acetilacijo encimov in inducira izražanje genov, ki zmanjšajo oksidativni stres. Prav tako se veže na dva različna z G proteinom povezana receptorja, preko te signalne poti zmanjša lipolizo, upočasni srčni utrip in zmanjša porabo energije.

== Maša Andoljšek: DOBRE STARE MAŠČOBE: POVEZAVA MED SIGNALIZACIJO LIPIDOV IN ŽIVLJENJSKO DOBO ==
Lipidi kot signalne molekule ali transkripcijski faktorji sodelujejo v procesih, ki podaljšujejo življenje. Večina raziskav poteka na glisti ''Caenorhabditis elegans'', saj ima kratko življenjsko dobo in se lahko genetsko manipulira. Obstajajo tri metode podaljševanja življenja, ki delujejo na več vrstah organizmov. Prva je inzulin signalirajoča pot, ki s pomočjo dafakronske kisline, holesterola in jedrnih receptorjev DAF-12 ter DAF-16, regulira življenjsko dobo in sproža avtofagijo. Drug način je dietna restrikcija, ki pa lahko poteka preko mutacije eat-2, preko razredčevanja hrane in preko občasnega postenja. Pri tem načinu sodeluje DAF-16, NHR-8 in NHR-64. Dietna restrikcija ima pozitivne vplive na zdravje. Zadnji način podaljšanja življenjske dobe je izrez signalov zarodne plasti, kar promovira lipolizo, metabolizem lipidov itd. Te raziskave kažejo, da je možna uporaba lipidov tudi za zdravljenje različnih bolezni, za kar pa se nekateri že uporabljajo. Pomembna je tudi akumulacija različnih molekul, na primer oleinske kisline pri staranju. Veda, ki se ukvarja s tem je lipodomika, ki preučuje metabolne poti lipidov in njihove strukture. Pri dalj živečih organizmih so strukturni lipidi v nasičenem stanju, lipidi v energijskih zalogah pa v nenasičenem stanju.

== Vivian Nemanič: VPLIV STRESA IN GLUKOKORTIKOIDOV NA PRENOS GLUTAMATA ==
Stres lahko opišemo kot nespecifičen odziv telesa na nek stresor, ki je lahko dogodek ali izkušnja, ki onemogoči posamezniku, da se bi odzval. Akuten in kroničen stres in s stresom povezana sprostitev glukokortikoidov lahko sproži spremembe v prefrontalnemu korteksu in v hipokampusu, saj povzroča spremembe v glutamatnih nevrotransmitorjih. Stres tudi dokazano povzroča kompleksne strukturne spremembe v različnih možganskih regijah. Glede na glutamatergično sinapso, ima lahko stres vpliv na plastičnost in sicer v pozitivnem smislu, da izboljša delovanje možganov, ali pa v slabem smislu, ko lahko vodi do psiholoških motenj. Vemo tudi to, da so s stresom povezane spremembe v različnih aspektih povezane z nevrotransmisijo oz. prenosom glutamata in z vlogo glukokortikoidov. Akutni stres ima generalni učinek na povečanje glutamatergične nevrotransmisije v prefrontalnem korteksu in drugih regijah, ki so povezane s spominom in učenjem ter vpliv na genimočne in negenomične spremembe na različnih straneh tridelne sinapse. Presinaptično sproščanje glutamata je povečano, če sodelujejo mineralokortikoidni in glukokortikoidni receptorji, saj ga oni regulirajo. Na postsinaptični strani akutni stres poveča ekspresijo in gostoto ionotropnih glutamat receptorjev (NDMA), kar vodi v sinaptično potenciranje. V nedavnih raziskavah poskušajo razumeti kako bi lahko mehanizmi, ki kontrolirajo funkcije glutamatne sinapse, lahko pomagali pri razvoju zdravil za različne duševne motnje.

