Wiki FKKT - User contributions [en]

MBT seminarji 2019

2019-04-23T20:48:15Z

Bk6146:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2018/19'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (14. marec) 
# Production of functional human interleukin 37 using plants (N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma; Plant Cell Rep. 38 (3), Mar. 2019; https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_funkcionalnega_%C4%8Dlove%C5%A1kega_IL37_v_rastlinah Proizvodnja funkcionalnega človeškega interlevkina 37 v rastlinah. Špela Malenšek]

'''Gensko spremenjene živali''' (21. marec) 
# Myopia disease mouse models: a missense point mutation (S673G) and a protein-truncating mutation of the ''Zfp644'' mimic human disease phenotype. (K. I. Szczerkowska ''et al.''; Cell Biosci. 9, 2019; https://doi.org/10.1186/s13578-019-0280-4). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mi%C5%A1ji_modeli_kratkovidnosti:_druga%C4%8Dnopomenska_to%C4%8Dkovna_mutacija_%28S673G%29_in_skraj%C5%A1evalna_mutacija_v_Zfp644_posnemata_fenotip_%C4%8Dlove%C5%A1ke_bolezni Mišji modeli kratkovidnosti: drugačnopomenska točkovna mutacija (S673G) in skrajševalna mutacija v ''Zfp644'' posnemata fenotip človeške bolezni] Rok Miklavčič
# A chicken bioreactor for efficient production of functional cytokines (Herron L.R. ''et al.''; BMC Biotechnol. 18 (1), Dec. 2018; https://doi.org/10.1186/s12896-018-0495-1).[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_kokošjega_bioreaktorja_za_učinkovito_proizvodnjo_funkcionalnih_citokinov Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov] Blaž Lebar
# Influence of a growth hormone transgene on the genetic architecture of growth-related traits: A comparative analysis between transgenic and wild-type coho salmon (M. Kodama, K. A. Naish in R. H. Devlin; Evol Appl. 11(10), 2018; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6231474/). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vpliv_transgena_rastnega_hormona_na_genetsko_arhitekturo_lastnosti_povezanimi_z_rastjo Vpliv transgena rastnega hormona na genetsko arhitekturo lastnosti povezanimi z rastjo: primerjalna analiza transgenega srebrnega lososa in srebrnega lososa divjega tipa] Nuša Kelhar

'''Okolje''' (4. april) 
# Bioremediation of soil long-term contaminated with PAHs by algal-bacterial synergy of Chlorella sp. MM3 and Rhodococcus wratislaviensis strain 9 in slurry phase (S.R.Subashchandrabose, K. Venkateswarlu in K. Venkidusamy; Sci. Total Environ., 2019; https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S004896971835349X). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bioremediacija_zemlje%2C_dolgotrajno_kontaminirane_s_PAH Bioremediacija zemlje, dolgotrajno kontaminirane s policikličnimi aromatskimi ogljikovodiki z sinergijo alge Chlorella sp. MM3 in seva 9 bakterije Rhodococcus wratislaviensis v suspenziji.] Eva Rajh
# Anaerobic degradation of xenobiotic isophthalate by the fermenting bacterium ''Syntrophorhabdus aromaticivorans'' (M. Junghare, D. Spiteller in B. Schink; ISME J, 2019; https://doi.org/10.1038/s41396-019-0348-5). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Anaerobna_razgradnja_izoftalata_pri_fermentacijski_bakteriji_Syntrophorhabdus_aromaticivorans Anaerobna razgradnja ksenobiotika izoftalata pri fermentirajoči bakteriji ''Syntrophorhabdus aromaticivorans'']. Elvira Boršič
# Biodegradation and toxicity of emerging contaminants: Isolation of an exopolysaccharide-producing ''Sphingomonas sp.'' for ionic liquids bioremediation. (M. Koutinas ''et al.''; J. Haz. Mat. 365, Mar. 2019; https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2018.10.059). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biorazgradnja_in_toksičnost_nastalih_produktov Biorazgradnja in toksičnost nastalih produktov: izolacija mikroorganizma Sphingomonas MKIV, ki proizvaja eksopolisaharide, za bioremediacijo ionskih tekočin] Katja Dolenc

'''Terapevtski proteini in protitelesa''' (11. april) 
# Constructive approach for synthesis of a functional IgG using a reconstituted cell-free protein synthesis system (S. Murakami ''et al''; Scientific Reports 9, 2019; https://doi.org/10.1038/s41598-018-36691-8). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovit_pristop_za_sintezo_funkcionalnega_IgG_z_uporabo_rekonstruiranega_brezceli%C4%8Dnega_sistema_za_sintezo_proteinov Učinkovit pristop za sintezo funkcionalnega IgG z uporabo rekonstruiranega brezceličnega sistema za sintezo proteinov.] Vida Štrancar
# New therapeutic approach for targeting Hippo signalling pathway (L. Dominguez-Berrocal ''et al''; Scientific Reports 9(4771), 2019; https://www.nature.com/articles/s41598-019-41404-w). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nov_terapevtski_pristop_za_ciljanje_signalne_poti_Hippo Nov terapevtski pristop za ciljanje signalne poti Hippo.] Ana Halužan Vasle
# Use of a design of experiments approach to optimise production of a recombinant antibody fragment in the periplasm of Escherichia coli: selection of signal peptide and optimal growth conditions (Kasli ''et al''. AMB Expr (2019) 9:5; https://doi.org/10.1186/s13568-018-0727-8). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_pristopa_načrtovanja_eksperimentov_za_optimizacijo_proizvodnje_rekombinantnega_fragmenta_protitelesa_v_periplazmi_Escherichie_coli:_izbira_signalnega_peptida_in_optimalnih_pogojev_rasti Uporaba pristopa načrtovanja eksperimentov za optimizacijo proizvodnje rekombinantnega fragmenta protitelesa v periplazmi ''Escherichie coli'': izbira signalnega peptida in optimalnih pogojev rasti.] Nina Mavec

'''Diagnostiki in cepiva''' (18. april) 
# A viral-vectored RSV vaccine induces long-lived humoral immunity in cotton rats (J. Grieves, Z. Yin, A. Garcia-Sastre et al.; Vaccine 36(26), 2018; https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2018.04.089) [[Cepivo proti RSV, pripravljeno z virusnim vektorjem, inducira dolgotrajno humoralno imunost pri bombažnih podganah]]. Nina Kobe
# Optimization of a multivalent peptide vaccine for nicotine addiction (D. F. Zeigler, R. Roque, C. H. Clegg; Vaccine 37(12), 2019; https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.02.003) [[Optimizacija večvalentnega peptidnega cepiva za nikotinsko odvisnost]]. Iza Oblak
# Design of a Type-1 Diabetes Vaccine Candidate Using Edible Plants Expressing a Major Autoantigen (E. Bertini ''et al''., Front. Plant Sci. 9, 2018 https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00572) [[Načrtovanje kandidatnega cepiva za diabetes tipa I s pomočjo užitnih rastlin, ki izražajo pomemben avtoantigen]]. Katarina Petra van Midden

'''LMW učinkovine''' (25. april) 
# Metabolic engineering of ''Escherichia coli'' for de novo biosynthesis of vitamin B12 (H. Fang ''et al.'', Nat Commun. 9(1), 2018 https://doi.org/10.1038/s41467-018-07412-6). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_bakterije_Escherichia_coli_za_de_novo_sintezo_vitamina_B12 Metabolno inženirstvo bakterije ''Escherichia coli'' za ''de novo'' sintezo vitamina B12]. Valentina Novak
# Genome-Wide Mutagenesis Links Multiple Metabolic Pathways with Actinorhodin Production in ''Streptomyces coelicolor'' (Z. Xu ''et al'', Appl. Environ. Microbiol. 85(7), 2019, https://doi.org/10.1128/AEM.03005-18). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mutageneza_celotnega_genoma_odkriva_povezave_med_metabolnimi_potmi_in_produkcijo_aktinorhodina_v_Streptomyces_coelicolor Mutageneza celotnega genoma odkriva povezave med metabolnimi potmi in produkcijo aktinorhodina v ''Streptomyces coelicolor''.] David Titovšek
# Cost-effective production of recombinant peptides in ''Escherichia coli'' (A. Gaglione ''et al'', N. Biotechnol. 51, 2019, https://doi.org/10.1016/j.nbt.2019.02.004.) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Stro%C5%A1kovno_u%C4%8Dinkovita_proizvodnja_rekombinantnih_peptidov_v_Escherichia_coli Stroškovno učinkovita proizvodnja rekombinantnih peptidov v ''Escherichia coli''] Bor Klančnik

'''Male molekule in polimeri''' (9. maj) 
# Primož Bembič
# Karin Dobravc Škof
# Jaka Kos

'''Pretvorba biomase in bioenergenti''' (16. maj) 
# Maksimiljan Adamek
# Aljoša Marinko
# Jošt Hočevar

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (23. maj) 
# Katja Kunčič
# Peter Pečan

'''Rezervni termin''' (30. maj) 
# Mia Žganjar
# Engineering Protein-Secreting Plasma Cells by Homology-Directed Repair in Primary Human B Cells (Hung ''et al.'', Mol Ther. 7;26(2):456-467. <noinclude>https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.11.012</noinclude>). Inženirstvo spreminjanja plazmatk s popravljanjem primarnih človeških celic B na osnovi homologije. Nives Ražnjević
# Ana Müller

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

MBT seminarji 2019

2019-04-23T20:47:32Z

Bk6146:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2018/19'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (14. marec) 
# Production of functional human interleukin 37 using plants (N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma; Plant Cell Rep. 38 (3), Mar. 2019; https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_funkcionalnega_%C4%8Dlove%C5%A1kega_IL37_v_rastlinah Proizvodnja funkcionalnega človeškega interlevkina 37 v rastlinah. Špela Malenšek]

'''Gensko spremenjene živali''' (21. marec) 
# Myopia disease mouse models: a missense point mutation (S673G) and a protein-truncating mutation of the ''Zfp644'' mimic human disease phenotype. (K. I. Szczerkowska ''et al.''; Cell Biosci. 9, 2019; https://doi.org/10.1186/s13578-019-0280-4). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mi%C5%A1ji_modeli_kratkovidnosti:_druga%C4%8Dnopomenska_to%C4%8Dkovna_mutacija_%28S673G%29_in_skraj%C5%A1evalna_mutacija_v_Zfp644_posnemata_fenotip_%C4%8Dlove%C5%A1ke_bolezni Mišji modeli kratkovidnosti: drugačnopomenska točkovna mutacija (S673G) in skrajševalna mutacija v ''Zfp644'' posnemata fenotip človeške bolezni] Rok Miklavčič
# A chicken bioreactor for efficient production of functional cytokines (Herron L.R. ''et al.''; BMC Biotechnol. 18 (1), Dec. 2018; https://doi.org/10.1186/s12896-018-0495-1).[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_kokošjega_bioreaktorja_za_učinkovito_proizvodnjo_funkcionalnih_citokinov Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov] Blaž Lebar
# Influence of a growth hormone transgene on the genetic architecture of growth-related traits: A comparative analysis between transgenic and wild-type coho salmon (M. Kodama, K. A. Naish in R. H. Devlin; Evol Appl. 11(10), 2018; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6231474/). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vpliv_transgena_rastnega_hormona_na_genetsko_arhitekturo_lastnosti_povezanimi_z_rastjo Vpliv transgena rastnega hormona na genetsko arhitekturo lastnosti povezanimi z rastjo: primerjalna analiza transgenega srebrnega lososa in srebrnega lososa divjega tipa] Nuša Kelhar

'''Okolje''' (4. april) 
# Bioremediation of soil long-term contaminated with PAHs by algal-bacterial synergy of Chlorella sp. MM3 and Rhodococcus wratislaviensis strain 9 in slurry phase (S.R.Subashchandrabose, K. Venkateswarlu in K. Venkidusamy; Sci. Total Environ., 2019; https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S004896971835349X). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bioremediacija_zemlje%2C_dolgotrajno_kontaminirane_s_PAH Bioremediacija zemlje, dolgotrajno kontaminirane s policikličnimi aromatskimi ogljikovodiki z sinergijo alge Chlorella sp. MM3 in seva 9 bakterije Rhodococcus wratislaviensis v suspenziji.] Eva Rajh
# Anaerobic degradation of xenobiotic isophthalate by the fermenting bacterium ''Syntrophorhabdus aromaticivorans'' (M. Junghare, D. Spiteller in B. Schink; ISME J, 2019; https://doi.org/10.1038/s41396-019-0348-5). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Anaerobna_razgradnja_izoftalata_pri_fermentacijski_bakteriji_Syntrophorhabdus_aromaticivorans Anaerobna razgradnja ksenobiotika izoftalata pri fermentirajoči bakteriji ''Syntrophorhabdus aromaticivorans'']. Elvira Boršič
# Biodegradation and toxicity of emerging contaminants: Isolation of an exopolysaccharide-producing ''Sphingomonas sp.'' for ionic liquids bioremediation. (M. Koutinas ''et al.''; J. Haz. Mat. 365, Mar. 2019; https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2018.10.059). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biorazgradnja_in_toksičnost_nastalih_produktov Biorazgradnja in toksičnost nastalih produktov: izolacija mikroorganizma Sphingomonas MKIV, ki proizvaja eksopolisaharide, za bioremediacijo ionskih tekočin] Katja Dolenc

'''Terapevtski proteini in protitelesa''' (11. april) 
# Constructive approach for synthesis of a functional IgG using a reconstituted cell-free protein synthesis system (S. Murakami ''et al''; Scientific Reports 9, 2019; https://doi.org/10.1038/s41598-018-36691-8). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovit_pristop_za_sintezo_funkcionalnega_IgG_z_uporabo_rekonstruiranega_brezceli%C4%8Dnega_sistema_za_sintezo_proteinov Učinkovit pristop za sintezo funkcionalnega IgG z uporabo rekonstruiranega brezceličnega sistema za sintezo proteinov.] Vida Štrancar
# New therapeutic approach for targeting Hippo signalling pathway (L. Dominguez-Berrocal ''et al''; Scientific Reports 9(4771), 2019; https://www.nature.com/articles/s41598-019-41404-w). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nov_terapevtski_pristop_za_ciljanje_signalne_poti_Hippo Nov terapevtski pristop za ciljanje signalne poti Hippo.] Ana Halužan Vasle
# Use of a design of experiments approach to optimise production of a recombinant antibody fragment in the periplasm of Escherichia coli: selection of signal peptide and optimal growth conditions (Kasli ''et al''. AMB Expr (2019) 9:5; https://doi.org/10.1186/s13568-018-0727-8). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_pristopa_načrtovanja_eksperimentov_za_optimizacijo_proizvodnje_rekombinantnega_fragmenta_protitelesa_v_periplazmi_Escherichie_coli:_izbira_signalnega_peptida_in_optimalnih_pogojev_rasti Uporaba pristopa načrtovanja eksperimentov za optimizacijo proizvodnje rekombinantnega fragmenta protitelesa v periplazmi ''Escherichie coli'': izbira signalnega peptida in optimalnih pogojev rasti.] Nina Mavec

'''Diagnostiki in cepiva''' (18. april) 
# A viral-vectored RSV vaccine induces long-lived humoral immunity in cotton rats (J. Grieves, Z. Yin, A. Garcia-Sastre et al.; Vaccine 36(26), 2018; https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2018.04.089) [[Cepivo proti RSV, pripravljeno z virusnim vektorjem, inducira dolgotrajno humoralno imunost pri bombažnih podganah]]. Nina Kobe
# Optimization of a multivalent peptide vaccine for nicotine addiction (D. F. Zeigler, R. Roque, C. H. Clegg; Vaccine 37(12), 2019; https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.02.003) [[Optimizacija večvalentnega peptidnega cepiva za nikotinsko odvisnost]]. Iza Oblak
# Design of a Type-1 Diabetes Vaccine Candidate Using Edible Plants Expressing a Major Autoantigen (E. Bertini ''et al''., Front. Plant Sci. 9, 2018 https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00572) [[Načrtovanje kandidatnega cepiva za diabetes tipa I s pomočjo užitnih rastlin, ki izražajo pomemben avtoantigen]]. Katarina Petra van Midden

'''LMW učinkovine''' (25. april) 
# Metabolic engineering of ''Escherichia coli'' for de novo biosynthesis of vitamin B12 (H. Fang ''et al.'', Nat Commun. 9(1), 2018 https://doi.org/10.1038/s41467-018-07412-6). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_bakterije_Escherichia_coli_za_de_novo_sintezo_vitamina_B12 Metabolno inženirstvo bakterije ''Escherichia coli'' za ''de novo'' sintezo vitamina B12]. Valentina Novak
# Genome-Wide Mutagenesis Links Multiple Metabolic Pathways with Actinorhodin Production in ''Streptomyces coelicolor'' (Z. Xu ''et al'', Appl. Environ. Microbiol. 85(7), 2019, https://doi.org/10.1128/AEM.03005-18). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mutageneza_celotnega_genoma_odkriva_povezave_med_metabolnimi_potmi_in_produkcijo_aktinorhodina_v_Streptomyces_coelicolor Mutageneza celotnega genoma odkriva povezave med metabolnimi potmi in produkcijo aktinorhodina v ''Streptomyces coelicolor''.] David Titovšek
# Cost-effective production of recombinant peptides in ''Escherichia coli'' (A. Gaglione ''et al'', N. Biotechnol. 51, 2019, https://doi.org/10.1016/j.nbt.2019.02.004.) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Stro%C5%A1kovno_u%C4%8Dinkovita_proizvodnja_rekombinantnih_peptidov_v_Escherichia_coli Stroškovno učinkovita proizvodnja rekombinantnih peptidov v Escherichia coli] Bor Klančnik

'''Male molekule in polimeri''' (9. maj) 
# Primož Bembič
# Karin Dobravc Škof
# Jaka Kos

'''Pretvorba biomase in bioenergenti''' (16. maj) 
# Maksimiljan Adamek
# Aljoša Marinko
# Jošt Hočevar

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (23. maj) 
# Katja Kunčič
# Peter Pečan

'''Rezervni termin''' (30. maj) 
# Mia Žganjar
# Engineering Protein-Secreting Plasma Cells by Homology-Directed Repair in Primary Human B Cells (Hung ''et al.'', Mol Ther. 7;26(2):456-467. <noinclude>https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.11.012</noinclude>). Inženirstvo spreminjanja plazmatk s popravljanjem primarnih človeških celic B na osnovi homologije. Nives Ražnjević
# Ana Müller

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

Stroškovno učinkovita proizvodnja rekombinantnih peptidov v Escherichia coli

2019-04-23T20:26:10Z

Bk6146: New page: <h2>Protimikrobni peptidi</h2> Protimikrobni peptidi -AMPs (ali »Host defence peptides-HDPs«) so majhni kationski bioaktivni peptidi, ki so del prirojenega imunskega sistema veliko orga...

