Wiki FKKT - User contributions [en]

Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov

2019-03-19T19:55:31Z

Blazlebar:

Biološka zdravila so na svetovnem trgu farmacije ena izmed najbolj rastočih smeri, vendar jih ovira visoka cena proizvodnje v primerjavi z običajnimi kemijskimi zdravili. To bi lahko rešili z izboljšavo transgenskih tehnik za proizvajanje takšnih zdravil. Kokošji bioreaktorji so redko uporabljeni, predvsem zaradi težke priprave transgenskih živali v preteklosti. Z novejšimi metodami izražamo terapevtski protein v jajčnem beljaku, kar močno zniža ceno proizvodnje <ref name="prvi">Herron LR, Pridans C, Turnbull ML, et al. A chicken bioreactor for efficient production of functional cytokines. ''BMC Biotechnol.'' '''2018''';18(1):82. Dec. 2018. doi:10.1186/s12896-018-0495-1</ref>.
<h2>Priprava bioloških zdravil</h2>
Razvoj postopka za pripravo rekombinantnega človeškega inzulina je usmeril farmacevtsko industrijo v razvoj več bioloških zdravil oz. proteinov. To so lahko protitelesa, encimi, citokini, rastni faktorji… Ta zdravila se v največjem obsegu pripravlja v bakterijah, kvasovkah, redkeje sesalskih celicah. Vsak sistem se definira s kompleksnostjo procesa, količino produkta, ustreznostjo PTM in najpomembneje, s ceno. V namen znižanja slednje, se razvijajo novi genetsko spremenjeni sistemi, ki temeljijo na živini. Pripravili so transgenske ovce, koze ter krave na takšen način, da se je terapevtski protein izločal v mleku. Kljub izjemni inovativnosti te metode, so prisotne tudi pomanjkljivosti – majhno število potomcev, dolga obdobja brejosti, zahteva po velikih življenjskih površinah in količinah hrane, težka izolacija terapevtika iz mleka (visoka vsebnost maščob) ter njegova reabsorpcija (negativne posledice za žival)<ref name="prvi"/>.

Kokošji bioreaktor bi terapevtik izločal v jajčni beljak. Ta vsebuje približno 3,5 g beljakovin v 60 g jajcu, vsaka kokoš pa znese letno preko 300 jajc. Cena gojenja je nizka, namnožitev transgenskih kokoši pa sorazmerno enostavna in hitra. Tudi glikozilacijski vzorec je podoben človeku, kar pomeni nizko imunogenost ter visoko biološko aktivnost terapevtika. Transgenske kokoši so v tej študiji pripravili s pomočjo lentivirusnega vektorja, izražanje pa omejili na jajcevod (torej le v jajčni beljak) s pomočjo zaporedij iz gena za ovalbumin. Fuzija s Fc proteinom je povečala razpolovni čas ter zvišala biološko aktivnost, prav tako omogoča izolacijo preko afinitetne kromatografije <ref name="prvi"/>.
<h2>Metode in rezultati</h2>
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega interferona α2a</h3>
Interferon α2a je citokin, ki se uporablja pri zdravljenju hepatitisa in nekaterih oblik raka. 500 bp dolg zapis je bil vstavljen v lentivirusni vektor, osnovan na EIAV (virus infektivne anemije konjev), ki se ni bil sposoben podvajati. 900 bp dolgo zaporedje ovalbuminskega promotorskega zaporedja med odzivnim elementom za estrogen in od steroidov odvisnim regulatornim elementom (EREOVA2) je povečalo izražanje in ga tudi omejilo na jajcevod (v jajčni beljak) <ref name="prvi"/>. Pripravljen vektor so injicirali v embrije izleženih jajc, da so pripravili G<sub>0</sub> transgenske kokoši. G<sub>0</sub> petelin, izležen iz teh jajc, je moral prestati PCR analizo za preverjanje vstavljanja gena – DNA je bila pridobljena iz semenske tekočine. Nato so ga križali z ''wild type'' kokošmi. G<sub>1</sub> potomcem so izolirali DNA iz krvi ter jo analizirali z restrikcijo in prenosom po Southernu <ref name="drugi"> Lillico SG, Sherman A, McGrew MJ, et al. Oviduct-specific expression of two therapeutic proteins in transgenic hens. ''Proc Natl Acad Sci U S A.'' '''2007''';104(6):1771-6. Feb. 2007. doi:10.1073/pnas.0610401104 </ref><ref name="tretji"> McGrew MJ, Sherman A, Ellard FM, et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. ''EMBO Rep.'' '''2004''';5(7):728-33. Jul. 2004. doi:10.1038/sj.embor.7400171</ref>. Prisotnost interferona α2a v jajčnem beljaku so preverjali v jajcih kokoši G<sub>1</sub> in G<sub>2</sub> z western blotom, ter določili koncentracijo s komercialno dostopnim kitom za ELISO. Biološko aktivnost so preverili s celicami, ki so imele odzivni element občutljiv na inteferon, kateri je povzročil prepis luciferaze. Izolacija produkta je bila sestavljena iz pH redukcije in centrifugiranja ter Hi Trap BLUE kolone. Po izolaciji so dobili 15 mg citokina na 100 mL jajčnega beljaka, kar je 60 % manj kot so določili z ELISO, zagotovili pa so ≥95 % čistost (kromatografija z obrnjeno fazo, SEC-MALS). Protivirusna aktivnost je bila preverjena proti H1N1 virusu gripe A v A549 celicah. Interferon α2a iz beljaka je bil bolj učinkovit kot komercialno dostopen (iz ''E. Coli'')<ref name="prvi"/>.
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega fuzijskega prašičjega rastnega faktorja s Fc</h3>
CSF1 (»''colony stimulating factor''«) ima ključne vloge pri diferenciaciji, proliferaciji in funkciji makrofagov, uporablja se tudi v regenerativni medicini. Prisoten je pri večini sesalskih vrst, fuzija s Fc proteinom pa poveča razpolovni čas ter njegovo učinkovitost ''in vivo''. Zapis za fuzijski protein pCSF1-Fc je bil kloniran v pLenti6 lentivirusni vektor izpeljan iz virusa HIV. Pred njim je bil promotor EREOVA2, za njim pa optimiziran posttranskripcijski regulatorni element oPRE iz svizca (»''woodchuck''«). Postopek priprave transgenskih kokoši je bil enak kot pri prej opisani pripravi interferona. Funkcionalnost proteina so preverili s Ba/F3 celicami, ki so imele izražen receptor za CSF1. Za njihovo preživetje je bila nujna prisotnost CSF1. Tudi tukaj so z enakimi metodami kot pri interferonu uspeli zagotoviti ≥97 % čistost proteina. Pokazali so tudi, da se iz jajčnega beljaka da izolirati protein tudi, če je zamrznjen do -80 °C za obdobje 1 meseca. Njegovo biološko aktivnost so pokazali na miših, tretiranih z izoliranim pCSF1-Fc. Analizirali so jetra, vranico in kri. V primerjavi s kontrolo so se povišale F4/80<sup>+</sup> CD11b<sup>+</sup> v krvi in F4/80<sup>+</sup> makrofagi v jetrih, kar pomeni, da izolirani protein res deluje <ref name="prvi"/>.
<h2>Zaključek</h2>
V tej študiji so pokazali, da so lentivirusni vektorji učinkovita metoda priprave transgenskih kokoši s stabilnim prenosom genske spremembe na potomce, izražanje pa je omejeno le na jajcevod oz. jajčni beljak.. Težavo jim je predstavljala prenizka stopnja izražanja za komercialno uporabo metode ter tudi izolacija iz beljaka, ki sestoji iz veliko različnih beljakovin (izgube). Cena kokošjih bioreaktorjev bi lahko dosegla dvakrat nižjo ceno kot z običajnimi sesalskimi celicami, v največji meri zaradi nižjih stroškov vzdrževanja poslopja za kokoši ter odsotnosti potrebe po »dobri proizvodni praksi« dokler ne razbijemo jajca. Vsekakor pa je potrebne še veliko optimizacije ter testiranja aplikacije na ta način pripravljenih terapevtikov na ljudeh, kjer ovir zagotovo ne bo manjkalo.
<h2>Viri in literatura</h2>
<references/>

Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov

2019-03-19T18:46:30Z

Blazlebar:

Biološka zdravila so na svetovnem trgu farmacije ena izmed najbolj rastočih smeri, vendar jih ovira visoka cena proizvodnje v primerjavi z običajnimi kemijskimi zdravili. To bi lahko rešili z izboljšavo transgenskih tehnik za proizvajanje takšnih zdravil. Kokošji bioreaktorji so redko uporabljeni, predvsem zaradi težke priprave transgenskih živali v preteklosti. Z novejšimi metodami izražamo terapevtski protein v jajčnem beljaku, kar močno zniža ceno proizvodnje <ref name="prvi">Herron LR, Pridans C, Turnbull ML, et al. A chicken bioreactor for efficient production of functional cytokines. ''BMC Biotechnol.'' '''2018''';18(1):82. Dec. 2018. doi:10.1186/s12896-018-0495-1</ref>.
<h2>Priprava bioloških zdravil</h2>
Razvoj postopka za pripravo rekombinantnega človeškega inzulina je usmeril farmacevtsko industrijo v razvoj več bioloških zdravil oz. proteinov. To so lahko protitelesa, encimi, citokini, rastni faktorji… Ta zdravila se v največjem obsegu pripravlja v bakterijah, kvasovkah, redkeje sesalskih celicah. Vsak sistem se definira s kompleksnostjo procesa, količino produkta, ustreznostjo PTM in najpomembneje, s ceno. V namen znižanja slednje, se razvijajo novi genetsko spremenjeni sistemi, ki temeljijo na živini. Pripravili so transgenske ovce, koze ter krave na takšen način, da se je terapevtski protein izločal v mleku. Kljub izjemni inovativnosti te metode, so prisotne tudi pomanjkljivosti – majhno število potomcev, dolga obdobja brejosti, zahteva po velikih življenjskih površinah in količinah hrane, težka izolacija terapevtika iz mleka (visoka vsebnost maščob) ter njegova reabsorpcija (negativne posledice za žival)<ref name="prvi"/>.

Kokošji bioreaktor bi terapevtik izločal v jajčni beljak. Ta vsebuje približno 3,5 g beljakovin v 60 g jajcu, vsaka kokoš pa znese letno preko 300 jajc. Cena gojenja je nizka, namnožitev transgenskih kokoši pa sorazmerno enostavna in hitra. Tudi glikozilacijski vzorec je podoben človeku, kar pomeni nizko imunogenost ter visoko biološko aktivnost terapevtika. Transgenske kokoši so v tej študiji pripravili s pomočjo lentivirusnega vektorja, izražanje pa omejili na jajcevod (torej le v jajčni beljak) s pomočjo zaporedij iz gena za ovalbumin. Fuzija s Fc proteinom je povečala razpolovni čas ter zvišala biološko aktivnost, prav tako omogoča izolacijo preko afinitetne kromatografije <ref name="prvi"/>.
<h2>Metode in rezultati</h2>
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega interferona α2a</h3>
Interferon α2a je citokin, ki se uporablja pri zdravljenju hepatitisa in nekaterih oblik raka. 500 bp dolg zapis je bil vstavljen v lentivirusni vektor, osnovan na EIAV (virus infektivne anemije konjev), ki se ni bil sposoben podvajati. 900 bp dolgo zaporedje ovalbuminskega promotorskega zaporedja med odzivnim elementom za estrogen in od steroidov odvisnim regulatornim elementom (EREOVA2) je povečalo izražanje in ga tudi omejilo na jajcevod (v jajčni beljak) <ref name="prvi"/>. Pripravljen vektor so injicirali v embrije izleženih jajc, da so pripravili G<sub>0</sub> transgenske kokoši. G<sub>0</sub> petelin, izležen iz teh jajc, je moral prestati PCR analizo za preverjanje vstavljanja gena – DNA je bila pridobljena iz semenske tekočine. Nato so ga križali z ''wild type'' kokošmi. G<sub>1</sub> potomcem so izolirali DNA iz krvi ter jo analizirali z restrikcijo in prenosom po Southernu <ref name="drugi"> Lillico SG, Sherman A, McGrew MJ, et al. Oviduct-specific expression of two therapeutic proteins in transgenic hens. ''Proc Natl Acad Sci U S A.'' '''2007''';104(6):1771-6. Feb. 2007. doi:10.1073/pnas.0610401104 </ref><ref name="tretji"> McGrew MJ, Sherman A, Ellard FM, et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. ''EMBO Rep.'' '''2004''';5(7):728-33. Jul. 2004. doi:10.1038/sj.embor.7400171</ref>. Prisotnost interferona α2a v jajčnem beljaku so preverjali v jajcih kokoši G<sub>1</sub> in G<sub>2</sub> z western blotom, ter določili koncentracijo s komercialno dostopnim kitom za ELISO. Biološko aktivnost so preverili s celicami, ki so imele odzivni element občutljiv na inteferon, kateri je povzročil prepis luciferaze. Čiščenje produkta je bilo sestavljeno iz pH redukcije in centrifugiranja ter Hi Trap BLUE kolone. Po čiščenju so dobili 15 mg citokina na 100 mL jajčnega beljaka, kar je 60 % manj kot so določili z ELISO, zagotovili pa so ≥95 % čistost (kromatografija z obrnjeno fazo, SEC-MALS). Protivirusna aktivnost je bila preverjena proti H1N1 virusu gripe A v A549 celicah. Interferon α2a iz beljaka je bil bolj učinkovit kot komercialno dostopen (iz ''E. Coli'')<ref name="prvi"/>.
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega fuzijskega prašičjega rastnega faktorja s Fc</h3>
CSF1 (»''colony stimulating factor''«) ima ključne vloge pri diferenciaciji, proliferaciji in funkciji makrofagov, uporablja se tudi v regenerativni medicini. Prisoten je pri večini sesalskih vrst, fuzija s Fc proteinom pa poveča razpolovni čas ter njegovo učinkovitost ''in vivo''. Zapis za fuzijski protein pCSF1-Fc je bil kloniran v pLenti6 lentivirusni vektor izpeljan iz virusa HIV. Pred njim je bil promotor EREOVA2, za njim pa optimiziran posttranskripcijski regulatorni element oPRE iz svizca (»''woodchuck''«). Postopek priprave transgenskih kokoši je bil enak kot pri prej opisani pripravi interferona. Funkcionalnost proteina so preverili s Ba/F3 celicami, ki so imele izražen receptor za CSF1. Za njihovo preživetje je bila nujna prisotnost CSF1. Tudi tukaj so z enakimi metodami kot pri interferonu uspeli zagotoviti ≥97 % čistost proteina. Pokazali so tudi, da se iz jajčnega beljaka da izolirati protein tudi, če je zamrznjen do -80 °C za obdobje 1 meseca. Njegovo biološko aktivnost so pokazali na miših, tretiranih z izoliranim pCSF1-Fc. Analizirali so jetra, vranico in kri. V primerjavi s kontrolo so se povišale F4/80<sup>+</sup> CD11b<sup>+</sup> v krvi in F4/80<sup>+</sup> makrofagi v jetrih, kar pomeni, da izolirani protein res deluje <ref name="prvi"/>.
<h2>Zaključek</h2>
V tej študiji so pokazali, da so lentivirusni vektorji učinkovita metoda priprave transgenskih kokoši s stabilnim prenosom genske spremembe na potomce, izražanje pa je omejeno le na jajcevod oz. jajčni beljak.. Težavo jim je predstavljala prenizka stopnja izražanja za komercialno uporabo metode ter tudi izolacija iz beljaka, ki sestoji iz veliko različnih beljakovin (izgube). Cena kokošjih bioreaktorjev bi lahko dosegla dvakrat nižjo ceno kot z običajnimi sesalskimi celicami, v največji meri zaradi nižjih stroškov vzdrževanja poslopja za kokoši ter odsotnosti potrebe po »dobri proizvodni praksi« dokler ne razbijemo jajca. Vsekakor pa je potrebne še veliko optimizacije ter testiranja aplikacije na ta način pripravljenih terapevtikov na ljudeh, kjer ovir zagotovo ne bo manjkalo.
<h2>Viri in literatura</h2>
<references/>

Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov

2019-03-19T18:39:28Z

Blazlebar:

Biološka zdravila so na svetovnem trgu farmacije ena izmed najbolj rastočih smeri, vendar jih ovira visoka cena proizvodnje v primerjavi z običajnimi kemijskimi zdravili. To bi lahko rešili z izboljšavo transgenskih tehnik za proizvajanje takšnih zdravil. Kokošji bioreaktorji so redko uporabljeni, predvsem zaradi težke priprave transgenskih živali v preteklosti. Z novejšimi metodami izražamo terapevtski protein v jajčnem beljaku, kar močno zniža ceno proizvodnje <ref name="prvi">Herron LR, Pridans C, Turnbull ML, et al. A chicken bioreactor for efficient production of functional cytokines. ''BMC Biotechnol.'' '''2018''';18(1):82. Dec. 2018. doi:10.1186/s12896-018-0495-1</ref>.
<h2>Priprava bioloških zdravil</h2>
Razvoj postopka za pripravo rekombinantnega človeškega inzulina je usmeril farmacevtsko industrijo v razvoj več bioloških zdravil oz. proteinov. To so lahko protitelesa, encimi, citokini, rastni faktorji… Ta zdravila se v največjem obsegu pripravlja v bakterijah, kvasovkah, redkeje sesalskih celicah. Vsak sistem se definira s kompleksnostjo procesa, količino produkta, ustreznostjo PTM in najpomembneje, s ceno. V namen znižanja slednje, se razvijajo novi genetsko spremenjeni sistemi, ki temeljijo na živini. Pripravili so transgenske ovce, koze ter krave na takšen način, da se je terapevtski protein izločal v mleku. Kljub izjemni inovativnosti te metode, so prisotne tudi pomanjkljivosti – majhno število potomcev, dolga obdobja brejosti, zahteva po velikih življenjskih površinah in količinah hrane, težka izolacija terapevtika iz mleka (visoka vsebnost maščob) ter njegova reabsorpcija (negativne posledice za žival)<ref name="prvi"/>.

Kokošji bioreaktor bi terapevtik izločal v jajčni beljak. Ta vsebuje približno 3,5 g beljakovin v 60 g jajcu, vsaka kokoš pa znese letno preko 300 jajc. Cena gojenja je nizka, namnožitev transgenskih kokoši pa sorazmerno enostavna in hitra. Tudi glikozilacijski vzorec je podoben človeku, kar pomeni nizko imunogenost ter visoko biološko aktivnost terapevtika. Transgenske kokoši so v tej študiji pripravili s pomočjo lentivirusnega vektorja, izražanje pa omejili na jajcevod (torej le v jajčni beljak) s pomočjo zaporedij iz gena za ovalbumin. Fuzija s Fc proteinom je povečala razpolovni čas ter zvišala biološko aktivnost, prav tako omogoča izolacijo preko afinitetne kromatografije <ref name="prvi"/>.
<h2>Metode in rezultati</h2>
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega interferona α2a</h3>
Interferon α2a je citokin, ki se uporablja pri zdravljenju hepatitisa in nekaterih oblik raka. 500 bp dolg zapis je bil vstavljen v lentivirusni vektor, osnovan na EIAV (virus infektivne anemije konjev), ki se ni bil sposoben podvajati. 900 bp dolgo zaporedje ovalbuminskega promotorskega zaporedja med odzivnim elementom za estrogen in od steroidov odvisnim regulatornim elementom (EREOVA2) je povečalo izražanje in ga tudi omejilo na jajcevod (v jajčni beljak) <ref name="prvi"/>. Pripravljen vektor so injicirali v embrije izleženih jajc, da so pripravili G<sub>0</sub> transgenske kokoši. G<sub>0</sub> petelin, izležen iz teh jajc, je moral prestati PCR analizo za preverjanje vstavljanja gena – DNA je bila pridobljena iz semenske tekočine. Nato so ga križali z ''wild type'' kokošmi. G<sub>1</sub> potomcem so izolirali DNA iz krvi ter jo analizirali z restrikcijo in prenosom po Southernu <ref name="drugi"> Lillico SG, Sherman A, McGrew MJ, et al. Oviduct-specific expression of two therapeutic proteins in transgenic hens. ''Proc Natl Acad Sci U S A.'' '''2007''';104(6):1771-6. Feb. 2007. doi:10.1073/pnas.0610401104 </ref><ref name="tretji"> McGrew MJ, Sherman A, Ellard FM, et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. ''EMBO Rep.'' '''2004''';5(7):728-33. Jul. 2004. doi:10.1038/sj.embor.7400171</ref>. Prisotnost interferona α2a v jajčnem beljaku so preverjali v jajcih kokoši G<sub>1</sub> in G<sub>2</sub> z western blotom, ter določili koncentracijo s komercialno dostopnim kitom za ELISO. Biološko aktivnost so preverili s celicami, ki so imele odzivni element občutljiv na inteferon, kateri je povzročil prepis luciferaze. Čiščenje produkta je bilo sestavljeno iz pH redukcije in centrifugiranja ter Hi Trap BLUE kolone. Po čiščenju so dobili 15 mg citokina na 100 mL jajčnega beljaka, kar je 60 % manj kot so določili z ELISO, zagotovili pa so ≥95 % čistost (kromatografija z obrnjeno fazo, SEC-MALS). Protivirusna aktivnost je bila preverjena proti H1N1 virusu gripe A v A549 celicah. Interferon α2a iz beljaka je bil bolj učinkovit kot komercialno dostopen (iz ''E. Coli'')<ref name="prvi"/>.
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega fuzijskega prašičjega rastnega faktorja s Fc</h3>
CSF1 (»''colony stimulating factor''«) ima ključne vloge pri diferenciaciji, proliferaciji in funkciji makrofagov, uporablja se tudi v regenerativni medicini. Prisoten je pri večini sesalskih vrst, fuzija s Fc proteinom pa poveča razpolovni čas ter njegovo učinkovitost in vivo. Zapis za fuzijski protein pCSF1-Fc je bil kloniran v pLenti6 lentivirusni vektor izpeljan iz virusa HIV. Pred njim je bil promotor EREOVA2, za njim pa optimiziran posttranskripcijski regulatorni element oPRE iz svizca (»''woodchuck''«). Postopek priprave transgenskih kokoši je bil enak kot pri prej opisani pripravi interferona. Funkcionalnost proteina so preverili s Ba/F3 celicami, ki so imele izražen receptor za CSF1. Za njihovo preživetje je bila nujna prisotnost CSF1. Tudi tukaj so z enakimi metodami kot pri interferonu uspeli zagotoviti ≥97 % čistost proteina. Pokazali so tudi, da se iz jajčnega beljaka da izolirati protein tudi, če je zamrznjen do -80 °C za obdobje 1 meseca. Njegovo biološko aktivnost so pokazali na miših, tretiranih z izoliranim pCSF1-Fc. Analizirali so jetra, vranico in kri. V primerjavi s kontrolo so se povišale F4/80<sup>+</sup> CD11b<sup>+</sup> v krvi in F4/80<sup>+</sup> makrofagi v jetrih, kar pomeni, da izolirani protein res deluje <ref name="prvi"/>.
<h2>Zaključek</h2>
V tej študiji so pokazali, da so lentivirusni vektorji učinkovita metoda priprave transgenskih kokoši s stabilnim prenosom genske spremembe na potomce, izražanje pa je omejeno le na jajcevod oz. jajčni beljak.. Težavo jim je predstavljala prenizka stopnja izražanja za komercialno uporabo metode ter tudi izolacija iz beljaka, ki sestoji iz veliko različnih beljakovin (izgube). Cena kokošjih bioreaktorjev bi lahko dosegla dvakrat nižjo ceno kot z običajnimi sesalskimi celicami, v največji meri zaradi nižjih stroškov vzdrževanja poslopja za kokoši ter odsotnosti potrebe po »dobri proizvodni praksi« dokler ne razbijemo jajca. Vsekakor pa je potrebne še veliko optimizacije ter testiranja aplikacije na ta način pripravljenih terapevtikov na ljudeh, kjer ovir zagotovo ne bo manjkalo.
<h2>Viri in literatura</h2>
<references/>

Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov

2019-03-19T18:39:02Z

Blazlebar:

Biološka zdravila so na svetovnem trgu farmacije ena izmed najbolj rastočih smeri, vendar jih ovira visoka cena proizvodnje v primerjavi z običajnimi kemijskimi zdravili. To bi lahko rešili z izboljšavo transgenskih tehnik za proizvajanje takšnih zdravil. Kokošji bioreaktorji so redko uporabljeni, predvsem zaradi težke priprave transgenskih živali v preteklosti. Z novejšimi metodami izražamo terapevtski protein v jajčnem beljaku, kar močno zniža ceno proizvodnje <ref name="prvi">Herron LR, Pridans C, Turnbull ML, et al. A chicken bioreactor for efficient production of functional cytokines. ''BMC Biotechnol.'' '''2018''';18(1):82. Dec. 2018. doi:10.1186/s12896-018-0495-1</ref>.
<h2>Priprava bioloških zdravil</h2>
Razvoj postopka za pripravo rekombinantnega človeškega inzulina je usmeril farmacevtsko industrijo v razvoj več bioloških zdravil oz. proteinov. To so lahko protitelesa, encimi, citokini, rastni faktorji… Ta zdravila se v največjem obsegu pripravlja v bakterijah, kvasovkah, redkeje sesalskih celicah. Vsak sistem se definira s kompleksnostjo procesa, količino produkta, ustreznostjo PTM in najpomembneje, s ceno. V namen znižanja slednje, se razvijajo novi genetsko spremenjeni sistemi, ki temeljijo na živini. Pripravili so transgenske ovce, koze ter krave na takšen način, da se je terapevtski protein izločal v mleku. Kljub izjemni inovativnosti te metode, so prisotne tudi pomanjkljivosti – majhno število potomcev, dolga obdobja brejosti, zahteva po velikih življenjskih površinah in količinah hrane, težka izolacija terapevtika iz mleka (visoka vsebnost maščob) ter njegova reabsorpcija (negativne posledice za žival)<ref name="prvi"/>.

Kokošji bioreaktor bi terapevtik izločal v jajčni beljak. Ta vsebuje približno 3,5 g beljakovin v 60 g jajcu, vsaka kokoš pa znese letno preko 300 jajc. Cena gojenja je nizka, namnožitev transgenskih kokoši pa sorazmerno enostavna in hitra. Tudi glikozilacijski vzorec je podoben človeku, kar pomeni nizko imunogenost ter visoko biološko aktivnost terapevtika. Transgenske kokoši so v tej študiji pripravili s pomočjo lentivirusnega vektorja, izražanje pa omejili na jajcevod (torej le v jajčni beljak) s pomočjo zaporedij iz gena za ovalbumin. Fuzija s Fc proteinom je povečala razpolovni čas ter zvišala biološko aktivnost, prav tako omogoča izolacijo preko afinitetne kromatografije <ref name="prvi"/>.
<h2>Metode in rezultati</h2>
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega interferona α2a</h3>
Interferon α2a je citokin, ki se uporablja pri zdravljenju hepatitisa in nekaterih oblik raka. 500 bp dolg zapis je bil vstavljen v lentivirusni vektor, osnovan na EIAV (virus infektivne anemije konjev), ki se ni bil sposoben podvajati. 900 bp dolgo zaporedje ovalbuminskega promotorskega zaporedja med odzivnim elementom za estrogen in od steroidov odvisnim regulatornim elementom (EREOVA2) je povečalo izražanje in ga tudi omejilo na jajcevod (v jajčni beljak) <ref name="prvi"/>. Pripravljen vektor so injicirali v embrije izleženih jajc, da so pripravili G<sub>0</sub> transgenske kokoši. G<sub>0</sub> petelin, izležen iz teh jajc, je moral prestati PCR analizo za preverjanje vstavljanja gena – DNA je bila pridobljena iz semenske tekočine. Nato so ga križali z wild type kokošmi. G<sub>1</sub> potomcem so izolirali DNA iz krvi ter jo analizirali z restrikcijo in prenosom po Southernu <ref name="drugi"> Lillico SG, Sherman A, McGrew MJ, et al. Oviduct-specific expression of two therapeutic proteins in transgenic hens. ''Proc Natl Acad Sci U S A.'' '''2007''';104(6):1771-6. Feb. 2007. doi:10.1073/pnas.0610401104 </ref><ref name="tretji"> McGrew MJ, Sherman A, Ellard FM, et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. ''EMBO Rep.'' '''2004''';5(7):728-33. Jul. 2004. doi:10.1038/sj.embor.7400171</ref>. Prisotnost interferona α2a v jajčnem beljaku so preverjali v jajcih kokoši G<sub>1</sub> in G<sub>2</sub> z western blotom, ter določili koncentracijo s komercialno dostopnim kitom za ELISO. Biološko aktivnost so preverili s celicami, ki so imele odzivni element občutljiv na inteferon, kateri je povzročil prepis luciferaze. Čiščenje produkta je bilo sestavljeno iz pH redukcije in centrifugiranja ter Hi Trap BLUE kolone. Po čiščenju so dobili 15 mg citokina na 100 mL jajčnega beljaka, kar je 60 % manj kot so določili z ELISO, zagotovili pa so ≥95 % čistost (kromatografija z obrnjeno fazo, SEC-MALS). Protivirusna aktivnost je bila preverjena proti H1N1 virusu gripe A v A549 celicah. Interferon α2a iz beljaka je bil bolj učinkovit kot komercialno dostopen (iz ''E. Coli'')<ref name="prvi"/>.
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega fuzijskega prašičjega rastnega faktorja s Fc</h3>
CSF1 (»''colony stimulating factor''«) ima ključne vloge pri diferenciaciji, proliferaciji in funkciji makrofagov, uporablja se tudi v regenerativni medicini. Prisoten je pri večini sesalskih vrst, fuzija s Fc proteinom pa poveča razpolovni čas ter njegovo učinkovitost in vivo. Zapis za fuzijski protein pCSF1-Fc je bil kloniran v pLenti6 lentivirusni vektor izpeljan iz virusa HIV. Pred njim je bil promotor EREOVA2, za njim pa optimiziran posttranskripcijski regulatorni element oPRE iz svizca (»''woodchuck''«). Postopek priprave transgenskih kokoši je bil enak kot pri prej opisani pripravi interferona. Funkcionalnost proteina so preverili s Ba/F3 celicami, ki so imele izražen receptor za CSF1. Za njihovo preživetje je bila nujna prisotnost CSF1. Tudi tukaj so z enakimi metodami kot pri interferonu uspeli zagotoviti ≥97 % čistost proteina. Pokazali so tudi, da se iz jajčnega beljaka da izolirati protein tudi, če je zamrznjen do -80 °C za obdobje 1 meseca. Njegovo biološko aktivnost so pokazali na miših, tretiranih z izoliranim pCSF1-Fc. Analizirali so jetra, vranico in kri. V primerjavi s kontrolo so se povišale F4/80<sup>+</sup> CD11b<sup>+</sup> v krvi in F4/80<sup>+</sup> makrofagi v jetrih, kar pomeni, da izolirani protein res deluje <ref name="prvi"/>.
<h2>Zaključek</h2>
V tej študiji so pokazali, da so lentivirusni vektorji učinkovita metoda priprave transgenskih kokoši s stabilnim prenosom genske spremembe na potomce, izražanje pa je omejeno le na jajcevod oz. jajčni beljak.. Težavo jim je predstavljala prenizka stopnja izražanja za komercialno uporabo metode ter tudi izolacija iz beljaka, ki sestoji iz veliko različnih beljakovin (izgube). Cena kokošjih bioreaktorjev bi lahko dosegla dvakrat nižjo ceno kot z običajnimi sesalskimi celicami, v največji meri zaradi nižjih stroškov vzdrževanja poslopja za kokoši ter odsotnosti potrebe po »dobri proizvodni praksi« dokler ne razbijemo jajca. Vsekakor pa je potrebne še veliko optimizacije ter testiranja aplikacije na ta način pripravljenih terapevtikov na ljudeh, kjer ovir zagotovo ne bo manjkalo.
<h2>Viri in literatura</h2>
<references/>

Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov

2019-03-19T18:38:46Z

Blazlebar:

Biološka zdravila so na svetovnem trgu farmacije ena izmed najbolj rastočih smeri, vendar jih ovira visoka cena proizvodnje v primerjavi z običajnimi kemijskimi zdravili. To bi lahko rešili z izboljšavo transgenskih tehnik za proizvajanje takšnih zdravil. Kokošji bioreaktorji so redko uporabljeni, predvsem zaradi težke priprave transgenskih živali v preteklosti. Z novejšimi metodami izražamo terapevtski protein v jajčnem beljaku, kar močno zniža ceno proizvodnje <ref name="prvi">Herron LR, Pridans C, Turnbull ML, et al. A chicken bioreactor for efficient production of functional cytokines. ''BMC Biotechnol.'' '''2018''';18(1):82. Dec. 2018. doi:10.1186/s12896-018-0495-1</ref>.
<h2>Priprava bioloških zdravil</h2>
Razvoj postopka za pripravo rekombinantnega človeškega inzulina je usmeril farmacevtsko industrijo v razvoj več bioloških zdravil oz. proteinov. To so lahko protitelesa, encimi, citokini, rastni faktorji… Ta zdravila se v največjem obsegu pripravlja v bakterijah, kvasovkah, redkeje sesalskih celicah. Vsak sistem se definira s kompleksnostjo procesa, količino produkta, ustreznostjo PTM in najpomembneje, s ceno. V namen znižanja slednje, se razvijajo novi genetsko spremenjeni sistemi, ki temeljijo na živini. Pripravili so transgenske ovce, koze ter krave na takšen način, da se je terapevtski protein izločal v mleku. Kljub izjemni inovativnosti te metode, so prisotne tudi pomanjkljivosti – majhno število potomcev, dolga obdobja brejosti, zahteva po velikih življenjskih površinah in količinah hrane, težka izolacija terapevtika iz mleka (visoka vsebnost maščob) ter njegova reabsorpcija (negativne posledice za žival)<ref name="prvi"/>.