== Lena Trnovec: KARBAMOILACIJA: MEHANIZMI IN POSLEDICE ==
Sečnina že več desetletij velja za relativno nestrupeno spojino. Že nekaj časa pa se nabirajo dokazi, ki podpirajo dejstvo, da post-translacijska modifikacija karbamoilacija, ki je neločljivo povezana s kopičenjem sečnine in odpovedjo ledvic, pripelje do mnogih bioloških in kliničnih posledic. Karbamoilacija proteinov je neencimska post-translacijska modifikacija, ki veže prosto aminsko skupino mnogih proteinov z izociansko kislino. Ta nastane pri disociaciji sečnine ali iz tiocianata, katerega razgradnjo usmerjajo mieloperoksidaze. Glede na vrsto spremenjene molekule (na primer kolagen, albumin, lipoprotein z nizko gostoto ali lipoprotein z visoko gostoto), ima karbamoilacija različne patofiziološke učinke. Karbamoilirani proteini naj bi bili povezani z aterosklerozo, presnovo maščob, motnjami imunskega sistema (kot je inhibicija klasične poti aktivacije komplementa, inhibicija od komplementa odvisne celične citotoksičnosti rituksimaba, zmanjšan oksidativni izbruh nevtrofilcev) in fibrozo jeter. Tako v in vitro kot in vivo raziskavah ima karbamoilacija škodljive posledice na vseh nivojih fiziologije, njena povezava z vnetjem in uremijo pa razsvetli faktorje tveganja pri bolnikih s kronično odpovedjo ledvic. Zmanjšanje stopnje karbamoilacije bi tako lahko bil zanimiv terapevtski pristop k zmanjšanju posledic bolezni ledvic. Obstaja mnogo možnosti za zmanjšanje stopnje karbamoilacije – prehranjevalni pristop (aminokislinska dopolnila), prilagoditev dialize in protivnetne terapije.

== Ana Vičič: VLOGA MITOHONDRIJA V TOKSIČNEM OKSIDATIVNEM STRESU ==
Do oksidativnega stresa v mitohondrijih pride, ko koncentracija oksidativnih zvrsti preseže kapaciteto mitohondrijskih antioksidativnih sistemov. V dihalni verigi nastajajo zelo reaktivni ROS-i, ki hitro po nastanku reagirajo z bližnjimi biološkimi makromolekulami in jih pri tem poškodujejo. Ker so biološke makromolekule, kot so mtDNA, kardiolipin, akonitaza, in UCP2, ključne za pravilno delovanje celice, imajo njihove poškodbe velike posledice, ki se lahko akumulirajo in nato odražajo v celični nekrozi in na nivoju človeškega organizma v nevrogenerativnih boleznih in staranju. Oksidacija mtDNA lahko vodi do napak v genskem zapisu za proteine in nukleinske kisline, ključne za delovanje celičnega dihanja. Oksidacija kardiolipina lahko sproži signalizacijo za celično apoptozo. ROS-i deaktivirajo encim akonitazo in s tem ovirajo potek Krebsovega cikla. Poleg tega se pri oksidaciji akonitaze sprostita Fe2+ in H2O2, ki tvorita proste nove proste radikale. ROS-i po mehanizmu ki še ni jasen, povzročajo razklop dihalne verige in sinteze ATP, torej tudi na ta način ovirajo energijski metabolizem celice. Zato da bi zmanjšali oksidativni stres v mitohondrijih, bi lahko vanje dodajali encimske ali ne encimske, naravne ali sintetične antioksidante. Ti zmanjšujejo koncentracijo ROS-ov v mitohondrijih in s tem zaščitijo pomembne biološke makromolekule. S tem, ko bi z antioksidanti povečali odpornost mitohondrija na oksidativni stres, bi zaščitili celico in celoten organizem.

== Maja Trifkovič: VPLIV MUTACIJ MITOHONDRIJSKE DNA NA DELOVANJE CELIC ==
Najpomembnejša naloga mitohondrijev je sintetiziranje ATP, ki ga celice potrebujejo za različne procese. Večina tega ATP se sintetizira pri procesu oksidativne fosforilacije, ki poteka s pomočjo proteinskih kompleksov na notranji membrani mitohondrija. Proteini, ki sestavljajo te komplekse, so kodirano tako z jedrno, kot tudi mitohondrijsko DNA (mtDNA). Ta je krožna in dvoverižna, poleg genov za že omenjenih 13 proteinov pa vsebuje še gene za 22 molekul tRNA in 2 molekuli rRNA. Najpogosteje mutacije mtDNA povzročijo nepravilnosti v zgradbi in delovanju enega izmed kompleksov elektronske prenašalne verige ali ATP sintaze, zaradi česar se sintetizira manj ATP, poveča koncentracija reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) in spremeni struktura mitohondrijev. Takšne spremembe najbolj vplivajo na celice, ki potrebujejo več energije (npr. mišične in živčne celice). Nekatere mutacije mtDNA se pojavijo pogosteje kot druge in povzročijo mitohondrijske bolezni, kot so na primer MELAS, MERRF, LHON, NARP in KSS, ki se večinoma izrazijo kot motnje v delovanju mišic (predvsem mišic oči in vek ali nenadzorovani gibi skeletnih mišic) ali živčnega sistema (največkrat optičnih živcev). Čeprav so bile številne mitohondrijske bolezni in mutacije, ki jih povzročajo, odkrite že pred nekaj časa in bile predmet številnih raziskav, nekaterih mehanizmov in posledic še ni mogoče natančno razložiti, prav tako za večino bolezni še ne poznamo zdravila.

