Wiki FKKT - User contributions [en]

LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid

2022-04-01T16:01:01Z

Barbara Jaklič:

Let.it.bee je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je zasnovala skupina podiplomskih študentov iz Univerze São Paulo v Braziliji. Z njim so se uvrstili med prvih deset ekip v kategoriji podiplomskih študentov. Njihov cilj je bil pripraviti rastlino, ki bi reševala problematiko manjšanja populacij čebel zaradi splošne uporabe pesticidov.

Spletna stran projekta Let.it.bee, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:USP-Brazil https://2021.igem.org/Team:USP-Brazil]

Avtorica povzetka: Barbara Jaklič

=='''Čebele in njihov pomen'''==

Kljub svoji majhnosti so čebele kot opraševalke ključnega pomena za ohranjanje številnih kopenskih življenjskih združb. Obstaja preko 20.000 vrst razdeljenih v sedem družin, med katerimi je najbolj znana družina pravih čebel (''Apidae''), kamor spadata rod čmrljev in medonosnih čebel. V Braziliji, od koder prihaja ekipa, je prisotnih okrog 3000 vrst [1], medtem ko jih imamo v Sloveniji okrog 550, predvsem iz rodu peščinskih čebel (''Andrena''). Za človeka je zagotovo najpomembnejša vrsta domača čebela (''Apis mellifera''), katere podvrsta kranjska čebela (''Apis mellifera carnica'') je v Sloveniji avtohtona [2].

Z opraševanjem čebele skrbijo za razmnoževanje številnih rastlinskih vrst in njihovo genetsko variabilnost. Oprašujejo kar 80 % vseh cvetočih rastlin, od tega več kot 130 vrst sadja in zelenjave [3]. Zato imajo poleg okoljskega vidika čebele tudi velik ekonomski pomen. Nekatere vrste sadja kot so kivi, melone, buče in lubenice so popolnoma odvisne od čebeljega opraševanja, brez čebel ne bi imeli niti kakava, brazilskih oreščkov, vanilije in klinčkov. Poleg tega obstajajo številne druge vrste sadja, oreščkov in drugih poljščin, katerih donos v odsotnosti čebel bi se zmanjšal za 40 do 90 %. V to skupino spadajo jabolka, marelice, borovnice, mango, breskve, slive, hruške, maline, mandlji, indijski oreščki, kumare, avokado in celo pšenica [4]. Na splošno se pomembnost čebel odraža v kar eni tretjini vse hrane, ki jo zaužijemo, pridelavi vlaken za oblačila in surovin za biogoriva ter seveda pridobivanju medu in voska. Zaradi navedenih razlogov čebele doprinesejo k 10 % BDP v kmetijskem sektorju [1].

=='''Problem'''==

Na žalost po celem svetu prihaja do upadanja števila čebeljih kolonij. Od konca 20. stoletja pa do danes naj bi izumrla skoraj četrtina nekdaj prisotnih vrst. Posebej za zmanjšanje populacij medonosnih vrst kot je ''Apis mellifera'' se je uveljavil izraz ''sindrom propadanja čebeljih družin'' [5]. Razlogov za to je več, najpomembnejši so zagotovo urbanizacija in z njo kulturno gojenje rastlin ter posledična izguba čebeljega habitata, upadanje dejavnosti čebelarjev, podnebne spremembe, pojav čebelje pršice in varoje ter sistematična uporaba pesticidov [6].

Posebej problematična je nepravilna uporaba pesticidov za zaščito zrnja, predvsem neonikotinoidov kot so klotianidin, imidakloprid in tiametoksam, ki povzročajo akutno zastrupitev čebel. Nevarne so že subletalne koncentracije, saj se lahko okužijo le posamezne čebele, kar pa zaradi posebne organizacije čebeljega panja lahko vpliva na celotno kolonijo [6].

===Uporaba neonikotinoidov===

Neonikotinoidi so najpogosteje uporabljena skupina pesticidov, čeprav je bila leta 2013 njihova uporaba v Evropski Uniji močno omejena [7]. Spadajo med nevrotoksine, saj delujejo agonistično na nikotinske acetilholinske receptorje (nAChR) v nevronih insektov, ne pa tudi vretenčarjev [8]. Kmetje se največ poslužujejo imidakloprida, saj je zelo učinkovit in v rastlinah deluje sistemsko [9].

'''Imidakloprid''' se običajno vnese v rastlino s talnim nanosom v obliki granul ali tekočine, lahko pa tudi z obdelavo semen, od koder se med rastjo razširi po celotni rastlini [8]. Čebele pridejo v stik z imidaklopridom bodisi pri hranjenju z nektarjem, ki predstavlja vir ogljikovih hidratov, ali pri prenosu cvetnega prahu, ki predstavlja vir beljakovin in maščob. V čebelah se ta pesticid pretvori v še nevarnejše metabolite, kar vpliva na njihove motorične in kognitivne sposobnosti (letenje, prehranjevanje in navigacija) [10]. Največja težava pa je, da tako nektar kot cvetni prah čebele nosijo v panj in zato ob stiku s strupeno substanco ne pride do zastrupitve ene same čebele, ampak celega panja [8].

=='''Ideja'''==

Kljub negativnim učinkom imidakloprida je njegova uporaba v kmetijstvu neizogibna, saj predstavlja enega izmed bolj učinkovitih načinov obrambe pred škodljivci, ki bi sicer močno zmanjšali donos ekonomsko pomembnih rastlin. Zato se je ekipa USP-Brazil lotila projekta Let.it.bee, katerega glavni cilj je bil zasnovati tehnologijo, s katero bi zmanjšali toksične učinke neonikotinoidnih pesticidov na čebele [1].

Njihova ideja temelji na dejstvu, da so določene vrste insektov odporne na imidakloprid zaradi povečanega izražanja nekaterih encimov iz naddružine citokromov P450 (CYP), ki sodelujejo pri pretvorbi strupenega imidakloprida v manj nevarne metabolite. Primer takšnih organizmov so vinske mušice (''Drosophila melanogaster''), ki izražajo kar 10- do 100-krat več encima CYP6G1 kakor ostali neodporni insekti [11]. Zato so zasnovali biološki sistem, ki omogoča rastlinam, da izražajo encim CYP6G1 samo v tkivih, s katerimi so v stiku čebele med opraševanjem, torej nektar in cvetni prah. Ostali deli rastline kot so listi in steblo pa ostanejo zaščiteni pred škodljivci, saj v njih ne pride do izgube funkcije pesticida [1]. Encim CYP6G1 metabolizira imidakloprid do intermediatov 4- in 5-hidroksiimidakloprida, ki sta v primerjavi z izhodno spojino manj toksična, poleg tega ju lahko CYP6G1 dodatno razgradi do olefina 4,5 hidroksiimidakloprida. Nastali produkti so tudi bolj hidrofilni od imidakloprida, zato jih žuželka lažje izloči iz telesa [12].

===Razvoj ideje===

Za šasijo so sprva izbrali pogosto uporabljen navadni repnjakovec (''Arabidopsis thaliana''), kasneje pa so za testno rastlino raje izbrali paradižnik, ki je četrta najpomembnejša kulturna rastlina na svetu in celo najpomembnejša, če izvzamemo žitarice. Poleg tega je transformacija paradižnika z uporabo ''Agrobacterium tumefaciens'' zanesljiva in učinkovita, rastline pa se po transformaciji dobro regenerirajo [13]. Natančneje so za šasijo uporabili rastline pritlikavega mikroparadižnika '''Micro-Tom (biokocka BBa_K3890000)''', ki je bil razvit za domače vrtove, in ima dobre eksperimentalne lastnosti, kot sta kratek življenjski krog in majhen genom (samo 950 Mb). Poleg tega rastline ne proizvajajo nektarja, zato je bilo dovolj, da izbran encim za aktivacijo pesticide izrazijo v pelodu [14].

===Načrtovanje konstrukta===

Načrtovali so biološki sistem, vstavljen v binarni vektor, ki temelji na plazmidu Ti ''Agrobacterium tumefaciens''. Poleg bakterijskega ori in selekcijskega markerja za bakterije (zapis za odpornost proti streptamicinu) vsebuje tudi elemente za transformacijo rastlin. Med levim in desnim robom T-DNA regije, ki se integrira v rastlinski genom, se nahaja rastlinski selekcijski marker (zapis za odpornost proti kanamicinu) pod kontrolo rastlinskega promotorja CaMV 35S in vsi elementi sistema, ki omogočajo izražanje CYP6G1 v cvetnem prahu [1]:

* '''Promotor pLAT52 (biokocka BBa_K3890001)''', ki je močan promotor specifičen za pelod. Pri predhodnih raziskavah so dokazali visok nivo izražanja po kontrolo tega promotorja v prašnikih, v preostalih rastlinskih organih praktično nič. Promotor so poleg paradižnika testirali tudi v navadnem repnjakovcu (''Arabidopsis thaliana'') in tobaku (''Nicotiana tabacum''), kjer so prav tako dokazali visoko specifičnost za pelod. To predstavlja prednost pred promotorjem pLAT59, pri katerem so dokazali nizek nivo izražanja tudi v semenih in koreninah.
* '''Zapis za encim CYP6G1 (biokocka BBa_K3890006)''' z optimizirano rabo kodonov za izražanje v paradižniku. V predhodnih raziskavah izražanja v tobaku je bilo ugotovljeno, da lahko v 48 urah encim metabolizira 83 % od 400 μg dodanega imidakloprida [Joussen, 2018].
* '''Fuzija dveh samoizrezujočih se peptidov LP4/2A (biokocka BBa_K3890002)''', kar omogoča izražanje dveh proteinov pod kontrolo istega promotorja. 2A peptidi so kratka aminokislinska zaporedja, ki so pogosto prisotna v virusni DNA, cepitev poteče po metodi preskakovanja ribosoma med translacijo. Ribosom pri tem pogosto popolnoma pade dol ali pa sploh ne prekine prevajanja, kar so izboljšali s fuzijo z rastlinskim peptidom LP4 iz semen ''Impatiens balsamina''.
* '''Reporterski gen GUS (biokocka BBa_K330002)''', navzdol od zapisa za encim.

=='''Eksperimenti'''==

Rastline transfromiranega mikroparadižnika so gojili v kontroliranem okolju pri 30 °C, ustrezni vlažnosti in naravnem dnevno-nočnem ciklu. Izolacijo listov in cvetnega prahu so vedno izvajali ob istem času in shranjevali material pri -80 °C. Glavni trije eksperimenti, s katerimi so potrdili delovanje biološkega sistema so bili:
* histokemijsko GUS barvanje peloda, pri katerem so aktivnost β-glukuronidaze detektirali z dodatkom substrata 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl β-D-Glucuronide (X-Gluc), ki ga encim β-glukuronidaza pretvarja v indigo modro,
* ekstrakcija genomske DNA iz listov in peloda ter validacija prisotnosti vstavljene kasete LAT52 CYP6G1 GUS,
* kvantifikacijska analiza transkriptoma, za kar so najprej izolirali RNA, sintetizirali cDNA in jo analizirali z RT-qPCR [1].

=='''Model in rezultati'''==

Pripravili so dva mikromodela, ki sta simulirala delovanje detoksifikacijskega encima CYP6G1. Pri prvem so želeli z mutagenezo izboljšati encim, tako da bi razgrajeval tudi druge pesticide, kar so preverjali z molekulsko umestitvijo. Za modelno molekulo so s pomočjo orodja PSI-BLAST izbrali encim CYP3A4. Pri drugem modelu so simulirali stopnjo izražanja encima pod kontrolo promotorja pLAT52 in z dobljenim teoretičnim modelom napovedali stopnjo razgradnje imidakloprida in nastanka razgradnih metabolitov.
Tretji makromodel je simuliral obnašanje čebel v prisotnosti genetsko spremenjene rastline in predvideval, koliko čebel bi se okužilo s pesticidom, če upoštevamo, da pesticid v panj prinesejo le čebele delavke, in kako razsežen bi bil vpliv zastrupitve.
Iz modelov so predvideli, da popolna razgradnja imidakloprida traja 12 sekund in da so rastline transformirane z Let.it.bee in tretirane z imdaklopridom za čebele 5- do 10-krat manj strupene od divjih rastlin [1].

=='''Viri'''==

[1] Team:USP-Brazil - 2021.igem.org. https://2021.igem.org/Team:USP-Brazil (pridobljeno 29. 3. 2022).

[2] A. Gogala: ''Čebele Slovenije.'' Ljubljana: Založba ZRC 2014.

[3] B. Randall: ''The Value of Birds and Bees'' - Farmers.gov. https://www.farmers.gov/blog/the-value-of-birds-and-bees (pridobljeno 27. 3. 2022).

[4] H. Ritchie: ''How much of the world’s food production is dependent on pollinators?'' - Our World in Data. https://ourworldindata.org/pollinator-dependence (pridobljeno 27. 3. 2022).

[5] M. Hood: ''Colony collapse disorder.'' - Definition, Causes, Effects, & Facts - Britannica. https://www.britannica.com/science/colony-collapse-disorder (pridobljeno 27. 3. 2022).

[6] ''Čebele''. https://sl.wikipedia.org/wiki/Čebele (pridobljeno 28. 3. 2022).

[7] ''Neonicotinoids.'' https://ec.europa.eu/food/plants/pesticides/approval-active-substances/renewal-approval/neonicotinoids_en (pridobljeno 29. 3. 2022).

[8] E. A. D. Mitchell, B. Mulhauser, M. Mulot, A. Mutabazi, G. Glauser, A. Aebi: A worldwide survey of neonicotinoids in honey. ''Science'' '''2017''', 358(6359), str. 109–111.

[9] A. Potenza: ''Bees: three-quarters of all honey on Earth has pesticides in it'' - The Verge. https://www.theverge.com/2017/10/5/16424216/honey-neonicotinoids-contamination-honeybees-pollinators-environment (pridobljeno 27. 3. 2022).

[10] S. Suchail, L. Debrauwer, L. P. Belzunces: Metabolism of imidacloprid in Apis mellifera. ''Pest Manag. Sci.'' '''2004''', 60(3), str. 291–296.

[11] M. Ihara, K. Matsuda: Neonicotinoids: Molecular Mechanisms of Action, Insights into Resistance and Impact on Pollinators. ''Current Opinion in Insect Science.'' Elsevier Inc. 2018, str. 86–92.

[12] N. Joußen, D. G. Heckel, M. Haas, I. Schuphan, B. Schmidt: Metabolism of imidacloprid and DDT by P450 CYP6G1 expressed in cell cultures of Nicotiana tabacum suggests detoxification of these insecticides in Cyp6g1-overexpressing strains of Drosophila melanogaster, leading to resistance. ''Pest Manag. Sci.'' '''2008''', 64(1), str. 65–73.

[13] M. A. Bruce, J. L. Shoup Rupp: Agrobacterium-mediated transformation of Solanum tuberosum L., Potato. V: ''Methods in Molecular Biology.'' Vol. 1864, Humana Press Inc. 2019, str. 203–223.

[14] B. K. Scott, John Warner, Harbaugh: Micro-Tom: A Miniature Dwarf Tomato. 1989.

LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid

2022-04-01T15:58:05Z

Barbara Jaklič: /* Viri */

LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid

2022-04-01T15:56:20Z

Barbara Jaklič:

Let.it.bee je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je zasnovala skupina podiplomskih študentov iz Univerze São Paulo v Braziliji. Z njim so se uvrstili med prvih deset ekip v kategoriji podiplomskih študentov. Njihov cilj je bil pripraviti rastlino, ki bi reševala problematiko manjšanja populacij čebel zaradi splošne uporabe pesticidov.

Spletna stran projekta Let.it.bee, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:USP-Brazil https://2021.igem.org/Team:USP-Brazil]

Avtorica povzetka: Barbara Jaklič

=='''Čebele in njihov pomen'''==

Kljub svoji majhnosti so čebele kot opraševalke ključnega pomena za ohranjanje številnih kopenskih življenjskih združb. Obstaja preko 20.000 vrst razdeljenih v sedem družin, med katerimi je najbolj znana družina pravih čebel (''Apidae''), kamor spadata rod čmrljev in medonosnih čebel. V Braziliji, od koder prihaja ekipa, je prisotnih okrog 3000 vrst [1], medtem ko jih imamo v Sloveniji okrog 550, predvsem iz rodu peščinskih čebel (''Andrena''). Za človeka je zagotovo najpomembnejša vrsta domača čebela (''Apis mellifera''), katere podvrsta kranjska čebela (''Apis mellifera carnica'') je v Sloveniji avtohtona [2].

Z opraševanjem čebele skrbijo za razmnoževanje številnih rastlinskih vrst in njihovo genetsko variabilnost. Oprašujejo kar 80 % vseh cvetočih rastlin, od tega več kot 130 vrst sadja in zelenjave [3]. Zato imajo poleg okoljskega vidika čebele tudi velik ekonomski pomen. Nekatere vrste sadja kot so kivi, melone, buče in lubenice so popolnoma odvisne od čebeljega opraševanja, brez čebel ne bi imeli niti kakava, brazilskih oreščkov, vanilije in klinčkov. Poleg tega obstajajo številne druge vrste sadja, oreščkov in drugih poljščin, katerih donos v odsotnosti čebel bi se zmanjšal za 40 do 90 %. V to skupino spadajo jabolka, marelice, borovnice, mango, breskve, slive, hruške, maline, mandlji, indijski oreščki, kumare, avokado in celo pšenica [4]. Na splošno se pomembnost čebel odraža v kar eni tretjini vse hrane, ki jo zaužijemo, pridelavi vlaken za oblačila in surovin za biogoriva ter seveda pridobivanju medu in voska. Zaradi navedenih razlogov čebele doprinesejo k 10 % BDP v kmetijskem sektorju [1].

=='''Problem'''==

Na žalost po celem svetu prihaja do upadanja števila čebeljih kolonij. Od konca 20. stoletja pa do danes naj bi izumrla skoraj četrtina nekdaj prisotnih vrst. Posebej za zmanjšanje populacij medonosnih vrst kot je ''Apis mellifera'' se je uveljavil izraz ''sindrom propadanja čebeljih družin'' [5]. Razlogov za to je več, najpomembnejši so zagotovo urbanizacija in z njo kulturno gojenje rastlin ter posledična izguba čebeljega habitata, upadanje dejavnosti čebelarjev, podnebne spremembe, pojav čebelje pršice in varoje ter sistematična uporaba pesticidov [6].

Posebej problematična je nepravilna uporaba pesticidov za zaščito zrnja, predvsem neonikotinoidov kot so klotianidin, imidakloprid in tiametoksam, ki povzročajo akutno zastrupitev čebel. Nevarne so že subletalne koncentracije, saj se lahko okužijo le posamezne čebele, kar pa zaradi posebne organizacije čebeljega panja lahko vpliva na celotno kolonijo [6].

===Uporaba neonikotinoidov===

Neonikotinoidi so najpogosteje uporabljena skupina pesticidov, čeprav je bila leta 2013 njihova uporaba v Evropski Uniji močno omejena [7]. Spadajo med nevrotoksine, saj delujejo agonistično na nikotinske acetilholinske receptorje (nAChR) v nevronih insektov, ne pa tudi vretenčarjev [8]. Kmetje se največ poslužujejo imidakloprida, saj je zelo učinkovit in v rastlinah deluje sistemsko [9].

'''Imidakloprid''' se običajno vnese v rastlino s talnim nanosom v obliki granul ali tekočine, lahko pa tudi z obdelavo semen, od koder se med rastjo razširi po celotni rastlini [8]. Čebele pridejo v stik z imidaklopridom bodisi pri hranjenju z nektarjem, ki predstavlja vir ogljikovih hidratov, ali pri prenosu cvetnega prahu, ki predstavlja vir beljakovin in maščob. V čebelah se ta pesticid pretvori v še nevarnejše metabolite, kar vpliva na njihove motorične in kognitivne sposobnosti (letenje, prehranjevanje in navigacija) [10]. Največja težava pa je, da tako nektar kot cvetni prah čebele nosijo v panj in zato ob stiku s strupeno substanco ne pride do zastrupitve ene same čebele, ampak celega panja [8].

=='''Ideja'''==

Kljub negativnim učinkom imidakloprida je njegova uporaba v kmetijstvu neizogibna, saj predstavlja enega izmed bolj učinkovitih načinov obrambe pred škodljivci, ki bi sicer močno zmanjšali donos ekonomsko pomembnih rastlin. Zato se je ekipa USP-Brazil lotila projekta Let.it.bee, katerega glavni cilj je bil zasnovati tehnologijo, s katero bi zmanjšali toksične učinke neonikotinoidnih pesticidov na čebele [1].

