Wiki FKKT - User contributions [en]

TheraPUFA: nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem

2021-04-12T09:52:51Z

Barbara Slapnik: /* Citokinski senzor */

Therapufa [1] je iGEM-projekt iz leta 2020, ki je bil nagrajen s prvim mestom za najboljši terapevtski projekt. Avtorji projekta so študenti univerze William & Mary v Williamsburgu, Virginia.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary

Avtorica povzetka: Barbara Slapnik

=='''Uvod – Kaj je TheraPUFA?'''==

TheraPUFA je nazalni probiotik, ki omogoča sintezo polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA), s katerimi uravnava vnetje in deluje protivirusno.
Ideja projekta je posledica pandemije koronavirusa SARS-CoV-2, ki je pripomogla k hitrem razvoju cepiv, diagnostičnih orodij in zdravil, ki vključujejo protivirusne učinkovine.

=='''Polinenasičene maščobne kisline (PUFA)'''==

Polinenasičene maščobne kisline (PUFA) lahko delujejo kot endogene antibakterijske, antivirusne in antiparazitske spojine, poleg tega pa lahko preko svojih metabolitov regulirajo tudi procese vnetja. Inaktivirajo lahko viruse z lipidno ovojnico (npr. herpes, influenza, SARS-CoV-2), tako da povzročijo lizo celic oziroma puščanje membrane, inhibirajo proliferacijo različnih mikroorganizmov, preprečujejo preureditev lipidnega dvosloja in vplivajo na interakcijo med virusom in receptorjem [2]–[7]. Med PUFA uvrščamo arahidonsko kislino (AA) in dokozaheksaenojsko kislino (DHA), ki so jih uporabili pri načrtovanju nazalnega probiotika. AA lahko povzroči lizo lipidnih ovojnic virusa, njeni metaboliti pa učinkujejo provnetno in protivnetno. Obe uporabljeni PUFA pa zavirata replikacijo +RNA virusov, saj spremenita lipidno sestavo in tako virusom onemogočita preureditev membran in njihovo razmnoževanje. Za metabolite DHA so značilni le protivnetni učinki.

=='''Izbira bakterij'''==

Za izbiro probiotične šasije so iskali vrsto bakterij, ki bi izpolnjevala tri pogoje:

• bakterija mora biti naravno del nosno-žrelnega mikrobioma,

• ne sme povzročati bolezni ali povečati tveganje za razvoj bolezni v zdravih posameznikih,

• bakterija je že bila uporabljena kot nazalni probiotik.

Pri projektu so se odločili za bakterijo ''Neisseria cinerea'', gram negativno bakterijo, ki jo najdemo v nazalni in oralni mikrobioti zdravih odraslih in otrok. ''N. cinerea'' je komenzalna bakterija, ki preprečuje rast patogenih bakterij, uvrščamo jo v 1. biološki varnostni razred, ne povzroča bolezni in ni znano, da bi sodelovala pri bolezni. Pri izbiri bakterije so morali upoštevati še kompatibilnost s predhodno izbranim citokinskim senzorjem, ki se uspešno izraža v gram negativnih bakterijah. Bakterije so razdelili v dve skupini in pripravili dve različni vezji. V prvo skupino bakterij so vstavili vezje, ki je omogočilo proizvodnjo AA, medtem ko je bila druga skupina bakterija prilagojena na proizvodnjo DHA. Uravnavanje sinteze ustrezne PUFA je zagotavljal citokinski senzor, ki se je odzval na vnetje v telesu. Obe skupini bakterij sta vsebovali še dve varnostni stikali, ki sta zagotovili varnost probiotika.

=='''Načrtovanje vezja'''==

Prva skupina bakterij je bila odgovorna za sintezo AA, njeno vezje je bilo sestavljeno iz promotor pspA, s katerim je bila pogojena sinteza represorja cI. Represor cI je s svojo vezavo na operator promotorja pLac inhibiral izražanje fosfolipaze cPLA2, ki je sodelovala pri transportu sintetizirane PUFA. AA sintaza je bila zapisana pod konstitutivnim Andersonovim promotorjem J23. V drugi skupini bakterij, je bilo vezje podobno, vendar sinteza ni bila uravnana s represorjem cI.

==''' Moduli, ki sestavljajo TheraPUFA'''==

=== Citokinski senzor ===

Pri projektu so želeli oblikovati senzor za zaznavanje IFN-γ in TNF-α, ki bi reguliral sintezo AA in DHA. V ta namen, so uporabili sintetični citokinski senzor, ki sta ga predhodno razvila raziskovalca Aurand in March [8]. Osnova tega senzorja je zunanji membranski porin A (OmpA) iz ''E. coli'', ki so mu zamenjali dve zunajcelični zanki z zunajceličnima zankama proteina OrpF. Z zamenjavo zank so omogočili zaznavanje IFN-γ in TNF-α.
Pri nizkih koncentracijah IFN-γ in TNF-α senzor ni aktiven. Transkripcijski faktor PspF, ki omogoči proizvodnjo DHA, je inhibiran. DHA se ne izloča v zunajcelični prostor.
Ko so v okolici bakterije prisotne zadostne koncentracije IFN-γ in TNF-α, se citokinski senzor aktivira, signal se preko OmpA proteina prenese do membranskih proteinov PspB, PspC in PspA, kar povzroči spremembe interakcij med proteini in inhibicija transkripcijskega faktorja PspF je prekinjena. Aktiven transkripcijski faktor PspF se lahko veže na operatorsko regijo PspA promotorja in inducira proizvodnjo DHA. V prvi skupini bakterij, ki so odgovorne za sintezo AA, transkripcijski faktor PspF aktivira izražanje represorja in transport AA je onemogočen. Ker le visoke koncentracije citokinov aktivirajo citokinski senzor, pride do preklopa med izločanjem AA in DHA le v primeru prekomernega imunskega odziva.

=== Sinteza polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA) ===

Za sintezo AA so uporabili zapis za PUFA sintazo iz ''Aureispira marina'', ki omogoča de novo sintezo AA. Za sintezo DHA pa so uporabili zapis za PUFA sintazo iz ''Scizochytrium'', ki omogoča de novo sintezo DHA.

=== Transport polinenasičenih maščobnih kislin ===

Pri oblikovanju sistema za transport PUFA so pri projektu izhajali iz gram negativne bakterije ''Rhodobacter sphaeroides'', ki lahko izloča dolge maščobne kisline v zunajcelični prostor. Sistem temelji na fosfolipazi, ki se nahaja v periplazmi in sprošča maščobne kisline iz fosfolipidov notranje membrane. Maščobne kisline se nato izločijo v zunajcelični prostor, po neznanem mehanizmu, ki ni odvisen od proteina Tol-C. Sistem za transport PUFA so prilagodili, tako da so izbrali acil-sintetazo in fosfolipazo, z večjo preferenco do PUFA. Izbrana acil-sintetaza omogoči, aktivacijo PUFA in sintezo fosfolipidov. Fosfolipaza je pomembna za sproščanje PUFA iz fosfolipidnega dvosloja v periplazmo.
Prvi korak pri proizvodnji in transportu AA je sinteza PUFA in vgradnja v notranjo celično membrano. Ker je vgradnja AA v fosfolipide značilna že v wt celicah, jim sistema ni bilo potrebno bistveno prilagajati. V drugem koraku je pomembna cPLA2, ki se s pomočjo CycA lokalizacijskega signala izloča v periplazmo in omogoči sproščanje AA iz notranje membrane v periplazemski prostor. V tretjem koraku gre za prehod AA iz periplazemskega v zunajcelični prostor. Ker je bakterijska membrana neprepustna za maščobne kisline in pasivna difuzija ni možna, so pri projektu predpostavili olajšan transport PUFA preko proteinskega transporterja. FadL je transporter dolgih maščobnih kislin, ki prenaša maščobne kisline v periplazmo. Predvidevali so, da mora obstajati protein podoben proteinu FadL, ki bi omogočil olajšan transport PUFA iz periplazme v zunajcelični prostor.
DHA se za razliko od AA v nativnih celicah akumulira v citoplazmi v obliki prostih maščobnih kislin. Za sintezo DHA so pri projektu uporabili PUFA sintazo iz ''Schizochytrium''. Poleg tega so dodali še zapis za fosfopantetinil transferazo iz ''Nostoc'' cianobakterij, ki postranslacijsko modificira DHA sintazo in je nujna za sintezo DHA [9]. Za vgradnjo DHA v membrano, se mora DHA še aktivirati z dodatkom CoA. Za aktivacijo so v bakterije vnesli zapis za acil-CoA sintetazo lacsA iz ''Thalassiosira pseudonana'', ki omogoči prenos CoA iz acetil-CoA na DHA. Aktivirana DHA se nato s pomočjo encimov vgradi v notranjo membrano. Za sproščanje DHA iz notranje membrane v periplazmo so uporabili človeško fosfolipazo iPLA2, ki so ji dodali CycA lokalizacijski signal za prehod v periplazmo. Transport DHA v zunajcelični prostor pa naj bi potekal na enak način kot transport AA.

=== Varnostni modul z dvema stikaloma ===

Prvo stikalo zagotavlja varnost probiotika v človeškem telesu. Z vklopom stikala pride do eliminacije probiotika iz organizma. Za stikalo so konstruirali aspirin-inducibilni ekspresijski sistem. Uporabili so promotor PsaI, ki zapisuje za zeta toksin in je odvisen od transkripcijskega faktorja SalR. Transkripcijski faktor SalR je zapisan pod konstitutivnem promotorjem PopaB in lahko obstaja v dveh oblikah: SalRr in SalRa. V obliki SalRr deluje kot represor, medtem ko v obliki SalRa s svojo vezavo aktivira transkripcijo toksina. SalR bo v odsotnosti aspirina deloval kot represor, ki bo zaviral izražanje zeta toksina. Ob dodatku aspirina bo SalR začel delovati kot aktivator in izražati se bo začel zeta toksin, ki bo inhibiral sintezo petidoglikanov in prišlo bo do lize celic.
Drugo stikalo preprečuje, da bi bakterije iz TheraPUFA preživele v okolju (zunaj gostitelja), saj prepreči replikacijo bakterij pri temperaturi nižji od 37 °C. Stikalo je uravnano s FitAB toksin-antitoksin sistemom, ki so ga združili z RNA termometrom CssA. CssA je RNA termometer, ki pri temperaturi nižji od 37 °C oblikuje lasnično zanko in blokira vezavo ribosoma na RBS. Toksin FitB in antitoksin FitA sta zapisana pod nativnim promotorjem. Pred zapis za antitoksin FitA so dodali še CssA, ki uravnava izražanje antitoksina. Pri temperaturi 37 °C se bosta izražala tako toksin FitB, kot antitoksin FitA, zato bo delovanje toksina inhibirano. Pri temperaturi nižji od 37 °C, pa bo izražanje antitoksina FitA ustavljeno zaradi tvorbe lasnične zanke CssA in toksin FitB bo aktiven.

=='''Optimizacija prvotnega modela'''==

Da bi lahko TheraPUFA uporabljali kot protivirusno učinkovino, bi morali model še prilagoditi:

• S pomočjo mestnospecifične mutageneze bi morali povečati občutljivost sintetičnega citokinskega receptorja.

• Povečati bi morali sintezo PUFA.

• Z uporabo posebnih gelov, ki se uporabljajo pri vnosu probiotika bi morali povečati obstojnost vnesenih bakterij v nosni votlini.

=='''Zaključek'''==

Predstavljen projekt TheraPUFA je delo študentov univerze William & Mary, ki so ga pripravili za tekmovanje iGEM 2020. Zaradi pandemije koronavirusa SARS-CoV-2 študentje niso imeli dostopa do laboratorija, zato so pripravili idejno zasnovo za nazalni probiotik, pri katerem bi v bakterije ''Neisseria cinerea'' vstavili vezje za sintezo PUFA in tako omogočili protivirusno delovanje in uravnavanje pretiranega imunskega odziva, ki je tudi posledica SARS-CoV-2. Idejno zasnovo so nato preverili z matematičnimi parametri, pridobljenimi iz literature. Model je nakazoval, da TheraPUFA ne bi bilo možno uporabljati kot protivirusno učinkovino, kljub temu so naknadno model optimizirali in tako oblikovali nazalni probiotik, ki bi prispeval k zmanjšanju virusne obremenitve.

=='''Viri in literatura'''==

[1] “Team:William and Mary - 2020.igem.org.” [Online]. Available: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary. [Accessed: 07-Apr-2021].

[2] C. Müller, M. Hardt, D. Schwudke, B. W. Neuman, S. Pleschka, and J. Ziebuhr, “Inhibition of cytosolic phospholipase A2α impairs an early step of coronavirus replication in cell culture,” J. Virol., vol. 92, no. 4, p. JVI.01463-17, Nov. 2017.

[3] A. Goc, “Polyunsaturated ω-3 fatty acids inhibit ACE2-controlled SARS-CoV-2 binding and cellular entry.”

[4] U. N. Das, “Can Bioactive Lipids Inactivate Coronavirus (COVID-19)?,” Arch. Med. Res., vol. 51, no. 3, pp. 282–286, Apr. 2020.

[5] U. N. Das, “Response to: Bioactive Lipids and Coronavirus (COVID-19)-further Discussion,” Archives of Medical Research, vol. 51, no. 5. Elsevier Inc., pp. 445–449, 01-Jul-2020.

[6] A. Kohn, J. Gitelman, and M. Inbar, “Unsaturated free fatty acids inactivate animal enveloped viruses,” Arch. Virol., vol. 66, no. 4, pp. 301–307, Dec. 1980.

[7] U. N. Das, “Arachidonic acid and other unsaturated fatty acids and some of their metabolites function as endogenous antimicrobial molecules: A review,” Journal of Advanced Research, vol. 11. Elsevier B.V., pp. 57–66, 01-May-2018.

[8] T. C. Aurand and J. C. March, “Development of a synthetic receptor protein for sensing inflammatory mediators interferon-γ and tumor necrosis factor-α,” Biotechnol. Bioeng., vol. 113, no. 3, pp. 492–500, Mar. 2016.

[9] J. Beld, E. C. Sonnenschein, C. R. Vickery, J. P. Noel, and M. D. Burkart, “The phosphopantetheinyl transferases: Catalysis of a post-translational modification crucial for life,” Nat. Prod. Rep., vol. 31, no. 1, pp. 61–108, Jan. 2014.

TheraPUFA: nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem

2021-04-11T19:18:08Z

Barbara Slapnik: /* Izbira bakterij */

Therapufa [1] je iGEM-projekt iz leta 2020, ki je bil nagrajen s prvim mestom za najboljši terapevtski projekt. Avtorji projekta so študenti univerze William & Mary v Williamsburgu, Virginia.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary

Avtorica povzetka: Barbara Slapnik

=='''Uvod – Kaj je TheraPUFA?'''==

TheraPUFA je nazalni probiotik, ki omogoča sintezo polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA), s katerimi uravnava vnetje in deluje protivirusno.
Ideja projekta je posledica pandemije koronavirusa SARS-CoV-2, ki je pripomogla k hitrem razvoju cepiv, diagnostičnih orodij in zdravil, ki vključujejo protivirusne učinkovine.

=='''Polinenasičene maščobne kisline (PUFA)'''==

Polinenasičene maščobne kisline (PUFA) lahko delujejo kot endogene antibakterijske, antivirusne in antiparazitske spojine, poleg tega pa lahko preko svojih metabolitov regulirajo tudi procese vnetja. Inaktivirajo lahko viruse z lipidno ovojnico (npr. herpes, influenza, SARS-CoV-2), tako da povzročijo lizo celic oziroma puščanje membrane, inhibirajo proliferacijo različnih mikroorganizmov, preprečujejo preureditev lipidnega dvosloja in vplivajo na interakcijo med virusom in receptorjem [2]–[7]. Med PUFA uvrščamo arahidonsko kislino (AA) in dokozaheksaenojsko kislino (DHA), ki so jih uporabili pri načrtovanju nazalnega probiotika. AA lahko povzroči lizo lipidnih ovojnic virusa, njeni metaboliti pa učinkujejo provnetno in protivnetno. Obe uporabljeni PUFA pa zavirata replikacijo +RNA virusov, saj spremenita lipidno sestavo in tako virusom onemogočita preureditev membran in njihovo razmnoževanje. Za metabolite DHA so značilni le protivnetni učinki.

=='''Izbira bakterij'''==

Za izbiro probiotične šasije so iskali vrsto bakterij, ki bi izpolnjevala tri pogoje:

• bakterija mora biti naravno del nosno-žrelnega mikrobioma,

• ne sme povzročati bolezni ali povečati tveganje za razvoj bolezni v zdravih posameznikih,

• bakterija je že bila uporabljena kot nazalni probiotik.

Pri projektu so se odločili za bakterijo ''Neisseria cinerea'', gram negativno bakterijo, ki jo najdemo v nazalni in oralni mikrobioti zdravih odraslih in otrok. ''N. cinerea'' je komenzalna bakterija, ki preprečuje rast patogenih bakterij, uvrščamo jo v 1. biološki varnostni razred, ne povzroča bolezni in ni znano, da bi sodelovala pri bolezni. Pri izbiri bakterije so morali upoštevati še kompatibilnost s predhodno izbranim citokinskim senzorjem, ki se uspešno izraža v gram negativnih bakterijah. Bakterije so razdelili v dve skupini in pripravili dve različni vezji. V prvo skupino bakterij so vstavili vezje, ki je omogočilo proizvodnjo AA, medtem ko je bila druga skupina bakterija prilagojena na proizvodnjo DHA. Uravnavanje sinteze ustrezne PUFA je zagotavljal citokinski senzor, ki se je odzval na vnetje v telesu. Obe skupini bakterij sta vsebovali še dve varnostni stikali, ki sta zagotovili varnost probiotika.

=='''Načrtovanje vezja'''==

Prva skupina bakterij je bila odgovorna za sintezo AA, njeno vezje je bilo sestavljeno iz promotor pspA, s katerim je bila pogojena sinteza represorja cI. Represor cI je s svojo vezavo na operator promotorja pLac inhibiral izražanje fosfolipaze cPLA2, ki je sodelovala pri transportu sintetizirane PUFA. AA sintaza je bila zapisana pod konstitutivnim Andersonovim promotorjem J23. V drugi skupini bakterij, je bilo vezje podobno, vendar sinteza ni bila uravnana s represorjem cI.

==''' Moduli, ki sestavljajo TheraPUFA'''==

=== Citokinski senzor ===

Pri projektu so želeli oblikovati senzor za zaznavanje IFN-γ in TNF-α, ki bi reguliral sintezo AA in DHA. V ta namen, so uporabili sintetični citokinski senzor, ki sta ga predhodno razvila raziskovalca Aurand in March [8]. Osnova tega senzorja je zunanji membranski porin A (OmpA) iz ''E. coli'', ki so mu zamenjali dve zunajcelični zanki z zunajceličnima zankama proteina OrpF. Z zamenjavo zank so omogočili zaznavanje IFN-γ in TNF-α.
Pri nizkih koncentracijah IFN-γ in TNF-α senzor ni aktiven. Transkripcijski faktor PspF, ki omogoči izražanje DHA sintaze, je inhibiran. Sinteza DHA ne poteka.
Ko so v okolici bakterije prisotne zadostne koncentracije IFN-γ in TNF-α, se citokinski senzor aktivira, signal se preko OmpA proteina prenese do membranskih proteinov PspB, PspC in PspA, kar povzroči spremembe interakcij med proteini in inhibicija transkripcijskega faktorja PspF je prekinjena. Aktiven transkripcijski faktor PspF se lahko veže na operatorsko regijo PspA promotorja in inducira izražanje DHA sintaze. V prvi skupini bakterij, ki so odgovorne za sintezo AA, transkripcijski faktor PspF aktivira izražanje represorja in transport AA je onemogočen. Ker le visoke koncentracije citokinov aktivirajo citokinski senzor, pride do preklopa med izločanjem AA in DHA le v primeru prekomernega imunskega odziva.

=== Sinteza polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA) ===

Za sintezo AA so uporabili zapis za PUFA sintazo iz ''Aureispira marina'', ki omogoča de novo sintezo AA. Za sintezo DHA pa so uporabili zapis za PUFA sintazo iz ''Scizochytrium'', ki omogoča de novo sintezo DHA.

=== Transport polinenasičenih maščobnih kislin ===

Pri oblikovanju sistema za transport PUFA so pri projektu izhajali iz gram negativne bakterije ''Rhodobacter sphaeroides'', ki lahko izloča dolge maščobne kisline v zunajcelični prostor. Sistem temelji na fosfolipazi, ki se nahaja v periplazmi in sprošča maščobne kisline iz fosfolipidov notranje membrane. Maščobne kisline se nato izločijo v zunajcelični prostor, po neznanem mehanizmu, ki ni odvisen od proteina Tol-C. Sistem za transport PUFA so prilagodili, tako da so izbrali acil-sintetazo in fosfolipazo, z večjo preferenco do PUFA. Izbrana acil-sintetaza omogoči, aktivacijo PUFA in sintezo fosfolipidov. Fosfolipaza je pomembna za sproščanje PUFA iz fosfolipidnega dvosloja v periplazmo.
Prvi korak pri proizvodnji in transportu AA je sinteza PUFA in vgradnja v notranjo celično membrano. Ker je vgradnja AA v fosfolipide značilna že v wt celicah, jim sistema ni bilo potrebno bistveno prilagajati. V drugem koraku je pomembna cPLA2, ki se s pomočjo CycA lokalizacijskega signala izloča v periplazmo in omogoči sproščanje AA iz notranje membrane v periplazemski prostor. V tretjem koraku gre za prehod AA iz periplazemskega v zunajcelični prostor. Ker je bakterijska membrana neprepustna za maščobne kisline in pasivna difuzija ni možna, so pri projektu predpostavili olajšan transport PUFA preko proteinskega transporterja. FadL je transporter dolgih maščobnih kislin, ki prenaša maščobne kisline v periplazmo. Predvidevali so, da mora obstajati protein podoben proteinu FadL, ki bi omogočil olajšan transport PUFA iz periplazme v zunajcelični prostor.
DHA se za razliko od AA v nativnih celicah akumulira v citoplazmi v obliki prostih maščobnih kislin. Za sintezo DHA so pri projektu uporabili PUFA sintazo iz ''Schizochytrium''. Poleg tega so dodali še zapis za fosfopantetinil transferazo iz ''Nostoc'' cianobakterij, ki postranslacijsko modificira DHA sintazo in je nujna za sintezo DHA [9]. Za vgradnjo DHA v membrano, se mora DHA še aktivirati z dodatkom CoA. Za aktivacijo so v bakterije vnesli zapis za acil-CoA sintetazo lacsA iz ''Thalassiosira pseudonana'', ki omogoči prenos CoA iz acetil-CoA na DHA. Aktivirana DHA se nato s pomočjo encimov vgradi v notranjo membrano. Za sproščanje DHA iz notranje membrane v periplazmo so uporabili človeško fosfolipazo iPLA2, ki so ji dodali CycA lokalizacijski signal za prehod v periplazmo. Transport DHA v zunajcelični prostor pa naj bi potekal na enak način kot transport AA.

=== Varnostni modul z dvema stikaloma ===

Prvo stikalo zagotavlja varnost probiotika v človeškem telesu. Z vklopom stikala pride do eliminacije probiotika iz organizma. Za stikalo so konstruirali aspirin-inducibilni ekspresijski sistem. Uporabili so promotor PsaI, ki zapisuje za zeta toksin in je odvisen od transkripcijskega faktorja SalR. Transkripcijski faktor SalR je zapisan pod konstitutivnem promotorjem PopaB in lahko obstaja v dveh oblikah: SalRr in SalRa. V obliki SalRr deluje kot represor, medtem ko v obliki SalRa s svojo vezavo aktivira transkripcijo toksina. SalR bo v odsotnosti aspirina deloval kot represor, ki bo zaviral izražanje zeta toksina. Ob dodatku aspirina bo SalR začel delovati kot aktivator in izražati se bo začel zeta toksin, ki bo inhibiral sintezo petidoglikanov in prišlo bo do lize celic.
Drugo stikalo preprečuje, da bi bakterije iz TheraPUFA preživele v okolju (zunaj gostitelja), saj prepreči replikacijo bakterij pri temperaturi nižji od 37 °C. Stikalo je uravnano s FitAB toksin-antitoksin sistemom, ki so ga združili z RNA termometrom CssA. CssA je RNA termometer, ki pri temperaturi nižji od 37 °C oblikuje lasnično zanko in blokira vezavo ribosoma na RBS. Toksin FitB in antitoksin FitA sta zapisana pod nativnim promotorjem. Pred zapis za antitoksin FitA so dodali še CssA, ki uravnava izražanje antitoksina. Pri temperaturi 37 °C se bosta izražala tako toksin FitB, kot antitoksin FitA, zato bo delovanje toksina inhibirano. Pri temperaturi nižji od 37 °C, pa bo izražanje antitoksina FitA ustavljeno zaradi tvorbe lasnične zanke CssA in toksin FitB bo aktiven.

=='''Optimizacija prvotnega modela'''==

Da bi lahko TheraPUFA uporabljali kot protivirusno učinkovino, bi morali model še prilagoditi:

• S pomočjo mestnospecifične mutageneze bi morali povečati občutljivost sintetičnega citokinskega receptorja.

• Povečati bi morali sintezo PUFA.

• Z uporabo posebnih gelov, ki se uporabljajo pri vnosu probiotika bi morali povečati obstojnost vnesenih bakterij v nosni votlini.

=='''Zaključek'''==

Predstavljen projekt TheraPUFA je delo študentov univerze William & Mary, ki so ga pripravili za tekmovanje iGEM 2020. Zaradi pandemije koronavirusa SARS-CoV-2 študentje niso imeli dostopa do laboratorija, zato so pripravili idejno zasnovo za nazalni probiotik, pri katerem bi v bakterije ''Neisseria cinerea'' vstavili vezje za sintezo PUFA in tako omogočili protivirusno delovanje in uravnavanje pretiranega imunskega odziva, ki je tudi posledica SARS-CoV-2. Idejno zasnovo so nato preverili z matematičnimi parametri, pridobljenimi iz literature. Model je nakazoval, da TheraPUFA ne bi bilo možno uporabljati kot protivirusno učinkovino, kljub temu so naknadno model optimizirali in tako oblikovali nazalni probiotik, ki bi prispeval k zmanjšanju virusne obremenitve.

=='''Viri in literatura'''==

[1] “Team:William and Mary - 2020.igem.org.” [Online]. Available: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary. [Accessed: 07-Apr-2021].

[2] C. Müller, M. Hardt, D. Schwudke, B. W. Neuman, S. Pleschka, and J. Ziebuhr, “Inhibition of cytosolic phospholipase A2α impairs an early step of coronavirus replication in cell culture,” J. Virol., vol. 92, no. 4, p. JVI.01463-17, Nov. 2017.

[3] A. Goc, “Polyunsaturated ω-3 fatty acids inhibit ACE2-controlled SARS-CoV-2 binding and cellular entry.”

[4] U. N. Das, “Can Bioactive Lipids Inactivate Coronavirus (COVID-19)?,” Arch. Med. Res., vol. 51, no. 3, pp. 282–286, Apr. 2020.

[5] U. N. Das, “Response to: Bioactive Lipids and Coronavirus (COVID-19)-further Discussion,” Archives of Medical Research, vol. 51, no. 5. Elsevier Inc., pp. 445–449, 01-Jul-2020.

[6] A. Kohn, J. Gitelman, and M. Inbar, “Unsaturated free fatty acids inactivate animal enveloped viruses,” Arch. Virol., vol. 66, no. 4, pp. 301–307, Dec. 1980.

[7] U. N. Das, “Arachidonic acid and other unsaturated fatty acids and some of their metabolites function as endogenous antimicrobial molecules: A review,” Journal of Advanced Research, vol. 11. Elsevier B.V., pp. 57–66, 01-May-2018.

[8] T. C. Aurand and J. C. March, “Development of a synthetic receptor protein for sensing inflammatory mediators interferon-γ and tumor necrosis factor-α,” Biotechnol. Bioeng., vol. 113, no. 3, pp. 492–500, Mar. 2016.

[9] J. Beld, E. C. Sonnenschein, C. R. Vickery, J. P. Noel, and M. D. Burkart, “The phosphopantetheinyl transferases: Catalysis of a post-translational modification crucial for life,” Nat. Prod. Rep., vol. 31, no. 1, pp. 61–108, Jan. 2014.