Kokošji bioreaktor bi terapevtik izločal v jajčni beljak. Ta vsebuje približno 3,5 g beljakovin v 60 g jajcu, vsaka kokoš pa znese letno preko 300 jajc. Cena gojenja je nizka, namnožitev transgenskih kokoši pa sorazmerno enostavna in hitra. Tudi glikozilacijski vzorec je podoben človeku, kar pomeni nizko imunogenost ter visoko biološko aktivnost terapevtika. Transgenske kokoši so v tej študiji pripravili s pomočjo lentivirusnega vektorja, izražanje pa omejili na jajcevod (torej le v jajčni beljak) s pomočjo zaporedij iz gena za ovalbumin. Fuzija s Fc proteinom je povečala razpolovni čas ter zvišala biološko aktivnost, prav tako omogoča izolacijo preko afinitetne kromatografije <ref name="prvi"/>.
<h2>Metode in rezultati</h2>
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega interferona α2a</h3>
Interferon α2a je citokin, ki se uporablja pri zdravljenju hepatitisa in nekaterih oblik raka. 500 bp dolg zapis je bil vstavljen v lentivirusni vektor, osnovan na EIAV (virus infektivne anemije konjev), ki se ni bil sposoben podvajati. 900 bp dolgo zaporedje ovalbuminskega promotorskega zaporedja med odzivnim elementom za estrogen in od steroidov odvisnim regulatornim elementom (EREOVA2) je povečalo izražanje in ga tudi omejilo na jajcevod (v jajčni beljak) <ref name="prvi"/>. Pripravljen vektor so injicirali v embrije izleženih jajc, da so pripravili G<sub>0</sub> transgenske kokoši. G<sub>0</sub> petelin, izležen iz teh jajc je moral prestati PCR analizo za preverjanje vstavljanja gena – DNA je bila pridobljena iz semenske tekočine. Nato so ga križali z wild type kokošmi. G<sub>1</sub> potomcem so izolirali DNA iz krvi ter jo analizirali z restrikcijo in prenosom po Southernu <ref name="drugi"> Lillico SG, Sherman A, McGrew MJ, et al. Oviduct-specific expression of two therapeutic proteins in transgenic hens. ''Proc Natl Acad Sci U S A.'' '''2007''';104(6):1771-6. Feb. 2007. doi:10.1073/pnas.0610401104 </ref><ref name="tretji"> McGrew MJ, Sherman A, Ellard FM, et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. ''EMBO Rep.'' '''2004''';5(7):728-33. Jul. 2004. doi:10.1038/sj.embor.7400171</ref>. Prisotnost interferona α2a v jajčnem beljaku so preverjali v jajcih kokoši G<sub>1</sub> in G<sub>2</sub> z western blotom, ter določili koncentracijo s komercialno dostopnim kitom za ELISO. Biološko aktivnost so preverili s celicami, ki so imele odzivni element občutljiv na inteferon, kateri je povzročil prepis luciferaze. Čiščenje produkta je bilo sestavljeno iz pH redukcije in centrifugiranja ter Hi Trap BLUE kolone. Po čiščenju so dobili 15 mg citokina na 100 mL jajčnega beljaka, kar je 60 % manj kot so določili z ELISO, zagotovili pa so ≥95 % čistost (kromatografija z obrnjeno fazo, SEC-MALS). Protivirusna aktivnost je bila preverjena proti H1N1 virusu gripe A v A549 celicah. Interferon α2a iz beljaka je bil bolj učinkovit kot komercialno dostopen (iz ''E. Coli'')<ref name="prvi"/>.
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega fuzijskega prašičjega rastnega faktorja s Fc</h3>
CSF1 (»''colony stimulating factor''«) ima ključne vloge pri diferenciaciji, proliferaciji in funkciji makrofagov, uporablja se tudi v regenerativni medicini. Prisoten je pri večini sesalskih vrst, fuzija s Fc proteinom pa poveča razpolovni čas ter njegovo učinkovitost in vivo. Zapis za fuzijski protein pCSF1-Fc je bil kloniran v pLenti6 lentivirusni vektor izpeljan iz virusa HIV. Pred njim je bil promotor EREOVA2, za njim pa optimiziran posttranskripcijski regulatorni element oPRE iz svizca (»''woodchuck''«). Postopek priprave transgenskih kokoši je bil enak kot pri prej opisani pripravi interferona. Funkcionalnost proteina so preverili s Ba/F3 celicami, ki so imele izražen receptor za CSF1. Za njihovo preživetje je bila nujna prisotnost CSF1. Tudi tukaj so z enakimi metodami kot pri interferonu uspeli zagotoviti ≥97 % čistost proteina. Pokazali so tudi, da se iz jajčnega beljaka da izolirati protein tudi, če je zamrznjen do -80 °C za obdobje 1 meseca. Njegovo biološko aktivnost so pokazali na miših, tretiranih z izoliranim pCSF1-Fc. Analizirali so jetra, vranico in kri. V primerjavi s kontrolo so se povišale F4/80<sup>+</sup> CD11b<sup>+</sup> v krvi in F4/80<sup>+</sup> makrofagi v jetrih, kar pomeni, da izolirani protein res deluje <ref name="prvi"/>.
<h2>Zaključek</h2>
V tej študiji so pokazali, da so lentivirusni vektorji učinkovita metoda priprave transgenskih kokoši s stabilnim prenosom genske spremembe na potomce, izražanje pa je omejeno le na jajcevod oz. jajčni beljak.. Težavo jim je predstavljala prenizka stopnja izražanja za komercialno uporabo metode ter tudi izolacija iz beljaka, ki sestoji iz veliko različnih beljakovin (izgube). Cena kokošjih bioreaktorjev bi lahko dosegla dvakrat nižjo ceno kot z običajnimi sesalskimi celicami, v največji meri zaradi nižjih stroškov vzdrževanja poslopja za kokoši ter odsotnosti potrebe po »dobri proizvodni praksi« dokler ne razbijemo jajca. Vsekakor pa je potrebne še veliko optimizacije ter testiranja aplikacije na ta način pripravljenih terapevtikov na ljudeh, kjer ovir zagotovo ne bo manjkalo.
<h2>Viri in literatura</h2>
<references/>

Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov

2019-03-19T18:37:58Z

Blazlebar:

Biološka zdravila so na svetovnem trgu farmacije ena izmed najbolj rastočih smeri, vendar jih ovira visoka cena proizvodnje v primerjavi z običajnimi kemijskimi zdravili. To bi lahko rešili z izboljšavo transgenskih tehnik za proizvajanje takšnih zdravil. Kokošji bioreaktorji so redko uporabljeni, predvsem zaradi težke priprave transgenskih živali v preteklosti. Z novejšimi metodami izražamo terapevtski protein v jajčnem beljaku, kar močno zniža ceno proizvodnje <ref name="prvi">Herron LR, Pridans C, Turnbull ML, et al. A chicken bioreactor for efficient production of functional cytokines. ''BMC Biotechnol.'' '''2018''';18(1):82. Dec. 2018. doi:10.1186/s12896-018-0495-1</ref>.
<h2>Priprava bioloških zdravil</h2>
Razvoj postopka za pripravo rekombinantnega človeškega inzulina je usmeril farmacevtsko industrijo v razvoj več bioloških zdravil oz. proteinov. To so lahko protitelesa, encimi, citokini, rastni faktorji… Ta zdravila se v največjem obsegu pripravlja v bakterijah, kvasovkah, redkeje sesalskih celicah. Vsak sistem se definira s kompleksnostjo procesa, količino produkta, ustreznostjo PTM in najpomembneje, s ceno. V namen znižanja slednje, se razvijajo novi genetsko spremenjeni sistemi, ki temeljijo na živini. Pripravili so transgenske ovce, koze ter krave na takšen način, da se je terapevtski protein izločal v mleku. Kljub izjemni inovativnosti te metode, so prisotne tudi pomanjkljivosti – majhno število potomcev, dolga obdobja brejosti, zahteva po velikih življenjskih površinah in količinah hrane, težka izolacija terapevtika iz mleka (visoka vsebnost maščob) ter njegova reabsorpcija (negativne posledice za žival)<ref name="prvi"/>.

Kokošji bioreaktor bi terapevtik izločal v jajčni beljak. Ta vsebuje približno 3,5 g beljakovin v 60 g jajcu, vsaka kokoš pa znese letno preko 300 jajc. Cena gojenja je nizka, namnožitev transgenskih kokoši pa sorazmerno enostavna in hitra. Tudi glikozilacijski vzorec je podoben človeku, kar pomeni nizko imunogenost ter visoko biološko aktivnost terapevtika. Transgenske kokoši so v tej študiji pripravili s pomočjo lentivirusnega vektorja, izražanje pa omejili na jajcevod (torej le v jajčni beljak) s pomočjo zaporedij iz gena za ovalbumin. Fuzija s Fc proteinom je povečala razpolovni čas ter zvišala biološko aktivnost, prav tako omogoča izolacijo preko afinitetne kromatografije <ref name="prvi"/>.
<h2>Metode in rezultati</h2>
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega interferona α2a</h3>
Interferon α2a je citokin, ki se uporablja pri zdravljenju hepatitisa in nekaterih oblik raka. 500 bp dolg zapis je bil vstavljen v lentivirusni vektor, osnovan na EIAV (virus infektivne anemije konjev), ki se ni bil sposoben podvajati. 900 bp dolgo zaporedje ovalbuminskega promotorskega zaporedja med odzivnim elementom za estrogen in od steroidov odvisnim regulatornim elementom (EREOVA2) je povečalo izražanje in ga tudi omejilo na jajcevod (v jajčni beljak) <ref name="prvi"/>. Pripravljen vektor so injicirali v embrije iz izleženih jajc, da so pripravili G<sub>0</sub> transgenske kokoši. G<sub>0</sub> petelin, izležen iz teh jajc je moral prestati PCR analizo za preverjanje vstavljanja gena – DNA je bila pridobljena iz semenske tekočine. Nato so ga križali z wild type kokošmi. G<sub>1</sub> potomcem so izolirali DNA iz krvi ter jo analizirali z restrikcijo in prenosom po Southernu <ref name="drugi"> Lillico SG, Sherman A, McGrew MJ, et al. Oviduct-specific expression of two therapeutic proteins in transgenic hens. ''Proc Natl Acad Sci U S A.'' '''2007''';104(6):1771-6. Feb. 2007. doi:10.1073/pnas.0610401104 </ref><ref name="tretji"> McGrew MJ, Sherman A, Ellard FM, et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. ''EMBO Rep.'' '''2004''';5(7):728-33. Jul. 2004. doi:10.1038/sj.embor.7400171</ref>. Prisotnost interferona α2a v jajčnem beljaku so preverjali v jajcih kokoši G<sub>1</sub> in G<sub>2</sub> z western blotom, ter določili koncentracijo s komercialno dostopnim kitom za ELISO. Biološko aktivnost so preverili s celicami, ki so imele odzivni element občutljiv na inteferon, kateri je povzročil prepis luciferaze. Čiščenje produkta je bilo sestavljeno iz pH redukcije in centrifugiranja ter Hi Trap BLUE kolone. Po čiščenju so dobili 15 mg citokina na 100 mL jajčnega beljaka, kar je 60 % manj kot so določili z ELISO, zagotovili pa so ≥95 % čistost (kromatografija z obrnjeno fazo, SEC-MALS). Protivirusna aktivnost je bila preverjena proti H1N1 virusu gripe A v A549 celicah. Interferon α2a iz beljaka je bil bolj učinkovit kot komercialno dostopen (iz ''E. Coli'')<ref name="prvi"/>.
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega fuzijskega prašičjega rastnega faktorja s Fc</h3>
CSF1 (»''colony stimulating factor''«) ima ključne vloge pri diferenciaciji, proliferaciji in funkciji makrofagov, uporablja se tudi v regenerativni medicini. Prisoten je pri večini sesalskih vrst, fuzija s Fc proteinom pa poveča razpolovni čas ter njegovo učinkovitost in vivo. Zapis za fuzijski protein pCSF1-Fc je bil kloniran v pLenti6 lentivirusni vektor izpeljan iz virusa HIV. Pred njim je bil promotor EREOVA2, za njim pa optimiziran posttranskripcijski regulatorni element oPRE iz svizca (»''woodchuck''«). Postopek priprave transgenskih kokoši je bil enak kot pri prej opisani pripravi interferona. Funkcionalnost proteina so preverili s Ba/F3 celicami, ki so imele izražen receptor za CSF1. Za njihovo preživetje je bila nujna prisotnost CSF1. Tudi tukaj so z enakimi metodami kot pri interferonu uspeli zagotoviti ≥97 % čistost proteina. Pokazali so tudi, da se iz jajčnega beljaka da izolirati protein tudi, če je zamrznjen do -80 °C za obdobje 1 meseca. Njegovo biološko aktivnost so pokazali na miših, tretiranih z izoliranim pCSF1-Fc. Analizirali so jetra, vranico in kri. V primerjavi s kontrolo so se povišale F4/80<sup>+</sup> CD11b<sup>+</sup> v krvi in F4/80<sup>+</sup> makrofagi v jetrih, kar pomeni, da izolirani protein res deluje <ref name="prvi"/>.
<h2>Zaključek</h2>
V tej študiji so pokazali, da so lentivirusni vektorji učinkovita metoda priprave transgenskih kokoši s stabilnim prenosom genske spremembe na potomce, izražanje pa je omejeno le na jajcevod oz. jajčni beljak.. Težavo jim je predstavljala prenizka stopnja izražanja za komercialno uporabo metode ter tudi izolacija iz beljaka, ki sestoji iz veliko različnih beljakovin (izgube). Cena kokošjih bioreaktorjev bi lahko dosegla dvakrat nižjo ceno kot z običajnimi sesalskimi celicami, v največji meri zaradi nižjih stroškov vzdrževanja poslopja za kokoši ter odsotnosti potrebe po »dobri proizvodni praksi« dokler ne razbijemo jajca. Vsekakor pa je potrebne še veliko optimizacije ter testiranja aplikacije na ta način pripravljenih terapevtikov na ljudeh, kjer ovir zagotovo ne bo manjkalo.
<h2>Viri in literatura</h2>
<references/>

Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov

2019-03-19T18:37:43Z

Blazlebar:

Biološka zdravila so na svetovnem trgu farmacije ena izmed najbolj rastočih smeri, vendar jih ovira visoka cena proizvodnje v primerjavi z običajnimi kemijskimi zdravili. To bi lahko rešili z izboljšavo transgenskih tehnik za proizvajanje takšnih zdravil. Kokošji bioreaktorji so redko uporabljeni, predvsem zaradi težke priprave transgenskih živali v preteklosti. Z novejšimi metodami izražamo terapevtski protein v jajčnem beljaku, kar močno zniža ceno proizvodnje <ref name="prvi">Herron LR, Pridans C, Turnbull ML, et al. A chicken bioreactor for efficient production of functional cytokines. ''BMC Biotechnol.'' '''2018''';18(1):82. Dec. 2018. doi:10.1186/s12896-018-0495-1</ref>.
<h2>Priprava bioloških zdravil</h2>
Razvoj postopka za pripravo rekombinantnega človeškega inzulina je usmeril farmacevtsko industrijo v razvoj več bioloških zdravil oz. proteinov. To so lahko protitelesa, encimi, citokini, rastni faktorji… Ta zdravila se v največjem obsegu pripravlja v bakterijah, kvasovkah, redkeje sesalskih celicah. Vsak sistem se definira s kompleksnostjo procesa, količino produkta, ustreznostjo PTM in najpomembneje, s ceno. V namen znižanja slednje, se razvijajo novi genetsko spremenjeni sistemi, ki temeljijo na živini. Pripravili so transgenske ovce, koze ter krave na takšen način, da se je terapevtski protein izločal v mleku. Kljub izjemni inovativnosti te metode, so prisotne tudi pomanjkljivosti – majhno število potomcev, dolga obdobja brejosti, zahteva po velikih življenjskih površinah in količinah hrane, težka izolacija terapevtika iz mleka (visoka vsebnost maščob) ter njegova reabsorpcija (negativne posledice za žival)<ref name="prvi"/>.

Kokošji bioreaktor bi terapevtik izločal v jajčni beljak. Ta vsebuje približno 3,5 g beljakovin v 60 g jajcu, vsaka kokoš pa znese letno preko 300 jajc. Cena gojenja je nizka, namnožitev transgenskih kokoši pa sorazmerno enostavna in hitra. Tudi glikozilacijski vzorec je podoben človeku, kar pomeni nizko imunogenost ter visoko biološko aktivnost terapevtika. Transgenske kokoši so v tej študiji s pomočjo lentivirusnega vektorja, izražanje pa omejili na jajcevod (torej le v jajčni beljak) s pomočjo zaporedij iz gena za ovalbumin. Fuzija s Fc proteinom je povečala razpolovni čas ter zvišala biološko aktivnost, prav tako omogoča izolacijo preko afinitetne kromatografije <ref name="prvi"/>.
<h2>Metode in rezultati</h2>
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega interferona α2a</h3>
Interferon α2a je citokin, ki se uporablja pri zdravljenju hepatitisa in nekaterih oblik raka. 500 bp dolg zapis je bil vstavljen v lentivirusni vektor, osnovan na EIAV (virus infektivne anemije konjev), ki se ni bil sposoben podvajati. 900 bp dolgo zaporedje ovalbuminskega promotorskega zaporedja med odzivnim elementom za estrogen in od steroidov odvisnim regulatornim elementom (EREOVA2) je povečalo izražanje in ga tudi omejilo na jajcevod (v jajčni beljak) <ref name="prvi"/>. Pripravljen vektor so injicirali v embrije iz izleženih jajc, da so pripravili G<sub>0</sub> transgenske kokoši. G<sub>0</sub> petelin, izležen iz teh jajc je moral prestati PCR analizo za preverjanje vstavljanja gena – DNA je bila pridobljena iz semenske tekočine. Nato so ga križali z wild type kokošmi. G<sub>1</sub> potomcem so izolirali DNA iz krvi ter jo analizirali z restrikcijo in prenosom po Southernu <ref name="drugi"> Lillico SG, Sherman A, McGrew MJ, et al. Oviduct-specific expression of two therapeutic proteins in transgenic hens. ''Proc Natl Acad Sci U S A.'' '''2007''';104(6):1771-6. Feb. 2007. doi:10.1073/pnas.0610401104 </ref><ref name="tretji"> McGrew MJ, Sherman A, Ellard FM, et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. ''EMBO Rep.'' '''2004''';5(7):728-33. Jul. 2004. doi:10.1038/sj.embor.7400171</ref>. Prisotnost interferona α2a v jajčnem beljaku so preverjali v jajcih kokoši G<sub>1</sub> in G<sub>2</sub> z western blotom, ter določili koncentracijo s komercialno dostopnim kitom za ELISO. Biološko aktivnost so preverili s celicami, ki so imele odzivni element občutljiv na inteferon, kateri je povzročil prepis luciferaze. Čiščenje produkta je bilo sestavljeno iz pH redukcije in centrifugiranja ter Hi Trap BLUE kolone. Po čiščenju so dobili 15 mg citokina na 100 mL jajčnega beljaka, kar je 60 % manj kot so določili z ELISO, zagotovili pa so ≥95 % čistost (kromatografija z obrnjeno fazo, SEC-MALS). Protivirusna aktivnost je bila preverjena proti H1N1 virusu gripe A v A549 celicah. Interferon α2a iz beljaka je bil bolj učinkovit kot komercialno dostopen (iz ''E. Coli'')<ref name="prvi"/>.
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega fuzijskega prašičjega rastnega faktorja s Fc</h3>
CSF1 (»''colony stimulating factor''«) ima ključne vloge pri diferenciaciji, proliferaciji in funkciji makrofagov, uporablja se tudi v regenerativni medicini. Prisoten je pri večini sesalskih vrst, fuzija s Fc proteinom pa poveča razpolovni čas ter njegovo učinkovitost in vivo. Zapis za fuzijski protein pCSF1-Fc je bil kloniran v pLenti6 lentivirusni vektor izpeljan iz virusa HIV. Pred njim je bil promotor EREOVA2, za njim pa optimiziran posttranskripcijski regulatorni element oPRE iz svizca (»''woodchuck''«). Postopek priprave transgenskih kokoši je bil enak kot pri prej opisani pripravi interferona. Funkcionalnost proteina so preverili s Ba/F3 celicami, ki so imele izražen receptor za CSF1. Za njihovo preživetje je bila nujna prisotnost CSF1. Tudi tukaj so z enakimi metodami kot pri interferonu uspeli zagotoviti ≥97 % čistost proteina. Pokazali so tudi, da se iz jajčnega beljaka da izolirati protein tudi, če je zamrznjen do -80 °C za obdobje 1 meseca. Njegovo biološko aktivnost so pokazali na miših, tretiranih z izoliranim pCSF1-Fc. Analizirali so jetra, vranico in kri. V primerjavi s kontrolo so se povišale F4/80<sup>+</sup> CD11b<sup>+</sup> v krvi in F4/80<sup>+</sup> makrofagi v jetrih, kar pomeni, da izolirani protein res deluje <ref name="prvi"/>.
<h2>Zaključek</h2>
V tej študiji so pokazali, da so lentivirusni vektorji učinkovita metoda priprave transgenskih kokoši s stabilnim prenosom genske spremembe na potomce, izražanje pa je omejeno le na jajcevod oz. jajčni beljak.. Težavo jim je predstavljala prenizka stopnja izražanja za komercialno uporabo metode ter tudi izolacija iz beljaka, ki sestoji iz veliko različnih beljakovin (izgube). Cena kokošjih bioreaktorjev bi lahko dosegla dvakrat nižjo ceno kot z običajnimi sesalskimi celicami, v največji meri zaradi nižjih stroškov vzdrževanja poslopja za kokoši ter odsotnosti potrebe po »dobri proizvodni praksi« dokler ne razbijemo jajca. Vsekakor pa je potrebne še veliko optimizacije ter testiranja aplikacije na ta način pripravljenih terapevtikov na ljudeh, kjer ovir zagotovo ne bo manjkalo.
<h2>Viri in literatura</h2>
<references/>

Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov

2019-03-19T18:37:00Z

Blazlebar:

Biološka zdravila so na svetovnem trgu farmacije ena izmed najbolj rastočih smeri, vendar jih ovira visoka cena proizvodnje v primerjavi z običajnimi kemijskimi zdravili. To bi lahko rešili z izboljšavo transgenskih tehnik za proizvajanje takšnih zdravil. Kokošji bioreaktorji so redko uporabljeni, predvsem zaradi težke priprave transgenskih živali v preteklosti. Z novejšimi metodami izražamo terapevtski protein v jajčnem beljaku, kar močno zniža ceno proizvodnje <ref name="prvi">Herron LR, Pridans C, Turnbull ML, et al. A chicken bioreactor for efficient production of functional cytokines. ''BMC Biotechnol.'' '''2018''';18(1):82. Dec. 2018. doi:10.1186/s12896-018-0495-1</ref>.
<h2>Priprava bioloških zdravil</h2>
Razvoj postopka za pripravo rekombinantnega človeškega inzulina je usmeril farmacevtsko industrijo v razvoj več bioloških zdravil oz. proteinov. To so lahko protitelesa, encimi, citokini, rastni faktorji… Ta zdravila se v največjem obsegu pripravlja v bakterijah, kvasovkah, redkeje sesalskih celicah. Vsak sistem se definira s kompleksnostjo procesa, količino produkta, ustreznostjo PTM in najpomembneje, s ceno. V namen znižanja slednje, se razvijajo novi genetsko spremenjeni sistemi, ki temeljijo na živini. Pripravili so transgenske ovce, koze ter krave na takšen način, da se je terapevtski protein izločal v mleku. Kljub izjemni inovativnosti te metode, so prisotne tudi pomanjkljivosti – majhno število potomcev, dolga obdobja brejosti, zahteva po velikih življenjskih površinah in količinah hrane, težka izolacija terapevtika iz mleka (visoka vsebnost maščob) ter njegova reabsorpcija (negativne posledice za žival)<ref name="prvi"/>.

Kokošji bioreaktor bi terapevtik izločal v jajčni beljak. Ta vsebuje približno 3,5 g beljakovin v 60 g jajcu, vsaka kokoš pa znese letno preko 300 jajc. Cena gojenja je nizka, namnožitev transgenskih kokoši pa sorazmerno enostavna in hitra. Tudi glikozilacijski vzorec je podoben človeku, kar pomeni nizko imunogenost ter visoko biološko aktivnost terapevtika. Način priprave transgenskih kokoši so izvedli s pomočjo lentivirusov, izražanje pa omejili na jajcevod (torej le v jajčni beljak) s pomočjo zaporedij iz gena za ovalbumin. Fuzija s Fc proteinom je povečala razpolovni čas ter zvišala biološko aktivnost, prav tako omogoča izolacijo preko afinitetne kromatografije <ref name="prvi"/>.
<h2>Metode in rezultati</h2>
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega interferona α2a</h3>
Interferon α2a je citokin, ki se uporablja pri zdravljenju hepatitisa in nekaterih oblik raka. 500 bp dolg zapis je bil vstavljen v lentivirusni vektor, osnovan na EIAV (virus infektivne anemije konjev), ki se ni bil sposoben podvajati. 900 bp dolgo zaporedje ovalbuminskega promotorskega zaporedja med odzivnim elementom za estrogen in od steroidov odvisnim regulatornim elementom (EREOVA2) je povečalo izražanje in ga tudi omejilo na jajcevod (v jajčni beljak) <ref name="prvi"/>. Pripravljen vektor so injicirali v embrije iz izleženih jajc, da so pripravili G<sub>0</sub> transgenske kokoši. G<sub>0</sub> petelin, izležen iz teh jajc je moral prestati PCR analizo za preverjanje vstavljanja gena – DNA je bila pridobljena iz semenske tekočine. Nato so ga križali z wild type kokošmi. G<sub>1</sub> potomcem so izolirali DNA iz krvi ter jo analizirali z restrikcijo in prenosom po Southernu <ref name="drugi"> Lillico SG, Sherman A, McGrew MJ, et al. Oviduct-specific expression of two therapeutic proteins in transgenic hens. ''Proc Natl Acad Sci U S A.'' '''2007''';104(6):1771-6. Feb. 2007. doi:10.1073/pnas.0610401104 </ref><ref name="tretji"> McGrew MJ, Sherman A, Ellard FM, et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. ''EMBO Rep.'' '''2004''';5(7):728-33. Jul. 2004. doi:10.1038/sj.embor.7400171</ref>. Prisotnost interferona α2a v jajčnem beljaku so preverjali v jajcih kokoši G<sub>1</sub> in G<sub>2</sub> z western blotom, ter določili koncentracijo s komercialno dostopnim kitom za ELISO. Biološko aktivnost so preverili s celicami, ki so imele odzivni element občutljiv na inteferon, kateri je povzročil prepis luciferaze. Čiščenje produkta je bilo sestavljeno iz pH redukcije in centrifugiranja ter Hi Trap BLUE kolone. Po čiščenju so dobili 15 mg citokina na 100 mL jajčnega beljaka, kar je 60 % manj kot so določili z ELISO, zagotovili pa so ≥95 % čistost (kromatografija z obrnjeno fazo, SEC-MALS). Protivirusna aktivnost je bila preverjena proti H1N1 virusu gripe A v A549 celicah. Interferon α2a iz beljaka je bil bolj učinkovit kot komercialno dostopen (iz ''E. Coli'')<ref name="prvi"/>.
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega fuzijskega prašičjega rastnega faktorja s Fc</h3>
CSF1 (»''colony stimulating factor''«) ima ključne vloge pri diferenciaciji, proliferaciji in funkciji makrofagov, uporablja se tudi v regenerativni medicini. Prisoten je pri večini sesalskih vrst, fuzija s Fc proteinom pa poveča razpolovni čas ter njegovo učinkovitost in vivo. Zapis za fuzijski protein pCSF1-Fc je bil kloniran v pLenti6 lentivirusni vektor izpeljan iz virusa HIV. Pred njim je bil promotor EREOVA2, za njim pa optimiziran posttranskripcijski regulatorni element oPRE iz svizca (»''woodchuck''«). Postopek priprave transgenskih kokoši je bil enak kot pri prej opisani pripravi interferona. Funkcionalnost proteina so preverili s Ba/F3 celicami, ki so imele izražen receptor za CSF1. Za njihovo preživetje je bila nujna prisotnost CSF1. Tudi tukaj so z enakimi metodami kot pri interferonu uspeli zagotoviti ≥97 % čistost proteina. Pokazali so tudi, da se iz jajčnega beljaka da izolirati protein tudi, če je zamrznjen do -80 °C za obdobje 1 meseca. Njegovo biološko aktivnost so pokazali na miših, tretiranih z izoliranim pCSF1-Fc. Analizirali so jetra, vranico in kri. V primerjavi s kontrolo so se povišale F4/80<sup>+</sup> CD11b<sup>+</sup> v krvi in F4/80<sup>+</sup> makrofagi v jetrih, kar pomeni, da izolirani protein res deluje <ref name="prvi"/>.
<h2>Zaključek</h2>
V tej študiji so pokazali, da so lentivirusni vektorji učinkovita metoda priprave transgenskih kokoši s stabilnim prenosom genske spremembe na potomce, izražanje pa je omejeno le na jajcevod oz. jajčni beljak.. Težavo jim je predstavljala prenizka stopnja izražanja za komercialno uporabo metode ter tudi izolacija iz beljaka, ki sestoji iz veliko različnih beljakovin (izgube). Cena kokošjih bioreaktorjev bi lahko dosegla dvakrat nižjo ceno kot z običajnimi sesalskimi celicami, v največji meri zaradi nižjih stroškov vzdrževanja poslopja za kokoši ter odsotnosti potrebe po »dobri proizvodni praksi« dokler ne razbijemo jajca. Vsekakor pa je potrebne še veliko optimizacije ter testiranja aplikacije na ta način pripravljenih terapevtikov na ljudeh, kjer ovir zagotovo ne bo manjkalo.
<h2>Viri in literatura</h2>
<references/>

Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov

2019-03-19T17:12:58Z

Blazlebar:

Biološka zdravila so na svetovnem trgu farmacije ena izmed najbolj rastočih smeri, vendar jih ovira visoka cena proizvodnje v primerjavi z običajnimi kemijskimi zdravili. To bi lahko rešili z izboljšavo transgenskih tehnik za proizvajanje takšnih zdravil. Kokošji bioreaktorji so redko uporabljeni, predvsem zaradi težke priprave transgenskih živali v preteklosti. Z novejšimi metodami izražamo terapevtski protein v jajčnem beljaku, kar močno zniža ceno proizvodnje <ref name="prvi">Herron LR, Pridans C, Turnbull ML, et al. A chicken bioreactor for efficient production of functional cytokines. ''BMC Biotechnol.'' '''2018''';18(1):82. Dec. 2018. doi:10.1186/s12896-018-0495-1</ref>.
<h2>Priprava bioloških zdravil</h2>
Razvoj postopka za pripravo rekombinantnega človeškega inzulina je usmeril farmacevtsko industrijo v razvoj več bioloških zdravil oz. proteinov. To so lahko protitelesa, encimi, citokini, rastni faktorji… Ta zdravila se v največjem obsegu pripravlja v bakterijah, kvasovkah, redkeje sesalskih celicah. Vsak sistem se definira s kompleksnostjo procesa, količino produkta, ustreznostjo PTM in najpomembneje, s ceno. V namen znižanja slednje, se razvijajo novi genetsko spremenjeni sistemi, ki temeljijo na živini. Pripravili so transgenske ovce, koze ter krave na takšen način, da se je terapevtski protein izločal v mleku. Kljub izjemni inovativnosti te metode, so prisotne tudi pomanjkljivosti – majhno število potomcev, dolga obdobja brejosti, zahteva po velikih življenjskih površinah in količinah hrane, težka izolacija terapevtika iz mleka (visoka vsebnost maščob) ter njegova reabsorpcija (negativne posledice za žival)<ref name="prvi"/>.

Kokošji bioreaktor bi terapevtik izločal v jajčni beljak. Ta vsebuje približno 3,5 g beljakovin v jajčnem beljaku v 60 g jajcu, vsaka kokoš pa znese letno preko 300 jajc. Cena gojenja je nizka, namnožitev transgenskih kokoši pa sorazmerno enostavna in hitra. Tudi glikozilacijski vzorec je podoben človeku, kar pomeni nizko imunogenost ter visoko biološko aktivnost terapevtika. Način priprave transgenskih kokoši so izvedli s pomočjo lentivirusov, izražanje pa omejili na jajcevod (torej le v jajčni beljak) s pomočjo zaporedij iz gena za ovalbumin. Fuzija s Fc proteinom je povečala razpolovni čas ter zvišala biološko aktivnost, prav tako omogoča izolacijo preko afinitetne kromatografije <ref name="prvi"/>.
<h2>Metode in rezultati</h2>
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega interferona α2a</h3>
Interferon α2a je citokin, ki se uporablja pri zdravljenju hepatitisa in nekaterih oblik raka. 500 bp dolg zapis je bil vstavljen v lentivirusni vektor, osnovan na EIAV (virus infektivne anemije konjev), ki se ni bil sposoben podvajati. 900 bp dolgo zaporedje ovalbuminskega promotorskega zaporedja med odzivnim elementom za estrogen in od steroidov odvisnim regulatornim elementom (EREOVA2) je povečalo izražanje in ga tudi omejilo na jajcevod (v jajčni beljak) <ref name="prvi"/>. Pripravljen vektor so injicirali v embrije iz izleženih jajc, da so pripravili G<sub>0</sub> transgenske kokoši. G<sub>0</sub> petelin, izležen iz teh jajc je moral prestati PCR analizo za preverjanje vstavljanja gena – DNA je bila pridobljena iz semenske tekočine. Nato so ga križali z wild type kokošmi. G<sub>1</sub> potomcem so izolirali DNA iz krvi ter jo analizirali z restrikcijo in prenosom po Southernu <ref name="drugi"> Lillico SG, Sherman A, McGrew MJ, et al. Oviduct-specific expression of two therapeutic proteins in transgenic hens. ''Proc Natl Acad Sci U S A.'' '''2007''';104(6):1771-6. Feb. 2007. doi:10.1073/pnas.0610401104 </ref><ref name="tretji"> McGrew MJ, Sherman A, Ellard FM, et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. ''EMBO Rep.'' '''2004''';5(7):728-33. Jul. 2004. doi:10.1038/sj.embor.7400171</ref>. Prisotnost interferona α2a v jajčnem beljaku so preverjali v jajcih kokoši G<sub>1</sub> in G<sub>2</sub> z western blotom, ter določili koncentracijo s komercialno dostopnim kitom za ELISO. Biološko aktivnost so preverili s celicami, ki so imele odzivni element občutljiv na inteferon, kateri je povzročil prepis luciferaze. Čiščenje produkta je bilo sestavljeno iz pH redukcije in centrifugiranja ter Hi Trap BLUE kolone. Po čiščenju so dobili 15 mg citokina na 100 mL jajčnega beljaka, kar je 60 % manj kot so določili z ELISO, zagotovili pa so ≥95 % čistost (kromatografija z obrnjeno fazo, SEC-MALS). Protivirusna aktivnost je bila preverjena proti H1N1 virusu gripe A v A549 celicah. Interferon α2a iz beljaka je bil bolj učinkovit kot komercialno dostopen (iz ''E. Coli'')<ref name="prvi"/>.
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega fuzijskega prašičjega rastnega faktorja s Fc</h3>
CSF1 (»''colony stimulating factor''«) ima ključne vloge pri diferenciaciji, proliferaciji in funkciji makrofagov, uporablja se tudi v regenerativni medicini. Prisoten je pri večini sesalskih vrst, fuzija s Fc proteinom pa poveča razpolovni čas ter njegovo učinkovitost in vivo. Zapis za fuzijski protein pCSF1-Fc je bil kloniran v pLenti6 lentivirusni vektor izpeljan iz virusa HIV. Pred njim je bil promotor EREOVA2, za njim pa optimiziran posttranskripcijski regulatorni element oPRE iz svizca (»''woodchuck''«). Postopek priprave transgenskih kokoši je bil enak kot pri prej opisani pripravi interferona. Funkcionalnost proteina so preverili s Ba/F3 celicami, ki so imele izražen receptor za CSF1. Za njihovo preživetje je bila nujna prisotnost CSF1. Tudi tukaj so z enakimi metodami kot pri interferonu uspeli zagotoviti ≥97 % čistost proteina. Pokazali so tudi, da se iz jajčnega beljaka da izolirati protein tudi, če je zamrznjen do -80 °C za obdobje 1 meseca. Njegovo biološko aktivnost so pokazali na miših, tretiranih z izoliranim pCSF1-Fc. Analizirali so jetra, vranico in kri. V primerjavi s kontrolo so se povišale F4/80<sup>+</sup> CD11b<sup>+</sup> v krvi in F4/80<sup>+</sup> makrofagi v jetrih, kar pomeni, da izolirani protein res deluje <ref name="prvi"/>.
<h2>Zaključek</h2>
V tej študiji so pokazali, da so lentivirusni vektorji učinkovita metoda priprave transgenskih kokoši s stabilnim prenosom genske spremembe na potomce, izražanje pa je omejeno le na jajcevod oz. jajčni beljak.. Težavo jim je predstavljala prenizka stopnja izražanja za komercialno uporabo metode ter tudi izolacija iz beljaka, ki sestoji iz veliko različnih beljakovin (izgube). Cena kokošjih bioreaktorjev bi lahko dosegla dvakrat nižjo ceno kot z običajnimi sesalskimi celicami, v največji meri zaradi nižjih stroškov vzdrževanja poslopja za kokoši ter odsotnosti potrebe po »dobri proizvodni praksi« dokler ne razbijemo jajca. Vsekakor pa je potrebne še veliko optimizacije ter testiranja aplikacije na ta način pripravljenih terapevtikov na ljudeh, kjer ovir zagotovo ne bo manjkalo.
<h2>Viri in literatura</h2>
<references/>

Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov

2019-03-19T17:12:20Z

Blazlebar:

Biološka zdravila so na svetovnem trgu farmacije ena izmed najbolj rastočih smeri, vendar jih ovira visoka cena proizvodnje v primerjavi z običajnimi kemijskimi zdravili. To bi lahko rešili z izboljšavo transgenskih tehnik za proizvajanje takšnih zdravil. Kokošji bioreaktorji so redko uporabljeni, predvsem zaradi težke priprave transgenskih živali v preteklosti. Z novejšimi metodami izražamo terapevtski protein v jajčnem beljaku, kar močno zniža ceno proizvodnje <ref name="prvi">Herron LR, Pridans C, Turnbull ML, et al. A chicken bioreactor for efficient production of functional cytokines. ''BMC Biotechnol.'' '''2018''';18(1):82. Dec. 2018. doi:10.1186/s12896-018-0495-1</ref>.
<h2>Priprava bioloških zdravil</h2>
Razvoj postopka za pripravo rekombinantnega človeškega inzulina je usmeril farmacevtsko industrijo v razvoj več bioloških zdravil oz. proteinov. To so lahko protitelesa, encimi, citokini, rastni faktorji… Ta zdravila se v največjem obsegu pripravlja v bakterijah, kvasovkah, redkeje sesalskih celicah. Vsak sistem se definira s kompleksnostjo procesa, količino produkta, ustreznostjo PTM in najpomembneje, s ceno. V namen znižanja slednje, se razvijajo novi genetsko spremenjeni sistemi, ki temeljijo na živini. Pripravili so transgenske ovce, koze ter krave na takšen način, da se je terapevtski protein izločal v mleku. Kljub izjemni inovativnosti te metode, so prisotne tudi pomanjkljivosti – majhno število potomcev, dolga obdobja brejosti, zahteva po velikih življenjskih površinah in količinah hrane, težka izolacija terapevtika iz mleka (visoka vsebnost maščob) ter njegova reabsorpcija (negativne posledice za žival)<ref name="prvi"/>.