<h2>Protimikrobni peptidi</h2>

Protimikrobni peptidi -AMPs (ali »Host defence peptides-HDPs«) so majhni kationski bioaktivni peptidi, ki so del prirojenega imunskega sistema veliko organizmov. Zaradi širokega spektra bioloških aktivnosti, dokazano uničujejo tako gram pozitivne kot tudi gram negativne bakterije, viruse, glive kot tudi rakave celice, imajo AMP-ji širok uporabnost, tako terapevtsko, kot tudi industrijsko.
Do danes je bilo odkritih več kot 2 500 različnih protimikrobnih peptidov. V glavnem je njihova izolacija in pridobivanje zamudno in zelo oteženo pri večjih količinah peptidov. Njihova kemijska sinteza je sicer učinkovita, vendar na majhne količine omejena s samo dolžino peptida (nekje do 30 aminokislin).

Zaradi neučinkovitosti takih sintez je rekombinanta DNA tehnologija način profitabilne in učinkovite proizvodnje takih peptidov. Kljub uspešnemu pridobivanju določenih AMP-jev z rekombinantnimi tehnikami v ''Escherichia coli'', naletimo tudi pri tem na določene težave. Protimikrobne lastnosti peptidov jih naredijo potencialno nevarne za baterije proizvajalke. Zaradi majhne velikosti in kationske narave so toliko bolj dovzetni za proteolitično razgradnjo.

Primerna tehnika, ki zaobide slednje težave, je priprava fuzijskih proteinov. Peptidi so s fuzijo pripreti tako na nosilni protein, iz katerega se cepijo s kemijsko cepitvijo na točno določenem mestu na med nosilni proteinom in petidom. Taka oblika spominja na prekurzorsko obliko petidov, kjer nosilni protein prevzame vlogo pro-segmenta naravnega peptida. Tako se izognemo tokisičnosti do bakterij v kateri proizvajamo peptid in proteolitični degradacijami s proteazami.
Tak nov nosilni protein predstavlja denaturirana onkonaza (ONC), ribonukleaza. Je majhen protein ki je lahko izražena v velikih količinah v inkluzijskih telescih. Njena topnost pa je močno odvisna od pH (denaturirana oblika topna samo pri pH = 4), kar omogoča čiščenje AMP-jev topnih pri pH 7.
Takim himernim konstruktom so dodali His tag zaporedje za lažje čiščenje in pa kratek »linker« ter Asp-Pro dipeptidom ki se cepi v kislih pogojih, kar sprosti peptid iz nosilca.

<h2>Novo gojišče in avto-indukcija</h2>

<h3>NAB</h3>

V članku so razvili novo tekoče gojišče in vzpostavili avto-inducirano izražanja v namen razširitve proizvodnje peptidov na velik in učinkovit obseg. Postopek so uspešno uvedli za peptid GKY20 – kratek kationski AMP iz C-končne regije človeškega trombina ter za dva HDP-ja, ki sta izoforma humanega Apolipopreteina B (ApoB).
V eksperimentih so uporabili seve E.coli BL21(DE3) in BL21(DE3)pLysS. Za pripravo fuzijskih proteinov so vzeli cDNA zapisujoče za protimikrobne peptide in jih klonirali v vektorju pET-22b(+).
Na novo so razvili gojišče delno definirano srednje bogato gojišče poimenovano tekoče gojišče Notomista-Arciello (NAB), v želji da bi dobili veliko celično gosto in višje izražanje rekombinantnih peptidov. V gojišču NAB so izvlečke kvasovk zamenjali s triptonom. Ker tripton lahko vsebuj laktozo, so dodali gojišču tudi glukozo v izogib bazalni indukciji izražanja rekombinantih konstruktov. V NAB so dodali tudi mešanico soli za zagotavljanje optimalne količine kofaktorskih kovinskih ionov. Poleg tega so dodali še amonijev citrat, ki je služil koz pufer in kot kelator, ter osmolit betain.
NAB gojišče so primerjali s konvencionalnim tekočim gojiščem TB, tako da so transformirane bakterijske celice gojili v obeh ob prisotnosti ampicilina. Izražanje peptidov v NAB gojišču je bili 1.5-1.6 krat večje kot v TB gojišču. NAB gojišče v primerjavi tako omogoča večjo biomaso in večjo proizvodnjo fuzijskega proteina.

<h3>Avto-indukcija izražanja peptidov</h3>

V želji, da bi dodatno optimizirali in vidno zmanjšali stroške proizvodnje, so vpeljali avto-indukcijski protokol. Gojišče NAB se je izkazalo primerno za ta protokol, zaradi primerne vsebine anorganskih soli. Gojišču so dodali 0,4% glicerola, 1,92 g/L laktoze in 0,5 g/L glukoze (za hitro rast celic in zaustavljanje razgradnje laktoze) – iNAB gojišče. Na ta način se je razgradnja laktoze šele začela po porabljeni glukozi in s tem avtomatsko inducirala izražanje rekombinantnega proteina pod promotorjem T7. temu tako je zaradi diauksičnega premika. Za razliko pri postopkih z IPTG indukcijo, je indukcija tukaj avtomatska in ni potrebnega nadzora.

<h2>Povečanje na industrijsko raven</h2>

Sledilo je povečanje produkcijskega postopka na 5 litrske fermentorje (biorekatorje). Kot poprej so tudi tukaj optimizirali postopek naprej z NAB in IPTG indukcijo in ga primerjali z postopkom v iNAB gojišču. V primerjavi z navadnim postopkom, je v pri avto-induciranem postopku nivo izražanja himernega proteina bil višji.

Čiščenje peptida so izvedli tako, da so fuzijski protein izolirali z nikljevo afinitetno kromatografijo. Peptid so nato na to odcepili s onkonaze s kislinsko hidrolizo, ki so jo oborili pri ph 7 peptid so izolirali s centrifugiranjem in liofilizacijo. Po zgoraj opisanih postopkih so pridobili 99% čisti peptid s koncentracijo 40-50 mg/L. Z gelsko filtracijo so dokončno očistili peptid in dobili 20-25 mg čistega peptida na liter bakterijske kulture.

V izračunih stroškov so ugotovil, da so stroški na majhni 5 L skali nekje 250 €/mg in so večinoma definirani preko stroška delavcev, same investicije in vzdrževanja opreme. Če pa proizvodnjo povečamo na 200, 500 ali 1000 mg na šaržo, se temu primerno stroški znižajo na 136, 65, 42 €/mg. Sorazmerno padejo tudi stroški delavcev temu primerno, saj za povečan obseg ni potrebno večjega nadzora.
V primerjavi s kemično sintezo in pa v primerjavi s sintezami drugih podobnih peptidov je ta opisana proizvodnja boljša oziroma vsaj kompetentna alternativam.

<h2>Viri in Literatura</h2>

[1] C. H. Henry and L. Xiaoming, “Industrial production of recombinant therapeutics in Escherichia coli and its recent advancements,” pp. 383–399, 2012. 
[2] B. G. Fox and P. G. Blommel, “Autoinduction of Protein Expression,” pp. 1–18, 2009. 
[3] A. R. Gaglione, K. Pane, E. D. Olmo, V. Cafaro, E. Pizzo, G. Olivieri, and A. Arciello, “SC,” N. Biotechnol., 2019.

Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz

2019-04-09T09:09:54Z

Bk6146:

'''
== Restrikcijski encimi ==
Restrikcijski encimi ali restrikcijske endonukleaze so encimi, ki so sposobni cepiti DNK v manjše fragmente. To storijo v bližini ali znotraj specifičnega prepoznavnega zaporedja , ki se nahaja znotraj DNK molekule. Mestu kjer encim cepi dvoverižno DNK pravimo restrikcijsko mesto.

Restrikcijske encime zdaj delimo na pet glavnih tipov, ki se med seboj razlikujejo v strukturi, ali cepijo znotraj restrikcijskega mesta ali pa izven, ter tudi kateri kofaktorji so potrebni za delovanje. Restriktaze cepijo molekulo DNK , na po enem mestu na posamezni verigi dvojne vijačnice, tako da razcepijo fosfodiestrsko vez.

Do poimenovanja restrikcijski encim so prišli pri proučevanju bakteriofagov λ v 60-ih prejšnjega stoletja. V nadaljevanju bova predstavila pionirske članke, ki so privedli do odkritja teh izjemno pomembnih encimov.

(Bor Klančnik)

== Od fagov do prvih 'E.coli'' restrikcijskih endonukleaz ==
Med prvima, ki sta opazoval bakterijske okužbe in pri tem naletela na fenomen restrikcije in modifikacije, sta bila G. Bertani in J.J. Weigle (članek objavljen 1952). Vendar takrat nista vedela, na kaj sta naletela. Sama sta preučevala fagni razvoj v bakterijskih gostiteljicah in kako različni sevi bakterij vplivajo na sam sev virusa. V študiji sta uporabila različne seve bakterije E. coli (S, C, in nelizogeničen K-12 in derivate) in Sh sev S. dysenteriae ter faga λ in P2. Oba faga sta uspešno rastla na prvih sevih bakterij. Pri novi okužbi drugega seva bakterij z fagom, ki je izhajal iz prve bakterije, sta ugotovila, da je le ta malokrat uspešna. Izključila sta možnost mutacij ali selekcije za nastale spremembe v infektivnosti fagov. Pravilno sta predpostavila, da gre pri tem za lastnosti bakterij in ne samih fagov. Ker pojem restrikcije še nista poznala, sta ta fenomen poimenoval, preko gostitelja inducirana/kontrolirana variacija (»host induced / controlled phage variation«). [1]

Za tem je v letu 1962 W. Aber objavil članek ,kjer je predlagal teorijo, ki bi razložila ta fenomen vpliva gostiteljskih bakterij na fagno DNK. V raziskavi je uporabil 32P-označen fag λ K in opazoval razgradnjo označene DNK pri okužbi različnih sevov bakterij. Poleg označevanja pa je še uporabil metodo reševanja cepljenega genoma faga (»restricted phage genome«) s superinfekcijo le tega v označene seve bakterij predhodno okužene z necepljenimi fagi. S slednjo je pokazal, da obstaja mehanizem znotraj gostiteljice, ki prepozna takšen fag in ga razgradi. V namigovanju , je opozoril, da obstaja možnost cepitve fagne DNK na točno določenih mestih. [2]

V letu 1968, pa je prišlo do odkritja prvega restrikcijskega encima. M. Meselson in Robert Yuan sta kot prva izloirala (sicer istočasno kot Aber) in opisala restrikcijski encim iz E.coli. Do tedaj že dobro poznani sistem gostiteljsko kontroliranih modifikacij fagov, je dobil nov pomen. Šlo je za encim, ki je sposoben razgraditi fagno DNK na omenjeno število fragmentov. Ugotovila sta, da ti restrikcijski encimi za popolno delovanje potrebujejo Mg+2 ione, ATP in S-adenozilmetionin (SAM). S serijo izvirnih in hkrati preprostih eksperimentov sta določila, da gre pri restrikcijskem encimu za endonukleazo (cepi samo znotraj zaporedja), nastali fragmenti DNK so dvoverižni in ne enoverižni ter da encim naprej cepi eno verigo in šele nato drugo. Nazadnje sta dokazal, da do cepitve heterodupleksov fagne DNK ne pride, kar pomeni da encim lahko cepi le določeno zaporedje. Uspešno sta izolirala encima iz bakterijskega seva K in iz P1 liziranih celice. Poimenovala sta ju E. coli endonukleza IIIK in IIIP. [3]

(Bor Klančnik)

== Odkritje restriktaz v ''Hemophilus influenzea'' in določitev restrikcijskega mesta ==
Po odkritju prvih restrikcijskih endonukleaz, ki so jih izolirali iz E. coli, je Hamilton Smith poizkusil in uspel dokazati, da podobne restrikcijske endonukleaze obstajajo tudi v bakteriji Hemophilus influenzae, ki jih danes imenujemo kar endonukleaze R. V članku iz leta 1970 sta skupaj z K. W. Wilcoxom podrobno opisala postopke izolacije, čiščenja in lastnosti sevov Rd iz H. influenzae. Ti vsebujejo restrikcijske endonukleaze, katere sta očistila do te mere, da ni bilo več mogoče zaznati exo- ali endonukleaznih aktivnosti proti lastni nativni DNA. Ker ima vsak organizem značilno specifično viskoznost DNK, sta za sledenje eksperimentom uporabila ravno to metodo. Opazila sta, da ko sta dodala nativno DNK od organizma iz katerega sta izolirala encim do sprememb v specifični viskoznosti ni prišlo. Medtem ko pa sta encimu dodajala tujo DNK, kot je recimo P22 DNK, je specifična viskoznost padla za približno 25%. S svojim eksperimentom sta dokazala, da endonukleaza prelomi DNK preko obeh vijačnic tako, da nastane 5’-fosforil, 3’-hidroksil cepitev in da se te cepitve zgodijo omejeno krat na tujih nativnih DNK. Poleg prej omenjene P22 DNK, sta testirala še fag T7, DNK od S. typhimurium, DNK iz sperme lososa in še nekatere druge, vendar pa sta pri vseh opazila degradacijo do podobne stopnje. Podobno kot endonukleaza izolirana iz E. coli tudi ta ne razcepi lastne nativne DNK ali tuje denaturirane. Danes vemo, da raziskovana endonukleaza R spada v skupino tipa 2 in da cepi točno pri ali zraven prepoznavnega zaporedja (restrikcijskega mesta). Prva vprašanja v to smer si je postavljal tudi Hamilton Smith, kar pa je nekoliko pozneje skupaj z Thomas J. Kellyjem tudi raziskal in potrdil. [4]

Oba članka sta bila objavlena v isti izdaji Journal of Molecular Biology. Sekvenco restrikcijskega mesta sta določevala s pomočjo analize koncev fragmentov, ki jih je naredil encim. S tem sta določila, da je zaporedje ki ga prepozna encim GTY|RAC, kjer je Y = piridinska nukleinska kislina in R = purinska nukleinska kislina. Ker encim ne razgradi lastne DNK, sta predvidela dve možnosti, ali je dotična sekvenca na nek način modificirana, ali pa je v svojem DNK ni tega zaporedja. Pri tem ju je najbolj presenetila simetričnost restrikcijskega mesta. Predpostavila sta tudi dva mehanizma delovanja endonukleaze. Pri prvem sta predlagala model, kjer se le ena molekula encima veže na restrikcijsko mesto in medtem ko cepi prvo verigo, takoj “napade” drugo komplementarno in razcepi verigo podobno kot na prvi verigi. Kot drug model pa sta predstavila mehanizem, kjer se dve podobni molekuli encima simetrično povežeta v tarčno zaporedje in dvojno vijačnico prelomita hkrati.[4,5]

Po objavi teh člankov se niti sam Hamilton Smith ni zavedal pomembnosti svojega odkritja. Vendar pa je na podlagi njegovih raziskav le leto dni pozneje Daniel Nathans postavil temelje moderne biokemijie kot jo poznamo danes. Saj je lahko s tem, da je vedel kje točno cepi endonukleaza R, sestavil celotno gensko mapo simian virusa 40 (SV40) iz fragmentov, ki so nastali po obdelavi z encimom. S tem je pa uspel odkriti tudi začetno mesto replikacije in mesto SV40 genov. Nathans je izboljšal tudi postopek ločbe fragmentov saj saharozni gradient, ki ga je prehodno uporabljal Smith, ni dal dovolj dobre resolucije. V tem času je ravno Ulrich Loening kot pionir začel izvajati elektroforezo na poliakrilnem gelu (PAGE), kar je dalo neprimerljivo boljšo ločbo. Ta tehnika je v uporabi v različnih izvedbah še danes. Nathans in njegova ekipa so zelo natančno napovedali potencialne aplikacije restrikcijskih endonukleaz, kot so: uporaba fragmentov za sestavo celotne genska mape (to so tudi sami dokazali); lokalizacija začetka replikacije in pozicija genov (tudi to so dokazali sami na primeru SV40); posamezen gen bi lahko mapirali na tak način, da mu med transformacijo testiramu biološko aktivnost; priprava mutantov z delecijo specifičnih fragmentov.[6]

(Alen Šadl)

== Uporabnost restrikcijskih encimov ==
Hamilton O. Smith, Daniel Nathans in Werner Arber so leta 1978 za svoja odkritja restrikcijskih encimov in njihove aplikacije v molekularni genetiki prejeli Nobelovo nagrado v fiziologiji in medicini.