TheraPUFA: nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem

2021-04-11T19:17:09Z

Barbara Slapnik: /* Izbira bakterij */

Therapufa [1] je iGEM-projekt iz leta 2020, ki je bil nagrajen s prvim mestom za najboljši terapevtski projekt. Avtorji projekta so študenti univerze William & Mary v Williamsburgu, Virginia.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary

Avtorica povzetka: Barbara Slapnik

=='''Uvod – Kaj je TheraPUFA?'''==

TheraPUFA je nazalni probiotik, ki omogoča sintezo polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA), s katerimi uravnava vnetje in deluje protivirusno.
Ideja projekta je posledica pandemije koronavirusa SARS-CoV-2, ki je pripomogla k hitrem razvoju cepiv, diagnostičnih orodij in zdravil, ki vključujejo protivirusne učinkovine.

=='''Polinenasičene maščobne kisline (PUFA)'''==

Polinenasičene maščobne kisline (PUFA) lahko delujejo kot endogene antibakterijske, antivirusne in antiparazitske spojine, poleg tega pa lahko preko svojih metabolitov regulirajo tudi procese vnetja. Inaktivirajo lahko viruse z lipidno ovojnico (npr. herpes, influenza, SARS-CoV-2), tako da povzročijo lizo celic oziroma puščanje membrane, inhibirajo proliferacijo različnih mikroorganizmov, preprečujejo preureditev lipidnega dvosloja in vplivajo na interakcijo med virusom in receptorjem [2]–[7]. Med PUFA uvrščamo arahidonsko kislino (AA) in dokozaheksaenojsko kislino (DHA), ki so jih uporabili pri načrtovanju nazalnega probiotika. AA lahko povzroči lizo lipidnih ovojnic virusa, njeni metaboliti pa učinkujejo provnetno in protivnetno. Obe uporabljeni PUFA pa zavirata replikacijo +RNA virusov, saj spremenita lipidno sestavo in tako virusom onemogočita preureditev membran in njihovo razmnoževanje. Za metabolite DHA so značilni le protivnetni učinki.

=='''Izbira bakterij'''==

Za izbiro probiotične šasije so iskali vrsto bakterij, ki bi izpolnjevala tri pogoje:

• bakterija mora biti naravno del nosno-žrelnega mikrobioma,

• ne sme povzročati bolezni ali povečati tveganje za razvoj bolezni v zdravih posameznikih,

• bakterija je že bila uporabljena kot nazalni probiotik.

Pri projektu so se odločili za bakterijo ''Neisseria cinerea'', gram negativno bakterijo, ki in jo najdemo v nazalni in oralni mikrobioti zdravih odraslih in otrok. ''N. cinerea'' je komenzalna bakterija, ki preprečuje rast patogenih bakterij, uvrščamo jo v 1. biološki varnostni razred, ne povzroča bolezni in ni znano, da bi sodelovala pri bolezni. Pri izbiri bakterije so morali upoštevati še kompatibilnost s predhodno izbranim citokinskim senzorjem, ki se uspešno izraža v gram negativnih bakterijah. Bakterije so razdelili v dve skupini in pripravili dve različni vezji. V prvo skupino bakterij so vstavili vezje, ki je omogočilo proizvodnjo AA, medtem ko je bila druga skupina bakterija prilagojena na proizvodnjo DHA. Uravnavanje sinteze ustrezne PUFA je zagotavljal citokinski senzor, ki se je odzval na vnetje v telesu. Obe skupini bakterij sta vsebovali še dve varnostni stikali, ki sta zagotovili varnost probiotika.

=='''Načrtovanje vezja'''==

Prva skupina bakterij je bila odgovorna za sintezo AA, njeno vezje je bilo sestavljeno iz promotor pspA, s katerim je bila pogojena sinteza represorja cI. Represor cI je s svojo vezavo na operator promotorja pLac inhibiral izražanje fosfolipaze cPLA2, ki je sodelovala pri transportu sintetizirane PUFA. AA sintaza je bila zapisana pod konstitutivnim Andersonovim promotorjem J23. V drugi skupini bakterij, je bilo vezje podobno, vendar sinteza ni bila uravnana s represorjem cI.

==''' Moduli, ki sestavljajo TheraPUFA'''==

=== Citokinski senzor ===

Pri projektu so želeli oblikovati senzor za zaznavanje IFN-γ in TNF-α, ki bi reguliral sintezo AA in DHA. V ta namen, so uporabili sintetični citokinski senzor, ki sta ga predhodno razvila raziskovalca Aurand in March [8]. Osnova tega senzorja je zunanji membranski porin A (OmpA) iz ''E. coli'', ki so mu zamenjali dve zunajcelični zanki z zunajceličnima zankama proteina OrpF. Z zamenjavo zank so omogočili zaznavanje IFN-γ in TNF-α.
Pri nizkih koncentracijah IFN-γ in TNF-α senzor ni aktiven. Transkripcijski faktor PspF, ki omogoči izražanje DHA sintaze, je inhibiran. Sinteza DHA ne poteka.
Ko so v okolici bakterije prisotne zadostne koncentracije IFN-γ in TNF-α, se citokinski senzor aktivira, signal se preko OmpA proteina prenese do membranskih proteinov PspB, PspC in PspA, kar povzroči spremembe interakcij med proteini in inhibicija transkripcijskega faktorja PspF je prekinjena. Aktiven transkripcijski faktor PspF se lahko veže na operatorsko regijo PspA promotorja in inducira izražanje DHA sintaze. V prvi skupini bakterij, ki so odgovorne za sintezo AA, transkripcijski faktor PspF aktivira izražanje represorja in transport AA je onemogočen. Ker le visoke koncentracije citokinov aktivirajo citokinski senzor, pride do preklopa med izločanjem AA in DHA le v primeru prekomernega imunskega odziva.

=== Sinteza polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA) ===

Za sintezo AA so uporabili zapis za PUFA sintazo iz ''Aureispira marina'', ki omogoča de novo sintezo AA. Za sintezo DHA pa so uporabili zapis za PUFA sintazo iz ''Scizochytrium'', ki omogoča de novo sintezo DHA.

=== Transport polinenasičenih maščobnih kislin ===

Pri oblikovanju sistema za transport PUFA so pri projektu izhajali iz gram negativne bakterije ''Rhodobacter sphaeroides'', ki lahko izloča dolge maščobne kisline v zunajcelični prostor. Sistem temelji na fosfolipazi, ki se nahaja v periplazmi in sprošča maščobne kisline iz fosfolipidov notranje membrane. Maščobne kisline se nato izločijo v zunajcelični prostor, po neznanem mehanizmu, ki ni odvisen od proteina Tol-C. Sistem za transport PUFA so prilagodili, tako da so izbrali acil-sintetazo in fosfolipazo, z večjo preferenco do PUFA. Izbrana acil-sintetaza omogoči, aktivacijo PUFA in sintezo fosfolipidov. Fosfolipaza je pomembna za sproščanje PUFA iz fosfolipidnega dvosloja v periplazmo.
Prvi korak pri proizvodnji in transportu AA je sinteza PUFA in vgradnja v notranjo celično membrano. Ker je vgradnja AA v fosfolipide značilna že v wt celicah, jim sistema ni bilo potrebno bistveno prilagajati. V drugem koraku je pomembna cPLA2, ki se s pomočjo CycA lokalizacijskega signala izloča v periplazmo in omogoči sproščanje AA iz notranje membrane v periplazemski prostor. V tretjem koraku gre za prehod AA iz periplazemskega v zunajcelični prostor. Ker je bakterijska membrana neprepustna za maščobne kisline in pasivna difuzija ni možna, so pri projektu predpostavili olajšan transport PUFA preko proteinskega transporterja. FadL je transporter dolgih maščobnih kislin, ki prenaša maščobne kisline v periplazmo. Predvidevali so, da mora obstajati protein podoben proteinu FadL, ki bi omogočil olajšan transport PUFA iz periplazme v zunajcelični prostor.
DHA se za razliko od AA v nativnih celicah akumulira v citoplazmi v obliki prostih maščobnih kislin. Za sintezo DHA so pri projektu uporabili PUFA sintazo iz ''Schizochytrium''. Poleg tega so dodali še zapis za fosfopantetinil transferazo iz ''Nostoc'' cianobakterij, ki postranslacijsko modificira DHA sintazo in je nujna za sintezo DHA [9]. Za vgradnjo DHA v membrano, se mora DHA še aktivirati z dodatkom CoA. Za aktivacijo so v bakterije vnesli zapis za acil-CoA sintetazo lacsA iz ''Thalassiosira pseudonana'', ki omogoči prenos CoA iz acetil-CoA na DHA. Aktivirana DHA se nato s pomočjo encimov vgradi v notranjo membrano. Za sproščanje DHA iz notranje membrane v periplazmo so uporabili človeško fosfolipazo iPLA2, ki so ji dodali CycA lokalizacijski signal za prehod v periplazmo. Transport DHA v zunajcelični prostor pa naj bi potekal na enak način kot transport AA.

=== Varnostni modul z dvema stikaloma ===

Prvo stikalo zagotavlja varnost probiotika v človeškem telesu. Z vklopom stikala pride do eliminacije probiotika iz organizma. Za stikalo so konstruirali aspirin-inducibilni ekspresijski sistem. Uporabili so promotor PsaI, ki zapisuje za zeta toksin in je odvisen od transkripcijskega faktorja SalR. Transkripcijski faktor SalR je zapisan pod konstitutivnem promotorjem PopaB in lahko obstaja v dveh oblikah: SalRr in SalRa. V obliki SalRr deluje kot represor, medtem ko v obliki SalRa s svojo vezavo aktivira transkripcijo toksina. SalR bo v odsotnosti aspirina deloval kot represor, ki bo zaviral izražanje zeta toksina. Ob dodatku aspirina bo SalR začel delovati kot aktivator in izražati se bo začel zeta toksin, ki bo inhibiral sintezo petidoglikanov in prišlo bo do lize celic.
Drugo stikalo preprečuje, da bi bakterije iz TheraPUFA preživele v okolju (zunaj gostitelja), saj prepreči replikacijo bakterij pri temperaturi nižji od 37 °C. Stikalo je uravnano s FitAB toksin-antitoksin sistemom, ki so ga združili z RNA termometrom CssA. CssA je RNA termometer, ki pri temperaturi nižji od 37 °C oblikuje lasnično zanko in blokira vezavo ribosoma na RBS. Toksin FitB in antitoksin FitA sta zapisana pod nativnim promotorjem. Pred zapis za antitoksin FitA so dodali še CssA, ki uravnava izražanje antitoksina. Pri temperaturi 37 °C se bosta izražala tako toksin FitB, kot antitoksin FitA, zato bo delovanje toksina inhibirano. Pri temperaturi nižji od 37 °C, pa bo izražanje antitoksina FitA ustavljeno zaradi tvorbe lasnične zanke CssA in toksin FitB bo aktiven.

=='''Optimizacija prvotnega modela'''==

Da bi lahko TheraPUFA uporabljali kot protivirusno učinkovino, bi morali model še prilagoditi:

• S pomočjo mestnospecifične mutageneze bi morali povečati občutljivost sintetičnega citokinskega receptorja.

• Povečati bi morali sintezo PUFA.

• Z uporabo posebnih gelov, ki se uporabljajo pri vnosu probiotika bi morali povečati obstojnost vnesenih bakterij v nosni votlini.

=='''Zaključek'''==

Predstavljen projekt TheraPUFA je delo študentov univerze William & Mary, ki so ga pripravili za tekmovanje iGEM 2020. Zaradi pandemije koronavirusa SARS-CoV-2 študentje niso imeli dostopa do laboratorija, zato so pripravili idejno zasnovo za nazalni probiotik, pri katerem bi v bakterije ''Neisseria cinerea'' vstavili vezje za sintezo PUFA in tako omogočili protivirusno delovanje in uravnavanje pretiranega imunskega odziva, ki je tudi posledica SARS-CoV-2. Idejno zasnovo so nato preverili z matematičnimi parametri, pridobljenimi iz literature. Model je nakazoval, da TheraPUFA ne bi bilo možno uporabljati kot protivirusno učinkovino, kljub temu so naknadno model optimizirali in tako oblikovali nazalni probiotik, ki bi prispeval k zmanjšanju virusne obremenitve.

=='''Viri in literatura'''==

[1] “Team:William and Mary - 2020.igem.org.” [Online]. Available: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary. [Accessed: 07-Apr-2021].

[2] C. Müller, M. Hardt, D. Schwudke, B. W. Neuman, S. Pleschka, and J. Ziebuhr, “Inhibition of cytosolic phospholipase A2α impairs an early step of coronavirus replication in cell culture,” J. Virol., vol. 92, no. 4, p. JVI.01463-17, Nov. 2017.

[3] A. Goc, “Polyunsaturated ω-3 fatty acids inhibit ACE2-controlled SARS-CoV-2 binding and cellular entry.”

[4] U. N. Das, “Can Bioactive Lipids Inactivate Coronavirus (COVID-19)?,” Arch. Med. Res., vol. 51, no. 3, pp. 282–286, Apr. 2020.

[5] U. N. Das, “Response to: Bioactive Lipids and Coronavirus (COVID-19)-further Discussion,” Archives of Medical Research, vol. 51, no. 5. Elsevier Inc., pp. 445–449, 01-Jul-2020.

[6] A. Kohn, J. Gitelman, and M. Inbar, “Unsaturated free fatty acids inactivate animal enveloped viruses,” Arch. Virol., vol. 66, no. 4, pp. 301–307, Dec. 1980.

[7] U. N. Das, “Arachidonic acid and other unsaturated fatty acids and some of their metabolites function as endogenous antimicrobial molecules: A review,” Journal of Advanced Research, vol. 11. Elsevier B.V., pp. 57–66, 01-May-2018.

[8] T. C. Aurand and J. C. March, “Development of a synthetic receptor protein for sensing inflammatory mediators interferon-γ and tumor necrosis factor-α,” Biotechnol. Bioeng., vol. 113, no. 3, pp. 492–500, Mar. 2016.

[9] J. Beld, E. C. Sonnenschein, C. R. Vickery, J. P. Noel, and M. D. Burkart, “The phosphopantetheinyl transferases: Catalysis of a post-translational modification crucial for life,” Nat. Prod. Rep., vol. 31, no. 1, pp. 61–108, Jan. 2014.

TheraPUFA: nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem

2021-04-11T19:16:46Z

Barbara Slapnik: /* Optimizacija prvotnega modela */

Therapufa [1] je iGEM-projekt iz leta 2020, ki je bil nagrajen s prvim mestom za najboljši terapevtski projekt. Avtorji projekta so študenti univerze William & Mary v Williamsburgu, Virginia.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary

Avtorica povzetka: Barbara Slapnik

=='''Uvod – Kaj je TheraPUFA?'''==

TheraPUFA je nazalni probiotik, ki omogoča sintezo polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA), s katerimi uravnava vnetje in deluje protivirusno.
Ideja projekta je posledica pandemije koronavirusa SARS-CoV-2, ki je pripomogla k hitrem razvoju cepiv, diagnostičnih orodij in zdravil, ki vključujejo protivirusne učinkovine.

=='''Polinenasičene maščobne kisline (PUFA)'''==

Polinenasičene maščobne kisline (PUFA) lahko delujejo kot endogene antibakterijske, antivirusne in antiparazitske spojine, poleg tega pa lahko preko svojih metabolitov regulirajo tudi procese vnetja. Inaktivirajo lahko viruse z lipidno ovojnico (npr. herpes, influenza, SARS-CoV-2), tako da povzročijo lizo celic oziroma puščanje membrane, inhibirajo proliferacijo različnih mikroorganizmov, preprečujejo preureditev lipidnega dvosloja in vplivajo na interakcijo med virusom in receptorjem [2]–[7]. Med PUFA uvrščamo arahidonsko kislino (AA) in dokozaheksaenojsko kislino (DHA), ki so jih uporabili pri načrtovanju nazalnega probiotika. AA lahko povzroči lizo lipidnih ovojnic virusa, njeni metaboliti pa učinkujejo provnetno in protivnetno. Obe uporabljeni PUFA pa zavirata replikacijo +RNA virusov, saj spremenita lipidno sestavo in tako virusom onemogočita preureditev membran in njihovo razmnoževanje. Za metabolite DHA so značilni le protivnetni učinki.

=='''Izbira bakterij'''==

Za izbiro probiotične šasije so iskali vrsto bakterij, ki bi izpolnjevala tri pogoje:
• bakterija mora biti naravno del nosno-žrelnega mikrobioma,
• ne sme povzročati bolezni ali povečati tveganje za razvoj bolezni v zdravih posameznikih,
• bakterija je že bila uporabljena kot nazalni probiotik.
Pri projektu so se odločili za bakterijo ''Neisseria cinerea'', gram negativno bakterijo, ki in jo najdemo v nazalni in oralni mikrobioti zdravih odraslih in otrok. ''N. cinerea'' je komenzalna bakterija, ki preprečuje rast patogenih bakterij, uvrščamo jo v 1. biološki varnostni razred, ne povzroča bolezni in ni znano, da bi sodelovala pri bolezni. Pri izbiri bakterije so morali upoštevati še kompatibilnost s predhodno izbranim citokinskim senzorjem, ki se uspešno izraža v gram negativnih bakterijah. Bakterije so razdelili v dve skupini in pripravili dve različni vezji. V prvo skupino bakterij so vstavili vezje, ki je omogočilo proizvodnjo AA, medtem ko je bila druga skupina bakterija prilagojena na proizvodnjo DHA. Uravnavanje sinteze ustrezne PUFA je zagotavljal citokinski senzor, ki se je odzval na vnetje v telesu. Obe skupini bakterij sta vsebovali še dve varnostni stikali, ki sta zagotovili varnost probiotika.

=='''Načrtovanje vezja'''==

Prva skupina bakterij je bila odgovorna za sintezo AA, njeno vezje je bilo sestavljeno iz promotor pspA, s katerim je bila pogojena sinteza represorja cI. Represor cI je s svojo vezavo na operator promotorja pLac inhibiral izražanje fosfolipaze cPLA2, ki je sodelovala pri transportu sintetizirane PUFA. AA sintaza je bila zapisana pod konstitutivnim Andersonovim promotorjem J23. V drugi skupini bakterij, je bilo vezje podobno, vendar sinteza ni bila uravnana s represorjem cI.

==''' Moduli, ki sestavljajo TheraPUFA'''==

=== Citokinski senzor ===

Pri projektu so želeli oblikovati senzor za zaznavanje IFN-γ in TNF-α, ki bi reguliral sintezo AA in DHA. V ta namen, so uporabili sintetični citokinski senzor, ki sta ga predhodno razvila raziskovalca Aurand in March [8]. Osnova tega senzorja je zunanji membranski porin A (OmpA) iz ''E. coli'', ki so mu zamenjali dve zunajcelični zanki z zunajceličnima zankama proteina OrpF. Z zamenjavo zank so omogočili zaznavanje IFN-γ in TNF-α.
Pri nizkih koncentracijah IFN-γ in TNF-α senzor ni aktiven. Transkripcijski faktor PspF, ki omogoči izražanje DHA sintaze, je inhibiran. Sinteza DHA ne poteka.
Ko so v okolici bakterije prisotne zadostne koncentracije IFN-γ in TNF-α, se citokinski senzor aktivira, signal se preko OmpA proteina prenese do membranskih proteinov PspB, PspC in PspA, kar povzroči spremembe interakcij med proteini in inhibicija transkripcijskega faktorja PspF je prekinjena. Aktiven transkripcijski faktor PspF se lahko veže na operatorsko regijo PspA promotorja in inducira izražanje DHA sintaze. V prvi skupini bakterij, ki so odgovorne za sintezo AA, transkripcijski faktor PspF aktivira izražanje represorja in transport AA je onemogočen. Ker le visoke koncentracije citokinov aktivirajo citokinski senzor, pride do preklopa med izločanjem AA in DHA le v primeru prekomernega imunskega odziva.

=== Sinteza polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA) ===

Za sintezo AA so uporabili zapis za PUFA sintazo iz ''Aureispira marina'', ki omogoča de novo sintezo AA. Za sintezo DHA pa so uporabili zapis za PUFA sintazo iz ''Scizochytrium'', ki omogoča de novo sintezo DHA.

=== Transport polinenasičenih maščobnih kislin ===

Pri oblikovanju sistema za transport PUFA so pri projektu izhajali iz gram negativne bakterije ''Rhodobacter sphaeroides'', ki lahko izloča dolge maščobne kisline v zunajcelični prostor. Sistem temelji na fosfolipazi, ki se nahaja v periplazmi in sprošča maščobne kisline iz fosfolipidov notranje membrane. Maščobne kisline se nato izločijo v zunajcelični prostor, po neznanem mehanizmu, ki ni odvisen od proteina Tol-C. Sistem za transport PUFA so prilagodili, tako da so izbrali acil-sintetazo in fosfolipazo, z večjo preferenco do PUFA. Izbrana acil-sintetaza omogoči, aktivacijo PUFA in sintezo fosfolipidov. Fosfolipaza je pomembna za sproščanje PUFA iz fosfolipidnega dvosloja v periplazmo.
Prvi korak pri proizvodnji in transportu AA je sinteza PUFA in vgradnja v notranjo celično membrano. Ker je vgradnja AA v fosfolipide značilna že v wt celicah, jim sistema ni bilo potrebno bistveno prilagajati. V drugem koraku je pomembna cPLA2, ki se s pomočjo CycA lokalizacijskega signala izloča v periplazmo in omogoči sproščanje AA iz notranje membrane v periplazemski prostor. V tretjem koraku gre za prehod AA iz periplazemskega v zunajcelični prostor. Ker je bakterijska membrana neprepustna za maščobne kisline in pasivna difuzija ni možna, so pri projektu predpostavili olajšan transport PUFA preko proteinskega transporterja. FadL je transporter dolgih maščobnih kislin, ki prenaša maščobne kisline v periplazmo. Predvidevali so, da mora obstajati protein podoben proteinu FadL, ki bi omogočil olajšan transport PUFA iz periplazme v zunajcelični prostor.
DHA se za razliko od AA v nativnih celicah akumulira v citoplazmi v obliki prostih maščobnih kislin. Za sintezo DHA so pri projektu uporabili PUFA sintazo iz ''Schizochytrium''. Poleg tega so dodali še zapis za fosfopantetinil transferazo iz ''Nostoc'' cianobakterij, ki postranslacijsko modificira DHA sintazo in je nujna za sintezo DHA [9]. Za vgradnjo DHA v membrano, se mora DHA še aktivirati z dodatkom CoA. Za aktivacijo so v bakterije vnesli zapis za acil-CoA sintetazo lacsA iz ''Thalassiosira pseudonana'', ki omogoči prenos CoA iz acetil-CoA na DHA. Aktivirana DHA se nato s pomočjo encimov vgradi v notranjo membrano. Za sproščanje DHA iz notranje membrane v periplazmo so uporabili človeško fosfolipazo iPLA2, ki so ji dodali CycA lokalizacijski signal za prehod v periplazmo. Transport DHA v zunajcelični prostor pa naj bi potekal na enak način kot transport AA.

=== Varnostni modul z dvema stikaloma ===

Prvo stikalo zagotavlja varnost probiotika v človeškem telesu. Z vklopom stikala pride do eliminacije probiotika iz organizma. Za stikalo so konstruirali aspirin-inducibilni ekspresijski sistem. Uporabili so promotor PsaI, ki zapisuje za zeta toksin in je odvisen od transkripcijskega faktorja SalR. Transkripcijski faktor SalR je zapisan pod konstitutivnem promotorjem PopaB in lahko obstaja v dveh oblikah: SalRr in SalRa. V obliki SalRr deluje kot represor, medtem ko v obliki SalRa s svojo vezavo aktivira transkripcijo toksina. SalR bo v odsotnosti aspirina deloval kot represor, ki bo zaviral izražanje zeta toksina. Ob dodatku aspirina bo SalR začel delovati kot aktivator in izražati se bo začel zeta toksin, ki bo inhibiral sintezo petidoglikanov in prišlo bo do lize celic.
Drugo stikalo preprečuje, da bi bakterije iz TheraPUFA preživele v okolju (zunaj gostitelja), saj prepreči replikacijo bakterij pri temperaturi nižji od 37 °C. Stikalo je uravnano s FitAB toksin-antitoksin sistemom, ki so ga združili z RNA termometrom CssA. CssA je RNA termometer, ki pri temperaturi nižji od 37 °C oblikuje lasnično zanko in blokira vezavo ribosoma na RBS. Toksin FitB in antitoksin FitA sta zapisana pod nativnim promotorjem. Pred zapis za antitoksin FitA so dodali še CssA, ki uravnava izražanje antitoksina. Pri temperaturi 37 °C se bosta izražala tako toksin FitB, kot antitoksin FitA, zato bo delovanje toksina inhibirano. Pri temperaturi nižji od 37 °C, pa bo izražanje antitoksina FitA ustavljeno zaradi tvorbe lasnične zanke CssA in toksin FitB bo aktiven.

=='''Optimizacija prvotnega modela'''==

Da bi lahko TheraPUFA uporabljali kot protivirusno učinkovino, bi morali model še prilagoditi:

• S pomočjo mestnospecifične mutageneze bi morali povečati občutljivost sintetičnega citokinskega receptorja.

• Povečati bi morali sintezo PUFA.

• Z uporabo posebnih gelov, ki se uporabljajo pri vnosu probiotika bi morali povečati obstojnost vnesenih bakterij v nosni votlini.

=='''Zaključek'''==

Predstavljen projekt TheraPUFA je delo študentov univerze William & Mary, ki so ga pripravili za tekmovanje iGEM 2020. Zaradi pandemije koronavirusa SARS-CoV-2 študentje niso imeli dostopa do laboratorija, zato so pripravili idejno zasnovo za nazalni probiotik, pri katerem bi v bakterije ''Neisseria cinerea'' vstavili vezje za sintezo PUFA in tako omogočili protivirusno delovanje in uravnavanje pretiranega imunskega odziva, ki je tudi posledica SARS-CoV-2. Idejno zasnovo so nato preverili z matematičnimi parametri, pridobljenimi iz literature. Model je nakazoval, da TheraPUFA ne bi bilo možno uporabljati kot protivirusno učinkovino, kljub temu so naknadno model optimizirali in tako oblikovali nazalni probiotik, ki bi prispeval k zmanjšanju virusne obremenitve.

=='''Viri in literatura'''==

[1] “Team:William and Mary - 2020.igem.org.” [Online]. Available: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary. [Accessed: 07-Apr-2021].

[2] C. Müller, M. Hardt, D. Schwudke, B. W. Neuman, S. Pleschka, and J. Ziebuhr, “Inhibition of cytosolic phospholipase A2α impairs an early step of coronavirus replication in cell culture,” J. Virol., vol. 92, no. 4, p. JVI.01463-17, Nov. 2017.

[3] A. Goc, “Polyunsaturated ω-3 fatty acids inhibit ACE2-controlled SARS-CoV-2 binding and cellular entry.”

[4] U. N. Das, “Can Bioactive Lipids Inactivate Coronavirus (COVID-19)?,” Arch. Med. Res., vol. 51, no. 3, pp. 282–286, Apr. 2020.

[5] U. N. Das, “Response to: Bioactive Lipids and Coronavirus (COVID-19)-further Discussion,” Archives of Medical Research, vol. 51, no. 5. Elsevier Inc., pp. 445–449, 01-Jul-2020.

[6] A. Kohn, J. Gitelman, and M. Inbar, “Unsaturated free fatty acids inactivate animal enveloped viruses,” Arch. Virol., vol. 66, no. 4, pp. 301–307, Dec. 1980.

[7] U. N. Das, “Arachidonic acid and other unsaturated fatty acids and some of their metabolites function as endogenous antimicrobial molecules: A review,” Journal of Advanced Research, vol. 11. Elsevier B.V., pp. 57–66, 01-May-2018.

[8] T. C. Aurand and J. C. March, “Development of a synthetic receptor protein for sensing inflammatory mediators interferon-γ and tumor necrosis factor-α,” Biotechnol. Bioeng., vol. 113, no. 3, pp. 492–500, Mar. 2016.

[9] J. Beld, E. C. Sonnenschein, C. R. Vickery, J. P. Noel, and M. D. Burkart, “The phosphopantetheinyl transferases: Catalysis of a post-translational modification crucial for life,” Nat. Prod. Rep., vol. 31, no. 1, pp. 61–108, Jan. 2014.