Kokošji bioreaktor bi terapevtik izločal v jajčni beljak. Ta vsebuje približno 3,5 g beljakovin v jajčnem beljaku v 60 g jajcu, vsaka kokoš pa znese letno preko 300 jajc. Cena gojenja je nizka, namnožitev transgenskih kokoši pa sorazmerno enostavna in hitra. Tudi glikozilacijski vzorec je podoben človeku, kar pomeni nizko imunogenost ter visoko biološko aktivnost terapevtika. Način priprave transgenskih kokoši so izvedli s pomočjo lentivirusov, izražanje pa omejili na jajcevod (torej le v jajčni beljak) s pomočjo zaporedij iz gena za ovalbumin. Fuzija s Fc proteinom je povečala razpolovni čas ter zvišala biološko aktivnost, prav tako omogoča izolacijo preko afinitetne kromatografije <ref name="prvi"/>.
<h2>Metode in rezultati</h2>
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega interferona α2a</h3>
Interferon α2a je citokin, ki se uporablja pri zdravljenju hepatitisa in nekaterih oblik raka. 500 bp dolg zapis je bil vstavljen v lentivirusni vektor, osnovan na EIAV (virus infektivne anemije konjev), ki se ni bil sposoben podvajati. 900 bp dolgo zaporedje ovalbuminskega promotorskega zaporedja med odzivnim elementom za estrogen in od steroidov odvisnim regulatornim elementom (EREOVA2) je povečalo izražanje in ga tudi omejilo na jajcevod (v jajčni beljak) <ref name="prvi"/>. Pripravljen vektor so injicirali v embrije iz izleženih jajc, da so pripravili G0 transgenske kokoši. G<sub>0</sub> petelin, izležen iz teh jajc je moral prestati PCR analizo za preverjanje vstavljanja gena – DNA je bila pridobljena iz semenske tekočine. Nato so ga križali z wild type kokošmi. G<sub>1</sub> potomcem so izolirali DNA iz krvi ter jo analizirali z restrikcijo in prenosom po Southernu <ref name="drugi"> Lillico SG, Sherman A, McGrew MJ, et al. Oviduct-specific expression of two therapeutic proteins in transgenic hens. ''Proc Natl Acad Sci U S A.'' '''2007''';104(6):1771-6. Feb. 2007. doi:10.1073/pnas.0610401104 </ref><ref name="tretji"> McGrew MJ, Sherman A, Ellard FM, et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. ''EMBO Rep.'' '''2004''';5(7):728-33. Jul. 2004. doi:10.1038/sj.embor.7400171</ref>. Prisotnost interferona α2a v jajčnem beljaku so preverjali v jajcih kokoši G<sub>1</sub> in G<sub>2</sub> z western blotom, ter določili koncentracijo s komercialno dostopnim kitom za ELISO. Biološko aktivnost so preverili s celicami, ki so imele odzivni element občutljiv na inteferon, kateri je povzročil prepis luciferaze. Čiščenje produkta je bilo sestavljeno iz pH redukcije in centrifugiranja ter Hi Trap BLUE kolone. Po čiščenju so dobili 15 mg citokina na 100 mL jajčnega beljaka, kar je 60 % manj kot so določili z ELISO, zagotovili pa so ≥95 % čistost (kromatografija z obrnjeno fazo, SEC-MALS). Protivirusna aktivnost je bila preverjena proti H1N1 virusu gripe A v A549 celicah. Interferon α2a iz beljaka je bil bolj učinkovit kot komercialno dostopen (iz ''E. Coli'')<ref name="prvi"/>.
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega fuzijskega prašičjega rastnega faktorja s Fc</h3>
CSF1 (»''colony stimulating factor''«) ima ključne vloge pri diferenciaciji, proliferaciji in funkciji makrofagov, uporablja se tudi v regenerativni medicini. Prisoten je pri večini sesalskih vrst, fuzija s Fc proteinom pa poveča razpolovni čas ter njegovo učinkovitost in vivo. Zapis za fuzijski protein pCSF1-Fc je bil kloniran v pLenti6 lentivirusni vektor izpeljan iz virusa HIV. Pred njim je bil promotor EREOVA2, za njim pa optimiziran posttranskripcijski regulatorni element oPRE iz svizca (»''woodchuck''«). Postopek priprave transgenskih kokoši je bil enak kot pri prej opisani pripravi interferona. Funkcionalnost proteina so preverili s Ba/F3 celicami, ki so imele izražen receptor za CSF1. Za njihovo preživetje je bila nujna prisotnost CSF1. Tudi tukaj so z enakimi metodami kot pri interferonu uspeli zagotoviti ≥97 % čistost proteina. Pokazali so tudi, da se iz jajčnega beljaka da izolirati protein tudi, če je zamrznjen do -80 °C za obdobje 1 meseca. Njegovo biološko aktivnost so pokazali na miših, tretiranih z izoliranim pCSF1-Fc. Analizirali so jetra, vranico in kri. V primerjavi s kontrolo so se povišale F4/80<sup>+</sup> CD11b<sup>+</sup> v krvi in F4/80<sup>+</sup> makrofagi v jetrih, kar pomeni, da izolirani protein res deluje <ref name="prvi"/>.
<h2>Zaključek</h2>
V tej študiji so pokazali, da so lentivirusni vektorji učinkovita metoda priprave transgenskih kokoši s stabilnim prenosom genske spremembe na potomce, izražanje pa je omejeno le na jajcevod oz. jajčni beljak.. Težavo jim je predstavljala prenizka stopnja izražanja za komercialno uporabo metode ter tudi izolacija iz beljaka, ki sestoji iz veliko različnih beljakovin (izgube). Cena kokošjih bioreaktorjev bi lahko dosegla dvakrat nižjo ceno kot z običajnimi sesalskimi celicami, v največji meri zaradi nižjih stroškov vzdrževanja poslopja za kokoši ter odsotnosti potrebe po »dobri proizvodni praksi« dokler ne razbijemo jajca. Vsekakor pa je potrebne še veliko optimizacije ter testiranja aplikacije na ta način pripravljenih terapevtikov na ljudeh, kjer ovir zagotovo ne bo manjkalo.
<h2>Viri in literatura</h2>
<references/>

Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov

2019-03-19T17:11:19Z

Blazlebar:

Biološka zdravila so na svetovnem trgu farmacije ena izmed najbolj rastočih smeri, vendar jih ovira visoka cena proizvodnje v primerjavi z običajnimi kemijskimi zdravili. To bi lahko rešili z izboljšavo transgenskih tehnik za proizvajanje takšnih zdravil. Kokošji bioreaktorji so redko uporabljeni, predvsem zaradi težke priprave transgenskih živali v preteklosti. Z novejšimi metodami izražamo terapevtski protein v jajčnem beljaku, kar močno zniža ceno proizvodnje <ref name="prvi">Herron LR, Pridans C, Turnbull ML, et al. A chicken bioreactor for efficient production of functional cytokines. ''BMC Biotechnol.'' '''2018''';18(1):82. Dec. 2018. doi:10.1186/s12896-018-0495-1</ref>.
<h2>Priprava bioloških zdravil</h2>
Razvoj postopka za pripravo rekombinantnega človeškega inzulina je usmeril farmacevtsko industrijo v razvoj več bioloških zdravil oz. proteinov. To so lahko protitelesa, encimi, citokini, rastni faktorji… Ta zdravila se v največjem obsegu pripravlja v bakterijah, kvasovkah, redkeje sesalskih celicah. Vsak sistem se definira s kompleksnostjo procesa, količino produkta, ustreznostjo PTM in najpomembneje, s ceno. V namen znižanja slednje, se razvijajo novi genetsko spremenjeni sistemi, ki temeljijo na živini. Pripravili so transgenske ovce, koze ter krave na takšen način, da se je terapevtski protein izločal v mleku. Kljub izjemni inovativnosti te metode, so prisotne tudi pomanjkljivosti – majhno število potomcev, dolga obdobja brejosti, zahteva po velikih življenjskih površinah in količinah hrane, težka izolacija terapevtika iz mleka (visoka vsebnost maščob) ter njegova reabsorpcija (negativne posledice za žival)<ref name="prvi"/>.

Kokošji bioreaktor bi terapevtik izločal v jajčni beljak. Ta vsebuje približno 3,5 g beljakovin v jajčnem beljaku v 60 g jajcu, vsaka kokoš pa znese letno preko 300 jajc. Cena gojenja je nizka, namnožitev transgenskih kokoši pa sorazmerno enostavna in hitra. Tudi glikozilacijski vzorec je podoben človeku, kar pomeni nizko imunogenost ter visoko biološko aktivnost terapevtika. Način priprave transgenskih kokoši so izvedli s pomočjo lentivirusov, izražanje pa omejili na jajcevod (torej le v jajčni beljak) s pomočjo zaporedij iz gena za ovalbumin. Fuzija s Fc proteinom je povečala razpolovni čas ter zvišala biološko aktivnost, prav tako omogoča izolacijo preko afinitetne kromatografije <ref name="prvi"/>.
<h2>Metode in rezultati</h2>
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega interferona α2a</h3>
Interferon α2a je citokin, ki se uporablja pri zdravljenju hepatitisa in nekaterih oblik raka. 500 bp dolg zapis je bil vstavljen v lentivirusni vektor, osnovan na EIAV (virus infektivne anemije konjev), ki se ni bil sposoben podvajati. 900 bp dolgo zaporedje ovalbuminskega promotorskega zaporedja med odzivnim elementom za estrogen in od steroidov odvisnim regulatornim elementom (EREOVA2) je povečalo izražanje in ga tudi omejilo na jajcevod (v jajčni beljak) <ref name="prvi"/>. Pripravljen vektor so injicirali v embrije iz izleženih jajc, da so pripravili G0 transgenske kokoši. G<sub>0</sub> petelin, izležen iz teh jajc je moral prestati PCR analizo za preverjanje vstavljanja gena – DNA je bila pridobljena iz semenske tekočine. Nato so ga križali z wild type kokošmi. G<sub>1</sub> potomcem so izolirali DNA iz krvi ter jo analizirali z restrikcijo in prenosom po Southernu <ref name="drugi"> Lillico SG, Sherman A, McGrew MJ, et al. Oviduct-specific expression of two therapeutic proteins in transgenic hens. ''Proc Natl Acad Sci U S A.'' '''2007''';104(6):1771-6. Feb. 2007. doi:10.1073/pnas.0610401104 </ref><ref name="tretji"> McGrew MJ, Sherman A, Ellard FM, et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. ''EMBO Rep.'' '''2004''';5(7):728-33. Jul. 2004. doi:10.1038/sj.embor.7400171</ref>. Prisotnost interferona α2a v jajčnem beljaku so preverjali v jajcih kokoši G<sub>1</sub> in G<sub>2</sub> z western blotom, ter določili koncentracijo s komercialno dostopnim kitom za ELISO. Biološko aktivnost so preverili s celicami, ki so imele odzivni element občutljiv na inteferon, kateri je povzročil prepis luciferaze. Čiščenje produkta je bilo sestavljeno iz pH redukcije in centrifugiranja ter Hi Trap BLUE kolone. Po čiščenju so dobili 15 mg citokina na 100 mL jajčnega beljaka, kar je 60 % manj kot so določili z ELISO, zagotovili pa so ≥95 % čistost (kromatografija z obrnjeno fazo, SEC-MALS). Protivirusna aktivnost je bila preverjena proti H1N1 virusu gripe A v A549 celicah. Interferon α2a iz beljaka je bil bolj učinkovit kot komercialno dostopen (iz ''E. Coli'')<ref name="prvi"/>.
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega fuzijskega prašičjega rastnega faktorja s Fc</h3>
CSF1 (»''colony stimulating factor''«) ima ključne vloge pri diferenciaciji, proliferaciji in funkciji makrofagov, uporablja se tudi v regenerativni medicini. Prisoten je pri večini sesalskih vrst, fuzija s Fc proteinom pa poveča razpolovni čas ter njegovo učinkovitost in vivo. Zapis za fuzijski protein pCSF1-Fc je bil kloniran v pLenti6 lentivirusni vektor izpeljan iz virusa HIV. Pred njim je bil promotor EREOVA2, za njim pa optimiziran posttranskripcijski regulatorni element oPRE iz svizca (»''woodchuck''«). Postopek priprave transgenskih kokoši je bil enak kot pri prej opisani pripravi interferona. Funkcionalnost proteina so preverili s Ba/F3 celicami, ki so imele izražen receptor za CSF1. Za njihovo preživetje je bila nujna prisotnost CSF1. Tudi tukaj so z enakimi metodami kot pri interferonu uspeli zagotoviti ≥97 % čistost proteina. Pokazali so tudi, da se iz jajčnega beljaka da izolirati protein tudi, če je zamrznjen do -80 °C za obdobje 1 meseca. Njegovo biološko aktivnost so pokazali na miših, tretiranih z izoliranim pCSF1-Fc. Analizirali so jetra, vranico in kri. V primerjavi s kontrolo so se povišale F4/80<sup>+</sup> CD11b<sup>+</sup> v krvi in F4/80<sup>+</sup> makrofagi v jetrih, kar pomeni, da izolirani protein res deluje <ref name="prvi"/>.
<h2>Zaključek</h2>
V tej študiji so pokazali, da so lentivirusni vektorji učinkovita metoda priprave transgenskih kokoši s stabilnim prenosom genske spremembe na potomce, izražanje pa je omejeno le na jajcevod oz. jajčni beljak.. Težavo jim je predstavljala prenizka stopnja izražanja za komercialno uporabo metode ter tudi izolacija iz beljaka, ki sestoji iz veliko različnih beljakovin (izgube). Cena kokošjih bioreaktorjev bi lahko dosegla dvakrat nižjo ceno kot z običajnimi sesalskimi celicami, v največji meri zaradi nižjih stroškov vzdrževanja poslopja za kokoši ter odsotnosti potrebe po »dobri proizvodni praksi« dokler ne razbijemo jajca. Vsekakor pa je potrebne še veliko optimizacije ter testiranja aplikacije na ta način pripravljenih terapevtikov na ljudeh, kjer ovir zagotovo ne bo manjkalo.
<references/>

Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov

2019-03-19T17:10:46Z

Blazlebar:

Biološka zdravila so na svetovnem trgu farmacije ena izmed najbolj rastočih smeri, vendar jih ovira visoka cena proizvodnje v primerjavi z običajnimi kemijskimi zdravili. To bi lahko rešili z izboljšavo transgenskih tehnik za proizvajanje takšnih zdravil. Kokošji bioreaktorji so redko uporabljeni, predvsem zaradi težke priprave transgenskih živali v preteklosti. Z novejšimi metodami izražamo terapevtski protein v jajčnem beljaku, kar močno zniža ceno proizvodnje <ref name="prvi">Herron LR, Pridans C, Turnbull ML, et al. A chicken bioreactor for efficient production of functional cytokines. ''BMC Biotechnol.'' '''2018''';18(1):82. Dec. 2018. doi:10.1186/s12896-018-0495-1</ref>.
<h2>Priprava bioloških zdravil</h2>
Razvoj postopka za pripravo rekombinantnega človeškega inzulina je usmeril farmacevtsko industrijo v razvoj več bioloških zdravil oz. proteinov. To so lahko protitelesa, encimi, citokini, rastni faktorji… Ta zdravila se v največjem obsegu pripravlja v bakterijah, kvasovkah, redkeje sesalskih celicah. Vsak sistem se definira s kompleksnostjo procesa, količino produkta, ustreznostjo PTM in najpomembneje, s ceno. V namen znižanja slednje, se razvijajo novi genetsko spremenjeni sistemi, ki temeljijo na živini. Pripravili so transgenske ovce, koze ter krave na takšen način, da se je terapevtski protein izločal v mleku. Kljub izjemni inovativnosti te metode, so prisotne tudi pomanjkljivosti – majhno število potomcev, dolga obdobja brejosti, zahteva po velikih življenjskih površinah in količinah hrane, težka izolacija terapevtika iz mleka (visoka vsebnost maščob) ter njegova reabsorpcija (negativne posledice za žival)<ref name="prvi"/>.

Kokošji bioreaktor bi terapevtik izločal v jajčni beljak. Ta vsebuje približno 3,5 g beljakovin v jajčnem beljaku v 60 g jajcu, vsaka kokoš pa znese letno preko 300 jajc. Cena gojenja je nizka, namnožitev transgenskih kokoši pa sorazmerno enostavna in hitra. Tudi glikozilacijski vzorec je podoben človeku, kar pomeni nizko imunogenost ter visoko biološko aktivnost terapevtika. Način priprave transgenskih kokoši so izvedli s pomočjo lentivirusov, izražanje pa omejili na jajcevod (torej le v jajčni beljak) s pomočjo zaporedij iz gena za ovalbumin. Fuzija s Fc proteinom je povečala razpolovni čas ter zvišala biološko aktivnost, prav tako omogoča izolacijo preko afinitetne kromatografije <ref name="prvi"/>.
<h2>Metode in rezultati</h2>
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega interferona α2a</h3>
Interferon α2a je citokin, ki se uporablja pri zdravljenju hepatitisa in nekaterih oblik raka. 500 bp dolg zapis je bil vstavljen v lentivirusni vektor, osnovan na EIAV (virus infektivne anemije konjev), ki se ni bil sposoben podvajati. 900 bp dolgo zaporedje ovalbuminskega promotorskega zaporedja med odzivnim elementom za estrogen in od steroidov odvisnim regulatornim elementom (EREOVA2) je povečalo izražanje in ga tudi omejilo na jajcevod (v jajčni beljak) <ref name="prvi"/>. Pripravljen vektor so injicirali v embrije iz izleženih jajc, da so pripravili G0 transgenske kokoši. G<sub>0</sub> petelin, izležen iz teh jajc je moral prestati PCR analizo za preverjanje vstavljanja gena – DNA je bila pridobljena iz semenske tekočine. Nato so ga križali z wild type kokošmi. G<sub>1</sub> potomcem so izolirali DNA iz krvi ter jo analizirali z restrikcijo in prenosom po Southernu <ref name="drugi"> Lillico SG, Sherman A, McGrew MJ, et al. Oviduct-specific expression of two therapeutic proteins in transgenic hens. ''Proc Natl Acad Sci U S A.'' '''2007''';104(6):1771-6. Feb. 2007. doi:10.1073/pnas.0610401104 </ref><ref name="tretji"> McGrew MJ, Sherman A, Ellard FM, et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. ''EMBO Rep.'' '''2004''';5(7):728-33. Jul. 2004. doi:10.1038/sj.embor.7400171</ref>. Prisotnost interferona α2a v jajčnem beljaku so preverjali v jajcih kokoši G<sub>1</sub> in G<sub>2</sub> z western blotom, ter določili koncentracijo s komercialno dostopnim kitom za ELISO. Biološko aktivnost so preverili s celicami, ki so imele odzivni element občutljiv na inteferon, kateri je povzročil prepis luciferaze. Čiščenje produkta je bilo sestavljeno iz pH redukcije in centrifugiranja ter Hi Trap BLUE kolone. Po čiščenju so dobili 15 mg citokina na 100 mL jajčnega beljaka, kar je 60 % manj kot so določili z ELISO, zagotovili pa so ≥95 % čistost (kromatografija z obrnjeno fazo, SEC-MALS). Protivirusna aktivnost je bila preverjena proti H1N1 virusu gripe A v A549 celicah. Interferon α2a iz beljaka je bil bolj učinkovit kot komercialno dostopen (iz E. Coli)<ref name="prvi"/>.
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega fuzijskega prašičjega rastnega faktorja s Fc</h3>
CSF1 (»''colony stimulating factor''«) ima ključne vloge pri diferenciaciji, proliferaciji in funkciji makrofagov, uporablja se tudi v regenerativni medicini. Prisoten je pri večini sesalskih vrst, fuzija s Fc proteinom pa poveča razpolovni čas ter njegovo učinkovitost in vivo. Zapis za fuzijski protein pCSF1-Fc je bil kloniran v pLenti6 lentivirusni vektor izpeljan iz virusa HIV. Pred njim je bil promotor EREOVA2, za njim pa optimiziran posttranskripcijski regulatorni element oPRE iz svizca (»''woodchuck''«). Postopek priprave transgenskih kokoši je bil enak kot pri prej opisani pripravi interferona. Funkcionalnost proteina so preverili s Ba/F3 celicami, ki so imele izražen receptor za CSF1. Za njihovo preživetje je bila nujna prisotnost CSF1. Tudi tukaj so z enakimi metodami kot pri interferonu uspeli zagotoviti ≥97 % čistost proteina. Pokazali so tudi, da se iz jajčnega beljaka da izolirati protein tudi, če je zamrznjen do -80 °C za obdobje 1 meseca. Njegovo biološko aktivnost so pokazali na miših, tretiranih z izoliranim pCSF1-Fc. Analizirali so jetra, vranico in kri. V primerjavi s kontrolo so se povišale F4/80<sup>+</sup> CD11b<sup>+</sup> v krvi in F4/80<sup>+</sup> makrofagi v jetrih, kar pomeni, da izolirani protein res deluje <ref name="prvi"/>.
<h2>Zaključek</h2>
V tej študiji so pokazali, da so lentivirusni vektorji učinkovita metoda priprave transgenskih kokoši s stabilnim prenosom genske spremembe na potomce, izražanje pa je omejeno le na jajcevod oz. jajčni beljak.. Težavo jim je predstavljala prenizka stopnja izražanja za komercialno uporabo metode ter tudi izolacija iz beljaka, ki sestoji iz veliko različnih beljakovin (izgube). Cena kokošjih bioreaktorjev bi lahko dosegla dvakrat nižjo ceno kot z običajnimi sesalskimi celicami, v največji meri zaradi nižjih stroškov vzdrževanja poslopja za kokoši ter odsotnosti potrebe po »dobri proizvodni praksi« dokler ne razbijemo jajca. Vsekakor pa je potrebne še veliko optimizacije ter testiranja aplikacije na ta način pripravljenih terapevtikov na ljudeh, kjer ovir zagotovo ne bo manjkalo.
<references/>

Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov

2019-03-19T17:03:11Z

Blazlebar:

Biološka zdravila so na svetovnem trgu farmacije ena izmed najbolj rastočih smeri, vendar jih ovira visoka cena proizvodnje v primerjavi z običajnimi kemijskimi zdravili. To bi lahko rešili z izboljšavo transgenskih tehnik za proizvajanje takšnih zdravil. Kokošji bioreaktorji so redko uporabljeni, predvsem zaradi težke priprave transgenskih živali v preteklosti. Z novejšimi metodami izražamo terapevtski protein v jajčnem beljaku, kar močno zniža ceno proizvodnje <ref name="prvi"> referenca ena </ref>.
<h2>Priprava bioloških zdravil</h2>
Razvoj postopka za pripravo rekombinantnega človeškega inzulina je usmeril farmacevtsko industrijo v razvoj več bioloških zdravil oz. proteinov. To so lahko protitelesa, encimi, citokini, rastni faktorji… Ta zdravila se v največjem obsegu pripravlja v bakterijah, kvasovkah, redkeje sesalskih celicah. Vsak sistem se definira s kompleksnostjo procesa, količino produkta, ustreznostjo PTM in najpomembneje, s ceno. V namen znižanja slednje, se razvijajo novi genetsko spremenjeni sistemi, ki temeljijo na živini. Pripravili so transgenske ovce, koze ter krave na takšen način, da se je terapevtski protein izločal v mleku. Kljub izjemni inovativnosti te metode, so prisotne tudi pomanjkljivosti – majhno število potomcev, dolga obdobja brejosti, zahteva po velikih življenjskih površinah in količinah hrane, težka izolacija terapevtika iz mleka (visoka vsebnost maščob) ter njegova reabsorpcija (negativne posledice za žival)<ref name="prvi"/>.

Kokošji bioreaktor bi terapevtik izločal v jajčni beljak. Ta vsebuje približno 3,5 g beljakovin v jajčnem beljaku v 60 g jajcu, vsaka kokoš pa znese letno preko 300 jajc. Cena gojenja je nizka, namnožitev transgenskih kokoši pa sorazmerno enostavna in hitra. Tudi glikozilacijski vzorec je podoben človeku, kar pomeni nizko imunogenost ter visoko biološko aktivnost terapevtika. Način priprave transgenskih kokoši so izvedli s pomočjo lentivirusov, izražanje pa omejili na jajcevod (torej le v jajčni beljak) s pomočjo zaporedij iz gena za ovalbumin. Fuzija s Fc proteinom je povečala razpolovni čas ter zvišala biološko aktivnost, prav tako omogoča izolacijo preko afinitetne kromatografije <ref name="prvi"/>.
<h2>Metode in rezultati</h2>
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega interferona α2a</h3>
Interferon α2a je citokin, ki se uporablja pri zdravljenju hepatitisa in nekaterih oblik raka. 500 bp dolg zapis je bil vstavljen v lentivirusni vektor, osnovan na EIAV (virus infektivne anemije konjev), ki se ni bil sposoben podvajati. 900 bp dolgo zaporedje ovalbuminskega promotorskega zaporedja med odzivnim elementom za estrogen in od steroidov odvisnim regulatornim elementom (EREOVA2) je povečalo izražanje in ga tudi omejilo na jajcevod (v jajčni beljak) <ref name="prvi"/>. Pripravljen vektor so injicirali v embrije iz izleženih jajc, da so pripravili G0 transgenske kokoši. G<sub>0</sub> petelin, izležen iz teh jajc je moral prestati PCR analizo za preverjanje vstavljanja gena – DNA je bila pridobljena iz semenske tekočine. Nato so ga križali z wild type kokošmi. G<sub>1</sub> potomcem so izolirali DNA iz krvi ter jo analizirali z restrikcijo in prenosom po Southernu <ref name="drugi"> referenca dva </ref><ref name="tretji"> referenca tri </ref>. Prisotnost interferona α2a v jajčnem beljaku so preverjali v jajcih kokoši G<sub>1</sub> in G<sub>2</sub> z western blotom, ter določili koncentracijo s komercialno dostopnim kitom za ELISO. Biološko aktivnost so preverili s celicami, ki so imele odzivni element občutljiv na inteferon, kateri je povzročil prepis luciferaze. Čiščenje produkta je bilo sestavljeno iz pH redukcije in centrifugiranja ter Hi Trap BLUE kolone. Po čiščenju so dobili 15 mg citokina na 100 mL jajčnega beljaka, kar je 60 % manj kot so določili z ELISO, zagotovili pa so ≥95 % čistost (kromatografija z obrnjeno fazo, SEC-MALS). Protivirusna aktivnost je bila preverjena proti H1N1 virusu gripe A v A549 celicah. Interferon α2a iz beljaka je bil bolj učinkovit kot komercialno dostopen (iz E. Coli)<ref name="prvi"/>.
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega fuzijskega prašičjega rastnega faktorja s Fc</h3>
CSF1 (»''colony stimulating factor''«) ima ključne vloge pri diferenciaciji, proliferaciji in funkciji makrofagov, uporablja se tudi v regenerativni medicini. Prisoten je pri večini sesalskih vrst, fuzija s Fc proteinom pa poveča razpolovni čas ter njegovo učinkovitost in vivo. Zapis za fuzijski protein pCSF1-Fc je bil kloniran v pLenti6 lentivirusni vektor izpeljan iz virusa HIV. Pred njim je bil promotor EREOVA2, za njim pa optimiziran posttranskripcijski regulatorni element oPRE iz svizca (»''woodchuck''«). Postopek priprave transgenskih kokoši je bil enak kot pri prej opisani pripravi interferona. Funkcionalnost proteina so preverili s Ba/F3 celicami, ki so imele izražen receptor za CSF1. Za njihovo preživetje je bila nujna prisotnost CSF1. Tudi tukaj so z enakimi metodami kot pri interferonu uspeli zagotoviti ≥97 % čistost proteina. Pokazali so tudi, da se iz jajčnega beljaka da izolirati protein tudi, če je zamrznjen do -80 °C za obdobje 1 meseca. Njegovo biološko aktivnost so pokazali na miših, tretiranih z izoliranim pCSF1-Fc. Analizirali so jetra, vranico in kri. V primerjavi s kontrolo so se povišale F4/80<sup>+</sup> CD11b<sup>+</sup> v krvi in F4/80<sup>+</sup> makrofagi v jetrih, kar pomeni, da izolirani protein res deluje <ref name="prvi"/>.
<h2>Zaključek</h2>
V tej študiji so pokazali, da so lentivirusni vektorji učinkovita metoda priprave transgenskih kokoši s stabilnim prenosom genske spremembe na potomce, izražanje pa je omejeno le na jajcevod oz. jajčni beljak.. Težavo jim je predstavljala prenizka stopnja izražanja za komercialno uporabo metode ter tudi izolacija iz beljaka, ki sestoji iz veliko različnih beljakovin (izgube). Cena kokošjih bioreaktorjev bi lahko dosegla dvakrat nižjo ceno kot z običajnimi sesalskimi celicami, v največji meri zaradi nižjih stroškov vzdrževanja poslopja za kokoši ter odsotnosti potrebe po »dobri proizvodni praksi« dokler ne razbijemo jajca. Vsekakor pa je potrebne še veliko optimizacije ter testiranja aplikacije na ta način pripravljenih terapevtikov na ljudeh, kjer ovir zagotovo ne bo manjkalo.
<references/>

Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov

2019-03-19T17:01:25Z

Blazlebar:

Biološka zdravila so na svetovnem trgu farmacije ena izmed najbolj rastočih smeri, vendar jih ovira visoka cena proizvodnje v primerjavi z običajnimi kemijskimi zdravili. To bi lahko rešili z izboljšavo transgenskih tehnik za proizvajanje takšnih zdravil. Kokošji bioreaktorji so redko uporabljeni, predvsem zaradi težke priprave transgenskih živali v preteklosti. Z novejšimi metodami izražamo terapevtski protein v jajčnem beljaku, kar močno zniža ceno proizvodnje <ref name="prvi"> referenca ena </ref>.
<h2>Priprava bioloških zdravil</h2>
Razvoj postopka za pripravo rekombinantnega človeškega inzulina je usmeril farmacevtsko industrijo v razvoj več bioloških zdravil oz. proteinov. To so lahko protitelesa, encimi, citokini, rastni faktorji… Ta zdravila se v največjem obsegu pripravlja v bakterijah, kvasovkah, redkeje sesalskih celicah. Vsak sistem se definira s kompleksnostjo procesa, količino produkta, ustreznostjo PTM in najpomembneje, s ceno. V namen znižanja slednje, se razvijajo novi genetsko spremenjeni sistemi, ki temeljijo na živini. Pripravili so transgenske ovce, koze ter krave na takšen način, da se je terapevtski protein izločal v mleku. Kljub izjemni inovativnosti te metode, so prisotne tudi pomanjkljivosti – majhno število potomcev, dolga obdobja brejosti, zahteva po velikih življenjskih površinah in količinah hrane, težka izolacija terapevtika iz mleka (visoka vsebnost maščob) ter njegova reabsorpcija (negativne posledice za žival)<ref name="prvi"/>.