Odkritje restrikcijskih endonukleaz je bila osnova za razvoj rekombinantne tehnologije. Encimi ki so sposobni cepiti na točno določenem mestu znotraj DNK, nam omogočajo manipulacijo genov in proizvodnjo proteinov v velikem obsegu (rekombinanten inzulin). Endonukleaza R in ostale iz skupine tipa 2 so izjemno pomembne v genetskem inženiringu, kjer se uporabljajo za kloniranje, tvorbo knjižnic, sekvenciranje DNK, detekcijo in preprodukcijo enzimov, hormonov in še česa. Uporabljamo jih tudi za DNK fingerprinting, tehnika s katero lahko lokaliziramo mutacije, detektiramo okvarjene gene, ugotavljamo sorodstvenost (testi očetovstva, kriminalna analitika,..)

Z ozirom na to, da danes v nobenem biokemijskem laboratoriju ni hladilnika, ki nebi vseboval endonukleacijskih restriktaz lahko mirne vesti trdimo, da so izjemno pomembne in da si danes dela v takem laboratoriju brez njih ne predstavljamo.

== Viri ==
[1] G. Bertani and J. J. Weigle, “HOST CONTROLLED VARIATION IN BACTERIAL VIRUSES ’,” pp. 113–121, 1952.

[2] D. Dussoix and W. Arber, “Host Specificity of DNA Produced by Escherichia Coli H , Control over acceptance of DNA from infecting phage A,” J. Mol. Biol., vol. 5, no. 1, pp. 37–49, 1962.

[3] M. Meselson and R. Yuan, “DNA Restriction Enzyme from E. coli,” Nature, vol. 217, pp. 1110–1114, 1968.

[4] J. Thomas, “Enzyme from Hemophilus infuenzae Site Base Sequence of the Recognition,” pp. 393–409, 1970.

[5] I. Purification, O. Smithand, and K. W. Wilcox, “Enzyme from Hemophilus influenzae,” pp. 379–391, 1970.

[6] K. Danna and D. Nathans, “Specific Cleavage of Simian Virus 40 DNA by Restriction Endonuclease of Hemophilus Influenzae *,” vol. 68, no. 12, pp. 2913–2917, 1971.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz

2019-04-09T09:08:30Z

Bk6146:

'''
== Restrikcijski encimi ==
Restrikcijski encimi ali restrikcijske endonukleaze so encimi, ki so sposobni cepiti DNK v manjše fragmente. To storijo v bližini ali znotraj specifičnega prepoznavnega zaporedja , ki se nahaja znotraj DNK molekule. Mestu kjer encim cepi dvoverižno DNK pravimo restrikcijsko mesto.

Restrikcijske encime zdaj delimo na pet glavnih tipov, ki se med seboj razlikujejo v strukturi, ali cepijo znotraj restrikcijskega mesta ali pa izven, ter tudi kateri kofaktorji so potrebni za delovanje. Restriktaze cepijo molekulo DNK , na po enem mestu na posamezni verigi dvojne vijačnice, tako da razcepijo fosfodiestrsko vez.

Do poimenovanja restrikcijski encim so prišli pri proučevanju bakteriofagov λ v 60-ih prejšnjega stoletja. V nadaljevanju bova predstavila pionirske članke, ki so privedli do odkritja teh izjemno pomembnih encimov.

(Bor Klančnik)

== Od fagov do prvih 'E.coli'' restrikcijskih endonukleaz ==
Med prvima, ki sta opazoval bakterijske okužbe in pri tem naletela na fenomen restrikcije in modifikacije, sta bila G. Bertani in J.J. Weigle (članek objavljen 1952). Vendar takrat nista vedela, na kaj sta naletela. Sama sta preučevala fagni razvoj v bakterijskih gostiteljicah in kako različni sevi bakterij vplivajo na sam sev virusa. V študiji sta uporabila različne seve bakterije E. coli (S, C, in nelizogeničen K-12 in derivate) in Sh sev S. dysenteriae ter faga λ in P2. Oba faga sta uspešno rastla na prvih sevih bakterij. Pri novi okužbi drugega seva bakterij z fagom, ki je izhajal iz prve bakterije, sta ugotovila, da je le ta malokrat uspešna. Izključila sta možnost mutacij ali selekcije za nastale spremembe v infektivnosti fagov. Pravilno sta predpostavila, da gre pri tem za lastnosti bakterij in ne samih fagov. Ker pojem restrikcije še nista poznala, sta ta fenomen poimenoval, preko gostitelja inducirana/kontrolirana variacija (»host induced / controlled phage variation«).

Za tem je v letu 1962 W. Aber objavil članek ,kjer je predlagal teorijo, ki bi razložila ta fenomen vpliva gostiteljskih bakterij na fagno DNK. V raziskavi je uporabil 32P-označen fag λ K in opazoval razgradnjo označene DNK pri okužbi različnih sevov bakterij. Poleg označevanja pa je še uporabil metodo reševanja cepljenega genoma faga (»restricted phage genome«) s superinfekcijo le tega v označene seve bakterij predhodno okužene z necepljenimi fagi. S slednjo je pokazal, da obstaja mehanizem znotraj gostiteljice, ki prepozna takšen fag in ga razgradi. V namigovanju , je opozoril, da obstaja možnost cepitve fagne DNK na točno določenih mestih.

V letu 1968, pa je prišlo do odkritja prvega restrikcijskega encima. M. Meselson in Robert Yuan sta kot prva izloirala (sicer istočasno kot Aber) in opisala restrikcijski encim iz E.coli. Do tedaj že dobro poznani sistem gostiteljsko kontroliranih modifikacij fagov, je dobil nov pomen. Šlo je za encim, ki je sposoben razgraditi fagno DNK na omenjeno število fragmentov. Ugotovila sta, da ti restrikcijski encimi za popolno delovanje potrebujejo Mg+2 ione, ATP in S-adenozilmetionin (SAM). S serijo izvirnih in hkrati preprostih eksperimentov sta določila, da gre pri restrikcijskem encimu za endonukleazo (cepi samo znotraj zaporedja), nastali fragmenti DNK so dvoverižni in ne enoverižni ter da encim naprej cepi eno verigo in šele nato drugo. Nazadnje sta dokazal, da do cepitve heterodupleksov fagne DNK ne pride, kar pomeni da encim lahko cepi le določeno zaporedje. Uspešno sta izolirala encima iz bakterijskega seva K in iz P1 liziranih celice. Poimenovala sta ju E. coli endonukleza IIIK in IIIP.

(Bor Klančnik)

== Odkritje restriktaz v ''Hemophilus influenzea'' in določitev restrikcijskega mesta ==
Po odkritju prvih restrikcijskih endonukleaz, ki so jih izolirali iz E. coli, je Hamilton Smith poizkusil in uspel dokazati, da podobne restrikcijske endonukleaze obstajajo tudi v bakteriji Hemophilus influenzae, ki jih danes imenujemo kar endonukleaze R. V članku iz leta 1970 sta skupaj z K. W. Wilcoxom podrobno opisala postopke izolacije, čiščenja in lastnosti sevov Rd iz H. influenzae. Ti vsebujejo restrikcijske endonukleaze, katere sta očistila do te mere, da ni bilo več mogoče zaznati exo- ali endonukleaznih aktivnosti proti lastni nativni DNA. Ker ima vsak organizem značilno specifično viskoznost DNK, sta za sledenje eksperimentom uporabila ravno to metodo. Opazila sta, da ko sta dodala nativno DNK od organizma iz katerega sta izolirala encim do sprememb v specifični viskoznosti ni prišlo. Medtem ko pa sta encimu dodajala tujo DNK, kot je recimo P22 DNK, je specifična viskoznost padla za približno 25%. S svojim eksperimentom sta dokazala, da endonukleaza prelomi DNK preko obeh vijačnic tako, da nastane 5’-fosforil, 3’-hidroksil cepitev in da se te cepitve zgodijo omejeno krat na tujih nativnih DNK. Poleg prej omenjene P22 DNK, sta testirala še fag T7, DNK od S. typhimurium, DNK iz sperme lososa in še nekatere druge, vendar pa sta pri vseh opazila degradacijo do podobne stopnje. Podobno kot endonukleaza izolirana iz E. coli tudi ta ne razcepi lastne nativne DNK ali tuje denaturirane. Danes vemo, da raziskovana endonukleaza R spada v skupino tipa 2 in da cepi točno pri ali zraven prepoznavnega zaporedja (restrikcijskega mesta). Prva vprašanja v to smer si je postavljal tudi Hamilton Smith, kar pa je nekoliko pozneje skupaj z Thomas J. Kellyjem tudi raziskal in potrdil.

Oba članka sta bila objavlena v isti izdaji Journal of Molecular Biology. Sekvenco restrikcijskega mesta sta določevala s pomočjo analize koncev fragmentov, ki jih je naredil encim. S tem sta določila, da je zaporedje ki ga prepozna encim GTY|RAC, kjer je Y = piridinska nukleinska kislina in R = purinska nukleinska kislina. Ker encim ne razgradi lastne DNK, sta predvidela dve možnosti, ali je dotična sekvenca na nek način modificirana, ali pa je v svojem DNK ni tega zaporedja. Pri tem ju je najbolj presenetila simetričnost restrikcijskega mesta. Predpostavila sta tudi dva mehanizma delovanja endonukleaze. Pri prvem sta predlagala model, kjer se le ena molekula encima veže na restrikcijsko mesto in medtem ko cepi prvo verigo, takoj “napade” drugo komplementarno in razcepi verigo podobno kot na prvi verigi. Kot drug model pa sta predstavila mehanizem, kjer se dve podobni molekuli encima simetrično povežeta v tarčno zaporedje in dvojno vijačnico prelomita hkrati.

Po objavi teh člankov se niti sam Hamilton Smith ni zavedal pomembnosti svojega odkritja. Vendar pa je na podlagi njegovih raziskav le leto dni pozneje Daniel Nathans postavil temelje moderne biokemijie kot jo poznamo danes. Saj je lahko s tem, da je vedel kje točno cepi endonukleaza R, sestavil celotno gensko mapo simian virusa 40 (SV40) iz fragmentov, ki so nastali po obdelavi z encimom. S tem je pa uspel odkriti tudi začetno mesto replikacije in mesto SV40 genov. Nathans je izboljšal tudi postopek ločbe fragmentov saj saharozni gradient, ki ga je prehodno uporabljal Smith, ni dal dovolj dobre resolucije. V tem času je ravno Ulrich Loening kot pionir začel izvajati elektroforezo na poliakrilnem gelu (PAGE), kar je dalo neprimerljivo boljšo ločbo. Ta tehnika je v uporabi v različnih izvedbah še danes. Nathans in njegova ekipa so zelo natančno napovedali potencialne aplikacije restrikcijskih endonukleaz, kot so: uporaba fragmentov za sestavo celotne genska mape (to so tudi sami dokazali); lokalizacija začetka replikacije in pozicija genov (tudi to so dokazali sami na primeru SV40); posamezen gen bi lahko mapirali na tak način, da mu med transformacijo testiramu biološko aktivnost; priprava mutantov z delecijo specifičnih fragmentov.

(Alen Šadl)

== Uporabnost restrikcijskih encimov ==
Hamilton O. Smith, Daniel Nathans in Werner Arber so leta 1978 za svoja odkritja restrikcijskih encimov in njihove aplikacije v molekularni genetiki prejeli Nobelovo nagrado v fiziologiji in medicini.

Odkritje restrikcijskih endonukleaz je bila osnova za razvoj rekombinantne tehnologije. Encimi ki so sposobni cepiti na točno določenem mestu znotraj DNK, nam omogočajo manipulacijo genov in proizvodnjo proteinov v velikem obsegu (rekombinanten inzulin). Endonukleaza R in ostale iz skupine tipa 2 so izjemno pomembne v genetskem inženiringu, kjer se uporabljajo za kloniranje, tvorbo knjižnic, sekvenciranje DNK, detekcijo in preprodukcijo enzimov, hormonov in še česa. Uporabljamo jih tudi za DNK fingerprinting, tehnika s katero lahko lokaliziramo mutacije, detektiramo okvarjene gene, ugotavljamo sorodstvenost (testi očetovstva, kriminalna analitika,..)

Z ozirom na to, da danes v nobenem biokemijskem laboratoriju ni hladilnika, ki nebi vseboval endonukleacijskih restriktaz lahko mirne vesti trdimo, da so izjemno pomembne in da si danes dela v takem laboratoriju brez njih ne predstavljamo.

== Viri ==
[1] G. Bertani and J. J. Weigle, “HOST CONTROLLED VARIATION IN BACTERIAL VIRUSES ’,” pp. 113–121, 1952.

[2] D. Dussoix and W. Arber, “Host Specificity of DNA Produced by Escherichia Coli H , Control over acceptance of DNA from infecting phage A,” J. Mol. Biol., vol. 5, no. 1, pp. 37–49, 1962.

[3] M. Meselson and R. Yuan, “DNA Restriction Enzyme from E. coli,” Nature, vol. 217, pp. 1110–1114, 1968.

[4] J. Thomas, “Enzyme from Hemophilus infuenzae Site Base Sequence of the Recognition,” pp. 393–409, 1970.

[5] I. Purification, O. Smithand, and K. W. Wilcox, “Enzyme from Hemophilus influenzae,” pp. 379–391, 1970.

[6] K. Danna and D. Nathans, “Specific Cleavage of Simian Virus 40 DNA by Restriction Endonuclease of Hemophilus Influenzae *,” vol. 68, no. 12, pp. 2913–2917, 1971.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-04-09T09:04:25Z

Bk6146:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315 pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Blokiranje_receptorjev_za_fage Blokiranje receptorjev za fage] (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa Proizvodnja zunajceličnega matriksa] (Patricija Miklavc, Benjamin Malovrh, Vid Modic) 
3. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_kompetitivnih_inhibitorjev Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev] (Ajda Godec,Liza Ulčakar,Luka Gnidovec) 
4. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_izklju%C4%8Ditve_naknadne_oku%C5%BEbe Izključitev naknadne okužbe] (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_prvih_restrikcijskih_endonukleaz Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz] (Alen Šadl, Bor Klančnik) 
7. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metilacijski_sistem_pri_bakterijah Metilacijski sistem pri bakterijah] (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme (Nika Boštic, Tadej Medved, Sonja Gabrijelčič) 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) (Eva Gartner, Neža Blaznik, Tina Zavodnik ) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mateja Špegel, Špela Friškovec Vončina, Anja Truden) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, Anja Tavčar) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Jernej Imperl, Klementina Polanec, Gašper Anton Komatar) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pavleković, Valeriya Musina) 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom (Sanja Stanković, Karin Dobravc Škof, Neža Žerjav ) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz

2019-04-09T09:02:54Z

Bk6146:

'''
== Restrikcijski encimi ==
Restrikcijski encimi ali restrikcijske endonukleaze so encimi, ki so sposobni cepiti DNK v manjše fragmente. To storijo v bližini ali znotraj specifičnega prepoznavnega zaporedja , ki se nahaja znotraj DNK molekule. Mestu kjer encim cepi dvoverižno DNK pravimo restrikcijsko mesto.