TheraPUFA: nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem

2021-04-11T19:16:36Z

Barbara Slapnik: /* Optimizacija prvotnega modela */

Therapufa [1] je iGEM-projekt iz leta 2020, ki je bil nagrajen s prvim mestom za najboljši terapevtski projekt. Avtorji projekta so študenti univerze William & Mary v Williamsburgu, Virginia.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary

Avtorica povzetka: Barbara Slapnik

=='''Uvod – Kaj je TheraPUFA?'''==

TheraPUFA je nazalni probiotik, ki omogoča sintezo polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA), s katerimi uravnava vnetje in deluje protivirusno.
Ideja projekta je posledica pandemije koronavirusa SARS-CoV-2, ki je pripomogla k hitrem razvoju cepiv, diagnostičnih orodij in zdravil, ki vključujejo protivirusne učinkovine.

=='''Polinenasičene maščobne kisline (PUFA)'''==

Polinenasičene maščobne kisline (PUFA) lahko delujejo kot endogene antibakterijske, antivirusne in antiparazitske spojine, poleg tega pa lahko preko svojih metabolitov regulirajo tudi procese vnetja. Inaktivirajo lahko viruse z lipidno ovojnico (npr. herpes, influenza, SARS-CoV-2), tako da povzročijo lizo celic oziroma puščanje membrane, inhibirajo proliferacijo različnih mikroorganizmov, preprečujejo preureditev lipidnega dvosloja in vplivajo na interakcijo med virusom in receptorjem [2]–[7]. Med PUFA uvrščamo arahidonsko kislino (AA) in dokozaheksaenojsko kislino (DHA), ki so jih uporabili pri načrtovanju nazalnega probiotika. AA lahko povzroči lizo lipidnih ovojnic virusa, njeni metaboliti pa učinkujejo provnetno in protivnetno. Obe uporabljeni PUFA pa zavirata replikacijo +RNA virusov, saj spremenita lipidno sestavo in tako virusom onemogočita preureditev membran in njihovo razmnoževanje. Za metabolite DHA so značilni le protivnetni učinki.

=='''Izbira bakterij'''==

Za izbiro probiotične šasije so iskali vrsto bakterij, ki bi izpolnjevala tri pogoje:
• bakterija mora biti naravno del nosno-žrelnega mikrobioma,
• ne sme povzročati bolezni ali povečati tveganje za razvoj bolezni v zdravih posameznikih,
• bakterija je že bila uporabljena kot nazalni probiotik.
Pri projektu so se odločili za bakterijo ''Neisseria cinerea'', gram negativno bakterijo, ki in jo najdemo v nazalni in oralni mikrobioti zdravih odraslih in otrok. ''N. cinerea'' je komenzalna bakterija, ki preprečuje rast patogenih bakterij, uvrščamo jo v 1. biološki varnostni razred, ne povzroča bolezni in ni znano, da bi sodelovala pri bolezni. Pri izbiri bakterije so morali upoštevati še kompatibilnost s predhodno izbranim citokinskim senzorjem, ki se uspešno izraža v gram negativnih bakterijah. Bakterije so razdelili v dve skupini in pripravili dve različni vezji. V prvo skupino bakterij so vstavili vezje, ki je omogočilo proizvodnjo AA, medtem ko je bila druga skupina bakterija prilagojena na proizvodnjo DHA. Uravnavanje sinteze ustrezne PUFA je zagotavljal citokinski senzor, ki se je odzval na vnetje v telesu. Obe skupini bakterij sta vsebovali še dve varnostni stikali, ki sta zagotovili varnost probiotika.

=='''Načrtovanje vezja'''==

Prva skupina bakterij je bila odgovorna za sintezo AA, njeno vezje je bilo sestavljeno iz promotor pspA, s katerim je bila pogojena sinteza represorja cI. Represor cI je s svojo vezavo na operator promotorja pLac inhibiral izražanje fosfolipaze cPLA2, ki je sodelovala pri transportu sintetizirane PUFA. AA sintaza je bila zapisana pod konstitutivnim Andersonovim promotorjem J23. V drugi skupini bakterij, je bilo vezje podobno, vendar sinteza ni bila uravnana s represorjem cI.

==''' Moduli, ki sestavljajo TheraPUFA'''==

=== Citokinski senzor ===

Pri projektu so želeli oblikovati senzor za zaznavanje IFN-γ in TNF-α, ki bi reguliral sintezo AA in DHA. V ta namen, so uporabili sintetični citokinski senzor, ki sta ga predhodno razvila raziskovalca Aurand in March [8]. Osnova tega senzorja je zunanji membranski porin A (OmpA) iz ''E. coli'', ki so mu zamenjali dve zunajcelični zanki z zunajceličnima zankama proteina OrpF. Z zamenjavo zank so omogočili zaznavanje IFN-γ in TNF-α.
Pri nizkih koncentracijah IFN-γ in TNF-α senzor ni aktiven. Transkripcijski faktor PspF, ki omogoči izražanje DHA sintaze, je inhibiran. Sinteza DHA ne poteka.
Ko so v okolici bakterije prisotne zadostne koncentracije IFN-γ in TNF-α, se citokinski senzor aktivira, signal se preko OmpA proteina prenese do membranskih proteinov PspB, PspC in PspA, kar povzroči spremembe interakcij med proteini in inhibicija transkripcijskega faktorja PspF je prekinjena. Aktiven transkripcijski faktor PspF se lahko veže na operatorsko regijo PspA promotorja in inducira izražanje DHA sintaze. V prvi skupini bakterij, ki so odgovorne za sintezo AA, transkripcijski faktor PspF aktivira izražanje represorja in transport AA je onemogočen. Ker le visoke koncentracije citokinov aktivirajo citokinski senzor, pride do preklopa med izločanjem AA in DHA le v primeru prekomernega imunskega odziva.

=== Sinteza polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA) ===

Za sintezo AA so uporabili zapis za PUFA sintazo iz ''Aureispira marina'', ki omogoča de novo sintezo AA. Za sintezo DHA pa so uporabili zapis za PUFA sintazo iz ''Scizochytrium'', ki omogoča de novo sintezo DHA.

=== Transport polinenasičenih maščobnih kislin ===

Pri oblikovanju sistema za transport PUFA so pri projektu izhajali iz gram negativne bakterije ''Rhodobacter sphaeroides'', ki lahko izloča dolge maščobne kisline v zunajcelični prostor. Sistem temelji na fosfolipazi, ki se nahaja v periplazmi in sprošča maščobne kisline iz fosfolipidov notranje membrane. Maščobne kisline se nato izločijo v zunajcelični prostor, po neznanem mehanizmu, ki ni odvisen od proteina Tol-C. Sistem za transport PUFA so prilagodili, tako da so izbrali acil-sintetazo in fosfolipazo, z večjo preferenco do PUFA. Izbrana acil-sintetaza omogoči, aktivacijo PUFA in sintezo fosfolipidov. Fosfolipaza je pomembna za sproščanje PUFA iz fosfolipidnega dvosloja v periplazmo.
Prvi korak pri proizvodnji in transportu AA je sinteza PUFA in vgradnja v notranjo celično membrano. Ker je vgradnja AA v fosfolipide značilna že v wt celicah, jim sistema ni bilo potrebno bistveno prilagajati. V drugem koraku je pomembna cPLA2, ki se s pomočjo CycA lokalizacijskega signala izloča v periplazmo in omogoči sproščanje AA iz notranje membrane v periplazemski prostor. V tretjem koraku gre za prehod AA iz periplazemskega v zunajcelični prostor. Ker je bakterijska membrana neprepustna za maščobne kisline in pasivna difuzija ni možna, so pri projektu predpostavili olajšan transport PUFA preko proteinskega transporterja. FadL je transporter dolgih maščobnih kislin, ki prenaša maščobne kisline v periplazmo. Predvidevali so, da mora obstajati protein podoben proteinu FadL, ki bi omogočil olajšan transport PUFA iz periplazme v zunajcelični prostor.
DHA se za razliko od AA v nativnih celicah akumulira v citoplazmi v obliki prostih maščobnih kislin. Za sintezo DHA so pri projektu uporabili PUFA sintazo iz ''Schizochytrium''. Poleg tega so dodali še zapis za fosfopantetinil transferazo iz ''Nostoc'' cianobakterij, ki postranslacijsko modificira DHA sintazo in je nujna za sintezo DHA [9]. Za vgradnjo DHA v membrano, se mora DHA še aktivirati z dodatkom CoA. Za aktivacijo so v bakterije vnesli zapis za acil-CoA sintetazo lacsA iz ''Thalassiosira pseudonana'', ki omogoči prenos CoA iz acetil-CoA na DHA. Aktivirana DHA se nato s pomočjo encimov vgradi v notranjo membrano. Za sproščanje DHA iz notranje membrane v periplazmo so uporabili človeško fosfolipazo iPLA2, ki so ji dodali CycA lokalizacijski signal za prehod v periplazmo. Transport DHA v zunajcelični prostor pa naj bi potekal na enak način kot transport AA.

=== Varnostni modul z dvema stikaloma ===

Prvo stikalo zagotavlja varnost probiotika v človeškem telesu. Z vklopom stikala pride do eliminacije probiotika iz organizma. Za stikalo so konstruirali aspirin-inducibilni ekspresijski sistem. Uporabili so promotor PsaI, ki zapisuje za zeta toksin in je odvisen od transkripcijskega faktorja SalR. Transkripcijski faktor SalR je zapisan pod konstitutivnem promotorjem PopaB in lahko obstaja v dveh oblikah: SalRr in SalRa. V obliki SalRr deluje kot represor, medtem ko v obliki SalRa s svojo vezavo aktivira transkripcijo toksina. SalR bo v odsotnosti aspirina deloval kot represor, ki bo zaviral izražanje zeta toksina. Ob dodatku aspirina bo SalR začel delovati kot aktivator in izražati se bo začel zeta toksin, ki bo inhibiral sintezo petidoglikanov in prišlo bo do lize celic.
Drugo stikalo preprečuje, da bi bakterije iz TheraPUFA preživele v okolju (zunaj gostitelja), saj prepreči replikacijo bakterij pri temperaturi nižji od 37 °C. Stikalo je uravnano s FitAB toksin-antitoksin sistemom, ki so ga združili z RNA termometrom CssA. CssA je RNA termometer, ki pri temperaturi nižji od 37 °C oblikuje lasnično zanko in blokira vezavo ribosoma na RBS. Toksin FitB in antitoksin FitA sta zapisana pod nativnim promotorjem. Pred zapis za antitoksin FitA so dodali še CssA, ki uravnava izražanje antitoksina. Pri temperaturi 37 °C se bosta izražala tako toksin FitB, kot antitoksin FitA, zato bo delovanje toksina inhibirano. Pri temperaturi nižji od 37 °C, pa bo izražanje antitoksina FitA ustavljeno zaradi tvorbe lasnične zanke CssA in toksin FitB bo aktiven.

=='''Optimizacija prvotnega modela'''==

Da bi lahko TheraPUFA uporabljali kot protivirusno učinkovino, bi morali model še prilagoditi:
• S pomočjo mestnospecifične mutageneze bi morali povečati občutljivost sintetičnega citokinskega receptorja.

• Povečati bi morali sintezo PUFA.

• Z uporabo posebnih gelov, ki se uporabljajo pri vnosu probiotika bi morali povečati obstojnost vnesenih bakterij v nosni votlini.

=='''Zaključek'''==

Predstavljen projekt TheraPUFA je delo študentov univerze William & Mary, ki so ga pripravili za tekmovanje iGEM 2020. Zaradi pandemije koronavirusa SARS-CoV-2 študentje niso imeli dostopa do laboratorija, zato so pripravili idejno zasnovo za nazalni probiotik, pri katerem bi v bakterije ''Neisseria cinerea'' vstavili vezje za sintezo PUFA in tako omogočili protivirusno delovanje in uravnavanje pretiranega imunskega odziva, ki je tudi posledica SARS-CoV-2. Idejno zasnovo so nato preverili z matematičnimi parametri, pridobljenimi iz literature. Model je nakazoval, da TheraPUFA ne bi bilo možno uporabljati kot protivirusno učinkovino, kljub temu so naknadno model optimizirali in tako oblikovali nazalni probiotik, ki bi prispeval k zmanjšanju virusne obremenitve.

=='''Viri in literatura'''==

[1] “Team:William and Mary - 2020.igem.org.” [Online]. Available: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary. [Accessed: 07-Apr-2021].

[2] C. Müller, M. Hardt, D. Schwudke, B. W. Neuman, S. Pleschka, and J. Ziebuhr, “Inhibition of cytosolic phospholipase A2α impairs an early step of coronavirus replication in cell culture,” J. Virol., vol. 92, no. 4, p. JVI.01463-17, Nov. 2017.

[3] A. Goc, “Polyunsaturated ω-3 fatty acids inhibit ACE2-controlled SARS-CoV-2 binding and cellular entry.”

[4] U. N. Das, “Can Bioactive Lipids Inactivate Coronavirus (COVID-19)?,” Arch. Med. Res., vol. 51, no. 3, pp. 282–286, Apr. 2020.

[5] U. N. Das, “Response to: Bioactive Lipids and Coronavirus (COVID-19)-further Discussion,” Archives of Medical Research, vol. 51, no. 5. Elsevier Inc., pp. 445–449, 01-Jul-2020.

[6] A. Kohn, J. Gitelman, and M. Inbar, “Unsaturated free fatty acids inactivate animal enveloped viruses,” Arch. Virol., vol. 66, no. 4, pp. 301–307, Dec. 1980.

[7] U. N. Das, “Arachidonic acid and other unsaturated fatty acids and some of their metabolites function as endogenous antimicrobial molecules: A review,” Journal of Advanced Research, vol. 11. Elsevier B.V., pp. 57–66, 01-May-2018.

[8] T. C. Aurand and J. C. March, “Development of a synthetic receptor protein for sensing inflammatory mediators interferon-γ and tumor necrosis factor-α,” Biotechnol. Bioeng., vol. 113, no. 3, pp. 492–500, Mar. 2016.

[9] J. Beld, E. C. Sonnenschein, C. R. Vickery, J. P. Noel, and M. D. Burkart, “The phosphopantetheinyl transferases: Catalysis of a post-translational modification crucial for life,” Nat. Prod. Rep., vol. 31, no. 1, pp. 61–108, Jan. 2014.

TheraPUFA: nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem

2021-04-11T19:16:13Z

Barbara Slapnik: /* Viri in literatura */

Therapufa [1] je iGEM-projekt iz leta 2020, ki je bil nagrajen s prvim mestom za najboljši terapevtski projekt. Avtorji projekta so študenti univerze William & Mary v Williamsburgu, Virginia.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary

Avtorica povzetka: Barbara Slapnik

=='''Uvod – Kaj je TheraPUFA?'''==

TheraPUFA je nazalni probiotik, ki omogoča sintezo polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA), s katerimi uravnava vnetje in deluje protivirusno.
Ideja projekta je posledica pandemije koronavirusa SARS-CoV-2, ki je pripomogla k hitrem razvoju cepiv, diagnostičnih orodij in zdravil, ki vključujejo protivirusne učinkovine.

=='''Polinenasičene maščobne kisline (PUFA)'''==

Polinenasičene maščobne kisline (PUFA) lahko delujejo kot endogene antibakterijske, antivirusne in antiparazitske spojine, poleg tega pa lahko preko svojih metabolitov regulirajo tudi procese vnetja. Inaktivirajo lahko viruse z lipidno ovojnico (npr. herpes, influenza, SARS-CoV-2), tako da povzročijo lizo celic oziroma puščanje membrane, inhibirajo proliferacijo različnih mikroorganizmov, preprečujejo preureditev lipidnega dvosloja in vplivajo na interakcijo med virusom in receptorjem [2]–[7]. Med PUFA uvrščamo arahidonsko kislino (AA) in dokozaheksaenojsko kislino (DHA), ki so jih uporabili pri načrtovanju nazalnega probiotika. AA lahko povzroči lizo lipidnih ovojnic virusa, njeni metaboliti pa učinkujejo provnetno in protivnetno. Obe uporabljeni PUFA pa zavirata replikacijo +RNA virusov, saj spremenita lipidno sestavo in tako virusom onemogočita preureditev membran in njihovo razmnoževanje. Za metabolite DHA so značilni le protivnetni učinki.

=='''Izbira bakterij'''==

Za izbiro probiotične šasije so iskali vrsto bakterij, ki bi izpolnjevala tri pogoje:
• bakterija mora biti naravno del nosno-žrelnega mikrobioma,
• ne sme povzročati bolezni ali povečati tveganje za razvoj bolezni v zdravih posameznikih,
• bakterija je že bila uporabljena kot nazalni probiotik.
Pri projektu so se odločili za bakterijo ''Neisseria cinerea'', gram negativno bakterijo, ki in jo najdemo v nazalni in oralni mikrobioti zdravih odraslih in otrok. ''N. cinerea'' je komenzalna bakterija, ki preprečuje rast patogenih bakterij, uvrščamo jo v 1. biološki varnostni razred, ne povzroča bolezni in ni znano, da bi sodelovala pri bolezni. Pri izbiri bakterije so morali upoštevati še kompatibilnost s predhodno izbranim citokinskim senzorjem, ki se uspešno izraža v gram negativnih bakterijah. Bakterije so razdelili v dve skupini in pripravili dve različni vezji. V prvo skupino bakterij so vstavili vezje, ki je omogočilo proizvodnjo AA, medtem ko je bila druga skupina bakterija prilagojena na proizvodnjo DHA. Uravnavanje sinteze ustrezne PUFA je zagotavljal citokinski senzor, ki se je odzval na vnetje v telesu. Obe skupini bakterij sta vsebovali še dve varnostni stikali, ki sta zagotovili varnost probiotika.

=='''Načrtovanje vezja'''==

Prva skupina bakterij je bila odgovorna za sintezo AA, njeno vezje je bilo sestavljeno iz promotor pspA, s katerim je bila pogojena sinteza represorja cI. Represor cI je s svojo vezavo na operator promotorja pLac inhibiral izražanje fosfolipaze cPLA2, ki je sodelovala pri transportu sintetizirane PUFA. AA sintaza je bila zapisana pod konstitutivnim Andersonovim promotorjem J23. V drugi skupini bakterij, je bilo vezje podobno, vendar sinteza ni bila uravnana s represorjem cI.

==''' Moduli, ki sestavljajo TheraPUFA'''==

=== Citokinski senzor ===

Pri projektu so želeli oblikovati senzor za zaznavanje IFN-γ in TNF-α, ki bi reguliral sintezo AA in DHA. V ta namen, so uporabili sintetični citokinski senzor, ki sta ga predhodno razvila raziskovalca Aurand in March [8]. Osnova tega senzorja je zunanji membranski porin A (OmpA) iz ''E. coli'', ki so mu zamenjali dve zunajcelični zanki z zunajceličnima zankama proteina OrpF. Z zamenjavo zank so omogočili zaznavanje IFN-γ in TNF-α.
Pri nizkih koncentracijah IFN-γ in TNF-α senzor ni aktiven. Transkripcijski faktor PspF, ki omogoči izražanje DHA sintaze, je inhibiran. Sinteza DHA ne poteka.
Ko so v okolici bakterije prisotne zadostne koncentracije IFN-γ in TNF-α, se citokinski senzor aktivira, signal se preko OmpA proteina prenese do membranskih proteinov PspB, PspC in PspA, kar povzroči spremembe interakcij med proteini in inhibicija transkripcijskega faktorja PspF je prekinjena. Aktiven transkripcijski faktor PspF se lahko veže na operatorsko regijo PspA promotorja in inducira izražanje DHA sintaze. V prvi skupini bakterij, ki so odgovorne za sintezo AA, transkripcijski faktor PspF aktivira izražanje represorja in transport AA je onemogočen. Ker le visoke koncentracije citokinov aktivirajo citokinski senzor, pride do preklopa med izločanjem AA in DHA le v primeru prekomernega imunskega odziva.

=== Sinteza polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA) ===

Za sintezo AA so uporabili zapis za PUFA sintazo iz ''Aureispira marina'', ki omogoča de novo sintezo AA. Za sintezo DHA pa so uporabili zapis za PUFA sintazo iz ''Scizochytrium'', ki omogoča de novo sintezo DHA.

=== Transport polinenasičenih maščobnih kislin ===

Pri oblikovanju sistema za transport PUFA so pri projektu izhajali iz gram negativne bakterije ''Rhodobacter sphaeroides'', ki lahko izloča dolge maščobne kisline v zunajcelični prostor. Sistem temelji na fosfolipazi, ki se nahaja v periplazmi in sprošča maščobne kisline iz fosfolipidov notranje membrane. Maščobne kisline se nato izločijo v zunajcelični prostor, po neznanem mehanizmu, ki ni odvisen od proteina Tol-C. Sistem za transport PUFA so prilagodili, tako da so izbrali acil-sintetazo in fosfolipazo, z večjo preferenco do PUFA. Izbrana acil-sintetaza omogoči, aktivacijo PUFA in sintezo fosfolipidov. Fosfolipaza je pomembna za sproščanje PUFA iz fosfolipidnega dvosloja v periplazmo.
Prvi korak pri proizvodnji in transportu AA je sinteza PUFA in vgradnja v notranjo celično membrano. Ker je vgradnja AA v fosfolipide značilna že v wt celicah, jim sistema ni bilo potrebno bistveno prilagajati. V drugem koraku je pomembna cPLA2, ki se s pomočjo CycA lokalizacijskega signala izloča v periplazmo in omogoči sproščanje AA iz notranje membrane v periplazemski prostor. V tretjem koraku gre za prehod AA iz periplazemskega v zunajcelični prostor. Ker je bakterijska membrana neprepustna za maščobne kisline in pasivna difuzija ni možna, so pri projektu predpostavili olajšan transport PUFA preko proteinskega transporterja. FadL je transporter dolgih maščobnih kislin, ki prenaša maščobne kisline v periplazmo. Predvidevali so, da mora obstajati protein podoben proteinu FadL, ki bi omogočil olajšan transport PUFA iz periplazme v zunajcelični prostor.
DHA se za razliko od AA v nativnih celicah akumulira v citoplazmi v obliki prostih maščobnih kislin. Za sintezo DHA so pri projektu uporabili PUFA sintazo iz ''Schizochytrium''. Poleg tega so dodali še zapis za fosfopantetinil transferazo iz ''Nostoc'' cianobakterij, ki postranslacijsko modificira DHA sintazo in je nujna za sintezo DHA [9]. Za vgradnjo DHA v membrano, se mora DHA še aktivirati z dodatkom CoA. Za aktivacijo so v bakterije vnesli zapis za acil-CoA sintetazo lacsA iz ''Thalassiosira pseudonana'', ki omogoči prenos CoA iz acetil-CoA na DHA. Aktivirana DHA se nato s pomočjo encimov vgradi v notranjo membrano. Za sproščanje DHA iz notranje membrane v periplazmo so uporabili človeško fosfolipazo iPLA2, ki so ji dodali CycA lokalizacijski signal za prehod v periplazmo. Transport DHA v zunajcelični prostor pa naj bi potekal na enak način kot transport AA.

=== Varnostni modul z dvema stikaloma ===

Prvo stikalo zagotavlja varnost probiotika v človeškem telesu. Z vklopom stikala pride do eliminacije probiotika iz organizma. Za stikalo so konstruirali aspirin-inducibilni ekspresijski sistem. Uporabili so promotor PsaI, ki zapisuje za zeta toksin in je odvisen od transkripcijskega faktorja SalR. Transkripcijski faktor SalR je zapisan pod konstitutivnem promotorjem PopaB in lahko obstaja v dveh oblikah: SalRr in SalRa. V obliki SalRr deluje kot represor, medtem ko v obliki SalRa s svojo vezavo aktivira transkripcijo toksina. SalR bo v odsotnosti aspirina deloval kot represor, ki bo zaviral izražanje zeta toksina. Ob dodatku aspirina bo SalR začel delovati kot aktivator in izražati se bo začel zeta toksin, ki bo inhibiral sintezo petidoglikanov in prišlo bo do lize celic.
Drugo stikalo preprečuje, da bi bakterije iz TheraPUFA preživele v okolju (zunaj gostitelja), saj prepreči replikacijo bakterij pri temperaturi nižji od 37 °C. Stikalo je uravnano s FitAB toksin-antitoksin sistemom, ki so ga združili z RNA termometrom CssA. CssA je RNA termometer, ki pri temperaturi nižji od 37 °C oblikuje lasnično zanko in blokira vezavo ribosoma na RBS. Toksin FitB in antitoksin FitA sta zapisana pod nativnim promotorjem. Pred zapis za antitoksin FitA so dodali še CssA, ki uravnava izražanje antitoksina. Pri temperaturi 37 °C se bosta izražala tako toksin FitB, kot antitoksin FitA, zato bo delovanje toksina inhibirano. Pri temperaturi nižji od 37 °C, pa bo izražanje antitoksina FitA ustavljeno zaradi tvorbe lasnične zanke CssA in toksin FitB bo aktiven.

=='''Optimizacija prvotnega modela'''==

Da bi lahko TheraPUFA uporabljali kot protivirusno učinkovino, bi morali model še prilagoditi:
• S pomočjo mestnospecifične mutageneze bi morali povečati občutljivost sintetičnega citokinskega receptorja.
• Povečati bi morali sintezo PUFA.
• Z uporabo posebnih gelov, ki se uporabljajo pri vnosu probiotika bi morali povečati obstojnost vnesenih bakterij v nosni votlini.

=='''Zaključek'''==

Predstavljen projekt TheraPUFA je delo študentov univerze William & Mary, ki so ga pripravili za tekmovanje iGEM 2020. Zaradi pandemije koronavirusa SARS-CoV-2 študentje niso imeli dostopa do laboratorija, zato so pripravili idejno zasnovo za nazalni probiotik, pri katerem bi v bakterije ''Neisseria cinerea'' vstavili vezje za sintezo PUFA in tako omogočili protivirusno delovanje in uravnavanje pretiranega imunskega odziva, ki je tudi posledica SARS-CoV-2. Idejno zasnovo so nato preverili z matematičnimi parametri, pridobljenimi iz literature. Model je nakazoval, da TheraPUFA ne bi bilo možno uporabljati kot protivirusno učinkovino, kljub temu so naknadno model optimizirali in tako oblikovali nazalni probiotik, ki bi prispeval k zmanjšanju virusne obremenitve.

=='''Viri in literatura'''==

[1] “Team:William and Mary - 2020.igem.org.” [Online]. Available: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary. [Accessed: 07-Apr-2021].

[2] C. Müller, M. Hardt, D. Schwudke, B. W. Neuman, S. Pleschka, and J. Ziebuhr, “Inhibition of cytosolic phospholipase A2α impairs an early step of coronavirus replication in cell culture,” J. Virol., vol. 92, no. 4, p. JVI.01463-17, Nov. 2017.

[3] A. Goc, “Polyunsaturated ω-3 fatty acids inhibit ACE2-controlled SARS-CoV-2 binding and cellular entry.”

[4] U. N. Das, “Can Bioactive Lipids Inactivate Coronavirus (COVID-19)?,” Arch. Med. Res., vol. 51, no. 3, pp. 282–286, Apr. 2020.

[5] U. N. Das, “Response to: Bioactive Lipids and Coronavirus (COVID-19)-further Discussion,” Archives of Medical Research, vol. 51, no. 5. Elsevier Inc., pp. 445–449, 01-Jul-2020.

[6] A. Kohn, J. Gitelman, and M. Inbar, “Unsaturated free fatty acids inactivate animal enveloped viruses,” Arch. Virol., vol. 66, no. 4, pp. 301–307, Dec. 1980.

[7] U. N. Das, “Arachidonic acid and other unsaturated fatty acids and some of their metabolites function as endogenous antimicrobial molecules: A review,” Journal of Advanced Research, vol. 11. Elsevier B.V., pp. 57–66, 01-May-2018.

[8] T. C. Aurand and J. C. March, “Development of a synthetic receptor protein for sensing inflammatory mediators interferon-γ and tumor necrosis factor-α,” Biotechnol. Bioeng., vol. 113, no. 3, pp. 492–500, Mar. 2016.

[9] J. Beld, E. C. Sonnenschein, C. R. Vickery, J. P. Noel, and M. D. Burkart, “The phosphopantetheinyl transferases: Catalysis of a post-translational modification crucial for life,” Nat. Prod. Rep., vol. 31, no. 1, pp. 61–108, Jan. 2014.

TheraPUFA: nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem

2021-04-11T19:14:57Z

Barbara Slapnik: /* Viri in literatura */

Therapufa [1] je iGEM-projekt iz leta 2020, ki je bil nagrajen s prvim mestom za najboljši terapevtski projekt. Avtorji projekta so študenti univerze William & Mary v Williamsburgu, Virginia.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary

Avtorica povzetka: Barbara Slapnik

=='''Uvod – Kaj je TheraPUFA?'''==

TheraPUFA je nazalni probiotik, ki omogoča sintezo polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA), s katerimi uravnava vnetje in deluje protivirusno.
Ideja projekta je posledica pandemije koronavirusa SARS-CoV-2, ki je pripomogla k hitrem razvoju cepiv, diagnostičnih orodij in zdravil, ki vključujejo protivirusne učinkovine.

=='''Polinenasičene maščobne kisline (PUFA)'''==

Polinenasičene maščobne kisline (PUFA) lahko delujejo kot endogene antibakterijske, antivirusne in antiparazitske spojine, poleg tega pa lahko preko svojih metabolitov regulirajo tudi procese vnetja. Inaktivirajo lahko viruse z lipidno ovojnico (npr. herpes, influenza, SARS-CoV-2), tako da povzročijo lizo celic oziroma puščanje membrane, inhibirajo proliferacijo različnih mikroorganizmov, preprečujejo preureditev lipidnega dvosloja in vplivajo na interakcijo med virusom in receptorjem [2]–[7]. Med PUFA uvrščamo arahidonsko kislino (AA) in dokozaheksaenojsko kislino (DHA), ki so jih uporabili pri načrtovanju nazalnega probiotika. AA lahko povzroči lizo lipidnih ovojnic virusa, njeni metaboliti pa učinkujejo provnetno in protivnetno. Obe uporabljeni PUFA pa zavirata replikacijo +RNA virusov, saj spremenita lipidno sestavo in tako virusom onemogočita preureditev membran in njihovo razmnoževanje. Za metabolite DHA so značilni le protivnetni učinki.

=='''Izbira bakterij'''==

Za izbiro probiotične šasije so iskali vrsto bakterij, ki bi izpolnjevala tri pogoje:
• bakterija mora biti naravno del nosno-žrelnega mikrobioma,
• ne sme povzročati bolezni ali povečati tveganje za razvoj bolezni v zdravih posameznikih,
• bakterija je že bila uporabljena kot nazalni probiotik.
Pri projektu so se odločili za bakterijo ''Neisseria cinerea'', gram negativno bakterijo, ki in jo najdemo v nazalni in oralni mikrobioti zdravih odraslih in otrok. ''N. cinerea'' je komenzalna bakterija, ki preprečuje rast patogenih bakterij, uvrščamo jo v 1. biološki varnostni razred, ne povzroča bolezni in ni znano, da bi sodelovala pri bolezni. Pri izbiri bakterije so morali upoštevati še kompatibilnost s predhodno izbranim citokinskim senzorjem, ki se uspešno izraža v gram negativnih bakterijah. Bakterije so razdelili v dve skupini in pripravili dve različni vezji. V prvo skupino bakterij so vstavili vezje, ki je omogočilo proizvodnjo AA, medtem ko je bila druga skupina bakterija prilagojena na proizvodnjo DHA. Uravnavanje sinteze ustrezne PUFA je zagotavljal citokinski senzor, ki se je odzval na vnetje v telesu. Obe skupini bakterij sta vsebovali še dve varnostni stikali, ki sta zagotovili varnost probiotika.

=='''Načrtovanje vezja'''==

Prva skupina bakterij je bila odgovorna za sintezo AA, njeno vezje je bilo sestavljeno iz promotor pspA, s katerim je bila pogojena sinteza represorja cI. Represor cI je s svojo vezavo na operator promotorja pLac inhibiral izražanje fosfolipaze cPLA2, ki je sodelovala pri transportu sintetizirane PUFA. AA sintaza je bila zapisana pod konstitutivnim Andersonovim promotorjem J23. V drugi skupini bakterij, je bilo vezje podobno, vendar sinteza ni bila uravnana s represorjem cI.

==''' Moduli, ki sestavljajo TheraPUFA'''==

=== Citokinski senzor ===

Pri projektu so želeli oblikovati senzor za zaznavanje IFN-γ in TNF-α, ki bi reguliral sintezo AA in DHA. V ta namen, so uporabili sintetični citokinski senzor, ki sta ga predhodno razvila raziskovalca Aurand in March [8]. Osnova tega senzorja je zunanji membranski porin A (OmpA) iz ''E. coli'', ki so mu zamenjali dve zunajcelični zanki z zunajceličnima zankama proteina OrpF. Z zamenjavo zank so omogočili zaznavanje IFN-γ in TNF-α.
Pri nizkih koncentracijah IFN-γ in TNF-α senzor ni aktiven. Transkripcijski faktor PspF, ki omogoči izražanje DHA sintaze, je inhibiran. Sinteza DHA ne poteka.
Ko so v okolici bakterije prisotne zadostne koncentracije IFN-γ in TNF-α, se citokinski senzor aktivira, signal se preko OmpA proteina prenese do membranskih proteinov PspB, PspC in PspA, kar povzroči spremembe interakcij med proteini in inhibicija transkripcijskega faktorja PspF je prekinjena. Aktiven transkripcijski faktor PspF se lahko veže na operatorsko regijo PspA promotorja in inducira izražanje DHA sintaze. V prvi skupini bakterij, ki so odgovorne za sintezo AA, transkripcijski faktor PspF aktivira izražanje represorja in transport AA je onemogočen. Ker le visoke koncentracije citokinov aktivirajo citokinski senzor, pride do preklopa med izločanjem AA in DHA le v primeru prekomernega imunskega odziva.

=== Sinteza polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA) ===

Za sintezo AA so uporabili zapis za PUFA sintazo iz ''Aureispira marina'', ki omogoča de novo sintezo AA. Za sintezo DHA pa so uporabili zapis za PUFA sintazo iz ''Scizochytrium'', ki omogoča de novo sintezo DHA.

=== Transport polinenasičenih maščobnih kislin ===

Pri oblikovanju sistema za transport PUFA so pri projektu izhajali iz gram negativne bakterije ''Rhodobacter sphaeroides'', ki lahko izloča dolge maščobne kisline v zunajcelični prostor. Sistem temelji na fosfolipazi, ki se nahaja v periplazmi in sprošča maščobne kisline iz fosfolipidov notranje membrane. Maščobne kisline se nato izločijo v zunajcelični prostor, po neznanem mehanizmu, ki ni odvisen od proteina Tol-C. Sistem za transport PUFA so prilagodili, tako da so izbrali acil-sintetazo in fosfolipazo, z večjo preferenco do PUFA. Izbrana acil-sintetaza omogoči, aktivacijo PUFA in sintezo fosfolipidov. Fosfolipaza je pomembna za sproščanje PUFA iz fosfolipidnega dvosloja v periplazmo.
Prvi korak pri proizvodnji in transportu AA je sinteza PUFA in vgradnja v notranjo celično membrano. Ker je vgradnja AA v fosfolipide značilna že v wt celicah, jim sistema ni bilo potrebno bistveno prilagajati. V drugem koraku je pomembna cPLA2, ki se s pomočjo CycA lokalizacijskega signala izloča v periplazmo in omogoči sproščanje AA iz notranje membrane v periplazemski prostor. V tretjem koraku gre za prehod AA iz periplazemskega v zunajcelični prostor. Ker je bakterijska membrana neprepustna za maščobne kisline in pasivna difuzija ni možna, so pri projektu predpostavili olajšan transport PUFA preko proteinskega transporterja. FadL je transporter dolgih maščobnih kislin, ki prenaša maščobne kisline v periplazmo. Predvidevali so, da mora obstajati protein podoben proteinu FadL, ki bi omogočil olajšan transport PUFA iz periplazme v zunajcelični prostor.
DHA se za razliko od AA v nativnih celicah akumulira v citoplazmi v obliki prostih maščobnih kislin. Za sintezo DHA so pri projektu uporabili PUFA sintazo iz ''Schizochytrium''. Poleg tega so dodali še zapis za fosfopantetinil transferazo iz ''Nostoc'' cianobakterij, ki postranslacijsko modificira DHA sintazo in je nujna za sintezo DHA [9]. Za vgradnjo DHA v membrano, se mora DHA še aktivirati z dodatkom CoA. Za aktivacijo so v bakterije vnesli zapis za acil-CoA sintetazo lacsA iz ''Thalassiosira pseudonana'', ki omogoči prenos CoA iz acetil-CoA na DHA. Aktivirana DHA se nato s pomočjo encimov vgradi v notranjo membrano. Za sproščanje DHA iz notranje membrane v periplazmo so uporabili človeško fosfolipazo iPLA2, ki so ji dodali CycA lokalizacijski signal za prehod v periplazmo. Transport DHA v zunajcelični prostor pa naj bi potekal na enak način kot transport AA.

=== Varnostni modul z dvema stikaloma ===

Prvo stikalo zagotavlja varnost probiotika v človeškem telesu. Z vklopom stikala pride do eliminacije probiotika iz organizma. Za stikalo so konstruirali aspirin-inducibilni ekspresijski sistem. Uporabili so promotor PsaI, ki zapisuje za zeta toksin in je odvisen od transkripcijskega faktorja SalR. Transkripcijski faktor SalR je zapisan pod konstitutivnem promotorjem PopaB in lahko obstaja v dveh oblikah: SalRr in SalRa. V obliki SalRr deluje kot represor, medtem ko v obliki SalRa s svojo vezavo aktivira transkripcijo toksina. SalR bo v odsotnosti aspirina deloval kot represor, ki bo zaviral izražanje zeta toksina. Ob dodatku aspirina bo SalR začel delovati kot aktivator in izražati se bo začel zeta toksin, ki bo inhibiral sintezo petidoglikanov in prišlo bo do lize celic.
Drugo stikalo preprečuje, da bi bakterije iz TheraPUFA preživele v okolju (zunaj gostitelja), saj prepreči replikacijo bakterij pri temperaturi nižji od 37 °C. Stikalo je uravnano s FitAB toksin-antitoksin sistemom, ki so ga združili z RNA termometrom CssA. CssA je RNA termometer, ki pri temperaturi nižji od 37 °C oblikuje lasnično zanko in blokira vezavo ribosoma na RBS. Toksin FitB in antitoksin FitA sta zapisana pod nativnim promotorjem. Pred zapis za antitoksin FitA so dodali še CssA, ki uravnava izražanje antitoksina. Pri temperaturi 37 °C se bosta izražala tako toksin FitB, kot antitoksin FitA, zato bo delovanje toksina inhibirano. Pri temperaturi nižji od 37 °C, pa bo izražanje antitoksina FitA ustavljeno zaradi tvorbe lasnične zanke CssA in toksin FitB bo aktiven.

=='''Optimizacija prvotnega modela'''==

Da bi lahko TheraPUFA uporabljali kot protivirusno učinkovino, bi morali model še prilagoditi:
• S pomočjo mestnospecifične mutageneze bi morali povečati občutljivost sintetičnega citokinskega receptorja.
• Povečati bi morali sintezo PUFA.
• Z uporabo posebnih gelov, ki se uporabljajo pri vnosu probiotika bi morali povečati obstojnost vnesenih bakterij v nosni votlini.

=='''Zaključek'''==

Predstavljen projekt TheraPUFA je delo študentov univerze William & Mary, ki so ga pripravili za tekmovanje iGEM 2020. Zaradi pandemije koronavirusa SARS-CoV-2 študentje niso imeli dostopa do laboratorija, zato so pripravili idejno zasnovo za nazalni probiotik, pri katerem bi v bakterije ''Neisseria cinerea'' vstavili vezje za sintezo PUFA in tako omogočili protivirusno delovanje in uravnavanje pretiranega imunskega odziva, ki je tudi posledica SARS-CoV-2. Idejno zasnovo so nato preverili z matematičnimi parametri, pridobljenimi iz literature. Model je nakazoval, da TheraPUFA ne bi bilo možno uporabljati kot protivirusno učinkovino, kljub temu so naknadno model optimizirali in tako oblikovali nazalni probiotik, ki bi prispeval k zmanjšanju virusne obremenitve.

=='''Viri in literatura'''==

[1] “Team:William and Mary - 2020.igem.org.” [Online]. Available: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary. [Accessed: 07-Apr-2021].

[2] C. Müller, M. Hardt, D. Schwudke, B. W. Neuman, S. Pleschka, and J. Ziebuhr, “Inhibition of cytosolic phospholipase A2α impairs an early step of coronavirus replication in cell culture,” J. Virol., vol. 92, no. 4, p. JVI.01463-17, Nov. 2017.

[3] A. Goc, “Polyunsaturated ω-3 fatty acids inhibit ACE2-controlled SARS-CoV-2 binding and cellular entry.”

[4] U. N. Das, “Can Bioactive Lipids Inactivate Coronavirus (COVID-19)?,” Arch. Med. Res., vol. 51, no. 3, pp. 282–286, Apr. 2020.

[5] U. N. Das, “Response to: Bioactive Lipids and Coronavirus (COVID-19)-further Discussion,” Archives of Medical Research, vol. 51, no. 5. Elsevier Inc., pp. 445–449, 01-Jul-2020.

[6] A. Kohn, J. Gitelman, and M. Inbar, “Unsaturated free fatty acids inactivate animal enveloped viruses,” Arch. Virol., vol. 66, no. 4, pp. 301–307, Dec. 1980.

[7] U. N. Das, “Arachidonic acid and other unsaturated fatty acids and some of their metabolites function as endogenous antimicrobial molecules: A review,” Journal of Advanced Research, vol. 11. Elsevier B.V., pp. 57–66, 01-May-2018.

[8] T. C. Aurand and J. C. March, “Development of a synthetic receptor protein for sensing inflammatory mediators interferon-γ and tumor necrosis factor-α,” Biotechnol. Bioeng., vol. 113, no. 3, pp. 492–500, Mar. 2016.

[9] J. Beld, E. C. Sonnenschein, C. R. Vickery, J. P. Noel, and M. D. Burkart, “The phosphopantetheinyl transferases: Catalysis of a post-translational modification crucial for life,” Nat. Prod. Rep., vol. 31, no. 1, pp. 61–108, Jan. 2014.

page discussion edit history move watch
Barbara Slapnik my talk my preferences my watchlist my contributions log out
navigation

TheraPUFA: nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem

2021-04-11T19:13:53Z

Barbara Slapnik: /* 4 moduli, ki sestavljajo TheraPUFA */

Therapufa [1] je iGEM-projekt iz leta 2020, ki je bil nagrajen s prvim mestom za najboljši terapevtski projekt. Avtorji projekta so študenti univerze William & Mary v Williamsburgu, Virginia.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary

Avtorica povzetka: Barbara Slapnik

=='''Uvod – Kaj je TheraPUFA?'''==

TheraPUFA je nazalni probiotik, ki omogoča sintezo polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA), s katerimi uravnava vnetje in deluje protivirusno.
Ideja projekta je posledica pandemije koronavirusa SARS-CoV-2, ki je pripomogla k hitrem razvoju cepiv, diagnostičnih orodij in zdravil, ki vključujejo protivirusne učinkovine.

=='''Polinenasičene maščobne kisline (PUFA)'''==

Polinenasičene maščobne kisline (PUFA) lahko delujejo kot endogene antibakterijske, antivirusne in antiparazitske spojine, poleg tega pa lahko preko svojih metabolitov regulirajo tudi procese vnetja. Inaktivirajo lahko viruse z lipidno ovojnico (npr. herpes, influenza, SARS-CoV-2), tako da povzročijo lizo celic oziroma puščanje membrane, inhibirajo proliferacijo različnih mikroorganizmov, preprečujejo preureditev lipidnega dvosloja in vplivajo na interakcijo med virusom in receptorjem [2]–[7]. Med PUFA uvrščamo arahidonsko kislino (AA) in dokozaheksaenojsko kislino (DHA), ki so jih uporabili pri načrtovanju nazalnega probiotika. AA lahko povzroči lizo lipidnih ovojnic virusa, njeni metaboliti pa učinkujejo provnetno in protivnetno. Obe uporabljeni PUFA pa zavirata replikacijo +RNA virusov, saj spremenita lipidno sestavo in tako virusom onemogočita preureditev membran in njihovo razmnoževanje. Za metabolite DHA so značilni le protivnetni učinki.

=='''Izbira bakterij'''==

Za izbiro probiotične šasije so iskali vrsto bakterij, ki bi izpolnjevala tri pogoje:
• bakterija mora biti naravno del nosno-žrelnega mikrobioma,
• ne sme povzročati bolezni ali povečati tveganje za razvoj bolezni v zdravih posameznikih,
• bakterija je že bila uporabljena kot nazalni probiotik.
Pri projektu so se odločili za bakterijo ''Neisseria cinerea'', gram negativno bakterijo, ki in jo najdemo v nazalni in oralni mikrobioti zdravih odraslih in otrok. ''N. cinerea'' je komenzalna bakterija, ki preprečuje rast patogenih bakterij, uvrščamo jo v 1. biološki varnostni razred, ne povzroča bolezni in ni znano, da bi sodelovala pri bolezni. Pri izbiri bakterije so morali upoštevati še kompatibilnost s predhodno izbranim citokinskim senzorjem, ki se uspešno izraža v gram negativnih bakterijah. Bakterije so razdelili v dve skupini in pripravili dve različni vezji. V prvo skupino bakterij so vstavili vezje, ki je omogočilo proizvodnjo AA, medtem ko je bila druga skupina bakterija prilagojena na proizvodnjo DHA. Uravnavanje sinteze ustrezne PUFA je zagotavljal citokinski senzor, ki se je odzval na vnetje v telesu. Obe skupini bakterij sta vsebovali še dve varnostni stikali, ki sta zagotovili varnost probiotika.

=='''Načrtovanje vezja'''==

Prva skupina bakterij je bila odgovorna za sintezo AA, njeno vezje je bilo sestavljeno iz promotor pspA, s katerim je bila pogojena sinteza represorja cI. Represor cI je s svojo vezavo na operator promotorja pLac inhibiral izražanje fosfolipaze cPLA2, ki je sodelovala pri transportu sintetizirane PUFA. AA sintaza je bila zapisana pod konstitutivnim Andersonovim promotorjem J23. V drugi skupini bakterij, je bilo vezje podobno, vendar sinteza ni bila uravnana s represorjem cI.

==''' Moduli, ki sestavljajo TheraPUFA'''==

=== Citokinski senzor ===

Pri projektu so želeli oblikovati senzor za zaznavanje IFN-γ in TNF-α, ki bi reguliral sintezo AA in DHA. V ta namen, so uporabili sintetični citokinski senzor, ki sta ga predhodno razvila raziskovalca Aurand in March [8]. Osnova tega senzorja je zunanji membranski porin A (OmpA) iz ''E. coli'', ki so mu zamenjali dve zunajcelični zanki z zunajceličnima zankama proteina OrpF. Z zamenjavo zank so omogočili zaznavanje IFN-γ in TNF-α.
Pri nizkih koncentracijah IFN-γ in TNF-α senzor ni aktiven. Transkripcijski faktor PspF, ki omogoči izražanje DHA sintaze, je inhibiran. Sinteza DHA ne poteka.
Ko so v okolici bakterije prisotne zadostne koncentracije IFN-γ in TNF-α, se citokinski senzor aktivira, signal se preko OmpA proteina prenese do membranskih proteinov PspB, PspC in PspA, kar povzroči spremembe interakcij med proteini in inhibicija transkripcijskega faktorja PspF je prekinjena. Aktiven transkripcijski faktor PspF se lahko veže na operatorsko regijo PspA promotorja in inducira izražanje DHA sintaze. V prvi skupini bakterij, ki so odgovorne za sintezo AA, transkripcijski faktor PspF aktivira izražanje represorja in transport AA je onemogočen. Ker le visoke koncentracije citokinov aktivirajo citokinski senzor, pride do preklopa med izločanjem AA in DHA le v primeru prekomernega imunskega odziva.

=== Sinteza polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA) ===

Za sintezo AA so uporabili zapis za PUFA sintazo iz ''Aureispira marina'', ki omogoča de novo sintezo AA. Za sintezo DHA pa so uporabili zapis za PUFA sintazo iz ''Scizochytrium'', ki omogoča de novo sintezo DHA.

=== Transport polinenasičenih maščobnih kislin ===

Pri oblikovanju sistema za transport PUFA so pri projektu izhajali iz gram negativne bakterije ''Rhodobacter sphaeroides'', ki lahko izloča dolge maščobne kisline v zunajcelični prostor. Sistem temelji na fosfolipazi, ki se nahaja v periplazmi in sprošča maščobne kisline iz fosfolipidov notranje membrane. Maščobne kisline se nato izločijo v zunajcelični prostor, po neznanem mehanizmu, ki ni odvisen od proteina Tol-C. Sistem za transport PUFA so prilagodili, tako da so izbrali acil-sintetazo in fosfolipazo, z večjo preferenco do PUFA. Izbrana acil-sintetaza omogoči, aktivacijo PUFA in sintezo fosfolipidov. Fosfolipaza je pomembna za sproščanje PUFA iz fosfolipidnega dvosloja v periplazmo.
Prvi korak pri proizvodnji in transportu AA je sinteza PUFA in vgradnja v notranjo celično membrano. Ker je vgradnja AA v fosfolipide značilna že v wt celicah, jim sistema ni bilo potrebno bistveno prilagajati. V drugem koraku je pomembna cPLA2, ki se s pomočjo CycA lokalizacijskega signala izloča v periplazmo in omogoči sproščanje AA iz notranje membrane v periplazemski prostor. V tretjem koraku gre za prehod AA iz periplazemskega v zunajcelični prostor. Ker je bakterijska membrana neprepustna za maščobne kisline in pasivna difuzija ni možna, so pri projektu predpostavili olajšan transport PUFA preko proteinskega transporterja. FadL je transporter dolgih maščobnih kislin, ki prenaša maščobne kisline v periplazmo. Predvidevali so, da mora obstajati protein podoben proteinu FadL, ki bi omogočil olajšan transport PUFA iz periplazme v zunajcelični prostor.
DHA se za razliko od AA v nativnih celicah akumulira v citoplazmi v obliki prostih maščobnih kislin. Za sintezo DHA so pri projektu uporabili PUFA sintazo iz ''Schizochytrium''. Poleg tega so dodali še zapis za fosfopantetinil transferazo iz ''Nostoc'' cianobakterij, ki postranslacijsko modificira DHA sintazo in je nujna za sintezo DHA [9]. Za vgradnjo DHA v membrano, se mora DHA še aktivirati z dodatkom CoA. Za aktivacijo so v bakterije vnesli zapis za acil-CoA sintetazo lacsA iz ''Thalassiosira pseudonana'', ki omogoči prenos CoA iz acetil-CoA na DHA. Aktivirana DHA se nato s pomočjo encimov vgradi v notranjo membrano. Za sproščanje DHA iz notranje membrane v periplazmo so uporabili človeško fosfolipazo iPLA2, ki so ji dodali CycA lokalizacijski signal za prehod v periplazmo. Transport DHA v zunajcelični prostor pa naj bi potekal na enak način kot transport AA.

=== Varnostni modul z dvema stikaloma ===

Prvo stikalo zagotavlja varnost probiotika v človeškem telesu. Z vklopom stikala pride do eliminacije probiotika iz organizma. Za stikalo so konstruirali aspirin-inducibilni ekspresijski sistem. Uporabili so promotor PsaI, ki zapisuje za zeta toksin in je odvisen od transkripcijskega faktorja SalR. Transkripcijski faktor SalR je zapisan pod konstitutivnem promotorjem PopaB in lahko obstaja v dveh oblikah: SalRr in SalRa. V obliki SalRr deluje kot represor, medtem ko v obliki SalRa s svojo vezavo aktivira transkripcijo toksina. SalR bo v odsotnosti aspirina deloval kot represor, ki bo zaviral izražanje zeta toksina. Ob dodatku aspirina bo SalR začel delovati kot aktivator in izražati se bo začel zeta toksin, ki bo inhibiral sintezo petidoglikanov in prišlo bo do lize celic.
Drugo stikalo preprečuje, da bi bakterije iz TheraPUFA preživele v okolju (zunaj gostitelja), saj prepreči replikacijo bakterij pri temperaturi nižji od 37 °C. Stikalo je uravnano s FitAB toksin-antitoksin sistemom, ki so ga združili z RNA termometrom CssA. CssA je RNA termometer, ki pri temperaturi nižji od 37 °C oblikuje lasnično zanko in blokira vezavo ribosoma na RBS. Toksin FitB in antitoksin FitA sta zapisana pod nativnim promotorjem. Pred zapis za antitoksin FitA so dodali še CssA, ki uravnava izražanje antitoksina. Pri temperaturi 37 °C se bosta izražala tako toksin FitB, kot antitoksin FitA, zato bo delovanje toksina inhibirano. Pri temperaturi nižji od 37 °C, pa bo izražanje antitoksina FitA ustavljeno zaradi tvorbe lasnične zanke CssA in toksin FitB bo aktiven.

=='''Optimizacija prvotnega modela'''==

Da bi lahko TheraPUFA uporabljali kot protivirusno učinkovino, bi morali model še prilagoditi:
• S pomočjo mestnospecifične mutageneze bi morali povečati občutljivost sintetičnega citokinskega receptorja.
• Povečati bi morali sintezo PUFA.
• Z uporabo posebnih gelov, ki se uporabljajo pri vnosu probiotika bi morali povečati obstojnost vnesenih bakterij v nosni votlini.

=='''Zaključek'''==

Predstavljen projekt TheraPUFA je delo študentov univerze William & Mary, ki so ga pripravili za tekmovanje iGEM 2020. Zaradi pandemije koronavirusa SARS-CoV-2 študentje niso imeli dostopa do laboratorija, zato so pripravili idejno zasnovo za nazalni probiotik, pri katerem bi v bakterije ''Neisseria cinerea'' vstavili vezje za sintezo PUFA in tako omogočili protivirusno delovanje in uravnavanje pretiranega imunskega odziva, ki je tudi posledica SARS-CoV-2. Idejno zasnovo so nato preverili z matematičnimi parametri, pridobljenimi iz literature. Model je nakazoval, da TheraPUFA ne bi bilo možno uporabljati kot protivirusno učinkovino, kljub temu so naknadno model optimizirali in tako oblikovali nazalni probiotik, ki bi prispeval k zmanjšanju virusne obremenitve.

=='''Viri in literatura'''==

[1] “Team:William and Mary - 2020.igem.org.” [Online]. Available: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary. [Accessed: 07-Apr-2021].
[2] C. Müller, M. Hardt, D. Schwudke, B. W. Neuman, S. Pleschka, and J. Ziebuhr, “Inhibition of cytosolic phospholipase A2α impairs an early step of coronavirus replication in cell culture,” J. Virol., vol. 92, no. 4, p. JVI.01463-17, Nov. 2017.
[3] A. Goc, “Polyunsaturated ω-3 fatty acids inhibit ACE2-controlled SARS-CoV-2 binding and cellular entry.”
[4] U. N. Das, “Can Bioactive Lipids Inactivate Coronavirus (COVID-19)?,” Arch. Med. Res., vol. 51, no. 3, pp. 282–286, Apr. 2020.
[5] U. N. Das, “Response to: Bioactive Lipids and Coronavirus (COVID-19)-further Discussion,” Archives of Medical Research, vol. 51, no. 5. Elsevier Inc., pp. 445–449, 01-Jul-2020.
[6] A. Kohn, J. Gitelman, and M. Inbar, “Unsaturated free fatty acids inactivate animal enveloped viruses,” Arch. Virol., vol. 66, no. 4, pp. 301–307, Dec. 1980.
[7] U. N. Das, “Arachidonic acid and other unsaturated fatty acids and some of their metabolites function as endogenous antimicrobial molecules: A review,” Journal of Advanced Research, vol. 11. Elsevier B.V., pp. 57–66, 01-May-2018.
[8] T. C. Aurand and J. C. March, “Development of a synthetic receptor protein for sensing inflammatory mediators interferon-γ and tumor necrosis factor-α,” Biotechnol. Bioeng., vol. 113, no. 3, pp. 492–500, Mar. 2016.
[9] J. Beld, E. C. Sonnenschein, C. R. Vickery, J. P. Noel, and M. D. Burkart, “The phosphopantetheinyl transferases: Catalysis of a post-translational modification crucial for life,” Nat. Prod. Rep., vol. 31, no. 1, pp. 61–108, Jan. 2014.

page discussion edit history move watch
Barbara Slapnik my talk my preferences my watchlist my contributions log out
navigation

TheraPUFA: nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem

2021-04-11T19:12:39Z

Barbara Slapnik:

Therapufa [1] je iGEM-projekt iz leta 2020, ki je bil nagrajen s prvim mestom za najboljši terapevtski projekt. Avtorji projekta so študenti univerze William & Mary v Williamsburgu, Virginia.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary

Avtorica povzetka: Barbara Slapnik

=='''Uvod – Kaj je TheraPUFA?'''==

TheraPUFA je nazalni probiotik, ki omogoča sintezo polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA), s katerimi uravnava vnetje in deluje protivirusno.
Ideja projekta je posledica pandemije koronavirusa SARS-CoV-2, ki je pripomogla k hitrem razvoju cepiv, diagnostičnih orodij in zdravil, ki vključujejo protivirusne učinkovine.

=='''Polinenasičene maščobne kisline (PUFA)'''==

Polinenasičene maščobne kisline (PUFA) lahko delujejo kot endogene antibakterijske, antivirusne in antiparazitske spojine, poleg tega pa lahko preko svojih metabolitov regulirajo tudi procese vnetja. Inaktivirajo lahko viruse z lipidno ovojnico (npr. herpes, influenza, SARS-CoV-2), tako da povzročijo lizo celic oziroma puščanje membrane, inhibirajo proliferacijo različnih mikroorganizmov, preprečujejo preureditev lipidnega dvosloja in vplivajo na interakcijo med virusom in receptorjem [2]–[7]. Med PUFA uvrščamo arahidonsko kislino (AA) in dokozaheksaenojsko kislino (DHA), ki so jih uporabili pri načrtovanju nazalnega probiotika. AA lahko povzroči lizo lipidnih ovojnic virusa, njeni metaboliti pa učinkujejo provnetno in protivnetno. Obe uporabljeni PUFA pa zavirata replikacijo +RNA virusov, saj spremenita lipidno sestavo in tako virusom onemogočita preureditev membran in njihovo razmnoževanje. Za metabolite DHA so značilni le protivnetni učinki.

=='''Izbira bakterij'''==

Za izbiro probiotične šasije so iskali vrsto bakterij, ki bi izpolnjevala tri pogoje:
• bakterija mora biti naravno del nosno-žrelnega mikrobioma,
• ne sme povzročati bolezni ali povečati tveganje za razvoj bolezni v zdravih posameznikih,
• bakterija je že bila uporabljena kot nazalni probiotik.
Pri projektu so se odločili za bakterijo ''Neisseria cinerea'', gram negativno bakterijo, ki in jo najdemo v nazalni in oralni mikrobioti zdravih odraslih in otrok. ''N. cinerea'' je komenzalna bakterija, ki preprečuje rast patogenih bakterij, uvrščamo jo v 1. biološki varnostni razred, ne povzroča bolezni in ni znano, da bi sodelovala pri bolezni. Pri izbiri bakterije so morali upoštevati še kompatibilnost s predhodno izbranim citokinskim senzorjem, ki se uspešno izraža v gram negativnih bakterijah. Bakterije so razdelili v dve skupini in pripravili dve različni vezji. V prvo skupino bakterij so vstavili vezje, ki je omogočilo proizvodnjo AA, medtem ko je bila druga skupina bakterija prilagojena na proizvodnjo DHA. Uravnavanje sinteze ustrezne PUFA je zagotavljal citokinski senzor, ki se je odzval na vnetje v telesu. Obe skupini bakterij sta vsebovali še dve varnostni stikali, ki sta zagotovili varnost probiotika.

=='''Načrtovanje vezja'''==

Prva skupina bakterij je bila odgovorna za sintezo AA, njeno vezje je bilo sestavljeno iz promotor pspA, s katerim je bila pogojena sinteza represorja cI. Represor cI je s svojo vezavo na operator promotorja pLac inhibiral izražanje fosfolipaze cPLA2, ki je sodelovala pri transportu sintetizirane PUFA. AA sintaza je bila zapisana pod konstitutivnim Andersonovim promotorjem J23. V drugi skupini bakterij, je bilo vezje podobno, vendar sinteza ni bila uravnana s represorjem cI.

=='''4 moduli, ki sestavljajo TheraPUFA'''==

=== Citokinski senzor ===

Pri projektu so želeli oblikovati senzor za zaznavanje IFN-γ in TNF-α, ki bi reguliral sintezo AA in DHA. V ta namen, so uporabili sintetični citokinski senzor, ki sta ga predhodno razvila raziskovalca Aurand in March [8]. Osnova tega senzorja je zunanji membranski porin A (OmpA) iz ''E. coli'', ki so mu zamenjali dve zunajcelični zanki z zunajceličnima zankama proteina OrpF. Z zamenjavo zank so omogočili zaznavanje IFN-γ in TNF-α.
Pri nizkih koncentracijah IFN-γ in TNF-α senzor ni aktiven. Transkripcijski faktor PspF, ki omogoči izražanje DHA sintaze, je inhibiran. Sinteza DHA ne poteka.
Ko so v okolici bakterije prisotne zadostne koncentracije IFN-γ in TNF-α, se citokinski senzor aktivira, signal se preko OmpA proteina prenese do membranskih proteinov PspB, PspC in PspA, kar povzroči spremembe interakcij med proteini in inhibicija transkripcijskega faktorja PspF je prekinjena. Aktiven transkripcijski faktor PspF se lahko veže na operatorsko regijo PspA promotorja in inducira izražanje DHA sintaze. V prvi skupini bakterij, ki so odgovorne za sintezo AA, transkripcijski faktor PspF aktivira izražanje represorja in transport AA je onemogočen. Ker le visoke koncentracije citokinov aktivirajo citokinski senzor, pride do preklopa med izločanjem AA in DHA le v primeru prekomernega imunskega odziva.

=== Sinteza polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA) ===

Za sintezo AA so uporabili zapis za PUFA sintazo iz ''Aureispira marina'', ki omogoča de novo sintezo AA. Za sintezo DHA pa so uporabili zapis za PUFA sintazo iz ''Scizochytrium'', ki omogoča de novo sintezo DHA.

=== Transport polinenasičenih maščobnih kislin ===

Pri oblikovanju sistema za transport PUFA so pri projektu izhajali iz gram negativne bakterije ''Rhodobacter sphaeroides'', ki lahko izloča dolge maščobne kisline v zunajcelični prostor. Sistem temelji na fosfolipazi, ki se nahaja v periplazmi in sprošča maščobne kisline iz fosfolipidov notranje membrane. Maščobne kisline se nato izločijo v zunajcelični prostor, po neznanem mehanizmu, ki ni odvisen od proteina Tol-C. Sistem za transport PUFA so prilagodili, tako da so izbrali acil-sintetazo in fosfolipazo, z večjo preferenco do PUFA. Izbrana acil-sintetaza omogoči, aktivacijo PUFA in sintezo fosfolipidov. Fosfolipaza je pomembna za sproščanje PUFA iz fosfolipidnega dvosloja v periplazmo.
Prvi korak pri proizvodnji in transportu AA je sinteza PUFA in vgradnja v notranjo celično membrano. Ker je vgradnja AA v fosfolipide značilna že v wt celicah, jim sistema ni bilo potrebno bistveno prilagajati. V drugem koraku je pomembna cPLA2, ki se s pomočjo CycA lokalizacijskega signala izloča v periplazmo in omogoči sproščanje AA iz notranje membrane v periplazemski prostor. V tretjem koraku gre za prehod AA iz periplazemskega v zunajcelični prostor. Ker je bakterijska membrana neprepustna za maščobne kisline in pasivna difuzija ni možna, so pri projektu predpostavili olajšan transport PUFA preko proteinskega transporterja. FadL je transporter dolgih maščobnih kislin, ki prenaša maščobne kisline v periplazmo. Predvidevali so, da mora obstajati protein podoben proteinu FadL, ki bi omogočil olajšan transport PUFA iz periplazme v zunajcelični prostor.
DHA se za razliko od AA v nativnih celicah akumulira v citoplazmi v obliki prostih maščobnih kislin. Za sintezo DHA so pri projektu uporabili PUFA sintazo iz ''Schizochytrium''. Poleg tega so dodali še zapis za fosfopantetinil transferazo iz ''Nostoc'' cianobakterij, ki postranslacijsko modificira DHA sintazo in je nujna za sintezo DHA [9]. Za vgradnjo DHA v membrano, se mora DHA še aktivirati z dodatkom CoA. Za aktivacijo so v bakterije vnesli zapis za acil-CoA sintetazo lacsA iz ''Thalassiosira pseudonana'', ki omogoči prenos CoA iz acetil-CoA na DHA. Aktivirana DHA se nato s pomočjo encimov vgradi v notranjo membrano. Za sproščanje DHA iz notranje membrane v periplazmo so uporabili človeško fosfolipazo iPLA2, ki so ji dodali CycA lokalizacijski signal za prehod v periplazmo. Transport DHA v zunajcelični prostor pa naj bi potekal na enak način kot transport AA.

=== Varnostni modul z dvema stikaloma ===

Prvo stikalo zagotavlja varnost probiotika v človeškem telesu. Z vklopom stikala pride do eliminacije probiotika iz organizma. Za stikalo so konstruirali aspirin-inducibilni ekspresijski sistem. Uporabili so promotor PsaI, ki zapisuje za zeta toksin in je odvisen od transkripcijskega faktorja SalR. Transkripcijski faktor SalR je zapisan pod konstitutivnem promotorjem PopaB in lahko obstaja v dveh oblikah: SalRr in SalRa. V obliki SalRr deluje kot represor, medtem ko v obliki SalRa s svojo vezavo aktivira transkripcijo toksina. SalR bo v odsotnosti aspirina deloval kot represor, ki bo zaviral izražanje zeta toksina. Ob dodatku aspirina bo SalR začel delovati kot aktivator in izražati se bo začel zeta toksin, ki bo inhibiral sintezo petidoglikanov in prišlo bo do lize celic.
Drugo stikalo preprečuje, da bi bakterije iz TheraPUFA preživele v okolju (zunaj gostitelja), saj prepreči replikacijo bakterij pri temperaturi nižji od 37 °C. Stikalo je uravnano s FitAB toksin-antitoksin sistemom, ki so ga združili z RNA termometrom CssA. CssA je RNA termometer, ki pri temperaturi nižji od 37 °C oblikuje lasnično zanko in blokira vezavo ribosoma na RBS. Toksin FitB in antitoksin FitA sta zapisana pod nativnim promotorjem. Pred zapis za antitoksin FitA so dodali še CssA, ki uravnava izražanje antitoksina. Pri temperaturi 37 °C se bosta izražala tako toksin FitB, kot antitoksin FitA, zato bo delovanje toksina inhibirano. Pri temperaturi nižji od 37 °C, pa bo izražanje antitoksina FitA ustavljeno zaradi tvorbe lasnične zanke CssA in toksin FitB bo aktiven.

=='''Optimizacija prvotnega modela'''==

Da bi lahko TheraPUFA uporabljali kot protivirusno učinkovino, bi morali model še prilagoditi:
• S pomočjo mestnospecifične mutageneze bi morali povečati občutljivost sintetičnega citokinskega receptorja.
• Povečati bi morali sintezo PUFA.
• Z uporabo posebnih gelov, ki se uporabljajo pri vnosu probiotika bi morali povečati obstojnost vnesenih bakterij v nosni votlini.

=='''Zaključek'''==

Predstavljen projekt TheraPUFA je delo študentov univerze William & Mary, ki so ga pripravili za tekmovanje iGEM 2020. Zaradi pandemije koronavirusa SARS-CoV-2 študentje niso imeli dostopa do laboratorija, zato so pripravili idejno zasnovo za nazalni probiotik, pri katerem bi v bakterije ''Neisseria cinerea'' vstavili vezje za sintezo PUFA in tako omogočili protivirusno delovanje in uravnavanje pretiranega imunskega odziva, ki je tudi posledica SARS-CoV-2. Idejno zasnovo so nato preverili z matematičnimi parametri, pridobljenimi iz literature. Model je nakazoval, da TheraPUFA ne bi bilo možno uporabljati kot protivirusno učinkovino, kljub temu so naknadno model optimizirali in tako oblikovali nazalni probiotik, ki bi prispeval k zmanjšanju virusne obremenitve.

=='''Viri in literatura'''==

[1] “Team:William and Mary - 2020.igem.org.” [Online]. Available: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary. [Accessed: 07-Apr-2021].
[2] C. Müller, M. Hardt, D. Schwudke, B. W. Neuman, S. Pleschka, and J. Ziebuhr, “Inhibition of cytosolic phospholipase A2α impairs an early step of coronavirus replication in cell culture,” J. Virol., vol. 92, no. 4, p. JVI.01463-17, Nov. 2017.
[3] A. Goc, “Polyunsaturated ω-3 fatty acids inhibit ACE2-controlled SARS-CoV-2 binding and cellular entry.”
[4] U. N. Das, “Can Bioactive Lipids Inactivate Coronavirus (COVID-19)?,” Arch. Med. Res., vol. 51, no. 3, pp. 282–286, Apr. 2020.
[5] U. N. Das, “Response to: Bioactive Lipids and Coronavirus (COVID-19)-further Discussion,” Archives of Medical Research, vol. 51, no. 5. Elsevier Inc., pp. 445–449, 01-Jul-2020.
[6] A. Kohn, J. Gitelman, and M. Inbar, “Unsaturated free fatty acids inactivate animal enveloped viruses,” Arch. Virol., vol. 66, no. 4, pp. 301–307, Dec. 1980.
[7] U. N. Das, “Arachidonic acid and other unsaturated fatty acids and some of their metabolites function as endogenous antimicrobial molecules: A review,” Journal of Advanced Research, vol. 11. Elsevier B.V., pp. 57–66, 01-May-2018.
[8] T. C. Aurand and J. C. March, “Development of a synthetic receptor protein for sensing inflammatory mediators interferon-γ and tumor necrosis factor-α,” Biotechnol. Bioeng., vol. 113, no. 3, pp. 492–500, Mar. 2016.
[9] J. Beld, E. C. Sonnenschein, C. R. Vickery, J. P. Noel, and M. D. Burkart, “The phosphopantetheinyl transferases: Catalysis of a post-translational modification crucial for life,” Nat. Prod. Rep., vol. 31, no. 1, pp. 61–108, Jan. 2014.

page discussion edit history move watch
Barbara Slapnik my talk my preferences my watchlist my contributions log out
navigation

TheraPUFA: nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem

2021-04-11T19:01:36Z

Barbara Slapnik:

Therapufa [1] je iGEM-projekt iz leta 2020, ki je bil nagrajen s prvim mestom za najboljši terapevtski projekt. Avtorji projekta so študenti univerze William & Mary v Williamsburgu, Virginia.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary

Avtorica povzetka: Barbara Slapnik

Contents [hide]
1 Uvod-Kaj je TheraPUFA
2 Polinenasičene maščobne kisline (PUFA)
3 Izbira bakterij
4 Načrtovanje vezja
5 4 moduli, ki sestavljajo TheraPUFA
5.1.Citokinski senzor
5.2.Sinteza polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA)
5.3.Transport polinenasičenih maščobnih kislin
5.4.Varnostni modul z dvema stikaloma
6 Optimizacija prvotnega modela
7 Zaključek
7 Viri in literatura

=='''Uvod – Kaj je TheraPUFA?'''==

TheraPUFA je nazalni probiotik, ki omogoča sintezo polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA), s katerimi uravnava vnetje in deluje protivirusno.
Ideja projekta je posledica pandemije koronavirusa SARS-CoV-2, ki je pripomogla k hitrem razvoju cepiv, diagnostičnih orodij in zdravil, ki vključujejo protivirusne učinkovine.

[edit]Polinenasičene maščobne kisline (PUFA)
Polinenasičene maščobne kisline (PUFA) lahko delujejo kot endogene antibakterijske, antivirusne in antiparazitske spojine, poleg tega pa lahko preko svojih metabolitov regulirajo tudi procese vnetja. Inaktivirajo lahko viruse z lipidno ovojnico (npr. herpes, influenza, SARS-CoV-2), tako da povzročijo lizo celic oziroma puščanje membrane, inhibirajo proliferacijo različnih mikroorganizmov, preprečujejo preureditev lipidnega dvosloja in vplivajo na interakcijo med virusom in receptorjem [2]–[7]. Med PUFA uvrščamo arahidonsko kislino (AA) in dokozaheksaenojsko kislino (DHA), ki so jih uporabili pri načrtovanju nazalnega probiotika. AA lahko povzroči lizo lipidnih ovojnic virusa, njeni metaboliti pa učinkujejo provnetno in protivnetno. Obe uporabljeni PUFA pa zavirata replikacijo +RNA virusov, saj spremenita lipidno sestavo in tako virusom onemogočita preureditev membran in njihovo razmnoževanje. Za metabolite DHA so značilni le protivnetni učinki.

[edit]Izbira bakterij
Za izbiro probiotične šasije so iskali vrsto bakterij, ki bi izpolnjevala tri pogoje:
• bakterija mora biti naravno del nosno-žrelnega mikrobioma,
• ne sme povzročati bolezni ali povečati tveganje za razvoj bolezni v zdravih posameznikih,
• bakterija je že bila uporabljena kot nazalni probiotik.
Pri projektu so se odločili za bakterijo Neisseria cinerea, gram negativno bakterijo, ki in jo najdemo v nazalni in oralni mikrobioti zdravih odraslih in otrok. N. cinerea je komenzalna bakterija, ki preprečuje rast patogenih bakterij, uvrščamo jo v 1. biološki varnostni razred, ne povzroča bolezni in ni znano, da bi sodelovala pri bolezni. Pri izbiri bakterije so morali upoštevati še kompatibilnost s predhodno izbranim citokinskim senzorjem, ki se uspešno izraža v gram negativnih bakterijah. Bakterije so razdelili v dve skupini in pripravili dve različni vezji. V prvo skupino bakterij so vstavili vezje, ki je omogočilo proizvodnjo AA, medtem ko je bila druga skupina bakterija prilagojena na proizvodnjo DHA. Uravnavanje sinteze ustrezne PUFA je zagotavljal citokinski senzor, ki se je odzval na vnetje v telesu. Obe skupini bakterij sta vsebovali še dve varnostni stikali, ki sta zagotovili varnost probiotika.

[edit]Načrtovanje vezja
Prva skupina bakterij je bila odgovorna za sintezo AA, njeno vezje je bilo sestavljeno iz promotor pspA, s katerim je bila pogojena sinteza represorja cI. Represor cI je s svojo vezavo na operator promotorja pLac inhibiral izražanje fosfolipaze cPLA2, ki je sodelovala pri transportu sintetizirane PUFA. AA sintaza je bila zapisana pod konstitutivnim Andersonovim promotorjem J23. V drugi skupini bakterij, je bilo vezje podobno, vendar sinteza ni bila uravnana s represorjem cI.

[edit]4 moduli, ki sestavljajo TheraPUFA

[edit]Citokinski senzor
Pri projektu so želeli oblikovati senzor za zaznavanje IFN-γ in TNF-α, ki bi reguliral sintezo AA in DHA. V ta namen, so uporabili sintetični citokinski senzor, ki sta ga predhodno razvila raziskovalca Aurand in March [8]. Osnova tega senzorja je zunanji membranski porin A (OmpA) iz E.coli, ki so mu zamenjali dve zunajcelični zanki z zunajceličnima zankama proteina OrpF. Z zamenjavo zank so omogočili zaznavanje IFN-γ in TNF-α.
Pri nizkih koncentracijah IFN-γ in TNF-α senzor ni aktiven. Transkripcijski faktor PspF, ki omogoči izražanje DHA sintaze, je inhibiran. Sinteza DHA ne poteka.
Ko so v okolici bakterije prisotne zadostne koncentracije IFN-γ in TNF-α, se citokinski senzor aktivira, signal se preko OmpA proteina prenese do membranskih proteinov PspB, PspC in PspA, kar povzroči spremembe interakcij med proteini in inhibicija transkripcijskega faktorja PspF je prekinjena. Aktiven transkripcijski faktor PspF se lahko veže na operatorsko regijo PspA promotorja in inducira izražanje DHA sintaze. V prvi skupini bakterij, ki so odgovorne za sintezo AA, transkripcijski faktor PspF aktivira izražanje represorja in transport AA je onemogočen. Ker le visoke koncentracije citokinov aktivirajo citokinski senzor, pride do preklopa med izločanjem AA in DHA le v primeru prekomernega imunskega odziva.

[edit]Sinteza polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA)
Za sintezo AA so uporabili zapis za PUFA sintazo iz Aureispira marina, ki omogoča de novo sintezo AA. Za sintezo DHA pa so uporabili zapis za PUFA sintazo iz Scizochytrium, ki omogoča de novo sintezo DHA.

[edit]Transport polinenasičenih maščobnih kislin
Pri oblikovanju sistema za transport PUFA so pri projektu izhajali iz gram negativne bakterije Rhodobacter sphaeroides, ki lahko izloča dolge maščobne kisline v zunajcelični prostor. Sistem temelji na fosfolipazi, ki se nahaja v periplazmi in sprošča maščobne kisline iz fosfolipidov notranje membrane. Maščobne kisline se nato izločijo v zunajcelični prostor, po neznanem mehanizmu, ki ni odvisen od proteina Tol-C. Sistem za transport PUFA so prilagodili, tako da so izbrali acil-sintetazo in fosfolipazo, z večjo preferenco do PUFA. Izbrana acil-sintetaza omogoči, aktivacijo PUFA in sintezo fosfolipidov. Fosfolipaza je pomembna za sproščanje PUFA iz fosfolipidnega dvosloja v periplazmo.
Prvi korak pri proizvodnji in transportu AA je sinteza PUFA in vgradnja v notranjo celično membrano. Ker je vgradnja AA v fosfolipide značilna že v wt celicah, jim sistema ni bilo potrebno bistveno prilagajati. V drugem koraku je pomembna cPLA2, ki se s pomočjo CycA lokalizacijskega signala izloča v periplazmo in omogoči sproščanje AA iz notranje membrane v periplazemski prostor. V tretjem koraku gre za prehod AA iz periplazemskega v zunajcelični prostor. Ker je bakterijska membrana neprepustna za maščobne kisline in pasivna difuzija ni možna, so pri projektu predpostavili olajšan transport PUFA preko proteinskega transporterja. FadL je transporter dolgih maščobnih kislin, ki prenaša maščobne kisline v periplazmo. Predvidevali so, da mora obstajati protein podoben proteinu FadL, ki bi omogočil olajšan transport PUFA iz periplazme v zunajcelični prostor.
DHA se za razliko od AA v nativnih celicah akumulira v citoplazmi v obliki prostih maščobnih kislin. Za sintezo DHA so pri projektu uporabili PUFA sintazo iz Schizochytrium. Poleg tega so dodali še zapis za fosfopantetinil transferazo iz Nostoc cianobakterij, ki postranslacijsko modificira DHA sintazo in je nujna za sintezo DHA [9]. Za vgradnjo DHA v membrano, se mora DHA še aktivirati z dodatkom CoA. Za aktivacijo so v bakterije vnesli zapis za acil-CoA sintetazo lacsA iz Thalassiosira pseudonana, ki omogoči prenos CoA iz acetil-CoA na DHA. Aktivirana DHA se nato s pomočjo encimov vgradi v notranjo membrano. Za sproščanje DHA iz notranje membrane v periplazmo so uporabili človeško fosfolipazo iPLA2, ki so ji dodali CycA lokalizacijski signal za prehod v periplazmo. Transport DHA v zunajcelični prostor pa naj bi potekal na enak način kot transport AA.

[edit]Varnostni modul z dvema stikaloma
Prvo stikalo zagotavlja varnost probiotika v človeškem telesu. Z vklopom stikala pride do eliminacije probiotika iz organizma. Za stikalo so konstruirali aspirin-inducibilni ekspresijski sistem. Uporabili so promotor PsaI, ki zapisuje za zeta toksin in je odvisen od transkripcijskega faktorja SalR. Transkripcijski faktor SalR je zapisan pod konstitutivnem promotorjem PopaB in lahko obstaja v dveh oblikah: SalRr in SalRa. V obliki SalRr deluje kot represor, medtem ko v obliki SalRa s svojo vezavo aktivira transkripcijo toksina. SalR bo v odsotnosti aspirina deloval kot represor, ki bo zaviral izražanje zeta toksina. Ob dodatku aspirina bo SalR začel delovati kot aktivator in izražati se bo začel zeta toksin, ki bo inhibiral sintezo petidoglikanov in prišlo bo do lize celic.
Drugo stikalo preprečuje, da bi bakterije iz TheraPUFA preživele v okolju (zunaj gostitelja), saj prepreči replikacijo bakterij pri temperaturi nižji od 37 °C. Stikalo je uravnano s FitAB toksin-antitoksin sistemom, ki so ga združili z RNA termometrom CssA. CssA je RNA termometer, ki pri temperaturi nižji od 37 °C oblikuje lasnično zanko in blokira vezavo ribosoma na RBS. Toksin FitB in antitoksin FitA sta zapisana pod nativnim promotorjem. Pred zapis za antitoksin FitA so dodali še CssA, ki uravnava izražanje antitoksina. Pri temperaturi 37 °C se bosta izražala tako toksin FitB, kot antitoksin FitA, zato bo delovanje toksina inhibirano. Pri temperaturi nižji od 37 °C, pa bo izražanje antitoksina FitA ustavljeno zaradi tvorbe lasnične zanke CssA in toksin FitB bo aktiven.

[edit]Optimizacija prvotnega modela
Da bi lahko TheraPUFA uporabljali kot protivirusno učinkovino, bi morali model še prilagoditi:
• S pomočjo mestnospecifične mutageneze bi morali povečati občutljivost sintetičnega citokinskega receptorja.
• Povečati bi morali sintezo PUFA.
• Z uporabo posebnih gelov, ki se uporabljajo pri vnosu probiotika bi morali povečati obstojnost vnesenih bakterij v nosni votlini.

[edit]Zaključek
Predstavljen projekt TheraPUFA je delo študentov univerze William & Mary, ki so ga pripravili za tekmovanje iGEM 2020. Zaradi pandemije koronavirusa SARS-CoV-2 študentje niso imeli dostopa do laboratorija, zato so pripravili idejno zasnovo za nazalni probiotik, pri katerem bi v bakterije Neisseria cinerea vstavili vezje za sintezo PUFA in tako omogočili protivirusno delovanje in uravnavanje pretiranega imunskega odziva, ki je tudi posledica SARS-CoV-2. Idejno zasnovo so nato preverili z matematičnimi parametri, pridobljenimi iz literature. Model je nakazoval, da TheraPUFA ne bi bilo možno uporabljati kot protivirusno učinkovino, kljub temu so naknadno model optimizirali in tako oblikovali nazalni probiotik, ki bi prispeval k zmanjšanju virusne obremenitve.

[edit]Viri in literatura
[1] “Team:William and Mary - 2020.igem.org.” [Online]. Available: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary. [Accessed: 07-Apr-2021].
[2] C. Müller, M. Hardt, D. Schwudke, B. W. Neuman, S. Pleschka, and J. Ziebuhr, “Inhibition of cytosolic phospholipase A2α impairs an early step of coronavirus replication in cell culture,” J. Virol., vol. 92, no. 4, p. JVI.01463-17, Nov. 2017.
[3] A. Goc, “Polyunsaturated ω-3 fatty acids inhibit ACE2-controlled SARS-CoV-2 binding and cellular entry.”
[4] U. N. Das, “Can Bioactive Lipids Inactivate Coronavirus (COVID-19)?,” Arch. Med. Res., vol. 51, no. 3, pp. 282–286, Apr. 2020.
[5] U. N. Das, “Response to: Bioactive Lipids and Coronavirus (COVID-19)-further Discussion,” Archives of Medical Research, vol. 51, no. 5. Elsevier Inc., pp. 445–449, 01-Jul-2020.
[6] A. Kohn, J. Gitelman, and M. Inbar, “Unsaturated free fatty acids inactivate animal enveloped viruses,” Arch. Virol., vol. 66, no. 4, pp. 301–307, Dec. 1980.
[7] U. N. Das, “Arachidonic acid and other unsaturated fatty acids and some of their metabolites function as endogenous antimicrobial molecules: A review,” Journal of Advanced Research, vol. 11. Elsevier B.V., pp. 57–66, 01-May-2018.
[8] T. C. Aurand and J. C. March, “Development of a synthetic receptor protein for sensing inflammatory mediators interferon-γ and tumor necrosis factor-α,” Biotechnol. Bioeng., vol. 113, no. 3, pp. 492–500, Mar. 2016.
[9] J. Beld, E. C. Sonnenschein, C. R. Vickery, J. P. Noel, and M. D. Burkart, “The phosphopantetheinyl transferases: Catalysis of a post-translational modification crucial for life,” Nat. Prod. Rep., vol. 31, no. 1, pp. 61–108, Jan. 2014.

page discussion edit history move watch
Barbara Slapnik my talk my preferences my watchlist my contributions log out
navigation

TheraPUFA: nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem

2021-04-11T18:58:57Z

Barbara Slapnik: New page: Therapufa [1] je iGEM-projekt iz leta 2020, ki je bil nagrajen s prvim mestom za najboljši terapevtski projekt. Avtorji projekta so študenti univerze William & Mary v Williamsburgu, Vir...

Therapufa [1] je iGEM-projekt iz leta 2020, ki je bil nagrajen s prvim mestom za najboljši terapevtski projekt. Avtorji projekta so študenti univerze William & Mary v Williamsburgu, Virginia.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary

Avtorica povzetka: Barbara Slapnik

Contents [hide]
1 Uvod-Kaj je TheraPUFA
2 Polinenasičene maščobne kisline (PUFA)
3 Izbira bakterij
4 Načrtovanje vezja
5 4 moduli, ki sestavljajo TheraPUFA
5.1.Citokinski senzor
5.2.Sinteza polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA)
5.3.Transport polinenasičenih maščobnih kislin
5.4.Varnostni modul z dvema stikaloma
6 Optimizacija prvotnega modela
7 Zaključek
7 Viri in literatura
[edit]Uvod – Kaj je TheraPUFA?
TheraPUFA je nazalni probiotik, ki omogoča sintezo polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA), s katerimi uravnava vnetje in deluje protivirusno.
Ideja projekta je posledica pandemije koronavirusa SARS-CoV-2, ki je pripomogla k hitrem razvoju cepiv, diagnostičnih orodij in zdravil, ki vključujejo protivirusne učinkovine.

[edit]Polinenasičene maščobne kisline (PUFA)
Polinenasičene maščobne kisline (PUFA) lahko delujejo kot endogene antibakterijske, antivirusne in antiparazitske spojine, poleg tega pa lahko preko svojih metabolitov regulirajo tudi procese vnetja. Inaktivirajo lahko viruse z lipidno ovojnico (npr. herpes, influenza, SARS-CoV-2), tako da povzročijo lizo celic oziroma puščanje membrane, inhibirajo proliferacijo različnih mikroorganizmov, preprečujejo preureditev lipidnega dvosloja in vplivajo na interakcijo med virusom in receptorjem [2]–[7]. Med PUFA uvrščamo arahidonsko kislino (AA) in dokozaheksaenojsko kislino (DHA), ki so jih uporabili pri načrtovanju nazalnega probiotika. AA lahko povzroči lizo lipidnih ovojnic virusa, njeni metaboliti pa učinkujejo provnetno in protivnetno. Obe uporabljeni PUFA pa zavirata replikacijo +RNA virusov, saj spremenita lipidno sestavo in tako virusom onemogočita preureditev membran in njihovo razmnoževanje. Za metabolite DHA so značilni le protivnetni učinki.

[edit]Izbira bakterij
Za izbiro probiotične šasije so iskali vrsto bakterij, ki bi izpolnjevala tri pogoje:
• bakterija mora biti naravno del nosno-žrelnega mikrobioma,
• ne sme povzročati bolezni ali povečati tveganje za razvoj bolezni v zdravih posameznikih,
• bakterija je že bila uporabljena kot nazalni probiotik.
Pri projektu so se odločili za bakterijo Neisseria cinerea, gram negativno bakterijo, ki in jo najdemo v nazalni in oralni mikrobioti zdravih odraslih in otrok. N. cinerea je komenzalna bakterija, ki preprečuje rast patogenih bakterij, uvrščamo jo v 1. biološki varnostni razred, ne povzroča bolezni in ni znano, da bi sodelovala pri bolezni. Pri izbiri bakterije so morali upoštevati še kompatibilnost s predhodno izbranim citokinskim senzorjem, ki se uspešno izraža v gram negativnih bakterijah. Bakterije so razdelili v dve skupini in pripravili dve različni vezji. V prvo skupino bakterij so vstavili vezje, ki je omogočilo proizvodnjo AA, medtem ko je bila druga skupina bakterija prilagojena na proizvodnjo DHA. Uravnavanje sinteze ustrezne PUFA je zagotavljal citokinski senzor, ki se je odzval na vnetje v telesu. Obe skupini bakterij sta vsebovali še dve varnostni stikali, ki sta zagotovili varnost probiotika.

[edit]Načrtovanje vezja
Prva skupina bakterij je bila odgovorna za sintezo AA, njeno vezje je bilo sestavljeno iz promotor pspA, s katerim je bila pogojena sinteza represorja cI. Represor cI je s svojo vezavo na operator promotorja pLac inhibiral izražanje fosfolipaze cPLA2, ki je sodelovala pri transportu sintetizirane PUFA. AA sintaza je bila zapisana pod konstitutivnim Andersonovim promotorjem J23. V drugi skupini bakterij, je bilo vezje podobno, vendar sinteza ni bila uravnana s represorjem cI.

[edit]4 moduli, ki sestavljajo TheraPUFA

[edit]Citokinski senzor
Pri projektu so želeli oblikovati senzor za zaznavanje IFN-γ in TNF-α, ki bi reguliral sintezo AA in DHA. V ta namen, so uporabili sintetični citokinski senzor, ki sta ga predhodno razvila raziskovalca Aurand in March [8]. Osnova tega senzorja je zunanji membranski porin A (OmpA) iz E.coli, ki so mu zamenjali dve zunajcelični zanki z zunajceličnima zankama proteina OrpF. Z zamenjavo zank so omogočili zaznavanje IFN-γ in TNF-α.
Pri nizkih koncentracijah IFN-γ in TNF-α senzor ni aktiven. Transkripcijski faktor PspF, ki omogoči izražanje DHA sintaze, je inhibiran. Sinteza DHA ne poteka.
Ko so v okolici bakterije prisotne zadostne koncentracije IFN-γ in TNF-α, se citokinski senzor aktivira, signal se preko OmpA proteina prenese do membranskih proteinov PspB, PspC in PspA, kar povzroči spremembe interakcij med proteini in inhibicija transkripcijskega faktorja PspF je prekinjena. Aktiven transkripcijski faktor PspF se lahko veže na operatorsko regijo PspA promotorja in inducira izražanje DHA sintaze. V prvi skupini bakterij, ki so odgovorne za sintezo AA, transkripcijski faktor PspF aktivira izražanje represorja in transport AA je onemogočen. Ker le visoke koncentracije citokinov aktivirajo citokinski senzor, pride do preklopa med izločanjem AA in DHA le v primeru prekomernega imunskega odziva.

[edit]Sinteza polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA)
Za sintezo AA so uporabili zapis za PUFA sintazo iz Aureispira marina, ki omogoča de novo sintezo AA. Za sintezo DHA pa so uporabili zapis za PUFA sintazo iz Scizochytrium, ki omogoča de novo sintezo DHA.

[edit]Transport polinenasičenih maščobnih kislin
Pri oblikovanju sistema za transport PUFA so pri projektu izhajali iz gram negativne bakterije Rhodobacter sphaeroides, ki lahko izloča dolge maščobne kisline v zunajcelični prostor. Sistem temelji na fosfolipazi, ki se nahaja v periplazmi in sprošča maščobne kisline iz fosfolipidov notranje membrane. Maščobne kisline se nato izločijo v zunajcelični prostor, po neznanem mehanizmu, ki ni odvisen od proteina Tol-C. Sistem za transport PUFA so prilagodili, tako da so izbrali acil-sintetazo in fosfolipazo, z večjo preferenco do PUFA. Izbrana acil-sintetaza omogoči, aktivacijo PUFA in sintezo fosfolipidov. Fosfolipaza je pomembna za sproščanje PUFA iz fosfolipidnega dvosloja v periplazmo.
Prvi korak pri proizvodnji in transportu AA je sinteza PUFA in vgradnja v notranjo celično membrano. Ker je vgradnja AA v fosfolipide značilna že v wt celicah, jim sistema ni bilo potrebno bistveno prilagajati. V drugem koraku je pomembna cPLA2, ki se s pomočjo CycA lokalizacijskega signala izloča v periplazmo in omogoči sproščanje AA iz notranje membrane v periplazemski prostor. V tretjem koraku gre za prehod AA iz periplazemskega v zunajcelični prostor. Ker je bakterijska membrana neprepustna za maščobne kisline in pasivna difuzija ni možna, so pri projektu predpostavili olajšan transport PUFA preko proteinskega transporterja. FadL je transporter dolgih maščobnih kislin, ki prenaša maščobne kisline v periplazmo. Predvidevali so, da mora obstajati protein podoben proteinu FadL, ki bi omogočil olajšan transport PUFA iz periplazme v zunajcelični prostor.
DHA se za razliko od AA v nativnih celicah akumulira v citoplazmi v obliki prostih maščobnih kislin. Za sintezo DHA so pri projektu uporabili PUFA sintazo iz Schizochytrium. Poleg tega so dodali še zapis za fosfopantetinil transferazo iz Nostoc cianobakterij, ki postranslacijsko modificira DHA sintazo in je nujna za sintezo DHA [9]. Za vgradnjo DHA v membrano, se mora DHA še aktivirati z dodatkom CoA. Za aktivacijo so v bakterije vnesli zapis za acil-CoA sintetazo lacsA iz Thalassiosira pseudonana, ki omogoči prenos CoA iz acetil-CoA na DHA. Aktivirana DHA se nato s pomočjo encimov vgradi v notranjo membrano. Za sproščanje DHA iz notranje membrane v periplazmo so uporabili človeško fosfolipazo iPLA2, ki so ji dodali CycA lokalizacijski signal za prehod v periplazmo. Transport DHA v zunajcelični prostor pa naj bi potekal na enak način kot transport AA.

[edit]Varnostni modul z dvema stikaloma
Prvo stikalo zagotavlja varnost probiotika v človeškem telesu. Z vklopom stikala pride do eliminacije probiotika iz organizma. Za stikalo so konstruirali aspirin-inducibilni ekspresijski sistem. Uporabili so promotor PsaI, ki zapisuje za zeta toksin in je odvisen od transkripcijskega faktorja SalR. Transkripcijski faktor SalR je zapisan pod konstitutivnem promotorjem PopaB in lahko obstaja v dveh oblikah: SalRr in SalRa. V obliki SalRr deluje kot represor, medtem ko v obliki SalRa s svojo vezavo aktivira transkripcijo toksina. SalR bo v odsotnosti aspirina deloval kot represor, ki bo zaviral izražanje zeta toksina. Ob dodatku aspirina bo SalR začel delovati kot aktivator in izražati se bo začel zeta toksin, ki bo inhibiral sintezo petidoglikanov in prišlo bo do lize celic.
Drugo stikalo preprečuje, da bi bakterije iz TheraPUFA preživele v okolju (zunaj gostitelja), saj prepreči replikacijo bakterij pri temperaturi nižji od 37 °C. Stikalo je uravnano s FitAB toksin-antitoksin sistemom, ki so ga združili z RNA termometrom CssA. CssA je RNA termometer, ki pri temperaturi nižji od 37 °C oblikuje lasnično zanko in blokira vezavo ribosoma na RBS. Toksin FitB in antitoksin FitA sta zapisana pod nativnim promotorjem. Pred zapis za antitoksin FitA so dodali še CssA, ki uravnava izražanje antitoksina. Pri temperaturi 37 °C se bosta izražala tako toksin FitB, kot antitoksin FitA, zato bo delovanje toksina inhibirano. Pri temperaturi nižji od 37 °C, pa bo izražanje antitoksina FitA ustavljeno zaradi tvorbe lasnične zanke CssA in toksin FitB bo aktiven.

[edit]Optimizacija prvotnega modela
Da bi lahko TheraPUFA uporabljali kot protivirusno učinkovino, bi morali model še prilagoditi:
• S pomočjo mestnospecifične mutageneze bi morali povečati občutljivost sintetičnega citokinskega receptorja.
• Povečati bi morali sintezo PUFA.
• Z uporabo posebnih gelov, ki se uporabljajo pri vnosu probiotika bi morali povečati obstojnost vnesenih bakterij v nosni votlini.

[edit]Zaključek
Predstavljen projekt TheraPUFA je delo študentov univerze William & Mary, ki so ga pripravili za tekmovanje iGEM 2020. Zaradi pandemije koronavirusa SARS-CoV-2 študentje niso imeli dostopa do laboratorija, zato so pripravili idejno zasnovo za nazalni probiotik, pri katerem bi v bakterije Neisseria cinerea vstavili vezje za sintezo PUFA in tako omogočili protivirusno delovanje in uravnavanje pretiranega imunskega odziva, ki je tudi posledica SARS-CoV-2. Idejno zasnovo so nato preverili z matematičnimi parametri, pridobljenimi iz literature. Model je nakazoval, da TheraPUFA ne bi bilo možno uporabljati kot protivirusno učinkovino, kljub temu so naknadno model optimizirali in tako oblikovali nazalni probiotik, ki bi prispeval k zmanjšanju virusne obremenitve.

[edit]Viri in literatura
[1] “Team:William and Mary - 2020.igem.org.” [Online]. Available: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary. [Accessed: 07-Apr-2021].
[2] C. Müller, M. Hardt, D. Schwudke, B. W. Neuman, S. Pleschka, and J. Ziebuhr, “Inhibition of cytosolic phospholipase A2α impairs an early step of coronavirus replication in cell culture,” J. Virol., vol. 92, no. 4, p. JVI.01463-17, Nov. 2017.
[3] A. Goc, “Polyunsaturated ω-3 fatty acids inhibit ACE2-controlled SARS-CoV-2 binding and cellular entry.”
[4] U. N. Das, “Can Bioactive Lipids Inactivate Coronavirus (COVID-19)?,” Arch. Med. Res., vol. 51, no. 3, pp. 282–286, Apr. 2020.
[5] U. N. Das, “Response to: Bioactive Lipids and Coronavirus (COVID-19)-further Discussion,” Archives of Medical Research, vol. 51, no. 5. Elsevier Inc., pp. 445–449, 01-Jul-2020.
[6] A. Kohn, J. Gitelman, and M. Inbar, “Unsaturated free fatty acids inactivate animal enveloped viruses,” Arch. Virol., vol. 66, no. 4, pp. 301–307, Dec. 1980.
[7] U. N. Das, “Arachidonic acid and other unsaturated fatty acids and some of their metabolites function as endogenous antimicrobial molecules: A review,” Journal of Advanced Research, vol. 11. Elsevier B.V., pp. 57–66, 01-May-2018.
[8] T. C. Aurand and J. C. March, “Development of a synthetic receptor protein for sensing inflammatory mediators interferon-γ and tumor necrosis factor-α,” Biotechnol. Bioeng., vol. 113, no. 3, pp. 492–500, Mar. 2016.
[9] J. Beld, E. C. Sonnenschein, C. R. Vickery, J. P. Noel, and M. D. Burkart, “The phosphopantetheinyl transferases: Catalysis of a post-translational modification crucial for life,” Nat. Prod. Rep., vol. 31, no. 1, pp. 61–108, Jan. 2014.

page discussion edit history move watch
Barbara Slapnik my talk my preferences my watchlist my contributions log out
navigation

Seminarji SB 2020/21

2021-04-11T18:48:37Z

Barbara Slapnik:

V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline]
(Liza Ulčakar) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv]
(Špela Supej) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 

----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Seminarji SB 2020/21

2021-04-11T18:47:37Z

Barbara Slapnik:

V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline]
(Liza Ulčakar) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv]
(Špela Supej) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem] (Barbara Slapnik) 

----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

BNT-seminar

2021-03-16T08:45:08Z

Barbara Slapnik: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019058 
30170022 
30200303 
30019363 
30200310 
30019057 
30170131 
30170078 
30019040 
30170177 
30200324 
30200315 
30019063 
30200312 
30170002 
30170103 
30019056 
30200319 
30200309 
30200322 
30200320 
30200311 
30200306 
30170243 
30019051 
30170141 
30170061 
30019035 
30200316 
30170222 
30200317 
30170193 
30200307 
30200321 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
16.3.2021 
16.3.2021 
23.3.2021 
23.3.2021 
23.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
13.4.2021 
13.4.2021 
20.4.2021 
20.4.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
23.3.2021 
20.4.2020 
20.4.2020 
6.4.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
11.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
30.3.2021 
13.4.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
18.5.2021 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Aljaž Bratina 
Matija Ruparčič 
Urban Hribar 
Sabina Sladič Oblak 
Irma Zeljković 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Ajda Godec 
Martin Špendl 
Tjaša Mlakar 
Urša Lovše 
Sara Laznik 
Neža Pvko 
Doroteja Armič 
Martina Lokar 
Špela Supej 
Martin Špendl 
Saša Slabe 
Eva Keber 
Mateja Žvipelj 
Urška Fajdiga 
Ernestina Lavrih 
Nika Mikulič Vernik 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Tadej Medved 
Urška Zagorc 
Nina Lukančič 
Urška Pečarič Strnad 
Anže Karlek 
Luka Gnidovec 
Almina Tahirović 
Mirsad Mešić 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Urška Zagorc 
Ernestina Lavrih 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Paula Horvat 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Eva Keber 
Jernej Imperl 
Barbara Slapnik 
Mirsad Mešić 
Urša Lovše 
Anamarija Agnič 
Neža Pavko 
Mateja Žvipelj 
Saša Slabe 
Almina Tahirović 
Nika Mikulič Vernik 
Martina Lokar 
Urška Fajdiga 
Klementina Polanec 
Tjaša Mlakar 
Ajda Godec 
Jernej Imperl 
Špela Supej 
Aljaž Bratina 
Nina Lukančič 
Matija Ruparčič 
Anže Karlek 
Sabina S. Oblak 
Urban Hribar 
Tina Kolenc Milavec 
Tadej Medved 
|}

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BNT-seminar

2021-03-09T07:06:01Z

Barbara Slapnik: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019057 
30170131 
30170078 
30170177 
30019063 
30170103 
30170002 
30200319 
30200309 
30200320 
30019056 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
20.4.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
23.3.2021 
20.4.2020 
6.4.2021 
4.5.2021 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Martin Špendl 
Sara Laznik 
Martina Lokar 
Doroteja Armič 
Martin Špendl 
Saša Slabe 
Mateja Žvipelj 
Špela Supej 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Jernej Imperl 
Urša Lovše 
Mateja Žvipelj 
Neža Pavko 
Almina Tahirović 
Nika Mikulič Vernik 
Urška Fajdiga 
Saša Slabe 
|-

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-03-08T19:47:10Z

Barbara Slapnik:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315|pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so (seznam v pripravi):

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. Blokiranje receptorjev za fage (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa (Patricija Miklavc, Benjamin Malovrh) 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme (Nika Boštic, Tadej Medved) 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, Anja Tavčar) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Jernej Imperl, Klementina Polanec, ) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pacleković, Valeriya Musina) 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom (Sanja Stanković, ) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-03-08T19:44:34Z

Barbara Slapnik:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315|pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so (seznam v pripravi):

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa (Patricija Miklavc, Benjamin Malovrh) 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. Blokiranje receptorjev za fage (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme (Nika Boštic, Tadej Medved) 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, Anja Tavčar) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Jernej Imperl, Klementina Polanec, ) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pacleković, Valeriya Musina) 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom (Sanja Stanković, ) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Molekularna biologija virusov

2018-03-15T17:56:44Z

Barbara Slapnik:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2017/18 obravnavajo področje virusov, saj v naslednjem letu ne boste imeli možnosti vpisa izbirnega predmeta Virologija. Tematika je razdeljena na 16 poglavij. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu.

Vsako temo obdelata praviloma dva študenta, nekatere teme pa omogočajo tudi razdelitev snovi na tri dele (to je označeno na prvem seznamu). Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ne več kot 1500 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili.
Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov!

Predstavitve seminarjev po datumih so razvidne iz spletne učilnice.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev sta običajno dve vprašanji od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

1. Herpesvirusi in sorodni dsDNA-virusi (lahko 3) 
2. Parvovirusi in sorodni ssDNA-virusi 
3. Reovirusi in drugi dsRNA-virusi 
4. Pikornavirusi in drugi RNA(+)-virusi 
5. Rabdovirusi in drugi RNA(-)-virusi 
6. Retrovirusi (lahko 3) 
7. Hepadnavirusi in kavlimovirusi (DNA-virusi z reverzno transkripcijo) 
8. Nitasti fagi 
9. Ikozaedrični fagi (lahko 3) 
10. Viroidi in satelitski virusi 
11. Evolucija virusov 
12. Virusi in rak 
13. Rastlinski virusi (lahko 3) 
14. Protivirusna zdravila (lahko 3) 
15. Protivirusna cepiva 
16. Diagnostika virusnih okužb 

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. Herpesvirusi in sorodni dsDNA-virusi (Ines Medved) 
2. Parvovirusi in sorodni ssDNA-virusi 
3. Reovirusi in drugi dsRNA-virusi 
4. Pikornavirusi in drugi RNA(+)-virusi 
5. Rabdovirusi in drugi RNA(-)-virusi 
6. Retrovirusi (Katja Dobrsek, Spela Supej, Barbara Slapnik) 
7. Hepadnavirusi in kavlimovirusi (DNA-virusi z reverzno transkripcijo) 
8. Nitasti fagi 
9. Ikozaedrični fagi 
10. Viroidi in satelitski virusi 
11. Evolucija virusov 
12. Virusi in rak 
13. Rastlinski virusi 
14. Protivirusna zdravila 
15. Protivirusna cepiva (Daria Latysheva, Jerneja Nimac) 
16. Diagnostika virusnih okužb 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, ki vsebuje povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]
Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

Molekularna biologija virusov

2018-03-15T17:56:19Z

Barbara Slapnik:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2017/18 obravnavajo področje virusov, saj v naslednjem letu ne boste imeli možnosti vpisa izbirnega predmeta Virologija. Tematika je razdeljena na 16 poglavij. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu.

Vsako temo obdelata praviloma dva študenta, nekatere teme pa omogočajo tudi razdelitev snovi na tri dele (to je označeno na prvem seznamu). Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ne več kot 1500 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili.
Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov!

Predstavitve seminarjev po datumih so razvidne iz spletne učilnice.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev sta običajno dve vprašanji od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

1. Herpesvirusi in sorodni dsDNA-virusi (lahko 3) 
2. Parvovirusi in sorodni ssDNA-virusi 
3. Reovirusi in drugi dsRNA-virusi 
4. Pikornavirusi in drugi RNA(+)-virusi 
5. Rabdovirusi in drugi RNA(-)-virusi 
6. Retrovirusi (lahko 3) 
7. Hepadnavirusi in kavlimovirusi (DNA-virusi z reverzno transkripcijo) 
8. Nitasti fagi 
9. Ikozaedrični fagi (lahko 3) 
10. Viroidi in satelitski virusi 
11. Evolucija virusov 
12. Virusi in rak 
13. Rastlinski virusi (lahko 3) 
14. Protivirusna zdravila (lahko 3) 
15. Protivirusna cepiva 
16. Diagnostika virusnih okužb 

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. Herpesvirusi in sorodni dsDNA-virusi (Ines Medved) 
2. Parvovirusi in sorodni ssDNA-virusi 
3. Reovirusi in drugi dsRNA-virusi 
4. Pikornavirusi in drugi RNA(+)-virusi 
5. Rabdovirusi in drugi RNA(-)-virusi 
6. Retrovirusi (Katja Dobrsek, Spela Supej, Barbara Slapnik 
7. Hepadnavirusi in kavlimovirusi (DNA-virusi z reverzno transkripcijo) 
8. Nitasti fagi 
9. Ikozaedrični fagi 
10. Viroidi in satelitski virusi 
11. Evolucija virusov 
12. Virusi in rak 
13. Rastlinski virusi 
14. Protivirusna zdravila 
15. Protivirusna cepiva (Daria Latysheva, Jerneja Nimac) 
16. Diagnostika virusnih okužb 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, ki vsebuje povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]
Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

BIO2 Povzetki seminarjev 2017

2017-11-10T21:52:49Z

Barbara Slapnik: /* Barbara Slapnik: Regulacija metabolizma glukoze v sesalskih celičnih kulturah */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2017/2018 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2017 stran]

=== Luka Gregorič: Pozitivne vloge negativnih regulatorjev ===

Pri preučevanju regulacije sistemov v celici, so negativni regulatorji bolj temen, neraziskan del celotnega procesa, čeprav enako pomemben. Brez njih se lahko v celici začenja nenadzorovano deljenje in posledično rakavost tkiva, ali pa se nam poveča možnost hujšega obolenja. V živčnem sistemu lahko brez GPR-jev poteče prekomerna mielinizacija aksonov, ki pomenijo veliko zmanjšanje vseh kognitivnih sposobnosti organizma in posledično tudi manjšo zmožnost prilagajanja. V mišičnem tkivu, pa lahko pomanjkanje ali slabše delovanje negativnih regulatorjev naredi tkiva manj eksplozivna in povzroči hitrejše staranje, zaradi razlik med tkivi tipa 1 in tipa 2. V najhujšem primeru pa nam pomanjkanje negativnih regulatorjev celo povzroči mišično atofijo, medtem ko nam bi boljše poznavanje prav njih lahko omogočilo, da obdržimo mlade mišice čez celo življenje. Hitrost celotnega delovanja negativnih regulatorjev pa ni odvisna od moči signala, saj signal v zelo majhnem času lahko spravijo na prvotno raven, ne glede na to, kdaj se je ta signal začel. Visoka odzivnost signalov pa tudi pomaga telesu, ko se rabi hitro odzvati na različne dražljaje. Najhitrejše to naredi tako, da je signal vedno aktiviran in se izklopi le ob primeru, da se je potrebno hitro odzvati.

=== Ines Medved: Vohalni receptorji v epidermisu ===
Primarna vloga vohalnih receptorjev je zaznava vonja, ki je zelo pomembna. Poleg zaznave vonja pa imajo receptorji za vonj tudi druge funkcije. Ti receptorji se nahajajo v tkivih, ki niso povezana z vohalno nalogo. Nahajajo se skoraj po celotnem telesu npr. v ledvicah, možganih, srcu, koži, v krvi … V epidermisu so našli dva takšna receptorja, in sicer receptorja OR2AT4 in OR51E2. Kljub podobnemu mehanizmu delovanja se po funkciji zelo razlikujeta. OR2AT4 ob stimulaciji z agonistom poveča celično proliferacijo, vpliva na migracijo celic in sodeluje pri reepitalizaciji v procesu celjenja ran. Ugotovili so, da sodeluje tudi pri zaprtju rane. Za razliko od OR2AT4 receptor OR51E2 zmanjša celično proliferacijo, sodeluje pa v melanogenezi, dendritogenezi in pri celični diferenciaciji. Vohalni receptor OR51E2 ima vlogo tudi v rakavih celicah prostate. Receptorja sta zelo specifična. Vohalni receptor OR2AT4 stimulira le sandanol in brahmanol, OR51E2 pa β-ionon. Za oba receptorja so našli tudi antagoniste, ki blokirajo Ca2+ signal. Za OR2AT4 so odkrili dva antagonista oksifenilon in fenirat, za receptor OR51E2 pa α-ionon. Kljub podobni lokaciji in mehanizmom se receptorja zelo razlikujeta. Medtem ko bi se OR2AT4 lahko uporabljal pri zdravljenju oziroma celjenju rane, bi bil lahko receptor OR51E2 potencialni pokazatelj za rakave celice.

===Daria Latysheva: The role of intrinsically disordered proteins in signalling pathways and regulation ===

Intrinsically disordered proteins (IDPs) are proteins, which do not have a defined three – dimensional structure, yet are completely functional. Found mostly in eukaryotic cells, they play an important role in biosignalling and regulation of a cell. Undergoing coupled folding and binding, IDPs’ recognition elements are cable of taking over the structures of different targets. Since IDPs have multiple interaction motifs, they often serve as signalling centres, thus contributing to the dynamic assembly of complex molecules and varied signalling pathways. Undergoing post – translational modifications, these proteins also add complexity to the regulatory networks and can change the original output of the crosswalk. IDPs are also an important component of higher - order signalling assemblies, enabling the formation of reversible complexes. Being an attractive field of the research, IDPs were not yet studied completely and there is still much to be understood about the structure, functions and the location of IDPs in the cell. Experimental and computational techniques are being developed to identify and characterise disordered regions in proteins in order to emphasize the prevalent role of IDPs in cellular signalling and regulation.

===Polona Skrt: Mehanizem zaznavanja okusa maščobe ===

Okus je pomembna zaznavna zmožnost, saj nas usmerja pri uživanju hranilne in prebavljive hrane ter nas ščiti pred strupi in ostalimi nevarnimi snovmi. Čutne celice se nahajajo v brbončicah v ustni votlini, na jeziku in v grlu. V brbončicah se nahaja okoli 100 celic, ki jih delimo v 3 skupine. Prvi tip so celice podobne glia celicam, ki se ovijejo okoli ostalih celic in jim nudijo oporo ter preprečujejo nekontrolirano širjenje živčnih prenašalcev. Naslednji tip so t.i. receptorske celice, ki zaznavajo sladko, grenko in umami ter sproščajo nevrotransmiterje, ki signal prenesejo do živčevja. Tretji tip celic so predsinaptične celice, ki se odzivajo predvsem na kisel okus. Njihova posebnost je, da se prek sinaps direktno povezujejo z živčnim vlakni. Pri signalizaciji okusov so zelo pomembni z G-proteini povezani receptorji, ki omogočajo zaznavanje sladkega, grenkega in umami okusa ter ionski kanalčki, ki prenašajo informacijo o kislem in slanem okusu. Ne dolgo nazaj so znanstveniki, k prej omenjenim petim osnovnim okusom, dodali še šestega – okus po maščobi. Signalizacija najverjetneje poteka preko receptorja CD36, možni pa so še GPR120 in GPR40 ter DRK kanalčki. Mehanizem je še dokaj neraziskan, predpostavljajo pa sodelovanje med več receptorji.

===Peter Škrinjar: Receptorji za okus in njihova povezava z debelostjo ===

Okus je eden izmed petih osnovnih čutov, katerega naloga je prepoznavanje hranil in preprečevanje vnosa telesu nevarnih snovi. Pri tem mu pomagajo receptorji za okus. Te se razlikujejo za vseh pet osnovnih okusov – grenko, sladko in umami zaznamo s pomočjo GPCR-jev, slano in kislo pa s pomočjo ionskih kanalčkov. Raziskave še potekajo glede receptorjev za maščobnokislinski okus. Poleg receptorjev v ustih pa poznamo tudi receptorje za okus v prebavni cevi. Tam so te pomembni predvsem v enteroendokrinih celicah, kjer ob prisotnosti različnih ligandov sprožijo izločanje različnih peptidnih hormonov (GLP-1, CCK, PYY itd.). Te nato stimulirajo vagusni živec, ki prenese informacijo do možganov, ki se primerno odzovejo (npr. ob prisotnosti sladkorjev se v prebavni cevi izloča GLP-1, ki sproži izločanje inzulina iz trebušne slinavke). Receptorje za okus lahko povežemo tudi z debelostjo. Genetske razlike pri receptorjih za maščobnokislinski okus (predvsem CD36, ki je najbolj raziskan) lahko povzročijo slabše zaznavanje maščobnih kislin, kar bi nato vodilo do debelosti. To povezavo je sicer potrebno še dokazati. Podobno bi lahko predvidevali za maščobnokislinske receptorje v prebavnem traktu. Kot alternativa za zdravljenje debelosti se je pojavila hipoteza o zdravljenju preko receptorjev za okus na adipocitah brez α-gustducina, na katere imajo grenke komponente inhibicijski učinek.

===Milica Janković: Jedrni receptorji: Karakteristike in regulacija receptorjev ter identifikacija ligandov===

Jedrni receptorji so proteini prisotni v celicah, ki prenašajo signale svojih ligandov. Naddružino jedrnih receptorjev sestavlja 48 transkripcijskih faktorjev (pri ljudeh). Aktivirajo se po vezavi liganda in vključujejo receptorje za steroidne hormone, lipofilne vitamine, ščitnične hormone in retinoinsko kislino. Receptor- ligandni kompleks se veže na specifično področje na DNA, katero imenujemo hormonski responsni element (HRE). Jedrni receptorji so transkripcijski faktorji, ker delujejo direktno v jedru in spreminjajo ekspresijo genov ter na ta način vplivajo na razvoj, diferencijacijo in homeostazo in metabolizem. Obstajajo štirje tipi nuklearnih receptorjev, ki se razlikujejo po signalnih poteh.Zavzemajo tudi različne konformacije, ki so povzročene z vezavo agonista, oziroma antagonista. Morda najbolj revolucionarna ugotovitev, je bilo presenetljivo odkritje, da obstajajo številni receptorji, kateri so povezani na majhne molekulske ligande. Ker ti ligandi niso znani, receptorji so poimenovani siroti (orphans) receptorji. Vprašanje je bilo, kako bi lahko prišli do odkritja tistih ligandov? Vsi jedrni receptorji imajo podobno strukturo, na podlagi česa je bilo lahko narediti vrsto testov za identifikacijo ligandov.
Ker se pa vežejo na majhne molekule, predstavljajo zanimive terapevtske cilje. Bi bili bogat vir za razvoj sintetičnih majhnih molekul kot ligandov.

===Tina Turel: Vpliv mikroorganizmov na presnovo glukoze===

V biomedicini je v zadnjih letih prišlo do odkritja, da črevesna mikroflora sodeluje v različnih metabolnih procesih. Mikroorganizmi v črevesju komunicirajo z gostiteljem preko TLR-jev. TLR so receptorji v prirojenem imunskem sistemu, ki zaznajo določeno patogeno zaporedje in aktivirajo imunski odziv oziroma omogočajo komunikacijo med črevesno mikrofloro in gostiteljem. Prav tako pa lahko TLR-ji pa omogočijo, da v različnih metabolnih procesih lahko sodelujejo tudi mikroorganizmi. V študiji so se znanstveniki usmerili v določitev vseh členov, ki vplivajo na presnovo glukoze. Presnova glukoze je univerzalni postopek, ki je prisoten v vseh vretenčarjih in tudi v nekaterih nevretenčarjih. Študija je odkrila manjkajočo povezavo med IFNɣ in presnovo glukoze in sicer A. muciniphilo, ključni mikroorganizem, ki je odgovoren za izboljšanje tolerance na glukozo. Potrdili so, da bakterija lahko izboljša toleranco glukoze v različnih gostiteljih. Irgm1 so določili kot glavnega posrednik med IFNɣ in A. muciniphilo. Dejstvo je, da je A. muciniphila prisotna tudi v človeški mikroflori, zato so znanstveniki opravili poskuse tudi na prostovoljcih. Izkazalo se je, da je postopek in pa vpliv določenih komponent na presnovo in toleranco glukoze enak kot pri miših. Raziskava pa ponuja novo pot v zdravljenju metabolnih bolezni in sicer reguliranje ravni A. muciniphile.

===Ana Maklin: Vloga PGP in PHO13 v metabolizmu===

PGP in njegov ortolog PHO13 v kvasovkah sta bila predmet številnih raziskav. Njune funkcije so zelo raznolike, jasno pa je, da s svojo fosfatazno aktivnostjo ter drugimi lastnostmi pomembno vplivata tudi na metabolizem. Zaradi stranske aktivnosti nekaterih encimov v metabolnih procesi, nastajajo tudi produkti, ki lahko ovirajo normalno delovanje celic. Evolucijsko gledano, so organizmi torej morali ustvariti popravljalni sistem, ki prepreči nadaljnje posledice teh napak. Naloga PGP in PHO13 je, da s svojo aktivnostjo pretvorita neželjene produkte, ki nastajajo zaradi stranske aktivnosti encimov, v druge, ki niso škodljivi. V metabolizmu glukoze, zaradi stranske aktivnosti gliceraldehid 3-fosfat dehidrogeaze nastajata 4-fosfoeritronat in 2-fosfolaktat. Prvi je inhibitor 6-fosfoglukonat dehidrogenaze, drugi pa fosfofruktokinaze-1. Inhibicija teh dveh encimov bi brez PGP in PHO13 povzročila moteno glikolizo in pentoza fosftno pot. PHO13 oziroma njegova odsotno v celicah ima pomembo vlogo tudi pri pretvorbi rastlinske biomase v etanol. Ker uporaba etanola iz biomase kot vir obnovljive energije postaja vedno bolj razširjena, je PHO13 postal pomemben predmet za napredek v metabolnem inženirstvu. Deaktivacija PHO13 v kvasovkah z izraženimi XR/XDH/XK namreč preprečuje defosforilacijo ksiluloze 5-fosfata, kar omogoča nadaljevanje metabolnih procesov potrebnih za nastanek etanola, izboljša toleranco na običajne inhibitorje fermentacije (šibke kisline, produkti razgradnje sladkorjev) ter povzroči pospešeno transkripcijo genov, vključenih v pentozo fosfatno pot (naprimer TAL1,ki kodira protein transaldolazo, enega ključnih encimov pri neoksidativni pentoza fosfatni poti).

===Barbara Slapnik: Regulacija metabolizma glukoze v sesalskih celičnih kulturah===

Regulacija metabolizma glukoze je iz vidika celičnih kultur zelo pomembna, saj vpliva na celično rast in produktivnost celic. Boljše poznavanje regulacije metabolizma nam omogoča njegovo kontroliranje in s tem možnost za povečanje produktivnosti celic v celičnih kulturah. Regulacija metabolizma glukoze v celici poteka v več stopnjah. Pretok omejujejo intermediati, ki vstopajo še v druge metabolne poti. Zelo pomembna stopnja je regulacija z encimi. Glavni encimi, ki regulirajo glikolizo so heksokinaza, fosfofruktokinaza in piruvat kinaza. Poznamo več izooblik encimov, ki se razlikujejo po delovanju in afiniteti do substratov. Regulacija metabolizma glukoze poteka tudi na nivoju celične signalizacije. Protein kinaza B, ki ga imenujemo tudi Akt je odvisen od prisotnosti inzulina. Akt vpliva na izražanje glukoznega prenašalca 1 in delovanje heksokinaze ter fosfofruktokinaze. AMP kinaza je ključna za aktivacijo katabolnih poti in inhibicijo anabolnih poti. c-Myc je transkripcijski faktor, ki vpliva na izražanje glukoznega prenašalca 1 in delovanje fosfofruktokinaze, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze, fosfoglicerat kinaze in enolaze. p53 je transkripcijski faktor, ki zmanjša transkripcijo glukoznega prenašalca 1 in 3 ter aktivnost fosfoglicerat mutaze. Razumevanje regulacije metabolizma glukoze nam omogoča boljšo celično rast v bioreaktorjih.

BIO2 Povzetki seminarjev 2017

2017-11-10T21:42:52Z

Barbara Slapnik: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2017/2018 */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2017/2018 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2017 stran]

=== Luka Gregorič: Pozitivne vloge negativnih regulatorjev ===

Pri preučevanju regulacije sistemov v celici, so negativni regulatorji bolj temen, neraziskan del celotnega procesa, čeprav enako pomemben. Brez njih se lahko v celici začenja nenadzorovano deljenje in posledično rakavost tkiva, ali pa se nam poveča možnost hujšega obolenja. V živčnem sistemu lahko brez GPR-jev poteče prekomerna mielinizacija aksonov, ki pomenijo veliko zmanjšanje vseh kognitivnih sposobnosti organizma in posledično tudi manjšo zmožnost prilagajanja. V mišičnem tkivu, pa lahko pomanjkanje ali slabše delovanje negativnih regulatorjev naredi tkiva manj eksplozivna in povzroči hitrejše staranje, zaradi razlik med tkivi tipa 1 in tipa 2. V najhujšem primeru pa nam pomanjkanje negativnih regulatorjev celo povzroči mišično atofijo, medtem ko nam bi boljše poznavanje prav njih lahko omogočilo, da obdržimo mlade mišice čez celo življenje. Hitrost celotnega delovanja negativnih regulatorjev pa ni odvisna od moči signala, saj signal v zelo majhnem času lahko spravijo na prvotno raven, ne glede na to, kdaj se je ta signal začel. Visoka odzivnost signalov pa tudi pomaga telesu, ko se rabi hitro odzvati na različne dražljaje. Najhitrejše to naredi tako, da je signal vedno aktiviran in se izklopi le ob primeru, da se je potrebno hitro odzvati.

=== Ines Medved: Vohalni receptorji v epidermisu ===
Primarna vloga vohalnih receptorjev je zaznava vonja, ki je zelo pomembna. Poleg zaznave vonja pa imajo receptorji za vonj tudi druge funkcije. Ti receptorji se nahajajo v tkivih, ki niso povezana z vohalno nalogo. Nahajajo se skoraj po celotnem telesu npr. v ledvicah, možganih, srcu, koži, v krvi … V epidermisu so našli dva takšna receptorja, in sicer receptorja OR2AT4 in OR51E2. Kljub podobnemu mehanizmu delovanja se po funkciji zelo razlikujeta. OR2AT4 ob stimulaciji z agonistom poveča celično proliferacijo, vpliva na migracijo celic in sodeluje pri reepitalizaciji v procesu celjenja ran. Ugotovili so, da sodeluje tudi pri zaprtju rane. Za razliko od OR2AT4 receptor OR51E2 zmanjša celično proliferacijo, sodeluje pa v melanogenezi, dendritogenezi in pri celični diferenciaciji. Vohalni receptor OR51E2 ima vlogo tudi v rakavih celicah prostate. Receptorja sta zelo specifična. Vohalni receptor OR2AT4 stimulira le sandanol in brahmanol, OR51E2 pa β-ionon. Za oba receptorja so našli tudi antagoniste, ki blokirajo Ca2+ signal. Za OR2AT4 so odkrili dva antagonista oksifenilon in fenirat, za receptor OR51E2 pa α-ionon. Kljub podobni lokaciji in mehanizmom se receptorja zelo razlikujeta. Medtem ko bi se OR2AT4 lahko uporabljal pri zdravljenju oziroma celjenju rane, bi bil lahko receptor OR51E2 potencialni pokazatelj za rakave celice.

===Daria Latysheva: The role of intrinsically disordered proteins in signalling pathways and regulation ===

Intrinsically disordered proteins (IDPs) are proteins, which do not have a defined three – dimensional structure, yet are completely functional. Found mostly in eukaryotic cells, they play an important role in biosignalling and regulation of a cell. Undergoing coupled folding and binding, IDPs’ recognition elements are cable of taking over the structures of different targets. Since IDPs have multiple interaction motifs, they often serve as signalling centres, thus contributing to the dynamic assembly of complex molecules and varied signalling pathways. Undergoing post – translational modifications, these proteins also add complexity to the regulatory networks and can change the original output of the crosswalk. IDPs are also an important component of higher - order signalling assemblies, enabling the formation of reversible complexes. Being an attractive field of the research, IDPs were not yet studied completely and there is still much to be understood about the structure, functions and the location of IDPs in the cell. Experimental and computational techniques are being developed to identify and characterise disordered regions in proteins in order to emphasize the prevalent role of IDPs in cellular signalling and regulation.

===Polona Skrt: Mehanizem zaznavanja okusa maščobe ===

Okus je pomembna zaznavna zmožnost, saj nas usmerja pri uživanju hranilne in prebavljive hrane ter nas ščiti pred strupi in ostalimi nevarnimi snovmi. Čutne celice se nahajajo v brbončicah v ustni votlini, na jeziku in v grlu. V brbončicah se nahaja okoli 100 celic, ki jih delimo v 3 skupine. Prvi tip so celice podobne glia celicam, ki se ovijejo okoli ostalih celic in jim nudijo oporo ter preprečujejo nekontrolirano širjenje živčnih prenašalcev. Naslednji tip so t.i. receptorske celice, ki zaznavajo sladko, grenko in umami ter sproščajo nevrotransmiterje, ki signal prenesejo do živčevja. Tretji tip celic so predsinaptične celice, ki se odzivajo predvsem na kisel okus. Njihova posebnost je, da se prek sinaps direktno povezujejo z živčnim vlakni. Pri signalizaciji okusov so zelo pomembni z G-proteini povezani receptorji, ki omogočajo zaznavanje sladkega, grenkega in umami okusa ter ionski kanalčki, ki prenašajo informacijo o kislem in slanem okusu. Ne dolgo nazaj so znanstveniki, k prej omenjenim petim osnovnim okusom, dodali še šestega – okus po maščobi. Signalizacija najverjetneje poteka preko receptorja CD36, možni pa so še GPR120 in GPR40 ter DRK kanalčki. Mehanizem je še dokaj neraziskan, predpostavljajo pa sodelovanje med več receptorji.

===Peter Škrinjar: Receptorji za okus in njihova povezava z debelostjo ===

Okus je eden izmed petih osnovnih čutov, katerega naloga je prepoznavanje hranil in preprečevanje vnosa telesu nevarnih snovi. Pri tem mu pomagajo receptorji za okus. Te se razlikujejo za vseh pet osnovnih okusov – grenko, sladko in umami zaznamo s pomočjo GPCR-jev, slano in kislo pa s pomočjo ionskih kanalčkov. Raziskave še potekajo glede receptorjev za maščobnokislinski okus. Poleg receptorjev v ustih pa poznamo tudi receptorje za okus v prebavni cevi. Tam so te pomembni predvsem v enteroendokrinih celicah, kjer ob prisotnosti različnih ligandov sprožijo izločanje različnih peptidnih hormonov (GLP-1, CCK, PYY itd.). Te nato stimulirajo vagusni živec, ki prenese informacijo do možganov, ki se primerno odzovejo (npr. ob prisotnosti sladkorjev se v prebavni cevi izloča GLP-1, ki sproži izločanje inzulina iz trebušne slinavke). Receptorje za okus lahko povežemo tudi z debelostjo. Genetske razlike pri receptorjih za maščobnokislinski okus (predvsem CD36, ki je najbolj raziskan) lahko povzročijo slabše zaznavanje maščobnih kislin, kar bi nato vodilo do debelosti. To povezavo je sicer potrebno še dokazati. Podobno bi lahko predvidevali za maščobnokislinske receptorje v prebavnem traktu. Kot alternativa za zdravljenje debelosti se je pojavila hipoteza o zdravljenju preko receptorjev za okus na adipocitah brez α-gustducina, na katere imajo grenke komponente inhibicijski učinek.

===Milica Janković: Jedrni receptorji: Karakteristike in regulacija receptorjev ter identifikacija ligandov===

Jedrni receptorji so proteini prisotni v celicah, ki prenašajo signale svojih ligandov. Naddružino jedrnih receptorjev sestavlja 48 transkripcijskih faktorjev (pri ljudeh). Aktivirajo se po vezavi liganda in vključujejo receptorje za steroidne hormone, lipofilne vitamine, ščitnične hormone in retinoinsko kislino. Receptor- ligandni kompleks se veže na specifično področje na DNA, katero imenujemo hormonski responsni element (HRE). Jedrni receptorji so transkripcijski faktorji, ker delujejo direktno v jedru in spreminjajo ekspresijo genov ter na ta način vplivajo na razvoj, diferencijacijo in homeostazo in metabolizem. Obstajajo štirje tipi nuklearnih receptorjev, ki se razlikujejo po signalnih poteh.Zavzemajo tudi različne konformacije, ki so povzročene z vezavo agonista, oziroma antagonista. Morda najbolj revolucionarna ugotovitev, je bilo presenetljivo odkritje, da obstajajo številni receptorji, kateri so povezani na majhne molekulske ligande. Ker ti ligandi niso znani, receptorji so poimenovani siroti (orphans) receptorji. Vprašanje je bilo, kako bi lahko prišli do odkritja tistih ligandov? Vsi jedrni receptorji imajo podobno strukturo, na podlagi česa je bilo lahko narediti vrsto testov za identifikacijo ligandov.
Ker se pa vežejo na majhne molekule, predstavljajo zanimive terapevtske cilje. Bi bili bogat vir za razvoj sintetičnih majhnih molekul kot ligandov.

===Tina Turel: Vpliv mikroorganizmov na presnovo glukoze===

V biomedicini je v zadnjih letih prišlo do odkritja, da črevesna mikroflora sodeluje v različnih metabolnih procesih. Mikroorganizmi v črevesju komunicirajo z gostiteljem preko TLR-jev. TLR so receptorji v prirojenem imunskem sistemu, ki zaznajo določeno patogeno zaporedje in aktivirajo imunski odziv oziroma omogočajo komunikacijo med črevesno mikrofloro in gostiteljem. Prav tako pa lahko TLR-ji pa omogočijo, da v različnih metabolnih procesih lahko sodelujejo tudi mikroorganizmi. V študiji so se znanstveniki usmerili v določitev vseh členov, ki vplivajo na presnovo glukoze. Presnova glukoze je univerzalni postopek, ki je prisoten v vseh vretenčarjih in tudi v nekaterih nevretenčarjih. Študija je odkrila manjkajočo povezavo med IFNɣ in presnovo glukoze in sicer A. muciniphilo, ključni mikroorganizem, ki je odgovoren za izboljšanje tolerance na glukozo. Potrdili so, da bakterija lahko izboljša toleranco glukoze v različnih gostiteljih. Irgm1 so določili kot glavnega posrednik med IFNɣ in A. muciniphilo. Dejstvo je, da je A. muciniphila prisotna tudi v človeški mikroflori, zato so znanstveniki opravili poskuse tudi na prostovoljcih. Izkazalo se je, da je postopek in pa vpliv določenih komponent na presnovo in toleranco glukoze enak kot pri miših. Raziskava pa ponuja novo pot v zdravljenju metabolnih bolezni in sicer reguliranje ravni A. muciniphile.

===Ana Maklin: Vloga PGP in PHO13 v metabolizmu===

PGP in njegov ortolog PHO13 v kvasovkah sta bila predmet številnih raziskav. Njune funkcije so zelo raznolike, jasno pa je, da s svojo fosfatazno aktivnostjo ter drugimi lastnostmi pomembno vplivata tudi na metabolizem. Zaradi stranske aktivnosti nekaterih encimov v metabolnih procesi, nastajajo tudi produkti, ki lahko ovirajo normalno delovanje celic. Evolucijsko gledano, so organizmi torej morali ustvariti popravljalni sistem, ki prepreči nadaljnje posledice teh napak. Naloga PGP in PHO13 je, da s svojo aktivnostjo pretvorita neželjene produkte, ki nastajajo zaradi stranske aktivnosti encimov, v druge, ki niso škodljivi. V metabolizmu glukoze, zaradi stranske aktivnosti gliceraldehid 3-fosfat dehidrogeaze nastajata 4-fosfoeritronat in 2-fosfolaktat. Prvi je inhibitor 6-fosfoglukonat dehidrogenaze, drugi pa fosfofruktokinaze-1. Inhibicija teh dveh encimov bi brez PGP in PHO13 povzročila moteno glikolizo in pentoza fosftno pot. PHO13 oziroma njegova odsotno v celicah ima pomembo vlogo tudi pri pretvorbi rastlinske biomase v etanol. Ker uporaba etanola iz biomase kot vir obnovljive energije postaja vedno bolj razširjena, je PHO13 postal pomemben predmet za napredek v metabolnem inženirstvu. Deaktivacija PHO13 v kvasovkah z izraženimi XR/XDH/XK namreč preprečuje defosforilacijo ksiluloze 5-fosfata, kar omogoča nadaljevanje metabolnih procesov potrebnih za nastanek etanola, izboljša toleranco na običajne inhibitorje fermentacije (šibke kisline, produkti razgradnje sladkorjev) ter povzroči pospešeno transkripcijo genov, vključenih v pentozo fosfatno pot (naprimer TAL1,ki kodira protein transaldolazo, enega ključnih encimov pri neoksidativni pentoza fosfatni poti).

===Barbara Slapnik: Regulacija metabolizma glukoze v sesalskih celičnih kulturah===

Regulacija metabolizma glukoze je iz vidika celičnih kultur zelo pomembna, saj vpliva na celično rast in produktivnost celic. Boljše poznavanje regulacije metabolizma nam omogoči kontrolo nad metabolizmom in s tem, večjo produktivnosti. Regulacija metabolizma glukoze v celici poteka v več stopnjah. Pretok omejujejo intermediati, ki vstopajo še v druge metabolne poti. Zelo pomembna stopnja je regulacija z encimi. Glavni encimi, ki regulirajo glikolizo so heksokinaza, fosfofruktokinaza in piruvat kinaza. Poznamo več izooblik encimov, ki se razlikujejo po delovanju in afiniteti do substratov. Regulacija metabolizma glukoze poteka tudi na nivoju celične signalizacije. Protein kinaza B, ki ga imenujemo tudi Akt je odvisen od prisotnosti inzulina. Akt vpliva na izražanje glukoznega prenašalca 1 in delovanje heksokinaze ter fosfofruktokinaze. AMP kinaza je ključna za aktivacijo katabolnih poti in inhibicijo anabolnih poti. c-Myc je transkripcijski faktor, ki vpliva na izražanje glukoznega prenašalca 1 in delovanje fosfofruktokinaze, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze, fosfoglicerat kinaze in enolaze. p53 je transkripcijski faktor, ki zmanjša transkripcijo glukoznega prenašalca 1 in 3 ter aktivnost fosfoglicerat mutaze. Razumevanje regulacije metabolizma glukoze nam omogoča boljšo celično rast v bioreaktorjih.

BIO2 Seminar 2017

2017-11-04T08:39:13Z

Barbara Slapnik: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Ines Medved || 12 || Receptorji za vonj v epidermisu || Špela Supej || Lea Knez || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Luka Gregorič || 12 || Pozitivne vloge negativnih regulatorjev || Uroš Prešern || Katja Doberšek || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Daria Latysheva || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2017#Daria_Latysheva:_The_role_of_intrinsically_disordered_proteins_in_signalling_pathways_and_regulation The role of intrinsically disordered proteins in signallng pathways and regulation] || Luka Fratina || Martin Špendl || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Polona Skrt || 12 || Mehanizem zaznavanja okusa maščobe || Andreja Habič || Ajda Galič || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Peter Škrinjar || 12 || Receptorji za okus in njihova povezava z debelostjo || Andrej Race || Nika Zaveršek || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Milica Janković || 12 || Nuklearni receptorji: Karakteristike in regulacija receptorjev ter identifikacija ligandov || Anže Jenko || Nika Goršek || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Tina Turel || 14-15 || Vpliv mikroorganizmov na presnovo glukoze || Ines Medved || Špela Supej || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Barbara Slapnik || 14-15 || Regulacija metabolizma glukoze v celičnih kulturah|| Luka Gregorič || Uroš Prešern || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Ana Maklin || 14-15 || || Daria Latysheva || Luka Fratina || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Ajda Krč || 16 || || Polona Skrt || Andreja Habič || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Urban Hribar || 16 || Citratni cikel v makrofagih || Peter Škrinjar || Andrej Race || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Urška Zagorc || 16 || || Milica Janković || Anže Jenko || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Patrik Levačić || 17 || || Tina Turel || Ines Medved || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Jerneja Nimac || 17 || || Barbara Slapnik || Luka Gregorič || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Lija Srnovršnik || 17 || || Ana Maklin || Daria Latysheva || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Nika Mikulič || 18 || || Ajda Krč || Polona Skrt || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Tanja Zupan || 18 || || Urban Hribar || Peter Škrinjar || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Anja Tavčar || 18 || || Urška Zagorc || Milica Janković || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Maja Vrabec || 19 || || Patrik Levačić || Tina Turel || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Špela Deučman || 19 || || Jerneja Nimac || Barbara Slapnik || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Anja Černe || 19 || || Lija Srnovršnik || Ana Maklin || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Lea Knez || 20 || || Nika Mikulič || Ajda Krč || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Katja Doberšek || 20 || || Tanja Zupan || Urban Hribar || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Martin Špendl || 20 || || Anja Tavčar || Urška Zagorc || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Ajda Galič || 21 || || Maja Vrabec || Patrik Levačić || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Nika Zaveršek || 21 || || Špela Deučman || Jerneja Nimac || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Nika Goršek || 21 || || Anja Černe || Lija Srnovršnik || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Špela Supej || 22 || || Lea Knez || Nika Mikulič || 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Uroš Prešern || 22 || || Katja Doberšek || Tanja Zupan || 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Luka Fratina || 22 || || Martin Špendl || Anja Tavčar || 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Andreja Habič || 23 || || Ajda Galič || Maja Vrabec || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Andrej Race || 23 || || Nika Zaveršek || Špela Deučman || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Anže Jenko || 23 || || Nika Goršek || Anja Černe || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Katja Dolenc || 23 || || ? || ? || 20/01/17 || 22/01/17 || 24/01/17
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2017|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2017-seminar

2017-03-14T17:26:24Z

Barbara Slapnik: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||12.12.||12.12.||12.12.||r1||r2||r3
|-
| Nina Mezgec Mrzlikar || Regulacija gena DISC-1 kot potencialnega zdravila za shizofrenijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170105144339.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar || Emilija Bogatinova
|-
| Tina Turel || Povezanost retrovirusov z razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170112110840.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Katja Doberšek || Uroš Prešern || Nika Zaveršek
|-
| Sonja Gabrijelčič || Ribosomske mutacije spodbujajo razvoj odpornosti proti antibiotikom v okolju z več zdravilnimi učinkovinami ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170221110808.htm https://elifesciences.org/content/6/e20420 || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Mariša Cvitanič || Špela Supej || Tanja Zupan
|-
| Patrik Levačić || Prehrambni aditivi v sladkarijah ter žvečilnih gumijih lahko spremenijo funkcionalnost in strukturo prebavnih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170217012450.htm|| 28.02. || 03.03. || 06.03. || Ajda Krč || Lea Knez || Andrej Race
|-
| Nika Goršek ||Nove študije razkrivajo delovanje molekulske črpalke, ki izloča zdravila proti raku || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170224160629.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Adela Šajn || Maja Jankovič || Urška Košir
|-
| Dragana Savković || Stopnja preživetja evkariotskih celic po elektroforezni nano-injekciji || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301105437.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Milica Janković || Luka Fratina || Martin Špendl
|-
| Hana Hiršman || || || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Ajda Godec || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik
|-
| Daria Latysheva || Mehanski raztezek sproži hitro delitev epitelijskih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170215131543.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Andreja Habič || Maja Vrabec || Ines Medved
|-
| Urška Zagorc || Proteini, zgodnje opozorilo sladkorne bolezni tipa 1 || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/11/161107112428.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar
|-
| Anja Černe || Učinek farmakološkega askorbata na rakave celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170109134014.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Tina Turel || Katja Doberšek || Uroš Prešern
|-
| Barbara Slapnik ||Holesterol v celični membrani || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170117163039.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič || Špela Supej
|-
| Jerneja Nimac || S CRISPR/Cas9 nad x-vezavno obliko kronične granulomatozne bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170112110734.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Patrik Levačić || Ajda Krč || Lea Knez
|-
| Gašper Anton Komatar || || || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Nika Goršek || Adela Šajn || Maja Jankovič
|-
| Nadja Škafar || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170104154408.htm|| 21.03. || 24.03. || 27.03. || Dragana Savković || Milica Janković || Luka Fratina
|-
| Anže Jenko || || || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Hana Hiršman || Ajda Godec || Anja Tavčar
|-
| Špela Deučman || Raziskovanje vzrokov kronične zavrnitve presajenih pljuč || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301105426.htm || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Daria Latysheva || Andreja Habič || Maja Vrabec
|-
| Luka Gregorič || Merjenje količine urina v plavalnih bazenih s pomočjo merjenja koncentracije umetnih sladil || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301084913.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski
|-
| Jana Kotnik || || || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Anja Černe || Tina Turel || Katja Doberšek
|-
| Andrej Špenko || Nova tehnika za boljšo regeneracijo kostnega tkiva || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/12/161220093946.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič
|-
| Ana Maklin || || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170313102420.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Jerneja Nimac || Patrik Levačić || Ajda Krč
|-
| Emilija Bogatinova ||NO3-anioni lahko delujejo kot Lewisovo kislino v tvrdnem stanju || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170222131802.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek || Adela Šajn
|-
| Nika Zaveršek || Bakterije lahko s pomočjo posebnih sintetičnih molekul spremenimo v električne generatorje || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170209133509.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Nadja Škafar || Dragana Savković || Milica Janković
|-
| Tanja Zupan || || || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Anže Jenko || Hana Hiršman || Ajda Godec
|-
| Andrej Race || || || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Špela Deučman || Daria Latysheva || Andreja Habič
|-
| Urška Košir || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Luka Gregorič || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar
|-
| Martin Špendl || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Jana Kotnik || Anja Černe || Tina Turel
|-
| Nika Mikulič Vernik || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Andrej Špenko || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič
|-
| Ines Medved ||Kako lahko z zmanjšanim vnosom hrane upočasnimo proces staranja ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170213151306.htm || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Ana Maklin || Jerneja Nimac || Patrik Levačić
|-
| Urban Hribar || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek
|-
| Uroš Prešern || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Nika Zaveršek || Nadja Škafar || Dragana Savković
|-
| Špela Supej || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170223114801.htm || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Tanja Zupan || Anže Jenko || Hana Hiršman
|-
| Lea Knez || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170217012518.htm || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Andrej Race || Špela Deučman || Daria Latysheva
|-
| Maja Jankovič || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Urška Košir || Luka Gregorič || Urška Zagorc
|-
| Luka Fratina || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Martin Špendl || Jana Kotnik || Anja Černe
|-
| Anja Tavčar || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko || Barbara Slapnik
|-
| Maja Vrabec || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Ines Medved || Ana Maklin || Jerneja Nimac
|-
| Vesna Dimitrovski || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Urban Hribar || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar
|-
| Katja Doberšek || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170213083810.htm || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Uroš Prešern || Nika Zaveršek || Nadja Škafar
|-
| Mariša Cvitanič || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Špela Supej || Tanja Zupan || Anže Jenko
|-
| Ajda Krč || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Lea Knez || Andrej Race || Špela Deučman
|-
| Adela Šajn || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Jankovič || Urška Košir || Luka Gregorič
|-
| Milica Janković || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Luka Fratina || Martin Špendl || Jana Kotnik
|-
| Ajda Godec || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko
|-
| Andreja Habič || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Vrabec || Ines Medved || Ana Maklin
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete v PubMed povezavi [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ tukaj]
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2017_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2017_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2017_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2017_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2017_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).'''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2017 Povzetki seminarjev

2017-03-14T17:25:30Z

Barbara Slapnik: /* Barbara Slapnik: Holesterol v celični membrani */

[[TBK2017-seminar|Nazaj na osnovno stran]]
===Ana Scott: Naslov seminarja===
Tekst ....

'''Patrik Levaćić: Prehrambni aditivi v sladkarijah ter žvečilnih gumijih lahko spremenijo funkcionanlnost in strukturo prebavnih celic'''

Vnos nano delcev titanovega dioksida (TiO2) preko prehrambenih izdelkov kot so sladkarije ter žvečilni gumiji je praktično nemogoče. Prebavni trakt služi kot pomembna meja med telesom in zunanjim okoljem. Cilj raziskave je bilo opazovanje posledic vnosa 30 nano meterskih delcev titanovega dioksida preko modela celične strukture tankega črevesja ter določitev kako akutna ter kronična izpostavljenost takim delcem lahko vpliva na funkcionalnost in strukturo celice. Postopek prepoznavanja TiO2 delcev je zelo kompleksen, navadno se uporablja Ramanova spektroskopija, ki izkorišča lastnosti molekule kot so vibracijska ter rotacijska stanja, s tem pa dobimo tako imenovani ''finger-print'' molekule, saj ima vsaka molekula svoje lastnosti in se po njih loči od drugih molekul. Rezultati raziskave so potrdili, da čeprav akutna izpostavljenost ni pustila resnejših posledic na celični strukturi, ima kronična izpostavljenost kar nekaj posledic na celičnem nivoju. Spremeni se funkcionalnost celice, nivo delovanja membranskih encimov vpade, spremeni se prav tako tudi struktura, saj se zmanjša sposobnost vsrkavanja nutrientov preko mikrovilov.

'''Tina Turel: Povezanost retrovirusov z razvojem možganov'''

Možgani človeka so bistveno bolj razviti od možganov drugih sesalcev in zato veliko težji za raziskovanje in razumevanje. Številne raziskave so dokazale, da bi transportni elementi (TE-ji), ki so še pred nekaj leti veljali za neuporaben del DNA, tako imenovan »junk DNK«, lahko bili odgovorni za današnjo stopnjo razvitosti človeških možganov.
Retrovirusi so posebna skupina virusov. Nekateri veljajo za škodljive (HIV), drugi pa so povsem neškodljivi. V našem DNA je več kot 1000 različnih retrovirusov. V raziskavi, ki jo je vodil Johan Jakobsson in se je odvijala v Lundu, so dokazovali pomembno vlogo ERV-ja, endogenega retrovirusa v razvoju človeških možganov. Želeli so pokazati, da nekaj tisoč ERV-jev, mnogi so primarno specifični, delujejo kot priklopna podlaga za epigenetske represorsko beljakovino TRIM28, ki vzpostavi lokalni hetero kromatin okoli ERV-jev. Retrovirusi lahko pri vsakem človeku reagirajo drugače, saj so tak tip genetskega materiala, da se lahko nahajajo v katerem koli delu v genomu. Različna izražanja ERV-ja pa bi bila lahko tudi razlog za možganske okvare, ki povzročijo bolezni, kot so ALS, shizofrenija in bipolarna motnja .

'''Nina Mezgec Mrzlikar: Regulacija gena DISC-1 kot potencialnega zdravila za shizofrenijo'''

Shizofrenija je duševna motnja, ki se razvije v zgodnjem odraslem obdobju. DISC-1 (Disrupted-In-Schizophrenia-1) je protein, kodiran z genom DISC-1 in je močno izražen v možganskem hipokampusu. Sodeluje pri razvoju aksonov in povezovanju celic. Caveolin-1 je ogrodni protein bistven pri regulaciji receptorjev na membranah in spodbuja razvoj novih povezav med živčnimi celicami. V tej raziskavi so znanstveniki proučevali vpliv proteina Cav-1 na izražanje gena DISC-1 v živčnih celicah. Ugotovljeno je bilo, da prekomerno izražen gen Cav-1 povzroči večje izražanje gena DISC-1 in drugih sinaptičnih proteinov, ki so potrebni za prenos živčnega signala. V miših, katerim so iz hipokampusa odstranili Cav-1 je posledično prišlo do manjšega izražanja DISC-1 in hkrati drugih sinaptičnih proteinov. Izguba Cav-1 torej zmanjšuje aktivnost sinaps, kar pa je vzrok za številne nevrodegenerativne bolezni, kot je tudi shizofrenija. Ugotovitve kažejo na pomembno vlogo proteina Caveolin-1 v celicah, saj vzdržuje pravilno delovanje receptorjev in s tem prenos živčnega signala.

'''Sonja Gabrijelčič: Ribosomske mutacije spodbujajo razvoj odpornosti proti antibiotikom v okolju z več zdravilnimi učinkovinami'''

Odpornost bakterij na antibiotike je v porastu po vsem svetu. Pojavlja se tako v državah v razvoju, kjer je predvsem posledica nekvalitetnih antibiotikov, kot v najrazvitejših državah sveta, kjer se pojavlja več in več patogenov, ki lahko preživijo v okolju z več zdravilnimi učinkovinami oziroma antibiotiki. Bakterije lahko pridobijo odpornost ali z izmenjavo mobilnih genetskih elementov ali z mutacijo genetskega materiala, ki je že v celici. V raziskavi, ki jo opisuje članek, so raziskovalci želeli opazovati slednje, zato so izmed bakterij, ki so lahko sočasno odporne na več antibiotikov, izbrali Mycobacterium smegmatis, sorodnico bakterije, ki povzroča tuberkulozo, in eno od predstavnic skupine bakterij, pri kateri do izmenjevanja plazmidov praktično ne pride. Klasificirali so tipe mutacij, do katerih je prišlo, in se osredotočili predvsem na mutacije, ki so se zgodile na mestih genoma, kjer se kodirajo proteini, ki so sestavni deli ribosomov. Ugotovili so, da so taki mutanti odporni na antibiotike z različnimi mehanizmi delovanja, ki jim niso bili še nikoli izpostavljeni, na antibiotike širokega spektra in poleg tega tudi na nekatere druge mehanske strese na membrane.

'''Daria Latysheva: Mehanski raztezek sproži hitro delitev epitelijskih celic'''

Mehansko aktivni kanalčki so membranski proteini, ki so neposredno odvisni od sile in pretvarjajo mehanske držljaje v električne oz. biokemijske signale. Piezo1 je mehansko aktiven ionski kanalček, ki spodbuja celično smrt v predelih z visoko gostoto celic. V raziskavi so ugotovili, da kotrolira tudi mitotsko delitev. Raziskali so mehanizem delovanja Piezo1 v procesu celične delitve. Pri nizki gostoti celic oz. kjer so celice raztegnjene se Piezo1 lokalizira na celični membrani ter se odpre; posledično sproži influks kalcija v celico. ERK1 se aktivira zaradi povečane koncentracije Ca2+ ionov, kar vpliva na aktivnost ciklina B v G2 fazi mitotske delitve in povzroči proliferacijo. Način, na kateri Piezo1 aktivira dva nasprotna procesa je odvisen od lokacije in načina aktivacije kanalčka. V predelih z nizko gostoto celic se Piezo1 lokalizira na celični membrani ter hitro aktivira celično delitev. Če so celice razporejene tesno druga ob drugi, se Piezo1 oblikuje v velike citiplazemske agregate in spodbuja celično smrt. Zaradi sposobnosti zaznave mehanskega raztezka ter prevelike in premajhne gostote celic Piezo 1 deluje kot homeostatski senzor in kontrolira število epitelijskih celic.

'''Nika Goršek: Nove študije razkrivajo delovanje molekulske črpalke, ki izloča zdravila proti raku'''

MRP1 ali »Multidrug resistance protein« je protein, ki spada v družino ABC-transporterjev. Pomemben je pri reguliranju redoks homeostaze, vnetij in sekrecije hormonov. Znano je tudi, da ima pomembno vlogo pri odpornosti na zdravila in njihovem črpanju iz celic. V raziskavi na univerzi Rockefeller so z uporabo elektronske kriomikroskopije določili njegovo zgradbo. Sestavljajo ga štirje glavni deli: dva transmembranska dela, ki tvorita telo transporterja, dva dela, ki vežeta ATP, motiv v obliki lase in N-terminalni transmembranski del. Čeprav ima MRP1 dva dela, ki bi lahko vezala ATP, pa tega veže le en, saj pri drugem delu pride do drugačnega zaporedja aminokislin. V raziskavah so dokazali, da mutacije določenih delov proteina vodijo v bolezenska stanja in da bi sprememba le ene aminokisline v zaporedju vplivala na aktivnost proteina. MRP1 ima le eno dvojno vezavno mesto, ki je pozitivno nabito. Pestrost substratov je zaradi takega vezavnega mesta veliko večja, kot pri nekaterih drugih znanih proteinih. Prenaša lahko organske, amfipatične in aninonske molekule, na primer zdravila proti raku, opijate, antidepresive in tudi nekatere za življenje pomembne snovi (hormoni in protivnetne molekule). Ob vezavi substrata se oblika proteina MRP1 spremeni, aktivnost pa se poveča. Po končanem transportu pa protein preide nazaj v prvotno, neaktivno obliko.

'''Dragana Savković: Stopnja preživetja evkariontskih celic po elektroforezni nanoinjekciji'''

Znotrajcelična dostava makromolekul je pomemben korak za terapevtske in raziskovalne namene. Za uvajanje tujih molekul v citoplazmo živih celic uporabljale so se metode, katere so se v večini primerov uporabljale za veliko število celic v kulturi in je splošno znano, da veliko število teh celic (do 50%) ne preživi ta proces. Da bi rešili ta problem, razvili so alternativno metodo znotrajcelične dobave, oziroma znotrajcelično elektroforezno nanoinjekcijo. V raziskavi so primerjali stopnjo preživetja celic injiciranih z pipeto s premerom 100 nm in pipeto s premerom 500 nm. Ugotovili so, da je stopnja preživetja z uporabo 100 nm pipeto veliko večja kot s 500 nm pipeto in tudi da ostale preživele celice kažejo bolj naraven cikel celic.

'''Urška Zagorc: Proteini, zgodnje opozorilo sladkorne bolezni tipa 1'''

Sladkorna bolezen tipa 1, ki je značilna predvsem za otroke in mladostnike, je posledica motnje v imunskem sistemu. Organizem uniči lastne celice v trebušni slinavki, ki proizvajajo inzulin. Ta omogoča glukozi iz hrane vstop v celico, s čimer celica dobi hrano in energijo. V raziskavi nemškega raziskovalnega centra za zdravje in okolje Helmholtz Zentrum München so sodelovali otroci, katerih ožji družinski član ima diabetes tipa 1 in otroci brez dednih dispozicij. Analizirali so krvne vzorce otrok z avto-protitelesi ter jih primerjala z vzorci otrok, ki ne kažejo znakov bolezni niti nimajo protiteles.Identificirali so 41 peptidov iz 26 proteinov, ki se razlikujejo v krvnih vzorcih tistih otrok s protitelesi in tistih brez. Glede na koncentracijo peptidov v treh proteinih (hepatocitni rastni faktor HGF, istem komplementa H in ceruloplazmin) in glede na starost otroka, so dosegli tudi boljšo oceno hitrosti razvoja bolezni. Večja koncentracija sistema komplementa H in hepatocitnega rastnega faktorja ter nižja koncentracija ceruloplazmina pri tem nižji starosti bolnika, pomenijo hitrejši napredek bolezni. Identificirani proteini nam pokažejo bolj natančno oceno stopnje pred pojavom simptomov. Zaradi njih je možno tudi ugotoviti ali ima bolnik s protitelesi, večjo ali manjšo možnost za razvoj sladkorne bolezni tipa 1 in kako hitro se bo bolezen razvila.

'''Anja Černe: Uporaba askorbata pri zdravljenju raka'''

Če askorbat vnesemo v organizem v manjših koncentracijah ima antioksidativne učinke, medtem ko se pri vnosu v večjih koncentracijah obnaša kot prooksidant. Farmakološko koncentriran askorbat povzroča tok izvenceličnega H2O2 v celico in vse celice, tako zdrave kot rakave, encimsko razgrajujejo H2O2, ki je zanje toksičen. Glavni encimi, ki razgrajujejo H2O2 pri velikih količinah so katalaze. Ker pa je katalaz v rakavih celicah malo, so rakave celice bolj dovzetne škodljive učinke, zato je askorbat zanje selektivno toksičen. Katalazna aktivnost v rakavih celicah lahko napove, kako se bo tumor odzval na terapijo z askorbatom. Pri nekaterih vrstah tkiv je rast tumorjev bolj upočasnjena, pri drugih manj (odvisnost od količine katalaz, ki jih tkivo vsebuje). Število aktivnih katalaznih monomerov na celico in ED50 (koločina snovi, ki učinkuje pri 50% osebkih) sta sorazmerna s konstanto celične razgradnje H2O2. Radikali, ki nastanejo pri reakciji med ionom kovine in H2O2, poškodujejo DNA, v kolikšni meri se to zgodi pa je odvisno od količine askorbata.

'''Jerneja Nimac: S CRISPR/Cas9 nad X-vezavno kronično granulomatozno bolezen'''

Kronična granulomatozna bolezen je dedna bolezen imunskega sistema, ki nastane zaradi mutacije v genu CYBB, ki kodira gp91phox. Slednji je katalitični center NADPH oksidaze 2 (NOX2), ki ima pomembno vlogo pri obrambi organizma pred okužbami. Mutacije v genu CYBB na kromosomu Xp21.1 pa so odgovorne za X-vezavni obliko kronične granulomatozne bolezni. Za popravljanje takšne monogenske mutacije so v raziskavi uporabili sistem CRISPR/Cas9. Ta sistem so za obrambo pred virusnimi okužbami razvile bakterije in arheje, gre pa za poseben od RNA odvisen sistem pridobljene imunosti, ki specifično prepozna in reže tujo tarčno DNA. V raziskavi so skušali s sistemom CRISPR/Cas9 popraviti mutacijo C676T na eksonu 7 gena CYBB. Z DHR testi so ugotovili, da s CRISPR/Cas9 popravljene mieloične celice obnovijo aktivnost NOX2 in ponovno izražajo protein gp91phox. S spreminjanjem količine ssODN pa dokazali, da je stopnja popravljenih genov večja, če je količina ssODN večja, delež indelov pa se zmanjša. Prav tako so potrdili uspešno presaditev s CRISPR/Cas9 popravljenih krvotvornih matičnih in predniških celic in njihovo diferenciacijo v nepoškodovane mieloične in limfocitne celice v NSG miših v obdobju petih mesecev.

'''Barbara Slapnik: Holesterol v celični membrani'''

Holesterol je razporejen po celični membrani. Pomemben je za vzdrževanje membranske fluidnosti, membrano naredi bolj togo in manj prepustno. Njegova porazdelitev med zunanjim in notranjim fosfolipidnim slojem pa ni enakomerna. V raziskavi so razvili dopolnilne senzorje, ki omogočajo vpogled holesterola v obeh slojih sočasno in določili njegovo točno koncentracijo. Ugotovili so, da je koncentracija holesterola v zunanjem sloju celične membrane znatno višja kot koncentracija v notranjem sloju. Visoka koncentracija holesterola v zunanjem sloju celične membrane zmanjša njeno prepustnost, medtem ko nizka koncentracija holesterola v notranjem sloju omogoča celično sporočanje. Rezultati prikazujejo pomen transbilarne asimetrije holesterola v celični membrani in njegovo prerazporeditev za celično homeostazo, rast in razmnoževanje. Podajajo tudi povezavo med holesterolom v notranjem sloju celične membrane in rakom. Določili so točno koncentracijo holesterola, kar jim omogoča boljšo diagnostiko in zdravljenje raka, vendar so za to potrebne še nadaljnje raziskave. Rezultati prav tako predstavljajo osnovo za nadaljnje študije transbilarne dinamike in funkcij holesterola in drugih lipidov v celici.

TBK2017-seminar

2017-03-05T17:00:55Z

Barbara Slapnik: /* Temelji biokemije- seminar */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||12.12.||12.12.||12.12.||r1||r2||r3
|-
| Nina Mezgec Mrzlikar || Regulacija gena DISC-1 kot potencialnega zdravila za shizofrenijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170105144339.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar || Emilija Bogatinova
|-
| Tina Turel || Povezanost retrovirusov z razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170112110840.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Katja Doberšek || Uroš Prešern || Nika Zaveršek
|-
| Sonja Gabrijelčič || Ribosomske mutacije spodbujajo razvoj odpornosti proti antibiotikom v okolju z več zdravilnimi učinkovinami ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170221110808.htm https://elifesciences.org/content/6/e20420 || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Mariša Cvitanič || Špela Supej || Tanja Zupan
|-
| Patrik Levačić || Prehrambni aditivi v sladkarijah ter žvečilnih gumijih lahko spremenijo funkcionalnost in strukturo prebavnih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170217012450.htm|| 28.02. || 03.03. || 06.03. || Ajda Krč || Lea Knez || Andrej Race
|-
| Nika Goršek ||Nove študije razkrivajo delovanje molekulske črpalke, ki izloča zdravila proti raku || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170224160629.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Adela Šajn || Maja Jankovič || Urška Košir
|-
| Dragana Savković || Stopnja preživetja evkariotskih celic po elektroforezni nano-injekciji || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301105437.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Milica Janković || Luka Fratina || Martin Špendl
|-
| Hana Hiršman || || || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Ajda Godec || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik
|-
| Daria Latysheva || Mehanski raztezek sproži hitro delitev epitelijskih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170215131543.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Andreja Habič || Maja Vrabec || Ines Medved
|-
| Urška Zagorc || Proteini, zgodnje opozorilo diabetesa tipa 1 || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/11/161107112428.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar
|-
| Anja Černe || Presnova vodikovega peroksida in učinek farmakološkega askorbata na rakave celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170109134014.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Tina Turel || Katja Doberšek || Uroš Prešern
|-
| Barbara Slapnik ||Vloga holesterola v celici || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170117163039.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič || Špela Supej
|-
| Jerneja Nimac || S CRISPR/Cas9 nad x-vezavno obliko kronične granulomatozne bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170112110734.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Patrik Levačić || Ajda Krč || Lea Knez
|-
| Gašper Anton Komatar || || || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Nika Goršek || Adela Šajn || Maja Jankovič
|-
| Nadja Škafar || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170104154408.htm|| 21.03. || 24.03. || 27.03. || Dragana Savković || Milica Janković || Luka Fratina
|-
| Anže Jenko || || || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Hana Hiršman || Ajda Godec || Anja Tavčar
|-
| Špela Deučman || Raziskovanje vzrokov kronične zavrnitve presajenih pljuč || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301105426.htm || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Daria Latysheva || Andreja Habič || Maja Vrabec
|-
| Luka Gregorič || || || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski
|-
| Jana Kotnik || || || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Anja Černe || Tina Turel || Katja Doberšek
|-
| Andrej Špenko || Nova tehnika za boljšo regeneracijo kostnega tkiva || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/12/161220093946.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič
|-
| Ana Maklin || || || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Jerneja Nimac || Patrik Levačić || Ajda Krč
|-
| Emilija Bogatinova || || || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek || Adela Šajn
|-
| Nika Zaveršek || Bakterije lahko s pomočjo posebnih sintetičnih molekul spremenimo v električne generatorje || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170209133509.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Nadja Škafar || Dragana Savković || Milica Janković
|-
| Tanja Zupan || || || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Anže Jenko || Hana Hiršman || Ajda Godec
|-
| Andrej Race || || || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Špela Deučman || Daria Latysheva || Andreja Habič
|-
| Urška Košir || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Luka Gregorič || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar
|-
| Martin Špendl || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Jana Kotnik || Anja Černe || Tina Turel
|-
| Nika Mikulič Vernik || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Andrej Špenko || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič
|-
| Ines Medved ||Kako lahko z zmanjšanim vnosom hrane upočasnimo proces staranja ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170213151306.htm || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Ana Maklin || Jerneja Nimac || Patrik Levačić
|-
| Urban Hribar || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek
|-
| Uroš Prešern || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Nika Zaveršek || Nadja Škafar || Dragana Savković
|-
| Špela Supej || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Tanja Zupan || Anže Jenko || Hana Hiršman
|-
| Lea Knez || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Andrej Race || Špela Deučman || Daria Latysheva
|-
| Maja Jankovič || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Urška Košir || Luka Gregorič || Urška Zagorc
|-
| Luka Fratina || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Martin Špendl || Jana Kotnik || Anja Černe
|-
| Anja Tavčar || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko || Barbara Slapnik
|-
| Maja Vrabec || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Ines Medved || Ana Maklin || Jerneja Nimac
|-
| Vesna Dimitrovski || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Urban Hribar || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar
|-
| Katja Doberšek || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Uroš Prešern || Nika Zaveršek || Nadja Škafar
|-
| Mariša Cvitanič || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Špela Supej || Tanja Zupan || Anže Jenko
|-
| Ajda Krč || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Lea Knez || Andrej Race || Špela Deučman
|-
| Adela Šajn || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Jankovič || Urška Košir || Luka Gregorič
|-
| Milica Janković || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Luka Fratina || Martin Špendl || Jana Kotnik
|-
| Ajda Godec || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko
|-
| Andreja Habič || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Vrabec || Ines Medved || Ana Maklin
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete v PubMed povezavi [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ tukaj]
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2017_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2017_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2017_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2017_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2017_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).'''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.