== Anja Konjc: SUPERKOMPLEKSI ==
Elektronska prenašalna veriga je sestavljena iz petih kompleksov. Ti kompleksi se med seboj lahko združujejo v organizirane enote višjega reda, ki jim pravimo superkompleksi. Sestavljanje le-teh poteka v točno določenem vrstnem redu. Najprej se morajo namreč izgraditi posamezni kompleksi, šele potem lahko pride do njihovega združevanja. Pri tem sodelujejo posebni proteini (ang. »assembly proteins«), ki imajo pomembno vlogo tudi pri stabilizaciji superkompleksov. Obstajata dve poti združitve kompleksov v superkomplekse. Razlikujeta se v vrstnem redu dodajanja podenot in po proteinih, ki pomagajo pri združevanju kompleksov. Še vedno ni čisto jasno, kaj je glavni razlog za nastanek superkompleksov, vendar se predvideva, da ima združevanje kompleksov več pozitivnih posledic. Tvorba superkompleksov naj bi izboljšala transport elektronov preko usmerjanja substrata. Poleg tega naj bi superkompleksi pomagali pri zmanjšanju proizvodnje reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS). Povezovanje v superkomplekse naj bi vplivalo tudi na komplekse same, saj bi se tako povečala stabilnost posameznih kompleksov. Med podenotami namreč obstajajo številne nekovalentne interakcije, kot je solni most. Proteini, ki pomagajo pri izgradnji kompleksov so povezani tudi s številnimi boleznimi. Če namreč pride do napak pri izgradnji posameznih kompleksov, to vpliva na potek oksidativne fosforilacije.

TBK2017 Povzetki seminarjev

2019-02-28T21:22:15Z

Anja Konjc:

[[TBK2017-seminar|Nazaj na osnovno stran]]
===Ana Scott: Nukleaza, ki povzroči partanatos oziroma od PARP-1 odvisno celično smrt===

Partanatos je ena izmed vrst celične smrti, ki nastopi zaradi prevelike aktivnosti poli(ADP-riboza) polimeraze 1 (PARP-1) v jedru. Pogost je v primeru možganske kapi, infarkta in nevrodegenerativnih boleznih, zaradi česar bi boljše poznavanje samega procesa omogočilo razvoj novih načinov zdravljenja teh obolenj. V predhodnih raziskavah so ugotovili, da partanatos nastopi, ko molekule poli-ADP-riboze, ki jih PARP-1 sintetizira, preidejo iz jedra v citosol, kjer aktivirajo premestitev indukcijskega faktorja apoptoze (AIF) iz mitohondrijev v jedro. Temu sledi razrez DNA. Nukleaza, ki povzroči razrez DNA, je bila do nedavnega manjkajoči člen v partanatosu. Skupini raziskovalcev je uspelo odkriti, da je iskana nukleaza inhibitorni dejavnik migracije makrofagov (MIF). Pokazali so, da se med partanatosom MIF veže na AIF in se skupaj z njim premesti v jedro, kjer povzroči fragmentacijo DNA. Inhibicija nukleazne aktivnosti MIF se je v modelu možganske kapi pri miših odrazila v 75-odstotnem zmanjšanju volumna prizadetega tkiva, pospešeno pa je bilo tudi okrevanje. Rezultati raziskave odpirajo potencialne možnosti za zdravljenje akutnih in kroničnih nevroloških bolezni, v katerih nastopi partanatos.

===Nina Varda: Kompleksne molekule, ki se zvijajo kot proteini, lahko nastanejo spontano===

Proteini in nukleinske kisline so ključne za delovanje živih organizmov. Zanj je značilno, da se zvijejo v posebne konformacije, ki določajo njihove funkcije. A načrt po katerem bi se makromolekule zvijale še ni bil odkrit. Tako se je razvilo področje raziskovanja foldamerov (sintetičnih oligomerov, ki se zvijajo v sekundarne in terciarne strukture npr. v vijačnice in plošče). Otto in sodelavci so v svoji raziskavi predstavili kompleksno molekulo, ki lahko nastane spontano. Iz gradnika, ki ga sestavljata aminokislinska in adeninska podenota, so pridobili makrocikel iz 15 gradnikov. 15mer se je tako v kristalni obliki, kot tudi v raztopini zvil, zaradi nekovalentnih interakcij med gradniki. Najbolj opazen strukturni motiv je nalaganje aromatskih obročev v kupe (sekundarne strukture). Ena molekula se zvije v 5 kupov, pri čemer je vsak sestavljen iz treh fenilnih obročev in dveh adeninskih obročev. Ker so kupi med sabo orientirani, je prisotna tudi terciarna struktura. Pri nekaterih foldamerih so že bile odkrite katalitske in inhibitorne lastnosti. Ker so foldameri, ki so zaradi svoje terciarne zgradbe relativno kompleksni, sposobni spontanega nastanka, je možno, da so se pojavili in imeli pomembno vlogo že v zgodnjih fazah nastanka življenja.