Kokošji bioreaktor bi terapevtik izločal v jajčni beljak. Ta vsebuje približno 3,5 g beljakovin v jajčnem beljaku v 60 g jajcu, vsaka kokoš pa znese letno preko 300 jajc. Cena gojenja je nizka, namnožitev transgenskih kokoši pa sorazmerno enostavna in hitra. Tudi glikozilacijski vzorec je podoben človeku, kar pomeni nizko imunogenost ter visoko biološko aktivnost terapevtika. Način priprave transgenskih kokoši so izvedli s pomočjo lentivirusov, izražanje pa omejili na jajcevod (torej le v jajčni beljak) s pomočjo zaporedij iz gena za ovalbumin. Fuzija s Fc proteinom je povečala razpolovni čas ter zvišala biološko aktivnost, prav tako omogoča izolacijo preko afinitetne kromatografije <ref name="prvi"/>.
<h2>Metode in rezultati</h2>
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega interferona α2a</h3>
Interferon α2a je citokin, ki se uporablja pri zdravljenju hepatitisa in nekaterih oblik raka. 500 bp dolg zapis je bil vstavljen v lentivirusni vektor, osnovan na EIAV (virus infektivne anemije konjev), ki se ni bil sposoben podvajati. 900 bp dolgo zaporedje ovalbuminskega promotorskega zaporedja med odzivnim elementom za estrogen in od steroidov odvisnim regulatornim elementom (EREOVA2) je povečalo izražanje in ga tudi omejilo na jajcevod (v jajčni beljak) <ref name="prvi"/>. Pripravljen vektor so injicirali v embrije iz izleženih jajc, da so pripravili G0 transgenske kokoši. G<sub>0</sub> petelin, izležen iz teh jajc je moral prestati PCR analizo za preverjanje vstavljanja gena – DNA je bila pridobljena iz semenske tekočine. Nato so ga križali z wild type kokošmi. G<sub>1</sub> potomcem so izolirali DNA iz krvi ter jo analizirali z restrikcijo in prenosom po Southernu <ref name="drugi"> referenca dva </ref>. Prisotnost interferona α2a v jajčnem beljaku so preverjali v jajcih kokoši G<sub>1</sub> in G<sub>2</sub> z western blotom, ter določili koncentracijo s komercialno dostopnim kitom za ELISO. Biološko aktivnost so preverili s celicami, ki so imele odzivni element občutljiv na inteferon, kateri je povzročil prepis luciferaze. Čiščenje produkta je bilo sestavljeno iz pH redukcije in centrifugiranja ter Hi Trap BLUE kolone. Po čiščenju so dobili 15 mg citokina na 100 mL jajčnega beljaka, kar je 60 % manj kot so določili z ELISO, zagotovili pa so ≥95 % čistost (kromatografija z obrnjeno fazo, SEC-MALS). Protivirusna aktivnost je bila preverjena proti H1N1 virusu gripe A v A549 celicah. Interferon α2a iz beljaka je bil bolj učinkovit kot komercialno dostopen (iz E. Coli)<ref name="prvi"/>.
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega fuzijskega prašičjega rastnega faktorja s Fc</h3>
CSF1 (»''colony stimulating factor''«) ima ključne vloge pri diferenciaciji, proliferaciji in funkciji makrofagov, uporablja se tudi v regenerativni medicini. Prisoten je pri večini sesalskih vrst, fuzija s Fc proteinom pa poveča razpolovni čas ter njegovo učinkovitost in vivo. Zapis za fuzijski protein pCSF1-Fc je bil kloniran v pLenti6 lentivirusni vektor izpeljan iz virusa HIV. Pred njim je bil promotor EREOVA2, za njim pa optimiziran posttranskripcijski regulatorni element oPRE iz svizca (»''woodchuck''«). Postopek priprave transgenskih kokoši je bil enak kot pri prej opisani pripravi interferona. Funkcionalnost proteina so preverili s Ba/F3 celicami, ki so imele izražen receptor za CSF1. Za njihovo preživetje je bila nujna prisotnost CSF1. Tudi tukaj so z enakimi metodami kot pri interferonu uspeli zagotoviti ≥97 % čistost proteina. Pokazali so tudi, da se iz jajčnega beljaka da izolirati protein tudi, če je zamrznjen do -80 °C za obdobje 1 meseca. Njegovo biološko aktivnost so pokazali na miših, tretiranih z izoliranim pCSF1-Fc. Analizirali so jetra, vranico in kri. V primerjavi s kontrolo so se povišale F4/80<sup>+</sup> CD11b<sup>+</sup> v krvi in F4/80<sup>+</sup> makrofagi v jetrih, kar pomeni, da izolirani protein res deluje <ref name="prvi"/>.
<h2>Zaključek</h2>
V tej študiji so pokazali, da so lentivirusni vektorji učinkovita metoda priprave transgenskih kokoši s stabilnim prenosom genske spremembe na potomce, izražanje pa je omejeno le na jajcevod oz. jajčni beljak.. Težavo jim je predstavljala prenizka stopnja izražanja za komercialno uporabo metode ter tudi izolacija iz beljaka, ki sestoji iz veliko različnih beljakovin (izgube). Cena kokošjih bioreaktorjev bi lahko dosegla dvakrat nižjo ceno kot z običajnimi sesalskimi celicami, v največji meri zaradi nižjih stroškov vzdrževanja poslopja za kokoši ter odsotnosti potrebe po »dobri proizvodni praksi« dokler ne razbijemo jajca. Vsekakor pa je potrebne še veliko optimizacije ter testiranja aplikacije na ta način pripravljenih terapevtikov na ljudeh, kjer ovir zagotovo ne bo manjkalo.
<references/>

Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov

2019-03-19T17:00:51Z

Blazlebar:

Biološka zdravila so na svetovnem trgu farmacije ena izmed najbolj rastočih smeri, vendar jih ovira visoka cena proizvodnje v primerjavi z običajnimi kemijskimi zdravili. To bi lahko rešili z izboljšavo transgenskih tehnik za proizvajanje takšnih zdravil. Kokošji bioreaktorji so redko uporabljeni, predvsem zaradi težke priprave transgenskih živali v preteklosti. Z novejšimi metodami izražamo terapevtski protein v jajčnem beljaku, kar močno zniža ceno proizvodnje <ref name="prvi"> referenca ena </ref>.
<h2>Priprava bioloških zdravil</h2>
Razvoj postopka za pripravo rekombinantnega človeškega inzulina je usmeril farmacevtsko industrijo v razvoj več bioloških zdravil oz. proteinov. To so lahko protitelesa, encimi, citokini, rastni faktorji… Ta zdravila se v največjem obsegu pripravlja v bakterijah, kvasovkah, redkeje sesalskih celicah. Vsak sistem se definira s kompleksnostjo procesa, količino produkta, ustreznostjo PTM in najpomembneje, s ceno. V namen znižanja slednje, se razvijajo novi genetsko spremenjeni sistemi, ki temeljijo na živini. Pripravili so transgenske ovce, koze ter krave na takšen način, da se je terapevtski protein izločal v mleku. Kljub izjemni inovativnosti te metode, so prisotne tudi pomanjkljivosti – majhno število potomcev, dolga obdobja brejosti, zahteva po velikih življenjskih površinah in količinah hrane, težka izolacija terapevtika iz mleka (visoka vsebnost maščob) ter njegova reabsorpcija (negativne posledice za žival)<ref name="prvi"/>.

Kokošji bioreaktor bi terapevtik izločal v jajčni beljak. Ta vsebuje približno 3,5 g beljakovin v jajčnem beljaku v 60 g jajcu, vsaka kokoš pa znese letno preko 300 jajc. Cena gojenja je nizka, namnožitev transgenskih kokoši pa sorazmerno enostavna in hitra. Tudi glikozilacijski vzorec je podoben človeku, kar pomeni nizko imunogenost ter visoko biološko aktivnost terapevtika. Način priprave transgenskih kokoši so izvedli s pomočjo lentivirusov, izražanje pa omejili na jajcevod (torej le v jajčni beljak) s pomočjo zaporedij iz gena za ovalbumin. Fuzija s Fc proteinom je povečala razpolovni čas ter zvišala biološko aktivnost, prav tako omogoča izolacijo preko afinitetne kromatografije <ref name="prvi"/>.
<h2>Metode in rezultati</h2>
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega interferona α2a</h3>
Interferon α2a je citokin, ki se uporablja pri zdravljenju hepatitisa in nekaterih oblik raka. 500 bp dolg zapis je bil vstavljen v lentivirusni vektor, osnovan na EIAV (virus infektivne anemije konjev), ki se ni bil sposoben podvajati. 900 bp dolgo zaporedje ovalbuminskega promotorskega zaporedja med odzivnim elementom za estrogen in od steroidov odvisnim regulatornim elementom (EREOVA2) je povečalo izražanje in ga tudi omejilo na jajcevod (v jajčni beljak) <ref name="prvi"/>. Pripravljen vektor so injicirali v embrije iz izleženih jajc, da so pripravili G0 transgenske kokoši. G<sub>0</sub> petelin, izležen iz teh jajc je moral prestati PCR analizo za preverjanje vstavljanja gena – DNA je bila pridobljena iz semenske tekočine. Nato so ga križali z wild type kokošmi. G<sub>1</sub> potomcem so izolirali DNA iz krvi ter jo analizirali z restrikcijo in prenosom po Southernu <ref name="prvi"> referenca dva </ref>. Prisotnost interferona α2a v jajčnem beljaku so preverjali v jajcih kokoši G<sub>1</sub> in G<sub>2</sub> z western blotom, ter določili koncentracijo s komercialno dostopnim kitom za ELISO. Biološko aktivnost so preverili s celicami, ki so imele odzivni element občutljiv na inteferon, kateri je povzročil prepis luciferaze. Čiščenje produkta je bilo sestavljeno iz pH redukcije in centrifugiranja ter Hi Trap BLUE kolone. Po čiščenju so dobili 15 mg citokina na 100 mL jajčnega beljaka, kar je 60 % manj kot so določili z ELISO, zagotovili pa so ≥95 % čistost (kromatografija z obrnjeno fazo, SEC-MALS). Protivirusna aktivnost je bila preverjena proti H1N1 virusu gripe A v A549 celicah. Interferon α2a iz beljaka je bil bolj učinkovit kot komercialno dostopen (iz E. Coli)<ref name="prvi"/>.
<h3>Priprava čistega in biološko aktivnega fuzijskega prašičjega rastnega faktorja s Fc</h3>
CSF1 (»''colony stimulating factor''«) ima ključne vloge pri diferenciaciji, proliferaciji in funkciji makrofagov, uporablja se tudi v regenerativni medicini. Prisoten je pri večini sesalskih vrst, fuzija s Fc proteinom pa poveča razpolovni čas ter njegovo učinkovitost in vivo. Zapis za fuzijski protein pCSF1-Fc je bil kloniran v pLenti6 lentivirusni vektor izpeljan iz virusa HIV. Pred njim je bil promotor EREOVA2, za njim pa optimiziran posttranskripcijski regulatorni element oPRE iz svizca (»''woodchuck''«). Postopek priprave transgenskih kokoši je bil enak kot pri prej opisani pripravi interferona. Funkcionalnost proteina so preverili s Ba/F3 celicami, ki so imele izražen receptor za CSF1. Za njihovo preživetje je bila nujna prisotnost CSF1. Tudi tukaj so z enakimi metodami kot pri interferonu uspeli zagotoviti ≥97 % čistost proteina. Pokazali so tudi, da se iz jajčnega beljaka da izolirati protein tudi, če je zamrznjen do -80 °C za obdobje 1 meseca. Njegovo biološko aktivnost so pokazali na miših, tretiranih z izoliranim pCSF1-Fc. Analizirali so jetra, vranico in kri. V primerjavi s kontrolo so se povišale F4/80<sup>+</sup> CD11b<sup>+</sup> v krvi in F4/80<sup>+</sup> makrofagi v jetrih, kar pomeni, da izolirani protein res deluje <ref name="prvi"/>.
<h2>Zaključek</h2>
V tej študiji so pokazali, da so lentivirusni vektorji učinkovita metoda priprave transgenskih kokoši s stabilnim prenosom genske spremembe na potomce, izražanje pa je omejeno le na jajcevod oz. jajčni beljak.. Težavo jim je predstavljala prenizka stopnja izražanja za komercialno uporabo metode ter tudi izolacija iz beljaka, ki sestoji iz veliko različnih beljakovin (izgube). Cena kokošjih bioreaktorjev bi lahko dosegla dvakrat nižjo ceno kot z običajnimi sesalskimi celicami, v največji meri zaradi nižjih stroškov vzdrževanja poslopja za kokoši ter odsotnosti potrebe po »dobri proizvodni praksi« dokler ne razbijemo jajca. Vsekakor pa je potrebne še veliko optimizacije ter testiranja aplikacije na ta način pripravljenih terapevtikov na ljudeh, kjer ovir zagotovo ne bo manjkalo.
<references/>

Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov

2019-03-19T16:50:18Z

Blazlebar:

Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov

2019-03-19T16:50:11Z

Blazlebar:

Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov

2019-03-19T16:42:15Z

Blazlebar: New page: Biološka zdravila so na svetovnem trgu farmacije ena izmed najbolj rastočih smeri, vendar jih ovira visoka cena proizvodnje v primerjavi z običajnimi kemijskimi zdravili. To bi lahko re...

MBT seminarji 2019

2019-03-19T16:36:50Z

Blazlebar:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2018/19'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (14. marec)<br>
# Production of functional human interleukin 37 using plants (N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma; Plant Cell Rep. 38 (3), Mar. 2019; https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_funkcionalnega_%C4%8Dlove%C5%A1kega_IL37_v_rastlinah Proizvodnja funkcionalnega človeškega interlevkina 37 v rastlinah. Špela Malenšek]

'''Gensko spremenjene živali''' (21. marec)<br>
# Myopia disease mouse models: a missense point mutation (S673G) and a protein-truncating mutation of the ''Zfp644'' mimic human disease phenotype. (K. I. Szczerkowska ''et al.''; Cell Biosci. 9, 2019; https://doi.org/10.1186/s13578-019-0280-4). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mi%C5%A1ji_modeli_kratkovidnosti:_druga%C4%8Dnopomenska_to%C4%8Dkovna_mutacija_%28S673G%29_in_skraj%C5%A1evalna_mutacija_v_Zfp644_posnemata_fenotip_%C4%8Dlove%C5%A1ke_bolezni Mišji modeli kratkovidnosti: drugačnopomenska točkovna mutacija (S673G) in skrajševalna mutacija v ''Zfp644'' posnemata fenotip človeške bolezni] Rok Miklavčič
# A chicken bioreactor for efficient production of functional cytokines (Herron L.R. ''et al.''; BMC Biotechnol. 18 (1), Dec. 2018; https://doi.org/10.1186/s12896-018-0495-1).[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_kokošjega_bioreaktorja_za_učinkovito_proizvodnjo_funkcionalnih_citokinov Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov] Blaž Lebar
# Influence of a growth hormone transgene on the genetic architecture of growth-related traits: A comparative analysis between transgenic and wild-type coho salmon (M. Kodama, K. A. Naish in R. H. Devlin; Evol Appl. 11(10), 2018; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6231474/). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vpliv_transgena_rastnega_hormona_na_genetsko_arhitekturo_lastnosti_povezanimi_z_rastjo Vpliv transgena rastnega hormona na genetsko arhitekturo lastnosti povezanimi z rastjo: primerjalna analiza transgenega srebrnega lososa in srebrnega lososa divjega tipa] Nuša Kelhar

'''Okolje''' (4. april)<br>
# Eva Rajh
# Elvira Boršič
# Katja Dolenc

'''Terapevtski proteini in protitelesa''' (11. april)<br>
# Vida Štrancar
# Ana Halužan Vasle
# Nina Mavec

'''Diagnostiki in cepiva''' (18. april)<br>
# Nina Kobe
# Optimization of a multivalent peptide vaccine for nicotine addiction (D. F. Zeigler, R. Roque, C. H. Clegg; Vaccine 37(12), 2019; https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.02.003) Optimizacija multivalentnega peptidnega cepiva za nikotinsko odvisnost. Iza Oblak
# Katarina Petra van Midden

'''LMW učinkovine''' (25. april)<br>
# Valentina Novak
# David Titovšek
# Bor Klančnik

'''Male molekule in polimeri''' (9. maj)<br>
# Primož Bembič
# Karin Dobravc Škof
# Jaka Kos

'''Pretvorba biomase in bioenergenti''' (16. maj)<br>
# Maksimiljan Adamek
# Aljoša Marinko
# Jošt Hočevar

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (23. maj)<br>
# Nives Ražnjević
# Katja Kunčič
# Peter Pečan

'''Rezervni termin''' (30. maj)<br>
# Mia Žganjar
# Ana Müller

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

MBT seminarji 2019

2019-03-19T16:36:03Z

Blazlebar:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2018/19'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (14. marec)<br>
# Production of functional human interleukin 37 using plants (N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma; Plant Cell Rep. 38 (3), Mar. 2019; https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_funkcionalnega_%C4%8Dlove%C5%A1kega_IL37_v_rastlinah Proizvodnja funkcionalnega človeškega interlevkina 37 v rastlinah. Špela Malenšek]

'''Gensko spremenjene živali''' (21. marec)<br>
# Myopia disease mouse models: a missense point mutation (S673G) and a protein-truncating mutation of the ''Zfp644'' mimic human disease phenotype. (K. I. Szczerkowska ''et al.''; Cell Biosci. 9, 2019; https://doi.org/10.1186/s13578-019-0280-4). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mi%C5%A1ji_modeli_kratkovidnosti:_druga%C4%8Dnopomenska_to%C4%8Dkovna_mutacija_%28S673G%29_in_skraj%C5%A1evalna_mutacija_v_Zfp644_posnemata_fenotip_%C4%8Dlove%C5%A1ke_bolezni Mišji modeli kratkovidnosti: drugačnopomenska točkovna mutacija (S673G) in skrajševalna mutacija v ''Zfp644'' posnemata fenotip človeške bolezni] Rok Miklavčič
# A chicken bioreactor for efficient production of functional cytokines (Herron L.R. "et al."; BMC Biotechnol. 18 (1), Dec. 2018; https://doi.org/10.1186/s12896-018-0495-1).[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_kokošjega_bioreaktorja_za_učinkovito_proizvodnjo_funkcionalnih_citokinov Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov] Blaž Lebar
# Influence of a growth hormone transgene on the genetic architecture of growth-related traits: A comparative analysis between transgenic and wild-type coho salmon (M. Kodama, K. A. Naish in R. H. Devlin; Evol Appl. 11(10), 2018; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6231474/). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vpliv_transgena_rastnega_hormona_na_genetsko_arhitekturo_lastnosti_povezanimi_z_rastjo Vpliv transgena rastnega hormona na genetsko arhitekturo lastnosti povezanimi z rastjo: primerjalna analiza transgenega srebrnega lososa in srebrnega lososa divjega tipa] Nuša Kelhar

'''Okolje''' (4. april)<br>
# Eva Rajh
# Elvira Boršič
# Katja Dolenc

'''Terapevtski proteini in protitelesa''' (11. april)<br>
# Vida Štrancar
# Ana Halužan Vasle
# Nina Mavec

'''Diagnostiki in cepiva''' (18. april)<br>
# Nina Kobe
# Optimization of a multivalent peptide vaccine for nicotine addiction (D. F. Zeigler, R. Roque, C. H. Clegg; Vaccine 37(12), 2019; https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.02.003) Optimizacija multivalentnega peptidnega cepiva za nikotinsko odvisnost. Iza Oblak
# Katarina Petra van Midden

'''LMW učinkovine''' (25. april)<br>
# Valentina Novak
# David Titovšek
# Bor Klančnik

'''Male molekule in polimeri''' (9. maj)<br>
# Primož Bembič
# Karin Dobravc Škof
# Jaka Kos

'''Pretvorba biomase in bioenergenti''' (16. maj)<br>
# Maksimiljan Adamek
# Aljoša Marinko
# Jošt Hočevar

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (23. maj)<br>
# Nives Ražnjević
# Katja Kunčič
# Peter Pečan

'''Rezervni termin''' (30. maj)<br>
# Mia Žganjar
# Ana Müller

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

MBT seminarji 2019

2019-03-19T16:32:17Z

Blazlebar:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2018/19'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (14. marec)<br>
# Production of functional human interleukin 37 using plants (N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma; Plant Cell Rep. 38 (3), Mar. 2019; https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_funkcionalnega_%C4%8Dlove%C5%A1kega_IL37_v_rastlinah Proizvodnja funkcionalnega človeškega interlevkina 37 v rastlinah. Špela Malenšek]

'''Gensko spremenjene živali''' (21. marec)<br>
# Myopia disease mouse models: a missense point mutation (S673G) and a protein-truncating mutation of the ''Zfp644'' mimic human disease phenotype. (K. I. Szczerkowska ''et al.''; Cell Biosci. 9, 2019; https://doi.org/10.1186/s13578-019-0280-4). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mi%C5%A1ji_modeli_kratkovidnosti:_druga%C4%8Dnopomenska_to%C4%8Dkovna_mutacija_%28S673G%29_in_skraj%C5%A1evalna_mutacija_v_Zfp644_posnemata_fenotip_%C4%8Dlove%C5%A1ke_bolezni Mišji modeli kratkovidnosti: drugačnopomenska točkovna mutacija (S673G) in skrajševalna mutacija v ''Zfp644'' posnemata fenotip človeške bolezni] Rok Miklavčič
# Blaž Lebar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_kokošjega_bioreaktorja_za_učinkovito_proizvodnjo_funkcionalnih_citokinov Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov]
# Influence of a growth hormone transgene on the genetic architecture of growth-related traits: A comparative analysis between transgenic and wild-type coho salmon (M. Kodama, K. A. Naish in R. H. Devlin; Evol Appl. 11(10), 2018; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6231474/). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vpliv_transgena_rastnega_hormona_na_genetsko_arhitekturo_lastnosti_povezanimi_z_rastjo Vpliv transgena rastnega hormona na genetsko arhitekturo lastnosti povezanimi z rastjo: primerjalna analiza transgenega srebrnega lososa in srebrnega lososa divjega tipa] Nuša Kelhar

'''Okolje''' (4. april)<br>
# Eva Rajh
# Elvira Boršič
# Katja Dolenc

'''Terapevtski proteini in protitelesa''' (11. april)<br>
# Vida Štrancar
# Ana Halužan Vasle
# Nina Mavec

'''Diagnostiki in cepiva''' (18. april)<br>
# Nina Kobe
# Optimization of a multivalent peptide vaccine for nicotine addiction (D. F. Zeigler, R. Roque, C. H. Clegg; Vaccine 37(12), 2019; https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.02.003) Optimizacija multivalentnega peptidnega cepiva za nikotinsko odvisnost. Iza Oblak
# Katarina Petra van Midden

'''LMW učinkovine''' (25. april)<br>
# Valentina Novak
# David Titovšek
# Bor Klančnik

'''Male molekule in polimeri''' (9. maj)<br>
# Primož Bembič
# Karin Dobravc Škof
# Jaka Kos

'''Pretvorba biomase in bioenergenti''' (16. maj)<br>
# Maksimiljan Adamek
# Aljoša Marinko
# Jošt Hočevar

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (23. maj)<br>
# Nives Ražnjević
# Katja Kunčič
# Peter Pečan

'''Rezervni termin''' (30. maj)<br>
# Mia Žganjar
# Ana Müller

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

MBT seminarji 2019

2019-03-19T16:29:39Z

Blazlebar:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2018/19'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (14. marec)<br>
# Production of functional human interleukin 37 using plants (N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma; Plant Cell Rep. 38 (3), Mar. 2019; https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_funkcionalnega_%C4%8Dlove%C5%A1kega_IL37_v_rastlinah Proizvodnja funkcionalnega človeškega interlevkina 37 v rastlinah. Špela Malenšek]

'''Gensko spremenjene živali''' (21. marec)<br>
# Myopia disease mouse models: a missense point mutation (S673G) and a protein-truncating mutation of the ''Zfp644'' mimic human disease phenotype. (K. I. Szczerkowska ''et al.''; Cell Biosci. 9, 2019; https://doi.org/10.1186/s13578-019-0280-4). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mi%C5%A1ji_modeli_kratkovidnosti:_druga%C4%8Dnopomenska_to%C4%8Dkovna_mutacija_%28S673G%29_in_skraj%C5%A1evalna_mutacija_v_Zfp644_posnemata_fenotip_%C4%8Dlove%C5%A1ke_bolezni Mišji modeli kratkovidnosti: drugačnopomenska točkovna mutacija (S673G) in skrajševalna mutacija v ''Zfp644'' posnemata fenotip človeške bolezni] Rok Miklavčič
# Blaž Lebar
# Influence of a growth hormone transgene on the genetic architecture of growth-related traits: A comparative analysis between transgenic and wild-type coho salmon (M. Kodama, K. A. Naish in R. H. Devlin; Evol Appl. 11(10), 2018; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6231474/). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vpliv_transgena_rastnega_hormona_na_genetsko_arhitekturo_lastnosti_povezanimi_z_rastjo Vpliv transgena rastnega hormona na genetsko arhitekturo lastnosti povezanimi z rastjo: primerjalna analiza transgenega srebrnega lososa in srebrnega lososa divjega tipa] Nuša Kelhar

'''Okolje''' (4. april)<br>
# Eva Rajh
# Elvira Boršič
# Katja Dolenc

'''Terapevtski proteini in protitelesa''' (11. april)<br>
# Vida Štrancar
# Ana Halužan Vasle
# Nina Mavec

'''Diagnostiki in cepiva''' (18. april)<br>
# Nina Kobe
# Optimization of a multivalent peptide vaccine for nicotine addiction (D. F. Zeigler, R. Roque, C. H. Clegg; Vaccine 37(12), 2019; https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.02.003) Optimizacija multivalentnega peptidnega cepiva za nikotinsko odvisnost. Iza Oblak
# Katarina Petra van Midden

'''LMW učinkovine''' (25. april)<br>
# Valentina Novak
# David Titovšek
# Bor Klančnik

'''Male molekule in polimeri''' (9. maj)<br>
# Primož Bembič
# Karin Dobravc Škof
# Jaka Kos

'''Pretvorba biomase in bioenergenti''' (16. maj)<br>
# Maksimiljan Adamek
# Aljoša Marinko
# Jošt Hočevar

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (23. maj)<br>
# Nives Ražnjević
# Katja Kunčič
# Peter Pečan

'''Rezervni termin''' (30. maj)<br>
# Mia Žganjar
# Ana Müller

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

MBT seminarji 2019

2019-03-19T16:29:23Z

Blazlebar:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2018/19'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (14. marec)<br>
# Production of functional human interleukin 37 using plants (N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma; Plant Cell Rep. 38 (3), Mar. 2019; https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_funkcionalnega_%C4%8Dlove%C5%A1kega_IL37_v_rastlinah Proizvodnja funkcionalnega človeškega interlevkina 37 v rastlinah. Špela Malenšek]

'''Gensko spremenjene živali''' (21. marec)<br>
# Myopia disease mouse models: a missense point mutation (S673G) and a protein-truncating mutation of the ''Zfp644'' mimic human disease phenotype. (K. I. Szczerkowska ''et al.''; Cell Biosci. 9, 2019; https://doi.org/10.1186/s13578-019-0280-4). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mi%C5%A1ji_modeli_kratkovidnosti:_druga%C4%8Dnopomenska_to%C4%8Dkovna_mutacija_%28S673G%29_in_skraj%C5%A1evalna_mutacija_v_Zfp644_posnemata_fenotip_%C4%8Dlove%C5%A1ke_bolezni Mišji modeli kratkovidnosti: drugačnopomenska točkovna mutacija (S673G) in skrajševalna mutacija v ''Zfp644'' posnemata fenotip človeške bolezni] Rok Miklavčič
# Blaž Lebar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mi%C5%A1ji_modeli_kratkovidnosti:_druga%C4%8Dnopomenska_to%C4%8Dkovna_mutacija_%28S673G%29_in_skraj%C5%A1evalna_mutacija_v_Zfp644_posnemata_fenotip_%C4%8Dlove%C5%A1ke_bolezni]
# Influence of a growth hormone transgene on the genetic architecture of growth-related traits: A comparative analysis between transgenic and wild-type coho salmon (M. Kodama, K. A. Naish in R. H. Devlin; Evol Appl. 11(10), 2018; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6231474/). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vpliv_transgena_rastnega_hormona_na_genetsko_arhitekturo_lastnosti_povezanimi_z_rastjo Vpliv transgena rastnega hormona na genetsko arhitekturo lastnosti povezanimi z rastjo: primerjalna analiza transgenega srebrnega lososa in srebrnega lososa divjega tipa] Nuša Kelhar

'''Okolje''' (4. april)<br>
# Eva Rajh
# Elvira Boršič
# Katja Dolenc

'''Terapevtski proteini in protitelesa''' (11. april)<br>
# Vida Štrancar
# Ana Halužan Vasle
# Nina Mavec

'''Diagnostiki in cepiva''' (18. april)<br>
# Nina Kobe
# Optimization of a multivalent peptide vaccine for nicotine addiction (D. F. Zeigler, R. Roque, C. H. Clegg; Vaccine 37(12), 2019; https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.02.003) Optimizacija multivalentnega peptidnega cepiva za nikotinsko odvisnost. Iza Oblak
# Katarina Petra van Midden

'''LMW učinkovine''' (25. april)<br>
# Valentina Novak
# David Titovšek
# Bor Klančnik

'''Male molekule in polimeri''' (9. maj)<br>
# Primož Bembič
# Karin Dobravc Škof
# Jaka Kos

'''Pretvorba biomase in bioenergenti''' (16. maj)<br>
# Maksimiljan Adamek
# Aljoša Marinko
# Jošt Hočevar

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (23. maj)<br>
# Nives Ražnjević
# Katja Kunčič
# Peter Pečan

'''Rezervni termin''' (30. maj)<br>
# Mia Žganjar
# Ana Müller

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

MBT seminarji 2019

2019-03-01T21:14:07Z

Blazlebar:

Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

2019-01-16T23:02:10Z

Blazlebar:

== '''Uvod''' ==
S pomočjo umetnega proteinskega konstrukta, ki lahko funkcijsko nadomesti naravno prisoten protein v celici, lahko zelo natančno določimo sestavo slednjega. V tem primeru je bila na ta način razkrita povezava med mitohondrijem in endoplazemskim retikulumom.

== '''Sodelovanje med organeli''' ==
Evkariontske celice so tekom evolucije preko kompartmentalizacije razdelile funkcije na posamezne organele. To je po eni strani zelo učinkovito zaradi prilagojenega kemijskega okolja, vendar je prav tako med temi organeli nujna komunikacija in izmenjava raznovrstnih molekul. Kot primer, fosfolipidi so sintetizirani v endoplazemskem retikulumu, ki se nato razvaža po celici s pomočjo vezikularnega transporta, v katerega pa mitohondrij ni vključen <ref name="prvi"> Kornmann, Benoît et al. “An ER-mitochondria tethering complex revealed by a synthetic biology screen” Science (New York, N.Y.) vol. 325,5939 (2009): 477-81 </ref>.

Študije so pokazale, da transport prej omenjenih fosfolipidov in prav tako kalcijevih ionov med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem poteka na točkah, kjer prihaja do stika med dvema organeloma. Ti »stiki« bi lahko bili ključni za nadzor citosolne in mitohondrijske koncentracije kalcijevih ionov. Z njimi povezujejo tudi proteini IP3 receptor (Ca<sup>2+</sup> kanalček), VDAC (mitohondrijski od napetosti odvisen anionski kanalček), šaperona grp75 in σ1R, sortirni protein PACS-2 in mitofuzin Mfn2 <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Chimera''' ==
V tej raziskavi so uporabljali sev ''Saccharomyces cerevisiae''. Ideja je bila, da bi vzeli mutante tega seva, ki imajo okvarjeno povezavo med organeloma, kar bi povzročilo opazne posledice v celici, vendar bi jih lahko preprečili z uporabo umetnega proteina, ki bi nadomestil njegovo funkcijo. Ustvarili so umetni protein, ki so ga poimenovali ChiMERA – »construct for helping in mitochondria-ER associaton« oz. konstrukt, za pomoč povezovanja mitohondrija in ER. Sestavljen je bil iz N-končne mitohondrijske signalne sekvence, transmembranske domene izpeljane iz protein Tom70, centralnega modula iz GFP proteina in C-končnega ER repnega sidra izpeljanega iz Ubc6 <ref name="prvi"> </ref>.

Mitohondrij lahko zavzema sferično obliko podobno fižolu, ali pa razvejano tubularno omrežje. V primeru ''S. cerevisiae'' je mitohondrij v celicah divjega tipa (wt) razvejan v bližini membrane. Takšna oblika se vzdržuje s pomočjo fizije in fuzije, ki se dogaja na približno vsaki dve minuti <ref name="drugi"> Shaw, Janet M and Jodi Nunnari. “Mitochondrial dynamics and division in budding yeast” Trends in cell biology vol. 12,4 (2002): 178-84 </ref>. V tej raziskavi so sevi z mutiranimi in okvarjenimi geni, ki sodelujejo v povezavi ER-mitohondrij, izgubili takšno obliko.

Konstrukt ChiMERA se je v največji meri lokaliziral na membrano ER in je označil tako periferni kot perinuklearni ER, mitohondrij pa je označil le na mestih kontakta z ER. Sevi divjega tipa so brez izražanja ChiMERE imeli mitohondrij prej opisane tubularne mreže, izražanje konstrukta pa je dodalo nekaj točkastih struktur na mestih kontakta z ER. S tem so pokazali, da umetni povezovalec izvaja želeno funkcijo. Močnejšo afiniteto konstrukta do ER so razložili z večjo dominanco vezavnega zaporedja za ER v primerjavi z vezavnim zaporedjem za mitohondrij v konstruktu <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Identifikacija povezave ER-mitohondrij''' ==
Za izražanje konstrukta je bil uporabljen kvasovkin centromerni plazmid. Približno 100 000 kolonij je bilo tretiranih s etilmetansulfonatom (EMS) za mutacijo, izmed nastalih mutant pa so dobili dve, ki nista mogli rasti brez prisotnosti plazmida. S pomočjo genske komplementacije so ugotovili, da sta obe mutaciji prisotni na genu ''MDM12''. Mdm12 je periferni protein zunanje mitohondrijske membrane, ki se ga da izolirati v kompleksu z Mmm1 in Mdm10. Lokalizira se v točkastih strukturah na mitohondrijskem omrežju še skupaj s četrtim proteinom, Mdm34. Vsi štirje proteini so nujni za aerobno rast in ohranjanje pravilne tubularne strukture mitohondrija <ref name="prvi"> </ref>.

V naslednji fazi so preverili v kolikšni meri izražanje ChiMERE kompenzira okvaro povzročeno z delecijo vsakega posameznega gena – ''MMM1, MDM10, MDM12 in MDM34''. Na YP ploščah, ki omogočajo fermentacijo, je razlika v uspešnosti rasti slabo opazna, medtem ko je rast na respiracijskih ploščah YPEG vidno uspešnejša ob prisotnosti umetnega konstrukta pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ . S pomočjo umetnega konstrukta jim je prav tako uspelo rešiti tubularno strukturo mitohondrija pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ, kar se ujema s prejšnjimi rezultati aerobne rasti. Novoidentificirani kompleks Mmm1/Mdm10/Mdm12/Mdm34 so poimenovali ERMES. Predvidevali so, da nekatere komponente ERMES-a pripadajo ER, nekatere pa mitohondriju. Mutacija v katerikoli komponenti je usodna za stik. Kadar se stik prekine, te ostanejo zasidrane v matični organel <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Študije kompleksa ERMES''' ==
Najprej so zamenjali gen za vsako komponento ERMES-a z genom za fuzijski protein z GFP. Tako so imeli seve ''MMM1-GFP, MDM12-GFP, MDM34-GFP in MDM10-GFP''. Nato so s fluorescenčno mikroskopijo opazovali WT in mutirane seve, kjer so mutirali vsako komponento ERMES-a posebej tako, da ni bila več funkcionalna.

*Vsi WT izhodni štirje sevi z zapisi za fuzijski protein so izkazovali točkaste strukture (sklepali na stike ER-mitohondrij), razen Mdm10-GFP, kjer so signali bili bolj široki (Mdm10 je sestavni del SAM kompleksa v OMM, ima še druge funkcije).
*Sevi z mutiranim ''MDM34'' ali ''MDM10'' so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na mitohondrij.
*Sevi z mutiranim ''MMM1'' so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na endoplazemski retikulum.
*Sevi z mutiranim ''MDM12'' so izgubili ERMES stike, v primeru mutacije/okvare gena ''MMM1'' se Mdm12-GFP lokalizira na mitohondrij, ob mutaciji/okvari ''MDM10'' in ''MDM34'' pa na ER.

V skladu s temi rezultati so postavili model kompleksa ERMES: Mdm34 in Mdm10 sta vezana v membrano mitohondrija, Mmm1 na membrano ER, protein Mdm12 pa je vezan na Mdm34 in Mmm1 in ni lokaliziran v nobeni membrani <ref name="prvi"> </ref>.

Njihov model je torej predpostavljal, da je protein Mmm1 vstavljen v membrano ER, medtem ko so dosedaj menili, da je sestavni del mitohondrijske notranje ali zunanje membrane. Ker se to ne ujema, so se odločili natančneje preveriti tudi to.

# test: Veliko integralnih ER proteinov je N-glikoziliranih na lumenski domeni in štiri potencialna mesta za glikozilacijo se nahajajo tudi na N-koncu pred transmembransko domeno. Da bi preverili, če so ta mest res glikozilirana, so gen za Mmm1 zamenjali z zapisom za fuzijski protein s HA (hemaglutinin). Nato so imeli tri vzorce – prvi je bil celični lizat tretiran z EndoHF (odstrani N-vezane glikane), drugi lizat ni bil tretiran z EndoHF, tretji pa je bil lizata seva z WT zapisom za Mmm1 (kontrola). Izvedli so NaSD-PAGE ter western prenos s protitelesi proti hemaglutininu. Lizat, tretiran z EndoHF je pripotoval dlje, kar pomeni, da je protein res glikoziliran in potemtakem integralni ER membranski protein <ref name="prvi"> </ref>.
# test: v celico so vnesli konstrukt, ki izraža protein Mmm1, fuziran s HA in cepitvenim mestom za TEV proteazo. Prav tako so vnesli zapis, za TEV proteazo s signalnim petidom za ER (Kar2) ali pa mitohondrij (Su9). Celične lizate so nanesli na NaDS-PAGE, izvedli western prenos s anti-HA protitelesi, in dobili dve lisi v sistemu, ki je izražal Kar2-TEV proteazo. To pomeni, da se protein Mmm1 res nahaja na ER <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Vloge kompleksa ERMES v celici''' ==
Genetske študije so pokazale, da so sestavni deli ERMES-a močno korelirani s še dvema proteinoma – Gem1 in Psd1. Prvi je kalcij-vezavna GTPaza iz družine rho, ki sodeluje pri preoblikovanju mitohondrija in njegovem pravilnem dedovanju, drugi pa fosfatidilserin dekarboksilaza, ki sodeluje pri de novo biosintezi aminoglicerofosfolipidov. Ta korelacija potrjuje, da je ERMES pomemben za medorganelno izmenjavo kalcija in fosfolipidov <ref name="prvi"> </ref>.