Restrikcijske encime zdaj delimo na pet glavnih tipov, ki se med seboj razlikujejo v strukturi, ali cepijo znotraj restrikcijskega mesta ali pa izven, ter tudi kateri kofaktorji so potrebni za delovanje. Restriktaze cepijo molekulo DNK , na po enem mestu na posamezni verigi dvojne vijačnice, tako da razcepijo fosfodiestrsko vez.

Do poimenovanja restrikcijski encim so prišli pri proučevanju bakteriofagov λ v 60-ih prejšnjega stoletja. V nadaljevanju bova predstavila pionirske članke, ki so privedli do odkritja teh izjemno pomembnih encimov.

(Bor Klančnik)

== Od fagov do prvih 'E.coli'' restrikcijskih endonukleaz ==
Med prvima, ki sta opazoval bakterijske okužbe in pri tem naletela na fenomen restrikcije in modifikacije, sta bila G. Bertani in J.J. Weigle (članek objavljen 1952). Vendar takrat nista vedela, na kaj sta naletela. Sama sta preučevala fagni razvoj v bakterijskih gostiteljicah in kako različni sevi bakterij vplivajo na sam sev virusa. V študiji sta uporabila različne seve bakterije E. coli (S, C, in nelizogeničen K-12 in derivate) in Sh sev S. dysenteriae ter faga λ in P2. Oba faga sta uspešno rastla na prvih sevih bakterij. Pri novi okužbi drugega seva bakterij z fagom, ki je izhajal iz prve bakterije, sta ugotovila, da je le ta malokrat uspešna. Izključila sta možnost mutacij ali selekcije za nastale spremembe v infektivnosti fagov. Pravilno sta predpostavila, da gre pri tem za lastnosti bakterij in ne samih fagov. Ker pojem restrikcije še nista poznala, sta ta fenomen poimenoval, preko gostitelja inducirana/kontrolirana variacija (»host induced / controlled phage variation«).

Za tem je v letu 1962 W. Aber objavil članek ,kjer je predlagal teorijo, ki bi razložila ta fenomen vpliva gostiteljskih bakterij na fagno DNK. V raziskavi je uporabil 32P-označen fag λ K in opazoval razgradnjo označene DNK pri okužbi različnih sevov bakterij. Poleg označevanja pa je še uporabil metodo reševanja cepljenega genoma faga (»restricted phage genome«) s superinfekcijo le tega v označene seve bakterij predhodno okužene z necepljenimi fagi. S slednjo je pokazal, da obstaja mehanizem znotraj gostiteljice, ki prepozna takšen fag in ga razgradi. V namigovanju , je opozoril, da obstaja možnost cepitve fagne DNK na točno določenih mestih.

V letu 1968, pa je prišlo do odkritja prvega restrikcijskega encima. M. Meselson in Robert Yuan sta kot prva izloirala (sicer istočasno kot Aber) in opisala restrikcijski encim iz E.coli. Do tedaj že dobro poznani sistem gostiteljsko kontroliranih modifikacij fagov, je dobil nov pomen. Šlo je za encim, ki je sposoben razgraditi fagno DNK na omenjeno število fragmentov. Ugotovila sta, da ti restrikcijski encimi za popolno delovanje potrebujejo Mg+2 ione, ATP in S-adenozilmetionin (SAM). S serijo izvirnih in hkrati preprostih eksperimentov sta določila, da gre pri restrikcijskem encimu za endonukleazo (cepi samo znotraj zaporedja), nastali fragmenti DNK so dvoverižni in ne enoverižni ter da encim naprej cepi eno verigo in šele nato drugo. Nazadnje sta dokazal, da do cepitve heterodupleksov fagne DNK ne pride, kar pomeni da encim lahko cepi le določeno zaporedje. Uspešno sta izolirala encima iz bakterijskega seva K in iz P1 liziranih celice. Poimenovala sta ju E. coli endonukleza IIIK in IIIP.

(Bor Klančnik)

== Odkritje restriktaz v ''Hemophilus influenzea'' in določitev restrikcijskega mesta ==
Po odkritju prvih restrikcijskih endonukleaz, ki so jih izolirali iz E. coli, je Hamilton Smith poizkusil in uspel dokazati, da podobne restrikcijske endonukleaze obstajajo tudi v bakteriji Hemophilus influenzae, ki jih danes imenujemo kar endonukleaze R. V članku iz leta 1970 sta skupaj z K. W. Wilcoxom podrobno opisala postopke izolacije, čiščenja in . Izvlečke seva Rd iz H. influenzae, ki vsebujejo restrikcijske endonukleaze sta očistila do te mere, da ni bilo več mogoče zaznati exo- ali endonukleaznih aktivnosti. Ker ima vsak organizem značilno specifično viskoznost DNK, sta za sledenje eksperimentom uporabila ravno to metodo. Opazila sta, da ko sta dodala nativno DNK od organizma iz katerega sta izolirala encim do sprememb v specifični viskoznosti ni prišlo. Medtem ko pa sta encimu dodajala tuje DNK, kot je recimo P22 DNK, je specifična viskoznost padla za približno 25%. S svojim eksperimentom sta dokazala, da endonukleaza prelomi DNK preko obeh vijačnic tako, da nastane 5’-fosforil, 3’-hidroksil cepitev in da se te cepitve zgodijo omejeno krat na tujih nativnih DNK. Poleg prej omenjene P22 DNK, sta testirala še fag T7, DNK od S. typhimurium, DNK iz sperme lososa in še nekatere druge, vendar pa sta pri vseh opazila degradacijo do podobne stopnje. Podobno kot endonukleaza izolirana iz E. coli tudi ta ne razcepi lastne nativne DNK ali tuje denaturirane. Danes vemo, da raziskovana endonukleaza R spada v skupino tipa 2 in da cepi točno pri ali zraven prepoznavnega zaporedja (restrikcijskega mesta). Prva vprašanja v to smer si je postavljal tudi Hamilton Smith, kar pa je nekoliko pozneje skupaj z Thomas J. Kellyjem tudi raziskal in potrdil.

Oba članka sta bila objavlena v isti izdaji Journal of Molecular Biology. Sekvenco restrikcijskega mesta sta določevala s pomočjo analize koncev fragmentov, ki jih je naredil encim. S tem sta določila, da je zaporedje ki ga prepozna encim GTY|RAC, kjer je Y = piridinska nukleinska kislina in R = purinska nukleinska kislina. Ker encim ne razgradi lastne DNK, sta predvidela dve možnosti, ali je dotična sekvenca na nek način modificirana, ali pa je v svojem DNK zapisu ne vsebuje. Pri tem ju je najbolj presenetila simetričnost restrikcijskega mesta. Predpostavila sta tudi dva mehanizma delovanja endonukleaze, pri prvem sta predlagala model, ko se le ena molekula encima veže na restrikcijsko mesto in medtem ko “zlomi” prvo verigo, takoj “napade” drugo komplementarno in razbije verigo podobno kot na prvi verigi. Kot drug model pa sta predstavila mehanizem, ko se dve podobni molekuli encima simetrično povežeta v tarčno zaporedje in dvojno vijačnico prelomita hkrati.

Po objavi teh člankov se niti sam Hamilton Smith ni zavedal pomembnosti svojega odkritja. Vendar pa je na podlagi njegovih raziskav le leto dni pozneje Daniel Nathans postavil temelje moderne biokemijie kot jo poznamo danes. Saj je lahko s tem, da je vedel kje točno cepi endonukleaza R, sestavil celotno fizično mapo simian virusa 40 (SV40) iz fragmentov, ki so nastali po obdelavi z encimom. S tem je pa uspel odkriti tudi začetno mesto replikacije in mesto SV40 genov. Nathans je izboljšal tudi postopek ločbe fragmentov saj sukrozni gradient, ki ga je uporabil Smith ni dal dovolj dobre resolucije. V tem času je ravno Ulrich Loening kot pionir začel izvajati elektroforezo na poliakrilnem gelu (PAGE), kar je dalo neprimerljivo boljšo ločbo. Ta tehnika je v uporabi v različnih izvedbah še danes. Nathans in njegova ekipa so zelo natančno napovedali potencialne aplikacije restrikcijskih endonukleaz, kot so: uporaba fragmentov za sestavo celotne fizične mape (to so tudi sami dokazali); lokalizacija začetka replikacije in pozicija genov (tudi to so dokazali sami na primeru SV40); posamezen gen bi lahko mapirali na tak način, da mu med transformacijo testiramu biološko aktivnost; priprava mutantov z delecijo specifičnih fragmentov.

(Alen Šadl)

== Uporabnost restrikcijskih encimov ==
Hamilton O. Smith, Daniel Nathans in Werner Arber so leta 1978 za svoja odkritja restrikcijskih encimov in njihove aplikacije v molekularni genetiki prejeli Nobelovo nagrado v fiziologiji in medicini.

Odkritje restrikcijskih endonukleaz je bila osnova za razvoj rekombinantne tehnologije. Encimi ki so sposobni cepiti na točno določenem mestu znotraj DNK, nam omogočajo manipulacijo genov in proizvodnjo proteinov v velikem obsegu (rekombinanten inzulin). Endonukleaza R in ostale iz skupine tipa 2 so izjemno pomembne v genetskem inženiringu, kjer se uporabljajo za kloniranje, tvorbo knjižnic, sekvenciranje DNK, detekcijo in preprodukcijo enzimov, hormonov in še česa. Uporabljamo jih tudi za DNK fingerprinting, tehnika s katero lahko lokaliziramo mutacije, detektiramo okvarjene gene, ugotavljamo sorodstvenost (testi očetovstva, kriminalna analitika,..)

Z ozirom na to, da danes v nobenem biokemijskem laboratoriju ni hladilnika, ki nebi vseboval endonukleacijskih restriktaz lahko mirne vesti trdimo, da so izjemno pomembne in da si danes dela v takem laboratoriju brez njih ne predstavljamo.

== Viri ==
[1] G. Bertani and J. J. Weigle, “HOST CONTROLLED VARIATION IN BACTERIAL VIRUSES ’,” pp. 113–121, 1952.

[2] D. Dussoix and W. Arber, “Host Specificity of DNA Produced by Escherichia Coli H , Control over acceptance of DNA from infecting phage A,” J. Mol. Biol., vol. 5, no. 1, pp. 37–49, 1962.

[3] M. Meselson and R. Yuan, “DNA Restriction Enzyme from E. coli,” Nature, vol. 217, pp. 1110–1114, 1968.

[4] J. Thomas, “Enzyme from Hemophilus infuenzae Site Base Sequence of the Recognition,” pp. 393–409, 1970.

[5] I. Purification, O. Smithand, and K. W. Wilcox, “Enzyme from Hemophilus influenzae,” pp. 379–391, 1970.

[6] K. Danna and D. Nathans, “Specific Cleavage of Simian Virus 40 DNA by Restriction Endonuclease of Hemophilus Influenzae *,” vol. 68, no. 12, pp. 2913–2917, 1971.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz

2019-04-09T08:54:32Z

Bk6146:

'''
== Restrikcijski encimi ==
Restrikcijski encimi ali restrikcijske endonukleaze so encimi, ki so sposobni cepiti DNK v manjše fragmente. To storijo v bližini ali znotraj specifičnega prepoznavnega zaporedja , ki se nahaja znotraj DNK molekule. Mestu kjer encim cepi dvoverižno DNK pravimo restrikcijsko mesto.

Restrikcijske encime zdaj delimo na pet glavnih tipov, ki se med seboj razlikujejo v strukturi, ali cepijo znotraj restrikcijskega mesta ali pa izven, ter tudi kateri kofaktorji so potrebni za delovanje. Restriktaze cepijo molekulo DNK , na po enem mestu na posamezni verigi dvojne vijačnice, tako da razcepijo fosfodiestrsko vez.

Do poimenovanja restrikcijski encim so prišli pri proučevanju bakteriofagov λ v 60-ih prejšnjega stoletja. V nadaljevanju bova predstavila pionirske članke, ki so privedli do odkritja teh izjemno pomembnih encimov.

(Bor Klančnik)

== Od fagov do prvih 'E.coli'' restrikcijskih endonukleaz ==
Med prvima, ki sta opazoval bakterijske okužbe in pri tem naletela na fenomen restrikcije in modifikacije, sta bila G. Bertani in J.J. Weigle (članek objavljen 1952). Vendar takrat nista vedela, na kaj sta naletela. Sama sta preučevala fagni razvoj v bakterijskih gostiteljicah in kako različni sevi bakterij vplivajo na sam sev virusa. V študiji sta uporabila različne seve bakterije E. coli (S, C, in nelizogeničen K-12 in derivate) in Sh sev S. dysenteriae ter faga λ in P2. Oba faga sta uspešno rastla na prvih sevih bakterij. Pri novi okužbi drugega seva bakterij z fagom, ki je izhajal iz prve bakterije, sta ugotovila, da je le ta malokrat uspešna. Izključila sta možnost mutacij ali selekcije za nastale spremembe v infektivnosti fagov. Pravilno sta predpostavila, da gre pri tem za lastnosti bakterij in ne samih fagov. Ker pojem restrikcije še nista poznala, sta ta fenomen poimenoval, preko gostitelja inducirana/kontrolirana variacija (»host induced / controlled phage variation«).

Za tem je v letu 1962 W. Aber objavil članek ,kjer je predlagal teorijo, ki bi razložila ta fenomen vpliva gostiteljskih bakterij na fagno DNK. V raziskavi je uporabil 32P-označen fag λ K in opazoval razgradnjo označene DNK pri okužbi različnih sevov bakterij. Poleg označevanja pa je še uporabil metodo reševanja cepljenega genoma faga (»restricted phage genome«) s superinfekcijo le tega v označene seve bakterij predhodno okužene z necepljenimi fagi. S slednjo je pokazal, da obstaja mehanizem znotraj gostiteljice, ki prepozna takšen fag in ga razgradi. V namigovanju , je opozoril, da obstaja možnost cepitve fagne DNK na točno določenih mestih.

V letu 1968, pa je prišlo do odkritja prvega restrikcijskega encima. M. Meselson in Robert Yuan sta kot prva izloirala (sicer istočasno kot Aber) in opisala restrikcijski encim iz E.coli. Do tedaj že dobro poznani sistem gostiteljsko kontroliranih modifikacij fagov, je dobil nov pomen. Šlo je za encim, ki je sposoben razgraditi fagno DNK na omenjeno število fragmentov. Ugotovila sta, da ti restrikcijski encimi za popolno delovanje potrebujejo Mg+2 ione, ATP in S-adenozilmetionin (SAM). S serijo izvirnih in hkrati preprostih eksperimentov sta določila, da gre pri restrikcijskem encimu za endonukleazo (cepi samo znotraj zaporedja), nastali fragmenti DNK so dvoverižni in ne enoverižni ter da encim naprej cepi eno verigo in šele nato drugo. Nazadnje sta dokazal, da do cepitve heterodupleksov fagne DNK ne pride, kar pomeni da encim lahko cepi le določeno zaporedje. Uspešno sta izolirala encima iz bakterijskega seva K in iz P1 liziranih celice. Poimenovala sta ju E. coli endonukleza IIIK in IIIP.