===Anja Konjc: Nanodelci v boju proti raku===

Nanodelci postajajo čedalje pomembnejši pri razvoju zdravil, saj imajo določene posebnosti, ki omogočajo tarčno usmerjanje zdravil in zmanjševanje njihovih stranskih učinkov (npr. pri kemoterapiji). Vendar so predhodne raziskave pokazale določene pomanjkljivosti. S sintezo posebnega ščita, imenovanega proteinski koronski ščit (PCS), so raziskovalci rešili te omejitve. Ugotovili so namreč, da PCS zmanjša interakcije nanodelcev s serumskimi proteini in omogoči, da makrofagi teh delcev ne fagocitirajo. Tako nanodelci ostanejo več časa v krvi in prenesejo zdravila na ciljno mesto (npr. v tumorje). Nanodelci so namreč sposobni prenašati sorazmerno velike količine molekul (npr. zdravil), ki jih vstavimo v njihove pore. Znanstveniki so PCS sintetizirali tako, da so nanodelce prevlekli s posebnimi proteini. Obnašanje tako prevlečenih nanodelcev so opazovali z različnimi poskusi. Ko so mišim vbrizgali različne nanodelce, so ugotovili, da so se v tumorjih najbolj nakopičili tisti s PCS. To je dokazalo hipotezo, da lahko ti nanodelci uspešno prinesejo zdravila v tumorje, ne da bi pri tem prišlo do imunskega odziva, torej fagocitoze delcev. Zato bodo tudi v prihodnje nanodelci s PCS imeli pomembno vlogo pri zdravljenju različnih obolenj, ne le rakavih, saj povečujejo učinkovitost zdravljenja.