Najprej so preverili vsebnost fosfolipidov v mitohondriju pri celicah, z okvarjenim ERMES kompleksom (izbrali so mdm12Δ sev). Vrednosti vseh fosfolipidnih razredov so bile primerljive z WT razen kardiolipin (CL). CL je fosfolipid specifičen za mitohondrij, nujen za respiracijo in ga je bilo pri mutiranih celicah (mdm12Δ, psd1Δ) opazno manj. Celice, ki so imele okvarjen kompleks ERMES ali pa gen ''PSD1'' in hkrati deletiran gen ''CRD1'', ki kodira za CL sintazo, niso bile sposobne preživeti (sintezno smrtna delecija) <ref name="prvi"> </ref>.

Ker so bile vrednosti ostalih fosfolipidov v mutiranih sevih primerljive s sevom divjega tipa, sklepajo, da so v celici kompenzacijski mehanizmi, ki zmanjšajo vpliv okvare ERMES-a. To so preverili na pretvorbi fosfatidilserina (PS) v fosfatidilholin (PC) s pomočjo metode s pulznim označevanjem. Je metoda, ki se uporablja za spremljanje celičnih procesov skozi čas s pomočjo označene snovi (pulza) in nato iste neoznačene snovi (lovljenje). Celico se najprej izpostavi označeni snovi, kjer je najpogosteje radioaktivno označen atom ene molekule (<sup>35</sup>S, <sup>14</sup>C, <sup>3</sup>H…). Ta molekula gre nato skozi metabolne poti v celici, nato pa se celico izpostavi presežeku neoznačene molekule. Pomemben je čas izpostavljenosti posamezni molekuli. Vzorce se nato pregleda na kvantitativnih metodah <ref name="tretji"> Simon E., Kornitzer D. »Pulse-Chase Analysis to Measure Protein Degradation« Methods in Enzymology, vol. 636, (2014): 65-75 </ref>.

Tukaj so izvedli <sup>14</sup>C-serin pulzno označevanje. Najprej so jih izpostavili radioaktivno označenemu serinu dve uri, nato pa neoznačenemu serinu. Po različnih časih so odvzeli alikvote, iz njih izolirali fosfolipide in jih kvantitativno analizirali s tankoplastno kromatografijo. Takšen poskus so izvedli na psd2Δ ozadju, kjer je gen ''PSD2'' deletiran. Naravno je prisoten v vakuoli in bi lahko vplival na rezultate. WT sev je pretvarjal PS v PC uspešno, mutanta psd1Δ psd2Δ ni izvajala te funkcije, mutante z okvarami v sestavnih delih ERMES-a pa so izvajale to funkcijo dva- do petkrat manj. S tem so potrdili, da okvara v ERMES-u ovira izmenjavo fosfolipidov med ER in mitohondrijem. Pri mutantah mdm12Δ in mdm34Δ je izražanje ChiMERE v močno obnovilo pretvorbo PS v PC <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Zaključek''' ==
V tej raziskavi so uspešno identificirali sestavne dele povezovalnega kompleksa med ER in mitohondrijem s pomočjo umetnega konstrukta, ki je posnemal njegovo funkcijo. Pokazali so, da je ta kompleks odgovoren za transport fosfolipidov, njegova okvara pa močno ovira rast celice. V celici je verjetno takšnih povezav med organeli več, katere bi se dalo na podoben princip identificirati in s tem prispevati k razumevanju fiziologije celic.

<references/>

Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

2019-01-16T20:32:06Z

Blazlebar:

== '''Uvod''' ==
S pomočjo umetnega proteinskega konstrukta, ki lahko funkcijsko nadomesti naravno prisoten protein v celici, lahko zelo natančno določimo sestavo slednjega. V tem primeru je bila na ta način razkrita povezava med mitohondrijem in endoplazemskim retikulumom.

== '''Sodelovanje med organeli''' ==
Evkariontske celice so tekom evolucije preko kompartmentalizacije razdelile funkcije na posamezne organele. To je po eni strani zelo učinkovito zaradi prilagojenega kemijskega okolja, vendar je prav tako med temi organeli nujna komunikacija in izmenjava raznovrstnih molekul. Kot primer, fosfolipidi so sintetizirani v endoplazemskem retikulumu, ki se nato razvaža po celici s pomočjo vezikularnega transporta, v katerega pa mitohondrij ni vključen <ref name="prvi"> Kornmann, Benoît et al. “An ER-mitochondria tethering complex revealed by a synthetic biology screen” Science (New York, N.Y.) vol. 325,5939 (2009): 477-81 </ref>.

Študije so pokazale, da transport prej omenjenih fosfolipidov in prav tako kalcijevih ionov med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem poteka na točkah, kjer prihaja do stika med dvema organeloma. Ti »stiki« bi lahko bili ključni za nadzor citosolne in mitohondrijske koncentracije kalcijevih ionov. Z njimi povezujejo tudi proteini IP3 receptor (Ca<sup>2+</sup> kanalček), VDAC (mitohondrijski od napetosti odvisen anionski kanalček), šaperona grp75 in σ1R, sortirni protein PACS-2 in mitofuzin Mfn2 <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Chimera''' ==
V tej raziskavi so uporabljali sev ''Saccharomyces cerevisiae''. Ideja je bila, da bi vzeli mutante tega seva, ki imajo okvarjeno povezavo med organeloma, kar bi povzročilo opazne posledice v celici, vendar bi jih lahko preprečili z uporabo umetnega proteina, ki bi nadomestil njegovo funkcijo. Ustvarili so umetni protein, ki so ga poimenovali ChiMERA – »construct for helping in mitochondria-ER associaton« oz. konstrukt, za pomoč povezovanja mitohondrija in ER. Sestavljen je bil iz N-končne mitohondrijske signalne sekvence, transmembranske domene izpeljane iz protein Tom70, centralnega modula iz GFP proteina in C-končnega ER repnega sidra izpeljanega iz Ubc6 <ref name="prvi"> </ref>.

Mitohondrij lahko zavzema sferično obliko podobno fižolu, ali pa razvejano tubularno omrežje. V primeru ''S. cerevisiae'' je mitohondrij v celicah divjega tipa (wt) razvejan v bližini membrane. Takšna oblika se vzdržuje s pomočjo fizije in fuzije, ki se dogaja na približno vsaki dve minuti <ref name="drugi"> Shaw, Janet M and Jodi Nunnari. “Mitochondrial dynamics and division in budding yeast” Trends in cell biology vol. 12,4 (2002): 178-84 </ref>. V tej raziskavi so sevi z mutiranimi in okvarjenimi geni, ki sodelujejo v povezavi ER-mitohondrij, izgubili takšno obliko.

Konstrukt ChiMERA se je v največji meri lokaliziral na membrano ER in je označil tako periferni kot perinuklearni ER, mitohondrij pa je označil le na mestih kontakta z ER. Sevi divjega tipa so brez izražanja ChiMERE imeli mitohondrij prej opisane tubularne mreže, izražanje konstrukta pa je dodalo nekaj točkastih struktur na mestih kontakta z ER. S tem so pokazali, da umetni povezovalec izvaja želeno funkcijo. Močnejšo afiniteto konstrukta do ER so razložili z večjo dominanco vezavnega zaporedja za ER v primerjavi z vezavnim zaporedjem za mitohondrij v konstruktu <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Identifikacija povezave ER-mitohondrij''' ==
Za izražanje konstrukta je bil uporabljen kvasovkin centromerni plazmid. Približno 100 000 kolonij je bilo tretiranih s etilmetansulfonatom (EMS) za mutacijo, izmed nastalih mutant pa so dobili dve, ki nista mogli rasti brez prisotnosti plazmida. S pomočjo genske komplementacije so ugotovili, da sta obe mutaciji prisotni na genu ''MDM12''. Mdm12 je periferni protein zunanje mitohondrijske membrane, ki se ga da izolirati v kompleksu z Mmm1 in Mdm10. Lokalizira se v točkastih strukturah na mitohondrijskem omrežju še skupaj s četrtim proteinom, Mdm34. Vsi štirje proteini so nujni za aerobno rast in ohranjanje pravilne tubularne strukture mitohondrija <ref name="prvi"> </ref>.

V naslednji fazi so preverili v kolikšni meri izražanje ChiMERE kompenzira okvaro povzročeno z delecijo vsakega posameznega gena – ''MMM1, MDM10, MDM12 in MDM34''. Na YP ploščah, ki omogočajo fermentacijo, je razlika v uspešnosti rasti slabo opazna, medtem ko je rast na respiracijskih ploščah YPEG vidno uspešnejša ob prisotnosti umetnega konstrukta pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ . S pomočjo umetnega konstrukta jim je prav tako uspelo rešiti tubularno strukturo mitohondrija pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ, kar se ujema s prejšnjimi rezultati aerobne rasti. Novoidentificirani kompleks Mmm1/Mdm10/Mdm12/Mdm34 so poimenovali ERMES. Predvidevali so, da nekatere komponente ERMES-a pripadajo ER, nekatere pa mitohondriju. Mutacija v katerikoli komponenti je usodna za stik. Kadar se stik prekine, te ostanejo zasidrane v matični organel <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Študije kompleksa ERMES''' ==
Najprej so zamenjali gen za vsako komponento ERMES-a z genom za fuzijski protein z GFP. Tako so imeli seve ''MMM1-GFP, MDM12-GFP, MDM34-GFP in MDM10-GFP''. Nato so s fluorescenčno mikroskopijo opazovali WT in mutirane seve, kjer so mutirali vsako komponento ERMES-a posebej tako, da ni bila več funkcionalna.

*Vsi WT izhodni štirje sevi z zapisi za fuzijski protein so izkazovali točkaste strukture (sklepali na stike ER-mitohondrij), razen Mdm10-GFP, kjer so signali bili bolj široki (Mdm10 je sestavni del SAM kompleksa v OMM, ima še druge funkcije).
*Sevi z mutiranim ''MDM34'' ali ''MDM10'' so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na mitohondrij.
*Sevi z mutiranim ''MDM1'' so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na endoplazemski retikulum.
*Sevi z mutiranim ''MDM12'' so izgubili ERMES stike, v primeru mutacije/okvare gena ''MMM1'' se Mdm12-GFP lokalizira na mitohondrij, ob mutaciji/okvari ''MDM10'' in ''MDM34'' pa na ER.

V skladu s temi rezultati so postavili model kompleksa ERMES: Mdm34 in Mdm10 sta vezana v membrano mitohondrija, Mmm1 na membrano ER, protein Mdm12 pa je vezan na Mdm34 in Mmm1 in ni lokaliziran v nobeni membrani <ref name="prvi"> </ref>.

Njihov model je torej predpostavljal, da je protein Mmm1 vstavljen v membrano ER, medtem ko so dosedaj menili, da je sestavni del mitohondrijske notranje ali zunanje membrane. Ker se to ne ujema, so se odločili natančneje preveriti tudi to.

# test: Veliko integralnih ER proteinov je N-glikoziliranih na lumenski domeni in štiri potencialna mesta za glikozilacijo se nahajajo tudi na N-koncu pred transmembransko domeno. Da bi preverili, če so ta mest res glikozilirana, so gen za Mmm1 zamenjali z zapisom za fuzijski protein s HA (hemaglutinin). Nato so imeli tri vzorce – prvi je bil celični lizat tretiran z EndoHF (odstrani N-vezane glikane), drugi lizat ni bil tretiran z EndoHF, tretji pa je bil lizata seva z WT zapisom za Mmm1 (kontrola). Izvedli so NaSD-PAGE ter western prenos s protitelesi proti hemaglutininu. Lizat, tretiran z EndoHF je pripotoval dlje, kar pomeni, da je protein res glikoziliran in potemtakem integralni ER membranski protein <ref name="prvi"> </ref>.
# test: v celico so vnesli konstrukt, ki izraža protein Mmm1, fuziran s HA in cepitvenim mestom za TEV proteazo. Prav tako so vnesli zapis, za TEV proteazo s signalnim petidom za ER (Kar2) ali pa mitohondrij (Su9). Celične lizate so nanesli na NaDS-PAGE, izvedli western prenos s anti-HA protitelesi, in dobili dve lisi v sistemu, ki je izražal Kar2-TEV proteazo. To pomeni, da se protein Mmm1 res nahaja na ER <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Vloge kompleksa ERMES v celici''' ==
Genetske študije so pokazale, da so sestavni deli ERMES-a močno korelirani s še dvema proteinoma – Gem1 in Psd1. Prvi je kalcij-vezavna GTPaza iz družine rho, ki sodeluje pri preoblikovanju mitohondrija in njegovem pravilnem dedovanju, drugi pa fosfatidilserin dekarboksilaza, ki sodeluje pri de novo biosintezi aminoglicerofosfolipidov. Ta korelacija potrjuje, da je ERMES pomemben za medorganelno izmenjavo kalcija in fosfolipidov <ref name="prvi"> </ref>.

Najprej so preverili vsebnost fosfolipidov v mitohondriju pri celicah, z okvarjenim ERMES kompleksom (izbrali so mdm12Δ sev). Vrednosti vseh fosfolipidnih razredov so bile primerljive z WT razen kardiolipin (CL). CL je fosfolipid specifičen za mitohondrij, nujen za respiracijo in ga je bilo pri mutiranih celicah (mdm12Δ, psd1Δ) opazno manj. Celice, ki so imele okvarjen kompleks ERMES ali pa gen ''PSD1'' in hkrati deletiran gen ''CRD1'', ki kodira za CL sintazo, niso bile sposobne preživeti (sintezno smrtna delecija) <ref name="prvi"> </ref>.

Ker so bile vrednosti ostalih fosfolipidov v mutiranih sevih primerljive s sevom divjega tipa, sklepajo, da so v celici kompenzacijski mehanizmi, ki zmanjšajo vpliv okvare ERMES-a. To so preverili na pretvorbi fosfatidilserina (PS) v fosfatidilholin (PC) s pomočjo metode s pulznim označevanjem. Je metoda, ki se uporablja za spremljanje celičnih procesov skozi čas s pomočjo označene snovi (pulza) in nato iste neoznačene snovi (lovljenje). Celico se najprej izpostavi označeni snovi, kjer je najpogosteje radioaktivno označen atom ene molekule (<sup>35</sup>S, <sup>14</sup>C, <sup>3</sup>H…). Ta molekula gre nato skozi metabolne poti v celici, nato pa se celico izpostavi presežeku neoznačene molekule. Pomemben je čas izpostavljenosti posamezni molekuli. Vzorce se nato pregleda na kvantitativnih metodah <ref name="tretji"> Simon E., Kornitzer D. »Pulse-Chase Analysis to Measure Protein Degradation« Methods in Enzymology, vol. 636, (2014): 65-75 </ref>.

Tukaj so izvedli <sup>14</sup>C-serin pulzno označevanje. Najprej so jih izpostavili radioaktivno označenemu serinu dve uri, nato pa neoznačenemu serinu. Po različnih časih so odvzeli alikvote, iz njih izolirali fosfolipide in jih kvantitativno analizirali s tankoplastno kromatografijo. Takšen poskus so izvedli na psd2Δ ozadju, kjer je gen ''PSD2'' deletiran. Naravno je prisoten v vakuoli in bi lahko vplival na rezultate. WT sev je pretvarjal PS v PC uspešno, mutanta psd1Δ psd2Δ ni izvajala te funkcije, mutante z okvarami v sestavnih delih ERMES-a pa so izvajale to funkcijo dva- do petkrat manj. S tem so potrdili, da okvara v ERMES-u ovira izmenjavo fosfolipidov med ER in mitohondrijem. Pri mutantah mdm12Δ in mdm34Δ je izražanje ChiMERE v močno obnovilo pretvorbo PS v PC <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Zaključek''' ==
V tej raziskavi so uspešno identificirali sestavne dele povezovalnega kompleksa med ER in mitohondrijem s pomočjo umetnega konstrukta, ki je posnemal njegovo funkcijo. Pokazali so, da je ta kompleks odgovoren za transport fosfolipidov, njegova okvara pa močno ovira rast celice. V celici je verjetno takšnih povezav med organeli več, katere bi se dalo na podoben princip identificirati in s tem prispevati k razumevanju fiziologije celic.

<references/>

Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

2019-01-16T14:00:59Z

Blazlebar:

== '''Uvod''' ==
S pomočjo umetnega proteinskega konstrukta, ki lahko funkcijsko nadomesti naravno prisoten protein v celici, lahko zelo natančno določimo sestavo slednjega. V tem primeru je bila na ta način razkrita povezava med mitohondrijem in endoplazemskim retikulumom.

== '''Sodelovanje med organeli''' ==
Evkariontske celice so tekom evolucije preko kompartmentalizacije razdelile funkcije na posemezne organele. To je po eni strani zelo učinkovito zaradi prilagojenega kemijskega okolja, vendar je prav tako med temi organeli nujna komunikacija in izmenjava raznovrstnih molekul. Kot primer, fosfolipidi so sintetizirani v endoplazemskem retikulumu, ki se nato razvaža po celici s pomočjo vezikularnega transporta, v katerega pa mitohondrij ni vključen <ref name="prvi"> Kornmann, Benoît et al. “An ER-mitochondria tethering complex revealed by a synthetic biology screen” Science (New York, N.Y.) vol. 325,5939 (2009): 477-81 </ref>.

Študije so pokazale, da transport prej omenjenih fosfolipidov in prav tako kalcijevih ionov med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem poteka na točkah, kjer prihaja do stika med dvema organeloma. Ti »stiki« bi lahko bili ključni za nadzor citosolne in mitohondrijske koncentracije kalcijevih ionov. Z njimi povezujejo tudi proteini IP3 receptor (Ca<sup>2+</sup> kanalček), VDAC (mitohondrijski od napetosti odvisen anionski kanalček), šaperona grp75 in σ1R, sortirni protein PACS-2 in mitofuzin Mfn2 <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Chimera''' ==
V tej raziskavi so uporabljali sev ''Saccharomyces cerevisiae''. Ideja je bila, da bi vzeli mutante tega seva, ki imajo okvarjeno povezavo med organeloma, kar bi povzročilo opazne posledice v celici, vendar bi jih lahko preprečili z uporabo umetnega proteina, ki bi nadomestil njegovo funkcijo. Ustvarili so umetni protein, ki so ga poimenovali ChiMERA – »construct for helping in mitochondria-ER associaton« oz. konstrukt, za pomoč povezovanja mitohondrija in ER. Sestavljen je bil iz N-končne mitohondrijske signalne sekvence, transmembranske domene izpeljane iz protein Tom70, centralnega modula iz GFP proteina in C-končnega ER repnega sidra izpeljanega iz Ubc6 <ref name="prvi"> </ref>.

Mitohondrij lahko zavzema sferično obliko podobno fižolu, ali pa razvejano tubularno omrežje. V primeru ''S. cerevisiae'' je mitohondrij v celicah divjega tipa (wt) razvejan v bližini membrane. Takšna oblika se vzdržuje s pomočjo fizije in fuzije, ki se dogaja na približno vsaki dve minuti <ref name="drugi"> Shaw, Janet M and Jodi Nunnari. “Mitochondrial dynamics and division in budding yeast” Trends in cell biology vol. 12,4 (2002): 178-84 </ref>. V tej raziskavi so sevi z mutiranimi in okvarjenimi geni, ki sodelujejo v povezavi ER-mitohondrij, izgubili takšno obliko.

Konstrukt ChiMERA se je v največji meri lokaliziral na membrano ER in je označil tako periferni kot perinuklearni ER, mitohondrij pa je označil le na mestih kontakta z ER. Sevi divjega tipa so brez izražanja ChiMERE imeli mitohondrij prej opisane tubularne mreže, izražanje konstrukta pa je dodalo nekaj točkastih struktur na mestih kontakta z ER. S tem so pokazali, da umetni povezovalec izvaja želeno funkcijo. Močnejšo afiniteto konstrukta do ER so razložili z večjo dominanco vezavnega zaporedja za ER v primerjavi z vezavnim zaporedjem za mitohondrij v konstruktu <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Identifikacija povezave ER-mitohondrij''' ==
Za izražanje konstrukta je bil uporabljen kvasovkin centromerni plazmid. Približno 100 000 kolonij je bilo tretiranih s etilmetansulfonatom (EMS) za mutacijo, izmed nastalih mutant pa so dobili dve, ki nista mogli rasti brez prisotnosti plazmida. S pomočjo genske komplementacije so ugotovili, da sta obe mutaciji prisotni na genu ''MDM12''. Mdm12 je periferni protein zunanje mitohondrijske membrane, ki se ga da izolirati v kompleksu z Mmm1 in Mdm10. Lokalizira se v točkastih strukturah na mitohondrijskem omrežju še skupaj s četrtim proteinom, Mdm34. Vsi štirje proteini so nujni za aerobno rast in ohranjanje pravilne tubularne strukture mitohondrija <ref name="prvi"> </ref>.

V naslednji fazi so preverili v kolikšni meri izražanje ChiMERE kompenzira okvaro povzročeno z delecijo vsakega posameznega gena – ''MMM1, MDM10, MDM12 in MDM34''. Na YP ploščah, ki omogočajo fermentacijo, je razlika v uspešnosti rasti slabo opazna, medtem ko je rast na respiracijskih ploščah YPEG vidno uspešnejša ob prisotnosti umetnega konstrukta pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ . S pomočjo umetnega konstrukta jim je prav tako uspelo rešiti tubularno strukturo mitohondrija pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ, kar se ujema s prejšnjimi rezultati aerobne rasti. Novoidentificirani kompleks Mmm1/Mdm10/Mdm12/Mdm34 so poimenovali ERMES. Predvidevali so, da nekatere komponente ERMES-a pripadajo ER, nekatere pa mitohondriju. Mutacija v katerikoli komponenti je usodna za stik. Kadar se stik prekine, te ostanejo zasidrane v matični organel <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Študije kompleksa ERMES''' ==
Najprej so zamenjali gen za vsako komponento ERMES-a z genom za fuzijski protein z GFP. Tako so imeli seve ''MMM1-GFP, MDM12-GFP, MDM34-GFP in MDM10-GFP''. Nato so s fluorescenčno mikroskopijo opazovali WT in mutirane seve, kjer so mutirali vsako komponento ERMES-a posebej tako, da ni bila več funkcionalna.

*Vsi WT izhodni štirje sevi z zapisi za fuzijski protein so izkazovali točkaste strukture (sklepali na stike ER-mitohondrij), razen Mdm10-GFP, kjer so signali bili bolj široki (Mdm10 je sestavni del SAM kompleksa v OMM, ima še druge funkcije).
*Sevi z mutiranim ''MDM34'' ali ''MDM10'' so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na mitohondrij.
*Sevi z mutiranim ''MDM1'' so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na endoplazemski retikulum.
*Sevi z mutiranim ''MDM12'' so izgubili ERMES stike, v primeru mutacije/okvare gena ''MMM1'' se Mdm12-GFP lokalizira na mitohondrij, ob mutaciji/okvari ''MDM10'' in ''MDM34'' pa na ER.

V skladu s temi rezultati so postavili model kompleksa ERMES: Mdm34 in Mdm10 sta vezana v membrano mitohondrija, Mmm1 na membrano ER, protein Mdm12 pa je vezan na Mdm34 in Mmm1 in ni lokaliziran v nobeni membrani <ref name="prvi"> </ref>.

Njihov model je torej predpostavljal, da je protein Mmm1 vstavljen v membrano ER, medtem ko so dosedaj menili, da je sestavni del mitohondrijske notranje ali zunanje membrane. Ker se to ne ujema, so se odločili natančneje preveriti tudi to.

# test: Veliko integralnih ER proteinov je N-glikoziliranih na lumenski domeni in štiri potencialna mesta za glikozilacijo se nahajajo tudi na N-koncu pred transmembransko domeno. Da bi preverili, če so ta mest res glikozilirana, so gen za Mmm1 zamenjali z zapisom za fuzijski protein s HA (hemaglutinin). Nato so imeli tri vzorce – prvi je bil celični lizat tretiran z EndoHF (odstrani N-vezane glikane), drugi lizat ni bil tretiran z EndoHF, tretji pa je bil lizata seva z WT zapisom za Mmm1 (kontrola). Izvedli so NaSD-PAGE ter western prenos s protitelesi proti hemaglutininu. Lizat, tretiran z EndoHF je pripotoval dlje, kar pomeni, da je protein res glikoziliran in potemtakem integralni ER membranski protein <ref name="prvi"> </ref>.
# test: v celico so vnesli konstrukt, ki izraža protein Mmm1, fuziran s HA in cepitvenim mestom za TEV proteazo. Prav tako so vnesli zapis, za TEV proteazo s signalnim petidom za ER (Kar2) ali pa mitohondrij (Su9). Celične lizate so nanesli na NaDS-PAGE, izvedli western prenos s anti-HA protitelesi, in dobili dve lisi v sistemu, ki je izražal Kar2-TEV proteazo. To pomeni, da se protein Mmm1 res nahaja na ER <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Vloge kompleksa ERMES v celici''' ==
Genetske študije so pokazale, da so sestavni deli ERMES-a močno korelirani s še dvema proteinoma – Gem1 in Psd1. Prvi je kalcij-vezavna GTPaza iz družine rho, ki sodeluje pri preoblikovanju mitohondrija in njegovem pravilnem dedovanju, drugi pa fosfatidilserin dekarboksilaza, ki sodeluje pri de novo biosintezi aminoglicerofosfolipidov. Ta korelacija potrjuje, da je ERMES pomemben za medorganelno izmenjavo kalcija in fosfolipidov <ref name="prvi"> </ref>.

Najprej so preverili vsebnost fosfolipidov v mitohondriju pri celicah, z okvarjenim ERMES kompleksom (izbrali so mdm12Δ sev). Vrednosti vseh fosfolipidnih razredov so bile primerljive z WT razen kardiolipin (CL). CL je fosfolipid specifičen za mitohondrij, nujen za respiracijo in ga je bilo pri mutiranih celicah (mdm12Δ, psd1Δ) opazno manj. Celice, ki so imele okvarjen kompleks ERMES ali pa gen ''PSD1'' in hkrati deletiran gen ''CRD1'', ki kodira za CL sintazo, niso bile sposobne preživeti (sintezno smrtna delecija) <ref name="prvi"> </ref>.

Ker so bile vrednosti ostalih fosfolipidov v mutiranih sevih primerljive s sevom divjega tipa, sklepajo, da so v celici kompenzacijski mehanizmi, ki zmanjšajo vpliv okvare ERMES-a. To so preverili na pretvorbi fosfatidilserina (PS) v fosfatidilholin (PC) s pomočjo metode s pulznim označevanjem. Je metoda, ki se uporablja za spremljanje celičnih procesov skozi čas s pomočjo označene snovi (pulza) in nato iste neoznačene snovi (lovljenje). Celico se najprej izpostavi označeni snovi, kjer je najpogosteje radioaktivno označen atom ene molekule (<sup>35</sup>S, <sup>14</sup>C, <sup>3</sup>H…). Ta molekula gre nato skozi metabolne poti v celici, nato pa se celico izpostavi presežeku neoznačene molekule. Pomemben je čas izpostavljenosti posamezni molekuli. Vzorce se nato pregleda na kvantitativnih metodah <ref name="tretji"> Simon E., Kornitzer D. »Pulse-Chase Analysis to Measure Protein Degradation« Methods in Enzymology, vol. 636, (2014): 65-75 </ref>.

Tukaj so izvedli <sup>14</sup>C-serin pulzno označevanje. Najprej so jih izpostavili radioaktivno označenemu serinu dve uri, nato pa neoznačenemu serinu. Po različnih časih so odvzeli alikvote, iz njih izolirali fosfolipide in jih kvantitativno analizirali s tankoplastno kromatografijo. Takšen poskus so izvedli na psd2Δ ozadju, kjer je gen ''PSD2'' deletiran. Naravno je prisoten v vakuoli in bi lahko vplival na rezultate. WT sev je pretvarjal PS v PC uspešno, mutanta psd1Δ psd2Δ ni izvajala te funkcije, mutante z okvarami v sestavnih delih ERMES-a pa so izvajale to funkcijo dva- do petkrat manj. S tem so potrdili, da okvara v ERMES-u ovira izmenjavo fosfolipidov med ER in mitohondrijem. Pri mutantah mdm12Δ in mdm34Δ je izražanje ChiMERE v močno obnovilo pretvorbo PS v PC <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Zaključek''' ==
V tej raziskavi so uspešno identificirali sestavne dele povezovalnega kompleksa med ER in mitohondrijem s pomočjo umetnega konstrukta, ki je posnemal njegovo funkcijo. Pokazali so, da je ta kompleks odgovoren za transport fosfolipidov, njegova okvara pa močno ovira rast celice. V celici je verjetno takšnih povezav med organeli več, katere bi se dalo na podoben princip identificirati in s tem prispevati k razumevanju fiziologije celic.

<references/>

Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

2019-01-16T13:57:45Z

Blazlebar:

== '''Uvod''' ==
S pomočjo umetnega proteinskega konstrukta, ki lahko funkcijsko nadomesti naravno prisoten protein v celici, lahko zelo natančno določimo sestavo slednjega. V tem primeru je bila na ta način razkrita povezava med mitohondrijem in endoplazemskim retikulumom.

== '''Sodelovanje med organeli''' ==
Evkariontske celice so tekom evolucije preko kompartmentalizacije razdelile funkcije na posemezne organele. To je po eni strani zelo učinkovito zaradi prilagojenega kemijskega okolja, vendar je prav tako med temi organeli nujna komunikacija in izmenjava raznovrstnih molekul. Kot primer, fosfolipidi so sintetizirani v endoplazemskem retikulumu, ki se nato razvaža po celici s pomočjo vezikularnega transporta, v katerega pa mitohondrij ni vključen <ref name="prvi"> Kornmann, Benoît et al. “An ER-mitochondria tethering complex revealed by a synthetic biology screen” Science (New York, N.Y.) vol. 325,5939 (2009): 477-81 </ref>.

Študije so pokazale, da transport prej omenjenih fosfolipidov in prav tako kalcijevih ionov med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem poteka na točkah, kjer prihaja do stika med dvema organeloma. Ti »stiki« bi lahko bili ključni za nadzor citosolne in mitohondrijske koncentracije kalcijevih ionov. Z njimi povezujejo tudi proteini IP3 receptor (Ca<sup>2+</sup> kanalček), VDAC (mitohondrijski od napetosti odvisen anionski kanalček), šaperona grp75 in σ1R, sortirni protein PACS-2 in mitofuzin Mfn2 <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Chimera''' ==
V tej raziskavi so uporabljali sev ''Saccharomyces cerevisiae''. Ideja je bila, da bi vzeli mutante tega seva, ki imajo okvarjeno povezavo med organeloma, kar bi povzročilo opazne posledice v celici, vendar bi jih lahko preprečili z uporabo umetnega proteina, ki bi nadomestil njegovo funkcijo. Ustvarili so umetni protein, ki so ga poimenovali ChiMERA – »construct for helping in mitochondria-ER associaton« oz. konstrukt, za pomoč povezovanja mitohondrija in ER. Sestavljen je bil iz N-končne mitohondrijske signalne sekvence, transmembranske domene izpeljane iz protein Tom70, centralnega modula iz GFP proteina in C-končnega ER repnega sidra izpeljanega iz Ubc6 <ref name="prvi"> </ref>.

Mitohondrij lahko zavzema sferično obliko podobno fižolu, ali pa razvejano tubularno omrežje. V primeru ''S. cerevisiae'' je mitohondrij v celicah divjega tipa (wt) razvejan v bližini membrane. Takšna oblika se vzdržuje s pomočjo fizije in fuzije, ki se dogaja na približno vsaki dve minuti <ref name="drugi"> Shaw, Janet M and Jodi Nunnari. “Mitochondrial dynamics and division in budding yeast” Trends in cell biology vol. 12,4 (2002): 178-84 </ref>. V tej raziskavi so sevi z mutiranimi in okvarjenimi geni, ki sodelujejo v povezavi ER-mitohondrij, izgubili takšno obliko.

Konstrukt ChiMERA se je v največji meri lokaliziral na membrano ER in je označil tako periferni kot perinuklearni ER, mitohondrij pa je označil le na mestih kontakta z ER. Sevi divjega tipa so brez izražanja ChiMERE imeli mitohondrij prej opisane tubularne mreže, izražanje konstrukta pa je dodalo nekaj točkastih struktur na mestih kontakta z ER. S tem so pokazali, da umetni povezovalec izvaja želeno funkcijo. Močnejšo afiniteto konstrukta do ER so razložili z večjo dominanco vezavnega zaporedja za ER v primerjavi z vezavnim zaporedjem za mitohondrij v konstruktu <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Identifikacija povezave ER-mitohondrij''' ==
Za izražanje konstrukta je bil uporabljen kvasovkin centromerni plazmid. Približno 100 000 kolonij je bilo tretiranih s etilmetansulfonatom (EMS) za mutacijo, izmed nastalih mutant pa so dobili dve, ki nista mogli rasti brez prisotnosti plazmida. S pomočjo genske komplementacije so ugotovili, da sta obe mutaciji prisotni na genu ''MDM12''. Mdm12 je periferni protein zunanje mitohondrijske membrane, ki se ga da izolirati v kompleksu z Mmm1 in Mdm10. Lokalizira se v točkastih strukturah na mitohondrijskem omrežju še skupaj s četrtim proteinom, Mdm34. Vsi štirje proteini so nujni za aerobno rast in ohranjanje pravilne tubularne strukture mitohondrija <ref name="prvi"> </ref>.

V naslednji fazi so preverili v kolikšni meri izražanje ChiMERE kompenzira okvaro povzročeno z delecijo vsakega posameznega gena – ''MMM1, MDM10, MDM12 in MDM34''. Na YP ploščah, ki omogočajo fermentacijo, je razlika v uspešnosti rasti slabo opazna, medtem ko je rast na respiracijskih ploščah YPEG vidno uspešnejša ob prisotnosti umetnega konstrukta pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ . S pomočjo umetnega konstrukta jim je prav tako uspelo rešiti tubularno strukturo mitohondrija pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ, kar se ujema s prejšnjimi rezultati aerobne rasti. Novoidentificirani kompleks Mmm1/Mdm10/Mdm12/Mdm34 so poimenovali ERMES. Predvidevali so, da nekatere komponente ERMES-a pripadajo ER, nekatere pa mitohondriju. Mutacija v katerikoli komponenti je usodna za stik. Kadar se stik prekine, te ostanejo zasidrane v matični organel <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Študije kompleksa ERMES''' ==
Najprej so zamenjali gen za vsako komponento ERMES-a z genom za fuzijski protein z GFP. Tako so imeli seve ''MMM1-GFP, MDM12-GFP, MDM34-GFP in MDM10-GFP''. Nato so s fluorescenčno mikroskopijo opazovali WT in mutirane seve, kjer so mutirali vsako komponento ERMES-a posebej tako, da ni bila več funkcionalna.

*Vsi WT izhodni štirje sevi z zapisi za fuzijski protein so izkazovali točkaste strukture (sklepali na stike ER-mitohondrij), razen Mdm10-GFP, kjer so signali bili bolj široki (Mdm10 je sestavni del SAM kompleksa v OMM, ima še druge funkcije).
*Sevi z mutiranim ''MDM34'' ali ''MDM10'' so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na mitohondrij.
*Sevi z mutiranim ''MDM1'' so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na endoplazemski retikulum.
*Sevi z mutiranim ''MDM12'' so izgubili ERMES stike, v primeru mutacije/okvare gena ''MMM1'' se Mdm12-GFP lokalizira na mitohondrij, ob mutaciji/okvari ''MDM10'' in ''MDM34'' pa na ER.

V skladu s temi rezultati so postavili model kompleksa ERMES: Mdm34 in Mdm10 sta vezana v membrano mitohondrija, Mmm1 na membrano ER, protein Mdm12 pa je vezan na Mdm34 in Mmm1 in ni lokaliziran v nobeni membrani <ref name="prvi"> </ref>.

Njihov model je torej predpostavljal, da je protein Mmm1 vstavljen v membrano ER, medtem ko so dosedaj menili, da je sestavni del mitohondrijske notranje ali zunanje membrane. Ker se to ne ujema, so se odločili natančneje preveriti tudi to.

# test: Veliko integralnih ER proteinov je N-glikoziliranih na lumenski domeni in štiri potencialna mesta za glikozilacijo se nahajajo tudi na N-koncu pred transmembransko domeno. Da bi preverili, če so ta mest res glikozilirana, so gen za Mmm1 zamenjali z zapisom za fuzijski protein z HA (hemaglutinin). Nato so imeli tri vzorce – prvi je bil celični lizat tretiran z EndoHF (odstrani N-vezane glikane), drugi lizat ni bil tretiran z EndoHF, tretji pa je bil lizata seva z WT zapisom za Mmm1 (kontrola). Izvedli so NaSD-PAGE ter western prenos s protitelesi proti hemaglutininu. Lizat, tretiran z EndoHF je pripotoval dlje, kar pomeni, da je protein res glikoziliran in potemtakem integralni ER membranski protein <ref name="prvi"> </ref>.
# test: v celico so vnesli konstrukt, ki izraža protein Mmm1, fuziran z HA in cepitvenim mestom za TEV proteazo. Prav tako so vnesli zapis, za TEV proteazo s signalnim petidom za ER (Kar2) ali pa mitohondrij (Su9). Celične lizate so nanesli na NaDS-PAGE, izvedli western prenos s anti-HA protitelesi, in dobili dve lisi v sistemu, ki je izražal Kar2-TEV proteazo. To pomeni, da se protein Mmm1 res nahaja na ER <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Vloge kompleksa ERMES v celici''' ==
Genetske študije so pokazale, da so sestavni deli ERMES-a močno korelirani s še dvema proteinoma – Gem1 in Psd1. Prvi je kalcij-vezavna GTPaza iz družine rho, ki sodeluje pri preoblikovanju mitohondrija in njegovem pravilnem dedovanju, drugi pa fosfatidilserin dekarboksilaza, ki sodeluje pri de novo biosintezi aminoglicerofosfolipidov. Ta korelacija potrjuje, da je ERMES pomemben za medorganelno izmenjavo kalcija in fosfolipidov <ref name="prvi"> </ref>.

Najprej so preverili vsebnost fosfolipidov v mitohondriju pri celicah, z okvarjenim ERMES kompleksom (izbrali so mdm12Δ sev). Vrednosti vseh fosfolipidnih razredov so bile primerljive z WT razen kardiolipin (CL). CL je fosfolipid specifičen za mitohondrij, nujen za respiracijo in ga je bilo pri mutiranih celicah (mdm12Δ, psd1Δ) opazno manj. Celice, ki so imele okvarjen kompleks ERMES ali pa gen ''PSD1'' in hkrati deletiran gen ''CRD1'', ki kodira za CL sintazo, niso bile sposobne preživeti (sintezno smrtna delecija) <ref name="prvi"> </ref>.

Ker so bile vrednosti ostalih fosfolipidov v mutiranih sevih primerljive s sevom divjega tipa, sklepajo, da so v celici kompenzacijski mehanizmi, ki zmanjšajo vpliv okvare ERMES-a. To so preverili na pretvorbi fosfatidilserina (PS) v fosfatidilholin (PC) s pomočjo metode s pulznim označevanjem. Je metoda, ki se uporablja za spremljanje celičnih procesov skozi čas s pomočjo označene snovi (pulza) in nato iste neoznačene snovi (lovljenje). Celico se najprej izpostavi označeni snovi, kjer je najpogosteje radioaktivno označen atom ene molekule (<sup>35</sup>S, <sup>14</sup>C, <sup>3</sup>H…). Ta molekula gre nato skozi metabolne poti v celici, nato pa se celico izpostavi presežeku neoznačene molekule. Pomemben je čas izpostavljenosti posamezni molekuli. Vzorce se nato pregleda na kvantitativnih metodah <ref name="tretji"> Simon E., Kornitzer D. »Pulse-Chase Analysis to Measure Protein Degradation« Methods in Enzymology, vol. 636, (2014): 65-75 </ref>.

Tukaj so izvedli <sup>14</sup>C-serin pulzno označevanje. Najprej so jih izpostavili radioaktivno označenemu serinu dve uri, nato pa neoznačenemu serinu. Po različnih časih so odvzeli alikvote, iz njih izolirali fosfolipide in jih kvantitativno analizirali s tankoplastno kromatografijo. Takšen poskus so izvedli na psd2Δ ozadju, kjer je gen ''PSD2'' deletiran. Naravno je prisoten v vakuoli in bi lahko vplival na rezultate. WT sev je pretvarjal PS v PC uspešno, mutanta psd1Δ psd2Δ ni izvajala te funkcije, mutante z okvarami v sestavnih delih ERMES-a pa so izvajale to funkcijo dva- do petkrat manj. S tem so potrdili, da okvara v ERMES-u ovira izmenjavo fosfolipidov med ER in mitohondrijem. Pri mutantah mdm12Δ in mdm34Δ je izražanje ChiMERE v močno obnovilo pretvorbo PS v PC <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Zaključek''' ==
V tej raziskavi so uspešno identificirali sestavne dele povezovalnega kompleksa med ER in mitohondrijem s pomočjo umetnega konstrukta, ki je posnemal njegovo funkcijo. Pokazali so, da je ta kompleks odgovoren za transport fosfolipidov, njegova okvara pa močno ovira rast celice. V celici je verjetno takšnih povezav med organeli več, katere bi se dalo na podoben princip identificirati in s tem prispevati k razumevanju fiziologije celic.

<references/>

Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

2019-01-16T13:49:13Z

Blazlebar:

== '''Uvod''' ==
S pomočjo umetnega proteinskega konstrukta, ki lahko funkcijsko nadomesti naravno prisoten protein v celici, lahko zelo natančno določimo sestavo slednjega. V tem primeru je bila na ta način razkrita povezava med mitohondrijem in endoplazemskim retikulumom.

== '''Sodelovanje med organeli''' ==
Evkariontske celice so tekom evolucije preko kompartmentalizacije razdelile funkcije na posemezne organele. To je po eni strani zelo učinkovito zaradi prilagojenega kemijskega okolja, vendar je prav tako med temi organeli nujna komunikacija in izmenjava raznovrstnih molekul. Kot primer, fosfolipidi so sintetizirani v endoplazemskem retikulumu, ki se nato razvaža po celici s pomočjo vezikularnega transporta, v katerega pa mitohondrij ni vključen <ref name="prvi"> Kornmann, Benoît et al. “An ER-mitochondria tethering complex revealed by a synthetic biology screen” Science (New York, N.Y.) vol. 325,5939 (2009): 477-81 </ref>.

Študije so pokazale, da transport prej omenjenih fosfolipidov in prav tako kalcijevih ionov med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem poteka na točkah, kjer prihaja do stika med dvema organeloma. Ti »stiki« bi lahko bili ključni za nadzor citosolne in mitohondrijske koncentracije kalcijevih ionov. Z njimi povezujejo tudi proteini IP3 receptor (Ca<sup>2+</sup> kanalček), VDAC (mitohondrijski od napetosti odvisen anionski kanalček), šaperona grp75 in σ1R, sortirni protein PACS-2 in mitofuzin Mfn2 <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Chimera''' ==
V tej raziskavi so uporabljali sev ''Saccharomyces cerevisiae''. Ideja je bila, da bi vzeli mutante tega seva, ki imajo okvarjeno povezavo med organeloma, kar bi povzročilo opazne posledice v celici, vendar bi jih lahko preprečili z uporabo umetnega proteina, ki bi nadomestil njegovo funkcijo. Ustvarili si umetni protein, ki so ga poimenovali ChiMERA – »construct for helping in mitochondria-ER associaton«. Sestavljen je bil iz N-končne mitohondrijske signalne sekvence, transmembranske domene izpeljane iz protein Tom70, centralnega modula iz GFP proteina in C-končnega ER repnega sidra izpeljanega iz Ubc6 <ref name="prvi"> </ref>.

Mitohondrij lahko zavzema sferično obliko podobno fižolu, ali pa celo razvejano tubularno omrežje. V primeru S. cerevisiae je mitohondrij v celicah divjega tipa (wt) razvejan v bližini membrane. Takšna oblika se vzdržuje s pomočjo fizije in fuzije ki se dogaja napribližno vsaki dve minuti <ref name="drugi"> Shaw, Janet M and Jodi Nunnari. “Mitochondrial dynamics and division in budding yeast” Trends in cell biology vol. 12,4 (2002): 178-84 </ref>. V tej raziskavi so sevi z mutiranimi in okvarjenimi geni, ki sodelujejo v povezavi ER-mitohondrij, izgubili takšno obliko.

Konstrukt ChiMERA se je v največji meri lokaliziral na membrano ER in je označil tako periferni kot perinuklearni ER, mitohondrij pa je označil le na mestih kontakta z ER. WT sevi so brez izražanja ChiMERE imeli mitohondrij prej opisane tubularne mreže, izražanje konstrukta pa je dodalo nekaj točkastih struktur na mestih kontakta z ER. S tem so pokazali, da umetni povezovalec izvaja želeno funkcijo. Močnejšo afiniteto konstrukta do ER so razložili z večjo dominanco vezavnega zaporedja za ER v primerjavi z vezavnim zaporedjem za mitohondrij v konstruktu <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Identifikacija povezave ER-mitohondrij''' ==
Za izražanje konstrukta je bil uporabljen kvasovkin centromerni plazmid. Približno 100 000 kolonij je bilo tretiranih s etilmetansulfonatom (EMS) za mutacijo, izmed nastalih mutant pa so dobili dve, ki nista mogli rasti brez prisotnosti plazmida. S pomočjo genske komplementacije so ugotovili, da sta obe mutaciji prisotni na genu ''MDM12''. Mdm12 je periferni protein zunanje mitohondrijske membrane, ki se ga da izolirati v kompleksu z Mmm1 in Mdm10. Lokalizira se v točkastih strukturah na mitohondrijskem omrežju še skupaj s četrtim proteinom, Mdm34. Vsi štirje proteini so nujni z aerobno rast in ohranjanje pravilne tubularne strukture mitohondrija <ref name="prvi"> </ref>.

V naslednji fazi so preverili v kolikšni meri izražanje ChiMERE kompenzira okvaro povzročeno z delecijo vsakega posameznega gena – ''MMM1, MDM10, MDM12 in MDM34''. Na YP ploščah, ki omogočajo fermentacijo, je razlika v uspešnosti rasti slabo opazna, medtem ko je rast na respiracijskih ploščah YPEG zelo uspešno ob prisotnosti umetnega konstrukta pri delecijah genov pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ . S pomočjo umetnega konstrukta jim je prav tako uspelo rešiti tubularno strukturo mitohondrija pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ, kar se ujema z prejšnjimi rezultati aerobne rasti. Novoidentificirani kompleks Mmm1/Mdm10/Mdm12/Mdm34 so poimenovali ERMES. Predvidevali so, da nekatere komponente ERMES-a pripadajo ER, nekatere pa mitohondriju. Mutacija v katerikoli komponenti je usodna za stik. Kadar se stik prekine, te ostanejo zasidrane v matični organel <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Študije kompleksa ERMES''' ==
Najprej so zamenjali gen za vsako komponento ERMES-a z genom za fuzijski protein z GFP. Tako so imeli seve ''MMM1-GFP, MDM12-GFP, MDM34-GFP in MDM10-GFP''. Nato so s fluorescenčno mikroskopijo opazovali WT in mutirane seve, kjer so mutirali vsako komponento ERMES-a posebej tako, da ni bila več funkcionalna.

*Vsi WT izhodni štirje sevi z zapisi za fuzijski protein so izkazovali točkaste strukture (sklepali na stike ER-mitohondrij), razen Mdm10-GFP, kjer so signali bili bolj široki (Mdm10 je sestavni del SAM kompleksa v OMM, ima še druge funkcije).
*Sevi z mutiranim ''MDM34'' ali ''MDM10'' so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na mitohondrij.
*Sevi z mutiranimi ''MDM1'' so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na endoplazemski retikulum.
*Sevi z mutiranim ''MDM12'' so izgubili ERMES stike, v primeru mutacije/okvare gena ''MMM1'' se Mdm12-GFP lokalizira na mitohondrij, ob mutaciji/okvari ''MDM10'' in ''MDM34'' pa na ER.

V skladu s temi rezultati so postavili model kompleksa ERMES: Mdm34 in Mdm10 sta vezana v membrano mitohondrija, Mmm1 na membrano ER, protein Mdm12 pa je vezan na Mdm12 in Mmm1 in ni lokaliziran v nobeni membrani <ref name="prvi"> </ref>.

Njihov model je torej predpostavljal, da je protein Mmm1 vstavljen v membrano ER, medtem ko so dosedaj menili, da je sestavni del mitohondrijske notranje ali zunanje membrane. Ker se to ne ujema, so se odločili natančneje preveriti tudi to.

# test: Veliko integralnih ER proteinov je N-glikoziliranih na lumenski domeni in štiri potencialna mesta za glikozilacijo se nahajajo tudi na N-koncu pred transmembransko domeno. Da bi preverili, če so ta mest res glikozilirana, so gen za Mmm1 zamenjali z zapisom za fuzijski protein z HA (hemaglutinin). Nato so imeli tri vzorce – prvi je bil celični lizat tretiran z EndoHF (odstrani N-vezane glikane), drugi lizat ni bil tretiran z EndoHF, tretji pa je bil lizata seva z WT zapisom za Mmm1 (kontrola). Izvedli so NaSD-PAGE ter western prenos s protitelesi proti hemaglutininu. Lizat, tretiran z EndoHF je pripotoval dlje, kar pomeni da je protein res glikoziliran potemtakem integralni ER membranski protein <ref name="prvi"> </ref>.
# test: v celico so vnesli konstrukt, ki izraža protein Mmm1, fuziran z HA in cepitvenim mestom za TEV proteazo. Prav tako so vnesli zapis, za TEV proteazo s signalnim petidom za ER (Kar2) ali pa mitohondrij (Su9). Celične lizate so nanesli na NaDS-PAGE, izvedli western prenos s anti-HA protitelesi, in dobili dve lisi v sistemu, ki je izražal Kar2-TEV proteazo. To pomeni, da se protein Mmm1 res nahaja na ER <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Vloge kompleksa ERMES v celici''' ==
Genetske študije so pokazale, da so sestavni deli ERMES-a močno korelirani s še dvema proteinoma – Gem1 in Psd1. Prvi je kalcij-vezavna GTPaza iz družine rho, ki sodeluje pri preoblikovanju mitohondrija in njegovem pravilnem dedovanju, drugi pa fosfatidilserin dekarboksilaza, ki sodeluje pri de novo biosintezi aminoglicerofosfolipidov. Ta korelacija potrjuje, da je ERMES pomemben za medorganelno izmenjavo kalcija in fosfolipidov <ref name="prvi"> </ref>.

Najprej so preverili vsebnost fosfolipidov v mitohondriju pri celicah, z okvarjenim ERMES kompleksom (izbrali so mdm12Δ sev). Vrednosti vseh fosfolipidnih razredov so bile primerljive z WT razen kardiolipin (CL). CL je fosfolipid specifičen za mitohondrij, nujen za respiracijo in ga je bilo pri mutiranih celicah (mdm12Δ, psd1Δ) opazno manj. Celice, ki so imele okvarjen kompleks ERMES ali pa gen ''PSD1'' in hkrati deletiran gen ''CRD1'', ki kodira za CL sintazo, niso bile sposobne preživeti (sintezno smrtna delecija) <ref name="prvi"> </ref>.

Ker so bile vrednosti ostalih fosfolipidov v mutiranih sevih primerljive z sevom divjega tipa, sklepajo, da so v celici kompenzacijski mehanizmi, ki zmanjšajo vpliv okvare ERMES-a. To so preverili na pretvorbi fosfatidilserina (PS) v fosfatidilholin (PC) s pomočjo metode s pulznim označevanjem. Je metoda, ki se uporablja za spremljanje celičnih procesov skozi čas s pomočjo označene snovi (pulza) in nato iste neoznačene snovi (lovljenje). Celico se najprej izpostavi označeni snovi, kjer je najpogosteje radioaktivno označen atom ene molekule (<sup>35</sup>S, <sup>14</sup>C, <sup>3</sup>H…). Ta molekula gre nato skozi metabolne poti v celici, nato pa se celico izpostavi presežeku neoznačene molekule. Pomemben je čas izpostavljenosti posamezni molekuli. Vzorce se nato pregleda na kvantitativnih metodah <ref name="tretji"> Simon E., Kornitzer D. »Pulse-Chase Analysis to Measure Protein Degradation« Methods in Enzymology, vol. 636, (2014): 65-75 </ref>.

Tukaj so izvedli <sup>14</sup>C-serin pulzno označevanje. Najprej so jih izpostavili radioaktivno označenemu serinu dve uri, nato pa neoznačenemu serinu. Po različnih časih so odvzeli alikvote, iz njih izolirali fosfolipide in jih kvantitativno analizirali s tankoplastno kromatografijo. Takšen poskus so izvedli na psd2Δ ozadju, kjer je gen ''PSD2'' deletiran. Naravno je prisoten v vakuoli in bi lahko vplival na rezultate. WT sev je pretvarjal PS v PC uspešno, mutanta psd1Δ psd2Δ ni izvajala te funkcije, mutante z okvarami v sestavnih delih ERMES-a pa so izvajale to funkcijo dva- do petkrat manj. S tem so potrdili, da okvara v ERMES-u ovira izmenjavo fosfolipidov med ER in mitohondrijem. Pri mutantah mdm12Δ in mdm34Δ je izražanje ChiMERE v močno obnovilo pretvorbo PS v PC <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Zaključek''' ==
V tej raziskavi so uspešno identificirali sestavne dele povezovalnega kompleksa med ER in mitohondrijem s pomočjo umetnega konstrukta, ki je posnemal njegovo funkcijo. Pokazali so, da je ta kompleks odgovoren za transport fosfolipidov, njegova okvara pa močno ovira rast celice. V celici je verjetno takšnih povezav med organeli več, katere bi se dalo na podoben princip identificirati in s tem prispevati k razumevanju fiziologije celic.

<references/>

Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

2019-01-15T20:20:27Z

Blazlebar:

== '''Uvod''' ==
S pomočjo umetnega proteinskega konstrukta, ki lahko funkcijsko nadomesti naravno prisoten protein v celici, lahko zelo natančno določimo sestavo slednjega. V tem primeru je bila na ta način razkrita povezava med mitohondrijem in endoplazemskim retikulumom.

== '''Sodelovanje med organeli''' ==
Evkariontske celice so tekom evolucije preko kompartmentalizacije razdelile funkcije na posemezne organele. To je po eni strani zelo učinkovito zaradi prilagojenega kemijskega okolja, vendar je prav tako med temi organeli nujna komunikacija in izmenjava raznovrstnih molekul. Kot primer, fosfolipidi so sintetizirani v endoplazemskem retikulumu, ki se nato razvaža po celici s pomočjo vezikularnega transporta, v katerega pa mitohondrij ni vključen <ref name="prvi"> Kornmann, Benoît et al. “An ER-mitochondria tethering complex revealed by a synthetic biology screen” Science (New York, N.Y.) vol. 325,5939 (2009): 477-81 </ref>.

Študije so pokazale, da transport prej omenjenih fosfolipidov in prav tako kalcijevih ionov med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem poteka na točkah, kjer prihaja do stika med dvema organeloma. Ti »stiki« bi lahko bili ključni za nadzor citosolne in mitohondrijske koncentracije kalcijevih ionov. Z njimi povezujejo tudi proteini IP3 receptor (Ca<sup>2+</sup> kanalček), VDAC (mitohondrijski od napetosti odvisen anionski kanalček), šaperona grp75 in σ1R, sortirni protein PACS-2 in mitofuzin Mfn2 <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Chimera''' ==
V tej raziskavi so uporabljali sev Saccharomyces cerevisiae. Ideja je bila, da bi vzeli mutante tega seva, ki imajo okvarjeno povezavo med organeloma, kar bi povzročilo opazne posledice v celici, vendar bi jih lahko preprečili z uporabo umetnega proteina, ki bi nadomestil njegovo funkcijo. Ustvarili si umetni protein, ki so ga poimenovali ChiMERA – »construct for helping in mitochondria-ER associaton«. Sestavljen je bil iz N-končne mitohondrijske signalne sekvence, transmembranske domene izpeljane iz protein Tom70, centralnega modula iz GFP proteina in C-končnega ER repnega sidra izpeljanega iz Ubc6 <ref name="prvi"> </ref>.

Mitohondrij lahko zavzema sferično obliko podobno fižolu, ali pa celo razvejano tubularno omrežje. V primeru S. cerevisiae je mitohondrij v celicah divjega tipa (wt) razvejan v bližini membrane. Takšna oblika se vzdržuje s pomočjo fizije in fuzije ki se dogaja napribližno vsaki dve minuti <ref name="drugi"> Shaw, Janet M and Jodi Nunnari. “Mitochondrial dynamics and division in budding yeast” Trends in cell biology vol. 12,4 (2002): 178-84 </ref>. V tej raziskavi so sevi z mutiranimi in okvarjenimi geni, ki sodelujejo v povezavi ER-mitohondrij, izgubili takšno obliko.

Konstrukt ChiMERA se je v največji meri lokaliziral na membrano ER in je označil tako periferni kot perinuklearni ER, mitohondrij pa je označil le na mestih kontakta z ER. WT sevi so brez izražanja ChiMERE imeli mitohondrij prej opisane tubularne mreže, izražanje konstrukta pa je dodalo nekaj točkastih struktur na mestih kontakta z ER. S tem so pokazali, da umetni povezovalec izvaja želeno funkcijo. Močnejšo afiniteto konstrukta do ER so razložili z večjo dominanco vezavnega zaporedja za ER v primerjavi z vezavnim zaporedjem za mitohondrij v konstruktu <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Identifikacija povezave ER-mitohondrij''' ==
Za izražanje konstrukta je bil uporabljen kvasovkin centromerni plazmid. Približno 100 000 kolonij je bilo tretiranih s etilmetansulfonatom (EMS) za mutacijo, izmed nastalih mutant pa so dobili dve, ki nista mogli rasti brez prisotnosti plazmida. S pomočjo genske komplementacije so ugotovili, da sta obe mutaciji prisotni na genu ''MDM12''. Mdm12 je periferni protein zunanje mitohondrijske membrane, ki se ga da izolirati v kompleksu z Mmm1 in Mdm10. Lokalizira se v točkastih strukturah na mitohondrijskem omrežju še skupaj s četrtim proteinom, Mdm34. Vsi štirje proteini so nujni z aerobno rast in ohranjanje pravilne tubularne strukture mitohondrija <ref name="prvi"> </ref>.

V naslednji fazi so preverili v kolikšni meri izražanje ChiMERE kompenzira okvaro povzročeno z delecijo vsakega posameznega gena – ''MMM1, MDM10, MDM12 in MDM34''. Na YP ploščah, ki omogočajo fermentacijo, je razlika v uspešnosti rasti slabo opazna, medtem ko je rast na respiracijskih ploščah YPEG zelo uspešno ob prisotnosti umetnega konstrukta pri delecijah genov pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ . S pomočjo umetnega konstrukta jim je prav tako uspelo rešiti tubularno strukturo mitohondrija pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ, kar se ujema z prejšnjimi rezultati aerobne rasti. Novoidentificirani kompleks Mmm1/Mdm10/Mdm12/Mdm34 so poimenovali ERMES. Predvidevali so, da nekatere komponente ERMES-a pripadajo ER, nekatere pa mitohondriju. Mutacija v katerikoli komponenti je usodna za stik. Kadar se stik prekine, te ostanejo zasidrane v matični organel <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Študije kompleksa ERMES''' ==
Najprej so zamenjali gen za vsako komponento ERMES-a z genom za fuzijski protein z GFP. Tako so imeli seve ''MMM1-GFP, MDM12-GFP, MDM34-GFP in MDM10-GFP''. Nato so s fluorescenčno mikroskopijo opazovali WT in mutirane seve, kjer so mutirali vsako komponento ERMES-a posebej tako, da ni bila več funkcionalna.

*Vsi WT izhodni štirje sevi z zapisi za fuzijski protein so izkazovali točkaste strukture (sklepali na stike ER-mitohondrij), razen Mdm10-GFP, kjer so signali bili bolj široki (Mdm10 je sestavni del SAM kompleksa v OMM, ima še druge funkcije).
*Sevi z mutiranim ''MDM34'' ali ''MDM10'' so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na mitohondrij.
*Sevi z mutiranimi ''MDM1'' so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na endoplazemski retikulum.
*Sevi z mutiranim ''MDM12'' so izgubili ERMES stike, v primeru mutacije/okvare gena ''MMM1'' se Mdm12-GFP lokalizira na mitohondrij, ob mutaciji/okvari ''MDM10'' in ''MDM34'' pa na ER.

V skladu s temi rezultati so postavili model kompleksa ERMES: Mdm34 in Mdm10 sta vezana v membrano mitohondrija, Mmm1 na membrano ER, protein Mdm12 pa je vezan na Mdm12 in Mmm1 in ni lokaliziran v nobeni membrani <ref name="prvi"> </ref>.

Njihov model je torej predpostavljal, da je protein Mmm1 vstavljen v membrano ER, medtem ko so dosedaj menili, da je sestavni del mitohondrijske notranje ali zunanje membrane. Ker se to ne ujema, so se odločili natančneje preveriti tudi to.

# test: Veliko integralnih ER proteinov je N-glikoziliranih na lumenski domeni in štiri potencialna mesta za glikozilacijo se nahajajo tudi na N-koncu pred transmembransko domeno. Da bi preverili, če so ta mest res glikozilirana, so gen za Mmm1 zamenjali z zapisom za fuzijski protein z HA (hemaglutinin). Nato so imeli tri vzorce – prvi je bil celični lizat tretiran z EndoHF (odstrani N-vezane glikane), drugi lizat ni bil tretiran z EndoHF, tretji pa je bil lizata seva z WT zapisom za Mmm1 (kontrola). Izvedli so NaSD-PAGE ter western prenos s protitelesi proti hemaglutininu. Lizat, tretiran z EndoHF je pripotoval dlje, kar pomeni da je protein res glikoziliran potemtakem integralni ER membranski protein <ref name="prvi"> </ref>.
# test: v celico so vnesli konstrukt, ki izraža protein Mmm1, fuziran z HA in cepitvenim mestom za TEV proteazo. Prav tako so vnesli zapis, za TEV proteazo s signalnim petidom za ER (Kar2) ali pa mitohondrij (Su9). Celične lizate so nanesli na NaDS-PAGE, izvedli western prenos s anti-HA protitelesi, in dobili dve lisi v sistemu, ki je izražal Kar2-TEV proteazo. To pomeni, da se protein Mmm1 res nahaja na ER <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Vloge kompleksa ERMES v celici''' ==
Genetske študije so pokazale, da so sestavni deli ERMES-a močno korelirani s še dvema proteinoma – Gem1 in Psd1. Prvi je kalcij-vezavna GTPaza iz družine rho, ki sodeluje pri preoblikovanju mitohondrija in njegovem pravilnem dedovanju, drugi pa fosfatidilserin dekarboksilaza, ki sodeluje pri de novo biosintezi aminoglicerofosfolipidov. Ta korelacija potrjuje, da je ERMES pomemben za medorganelno izmenjavo kalcija in fosfolipidov <ref name="prvi"> </ref>.

Najprej so preverili vsebnost fosfolipidov v mitohondriju pri celicah, z okvarjenim ERMES kompleksom (izbrali so mdm12Δ sev). Vrednosti vseh fosfolipidnih razredov so bile primerljive z WT razen kardiolipin (CL). CL je fosfolipid specifičen za mitohondrij, nujen za respiracijo in ga je bilo pri mutiranih celicah (mdm12Δ, psd1Δ) opazno manj. Celice, ki so imele okvarjen kompleks ERMES ali pa gen ''PSD1'' in hkrati deletiran gen ''CRD1'', ki kodira za CL sintazo, niso bile sposobne preživeti (sintezno smrtna delecija) <ref name="prvi"> </ref>.

Ker so bile vrednosti ostalih fosfolipidov v mutiranih sevih primerljive z sevom divjega tipa, sklepajo, da so v celici kompenzacijski mehanizmi, ki zmanjšajo vpliv okvare ERMES-a. To so preverili na pretvorbi fosfatidilserina (PS) v fosfatidilholin (PC) s pomočjo metode s pulznim označevanjem. Je metoda, ki se uporablja za spremljanje celičnih procesov skozi čas s pomočjo označene snovi (pulza) in nato iste neoznačene snovi (lovljenje). Celico se najprej izpostavi označeni snovi, kjer je najpogosteje radioaktivno označen atom ene molekule (<sup>35</sup>S, <sup>14</sup>C, <sup>3</sup>H…). Ta molekula gre nato skozi metabolne poti v celici, nato pa se celico izpostavi presežeku neoznačene molekule. Pomemben je čas izpostavljenosti posamezni molekuli. Vzorce se nato pregleda na kvantitativnih metodah <ref name="tretji"> Simon E., Kornitzer D. »Pulse-Chase Analysis to Measure Protein Degradation« Methods in Enzymology, vol. 636, (2014): 65-75 </ref>.

Tukaj so izvedli <sup>14</sup>C-serin pulzno označevanje. Najprej so jih izpostavili radioaktivno označenemu serinu dve uri, nato pa neoznačenemu serinu. Po različnih časih so odvzeli alikvote, iz njih izolirali fosfolipide in jih kvantitativno analizirali s tankoplastno kromatografijo. Takšen poskus so izvedli na psd2Δ ozadju, kjer je gen ''PSD2'' deletiran. Naravno je prisoten v vakuoli in bi lahko vplival na rezultate. WT sev je pretvarjal PS v PC uspešno, mutanta psd1Δ psd2Δ ni izvajala te funkcije, mutante z okvarami v sestavnih delih ERMES-a pa so izvajale to funkcijo dva- do petkrat manj. S tem so potrdili, da okvara v ERMES-u ovira izmenjavo fosfolipidov med ER in mitohondrijem. Pri mutantah mdm12Δ in mdm34Δ je izražanje ChiMERE v močno obnovilo pretvorbo PS v PC <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Zaključek''' ==
V tej raziskavi so uspešno identificirali sestavne dele povezovalnega kompleksa med ER in mitohondrijem s pomočjo umetnega konstrukta, ki je posnemal njegovo funkcijo. Pokazali so, da je ta kompleks odgovoren za transport fosfolipidov, njegova okvara pa močno ovira rast celice. V celici je verjetno takšnih povezav med organeli več, katere bi se dalo na podoben princip identificirati in s tem prispevati k razumevanju fiziologije celic.

<references/>

Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

2019-01-15T20:18:51Z

Blazlebar:

== '''Uvod''' ==
S pomočjo umetnega proteinskega konstrukta, ki lahko funkcijsko nadomesti naravno prisoten protein v celici, lahko zelo natančno določimo sestavo slednjega. V tem primeru je bila na ta način razkrita povezava med mitohondrijem in endoplazemskim retikulumom.

== '''Sodelovanje med organeli''' ==
Evkariontske celice so tekom evolucije preko kompartmentalizacije razdelile funkcije na posemezne organele. To je po eni strani zelo učinkovito zaradi prilagojenega kemijskega okolja, vendar je prav tako med temi organeli nujna komunikacija in izmenjava raznovrstnih molekul. Kot primer, fosfolipidi so sintetizirani v endoplazemskem retikulumu, ki se nato razvaža po celici s pomočjo vezikularnega transporta, v katerega pa mitohondrij ni vključen <ref name="prvi"> Kornmann, Benoît et al. “An ER-mitochondria tethering complex revealed by a synthetic biology screen” Science (New York, N.Y.) vol. 325,5939 (2009): 477-81 </ref>.

Študije so pokazale, da transport prej omenjenih fosfolipidov in prav tako kalcijevih ionov med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem poteka na točkah, kjer prihaja do stika med dvema organeloma. Ti »stiki« bi lahko bili ključni za nadzor citosolne in mitohondrijske koncentracije kalcijevih ionov. Z njimi povezujejo tudi proteini IP3 receptor (Ca<sup>2+</sup> kanalček), VDAC (mitohondrijski od napetosti odvisen anionski kanalček), šaperona grp75 in σ1R, sortirni protein PACS-2 in mitofuzin Mfn2 <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Chimera''' ==
V tej raziskavi so uporabljali sev Saccharomyces cerevisiae. Ideja je bila, da bi vzeli mutante tega seva, ki imajo okvarjeno povezavo med organeloma, kar bi povzročilo opazne posledice v celici, vendar bi jih lahko preprečili z uporabo umetnega proteina, ki bi nadomestil njegovo funkcijo. Ustvarili si umetni protein, ki so ga poimenovali ChiMERA – »construct for helping in mitochondria-ER associaton«. Sestavljen je bil iz N-končne mitohondrijske signalne sekvence, transmembranske domene izpeljane iz protein Tom70, centralnega modula iz GFP proteina in C-končnega ER repnega sidra izpeljanega iz Ubc6 <ref name="prvi"> </ref>.

Mitohondrij lahko zavzema sferično obliko podobno fižolu, ali pa celo razvejano tubularno omrežje. V primeru S. cerevisiae je mitohondrij v celicah divjega tipa (wt) razvejan v bližini membrane. Takšna oblika se vzdržuje s pomočjo fizije in fuzije ki se dogaja napribližno vsaki dve minuti <ref name="drugi"> Shaw, Janet M and Jodi Nunnari. “Mitochondrial dynamics and division in budding yeast” Trends in cell biology vol. 12,4 (2002): 178-84 </ref>. V tej raziskavi so sevi z mutiranimi in okvarjenimi geni, ki sodelujejo v povezavi ER-mitohondrij, izgubili takšno obliko.

Konstrukt ChiMERA se je v največji meri lokaliziral na membrano ER in je označil tako periferni kot perinuklearni ER, mitohondrij pa je označil le na mestih kontakta z ER. WT sevi so brez izražanja ChiMERE imeli mitohondrij prej opisane tubularne mreže, izražanje konstrukta pa je dodalo nekaj točkastih struktur na mestih kontakta z ER. S tem so pokazali, da umetni povezovalec izvaja želeno funkcijo. Močnejšo afiniteto konstrukta do ER so razložili z večjo dominanco vezavnega zaporedja za ER v primerjavi z vezavnim zaporedjem za mitohondrij v konstruktu <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Identifikacija povezave ER-mitohondrij''' ==
Za izražanje konstrukta je bil uporabljen kvasovkin centromerni plazmid. Približno 100 000 kolonij je bilo tretiranih s etilmetansulfonatom (EMS) za mutacijo, izmed nastalih mutant pa so dobili dve, ki nista mogli rasti brez prisotnosti plazmida. S pomočjo genske komplementacije so ugotovili, da sta obe mutaciji prisotni na genu ''MDM12''. Mdm12 je periferni protein zunanje mitohondrijske membrane, ki se ga da izolirati v kompleksu z Mmm1 in Mdm10. Lokalizira se v točkastih strukturah na mitohondrijskem omrežju še skupaj s četrtim proteinom, Mdm34. Vsi štirje proteini so nujni z aerobno rast in ohranjanje pravilne tubularne strukture mitohondrija <ref name="prvi"> </ref>.

V naslednji fazi so preverili v kolikšni meri izražanje ChiMERE kompenzira okvaro povzročeno z delecijo vsakega posameznega gena – ''MMM1, MDM10, MDM12 in MDM34''. Na YP ploščah, ki omogočajo fermentacijo, je razlika v uspešnosti rasti slabo opazna, medtem ko je rast na respiracijskih ploščah YPEG zelo uspešno ob prisotnosti umetnega konstrukta pri delecijah genov pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ . S pomočjo umetnega konstrukta jim je prav tako uspelo rešiti tubularno strukturo mitohondrija pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ, kar se ujema z prejšnjimi rezultati aerobne rasti. Novoidentificirani kompleks Mmm1/Mdm10/Mdm12/Mdm34 so poimenovali ERMES. Predvidevali so, da nekatere komponente ERMES-a pripadajo ER, nekatere pa mitohondriju. Mutacija v katerikoli komponenti je usodna za stik. Kadar se stik prekine, te ostanejo zasidrane v matični organel <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Študije kompleksa ERMES''' ==
Najprej so zamenjali gen za vsako komponento ERMES-a z genom za fuzijski protein z GFP. Tako so imeli seve ''MMM1-GFP, MDM12-GFP, MDM34-GFP in MDM10-GFP''. Nato so s fluorescenčno mikroskopijo opazovali WT in mutirane seve, kjer so mutirali vsako komponento ERMES-a posebej tako, da ni bila več funkcionalna.

*Vsi WT izhodni štirje sevi z zapisi za fuzijski protein so izkazovali točkaste strukture (sklepali na stike ER-mitohondrij), razen MDM10-GFP, kjer so signali bili bolj široki (Mdm10 je sestavni del SAM kompleksa v OMM, ima še druge funkcije).
*Sevi z mutiranim ''MDM34'' ali ''MDM10'' so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na mitohondrij.
*Sevi z mutiranimi ''MDM1'' so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na endoplazemski retikulum.
*Sevi z mutiranim ''MDM12'' so izgubili ERMES stike, v primeru mutacije/okvare gena ''MMM1'' se Mdm12-GFP lokalizira na mitohondrij, ob mutaciji/okvari ''MDM10'' in ''MDM34'' pa na ER.

V skladu s temi rezultati so postavili model kompleksa ERMES: Mdm34 in Mdm10 sta vezana v membrano mitohondrija, Mmm1 na membrano ER, protein Mdm12 pa je vezan na Mdm12 in Mmm1 in ni lokaliziran v nobeni membrani <ref name="prvi"> </ref>.

Njihov model je torej predpostavljal, da je protein Mmm1 vstavljen v membrano ER, medtem ko so dosedaj menili, da je sestavni del mitohondrijske notranje ali zunanje membrane. Ker se to ne ujema, so se odločili natančneje preveriti tudi to.

# test: Veliko integralnih ER proteinov je N-glikoziliranih na lumenski domeni in štiri potencialna mesta za glikozilacijo se nahajajo tudi na N-koncu pred transmembransko domeno. Da bi preverili, če so ta mest res glikozilirana, so gen za Mmm1 zamenjali z zapisom za fuzijski protein z HA (hemaglutinin). Nato so imeli tri vzorce – prvi je bil celični lizat tretiran z EndoHF (odstrani N-vezane glikane), drugi lizat ni bil tretiran z EndoHF, tretji pa je bil lizata seva z WT zapisom za Mmm1 (kontrola). Izvedli so NaSD-PAGE ter western prenos s protitelesi proti hemaglutininu. Lizat, tretiran z EndoHF je pripotoval dlje, kar pomeni da je protein res glikoziliran potemtakem integralni ER membranski protein <ref name="prvi"> </ref>.
# test: v celico so vnesli konstrukt, ki izraža protein Mmm1, fuziran z HA in cepitvenim mestom za TEV proteazo. Prav tako so vnesli zapis, za TEV proteazo s signalnim petidom za ER (Kar2) ali pa mitohondrij (Su9). Celične lizate so nanesli na NaDS-PAGE, izvedli western prenos s anti-HA protitelesi, in dobili dve lisi v sistemu, ki je izražal Kar2-TEV proteazo. To pomeni, da se protein Mmm1 res nahaja na ER <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Vloge kompleksa ERMES v celici''' ==
Genetske študije so pokazale, da so sestavni deli ERMES-a močno korelirani s še dvema proteinoma – Gem1 in Psd1. Prvi je kalcij-vezavna GTPaza iz družine rho, ki sodeluje pri preoblikovanju mitohondrija in njegovem pravilnem dedovanju, drugi pa fosfatidilserin dekarboksilaza, ki sodeluje pri de novo biosintezi aminoglicerofosfolipidov. Ta korelacija potrjuje, da je ERMES pomemben za medorganelno izmenjavo kalcija in fosfolipidov <ref name="prvi"> </ref>.

Najprej so preverili vsebnost fosfolipidov v mitohondriju pri celicah, z okvarjenim ERMES kompleksom (izbrali so mdm12Δ sev). Vrednosti vseh fosfolipidnih razredov so bile primerljive z WT razen kardiolipin (CL). CL je fosfolipid specifičen za mitohondrij, nujen za respiracijo in ga je bilo pri mutiranih celicah (mdm12Δ, psd1Δ) opazno manj. Celice, ki so imele okvarjen kompleks ERMES ali pa gen ''PSD1'' in hkrati deletiran gen ''CRD1'', ki kodira za CL sintazo, niso bile sposobne preživeti (sintezno smrtna delecija) <ref name="prvi"> </ref>.

Ker so bile vrednosti ostalih fosfolipidov v mutiranih sevih primerljive z sevom divjega tipa, sklepajo, da so v celici kompenzacijski mehanizmi, ki zmanjšajo vpliv okvare ERMES-a. To so preverili na pretvorbi fosfatidilserina (PS) v fosfatidilholin (PC) s pomočjo metode s pulznim označevanjem. Je metoda, ki se uporablja za spremljanje celičnih procesov skozi čas s pomočjo označene snovi (pulza) in nato iste neoznačene snovi (lovljenje). Celico se najprej izpostavi označeni snovi, kjer je najpogosteje radioaktivno označen atom ene molekule (<sup>35</sup>S, <sup>14</sup>C, <sup>3</sup>H…). Ta molekula gre nato skozi metabolne poti v celici, nato pa se celico izpostavi presežeku neoznačene molekule. Pomemben je čas izpostavljenosti posamezni molekuli. Vzorce se nato pregleda na kvantitativnih metodah <ref name="tretji"> Simon E., Kornitzer D. »Pulse-Chase Analysis to Measure Protein Degradation« Methods in Enzymology, vol. 636, (2014): 65-75 </ref>.

Tukaj so izvedli <sup>14</sup>C-serin pulzno označevanje. Najprej so jih izpostavili radioaktivno označenemu serinu dve uri, nato pa neoznačenemu serinu. Po različnih časih so odvzeli alikvote, iz njih izolirali fosfolipide in jih kvantitativno analizirali s tankoplastno kromatografijo. Takšen poskus so izvedli na psd2Δ ozadju, kjer je gen ''PSD2'' deletiran. Naravno je prisoten v vakuoli in bi lahko vplival na rezultate. WT sev je pretvarjal PS v PC uspešno, mutanta psd1Δ psd2Δ ni izvajala te funkcije, mutante z okvarami v sestavnih delih ERMES-a pa so izvajale to funkcijo dva- do petkrat manj. S tem so potrdili, da okvara v ERMES-u ovira izmenjavo fosfolipidov med ER in mitohondrijem. Pri mutantah mdm12Δ in mdm34Δ je izražanje ChiMERE v močno obnovilo pretvorbo PS v PC <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Zaključek''' ==
V tej raziskavi so uspešno identificirali sestavne dele povezovalnega kompleksa med ER in mitohondrijem s pomočjo umetnega konstrukta, ki je posnemal njegovo funkcijo. Pokazali so, da je ta kompleks odgovoren za transport fosfolipidov, njegova okvara pa močno ovira rast celice. V celici je verjetno takšnih povezav med organeli več, katere bi se dalo na podoben princip identificirati in s tem prispevati k razumevanju fiziologije celic.

<references/>

Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

2019-01-15T20:16:44Z

Blazlebar:

== '''Uvod''' ==
S pomočjo umetnega proteinskega konstrukta, ki lahko funkcijsko nadomesti naravno prisoten protein v celici, lahko zelo natančno določimo sestavo slednjega. V tem primeru je bila na ta način razkrita povezava med mitohondrijem in endoplazemskim retikulumom.

== '''Sodelovanje med organeli''' ==
Evkariontske celice so tekom evolucije preko kompartmentalizacije razdelile funkcije na posemezne organele. To je po eni strani zelo učinkovito zaradi prilagojenega kemijskega okolja, vendar je prav tako med temi organeli nujna komunikacija in izmenjava raznovrstnih molekul. Kot primer, fosfolipidi so sintetizirani v endoplazemskem retikulumu, ki se nato razvaža po celici s pomočjo vezikularnega transporta, v katerega pa mitohondrij ni vključen <ref name="prvi"> Kornmann, Benoît et al. “An ER-mitochondria tethering complex revealed by a synthetic biology screen” Science (New York, N.Y.) vol. 325,5939 (2009): 477-81 </ref>.

Študije so pokazale, da transport prej omenjenih fosfolipidov in prav tako kalcijevih ionov med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem poteka na točkah, kjer prihaja do stika med dvema organeloma. Ti »stiki« bi lahko bili ključni za nadzor citosolne in mitohondrijske koncentracije kalcijevih ionov. Z njimi povezujejo tudi proteini IP3 receptor (Ca2+ kanalček), VDAC (mitohondrijski od napetosti odvisen anionski kanalček), šaperona grp75 in σ1R, sortirni protein PACS-2 in mitofuzin Mfn2 <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Chimera''' ==
V tej raziskavi so uporabljali sev Saccharomyces cerevisiae. Ideja je bila, da bi vzeli mutante tega seva, ki imajo okvarjeno povezavo med organeloma, kar bi povzročilo opazne posledice v celici, vendar bi jih lahko preprečili z uporabo umetnega proteina, ki bi nadomestil njegovo funkcijo. Ustvarili si umetni protein, ki so ga poimenovali ChiMERA – »construct for helping in mitochondria-ER associaton«. Sestavljen je bil iz N-končne mitohondrijske signalne sekvence, transmembranske domene izpeljane iz protein Tom70, centralnega modula iz GFP proteina in C-končnega ER repnega sidra izpeljanega iz Ubc6 <ref name="prvi"> </ref>.

Mitohondrij lahko zavzema sferično obliko podobno fižolu, ali pa celo razvejano tubularno omrežje. V primeru S. cerevisiae je mitohondrij v celicah divjega tipa (wt) razvejan v bližini membrane. Takšna oblika se vzdržuje s pomočjo fizije in fuzije ki se dogaja napribližno vsaki dve minuti <ref name="drugi"> Shaw, Janet M and Jodi Nunnari. “Mitochondrial dynamics and division in budding yeast” Trends in cell biology vol. 12,4 (2002): 178-84 </ref>. V tej raziskavi so sevi z mutiranimi in okvarjenimi geni, ki sodelujejo v povezavi ER-mitohondrij, izgubili takšno obliko.

Konstrukt ChiMERA se je v največji meri lokaliziral na membrano ER in je označil tako periferni kot perinuklearni ER, mitohondrij pa je označil le na mestih kontakta z ER. WT sevi so brez izražanja ChiMERE imeli mitohondrij prej opisane tubularne mreže, izražanje konstrukta pa je dodalo nekaj točkastih struktur na mestih kontakta z ER. S tem so pokazali, da umetni povezovalec izvaja želeno funkcijo. Močnejšo afiniteto konstrukta do ER so razložili z večjo dominanco vezavnega zaporedja za ER v primerjavi z vezavnim zaporedjem za mitohondrij v konstruktu <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Identifikacija povezave ER-mitohondrij''' ==
Za izražanje konstrukta je bil uporabljen kvasovkin centromerni plazmid. Približno 100 000 kolonij je bilo tretiranih s etilmetansulfonatom (EMS) za mutacijo, izmed nastalih mutant pa so dobili dve, ki nista mogli rasti brez prisotnosti plazmida. S pomočjo genske komplementacije so ugotovili, da sta obe mutaciji prisotni na genu ''MDM12''. Mdm12 je periferni protein zunanje mitohondrijske membrane, ki se ga da izolirati v kompleksu z Mmm1 in Mdm10. Lokalizira se v točkastih strukturah na mitohondrijskem omrežju še skupaj s četrtim proteinom, Mdm34. Vsi štirje proteini so nujni z aerobno rast in ohranjanje pravilne tubularne strukture mitohondrija <ref name="prvi"> </ref>.

V naslednji fazi so preverili v kolikšni meri izražanje ChiMERE kompenzira okvaro povzročeno z delecijo vsakega posameznega gena – ''MMM1, MDM10, MDM12 in MDM34''. Na YP ploščah, ki omogočajo fermentacijo, je razlika v uspešnosti rasti slabo opazna, medtem ko je rast na respiracijskih ploščah YPEG zelo uspešno ob prisotnosti umetnega konstrukta pri delecijah genov pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ . S pomočjo umetnega konstrukta jim je prav tako uspelo rešiti tubularno strukturo mitohondrija pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ, kar se ujema z prejšnjimi rezultati aerobne rasti. Novoidentificirani kompleks Mmm1/Mdm10/Mdm12/Mdm34 so poimenovali ERMES. Predvidevali so, da nekatere komponente ERMES-a pripadajo ER, nekatere pa mitohondriju. Mutacija v katerikoli komponenti je usodna za stik. Kadar se stik prekine, te ostanejo zasidrane v matični organel <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Študije kompleksa ERMES''' ==
Najprej so zamenjali gen za vsako komponento ERMES-a z genom za fuzijski protein z GFP. Tako so imeli seve ''MMM1-GFP, MDM12-GFP, MDM34-GFP in MDM10-GFP''. Nato so s fluorescenčno mikroskopijo opazovali WT in mutirane seve, kjer so mutirali vsako komponento ERMES-a posebej tako, da ni bila več funkcionalna.

*Vsi WT izhodni štirje sevi z zapisi za fuzijski protein so izkazovali točkaste strukture (sklepali na stike ER-mitohondrij), razen MDM10-GFP, kjer so signali bili bolj široki (Mdm10 je sestavni del SAM kompleksa v OMM, ima še druge funkcije).
*Sevi z mutiranim ''MDM34'' ali ''MDM10'' so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na mitohondrij.
*Sevi z mutiranimi ''MDM1'' so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na endoplazemski retikulum.
*Sevi z mutiranim ''MDM12'' so izgubili ERMES stike, v primeru mutacije/okvare gena ''MMM1'' se Mdm12-GFP lokalizira na mitohondrij, ob mutaciji/okvari ''MDM10'' in ''MDM34'' pa na ER.

V skladu s temi rezultati so postavili model kompleksa ERMES: Mdm34 in Mdm10 sta vezana v membrano mitohondrija, Mmm1 na membrano ER, protein Mdm12 pa je vezan na Mdm12 in Mmm1 in ni lokaliziran v nobeni membrani <ref name="prvi"> </ref>.

Njihov model je torej predpostavljal, da je protein Mmm1 vstavljen v membrano ER, medtem ko so dosedaj menili, da je sestavni del mitohondrijske notranje ali zunanje membrane. Ker se to ne ujema, so se odločili natančneje preveriti tudi to.

# test: Veliko integralnih ER proteinov je N-glikoziliranih na lumenski domeni in štiri potencialna mesta za glikozilacijo se nahajajo tudi na N-koncu pred transmembransko domeno. Da bi preverili, če so ta mest res glikozilirana, so gen za Mmm1 zamenjali z zapisom za fuzijski protein z HA (hemaglutinin). Nato so imeli tri vzorce – prvi je bil celični lizat tretiran z EndoHF (odstrani N-vezane glikane), drugi lizat ni bil tretiran z EndoHF, tretji pa je bil lizata seva z WT zapisom za Mmm1 (kontrola). Izvedli so NaSD-PAGE ter western prenos s protitelesi proti hemaglutininu. Lizat, tretiran z EndoHF je pripotoval dlje, kar pomeni da je protein res glikoziliran potemtakem integralni ER membranski protein <ref name="prvi"> </ref>.
# test: v celico so vnesli konstrukt, ki izraža protein Mmm1, fuziran z HA in cepitvenim mestom za TEV proteazo. Prav tako so vnesli zapis, za TEV proteazo s signalnim petidom za ER (Kar2) ali pa mitohondrij (Su9). Celične lizate so nanesli na NaDS-PAGE, izvedli western prenos s anti-HA protitelesi, in dobili dve lisi v sistemu, ki je izražal Kar2-TEV proteazo. To pomeni, da se protein Mmm1 res nahaja na ER <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Vloge kompleksa ERMES v celici''' ==
Genetske študije so pokazale, da so sestavni deli ERMES-a močno korelirani s še dvema proteinoma – Gem1 in Psd1. Prvi je kalcij-vezavna GTPaza iz družine rho, ki sodeluje pri preoblikovanju mitohondrija in njegovem pravilnem dedovanju, drugi pa fosfatidilserin dekarboksilaza, ki sodeluje pri de novo biosintezi aminoglicerofosfolipidov. Ta korelacija potrjuje, da je ERMES pomemben za medorganelno izmenjavo kalcija in fosfolipidov <ref name="prvi"> </ref>.

Najprej so preverili vsebnost fosfolipidov v mitohondriju pri celicah, z okvarjenim ERMES kompleksom (izbrali so mdm12Δ sev). Vrednosti vseh fosfolipidnih razredov so bile primerljive z WT razen kardiolipin (CL). CL je fosfolipid specifičen za mitohondrij, nujen za respiracijo in ga je bilo pri mutiranih celicah (mdm12Δ, psd1Δ) opazno manj. Celice, ki so imele okvarjen kompleks ERMES ali pa gen ''PSD1'' in hkrati deletiran gen ''CRD1'', ki kodira za CL sintazo, niso bile sposobne preživeti (sintezno smrtna delecija) <ref name="prvi"> </ref>.

Ker so bile vrednosti ostalih fosfolipidov v mutiranih sevih primerljive z sevom divjega tipa, sklepajo, da so v celici kompenzacijski mehanizmi, ki zmanjšajo vpliv okvare ERMES-a. To so preverili na pretvorbi fosfatidilserina (PS) v fosfatidilholin (PC) s pomočjo metode s pulznim označevanjem. Je metoda, ki se uporablja za spremljanje celičnih procesov skozi čas s pomočjo označene snovi (pulza) in nato iste neoznačene snovi (lovljenje). Celico se najprej izpostavi označeni snovi, kjer je najpogosteje radioaktivno označen atom ene molekule (35S, 14C, 3H…). Ta molekula gre nato skozi metabolne poti v celici, nato pa se celico izpostavi presežeku neoznačene molekule. Pomemben je čas izpostavljenosti posamezni molekuli. Vzorce se nato pregleda na kvantitativnih metodah <ref name="tretji"> Simon E., Kornitzer D. »Pulse-Chase Analysis to Measure Protein Degradation« Methods in Enzymology, vol. 636, (2014): 65-75 </ref>.

Tukaj so izvedli 14C-serin pulzno označevanje. Najprej so jih izpostavili radioaktivno označenemu serinu dve uri, nato pa neoznačenemu serinu. Po različnih časih so odvzeli alikvote, iz njih izolirali fosfolipide in jih kvantitativno analizirali s tankoplastno kromatografijo. Takšen poskus so izvedli na psd2Δ ozadju, kjer je encim Psd2 deletiran. Naravno je prisoten v vakuoli in bi lahko vplival na rezultate. WT sev je pretvarjal PS v PC uspešno, mutanta psd1Δ psd2Δ ni izvajala te funkcije, mutante z okvarami v sestavnih delih ERMES-a pa so izvajale to funkcijo dva- do petkrat manj. S tem so potrdili, da okvara v ERMES-u ovira izmenjavo fosfolipidov med ER in mitohondrijem. Pri mutantah mdm12Δ in mdm34Δ je izražanje ChiMERE v močno obnovilo pretvorbo PS v PC <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Zaključek''' ==
V tej raziskavi so uspešno identificirali sestavne dele povezovalnega kompleksa med ER in mitohondrijem s pomočjo umetnega konstrukta, ki je posnemal njegovo funkcijo. Pokazali so, da je ta kompleks odgovoren za transport fosfolipidov, njegova okvara pa močno ovira rast celice. V celici je verjetno takšnih povezav med organeli več, katere bi se dalo na podoben princip identificirati in s tem prispevati k razumevanju fiziologije celic.

<references/>

Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

2019-01-15T20:16:21Z

Blazlebar:

== '''Uvod''' ==
S pomočjo umetnega proteinskega konstrukta, ki lahko funkcijsko nadomesti naravno prisoten protein v celici, lahko zelo natančno določimo sestavo slednjega. V tem primeru je bila na ta način razkrita povezava med mitohondrijem in endoplazemskim retikulumom.

== '''Sodelovanje med organeli''' ==
Evkariontske celice so tekom evolucije preko kompartmentalizacije razdelile funkcije na posemezne organele. To je po eni strani zelo učinkovito zaradi prilagojenega kemijskega okolja, vendar je prav tako med temi organeli nujna komunikacija in izmenjava raznovrstnih molekul. Kot primer, fosfolipidi so sintetizirani v endoplazemskem retikulumu, ki se nato razvaža po celici s pomočjo vezikularnega transporta, v katerega pa mitohondrij ni vključen <ref name="prvi"> Kornmann, Benoît et al. “An ER-mitochondria tethering complex revealed by a synthetic biology screen” Science (New York, N.Y.) vol. 325,5939 (2009): 477-81 </ref>.

Študije so pokazale, da transport prej omenjenih fosfolipidov in prav tako kalcijevih ionov med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem poteka na točkah, kjer prihaja do stika med dvema organeloma. Ti »stiki« bi lahko bili ključni za nadzor citosolne in mitohondrijske koncentracije kalcijevih ionov. Z njimi povezujejo tudi proteini IP3 receptor (Ca2+ kanalček), VDAC (mitohondrijski od napetosti odvisen anionski kanalček), šaperona grp75 in σ1R, sortirni protein PACS-2 in mitofuzin Mfn2 <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Chimera''' ==
V tej raziskavi so uporabljali sev Saccharomyces cerevisiae. Ideja je bila, da bi vzeli mutante tega seva, ki imajo okvarjeno povezavo med organeloma, kar bi povzročilo opazne posledice v celici, vendar bi jih lahko preprečili z uporabo umetnega proteina, ki bi nadomestil njegovo funkcijo. Ustvarili si umetni protein, ki so ga poimenovali ChiMERA – »construct for helping in mitochondria-ER associaton«. Sestavljen je bil iz N-končne mitohondrijske signalne sekvence, transmembranske domene izpeljane iz protein Tom70, centralnega modula iz GFP proteina in C-končnega ER repnega sidra izpeljanega iz Ubc6 <ref name="prvi"> </ref>.

Mitohondrij lahko zavzema sferično obliko podobno fižolu, ali pa celo razvejano tubularno omrežje. V primeru S. cerevisiae je mitohondrij v celicah divjega tipa (wt) razvejan v bližini membrane. Takšna oblika se vzdržuje s pomočjo fizije in fuzije ki se dogaja napribližno vsaki dve minuti <ref name="drugi"> Shaw, Janet M and Jodi Nunnari. “Mitochondrial dynamics and division in budding yeast” Trends in cell biology vol. 12,4 (2002): 178-84 </ref>. V tej raziskavi so sevi z mutiranimi in okvarjenimi geni, ki sodelujejo v povezavi ER-mitohondrij, izgubili takšno obliko.

Konstrukt ChiMERA se je v največji meri lokaliziral na membrano ER in je označil tako periferni kot perinuklearni ER, mitohondrij pa je označil le na mestih kontakta z ER. WT sevi so brez izražanja ChiMERE imeli mitohondrij prej opisane tubularne mreže, izražanje konstrukta pa je dodalo nekaj točkastih struktur na mestih kontakta z ER. S tem so pokazali, da umetni povezovalec izvaja želeno funkcijo. Močnejšo afiniteto konstrukta do ER so razložili z večjo dominanco vezavnega zaporedja za ER v primerjavi z vezavnim zaporedjem za mitohondrij v konstruktu <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Identifikacija povezave ER-mitohondrij''' ==
Za izražanje konstrukta je bil uporabljen kvasovkin centromerni plazmid. Približno 100 000 kolonij je bilo tretiranih s etilmetansulfonatom (EMS) za mutacijo, izmed nastalih mutant pa so dobili dve, ki nista mogli rasti brez prisotnosti plazmida. S pomočjo genske komplementacije so ugotovili, da sta obe mutaciji prisotni na genu ''MDM12''. Mdm12 je periferni protein zunanje mitohondrijske membrane, ki se ga da izolirati v kompleksu z Mmm1 in Mdm10. Lokalizira se v točkastih strukturah na mitohondrijskem omrežju še skupaj s četrtim proteinom, Mdm34. Vsi štirje proteini so nujni z aerobno rast in ohranjanje pravilne tubularne strukture mitohondrija <ref name="prvi"> </ref>.

V naslednji fazi so preverili v kolikšni meri izražanje ChiMERE kompenzira okvaro povzročeno z delecijo vsakega posameznega gena – ''MMM1, MDM10, MDM12 in MDM34''. Na YP ploščah, ki omogočajo fermentacijo, je razlika v uspešnosti rasti slabo opazna, medtem ko je rast na respiracijskih ploščah YPEG zelo uspešno ob prisotnosti umetnega konstrukta pri delecijah genov pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ . S pomočjo umetnega konstrukta jim je prav tako uspelo rešiti tubularno strukturo mitohondrija pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ, kar se ujema z prejšnjimi rezultati aerobne rasti. Novoidentificirani kompleks Mmm1/Mdm10/Mdm12/Mdm34 so poimenovali ERMES. Predvidevali so, da nekatere komponente ERMES-a pripadajo ER, nekatere pa mitohondriju. Mutacija v katerikoli komponenti je usodna za stik. Kadar se stik prekine, te ostanejo zasidrane v matični organel <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Študije kompleksa ERMES''' ==
Najprej so zamenjali gen za vsako komponento ERMES-a z genom za fuzijski protein z GFP. Tako so imeli seve ''MMM1-GFP, MDM12-GFP, MDM34-GFP in MDM10-GFP''. Nato so s fluorescenčno mikroskopijo opazovali WT in mutirane seve, kjer so mutirali vsako komponento ERMES-a posebej tako, da ni bila več funkcionalna.

*Vsi WT izhodni štirje sevi z zapisi za fuzijski protein so izkazovali točkaste strukture (sklepali na stike ER-mitohondrij), razen MDM10-GFP, kjer so signali bili bolj široki (Mdm10 je sestavni del SAM kompleksa v OMM, ima še druge funkcije).
*Sevi z mutiranim ''MDM34'' ali ''MDM10'' so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na mitohondrij.
*Sevi z mutiranimi ''MDM1'' so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na endoplazemski retikulum.
*Sevi z mutiranim ''MDM12'' so izgubili ERMES stike, v primeru mutacije/okvare gena ''MMM1'' se Mdm12-GFP lokalizira na mitohondrij, ob mutaciji/okvari ''MDM10'' in ''MDM34'' pa na ER.

V skladu s temi rezultati so postavili model kompleksa ERMES: Mdm34 in Mdm10 sta vezana v membrano mitohondrija, Mmm1 na membrano ER, protein MDm12 pa je vezan na Mdm12 in Mmm1 in ni lokaliziran v nobeni membrani <ref name="prvi"> </ref>.

Njihov model je torej predpostavljal, da je protein Mmm1 vstavljen v membrano ER, medtem ko so dosedaj menili, da je sestavni del mitohondrijske notranje ali zunanje membrane. Ker se to ne ujema, so se odločili natančneje preveriti tudi to.

# test: Veliko integralnih ER proteinov je N-glikoziliranih na lumenski domeni in štiri potencialna mesta za glikozilacijo se nahajajo tudi na N-koncu pred transmembransko domeno. Da bi preverili, če so ta mest res glikozilirana, so gen za Mmm1 zamenjali z zapisom za fuzijski protein z HA (hemaglutinin). Nato so imeli tri vzorce – prvi je bil celični lizat tretiran z EndoHF (odstrani N-vezane glikane), drugi lizat ni bil tretiran z EndoHF, tretji pa je bil lizata seva z WT zapisom za Mmm1 (kontrola). Izvedli so NaSD-PAGE ter western prenos s protitelesi proti hemaglutininu. Lizat, tretiran z EndoHF je pripotoval dlje, kar pomeni da je protein res glikoziliran potemtakem integralni ER membranski protein <ref name="prvi"> </ref>.
# test: v celico so vnesli konstrukt, ki izraža protein Mmm1, fuziran z HA in cepitvenim mestom za TEV proteazo. Prav tako so vnesli zapis, za TEV proteazo s signalnim petidom za ER (Kar2) ali pa mitohondrij (Su9). Celične lizate so nanesli na NaDS-PAGE, izvedli western prenos s anti-HA protitelesi, in dobili dve lisi v sistemu, ki je izražal Kar2-TEV proteazo. To pomeni, da se protein Mmm1 res nahaja na ER <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Vloge kompleksa ERMES v celici''' ==
Genetske študije so pokazale, da so sestavni deli ERMES-a močno korelirani s še dvema proteinoma – Gem1 in Psd1. Prvi je kalcij-vezavna GTPaza iz družine rho, ki sodeluje pri preoblikovanju mitohondrija in njegovem pravilnem dedovanju, drugi pa fosfatidilserin dekarboksilaza, ki sodeluje pri de novo biosintezi aminoglicerofosfolipidov. Ta korelacija potrjuje, da je ERMES pomemben za medorganelno izmenjavo kalcija in fosfolipidov <ref name="prvi"> </ref>.

Najprej so preverili vsebnost fosfolipidov v mitohondriju pri celicah, z okvarjenim ERMES kompleksom (izbrali so mdm12Δ sev). Vrednosti vseh fosfolipidnih razredov so bile primerljive z WT razen kardiolipin (CL). CL je fosfolipid specifičen za mitohondrij, nujen za respiracijo in ga je bilo pri mutiranih celicah (mdm12Δ, psd1Δ) opazno manj. Celice, ki so imele okvarjen kompleks ERMES ali pa gen ''PSD1'' in hkrati deletiran gen ''CRD1'', ki kodira za CL sintazo, niso bile sposobne preživeti (sintezno smrtna delecija) <ref name="prvi"> </ref>.

Ker so bile vrednosti ostalih fosfolipidov v mutiranih sevih primerljive z sevom divjega tipa, sklepajo, da so v celici kompenzacijski mehanizmi, ki zmanjšajo vpliv okvare ERMES-a. To so preverili na pretvorbi fosfatidilserina (PS) v fosfatidilholin (PC) s pomočjo metode s pulznim označevanjem. Je metoda, ki se uporablja za spremljanje celičnih procesov skozi čas s pomočjo označene snovi (pulza) in nato iste neoznačene snovi (lovljenje). Celico se najprej izpostavi označeni snovi, kjer je najpogosteje radioaktivno označen atom ene molekule (35S, 14C, 3H…). Ta molekula gre nato skozi metabolne poti v celici, nato pa se celico izpostavi presežeku neoznačene molekule. Pomemben je čas izpostavljenosti posamezni molekuli. Vzorce se nato pregleda na kvantitativnih metodah <ref name="tretji"> Simon E., Kornitzer D. »Pulse-Chase Analysis to Measure Protein Degradation« Methods in Enzymology, vol. 636, (2014): 65-75 </ref>.

Tukaj so izvedli 14C-serin pulzno označevanje. Najprej so jih izpostavili radioaktivno označenemu serinu dve uri, nato pa neoznačenemu serinu. Po različnih časih so odvzeli alikvote, iz njih izolirali fosfolipide in jih kvantitativno analizirali s tankoplastno kromatografijo. Takšen poskus so izvedli na psd2Δ ozadju, kjer je encim Psd2 deletiran. Naravno je prisoten v vakuoli in bi lahko vplival na rezultate. WT sev je pretvarjal PS v PC uspešno, mutanta psd1Δ psd2Δ ni izvajala te funkcije, mutante z okvarami v sestavnih delih ERMES-a pa so izvajale to funkcijo dva- do petkrat manj. S tem so potrdili, da okvara v ERMES-u ovira izmenjavo fosfolipidov med ER in mitohondrijem. Pri mutantah mdm12Δ in mdm34Δ je izražanje ChiMERE v močno obnovilo pretvorbo PS v PC <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Zaključek''' ==
V tej raziskavi so uspešno identificirali sestavne dele povezovalnega kompleksa med ER in mitohondrijem s pomočjo umetnega konstrukta, ki je posnemal njegovo funkcijo. Pokazali so, da je ta kompleks odgovoren za transport fosfolipidov, njegova okvara pa močno ovira rast celice. V celici je verjetno takšnih povezav med organeli več, katere bi se dalo na podoben princip identificirati in s tem prispevati k razumevanju fiziologije celic.

<references/>

Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

2019-01-15T20:13:04Z

Blazlebar:

== '''Uvod''' ==
S pomočjo umetnega proteinskega konstrukta, ki lahko funkcijsko nadomesti naravno prisoten protein v celici, lahko zelo natančno določimo sestavo slednjega. V tem primeru je bila na ta način razkrita povezava med mitohondrijem in endoplazemskim retikulumom.

== '''Sodelovanje med organeli''' ==
Evkariontske celice so tekom evolucije preko kompartmentalizacije razdelile funkcije na posemezne organele. To je po eni strani zelo učinkovito zaradi prilagojenega kemijskega okolja, vendar je prav tako med temi organeli nujna komunikacija in izmenjava raznovrstnih molekul. Kot primer, fosfolipidi so sintetizirani v endoplazemskem retikulumu, ki se nato razvaža po celici s pomočjo vezikularnega transporta, v katerega pa mitohondrij ni vključen <ref name="prvi"> Kornmann, Benoît et al. “An ER-mitochondria tethering complex revealed by a synthetic biology screen” Science (New York, N.Y.) vol. 325,5939 (2009): 477-81 </ref>.

Študije so pokazale, da transport prej omenjenih fosfolipidov in prav tako kalcijevih ionov med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem poteka na točkah, kjer prihaja do stika med dvema organeloma. Ti »stiki« bi lahko bili ključni za nadzor citosolne in mitohondrijske koncentracije kalcijevih ionov. Z njimi povezujejo tudi proteini IP3 receptor (Ca2+ kanalček), VDAC (mitohondrijski od napetosti odvisen anionski kanalček), šaperona grp75 in σ1R, sortirni protein PACS-2 in mitofuzin Mfn2 <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Chimera''' ==
V tej raziskavi so uporabljali sev Saccharomyces cerevisiae. Ideja je bila, da bi vzeli mutante tega seva, ki imajo okvarjeno povezavo med organeloma, kar bi povzročilo opazne posledice v celici, vendar bi jih lahko preprečili z uporabo umetnega proteina, ki bi nadomestil njegovo funkcijo. Ustvarili si umetni protein, ki so ga poimenovali ChiMERA – »construct for helping in mitochondria-ER associaton«. Sestavljen je bil iz N-končne mitohondrijske signalne sekvence, transmembranske domene izpeljane iz protein Tom70, centralnega modula iz GFP proteina in C-končnega ER repnega sidra izpeljanega iz Ubc6 <ref name="prvi"> </ref>.

Mitohondrij lahko zavzema sferično obliko podobno fižolu, ali pa celo razvejano tubularno omrežje. V primeru S. cerevisiae je mitohondrij v celicah divjega tipa (wt) razvejan v bližini membrane. Takšna oblika se vzdržuje s pomočjo fizije in fuzije ki se dogaja napribližno vsaki dve minuti <ref name="drugi"> Shaw, Janet M and Jodi Nunnari. “Mitochondrial dynamics and division in budding yeast” Trends in cell biology vol. 12,4 (2002): 178-84 </ref>. V tej raziskavi so sevi z mutiranimi in okvarjenimi geni, ki sodelujejo v povezavi ER-mitohondrij, izgubili takšno obliko.

Konstrukt ChiMERA se je v največji meri lokaliziral na membrano ER in je označil tako periferni kot perinuklearni ER, mitohondrij pa je označil le na mestih kontakta z ER. WT sevi so brez izražanja ChiMERE imeli mitohondrij prej opisane tubularne mreže, izražanje konstrukta pa je dodalo nekaj točkastih struktur na mestih kontakta z ER. S tem so pokazali, da umetni povezovalec izvaja želeno funkcijo. Močnejšo afiniteto konstrukta do ER so razložili z večjo dominanco vezavnega zaporedja za ER v primerjavi z vezavnim zaporedjem za mitohondrij v konstruktu <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Identifikacija povezave ER-mitohondrij''' ==
Za izražanje konstrukta je bil uporabljen kvasovkin centromerni plazmid. Približno 100 000 kolonij je bilo tretiranih s etilmetansulfonatom (EMS) za mutacijo, izmed nastalih mutant pa so dobili dve, ki nista mogli rasti brez prisotnosti plazmida. S pomočjo genske komplementacije so ugotovili, da sta obe mutaciji prisotni na genu MDM12. Mdm12 je periferni protein zunanje mitohondrijske membrane, ki se ga da izolirati v kompleksu z Mmm1 in Mdm10. Lokalizira se v točkastih strukturah na mitohondrijskem omrežju še skupaj s četrtim proteinom, Mdm34. Vsi štirje proteini so nujni z aerobno rast in ohranjanje pravilne tubularne strukture mitohondrija <ref name="prvi"> </ref>.

V naslednji fazi so preverili v kolikšni meri izražanje ChiMERE kompenzira okvaro povzročeno z delecijo vsakega posameznega gena – MMM1, MDM10, MDM12 in MDM34. Na YP ploščah, ki omogočajo fermentacijo, je razlika v uspešnosti rasti slabo opazna, medtem ko je rast na respiracijskih ploščah YPEG zelo uspešno ob prisotnosti umetnega konstrukta pri delecijah genov pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ . S pomočjo umetnega konstrukta jim je prav tako uspelo rešiti tubularno strukturo mitohondrija pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ, kar se ujema z prejšnjimi rezultati aerobne rasti. Novoidentificirani kompleks Mmm1/Mdm10/Mdm12/Mdm34 so poimenovali ERMES. Predvidevali so, da nekatere komponente ERMES-a pripadajo ER, nekatere pa mitohondriju. Mutacija v katerikoli komponenti je usodna za stik. Kadar se stik prekine, te ostanejo zasidrane v matični organel <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Študije kompleksa ERMES''' ==
Najprej so zamenjali gen za vsako komponento ERMES-a z genom za fuzijski protein z GFP. Tako so imeli seve MMM1-GFP, MDM12-GFP, MDM34-GFP in MDM10-GFP. Nato so s fluorescenčno mikroskopijo opazovali WT in mutirane seve, kjer so mutirali vsako komponento ERMES-a posebej tako, da ni bila več funkcionalna.

*Vsi WT izhodni štirje sevi z zapisi za fuzijski protein so izkazovali točkaste strukture (sklepali na stike ER-mitohondrij), razen MDM10-GFP, kjer so signali bili bolj široki (Mdm10 je sestavni del SAM kompleksa v OMM, ima še druge funkcije).
*Sevi z mutiranimi MDM34 in MLokaDM10 so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na mitohondrij.
*Sevi z mutiranimi MDM1 so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na endoplazemski retikulum.
*Sevi z mutiranim MDM12 so izgubili ERMES stike, v primeru mutacije/okvare gena MMM1, se MDM12-GFP lokalizira na mitohondrij, ob mutaciji/okvari MDM10 in MDM34 pa na ER.

V skladu s temi rezultati so postavili model kompleksa ERMES: Mdm34 in Mdm10 sta vezana v membrano mitohondrija, Mmm1 na membrano ER, protein MDm12 pa je vezan na Mdm12 in Mmm1 in ni lokaliziran v nobeni membrani <ref name="prvi"> </ref>.

Njihov model je torej predpostavljal, da je protein Mmm1 vstavljen v membrano ER, medtem ko so dosedaj menili, da je sestavni del mitohondrijske notranje ali zunanje membrane. Ker se to ne ujema, so se odločili natančneje preveriti tudi to.

# test: Veliko integralnih ER proteinov je N-glikoziliranih na lumenski domeni in štiri potencialna mesta za glikozilacijo se nahajajo tudi na N-koncu pred transmembransko domeno. Da bi preverili, če so ta mest res glikozilirana, so gen za Mmm1 zamenjali z zapisom za fuzijski protein z HA (hemaglutinin). Nato so imeli tri vzorce – prvi je bil celični lizat tretiran z EndoHF (odstrani N-vezane glikane), drugi lizat ni bil tretiran z EndoHF, tretji pa je bil lizata seva z WT zapisom za Mmm1 (kontrola). Izvedli so NaSD-PAGE ter western prenos s protitelesi proti hemaglutininu. Lizat, tretiran z EndoHF je pripotoval dlje, kar pomeni da je protein res glikoziliran potemtakem integralni ER membranski protein <ref name="prvi"> </ref>.
# test: v celico so vnesli konstrukt, ki izraža protein Mmm1, fuziran z HA in cepitvenim mestom za TEV proteazo. Prav tako so vnesli zapis, za TEV proteazo s signalnim petidom za ER (Kar2) ali pa mitohondrij (Su9). Celične lizate so nanesli na NaDS-PAGE, izvedli western prenos s anti-HA protitelesi, in dobili dve lisi v sistemu, ki je izražal Kar2-TEV proteazo. To pomeni, da se protein Mmm1 res nahaja na ER <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Vloge kompleksa ERMES v celici''' ==
Genetske študije so pokazale, da so sestavni deli ERMES-a močno korelirani s še dvema proteinoma – Gem1 in Psd1. Prvi je kalcij-vezavna GTPaza iz družine rho, ki sodeluje pri preoblikovanju mitohondrija in njegovem pravilnem dedovanju, drugi pa fosfatidilserin dekarboksilaza, ki sodeluje pri de novo biosintezi aminoglicerofosfolipidov. Ta korelacija potrjuje, da je ERMES pomemben za medorganelno izmenjavo kalcija in fosfolipidov <ref name="prvi"> </ref>.

Najprej so preverili vsebnost fosfolipidov v mitohondriju pri celicah, z okvarjenim ERMES kompleksom (izbrali so mdm12Δ sev). Vrednosti vseh fosfolipidnih razredov so bile primerljive z WT razen kardiolipin (CL). CL je fosfolipid specifičen za mitohondrij, nujen za respiracijo in ga je bilo pri mutiranih celicah (mdm12Δ, psd1Δ) opazno manj. Celice, ki so imele okvarjen kompleks ERMES ali pa gen PSD1 in hkrati deletiran gen CRD1, ki kodira za CL sintazo, niso bile sposobne preživeti (sintezno smrtna delecija) <ref name="prvi"> </ref>.

Ker so bile vrednosti ostalih fosfolipidov v mutiranih sevih primerljive z sevom divjega tipa, sklepajo, da so v celici kompenzacijski mehanizmi, ki zmanjšajo vpliv okvare ERMES-a. To so preverili na pretvorbi fosfatidilserina (PS) v fosfatidilholin (PC) s pomočjo metode s pulznim označevanjem. Je metoda, ki se uporablja za spremljanje celičnih procesov skozi čas s pomočjo označene snovi (pulza) in nato iste neoznačene snovi (lovljenje). Celico se najprej izpostavi označeni snovi, kjer je najpogosteje radioaktivno označen atom ene molekule (35S, 14C, 3H…). Ta molekula gre nato skozi metabolne poti v celici, nato pa se celico izpostavi presežeku neoznačene molekule. Pomemben je čas izpostavljenosti posamezni molekuli. Vzorce se nato pregleda na kvantitativnih metodah <ref name="tretji"> Simon E., Kornitzer D. »Pulse-Chase Analysis to Measure Protein Degradation« Methods in Enzymology, vol. 636, (2014): 65-75 </ref>.

Tukaj so izvedli 14C-serin pulzno označevanje. Najprej so jih izpostavili radioaktivno označenemu serinu dve uri, nato pa neoznačenemu serinu. Po različnih časih so odvzeli alikvote, iz njih izolirali fosfolipide in jih kvantitativno analizirali s tankoplastno kromatografijo. Takšen poskus so izvedli na psd2Δ ozadju, kjer je encim Psd2 deletiran. Naravno je prisoten v vakuoli in bi lahko vplival na rezultate. WT sev je pretvarjal PS v PC uspešno, mutanta psd1Δ psd2Δ ni izvajala te funkcije, mutante z okvarami v sestavnih delih ERMES-a pa so izvajale to funkcijo dva- do petkrat manj. S tem so potrdili, da okvara v ERMES-u ovira izmenjavo fosfolipidov med ER in mitohondrijem. Pri mutantah mdm12Δ in mdm34Δ je izražanje ChiMERE v močno obnovilo pretvorbo PS v PC <ref name="prvi"> </ref>.

== '''Zaključek''' ==
V tej raziskavi so uspešno identificirali sestavne dele povezovalnega kompleksa med ER in mitohondrijem s pomočjo umetnega konstrukta, ki je posnemal njegovo funkcijo. Pokazali so, da je ta kompleks odgovoren za transport fosfolipidov, njegova okvara pa močno ovira rast celice. V celici je verjetno takšnih povezav med organeli več, katere bi se dalo na podoben princip identificirati in s tem prispevati k razumevanju fiziologije celic.

<references/>

Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

2019-01-15T20:11:17Z

Blazlebar:

Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

2019-01-15T20:11:04Z

Blazlebar:

Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

2019-01-15T20:10:25Z

Blazlebar:

Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

2019-01-15T20:09:46Z

Blazlebar:

Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

2019-01-15T20:07:56Z

Blazlebar:

Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

2019-01-15T20:06:45Z

Blazlebar:

Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

2019-01-15T20:05:33Z

Blazlebar:

Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

2019-01-15T20:04:20Z

Blazlebar:

Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

2019-01-15T20:04:07Z

Blazlebar:

Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

2019-01-15T20:03:51Z

Blazlebar:

Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

2019-01-15T20:02:31Z

Blazlebar:

Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

2019-01-15T20:00:30Z

Blazlebar:

== '''Uvod''' ==
Abc

== '''Sodelovanje med organeli''' ==
Abc

== '''Chimera''' ==
Abc

== '''Identifikacija povezave ER-mitohondrij''' ==
Abc

== '''Študije kompleksa ERMES''' ==
Abc

== '''Vloge kompleksa ERMES v celici''' ==
Abc

== '''Zaključek''' ==
Abc

<ref name="prvi"> xy </ref>

Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

2019-01-15T19:55:13Z

Blazlebar:

Test strani
<ref name="prvi"> xy </ref>

Seminarji SB 2018/19

2019-01-15T19:54:02Z

Blazlebar:

V študijskem letu 2018/19 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br>

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RNA-stikala_tipa_%C2%BBToehold%C2%AB:_de_novo_oblikovani_regulatorji_izra%C5%BEanja_genov RNA-stikala tipa Toehold: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov] (Špela Malenšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Raznoliko_in_modelno_zasnovana_priprava_sinteti%C4%8Dnih_genskih_vezij_s_predvidenimi_lastnostmi Raznoliko in modelno zasnovana priprava sintetičnih genskih vezij s predvidenimi lastnostmi] (Matej Kolarič)

[[Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage]] (Fran Krstanović)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nekaj_pogledov_na_sistemsko_biologijo_kvasovke Nekaj pogledov na sistemsko biologijo kvasovke] (Gašper Žun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organizacija_znotrajceli%C4%8Dnih_reakcij_z_razumsko_na%C4%8Drtovanimi_RNA_sestavi#Na.C4.8Drtovanje_in_sestavljanje_RNA_sestavov Organizacija znotrajceličnih reakcij z razumsko načrtovanimi RNA sestavi] (Urška Jelenovec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biolo%C5%A1ko_vezje_na_osnovi_RNA-interference_za_identifikacijo_specifi%C4%8Dnih_rakavih_celic Biološko vezje na osnovi RNA-interference za identifikacijo specifičnih rakavih celic] (Gašper Marinšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kontrola_hitrosti_translacije_preko_pomožnega_mesta_5’-UTR:_energijski_kompromis_med_dostopnostjo%2C_selektivnim_razvijanjem_RNA-struktur_in_drsenjem_30S_ribosomske_podenote_po_RNA-strukturah Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah] (Neža Koritnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_genskega_skupka_za_fiksacijo_dušika_bakterije_Klebsiella_oxytoca Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije ''Klebsiella oxytoca''] (Gašper Virant)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Negativna_samoregulacija_linearizira_odziv_na_odmerek_in_zavira_heterogenost_genskega_izražanja Negativna samoregulacija linearizira odziv na odmerek in zavira heterogenost genskega izražanja] (Primož Tič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Design_and_analysis_of_synthetic_carbon_fixation_pathways Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways] (Marija Atanasova)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pol-sinteti%C4%8Den_organizem_z_raz%C5%A1irjeno_gensko_abecedo Pol-sintetičen organizem z razširjeno gensko abecedo] (Peter Pečan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programirano_uti%C5%A1anje_in_aktivacija_izra%C5%BEanja_bakterijskega_gena_z_uporabo_konstruiranega_CRISPR-Cas_sistema Programirano utišanje in aktivacija izražanja bakterijskega gena z uporabo konstruiranega CRISPR-Cas sistema] (Tjaša Sorčan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_optogenetska_transkripcijska_naprava_za_izboljšanje_homeostaze_krvnega_sladkorja_pri_miših Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših] (Natalija Pucihar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_bakterij_Escherichia_coli_odzivnih_na_svetlobo Inženiring bakterij ''Escherichia coli'' odzivnih na svetlobo] (Karmen Žbogar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_in%C5%BEeniring_intergenskih_regij_v_operonih_uravnava_izra%C5%BEanje_ve%C4%8D_genov Kombinatorični inženiring intergenskih regij v operonih uravnava izražanje več genov] (Urška Kašnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Stohasti%C4%8Dna_oja%C4%8Ditev_in_signalizacija_v_substratnih_ciklih_s_%C5%A1umom_induciranih_bistabilnosti_z_oscilacijami Stohastična ojačitev in signalizacija v substratnih ciklih s šumom induciranih bistabilnosti z oscilacijami] (Uroš Zavrtanik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zaznavalni_niz_genetskih_biopikslov_sklopljenih_preko_radikalov Zaznavalni niz genetskih "biopikslov", sklopljenih preko radikalov] (Miha Koprivnikar Krajnc)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularna_optimizacija_večgenskih_poti_za_proizvodnjo_maščobnih_kislin_v_E._coli Modularna optimizacija večgenskih poti za proizvodnjo maščobnih kislin v ''E. coli''] (Špela Koren)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razodetje_povezovalnega_kompleksa_med_endoplazemskim_retikulumom_in_mitohondrijem_s_presejalnim_testom_sintezne_biologije Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije] (Blaž Lebar)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) <br>
[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Canditect:_hitra_detekcija_vaginalne_infekcije_s_Candido_albicans_z_uporabo_sistema_CRISPR/dCas9 Canditect – hitra detekcija vaginalne infekcije s Candido albicans z uporabo sistema CRISPR/dCas9] (Jerneja Ovčar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAPOEIRA_-_razvoj_personaliziranega_cepiva_proti_raku_in_sistema_za_spremljanje_odziva_na_zdravljenje CAPOEIRA – razvoj personaliziranega cepiva proti raku in sistema za spremljanje odziva na zdravljenje] (Anamarija Habič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biotic_Blue_-_encimska_razgradnja_zdravilnih_u%C4%8Dinkovin_v_odpadnih_vodah#BIOTIC_BLUE BIOTIC BLUE - encimska razgradnja zdravilnih učinkovin v odpadnih vodah] (Tina Požun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Of_CO2urse_-_sistem_za_zmanj%C5%A1evanje_izpustov_ogljikovega_dioksida_v_industriji Of CO<sub>2</sub>urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji] (Kity Požek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cockroach_terminator Cockroach terminator]] (Roberta Mulac)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MiBiome_-_probioti%C4%8Dna_bakterija_za_zdravljenje_kroni%C4%8Dne_vnetne_%C4%8Drevesne_bolezni MiBiome - probiotična bakterija za zdravljenje kronične vnetne črevesne bolezni] (Ernest Šprager)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BioWatcher_pametna_ura_za_sledenje_ravni_biomarkerjev_za_bolezni BioWatcher: Pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni] (Nina Mavec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAT-Seq:_Visokoprepustna_metoda_za_analizo_katalitske_aktivnosti_biomolekul CAT-Seq: Visokoprepustna metoda za analizo katalitske aktivnosti biomolekul] (Bine Tršavec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/VIBRIGENS:_pospe%C5%A1evanje_procesov_sintezne_biologije_z_Vibrio_natriegens VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z ''Vibrio natriegens''] (Tadej Satler)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/APIS-_nov_pristop_za_zdravljenje_oku%C5%BEbe_z_Nosema_caranae_pri_%C4%8Debelah#PROJEKT_APIS APIS- nov pristop za zdravljenje okužbe z Nosema caranae pri čebelah] (Jerneja Kocutar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/StyGreen_-_proizvodnja_stirena_iz_obnovljivih_virov: StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov] (Milena Stojkovska)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

22.11.<br>
1 <br>
2 Valentina Levak <br>

27.11.<br>
1 <br>
2 <br>
3 <br>
4 <br>

29.11.<br>
1 Matej Kolarič<br>
2 Špela Malenšek<br>
3 <br>
4 <br>

4.12.<br>
1 Gašper Žun<br>
2 Fran Krstanovic<br>
3 <br>
4 <br>

6.12.<br>
1 Urška Jelenovec<br>
2 Rok Miklavčič <br>
3 <br>
4 <br>

11.12.<br>
1 Jerneja Ovčar<br>
2 Neža Koritnik<br>
3 Gašper Virant<br>
4 Gašper Marinšek<br>

18.12.<br>
1 Tina Požun<br>
2 Anamarija Habič<br>
3 Roberta Mulac<br>
4 Kity Požek<br>

3.1.<br>
1 Nina Mavec<br>
2 Primož Tič<br>
3 Ernest Šprager<br>
4 <br>

8.1.<br>
1 Marija Atanasova<br>
2 Bine Tršavec<br>
3 Peter Pečan<br>
4 Tjaša Sorčan<br>

10.1.<br>
1 Urška Kašnik<br>
2 Natalija Pucihar<br>
3 Karmen Žbogar<br>
4 Uroš Zavrtanik<br>

15.1.<br>
1 Jerneja Kocutar<br>
2 Špela Koren<br>
3 Tadej Satler<br>
4 Miha Koprivnikar Krajnc<br>

17.1.<br>
1 Milena Stojkovska<br>
2 Blaž Lebar<br>

Seminarji SB 2018/19

2019-01-15T19:53:15Z

Blazlebar:

V študijskem letu 2018/19 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br>

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RNA-stikala_tipa_%C2%BBToehold%C2%AB:_de_novo_oblikovani_regulatorji_izra%C5%BEanja_genov RNA-stikala tipa Toehold: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov] (Špela Malenšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Raznoliko_in_modelno_zasnovana_priprava_sinteti%C4%8Dnih_genskih_vezij_s_predvidenimi_lastnostmi Raznoliko in modelno zasnovana priprava sintetičnih genskih vezij s predvidenimi lastnostmi] (Matej Kolarič)

[[Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage]] (Fran Krstanović)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nekaj_pogledov_na_sistemsko_biologijo_kvasovke Nekaj pogledov na sistemsko biologijo kvasovke] (Gašper Žun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organizacija_znotrajceli%C4%8Dnih_reakcij_z_razumsko_na%C4%8Drtovanimi_RNA_sestavi#Na.C4.8Drtovanje_in_sestavljanje_RNA_sestavov Organizacija znotrajceličnih reakcij z razumsko načrtovanimi RNA sestavi] (Urška Jelenovec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biolo%C5%A1ko_vezje_na_osnovi_RNA-interference_za_identifikacijo_specifi%C4%8Dnih_rakavih_celic Biološko vezje na osnovi RNA-interference za identifikacijo specifičnih rakavih celic] (Gašper Marinšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kontrola_hitrosti_translacije_preko_pomožnega_mesta_5’-UTR:_energijski_kompromis_med_dostopnostjo%2C_selektivnim_razvijanjem_RNA-struktur_in_drsenjem_30S_ribosomske_podenote_po_RNA-strukturah Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah] (Neža Koritnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_genskega_skupka_za_fiksacijo_dušika_bakterije_Klebsiella_oxytoca Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije ''Klebsiella oxytoca''] (Gašper Virant)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Negativna_samoregulacija_linearizira_odziv_na_odmerek_in_zavira_heterogenost_genskega_izražanja Negativna samoregulacija linearizira odziv na odmerek in zavira heterogenost genskega izražanja] (Primož Tič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Design_and_analysis_of_synthetic_carbon_fixation_pathways Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways] (Marija Atanasova)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pol-sinteti%C4%8Den_organizem_z_raz%C5%A1irjeno_gensko_abecedo Pol-sintetičen organizem z razširjeno gensko abecedo] (Peter Pečan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programirano_uti%C5%A1anje_in_aktivacija_izra%C5%BEanja_bakterijskega_gena_z_uporabo_konstruiranega_CRISPR-Cas_sistema Programirano utišanje in aktivacija izražanja bakterijskega gena z uporabo konstruiranega CRISPR-Cas sistema] (Tjaša Sorčan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_optogenetska_transkripcijska_naprava_za_izboljšanje_homeostaze_krvnega_sladkorja_pri_miših Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših] (Natalija Pucihar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_bakterij_Escherichia_coli_odzivnih_na_svetlobo Inženiring bakterij ''Escherichia coli'' odzivnih na svetlobo] (Karmen Žbogar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_in%C5%BEeniring_intergenskih_regij_v_operonih_uravnava_izra%C5%BEanje_ve%C4%8D_genov Kombinatorični inženiring intergenskih regij v operonih uravnava izražanje več genov] (Urška Kašnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Stohasti%C4%8Dna_oja%C4%8Ditev_in_signalizacija_v_substratnih_ciklih_s_%C5%A1umom_induciranih_bistabilnosti_z_oscilacijami Stohastična ojačitev in signalizacija v substratnih ciklih s šumom induciranih bistabilnosti z oscilacijami] (Uroš Zavrtanik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zaznavalni_niz_genetskih_biopikslov_sklopljenih_preko_radikalov Zaznavalni niz genetskih "biopikslov", sklopljenih preko radikalov] (Miha Koprivnikar Krajnc)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularna_optimizacija_večgenskih_poti_za_proizvodnjo_maščobnih_kislin_v_E._coli Modularna optimizacija večgenskih poti za proizvodnjo maščobnih kislin v ''E. coli''] (Špela Koren)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razodetje_povezovalnega_kompleksa_med_endoplazemskim_retikulumom_in_mitohondrijem_s_presejalnim_testom_sintezne_biologije] (Blaž Lebar)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) <br>
[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Canditect:_hitra_detekcija_vaginalne_infekcije_s_Candido_albicans_z_uporabo_sistema_CRISPR/dCas9 Canditect – hitra detekcija vaginalne infekcije s Candido albicans z uporabo sistema CRISPR/dCas9] (Jerneja Ovčar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAPOEIRA_-_razvoj_personaliziranega_cepiva_proti_raku_in_sistema_za_spremljanje_odziva_na_zdravljenje CAPOEIRA – razvoj personaliziranega cepiva proti raku in sistema za spremljanje odziva na zdravljenje] (Anamarija Habič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biotic_Blue_-_encimska_razgradnja_zdravilnih_u%C4%8Dinkovin_v_odpadnih_vodah#BIOTIC_BLUE BIOTIC BLUE - encimska razgradnja zdravilnih učinkovin v odpadnih vodah] (Tina Požun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Of_CO2urse_-_sistem_za_zmanj%C5%A1evanje_izpustov_ogljikovega_dioksida_v_industriji Of CO<sub>2</sub>urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji] (Kity Požek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cockroach_terminator Cockroach terminator]] (Roberta Mulac)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MiBiome_-_probioti%C4%8Dna_bakterija_za_zdravljenje_kroni%C4%8Dne_vnetne_%C4%8Drevesne_bolezni MiBiome - probiotična bakterija za zdravljenje kronične vnetne črevesne bolezni] (Ernest Šprager)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BioWatcher_pametna_ura_za_sledenje_ravni_biomarkerjev_za_bolezni BioWatcher: Pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni] (Nina Mavec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAT-Seq:_Visokoprepustna_metoda_za_analizo_katalitske_aktivnosti_biomolekul CAT-Seq: Visokoprepustna metoda za analizo katalitske aktivnosti biomolekul] (Bine Tršavec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/VIBRIGENS:_pospe%C5%A1evanje_procesov_sintezne_biologije_z_Vibrio_natriegens VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z ''Vibrio natriegens''] (Tadej Satler)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/APIS-_nov_pristop_za_zdravljenje_oku%C5%BEbe_z_Nosema_caranae_pri_%C4%8Debelah#PROJEKT_APIS APIS- nov pristop za zdravljenje okužbe z Nosema caranae pri čebelah] (Jerneja Kocutar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/StyGreen_-_proizvodnja_stirena_iz_obnovljivih_virov: StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov] (Milena Stojkovska)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

22.11.<br>
1 <br>
2 Valentina Levak <br>

27.11.<br>
1 <br>
2 <br>
3 <br>
4 <br>

29.11.<br>
1 Matej Kolarič<br>
2 Špela Malenšek<br>
3 <br>
4 <br>

4.12.<br>
1 Gašper Žun<br>
2 Fran Krstanovic<br>
3 <br>
4 <br>

6.12.<br>
1 Urška Jelenovec<br>
2 Rok Miklavčič <br>
3 <br>
4 <br>

11.12.<br>
1 Jerneja Ovčar<br>
2 Neža Koritnik<br>
3 Gašper Virant<br>
4 Gašper Marinšek<br>

18.12.<br>
1 Tina Požun<br>
2 Anamarija Habič<br>
3 Roberta Mulac<br>
4 Kity Požek<br>

3.1.<br>
1 Nina Mavec<br>
2 Primož Tič<br>
3 Ernest Šprager<br>
4 <br>

8.1.<br>
1 Marija Atanasova<br>
2 Bine Tršavec<br>
3 Peter Pečan<br>
4 Tjaša Sorčan<br>

10.1.<br>
1 Urška Kašnik<br>
2 Natalija Pucihar<br>
3 Karmen Žbogar<br>
4 Uroš Zavrtanik<br>

15.1.<br>
1 Jerneja Kocutar<br>
2 Špela Koren<br>
3 Tadej Satler<br>
4 Miha Koprivnikar Krajnc<br>

17.1.<br>
1 Milena Stojkovska<br>
2 Blaž Lebar<br>

Seminarji SB 2018/19

2019-01-15T19:52:53Z

Blazlebar:

V študijskem letu 2018/19 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br>

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RNA-stikala_tipa_%C2%BBToehold%C2%AB:_de_novo_oblikovani_regulatorji_izra%C5%BEanja_genov RNA-stikala tipa Toehold: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov] (Špela Malenšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Raznoliko_in_modelno_zasnovana_priprava_sinteti%C4%8Dnih_genskih_vezij_s_predvidenimi_lastnostmi Raznoliko in modelno zasnovana priprava sintetičnih genskih vezij s predvidenimi lastnostmi] (Matej Kolarič)

[[Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage]] (Fran Krstanović)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nekaj_pogledov_na_sistemsko_biologijo_kvasovke Nekaj pogledov na sistemsko biologijo kvasovke] (Gašper Žun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organizacija_znotrajceli%C4%8Dnih_reakcij_z_razumsko_na%C4%8Drtovanimi_RNA_sestavi#Na.C4.8Drtovanje_in_sestavljanje_RNA_sestavov Organizacija znotrajceličnih reakcij z razumsko načrtovanimi RNA sestavi] (Urška Jelenovec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biolo%C5%A1ko_vezje_na_osnovi_RNA-interference_za_identifikacijo_specifi%C4%8Dnih_rakavih_celic Biološko vezje na osnovi RNA-interference za identifikacijo specifičnih rakavih celic] (Gašper Marinšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kontrola_hitrosti_translacije_preko_pomožnega_mesta_5’-UTR:_energijski_kompromis_med_dostopnostjo%2C_selektivnim_razvijanjem_RNA-struktur_in_drsenjem_30S_ribosomske_podenote_po_RNA-strukturah Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah] (Neža Koritnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_genskega_skupka_za_fiksacijo_dušika_bakterije_Klebsiella_oxytoca Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije ''Klebsiella oxytoca''] (Gašper Virant)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Negativna_samoregulacija_linearizira_odziv_na_odmerek_in_zavira_heterogenost_genskega_izražanja Negativna samoregulacija linearizira odziv na odmerek in zavira heterogenost genskega izražanja] (Primož Tič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Design_and_analysis_of_synthetic_carbon_fixation_pathways Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways] (Marija Atanasova)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pol-sinteti%C4%8Den_organizem_z_raz%C5%A1irjeno_gensko_abecedo Pol-sintetičen organizem z razširjeno gensko abecedo] (Peter Pečan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programirano_uti%C5%A1anje_in_aktivacija_izra%C5%BEanja_bakterijskega_gena_z_uporabo_konstruiranega_CRISPR-Cas_sistema Programirano utišanje in aktivacija izražanja bakterijskega gena z uporabo konstruiranega CRISPR-Cas sistema] (Tjaša Sorčan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_optogenetska_transkripcijska_naprava_za_izboljšanje_homeostaze_krvnega_sladkorja_pri_miših Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših] (Natalija Pucihar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_bakterij_Escherichia_coli_odzivnih_na_svetlobo Inženiring bakterij ''Escherichia coli'' odzivnih na svetlobo] (Karmen Žbogar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_in%C5%BEeniring_intergenskih_regij_v_operonih_uravnava_izra%C5%BEanje_ve%C4%8D_genov Kombinatorični inženiring intergenskih regij v operonih uravnava izražanje več genov] (Urška Kašnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Stohasti%C4%8Dna_oja%C4%8Ditev_in_signalizacija_v_substratnih_ciklih_s_%C5%A1umom_induciranih_bistabilnosti_z_oscilacijami Stohastična ojačitev in signalizacija v substratnih ciklih s šumom induciranih bistabilnosti z oscilacijami] (Uroš Zavrtanik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zaznavalni_niz_genetskih_biopikslov_sklopljenih_preko_radikalov Zaznavalni niz genetskih "biopikslov", sklopljenih preko radikalov] (Miha Koprivnikar Krajnc)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularna_optimizacija_večgenskih_poti_za_proizvodnjo_maščobnih_kislin_v_E._coli Modularna optimizacija večgenskih poti za proizvodnjo maščobnih kislin v ''E. coli''] (Špela Koren)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razodetje_povezovalnega_kompleksa_med_endoplazemskim_retikulumom_in_mitohondrijem_s_presejalnim_testom_sintezne_biologije] (Blaž Lebar)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) <br>
[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Canditect:_hitra_detekcija_vaginalne_infekcije_s_Candido_albicans_z_uporabo_sistema_CRISPR/dCas9 Canditect – hitra detekcija vaginalne infekcije s Candido albicans z uporabo sistema CRISPR/dCas9] (Jerneja Ovčar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAPOEIRA_-_razvoj_personaliziranega_cepiva_proti_raku_in_sistema_za_spremljanje_odziva_na_zdravljenje CAPOEIRA – razvoj personaliziranega cepiva proti raku in sistema za spremljanje odziva na zdravljenje] (Anamarija Habič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biotic_Blue_-_encimska_razgradnja_zdravilnih_u%C4%8Dinkovin_v_odpadnih_vodah#BIOTIC_BLUE BIOTIC BLUE - encimska razgradnja zdravilnih učinkovin v odpadnih vodah] (Tina Požun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Of_CO2urse_-_sistem_za_zmanj%C5%A1evanje_izpustov_ogljikovega_dioksida_v_industriji Of CO<sub>2</sub>urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji] (Kity Požek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cockroach_terminator Cockroach terminator]] (Roberta Mulac)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MiBiome_-_probioti%C4%8Dna_bakterija_za_zdravljenje_kroni%C4%8Dne_vnetne_%C4%8Drevesne_bolezni MiBiome - probiotična bakterija za zdravljenje kronične vnetne črevesne bolezni] (Ernest Šprager)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BioWatcher_pametna_ura_za_sledenje_ravni_biomarkerjev_za_bolezni BioWatcher: Pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni] (Nina Mavec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAT-Seq:_Visokoprepustna_metoda_za_analizo_katalitske_aktivnosti_biomolekul CAT-Seq: Visokoprepustna metoda za analizo katalitske aktivnosti biomolekul] (Bine Tršavec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/VIBRIGENS:_pospe%C5%A1evanje_procesov_sintezne_biologije_z_Vibrio_natriegens VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z ''Vibrio natriegens''] (Tadej Satler)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/APIS-_nov_pristop_za_zdravljenje_oku%C5%BEbe_z_Nosema_caranae_pri_%C4%8Debelah#PROJEKT_APIS APIS- nov pristop za zdravljenje okužbe z Nosema caranae pri čebelah] (Jerneja Kocutar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/StyGreen_-_proizvodnja_stirena_iz_obnovljivih_virov: StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov] (Milena Stojkovska)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razodetje_povezovalnega_kompleksa_med_endoplazemskim_retikulumom_in_mitohondrijem_s_presejalnim_testom_sintezne_biologije] (Blaž Lebar)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

22.11.<br>
1 <br>
2 Valentina Levak <br>

27.11.<br>
1 <br>
2 <br>
3 <br>
4 <br>

29.11.<br>
1 Matej Kolarič<br>
2 Špela Malenšek<br>
3 <br>
4 <br>

4.12.<br>
1 Gašper Žun<br>
2 Fran Krstanovic<br>
3 <br>
4 <br>

6.12.<br>
1 Urška Jelenovec<br>
2 Rok Miklavčič <br>
3 <br>
4 <br>

11.12.<br>
1 Jerneja Ovčar<br>
2 Neža Koritnik<br>
3 Gašper Virant<br>
4 Gašper Marinšek<br>

18.12.<br>
1 Tina Požun<br>
2 Anamarija Habič<br>
3 Roberta Mulac<br>
4 Kity Požek<br>

3.1.<br>
1 Nina Mavec<br>
2 Primož Tič<br>
3 Ernest Šprager<br>
4 <br>

8.1.<br>
1 Marija Atanasova<br>
2 Bine Tršavec<br>
3 Peter Pečan<br>
4 Tjaša Sorčan<br>

10.1.<br>
1 Urška Kašnik<br>
2 Natalija Pucihar<br>
3 Karmen Žbogar<br>
4 Uroš Zavrtanik<br>

15.1.<br>
1 Jerneja Kocutar<br>
2 Špela Koren<br>
3 Tadej Satler<br>
4 Miha Koprivnikar Krajnc<br>

17.1.<br>
1 Milena Stojkovska<br>
2 Blaž Lebar<br>