(Bor Klančnik)

== Odkritje restriktaz v ''Hemophilus influenzea'' in določitev restrikcijskega mesta ==
Po odkritju prvih restrikcijskih endonukleaz, ki so jih izolirali iz E. coli, je Hamilton Smith poizkusil in uspel dokazati, da podobne restrikcijske endonukleaze obstajajo tudi v bakteriji Hemophilus influenzae, ki jih danes imenujemo kar endonukleaze R. V članku iz leta 1970 sta skupaj z K. W. Wilcoxom podrobno opisala postopke izolacije, čiščenja in . Izvlečke seva Rd iz H. influenzae, ki vsebujejo restrikcijske endonukleaze sta očistila do te mere, da ni bilo več mogoče zaznati exo- ali endonukleaznih aktivnosti. Ker ima vsak organizem značilno specifično viskoznost DNK, sta za sledenje eksperimentom uporabila ravno to metodo. Opazila sta, da ko sta dodala nativno DNK od organizma iz katerega sta izolirala encim do sprememb v specifični viskoznosti ni prišlo. Medtem ko pa sta encimu dodajala tuje DNK, kot je recimo P22 DNK, je specifična viskoznost padla za približno 25%. S svojim eksperimentom sta dokazala, da endonukleaza prelomi DNK preko obeh vijačnic tako, da nastane 5’-fosforil, 3’-hidroksil cepitev in da se te cepitve zgodijo omejeno krat na tujih nativnih DNK. Poleg prej omenjene P22 DNK, sta testirala še fag T7, DNK od S. typhimurium, DNK iz sperme lososa in še nekatere druge, vendar pa sta pri vseh opazila degradacijo do podobne stopnje. Podobno kot endonukleaza izolirana iz E. coli tudi ta ne razcepi lastne nativne DNK ali tuje denaturirane. Danes vemo, da raziskovana endonukleaza R spada v skupino tipa 2 in da cepi točno pri ali zraven prepoznavnega zaporedja (restrikcijskega mesta). Prva vprašanja v to smer si je postavljal tudi Hamilton Smith, kar pa je nekoliko pozneje skupaj z Thomas J. Kellyjem tudi raziskal in potrdil.

Oba članka sta bila objavlena v isti izdaji Journal of Molecular Biology. Sekvenco restrikcijskega mesta sta določevala s pomočjo analize koncev fragmentov, ki jih je naredil encim. S tem sta določila, da je zaporedje ki ga prepozna encim GTY|RAC, kjer je Y = piridinska nukleinska kislina in R = purinska nukleinska kislina. Ker encim ne razgradi lastne DNK, sta predvidela dve možnosti, ali je dotična sekvenca na nek način modificirana, ali pa je v svojem DNK zapisu ne vsebuje. Pri tem ju je najbolj presenetila simetričnost restrikcijskega mesta. Predpostavila sta tudi dva mehanizma delovanja endonukleaze, pri prvem sta predlagala model, ko se le ena molekula encima veže na restrikcijsko mesto in medtem ko “zlomi” prvo verigo, takoj “napade” drugo komplementarno in razbije verigo podobno kot na prvi verigi. Kot drug model pa sta predstavila mehanizem, ko se dve podobni molekuli encima simetrično povežeta v tarčno zaporedje in dvojno vijačnico prelomita hkrati.

Po objavi teh člankov se niti sam Hamilton Smith ni zavedal pomembnosti svojega odkritja. Vendar pa je na podlagi njegovih raziskav le leto dni pozneje Daniel Nathans postavil temelje moderne biokemijie kot jo poznamo danes. Saj je lahko s tem, da je vedel kje točno cepi endonukleaza R, sestavil celotno fizično mapo simian virusa 40 (SV40) iz fragmentov, ki so nastali po obdelavi z encimom. S tem je pa uspel odkriti tudi začetno mesto replikacije in mesto SV40 genov. Nathans je izboljšal tudi postopek ločbe fragmentov saj sukrozni gradient, ki ga je uporabil Smith ni dal dovolj dobre resolucije. V tem času je ravno Ulrich Loening kot pionir začel izvajati elektroforezo na poliakrilnem gelu (PAGE), kar je dalo neprimerljivo boljšo ločbo. Ta tehnika je v uporabi v različnih izvedbah še danes. Nathans in njegova ekipa so zelo natančno napovedali potencialne aplikacije restrikcijskih endonukleaz, kot so: uporaba fragmentov za sestavo celotne fizične mape (to so tudi sami dokazali); lokalizacija začetka replikacije in pozicija genov (tudi to so dokazali sami na primeru SV40); posamezen gen bi lahko mapirali na tak način, da mu med transformacijo testiramu biološko aktivnost; priprava mutantov z delecijo specifičnih fragmentov.

(Alen Šadl)

== Uporabnost restrikcijskih encimov ==
Hamilton O. Smith, Daniel Nathans in Werner Arber so leta 1978 za svoja odkritja restrikcijskih encimov in njihove aplikacije v molekularni genetiki prejeli Nobelovo nagrado v fiziologiji in medicini.

Odkritje restrikcijskih endonukleaz je bila osnova za razvoj rekombinantne tehnologije. Encimi ki so sposobni cepiti na točno določenem mestu znotraj DNK, nam omogočajo manipulacijo genov in proizvodnjo proteinov v velikem obsegu (rekombinanten inzulin). Endonukleaza R in ostale iz skupine tipa 2 so izjemno pomembne v genetskem inženiringu, kjer se uporabljajo za kloniranje, tvorbo knjižnic, sekvenciranje DNK, detekcijo in preprodukcijo enzimov, hormonov in še česa. Uporabljamo jih tudi za DNK fingerprinting, tehnika s katero lahko lokaliziramo mutacije, detektiramo okvarjene gene, ugotavljamo sorodstvenost (testi očetovstva, kriminalna analitika,..)

Z ozirom na to, da danes v nobenem biokemijskem laboratoriju ni hladilnika, ki nebi vseboval endonukleacijskih restriktaz lahko mirne vesti trdimo, da so izjemno pomembne in da si danes dela v takem laboratoriju brez njih ne predstavljamo.

== Viri ==
[1] W. A. M. Loenen, D. T. F. Dryden, E. A. Raleigh, G. G. Wilson, and N. E. Murray, “NAR Breakthrough Article SURVEY AND SUMMARY Highlights of the DNA cutters : a short history of the restriction enzymes,” vol. 42, no. 1, 2014.

[2] D. Nathans and H. O. Smith, “RESTRICTION IN THE ANALYSIS AND RESTRUCTURING OF DNA MOLECULES,” 1975.

[3] K. Danna and D. Nathans, “Specific Cleavage of Simian Virus 40 DNA by Restriction Endonuclease of Hemophilus Influenzae *,” vol. 68, no. 12, pp. 2913–2917, 1971.

[4] R. J. Roberts and K. Danna, “of molecular biology,” vol. 102, no. 17, pp. 5905–5908, 2005.

[5] I. Purification, O. Smithand, and K. W. Wilcox, “Enzyme from Hemophilus influenzae,” pp. 379–391, 1970.

[6] J. Thomas, “Enzyme from Hemophilus infuenzae Site Base Sequence of the Recognition,” pp. 393–409, 1970.

[7] S. J. Labrie, J. E. Samson, and S. Moineau, “Bacteriophage resistance mechanisms,” Nat. Publ. Gr., vol. 8, no. 5, pp. 317–327, 2010.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-04-09T00:48:56Z

Bk6146:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315 pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Blokiranje_receptorjev_za_fage Blokiranje receptorjev za fage] (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa Proizvodnja zunajceličnega matriksa] (Patricija Miklavc, Benjamin Malovrh, Vid Modic) 
3. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_kompetitivnih_inhibitorjev Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev] (Ajda Godec,Liza Ulčakar,Luka Gnidovec) 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_prvih_restrikcijskih_endonukleaz Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz] (Alen Šadl, Bor Klančnik, Andrej Špenko) 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme (Nika Boštic, Tadej Medved, Sonja Gabrijelčič) 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) (Eva Gartner, Neža Blaznik, Tina Zavodnik ) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mateja Špegel, Špela Friškovec Vončina, Anja Truden) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, Anja Tavčar) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Jernej Imperl, Klementina Polanec, Gašper Anton Komatar) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pavleković, Valeriya Musina) 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom (Sanja Stanković, Karin Dobravc Škof, Neža Žerjav ) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-04-09T00:47:57Z

Bk6146:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315 pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Blokiranje_receptorjev_za_fage Blokiranje receptorjev za fage] (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa Proizvodnja zunajceličnega matriksa] (Patricija Miklavc, Benjamin Malovrh, Vid Modic) 
3. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_kompetitivnih_inhibitorjev Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev] (Ajda Godec,Liza Ulčakar,Luka Gnidovec) 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_prvih_restrikcijskih_endonukleaz] (Alen Šadl, Bor Klančnik, Andrej Špenko) 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme (Nika Boštic, Tadej Medved, Sonja Gabrijelčič) 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) (Eva Gartner, Neža Blaznik, Tina Zavodnik ) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mateja Špegel, Špela Friškovec Vončina, Anja Truden) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, Anja Tavčar) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Jernej Imperl, Klementina Polanec, Gašper Anton Komatar) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pavleković, Valeriya Musina) 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom (Sanja Stanković, Karin Dobravc Škof, Neža Žerjav ) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz

2019-04-09T00:47:00Z

Bk6146:

'''
== Restrikcijski encimi ==
Restrikcijski encimi ali restrikcijske endonukleaze so encimi, ki so sposobni cepiti DNK v manjše fragmente. To storijo v bližini ali znotraj specifičnega prepoznavnega zaporedja, ki se nahaja znotraj DNK molekule. To so restrikcijska mesta.

Restrikcijske encime zdaj delimo na pet glavnih tipov, ki se med seboj razlikujejo v strukturi, ali cepijo znotraj restrikcijskega mesta ali pa izven, ter tudi kateri kofaktorji so potrebni za delovanje. Restriktaze cepijo molekulo DNK , na po enem mestu na posamezni verigi dvojne vijačnice, tako da razcepijo fosfodiestrsko vez.
Do poimenovanja restrikcijski encim so prišli pri proučevanju bakteriofagov λ v 60-ih prejšnega stoletja. V nadaljevanju bova predstavila pionirske članke, ki so privedli do odkritja teh izjemno pomembnih encimov.

(Bor Klančnik)
== Od fagov do prvih 'E.coli'' restrikcijskih endonukleaz ==
Med prvima, ki sta opazoval bakterijske okužbe in pri tem naletela na fenomen restrikcije in modifikacije, sta bila G. Bertani in J.J. Weigle (članek objavljen 1952). Vendar takrat nista vedela na kaj sta naletela. Sama sta preučevala fagni razvoj v bakterijskih gostiteljicah in kako različni sevi bakterij vplivajo na sam sev virusa. V študiji sta uporabila različne seve bakterije E. coli (S, C, in nelizogeničen K-12 in derivate) in Sh sev S. dysenteriae ter faga λ in P2. Oba fag sta bila uspešno transformirana v prvih bakterijah. Pri ponovni okužbi s pridobljenimi novimi fagi, sta poskušala okužiti druge seve bakterij in pri tem ugotovila, da je to le malokrat uspešno. Pravilno sta predpostavila, da gre pri tem za lastnosti bakterij in ne samih fagov. Ker pojem restrikcije še nista poznala, sta to opisala kot preko gostitelja inducirana/kontrolirana variacija.

V letu 1962 je W. Aber objavil članek ,kjer je predlagal teorijo, ki bi razložila ta fenomen vpliva gostiteljskih bakterij na fagno DNK. V raziskavi je uporabil 32P-označen fag λ K in opazoval razgradnjo označene DNK ob okužbi različnih sevov bakterij. Poleg označevanja pa je še uporabil metodo reševanja cepljenega genoma faga s superinfekcijo le tega v označene seve bakterij okužene z necepljenimi fagi. S slednjo je pokazal, da obstaja mehanizem znotraj gostiteljice, ki prepozna takšen fag in ga razgradi. V namigovanju , je opozoril, da obstaja možnost cepitve fagne DNK na točno določenih mestih. Vendar se tej teze, takrat še ni zagovarjal.

Kmalu za tem, v letu 1968, pa je prišlo do odkritja prvega restrikcijskega encima. M. Meselson in Robert Yuan sta kot prva izloirala (sicer istočasno kot Aber) in opisala restrikcijski encim iz E.coli. Do tedaj že dobro poznani sistem gostiteljsko kontroliranim modifikacij, je dobil nov pomen. Šlo je za encim, ki je sposoben razgraditi fagno DNK na določen fragmente. Ugotovila sta, da ti restrikcijski encimi za popolno delovanje potrebujejo Mg+2 ione, ATP in S-adenozilmetionin (SAM). S serijo izvirnih in hkrati preprostih eksperimentov sta določila, da gre pri restrikcijskem encimu za endonukleazo (cepi samo znotraj zaporedja), nastali fragmenti DNK so dvoverižni in ne enoverižni ter da encim naprej cepi eno verigo in šele nato drugo. Nazadnje sta dokazal, da do cepitve heterodupleksov fagne DNK ne pride, kar pomeni da encim lahko cepi le določeno zaporedje. Uspešno sta izolirala encima iz bakterijskega seva K in iz P1 liziranih celice. Poimenovala sta ju E. coli endonukleza IIIK in IIIP.

(Bor Klančnik)

== Odkritje restriktaz v ''Hemophilus influenzea'' in določitev restrikcijskega mesta ==
Po odkritju prvih restrikcijskih endonukleaz, ki so jih izolirali iz E. coli, je Hamilton Smith poizkusil in uspel dokazati, da podobne restrikcijske endonukleaze obstajajo tudi v bakteriji Hemophilus influenzae, ki jih danes imenujemo kar endonukleaze R. V članku iz leta 1970 sta skupaj z K. W. Wilcoxom podrobno opisala postopke izolacije, čiščenja in . Izvlečke seva Rd iz H. influenzae, ki vsebujejo restrikcijske endonukleaze sta očistila do te mere, da ni bilo več mogoče zaznati exo- ali endonukleaznih aktivnosti. Ker ima vsak organizem značilno specifično viskoznost DNK, sta za sledenje eksperimentom uporabila ravno to metodo. Opazila sta, da ko sta dodala nativno DNK od organizma iz katerega sta izolirala encim do sprememb v specifični viskoznosti ni prišlo. Medtem ko pa sta encimu dodajala tuje DNK, kot je recimo P22 DNK, je specifična viskoznost padla za približno 25%. S svojim eksperimentom sta dokazala, da endonukleaza prelomi DNK preko obeh vijačnic tako, da nastane 5’-fosforil, 3’-hidroksil cepitev in da se te cepitve zgodijo omejeno krat na tujih nativnih DNK. Poleg prej omenjene P22 DNK, sta testirala še fag T7, DNK od S. typhimurium, DNK iz sperme lososa in še nekatere druge, vendar pa sta pri vseh opazila degradacijo do podobne stopnje. Podobno kot endonukleaza izolirana iz E. coli tudi ta ne razcepi lastne nativne DNK ali tuje denaturirane. Danes vemo, da raziskovana endonukleaza R spada v skupino tipa 2 in da cepi točno pri ali zraven prepoznavnega zaporedja (restrikcijskega mesta). Prva vprašanja v to smer si je postavljal tudi Hamilton Smith, kar pa je nekoliko pozneje skupaj z Thomas J. Kellyjem tudi raziskal in potrdil.

Oba članka sta bila objavlena v isti izdaji Journal of Molecular Biology. Sekvenco restrikcijskega mesta sta določevala s pomočjo analize koncev fragmentov, ki jih je naredil encim. S tem sta določila, da je zaporedje ki ga prepozna encim GTY|RAC, kjer je Y = piridinska nukleinska kislina in R = purinska nukleinska kislina. Ker encim ne razgradi lastne DNK, sta predvidela dve možnosti, ali je dotična sekvenca na nek način modificirana, ali pa je v svojem DNK zapisu ne vsebuje. Pri tem ju je najbolj presenetila simetričnost restrikcijskega mesta. Predpostavila sta tudi dva mehanizma delovanja endonukleaze, pri prvem sta predlagala model, ko se le ena molekula encima veže na restrikcijsko mesto in medtem ko “zlomi” prvo verigo, takoj “napade” drugo komplementarno in razbije verigo podobno kot na prvi verigi. Kot drug model pa sta predstavila mehanizem, ko se dve podobni molekuli encima simetrično povežeta v tarčno zaporedje in dvojno vijačnico prelomita hkrati.

Po objavi teh člankov se niti sam Hamilton Smith ni zavedal pomembnosti svojega odkritja. Vendar pa je na podlagi njegovih raziskav le leto dni pozneje Daniel Nathans postavil temelje moderne biokemijie kot jo poznamo danes. Saj je lahko s tem, da je vedel kje točno cepi endonukleaza R, sestavil celotno fizično mapo simian virusa 40 (SV40) iz fragmentov, ki so nastali po obdelavi z encimom. S tem je pa uspel odkriti tudi začetno mesto replikacije in mesto SV40 genov. Nathans je izboljšal tudi postopek ločbe fragmentov saj sukrozni gradient, ki ga je uporabil Smith ni dal dovolj dobre resolucije. V tem času je ravno Ulrich Loening kot pionir začel izvajati elektroforezo na poliakrilnem gelu (PAGE), kar je dalo neprimerljivo boljšo ločbo. Ta tehnika je v uporabi v različnih izvedbah še danes. Nathans in njegova ekipa so zelo natančno napovedali potencialne aplikacije restrikcijskih endonukleaz, kot so: uporaba fragmentov za sestavo celotne fizične mape (to so tudi sami dokazali); lokalizacija začetka replikacije in pozicija genov (tudi to so dokazali sami na primeru SV40); posamezen gen bi lahko mapirali na tak način, da mu med transformacijo testiramu biološko aktivnost; priprava mutantov z delecijo specifičnih fragmentov.