TBK2019-seminar

2019-02-21T17:18:23Z

Anja Konjc: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Maša Andoljšek||Zrele človeške celice lahko spremenijo svojo funkcijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190213132309.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Isidora Stevanoska|| Tina Arnšek|| Lena Trnovec
|-
| Maja Trifkovič||naslov||povezava do novice||21.02.||22.02.||25.02.|| Manca Osolin|| Tadej Uršič|| Ana Vičič
|-
| Teo Nograšek||Kako se proteini vgradijo v celično membrano||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Ajda Košorok|| Ana Potočnik|| Maša Gabrič
|-
| Maja Kolar||Vpliv aksonskih mitohondrijev v možganih na prenos impulzov ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181127110959.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Hana Zajc|| Mateja Milošević|| Laura Unuk
|-
| Nina Varda||Kompleksne molekule, ki se zvijajo kot proteini, lahko nastanejo spontano||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190117110824.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Katja Benčuk|| Nastja Feguš|| Sašo Jakob
|-
| Anja Konjc||Nanodelci v boju proti raku||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190117092550.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Tina Logonder|| Maja Mahorič|| Alliana Kolar
|-
| Timotej Zgonik||Vijačna struktura v biomolekulah se lahko razvije na dokaj preprost način||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190124095112.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Špela Sotlar|| Nika Banovšek|| Nika Ramšak
|-
| Ela Sabadin||||||05.03.||08.03.||11.03.|| Maša Andoljšek|| Greta Junger|| Tim Nograšek
|-
| Kim Glavič||||||05.03.||08.03.||11.03.|| Maja Trifkovič|| Isidora Stevanoska|| Žan Fortuna
|-
| Oskar Nemec||Shizofrenija je povezana z nenavadnim imunskim odzivom na virus Epstein-Barr||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190109090911.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Teo Nograšek|| Manca Osolin|| Jure Povšin
|-
| Vivian Nemanič||||||05.03.||08.03.||11.03.|| Maja Kolar|| Ajda Košorok|| Jernej Kastelic
|-
| Srna Anastasovska||||||12.03.||15.03.||18.03.|| Nina Varda|| Hana Zajc|| Tina Arnšek
|-
| Karmen Ferjan||||||12.03.||15.03.||18.03.|| Anja Konjc|| Katja Benčuk|| Tadej Uršič
|-
| Ana Babnik||||||12.03.||15.03.||18.03.|| Timotej Zgonik|| Tina Logonder|| Ana Potočnik
|-
| Aleksandra Rauter||||||12.03.||15.03.||18.03.|| Ela Sabadin|| Špela Sotlar|| Mateja Milošević
|-
| Nika Vegelj||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Kim Glavič|| Maša Andoljšek|| Nastja Feguš
|-
| Adela Šajn||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Oskar Nemec|| Maja Trifkovič|| Maja Mahorič
|-
| Michelle Oletič||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Vivian Nemanič|| Teo Nograšek|| Nika Banovšek
|-
| Tevž Levstek||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Srna Anastasovska|| Maja Kolar|| Greta Junger
|-
| Matevž Drnovšek||||||26.03.||29.03.||01.04.|| Karmen Ferjan|| Nina Varda|| Isidora Stevanoska
|-
| Marjeta Milostnik||||||26.03.||29.03.||01.04.|| Ana Babnik|| Anja Konjc|| Manca Osolin
|-
| Lena Trnovec||||||26.03.||29.03.||01.04.|| Aleksandra Rauter|| Timotej Zgonik|| Ajda Košorok
|-
| Ana Vičič||Great white shark genome decoded|| https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190218153238.htm ||26.03.||29.03.||01.04.|| Nika Vegelj|| Ela Sabadin|| Hana Zajc
|-
| Maša Gabrič||||||02.04.||05.04.||08.04.|| Adela Šajn|| Kim Glavič|| Katja Benčuk
|-
| Laura Unuk||||||02.04.||05.04.||08.04.|| Michelle Oletič|| Oskar Nemec|| Tina Logonder
|-
| Sašo Jakob||Terapija pljučnih bolezni z vdihavanjem mRNA ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190104104032.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Tevž Levstek|| Vivian Nemanič|| Špela Sotlar
|-
| Alliana Kolar||||||02.04.||05.04.||08.04.|| Matevž Drnovšek|| Srna Anastasovska|| Maša Andoljšek
|-
| Nika Ramšak||||||09.04.||12.04.||15.04.|| Marjeta Milostnik|| Karmen Ferjan|| Maja Trifkovič
|-
| Tim Nograšek||||||09.04.||12.04.||15.04.|| Lena Trnovec|| Ana Babnik|| Teo Nograšek
|-
| Žan Fortuna||||||09.04.||12.04.||15.04.|| Ana Vičič|| Aleksandra Rauter|| Maja Kolar
|-
| Jure Povšin||||||09.04.||12.04.||15.04.|| Maša Gabrič|| Nika Vegelj|| Nina Varda
|-
| Jernej Kastelic||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Laura Unuk|| Adela Šajn|| Anja Konjc
|-
| Tina Arnšek||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Sašo Jakob|| Michelle Oletič|| Timotej Zgonik
|-
| Tadej Uršič||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Alliana Kolar|| Tevž Levstek|| Ela Sabadin
|-
| Ana Potočnik||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Nika Ramšak|| Matevž Drnovšek|| Kim Glavič
|-
| Mateja Milošević||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Tim Nograšek|| Marjeta Milostnik|| Oskar Nemec
|-
| Nastja Feguš||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Žan Fortuna|| Lena Trnovec|| Vivian Nemanič
|-
| Maja Mahorič||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Jure Povšin|| Ana Vičič|| Srna Anastasovska
|-
| Nika Banovšek||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Jernej Kastelic|| Maša Gabrič|| Karmen Ferjan
|-
| Greta Junger||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Tina Arnšek|| Laura Unuk|| Ana Babnik
|-
| Isidora Stevanoska||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Tadej Uršič|| Sašo Jakob|| Aleksandra Rauter
|-
| Manca Osolin||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Ana Potočnik|| Alliana Kolar|| Nika Vegelj
|-
| Ajda Košorok||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Mateja Milošević|| Nika Ramšak|| Adela Šajn
|-
| Hana Zajc||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Nastja Feguš|| Tim Nograšek|| Michelle Oletič
|-
| Katja Benčuk||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Maja Mahorič|| Žan Fortuna|| Tevž Levstek
|-
| Tina Logonder||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Nika Banovšek|| Jure Povšin|| Matevž Drnovšek
|-
| Špela Sotlar||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Greta Junger|| Jernej Kastelic|| Marjeta Milostnik

|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2019_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2019_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2019_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2019_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2019_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2019_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.