Njihova ideja temelji na dejstvu, da so določene vrste insektov odporne na imidakloprid zaradi povečanega izražanja nekaterih encimov iz naddružine citokromov P450 (CYP), ki sodelujejo pri pretvorbi strupenega imidakloprida v manj nevarne metabolite. Primer takšnih organizmov so vinske mušice (''Drosophila melanogaster''), ki izražajo kar 10- do 100-krat več encima CYP6G1 kakor ostali neodporni insekti [11]. Zato so zasnovali biološki sistem, ki omogoča rastlinam, da izražajo encim CYP6G1 samo v tkivih, s katerimi so v stiku čebele med opraševanjem, torej nektar in cvetni prah. Ostali deli rastline kot so listi in steblo pa ostanejo zaščiteni pred škodljivci, saj v njih ne pride do izgube funkcije pesticida [1]. Encim CYP6G1 metabolizira imidakloprid do intermediatov 4- in 5-hidroksiimidakloprida, ki sta v primerjavi z izhodno spojino manj toksična, poleg tega ju lahko CYP6G1 dodatno razgradi do olefina 4,5 hidroksiimidakloprida. Nastali produkti so tudi bolj hidrofilni od imidakloprida, zato jih žuželka lažje izloči iz telesa [12].

===Razvoj ideje===

Za šasijo so sprva izbrali pogosto uporabljen navadni repnjakovec (''Arabidopsis thaliana''), kasneje pa so za testno rastlino raje izbrali paradižnik, ki je četrta najpomembnejša kulturna rastlina na svetu in celo najpomembnejša, če izvzamemo žitarice. Poleg tega je transformacija paradižnika z uporabo ''Agrobacterium tumefaciens'' zanesljiva in učinkovita, rastline pa se po transformaciji dobro regenerirajo [13]. Natančneje so za šasijo uporabili rastline pritlikavega mikroparadižnika '''Micro-Tom (biokocka BBa_K3890000)''', ki je bil razvit za domače vrtove, in ima dobre eksperimentalne lastnosti, kot sta kratek življenjski krog in majhen genom (samo 950 Mb). Poleg tega rastline ne proizvajajo nektarja, zato je bilo dovolj, da izbran encim za aktivacijo pesticide izrazijo v pelodu [14].

===Načrtovanje konstrukta===

Načrtovali so biološki sistem, vstavljen v binarni vektor, ki temelji na plazmidu Ti ''Agrobacterium tumefaciens''. Poleg bakterijskega ori in selekcijskega markerja za bakterije (zapis za odpornost proti streptamicinu) vsebuje tudi elemente za transformacijo rastlin. Med levim in desnim robom T-DNA regije, ki se integrira v rastlinski genom, se nahaja rastlinski selekcijski marker (zapis za odpornost proti kanamicinu) pod kontrolo rastlinskega promotorja CaMV 35S in vsi elementi sistema, ki omogočajo izražanje CYP6G1 v cvetnem prahu [1]:

* '''Promotor pLAT52 (biokocka BBa_K3890001)''', ki je močan promotor specifičen za pelod. Pri predhodnih raziskavah so dokazali visok nivo izražanja po kontrolo tega promotorja v prašnikih, v preostalih rastlinskih organih praktično nič. Promotor so poleg paradižnika testirali tudi v navadnem repnjakovcu (''Arabidopsis thaliana'') in tobaku (''Nicotiana tabacum''), kjer so prav tako dokazali visoko specifičnost za pelod. To predstavlja prednost pred promotorjem pLAT59, pri katerem so dokazali nizek nivo izražanja tudi v semenih in koreninah.
* '''Zapis za encim CYP6G1 (biokocka BBa_K3890006)''' z optimizirano rabo kodonov za izražanje v paradižniku. V predhodnih raziskavah izražanja v tobaku je bilo ugotovljeno, da lahko v 48 urah encim metabolizira 83 % od 400 μg dodanega imidakloprida [Joussen, 2018].
* '''Fuzija dveh samoizrezujočih se peptidov LP4/2A (biokocka BBa_K3890002)''', kar omogoča izražanje dveh proteinov pod kontrolo istega promotorja. 2A peptidi so kratka aminokislinska zaporedja, ki so pogosto prisotna v virusni DNA, cepitev poteče po metodi preskakovanja ribosoma med translacijo. Ribosom pri tem pogosto popolnoma pade dol ali pa sploh ne prekine prevajanja, kar so izboljšali s fuzijo z rastlinskim peptidom LP4 iz semen ''Impatiens balsamina''.
* '''Reporterski gen GUS (biokocka BBa_K330002)''', navzdol od zapisa za encim.

=='''Eksperimenti'''==

Rastline transfromiranega mikroparadižnika so gojili v kontroliranem okolju pri 30 °C, ustrezni vlažnosti in naravnem dnevno-nočnem ciklu. Izolacijo listov in cvetnega prahu so vedno izvajali ob istem času in shranjevali material pri -80 °C. Glavni trije eksperimenti, s katerimi so potrdili delovanje biološkega sistema so bili:
* histokemijsko GUS barvanje peloda, pri katerem so aktivnost β-glukuronidaze detektirali z dodatkom substrata 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl β-D-Glucuronide (X-Gluc), ki ga encim β-glukuronidaza pretvarja v indigo modro,
* ekstrakcija genomske DNA iz listov in peloda ter validacija prisotnosti vstavljene kasete LAT52 CYP6G1 GUS,
* kvantifikacijska analiza transkriptoma, za kar so najprej izolirali RNA, sintetizirali cDNA in jo analizirali z RT-qPCR [1].

=='''Model in rezultati'''==

Pripravili so dva mikromodela, ki sta simulirala delovanje detoksifikacijskega encima CYP6G1. Pri prvem so želeli z mutagenezo izboljšati encim, tako da bi razgrajeval tudi druge pesticide, kar so preverjali z molekulsko umestitvijo. Za modelno molekulo so s pomočjo orodja PSI-BLAST izbrali encim CYP3A4. Pri drugem modelu so simulirali stopnjo izražanja encima pod kontrolo promotorja pLAT52 in z dobljenim teoretičnim modelom napovedali stopnjo razgradnje imidakloprida in nastanka razgradnih metabolitov.
Tretji makromodel je simuliral obnašanje čebel v prisotnosti genetsko spremenjene rastline in predvideval, koliko čebel bi se okužilo s pesticidom, če upoštevamo, da pesticid v panj prinesejo le čebele delavke, in kako razsežen bi bil vpliv zastrupitve.
Iz modelov so predvideli, da popolna razgradnja imidakloprida traja 12 sekund in da so rastline transformirane z Let.it.bee in tretirane z imdaklopridom za čebele 5- do 10-krat manj strupene od divjih rastlin [1].

=='''Viri'''==

[1] Team:USP-Brazil - 2021.igem.org. https://2021.igem.org/Team:USP-Brazil (pridobljeno 29. 3. 2022).
[2] A. Gogala: ''Čebele Slovenije.'' Ljubljana: Založba ZRC 2014.
[3] B. Randall: ''The Value of Birds and Bees'' - Farmers.gov. https://www.farmers.gov/blog/the-value-of-birds-and-bees (pridobljeno 27. 3. 2022).
[4] H. Ritchie: ''How much of the world’s food production is dependent on pollinators?'' - Our World in Data. https://ourworldindata.org/pollinator-dependence (pridobljeno 27. 3. 2022).
[5] M. Hood: ''Colony collapse disorder.'' - Definition, Causes, Effects, & Facts - Britannica. https://www.britannica.com/science/colony-collapse-disorder (pridobljeno 27. 3. 2022).
[6] ''Čebele''. https://sl.wikipedia.org/wiki/Čebele (pridobljeno 28. 3. 2022).
[7] ''Neonicotinoids.'' https://ec.europa.eu/food/plants/pesticides/approval-active-substances/renewal-approval/neonicotinoids_en (pridobljeno 29. 3. 2022).
[8] E. A. D. Mitchell, B. Mulhauser, M. Mulot, A. Mutabazi, G. Glauser, A. Aebi: A worldwide survey of neonicotinoids in honey. ''Science'' '''2017''', 358(6359), str. 109–111.
[9] A. Potenza: ''Bees: three-quarters of all honey on Earth has pesticides in it'' - The Verge. https://www.theverge.com/2017/10/5/16424216/honey-neonicotinoids-contamination-honeybees-pollinators-environment (pridobljeno 27. 3. 2022).
[10] S. Suchail, L. Debrauwer, L. P. Belzunces: Metabolism of imidacloprid in Apis mellifera. ''Pest Manag. Sci.'' '''2004''', 60(3), str. 291–296.
[11] M. Ihara, K. Matsuda: Neonicotinoids: Molecular Mechanisms of Action, Insights into Resistance and Impact on Pollinators. ''Current Opinion in Insect Science.'' Elsevier Inc. 2018, str. 86–92.
[12] N. Joußen, D. G. Heckel, M. Haas, I. Schuphan, B. Schmidt: Metabolism of imidacloprid and DDT by P450 CYP6G1 expressed in cell cultures of Nicotiana tabacum suggests detoxification of these insecticides in Cyp6g1-overexpressing strains of Drosophila melanogaster, leading to resistance. ''Pest Manag. Sci.'' '''2008''', 64(1), str. 65–73.
[13] M. A. Bruce, J. L. Shoup Rupp: Agrobacterium-mediated transformation of Solanum tuberosum L., Potato. V: ''Methods in Molecular Biology.'' Vol. 1864, Humana Press Inc. 2019, str. 203–223.
[14] B. K. Scott, John Warner, Harbaugh: Micro-Tom: A Miniature Dwarf Tomato. 1989.

LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid

2022-04-01T13:43:21Z

Barbara Jaklič:

Let.it.bee je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je zasnovala skupina podiplomskih študentov iz Univerze São Paulo v Braziliji. Z njim so se uvrstili med prvih deset ekip v kategoriji podiplomskih študentov. Njihov cilj je bil pripraviti rastlino, ki bi reševala problematiko manjšanja populacij čebel zaradi splošne uporabe pesticidov.

Spletna stran projekta Let.it.bee, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:USP-Brazil https://2021.igem.org/Team:USP-Brazil]

Avtorica povzetka: Barbara Jaklič

=='''Čebele in njihov pomen'''==

Kljub svoji majhnosti so čebele kot opraševalke ključnega pomena za ohranjanje številnih kopenskih življenjskih združb. Obstaja preko 20.000 vrst razdeljenih v sedem družin, med katerimi je najbolj znana družina pravih čebel (''Apidae''), kamor spadata rod čmrljev in medonosnih čebel. V Braziliji, od koder prihaja ekipa, je prisotnih okrog 3000 vrst [1], medtem ko jih imamo v Sloveniji okrog 550, predvsem iz rodu peščinskih čebel (''Andrena''). Za človeka je zagotovo najpomembnejša vrsta domača čebela (''Apis mellifera''), katere podvrsta kranjska čebela (''Apis mellifera carnica'') je v Sloveniji avtohtona [2].

Z opraševanjem čebele skrbijo za razmnoževanje številnih rastlinskih vrst in njihovo genetsko variabilnost. Oprašujejo kar 80 % vseh cvetočih rastlin, od tega več kot 130 vrst sadja in zelenjave [3]. Zato imajo poleg okoljskega vidika čebele tudi velik ekonomski pomen. Nekatere vrste sadja kot so kivi, melone, buče in lubenice so popolnoma odvisne od čebeljega opraševanja, brez čebel ne bi imeli niti kakava, brazilskih oreščkov, vanilije in klinčkov. Poleg tega obstajajo številne druge vrste sadja, oreščkov in drugih poljščin, katerih donos v odsotnosti čebel bi se zmanjšal za 40 do 90 %. V to skupino spadajo jabolka, marelice, borovnice, mango, breskve, slive, hruške, maline, mandlji, indijski oreščki, kumare, avokado in celo pšenica [4]. Na splošno se pomembnost čebel odraža v kar eni tretjini vse hrane, ki jo zaužijemo, pridelavi vlaken za oblačila in surovin za biogoriva ter seveda pridobivanju medu in voska. Zaradi navedenih razlogov čebele doprinesejo k 10 % BDP v kmetijskem sektorju [1].

=='''Problem'''==

Na žalost po celem svetu prihaja do upadanja števila čebeljih kolonij. Od konca 20. stoletja pa do danes naj bi izumrla skoraj četrtina nekdaj prisotnih vrst. Posebej za zmanjšanje populacij medonosnih vrst kot je ''Apis mellifera'' se je uveljavil izraz ''sindrom propadanja čebeljih družin'' [5]. Razlogov za to je več, najpomembnejši so zagotovo urbanizacija in z njo kulturno gojenje rastlin ter posledična izguba čebeljega habitata, upadanje dejavnosti čebelarjev, podnebne spremembe, pojav čebelje pršice in varoje ter sistematična uporaba pesticidov [6].

Posebej problematična je nepravilna uporaba pesticidov za zaščito zrnja, predvsem neonikotinoidov kot so klotianidin, imidakloprid in tiametoksam, ki povzročajo akutno zastrupitev čebel. Nevarne so že subletalne koncentracije, saj se lahko okužijo le posamezne čebele, kar pa zaradi posebne organizacije čebeljega panja lahko vpliva na celotno kolonijo [6].

===Uporaba neonikotinoidov===

Neonikotinoidi so najpogosteje uporabljena skupina pesticidov, čeprav je bila leta 2013 njihova uporaba v Evropski Uniji močno omejena [7]. Spadajo med nevrotoksine, saj delujejo agonistično na nikotinske acetilholinske receptorje (nAChR) v nevronih insektov, ne pa tudi vretenčarjev [8]. Kmetje se največ poslužujejo imidakloprida, saj je zelo učinkovit in v rastlinah deluje sistemsko [9].

'''Imidakloprid''' se običajno vnese v rastlino s talnim nanosom v obliki granul ali tekočine, lahko pa tudi z obdelavo semen, od koder se med rastjo razširi po celotni rastlini [8]. Čebele pridejo v stik z imidaklopridom bodisi pri hranjenju z nektarjem, ki predstavlja vir ogljikovih hidratov, ali pri prenosu cvetnega prahu, ki predstavlja vir beljakovin in maščob. V čebelah se ta pesticid pretvori v še nevarnejše metabolite, kar vpliva na njihove motorične in kognitivne sposobnosti (letenje, prehranjevanje in navigacija) [10]. Največja težava pa je, da tako nektar kot cvetni prah čebele nosijo v panj in zato ob stiku s strupeno substanco ne pride do zastrupitve ene same čebele, ampak celega panja [8].

=='''Ideja'''==

Kljub negativnim učinkom imidakloprida je njegova uporaba v kmetijstvu neizogibna, saj predstavlja enega izmed bolj učinkovitih načinov obrambe pred škodljivci, ki bi sicer močno zmanjšali donos ekonomsko pomembnih rastlin. Zato se je ekipa USP-Brazil lotila projekta Let.it.bee, katerega glavni cilj je bil zasnovati tehnologijo, s katero bi zmanjšali toksične učinke neonikotinoidnih pesticidov na čebele [1].

Njihova ideja temelji na dejstvu, da so določene vrste insektov odporne na imidakloprid zaradi povečanega izražanja nekaterih encimov iz naddružine citokromov P450 (CYP), ki sodelujejo pri pretvorbi strupenega imidakloprida v manj nevarne metabolite. Primer takšnih organizmov so vinske mušice (''Drosophila melanogaster''), ki izražajo kar 10- do 100-krat več encima CYP6G1 kakor ostali neodporni insekti [11]. Zato so zasnovali biološki sistem, ki omogoča rastlinam, da izražajo encim CYP6G1 samo v tkivih, s katerimi so v stiku čebele med opraševanjem, torej nektar in cvetni prah. Ostali deli rastline kot so listi in steblo pa ostanejo zaščiteni pred škodljivci, saj v njih ne pride do izgube funkcije pesticida [1]. Encim CYP6G1 metabolizira imidakloprid do intermediatov 4- in 5-hidroksiimidakloprida, ki sta v primerjavi z izhodno spojino manj toksična, poleg tega ju lahko CYP6G1 dodatno razgradi do olefina 4,5 hidroksiimidakloprida. Nastali produkti so tudi bolj hidrofilni od imidakloprida, zato jih žuželka lažje izloči iz telesa [12].

===Razvoj ideje===

Za šasijo so sprva izbrali pogosto uporabljen navadni repnjakovec (''Arabidopsis thaliana''), kasneje pa so za testno rastlino raje izbrali paradižnik, ki je četrta najpomembnejša kulturna rastlina na svetu in celo najpomembnejša, če izvzamemo žitarice. Poleg tega je transformacija paradižnika z uporabo ''Agrobacterium tumefaciens'' zanesljiva in učinkovita, rastline pa se po transformaciji dobro regenerirajo [13]. Natančneje so za šasijo uporabili rastline pritlikavega mikroparadižnika '''Micro-Tom (biokocka BBa_K3890000)''', ki je bil razvit za domače vrtove, in ima dobre eksperimentalne lastnosti, kot sta kratek življenjski krog in majhen genom (samo 950 Mb). Poleg tega rastline ne proizvajajo nektarja, zato je bilo dovolj, da izbran encim za aktivacijo pesticide izrazijo v pelodu [14].

===Načrtovanje konstrukta===

Načrtovali so biološki sistem, vstavljen v binarni vektor za ''Agrobacterium tumefaciens'', ki poleg bakterijskega ori in selekcijskega markerja za bakterije (zapis za odpornost proti streptamicinu) vsebuje tudi vse potrebne elemente za transformacijo rastlin. Med levim in desnim robom T-DNA regije, ki se integrira v rastlinski genom, se nahaja rastlinski selekcijski marker (zapis za odpornost proti kanamicinu) pod kontrolo rastlinskega promotorja CaMV 35S in vsi sestavni deli testnega sistema, ki omogočajo izražanje CYP6G1 v cvetnem prahu [1]:

* '''Promotor pLAT52 (biokocka BBa_K3890001)''', ki je močan promotor specifičen za pelod. Pri predhodnih raziskavah so dokazali visok nivo izražanja po kontrolo tega promotorja v prašnikih, v preostalih rastlinskih organih praktično nič. Promotor so poleg paradižnika testirali tudi v navadnem repnjakovcu (''Arabidopsis thaliana'') in tobaku (''Nicotiana tabacum''), kjer so prav tako dokazali visoko specifičnost za pelod. To predstavlja prednost pred promotorjem pLAT59, pri katerem so dokazali nizek nivo izražanja tudi v semenih in koreninah.
* '''Zapis za encim CYP6G1 (biokocka BBa_K3890006)''' z optimizirano rabo kodonov za izražanje v paradižniku. V predhodnih raziskavah izražanja v tobaku je bilo ugotovljeno, da lahko v 48 urah encim metabolizira 83 % od 400 μg dodanega imidakloprida [Joussen, 2018].
* '''Fuzija dveh samoizrezujočih se peptidov LP4/2A (biokocka BBa_K3890002)''', kar omogoča izražanje dveh proteinov pod kontrolo istega promotorja. 2A peptidi so kratka aminokislinska zaporedja, ki so pogosto prisotna v virusni DNA, cepitev poteče po metodi preskakovanja ribosoma med translacijo. Ribosom pri tem pogosto popolnoma pade dol ali pa sploh ne prekine prevajanja, kar so izboljšali s fuzijo z rastlinskim peptidom LP4 iz semen ''Impatiens balsamina''.
* '''Reporterski gen GUS (biokocka BBa_K330002)''', navzdol od zapisa za encim.

=='''Eksperimenti'''==

Rastline transfromiranega mikroparadižnika so gojili v kontroliranem okolju pri 30 °C, ustrezni vlažnosti in naravnem dnevno-nočnem ciklu. Izolacijo listov in cvetnega prahu so vedno izvajali ob istem času in shranjevali material pri -80 °C. Glavni trije eksperimenti, s katerimi so potrdili delovanje biološkega sistema so bili:
* histokemijsko GUS barvanje peloda, pri katerem so aktivnost β-glukuronidaze detektirali z dodatkom substrata 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl β-D-Glucuronide (X-Gluc), ki ga encim β-glukuronidaza pretvarja v indigo modro,
* ekstrakcija genomske DNA iz listov in peloda ter validacija prisotnosti vstavljene kasete LAT52 CYP6G1 GUS,
* kvantifikacijska analiza transkriptoma, za kar so najprej izolirali RNA, sintetizirali cDNA in jo analizirali z RT-qPCR [1].

=='''Model in rezultati'''==
Pripravili so dva mikromodela, ki sta simulirala delovanje detoksifikacijskega encima CYP6G1. Pri prvem so želeli z mutagenezo izboljšati encim, tako da bi razgrajeval tudi druge pesticide, kar so preverjali z molekulsko umestitvijo. Za modelno molekulo so s pomočjo orodja PSI-BLAST izbrali encim CYP3A4. Pri drugem modelu so simulirali stopnjo izražanja encima pod kontrolo promotorja pLAT52 in z dobljenim teoretičnim modelom napovedali stopnjo razgradnje imidakloprida in nastanka razgradnih metabolitov.
Tretji makromodel je simuliral obnašanje čebel v prisotnosti genetsko spremenjene rastline in predvideval, koliko čebel bi se okužilo s pesticidom, če upoštevamo, da pesticid v panj prinesejo le čebele delavke, in kako razsežen bi bil vpliv zastrupitve.
Iz modelov so predvideli, da popolna razgradnja imidakloprida traja 12 sekund in da so rastline transformirane z Let.it.bee in tretirane z imdaklopridom za čebele 5- do 10-krat manj strupene od divjih rastlin [1].

=='''Model in rezultati'''==

Struktura in mehanizem restriktaz tipa II

2019-04-14T08:09:23Z

Barbara Jaklič: /* Struktura */

==Uvod==
Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo.

Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.

==Restriktaze tipa II==
Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg2+, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.

Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).

Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.

• Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve.

• Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP.

• Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti.

• Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.

• Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja.

• Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.

==Struktura==
Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.

V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).

S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze in endonukleaze ''Mut''H, ''Rec''B, VSR ter T7I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom, zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi .

Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg2+. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca2+.
Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.

==Mehanizem==
Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere več kot 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.

Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene.

Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II pri vezavi na DNA in njeni cepitvi sodelujeta. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati.

Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2-. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg2+. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.

==Viri in literatura==

*Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327. DOI: https://doi.org/10.1038/nrmicro2315.
*Pingoud, A., Wilson, G. G., Wende, W. Type II restriction endonucleases – a historical perspective and more. ''Nucleic Acids Research'', 2014, let. 42 (12), str. 7489–7527. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gku447
*Pingoud, A., Jeltsch, A. Structure and function of type II restriction endonucleases. ''Nucleic Acids Research'', 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727.
*Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ''et. al.'' Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. ''Cellular and Molecular Life Science''s, 2005, let. 62, str. 685-707. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-004-4513-1.
[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura in mehanizem restriktaz tipa II

2019-04-14T08:00:14Z

Barbara Jaklič: /* Struktura */

==Uvod==
Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo.

Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.

==Restriktaze tipa II==
Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg2+, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.

Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).

Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.

• Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve.

• Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP.

• Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti.

• Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.

• Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja.

• Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.

==Struktura==
Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.

V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).

S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze in endonukleaze MutH, RecB, VSR ter T7I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom, zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi .

Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg2+. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca2+.
Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.

==Mehanizem==
Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere več kot 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.

Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene.

Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II pri vezavi na DNA in njeni cepitvi sodelujeta. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati.

Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2-. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg2+. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.

==Viri in literatura==

*Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327. DOI: https://doi.org/10.1038/nrmicro2315.
*Pingoud, A., Wilson, G. G., Wende, W. Type II restriction endonucleases – a historical perspective and more. ''Nucleic Acids Research'', 2014, let. 42 (12), str. 7489–7527. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gku447
*Pingoud, A., Jeltsch, A. Structure and function of type II restriction endonucleases. ''Nucleic Acids Research'', 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727.
*Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ''et. al.'' Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. ''Cellular and Molecular Life Science''s, 2005, let. 62, str. 685-707. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-004-4513-1.
[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura in mehanizem restriktaz tipa II

2019-04-14T07:59:43Z

Barbara Jaklič: /* Struktura */

==Uvod==
Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo.

Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.

==Restriktaze tipa II==
Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg2+, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.

Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).

Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.

• Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve.

• Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP.

• Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti.

• Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.

• Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja.

• Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.

==Struktura==
Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.

V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).

S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze in endonukleaze MutH, RecB, VSR ter T7. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom, zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi .

Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg2+. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca2+.
Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.

==Mehanizem==
Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere več kot 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.

Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene.

Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II pri vezavi na DNA in njeni cepitvi sodelujeta. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati.

Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2-. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg2+. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.

==Viri in literatura==

*Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327. DOI: https://doi.org/10.1038/nrmicro2315.
*Pingoud, A., Wilson, G. G., Wende, W. Type II restriction endonucleases – a historical perspective and more. ''Nucleic Acids Research'', 2014, let. 42 (12), str. 7489–7527. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gku447
*Pingoud, A., Jeltsch, A. Structure and function of type II restriction endonucleases. ''Nucleic Acids Research'', 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727.
*Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ''et. al.'' Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. ''Cellular and Molecular Life Science''s, 2005, let. 62, str. 685-707. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-004-4513-1.
[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura in mehanizem restriktaz tipa II

2019-04-14T07:58:33Z

Barbara Jaklič: /* Struktura */

==Uvod==
Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo.

Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.

==Restriktaze tipa II==
Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg2+, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.

Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).

Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.

• Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve.

• Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP.

• Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti.

• Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.

• Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja.

• Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.

==Struktura==
Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.

V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).

S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB, VSR in T7 nukleaze. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom, zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi .

Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg2+. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca2+.
Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.

==Mehanizem==
Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere več kot 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.

Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene.

Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II pri vezavi na DNA in njeni cepitvi sodelujeta. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati.

Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2-. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg2+. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.

==Viri in literatura==

*Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327. DOI: https://doi.org/10.1038/nrmicro2315.
*Pingoud, A., Wilson, G. G., Wende, W. Type II restriction endonucleases – a historical perspective and more. ''Nucleic Acids Research'', 2014, let. 42 (12), str. 7489–7527. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gku447
*Pingoud, A., Jeltsch, A. Structure and function of type II restriction endonucleases. ''Nucleic Acids Research'', 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727.
*Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ''et. al.'' Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. ''Cellular and Molecular Life Science''s, 2005, let. 62, str. 685-707. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-004-4513-1.
[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Talk:Struktura in mehanizem restriktaz tipa II

2019-04-14T07:53:28Z

Barbara Jaklič:

*Meta Kodrič: Uvod, Restriktaze tipa II
*Barbara Jaklič: Struktura
*Laura Gašperšič: Mehanizem

Talk:Struktura in mehanizem restriktaz tipa II

2019-04-14T07:53:06Z

Barbara Jaklič: New page: Meta Kodrič: Uvod, Restriktaze tipa II Barbara Jaklič: Struktura Laura Gašperšič: Mehanizem

Meta Kodrič: Uvod, Restriktaze tipa II
Barbara Jaklič: Struktura
Laura Gašperšič: Mehanizem

Struktura in mehanizem restriktaz tipa II

2019-04-14T07:49:51Z

Barbara Jaklič: /* Viri in literatura */

==Uvod==
Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo.

Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.

==Restriktaze tipa II==
Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg2+, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.

Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).

Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.

• Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve.

• Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP.

• Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti.

• Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.

• Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja.

• Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.

==Struktura==
Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.

V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).

S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom, zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi .

Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg2+. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca2+.
Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.

==Mehanizem==
Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere več kot 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.

Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene.

Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II pri vezavi na DNA in njeni cepitvi sodelujeta. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati.

Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2-. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg2+. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.

==Viri in literatura==

*Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327. DOI: https://doi.org/10.1038/nrmicro2315.
*Pingoud A., Wilson G. G., Wende W. Type II restriction endonucleases – a historical perspective and more. ''Nucleic Acids Research'', 2014, let. 42 (12), str. 7489–7527. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gku447
*Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. ''Nucleic Acids Research'', 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727.
*Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ''et. al.'' Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. ''Cellular and Molecular Life Science''s, 2005, let. 62, str. 685-707. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-004-4513-1.
[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura in mehanizem restriktaz tipa II

2019-04-14T07:44:53Z

Barbara Jaklič: /* Struktura */

==Uvod==
Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo.

Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.

==Restriktaze tipa II==
Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg2+, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.

Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).

Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.

• Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve.

• Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP.

• Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti.

• Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.

• Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja.

• Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.

==Struktura==
Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.

V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).

S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom, zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi .

Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg2+. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca2+.
Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.

==Mehanizem==
Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere več kot 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.

Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene.

Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II pri vezavi na DNA in njeni cepitvi sodelujeta. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati.

Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2-. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg2+. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.

==Viri in literatura==

*Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327. DOI: https://doi.org/10.1038/nrmicro2315.
*Pingoud A., Wilson G. G., Wende W. Type II restriction endonucleases – a historical perspective and more. ''Nucleic Acids Research'', 2014, let. 42 (12), str. 7489–7527. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gku447
*Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. ''Nucleic Acids Research'', 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727. PubMed PMID: 11557805; PubMed Central PMCID: PMC55916.
*Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ''et. al.'' Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. ''Cellular and Molecular Life Science''s, 2005, let. 62, str. 685-707. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-004-4513-1.
[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura in mehanizem restriktaz tipa II

2019-04-14T07:42:35Z

Barbara Jaklič: /* Struktura */

==Uvod==
Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo.

Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.

==Restriktaze tipa II==
Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg2+, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.

Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).

Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.

• Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve.

• Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP.

• Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti.

• Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.

• Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja.

• Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.

==Struktura==
Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.

V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).

S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama [3]. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom , zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi .

Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg2+. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca2+.
Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.

==Mehanizem==
Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere več kot 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.

Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene.

Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II pri vezavi na DNA in njeni cepitvi sodelujeta. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati.

Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2-. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg2+. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.

==Viri in literatura==

*Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327. DOI: https://doi.org/10.1038/nrmicro2315.
*Pingoud A., Wilson G. G., Wende W. Type II restriction endonucleases – a historical perspective and more. ''Nucleic Acids Research'', 2014, let. 42 (12), str. 7489–7527. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gku447
*Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. ''Nucleic Acids Research'', 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727. PubMed PMID: 11557805; PubMed Central PMCID: PMC55916.
*Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ''et. al.'' Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. ''Cellular and Molecular Life Science''s, 2005, let. 62, str. 685-707. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-004-4513-1.
[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura in mehanizem restriktaz tipa II

2019-04-14T07:35:31Z

Barbara Jaklič: /* Viri in literatura */

==Uvod==
Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo.

Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.

==Restriktaze tipa II==
Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg2+, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.

Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).

Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.

• Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve.

• Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP.

• Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti.

• Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.

• Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja.

• Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.

==Struktura==
Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.

V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki, ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).

S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama [3]. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom , zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi .

Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg2+. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca2+.
Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.

==Mehanizem==
Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere več kot 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.

Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene.

Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II pri vezavi na DNA in njeni cepitvi sodelujeta. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati.

Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2-. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg2+. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.

==Viri in literatura==

*Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327. DOI: https://doi.org/10.1038/nrmicro2315.
*Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. ''Nucleic Acids Research'', 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727. PubMed PMID: 11557805; PubMed Central PMCID: PMC55916.
*Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ''et. al.'' Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. ''Cellular and Molecular Life Science''s, 2005, let. 62, str. 685-707. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-004-4513-1.
*Pingoud A., Wilson G. G., Wende W. Type II restriction endonucleases – a historical perspective and more. ''Nucleic Acids Research'', 2014, let. 42 (12), str. 7489–7527.
[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura in mehanizem restriktaz tipa II

2019-04-14T07:33:12Z

Barbara Jaklič: /* Viri in literatura */

==Uvod==
Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo.

Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.

==Restriktaze tipa II==
Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg2+, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.

Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).

Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.

• Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve.

• Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP.

• Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti.

• Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.

• Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja.

• Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.

==Struktura==
Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.

V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki, ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).

S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama [3]. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom , zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi .

Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg2+. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca2+.
Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.

==Mehanizem==
Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere več kot 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.

Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene.

Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II pri vezavi na DNA in njeni cepitvi sodelujeta. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati.

Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2-. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg2+. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.

==Viri in literatura==

*Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327. DOI: https://doi.org/10.1038/nrmicro2315.
*Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. ''Nucleic Acids Research'', 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727.
*Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ''et. al.'' Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. ''Cellular and Molecular Life Science''s, 2005, let. 62, str. 685-707. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-004-4513-1.
*Pingoud A., Wilson G. G., Wende W. Type II restriction endonucleases – a historical perspective and more. ''Nucleic Acids Research'', 2014, let. 42 (12), str. 7489–7527.
[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura in mehanizem restriktaz tipa II

2019-04-14T07:30:51Z

Barbara Jaklič: /* Viri in literatura */

==Uvod==
Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo.

Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.

==Restriktaze tipa II==
Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg2+, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.

Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).

Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.

• Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve.

• Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP.

• Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti.

• Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.

• Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja.

• Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.

==Struktura==
Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.

V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki, ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).

S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama [3]. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom , zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi .

Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg2+. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca2+.
Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.

==Mehanizem==
Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere več kot 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.

Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene.

Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II pri vezavi na DNA in njeni cepitvi sodelujeta. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati.

Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2-. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg2+. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.

==Viri in literatura==

*Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327.
*Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. ''Nucleic Acids Research'', 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727.
*Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ''et. al.'' Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. ''Cellular and Molecular Life Science''s, 2005, let. 62, str. 685-707. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-004-4513-1.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura in mehanizem restriktaz tipa II

2019-04-14T07:26:10Z

Barbara Jaklič: /* Viri in literatura */

==Uvod==
Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo.

Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.

==Restriktaze tipa II==
Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg2+, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.

Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).

Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.

• Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve.

• Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP.

• Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti.

• Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.

• Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja.

• Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.

==Struktura==
Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.

V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki, ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).

S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama [3]. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom , zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi .

Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg2+. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca2+.
Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.

==Mehanizem==
Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere nad 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.

Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene.

Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II sodelujeta pri vezavi na DNA in njeni cepitvi. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati.

Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2-. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg2+. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.

==Viri in literatura==

*Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327.
*Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. ''Nucleic Acids Research'', 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727.
*Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ''et. al.'' Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. ''Cellular and Molecular Life Science''s, 2005, let. 62, str. 685-707.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura in mehanizem restriktaz tipa II

2019-04-14T07:23:50Z

Barbara Jaklič: /* Viri in literatura */

==Uvod==
Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo.

Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.

==Restriktaze tipa II==
Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg2+, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.

Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).

Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.

• Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve.

• Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP.

• Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti.

• Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.

• Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja.

• Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.

==Struktura==
Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.

V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki, ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).

S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama [3]. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom , zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi .

Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg2+. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca2+.
Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.

==Mehanizem==
Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere nad 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.

Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene.

Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II sodelujeta pri vezavi na DNA in njeni cepitvi. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati.

Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2-. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg2+. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.

==Viri in literatura==

*Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327.
*Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Research, 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727.
*Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ''et. al.'' Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. Cellular and Molecular Life Sciences, 2005, let. 62, str. 685-707.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura in mehanizem restriktaz tipa II

2019-04-14T07:23:05Z

Barbara Jaklič: /* Viri in literatura */

==Uvod==
Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo.

Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.

==Restriktaze tipa II==
Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg2+, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.

Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).

Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.

• Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve.

• Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP.

• Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti.

• Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.

• Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja.

• Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.

==Struktura==
Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.

V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki, ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).

S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama [3]. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom , zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi .

Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg2+. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca2+.
Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.

==Mehanizem==
Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere nad 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.

Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene.

Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II sodelujeta pri vezavi na DNA in njeni cepitvi. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati.

Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2-. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg2+. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.

==Viri in literatura==

*Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327.
*Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Research, 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727.
*Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. et al. Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. Cellular and Molecular Life Sciences, 2005, let. 62, str. 685.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura in mehanizem restriktaz tipa II

2019-04-14T07:19:07Z

Barbara Jaklič: /* Viri in literatura */

==Uvod==
Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo.

Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.

==Restriktaze tipa II==
Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg2+, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.

Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).

Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.

• Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve.

• Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP.

• Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti.

• Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.

• Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja.

• Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.

==Struktura==
Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.

V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki, ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).

S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama [3]. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom , zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi .

Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg2+. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca2+.
Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.

==Mehanizem==
Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere nad 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.

Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene.

Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II sodelujeta pri vezavi na DNA in njeni cepitvi. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati.

Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2-. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg2+. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.

==Viri in literatura==

*Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327.
*Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Research, 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura in mehanizem restriktaz tipa II

2019-04-14T07:14:18Z

Barbara Jaklič:

==Uvod==
Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo.

Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.

==Restriktaze tipa II==
Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg2+, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.

Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).

Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.

• Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve.

• Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP.

• Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti.

• Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.

• Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja.

• Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.

==Struktura==
Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.

V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki, ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).

S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama [3]. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom , zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi .

Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg2+. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca2+.
Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.

==Mehanizem==
Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere nad 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.

Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene.

Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II sodelujeta pri vezavi na DNA in njeni cepitvi. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati.

Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2-. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg2+. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.

==Viri in literatura==

*Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura in mehanizem restriktaz tipa II

2019-04-14T07:12:31Z

Barbara Jaklič: /* Struktura */

==Uvod==
Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo.

Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.

==Restriktaze tipa II==
Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg2+, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.

Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).

Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.

• Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve.

• Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP.

• Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti.

• Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.

• Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja.

• Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.

==Struktura==
Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.

V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki, ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).

S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama [3]. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom , zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi .

Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg2+. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca2+.
Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.

==Mehanizem==
Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere nad 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.

Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene.

Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II sodelujeta pri vezavi na DNA in njeni cepitvi. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati.

Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2-. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg2+. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.

Struktura in mehanizem restriktaz tipa II

2019-04-14T07:11:35Z

Barbara Jaklič:

==Uvod==
Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo.

Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.

==Restriktaze tipa II==
Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg2+, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.

Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).

Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.

• Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve.

• Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP.

• Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti.

• Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.

• Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja.

• Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.

==Struktura==
Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.
V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki, ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).
S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama [3]. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom , zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi .
Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg2+. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca2+.
Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.

==Mehanizem==
Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere nad 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.

Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene.

Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II sodelujeta pri vezavi na DNA in njeni cepitvi. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati.

Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2-. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg2+. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-04-14T07:00:28Z

Barbara Jaklič:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315 pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Blokiranje_receptorjev_za_fage Blokiranje receptorjev za fage] (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa Proizvodnja zunajceličnega matriksa] (Patricija Miklavc, Benjamin Malovrh, Vid Modic) 
3. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_kompetitivnih_inhibitorjev Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev] (Ajda Godec,Liza Ulčakar,Luka Gnidovec) 
4. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_izklju%C4%8Ditve_naknadne_oku%C5%BEbe Izključitev naknadne okužbe] (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_prvih_restrikcijskih_endonukleaz Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz] (Alen Šadl, Bor Klančnik) 
7. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metilacijski_sistem_pri_bakterijah Metilacijski sistem pri bakterijah] (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II] (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prilagoditve_fagov_na_bakterijske_restrikcijsko-modifikacijske_sisteme Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme] (Nika Boštic, Tadej Medved, Sonja Gabrijelčič) 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) (Eva Gartner, Neža Blaznik, Tina Zavodnik ) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mateja Špegel, Špela Friškovec Vončina, Anja Truden) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, Anja Tavčar) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Jernej Imperl, Klementina Polanec, Gašper Anton Komatar) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pavleković, Valeriya Musina) 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom (Sanja Stanković, Karin Dobravc Škof, Neža Žerjav ) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-04-14T06:56:13Z

Barbara Jaklič:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315 pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Blokiranje_receptorjev_za_fage Blokiranje receptorjev za fage] (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa Proizvodnja zunajceličnega matriksa] (Patricija Miklavc, Benjamin Malovrh, Vid Modic) 
3. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_kompetitivnih_inhibitorjev Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev] (Ajda Godec,Liza Ulčakar,Luka Gnidovec) 
4. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_izklju%C4%8Ditve_naknadne_oku%C5%BEbe Izključitev naknadne okužbe] (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_prvih_restrikcijskih_endonukleaz Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz] (Alen Šadl, Bor Klančnik) 
7. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metilacijski_sistem_pri_bakterijah Metilacijski sistem pri bakterijah] (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II] (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prilagoditve_fagov_na_bakterijske_restrikcijsko-modifikacijske_sisteme Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme] (Nika Boštic, Tadej Medved, Sonja Gabrijelčič) 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) (Eva Gartner, Neža Blaznik, Tina Zavodnik ) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mateja Špegel, Špela Friškovec Vončina, Anja Truden) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, Anja Tavčar) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Jernej Imperl, Klementina Polanec, Gašper Anton Komatar) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pavleković, Valeriya Musina) 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom (Sanja Stanković, Karin Dobravc Škof, Neža Žerjav ) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Struktura in mehanizem restriktaz tipa II

2019-04-14T06:53:07Z

Barbara Jaklič: /* UVOD */

==UVOD==
Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbam s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v razmnoževanju bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo.
Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.

BIO2 Povzetki seminarjev 2018

2018-12-01T02:20:41Z

Barbara Jaklič: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2018/2019 */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2018/2019 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2018 stran]

===Karmen Mlinar: Signalizacija in odzivi na abiotski stres pri rastlinah===
Rastline živijo v stalno spreminjajočem se okolju, ki je pogosto neugodno in stresno za njihovo rast in razvoj. Primer abiotskega stresa so suša, ekstremne temperature, slanost tal, pomanjkanje hranil v prsti ipd. Rastline lahko stres preživijo tako, da se mu prilagodijo ali pa izognejo. V nasprotnem primeru so obsojene na smrt. Identificiranih je le malo senzorjev, ki zaznavajo stres. Pri signalizaciji odzivov na stresna okolja pogosto sodeluje družina kinaz SnRK, ki zaznajo spremembe v energijskem statusu rastline, ki jih povzroči stres. Znane so tri poddružine SnRKs: SnRK1s, SnRK2s, ki sodelujejo pri osmotskem stresu in ABA signalizaciji, in SnRK3s, ki so ključni regulatorji ionske homeostaze pri spopadanju s solnim stresom. Pri ionskem stresu pogosto problem predstavlja Na+. Pri njegovi signalizaciji je ključna SOS signalna pot. Signalizacija temperaturnega stresa se začne s spremembami v fluidnosti membrane, kar zaznajo integralni membranski proteini. Pri signalizaciji pogosto sodelujejo tudi MAPKs, CPKs in stresni hormon ABA, pomembno vlogo pa nosijo sekundarni sporočevalci kot sta kalcij in ROS. Vse to stremi k vzpostavitvi ionske in vodne homeostaze ter celične stabilnosti v stresnem okolju. Z razumevanjem signalizacije stresa in odzivov, ki sledijo, bomo lahko izboljšali odpornost pridelkov na stres in s tem zagotovili kmetijsko stabilnost in preskrbo s hrano za rastoče svetovno prebivalstvo.

===Aljaž Bratina: Pomen različnih signalnih poti pri staranju===
Staranje je postopna izguba fiziološke integritete in vodi v prizadeto funkcionalnost ter povečano možnost za smrt. Hitremu staranju nasprotna je dolgoživost, to je stanje, v katerem organizem ne izgublja funkcionalnosti ali jo izgublja počasneje. Staranje lahko opredelimo z devetimi splošnimi lastnostmi, ki jih opazimo v večini organizmov. Pri preučevanju staranja opazujemo organizem C. elegans, ki lahko med razvojem v primeru neugodnih razmer razvije stanje dauer, v katerem je razvoj ustavljen in je tako organizem sposoben preživeti dalj časa. Pri regulaciji staranja in dolgoživosti so pomembne mnoge celične signalne poti, kot del njih pa predvsem jedrni receptorji, ki uravnavajo prepisovanje genov, ki imajo vpliv na hitrost staranja oz. vzdrževanje dolgoživosti. V seminarski nalogi so opisane štiri pomembne signalne poti in njihov vpliv na staranje. Pri prvi je pomemben jedrni receptor DAF-12, ki za svoje delovanje potrebuje steroid DA. Neugodne razmere ga deaktivirajo, kar vodi v razvoj stanja dauer. Na dolgoživost pozitivno vpliva tudi aktiviran kompleks NSBP-1 in jedrnega receptorja DAF-16, ki sta del signalne poti IIS. To pot regulira tudi količina holesterola v celici. Dolgoživost povzročajo tudi prekinitveni post, pri katerem se aktivira jedrni receptor AP-1, pa tudi odstranitev zarodnih celic, ki poleg prej omenjene DAF-12 in DAF-16 aktivira tudi nekatere druge receptorje, npr. NHR-80 in NH3-49.

===Eva Gartner: Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi===
Wnt signalizacija zajema skupino signalnih poti, ki jih regulirajo wnt proteini. Ti se vežejo na posebne receptorje v membrani celice, preko katerih se signal prenese v notranjost. Wnt signalizacijo sestavljajo tri glavne signalizacijske poti: kanonična wnt pot, ki vključuje protein β-katenin, nekanonična (PCP) pot in nekanonična pot, ki sodeluje pri regulaciji kalcija. Vse poti se začnejo z vezavo wnt-liganda na transmembranske Fz receptorje in prenosom signala do znotrajceličnega proteina Dsh. Od tu naprej se poti razcepijo vsaka v svojo smer. Wnt signalizacija sodeluje v mnogih procesih, potrebnih za normalen razvoj organizma, kot so npr. razmnoževanje, specializacija in migracije celic. Prisotnost regulacije z wnt signalizacijo so odkrili tudi pri srčni fibrozi in z njo povezanih boleznih in poškodbah srca. V zdravih celicah wnt signalizacija navadno ni prisotna. Izraz fibroza se nanaša na povečanje količine zunajceličnega matriksa, zaradi česar postane srčna mišica otrdela in krčenje manj intenzivno. Pride do prekomerne namnožitve fibroblastov in diferenciacije v miofibroblaste, ki so fenotipsko med fibroblasti in mišičnimi celicami. Kljub številnim raziskavam, ki dokazujejo vpletenost wnt signalizacije v razvoju fibroze, natančni mehanizmi vseh signalnih poti še vedno niso znani. Potrebne so še nadaljnje raziskave za razumevanje zapletene celične komunikacije in odkritje novih terapevtskih možnosti.

===Neža Žerjav: Vloga kaspaz pri celični smrti===
Kaspaze so cisteinske peptidaze, ki sodelujejo v signalnih poteh celične smrti. Poznamo več vrst celične smrti, med njii tudi apoptozo, nekrozo, nekroptozo in piroptozo. Vloga kaspaz pri apoptozi je dobro znana, so adapterski proteini ali pa aktivno sodelujejo pri postopni razgradnji celice, saj sprožijo nastajanje apoptotskih veziklov in fagocitozo celice. Nekrozo označujemo kot neprogramirano celično smrt, vendar to za nekroptozo, ki ji pravimo tudi programirana nekroza, ne drži. Slednja je namreč v celici konkurenčna apoptozi, preko kaspaz sta recipročno regulirani. Nekroptozo kaspaze zavirajo, saj inhibirajo kompleks RIPK1/RIPK3, ki z aktivacijo proteina MLKL povzroči razlitje celične vsebine, značilno za nekrozo. Kaspaze sodelujejo tudi pri piroptozi, ki je posledica stresnih dejavnikov iz okolice – poškodb, patogenih organizmov ali njihovih toksinov. Kaspaze pri piroptozi povzročijo aktivacijo gasdermina D, ki sproži celično lizo, in vnetni odziv. Poznavanje delovanja kaspaz nam omogoča tako vpogled v razvoj in mehanizem vzdrževanja homeostaze organizmov, kakor tudi razumevanje patoloških procesov, na primer multiple in amiotrofične lateralne skleroze, ishemične bolezni srca ter vnetnih odzivov zaradi okužb.

===Meta Kodrič: Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze===
Svetloba je za rastline eden od najpomembnejših okoljskih signalov, ki vplivajo na rast in razvoj. V odvisnosti od intenzitete in valovne dolžine svetlobe se pri rastlinah pojavljata dva kontrastna razvojna procesa. Fotomorfogeneza je osnovna oblika rasti, saj rastlinam omogoča razvoj v avtotrofne organizme, sposobne opravljati fotosintezo, skotomorfogeneza pa je le zavrta oblika fotomorfogeneze, ki se odvija v temi. Potek teh dveh procesov rastline uravnavajo pod vplivom svetlobnega signala v svetlobni signalni poti. V njej sodelujejo fotoreceptorji ter pozitivni in negativni regulatorji fotomorfogeneze. V temi se fotoreceptor fitokrom nahaja v biološko neaktivni obliki v citosolu rastlinske celice. Negativni regulatorji se tako lahko v jedru prosto vežejo na druge molekule. Transkripcijski faktorji PIF se v obliki dimerov vežejo na promotorske regije na molekuli DNA in s tem preprečijo prepisovanje genov za fotomorfogenezo. Proteini COP/DET/FUS delujejo kot E3 ligaze pozitivnih regulatorjev HY5, HFR1, LAF1 in tako sodelujejo pri njihovi razgradnji. Z vzajemnim delovanjem tako negativni regulatorji zatirajo potek fotomorfogeneze. Na svetlobi se fitokrom konformacijsko spremeni in preide v jedro. Tam v sodelovanju z drugimi molekulami inhibira negativne regulatorje, bodisi s preprečitvijo njihovega encimskega delovanja, bodisi s sodelovanjem pri njihovi razgradnji. Posledično lahko postanejo aktivni pozitivni regulatorji, ki se vežejo poleg promotorskih regij na DNA in tako aktivirajo prepisovanje genov za fotomorfogenezo.

===Tina Zavodnik: Mehanična transdukcija in proteini Piezo===
Praktično vsi organizmi so občutljivi na mehanske dražljaje. Fizične sile regulirajo številne fiziološke procese, nezadostni oz. napačni odzivi nanje pa lahko vodijo do številnih okvar ali bolezni. Naše zaznavanje teh dražljajev in njihova pretvorba v biokemijske informacije, imenovana tudi mehanotransdukcija, sta torej ključna za dojemanje sveta okoli nas in odzivanje nanj. To nam omogočajo čutila, navadno sestavljena iz čutilne celice ali receptorja in senzoričnega nevrona. Zaradi obstoja mnogo različnih vrst in intenzitet dražljajev so se tudi čutnice in senzorični nevroni specializirali v zaznavanje vsakega od stimulusov. Merklovi živčni končiči so mehanski receptorji, sposobni zaznavati nežen pritisk na koži. To pa jim omogočajo posebni ionski kanalčki, imenovani proteini Piezo. Nežen dotik na površini kože sproži prenos mehaničnega dražljaja do Merklovih živčnih končičev, kjer se aktivira kanalček Piezo2 v Merklovi celici. Aktivacija kanalčka omogoči prehod kalcijevih in natrijevih ionov v notranjost celice. Merklova celica se depolarizira in sproži akcijski potencial v pripadajočem aferentnem nevronu. Mehanični dražljaj pa aktivira tudi kanalčke Piezo2 v membrani SA1 aferentnega nevrona in s tem sproži dodatno vzpostavitev akcijskega potenciala. Pred kratkim je bila odkrita struktura proteina Piezo, kar pa še vedno ne razkriva natančnega mehanizma aktivacije ionskega kanalčka zaradi mehanskega dražljaja. Najverjetneje se zaradi mehanskega dražljaja spremeni konformacija proteina Piezo. Kanalček se odpre in ioni lahko pod vplivom koncentracijskega gradienta prehajajo skozi membrano.

===Doroteja Armič: Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze===
PFK-2/FBPaza-2 (fosfofruktokinaza-2/fruktoza-2,6-bisfosfataza) je eden izmed encimov, ki sodelujejo pri regulaciji metabolizma glukoze v evkariontih. Je bifunkcionalen encim, ki uravnava, ali bo v celici potekala glikoliza ali glukoneogeneza. Za to je odgovoren posredno, saj regulira količino alosteričnega efektorja encimov PFK-1 in FBPaza-1 – fruktoze-2,6-bisfosfata. En encim ima dve katalitični domeni. Kinazna domena katalizira sintezo, bisfosfatazna domena pa razgradnjo fruktoze-2,6-bisfosfata. Delovanje encima je regulirano na nivoju posttranslacijske modifikacije, in sicer s fosforilacijo/defosforilacijo. Pri sesalcih obstajajo štirje različni izocimi, vsakega kodira drug gen. Ti izocimi so jetrni, srčni, možganski in izocim testisov. Vsak izocim pa ima več izooblik, ki nastanejo z alternativnim spajanjem eksonov. Izooblike se razlikujejo v regulatornih regijah. Fosforilirajo in defosforilirajo jih drugačne kinaze, nekatere izooblike pa fosforilacijskih mest sploh nimajo. Encim PFK-2/FBPaza-2 je nastal s fuzijo dveh genov. Encim se je razvil tako, da je funkcionalen samo, če sta prisotni obe domeni. Tudi pri tripanosomatidih in kvasovkah, kjer je encim monofunkcionalen, je zato še vedno zapis za obe domeni. V razvoju je prišlo do različnih izooblik v različnih tkivih oziroma organizmih zaradi drugačnih potreb za metabolizem glukoze. Ker PFK-2/FBPaza uravnava glikolizo in glukoneogenezo, bi lahko tarčno reguliranje encima postalo nov način zdravljenja diabetesa.

===Martina Lokar: Biotinilacija proteinov ===
Biotin je pomemben encimski kofaktor, saj olajša prenos karboksilne skupine med metaboliti pri karboksilaciji, dekarboksilaciji in transkarboksilaciji. Biotin protein ligaza (BPL) ga v procesu biotinilacije veže na tarčni biotin-odvisen encim. Biotinilacija je dvostopenjski proces, pri katerem pride v prvem koraku do ligacije biotina in ATP ter nastanka intermediata biotinil-AMP. V drugem koraku se biotin iz biotinil-AMP veže na tarčni encim in pride do sprostitve molekule AMP. Ker je biotin v naravi redek, organizmi natančno uravnavajo njegovo porabo. Evkarionti so nezmožni sami sintetizirati biotin, zato ga pridobivajo iz okolja. Zadostno količino ohranjajo v biotinskem ciklu z reciklacijo biotina iz biotin-odvisnih encimov. Pri metaboličnih procesih sesalcev sodeluje pet biotin-odvisnih karboksilaz, ki so v splošnem zgrajene iz treh domen: domene BC, domene CT in domene BCCD. Biotin je kovalentno vezan na lizinski ostanek v domeni BCCD in se preko modela zibajoče roke ali modela zibajoče domene med katalizo translocira iz domene BC v domeno CT. Karboksilaze katalizirajo reakcijo prenosa karboksilne skupine na substrat v dveh korakih. Najprej se v domeni BC karboksilna skupina veže na biotin. Slednji se nato premakne v domeno CT, kjer se karboksilna skupina iz biotina prenese na substrat. Če telo ni sposobno uravnavati in izkoriščati zaloge biotina, človek oboli za boleznijo MCD.

===Lara Drinovec: AMPK in avtofagija pri glukoznem/glikogenem metabolizmu===
Glukozni/glikogeni metabolizem je primarna metabolična pot, ki je uravnavana na najrazličnejših nivojih, glede na potrebe celice. Znano je, da raven glukoze v krvi uravnavata dva hormona: inzulin, ki omogoča prevzem glukoze v celico in glukagon z nasprotno učinkovitostjo. Metabolni regulator, ki deluje od inzulina neodvisno in se odziva na krčenje mišic, je AMPK (AMP-aktivirana protein kinaza). Aktivira jo lahko AMP, tako da se veže na vezavno mesto na eni izmed treh podenot AMPK. Spremembo koncentracije AMP lahko AMPK zazna hitreje kot spremembo koncentracije ATP. Aktivirana AMPK inhibira anabolne poti in aktivira katabolne procese, ter tako vzdržuje energijsko homoestazo v aktivnih celicah. Pomembno vlogo pri vzdrževanju nivoja glukoze v celici igra tudi avtofagija, ki povzroči razgradnjo hranilnih snovi, kot so glikogen in lipidne kapljice, s tem zagotovi celici zadostno količino glukoze, in tako deluje kot nadomesten proces za glukoneogenezo. Tudi ta proces je v celicah uravnavan, in sicer z različnimi signalnimi molekulami. Mnogo bolezni, kot sta na primer diabetes in rak, sta tesno povezani z nefunkcionalnostjo nekaterih metaboličnih senzorjev ali avtofagije, zato je razumevanje njihovih funkcionalnih interakcij osnova za nove terapevtske možnosti.

=== Tina Kolenc Milavec: Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule pri vnetnem in protivnetnem odgovoru===
Intermediati Krebsovega cikla imajo v celici pomembno vlogo, saj ne služijo le kot vmesni produkti v procesu nastanka molekul ATP, temveč tudi kot prekurzorji za sintezo drugih biološko pomembnih molekul ter kot signalne molekule v številnih metaboličnih poteh. Ko se na tolične receptorje (TLR4) na površini makrofaga vežejo s patogeni povezani molekulski vzorci, pride v celici do preklopa metabolizma z oksidativne fosforilacije na glikolizo za namene pridobivanja energije v obliki ATP, kar neposredno vpliva na vnetno stanje v celici. Krebsov cikel, ki sedaj nima več vloge zagotavljanja energije celici, se prekine na dveh mestih: za sukcinatom ter pri izocitrat dehidrogenazi, kar omogoči, da intermediati citratnega cikla delujejo kot signalne molekule. Pri vnetnem odzivu organizma na patogene sta zelo pomembna sukcinat in citrat. Prvi povzroči povišanje koncentracije Hif1α v celici ter nastanek reaktivnih kisikovih spojin (ROS) zaradi vzvratnega elektronskega transporta, citrat pa deluje kot substrat za verigo reakcij, ki prav tako vodijo do nastanka ROS. Pri ponovni vzpostavitvi normalnih razmer v celici po uspešni odstranitvi patogenov pa ima pomembno vlogo itakonat - molekula, ki nastane iz cis-akonitata. Ta vpliva na tri pomembne molekule (sukcinat dehidrogenazo, Nrf2 ter ATF3), ki sprožijo vsaka svojo kaskado reakcij protivnetnega odgovora.

===Valeriya Musina: Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na celične procese===
Krebsov cikel je bil oblikovan osedemdeset let nazaj, vloge njegovih inermediatov, zlasti sukcinata in fumarata, pa so bile odkrite nedavno. V zadnjem času so bile narejene številne raziskave človeških bolezni, zlasti niza specifičnih vrst raka, ki so razkrile pomembne vloge intermediatov Krebsovega cikla pri metilaciji genov in s tem pri preoblikovanju celic. Intermediati Krebsovega cikla lahko delujejo kot primarni substrati, signalne molekule ali sodelujejo pri posttranslacijskih modifikacijah. Vedno več dokazov kaže, da ima epigenetika pomembno vlogo pri regulaciji dobe zdravja, in je vključena v proces staranja. 2-oksoglutarat (α-ketoglutarat) je ključni metabolit v Krebsovem ciklu, vendar je tudi obvezen substrat za 2-oksoglutarat odvisne dioksigenaze (2-OGDO). Družina encimov 2-OGDO vključuje glavne encime za demetilacijo DNA in histonov, encime Ten-Eleven translocation (TETs) in encime z domeno Jumonji C (JmjC). Poleg tega lahko člani družine 2-OGDO regulirajo sintezo kolagena in odzive na hipoksično okolje tudi na neepigenetski način. 2-oksoglutarat je substrat 2-oksoglutarat dehidrogenaz (2-OGDH), zato lahko motnje v funkciji 2-OGDH v Krebsovem ciklu povzročijo globalne degenerativne spremembe v strukturi kromatina. Sukcinat in fumarat močna inhibitorja 2-OGDO encimov, zato ravnotežje reakcij v Krebsovem ciklu lahko vpliva na raven metilacije DNA in histonov ter tako nadzira izražanje genov.

===Marko Pavleković: Vloga sukcinata kot ligand z G proteini vezanega receptorja GPR91===
Znano je, da je cikel citronske kisline osrednjega pomena za presnovo celic in energetsko homeostazo. Vendar marsikateri intermediat cikla igra vlogo tudi v drugih procesih v telesu. Na primer sukcinat deluje kot ekstracelularni ligand z vezavo na z G proteinom vezan receptor, znan kot GPR91, izražen v ledvicah, jetrih, srcu, retinalnih celicah in morda v številnih drugih tkivih, kar vodi do širokega nabora fizioloških in patoloških učinkov. V normalnih pogojih se sukcinata ne sintetizira dovolj, da bi lahko aktiviral GPR91, šele v pogojih kot so ishemija, diabetes in hipoksija, sukcinata nastane dovolj. Ker pa sukcinat nastaja v matriksu mitohondrija mora na poti do receptorja, ki se nahaja na zunanji strani celic, prečkati še tri membrane. Skozi GPR91 je sukcinat vključen v funkcije, kot so uravnavanje krvnega tlaka, zaviranje lipolize v belem maščobnem tkivu, razvoj vaskularizacije mrežnice, srčna hipertrofija in aktivacija zvezdastih jetrnih celic z ishemičnimi hepatociti. Zaradi tega je sukcinatni receptor obetajoč cilj za zdravila za preprečevanje teh neželenih patoloških učinkov. Nedavni razvoj antagonistov, specifičnih za SUCNR1, odpira nove možnosti za raziskave v modelih za te motnje in lahko sčasoma zagotovi nove možnosti za zdravljenje bolnikov.

===Klementina Polanec: Sirtuini kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin===
Sirtuini so družina visoko ohranjenih proteinov (SIRT1-SIRT7 pri sesalcih), ki imajo regulatorno vlogo v metabolizmu in staranju. Delujejo kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin v odgovor na številne strese za celico, kot so omejitev kalorij, postenje, mraz. Ker se zniža nivo ATP v celici in je glukoze premalo, se poveča razgradnja glikogena, hkrati pa se pospeši oksidacija maščobnih kislin v mišicah in jetrih. Do nedavnega je veljajo prepričanje, da je aktivnost sirtuinov odvisna le od koncentracije NAD+ v celici. Raziskovalci so pred kratkim dokazali, da se lahko SIRT1 aktivira tudi s fosforilacijo, ki jo izvede protein kinaza A (PKA). Ko so sirtuini aktivirani, delujejo v glavnem kot deacetilaze številnih encimov, s čimer jih aktivirajo. SIRT1 tako deacetilira PGC1α, ki pospeši izražanje tarčnih genov, ki so povezani z oksidacijo maščobnih kislin. SIRT3 pa odvisno od koncentracije NAD+ deacetilira in s tem aktivira LCAD (long-chain acyl-CoA dehydrogenase). To je pri miših ključen encim, ki sodeluje v oksidaciji dolgoverižnih maščobnih kislin. S pospešeno oksidacijo celica dvigne nivo ATP in ponovno vzpostavi homeostazo. Sirtuini so zato lahko potencialna tarča za zdravljenje motenj v oksidaciji maščobnih kislin ter tudi za preprečevanje prekomerne teže oziroma debelosti.

===Tadej Medved: Vpliv oksidacije maščobnih kislin na usodo celic===
Usodo celic, tj. končne lastnosti, ki jih bo celica izražala po razvoju in diferenciaciji, določajo številni procesi. Mednje spada tudi metabolična β-oksidacija maščobnih kislin. Izkaže se, da je količina acetil-CoA, pridobljena preko oksidacije maščobnih kislin, pogosto odločilni dejavnik za izražanje lastnosti določenih tipov celic; do sedaj je bil ta vpliv raziskan v endotelijskih celicah limfnih žil in srca ter v limfocitih T. Ključna regulacija oksidacije MK se prične pri izražanju encima CPT1, ki omogoča transport maščobnih kislin v mitohondrij. V srčnem endoteliju vpliva ta proces na pretvorbo endotelijskih celic v mezenhimske, in sicer zaradi TGF-β signalizacije, ki z inhibicijo metabolizma MK sproži spremembe celičnih lastnosti v mezenhimske. V endoteliju limfnih žil je oksidacija MK pomembna za vršenje limfangiogeneze, tj. tvorbe novih limfnih žil s proliferacijo in diferenciacijo obstoječih limfnih endotelijskih celic. Ta proces je odvisen od signalov VEGF-C in PROX1; slednji poveča izražanje CPT1 in pripravi celico do migracije in proliferacije. Količina acetil-CoA je relevanten dejavnik za diferenciacijo in dolgoživost spominskih T celic, povezana pa je preko aktivacije AMPK s signalno molekulo TRAF6. V T celicah na sploh pa močno učinkuje PD-1, ki pospeši tako hidrolizo MK kot tudi njihovo oksidacijo in omogoča preživetje teh celic v pogojih, kjer niso sposobne sprejemanja drugih hranilnih snovi, kot je glukoza.

===Rebeka Dajčman: Metabolizen, signalizacija in farmakološka funkcija ketonskih teles===
ketonska telesa nastanejo kot stranski produk pri presnovi maščobnih kislin. mednje sodijo acetoacetat, aceton in najobstojnejši beta hidroksibutirat. njihova sinteza se poveča, ko telesu primanjkuje ogljikovih hidratov. to je med stradanjem, po športni aktivnosti, med nosečnostjo ali med ketonsko dieto. v seminarski nalogi bom predstavila metabolično bot ketonskih teles. od sinteze v jetrih do njihovega transporta v ostala tkiva. to so predvsem skeletne mišice, srce in možgani ter njihovo oksidacijo nazaj v acetil-CoA. sinteza ketonskih teles je regulirana s transkripcijsko in post-translacijsko regulacijo. pri tem gre predvsem za regulacijo encimov, ki sodelujejo v sintezi in razgradnji teles. ketonska telesa pa imajo vlogo regulacije dveh membranskih receptorje ali histonske deacetilaze. ketonska telesa se že desetletja uporabljajo v zdravljenju nevrodegenerativnih bolezni in v tej smeri tudi tečejo prihodnje raziskave

===Sumeja Kudelić: Transsulfuracijska pot kot obrambni mehanizem celic pri oksidativnem stresu===
Transsulfuracijska pot, kot novo raziskovalno področje nam podarja veliko pozitivnih načinov v boju proti oksidativnemu stresu. Oksidativni stres, kot negativni dejavnik celic s svojimi reaktivnimi kisikovim zvrsti, poškoduje različne celične organele, kar vodi do celične smrti. Pri transsulfuraciji poti je ugotovljeno, da bistveni pomen ima cistein y-liaza, ki je biosintetični encim cisteina. Pri razgradnji cisteina lahko pridobimo vodikov sulfid (H2S), ki je v zelo majhnih koncentracijah pomemben signalizator celice. Več mehanizmov pozitivnega delovanja transsulfuracije poti (posredne ali neposredne) je raziskano, te so prišli do rezultatov, ki bi lahko pomagali pri izboljšanem terapevtskem zdravljenju nevrodegenerativnih bolezni, ki so povezane z metabolizmom aminokislin. Važno je iztakniti, da s pomočjo tega mehanizma ali z njeno inhibicijo bi tudi vplivali na bakterijsko smrt. Saj se pri bakterijah razvila obrambna stimulacija transsulfuracijske poti, pri čemer so bakterije postale 'imune' na antibiotike. Vodikov sulfid kot pomemben dejavnik transsulfuracijske poti vpliva na to, da veže proste ione, ki bi lahko v oksidativnih pogojih (H2O2) reagirali s to spojino. Kot posledica reakcije nastanejo prosti kisikovi radikali, ki poškodujejo celične organele. Nevrodegenerativne bolezni uporabljajo transsulfuracijsko pot kod pomemben vir aminokislin in tudi s tem preprečujejo, da so njihove celice izpostavljene oksidativnemu stresu.

===Matija Ruparčič: Ureaze in njihova vloga v živih bitjih===
Ureaze so metaloencimi, ki katalizirajo hidrolizo uree oziroma sečnine. Pri tem nastaneta dve molekuli amoniaka ter ena molekula ogljikovega dioksida. Najdemo jih v veliko organizmih kot so rastline, glive in bakterije. Le živali jih nimajo, saj se pri njih sečnina tvori kot odpadni produkt. Strukturno se razlikujejo glede na vrsto organizma, zapis za njihove sestavne dele pa se skriva v velikem številu genov. Za organizme, ki jih vsebujejo, predstavljajo ključen faktor za življenje. S pomočjo njih lahko bakterije ''Helicobacter pylori'' preživijo v ekstremno kislih razmerah želodca, bakterijam ''Proteus mirabilis'' omogočajo tvorbo zaščitnih biofilmov, rastlinam pa zagotavljajo bogat vir dušika in jim pomagajo pri katabolizmu arginina. Pred kratkim pa so odkrili, da imajo poleg tega ureaze še druge naloge, ki niso povezane z njihovo katalitično sposobnostjo. Med te štejemo vlogo medcelične komunikacije pri lišajih, obramba pred oksidativnim stresom kot odgovor imunskega sistema in še veliko več. Poznamo jih sicer že skoraj 150 let, vendar o njih vemo še vedno relativno malo. Motivacija za njihovo preučevanje pa je velika, saj nam lahko pomagajo k napredkom na raznih področjih kot sta medicina in agronomija.
===Maks Kumek: Vloga metabolizma arginina v celični regulaciji in erekcija===
Izmed vseh intermediatov ureinega ciklusa je pravzagotovo arginin najbolj prepleten v razne regulacijske sisteme celice. Metabolične poti arginina so kompleksne in se mnogokrat prepletajo med seboj. Sinteza arginina poteka v različnih predelih telesa v ti. črevesno renalni osi. Pretvorba glutamina vse do citrulina poteka v celicah tankega črevesja. Citrulin se izloči v krvni obtok in potuje do ledvic, kjer se nadaljnjo sintetizira do argenina. Regulacija nastajanja produktov je tesno povezana z transportnimi regulatorji družine SLC7 ( CAT 1, CAT-2A, y+LAT, b0,+, CAT-2B) . Regulacija transporterjev ne poteka le na transkripcijskem nivoju temveč tudi na posttranslacijskem nivoju (npr. spermin). Kompleksnost s poglabljanjem le narašča.Vrste encimov, pri katerih igra arginin vlogo substrata so: arginaza, NOS (ang. nitric oxide synthase), arginin dekarboksilaza (ADC), arginin:glicil amidinotransferaza. Posebno pomembnost ima NOS,ki so trije izocimi: iNOS, nNOS, eNOS. Ti trije encimi so prostorsko in regulacijsko ločeni med seboj, vendar pa je moč tudi pri njih zapaziti prepletanje delovanja v procesu, kot je erekcija.Razumevanje vloge metaboličnih produktov arginina v celic pomaga razumeti širšo sliko imunološkega odziva, preprečevanje bolezenskih stanj (npr. impotence) in konec koncev pomaga tudi pri razumevanju lastnega telesa.

===Anže Šumah: Delovanje proteina termogenina in njegov pomen pri termogenezi===
Ohranjanje stalne telesne temperature je za toplokrvne organizme življenjskega pomena. Eden izmed mehanizmov termoregulacije je termogeneza – proizvodnja toplote. Pri sesalcih se je razvilo posebno tkivo, katerega osnovna naloga je termogeneza. To je rjavo maščobno tkivo, ki je pomembno predvsem za majhne sesalce, pri ljudeh pa se v večji meri pojavlja pri novorojenčkih. V notranji membrani mitohondrijev tega tkiva se nahaja protein termogenin, imenovan tudi UCP1, ki energijo protonskega gradienta, nastalega pri dihalni verigi, porabi za proizvodnjo toplote, namesto da bi se le-ta porabila za sintezo ATP. Glavni regulatorji termogenina so proste maščobne kisline in purinski nukleotidi, pri čemer delujejo prve kot aktivatorji, slednji pa kot inhibitorji. Sam mehanizem prenosa protonov iz medmembranskega prostora v matriks še ni popolnoma jasen, sta se pa uveljavila dva modela. Prvi predpostavlja, da deluje termogenin kot simporter maščobnih kislin in protonov. Drugi model pa ugotavlja, da je termogenin uniporter za maščobne kisline, katere prenaša v medmembranski prostor. Tam se protoni vežejo na njih in lahko tako skupaj difundirajo skozi membrano. Ker številni znanstveniki menijo, da bi lahko uporabili izsledke o delovanja in regulacije termogenina v boju proti debelosti in z njo povezanih bolezni, je pomembno, da se raziskave na tem področju nadaljujejo.

===Liza Praznik: Dinamična strukture mitohondrija za opravljanje raznolikih funkcij===
Sposobnost opravljanja raznolikih funkcij mitohondrija je posledica dveh prilagodljivih membran znotraj njega. Tvorita dinamičen organel s sposobnostjo nenehnega spreminjanja svoje oblike. Za to so zadolženi proteini MTC (mitochondria shaping proteins), ki so zasidrani v obeh membranah, od koder skrbijo za pravilno urejenost mitohondrija, primer takšnih proteinov je OPA1, MTF1 in MTF2, Drp1 ter proteinski kompleks MICOS. Najzaznavnejše so spremembe v mitohondrijskih kristah, ki jih tvori notranja membrana. Gre za kompartment, bogat s proteini, preko katerega je regulirana struktura mitohondrija. Ta organel se deli neodvisno od celice, v kateri se nahaja, razvil je lasten življenski cikel mitohondrija. Gre za nenehne procese fuzije (spajanje) in fizije (cepitve), preko katerih mitohondrij uravnava število organelov, hkrati pa izloča in razgradi tiste dele, ki delujejo nepravilno oziroma so poškodovani. S tem istim mehanizmom se odzove tudi na različno količino hranil, ki je celici na voljo. V presežkih razpade na krajše fragmente, v primankljaju pa tvori podaljšano obliko z večjo gostoto krist, v katerih pospešeno nastaja ATP. Takšno obliko tvori tudi kot odgovor na avtofagijo in se zato ne razgradi, temveč preskrbi celico z energijo. Pomemben je odgovor mitohondrija na apoptozo, signal zanjo povzroči spremembe v delovanju proteinov, OPA1 se razpre in citokrom c se iz krist je preko kanalčkov sprosti v citosol.

===Barbara Jaklič: Vloga proton-črpajočega rodopsina pri fotofosforilaciji in drugih procesih odvisnih od protonske gonilne sile===
Poznamo več vrst rodopsinskih kompleksov: signalni pretvorniki, ionske črpalke in protonske črpalke. Slednje sestavlja 7 transmembranskih alfa vijačnic, z vmesnimi kratkimi zankami. V sredini je na aspartatni kislinski ostanek s svojim N-koncem vezana molekula retinala. Retinal je večinoma edini pigment v proton črpajočih rodopsinih (PPR), njegova vijolična barva se odraža v barvi celotnega kompleksa. Retinal je tudi ključnega pomena za delovanje PPR, saj absorpcija fotonov povzroči njegovo konformacijsko spremembo in s tem črpanje protonov skozi membrano. V eni od vrst PPR imenovani ksantorodopsini so prisotni antenski pigmenti keto-karotenoidi, ki razširijo absorpcijski spekter, saj je v osnovi omejen na ozek pas zeleno-modre vidne svetlobe. Potencialna uporaba PPR v genskem inženiringu je usmerjena predvsem v heterologno ekspresijo v gostiteljskih celicah, s katero lahko v heterotrofne organizme uvedemo avtotrofijo ali pa PPR izrazimo le kot dodaten vir črpanja protonov, saj so številni metabolični procesi odvisni prav od protonske gonilne sile. Rodopsinski proton-črpajoči kompleksi so dokazano manj učinkoviti za ustvarjanje protonskega gradienta kot klorofilni, ker lahko v enem fotociklu prečrpajo največ en proton, vendar je njihova heterologna ekspresija bolj preprosta, ker jih poleg genov za sam rodopsin kodira samo 5 dodatnih genov za biosintezo retinala.

BIO2 Seminar 2018

2018-12-01T00:52:11Z

Barbara Jaklič: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Eva Gartner || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Eva_Gartner:_Wnt_signalizacija_in_njena_vloga_pri_sr.C4.8Dni_fibrozi Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi] || Anamarija Agnič || Anastasija Nechevska || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Aljaž Bratina || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Alja.C5.BE_Bratina:_Pomen_razli.C4.8Dnih_signalnih_poti_pri_staranju Pomen različnih signalnih poti pri staranju]|| Lara Drinovec || Liza Ulčakar || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Karmen Mlinar || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Karmen_Mlinar:_Signalizacija_in_odzivi_na_abiotski_stres_pri_rastlinah Signalizacija in odzivi na abiotski stres v rastlinah] || Luka Gnidovec || Maja Škof || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Tina Zavodnik || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Zavodnik:_Mehani.C4.8Dna_transdukcija_in_proteini_Piezo Mehanična transdukcija in proteini Piezo] || Jernej Imperl || Ajda Godec || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Meta Kodrič || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Meta_Kodri.C4.8D:_Svetlobne_signalne_poti_za_uravnavanje_fotomorfogeneze Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze] || Laura Gašperšič || Neža Blaznik || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Neža Žerjav || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Ne.C5.BEa_.C5.BDerjav:_Vloga_kaspaz_pri_celi.C4.8Dni_smrti Vloga kaspaz pri celični smrti] || Nika Boštic || Urša Štrancar || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Doroteja Armič || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Doroteja_Armi.C4.8D:_Bifunkcionalen_encim_PFK-2.2FFBPaza-2_in_njegova_vloga_v_metabolizmu_glukoze Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze] || Eva Gartner || Anamarija Agnič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Lara Drinovec || 14-15 || AMPK in avtofagija pri glukoznem/glikogenem metabolizmu || Aljaž Bratina || Barbara Jaklič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Martina Lokar || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Martina_Lokar:_Biotinilacija_proteinov Biotinilacija proteinov]|| Karmen Mlinar || Luka Gnidovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Marko Pavleković || 16 || Vloga sukcinata kot ligand z G proteini vezanega receptorja GPR91 || Tina Zavodnik || Jernej Imperl || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Valeriya Musina || 16 || Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na celične procese || Meta Kodrič || Laura Gašperšič || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Tina Kolenc Milavec || 16 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Kolenc_Milavec:_Intermediati_Krebsovega_cikla_kot_signalne_molekule_pri_vnetnem_in_protivnetnem_odgovoru Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule pri vnetnem in protivnetnem odgovoru]|| Neža Žerjav || Nika Boštic || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Andrej Špenko || 17 || Regulacija oksidacije maščobnih kislin v skeletnih mišicah || Doroteja Armič || Eva Gartner || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Tadej Medved || 17 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tadej_Medved:_Vpliv_oksidacije_ma.C5.A1.C4.8Dobnih_kislin_na_usodo_celic Vpliv oksidacije maščobnih kislin na usodo celic] || Sanja Stanković || Aljaž Bratina || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Klementina Polanec || 17 || Sirtuini kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin || Martina Lokar || Karmen Mlinar || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Rebeka Dajčman || 17 || Ketonska telesa kot signalni metaboliti || Marko Pavleković || Tina Zavodnik || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Sumeja Kudelić || 18 || Transsulfuracijska pot kot obrambni mehanizem celic pri oksidativnem stresu || Valeriya Musina || Meta Kodrič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Matija Ruparčič || 18 || Ureaze in njihova vloga v živih bitjih || Tina Kolenc Milavec || Neža Žerjav || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Maks Kumek || 18 || Vloga metabolizma arginina v celični regulaciji in erekcija || Andrej Špenko || Doroteja Armič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Anže Šumah || 19 || Delovanje proteina termogenina in njegov pomen pri termogenezi || Tadej Medved || Sanja Stanković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Barbara Jaklič || 19 || Vloga proton-črpajočega rodopsina pri fotofosforilaciji in drugih procesih odvisnih od protonske gonilne sile || Klementina Polanec || Martina Lokar || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Gašper Anton Komatar || 19 || Kako športna vadba pospeši biosintezo mitohondrijev in vpliva na zdravje || Rebeka Dajčman || Marko Pavleković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Praznik Liza || 19 || Dinamična struktura mitohondrija za opravljanje raznolikih funkcij || Sumeja Kudelić || Valeriya Musina || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Lara Hrvatin || 20 || Mehanizmi koncentriranja ogljika || Matija Ruparčič || Tina Kolenc Milavec || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Sonja Gabrijelčič || 20 || Biosinteza bakterijske celuloze || Maks Kumek || Andrej Špenko || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Anastasija Nechevska || 20 || Synthesis, regulation and degradation of bacterial peptidoglycan || Anže Šumah || Tadej Medved || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Liza Ulčakar || 21 || Vloga interakcij med lipidnimi kapljicami in organeli pri homeostazi lipidov|| Barbara Jaklič || Klementina Polanec || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Maja Škof || 21 || Sinteza sfingolipidov || Gašper Anton Komatar || Rebeka Dajčman || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Ajda Godec || 21 || Biosinteza leukotriena B4 || Praznik Liza || Sumeja Kudelić || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Neža Blaznik || 22 || moj naslov || Lara Hrvatin || Matija Ruparčič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Urša Štrancar || 22 || moj naslov || Sonja Gabrijelčič || Maks Kumek || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Anamarija Agnič || 22 || moj naslov || Anastasija Nechevska || Anže Šumah || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Sanja Stanković || 23 || moj naslov || Liza Ulčakar || Lara Drinovec|| 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Luka Gnidovec || 23 || moj naslov || Maja Škof || Gašper Anton Komatar || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Jernej Imperl || 23 || moj naslov || Ajda Godec || Praznik Liza || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Laura Gašperšič || 23 || moj naslov || Neža Blaznik || Lara Hrvatin || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Nika Boštic || 23 || moj naslov || Urša Štrancar || Sonja Gabrijelčič || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2018|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2017 Povzetki seminarjev

2018-05-09T19:37:10Z

Barbara Jaklič: /* Ana Scott: Naslov seminarja */

[[TBK2017-seminar|Nazaj na osnovno stran]]
===Ana Scott: Naslov seminarja===
Tekst ....

'''Uroš Prešern: Nukleaza, ki povzroči partanatos oziroma od PARP-1 odvisno celično smrt'''

Partanatos je ena izmed vrst celične smrti, ki nastopi zaradi prevelike aktivnosti poli(ADP-riboza) polimeraze 1 (PARP-1) v jedru. Pogost je v primeru možganske kapi, infarkta in nevrodegenerativnih boleznih, zaradi česar bi boljše poznavanje samega procesa omogočilo razvoj novih načinov zdravljenja teh obolenj. V predhodnih raziskavah so ugotovili, da partanatos nastopi, ko molekule poli-ADP-riboze, ki jih PARP-1 sintetizira, preidejo iz jedra v citosol, kjer aktivirajo premestitev indukcijskega faktorja apoptoze (AIF) iz mitohondrijev v jedro. Temu sledi razrez DNA. Nukleaza, ki povzroči razrez DNA, je bila do nedavnega manjkajoči člen v partanatosu. Skupini raziskovalcev je uspelo odkriti, da je iskana nukleaza inhibitorni dejavnik migracije makrofagov (MIF). Pokazali so, da se med partanatosom MIF veže na AIF in se skupaj z njim premesti v jedro, kjer povzroči fragmentacijo DNA. Inhibicija nukleazne aktivnosti MIF se je v modelu možganske kapi pri miših odrazila v 75-odstotnem zmanjšanju volumna prizadetega tkiva, pospešeno pa je bilo tudi okrevanje. Rezultati raziskave odpirajo potencialne možnosti za zdravljenje akutnih in kroničnih nevroloških bolezni, v katerih nastopi partanatos.

'''Doroteja Armič: Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR'''

Pluripotentne matične celice so še nediferencirane celice, ki imajo sposobnost, da se diferencirajo v skoraj vse tipe celic. Poznamo več vrst pluripotentnih matičnih celic. Ene izmed njih so inducirane pluripotentne matične celice (celice iPS). To so pluripotentne celice, ki jih umetno dediferencirajo iz odraslih somatskih celic. Leta 2006 so odkrili postopek pridobivanja celic iPS iz mišjih fibroblastov. Ugotovili so, da so za reprogramiranje somatskih celic najpomembnejši štirje transkripcijski dejavniki, in sicer Oct4, Sox2, Klf4 in c-Myc. Letos pa je skupini znanstvenikov uspelo odkriti nov, bolj enostaven postopek pridobivanja celic iPS. Ugotovili so namreč, da lahko sprožijo njihov nastanek že z aktivacijo enega samega gena – Oct4 ali Sox2. Aktivacija Sox2-promotorja oziroma Oct4-promotorja in Oct4-ojačevalca hkrati pa nato povzroči aktivacijo ostalih genov, ki sodelujejo pri vzpostavitvi pluripotentnosti v celicah. Za aktivacijo genov so uporabili tehnologijo CRISPR. Primerjali so uporabo dveh sistemov – dCas9-SunTag-VP64 in dCas9-SunTag-p300core. V obeh primerih so dobili primerljive rezultate. Uporaba celic iPS je pomembna v regenerativni medicini, saj lahko zamenja uporabo človeških embrionalnih matičnih celic. Z uporabo celic iPS, generiranih iz pacientovih lastnih celic, ne bi prišlo do zavrnitvenih reakcij, prav tako pa bi se izognili etičnih pomislekov. Znanstveniki predvidevajo, da lahko tehnologija reprogramiranja celic, ki so jo uporabili na mišjih celicah, z manjšimi spremembami deluje tudi na človeških celicah.

'''Dea Simonič: Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu'''

Avtoimunska bolezen je bolezen, ki nastane zaradi pretiranega odziva imunskega sistema na celice, ki so last organizma. Veliko vlogo pri nastanku avtoimunske bolezni imajo limfociti B, ki omogočajo humoralni imunski odziv. Transkripcijski faktor T-bet v limfocitih B povzroči razvoj ABC, te celice so pa »pogon« avtoimunske bolezni. Avtoimunska bolezen se v veliki večini primerov razširi po telesu . Vzrok tega so ravno limfociti B, ki razširijo svoj napad po telesu in pride do širjenja epitopa. Ta proces se začne, ko imunski sistem napade antigene na drugih delih telesa, ki jih na začetku ni hotel uničiti. Telo začne pospeševano uničevati lastna tkiva. Da bi razumeli, zakaj pride do tega mehanizma so raziskovalci uporabili fluorescenčne markerje beljakovin, ki razlikujejo različne celične skupke limfocitov B (oziroma germinalne centre), na miših obolelih z lupusom. V germinalnih centrih limfociti B »tekmujejo« med sabo, kateri bo naredil najboljše protitelo, ki bo nevtraliziralo zaznano grožnjo. Te germinalne skupke so s pomočjo markerjev zaznali kot 10 različnih barv. Po tednu ali dveh začne prevladovati ena sama barva. Ta germinalni skupek je ustvaril najboljše protitelo in skupaj z ostalimi limfociti aktiviral avtoimunski protinapad. S to študijo so raziskovalci naredili velik korak v smer zaustavitve oziroma zdravljenja avtoimunske bolezni.

'''Valeriya Musina: Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke'''

Uničenje mitohondrijev je eden najbolj obetavnih pristopov pri razvoju novih zdravil proti raku. Znanstveniki so sintetizirali peptid, ki vsebuje baker, ki ga zlahka sprejmejo mitohondriji v matičnih celicah raka dojk, kjer le ta učinkovito povzroča apoptozo. Rakaste celice, ki imajo povečani metabolizem, ne samo, da vsebujejo več mitohondrijev kot zdrave celice, temveč so te tudi drugačni, strukturno in funkcionalno. Zaradi posebnih značilnosti in njihove odločilne vloge v presnovi celic so maligne mitohondrije pomembne tarčej za nove terapevtske spojine. Mitohondrije je možno uničiti z uvajanjem sredstev za proizvajanje reaktivnih vrst kisika (ROS). Te reaktivne spojine ovirajo metabolizem mitohondrijev. Kot močan ROS generator je bila predlagana organokovinska spojina bakrov(II) fenantrolin. Za dostavo in prenos skozi zunanjo membrano mitohondrija pa so bakrov(II) fenantrolin vezali na specifičen peptid, ki prodira v mitohondrije. Preizkusi so bili izvedeni z dvema celicnima linijama raka dojke, ena celična linija je vsebovala matične celice raka dojk. Rezultati so bili : odvisna od količine odmerka izguba sposobnosti za preživetje, razpad membran mitohondrijev, nastanek ROS in slabši metabolizma mitohondrijev. Zdravilo je bolj vplivalo na matične celice raka, kar je bilo razloženo z večjo vsebnostjo mitohondrijev. Ta študija izpostavlja potencial metalopeptida tako za dostavo kot tudi za uničenje mitohondrijev, zlasti v matičnih celicah raka.

'''Neža Štremfelj: Delovanje inzulinskih receptorjev'''

Človeški inzulinski receptorji igrajo pomembno vlogo v človeškem telesu. Signalizacija z inzulinskimi receptorji igra ključno vlogo pri regulaciji metabolizma in pri rasti v večceličnih organizmih. Nepravilno delovanje inzulinskih receptorjev je povezano z mnogimi hujšimi obolenji, na primer z rakavim obolenjem, diabetesom in Alzheimerjevo boleznijo.
Glavna ideja raziskave, ki jo opisuje članek, ki sem si ga izbrala za osnovo moje seminarske naloge je, da vezava inzulina na inzulinski receptor preoblikuje zunajcelični del transmembranskih proteinov (ektodomeno) receptorja iz U-konformacije v T-konformacijo. Prerazporeditev v ektodomeni se razširi tudi na transmembranske domene, ki so, ko je receptor neaktiviran pomaknjene narazen, ob vezavi inzulina pa se pomaknejo skupaj, kar omogoči fosforilizacijo tirozin kinaze v citoplazmi. Pri transmembranski signalizaciji z inzulinskim receptorjem poleg dimerizacije z vezavo liganda pride tudi do strukturnih sprememb znotraj receptorskega dimera.

'''Marko Pavleković: Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado'''

Multipla skleroza je avtoimunska bolezen, pri kateri limfociti napadejo živčne celice in jih demielinizirajo ter tako škodujejo prenosu signalov med nevroni. Iz predhodnih raziskav so odkrili, da sta za multiplo sklerozo najbolj krivi celiti pomagalki T 1 in T 17. Da bi prišli do centralnega živčnega sistema morata celici najprej prečkati vaskularno pregrado. Kako to dosežeta so raziskovali znanstveniki z univerze v Kolumbiji in z univerze v Kaliforniji. Z dvo-fotonsko mikroskopijo so opazovali tesne stike pri miših obolelih za eksperimentalnim avtoimunskim encefalomielitisom, ki je živalski primer multiple skleroze. Ugotovili so, da krvno-možgansko pregrado preideta na dva različna načina: s transcitozo in skozi prekinjene tesne stike med endotelnimi celicami. S pomočjo miši, ki jim je primanjkovalo kaveol (kaveolina1) pa so dokazali, da za prehod do centralnega živčnega sistema celica T 1 izkorišča transcitozo, medtem ko celica T 17 prehaja skozi prekinjene tesne stike. Te ugotovitve bi lahko močno pomagale pri nadaljnjem zdravljenju bolezni, kjer bi se osredotočili na preprečevanje dostopa imunskih celic do centralnega živčnega sistema.

'''Rebeka Dajčman: več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija'''

Kalcij igra ključno vlogo pri skoraj vseh procesih v celici. Razni signali, kot je na primer sinteza RNA in DNA ali pa migracija celic, je posledica spremembe intracelularne koncentracije kalcija. Spremembo koncentracije lahko zaznamo z merjenjem intenzivnosti fluorescentne svetlobe, ki jo oddajajo GCaMP proteini. Če celice poškodujemo z laserskim mehurčkom, ustvarimo rano, ki je podobna udarcu. Sledijo trije mehanizmi signaliziranja, ki so odvisni od velikosti rane. Takoj po poškodbi celične membrane uide kalcij iz ekstracelularne tekočine v citosol, kjer se koncentracija kalcija dvigne. Kalcij nato skupaj s signalnimi molekulami difundira v okoliške celice in temu pravimo prvi val oz. takojšnji odziv. Po 45 sekundah mu sledi drugi močnejši valj, ki pa se širi počasneje, ker skozi membrano prehajajo večji signalni proteini. Ti signali sprožijo sistemski odziv na poškodbo, ki poskrbi, da se celice v najkrajšem možnem času regenerirajo. Da pri regeneraciji povrhnjice kože ne nastanejo brazgotine poskušamo v tkivo, ki je bilo poškodovano, vstaviti lasne mešičke. Ti pripomorejo k nastajanju maščobe in tako preprečijo brazgotinjenje. Če se poškoduje žilna stena pa sistem poskrbi za nastanek strdkov, ki so sestavljeni iz krvnih celic in fibrina. Trombociti navijejo fibrin v toge zvitke in ti se s pomočjo posebnih encimov raztopijo v krvi. Nova odkritja o celičnemu celjenju pripomorejo k hitrejšemu in učinkovitejšemu celjenju ran.

'''Gašper Anton Komatar: Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri vorbi spomina'''

LTP ali dolgoročna potenciacija pomeni povečanje sinaptične moči za dolgo časa in ker gre pri tvorbi spominov prav za povečanje sinaptične aktivnosti, je med znanstveniki priznan kot najverjetnejši model učenja in tvorbe spomina na celični ravni. Med LTP se poveča število receptorjev AMPA v postsinaptični membrani, kar še dodatno poveča sinaptično moč.
Kakšen je mehanizem in katere molekule sodelujejo pri prenosu in vgradnji AMPAR v postsinaptično membrano, to je bilo glavno vprašanje raziskovalcev v članku, ki sem si ga izbral za seminarsko nalogo. Že dlje časa je bilo znano, da ephirinB2, ApoER2 in Reelin sodelujejo pri razvoju možganov kot regulatorji migracije nevronov. Znanstveniki so preverili, če sodelujejo tudi pri procesih prenosa in vgradnje AMPAR v membrano. S tehniko knockout (inaktivacija določenih genov) ter z imunoprecepcijo, so selektivno inhibirali interakcije med proteini, rezultate pa so beležili s fluorescentnimi analizami in prenosom western. Ugotovili so, da tvorba kompleksa multiplih receptorjev ApoER2/ephirinB2/AMPAR in GRIP1 povzroči vgradnjo tega AMPAR na membrano dendrita in sproži signalne kaskade, ki regulirajo vgradnjo novih AMPAR. Ko je bila interakcija med temi proteini inhibirana, so bili nevroni nezmožni reagirati na spremembe v njihovem omrežju, kar je zmanjšano sinaptično aktivnost. To pomeni, da skupki teh proteinov vzdržujejo oz. ojačajo sinaptično aktivnost. S tem so znanstveniki dokazali, da zgoraj omenjen kompleks receptorjev zares sodeluje pri tvorbi spominov.

'''Laura Gašperšič: Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2'''

Pri Alzheimerjevi bolezni je glavni simptom okvara spomina, do česar pride zaradi utišanja genov, ki sodelujejo pri tvorbi novih spominov. Do utišanja pride zaradi deacetilacije histonov, ki jo povzročijo encimi histonske deacetilaze (HDAC). Pri utišanju genov za tvorbo spominov je najpomembnejši HDAC2. Njegova raven je pri bolnikih z Alzheimerjevo boleznijo povišana. Encimi HDAC so si po zgradbi podobni, poleg tega tvori en encim več različnih kompleksov, kar lahko pri inhibiciji encimov HDAC sproži tudi stranske učinke. Raziskovalci so zato želeli najti molekulo, s katero se HDAC2 veže na promotorje genov za učenje in spomin. S prvimi raziskavami so določili 3 najbolj verjetne proteine: Tdp2, Sap30 in Sp3, z meritvami pa so ugotovili, da Sp3 vpliva na delovanje sinapse. V nadaljnjih raziskavah so dokazali, da kompleks med HDAC2 in Sp3 v bolezenskem stanju z vezavo na promotorje negativno uravnava izražanje genov povezanih z delovanjem sinapse. V zadnjem delu raziskave so želeli določiti del HDAC2, ki se veže na Sp3 in inhibirati nastanek kompleksa med HDAC2 in Sp3. Ugotovili so, da se na Sp3 veže C-konec HDAC2. C-končni fragment HDAC2 se že sam veže na Sp3, s čimer se zmanjša število kompleksov med HDAC2 in Sp3 na promotorjih. Fragment HDAC2 pa se ne veže na druge proteine, s katerimi HDAC nadzorujejo druge pomembne procese. Izražanje C-končnega fragmenta HDAC2 torej predstavlja obetaven način, s katerim bi lahko zdravili nevrološke bolezni povezane z okvarami spomina.

'''Maja Škof: Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje'''

Koronavirusi so razširjeni po vsem svetu in največkrat povzročajo okužbe dihal pri ljudeh in živalih. Spadajo med RNA viruse, za katere je značilna visoka stopnja genskih mutacij, kar jim omogoča, da se uspešno prilagajajo na okolje. S-proteini so trimerni proteini, s katerimi se koronavirusi vežejo na gostiteljsko celico, nato pa sprožijo spojitev virusne in celične membrane, kar omoči, da virusna RNA preide v celico. S-proteini so sestavljeni iz dveh podenot, S1 in S2. Pri vezavi na celični protein sodeluje zunanji del podenote S1, ki je v obliki treh podaljšanih zank (receptorsko-vezavne zanke). Med aminokislinami S-proteina in receptorskega proteina se vzpostavijo medmolekulske vezi, nato pa podenota S2 sproži spojitev s celično membrano. S1 je tudi glavna tarča protiteles, ki preprečujejo virusu, da bi vstopil v celico. A protitelo, ki se uspešno veže na sev virusa, ob ponovni okužbi virusa ne prepozna več. To je posledica naključnih genskih mutacij. Analiza genomov koronavirusov, izoliranih v zadnjih 50-ih letih, je pokazala, da se receptorsko-vezavne zanke S-proteinon med seboj občutno razlikujejo. Kar 73% aminokislin na receptorsko-vezavnih zankah variira. Odstotek je ravno dovolj velik, da se koronavirusi še vedno lahko vežejo na receptor, protitelesa pa jih ne zaznajo več.

'''Tadej Medved: Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3'''

Ključnega pomena za procese, kot so celično gibanje in endocitoza, so aktinski filamenti. Nastanek in prerazporeditev le-teh nadzorujejo določeni proteinski kompleksi; za razvejane aktinske filamente je to Arp2/3. Le-ta je sestavljen iz več podenot; najpomembnejši sta Arp2 in Arp3, ki sta po strukturi podobni aktinu. Na Arp2/3 se vežejo proteini družine WASP, ki spravijo proteinski kompleks v konformacijo, pri kateri lahko dejansko vrši nastanek novih filamentov. Za vse WASP-e velja, da se na Arp2/3 vežejo z odsekom VCA(verprolin, central, acidic), a do podatkov o strukturah takšnih vezi se znanost še ni dokopala. S pomočjo "cross-linking" masne spektrometrije in "reversed phase liquid" kromatografije je pred kratkim nastal model, ki zadovoljivo opisuje mesta, na katera se vežejo WASP-i. Vezava namreč poteka na dveh mestih: na hrbtni strani Arp2/3 in na spodnji strani kompleksa, pri Arp2 in poddomeno ARPC1. Na Arp2/3 se pri WASP-u veže odsek CA, konec odseka V pa ostaja prost za vezavo aktina. Izkazalo se je, da se za uspešno nukleacijo aktina vezavni mesti za aktin in CA ne smeta prekrivati; odsek WASP C pa je še zlasti pomemben za aktivacijo Arp2/3.

'''Tina Zavodnik: Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost'''

Mitohondriji so zelo kompleksni organeli, ki za normalno opravljanje svojih funkcij potrebujejo številne proteine. Večina teh proteinov se sintetizira v citoplazmi, nato pa so uvoženi nazaj v mitohondrije. Ob morebitni okvari transportnih mehanizmov in posledično okvarjenih mitohondrijih pa pride do akumulacije proteinov v citoplazmi, kar poruši celično ravnovesje. Skupina znanstvenikov iz Nemčije in Poljske pa je odkrila mehanizem, ki poškodovanim mitohondrijem omogoča nadzor nad sintezo proteinov z induciranjem reverzibilnih sprememb na translacijskem mehanizmu. Kot signal uporabijo ROS, ki povzroči oksidacijo tiolov na peptidih, ki so sestavni deli translacijskega mehanizma. Do odkritja so prišli s kvantitativno analizo cisteinskih ostankov oz. tiolnih skupin na proteomu kvasovke Saccharomyces cerevisia ter izdelali obsežno zbirko oksidacijskih stanj peptidov, ki so vsebovali tiolne skupine. Analizo so ponovili še na gojenih celicah kvasovke, ki so bile izpostavljene induciranemu oksidativnemu stresu s pomočjo H2O2, ter na mutiranih celicah z disfunkcionalnimi mitohondriji. Pri obojih so zaznali povečano oksidacijo Cys-peptidov in zmanjšano translacijsko aktivnost. Z odstranitvijo stresorskega faktorja pa se je translacijska aktivnost delno do popolnoma obnovila, kar dokazuje, da je oksidacija peptidov, ki so del mehanizmov za sintetiziranje novih proteinov, reverzibilen proces. Cisteinski ostanki torej delujejo kot nekakšni senzorji za ROS in ob oksidativnem stresu inhibirajo sintetiziranje novih proteinov.

'''Tina Kolenc Milavec: Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli'''

Alfa-sinuklein je majhen, v vodi topen protein brez stabilne terciarne strukture, ki ga genetsko in nevropatološko povezujejo s Parkinsonovo boleznijo, o njegovi vlogi pri razvoju bolezni pa še marsikaj ni znano. Nahaja se predvsem v živčnih končičih, kjer je ravnovesje med α-sinukleinom raztopljenim v citosolu in tistim vezanim na fosfolipidni dvosloj močno regulirano. Ker se α-sinuklein nahaja na območju, kjer koncentracija kalcija ves čas močno niha, so raziskovalci Lautenschläger ''et al.'' predpostavili, da je normalna fiziološka funkcija α-sinukleina odvisna od kalcija. Da bi bolje razumeli funkcijo tega proteina, so v raziskavi izvedli več ''ex vivo'' ter ''in vitro'' eksperimentov, s katerimi so skušali ugotoviti predvsem to, kako se α-sinuklein veže na membrano sinaptičnega vezikla ter kako koncentraciji kalcija in α-sinukleina vplivata na homeostazo sinaptičnih veziklov ter na združevanje α-sinukleina v fibrilarne skupke. Povečana koncentracija kalcija in/ali α-sinukleina namreč pod določenimi pogoji povzroča toksičnost in posledično celično smrt, saj α-sinuklein oligomerizira ter tvori dolge in debele netopne fibrile, ki so del Lewyjevih telesc – citoplazemskih vključkov, značilnih za Parkinsonovo bolezen. Iz medicinskega stališča pa je zanimiva ugotovitev, da isradipin (antagonist kalicevih kanalčkov) preprečuje fibrilizacijo, saj znižuje znotrajcelično koncentracijo kalcija, kar odpira nove možnosti za razvoj zdravil proti Parkinsonovi bolezni.

'''Anže Šumah: Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53'''

Protein p53 je tumorski zatiralec (tumor supresor), ki je zaradi svoje nadvse pomembne vloge pri ohranjanju celovitosti celičnega genoma pogosto deležen naziva »varuh genoma«. V normalnih primerih je izražanje tega proteina na nizki ravni, v primeru celičnega stresa pa deluje kot prepisovalni dejavnik, ki uravnava izražanje genov, ki so vključeni v nadzor celičnega cikla, popravljanje DNA in apoptozo. Ugotovili so, da je okoli 50 % vseh človeških oblik raka povezanih z mutacijami gena TP53 (gena za sintezo p53), zato so v raziskavi želeli razviti genski senzor, ki bi bil sposoben uničiti celice, ki ne sintetizirajo p53 (so rakave). Na podlagi promotorjev, ki jih p53 kot prepisovalni dejavnik zavira ali aktivira, so razvili senzor, ki v primeru pomanjkanja p53 sintetizira protein »Herpes simplex virus thymidine kinase« (HSV-TK), preko katerega lahko z zdravilom Ganciclovir uničimo rakasto celico, ki je brez p53. V primeru, da je p53 prisoten (je celica »zdrava«), pa je sinteza HSV-TK zavirana preko različnih mehanizmov. Senzor so najprej testirali na celični kulturi HCT116 (rakaste človeške črevesne celice) s fluorescentnima proteinskima markerjema, nato pa še v živih organizmih, in sicer golih miših brez imunosti. Tako so dokazali tako in vitro kot tudi in vivo uporabnost izdelanega genskega senzorja, ki bi ga bilo mogoče uporabiti v terapevtske namene.

'''Liza Praznik: Vpliv šaperonov Skp in SurA na zvijanje izvenmembranskih proteinov FhuA v terciarno strukturo'''

Naloga posebne vrste proteinov, imenovanih šaperoni je, da preoblikujejo polipeptidne verige v terciarno strukturo, v kateri so ti zmožni aktivnega delovanja. Delovanje in odzivanje šaperonov na različne dejavnike je še dokaj neznano, zato je skupina znanstvenikov Univerze v Baslu raziskovalo šaperona Skp in SurA, holdaz, ki delujeta na protein FhuA. Ta se nahaja na zunanji membrani gram negativnih bakterij, kjer služi kot receptor za ferikrom in tvori obliko beta-sodčka. Z večkratnimi ponovitvami poskusov so ugotovili, da se v prisotnosti obeh šaperonov struktura proteina, vgrajenega v membrano, ne podere, če jo delno razvijemo, ne glede na to, do katere stopnje. Šaperona sta obenem zmožna delno razvit protein preoblikovati nazaj v funkcionalno obliko, ki omogoča ponovno delovanje v membrani. Naloga obeh šaperonov je, da zadržujeta zvit polipeptid v dinamični, termodinamsko najugodnejši konformaciji, s katero se posamezni beta-zavoji polipeptida lahko vstavljajo v membrano. Ugotovljeno pa je bilo, da je šaperon SurA pri tem znatno učinkovitejši. Rezultati raziskave omogočajo boljši vpogled v mehanizme delovanja šaperonov in nakazujejo, kako pomembni so za učinkovito delovanje proteinov.

'''Urša Štrancar: Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo para fret'''

Mitofagija je kataboličen proces razgradnje mitohondrijev s pomočjo encimov v lizosomih, pri čemer se neuporabni deli mitohondrija razgradijo in reciklirajo. Da bi tak proces lahko opazovali in ga podrobno preučili, so znanstveniki v eksperimentu ob raziskovanju mitofagije uporabili eno novejših metod za prikaz celičnih procesov v živih celicah, par FRET, ki temelji na visoki vezavni afiniteti med dvema sintetičnima molekulama (kromoforoma) CB[7]-Cy3 in AdA-Cy5. Konfokalna laserska skenirna mikroskopija je pokazala, da sta bili molekuli CB[7]-Cy3 in AdA-Cy5 najprej intracelularno ločeni in zbrani v mitohondriju oz. lizosomu, nato pa sta po združitvi lizosoma in mitohondrija tvorili kompleks gost-gostitelj, prikazan kot fluorescenčni signal para FRET, ki ga človeško oko ob opazovanju na mikroskopu lahko zazna. Ta ugotovitev pa ni prikazala le zelo stabilne vezi med CB[7] in AdA v živi celici, temveč je potrdila tudi, da par FRET lahko prikaže dinamične procese spajanja celičnih organelov v mitofagiji. Kompleks, ki ga tvorita zgoraj navedeni molekuli, prav tako ni citotoksičen, zato je zelo uporaben za raziskovanje procesa mitofagije, nadaljno pa tudi procesov avtofagije v drugih celičnih organelih.

'''Neža Žerjav: Dodajanje enega samega nukleotida omejuje aktivnost človeške telomeraze'''

Telomeraza je vrsta DNA-polimeraze, ki na konce kromosomov dodaja nukleotidna zaporedja (GGTTAG) ob pomoči matrične RNA. Procesivni katabolni cikel telomeraze sestavljajo translokacija matrice, dodajanje prvega nukleotida in dodajanje preostalih petih nukleotdov. Zanimanje znanstvenikov je vzbudila zaradi počasnega delovanja v primerjavi z ostalimi DNA-polimerazami. Za pojasnitev mehanizma, ki omejuje njeno delovanje, so znanstveniki raziskovali vpliv prekinitvenega signala matrične RNA na visoko Michaelisovo konstanto prvega nukleotida, odvisnost procesivnosti in hitrosti telomeraze v odvisnosti od koncentracije dGTP, vpliv spremenjenega prvega nukleotida in posledice odstranitve prekinitvenega signala. Prišli so do zaključka, da prekinitveni signal povzroča počasnejše dodajanje prvega nukleotida v telomerno zaporedje, kar zmanjša procesivnost in hitrost telomeraze, ki pa ju lahko lahko povečano s povečano koncentracijo ustreznega deoksinukleozid fosfata.

'''Aljaž Bratina: Intrinzična destabilizacija ribosoma'''

Sinteza proteinov v celici poteka na ribosomih, ki so sestavljeni iz dveh podenot. Med prevajanjem RNA (translacija) se genski zapis pretvori v zaporedje aminokislin, ki se zvijejo v protein. Polipeptidno verigo, ki nastaja na ribosomu, in je vezana na tRNA, imenujemo nascenti polipeptid. Hitrost translacije ni vedno enaka in je podvržena mnogim anomalijam. Včasih se od ribosoma predčasno odcepi tRNA z vezanim nascentnim polipeptidom, lahko pa določeno zaporedje v nascentnem polipeptidu celo povzroči disociacijo ribosoma na dve podenoti in s tem prekine sintezo proteina. To imenujemo intrinzična destabilizacija ribosoma (IRD). IRD-inducirajoče zaporedje je ponavadi sestavljeno iz negativno nabitih aminokislin (aspartata in glutamata) ali prolina v različnih kombinacijah. Ugotovljeno je bilo, da nekatera zaporedja povzročajo IRD le in vitro, druga pa tudi in vivo. To pomeni, da ribosom vsebuje nek mehanizem, ki IRD zavira. To je protein bL31, ki povezuje podenoti ribosoma in s tem stabilizira ribosom. Celica IRD izkorišča tudi za nadzorovanje koncentracije magnezijevih ionov. Večja kot je ta koncentracija, manj proteina MgtA (prenašalec Mg2+) se bo tvorilo. Pomembno vlogo pri tem razmerju ima MgtL, polipeptid, ki je kodiran tik pred MgtA, in vsebuje IRD zaporedje. IRD je raziskana le na prokariontskih organizmih, vendar je možno, da je ta proces prisoten tudi v evkariontih.

'''Anamarija Agnič: ATP-aza P4 s premeščanjem fosfolipidov uravnava uvihanost membrane'''

ATP-azo P4 uvrščamo v skupino membranskih proteinov, ki ob hidrolizi ATP sodelujejo pri vzdrževanju asimetrične porazdelitve lipidov v membrani; omogočajo npr. prenos membranskih fosfolipidov fosfatidilserina in fosfatidiletanolamina iz monomolekularnega sloja celične membrane na zunajcelični strani v monomolekularni sloj membrane na citosolni strani membrane. Spremembe v razporeditvi lipidov v dvosloju, ki jih povzročajo flipaze, so ključnega pomena za deformacijo membrane, česar dokaz je bil tudi temeljni znanstveni problem skupine celičnih biologov iz univerze v Kjotu. V okviru raziskave so znanstveniki preko sistema, ki na membrano iz citoplazme inducirano veže t.i. domene Bin/amphiphysin/Rvs (domene BAR), natančno opazovali stopnje membranske tubulacije. S fluorescirajočimi molekulami so označili citosolne proteine BAR, ki so občutljivi na ukrivljenost membrane, in opazovali njihovo obnašanje. Povečana aktivnost flipaze za fosfatidilholin ATP10A, ki sodi v družino ATP-az P4, je zaradi vzpostavljene neuravnovešenosti med lipidnima slojema omogočila vezavo domen BAR ter s tem spodbudila proces membranske tubulacije. Povečana aktivnost flipaze ATP10A, ki omogoči uvihanost celične membrane, velja za enega pomembnih gonilnih mehanizmov endocitoze. Plazmalema drastično spreminja obliko tudi med celičnimi migracijami, invazijo rakastih celic, celično delitvijo, sprejemanjem hrane in vstopom patogenov ter virusov v celico. Ta raziskava je prvi dokaz, da imajo spremembe v trans-lipidnem dvosloju, ki jih povzročijo ATP-aze P4, pri deformiranju bioloških membran pomembno vlogo.

'''Simona Gorgievska: Optical tools to detect metabolic changes linked to diseases'''

Metabolic changes in cell can occur at the earliest stages of disease. In most cases, knowledge of those signals is limited, since we usually detect diseases only after it has done significant damage. Now, a team led by engineers at Tufts University School of Engineering has opened a window into the cell by developing an optical tool that can read metabolism at subcellular resolution, without having to perturb cells with contrasts agents or destroy them to conduct assays.The method is based on the fluorescence of two important coenzymes (biomolecules that work in concert with enzymes) when excited by a laser beam. The coenzymes –nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and Flavin adenine dinucleotide (FAD) are involved in a large number of metabolic pathways in every cell. In order to find out the specific metabolic pathways affected by disease or stress, scientists have looked at three parameters. Those are: the ratio of FAD and NADH, the fluorescence “fade” of NADH and the organization of mitochondria as revealed by the spatial distribution of NADH within a cell (the energy producing “batteries” of the cell). The first parameter-the relative amounts of FAD to NADH -can reveal how well the cell is consuming oxygen, metabolizing sugars, or producing or breaking down fat molecules. The second parameter -the fluorescence "fade" of NADH -reveals details about the local environment of the NADH. The third parameter -the spatial distribution of NADH in the cells -shows how the mitochondria split and fuse in response to cellular growth and stress.

'''Matej Jereb: Gradnja človeške pluripotentne matične celice v funkcionalno skeletno mišično tkivo'''

V študiji so razvili prvo popolnoma delujočo 3D skeletno mišično vlakno iz človeške pluripotentne matične celice. Z uporabo štirih različnih hPSC virov so razvili ponovljivo metodo za generacijo miogenskih celic prednic (iMPC), ki so sposobne učinkovite diferenciacije v večcelične miotubule v 2D kulturi. Če je gojena v 3D okolju hidrogela se iMPC strukturno preoblikuje tako, da tvori poravnano funkcionalno skeletno mišično vlakno (iSKM vretena), ki se lahko skrči in kot odgovor na električno ali nevrotransmitersko stimulacijo prenaša kalcijeve ione (Ca2+). V obdobju štirih tednov so 3D iSKM vretena doživela hipertrofijo miotubulov in funkcionalno izboljšanje ter naprednejšo stopnjo miogenske diferenciacije v primerjavi z 2D kulturo enake starosti. Pokazali so tudi, da se da iSKM vretena uspešno implantirati. Poskusi na miših nakazujejo potencial za uporabo teh metod in vitro in in vivo.

'''Neža Blaznik: Glikozilirana sialična kislina na protitelesu IgA inhibira virus influence tipa A'''

Nekateri virusi za vezavo na gostiteljsko celico uporabljajo receptorje, ki so glikozilirani s sialično kislino. V to skupino virusov spada tudi virus tipa influence A, ki povzroča gripo. Virus se prek glikoproteina hemaglutinina veže na sialično kislino v receptorjih in tako okuži gostiteljsko celico. Protitelesa imunoglobulini G (IgG), ki se uporabljajo v cepivih za gripo, imajo glikozilirane polipeptidne verige in prav tako vsebujejo nekaj sialične kisline, vendar je vsebnost sialične kisline v imunoglobulinih A (IgA) veliko večja. Znanstveniki so primerjali delovanje dveh tipov IgG in IgA na enega izmed tipov virusa influenze A (H5N3). Ugotovili so, da oba tipa IgA nevtralizirata virus v večji meri kot IgG, poleg tega pa so s križanjem komponent obeh imunoglobulinov tudi določili domeno na IgA, ki največ prispeva k povečani nevtralizaciji virusa. S tem so torej ugotovili, da glikozilirana sialična kislina na IgA inhibira virus influence tipa A, saj se veže še na dodatno mesto virusa in tako blokira povezavo med virusom in gostiteljsko telesno celico. To znanje je uporabno v razvoju novih cepiv proti gripi, vendar zaradi same zahtevnosti testiranja IgA in vivo, želijo znanstveniki v prihodnosti sintetizirati protitelo tipa IgG, ki bi vsebovalo del verige IgA, ter tako združiti prednost obeh protiteles.

'''Liza Ulčakar: Kombinirana DNA-RNA/neoantigen nanocepiva - učinkovita imunoterapevtska metoda'''

Cepiva proti raku postajajo vedno bolj raziskana tema. Znanstveniki so zato sintetizirali kombinirano zdravilo, ki vsebuje CpG (kratka enoverižna DNA), shRNA in rakave neoantigene. CpG deluje kot imunostimulator, saj se veže na receptor TLR9 v membrani endosomov antigen prezentirajočih celic in sproži imunski odgovor na rakave celice. shRNA preko RNA-interference preprečuje translacijo transkripcijskega faktorja STAT3, ki deluje imunosupresivno. Da bi zdravilo nemoteno potovalo po limfnem sistemu in prehajalo v celice, so sintetizirali kopolimer PPT-g-PEG, ki je skrčil kombinirano zdravilo. Cepivo so najprej preizkusili in vitro in ugotovili, da cepivo deluje imunostimulativno - antigen prezentirajoče celice so začele sproščati več citokinov, proizvodnja proteina STAT3 se je zmanjšala. Nato so poskus ponovili še in vivo, miših, ki so bile okužene z adenokarcinomom debelega črevesa. Mišim so nato odstranili organe z metastazami in opazili, da se je tumor pri miših, ki so bile zdravljene s kombiniranim zdravilom v primerjavi z mišmi, ki zdravila niso dobile, močno zmanjšal.

'''Matija Ruparčič: Od strupenih kompleksov do zlatih zrnc s ''Cupriavidus mellidurans'''''

Kakor voda, ogljik in dušik, tudi zlato kroži v naravi. Eden izmed organizmov, ki to omogoča, je ''Cupriavidus metallidurans''. Ta betaproteobakterija je skozi čas razvila vrsto mehanizmov, ki jo ščitijo pred velikimi koncentracijami težkih kovin. Problem pa se pojavi, ko je v prsteh prisotno zlato. To namreč inhibira glavno črpalko bakrovih ionov CupA in tako vodi do sinergistične toksičnosti bakra in zlata. Bakterija črpalk za zlato nima, zato je morala razviti mehanizem, ki bi preprečil sam vstop zlata v citoplazmo. Ker imajo bakterije, ki živijo v prsteh z večjo koncentracijo Au, v povprečju večje število encima CopA, ki ga skupaj z drugimi proteini kodirajo geni ''copABCD'', so se znanstveniki osredotočili nanj. Ugotovili so, da so produkti genov ''copABCD'' zasluženi za povečano odpornost na Cu/Au mešanice, CopA pa poleg Cu(I) oksidira tudi Au(I) ione v Au(III), nato pa pomaga pri redukciji le-teh do Au(0) nanodelcev. Rezultati raziskave tako predstavljajo nov korak k popolnemu razumevanju biogeokemičnega cikla zlata.

'''Jernej Imperl: Optimizacija protimikrobnih peptidov s pomočjo virtualnih metod'''

Gramnegativne bakterije premorejo vrsto mehanizmov za obrambo pred antibiotiki in s časom so na mnoge od njih postale celo imune. Skupaj z dejstvom, da je proizvodnja novih antibiotikov zapleten in drag proces, lahko predstavljajo resno dolgoročno grožnjo. Da bi bakterije "presenetili", so se znanstveniki obrnili na izdelavo protimikrobnih peptidov po šabloni peptidov rastlinskega izvora, ki se zaradi zapletene zgradbe na trgu še ne uporabljajo, a so znani v tradicionalni medicini že zelo dolgo časa. Peptid sadeža guave, Pg-AMP1, v osnovni obliki neugodnega za komercialno rabo, so s pomočjo računalniškega algoritma, ki posnema proces evolucije, in funkcije, ki peptide ovrednoti na podlagi verjetnosti tvorbe vijačnic, postopoma spreminjali in optimizirali. S simulacijo, ki so jo zagnali kar 100-krat, vsakič z naborom 250 začetnih peptidov, so uspeli odkriti guavanin 2, prvaka med stotimi kandidati vsake od simulacij, ki se je izkazal za učinkovitega proti gramnegativnim bakterijam in neškodljiv za človeške celice. Uspešnost guavanina 2 in njegova pomenljiva drugačnost od že obstoječih protimikrobnih peptidov nakazuje obetaven korak za nadaljnjo raziskovanje antibiotikov rastlinskega izvora.

'''Tiana Karmen Kokalj: B-1a limfociti spodbudijo oligodendrogenezo med razvojem možganov'''

Oligodendrociti so celice v centralnem živčnem sistemu, ki tvorijo mielinske ovojnice aksonov. Imajo ključno vlogo v razvoju in delovanju možganov, kar ima tudi limfni sistem, specifično periferni limfociti. Specifično T celice sodelujejo pri spominu, med embrionalnim razvojem pa prehaja v možgane diferenciirana oblika teh, B-1a celice. Te že v embrionalni fazi dozorijo in dosežejo največjo količino tik po rojstvu. Iz krvi v možgane prehajajo preko signalnega kompleksa CXCL13-CXCR5. Ko so enkrat te celice v možganih pa vidimo, da vplivajo na oligodendrogenezo, saj je kultivacija živčnih matičnih celic z B-1a celicami pokazala večji delež zrelih oligodendrocitov. B-1a celice direktno vplivajo na oligodendrogenezo s spodbuditvijo razmnoževanje oligodendrocitskih predhodnih celic (OPC) preko IgM-Fcα/µR signalizacije. B.1a celice izločajo IgM - polireaktivna protitelesa, ki se vežejo na Fcα/µR, katerega izražajo OPC, ki veže Fc regijo IgM. Delež B-1a celic v možganih pa pada s starostjo, zato predvidevajo da imajo največjo vlogo pri razmnoževanju oligodendrocitov, pri spontani obnovitvi mielinskih ovojnic pa naj ne bi imeli velikega pomena. Študija tega procesa lahko pripomore k boljšem razumevanju in preučevanju nevrorazvojnih motenj.

'''Barbara Jaklič: I-motif DNA strukture nastajajo tudi v jedrih človeških celic'''

Prva znana in najpogostejša strukturna oblika DNA je dvojna vijačnica, katere model sta predlagala Watson in Crick. Je desnosučna, sestavljena iz velikega in malega žleba, imenujemo pa jo A-DNA. Poleg te oblike sta dobro proučeni še B-DNA, ki je prav tako desnosučna, vendar dehidrirana in zato bolj stisnjena, in Z-DNA, ki pa je levosučna in dodatno zvita struktura v sintetičnih verigah DNA. Znano pa je, da lahko DNA in vitro tvori tudi drugačne inter- in intramolekularne sekundarne strukture, med katerimi je najbolj raziskana G-quadruplex (G4) v regijah genoma bogatih z gvaninom. Nekoliko manj poznana je struktura imenovana »intercalated motif« (i-motif), ki nastaja v regijah bogatih s citozinom. Sestavljajo jo štiri verige, povezane z vrinjenimi baznimi pari delno protoniranega in nevtralnega citozina (C+:C). Za to strukturo predvidevajo, da sodeluje pri uravnavanju replikacije in transkripcije, vendar je njen obstoj in vivo dolgo ostajal dvomljiv zaradi stabilizacije v kislem pH. V raziskavi so karakterizirali protitelesni fragment iMab, ki se zelo specifično in z veliko afiniteto veže na strukturo i-motif, in s tem dokazali njeno prisotnost v jedrih človeških celic. Preučili so tudi stabilnost i-motif strukture v različnih pH razmerah in fazah celičnega cikla ter s tem omogočili nadaljnje raziskave na področju regulacijske in biološke vloge te strukture v človeških celicah.

TBK2018-seminar

2018-05-08T23:13:36Z

Barbara Jaklič: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Doroteja Armič || Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180118162449.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Martina Lokar || Liza Ulčakar || Zoja Siter
|-
| Valeriya Musina || Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171213124751.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Nika Boštic || Tiana Karmen Kokalj || Aljaž Bratina
|-
| Dea Simonič || Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170824141207.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Sumeja Kudelić || Jernej Imperl || Anamarija Agnič
|-
| Neža Štremfelj ||Delovanje inzulinskih receptorjev||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103256.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Luka Gnidovec || Matija Ruparčič || Simona Gorgievska
|-
| Gašper Komatar || Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri tvorbi spomina || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171009093207.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Lara Hrvatin || Tiana Karmen Kokalj || Matej Jereb
|-
| Marko Pavleković || Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171121155811.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Klementina Polanec || Meta Kodrič || Lara Drinovec
|-
| Laura Gašperšič || Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170808150001.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Karmen Mlinar || Ana Menegalija || Maks Kumek
|-
| Rebeka Dajčman || Več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171003124646.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Ula Nikolaja Ratajec || Andreja Marija Belič || Neža Blaznik
|-
| Maja Škof || Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje. || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171127105937.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Doroteja Armič || Barbara Jaklič || Liza Ulčakar
|-
| Tina Kolenc Milavec || Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219071758.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Valeriya Musina || Eva Gartner || Jana Rajchevska
|-
| Tina Zavodnik || Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180202112629.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Dea Simonič || Martina Lokar || Jernej Imperl
|-
| Tadej Medved || Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180305130632.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Neža Štremfelj || Nika Boštic || Matija Ruparčič
|-
| Bogdan Jovićević || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Laura Gašperšič || Lara Hrvatin || Ana Menegalija
|-
| Polona Kalan || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180214111055.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Rebeka Dajčman || Klementina Polanec || Andreja Marija Belič
|-
| Liza Praznik ||Vpliv šaperono Skp in SurA na zvijanje proteinov FhuA v terciarno strukturo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2015/09/150907113757.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Maja Škof || Karmen Mlinar || Barbara Jaklič
|-
| Anže Šumah || Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171114104201.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Tina Kolenc Milavec || Ula Nikolaja Ratajec || Eva Gartner
|-
| Neža Žerjav|| Dodajanje enega samega nukleotida omejuje aktivnost človeške telomeraze ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180227142114.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tina Zavodnik || Doroteja Armič || Martina Lokar
|-
| Urša Štrancar || Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo supermolekularnega para FRET || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103254.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tadej Medved || Valeriya Musina || Nika Boštic
|-
| Zoja Siter || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Neža Žerjav || Dea Simonič || Sumeja Kudelić
|-
| Aljaž Bratina || Intrinzična destabilizacija ribosoma || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171120101314.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Anastasija Nechevska || Neža Štremfelj || Luka Gnidovec
|-
| Anamarija Agnič || ATP-aza P4 s premeščanjem fosfolipidov uravnava uvihanost membrane || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180329141014.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Bogdan Jovićević || Sumeja Kudelić || Lara Hrvatin
|-
| Simona Gorgievska || Optical tools to detect metabolic changes linked to disease || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180307161351.htm|| 10.04. || 13.04. || 16.04. || Polona Kalan || Marko Pavleković || Klementina Polanec
|-
| Matej Jereb || Gradnja človeške pluripotentne matične celice v funkcionalno skeletno mišično tkivo|| https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180109104707.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Liza Praznik || Laura Gašperšič || Karmen Mlinar
|-
| Lara Drinovec || Tavrin pomaga obnoviti zaradi multiple skleroze poškodovane celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171208143024.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Anže Šumah || Rebeka Dajčman || Ula Nikolaja Ratajec
|-
| Maks Kumek || Dinamični izvor sprememb specifčne toplote v encimsko kataliziranih reakcijah || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180321090854.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Marko Pavleković || Maja Škof || Doroteja Armič
|-
| Neža Blaznik || Glikozilirana sialična kislina na protitelesu IgA inhibira virus influence tipa A || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180403111203.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Urša Štrancar || Tina Kolenc Milavec || Valeriya Musina
|-
| Liza Ulčakar || Kombinirana DNA-RNA/antigen nanocepiva - učinkovita imunoterapevtska metoda ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171129163851.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Zoja Siter || Tina Zavodnik || Dea Simonič
|-
| Anastasija Nechevska || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180319155730.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Aljaž Bratina || Tadej Medved || Neža Štremfelj
|-
| Jernej Imperl || Optimizacija protimikrobnih peptidov s pomočjo virtualnih metod || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180416085922.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Anamarija Agnič || Neža Žerjav || Luka Gnidovec
|-
| Matija Ruparčič || Od strupenih kompleksov do zlatih zrnc s ''Cupriavidus metallidurans'' || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180131095453.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Simona Gorgievska || Anastasija Nechevska || Marko Pavleković
|-
| Tiana Karmen Kokalj || B-1a limfociti spodbujajo oligodendrogenezo med razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180313091702.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Matej Jereb || Bogdan Jovićević || Laura Gašperšič
|-
| Meta Kodrič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180416155619.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Lara Drinovec || Polona Kalan || Rebeka Dajčman
|-
| Ana Menegalija || METTL3 nova potencialna terapevtska tarča pri akutni mieloični levkemiji || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171127135838.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Maks Kumek || Liza Praznik || Maja Škof
|-
| Andreja Marija Belič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Neža Blaznik || Anže Šumah || Tina Kolenc Milavec
|-
| Barbara Jaklič || I-motif DNA strukture nastajajo tudi v jedrih človeških celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180423135054.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Liza Ulčakar || Meta Kodrič || Tina Zavodnik
|-
| Eva Gartner || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180418111615.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Gašper Komatar || Urša Štrancar || Tadej Medved
|-
| Martina Lokar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180301144138.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Jernej Imperl || Zoja Siter || Neža Žerjav
|-
| Nika Boštic || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Matija Ruparčič || Aljaž Bratina || Anastasija Nechevska
|-
| Sumeja Kudelić || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171221122927.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Tiana Karmen Kokalj || Anamarija Agnič || Bogdan Jovićević
|-
| Luka Gnidovec || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171102124907.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Meta Kodrič || Simona Gorgievska || Polona Kalan
|-
| Lara Hrvatin || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180117131129.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Ana Menegalija || Matej Jereb || Liza Praznik
|-
| Klementina Polanec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Andreja Marija Belič || Lara Drinovec || Anže Šumah
|-
| Karmen Mlinar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/05/180501085533.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Barbara Jaklič || Maks Kumek || Gašper Komatar
|-
| Ula Nikolaja Ratajec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Eva Gartner || Neža Blaznik || Urša Štrancar
|-
| rezerva || || || 29.05. || 01.06. || 04.06. || || ||
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2018_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2018_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2018_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2018_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2018_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2018-seminar

2018-05-08T23:11:38Z

Barbara Jaklič: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Doroteja Armič || Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180118162449.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Martina Lokar || Liza Ulčakar || Zoja Siter
|-
| Valeriya Musina || Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171213124751.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Nika Boštic || Tiana Karmen Kokalj || Aljaž Bratina
|-
| Dea Simonič || Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170824141207.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Sumeja Kudelić || Jernej Imperl || Anamarija Agnič
|-
| Neža Štremfelj ||Delovanje inzulinskih receptorjev||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103256.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Luka Gnidovec || Matija Ruparčič || Simona Gorgievska
|-
| Gašper Komatar || Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri tvorbi spomina || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171009093207.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Lara Hrvatin || Tiana Karmen Kokalj || Matej Jereb
|-
| Marko Pavleković || Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171121155811.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Klementina Polanec || Meta Kodrič || Lara Drinovec
|-
| Laura Gašperšič || Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170808150001.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Karmen Mlinar || Ana Menegalija || Maks Kumek
|-
| Rebeka Dajčman || Več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171003124646.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Ula Nikolaja Ratajec || Andreja Marija Belič || Neža Blaznik
|-
| Maja Škof || Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje. || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171127105937.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Doroteja Armič || Barbara Jaklič || Liza Ulčakar
|-
| Tina Kolenc Milavec || Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219071758.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Valeriya Musina || Eva Gartner || Jana Rajchevska
|-
| Tina Zavodnik || Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180202112629.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Dea Simonič || Martina Lokar || Jernej Imperl
|-
| Tadej Medved || Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180305130632.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Neža Štremfelj || Nika Boštic || Matija Ruparčič
|-
| Bogdan Jovićević || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Laura Gašperšič || Lara Hrvatin || Ana Menegalija
|-
| Polona Kalan || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180214111055.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Rebeka Dajčman || Klementina Polanec || Andreja Marija Belič
|-
| Liza Praznik ||Vpliv šaperono Skp in SurA na zvijanje proteinov FhuA v terciarno strukturo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2015/09/150907113757.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Maja Škof || Karmen Mlinar || Barbara Jaklič
|-
| Anže Šumah || Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171114104201.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Tina Kolenc Milavec || Ula Nikolaja Ratajec || Eva Gartner
|-
| Neža Žerjav|| Dodajanje enega samega nukleotida omejuje aktivnost človeške telomeraze ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180227142114.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tina Zavodnik || Doroteja Armič || Martina Lokar
|-
| Urša Štrancar || Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo supermolekularnega para FRET || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103254.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tadej Medved || Valeriya Musina || Nika Boštic
|-
| Zoja Siter || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Neža Žerjav || Dea Simonič || Sumeja Kudelić
|-
| Aljaž Bratina || Intrinzična destabilizacija ribosoma || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171120101314.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Anastasija Nechevska || Neža Štremfelj || Luka Gnidovec
|-
| Anamarija Agnič || ATP-aza P4 s premeščanjem fosfolipidov uravnava uvihanost membrane || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180329141014.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Bogdan Jovićević || Sumeja Kudelić || Lara Hrvatin
|-
| Simona Gorgievska || Optical tools to detect metabolic changes linked to disease || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180307161351.htm|| 10.04. || 13.04. || 16.04. || Polona Kalan || Marko Pavleković || Klementina Polanec
|-
| Matej Jereb || Gradnja človeške pluripotentne matične celice v funkcionalno skeletno mišično tkivo|| https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180109104707.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Liza Praznik || Laura Gašperšič || Karmen Mlinar
|-
| Lara Drinovec || Tavrin pomaga obnoviti zaradi multiple skleroze poškodovane celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171208143024.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Anže Šumah || Rebeka Dajčman || Ula Nikolaja Ratajec
|-
| Maks Kumek || Dinamični izvor sprememb specifčne toplote v encimsko kataliziranih reakcijah || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180321090854.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Marko Pavleković || Maja Škof || Doroteja Armič
|-
| Neža Blaznik || Glikozilirana sialična kislina na protitelesu IgA inhibira virus influence tipa A || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180403111203.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Urša Štrancar || Tina Kolenc Milavec || Valeriya Musina
|-
| Liza Ulčakar || Kombinirana DNA-RNA/antigen nanocepiva - učinkovita imunoterapevtska metoda ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171129163851.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Zoja Siter || Tina Zavodnik || Dea Simonič
|-
| Anastasija Nechevska || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180319155730.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Aljaž Bratina || Tadej Medved || Neža Štremfelj
|-
| Jernej Imperl || Optimizacija protimikrobnih peptidov s pomočjo virtualnih metod || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180416085922.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Anamarija Agnič || Neža Žerjav || Luka Gnidovec
|-
| Matija Ruparčič || Od strupenih kompleksov do zlatih zrnc s ''Cupriavidus metallidurans'' || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180131095453.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Simona Gorgievska || Anastasija Nechevska || Marko Pavleković
|-
| Tiana Karmen Kokalj || B-1a limfociti spodbujajo oligodendrogenezo med razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180313091702.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Matej Jereb || Bogdan Jovićević || Laura Gašperšič
|-
| Meta Kodrič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180416155619.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Lara Drinovec || Polona Kalan || Rebeka Dajčman
|-
| Ana Menegalija || METTL3 nova potencialna terapevtska tarča pri akutni mieloični levkemiji || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171127135838.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Maks Kumek || Liza Praznik || Maja Škof
|-
| Andreja Marija Belič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Neža Blaznik || Anže Šumah || Tina Kolenc Milavec
|-
| Barbara Jaklič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180423135054.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Liza Ulčakar || Meta Kodrič || Tina Zavodnik
|-
| Eva Gartner || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180418111615.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Gašper Komatar || Urša Štrancar || Tadej Medved
|-
| Martina Lokar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180301144138.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Jernej Imperl || Zoja Siter || Neža Žerjav
|-
| Nika Boštic || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Matija Ruparčič || Aljaž Bratina || Anastasija Nechevska
|-
| Sumeja Kudelić || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171221122927.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Tiana Karmen Kokalj || Anamarija Agnič || Bogdan Jovićević
|-
| Luka Gnidovec || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171102124907.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Meta Kodrič || Simona Gorgievska || Polona Kalan
|-
| Lara Hrvatin || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180117131129.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Ana Menegalija || Matej Jereb || Liza Praznik
|-
| Klementina Polanec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Andreja Marija Belič || Lara Drinovec || Anže Šumah
|-
| Karmen Mlinar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/05/180501085533.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Barbara Jaklič || Maks Kumek || Gašper Komatar
|-
| Ula Nikolaja Ratajec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Eva Gartner || Neža Blaznik || Urša Štrancar
|-
| rezerva || || || 29.05. || 01.06. || 04.06. || || ||
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2018_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2018_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2018_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2018_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2018_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2018-seminar

2018-03-20T21:20:52Z

Barbara Jaklič: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Doroteja Armič || Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180118162449.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Martina Lokar || Liza Ulčakar || Zoja Siter
|-
| Valeriya Musina || Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171213124751.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Nika Boštic || Tiana Karmen Kokalj || Aljaž Bratina
|-
| Dea Simonič || Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170824141207.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Sumeja Kudelić || Jernej Imperl || Anamarija Agnič
|-
| Neža Štremfelj ||Delovanje inzulinskih receptorjev||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103256.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Luka Gnidovec || Matija Ruparčič || Simona Gorgievska
|-
| Gašper Komatar || Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri tvorbi spomina || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171009093207.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Lara Hrvatin || Tiana Karmen Kokalj || Matej Jereb
|-
| Marko Pavleković || Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171121155811.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Klementina Polanec || Meta Kodrič || Lara Drinovec
|-
| Laura Gašperšič || Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170808150001.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Karmen Mlinar || Ana Menegalija || Maks Kumek
|-
| Rebeka Dajčman || Več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171003124646.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Ula Nikolaja Ratajec || Andreja Marija Belič || Neža Blaznik
|-
| Maja Škof || Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje. || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171127105937.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Doroteja Armič || Barbara Jaklič || Liza Ulčakar
|-
| Tina Kolenc Milavec || Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219071758.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Valeriya Musina || Eva Gartner || Jana Rajchevska
|-
| Tina Zavodnik || Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180202112629.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Dea Simonič || Martina Lokar || Jernej Imperl
|-
| Tadej Medved || Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180305130632.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Neža Štremfelj || Nika Boštic || Matija Ruparčič
|-
| Bogdan Jovićević || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Laura Gašperšič || Lara Hrvatin || Ana Menegalija
|-
| Polona Kalan || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180214111055.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Rebeka Dajčman || Klementina Polanec || Andreja Marija Belič
|-
| Liza Praznik ||Vpliv šaperono Skp in SurA na zvijanje izvenmembranskih proteinov FhuA v terciarno strukturo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2015/09/150907113757.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Maja Škof || Karmen Mlinar || Barbara Jaklič
|-
| Anže Šumah || Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171114104201.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Tina Kolenc Milavec || Ula Nikolaja Ratajec || Eva Gartner
|-
| Neža Žerjav|| ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180227142114.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tina Zavodnik || Doroteja Armič || Martina Lokar
|-
| Urša Štrancar || Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo supermolekularnega para FRET || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103254.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tadej Medved || Valeriya Musina || Nika Boštic
|-
| Zoja Siter || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Neža Žerjav || Dea Simonič || Sumeja Kudelić
|-
| Aljaž Bratina || || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171120101314.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Anastasija Nechevska || Neža Štremfelj || Luka Gnidovec
|-
| Anamarija Agnič || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Bogdan Jovićević || Sumeja Kudelić || Lara Hrvatin
|-
| Simona Gorgievska || Optical tools to detect metabolic changes linked to disease || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180307161351.htm|| 10.04. || 13.04. || 16.04. || Polona Kalan || Marko Pavleković || Klementina Polanec
|-
| Matej Jereb || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Liza Praznik || Laura Gašperšič || Karmen Mlinar
|-
| Lara Drinovec || || || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Anže Šumah || Rebeka Dajčman || Ula Nikolaja Ratajec
|-
| Maks Kumek || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Marko Pavleković || Maja Škof || Doroteja Armič
|-
| Neža Blaznik || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Urša Štrancar || Tina Kolenc Milavec || Valeriya Musina
|-
| Liza Ulčakar || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171129163851.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Zoja Siter || Tina Zavodnik || Dea Simonič
|-
| Anastasija Nechevska || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Aljaž Bratina || Tadej Medved || Neža Štremfelj
|-
| Jernej Imperl || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Anamarija Agnič || Neža Žerjav || Luka Gnidovec
|-
| Matija Ruparčič || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Simona Gorgievska || Anastasija Nechevska || Marko Pavleković
|-
| Tiana Karmen Kokalj || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Matej Jereb || Bogdan Jovićević || Laura Gašperšič
|-
| Meta Kodrič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180125101321.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Lara Drinovec || Polona Kalan || Rebeka Dajčman
|-
| Ana Menegalija || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Maks Kumek || Liza Praznik || Maja Škof
|-
| Andreja Marija Belič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Neža Blaznik || Anže Šumah || Tina Kolenc Milavec
|-
| Barbara Jaklič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180220161201.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Liza Ulčakar || Meta Kodrič || Tina Zavodnik
|-
| Eva Gartner || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Gašper Komatar || Urša Štrancar || Tadej Medved
|-
| Martina Lokar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180301144138.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Jernej Imperl || Zoja Siter || Neža Žerjav
|-
| Nika Boštic || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Matija Ruparčič || Aljaž Bratina || Anastasija Nechevska
|-
| Sumeja Kudelić ||Toksin botulin "preskočil" v novo vrsto bakterije ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180126122856.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Tiana Karmen Kokalj || Anamarija Agnič || Bogdan Jovićević
|-
| Luka Gnidovec || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Meta Kodrič || Simona Gorgievska || Polona Kalan
|-
| Lara Hrvatin || Mg2+ ioni omogočajo kondenzacijo kromosomov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180201104559.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Ana Menegalija || Matej Jereb || Liza Praznik
|-
| Klementina Polanec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Andreja Marija Belič || Lara Drinovec || Anže Šumah
|-
| Karmen Mlinar || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Barbara Jaklič || Maks Kumek || Gašper Komatar
|-
| Ula Nikolaja Ratajec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Eva Gartner || Neža Blaznik || Urša Štrancar
|-
| rezerva || || || 29.05. || 01.06. || 04.06. || || ||
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2018_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2018_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2018_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2018_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2018_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.