(Alen Šadl)

== Uporabnost restrikcijskih encimov ==
Hamilton O. Smith, Daniel Nathans in Werner Arber so leta 1978 za svoja odkritja restrikcijskih encimov in njihove aplikacije v molekularni genetiki prejeli Nobelovo nagrado v fiziologiji in medicini.

Odkritje restrikcijskih endonukleaz je bila osnova za razvoj rekombinantne tehnologije. Encimi ki so sposobni cepiti na točno določenem mestu znotraj DNK, nam omogočajo manipulacijo genov in proizvodnjo proteinov v velikem obsegu (rekombinanten inzulin). Endonukleaza R in ostale iz skupine tipa 2 so izjemno pomembne v genetskem inženiringu, kjer se uporabljajo za kloniranje, tvorbo knjižnic, sekvenciranje DNK, detekcijo in preprodukcijo enzimov, hormonov in še česa. Uporabljamo jih tudi za DNK fingerprinting, tehnika s katero lahko lokaliziramo mutacije, detektiramo okvarjene gene, ugotavljamo sorodstvenost (testi očetovstva, kriminalna analitika,..)

Z ozirom na to, da danes v nobenem biokemijskem laboratoriju ni hladilnika, ki nebi vseboval endonukleacijskih restriktaz lahko mirne vesti trdimo, da so izjemno pomembne in da si danes dela v takem laboratoriju brez njih ne predstavljamo.

== Viri ==
[1] W. A. M. Loenen, D. T. F. Dryden, E. A. Raleigh, G. G. Wilson, and N. E. Murray, “NAR Breakthrough Article SURVEY AND SUMMARY Highlights of the DNA cutters : a short history of the restriction enzymes,” vol. 42, no. 1, 2014.

[2] D. Nathans and H. O. Smith, “RESTRICTION IN THE ANALYSIS AND RESTRUCTURING OF DNA MOLECULES,” 1975.

[3] K. Danna and D. Nathans, “Specific Cleavage of Simian Virus 40 DNA by Restriction Endonuclease of Hemophilus Influenzae *,” vol. 68, no. 12, pp. 2913–2917, 1971.

[4] R. J. Roberts and K. Danna, “of molecular biology,” vol. 102, no. 17, pp. 5905–5908, 2005.

[5] I. Purification, O. Smithand, and K. W. Wilcox, “Enzyme from Hemophilus influenzae,” pp. 379–391, 1970.

[6] J. Thomas, “Enzyme from Hemophilus infuenzae Site Base Sequence of the Recognition,” pp. 393–409, 1970.

[7] S. J. Labrie, J. E. Samson, and S. Moineau, “Bacteriophage resistance mechanisms,” Nat. Publ. Gr., vol. 8, no. 5, pp. 317–327, 2010.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz

2019-04-09T00:46:14Z

Bk6146:

'''
== Restrikcijski encimi ==
Restrikcijski encimi ali restrikcijske endonukleaze so encimi, ki so sposobni cepiti DNK v manjše fragmente. To storijo v bližini ali znotraj specifičnega prepoznavnega zaporedja, ki se nahaja znotraj DNK molekule. To so restrikcijska mesta.

Restrikcijske encime zdaj delimo na pet glavnih tipov, ki se med seboj razlikujejo v strukturi, ali cepijo znotraj restrikcijskega mesta ali pa izven, ter tudi kateri kofaktorji so potrebni za delovanje. Restriktaze cepijo molekulo DNK , na po enem mestu na posamezni verigi dvojne vijačnice, tako da razcepijo fosfodiestrsko vez.
Do poimenovanja restrikcijski encim so prišli pri proučevanju bakteriofagov λ v 60-ih prejšnega stoletja. V nadaljevanju bova predstavila pionirske članke, ki so privedli do odkritja teh izjemno pomembnih encimov.

(Bor Klančnik)
== Od fagov do prvih 'E.coli'' restrikcijskih endonukleaz ==
Med prvima, ki sta opazoval bakterijske okužbe in pri tem naletela na fenomen restrikcije in modifikacije, sta bila G. Bertani in J.J. Weigle (članek objavljen 1952). Vendar takrat nista vedela na kaj sta naletela. Sama sta preučevala fagni razvoj v bakterijskih gostiteljicah in kako različni sevi bakterij vplivajo na sam sev virusa. V študiji sta uporabila različne seve bakterije E. coli (S, C, in nelizogeničen K-12 in derivate) in Sh sev S. dysenteriae ter faga λ in P2. Oba fag sta bila uspešno transformirana v prvih bakterijah. Pri ponovni okužbi s pridobljenimi novimi fagi, sta poskušala okužiti druge seve bakterij in pri tem ugotovila, da je to le malokrat uspešno. Pravilno sta predpostavila, da gre pri tem za lastnosti bakterij in ne samih fagov. Ker pojem restrikcije še nista poznala, sta to opisala kot preko gostitelja inducirana/kontrolirana variacija.

V letu 1962 je W. Aber objavil članek ,kjer je predlagal teorijo, ki bi razložila ta fenomen vpliva gostiteljskih bakterij na fagno DNK. V raziskavi je uporabil 32P-označen fag λ K in opazoval razgradnjo označene DNK ob okužbi različnih sevov bakterij. Poleg označevanja pa je še uporabil metodo reševanja cepljenega genoma faga s superinfekcijo le tega v označene seve bakterij okužene z necepljenimi fagi. S slednjo je pokazal, da obstaja mehanizem znotraj gostiteljice, ki prepozna takšen fag in ga razgradi. V namigovanju , je opozoril, da obstaja možnost cepitve fagne DNK na točno določenih mestih. Vendar se tej teze, takrat še ni zagovarjal.

Kmalu za tem, v letu 1968, pa je prišlo do odkritja prvega restrikcijskega encima. M. Meselson in Robert Yuan sta kot prva izloirala (sicer istočasno kot Aber) in opisala restrikcijski encim iz E.coli. Do tedaj že dobro poznani sistem gostiteljsko kontroliranim modifikacij, je dobil nov pomen. Šlo je za encim, ki je sposoben razgraditi fagno DNK na določen fragmente. Ugotovila sta, da ti restrikcijski encimi za popolno delovanje potrebujejo Mg+2 ione, ATP in S-adenozilmetionin (SAM). S serijo izvirnih in hkrati preprostih eksperimentov sta določila, da gre pri restrikcijskem encimu za endonukleazo (cepi samo znotraj zaporedja), nastali fragmenti DNK so dvoverižni in ne enoverižni ter da encim naprej cepi eno verigo in šele nato drugo. Nazadnje sta dokazal, da do cepitve heterodupleksov fagne DNK ne pride, kar pomeni da encim lahko cepi le določeno zaporedje. Uspešno sta izolirala encima iz bakterijskega seva K in iz P1 liziranih celice. Poimenovala sta ju E. coli endonukleza IIIK in IIIP.

(Bor Klančnik)

== Odkritje restriktaz v ''Hemophilus influenzea'' in določitev restrikcijskega mesta ==
Po odkritju prvih restrikcijskih endonukleaz, ki so jih izolirali iz E. coli, je Hamilton Smith poizkusil in uspel dokazati, da podobne restrikcijske endonukleaze obstajajo tudi v bakteriji Hemophilus influenzae, ki jih danes imenujemo kar endonukleaze R. V članku iz leta 1970 sta skupaj z K. W. Wilcoxom podrobno opisala postopke izolacije, čiščenja in . Izvlečke seva Rd iz H. influenzae, ki vsebujejo restrikcijske endonukleaze sta očistila do te mere, da ni bilo več mogoče zaznati exo- ali endonukleaznih aktivnosti. Ker ima vsak organizem značilno specifično viskoznost DNK, sta za sledenje eksperimentom uporabila ravno to metodo. Opazila sta, da ko sta dodala nativno DNK od organizma iz katerega sta izolirala encim do sprememb v specifični viskoznosti ni prišlo. Medtem ko pa sta encimu dodajala tuje DNK, kot je recimo P22 DNK, je specifična viskoznost padla za približno 25%. S svojim eksperimentom sta dokazala, da endonukleaza prelomi DNK preko obeh vijačnic tako, da nastane 5’-fosforil, 3’-hidroksil cepitev in da se te cepitve zgodijo omejeno krat na tujih nativnih DNK. Poleg prej omenjene P22 DNK, sta testirala še fag T7, DNK od S. typhimurium, DNK iz sperme lososa in še nekatere druge, vendar pa sta pri vseh opazila degradacijo do podobne stopnje. Podobno kot endonukleaza izolirana iz E. coli tudi ta ne razcepi lastne nativne DNK ali tuje denaturirane. Danes vemo, da raziskovana endonukleaza R spada v skupino tipa 2 in da cepi točno pri ali zraven prepoznavnega zaporedja (restrikcijskega mesta). Prva vprašanja v to smer si je postavljal tudi Hamilton Smith, kar pa je nekoliko pozneje skupaj z Thomas J. Kellyjem tudi raziskal in potrdil.

Oba članka sta bila objavlena v isti izdaji Journal of Molecular Biology. Sekvenco restrikcijskega mesta sta določevala s pomočjo analize koncev fragmentov, ki jih je naredil encim. S tem sta določila, da je zaporedje ki ga prepozna encim GTY|RAC, kjer je Y = piridinska nukleinska kislina in R = purinska nukleinska kislina. Ker encim ne razgradi lastne DNK, sta predvidela dve možnosti, ali je dotična sekvenca na nek način modificirana, ali pa je v svojem DNK zapisu ne vsebuje. Pri tem ju je najbolj presenetila simetričnost restrikcijskega mesta. Predpostavila sta tudi dva mehanizma delovanja endonukleaze, pri prvem sta predlagala model, ko se le ena molekula encima veže na restrikcijsko mesto in medtem ko “zlomi” prvo verigo, takoj “napade” drugo komplementarno in razbije verigo podobno kot na prvi verigi. Kot drug model pa sta predstavila mehanizem, ko se dve podobni molekuli encima simetrično povežeta v tarčno zaporedje in dvojno vijačnico prelomita hkrati.

Po objavi teh člankov se niti sam Hamilton Smith ni zavedal pomembnosti svojega odkritja. Vendar pa je na podlagi njegovih raziskav le leto dni pozneje Daniel Nathans postavil temelje moderne biokemijie kot jo poznamo danes. Saj je lahko s tem, da je vedel kje točno cepi endonukleaza R, sestavil celotno fizično mapo simian virusa 40 (SV40) iz fragmentov, ki so nastali po obdelavi z encimom. S tem je pa uspel odkriti tudi začetno mesto replikacije in mesto SV40 genov. Nathans je izboljšal tudi postopek ločbe fragmentov saj sukrozni gradient, ki ga je uporabil Smith ni dal dovolj dobre resolucije. V tem času je ravno Ulrich Loening kot pionir začel izvajati elektroforezo na poliakrilnem gelu (PAGE), kar je dalo neprimerljivo boljšo ločbo. Ta tehnika je v uporabi v različnih izvedbah še danes. Nathans in njegova ekipa so zelo natančno napovedali potencialne aplikacije restrikcijskih endonukleaz, kot so: uporaba fragmentov za sestavo celotne fizične mape (to so tudi sami dokazali); lokalizacija začetka replikacije in pozicija genov (tudi to so dokazali sami na primeru SV40); posamezen gen bi lahko mapirali na tak način, da mu med transformacijo testiramu biološko aktivnost; priprava mutantov z delecijo specifičnih fragmentov.

(Alen Šadl)

== Uporabnost restrikcijskih encimov ==
Hamilton O. Smith, Daniel Nathans in Werner Arber so leta 1978 za svoja odkritja restrikcijskih encimov in njihove aplikacije v molekularni genetiki prejeli Nobelovo nagrado v fiziologiji in medicini.

Odkritje restrikcijskih endonukleaz je bila osnova za razvoj rekombinantne tehnologije. Encimi ki so sposobni cepiti na točno določenem mestu znotraj DNK, nam omogočajo manipulacijo genov in proizvodnjo proteinov v velikem obsegu (rekombinanten inzulin). Endonukleaza R in ostale iz skupine tipa 2 so izjemno pomembne v genetskem inženiringu, kjer se uporabljajo za kloniranje, tvorbo knjižnic, sekvenciranje DNK, detekcijo in preprodukcijo enzimov, hormonov in še česa. Uporabljamo jih tudi za DNK fingerprinting, tehnika s katero lahko lokaliziramo mutacije, detektiramo okvarjene gene, ugotavljamo sorodstvenost (testi očetovstva, kriminalna analitika,..)

Z ozirom na to, da danes v nobenem biokemijskem laboratoriju ni hladilnika, ki nebi vseboval endonukleacijskih restriktaz lahko mirne vesti trdimo, da so izjemno pomembne in da si danes dela v takem laboratoriju brez njih ne predstavljamo.

== Viri ==
[1] W. A. M. Loenen, D. T. F. Dryden, E. A. Raleigh, G. G. Wilson, and N. E. Murray, “NAR Breakthrough Article SURVEY AND SUMMARY Highlights of the DNA cutters : a short history of the restriction enzymes,” vol. 42, no. 1, 2014.

[2] D. Nathans and H. O. Smith, “RESTRICTION IN THE ANALYSIS AND RESTRUCTURING OF DNA MOLECULES,” 1975.

[3] K. Danna and D. Nathans, “Specific Cleavage of Simian Virus 40 DNA by Restriction Endonuclease of Hemophilus Influenzae *,” vol. 68, no. 12, pp. 2913–2917, 1971.

[4] R. J. Roberts and K. Danna, “of molecular biology,” vol. 102, no. 17, pp. 5905–5908, 2005.

[5] I. Purification, O. Smithand, and K. W. Wilcox, “Enzyme from Hemophilus influenzae,” pp. 379–391, 1970.

[6] J. Thomas, “Enzyme from Hemophilus infuenzae Site Base Sequence of the Recognition,” pp. 393–409, 1970.

[7] S. J. Labrie, J. E. Samson, and S. Moineau, “Bacteriophage resistance mechanisms,” Nat. Publ. Gr., vol. 8, no. 5, pp. 317–327, 2010.

Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz

2019-04-09T00:45:20Z

Bk6146:

'''
== Restrikcijski encimi ==
Restrikcijski encimi ali restrikcijske endonukleaze so encimi, ki so sposobni cepiti DNK v manjše fragmente. To storijo v bližini ali znotraj specifičnega prepoznavnega zaporedja, ki se nahaja znotraj DNK molekule. To so restrikcijska mesta.

Restrikcijske encime zdaj delimo na pet glavnih tipov, ki se med seboj razlikujejo v strukturi, ali cepijo znotraj restrikcijskega mesta ali pa izven, ter tudi kateri kofaktorji so potrebni za delovanje. Restriktaze cepijo molekulo DNK , na po enem mestu na posamezni verigi dvojne vijačnice, tako da razcepijo fosfodiestrsko vez.
Do poimenovanja restrikcijski encim so prišli pri proučevanju bakteriofagov λ v 60-ih prejšnega stoletja. V nadaljevanju bova predstavila pionirske članke, ki so privedli do odkritja teh izjemno pomembnih encimov.

(Bor Klančnik)
== Od fagov do prvih 'E.coli'' restrikcijskih endonukleaz ==
Med prvima, ki sta opazoval bakterijske okužbe in pri tem naletela na fenomen restrikcije in modifikacije, sta bila G. Bertani in J.J. Weigle (članek objavljen 1952). Vendar takrat nista vedela na kaj sta naletela. Sama sta preučevala fagni razvoj v bakterijskih gostiteljicah in kako različni sevi bakterij vplivajo na sam sev virusa. V študiji sta uporabila različne seve bakterije E. coli (S, C, in nelizogeničen K-12 in derivate) in Sh sev S. dysenteriae ter faga λ in P2. Oba fag sta bila uspešno transformirana v prvih bakterijah. Pri ponovni okužbi s pridobljenimi novimi fagi, sta poskušala okužiti druge seve bakterij in pri tem ugotovila, da je to le malokrat uspešno. Pravilno sta predpostavila, da gre pri tem za lastnosti bakterij in ne samih fagov. Ker pojem restrikcije še nista poznala, sta to opisala kot preko gostitelja inducirana/kontrolirana variacija.

