Wiki FKKT - User contributions [en]

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T20:06:13Z

Barbara Lipovšek: /* Razgradnja celuloze */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptoloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibolokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz operona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je mikrokompartment, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celuloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor [http://parts.igem.org/Part:pSB1C3 pSB1C3], gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor [http://parts.igem.org/Part:pSB1A3 pSB1A3], obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom »fluorescent brightener 28«, ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV-svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze verjetno videli modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein fikocianobilin (PCB), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ki inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala, kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja: fotokontrolna naprava naj bi bila pod kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gen za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen ''cenA'') in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na zunajcelični strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili transportni sistem z ɑ-hemolizinom, in sicer so konstruirali zapise za ta 2 encima s oznako HlyA. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A'') do glukoze. Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim ([http://parts.igem.org/Part:pSB3K3 pSB3K3]) kot tudi z visokim številom kopij ([http://parts.igem.org/Part:pSB1C3 pSB1C3]), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten v celičnem lizatu ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Kot kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A, je dosegla po 48 urah vrednost OD600 = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600 = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rasle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rasle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz monomerov PilA, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevodnost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment, sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zraslih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je bil razviti alternativo trenutnim virom energije. Ekipa si v prihodnje želi, da bi to napravo dejansko izdelali. Sestavljena naj bi bila iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnaževalce iz okolja, kar bi poleg pridobivanja trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark (22. 1. 2018) 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of ''Gluconacetobacter hansenii'' at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe (III) -Reducing Organism ''Geobacter sulfurreducens'' by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T18:08:11Z

Barbara Lipovšek: /* ZAKLJUČEK */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptoloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibolokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz operona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je mikrokompartment, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celuloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor [http://parts.igem.org/Part:pSB1C3 pSB1C3], gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor [http://parts.igem.org/Part:pSB1A3 pSB1A3], obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom »fluorescent brightener 28«, ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV-svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze verjetno videli modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein fikocianobilin (PCB), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ki inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala, kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja: fotokontrolna naprava naj bi bila pod kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gen za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen ''cenA'') in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na zunajcelični strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili transportni sistem z ɑ-hemolizinom, in sicer so konstruirali zapise za ta 2 encima s oznako HlyA. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A'') do glukoze. Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim ([http://parts.igem.org/Part:pSB3K3 pSB3K3]) kot tudi z visokim številom kopij ([http://parts.igem.org/Part:pSB1C3 pSB1C3]), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu kot tudi v mediju ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Kot kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A, je dosegla po 48 urah vrednost OD600 = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600 = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rasle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rasle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz monomerov PilA, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevodnost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment, sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zraslih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je bil razviti alternativo trenutnim virom energije. Ekipa si v prihodnje želi, da bi to napravo dejansko izdelali. Sestavljena naj bi bila iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnaževalce iz okolja, kar bi poleg pridobivanja trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark (22. 1. 2018) 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of ''Gluconacetobacter hansenii'' at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe (III) -Reducing Organism ''Geobacter sulfurreducens'' by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T17:46:11Z

Barbara Lipovšek: /* Razgradnja celuloze */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptoloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibolokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz operona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je mikrokompartment, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celuloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor [http://parts.igem.org/Part:pSB1C3 pSB1C3], gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor [http://parts.igem.org/Part:pSB1A3 pSB1A3], obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom »fluorescent brightener 28«, ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV-svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze verjetno videli modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein fikocianobilin (PCB), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ki inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala, kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja: fotokontrolna naprava naj bi bila pod kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gen za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen ''cenA'') in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na zunajcelični strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili transportni sistem z ɑ-hemolizinom, in sicer so konstruirali zapise za ta 2 encima s oznako HlyA. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A'') do glukoze. Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim ([http://parts.igem.org/Part:pSB3K3 pSB3K3]) kot tudi z visokim številom kopij ([http://parts.igem.org/Part:pSB1C3 pSB1C3]), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu kot tudi v mediju ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Kot kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A, je dosegla po 48 urah vrednost OD600 = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600 = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rasle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rasle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz monomerov PilA, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevodnost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment, sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zraslih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je bil razviti alternativo trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo, sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark (22. 1. 2018) 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of ''Gluconacetobacter hansenii'' at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe (III) -Reducing Organism ''Geobacter sulfurreducens'' by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T17:04:14Z

Barbara Lipovšek: /* Fiksacija ogljika */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptoloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibolokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz operona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je mikrokompartment, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celuloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor [http://parts.igem.org/Part:pSB1C3 pSB1C3], gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor [http://parts.igem.org/Part:pSB1A3 pSB1A3], obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom »fluorescent brightener 28«, ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV-svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze verjetno videli modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein fikocianobilin (PCB), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ki inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala, kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja: fotokontrolna naprava naj bi bila pod kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gen za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen ''cenA'') in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na zunajcelični strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili transportni sistem z ɑ-hemolizinom, in sicer so konstruirali zapise za ta 2 encima s oznako HlyA. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim ([http://parts.igem.org/Part:pSB3K3 pSB3K3]) kot tudi z visokim številom kopij ([http://parts.igem.org/Part:pSB1C3 pSB1C3]), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu kot tudi v mediju ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Kot kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A, je dosegla po 48 urah vrednost OD600 = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600 = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rasle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rasle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz monomerov PilA, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevodnost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment, sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zraslih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je bil razviti alternativo trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo, sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark (22. 1. 2018) 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of ''Gluconacetobacter hansenii'' at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe (III) -Reducing Organism ''Geobacter sulfurreducens'' by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T17:02:19Z

Barbara Lipovšek: /* Fiksacija ogljika */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptoloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibolokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz operona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celuloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor [http://parts.igem.org/Part:pSB1C3 pSB1C3], gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor [http://parts.igem.org/Part:pSB1A3 pSB1A3], obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom »fluorescent brightener 28«, ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV-svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze verjetno videli modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein fikocianobilin (PCB), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ki inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala, kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja: fotokontrolna naprava naj bi bila pod kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gen za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen ''cenA'') in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na zunajcelični strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili transportni sistem z ɑ-hemolizinom, in sicer so konstruirali zapise za ta 2 encima s oznako HlyA. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim ([http://parts.igem.org/Part:pSB3K3 pSB3K3]) kot tudi z visokim številom kopij ([http://parts.igem.org/Part:pSB1C3 pSB1C3]), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu kot tudi v mediju ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Kot kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A, je dosegla po 48 urah vrednost OD600 = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600 = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rasle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rasle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz monomerov PilA, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevodnost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment, sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zraslih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je bil razviti alternativo trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo, sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark (22. 1. 2018) 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of ''Gluconacetobacter hansenii'' at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe (III) -Reducing Organism ''Geobacter sulfurreducens'' by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T17:01:47Z

Barbara Lipovšek: /* Fiksacija ogljika */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptoloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibolokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz oparona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celuloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor [http://parts.igem.org/Part:pSB1C3 pSB1C3], gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor [http://parts.igem.org/Part:pSB1A3 pSB1A3], obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom »fluorescent brightener 28«, ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV-svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze verjetno videli modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein fikocianobilin (PCB), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ki inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala, kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja: fotokontrolna naprava naj bi bila pod kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gen za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen ''cenA'') in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na zunajcelični strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili transportni sistem z ɑ-hemolizinom, in sicer so konstruirali zapise za ta 2 encima s oznako HlyA. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim ([http://parts.igem.org/Part:pSB3K3 pSB3K3]) kot tudi z visokim številom kopij ([http://parts.igem.org/Part:pSB1C3 pSB1C3]), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu kot tudi v mediju ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Kot kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A, je dosegla po 48 urah vrednost OD600 = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600 = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rasle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rasle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz monomerov PilA, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevodnost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment, sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zraslih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je bil razviti alternativo trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo, sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark (22. 1. 2018) 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of ''Gluconacetobacter hansenii'' at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe (III) -Reducing Organism ''Geobacter sulfurreducens'' by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T16:24:28Z

Barbara Lipovšek: /* VIRI */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptuloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibulokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz oparona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celuloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor [http://parts.igem.org/Part:pSB1C3 pSB1C3], gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor [http://parts.igem.org/Part:pSB1A3 pSB1A3], obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom »fluorescent brightener 28«, ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV-svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze verjetno videli modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein fikocianobilin (PCB), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ki inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala, kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja: fotokontrolna naprava naj bi bila pod kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gen za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen ''cenA'') in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na zunajcelični strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili transportni sistem z ɑ-hemolizinom, in sicer so konstruirali zapise za ta 2 encima s oznako HlyA. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim ([http://parts.igem.org/Part:pSB3K3 pSB3K3]) kot tudi z visokim številom kopij ([http://parts.igem.org/Part:pSB1C3 pSB1C3]), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu kot tudi v mediju ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Kot kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A, je dosegla po 48 urah vrednost OD600 = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600 = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rasle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rasle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz monomerov PilA, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevodnost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment, sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zraslih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je bil razviti alternativo trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo, sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark (22. 1. 2018) 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of ''Gluconacetobacter hansenii'' at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe (III) -Reducing Organism ''Geobacter sulfurreducens'' by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T16:23:12Z

Barbara Lipovšek: /* Razgradnja celuloze */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptuloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibulokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz oparona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celuloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor [http://parts.igem.org/Part:pSB1C3 pSB1C3], gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor [http://parts.igem.org/Part:pSB1A3 pSB1A3], obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom »fluorescent brightener 28«, ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV-svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze verjetno videli modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein fikocianobilin (PCB), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ki inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala, kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja: fotokontrolna naprava naj bi bila pod kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gen za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen ''cenA'') in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na zunajcelični strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili transportni sistem z ɑ-hemolizinom, in sicer so konstruirali zapise za ta 2 encima s oznako HlyA. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim ([http://parts.igem.org/Part:pSB3K3 pSB3K3]) kot tudi z visokim številom kopij ([http://parts.igem.org/Part:pSB1C3 pSB1C3]), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu kot tudi v mediju ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Kot kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A, je dosegla po 48 urah vrednost OD600 = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600 = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rasle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rasle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz monomerov PilA, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevodnost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment, sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zraslih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je bil razviti alternativo trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo, sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of ''Gluconacetobacter hansenii'' at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe (III) -Reducing Organism ''Geobacter sulfurreducens'' by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T16:21:50Z

Barbara Lipovšek: /* Sinteza celuloze */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptuloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibulokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz oparona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celuloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor [http://parts.igem.org/Part:pSB1C3 pSB1C3], gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor [http://parts.igem.org/Part:pSB1A3 pSB1A3], obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom »fluorescent brightener 28«, ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV-svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze verjetno videli modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein fikocianobilin (PCB), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ki inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala, kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja: fotokontrolna naprava naj bi bila pod kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gen za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen ''cenA'') in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na zunajcelični strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili transportni sistem z ɑ-hemolizinom, in sicer so konstruirali zapise za ta 2 encima s oznako HlyA. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu kot tudi v mediju ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Kot kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A, je dosegla po 48 urah vrednost OD600 = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600 = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rasle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rasle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz monomerov PilA, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevodnost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment, sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zraslih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je bil razviti alternativo trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo, sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of ''Gluconacetobacter hansenii'' at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe (III) -Reducing Organism ''Geobacter sulfurreducens'' by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T16:20:21Z

Barbara Lipovšek: /* VIRI */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptuloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibulokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz oparona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celuloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom »fluorescent brightener 28«, ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV-svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze verjetno videli modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein fikocianobilin (PCB), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ki inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala, kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja: fotokontrolna naprava naj bi bila pod kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gen za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen ''cenA'') in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na zunajcelični strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili transportni sistem z ɑ-hemolizinom, in sicer so konstruirali zapise za ta 2 encima s oznako HlyA. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu kot tudi v mediju ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Kot kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A, je dosegla po 48 urah vrednost OD600 = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600 = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rasle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rasle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz monomerov PilA, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevodnost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment, sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zraslih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je bil razviti alternativo trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo, sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of ''Gluconacetobacter hansenii'' at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe (III) -Reducing Organism ''Geobacter sulfurreducens'' by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T16:19:34Z

Barbara Lipovšek: /* VIRI */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptuloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibulokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz oparona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celuloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom »fluorescent brightener 28«, ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV-svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze verjetno videli modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein fikocianobilin (PCB), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ki inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala, kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja: fotokontrolna naprava naj bi bila pod kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gen za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen ''cenA'') in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na zunajcelični strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili transportni sistem z ɑ-hemolizinom, in sicer so konstruirali zapise za ta 2 encima s oznako HlyA. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu kot tudi v mediju ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Kot kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A, je dosegla po 48 urah vrednost OD600 = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600 = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rasle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rasle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz monomerov PilA, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevodnost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment, sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zraslih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je bil razviti alternativo trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo, sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of ''Gluconacetobacter hansenii'' at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe (III) -Reducing Organism ''Geobacter sulfurreducens'' by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe (III) -Reducing Organism ''Geobacter sulfurreducens'' by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T16:19:04Z

Barbara Lipovšek: /* VIRI */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptuloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibulokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz oparona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celuloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom »fluorescent brightener 28«, ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV-svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze verjetno videli modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein fikocianobilin (PCB), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ki inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala, kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja: fotokontrolna naprava naj bi bila pod kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gen za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen ''cenA'') in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na zunajcelični strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili transportni sistem z ɑ-hemolizinom, in sicer so konstruirali zapise za ta 2 encima s oznako HlyA. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu kot tudi v mediju ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Kot kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A, je dosegla po 48 urah vrednost OD600 = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600 = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rasle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rasle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz monomerov PilA, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevodnost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment, sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zraslih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je bil razviti alternativo trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo, sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of ''Gluconacetobacter hansenii'' at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe (III) -Reducing Organism ''Geobacter sulfurreducens'' by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe (III) -Reducing Organism ''Geobacter sulfurreducens'' by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T16:17:16Z

Barbara Lipovšek: /* Sinteza celuloze */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptuloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibulokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz oparona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celuloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom »fluorescent brightener 28«, ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV-svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze verjetno videli modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein fikocianobilin (PCB), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ki inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala, kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja: fotokontrolna naprava naj bi bila pod kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gen za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen ''cenA'') in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na zunajcelični strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili transportni sistem z ɑ-hemolizinom, in sicer so konstruirali zapise za ta 2 encima s oznako HlyA. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu kot tudi v mediju ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Kot kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A, je dosegla po 48 urah vrednost OD600 = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600 = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rasle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rasle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz monomerov PilA, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevodnost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment, sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zraslih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je bil razviti alternativo trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo, sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T16:12:22Z

Barbara Lipovšek: /* ZAKLJUČEK */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptuloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibulokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz oparona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celuloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV-svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze verjetno videli modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein fikocianobilin (PCB), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ki inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala, kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja: fotokontrolna naprava naj bi bila pod kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gen za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen ''cenA'') in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na zunajcelični strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili transportni sistem z ɑ-hemolizinom, in sicer so konstruirali zapise za ta 2 encima s oznako HlyA. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu kot tudi v mediju ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Kot kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A, je dosegla po 48 urah vrednost OD600 = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600 = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rasle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rasle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz monomerov PilA, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevodnost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment, sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zraslih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je bil razviti alternativo trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo, sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T16:09:08Z

Barbara Lipovšek: /* VIRI */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptuloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibulokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz oparona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celuloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV-svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze verjetno videli modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein fikocianobilin (PCB), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ki inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala, kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja: fotokontrolna naprava naj bi bila pod kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gen za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen ''cenA'') in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na zunajcelični strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili transportni sistem z ɑ-hemolizinom, in sicer so konstruirali zapise za ta 2 encima s oznako HlyA. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu kot tudi v mediju ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Kot kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A, je dosegla po 48 urah vrednost OD600 = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600 = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rasle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rasle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz monomerov PilA, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevodnost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment, sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zraslih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T16:07:57Z

Barbara Lipovšek: /* Zunajcelični prenos elektronov */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptuloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibulokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz oparona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celuloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV-svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze verjetno videli modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein fikocianobilin (PCB), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ki inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala, kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja: fotokontrolna naprava naj bi bila pod kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gen za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen ''cenA'') in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na zunajcelični strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili transportni sistem z ɑ-hemolizinom, in sicer so konstruirali zapise za ta 2 encima s oznako HlyA. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu kot tudi v mediju ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Kot kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A, je dosegla po 48 urah vrednost OD600 = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600 = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rasle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rasle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz monomerov PilA, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevodnost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment, sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zraslih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T15:55:00Z

Barbara Lipovšek: /* Razgradnja celuloze */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptuloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibulokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz oparona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celuloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV-svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze verjetno videli modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein fikocianobilin (PCB), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ki inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala, kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja: fotokontrolna naprava naj bi bila pod kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gen za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen ''cenA'') in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na zunajcelični strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili transportni sistem z ɑ-hemolizinom, in sicer so konstruirali zapise za ta 2 encima s oznako HlyA. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu kot tudi v mediju ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Kot kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A, je dosegla po 48 urah vrednost OD600 = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600 = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rasle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz PilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T15:53:27Z

Barbara Lipovšek: /* Razgradnja celuloze */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptuloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibulokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz oparona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celuloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV-svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze verjetno videli modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein fikocianobilin (PCB), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ki inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala, kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja: fotokontrolna naprava naj bi bila pod kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gen za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen ''cenA'') in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na zunajcelični strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili transportni sistem z ɑ-hemolizinom, in sicer so konstruirali zapise za ta 2 encima s oznako HlyA. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu, kot tudi v mediju, ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Koz kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A je dosegla po 48 urah vrednost OD600 = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600 = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rastle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne, če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz PilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T15:50:58Z

Barbara Lipovšek: /* Sistem mirovanja */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptuloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibulokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz oparona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celuloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV-svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze verjetno videli modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein fikocianobilin (PCB), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ki inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala, kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja: fotokontrolna naprava naj bi bila pod kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gen za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen cenA) in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na ekstracelularni strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili ɑ-hemolizin transportni sistem, in sicer konstruirali so zapise za ta 2 encima s HlyA oznako. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontoro promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu, kot tudi v mediju, ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Koz kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A je dosegla po 48 urah vrednost OD600 = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600 = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rastle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne, če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz PilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T15:49:01Z

Barbara Lipovšek: /* Sinteza celuloze */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptuloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibulokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz oparona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celuloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV-svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze verjetno videli modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein PCB (fikocianobilin), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ta inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja. Fotokontrolna naprava naj bi bila po kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gen za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD, na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR, na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen cenA) in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na ekstracelularni strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili ɑ-hemolizin transportni sistem, in sicer konstruirali so zapise za ta 2 encima s HlyA oznako. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontoro promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu, kot tudi v mediju, ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Koz kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A je dosegla po 48 urah vrednost OD600 = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600 = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rastle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne, če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz PilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T15:40:46Z

Barbara Lipovšek: /* Razgradnja celuloze */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptuloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibulokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz oparona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice, na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celoloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze videlo modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein PCB (fikocianobilin), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ta inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja. Fotokontrolna naprava naj bi bila po kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gen za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD, na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR, na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen cenA) in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na ekstracelularni strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili ɑ-hemolizin transportni sistem, in sicer konstruirali so zapise za ta 2 encima s HlyA oznako. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontoro promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu, kot tudi v mediju, ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Koz kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A je dosegla po 48 urah vrednost OD600 = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600 = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rastle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne, če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz PilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T15:20:05Z

Barbara Lipovšek: /* Sistem mirovanja */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptuloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibulokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz oparona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice, na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celoloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze videlo modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein PCB (fikocianobilin), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ta inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja. Fotokontrolna naprava naj bi bila po kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gen za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD, na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR, na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen cenA) in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na ekstracelularni strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili ɑ-hemolizin transportni sistem, in sicer konstruirali so zapise za ta 2 encima s HlyA oznako. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontoro promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu, kot tudi v mediju, ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Koz kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A je dosegla po 48 urah vrednost OD600=0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600=0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rastle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne, če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz PilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T15:19:32Z

Barbara Lipovšek: /* Sinteza celuloze */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptuloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibulokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz oparona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice, na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celoloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze videlo modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein PCB (fikocianobilin), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ta inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja. Fotokontrolna naprava naj bi bila po kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gez za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD, na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR, na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen cenA) in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na ekstracelularni strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili ɑ-hemolizin transportni sistem, in sicer konstruirali so zapise za ta 2 encima s HlyA oznako. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontoro promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu, kot tudi v mediju, ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Koz kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A je dosegla po 48 urah vrednost OD600=0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600=0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rastle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne, če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz PilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T15:18:10Z

Barbara Lipovšek: /* Fiksacija ogljika */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptuloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibulokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz oparona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo v ''E. coli'' potrebno vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice, na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celoloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze videlo modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein PCB (fikocianobilin), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ta inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja. Fotokontrolna naprava naj bi bila po kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gez za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD, na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR, na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen cenA) in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na ekstracelularni strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili ɑ-hemolizin transportni sistem, in sicer konstruirali so zapise za ta 2 encima s HlyA oznako. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontoro promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu, kot tudi v mediju, ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Koz kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A je dosegla po 48 urah vrednost OD600=0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600=0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rastle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne, če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz PilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T15:13:18Z

Barbara Lipovšek: /* Fiksacija ogljika */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptuloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibulokinaza A (PRK). Da bi optimizirali proces fiksacije ogljika so želeli v ''E. coli'' vnesti še gene iz ''cso'' operona bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in ogljik anhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni ''cso operona'' za tvorbo karboksisoma, ni jim pa uspelo vstaviti Tac promotorja, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo v ''E. coli'' potrebno vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice, na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celoloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze videlo modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein PCB (fikocianobilin), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ta inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja. Fotokontrolna naprava naj bi bila po kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gez za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD, na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR, na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen cenA) in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na ekstracelularni strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili ɑ-hemolizin transportni sistem, in sicer konstruirali so zapise za ta 2 encima s HlyA oznako. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontoro promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu, kot tudi v mediju, ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Koz kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A je dosegla po 48 urah vrednost OD600=0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600=0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rastle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne, če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz PilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T15:08:21Z

Barbara Lipovšek: /* Fiksacija ogljika */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptuloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibulokinaza A (PRK). Da bi optimizirali proces fiksacije ogljika so želeli v ''E. coli'' vnesti še gene iz ''cso'' operona bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in ogljik anhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni ''cso operona'' za tvorbo karboksisoma, ni jim pa uspelo vstaviti Tac promotorja, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo v ''E. coli'' potrebno vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice, na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celoloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze videlo modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein PCB (fikocianobilin), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ta inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja. Fotokontrolna naprava naj bi bila po kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gez za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD, na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR, na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen cenA) in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na ekstracelularni strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili ɑ-hemolizin transportni sistem, in sicer konstruirali so zapise za ta 2 encima s HlyA oznako. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontoro promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu, kot tudi v mediju, ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Koz kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A je dosegla po 48 urah vrednost OD600=0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600=0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rastle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne, če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz PilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T15:05:23Z

Barbara Lipovšek: /* Fiksacija ogljika */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), SBPaza in PRK. Da bi optimizirali proces fiksacije ogljika so želeli v ''E. coli'' vnesti še gene iz ''cso'' operona bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in ogljik anhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni ''cso operona'' za tvorbo karboksisoma, ni jim pa uspelo vstaviti Tac promotorja, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo v ''E. coli'' potrebno vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice, na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celoloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze videlo modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein PCB (fikocianobilin), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ta inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja. Fotokontrolna naprava naj bi bila po kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gez za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD, na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR, na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen cenA) in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na ekstracelularni strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili ɑ-hemolizin transportni sistem, in sicer konstruirali so zapise za ta 2 encima s HlyA oznako. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontoro promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu, kot tudi v mediju, ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Koz kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A je dosegla po 48 urah vrednost OD600=0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600=0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rastle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne, če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz PilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T15:01:23Z

Barbara Lipovšek: /* UVOD */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so RuBisCo, SBPaza in PRK. Da bi optimizirali proces fiksacije ogljika so želeli v ''E. coli'' vnesti še gene iz ''cso'' operona bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in ogljik anhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni ''cso operona'' za tvorbo karboksisoma, ni jim pa uspelo vstaviti Tac promotorja, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo v ''E. coli'' potrebno vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice, na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celoloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze videlo modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein PCB (fikocianobilin), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ta inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja. Fotokontrolna naprava naj bi bila po kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gez za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD, na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR, na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen cenA) in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na ekstracelularni strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili ɑ-hemolizin transportni sistem, in sicer konstruirali so zapise za ta 2 encima s HlyA oznako. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontoro promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu, kot tudi v mediju, ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Koz kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A je dosegla po 48 urah vrednost OD600=0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600=0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rastle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne, če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz PilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T15:00:40Z

Barbara Lipovšek: /* UVOD */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjša izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so RuBisCo, SBPaza in PRK. Da bi optimizirali proces fiksacije ogljika so želeli v ''E. coli'' vnesti še gene iz ''cso'' operona bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in ogljik anhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni ''cso operona'' za tvorbo karboksisoma, ni jim pa uspelo vstaviti Tac promotorja, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo v ''E. coli'' potrebno vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice, na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celoloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze videlo modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein PCB (fikocianobilin), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ta inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja. Fotokontrolna naprava naj bi bila po kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gez za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD, na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR, na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen cenA) in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na ekstracelularni strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili ɑ-hemolizin transportni sistem, in sicer konstruirali so zapise za ta 2 encima s HlyA oznako. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontoro promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu, kot tudi v mediju, ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Koz kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A je dosegla po 48 urah vrednost OD600=0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600=0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rastle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne, če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz PilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T14:59:59Z

Barbara Lipovšek: /* UVOD */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov, enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi ''E. coli'' to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjša izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so RuBisCo, SBPaza in PRK. Da bi optimizirali proces fiksacije ogljika so želeli v ''E. coli'' vnesti še gene iz ''cso'' operona bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in ogljik anhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni ''cso operona'' za tvorbo karboksisoma, ni jim pa uspelo vstaviti Tac promotorja, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo v ''E. coli'' potrebno vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice, na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celoloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze videlo modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein PCB (fikocianobilin), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ta inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja. Fotokontrolna naprava naj bi bila po kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gez za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD, na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR, na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen cenA) in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na ekstracelularni strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili ɑ-hemolizin transportni sistem, in sicer konstruirali so zapise za ta 2 encima s HlyA oznako. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontoro promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu, kot tudi v mediju, ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Koz kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A je dosegla po 48 urah vrednost OD600=0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600=0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rastle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne, če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz PilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T14:58:53Z

Barbara Lipovšek: /* UVOD */

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov, enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi E. coli to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjša izguba energije zaradi metabolizma.

== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so RuBisCo, SBPaza in PRK. Da bi optimizirali proces fiksacije ogljika so želeli v ''E. coli'' vnesti še gene iz ''cso'' operona bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in ogljik anhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni ''cso operona'' za tvorbo karboksisoma, ni jim pa uspelo vstaviti Tac promotorja, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo v ''E. coli'' potrebno vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice, na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celoloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze videlo modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein PCB (fikocianobilin), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ta inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja. Fotokontrolna naprava naj bi bila po kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gez za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD, na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR, na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen cenA) in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na ekstracelularni strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili ɑ-hemolizin transportni sistem, in sicer konstruirali so zapise za ta 2 encima s HlyA oznako. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontoro promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu, kot tudi v mediju, ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Koz kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A je dosegla po 48 urah vrednost OD600=0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600=0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rastle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne, če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz PilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T14:57:53Z

Barbara Lipovšek:

Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark PowerLeaf], ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na iGEM tekmovanju 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi bila lahko alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov, enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi E. coli to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjša izguba energije zaradi metabolizma.
== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so RuBisCo, SBPaza in PRK. Da bi optimizirali proces fiksacije ogljika so želeli v ''E. coli'' vnesti še gene iz ''cso'' operona bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in ogljik anhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni ''cso operona'' za tvorbo karboksisoma, ni jim pa uspelo vstaviti Tac promotorja, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo v ''E. coli'' potrebno vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice, na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celoloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze videlo modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein PCB (fikocianobilin), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ta inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja. Fotokontrolna naprava naj bi bila po kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gez za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD, na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR, na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen cenA) in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na ekstracelularni strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili ɑ-hemolizin transportni sistem, in sicer konstruirali so zapise za ta 2 encima s HlyA oznako. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontoro promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu, kot tudi v mediju, ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Koz kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A je dosegla po 48 urah vrednost OD600=0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600=0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rastle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne, če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz PilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T14:55:40Z

Barbara Lipovšek: /* Zunajcelični prenos elektronov */

Povzeto po projektu PowerLeaf, ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na iGEM tekmovanju 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi bila lahko alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov, enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi E. coli to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjša izguba energije zaradi metabolizma.
== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so RuBisCo, SBPaza in PRK. Da bi optimizirali proces fiksacije ogljika so želeli v ''E. coli'' vnesti še gene iz ''cso'' operona bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in ogljik anhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni ''cso operona'' za tvorbo karboksisoma, ni jim pa uspelo vstaviti Tac promotorja, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo v ''E. coli'' potrebno vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice, na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celoloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze videlo modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein PCB (fikocianobilin), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ta inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja. Fotokontrolna naprava naj bi bila po kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gez za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD, na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR, na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen cenA) in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na ekstracelularni strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili ɑ-hemolizin transportni sistem, in sicer konstruirali so zapise za ta 2 encima s HlyA oznako. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontoro promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu, kot tudi v mediju, ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Koz kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A je dosegla po 48 urah vrednost OD600=0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600=0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rastle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne, če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz PilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T14:54:35Z

Barbara Lipovšek: /* Razgradnja celuloze */

Povzeto po projektu PowerLeaf, ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na iGEM tekmovanju 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi bila lahko alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov, enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi E. coli to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjša izguba energije zaradi metabolizma.
== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so RuBisCo, SBPaza in PRK. Da bi optimizirali proces fiksacije ogljika so želeli v ''E. coli'' vnesti še gene iz ''cso'' operona bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in ogljik anhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni ''cso operona'' za tvorbo karboksisoma, ni jim pa uspelo vstaviti Tac promotorja, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo v ''E. coli'' potrebno vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice, na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celoloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze videlo modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein PCB (fikocianobilin), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ta inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja. Fotokontrolna naprava naj bi bila po kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gez za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD, na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR, na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen cenA) in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na ekstracelularni strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili ɑ-hemolizin transportni sistem, in sicer konstruirali so zapise za ta 2 encima s HlyA oznako. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontoro promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu, kot tudi v mediju, ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Koz kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A je dosegla po 48 urah vrednost OD600=0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600=0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rastle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne, če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz pilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T14:52:27Z

Barbara Lipovšek: /* Sistem mirovanja */

Povzeto po projektu PowerLeaf, ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na iGEM tekmovanju 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi bila lahko alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov, enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi E. coli to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjša izguba energije zaradi metabolizma.
== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so RuBisCo, SBPaza in PRK. Da bi optimizirali proces fiksacije ogljika so želeli v ''E. coli'' vnesti še gene iz ''cso'' operona bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in ogljik anhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni ''cso operona'' za tvorbo karboksisoma, ni jim pa uspelo vstaviti Tac promotorja, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo v ''E. coli'' potrebno vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice, na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celoloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze videlo modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein PCB (fikocianobilin), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ta inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen ''relE'' bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja. Fotokontrolna naprava naj bi bila po kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gez za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD, na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR, na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen cenA) in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na ekstracelularni strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili ɑ-hemolizin transportni sistem, in sicer konstruirali so zapise za ta 2 encima s HlyA oznako. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontoro promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu, kot tudi v mediju, ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Koz kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za cep94A je dosegla po 48 urah vrednost OD600=0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s cep94A pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600=0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rastle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne, če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz pilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T14:46:38Z

Barbara Lipovšek: /* Sinteza celuloze */

Povzeto po projektu PowerLeaf, ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na iGEM tekmovanju 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi bila lahko alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov, enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi E. coli to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjša izguba energije zaradi metabolizma.
== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so RuBisCo, SBPaza in PRK. Da bi optimizirali proces fiksacije ogljika so želeli v ''E. coli'' vnesti še gene iz ''cso'' operona bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in ogljik anhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni ''cso operona'' za tvorbo karboksisoma, ni jim pa uspelo vstaviti Tac promotorja, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo v ''E. coli'' potrebno vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice, na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celoloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze videlo modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein PCB (fikocianobilin), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ta inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. RelE bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se RelE izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja. Fotokontrolna naprava naj bi bila po kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, antitoksin RelB pod kontrolo pBAD, na plazmidu z majhnim številom kopij. Toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR, na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen cenA) in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na ekstracelularni strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili ɑ-hemolizin transportni sistem, in sicer konstruirali so zapise za ta 2 encima s HlyA oznako. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontoro promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu, kot tudi v mediju, ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Koz kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za cep94A je dosegla po 48 urah vrednost OD600=0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s cep94A pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600=0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rastle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne, če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz pilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T14:43:48Z

Barbara Lipovšek: /* Fiksacija ogljika */

Povzeto po projektu PowerLeaf, ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na iGEM tekmovanju 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi bila lahko alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov, enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi E. coli to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjša izguba energije zaradi metabolizma.
== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so RuBisCo, SBPaza in PRK. Da bi optimizirali proces fiksacije ogljika so želeli v ''E. coli'' vnesti še gene iz ''cso'' operona bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in ogljik anhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni ''cso operona'' za tvorbo karboksisoma, ni jim pa uspelo vstaviti Tac promotorja, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo v ''E. coli'' potrebno vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice, na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celoloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon acsABCD v en vektor pod kontrolo promotorja tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''AcsC'' in ''AcsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze videlo modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein PCB (fikocianobilin), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ta inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. RelE bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se RelE izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja. Fotokontrolna naprava naj bi bila po kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, antitoksin RelB pod kontrolo pBAD, na plazmidu z majhnim številom kopij. Toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR, na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen cenA) in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na ekstracelularni strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili ɑ-hemolizin transportni sistem, in sicer konstruirali so zapise za ta 2 encima s HlyA oznako. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontoro promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu, kot tudi v mediju, ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Koz kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za cep94A je dosegla po 48 urah vrednost OD600=0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s cep94A pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600=0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rastle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne, če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz pilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T14:41:37Z

Barbara Lipovšek: /* Fiksacija ogljika */

Povzeto po projektu PowerLeaf, ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na iGEM tekmovanju 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi bila lahko alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov, enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi E. coli to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjša izguba energije zaradi metabolizma.
== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so RuBisCo, SBPaza in PRK. Da bi optimizirali proces fiksacije ogljika so želeli v ''E. coli'' vnesti še gene iz ''cso'' operona bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in ogljikova anhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni ''cso operona'' za tvorbo karboksisoma, ni jim pa uspelo vstaviti Tac promotorja, zato so tudi to nalogo opustili.

=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo v ''E. coli'' potrebno vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice, na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celoloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon acsABCD v en vektor pod kontrolo promotorja tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''AcsC'' in ''AcsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze videlo modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein PCB (fikocianobilin), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ta inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. RelE bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se RelE izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja. Fotokontrolna naprava naj bi bila po kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, antitoksin RelB pod kontrolo pBAD, na plazmidu z majhnim številom kopij. Toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR, na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen cenA) in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na ekstracelularni strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili ɑ-hemolizin transportni sistem, in sicer konstruirali so zapise za ta 2 encima s HlyA oznako. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontoro promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu, kot tudi v mediju, ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Koz kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za cep94A je dosegla po 48 urah vrednost OD600=0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s cep94A pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600=0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rastle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne, če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz pilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

Seminarji SB 2017/18

2018-01-22T14:38:06Z

Barbara Lipovšek:

V študijskem letu 2017/18 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola] 
#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah] 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prostorsko-%C4%8Dasovni_nadzor_izra%C5%BEanja_genov_z_mre%C5%BEami_generatorjev_impulzov Prostorsko-časovni nadzor izražanja genov z mrežami generatorjev impulzov] 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularna_in_razširljiva_platforma_na_osnovi_regulacije_izražanja_genov_z_RNA_za_inženiring_celičnih_funkcij Modularna in razširljiva platforma na osnovi regulacije izražanja genov z RNA za inženiring celičnih funkcij] - Ana Cirnski 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezceli%C4%8Dna_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni CascAID - test s Cas13a za diagnostiko nalezljivih bolezni]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Case13a_Sistem_za_zaznavanje_genov_za_odpornost_proti_antibiotiku Case13a - Sistem za zaznavanje genov za odpornost proti antibiotiku]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pospe%C5%A1ena_in_vivo_evolucija Pospešena ''in vivo'' evolucija]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pilus%2B Pilus+]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/%C5%A0irjenje_genetskega_koda Širjenje genetskega koda]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aflatoxout Aflatoxout] 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Super_tobak Super tobak]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Enkabcillus_-_to_je_past%21 Enkabcillus - to je past!] 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Solni_trezor Solni trezor] 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/H2ydroGEM_-_%C4%8Cista_energija_za_prihodnost H2ydroGEM - Čista energija za prihodnost] 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Shramba_fosfata Shramba fosfata] 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynORI_–_ogrodje_za_večplazmidne_sisteme SynORI – ogrodje za večplazmidne sisteme] 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PowerLeaf_%E2%80%93_bakterijska_solarna_baterija PowerLeaf – bakterijska solarna baterija] 

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

---------------------------
Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

27.11. 
1 Marija Srnko -[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem] 
2 Neža Brezovar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SLOVO_RAKU Slovo raku] 

28.11. 
1 Tjaša Grum - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola] 
2 Urška Černe [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] 
3 Petra Vivod - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense] 
4 

4.12. 
1 Sara Kimm Fuhrmann - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ] 
2 Anja Tanšek - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DNA_assembler - DNA assembler] 

5.12. 
1 Urška Furar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah] 
2 Tina Lekan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] 
3 Katja Malovrh [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin] 
4 Jernej Vidmar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka] 

12.12. 
1 Helena Jakše - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka] 
2 Tjaša Bensa - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezcelična_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni] 
3 Sabina Štukelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MagicBlock:_interaktivna_platforma_za_sintezno_biologijo MagicBlock: interaktivna platforma za sintezno biologijo] 
4 Amadeja Lapornik [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano] 

19.12. 
1 Ana Krišelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED] 
2 Vanna Imširović [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Beton-samoporavljaju%C4%87i_sistem Beton-samopopravljajući sistem] 
3 Dominik Dekleva - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] 
4 Neža Gaube [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni CascAID - test s Cas13a za diagnostiko nalezljivih bolezni] 

9.1. 
1 Nastja Marondini - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pospe%C5%A1ena_in_vivo_evolucija Pospešena ''in vivo'' evolucija] 
2 Elizabeta Jevnikar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prostorsko-%C4%8Dasovni_nadzor_izra%C5%BEanja_genov_z_mre%C5%BEami_generatorjev_impulzov Prostorsko-časovni nadzor izražanja genov z mrežami generatorjev impulzov] 
3 Nina Roštan - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Case13a_Sistem_za_zaznavanje_genov_za_odpornost_proti_antibiotiku Case13a - Sistem za zaznavanje genov za odpornost proti antibiotiku] 
4 

15.1. 
1 Matic Kovačič - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/%C5%A0irjenje_genetskega_koda Širjenje genetskega koda] 

16.1. 
1 Inge Sotlar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Super_tobak Super tobak] 
2 Marija Kisilak - [[Enkabcillus - to je past!]] 
3 Nataša Traven - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aflatoxout Aflatoxout] 
4 Tina Šimunović - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pilus%2B Pilus+] 

22.1. 
1 Mojca Hunski - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynORI_–_ogrodje_za_večplazmidne_sisteme SynORI – ogrodje za večplazmidne sisteme] 
2 Tomaž Žagar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Solni_trezor Solni trezor] 
3 Tadej Ulčnik - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Shramba_fosfata Shramba fosfata] 
4 Jakob Rupert - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/H2ydroGEM_-_%C4%8Cista_energija_za_prihodnost H2ydroGEM - Čista energija za prihodnost] 

23.1. 
1 Ana Cirnski - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularna_in_razširljiva_platforma_na_osnovi_regulacije_izražanja_genov_z_RNA_za_inženiring_celičnih_funkcij Modularna in razširljiva platforma na osnovi regulacije izražanja genov z RNA za inženiring celičnih funkcij] 
2 Rok Ferenc 
3 Barbara Lipovšek - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PowerLeaf_%E2%80%93_bakterijska_solarna_baterija PowerLeaf – bakterijska solarna baterija] 
4

PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

2018-01-22T14:34:05Z

Barbara Lipovšek: New page: Povzeto po projektu PowerLeaf, ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. Avtorica: Barbara Lipovšek == UVOD == Ekipa študentov iz Danske je na iGEM tekmovanju 2017 predstavila ...

Povzeto po projektu PowerLeaf, ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017. 
Avtorica: Barbara Lipovšek
== UVOD ==
Ekipa študentov iz Danske je na iGEM tekmovanju 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi bila lahko alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov, enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije ''E. coli'' fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi E. coli to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjša izguba energije zaradi metabolizma.
== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
=== Fiksacija ogljika ===
Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so RuBisCo, SBPaza in PRK. Da bi optimizirali proces fiksacije ogljika so želeli v ''E. coli'' vnesti še gene iz ''cso'' operona bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in ogljikova anhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO3- do CO2, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid 3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze. 
Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni ''cso operona'' za tvorbo karboksisoma, ni jim pa uspelo vstaviti Tac promotorja, zato so tudi to nalogo opustili.
=== Sinteza celuloze ===
Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo v ''E. coli'' potrebno vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice, na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celoloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. Najprej so želeli prenesti celoten operon acsABCD v en vektor pod kontrolo promotorja tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''AcsC'' in ''AcsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom ''fluorescent brightener 28'', ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze videlo modro barvo.

=== Sistem mirovanja ===
Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein PCB (fikocianobilin), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ta inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. RelE bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se RelE izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja.
Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem. Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja. Fotokontrolna naprava naj bi bila po kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, antitoksin RelB pod kontrolo pBAD, na plazmidu z majhnim številom kopij. Toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR, na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

== ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE ==
=== Razgradnja celuloze ===
Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen cenA) in ekso-β-1,4-glukanaza (gen ''cex''), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na ekstracelularni strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili ɑ-hemolizin transportni sistem, in sicer konstruirali so zapise za ta 2 encima s HlyA oznako. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran.
Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontoro promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu, kot tudi v mediju, ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Koz kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za cep94A je dosegla po 48 urah vrednost OD600=0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s cep94A pa je po 72 urah dosegla vrednost OD600=0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rastle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne, če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

=== Zunajcelični prenos elektronov ===
Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi ''E. coli'' rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi ''Geobacter sulfurreducens''. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz pilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v ''E. coli'' prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic ''G. sulfurreducens''. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic ''G. metallireducens'' tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z ''G. metallireducens'' težavno, so se odločili, da bodo delali s ''G. sulfurreducens''. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz ''pilA'' gena iz ''G. metallireducens'', zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena ''pilA'' iz ''G. sulfurreducens''. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom ''G. sulfurreducens'' s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

== ZAKLJUČEK ==

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

== VIRI ==
- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety 
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. 
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. 
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.

Seminarji SB 2017/18

2017-12-21T14:51:23Z

Barbara Lipovšek:

Seminarji SB 2017/18

2017-11-16T16:38:30Z

Barbara Lipovšek:

Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v bakteriji Escherichia coli, ki temelji na endogeni kontroli fermentacije

2017-05-29T18:27:19Z

Barbara Lipovšek: /* Zaključek */

== Butanol ==
Butanol je možni nadomestek tekočih goriv, saj se lahko kot 85-odstotni delež goriva uporabi pri večini bencinskih motorjev z notranjim zgorevanjem brez dodatnih predelav motorja. Nastaja pri fermentaciji biomase v organizmu ''Clostridium acetobutylicum''. Prednosti butanola sta visoka oktanska in visoka energijska vrednost.
== Priprava ''E. coli'' za sintezo 1-butanola ==
V študiji so konstruirali sistem za sintezo 1-butanola v bakteriji ''Escherichia coli'' pod endogenimi, nativnimi fermentacijskimi regulatornimi elementi (FRE). FRE vsebujejo promotor, vezavno mesto za ribosom in vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Uporabili so FRE''ackA'', FRE''adhE'', FRE''frd'' in FRE''ldhA''.

Najprej so pripravili sev ''E. coli'' z delecijami genov za nativno pot fermentacije. Sev je imel delecije genov za laktat dehidrogenazo (Δ''ldhA''), fumarat reduktazo (Δ''frdBC''), alkohol dehidrogenazo (Δ''adhE'') in fosfotransacetilazo (Δ''pta''). Posledica teh delecij je bil onemogočen metabolizem do sukcinata, laktata, etanola ter acetata.

Pripravili so tri različne plazmide, na katerih je bilo razporejenih 6 genov. Prvi plazmid je vseboval gene ''atoB'' (acetil-CoA acetiltransferaza), ''adhE2'' (aldehid-alkohol dehidrogenaza), ''crt'' (3-hidroksibutiril-CoA dehidrataza), ''hbd'' (hidroksimaslena dehidrogenaza), drugi plazmid gen ''fdh'' (format dehidrogenaza), tretji pa gen ''ter'' (trans-enoil-CoA reduktaza). Z vnosom teh genov so omogočili biosintezno pot do 1-butanola. V vsakega od teh treh plazmidov so klonirali po 4 različne FRE in tako pridobili 64 različnih kombinacij. S temi plazmidi so transformirali prej pripravljeni sev ''E. coli''.

Pripravljene bakterije so rastle v bogatem gojišču z glukozo, triptonom in kvasnim ekstraktom aerobno do stacionarne faze, temu pa je sledil preklop v anaerobno atmosfero, saj ta inducira sintezo 1-butanola. Sev s plazmidi, ki so vsebovali FRE''adhE''::''fdh'', FRE''ackA''::''atoB-adhE2-crt-hbd'' in FRE''adhE''::''ter'', je proizvajal najvišji titer 1-butanola, in sicer 3 g/L.

Ugotovili so, da je za sintezo 1-butanola v višjih koncentracijah v največji meri odgovorna aktivnost Fdh. Ta encim je odgovoren za redoks stanje v celici, saj pri svojem delovanju generira NADH. Da lahko glikoliza normalno poteka, se mora NADH oksidirati do NAD+. Presežek NADH v sevu ''E. coli'' z deletiranimi geni za nativno pot fermentacije poganja pot sinteze 1-butanola. Poskusili so, kako različni FRE vplivajo na izražanje ''fdh'', in ugotovili, da ima Fdh največjo aktivnost, ko se izraža pod kontrolo FRE''adhE''.
== Analiza različnih vplivov na sintezo 1-butanola ==
Testirali so vpliv različnih koncentracij kisika v atmosferi na sintezo 1-butanola. Uporabili so sev z najboljšo kombinacijo plazmidov, ga gojili v različnih okoljih in ugotovili, da za začetek sinteze ni potrebna popolna odsotnost kisika, ampak se ta prične že v mikro-aerobnem okolju.

Ugotovili so tudi, da imajo na sintezo 1-butanola velik vpliv sestavine medija. Merili so titer 1-butanola v TB-mediju, v M9-mediju in v M9-mediju z dodanim ekstraktom kvasovk. Zaznali so padec titra 1-butanola v obeh M9-medijih, torej so kompleksna hranila za zadovoljivo sintezo 1-butanola nujno potrebna.

Pomemben je tudi čas prehoda v anaerobno atmosfero. Testirali so prehod v različnih fazah rasti celic in ugotovili, da prehod v anaerobno atmosfero v lag, eksponentni ali zgodnji stacionarni fazi povzroči podobno količino sintetiziranega 1-butanola, medtem ko je posledica prehoda v anaerobno atmosfero v pozni stacionarni fazi nizek titer 1-butanola. Do tega pride zaradi zmanjšanega izražanja proteinov pri veliki celični gostoti.

Prav tako so poskusili, kako poteka sinteza 1-butanola v odsotnosti induktorja in antibiotikov v gojišču in prišli do zaključka, da ti niso nujno potrebni za uspešno proizvodnjo 1-butanola, saj je bil titer v tem primeru 10 g/L v 24 h, izkoristek pa 0,25 g/g glukoze.

== Zaključek ==
V tej študiji so raziskovalci uspešno skonstruirali sistem samoregulirane proizvodnje 1-butanola v bakteriji ''E. coli''. Za industrijsko uporabo pa je treba sistem optimizirati in izboljšati sintezo 1-butanola v minimalnem mediju.

== Vir ==
Wen RC, Shen CR. Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control. Biotechnol Biofuels. 2016;9(1):267.

Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v bakteriji Escherichia coli, ki temelji na endogeni kontroli fermentacije

2017-05-29T18:26:57Z

Barbara Lipovšek: /* Zaključek */

== Butanol ==
Butanol je možni nadomestek tekočih goriv, saj se lahko kot 85-odstotni delež goriva uporabi pri večini bencinskih motorjev z notranjim zgorevanjem brez dodatnih predelav motorja. Nastaja pri fermentaciji biomase v organizmu ''Clostridium acetobutylicum''. Prednosti butanola sta visoka oktanska in visoka energijska vrednost.
== Priprava ''E. coli'' za sintezo 1-butanola ==
V študiji so konstruirali sistem za sintezo 1-butanola v bakteriji ''Escherichia coli'' pod endogenimi, nativnimi fermentacijskimi regulatornimi elementi (FRE). FRE vsebujejo promotor, vezavno mesto za ribosom in vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Uporabili so FRE''ackA'', FRE''adhE'', FRE''frd'' in FRE''ldhA''.

Najprej so pripravili sev ''E. coli'' z delecijami genov za nativno pot fermentacije. Sev je imel delecije genov za laktat dehidrogenazo (Δ''ldhA''), fumarat reduktazo (Δ''frdBC''), alkohol dehidrogenazo (Δ''adhE'') in fosfotransacetilazo (Δ''pta''). Posledica teh delecij je bil onemogočen metabolizem do sukcinata, laktata, etanola ter acetata.

Pripravili so tri različne plazmide, na katerih je bilo razporejenih 6 genov. Prvi plazmid je vseboval gene ''atoB'' (acetil-CoA acetiltransferaza), ''adhE2'' (aldehid-alkohol dehidrogenaza), ''crt'' (3-hidroksibutiril-CoA dehidrataza), ''hbd'' (hidroksimaslena dehidrogenaza), drugi plazmid gen ''fdh'' (format dehidrogenaza), tretji pa gen ''ter'' (trans-enoil-CoA reduktaza). Z vnosom teh genov so omogočili biosintezno pot do 1-butanola. V vsakega od teh treh plazmidov so klonirali po 4 različne FRE in tako pridobili 64 različnih kombinacij. S temi plazmidi so transformirali prej pripravljeni sev ''E. coli''.

Pripravljene bakterije so rastle v bogatem gojišču z glukozo, triptonom in kvasnim ekstraktom aerobno do stacionarne faze, temu pa je sledil preklop v anaerobno atmosfero, saj ta inducira sintezo 1-butanola. Sev s plazmidi, ki so vsebovali FRE''adhE''::''fdh'', FRE''ackA''::''atoB-adhE2-crt-hbd'' in FRE''adhE''::''ter'', je proizvajal najvišji titer 1-butanola, in sicer 3 g/L.

Ugotovili so, da je za sintezo 1-butanola v višjih koncentracijah v največji meri odgovorna aktivnost Fdh. Ta encim je odgovoren za redoks stanje v celici, saj pri svojem delovanju generira NADH. Da lahko glikoliza normalno poteka, se mora NADH oksidirati do NAD+. Presežek NADH v sevu ''E. coli'' z deletiranimi geni za nativno pot fermentacije poganja pot sinteze 1-butanola. Poskusili so, kako različni FRE vplivajo na izražanje ''fdh'', in ugotovili, da ima Fdh največjo aktivnost, ko se izraža pod kontrolo FRE''adhE''.
== Analiza različnih vplivov na sintezo 1-butanola ==
Testirali so vpliv različnih koncentracij kisika v atmosferi na sintezo 1-butanola. Uporabili so sev z najboljšo kombinacijo plazmidov, ga gojili v različnih okoljih in ugotovili, da za začetek sinteze ni potrebna popolna odsotnost kisika, ampak se ta prične že v mikro-aerobnem okolju.

Ugotovili so tudi, da imajo na sintezo 1-butanola velik vpliv sestavine medija. Merili so titer 1-butanola v TB-mediju, v M9-mediju in v M9-mediju z dodanim ekstraktom kvasovk. Zaznali so padec titra 1-butanola v obeh M9-medijih, torej so kompleksna hranila za zadovoljivo sintezo 1-butanola nujno potrebna.

Pomemben je tudi čas prehoda v anaerobno atmosfero. Testirali so prehod v različnih fazah rasti celic in ugotovili, da prehod v anaerobno atmosfero v lag, eksponentni ali zgodnji stacionarni fazi povzroči podobno količino sintetiziranega 1-butanola, medtem ko je posledica prehoda v anaerobno atmosfero v pozni stacionarni fazi nizek titer 1-butanola. Do tega pride zaradi zmanjšanega izražanja proteinov pri veliki celični gostoti.

Prav tako so poskusili, kako poteka sinteza 1-butanola v odsotnosti induktorja in antibiotikov v gojišču in prišli do zaključka, da ti niso nujno potrebni za uspešno proizvodnjo 1-butanola, saj je bil titer v tem primeru 10 g/L v 24 h, izkoristek pa 0,25 g/g glukoze.

== Zaključek ==
V tej študiji so raziskovalci uspešno skonstruirali sistem samoregulirane proizvodnje 1-butanola v bakteriji ''E. coli''. Za industrijsko uporabo pa je treba sistem še optimizirati in izboljšati sintezo 1-butanola v minimalnem mediju.

== Vir ==
Wen RC, Shen CR. Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control. Biotechnol Biofuels. 2016;9(1):267.

Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v bakteriji Escherichia coli, ki temelji na endogeni kontroli fermentacije

2017-05-29T18:25:07Z

Barbara Lipovšek: /* Analiza različnih vplivov na sintezo 1-butanola */

== Butanol ==
Butanol je možni nadomestek tekočih goriv, saj se lahko kot 85-odstotni delež goriva uporabi pri večini bencinskih motorjev z notranjim zgorevanjem brez dodatnih predelav motorja. Nastaja pri fermentaciji biomase v organizmu ''Clostridium acetobutylicum''. Prednosti butanola sta visoka oktanska in visoka energijska vrednost.
== Priprava ''E. coli'' za sintezo 1-butanola ==
V študiji so konstruirali sistem za sintezo 1-butanola v bakteriji ''Escherichia coli'' pod endogenimi, nativnimi fermentacijskimi regulatornimi elementi (FRE). FRE vsebujejo promotor, vezavno mesto za ribosom in vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Uporabili so FRE''ackA'', FRE''adhE'', FRE''frd'' in FRE''ldhA''.

Najprej so pripravili sev ''E. coli'' z delecijami genov za nativno pot fermentacije. Sev je imel delecije genov za laktat dehidrogenazo (Δ''ldhA''), fumarat reduktazo (Δ''frdBC''), alkohol dehidrogenazo (Δ''adhE'') in fosfotransacetilazo (Δ''pta''). Posledica teh delecij je bil onemogočen metabolizem do sukcinata, laktata, etanola ter acetata.

Pripravili so tri različne plazmide, na katerih je bilo razporejenih 6 genov. Prvi plazmid je vseboval gene ''atoB'' (acetil-CoA acetiltransferaza), ''adhE2'' (aldehid-alkohol dehidrogenaza), ''crt'' (3-hidroksibutiril-CoA dehidrataza), ''hbd'' (hidroksimaslena dehidrogenaza), drugi plazmid gen ''fdh'' (format dehidrogenaza), tretji pa gen ''ter'' (trans-enoil-CoA reduktaza). Z vnosom teh genov so omogočili biosintezno pot do 1-butanola. V vsakega od teh treh plazmidov so klonirali po 4 različne FRE in tako pridobili 64 različnih kombinacij. S temi plazmidi so transformirali prej pripravljeni sev ''E. coli''.

Pripravljene bakterije so rastle v bogatem gojišču z glukozo, triptonom in kvasnim ekstraktom aerobno do stacionarne faze, temu pa je sledil preklop v anaerobno atmosfero, saj ta inducira sintezo 1-butanola. Sev s plazmidi, ki so vsebovali FRE''adhE''::''fdh'', FRE''ackA''::''atoB-adhE2-crt-hbd'' in FRE''adhE''::''ter'', je proizvajal najvišji titer 1-butanola, in sicer 3 g/L.

Ugotovili so, da je za sintezo 1-butanola v višjih koncentracijah v največji meri odgovorna aktivnost Fdh. Ta encim je odgovoren za redoks stanje v celici, saj pri svojem delovanju generira NADH. Da lahko glikoliza normalno poteka, se mora NADH oksidirati do NAD+. Presežek NADH v sevu ''E. coli'' z deletiranimi geni za nativno pot fermentacije poganja pot sinteze 1-butanola. Poskusili so, kako različni FRE vplivajo na izražanje ''fdh'', in ugotovili, da ima Fdh največjo aktivnost, ko se izraža pod kontrolo FRE''adhE''.
== Analiza različnih vplivov na sintezo 1-butanola ==
Testirali so vpliv različnih koncentracij kisika v atmosferi na sintezo 1-butanola. Uporabili so sev z najboljšo kombinacijo plazmidov, ga gojili v različnih okoljih in ugotovili, da za začetek sinteze ni potrebna popolna odsotnost kisika, ampak se ta prične že v mikro-aerobnem okolju.

Ugotovili so tudi, da imajo na sintezo 1-butanola velik vpliv sestavine medija. Merili so titer 1-butanola v TB-mediju, v M9-mediju in v M9-mediju z dodanim ekstraktom kvasovk. Zaznali so padec titra 1-butanola v obeh M9-medijih, torej so kompleksna hranila za zadovoljivo sintezo 1-butanola nujno potrebna.

Pomemben je tudi čas prehoda v anaerobno atmosfero. Testirali so prehod v različnih fazah rasti celic in ugotovili, da prehod v anaerobno atmosfero v lag, eksponentni ali zgodnji stacionarni fazi povzroči podobno količino sintetiziranega 1-butanola, medtem ko je posledica prehoda v anaerobno atmosfero v pozni stacionarni fazi nizek titer 1-butanola. Do tega pride zaradi zmanjšanega izražanja proteinov pri veliki celični gostoti.

Prav tako so poskusili, kako poteka sinteza 1-butanola v odsotnosti induktorja in antibiotikov v gojišču in prišli do zaključka, da ti niso nujno potrebni za uspešno proizvodnjo 1-butanola, saj je bil titer v tem primeru 10 g/L v 24 h, izkoristek pa 0,25 g/g glukoze.

== Zaključek ==
V tej študiji so raziskovalci uspešno skonstruirali sistem samoregulirane proizvodnje 1-butanola v bakteriji ''E. coli''. Za industrijsko uporabo pa bi bilo potrebo sistem še optimizirati in izboljšati sintezo 1-butanola v minimalnem mediju.
== Vir ==
Wen RC, Shen CR. Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control. Biotechnol Biofuels. 2016;9(1):267.

Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v bakteriji Escherichia coli, ki temelji na endogeni kontroli fermentacije

2017-05-29T18:24:54Z

Barbara Lipovšek: /* Analiza različnih vplivov na sintezo 1-butanola */

== Butanol ==
Butanol je možni nadomestek tekočih goriv, saj se lahko kot 85-odstotni delež goriva uporabi pri večini bencinskih motorjev z notranjim zgorevanjem brez dodatnih predelav motorja. Nastaja pri fermentaciji biomase v organizmu ''Clostridium acetobutylicum''. Prednosti butanola sta visoka oktanska in visoka energijska vrednost.
== Priprava ''E. coli'' za sintezo 1-butanola ==
V študiji so konstruirali sistem za sintezo 1-butanola v bakteriji ''Escherichia coli'' pod endogenimi, nativnimi fermentacijskimi regulatornimi elementi (FRE). FRE vsebujejo promotor, vezavno mesto za ribosom in vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Uporabili so FRE''ackA'', FRE''adhE'', FRE''frd'' in FRE''ldhA''.

Najprej so pripravili sev ''E. coli'' z delecijami genov za nativno pot fermentacije. Sev je imel delecije genov za laktat dehidrogenazo (Δ''ldhA''), fumarat reduktazo (Δ''frdBC''), alkohol dehidrogenazo (Δ''adhE'') in fosfotransacetilazo (Δ''pta''). Posledica teh delecij je bil onemogočen metabolizem do sukcinata, laktata, etanola ter acetata.

Pripravili so tri različne plazmide, na katerih je bilo razporejenih 6 genov. Prvi plazmid je vseboval gene ''atoB'' (acetil-CoA acetiltransferaza), ''adhE2'' (aldehid-alkohol dehidrogenaza), ''crt'' (3-hidroksibutiril-CoA dehidrataza), ''hbd'' (hidroksimaslena dehidrogenaza), drugi plazmid gen ''fdh'' (format dehidrogenaza), tretji pa gen ''ter'' (trans-enoil-CoA reduktaza). Z vnosom teh genov so omogočili biosintezno pot do 1-butanola. V vsakega od teh treh plazmidov so klonirali po 4 različne FRE in tako pridobili 64 različnih kombinacij. S temi plazmidi so transformirali prej pripravljeni sev ''E. coli''.

Pripravljene bakterije so rastle v bogatem gojišču z glukozo, triptonom in kvasnim ekstraktom aerobno do stacionarne faze, temu pa je sledil preklop v anaerobno atmosfero, saj ta inducira sintezo 1-butanola. Sev s plazmidi, ki so vsebovali FRE''adhE''::''fdh'', FRE''ackA''::''atoB-adhE2-crt-hbd'' in FRE''adhE''::''ter'', je proizvajal najvišji titer 1-butanola, in sicer 3 g/L.

Ugotovili so, da je za sintezo 1-butanola v višjih koncentracijah v največji meri odgovorna aktivnost Fdh. Ta encim je odgovoren za redoks stanje v celici, saj pri svojem delovanju generira NADH. Da lahko glikoliza normalno poteka, se mora NADH oksidirati do NAD+. Presežek NADH v sevu ''E. coli'' z deletiranimi geni za nativno pot fermentacije poganja pot sinteze 1-butanola. Poskusili so, kako različni FRE vplivajo na izražanje ''fdh'', in ugotovili, da ima Fdh največjo aktivnost, ko se izraža pod kontrolo FRE''adhE''.
== Analiza različnih vplivov na sintezo 1-butanola ==
Testirali so vpliv različnih koncentracij kisika v atmosferi na sintezo 1-butanola. Uporabili so sev z najboljšo kombinacijo plazmidov, ga gojili v različnih okoljih in ugotovili, da za začetek sinteze ni potrebna popolna odsotnost kisika, ampak se ta prične že v mikro-aerobnem okolju.

Ugotovili so tudi, da imajo na sintezo 1-butanola velik vpliv sestavine medija. Merili so titer 1-butanola v TB-mediju, v M9-mediju in v M9-mediju z dodanim ekstraktom kvasovk. Zaznali so padec titra 1-butanola v obeh M9-medijih, torej so kompleksna hranila za zadovoljivo sintezo 1-butanola nujno potrebna.

Pomemben je tudi čas prehoda v anaerobno atmosfero. Testirali so prehod v različnih fazah rasti celic in ugotovili, da prehod v anaerobno atmosfero v lag, eksponentni ali zgodnji stacionarni fazi povzroči podobno količino sintetiziranega 1-butanola, medtem ko je posledica prehoda v anaerobno atmosfero v pozni stacionarni fazi nizek titer 1-butanola. Do tega pride zaradi zmanjšanega izražanja proteinov pri veliki celični gostoti.

Prav tako so puskusili, kako poteka sinteza 1-butanola v odsotnosti induktorja in antibiotikov v gojišču in prišli do zaključka, da ti niso nujno potrebni za uspešno proizvodnjo 1-butanola, saj je bil titer v tem primeru 10 g/L v 24 h, izkoristek pa 0,25 g/g glukoze.

== Zaključek ==
V tej študiji so raziskovalci uspešno skonstruirali sistem samoregulirane proizvodnje 1-butanola v bakteriji ''E. coli''. Za industrijsko uporabo pa bi bilo potrebo sistem še optimizirati in izboljšati sintezo 1-butanola v minimalnem mediju.
== Vir ==
Wen RC, Shen CR. Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control. Biotechnol Biofuels. 2016;9(1):267.

Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v bakteriji Escherichia coli, ki temelji na endogeni kontroli fermentacije

2017-05-29T18:23:27Z

Barbara Lipovšek: /* Analiza različnih vplivov na sintezo 1-butanola */

== Butanol ==
Butanol je možni nadomestek tekočih goriv, saj se lahko kot 85-odstotni delež goriva uporabi pri večini bencinskih motorjev z notranjim zgorevanjem brez dodatnih predelav motorja. Nastaja pri fermentaciji biomase v organizmu ''Clostridium acetobutylicum''. Prednosti butanola sta visoka oktanska in visoka energijska vrednost.
== Priprava ''E. coli'' za sintezo 1-butanola ==
V študiji so konstruirali sistem za sintezo 1-butanola v bakteriji ''Escherichia coli'' pod endogenimi, nativnimi fermentacijskimi regulatornimi elementi (FRE). FRE vsebujejo promotor, vezavno mesto za ribosom in vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Uporabili so FRE''ackA'', FRE''adhE'', FRE''frd'' in FRE''ldhA''.

Najprej so pripravili sev ''E. coli'' z delecijami genov za nativno pot fermentacije. Sev je imel delecije genov za laktat dehidrogenazo (Δ''ldhA''), fumarat reduktazo (Δ''frdBC''), alkohol dehidrogenazo (Δ''adhE'') in fosfotransacetilazo (Δ''pta''). Posledica teh delecij je bil onemogočen metabolizem do sukcinata, laktata, etanola ter acetata.

Pripravili so tri različne plazmide, na katerih je bilo razporejenih 6 genov. Prvi plazmid je vseboval gene ''atoB'' (acetil-CoA acetiltransferaza), ''adhE2'' (aldehid-alkohol dehidrogenaza), ''crt'' (3-hidroksibutiril-CoA dehidrataza), ''hbd'' (hidroksimaslena dehidrogenaza), drugi plazmid gen ''fdh'' (format dehidrogenaza), tretji pa gen ''ter'' (trans-enoil-CoA reduktaza). Z vnosom teh genov so omogočili biosintezno pot do 1-butanola. V vsakega od teh treh plazmidov so klonirali po 4 različne FRE in tako pridobili 64 različnih kombinacij. S temi plazmidi so transformirali prej pripravljeni sev ''E. coli''.

Pripravljene bakterije so rastle v bogatem gojišču z glukozo, triptonom in kvasnim ekstraktom aerobno do stacionarne faze, temu pa je sledil preklop v anaerobno atmosfero, saj ta inducira sintezo 1-butanola. Sev s plazmidi, ki so vsebovali FRE''adhE''::''fdh'', FRE''ackA''::''atoB-adhE2-crt-hbd'' in FRE''adhE''::''ter'', je proizvajal najvišji titer 1-butanola, in sicer 3 g/L.

Ugotovili so, da je za sintezo 1-butanola v višjih koncentracijah v največji meri odgovorna aktivnost Fdh. Ta encim je odgovoren za redoks stanje v celici, saj pri svojem delovanju generira NADH. Da lahko glikoliza normalno poteka, se mora NADH oksidirati do NAD+. Presežek NADH v sevu ''E. coli'' z deletiranimi geni za nativno pot fermentacije poganja pot sinteze 1-butanola. Poskusili so, kako različni FRE vplivajo na izražanje ''fdh'', in ugotovili, da ima Fdh največjo aktivnost, ko se izraža pod kontrolo FRE''adhE''.
== Analiza različnih vplivov na sintezo 1-butanola ==
Testirali so vpliv različnih koncentracij kisika v atmosferi na sintezo 1-butanola. Uporabili so sev z najboljšo kombinacijo plazmidov, ga gojili v različnih okoljih in ugotovili, da za začetek sinteze ni potrebna popolna odsotnost kisika, ampak se ta prične že v mikro-aerobnem okolju.

Ugotovili so tudi, da imajo na sintezo 1-butanola velik vpliv sestavine medija. Merili so titer 1-butanola v TB-mediju, v M9-mediju in v M9-mediju z dodanim ekstraktom kvasovk. Zaznali so padec titra 1-butanola v obeh M9-medijih, torej so kompleksna hranila za zadovoljivo sintezo 1-butanola nujno potrebna.

Pomemben je tudi čas prehoda v anaerobno atmosfero. Testirali so prehod v različnih fazah rasti celic in ugotovili, da prehod v anaerobno atmosfero v lag, eksponentni ali zgodnji stacionarni fazi povzroči podobno količino sintetiziranega 1-butanola, medtem ko je posledica prehoda v anaerobno atmosfero v pozni stacionarni fazi nizek titer 1-butanola. Do tega pride zaradi zmanjšanega izražanja proteinov pri veliki celični gostoti.

Poskusili so tudi, kako poteka sinteza 1-butanola v odsotnosti induktorja in antibiotikov v gojišču. Ugotovili so, da ti niso nujno potrebni za uspešno proizvodnjo 1-butanola, saj je bil titer v tem primeru 10 g/L v 24 h, izkoristek pa 0,25 g/g glukoze.

== Zaključek ==
V tej študiji so raziskovalci uspešno skonstruirali sistem samoregulirane proizvodnje 1-butanola v bakteriji ''E. coli''. Za industrijsko uporabo pa bi bilo potrebo sistem še optimizirati in izboljšati sintezo 1-butanola v minimalnem mediju.
== Vir ==
Wen RC, Shen CR. Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control. Biotechnol Biofuels. 2016;9(1):267.

Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v bakteriji Escherichia coli, ki temelji na endogeni kontroli fermentacije

2017-05-29T18:22:42Z

Barbara Lipovšek: /* Analiza različnih vplivov na sintezo 1-butanola */

== Butanol ==
Butanol je možni nadomestek tekočih goriv, saj se lahko kot 85-odstotni delež goriva uporabi pri večini bencinskih motorjev z notranjim zgorevanjem brez dodatnih predelav motorja. Nastaja pri fermentaciji biomase v organizmu ''Clostridium acetobutylicum''. Prednosti butanola sta visoka oktanska in visoka energijska vrednost.
== Priprava ''E. coli'' za sintezo 1-butanola ==
V študiji so konstruirali sistem za sintezo 1-butanola v bakteriji ''Escherichia coli'' pod endogenimi, nativnimi fermentacijskimi regulatornimi elementi (FRE). FRE vsebujejo promotor, vezavno mesto za ribosom in vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Uporabili so FRE''ackA'', FRE''adhE'', FRE''frd'' in FRE''ldhA''.

Najprej so pripravili sev ''E. coli'' z delecijami genov za nativno pot fermentacije. Sev je imel delecije genov za laktat dehidrogenazo (Δ''ldhA''), fumarat reduktazo (Δ''frdBC''), alkohol dehidrogenazo (Δ''adhE'') in fosfotransacetilazo (Δ''pta''). Posledica teh delecij je bil onemogočen metabolizem do sukcinata, laktata, etanola ter acetata.

Pripravili so tri različne plazmide, na katerih je bilo razporejenih 6 genov. Prvi plazmid je vseboval gene ''atoB'' (acetil-CoA acetiltransferaza), ''adhE2'' (aldehid-alkohol dehidrogenaza), ''crt'' (3-hidroksibutiril-CoA dehidrataza), ''hbd'' (hidroksimaslena dehidrogenaza), drugi plazmid gen ''fdh'' (format dehidrogenaza), tretji pa gen ''ter'' (trans-enoil-CoA reduktaza). Z vnosom teh genov so omogočili biosintezno pot do 1-butanola. V vsakega od teh treh plazmidov so klonirali po 4 različne FRE in tako pridobili 64 različnih kombinacij. S temi plazmidi so transformirali prej pripravljeni sev ''E. coli''.

Pripravljene bakterije so rastle v bogatem gojišču z glukozo, triptonom in kvasnim ekstraktom aerobno do stacionarne faze, temu pa je sledil preklop v anaerobno atmosfero, saj ta inducira sintezo 1-butanola. Sev s plazmidi, ki so vsebovali FRE''adhE''::''fdh'', FRE''ackA''::''atoB-adhE2-crt-hbd'' in FRE''adhE''::''ter'', je proizvajal najvišji titer 1-butanola, in sicer 3 g/L.

Ugotovili so, da je za sintezo 1-butanola v višjih koncentracijah v največji meri odgovorna aktivnost Fdh. Ta encim je odgovoren za redoks stanje v celici, saj pri svojem delovanju generira NADH. Da lahko glikoliza normalno poteka, se mora NADH oksidirati do NAD+. Presežek NADH v sevu ''E. coli'' z deletiranimi geni za nativno pot fermentacije poganja pot sinteze 1-butanola. Poskusili so, kako različni FRE vplivajo na izražanje ''fdh'', in ugotovili, da ima Fdh največjo aktivnost, ko se izraža pod kontrolo FRE''adhE''.
== Analiza različnih vplivov na sintezo 1-butanola ==
Testirali so vpliv različnih koncentracij kisika v atmosferi na sintezo 1-butanola. Uporabili so sev z najboljšo kombinacijo plazmidov, ga gojili v različnih okoljih in ugotovili, da za začetek sinteze ni potrebna popolna odsotnost kisika, ampak se ta prične že v mikro-aerobnem okolju.

Ugotovili so tudi, da imajo na sintezo 1-butanola velik vpliv sestavine medija. Merili so titer 1-butanola v TB-mediju, v M9-mediju in v M9-mediju z dodanim ekstraktom kvasovk. Zaznali so padec titra 1-butanola v obeh M9-medijih, torej so kompleksna hranila za zadovoljivo sintezo 1-butanola nujno potrebna.

Pomemben je tudi čas prehoda v anaerobno atmosfero. Testirali so prehod v različnih fazah rasti celic in ugotovili, da prehod v anaerobno atmosfero v lag, eksponentni ali zgodnji stacionarni fazi povzroči podobo količino sintetiziranega 1-butanola, medtem ko je posledica prehoda v anaerobno atmosfero v pozni stacionarni fazi nizek titer 1-butanola. Do tega pride zaradi zmanjšanega izražanja proteinov pri veliki celični gostoti.

Poskusili so tudi, kako poteka sinteza 1-butanola v odsotnosti induktorja in antibiotikov v gojišču. Ugotovili so, da ti niso nujno potrebni za uspešno proizvodnjo 1-butanola, saj je bil titer v tem primeru 10 g/L v 24 h, izkoristek pa 0,25 g/g glukoze.

== Zaključek ==
V tej študiji so raziskovalci uspešno skonstruirali sistem samoregulirane proizvodnje 1-butanola v bakteriji ''E. coli''. Za industrijsko uporabo pa bi bilo potrebo sistem še optimizirati in izboljšati sintezo 1-butanola v minimalnem mediju.
== Vir ==
Wen RC, Shen CR. Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control. Biotechnol Biofuels. 2016;9(1):267.

Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v bakteriji Escherichia coli, ki temelji na endogeni kontroli fermentacije

2017-05-29T18:20:35Z

Barbara Lipovšek: /* Analiza različnih vplivov na sintezo 1-butanola */

== Butanol ==
Butanol je možni nadomestek tekočih goriv, saj se lahko kot 85-odstotni delež goriva uporabi pri večini bencinskih motorjev z notranjim zgorevanjem brez dodatnih predelav motorja. Nastaja pri fermentaciji biomase v organizmu ''Clostridium acetobutylicum''. Prednosti butanola sta visoka oktanska in visoka energijska vrednost.
== Priprava ''E. coli'' za sintezo 1-butanola ==
V študiji so konstruirali sistem za sintezo 1-butanola v bakteriji ''Escherichia coli'' pod endogenimi, nativnimi fermentacijskimi regulatornimi elementi (FRE). FRE vsebujejo promotor, vezavno mesto za ribosom in vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Uporabili so FRE''ackA'', FRE''adhE'', FRE''frd'' in FRE''ldhA''.

Najprej so pripravili sev ''E. coli'' z delecijami genov za nativno pot fermentacije. Sev je imel delecije genov za laktat dehidrogenazo (Δ''ldhA''), fumarat reduktazo (Δ''frdBC''), alkohol dehidrogenazo (Δ''adhE'') in fosfotransacetilazo (Δ''pta''). Posledica teh delecij je bil onemogočen metabolizem do sukcinata, laktata, etanola ter acetata.

Pripravili so tri različne plazmide, na katerih je bilo razporejenih 6 genov. Prvi plazmid je vseboval gene ''atoB'' (acetil-CoA acetiltransferaza), ''adhE2'' (aldehid-alkohol dehidrogenaza), ''crt'' (3-hidroksibutiril-CoA dehidrataza), ''hbd'' (hidroksimaslena dehidrogenaza), drugi plazmid gen ''fdh'' (format dehidrogenaza), tretji pa gen ''ter'' (trans-enoil-CoA reduktaza). Z vnosom teh genov so omogočili biosintezno pot do 1-butanola. V vsakega od teh treh plazmidov so klonirali po 4 različne FRE in tako pridobili 64 različnih kombinacij. S temi plazmidi so transformirali prej pripravljeni sev ''E. coli''.

Pripravljene bakterije so rastle v bogatem gojišču z glukozo, triptonom in kvasnim ekstraktom aerobno do stacionarne faze, temu pa je sledil preklop v anaerobno atmosfero, saj ta inducira sintezo 1-butanola. Sev s plazmidi, ki so vsebovali FRE''adhE''::''fdh'', FRE''ackA''::''atoB-adhE2-crt-hbd'' in FRE''adhE''::''ter'', je proizvajal najvišji titer 1-butanola, in sicer 3 g/L.

Ugotovili so, da je za sintezo 1-butanola v višjih koncentracijah v največji meri odgovorna aktivnost Fdh. Ta encim je odgovoren za redoks stanje v celici, saj pri svojem delovanju generira NADH. Da lahko glikoliza normalno poteka, se mora NADH oksidirati do NAD+. Presežek NADH v sevu ''E. coli'' z deletiranimi geni za nativno pot fermentacije poganja pot sinteze 1-butanola. Poskusili so, kako različni FRE vplivajo na izražanje ''fdh'', in ugotovili, da ima Fdh največjo aktivnost, ko se izraža pod kontrolo FRE''adhE''.
== Analiza različnih vplivov na sintezo 1-butanola ==
Testirali so vpliv različnih koncentracij kisika v atmosferi na sintezo 1-butanola. Uporabili so sev z najboljšo kombinacijo plazmidov, ga gojili v različnih okoljih in ugotovili, da za začetek sinteze ni potrebna popolna odsotnost kisika, ampak se ta prične že v mikro-aerobnem okolju.

Ugotovili so tudi, da imajo na sintezo 1-butanola velik vpliv sestavine medija. Merili so titer 1-butanola v TB mediju, v M9 mediju in v M9 mediju z dodanim ekstraktom kvasovk. Zaznali so padec titra 1-butanola v obeh M9 medijih, torej so kompleksna hranila za zadovoljivo sintezo 1-butanola nujno potrebna.

Pomemben je tudi čas prehoda v anaerobno atmosfero. Testirali so prehod v različnih fazah rasti celic in ugotovili, da prehod v anaerobno atmosfero v lag, eksponentni ali zgodnji stacionarni fazi povzroči podobo količino sintetiziranega 1-butanola, medtem ko je posledica prehoda v anaerobno atmosfero v pozni stacionarni fazi nizek titer 1-butanola. Do tega pride zaradi zmanjšanega izražanja proteinov pri veliki celični gostoti.

Poskusili so tudi, kako poteka sinteza 1-butanola v odsotnosti induktorja in antibiotikov v gojišču. Ugotovili so, da ti niso nujno potrebni za uspešno proizvodnjo 1-butanola, saj je bil titer v tem primeru 10 g/L v 24 h, izkoristek pa 0,25 g/g glukoze.

== Zaključek ==
V tej študiji so raziskovalci uspešno skonstruirali sistem samoregulirane proizvodnje 1-butanola v bakteriji ''E. coli''. Za industrijsko uporabo pa bi bilo potrebo sistem še optimizirati in izboljšati sintezo 1-butanola v minimalnem mediju.
== Vir ==
Wen RC, Shen CR. Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control. Biotechnol Biofuels. 2016;9(1):267.

Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v bakteriji Escherichia coli, ki temelji na endogeni kontroli fermentacije

2017-05-29T18:19:54Z

Barbara Lipovšek:

== Butanol ==
Butanol je možni nadomestek tekočih goriv, saj se lahko kot 85-odstotni delež goriva uporabi pri večini bencinskih motorjev z notranjim zgorevanjem brez dodatnih predelav motorja. Nastaja pri fermentaciji biomase v organizmu ''Clostridium acetobutylicum''. Prednosti butanola sta visoka oktanska in visoka energijska vrednost.
== Priprava ''E. coli'' za sintezo 1-butanola ==
V študiji so konstruirali sistem za sintezo 1-butanola v bakteriji ''Escherichia coli'' pod endogenimi, nativnimi fermentacijskimi regulatornimi elementi (FRE). FRE vsebujejo promotor, vezavno mesto za ribosom in vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Uporabili so FRE''ackA'', FRE''adhE'', FRE''frd'' in FRE''ldhA''.

Najprej so pripravili sev ''E. coli'' z delecijami genov za nativno pot fermentacije. Sev je imel delecije genov za laktat dehidrogenazo (Δ''ldhA''), fumarat reduktazo (Δ''frdBC''), alkohol dehidrogenazo (Δ''adhE'') in fosfotransacetilazo (Δ''pta''). Posledica teh delecij je bil onemogočen metabolizem do sukcinata, laktata, etanola ter acetata.

Pripravili so tri različne plazmide, na katerih je bilo razporejenih 6 genov. Prvi plazmid je vseboval gene ''atoB'' (acetil-CoA acetiltransferaza), ''adhE2'' (aldehid-alkohol dehidrogenaza), ''crt'' (3-hidroksibutiril-CoA dehidrataza), ''hbd'' (hidroksimaslena dehidrogenaza), drugi plazmid gen ''fdh'' (format dehidrogenaza), tretji pa gen ''ter'' (trans-enoil-CoA reduktaza). Z vnosom teh genov so omogočili biosintezno pot do 1-butanola. V vsakega od teh treh plazmidov so klonirali po 4 različne FRE in tako pridobili 64 različnih kombinacij. S temi plazmidi so transformirali prej pripravljeni sev ''E. coli''.

Pripravljene bakterije so rastle v bogatem gojišču z glukozo, triptonom in kvasnim ekstraktom aerobno do stacionarne faze, temu pa je sledil preklop v anaerobno atmosfero, saj ta inducira sintezo 1-butanola. Sev s plazmidi, ki so vsebovali FRE''adhE''::''fdh'', FRE''ackA''::''atoB-adhE2-crt-hbd'' in FRE''adhE''::''ter'', je proizvajal najvišji titer 1-butanola, in sicer 3 g/L.

Ugotovili so, da je za sintezo 1-butanola v višjih koncentracijah v največji meri odgovorna aktivnost Fdh. Ta encim je odgovoren za redoks stanje v celici, saj pri svojem delovanju generira NADH. Da lahko glikoliza normalno poteka, se mora NADH oksidirati do NAD+. Presežek NADH v sevu ''E. coli'' z deletiranimi geni za nativno pot fermentacije poganja pot sinteze 1-butanola. Poskusili so, kako različni FRE vplivajo na izražanje ''fdh'', in ugotovili, da ima Fdh največjo aktivnost, ko se izraža pod kontrolo FRE''adhE''.
== Analiza različnih vplivov na sintezo 1-butanola ==
Testirali so vpliv različnih koncentracij kisika v atmosferi na sintezo 1-butanola. Uporabili so sev z najboljšo kombinacijo plazmidov, ga gojili v različnih okoljih in ugotovili, da za začetek sinteze ni potreba popolna odsotnost kisika, ampak se ta prične že v mikro-aerobnem okolju.

Ugotovili so tudi, da imajo na sintezo 1-butanola velik vpliv sestavine medija. Merili so titer 1-butanola v TB mediju, v M9 mediju in v M9 mediju z dodanim ekstraktom kvasovk. Zaznali so padec titra 1-butanola v obeh M9 medijih, torej so kompleksna hranila za zadovoljivo sintezo 1-butanola nujno potrebna.

Pomemben je tudi čas prehoda v anaerobno atmosfero. Testirali so prehod v različnih fazah rasti celic in ugotovili, da prehod v anaerobno atmosfero v lag, eksponentni ali zgodnji stacionarni fazi povzroči podobo količino sintetiziranega 1-butanola, medtem ko je posledica prehoda v anaerobno atmosfero v pozni stacionarni fazi nizek titer 1-butanola. Do tega pride zaradi zmanjšanega izražanja proteinov pri veliki celični gostoti.

Poskusili so tudi, kako poteka sinteza 1-butanola v odsotnosti induktorja in antibiotikov v gojišču. Ugotovili so, da ti niso nujno potrebni za uspešno proizvodnjo 1-butanola, saj je bil titer v tem primeru 10 g/L v 24 h, izkoristek pa 0,25 g/g glukoze.

== Zaključek ==
V tej študiji so raziskovalci uspešno skonstruirali sistem samoregulirane proizvodnje 1-butanola v bakteriji ''E. coli''. Za industrijsko uporabo pa bi bilo potrebo sistem še optimizirati in izboljšati sintezo 1-butanola v minimalnem mediju.
== Vir ==
Wen RC, Shen CR. Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control. Biotechnol Biofuels. 2016;9(1):267.