V letu 1962 je W. Aber objavil članek ,kjer je predlagal teorijo, ki bi razložila ta fenomen vpliva gostiteljskih bakterij na fagno DNK. V raziskavi je uporabil 32P-označen fag λ K in opazoval razgradnjo označene DNK ob okužbi različnih sevov bakterij. Poleg označevanja pa je še uporabil metodo reševanja cepljenega genoma faga s superinfekcijo le tega v označene seve bakterij okužene z necepljenimi fagi. S slednjo je pokazal, da obstaja mehanizem znotraj gostiteljice, ki prepozna takšen fag in ga razgradi. V namigovanju , je opozoril, da obstaja možnost cepitve fagne DNK na točno določenih mestih. Vendar se tej teze, takrat še ni zagovarjal.

Kmalu za tem, v letu 1968, pa je prišlo do odkritja prvega restrikcijskega encima. M. Meselson in Robert Yuan sta kot prva izloirala (sicer istočasno kot Aber) in opisala restrikcijski encim iz E.coli. Do tedaj že dobro poznani sistem gostiteljsko kontroliranim modifikacij, je dobil nov pomen. Šlo je za encim, ki je sposoben razgraditi fagno DNK na določen fragmente. Ugotovila sta, da ti restrikcijski encimi za popolno delovanje potrebujejo Mg+2 ione, ATP in S-adenozilmetionin (SAM). S serijo izvirnih in hkrati preprostih eksperimentov sta določila, da gre pri restrikcijskem encimu za endonukleazo (cepi samo znotraj zaporedja), nastali fragmenti DNK so dvoverižni in ne enoverižni ter da encim naprej cepi eno verigo in šele nato drugo. Nazadnje sta dokazal, da do cepitve heterodupleksov fagne DNK ne pride, kar pomeni da encim lahko cepi le določeno zaporedje. Uspešno sta izolirala encima iz bakterijskega seva K in iz P1 liziranih celice. Poimenovala sta ju E. coli endonukleza IIIK in IIIP.

(Bor Klančnik)

== Odkritje restriktaz v ''Hemophilus influenzea'' in določitev restrikcijskega mesta ==
Po odkritju prvih restrikcijskih endonukleaz, ki so jih izolirali iz E. coli, je Hamilton Smith poizkusil in uspel dokazati, da podobne restrikcijske endonukleaze obstajajo tudi v bakteriji Hemophilus influenzae, ki jih danes imenujemo kar endonukleaze R. V članku iz leta 1970 sta skupaj z K. W. Wilcoxom podrobno opisala postopke izolacije, čiščenja in . Izvlečke seva Rd iz H. influenzae, ki vsebujejo restrikcijske endonukleaze sta očistila do te mere, da ni bilo več mogoče zaznati exo- ali endonukleaznih aktivnosti. Ker ima vsak organizem značilno specifično viskoznost DNK, sta za sledenje eksperimentom uporabila ravno to metodo. Opazila sta, da ko sta dodala nativno DNK od organizma iz katerega sta izolirala encim do sprememb v specifični viskoznosti ni prišlo. Medtem ko pa sta encimu dodajala tuje DNK, kot je recimo P22 DNK, je specifična viskoznost padla za približno 25%. S svojim eksperimentom sta dokazala, da endonukleaza prelomi DNK preko obeh vijačnic tako, da nastane 5’-fosforil, 3’-hidroksil cepitev in da se te cepitve zgodijo omejeno krat na tujih nativnih DNK. Poleg prej omenjene P22 DNK, sta testirala še fag T7, DNK od S. typhimurium, DNK iz sperme lososa in še nekatere druge, vendar pa sta pri vseh opazila degradacijo do podobne stopnje. Podobno kot endonukleaza izolirana iz E. coli tudi ta ne razcepi lastne nativne DNK ali tuje denaturirane. Danes vemo, da raziskovana endonukleaza R spada v skupino tipa 2 in da cepi točno pri ali zraven prepoznavnega zaporedja (restrikcijskega mesta). Prva vprašanja v to smer si je postavljal tudi Hamilton Smith, kar pa je nekoliko pozneje skupaj z Thomas J. Kellyjem tudi raziskal in potrdil.

Oba članka sta bila objavlena v isti izdaji Journal of Molecular Biology. Sekvenco restrikcijskega mesta sta določevala s pomočjo analize koncev fragmentov, ki jih je naredil encim. S tem sta določila, da je zaporedje ki ga prepozna encim GTY|RAC, kjer je Y = piridinska nukleinska kislina in R = purinska nukleinska kislina. Ker encim ne razgradi lastne DNK, sta predvidela dve možnosti, ali je dotična sekvenca na nek način modificirana, ali pa je v svojem DNK zapisu ne vsebuje. Pri tem ju je najbolj presenetila simetričnost restrikcijskega mesta. Predpostavila sta tudi dva mehanizma delovanja endonukleaze, pri prvem sta predlagala model, ko se le ena molekula encima veže na restrikcijsko mesto in medtem ko “zlomi” prvo verigo, takoj “napade” drugo komplementarno in razbije verigo podobno kot na prvi verigi. Kot drug model pa sta predstavila mehanizem, ko se dve podobni molekuli encima simetrično povežeta v tarčno zaporedje in dvojno vijačnico prelomita hkrati.

Po objavi teh člankov se niti sam Hamilton Smith ni zavedal pomembnosti svojega odkritja. Vendar pa je na podlagi njegovih raziskav le leto dni pozneje Daniel Nathans postavil temelje moderne biokemijie kot jo poznamo danes. Saj je lahko s tem, da je vedel kje točno cepi endonukleaza R, sestavil celotno fizično mapo simian virusa 40 (SV40) iz fragmentov, ki so nastali po obdelavi z encimom. S tem je pa uspel odkriti tudi začetno mesto replikacije in mesto SV40 genov. Nathans je izboljšal tudi postopek ločbe fragmentov saj sukrozni gradient, ki ga je uporabil Smith ni dal dovolj dobre resolucije. V tem času je ravno Ulrich Loening kot pionir začel izvajati elektroforezo na poliakrilnem gelu (PAGE), kar je dalo neprimerljivo boljšo ločbo. Ta tehnika je v uporabi v različnih izvedbah še danes. Nathans in njegova ekipa so zelo natančno napovedali potencialne aplikacije restrikcijskih endonukleaz, kot so: uporaba fragmentov za sestavo celotne fizične mape (to so tudi sami dokazali); lokalizacija začetka replikacije in pozicija genov (tudi to so dokazali sami na primeru SV40); posamezen gen bi lahko mapirali na tak način, da mu med transformacijo testiramu biološko aktivnost; priprava mutantov z delecijo specifičnih fragmentov.

(Alen Šadl)

== Uporabnost restrikcijskih encimov ==
Hamilton O. Smith, Daniel Nathans in Werner Arber so leta 1978 za svoja odkritja restrikcijskih encimov in njihove aplikacije v molekularni genetiki prejeli Nobelovo nagrado v fiziologiji in medicini.

Odkritje restrikcijskih endonukleaz je bila osnova za razvoj rekombinantne tehnologije. Encimi ki so sposobni cepiti na točno določenem mestu znotraj DNK, nam omogočajo manipulacijo genov in proizvodnjo proteinov v velikem obsegu (rekombinanten inzulin). Endonukleaza R in ostale iz skupine tipa 2 so izjemno pomembne v genetskem inženiringu, kjer se uporabljajo za kloniranje, tvorbo knjižnic, sekvenciranje DNK, detekcijo in preprodukcijo enzimov, hormonov in še česa. Uporabljamo jih tudi za DNK fingerprinting, tehnika s katero lahko lokaliziramo mutacije, detektiramo okvarjene gene, ugotavljamo sorodstvenost (testi očetovstva, kriminalna analitika,..)

Z ozirom na to, da danes v nobenem biokemijskem laboratoriju ni hladilnika, ki nebi vseboval endonukleacijskih restriktaz lahko mirne vesti trdimo, da so izjemno pomembne in da si danes dela v takem laboratoriju brez njih ne predstavljamo.

== Viri ==
[1] W. A. M. Loenen, D. T. F. Dryden, E. A. Raleigh, G. G. Wilson, and N. E. Murray, “NAR Breakthrough Article SURVEY AND SUMMARY Highlights of the DNA cutters : a short history of the restriction enzymes,” vol. 42, no. 1, 2014.
[2] D. Nathans and H. O. Smith, “RESTRICTION IN THE ANALYSIS AND RESTRUCTURING OF DNA MOLECULES,” 1975.
[3] K. Danna and D. Nathans, “Specific Cleavage of Simian Virus 40 DNA by Restriction Endonuclease of Hemophilus Influenzae *,” vol. 68, no. 12, pp. 2913–2917, 1971.
[4] R. J. Roberts and K. Danna, “of molecular biology,” vol. 102, no. 17, pp. 5905–5908, 2005.
[5] I. Purification, O. Smithand, and K. W. Wilcox, “Enzyme from Hemophilus influenzae,” pp. 379–391, 1970.
[6] J. Thomas, “Enzyme from Hemophilus infuenzae Site Base Sequence of the Recognition,” pp. 393–409, 1970.
[7] S. J. Labrie, J. E. Samson, and S. Moineau, “Bacteriophage resistance mechanisms,” Nat. Publ. Gr., vol. 8, no. 5, pp. 317–327, 2010.

Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz

2019-04-09T00:42:50Z

Bk6146:

'''
== Restrikcijski encimi ==
Restrikcijski encimi ali restrikcijske endonukleaze so encimi, ki so sposobni cepiti DNK v manjše fragmente. To storijo v bližini ali znotraj specifičnega prepoznavnega zaporedja, ki se nahaja znotraj DNK molekule. To so restrikcijska mesta.

Restrikcijske encime zdaj delimo na pet glavnih tipov, ki se med seboj razlikujejo v strukturi, ali cepijo znotraj restrikcijskega mesta ali pa izven, ter tudi kateri kofaktorji so potrebni za delovanje. Restriktaze cepijo molekulo DNK , na po enem mestu na posamezni verigi dvojne vijačnice, tako da razcepijo fosfodiestrsko vez.
Do poimenovanja restrikcijski encim so prišli pri proučevanju bakteriofagov λ v 60-ih prejšnega stoletja. V nadaljevanju bova predstavila pionirske članke, ki so privedli do odkritja teh izjemno pomembnih encimov.

(Bor Klančnik)
== Od fagov do prvih 'E.coli'' restrikcijskih endonukleaz ==
Med prvima, ki sta opazoval bakterijske okužbe in pri tem naletela na fenomen restrikcije in modifikacije, sta bila G. Bertani in J.J. Weigle (članek objavljen 1952). Vendar takrat nista vedela na kaj sta naletela. Sama sta preučevala fagni razvoj v bakterijskih gostiteljicah in kako različni sevi bakterij vplivajo na sam sev virusa. V študiji sta uporabila različne seve bakterije E. coli (S, C, in nelizogeničen K-12 in derivate) in Sh sev S. dysenteriae ter faga λ in P2. Oba fag sta bila uspešno transformirana v prvih bakterijah. Pri ponovni okužbi s pridobljenimi novimi fagi, sta poskušala okužiti druge seve bakterij in pri tem ugotovila, da je to le malokrat uspešno. Pravilno sta predpostavila, da gre pri tem za lastnosti bakterij in ne samih fagov. Ker pojem restrikcije še nista poznala, sta to opisala kot preko gostitelja inducirana/kontrolirana variacija.

V letu 1962 je W. Aber objavil članek ,kjer je predlagal teorijo, ki bi razložila ta fenomen vpliva gostiteljskih bakterij na fagno DNK. V raziskavi je uporabil 32P-označen fag λ K in opazoval razgradnjo označene DNK ob okužbi različnih sevov bakterij. Poleg označevanja pa je še uporabil metodo reševanja cepljenega genoma faga s superinfekcijo le tega v označene seve bakterij okužene z necepljenimi fagi. S slednjo je pokazal, da obstaja mehanizem znotraj gostiteljice, ki prepozna takšen fag in ga razgradi. V namigovanju , je opozoril, da obstaja možnost cepitve fagne DNK na točno določenih mestih. Vendar se tej teze, takrat še ni zagovarjal.

Kmalu za tem, v letu 1968, pa je prišlo do odkritja prvega restrikcijskega encima. M. Meselson in Robert Yuan sta kot prva izloirala (sicer istočasno kot Aber) in opisala restrikcijski encim iz E.coli. Do tedaj že dobro poznani sistem gostiteljsko kontroliranim modifikacij, je dobil nov pomen. Šlo je za encim, ki je sposoben razgraditi fagno DNK na določen fragmente. Ugotovila sta, da ti restrikcijski encimi za popolno delovanje potrebujejo Mg+2 ione, ATP in S-adenozilmetionin (SAM). S serijo izvirnih in hkrati preprostih eksperimentov sta določila, da gre pri restrikcijskem encimu za endonukleazo (cepi samo znotraj zaporedja), nastali fragmenti DNK so dvoverižni in ne enoverižni ter da encim naprej cepi eno verigo in šele nato drugo. Nazadnje sta dokazal, da do cepitve heterodupleksov fagne DNK ne pride, kar pomeni da encim lahko cepi le določeno zaporedje. Uspešno sta izolirala encima iz bakterijskega seva K in iz P1 liziranih celice. Poimenovala sta ju E. coli endonukleza IIIK in IIIP.

(Bor Klančnik)

== Odkritje restriktaz v ''Hemophilus influenzea'' in določitev restrikcijskega mesta ==
Po odkritju prvih restrikcijskih endonukleaz, ki so jih izolirali iz E. coli, je Hamilton Smith poizkusil in uspel dokazati, da podobne restrikcijske endonukleaze obstajajo tudi v bakteriji Hemophilus influenzae, ki jih danes imenujemo kar endonukleaze R. V članku iz leta 1970 sta skupaj z K. W. Wilcoxom podrobno opisala postopke izolacije, čiščenja in . Izvlečke seva Rd iz H. influenzae, ki vsebujejo restrikcijske endonukleaze sta očistila do te mere, da ni bilo več mogoče zaznati exo- ali endonukleaznih aktivnosti. Ker ima vsak organizem značilno specifično viskoznost DNK, sta za sledenje eksperimentom uporabila ravno to metodo. Opazila sta, da ko sta dodala nativno DNK od organizma iz katerega sta izolirala encim do sprememb v specifični viskoznosti ni prišlo. Medtem ko pa sta encimu dodajala tuje DNK, kot je recimo P22 DNK, je specifična viskoznost padla za približno 25%. S svojim eksperimentom sta dokazala, da endonukleaza prelomi DNK preko obeh vijačnic tako, da nastane 5’-fosforil, 3’-hidroksil cepitev in da se te cepitve zgodijo omejeno krat na tujih nativnih DNK. Poleg prej omenjene P22 DNK, sta testirala še fag T7, DNK od S. typhimurium, DNK iz sperme lososa in še nekatere druge, vendar pa sta pri vseh opazila degradacijo do podobne stopnje. Podobno kot endonukleaza izolirana iz E. coli tudi ta ne razcepi lastne nativne DNK ali tuje denaturirane. Danes vemo, da raziskovana endonukleaza R spada v skupino tipa 2 in da cepi točno pri ali zraven prepoznavnega zaporedja (restrikcijskega mesta). Prva vprašanja v to smer si je postavljal tudi Hamilton Smith, kar pa je nekoliko pozneje skupaj z Thomas J. Kellyjem tudi raziskal in potrdil.

Oba članka sta bila objavlena v isti izdaji Journal of Molecular Biology. Sekvenco restrikcijskega mesta sta določevala s pomočjo analize koncev fragmentov, ki jih je naredil encim. S tem sta določila, da je zaporedje ki ga prepozna encim GTY|RAC, kjer je Y = piridinska nukleinska kislina in R = purinska nukleinska kislina. Ker encim ne razgradi lastne DNK, sta predvidela dve možnosti, ali je dotična sekvenca na nek način modificirana, ali pa je v svojem DNK zapisu ne vsebuje. Pri tem ju je najbolj presenetila simetričnost restrikcijskega mesta. Predpostavila sta tudi dva mehanizma delovanja endonukleaze, pri prvem sta predlagala model, ko se le ena molekula encima veže na restrikcijsko mesto in medtem ko “zlomi” prvo verigo, takoj “napade” drugo komplementarno in razbije verigo podobno kot na prvi verigi. Kot drug model pa sta predstavila mehanizem, ko se dve podobni molekuli encima simetrično povežeta v tarčno zaporedje in dvojno vijačnico prelomita hkrati.

Po objavi teh člankov se niti sam Hamilton Smith ni zavedal pomembnosti svojega odkritja. Vendar pa je na podlagi njegovih raziskav le leto dni pozneje Daniel Nathans postavil temelje moderne biokemijie kot jo poznamo danes. Saj je lahko s tem, da je vedel kje točno cepi endonukleaza R, sestavil celotno fizično mapo simian virusa 40 (SV40) iz fragmentov, ki so nastali po obdelavi z encimom. S tem je pa uspel odkriti tudi začetno mesto replikacije in mesto SV40 genov. Nathans je izboljšal tudi postopek ločbe fragmentov saj sukrozni gradient, ki ga je uporabil Smith ni dal dovolj dobre resolucije. V tem času je ravno Ulrich Loening kot pionir začel izvajati elektroforezo na poliakrilnem gelu (PAGE), kar je dalo neprimerljivo boljšo ločbo. Ta tehnika je v uporabi v različnih izvedbah še danes. Nathans in njegova ekipa so zelo natančno napovedali potencialne aplikacije restrikcijskih endonukleaz, kot so: uporaba fragmentov za sestavo celotne fizične mape (to so tudi sami dokazali); lokalizacija začetka replikacije in pozicija genov (tudi to so dokazali sami na primeru SV40); posamezen gen bi lahko mapirali na tak način, da mu med transformacijo testiramu biološko aktivnost; priprava mutantov z delecijo specifičnih fragmentov.

(Alen Šadl)

== Uporabnost restrikcijskih encimov ==
Hamilton O. Smith, Daniel Nathans in Werner Arber so leta 1978 za svoja odkritja restrikcijskih encimov in njihove aplikacije v molekularni genetiki prejeli Nobelovo nagrado v fiziologiji in medicini.

Odkritje restrikcijskih endonukleaz je bila osnova za razvoj rekombinantne tehnologije. Encimi ki so sposobni cepiti na točno določenem mestu znotraj DNK, nam omogočajo manipulacijo genov in proizvodnjo proteinov v velikem obsegu (rekombinanten inzulin). Endonukleaza R in ostale iz skupine tipa 2 so izjemno pomembne v genetskem inženiringu, kjer se uporabljajo za kloniranje, tvorbo knjižnic, sekvenciranje DNK, detekcijo in preprodukcijo enzimov, hormonov in še česa. Uporabljamo jih tudi za DNK fingerprinting, tehnika s katero lahko lokaliziramo mutacije, detektiramo okvarjene gene, ugotavljamo sorodstvenost (testi očetovstva, kriminalna analitika,..)

Z ozirom na to, da danes v nobenem biokemijskem laboratoriju ni hladilnika, ki nebi vseboval endonukleacijskih restriktaz lahko mirne vesti trdimo, da so izjemno pomembne in da si danes dela v takem laboratoriju brez njih ne predstavljamo.

Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz

2019-04-09T00:41:05Z

Bk6146:

'''
== Restrikcijski encimi ==

Restrikcijski encimi ali restrikcijske endonukleaze so encimi, ki so sposobni cepiti DNK v manjše fragmente. To storijo v bližini ali znotraj specifičnega prepoznavnega zaporedja, ki se nahaja znotraj DNK molekule. To so restrikcijska mesta.
Restrikcijske encime zdaj delimo na pet glavnih tipov, ki se med seboj razlikujejo v strukturi, ali cepijo znotraj restrikcijskega mesta ali pa izven, ter tudi kateri kofaktorji so potrebni za delovanje. Restriktaze cepijo molekulo DNK , na po enem mestu na posamezni verigi dvojne vijačnice, tako da razcepijo fosfodiestrsko vez.

Do poimenovanja restrikcijski encim so prišli pri proučevanju bakteriofagov λ v 60-ih prejšnega stoletja. V nadaljevanju bova predstavila pionirske članke, ki so privedli do odkritja teh izjemno pomembnih encimov.

(Bor Klančnik)
== Od fagov do prvih 'E.coli'' restrikcijskih endonukleaz ==

Med prvima, ki sta opazoval bakterijske okužbe in pri tem naletela na fenomen restrikcije in modifikacije, sta bila G. Bertani in J.J. Weigle (članek objavljen 1952). Vendar takrat nista vedela na kaj sta naletela. Sama sta preučevala fagni razvoj v bakterijskih gostiteljicah in kako različni sevi bakterij vplivajo na sam sev virusa. V študiji sta uporabila različne seve bakterije E. coli (S, C, in nelizogeničen K-12 in derivate) in Sh sev S. dysenteriae ter faga λ in P2. Oba fag sta bila uspešno transformirana v prvih bakterijah. Pri ponovni okužbi s pridobljenimi novimi fagi, sta poskušala okužiti druge seve bakterij in pri tem ugotovila, da je to le malokrat uspešno. Pravilno sta predpostavila, da gre pri tem za lastnosti bakterij in ne samih fagov. Ker pojem restrikcije še nista poznala, sta to opisala kot preko gostitelja inducirana/kontrolirana variacija.

V letu 1962 je W. Aber objavil članek ,kjer je predlagal teorijo, ki bi razložila ta fenomen vpliva gostiteljskih bakterij na fagno DNK. V raziskavi je uporabil 32P-označen fag λ K in opazoval razgradnjo označene DNK ob okužbi različnih sevov bakterij. Poleg označevanja pa je še uporabil metodo reševanja cepljenega genoma faga s superinfekcijo le tega v označene seve bakterij okužene z necepljenimi fagi. S slednjo je pokazal, da obstaja mehanizem znotraj gostiteljice, ki prepozna takšen fag in ga razgradi. V namigovanju , je opozoril, da obstaja možnost cepitve fagne DNK na točno določenih mestih. Vendar se tej teze, takrat še ni zagovarjal.

Kmalu za tem, v letu 1968, pa je prišlo do odkritja prvega restrikcijskega encima. M. Meselson in Robert Yuan sta kot prva izloirala (sicer istočasno kot Aber) in opisala restrikcijski encim iz E.coli. Do tedaj že dobro poznani sistem gostiteljsko kontroliranim modifikacij, je dobil nov pomen. Šlo je za encim, ki je sposoben razgraditi fagno DNK na določen fragmente. Ugotovila sta, da ti restrikcijski encimi za popolno delovanje potrebujejo Mg+2 ione, ATP in S-adenozilmetionin (SAM). S serijo izvirnih in hkrati preprostih eksperimentov sta določila, da gre pri restrikcijskem encimu za endonukleazo (cepi samo znotraj zaporedja), nastali fragmenti DNK so dvoverižni in ne enoverižni ter da encim naprej cepi eno verigo in šele nato drugo. Nazadnje sta dokazal, da do cepitve heterodupleksov fagne DNK ne pride, kar pomeni da encim lahko cepi le določeno zaporedje. Uspešno sta izolirala encima iz bakterijskega seva K in iz P1 liziranih celice. Poimenovala sta ju E. coli endonukleza IIIK in IIIP.

(Bor Klančnik)

== Odkritje restriktaz v ''Hemophilus influenzea'' in določitev restrikcijskega mesta ==

Po odkritju prvih restrikcijskih endonukleaz, ki so jih izolirali iz E. coli, je Hamilton Smith poizkusil in uspel dokazati, da podobne restrikcijske endonukleaze obstajajo tudi v bakteriji Hemophilus influenzae, ki jih danes imenujemo kar endonukleaze R. V članku iz leta 1970 sta skupaj z K. W. Wilcoxom podrobno opisala postopke izolacije, čiščenja in . Izvlečke seva Rd iz H. influenzae, ki vsebujejo restrikcijske endonukleaze sta očistila do te mere, da ni bilo več mogoče zaznati exo- ali endonukleaznih aktivnosti. Ker ima vsak organizem značilno specifično viskoznost DNK, sta za sledenje eksperimentom uporabila ravno to metodo. Opazila sta, da ko sta dodala nativno DNK od organizma iz katerega sta izolirala encim do sprememb v specifični viskoznosti ni prišlo. Medtem ko pa sta encimu dodajala tuje DNK, kot je recimo P22 DNK, je specifična viskoznost padla za približno 25%. S svojim eksperimentom sta dokazala, da endonukleaza prelomi DNK preko obeh vijačnic tako, da nastane 5’-fosforil, 3’-hidroksil cepitev in da se te cepitve zgodijo omejeno krat na tujih nativnih DNK. Poleg prej omenjene P22 DNK, sta testirala še fag T7, DNK od S. typhimurium, DNK iz sperme lososa in še nekatere druge, vendar pa sta pri vseh opazila degradacijo do podobne stopnje. Podobno kot endonukleaza izolirana iz E. coli tudi ta ne razcepi lastne nativne DNK ali tuje denaturirane. Danes vemo, da raziskovana endonukleaza R spada v skupino tipa 2 in da cepi točno pri ali zraven prepoznavnega zaporedja (restrikcijskega mesta). Prva vprašanja v to smer si je postavljal tudi Hamilton Smith, kar pa je nekoliko pozneje skupaj z Thomas J. Kellyjem tudi raziskal in potrdil.

Oba članka sta bila objavlena v isti izdaji Journal of Molecular Biology. Sekvenco restrikcijskega mesta sta določevala s pomočjo analize koncev fragmentov, ki jih je naredil encim. S tem sta določila, da je zaporedje ki ga prepozna encim GTY|RAC, kjer je Y = piridinska nukleinska kislina in R = purinska nukleinska kislina. Ker encim ne razgradi lastne DNK, sta predvidela dve možnosti, ali je dotična sekvenca na nek način modificirana, ali pa je v svojem DNK zapisu ne vsebuje. Pri tem ju je najbolj presenetila simetričnost restrikcijskega mesta. Predpostavila sta tudi dva mehanizma delovanja endonukleaze, pri prvem sta predlagala model, ko se le ena molekula encima veže na restrikcijsko mesto in medtem ko “zlomi” prvo verigo, takoj “napade” drugo komplementarno in razbije verigo podobno kot na prvi verigi. Kot drug model pa sta predstavila mehanizem, ko se dve podobni molekuli encima simetrično povežeta v tarčno zaporedje in dvojno vijačnico prelomita hkrati.

Po objavi teh člankov se niti sam Hamilton Smith ni zavedal pomembnosti svojega odkritja. Vendar pa je na podlagi njegovih raziskav le leto dni pozneje Daniel Nathans postavil temelje moderne biokemijie kot jo poznamo danes. Saj je lahko s tem, da je vedel kje točno cepi endonukleaza R, sestavil celotno fizično mapo simian virusa 40 (SV40) iz fragmentov, ki so nastali po obdelavi z encimom. S tem je pa uspel odkriti tudi začetno mesto replikacije in mesto SV40 genov. Nathans je izboljšal tudi postopek ločbe fragmentov saj sukrozni gradient, ki ga je uporabil Smith ni dal dovolj dobre resolucije. V tem času je ravno Ulrich Loening kot pionir začel izvajati elektroforezo na poliakrilnem gelu (PAGE), kar je dalo neprimerljivo boljšo ločbo. Ta tehnika je v uporabi v različnih izvedbah še danes. Nathans in njegova ekipa so zelo natančno napovedali potencialne aplikacije restrikcijskih endonukleaz, kot so: uporaba fragmentov za sestavo celotne fizične mape (to so tudi sami dokazali); lokalizacija začetka replikacije in pozicija genov (tudi to so dokazali sami na primeru SV40); posamezen gen bi lahko mapirali na tak način, da mu med transformacijo testiramu biološko aktivnost; priprava mutantov z delecijo specifičnih fragmentov.

(Alen Šadl)

== Uporabnost restrikcijskih encimov ==

Hamilton O. Smith, Daniel Nathans in Werner Arber so leta 1978 za svoja odkritja restrikcijskih encimov in njihove aplikacije v molekularni genetiki prejeli Nobelovo nagrado v fiziologiji in medicini.

Odkritje restrikcijskih endonukleaz je bila osnova za razvoj rekombinantne tehnologije. Encimi ki so sposobni cepiti na točno določenem mestu znotraj DNK, nam omogočajo manipulacijo genov in proizvodnjo proteinov v velikem obsegu (rekombinanten inzulin). Endonukleaza R in ostale iz skupine tipa 2 so izjemno pomembne v genetskem inženiringu, kjer se uporabljajo za kloniranje, tvorbo knjižnic, sekvenciranje DNK, detekcijo in preprodukcijo enzimov, hormonov in še česa. Uporabljamo jih tudi za DNK fingerprinting, tehnika s katero lahko lokaliziramo mutacije, detektiramo okvarjene gene, ugotavljamo sorodstvenost (testi očetovstva, kriminalna analitika,..)

Z ozirom na to, da danes v nobenem biokemijskem laboratoriju ni hladilnika, ki nebi vseboval endonukleacijskih restriktaz lahko mirne vesti trdimo, da so izjemno pomembne in da si danes dela v takem laboratoriju brez njih ne predstavljamo.

Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz

2019-04-08T09:46:13Z

Bk6146: /* Odkritje restriktaz v Hemophilus influenzea */

'''
== Restrikcijski encimi ==

== Odritje DNK restriktaz v ''E.coli'' ==

== Odkritje restriktaz v ''Hemophilus influenzea'' in določitev restrikcijskega mesta ==

== Uporabnost restrikcijskih encimov ==

Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz

2019-04-08T09:07:40Z

Bk6146:

'''
== Restrikcijski encimi ==

== Odritje DNK restriktaz v ''E.coli'' ==

== Odkritje restriktaz v ''Hemophilus influenzea'' ==

== Uporabnost restrikcijskih encimov ==

Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz

2019-04-08T08:51:47Z

Bk6146:

'''
== Restrikcijski encimi ==

hahahahhahahahahahha

Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz

2019-04-08T08:51:28Z

Bk6146:

'''
== Restrikcijski encimi ==
'''
hahahahhahahahahahha

Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz

2019-04-08T08:51:18Z

Bk6146:

'''
== Restrikcijski encimi ==
'''

Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz

2019-04-08T08:51:01Z

Bk6146: New page: '''Restrikcijski encimi'''

'''Restrikcijski encimi'''

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-03-09T17:45:37Z

Bk6146:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315|pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so (seznam v pripravi):

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. Blokiranje receptorjev za fage (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa (Patricija Miklavc, Benjamin Malovrh) 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev (Ajda Godec,Liza Ulčakar,Luka Gnidovec) 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah (Mateja Špegel, Špela Friškovec) 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz (Alen Šadl, Bor Klančnik,) 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme (Nika Boštic, Tadej Medved, Sonja Gabrijelčič) 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) (Eva Gartner, Neža Blaznik, ) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, Anja Tavčar) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Jernej Imperl, Klementina Polanec, ) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pacleković, Valeriya Musina) 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom (Sanja Stanković, ) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-03-09T13:03:09Z

Bk6146:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315|pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so (seznam v pripravi):

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. Blokiranje receptorjev za fage (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa (Patricija Miklavc, Benjamin Malovrh) 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev (Ajda Godec,Liza Ulčakar,Luka Gnidovec) 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz (Alen Šadl, Bor Klančnik,) 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme (Nika Boštic, Tadej Medved, Sonja Gabrijelčič) 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) (Eva Gartner, Neža Blaznik, ) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, Anja Tavčar) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Jernej Imperl, Klementina Polanec, ) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pacleković, Valeriya Musina) 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom (Sanja Stanković, ) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-03-09T13:02:46Z

Bk6146:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315|pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so (seznam v pripravi):

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. Blokiranje receptorjev za fage (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa (Patricija Miklavc, Benjamin Malovrh) 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev (Ajda Godec,Liza Ulčakar,Luka Gnidovec) 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz (Alen Šadl, Bor Klančnik) 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme (Nika Boštic, Tadej Medved, Sonja Gabrijelčič) 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) (Eva Gartner, Neža Blaznik, ) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, Anja Tavčar) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Jernej Imperl, Klementina Polanec, ) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pacleković, Valeriya Musina) 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom (Sanja Stanković, ) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-03-09T13:02:10Z

Bk6146:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315|pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so (seznam v pripravi):

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. Blokiranje receptorjev za fage (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa (Patricija Miklavc, Benjamin Malovrh) 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev (Ajda Godec,Liza Ulčakar,Luka Gnidovec) 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz (Alen Šadl, Bor Klančnik)
7. Metilacijski sistem pri bakterijah (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme (Nika Boštic, Tadej Medved, Sonja Gabrijelčič) 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) (Eva Gartner, Neža Blaznik, ) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, Anja Tavčar) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Jernej Imperl, Klementina Polanec, ) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pacleković, Valeriya Musina) 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom (Sanja Stanković, ) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

MBT seminarji 2019

2019-03-02T10:50:14Z

Bk6146: