https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=Bm7118 2026-05-04T17:26:16Z User contributions MediaWiki 1.45.3 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=SBTS&diff=17599 2020-09-26T10:02:28Z

<p>Bm7118: /* F */</p> <hr /> <div>= Sinteznobiološki terminološki slovar =<br /> Tu bo postopno rasel sinteznobiološki angleško slovenski slovar. Morebitne nove izraze vpisujte sami in če imate predlog za prevod, vpišite tudi tega. Da bomo vedeli, kateri izrazi so novi, jih vpišite ''poševno''.<br /> <br /> ==A==<br /> abstraction - abstrakcija, abstrahiranje&lt;br&gt;<br /> actuator - prožilo, aktuator&lt;br&gt;<br /> amplification - pomnožitev (DNA)&lt;br&gt;<br /> amplitude - amplituda&lt;br&gt;<br /> annotation - anotacija&lt;br&gt;<br /> aptazyme - aptacim&lt;br&gt;<br /> assembly - sestav?, sestavljanje&lt;br&gt;<br /> autopoiesis - avtopoeza; samoohranjanje, samoproizvajanje? (soc.), samozadostnost?, samorazmnoževanje?, npr. autopoiesis system - samoohranjevalni sistem&lt;br&gt;<br /> <br /> ==B==<br /> back insert (BI) - zadnji vključek (BI); prim. front insert&lt;br&gt;<br /> back vector (BV) - zadnji vektor (BV); prim. front vector&lt;br&gt;<br /> band detector - pasovni detektor&lt;br&gt;<br /> band pass filter - pasovnoprepustni filter&lt;br&gt;<br /> biobrick - biokocka&lt;br&gt;<br /> BioBrick(R) - BioBrick(R) (zaščiteno ime - ne prevajamo)&lt;br&gt;<br /> bioprinting - biotisk, biotiskanje&lt;br&gt;<br /> biosafety - biološka varnost&lt;br&gt;<br /> biosecurity - biološka varnost ?&lt;br&gt;<br /> bistable switch - dvopolno stikalo&lt;br&gt;<br /> bottom-up - od spodaj navzgor<br /> <br /> ==C==<br /> CAR --&gt; gl. chimeric antigen receptor&lt;br&gt;<br /> Cas --&gt; gl. CRISPR-associated&lt;br&gt;<br /> chimeric antigen receptor - himerni receptor za antigen&lt;br&gt;<br /> circuit - vezje&lt;br&gt;<br /> clustered regularly interspersed short palindromic repeats (CRISPR) - gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev (CRISPR)&lt;br&gt;<br /> comparator - primerjalnik&lt;br&gt;<br /> composable - sestavljiv; npr. composable inverter - sestavljivi inverter&lt;br&gt;<br /> CRISPR-associated (Cas) - s CRISPR povezan (Cas); v povezavi s CRISPR (Cas)&lt;br&gt;<br /> <br /> ==D==<br /> DArT --&gt; gl. diversity arrays technology&lt;br&gt;<br /> decoupling - razklop&lt;br&gt;<br /> degradation tag - oznaka za razgradnjo&lt;br&gt;<br /> designer receptors exclusively activated by designer drugs - dizajnerski receptorji, izključno aktivirani z dizajnerskimi zdravili&lt;br&gt;<br /> destination vector - ciljni vektor (toda: target vector!); destinacijski vektor (J. Turnšek, diploma BF 2012)&lt;br&gt;<br /> digital sequence information - digitalni podatki o zaporedjih (v kontekstu Nagojskega protokola); za razumevanje bi zadoščalo 'zaporedja'&lt;br&gt;<br /> diresidue - ostanka (pri TALE), gl. repeat variable diresidue&lt;br&gt;<br /> diversity arrays technology (DArT) - tehnologija razlikovalnih mrež (DArT)&lt;br&gt;<br /> DREADD --&gt; gl. designer receptors exclusively activated by designer drugs&lt;br&gt;<br /> <br /> ==E==<br /> enabling technologies - zmogljive napredne tehnologije, prebojne tehnologije<br /> <br /> ==F==<br /> front insert (FI) - sprednji vključek (FI); prim. back insert&lt;br&gt;<br /> front vector (FV) - sprednji vektor (FV); prim. back vector&lt;br&gt;<br /> ''four-helix bundle - snop štirih alfa vijačnic''<br /> <br /> ==G==<br /> gate - vrata&lt;br&gt;<br /> ''gene stacking - nalaganje genov''&lt;br&gt;<br /> guide RNA - usmerjevalna RNA [terminol. slovar SBD, 2. izdaja v pripravi], vodeča RNA (pri tehniki CRISPR-Cas)<br /> <br /> ==H==<br /> high-pass filter - visokoprepustni filter<br /> <br /> ==I==<br /> <br /> ==J==<br /> <br /> ==K==<br /> kill-switch - stikalo za uničenje, ubijalsko stikalo (inducibilni sistem za samouničenje celice); izklopno stikalo (v tehniški varnosti 'stikalo za izklop v sili')&lt;br&gt;<br /> killer gene - ubijalski gen [pri mehanizmih biološke varnosti; povzročijo samomor celice, ko se aktivirajo]<br /> <br /> ==L==<br /> LID --&gt; gl. ligand-induced degradation&lt;br&gt;<br /> ligand-induced degradation - z ligandom inducirana razgradnja&lt;br&gt;<br /> logic circuit - logično vezje&lt;br&gt;<br /> logic gate - logična vrata&lt;br&gt;<br /> low-pass filter - nizkoprepustni filter&lt;br&gt;<br /> <br /> ==M==<br /> ''multigene construct: večgenski konstrukt''<br /> <br /> ==N==<br /> <br /> ==O==<br /> <br /> ==P==<br /> PAM --&gt; glej protospacer adjacent motif&lt;br&gt;<br /> PCA --&gt; glej polymerase cycling assembly&lt;br&gt;<br /> persistent genes - persistentni geni (tisti, ki so ohranjeni v večini genomov in se močno izražajo)&lt;br&gt;<br /> polymerase cycling assembly (PCA) - verižno sestavljanje s polimerazo&lt;br&gt;<br /> prefix - predpona; zgornji rob (?); prim. suffix&lt;br&gt;<br /> protospacer adjacent motif (PAM) - motiv ob protovmesniku<br /> <br /> ==Q==<br /> <br /> ==R==<br /> RASSL --&gt; gl. receptors activated solely by synthetic ligands&lt;br&gt;<br /> receptors activated solely by synthetic ligands - receptorji, aktivirani izključno s sintetičnimi ligandi&lt;br&gt;<br /> recombineering - rekombinacijsko inženirstvo (angl. recombination-mediated genetic engineering), ?rekombinirstvo &lt;br&gt;<br /> reconstruction - rekonstrukcija (genome reconstruction - rekonstrukcija genoma, rekonstruiranje genoma)&lt;br&gt;<br /> refactoring - preoblikovanje kode (v sintezni genomiki)&lt;br&gt;<br /> registry - register&lt;br&gt;<br /> repeat variable diresidue - variabilna ostanka v ponovitvi (nanaša se na domene v proteinih TALE)&lt;br&gt;<br /> rewire - prevezati&lt;br&gt;<br /> rewiring - prevezava [prevod ni optimalen, npr. v kontekstu 'rewiring nature', kar pomeni bolj 'preureditev z uvedbo drugačnih povezav']&lt;br&gt;<br /> RISC (RNA-induced silencing complex) - z RNA induciran utiševalni kompleks&lt;br&gt;<br /> ring oscilator - obročasti oscilator &lt;br&gt;<br /> Recombinase Polymerase Amplification (RPA) - pomnoževanje z rekombinazo in polimerazo (?)<br /> <br /> ==S==<br /> scaffold - ogrodje &lt;br&gt;<br /> scar - spoj, brazgotina (?) (op.: z leti se je 'spoj' bolj uveljavil)&lt;br&gt;<br /> sensor - senzor&lt;br&gt;<br /> standardisation - standardizacija&lt;br&gt;<br /> standby ribosome binding site - pomožno vezavno mesto za ribosom&lt;br&gt;<br /> suffix - obrazilo; spodnji rob (?) (op.: z leti se je 'obrazilo' bolj uveljavilo)&lt;br&gt;<br /> suicide switch - samomorilsko stikalo&lt;br&gt;<br /> switch - stikalo&lt;br&gt;<br /> synthetic attenuated virus - sintetični atenuiran virus&lt;br&gt;<br /> <br /> ==T==<br /> TAL (transcription activator-like) - podoben transkripcijskemu aktivatorju&lt;br&gt;<br /> TALE (transcription activator-like effector) - efektor, podoben transkripcijskemu aktivatorju&lt;br&gt;<br /> TALEN (TALE nuclease) - efektorska nukleaza, podobna transkripcijskemu aktivatorju, TALE-nukleaza&lt;br&gt;<br /> tracrRNA - gl. transactivating crRNA&lt;br&gt;<br /> transactivating crRNA - transaktivacijska crRNA (pri CRISPR/Cas)br&gt;<br /> transducer - pretvornik &lt;br&gt;<br /> tunable oscillator - nastavljivi oscilator &lt;br&gt;<br /> <br /> ==U==<br /> <br /> ==V==<br /> <br /> ==X==<br /> xeno nucleic acid (XNA) - ksenonukleinska kislina (XNA)&lt;br&gt;<br /> xeno-nucleotide - ksenonukleotid&lt;br&gt;<br /> xeno-organism - ksenoorganizem&lt;br&gt;<br /> xenosome - ksenosom [analog ribosoma, ki je kompatibilen s XNA]&lt;br&gt;<br /> XNA --&gt; gl. xeno nucleic acid<br /> <br /> ==Y==<br /> <br /> ==Z==<br /> zinc finger nuclease - nukleaza s cinkovimi prsti</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=SBTS&diff=17598 2020-09-26T10:02:00Z

<p>Bm7118: /* F */</p> <hr /> <div>= Sinteznobiološki terminološki slovar =<br /> Tu bo postopno rasel sinteznobiološki angleško slovenski slovar. Morebitne nove izraze vpisujte sami in če imate predlog za prevod, vpišite tudi tega. Da bomo vedeli, kateri izrazi so novi, jih vpišite ''poševno''.<br /> <br /> ==A==<br /> abstraction - abstrakcija, abstrahiranje&lt;br&gt;<br /> actuator - prožilo, aktuator&lt;br&gt;<br /> amplification - pomnožitev (DNA)&lt;br&gt;<br /> amplitude - amplituda&lt;br&gt;<br /> annotation - anotacija&lt;br&gt;<br /> aptazyme - aptacim&lt;br&gt;<br /> assembly - sestav?, sestavljanje&lt;br&gt;<br /> autopoiesis - avtopoeza; samoohranjanje, samoproizvajanje? (soc.), samozadostnost?, samorazmnoževanje?, npr. autopoiesis system - samoohranjevalni sistem&lt;br&gt;<br /> <br /> ==B==<br /> back insert (BI) - zadnji vključek (BI); prim. front insert&lt;br&gt;<br /> back vector (BV) - zadnji vektor (BV); prim. front vector&lt;br&gt;<br /> band detector - pasovni detektor&lt;br&gt;<br /> band pass filter - pasovnoprepustni filter&lt;br&gt;<br /> biobrick - biokocka&lt;br&gt;<br /> BioBrick(R) - BioBrick(R) (zaščiteno ime - ne prevajamo)&lt;br&gt;<br /> bioprinting - biotisk, biotiskanje&lt;br&gt;<br /> biosafety - biološka varnost&lt;br&gt;<br /> biosecurity - biološka varnost ?&lt;br&gt;<br /> bistable switch - dvopolno stikalo&lt;br&gt;<br /> bottom-up - od spodaj navzgor<br /> <br /> ==C==<br /> CAR --&gt; gl. chimeric antigen receptor&lt;br&gt;<br /> Cas --&gt; gl. CRISPR-associated&lt;br&gt;<br /> chimeric antigen receptor - himerni receptor za antigen&lt;br&gt;<br /> circuit - vezje&lt;br&gt;<br /> clustered regularly interspersed short palindromic repeats (CRISPR) - gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev (CRISPR)&lt;br&gt;<br /> comparator - primerjalnik&lt;br&gt;<br /> composable - sestavljiv; npr. composable inverter - sestavljivi inverter&lt;br&gt;<br /> CRISPR-associated (Cas) - s CRISPR povezan (Cas); v povezavi s CRISPR (Cas)&lt;br&gt;<br /> <br /> ==D==<br /> DArT --&gt; gl. diversity arrays technology&lt;br&gt;<br /> decoupling - razklop&lt;br&gt;<br /> degradation tag - oznaka za razgradnjo&lt;br&gt;<br /> designer receptors exclusively activated by designer drugs - dizajnerski receptorji, izključno aktivirani z dizajnerskimi zdravili&lt;br&gt;<br /> destination vector - ciljni vektor (toda: target vector!); destinacijski vektor (J. Turnšek, diploma BF 2012)&lt;br&gt;<br /> digital sequence information - digitalni podatki o zaporedjih (v kontekstu Nagojskega protokola); za razumevanje bi zadoščalo 'zaporedja'&lt;br&gt;<br /> diresidue - ostanka (pri TALE), gl. repeat variable diresidue&lt;br&gt;<br /> diversity arrays technology (DArT) - tehnologija razlikovalnih mrež (DArT)&lt;br&gt;<br /> DREADD --&gt; gl. designer receptors exclusively activated by designer drugs&lt;br&gt;<br /> <br /> ==E==<br /> enabling technologies - zmogljive napredne tehnologije, prebojne tehnologije<br /> <br /> ==F==<br /> front insert (FI) - sprednji vključek (FI); prim. back insert&lt;br&gt;<br /> front vector (FV) - sprednji vektor (FV); prim. back vector<br /> ''four-helix bundle - snop štirih alfa vijačnic''<br /> <br /> ==G==<br /> gate - vrata&lt;br&gt;<br /> ''gene stacking - nalaganje genov''&lt;br&gt;<br /> guide RNA - usmerjevalna RNA [terminol. slovar SBD, 2. izdaja v pripravi], vodeča RNA (pri tehniki CRISPR-Cas)<br /> <br /> ==H==<br /> high-pass filter - visokoprepustni filter<br /> <br /> ==I==<br /> <br /> ==J==<br /> <br /> ==K==<br /> kill-switch - stikalo za uničenje, ubijalsko stikalo (inducibilni sistem za samouničenje celice); izklopno stikalo (v tehniški varnosti 'stikalo za izklop v sili')&lt;br&gt;<br /> killer gene - ubijalski gen [pri mehanizmih biološke varnosti; povzročijo samomor celice, ko se aktivirajo]<br /> <br /> ==L==<br /> LID --&gt; gl. ligand-induced degradation&lt;br&gt;<br /> ligand-induced degradation - z ligandom inducirana razgradnja&lt;br&gt;<br /> logic circuit - logično vezje&lt;br&gt;<br /> logic gate - logična vrata&lt;br&gt;<br /> low-pass filter - nizkoprepustni filter&lt;br&gt;<br /> <br /> ==M==<br /> ''multigene construct: večgenski konstrukt''<br /> <br /> ==N==<br /> <br /> ==O==<br /> <br /> ==P==<br /> PAM --&gt; glej protospacer adjacent motif&lt;br&gt;<br /> PCA --&gt; glej polymerase cycling assembly&lt;br&gt;<br /> persistent genes - persistentni geni (tisti, ki so ohranjeni v večini genomov in se močno izražajo)&lt;br&gt;<br /> polymerase cycling assembly (PCA) - verižno sestavljanje s polimerazo&lt;br&gt;<br /> prefix - predpona; zgornji rob (?); prim. suffix&lt;br&gt;<br /> protospacer adjacent motif (PAM) - motiv ob protovmesniku<br /> <br /> ==Q==<br /> <br /> ==R==<br /> RASSL --&gt; gl. receptors activated solely by synthetic ligands&lt;br&gt;<br /> receptors activated solely by synthetic ligands - receptorji, aktivirani izključno s sintetičnimi ligandi&lt;br&gt;<br /> recombineering - rekombinacijsko inženirstvo (angl. recombination-mediated genetic engineering), ?rekombinirstvo &lt;br&gt;<br /> reconstruction - rekonstrukcija (genome reconstruction - rekonstrukcija genoma, rekonstruiranje genoma)&lt;br&gt;<br /> refactoring - preoblikovanje kode (v sintezni genomiki)&lt;br&gt;<br /> registry - register&lt;br&gt;<br /> repeat variable diresidue - variabilna ostanka v ponovitvi (nanaša se na domene v proteinih TALE)&lt;br&gt;<br /> rewire - prevezati&lt;br&gt;<br /> rewiring - prevezava [prevod ni optimalen, npr. v kontekstu 'rewiring nature', kar pomeni bolj 'preureditev z uvedbo drugačnih povezav']&lt;br&gt;<br /> RISC (RNA-induced silencing complex) - z RNA induciran utiševalni kompleks&lt;br&gt;<br /> ring oscilator - obročasti oscilator &lt;br&gt;<br /> Recombinase Polymerase Amplification (RPA) - pomnoževanje z rekombinazo in polimerazo (?)<br /> <br /> ==S==<br /> scaffold - ogrodje &lt;br&gt;<br /> scar - spoj, brazgotina (?) (op.: z leti se je 'spoj' bolj uveljavil)&lt;br&gt;<br /> sensor - senzor&lt;br&gt;<br /> standardisation - standardizacija&lt;br&gt;<br /> standby ribosome binding site - pomožno vezavno mesto za ribosom&lt;br&gt;<br /> suffix - obrazilo; spodnji rob (?) (op.: z leti se je 'obrazilo' bolj uveljavilo)&lt;br&gt;<br /> suicide switch - samomorilsko stikalo&lt;br&gt;<br /> switch - stikalo&lt;br&gt;<br /> synthetic attenuated virus - sintetični atenuiran virus&lt;br&gt;<br /> <br /> ==T==<br /> TAL (transcription activator-like) - podoben transkripcijskemu aktivatorju&lt;br&gt;<br /> TALE (transcription activator-like effector) - efektor, podoben transkripcijskemu aktivatorju&lt;br&gt;<br /> TALEN (TALE nuclease) - efektorska nukleaza, podobna transkripcijskemu aktivatorju, TALE-nukleaza&lt;br&gt;<br /> tracrRNA - gl. transactivating crRNA&lt;br&gt;<br /> transactivating crRNA - transaktivacijska crRNA (pri CRISPR/Cas)br&gt;<br /> transducer - pretvornik &lt;br&gt;<br /> tunable oscillator - nastavljivi oscilator &lt;br&gt;<br /> <br /> ==U==<br /> <br /> ==V==<br /> <br /> ==X==<br /> xeno nucleic acid (XNA) - ksenonukleinska kislina (XNA)&lt;br&gt;<br /> xeno-nucleotide - ksenonukleotid&lt;br&gt;<br /> xeno-organism - ksenoorganizem&lt;br&gt;<br /> xenosome - ksenosom [analog ribosoma, ki je kompatibilen s XNA]&lt;br&gt;<br /> XNA --&gt; gl. xeno nucleic acid<br /> <br /> ==Y==<br /> <br /> ==Z==<br /> zinc finger nuclease - nukleaza s cinkovimi prsti</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=17294 2020-05-10T20:16:48Z

<p>Bm7118: </p> <hr /> <div>Povzeto po: T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. 2018, 36, 352–358.<br /> <br /> Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == '''Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov''' ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> == '''Teoretično ozadje''' ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> G=c/R^n <br /> kjer je:<br /> <br /> c – število kopij <br /> <br /> R – koncentracija represorja<br /> <br /> n – kooperativnost vezave<br /> <br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == '''Priprava stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na promotor kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija promotorske regije v promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp promotorske regije pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1].<br /> <br /> ==''' Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> <br /> == '''Aplikacija stabiliziranih promotorjev''' ==<br /> <br /> == '''1. Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1].<br /> <br /> =='''2. Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana'''==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> == '''3. Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=17293 2020-05-10T19:03:43Z

<p>Bm7118: </p> <hr /> <div>Povzeto po: T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. 2018, 36, 352–358.<br /> <br /> Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == '''Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov''' ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> == '''Teoretično ozadje''' ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> G=c/R^n <br /> kjer je:<br /> <br /> c – število kopij <br /> <br /> R – koncentracija represorja<br /> <br /> n – kooperativnost vezave<br /> <br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == '''Priprava stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na promotor kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija promotorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp promotorske regije pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1].<br /> <br /> ==''' Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> <br /> == '''Aplikacija stabiliziranih promotorjev''' ==<br /> <br /> == '''1. Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1].<br /> <br /> =='''2. Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana'''==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> == '''3. Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=17194 2020-05-08T18:24:56Z

<p>Bm7118: /* Vpliv mutacij na replikacijo */</p> <hr /> <div>Povzeto po: T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. 2018, 36, 352–358.<br /> <br /> Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == '''Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov''' ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> == '''Teoretično ozadje''' ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> G=c/R^n <br /> kjer je:<br /> <br /> c – število kopij <br /> <br /> R – koncentracija represorja<br /> <br /> n – kooperativnost vezave<br /> <br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == '''Priprava stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1].<br /> <br /> ==''' Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> <br /> == '''Aplikacija stabiliziranih promotorjev''' ==<br /> <br /> == '''1. Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1].<br /> <br /> =='''2. Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana'''==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> == '''3. Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=17193 2020-05-08T18:24:32Z

<p>Bm7118: /* Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana */</p> <hr /> <div>Povzeto po: T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. 2018, 36, 352–358.<br /> <br /> Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == '''Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov''' ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> == '''Teoretično ozadje''' ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> G=c/R^n <br /> kjer je:<br /> <br /> c – število kopij <br /> <br /> R – koncentracija represorja<br /> <br /> n – kooperativnost vezave<br /> <br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == '''Priprava stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1].<br /> <br /> ==''' Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> <br /> == '''Aplikacija stabiliziranih promotorjev''' ==<br /> <br /> == '''1. Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1].<br /> <br /> =='''2. Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana'''==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> == '''Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=17192 2020-05-08T18:24:19Z

<p>Bm7118: /* Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev */</p> <hr /> <div>Povzeto po: T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. 2018, 36, 352–358.<br /> <br /> Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == '''Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov''' ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> == '''Teoretično ozadje''' ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> G=c/R^n <br /> kjer je:<br /> <br /> c – število kopij <br /> <br /> R – koncentracija represorja<br /> <br /> n – kooperativnost vezave<br /> <br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == '''Priprava stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1].<br /> <br /> ==''' Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> <br /> == '''Aplikacija stabiliziranih promotorjev''' ==<br /> <br /> == '''1. Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1].<br /> <br /> =='''Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana'''==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> == '''Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=17191 2020-05-08T18:23:44Z

<p>Bm7118: /* Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev */</p> <hr /> <div>Povzeto po: T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. 2018, 36, 352–358.<br /> <br /> Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == '''Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov''' ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> == '''Teoretično ozadje''' ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> G=c/R^n <br /> kjer je:<br /> <br /> c – število kopij <br /> <br /> R – koncentracija represorja<br /> <br /> n – kooperativnost vezave<br /> <br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == '''Priprava stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1].<br /> <br /> ==''' Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> <br /> == '''Aplikacija stabiliziranih promotorjev''' ==<br /> <br /> == '''Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> =='''Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana'''==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> == '''Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=17190 2020-05-08T18:23:12Z

<p>Bm7118: </p> <hr /> <div>Povzeto po: T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. 2018, 36, 352–358.<br /> <br /> Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == '''Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov''' ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> == '''Teoretično ozadje''' ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> G=c/R^n <br /> kjer je:<br /> <br /> c – število kopij <br /> <br /> R – koncentracija represorja<br /> <br /> n – kooperativnost vezave<br /> <br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == '''Priprava stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1].<br /> <br /> ==''' Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> <br /> == '''Aplikacija stabiliziranih promotorjev== '''<br /> <br /> == '''Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> =='''Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana'''==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> == '''Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=17162 2020-05-05T10:19:47Z

<p>Bm7118: </p> <hr /> <div>Povzeto po: T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. 2018, 36, 352–358.<br /> <br /> Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == '''Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov''' ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> == '''Teoretično ozadje''' ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> G=c/R^n <br /> kjer je:<br /> <br /> c – število kopij <br /> <br /> R – koncentracija represorja<br /> <br /> n – kooperativnost vezave<br /> <br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == '''Priprava stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1].<br /> <br /> ==''' Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> Aplikacija stabiliziranih promotorjev<br /> <br /> == '''Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> =='''Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana'''==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> == '''Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2019/20&diff=16317 2020-03-30T17:54:26Z

<p>Bm7118: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> <br /> Primer: &lt;br&gt;<br /> 1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)<br /> <br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) &lt;br&gt;<br /> Primer: &lt;br&gt;<br /> 1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)<br /> <br /> <br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut. <br /> <br /> ----<br /> <br /> <br /> Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar): <br /> <br /> 18.3.&lt;br&gt; <br /> 1 Veronika Razpotnik &lt;br&gt; <br /> 2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) &lt;br&gt;<br /> 3 Samo Purič &lt;br&gt;<br /> 4 Jerneja Nimac &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 25.3.&lt;br&gt;<br /> 1 Lana Vogrinec &lt;br&gt;<br /> 2 Peter Škrinjar &lt;br&gt;<br /> 3 Tanja Zupan &lt;br&gt;<br /> 4 Nika Testen &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 1.4.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Obaha &lt;br&gt;<br /> 2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) &lt;br&gt;<br /> 3 Dunia Sahir &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 7.4.&lt;br&gt;<br /> 1 Vesna Podgrajšek &lt;br&gt;<br /> 2 Luka Lavrič &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 8.4.&lt;br&gt;<br /> 1 Nika Zaveršek &lt;br&gt;<br /> 2 Željka Erić &lt;br&gt;<br /> 3 Žiga Vičič &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 14.4.&lt;br&gt;<br /> 1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) &lt;br&gt;<br /> 2 Ana Maklin &lt;br&gt;<br /> 3 Anže Jenko &lt;br&gt;<br /> 4 Patricija Miklavc &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 15.4.&lt;br&gt;<br /> 1 Daria Latysheva &lt;br&gt;<br /> 2 Milica Janković &lt;br&gt;<br /> 3 Ines Medved &lt;br&gt;<br /> 4 Sara Jereb &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 22.4.&lt;br&gt;<br /> 1 Jelena Štrbac &lt;br&gt;<br /> 2 Ajda Lenardič &lt;br&gt;<br /> 3 Andrej Ivanovski &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 6.5.&lt;br&gt;<br /> 1 Uroš Prešern &lt;br&gt;<br /> 2 Sara Korošec &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 Luka Gregorič &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 13.5.&lt;br&gt;<br /> 1 Urban Hribar &lt;br&gt;<br /> 2 Tina Turel &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 Vid Modic &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 20.5.&lt;br&gt;<br /> 1 Katja Malenšek &lt;br&gt;<br /> 2 Janina Gea Cvikl &lt;br&gt;<br /> 3 Maja Globočnik &lt;br&gt;<br /> 4 Primož Bembič &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 27.5. Rezervni termin&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2019/20&diff=16316 2020-03-30T17:53:29Z

<p>Bm7118: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> <br /> Primer: &lt;br&gt;<br /> 1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)<br /> <br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) &lt;br&gt;<br /> Primer: &lt;br&gt;<br /> 1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)<br /> <br /> <br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut. <br /> <br /> ----<br /> <br /> <br /> Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar): <br /> <br /> 18.3.&lt;br&gt; <br /> 1 Veronika Razpotnik &lt;br&gt; <br /> 2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) &lt;br&gt;<br /> 3 Samo Purič &lt;br&gt;<br /> 4 Jerneja Nimac &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 25.3.&lt;br&gt;<br /> 1 Lana Vogrinec &lt;br&gt;<br /> 2 Peter Škrinjar &lt;br&gt;<br /> 3 Tanja Zupan &lt;br&gt;<br /> 4 Nika Testen &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 1.4.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Obaha &lt;br&gt;<br /> 2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij] (Benjamin Malovrh) &lt;br&gt;<br /> 3 Dunia Sahir &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 7.4.&lt;br&gt;<br /> 1 Vesna Podgrajšek &lt;br&gt;<br /> 2 Luka Lavrič &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 8.4.&lt;br&gt;<br /> 1 Nika Zaveršek &lt;br&gt;<br /> 2 Željka Erić &lt;br&gt;<br /> 3 Žiga Vičič &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 14.4.&lt;br&gt;<br /> 1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) &lt;br&gt;<br /> 2 Ana Maklin &lt;br&gt;<br /> 3 Anže Jenko &lt;br&gt;<br /> 4 Patricija Miklavc &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 15.4.&lt;br&gt;<br /> 1 Daria Latysheva &lt;br&gt;<br /> 2 Milica Janković &lt;br&gt;<br /> 3 Ines Medved &lt;br&gt;<br /> 4 Sara Jereb &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 22.4.&lt;br&gt;<br /> 1 Jelena Štrbac &lt;br&gt;<br /> 2 Ajda Lenardič &lt;br&gt;<br /> 3 Andrej Ivanovski &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 6.5.&lt;br&gt;<br /> 1 Uroš Prešern &lt;br&gt;<br /> 2 Sara Korošec &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 Luka Gregorič &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 13.5.&lt;br&gt;<br /> 1 Urban Hribar &lt;br&gt;<br /> 2 Tina Turel &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 Vid Modic &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 20.5.&lt;br&gt;<br /> 1 Katja Malenšek &lt;br&gt;<br /> 2 Janina Gea Cvikl &lt;br&gt;<br /> 3 Maja Globočnik &lt;br&gt;<br /> 4 Primož Bembič &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 27.5. Rezervni termin&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=16315 2020-03-30T17:40:08Z

<p>Bm7118: /* Teoretično ozadje */</p> <hr /> <div>Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == '''Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov''' ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> == '''Teoretično ozadje''' ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> G=c/R^n <br /> kjer je:<br /> <br /> c – število kopij <br /> <br /> R – koncentracija represorja<br /> <br /> n – kooperativnost vezave<br /> <br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == '''Priprava stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1].<br /> <br /> ==''' Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> Aplikacija stabiliziranih promotorjev<br /> <br /> == '''Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> =='''Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana'''==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> == '''Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=16314 2020-03-30T17:39:53Z

<p>Bm7118: /* Teoretično ozadje */</p> <hr /> <div>Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == '''Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov''' ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> == '''Teoretično ozadje''' ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> G=c/R^n <br /> kjer je:<br /> <br /> c – število kopij <br /> <br /> R – koncentracija represorja<br /> <br /> n – kooperativna vezava<br /> <br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == '''Priprava stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1].<br /> <br /> ==''' Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> Aplikacija stabiliziranih promotorjev<br /> <br /> == '''Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> =='''Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana'''==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> == '''Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=16313 2020-03-30T17:38:56Z

<p>Bm7118: /* Teoretično ozadje */</p> <hr /> <div>Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == '''Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov''' ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> == '''Teoretično ozadje''' ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> G=c/R^n <br /> kjer je:<br /> <br /> c – število kopij <br /> <br /> R – koncentracija represorja<br /> <br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == '''Priprava stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1].<br /> <br /> ==''' Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> Aplikacija stabiliziranih promotorjev<br /> <br /> == '''Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> =='''Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana'''==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> == '''Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=16312 2020-03-30T17:36:03Z

<p>Bm7118: /* Teoretično ozadje */</p> <hr /> <div>Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == '''Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov''' ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> == '''Teoretično ozadje''' ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> G=c/R^n <br /> kjer je:<br /> c – število kopij <br /> <br /> R – koncentracija represorja<br /> <br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == '''Priprava stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1].<br /> <br /> ==''' Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> Aplikacija stabiliziranih promotorjev<br /> <br /> == '''Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> =='''Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana'''==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> == '''Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=16311 2020-03-30T17:35:26Z

<p>Bm7118: /* Teoretično ozadje */</p> <hr /> <div>Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == '''Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov''' ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> == '''Teoretično ozadje''' ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> G=c/R^n <br /> <br /> kjer je:<br /> c – število kopij <br /> R – koncentracija represorja<br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == '''Priprava stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1].<br /> <br /> ==''' Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> Aplikacija stabiliziranih promotorjev<br /> <br /> == '''Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> =='''Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana'''==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> == '''Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=16310 2020-03-30T17:34:43Z

<p>Bm7118: /* Teoretično ozadje */</p> <hr /> <div>Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == '''Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov''' ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> == '''Teoretično ozadje''' ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> G=c/R^n <br /> <br /> kjer je:<br /> c – število kopij <br /> R – koncentracija represorja<br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == '''Priprava stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1].<br /> <br /> ==''' Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> Aplikacija stabiliziranih promotorjev<br /> <br /> == '''Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> =='''Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana'''==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> == '''Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=16309 2020-03-30T17:31:17Z

<p>Bm7118: /* Teoretično ozadje */</p> <hr /> <div>Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == '''Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov''' ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> == '''Teoretično ozadje''' ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> G=c/R^n<br /> <br /> kjer je:<br /> c – število kopij <br /> R – koncentracija represorja<br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == '''Priprava stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1].<br /> <br /> ==''' Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> Aplikacija stabiliziranih promotorjev<br /> <br /> == '''Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> =='''Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana'''==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> == '''Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=16308 2020-03-30T17:30:53Z

<p>Bm7118: /* Teoretično ozadje */</p> <hr /> <div>Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == '''Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov''' ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> == '''Teoretično ozadje''' ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> G=c/R^n∝<br /> <br /> kjer je:<br /> c – število kopij <br /> R – koncentracija represorja<br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == '''Priprava stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1].<br /> <br /> ==''' Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> Aplikacija stabiliziranih promotorjev<br /> <br /> == '''Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> =='''Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana'''==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> == '''Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=16307 2020-03-30T17:30:38Z

<p>Bm7118: /* Teoretično ozadje */</p> <hr /> <div>Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == '''Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov''' ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> == '''Teoretično ozadje''' ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> G=c/R^n<br /> <br /> kjer je:<br /> c – število kopij <br /> R – koncentracija represorja<br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == '''Priprava stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1].<br /> <br /> ==''' Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> Aplikacija stabiliziranih promotorjev<br /> <br /> == '''Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> =='''Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana'''==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> == '''Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=16306 2020-03-30T17:27:55Z

<p>Bm7118: /* Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov */</p> <hr /> <div>Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == '''Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov''' ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> == '''Teoretično ozadje''' ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> <br /> G=c/R^n<br /> <br /> kjer je:<br /> c – število kopij <br /> R – koncentracija represorja<br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == '''Priprava stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1].<br /> <br /> ==''' Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> Aplikacija stabiliziranih promotorjev<br /> <br /> == '''Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> =='''Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana'''==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> == '''Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=16305 2020-03-30T17:27:45Z

<p>Bm7118: /* Teoretično ozadje */</p> <hr /> <div>Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> <br /> == '''Teoretično ozadje''' ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> <br /> G=c/R^n<br /> <br /> kjer je:<br /> c – število kopij <br /> R – koncentracija represorja<br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == '''Priprava stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1].<br /> <br /> ==''' Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> Aplikacija stabiliziranih promotorjev<br /> <br /> == '''Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> =='''Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana'''==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> == '''Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=16304 2020-03-30T17:27:35Z

<p>Bm7118: /* Priprava stabiliziranih promotorjev */</p> <hr /> <div>Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> <br /> == Teoretično ozadje ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> <br /> G=c/R^n<br /> <br /> kjer je:<br /> c – število kopij <br /> R – koncentracija represorja<br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == '''Priprava stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1].<br /> <br /> ==''' Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> Aplikacija stabiliziranih promotorjev<br /> <br /> == '''Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> =='''Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana'''==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> == '''Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=16303 2020-03-30T17:27:24Z

<p>Bm7118: /* Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev */</p> <hr /> <div>Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> <br /> == Teoretično ozadje ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> <br /> G=c/R^n<br /> <br /> kjer je:<br /> c – število kopij <br /> R – koncentracija represorja<br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == Priprava stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1]. <br /> <br /> <br /> ==''' Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> Aplikacija stabiliziranih promotorjev<br /> <br /> == '''Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> =='''Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana'''==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> == '''Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=16302 2020-03-30T17:27:12Z

<p>Bm7118: /* Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev */</p> <hr /> <div>Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> <br /> == Teoretično ozadje ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> <br /> G=c/R^n<br /> <br /> kjer je:<br /> c – število kopij <br /> R – koncentracija represorja<br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == Priprava stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1]. <br /> <br /> <br /> == Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> Aplikacija stabiliziranih promotorjev <br /> <br /> <br /> <br /> == '''Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev'''==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> =='''Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana'''==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> == '''Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=16301 2020-03-30T17:26:19Z

<p>Bm7118: /* Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana */</p> <hr /> <div>Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> <br /> == Teoretično ozadje ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> <br /> G=c/R^n<br /> <br /> kjer je:<br /> c – število kopij <br /> R – koncentracija represorja<br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == Priprava stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1]. <br /> <br /> <br /> == Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> Aplikacija stabiliziranih promotorjev <br /> <br /> <br /> <br /> == Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> '''== Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana==<br /> '''<br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> == '''Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=16300 2020-03-30T17:26:06Z

<p>Bm7118: /* Vpliv mutacij na replikacijo */</p> <hr /> <div>Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> <br /> == Teoretično ozadje ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> <br /> G=c/R^n<br /> <br /> kjer je:<br /> c – število kopij <br /> R – koncentracija represorja<br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == Priprava stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1]. <br /> <br /> <br /> == Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> Aplikacija stabiliziranih promotorjev <br /> <br /> <br /> <br /> == Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> == Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == '''Vpliv mutacij na replikacijo'''==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].<br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=16299 2020-03-30T17:25:54Z

<p>Bm7118: /* Literatura */</p> <hr /> <div>Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> <br /> == Teoretično ozadje ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> <br /> G=c/R^n<br /> <br /> kjer je:<br /> c – število kopij <br /> R – koncentracija represorja<br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == Priprava stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1]. <br /> <br /> <br /> == Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> Aplikacija stabiliziranih promotorjev <br /> <br /> <br /> <br /> == Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> == Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == Vpliv mutacij na replikacijo==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1]. <br /> <br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. '''2018''', 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. '''2012''', 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. '''2002''', 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. '''2015''', 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=16298 2020-03-30T17:22:44Z

<p>Bm7118: /* Literatura */</p> <hr /> <div>Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> <br /> == Teoretično ozadje ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> <br /> G=c/R^n<br /> <br /> kjer je:<br /> c – število kopij <br /> R – koncentracija represorja<br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == Priprava stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1]. <br /> <br /> <br /> == Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> Aplikacija stabiliziranih promotorjev <br /> <br /> <br /> <br /> == Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> == Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == Vpliv mutacij na replikacijo==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1]. <br /> <br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. 2018, 36, 352–358.<br /> <br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. 2012, 40, 8979–8992.<br /> <br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. 2002, 21, 1864–1872.<br /> <br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. 2015, 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=16297 2020-03-30T17:21:56Z

<p>Bm7118: /* Teoretično ozadje */</p> <hr /> <div>Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> <br /> == Teoretično ozadje ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> <br /> G=c/R^n<br /> <br /> kjer je:<br /> c – število kopij <br /> R – koncentracija represorja<br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1)<br /> <br /> == Priprava stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1]. <br /> <br /> <br /> == Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> Aplikacija stabiliziranih promotorjev <br /> <br /> <br /> <br /> == Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> == Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == Vpliv mutacij na replikacijo==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1]. <br /> <br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. 2018, 36, 352–358.<br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. 2012, 40, 8979–8992.<br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. 2002, 21, 1864–1872.<br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. 2015, 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=16296 2020-03-30T17:21:37Z

<p>Bm7118: /* Teoretično ozadje */</p> <hr /> <div>Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> <br /> == Teoretično ozadje ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> <br /> G=c/R^n. <br /> <br /> kjer je:<br /> c – število kopij <br /> R – koncentracija represorja<br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1).<br /> <br /> == Priprava stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1]. <br /> <br /> <br /> == Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> Aplikacija stabiliziranih promotorjev <br /> <br /> <br /> <br /> == Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> == Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == Vpliv mutacij na replikacijo==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1]. <br /> <br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. 2018, 36, 352–358.<br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. 2012, 40, 8979–8992.<br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. 2002, 21, 1864–1872.<br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. 2015, 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=16295 2020-03-30T17:21:12Z

<p>Bm7118: /* Teoretično ozadje */</p> <hr /> <div>Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> <br /> == Teoretično ozadje ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> <br /> G=c/R^n <br /> <br /> kjer je:<br /> c – število kopij <br /> R – koncentracija represorja<br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1).<br /> <br /> == Priprava stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1]. <br /> <br /> <br /> == Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> Aplikacija stabiliziranih promotorjev <br /> <br /> <br /> <br /> == Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> == Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == Vpliv mutacij na replikacijo==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1]. <br /> <br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. 2018, 36, 352–358.<br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. 2012, 40, 8979–8992.<br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. 2002, 21, 1864–1872.<br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. 2015, 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji,_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij&diff=16294 2020-03-30T17:20:20Z

<p>Bm7118: New page: Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takš...</p> <hr /> <div>Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov ==<br /> <br /> Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].<br /> <br /> <br /> == Teoretično ozadje ==<br /> <br /> Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. <br /> V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo: <br /> G=c/R^n <br /> kjer je:<br /> c – število kopij <br /> R – koncentracija represorja<br /> Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:<br /> G∝c^(n-1). <br /> <br /> <br /> == Priprava stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na operator kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija operatorske regije v stabiliziranem promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp operatorja pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1]. <br /> <br /> <br /> == Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].<br /> <br /> Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].<br /> <br /> <br /> Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1]. <br /> Aplikacija stabiliziranih promotorjev <br /> <br /> <br /> <br /> == Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev==<br /> <br /> Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1]. <br /> <br /> <br /> == Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana==<br /> <br /> Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].<br /> <br /> <br /> == Vpliv mutacij na replikacijo==<br /> <br /> Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1]. <br /> <br /> <br /> == Literatura ==<br /> <br /> [1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. 2018, 36, 352–358.<br /> [2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. 2012, 40, 8979–8992.<br /> [3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. 2002, 21, 1864–1872.<br /> [4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. 2015, 4, 1361–1372.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2019/20&diff=16143 2020-03-04T21:19:23Z

<p>Bm7118: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> <br /> Primer: &lt;br&gt;<br /> 1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)<br /> <br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) &lt;br&gt;<br /> Primer: &lt;br&gt;<br /> 1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)<br /> <br /> <br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut. <br /> <br /> ----<br /> <br /> <br /> Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar): <br /> <br /> 18.3.&lt;br&gt; <br /> 1 Veronika Razpotnik &lt;br&gt; <br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 25.3.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 1.4.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 7.4.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 8.4.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 14.4.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 15.4.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 22.4.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 6.5.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 13.5.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 20.5.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 27.5. Rezervni termin&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2019/20&diff=16142 2020-03-04T21:17:13Z

<p>Bm7118: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> <br /> Primer: &lt;br&gt;<br /> 1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)<br /> <br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) &lt;br&gt;<br /> Primer: &lt;br&gt;<br /> 1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)<br /> <br /> <br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut. <br /> <br /> ----<br /> <br /> <br /> Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar): <br /> <br /> 18.3.&lt;br&gt; <br /> 1 Veronika Razpotnik &lt;br&gt; <br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 25.3.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 1.4.&lt;br&gt;<br /> 1 Benjamin Malovrh&lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 7.4.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 8.4.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 14.4.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 15.4.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 22.4.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 6.5.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 13.5.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 20.5.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 27.5. Rezervni termin&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2019/20&diff=16141 2020-03-04T21:16:14Z

<p>Bm7118: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> <br /> Primer: &lt;br&gt;<br /> 1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)<br /> <br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) &lt;br&gt;<br /> Primer: &lt;br&gt;<br /> 1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)<br /> <br /> <br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut. <br /> <br /> ----<br /> <br /> <br /> Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar): <br /> <br /> 18.3.&lt;br&gt; <br /> 1 Veronika Razpotnik &lt;br&gt; <br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 25.3.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 1.4.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;Benjamin Malovrh<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 7.4.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 8.4.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 14.4.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 15.4.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 22.4.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 6.5.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 13.5.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 20.5.&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 27.5. Rezervni termin&lt;br&gt;<br /> 1 &lt;br&gt;<br /> 2 &lt;br&gt;<br /> 3 &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa&diff=15378 2019-04-07T06:44:05Z

<p>Bm7118: </p> <hr /> <div>*Vid Modic:Uvod, Komponente ECM v bakterijskem biofilmu<br /> *Benjamin Malovrh:Signalizacija med proizvodnjo zunajceličnega matriksa<br /> *Patricija Miklavc:Preprečevanje pojava biofilmov z uporabo bakteriofagov.</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa&diff=15377 2019-04-07T06:43:43Z

<p>Bm7118: New page: *Vid Modic:Uvod, Komponente ECM v bakterijskem biofilmu *Benjamin Malovrh:Signalizacija med proizvodnjo zunajceličnega matriksa *Patricija Miklavc:Preprečevanje pojava biofilmov z uporab...</p> <hr /> <div>*Vid Modic:Uvod, Komponente ECM v bakterijskem biofilmu<br /> *Benjamin Malovrh:Signalizacija med proizvodnjo zunajceličnega matriksa<br /> *Patricija Miklavc:Preprečevanje pojava biofilmov z uporabo bakteriofagov</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa&diff=15355 2019-04-06T16:28:23Z

<p>Bm7118: /* PREPREČEVANJE POJAVA BIOFILMOV Z UPORABO BAKTERIOFAGOV */</p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> Adsorpcija bakteriofagov na gostiteljske receptorje je prvi korak v infekciji gostiteljske celice. Hkrati velja za najbolj zapleten korak, saj morajo virusi prepoznati zelo raznolike vzorce celičnih membran. Bakterije so tekom svojega razvoja razvile številne obrambne mehanizme proti adsorpciji bakteriofagov. Te obrambne mehanizme delimo v tri osnovne skupine:<br /> *blokiranje fagoreceptorjev, <br /> *proizvodnja zunajceličnega matriksa,<br /> *proizvodnja inhibitorjev adhezije.<br /> Komponente zunajceličnega matriksa (v nadaljevanju: ECM) ščitijo bakterijske celice pred adsorpcijo bakteriofagov s ustvarjanjem fizične bariere<br /> Bakterijski ECM omogoča življenjski slog bakterij, ki večinoma uspevajo v tesno zapakiranih skupnostih imenovanih biofilm. Čeprav je veliko znanega o različnih funkcijah ECM pri živalskih celicah, je bakterijski ECM še vedno manj raziskan in se običajno o njem govori v kontekstu biofilma.<br /> <br /> == KOMPONENTE ECM V BAKTERIJSKEM BIOFILMU ==<br /> [1]Raziskane komponente ECM so polimeri bogati z eksopolisaharidi, proteini, nukleinske kisline in lipidi. <br /> *Eksopolisaharidi ali zunajcelični polisaharidi imajo pomembno vlogo v virulentnosti bakterij in sporulaciji. Velik delež eksopolisaharidov v svoji strukturi vsebuje celulozo in adhezijski znotrajcelični polisaharid (PIA), ki bakterijam predstavljajo zaščito pred bakteriofagi in tudi imunskim sistemom. Polimerne komponene ECM, ki vsebujejo PIA proizvajajo številne gram negativne bakterije. Med drugim Staphylococcus epidermis, S. aureus. Številne bakterijske vrste so sposobne proizvodnje raznolikih eksopolisaharidov. <br /> <br /> *Proteinske komponente<br /> Bakterijski funkcionalni amiloidi so netopni vlaknasti agregati proteinov, ki vsebujejo paralelne beta ploskve. V bakterijah predstavljajo ključno proteinsko enoto ECM in jih proizvajajo tako gram negativne kot pozitivne bakterije. Pri gram pozitivnih bakterijah je najpogostejši proteinski predstavnik TasA, ki ga proizvajajo ''Bacillus subtilis''. TasA amiloidna vlakna so pritrjena na celično membrano in predstavljajo medcelično povezavo z drugimi zunajceličnimi komponentami.Vseeno amiloidi ne predstavljajo celotnega deleža proteinskih komponent v ECM. Poznamo tudi adhezine, ki so ključni v povezavi celice z medceličnim tkivom gostiteljske celice. <br /> <br /> *Zunajcelična DNA (eDNA)<br /> Je dvoverižna, nizkomulekularna skupina molekul z velikostjo od 0,5 do 21kb, strukturno povezanih s histoni v mono- in oligonukleosome. Velja za pomembno strukturno komponento v mnogih bakterijskih biofilmih. Dodajanje DNaze rastočemu biofilmu inhibira njegov razvoj in povzroča prekinitve v njegovi strukturi. Mlajšega nastanka kot je biofilm, bolj je občutljiv na DNaze. Kemijska vloga dolgih, nabitih molekul DNA je modeliranje lastnosti celične površine in spodbujanje adhezije med celicami samimi in z gostiteljskim tkivom. eDNA izločajo v ECM lizirane celice. <br /> <br /> *Lipidi<br /> ECM vsebuje tudi lipopolisaharide. Vloga katerih je navadno adhezijska. Surfaktin, viskozin, emulzan lahko dispergirajo hidrofobne substance in tako omogočijo, da so biodostopne. <br /> <br /> *Voda<br /> Voda predstavlja največji del ECM. Eksopolisaharidi matriksu, ki je visoko hidriran omogočajo počasnejše sušenje od okolice. Ohranjajo pa tudi strukturo matriksa ob povečani prisotnosti nevezane vode.<br /> <br /> == SIGNALIZACIJA MED PROIZVODNJO ZUNAJCELIČNEGA MATRIKSA ==<br /> *Signalizacija ECM ob adheziji bakterij, in začetni tvorbi biofilma[2]<br /> Biofilm, ki ga tvorijo bakterije je pogosto pritrjen na površino. Bakterije ob pritrjevanju na površino stimulirajo signalne poti, ki so ključne za proizvodnjo ECM. Poznamo več signalnih poti, ki jih sprožijo bakterije. Bakterija ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1 v prisotnosti zunajceličnega polisaharida Psl ustvarja signalno pot, ki aktivira proizvodjo bis-(3´-5´)-cikličnega dimernega GMP (v nadaljevanju: c-di-GMP). Ciklični dimer GMP velja za sekundarnega obveščevalca v številnih bakterijskih vrstah. Sproža tvorbo bakterijskega biofilma, iz prosto gibajočih se bakterij s onemogočanjem bakterijskega gibanja. Znotrajcelične koncentracije c-di-GMP so skrbno regulirane s strani nasprotno delujoče digvanilat ciklaze, ki proizvajajo c-di-GMP iz dveh GTP molekul, in fosfodiestraze, ki prekine vez med 5´-fosfogvanilin (3´-5´)-gvanozo. <br /> <br /> *Signalizacija ECM med pospešeno rastjo biofilma[2]<br /> Prisotnost velikih količin induktorja c-di-GMP sproži vezavo na represor FleQ. Kompleks se veže na operon PelA-G, kar vodi v indukcijo transkripcije zapisov za ECM. Medtem ko nizke koncentracije c-di-GMP vodijo v represijo izražanja. Prisotnost Psl vodi v naraščanje koncentracije znotrajceličnega c-di-GMP. Poleg visoke vsebnosti c-di-GMP na indukcijo proizvodnje ECM vpliva tudi parakrino delovanje samega ECM. Dejstvo, da Psl deluje tudi na površini celic omogoča, aktivacijo proizvodnje ECM v sorodnih celicah, ki ga še ne proizvajajo. Poleg lastnosti, ki so ključne pri proizvodnji ECM in s tem zunajceličnega polisaharida, Psl sodeluje tudi pri širjenju biofilma oziroma kolonizaciji novih površin. Pri čeme bakterije ''P. aeruginosa'' PAO1 uporabljajo pilije. Zunajcelična DNA (v nadaljevanju eDNA) promovira celično migracijo preko ustvarjenih kanalčkov v bakterijskem biofilmu. Kar vodi v povečan volumen biofilma, saj je omogočena migracija celic preko teh kanalčkov. Celice se gibajo s pomočjo T4P in interagirajo s eDNA. Sledenje pilijev tipa 4 eDNA predstavlja usmerjeno gibanje celic in s tem povezano povečano proizvodnjo ECM na novo zasedenih območjih. V biofilmu bakterije P. aeruginosa ima eDNA poleg strukturne vloge tudi signalno.<br /> <br /> *Signalizacija ECM med poznimi fazami biofilmskega obstoja[2]<br /> Tekom zorenja biofilma prihaja do pomankanja hranil in akumulacije celičnih metabolitov. Bakterije, ki niso sposobne zapustiti biofilma postanejo ujete v ECM, kar vodi v njihov propad. Vendar pa bakterije same ne vedo kdaj je najbolj primeren čas za pobeg. Zato se pogosto v fazah, ko je čas za to še vedno delijo. Ob pomanjkanju hranilnih snovi in povečanju gostote ECM je za pobeg že prepozno. Celice, ki gradijo biofilm imajo na svoji površini polarne adhezijske komponente polisaharidov, ki so ključni za začetno vezavo na površino in tudi kasnejšo tvorbo biofilma ter s tem ECM. Ti adhezijski zunajcelični polisaharidi pa predstavljajo ločitveni problem za celice v poznih fazah obstoja biofilma. Celična smrt bakterij v biofilmu povzroči povečano prisotnost eDNA v okolju. Zunajcelična DNA, ki se sprošča v zunajcelično okolje, povzroča inhibicijo tvorjenja ECM tako statičnega kot na površini gibajočih se celic. Tvorbo novih filmov prepreči s vezavo na receptorje, ki so ključni za pritrditev celic na površino. ''S. aureus'' surfaktanti, tako imenovani majhni peptidi topni fenolni modulini (PSM), tvorijo amiloidna vlakna, ki imajo strukturno vlogo pri preprečevanju vezave bakterij na površino. V splošnem velja, da bakterije, ki imajo mutirane gene za izražanje PSM-jev tvorijo trdnejše, gostejše in bolj gladke biofilme.<br /> <br /> == PREPREČEVANJE POJAVA BIOFILMOV Z UPORABO BAKTERIOFAGOV ==<br /> Znaten delež bakterij in drugih mikroorganizmov, vključno s številnimi patogeni, obstaja kot komponenta biofilmov. Poznamo nekaj potencialnih bakterijskih virusov, znani kot fagi ali bakteriofagi, ki skupaj z različnimi encimi, ki jih kodirajo, služijo kot relativno netoksično antibiofilmsko sredstvo. Fagi imajo zato pomembno vlogo pri evoluciji bakterij, kot tudi pri globalnem biogeokemičnem kroženju ogljika in drugih elementov [3]. <br /> <br /> Vlogo fagov lahko iz te perspektive razdelimo v tri skupine: <br /> *biomedicinska uporaba fagov, <br /> *ekologija fagov,<br /> *interakcija fagov z bakterijskimi biofilmi [4]. <br /> Bakteriofagi, so virusi, ki okužijo bakterije in so specifični za vrsto ali sev bakterij. So med najštevilčnejšimi in najbolj raznolikimi mikroorganizmi na planetu. Raznolikost je večinoma posledica njihovega dinamičnega prilagajanja na mehanizme rezistence, ki so prisotni v gostiteljskih bakterijah [3].<br /> Pri odstranitvi biofilmov, fagi in njihovi encimi delujejo po treh splošnih mehanizmih:<br /> *EPS depolimeraze, kemično degradirajo EPS, ki je komponenta zunajceličnega matriksa, vendar so ti encimi zelo specifični za vrsto EPS, ki ga napadajo. Encime, ki degradirajo polisaharide lahko klasificiramo v dve skupini:<br /> **Hidrolaze (polisaharaze)<br /> **Liaze <br /> Liaze cepijo vezi med monosaharidi in C4 uronske kisline ter uvajajo dvojno vez med C4 in C5 uronske kisline. Hidrolaze pa cepijo glikozidne vezi.<br /> *Delovanje fagov proti tvorbi bakterijskih biofilmov. Ta pojav se sicer zgodi v kontekstu običajnih fagnih infekcij, kar povzroči lizo (&quot;liza od znotraj&quot;)[5].<br /> *Nekateri fagi pa so sposobni povzročiti ''lizo od zunaj'', s tem ko po množični adsorpciji hitro prekinejo ovojnico bakterijskih celic z virioni. Pri tem mehanizmu ni potrebna genska ekspresija fagov po adsorpciji na bakterijsko gostiteljsko celico [5].<br /> Biofilmi so bistveni za preživetje nekaterih bakterij v številnih naravnih in umetnih okoljih ter predstavljajo vir okužb in kontaminacij v medicini, industriji in prehrambnih obratih, zaradi rezistence na antimikrobna sredstva in obrambni sistem gostiteljev [5].&lt;br /&gt;[3]Zdravljenje z bakteriofagi je bilo predlagano kot ena od metod za nadzor bakterijskih biofilmov. &lt;br /&gt;Primer:<br /> *Fagi T4 lahko okužijo biofilme Escherichia coli, se znotraj njih replicirajo in uničijo biofilmsko morfologijo z ubijanjem celic.<br /> *Fagi se tudi modificirajo: E. coli, ki proizvaja polisaharidno kapsulo K1, je običajno rezistentna na infekcije s T7, vendar je dovzetna za okužbo s T7, ki je zasnovan za ekspresijo K1-5 endosialidaze. <br /> *Litični fag s polisaharidno depolimerazo povzroči lizo in EPS degradacijo in s tem zmanjša bakterijske biofilme. Te depolimeraze so na površinah fagov in degradirajo bakterijsko polisaharidno kapsulo.<br /> *Encimska razgradnja celično vezanega EPS polisaharida adhezina, znanega kot polimer β-1,6-N-acetil-Dglukozamina, z eksogeno uporabljeno disperzijo B (DspB), je potrdila redukcijo biofilmov različnih vrst bakterij. DspB je encim, ki ga proizvaja Actinobacillus actinomycetemcomitans in hidrolizira <br /> β-1,6-N-acetilDglukozamin, ki je torej ključen adhezin, potreben za tvorbo biofilma in integritete pri ''Staphylococcus'' in ''E. coli'', vključno z ''E. coli'' K-12, kot tudi kliničnih izolatov. <br /> <br /> [3]Encimska razgradnja komponente EPS je torej koristna strategija za uničevanje biofilmov, čeprav bakterijske celice niso ubite. Predlagano je bilo modularno preoblikovanje fagov, pri majhnih začetnih inokulacijah, v kateri fag ubija bakterije na način, da izraža najbolj učinkovite EPS degradacijske encime, ki so specifični za ciljni biofilm. Encimsko aktivirani fagi se razmnožujejo znotraj biofilmov in dosegajo visoke lokalne koncentracije encimov in litičnih fagov, katerih tarča so biofilmske komponente. Hitra replikacija fagov povzroči bakterijsko lizo in ekspresijo encimov, ki degradirajo biofilm. Ta strategija je uspešna pri katalitskih metodah za odstranjevanje bakterijskih biofilmov v okolju, industriji in prostorih/pripomočkih zdravstvene oskrbe. Prav tako tak način zmanjša potrebe po izražanju velikih količin encimov na specifična mesta infekcij, ki so težje dostopna in izboljša učinkovitost terapije s fagi pri odstranjevanju biofilmov.<br /> <br /> == VIRI ==<br /> [1] A. Dragoš in Á. T. Kovács, „The Peculiar Functions of the Bacterial Extracellular Matrix“, Trends Microbiol., let. 25, št. 4, str. 257–266, 2017.&lt;br /&gt;[2] N. Steinberg in I. Kolodkin-Gal, „The Matrix Reloaded: How Sensing the Extracellular Matrix Synchronizes Bacterial Communities“, J. Bacteriol., let. 197, št. 13, str. 2092–2103, 2015.&lt;br /&gt;[3] S. J. Labrie, J. E. Samson, in S. Moineau, „Bacteriophage resistance mechanisms“, Nat. Rev. Microbiol., let. 8, št. 5, str. 317–327, 2010.&lt;br /&gt;[4] B. K. Chan in S. T. Abedon, „Bacteriophage and their enzymes in biofilms“, str. 85–99, 2015.&lt;br /&gt;[5] T. K. Lu in J. J. Collins, „Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage“, Proc. Natl. Acad. Sci., let. 104, št. 27, str. 11197–11202, 2007.<br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa&diff=15354 2019-04-06T16:27:22Z

<p>Bm7118: /* PREPREČEVANJE POJAVA BIOFILMOV Z UPORABO BAKTERIOFAGOV */</p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> Adsorpcija bakteriofagov na gostiteljske receptorje je prvi korak v infekciji gostiteljske celice. Hkrati velja za najbolj zapleten korak, saj morajo virusi prepoznati zelo raznolike vzorce celičnih membran. Bakterije so tekom svojega razvoja razvile številne obrambne mehanizme proti adsorpciji bakteriofagov. Te obrambne mehanizme delimo v tri osnovne skupine:<br /> *blokiranje fagoreceptorjev, <br /> *proizvodnja zunajceličnega matriksa,<br /> *proizvodnja inhibitorjev adhezije.<br /> Komponente zunajceličnega matriksa (v nadaljevanju: ECM) ščitijo bakterijske celice pred adsorpcijo bakteriofagov s ustvarjanjem fizične bariere<br /> Bakterijski ECM omogoča življenjski slog bakterij, ki večinoma uspevajo v tesno zapakiranih skupnostih imenovanih biofilm. Čeprav je veliko znanega o različnih funkcijah ECM pri živalskih celicah, je bakterijski ECM še vedno manj raziskan in se običajno o njem govori v kontekstu biofilma.<br /> <br /> == KOMPONENTE ECM V BAKTERIJSKEM BIOFILMU ==<br /> [1]Raziskane komponente ECM so polimeri bogati z eksopolisaharidi, proteini, nukleinske kisline in lipidi. <br /> *Eksopolisaharidi ali zunajcelični polisaharidi imajo pomembno vlogo v virulentnosti bakterij in sporulaciji. Velik delež eksopolisaharidov v svoji strukturi vsebuje celulozo in adhezijski znotrajcelični polisaharid (PIA), ki bakterijam predstavljajo zaščito pred bakteriofagi in tudi imunskim sistemom. Polimerne komponene ECM, ki vsebujejo PIA proizvajajo številne gram negativne bakterije. Med drugim Staphylococcus epidermis, S. aureus. Številne bakterijske vrste so sposobne proizvodnje raznolikih eksopolisaharidov. <br /> <br /> *Proteinske komponente<br /> Bakterijski funkcionalni amiloidi so netopni vlaknasti agregati proteinov, ki vsebujejo paralelne beta ploskve. V bakterijah predstavljajo ključno proteinsko enoto ECM in jih proizvajajo tako gram negativne kot pozitivne bakterije. Pri gram pozitivnih bakterijah je najpogostejši proteinski predstavnik TasA, ki ga proizvajajo ''Bacillus subtilis''. TasA amiloidna vlakna so pritrjena na celično membrano in predstavljajo medcelično povezavo z drugimi zunajceličnimi komponentami.Vseeno amiloidi ne predstavljajo celotnega deleža proteinskih komponent v ECM. Poznamo tudi adhezine, ki so ključni v povezavi celice z medceličnim tkivom gostiteljske celice. <br /> <br /> *Zunajcelična DNA (eDNA)<br /> Je dvoverižna, nizkomulekularna skupina molekul z velikostjo od 0,5 do 21kb, strukturno povezanih s histoni v mono- in oligonukleosome. Velja za pomembno strukturno komponento v mnogih bakterijskih biofilmih. Dodajanje DNaze rastočemu biofilmu inhibira njegov razvoj in povzroča prekinitve v njegovi strukturi. Mlajšega nastanka kot je biofilm, bolj je občutljiv na DNaze. Kemijska vloga dolgih, nabitih molekul DNA je modeliranje lastnosti celične površine in spodbujanje adhezije med celicami samimi in z gostiteljskim tkivom. eDNA izločajo v ECM lizirane celice. <br /> <br /> *Lipidi<br /> ECM vsebuje tudi lipopolisaharide. Vloga katerih je navadno adhezijska. Surfaktin, viskozin, emulzan lahko dispergirajo hidrofobne substance in tako omogočijo, da so biodostopne. <br /> <br /> *Voda<br /> Voda predstavlja največji del ECM. Eksopolisaharidi matriksu, ki je visoko hidriran omogočajo počasnejše sušenje od okolice. Ohranjajo pa tudi strukturo matriksa ob povečani prisotnosti nevezane vode.<br /> <br /> == SIGNALIZACIJA MED PROIZVODNJO ZUNAJCELIČNEGA MATRIKSA ==<br /> *Signalizacija ECM ob adheziji bakterij, in začetni tvorbi biofilma[2]<br /> Biofilm, ki ga tvorijo bakterije je pogosto pritrjen na površino. Bakterije ob pritrjevanju na površino stimulirajo signalne poti, ki so ključne za proizvodnjo ECM. Poznamo več signalnih poti, ki jih sprožijo bakterije. Bakterija ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1 v prisotnosti zunajceličnega polisaharida Psl ustvarja signalno pot, ki aktivira proizvodjo bis-(3´-5´)-cikličnega dimernega GMP (v nadaljevanju: c-di-GMP). Ciklični dimer GMP velja za sekundarnega obveščevalca v številnih bakterijskih vrstah. Sproža tvorbo bakterijskega biofilma, iz prosto gibajočih se bakterij s onemogočanjem bakterijskega gibanja. Znotrajcelične koncentracije c-di-GMP so skrbno regulirane s strani nasprotno delujoče digvanilat ciklaze, ki proizvajajo c-di-GMP iz dveh GTP molekul, in fosfodiestraze, ki prekine vez med 5´-fosfogvanilin (3´-5´)-gvanozo. <br /> <br /> *Signalizacija ECM med pospešeno rastjo biofilma[2]<br /> Prisotnost velikih količin induktorja c-di-GMP sproži vezavo na represor FleQ. Kompleks se veže na operon PelA-G, kar vodi v indukcijo transkripcije zapisov za ECM. Medtem ko nizke koncentracije c-di-GMP vodijo v represijo izražanja. Prisotnost Psl vodi v naraščanje koncentracije znotrajceličnega c-di-GMP. Poleg visoke vsebnosti c-di-GMP na indukcijo proizvodnje ECM vpliva tudi parakrino delovanje samega ECM. Dejstvo, da Psl deluje tudi na površini celic omogoča, aktivacijo proizvodnje ECM v sorodnih celicah, ki ga še ne proizvajajo. Poleg lastnosti, ki so ključne pri proizvodnji ECM in s tem zunajceličnega polisaharida, Psl sodeluje tudi pri širjenju biofilma oziroma kolonizaciji novih površin. Pri čeme bakterije ''P. aeruginosa'' PAO1 uporabljajo pilije. Zunajcelična DNA (v nadaljevanju eDNA) promovira celično migracijo preko ustvarjenih kanalčkov v bakterijskem biofilmu. Kar vodi v povečan volumen biofilma, saj je omogočena migracija celic preko teh kanalčkov. Celice se gibajo s pomočjo T4P in interagirajo s eDNA. Sledenje pilijev tipa 4 eDNA predstavlja usmerjeno gibanje celic in s tem povezano povečano proizvodnjo ECM na novo zasedenih območjih. V biofilmu bakterije P. aeruginosa ima eDNA poleg strukturne vloge tudi signalno.<br /> <br /> *Signalizacija ECM med poznimi fazami biofilmskega obstoja[2]<br /> Tekom zorenja biofilma prihaja do pomankanja hranil in akumulacije celičnih metabolitov. Bakterije, ki niso sposobne zapustiti biofilma postanejo ujete v ECM, kar vodi v njihov propad. Vendar pa bakterije same ne vedo kdaj je najbolj primeren čas za pobeg. Zato se pogosto v fazah, ko je čas za to še vedno delijo. Ob pomanjkanju hranilnih snovi in povečanju gostote ECM je za pobeg že prepozno. Celice, ki gradijo biofilm imajo na svoji površini polarne adhezijske komponente polisaharidov, ki so ključni za začetno vezavo na površino in tudi kasnejšo tvorbo biofilma ter s tem ECM. Ti adhezijski zunajcelični polisaharidi pa predstavljajo ločitveni problem za celice v poznih fazah obstoja biofilma. Celična smrt bakterij v biofilmu povzroči povečano prisotnost eDNA v okolju. Zunajcelična DNA, ki se sprošča v zunajcelično okolje, povzroča inhibicijo tvorjenja ECM tako statičnega kot na površini gibajočih se celic. Tvorbo novih filmov prepreči s vezavo na receptorje, ki so ključni za pritrditev celic na površino. ''S. aureus'' surfaktanti, tako imenovani majhni peptidi topni fenolni modulini (PSM), tvorijo amiloidna vlakna, ki imajo strukturno vlogo pri preprečevanju vezave bakterij na površino. V splošnem velja, da bakterije, ki imajo mutirane gene za izražanje PSM-jev tvorijo trdnejše, gostejše in bolj gladke biofilme.<br /> <br /> == PREPREČEVANJE POJAVA BIOFILMOV Z UPORABO BAKTERIOFAGOV ==<br /> Znaten delež bakterij in drugih mikroorganizmov, vključno s številnimi patogeni, obstaja kot komponenta biofilmov. Poznamo nekaj potencialnih bakterijskih virusov, znani kot fagi ali bakteriofagi, ki skupaj z različnimi encimi, ki jih kodirajo, služijo kot relativno netoksično antibiofilmsko sredstvo. Fagi imajo zato pomembno vlogo pri evoluciji bakterij, kot tudi pri globalnem biogeokemičnem kroženju ogljika in drugih elementov [3]. <br /> <br /> Vlogo fagov lahko iz te perspektive razdelimo v tri skupine: <br /> *biomedicinska uporaba fagov, <br /> *ekologija fagov,<br /> *interakcija fagov z bakterijskimi biofilmi [4]. <br /> Bakteriofagi, so virusi, ki okužijo bakterije in so specifični za vrsto ali sev bakterij. So med najštevilčnejšimi in najbolj raznolikimi mikroorganizmi na planetu. Raznolikost je večinoma posledica njihovega dinamičnega prilagajanja na mehanizme rezistence, ki so prisotni v gostiteljskih bakterijah [3].<br /> Pri odstranitvi biofilmov, fagi in njihovi encimi delujejo po treh splošnih mehanizmih:<br /> *EPS depolimeraze, kemično degradirajo EPS, ki je komponenta zunajceličnega matriksa, vendar so ti encimi zelo specifični za vrsto EPS, ki ga napadajo. Encime, ki degradirajo polisaharide lahko klasificiramo v dve skupini:<br /> **Hidrolaze (polisaharaze)<br /> **Liaze <br /> Liaze cepijo vezi med monosaharidi in C4 uronske kisline ter uvajajo dvojno vez med C4 in C5 uronske kisline. Hidrolaze pa cepijo glikozidne vezi.<br /> *Delovanje fagov proti tvorbi bakterijskih biofilmov. Ta pojav se sicer zgodi v kontekstu običajnih fagnih infekcij, kar povzroči lizo (&quot;liza od znotraj&quot;)[5].<br /> *Nekateri fagi pa so sposobni povzročiti ''lizo od zunaj'', s tem ko po množični adsorpciji hitro prekinejo ovojnico bakterijskih celic z virioni. Pri tem mehanizmu ni potrebna genska ekspresija fagov po adsorpciji na bakterijsko gostiteljsko celico [5].<br /> Biofilmi so bistveni za preživetje nekaterih bakterij v številnih naravnih in umetnih okoljih ter predstavljajo vir okužb in kontaminacij v medicini, industriji in prehrambnih obratih, zaradi rezistence na antimikrobna sredstva in obrambni sistem gostiteljev [5].<br /> [3]Zdravljenje z bakteriofagi je bilo predlagano kot ena od metod za nadzor bakterijskih biofilmov. &lt;br /&gt;Primer:<br /> *Fagi T4 lahko okužijo biofilme Escherichia coli, se znotraj njih replicirajo in uničijo biofilmsko morfologijo z ubijanjem celic.<br /> *Fagi se tudi modificirajo: E. coli, ki proizvaja polisaharidno kapsulo K1, je običajno rezistentna na infekcije s T7, vendar je dovzetna za okužbo s T7, ki je zasnovan za ekspresijo K1-5 endosialidaze. <br /> *Litični fag s polisaharidno depolimerazo povzroči lizo in EPS degradacijo in s tem zmanjša bakterijske biofilme. Te depolimeraze so na površinah fagov in degradirajo bakterijsko polisaharidno kapsulo.<br /> *Encimska razgradnja celično vezanega EPS polisaharida adhezina, znanega kot polimer β-1,6-N-acetil-Dglukozamina, z eksogeno uporabljeno disperzijo B (DspB), je potrdila redukcijo biofilmov različnih vrst bakterij. DspB je encim, ki ga proizvaja Actinobacillus actinomycetemcomitans in hidrolizira <br /> β-1,6-N-acetilDglukozamin, ki je torej ključen adhezin, potreben za tvorbo biofilma in integritete pri ''Staphylococcus'' in ''E. coli'', vključno z ''E. coli'' K-12, kot tudi kliničnih izolatov. <br /> <br /> [3]Encimska razgradnja komponente EPS je torej koristna strategija za uničevanje biofilmov, čeprav bakterijske celice niso ubite. Predlagano je bilo modularno preoblikovanje fagov, pri majhnih začetnih inokulacijah, v kateri fag ubija bakterije na način, da izraža najbolj učinkovite EPS degradacijske encime, ki so specifični za ciljni biofilm. Encimsko aktivirani fagi se razmnožujejo znotraj biofilmov in dosegajo visoke lokalne koncentracije encimov in litičnih fagov, katerih tarča so biofilmske komponente. Hitra replikacija fagov povzroči bakterijsko lizo in ekspresijo encimov, ki degradirajo biofilm. Ta strategija je uspešna pri katalitskih metodah za odstranjevanje bakterijskih biofilmov v okolju, industriji in prostorih/pripomočkih zdravstvene oskrbe. Prav tako tak način zmanjša potrebe po izražanju velikih količin encimov na specifična mesta infekcij, ki so težje dostopna in izboljša učinkovitost terapije s fagi pri odstranjevanju biofilmov.<br /> <br /> == VIRI ==<br /> [1] A. Dragoš in Á. T. Kovács, „The Peculiar Functions of the Bacterial Extracellular Matrix“, Trends Microbiol., let. 25, št. 4, str. 257–266, 2017.&lt;br /&gt;[2] N. Steinberg in I. Kolodkin-Gal, „The Matrix Reloaded: How Sensing the Extracellular Matrix Synchronizes Bacterial Communities“, J. Bacteriol., let. 197, št. 13, str. 2092–2103, 2015.&lt;br /&gt;[3] S. J. Labrie, J. E. Samson, in S. Moineau, „Bacteriophage resistance mechanisms“, Nat. Rev. Microbiol., let. 8, št. 5, str. 317–327, 2010.&lt;br /&gt;[4] B. K. Chan in S. T. Abedon, „Bacteriophage and their enzymes in biofilms“, str. 85–99, 2015.&lt;br /&gt;[5] T. K. Lu in J. J. Collins, „Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage“, Proc. Natl. Acad. Sci., let. 104, št. 27, str. 11197–11202, 2007.<br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa&diff=15353 2019-04-06T16:26:09Z

<p>Bm7118: /* PREPREČEVANJE POJAVA BIOFILMOV Z UPORABO BAKTERIOFAGOV */</p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> Adsorpcija bakteriofagov na gostiteljske receptorje je prvi korak v infekciji gostiteljske celice. Hkrati velja za najbolj zapleten korak, saj morajo virusi prepoznati zelo raznolike vzorce celičnih membran. Bakterije so tekom svojega razvoja razvile številne obrambne mehanizme proti adsorpciji bakteriofagov. Te obrambne mehanizme delimo v tri osnovne skupine:<br /> *blokiranje fagoreceptorjev, <br /> *proizvodnja zunajceličnega matriksa,<br /> *proizvodnja inhibitorjev adhezije.<br /> Komponente zunajceličnega matriksa (v nadaljevanju: ECM) ščitijo bakterijske celice pred adsorpcijo bakteriofagov s ustvarjanjem fizične bariere<br /> Bakterijski ECM omogoča življenjski slog bakterij, ki večinoma uspevajo v tesno zapakiranih skupnostih imenovanih biofilm. Čeprav je veliko znanega o različnih funkcijah ECM pri živalskih celicah, je bakterijski ECM še vedno manj raziskan in se običajno o njem govori v kontekstu biofilma.<br /> <br /> == KOMPONENTE ECM V BAKTERIJSKEM BIOFILMU ==<br /> [1]Raziskane komponente ECM so polimeri bogati z eksopolisaharidi, proteini, nukleinske kisline in lipidi. <br /> *Eksopolisaharidi ali zunajcelični polisaharidi imajo pomembno vlogo v virulentnosti bakterij in sporulaciji. Velik delež eksopolisaharidov v svoji strukturi vsebuje celulozo in adhezijski znotrajcelični polisaharid (PIA), ki bakterijam predstavljajo zaščito pred bakteriofagi in tudi imunskim sistemom. Polimerne komponene ECM, ki vsebujejo PIA proizvajajo številne gram negativne bakterije. Med drugim Staphylococcus epidermis, S. aureus. Številne bakterijske vrste so sposobne proizvodnje raznolikih eksopolisaharidov. <br /> <br /> *Proteinske komponente<br /> Bakterijski funkcionalni amiloidi so netopni vlaknasti agregati proteinov, ki vsebujejo paralelne beta ploskve. V bakterijah predstavljajo ključno proteinsko enoto ECM in jih proizvajajo tako gram negativne kot pozitivne bakterije. Pri gram pozitivnih bakterijah je najpogostejši proteinski predstavnik TasA, ki ga proizvajajo ''Bacillus subtilis''. TasA amiloidna vlakna so pritrjena na celično membrano in predstavljajo medcelično povezavo z drugimi zunajceličnimi komponentami.Vseeno amiloidi ne predstavljajo celotnega deleža proteinskih komponent v ECM. Poznamo tudi adhezine, ki so ključni v povezavi celice z medceličnim tkivom gostiteljske celice. <br /> <br /> *Zunajcelična DNA (eDNA)<br /> Je dvoverižna, nizkomulekularna skupina molekul z velikostjo od 0,5 do 21kb, strukturno povezanih s histoni v mono- in oligonukleosome. Velja za pomembno strukturno komponento v mnogih bakterijskih biofilmih. Dodajanje DNaze rastočemu biofilmu inhibira njegov razvoj in povzroča prekinitve v njegovi strukturi. Mlajšega nastanka kot je biofilm, bolj je občutljiv na DNaze. Kemijska vloga dolgih, nabitih molekul DNA je modeliranje lastnosti celične površine in spodbujanje adhezije med celicami samimi in z gostiteljskim tkivom. eDNA izločajo v ECM lizirane celice. <br /> <br /> *Lipidi<br /> ECM vsebuje tudi lipopolisaharide. Vloga katerih je navadno adhezijska. Surfaktin, viskozin, emulzan lahko dispergirajo hidrofobne substance in tako omogočijo, da so biodostopne. <br /> <br /> *Voda<br /> Voda predstavlja največji del ECM. Eksopolisaharidi matriksu, ki je visoko hidriran omogočajo počasnejše sušenje od okolice. Ohranjajo pa tudi strukturo matriksa ob povečani prisotnosti nevezane vode.<br /> <br /> == SIGNALIZACIJA MED PROIZVODNJO ZUNAJCELIČNEGA MATRIKSA ==<br /> *Signalizacija ECM ob adheziji bakterij, in začetni tvorbi biofilma[2]<br /> Biofilm, ki ga tvorijo bakterije je pogosto pritrjen na površino. Bakterije ob pritrjevanju na površino stimulirajo signalne poti, ki so ključne za proizvodnjo ECM. Poznamo več signalnih poti, ki jih sprožijo bakterije. Bakterija ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1 v prisotnosti zunajceličnega polisaharida Psl ustvarja signalno pot, ki aktivira proizvodjo bis-(3´-5´)-cikličnega dimernega GMP (v nadaljevanju: c-di-GMP). Ciklični dimer GMP velja za sekundarnega obveščevalca v številnih bakterijskih vrstah. Sproža tvorbo bakterijskega biofilma, iz prosto gibajočih se bakterij s onemogočanjem bakterijskega gibanja. Znotrajcelične koncentracije c-di-GMP so skrbno regulirane s strani nasprotno delujoče digvanilat ciklaze, ki proizvajajo c-di-GMP iz dveh GTP molekul, in fosfodiestraze, ki prekine vez med 5´-fosfogvanilin (3´-5´)-gvanozo. <br /> <br /> *Signalizacija ECM med pospešeno rastjo biofilma[2]<br /> Prisotnost velikih količin induktorja c-di-GMP sproži vezavo na represor FleQ. Kompleks se veže na operon PelA-G, kar vodi v indukcijo transkripcije zapisov za ECM. Medtem ko nizke koncentracije c-di-GMP vodijo v represijo izražanja. Prisotnost Psl vodi v naraščanje koncentracije znotrajceličnega c-di-GMP. Poleg visoke vsebnosti c-di-GMP na indukcijo proizvodnje ECM vpliva tudi parakrino delovanje samega ECM. Dejstvo, da Psl deluje tudi na površini celic omogoča, aktivacijo proizvodnje ECM v sorodnih celicah, ki ga še ne proizvajajo. Poleg lastnosti, ki so ključne pri proizvodnji ECM in s tem zunajceličnega polisaharida, Psl sodeluje tudi pri širjenju biofilma oziroma kolonizaciji novih površin. Pri čeme bakterije ''P. aeruginosa'' PAO1 uporabljajo pilije. Zunajcelična DNA (v nadaljevanju eDNA) promovira celično migracijo preko ustvarjenih kanalčkov v bakterijskem biofilmu. Kar vodi v povečan volumen biofilma, saj je omogočena migracija celic preko teh kanalčkov. Celice se gibajo s pomočjo T4P in interagirajo s eDNA. Sledenje pilijev tipa 4 eDNA predstavlja usmerjeno gibanje celic in s tem povezano povečano proizvodnjo ECM na novo zasedenih območjih. V biofilmu bakterije P. aeruginosa ima eDNA poleg strukturne vloge tudi signalno.<br /> <br /> *Signalizacija ECM med poznimi fazami biofilmskega obstoja[2]<br /> Tekom zorenja biofilma prihaja do pomankanja hranil in akumulacije celičnih metabolitov. Bakterije, ki niso sposobne zapustiti biofilma postanejo ujete v ECM, kar vodi v njihov propad. Vendar pa bakterije same ne vedo kdaj je najbolj primeren čas za pobeg. Zato se pogosto v fazah, ko je čas za to še vedno delijo. Ob pomanjkanju hranilnih snovi in povečanju gostote ECM je za pobeg že prepozno. Celice, ki gradijo biofilm imajo na svoji površini polarne adhezijske komponente polisaharidov, ki so ključni za začetno vezavo na površino in tudi kasnejšo tvorbo biofilma ter s tem ECM. Ti adhezijski zunajcelični polisaharidi pa predstavljajo ločitveni problem za celice v poznih fazah obstoja biofilma. Celična smrt bakterij v biofilmu povzroči povečano prisotnost eDNA v okolju. Zunajcelična DNA, ki se sprošča v zunajcelično okolje, povzroča inhibicijo tvorjenja ECM tako statičnega kot na površini gibajočih se celic. Tvorbo novih filmov prepreči s vezavo na receptorje, ki so ključni za pritrditev celic na površino. ''S. aureus'' surfaktanti, tako imenovani majhni peptidi topni fenolni modulini (PSM), tvorijo amiloidna vlakna, ki imajo strukturno vlogo pri preprečevanju vezave bakterij na površino. V splošnem velja, da bakterije, ki imajo mutirane gene za izražanje PSM-jev tvorijo trdnejše, gostejše in bolj gladke biofilme.<br /> <br /> == PREPREČEVANJE POJAVA BIOFILMOV Z UPORABO BAKTERIOFAGOV ==<br /> Znaten delež bakterij in drugih mikroorganizmov, vključno s številnimi patogeni, obstaja kot komponenta biofilmov. Poznamo nekaj potencialnih bakterijskih virusov, znani kot fagi ali bakteriofagi, ki skupaj z različnimi encimi, ki jih kodirajo, služijo kot relativno netoksično antibiofilmsko sredstvo. Fagi imajo zato pomembno vlogo pri evoluciji bakterij, kot tudi pri globalnem biogeokemičnem kroženju ogljika in drugih elementov [3]. <br /> <br /> Vlogo fagov lahko iz te perspektive razdelimo v tri skupine: <br /> *biomedicinska uporaba fagov, <br /> *ekologija fagov,<br /> *interakcija fagov z bakterijskimi biofilmi [4]. <br /> Bakteriofagi, so virusi, ki okužijo bakterije in so specifični za vrsto ali sev bakterij. So med najštevilčnejšimi in najbolj raznolikimi mikroorganizmi na planetu. Raznolikost je večinoma posledica njihovega dinamičnega prilagajanja na mehanizme rezistence, ki so prisotni v gostiteljskih bakterijah [3].<br /> Pri odstranitvi biofilmov, fagi in njihovi encimi delujejo po treh splošnih mehanizmih:<br /> *EPS depolimeraze, kemično degradirajo EPS, ki je komponenta zunajceličnega matriksa, vendar so ti encimi zelo specifični za vrsto EPS, ki ga napadajo. Encime, ki degradirajo polisaharide lahko klasificiramo v dve skupini:<br /> **Hidrolaze (polisaharaze)<br /> **Liaze <br /> Liaze cepijo vezi med monosaharidi in C4 uronske kisline ter uvajajo dvojno vez med C4 in C5 uronske kisline. Hidrolaze pa cepijo glikozidne vezi.<br /> *Delovanje fagov proti tvorbi bakterijskih biofilmov. Ta pojav se sicer zgodi v kontekstu običajnih fagnih infekcij, kar povzroči lizo (&quot;liza od znotraj&quot;)[5].<br /> *Nekateri fagi pa so sposobni povzročiti ''lizo od zunaj'', s tem ko po množični adsorpciji hitro prekinejo ovojnico bakterijskih celic z virioni. Pri tem mehanizmu ni potrebna genska ekspresija fagov po adsorpciji na bakterijsko gostiteljsko celico [5].<br /> Biofilmi so bistveni za preživetje nekaterih bakterij v številnih naravnih in umetnih okoljih ter predstavljajo vir okužb in kontaminacij v medicini, industriji in prehrambnih obratih, zaradi rezistence na antimikrobna sredstva in obrambni sistem gostiteljev [5].<br /> [3]Zdravljenje z bakteriofagi je bilo predlagano kot ena od metod za nadzor bakterijskih biofilmov. Primer:<br /> *Fagi T4 lahko okužijo biofilme Escherichia coli, se znotraj njih replicirajo in uničijo biofilmsko morfologijo z ubijanjem celic.<br /> *Fagi se tudi modificirajo: E. coli, ki proizvaja polisaharidno kapsulo K1, je običajno rezistentna na infekcije s T7, vendar je dovzetna za okužbo s T7, ki je zasnovan za ekspresijo K1-5 endosialidaze. <br /> *Litični fag s polisaharidno depolimerazo povzroči lizo in EPS degradacijo in s tem zmanjša bakterijske biofilme. Te depolimeraze so na površinah fagov in degradirajo bakterijsko polisaharidno kapsulo.<br /> *Encimska razgradnja celično vezanega EPS polisaharida adhezina, znanega kot polimer β-1,6-N-acetil-Dglukozamina, z eksogeno uporabljeno disperzijo B (DspB), je potrdila redukcijo biofilmov različnih vrst bakterij. DspB je encim, ki ga proizvaja Actinobacillus actinomycetemcomitans in hidrolizira <br /> β-1,6-N-acetilDglukozamin, ki je torej ključen adhezin, potreben za tvorbo biofilma in integritete pri ''Staphylococcus'' in ''E. coli'', vključno z ''E. coli'' K-12, kot tudi kliničnih izolatov. <br /> <br /> [3]Encimska razgradnja komponente EPS je torej koristna strategija za uničevanje biofilmov, čeprav bakterijske celice niso ubite. Predlagano je bilo modularno preoblikovanje fagov, pri majhnih začetnih inokulacijah, v kateri fag ubija bakterije na način, da izraža najbolj učinkovite EPS degradacijske encime, ki so specifični za ciljni biofilm. Encimsko aktivirani fagi se razmnožujejo znotraj biofilmov in dosegajo visoke lokalne koncentracije encimov in litičnih fagov, katerih tarča so biofilmske komponente. Hitra replikacija fagov povzroči bakterijsko lizo in ekspresijo encimov, ki degradirajo biofilm. Ta strategija je uspešna pri katalitskih metodah za odstranjevanje bakterijskih biofilmov v okolju, industriji in prostorih/pripomočkih zdravstvene oskrbe. Prav tako tak način zmanjša potrebe po izražanju velikih količin encimov na specifična mesta infekcij, ki so težje dostopna in izboljša učinkovitost terapije s fagi pri odstranjevanju biofilmov.<br /> <br /> == VIRI ==<br /> [1] A. Dragoš in Á. T. Kovács, „The Peculiar Functions of the Bacterial Extracellular Matrix“, Trends Microbiol., let. 25, št. 4, str. 257–266, 2017.&lt;br /&gt;[2] N. Steinberg in I. Kolodkin-Gal, „The Matrix Reloaded: How Sensing the Extracellular Matrix Synchronizes Bacterial Communities“, J. Bacteriol., let. 197, št. 13, str. 2092–2103, 2015.&lt;br /&gt;[3] S. J. Labrie, J. E. Samson, in S. Moineau, „Bacteriophage resistance mechanisms“, Nat. Rev. Microbiol., let. 8, št. 5, str. 317–327, 2010.&lt;br /&gt;[4] B. K. Chan in S. T. Abedon, „Bacteriophage and their enzymes in biofilms“, str. 85–99, 2015.&lt;br /&gt;[5] T. K. Lu in J. J. Collins, „Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage“, Proc. Natl. Acad. Sci., let. 104, št. 27, str. 11197–11202, 2007.<br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa&diff=15352 2019-04-06T16:25:20Z

<p>Bm7118: /* PREPREČEVANJE POJAVA BIOFILMOV Z UPORABO BAKTERIOFAGOV */</p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> Adsorpcija bakteriofagov na gostiteljske receptorje je prvi korak v infekciji gostiteljske celice. Hkrati velja za najbolj zapleten korak, saj morajo virusi prepoznati zelo raznolike vzorce celičnih membran. Bakterije so tekom svojega razvoja razvile številne obrambne mehanizme proti adsorpciji bakteriofagov. Te obrambne mehanizme delimo v tri osnovne skupine:<br /> *blokiranje fagoreceptorjev, <br /> *proizvodnja zunajceličnega matriksa,<br /> *proizvodnja inhibitorjev adhezije.<br /> Komponente zunajceličnega matriksa (v nadaljevanju: ECM) ščitijo bakterijske celice pred adsorpcijo bakteriofagov s ustvarjanjem fizične bariere<br /> Bakterijski ECM omogoča življenjski slog bakterij, ki večinoma uspevajo v tesno zapakiranih skupnostih imenovanih biofilm. Čeprav je veliko znanega o različnih funkcijah ECM pri živalskih celicah, je bakterijski ECM še vedno manj raziskan in se običajno o njem govori v kontekstu biofilma.<br /> <br /> == KOMPONENTE ECM V BAKTERIJSKEM BIOFILMU ==<br /> [1]Raziskane komponente ECM so polimeri bogati z eksopolisaharidi, proteini, nukleinske kisline in lipidi. <br /> *Eksopolisaharidi ali zunajcelični polisaharidi imajo pomembno vlogo v virulentnosti bakterij in sporulaciji. Velik delež eksopolisaharidov v svoji strukturi vsebuje celulozo in adhezijski znotrajcelični polisaharid (PIA), ki bakterijam predstavljajo zaščito pred bakteriofagi in tudi imunskim sistemom. Polimerne komponene ECM, ki vsebujejo PIA proizvajajo številne gram negativne bakterije. Med drugim Staphylococcus epidermis, S. aureus. Številne bakterijske vrste so sposobne proizvodnje raznolikih eksopolisaharidov. <br /> <br /> *Proteinske komponente<br /> Bakterijski funkcionalni amiloidi so netopni vlaknasti agregati proteinov, ki vsebujejo paralelne beta ploskve. V bakterijah predstavljajo ključno proteinsko enoto ECM in jih proizvajajo tako gram negativne kot pozitivne bakterije. Pri gram pozitivnih bakterijah je najpogostejši proteinski predstavnik TasA, ki ga proizvajajo ''Bacillus subtilis''. TasA amiloidna vlakna so pritrjena na celično membrano in predstavljajo medcelično povezavo z drugimi zunajceličnimi komponentami.Vseeno amiloidi ne predstavljajo celotnega deleža proteinskih komponent v ECM. Poznamo tudi adhezine, ki so ključni v povezavi celice z medceličnim tkivom gostiteljske celice. <br /> <br /> *Zunajcelična DNA (eDNA)<br /> Je dvoverižna, nizkomulekularna skupina molekul z velikostjo od 0,5 do 21kb, strukturno povezanih s histoni v mono- in oligonukleosome. Velja za pomembno strukturno komponento v mnogih bakterijskih biofilmih. Dodajanje DNaze rastočemu biofilmu inhibira njegov razvoj in povzroča prekinitve v njegovi strukturi. Mlajšega nastanka kot je biofilm, bolj je občutljiv na DNaze. Kemijska vloga dolgih, nabitih molekul DNA je modeliranje lastnosti celične površine in spodbujanje adhezije med celicami samimi in z gostiteljskim tkivom. eDNA izločajo v ECM lizirane celice. <br /> <br /> *Lipidi<br /> ECM vsebuje tudi lipopolisaharide. Vloga katerih je navadno adhezijska. Surfaktin, viskozin, emulzan lahko dispergirajo hidrofobne substance in tako omogočijo, da so biodostopne. <br /> <br /> *Voda<br /> Voda predstavlja največji del ECM. Eksopolisaharidi matriksu, ki je visoko hidriran omogočajo počasnejše sušenje od okolice. Ohranjajo pa tudi strukturo matriksa ob povečani prisotnosti nevezane vode.<br /> <br /> == SIGNALIZACIJA MED PROIZVODNJO ZUNAJCELIČNEGA MATRIKSA ==<br /> *Signalizacija ECM ob adheziji bakterij, in začetni tvorbi biofilma[2]<br /> Biofilm, ki ga tvorijo bakterije je pogosto pritrjen na površino. Bakterije ob pritrjevanju na površino stimulirajo signalne poti, ki so ključne za proizvodnjo ECM. Poznamo več signalnih poti, ki jih sprožijo bakterije. Bakterija ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1 v prisotnosti zunajceličnega polisaharida Psl ustvarja signalno pot, ki aktivira proizvodjo bis-(3´-5´)-cikličnega dimernega GMP (v nadaljevanju: c-di-GMP). Ciklični dimer GMP velja za sekundarnega obveščevalca v številnih bakterijskih vrstah. Sproža tvorbo bakterijskega biofilma, iz prosto gibajočih se bakterij s onemogočanjem bakterijskega gibanja. Znotrajcelične koncentracije c-di-GMP so skrbno regulirane s strani nasprotno delujoče digvanilat ciklaze, ki proizvajajo c-di-GMP iz dveh GTP molekul, in fosfodiestraze, ki prekine vez med 5´-fosfogvanilin (3´-5´)-gvanozo. <br /> <br /> *Signalizacija ECM med pospešeno rastjo biofilma[2]<br /> Prisotnost velikih količin induktorja c-di-GMP sproži vezavo na represor FleQ. Kompleks se veže na operon PelA-G, kar vodi v indukcijo transkripcije zapisov za ECM. Medtem ko nizke koncentracije c-di-GMP vodijo v represijo izražanja. Prisotnost Psl vodi v naraščanje koncentracije znotrajceličnega c-di-GMP. Poleg visoke vsebnosti c-di-GMP na indukcijo proizvodnje ECM vpliva tudi parakrino delovanje samega ECM. Dejstvo, da Psl deluje tudi na površini celic omogoča, aktivacijo proizvodnje ECM v sorodnih celicah, ki ga še ne proizvajajo. Poleg lastnosti, ki so ključne pri proizvodnji ECM in s tem zunajceličnega polisaharida, Psl sodeluje tudi pri širjenju biofilma oziroma kolonizaciji novih površin. Pri čeme bakterije ''P. aeruginosa'' PAO1 uporabljajo pilije. Zunajcelična DNA (v nadaljevanju eDNA) promovira celično migracijo preko ustvarjenih kanalčkov v bakterijskem biofilmu. Kar vodi v povečan volumen biofilma, saj je omogočena migracija celic preko teh kanalčkov. Celice se gibajo s pomočjo T4P in interagirajo s eDNA. Sledenje pilijev tipa 4 eDNA predstavlja usmerjeno gibanje celic in s tem povezano povečano proizvodnjo ECM na novo zasedenih območjih. V biofilmu bakterije P. aeruginosa ima eDNA poleg strukturne vloge tudi signalno.<br /> <br /> *Signalizacija ECM med poznimi fazami biofilmskega obstoja[2]<br /> Tekom zorenja biofilma prihaja do pomankanja hranil in akumulacije celičnih metabolitov. Bakterije, ki niso sposobne zapustiti biofilma postanejo ujete v ECM, kar vodi v njihov propad. Vendar pa bakterije same ne vedo kdaj je najbolj primeren čas za pobeg. Zato se pogosto v fazah, ko je čas za to še vedno delijo. Ob pomanjkanju hranilnih snovi in povečanju gostote ECM je za pobeg že prepozno. Celice, ki gradijo biofilm imajo na svoji površini polarne adhezijske komponente polisaharidov, ki so ključni za začetno vezavo na površino in tudi kasnejšo tvorbo biofilma ter s tem ECM. Ti adhezijski zunajcelični polisaharidi pa predstavljajo ločitveni problem za celice v poznih fazah obstoja biofilma. Celična smrt bakterij v biofilmu povzroči povečano prisotnost eDNA v okolju. Zunajcelična DNA, ki se sprošča v zunajcelično okolje, povzroča inhibicijo tvorjenja ECM tako statičnega kot na površini gibajočih se celic. Tvorbo novih filmov prepreči s vezavo na receptorje, ki so ključni za pritrditev celic na površino. ''S. aureus'' surfaktanti, tako imenovani majhni peptidi topni fenolni modulini (PSM), tvorijo amiloidna vlakna, ki imajo strukturno vlogo pri preprečevanju vezave bakterij na površino. V splošnem velja, da bakterije, ki imajo mutirane gene za izražanje PSM-jev tvorijo trdnejše, gostejše in bolj gladke biofilme.<br /> <br /> == PREPREČEVANJE POJAVA BIOFILMOV Z UPORABO BAKTERIOFAGOV ==<br /> Znaten delež bakterij in drugih mikroorganizmov, vključno s številnimi patogeni, obstaja kot komponenta biofilmov. Poznamo nekaj potencialnih bakterijskih virusov, znani kot fagi ali bakteriofagi, ki skupaj z različnimi encimi, ki jih kodirajo, služijo kot relativno netoksično antibiofilmsko sredstvo. Fagi imajo zato pomembno vlogo pri evoluciji bakterij, kot tudi pri globalnem biogeokemičnem kroženju ogljika in drugih elementov [3]. <br /> <br /> Vlogo fagov lahko iz te perspektive razdelimo v tri skupine: <br /> *biomedicinska uporaba fagov, <br /> *ekologija fagov,<br /> *interakcija fagov z bakterijskimi biofilmi [4]. <br /> Bakteriofagi, so virusi, ki okužijo bakterije in so specifični za vrsto ali sev bakterij. So med najštevilčnejšimi in najbolj raznolikimi mikroorganizmi na planetu. Raznolikost je večinoma posledica njihovega dinamičnega prilagajanja na mehanizme rezistence, ki so prisotni v gostiteljskih bakterijah [3].<br /> Pri odstranitvi biofilmov, fagi in njihovi encimi delujejo po treh splošnih mehanizmih:<br /> *EPS depolimeraze, kemično degradirajo EPS, ki je komponenta zunajceličnega matriksa, vendar so ti encimi zelo specifični za vrsto EPS, ki ga napadajo. Encime, ki degradirajo polisaharide lahko klasificiramo v dve skupini:<br /> **Hidrolaze (polisaharaze)<br /> **Liaze <br /> Liaze cepijo vezi med monosaharidi in C4 uronske kisline ter uvajajo dvojno vez med C4 in C5 uronske kisline. Hidrolaze pa cepijo glikozidne vezi.<br /> *Delovanje fagov proti tvorbi bakterijskih biofilmov. Ta pojav se sicer zgodi v kontekstu običajnih fagnih infekcij, kar povzroči lizo (''liza od znotraj'')[5].<br /> *Nekateri fagi pa so sposobni povzročiti ''lizo od zunaj'', s tem ko po množični adsorpciji hitro prekinejo ovojnico bakterijskih celic z virioni. Pri tem mehanizmu ni potrebna genska ekspresija fagov po adsorpciji na bakterijsko gostiteljsko celico [5].<br /> Biofilmi so bistveni za preživetje nekaterih bakterij v številnih naravnih in umetnih okoljih ter predstavljajo vir okužb in kontaminacij v medicini, industriji in prehrambnih obratih, zaradi rezistence na antimikrobna sredstva in obrambni sistem gostiteljev [5].<br /> [3]Zdravljenje z bakteriofagi je bilo predlagano kot ena od metod za nadzor bakterijskih biofilmov. Primer:<br /> *Fagi T4 lahko okužijo biofilme Escherichia coli, se znotraj njih replicirajo in uničijo biofilmsko morfologijo z ubijanjem celic.<br /> *Fagi se tudi modificirajo: E. coli, ki proizvaja polisaharidno kapsulo K1, je običajno rezistentna na infekcije s T7, vendar je dovzetna za okužbo s T7, ki je zasnovan za ekspresijo K1-5 endosialidaze. <br /> *Litični fag s polisaharidno depolimerazo povzroči lizo in EPS degradacijo in s tem zmanjša bakterijske biofilme. Te depolimeraze so na površinah fagov in degradirajo bakterijsko polisaharidno kapsulo.<br /> *Encimska razgradnja celično vezanega EPS polisaharida adhezina, znanega kot polimer β-1,6-N-acetil-Dglukozamina, z eksogeno uporabljeno disperzijo B (DspB), je potrdila redukcijo biofilmov različnih vrst bakterij. DspB je encim, ki ga proizvaja Actinobacillus actinomycetemcomitans in hidrolizira <br /> β-1,6-N-acetilDglukozamin, ki je torej ključen adhezin, potreben za tvorbo biofilma in integritete pri ''Staphylococcus'' in ''E. coli'', vključno z ''E. coli'' K-12, kot tudi kliničnih izolatov. <br /> <br /> [3]Encimska razgradnja komponente EPS je torej koristna strategija za uničevanje biofilmov, čeprav bakterijske celice niso ubite. Predlagano je bilo modularno preoblikovanje fagov, pri majhnih začetnih inokulacijah, v kateri fag ubija bakterije na način, da izraža najbolj učinkovite EPS degradacijske encime, ki so specifični za ciljni biofilm. Encimsko aktivirani fagi se razmnožujejo znotraj biofilmov in dosegajo visoke lokalne koncentracije encimov in litičnih fagov, katerih tarča so biofilmske komponente. Hitra replikacija fagov povzroči bakterijsko lizo in ekspresijo encimov, ki degradirajo biofilm. Ta strategija je uspešna pri katalitskih metodah za odstranjevanje bakterijskih biofilmov v okolju, industriji in prostorih/pripomočkih zdravstvene oskrbe. Prav tako tak način zmanjša potrebe po izražanju velikih količin encimov na specifična mesta infekcij, ki so težje dostopna in izboljša učinkovitost terapije s fagi pri odstranjevanju biofilmov.<br /> <br /> == VIRI ==<br /> [1] A. Dragoš in Á. T. Kovács, „The Peculiar Functions of the Bacterial Extracellular Matrix“, Trends Microbiol., let. 25, št. 4, str. 257–266, 2017.&lt;br /&gt;[2] N. Steinberg in I. Kolodkin-Gal, „The Matrix Reloaded: How Sensing the Extracellular Matrix Synchronizes Bacterial Communities“, J. Bacteriol., let. 197, št. 13, str. 2092–2103, 2015.&lt;br /&gt;[3] S. J. Labrie, J. E. Samson, in S. Moineau, „Bacteriophage resistance mechanisms“, Nat. Rev. Microbiol., let. 8, št. 5, str. 317–327, 2010.&lt;br /&gt;[4] B. K. Chan in S. T. Abedon, „Bacteriophage and their enzymes in biofilms“, str. 85–99, 2015.&lt;br /&gt;[5] T. K. Lu in J. J. Collins, „Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage“, Proc. Natl. Acad. Sci., let. 104, št. 27, str. 11197–11202, 2007.<br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa&diff=15351 2019-04-06T16:21:36Z

<p>Bm7118: /* SIGNALIZACIJA MED PROIZVODNJO ZUNAJCELIČNEGA MATRIKSA */</p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> Adsorpcija bakteriofagov na gostiteljske receptorje je prvi korak v infekciji gostiteljske celice. Hkrati velja za najbolj zapleten korak, saj morajo virusi prepoznati zelo raznolike vzorce celičnih membran. Bakterije so tekom svojega razvoja razvile številne obrambne mehanizme proti adsorpciji bakteriofagov. Te obrambne mehanizme delimo v tri osnovne skupine:<br /> *blokiranje fagoreceptorjev, <br /> *proizvodnja zunajceličnega matriksa,<br /> *proizvodnja inhibitorjev adhezije.<br /> Komponente zunajceličnega matriksa (v nadaljevanju: ECM) ščitijo bakterijske celice pred adsorpcijo bakteriofagov s ustvarjanjem fizične bariere<br /> Bakterijski ECM omogoča življenjski slog bakterij, ki večinoma uspevajo v tesno zapakiranih skupnostih imenovanih biofilm. Čeprav je veliko znanega o različnih funkcijah ECM pri živalskih celicah, je bakterijski ECM še vedno manj raziskan in se običajno o njem govori v kontekstu biofilma.<br /> <br /> == KOMPONENTE ECM V BAKTERIJSKEM BIOFILMU ==<br /> [1]Raziskane komponente ECM so polimeri bogati z eksopolisaharidi, proteini, nukleinske kisline in lipidi. <br /> *Eksopolisaharidi ali zunajcelični polisaharidi imajo pomembno vlogo v virulentnosti bakterij in sporulaciji. Velik delež eksopolisaharidov v svoji strukturi vsebuje celulozo in adhezijski znotrajcelični polisaharid (PIA), ki bakterijam predstavljajo zaščito pred bakteriofagi in tudi imunskim sistemom. Polimerne komponene ECM, ki vsebujejo PIA proizvajajo številne gram negativne bakterije. Med drugim Staphylococcus epidermis, S. aureus. Številne bakterijske vrste so sposobne proizvodnje raznolikih eksopolisaharidov. <br /> <br /> *Proteinske komponente<br /> Bakterijski funkcionalni amiloidi so netopni vlaknasti agregati proteinov, ki vsebujejo paralelne beta ploskve. V bakterijah predstavljajo ključno proteinsko enoto ECM in jih proizvajajo tako gram negativne kot pozitivne bakterije. Pri gram pozitivnih bakterijah je najpogostejši proteinski predstavnik TasA, ki ga proizvajajo ''Bacillus subtilis''. TasA amiloidna vlakna so pritrjena na celično membrano in predstavljajo medcelično povezavo z drugimi zunajceličnimi komponentami.Vseeno amiloidi ne predstavljajo celotnega deleža proteinskih komponent v ECM. Poznamo tudi adhezine, ki so ključni v povezavi celice z medceličnim tkivom gostiteljske celice. <br /> <br /> *Zunajcelična DNA (eDNA)<br /> Je dvoverižna, nizkomulekularna skupina molekul z velikostjo od 0,5 do 21kb, strukturno povezanih s histoni v mono- in oligonukleosome. Velja za pomembno strukturno komponento v mnogih bakterijskih biofilmih. Dodajanje DNaze rastočemu biofilmu inhibira njegov razvoj in povzroča prekinitve v njegovi strukturi. Mlajšega nastanka kot je biofilm, bolj je občutljiv na DNaze. Kemijska vloga dolgih, nabitih molekul DNA je modeliranje lastnosti celične površine in spodbujanje adhezije med celicami samimi in z gostiteljskim tkivom. eDNA izločajo v ECM lizirane celice. <br /> <br /> *Lipidi<br /> ECM vsebuje tudi lipopolisaharide. Vloga katerih je navadno adhezijska. Surfaktin, viskozin, emulzan lahko dispergirajo hidrofobne substance in tako omogočijo, da so biodostopne. <br /> <br /> *Voda<br /> Voda predstavlja največji del ECM. Eksopolisaharidi matriksu, ki je visoko hidriran omogočajo počasnejše sušenje od okolice. Ohranjajo pa tudi strukturo matriksa ob povečani prisotnosti nevezane vode.<br /> <br /> == SIGNALIZACIJA MED PROIZVODNJO ZUNAJCELIČNEGA MATRIKSA ==<br /> *Signalizacija ECM ob adheziji bakterij, in začetni tvorbi biofilma[2]<br /> Biofilm, ki ga tvorijo bakterije je pogosto pritrjen na površino. Bakterije ob pritrjevanju na površino stimulirajo signalne poti, ki so ključne za proizvodnjo ECM. Poznamo več signalnih poti, ki jih sprožijo bakterije. Bakterija ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1 v prisotnosti zunajceličnega polisaharida Psl ustvarja signalno pot, ki aktivira proizvodjo bis-(3´-5´)-cikličnega dimernega GMP (v nadaljevanju: c-di-GMP). Ciklični dimer GMP velja za sekundarnega obveščevalca v številnih bakterijskih vrstah. Sproža tvorbo bakterijskega biofilma, iz prosto gibajočih se bakterij s onemogočanjem bakterijskega gibanja. Znotrajcelične koncentracije c-di-GMP so skrbno regulirane s strani nasprotno delujoče digvanilat ciklaze, ki proizvajajo c-di-GMP iz dveh GTP molekul, in fosfodiestraze, ki prekine vez med 5´-fosfogvanilin (3´-5´)-gvanozo. <br /> <br /> *Signalizacija ECM med pospešeno rastjo biofilma[2]<br /> Prisotnost velikih količin induktorja c-di-GMP sproži vezavo na represor FleQ. Kompleks se veže na operon PelA-G, kar vodi v indukcijo transkripcije zapisov za ECM. Medtem ko nizke koncentracije c-di-GMP vodijo v represijo izražanja. Prisotnost Psl vodi v naraščanje koncentracije znotrajceličnega c-di-GMP. Poleg visoke vsebnosti c-di-GMP na indukcijo proizvodnje ECM vpliva tudi parakrino delovanje samega ECM. Dejstvo, da Psl deluje tudi na površini celic omogoča, aktivacijo proizvodnje ECM v sorodnih celicah, ki ga še ne proizvajajo. Poleg lastnosti, ki so ključne pri proizvodnji ECM in s tem zunajceličnega polisaharida, Psl sodeluje tudi pri širjenju biofilma oziroma kolonizaciji novih površin. Pri čeme bakterije ''P. aeruginosa'' PAO1 uporabljajo pilije. Zunajcelična DNA (v nadaljevanju eDNA) promovira celično migracijo preko ustvarjenih kanalčkov v bakterijskem biofilmu. Kar vodi v povečan volumen biofilma, saj je omogočena migracija celic preko teh kanalčkov. Celice se gibajo s pomočjo T4P in interagirajo s eDNA. Sledenje pilijev tipa 4 eDNA predstavlja usmerjeno gibanje celic in s tem povezano povečano proizvodnjo ECM na novo zasedenih območjih. V biofilmu bakterije P. aeruginosa ima eDNA poleg strukturne vloge tudi signalno.<br /> <br /> *Signalizacija ECM med poznimi fazami biofilmskega obstoja[2]<br /> Tekom zorenja biofilma prihaja do pomankanja hranil in akumulacije celičnih metabolitov. Bakterije, ki niso sposobne zapustiti biofilma postanejo ujete v ECM, kar vodi v njihov propad. Vendar pa bakterije same ne vedo kdaj je najbolj primeren čas za pobeg. Zato se pogosto v fazah, ko je čas za to še vedno delijo. Ob pomanjkanju hranilnih snovi in povečanju gostote ECM je za pobeg že prepozno. Celice, ki gradijo biofilm imajo na svoji površini polarne adhezijske komponente polisaharidov, ki so ključni za začetno vezavo na površino in tudi kasnejšo tvorbo biofilma ter s tem ECM. Ti adhezijski zunajcelični polisaharidi pa predstavljajo ločitveni problem za celice v poznih fazah obstoja biofilma. Celična smrt bakterij v biofilmu povzroči povečano prisotnost eDNA v okolju. Zunajcelična DNA, ki se sprošča v zunajcelično okolje, povzroča inhibicijo tvorjenja ECM tako statičnega kot na površini gibajočih se celic. Tvorbo novih filmov prepreči s vezavo na receptorje, ki so ključni za pritrditev celic na površino. ''S. aureus'' surfaktanti, tako imenovani majhni peptidi topni fenolni modulini (PSM), tvorijo amiloidna vlakna, ki imajo strukturno vlogo pri preprečevanju vezave bakterij na površino. V splošnem velja, da bakterije, ki imajo mutirane gene za izražanje PSM-jev tvorijo trdnejše, gostejše in bolj gladke biofilme.<br /> <br /> == PREPREČEVANJE POJAVA BIOFILMOV Z UPORABO BAKTERIOFAGOV ==<br /> Znaten delež bakterij in drugih mikroorganizmov, vključno s številnimi patogeni, obstaja kot komponenta biofilmov. Poznamo nekaj potencialnih bakterijskih virusov, znani kot fagi ali bakteriofagi, ki skupaj z različnimi encimi, ki jih kodirajo, služijo kot relativno netoksično antibiofilmsko sredstvo. Fagi imajo zato pomembno vlogo pri evoluciji bakterij, kot tudi pri globalnem biogeokemičnem kroženju ogljika in drugih elementov [3]. <br /> <br /> Vlogo fagov lahko iz te perspektive razdelimo v tri skupine: <br /> *biomedicinska uporaba fagov, <br /> *ekologija fagov,<br /> *interakcija fagov z bakterijskimi biofilmi [4]. <br /> Bakteriofagi, so virusi, ki okužijo bakterije in so specifični za vrsto ali sev bakterij. So med najštevilčnejšimi in najbolj raznolikimi mikroorganizmi na planetu. Raznolikost je večinoma posledica njihovega dinamičnega prilagajanja na mehanizme rezistence, ki so prisotni v gostiteljskih bakterijah [3].<br /> Pri odstranitvi biofilmov, fagi in njihovi encimi delujejo po treh splošnih mehanizmih:<br /> *EPS depolimeraze, kemično degradirajo EPS, ki je komponenta zunajceličnega matriksa, vendar so ti encimi zelo specifični za vrsto EPS, ki ga napadajo. Encime, ki degradirajo polisaharide lahko klasificiramo v dve skupini:<br /> **Hidrolaze (polisaharaze)<br /> **Liaze <br /> Liaze cepijo vezi med monosaharidi in C4 uronske kisline ter uvajajo dvojno vez med C4 in C5 uronske kisline. Hidrolaze pa cepijo glikozidne vezi.<br /> *Delovanje fagov proti tvorbi bakterijskih biofilmov. Ta pojav se sicer zgodi v kontekstu običajnih fagnih infekcij, kar povzroči lizo (''liza od znotraj'')[5].<br /> *Nekateri fagi pa so sposobni povzročiti ''lizo od zunaj'', s tem ko po množični adsorpciji hitro prekinejo ovojnico bakterijskih celic z virioni. Pri tem mehanizmu ni potrebna genska ekspresija fagov po adsorpciji na bakterijsko gostiteljsko celico [5].<br /> Biofilmi so bistveni za preživetje nekaterih bakterij v številnih naravnih in umetnih okoljih ter predstavljajo vir okužb in kontaminacij v medicini, industriji in prehrambnih obratih, zaradi rezistence na antimikrobna sredstva in obrambni sistem gostiteljev [5].<br /> [3]Zdravljenje z bakteriofagi je bilo predlagano kot ena od metod za nadzor bakterijskih biofilmov. Primer:<br /> *Fagi T4 lahko okužijo biofilme Escherichia coli, se znotraj njih replicirajo in uničijo biofilmsko morfologijo z ubijanjem celic.<br /> *Fagi se tudi modificirajo: E. coli, ki proizvaja polisaharidno kapsulo K1, je običajno rezistentna na infekcije s T7, vendar je dovzetna za okužbo s T7, ki je zasnovan za ekspresijo K1-5 endosialidaze. <br /> *Litični fag s polisaharidno depolimerazo povzroči lizo in EPS degradacijo in s tem zmanjša bakterijske biofilme. Te depolimeraze so na površinah fagov in degradirajo bakterijsko polisaharidno kapsulo.<br /> *Encimska razgradnja celično vezanega EPS polisaharida adhezina, znanega kot polimer β-1,6-N-acetil-Dglukozamina, z eksogeno uporabljeno disperzijo B (DspB), je potrdila redukcijo biofilmov različnih vrst bakterij. DspB je encim, ki ga proizvaja Actinobacillus actinomycetemcomitans in hidrolizira <br /> β-1,6-N-acetilDglukozamin, ki je torej ključen adhezin, potreben za tvorbo biofilma in integritete pri Staphylococcus in E. coli, vključno z E. coli K-12, kot tudi kliničnih izolatov. <br /> <br /> [3]Encimska razgradnja komponente EPS je torej koristna strategija za uničevanje biofilmov, čeprav bakterijske celice niso ubite. Predlagano je bilo modularno preoblikovanje fagov, pri majhnih začetnih inokulacijah, v kateri fag ubija bakterije na način, da izraža najbolj učinkovite EPS degradacijske encime, ki so specifični za ciljni biofilm. Encimsko aktivirani fagi se razmnožujejo znotraj biofilmov in dosegajo visoke lokalne koncentracije encimov in litičnih fagov, katerih tarča so biofilmske komponente. Hitra replikacija fagov povzroči bakterijsko lizo in ekspresijo encimov, ki degradirajo biofilm. Ta strategija je uspešna pri katalitskih metodah za odstranjevanje bakterijskih biofilmov v okolju, industriji in prostorih/pripomočkih zdravstvene oskrbe. Prav tako tak način zmanjša potrebe po izražanju velikih količin encimov na specifična mesta infekcij, ki so težje dostopna in izboljša učinkovitost terapije s fagi pri odstranjevanju biofilmov.<br /> <br /> == VIRI ==<br /> [1] A. Dragoš in Á. T. Kovács, „The Peculiar Functions of the Bacterial Extracellular Matrix“, Trends Microbiol., let. 25, št. 4, str. 257–266, 2017.&lt;br /&gt;[2] N. Steinberg in I. Kolodkin-Gal, „The Matrix Reloaded: How Sensing the Extracellular Matrix Synchronizes Bacterial Communities“, J. Bacteriol., let. 197, št. 13, str. 2092–2103, 2015.&lt;br /&gt;[3] S. J. Labrie, J. E. Samson, in S. Moineau, „Bacteriophage resistance mechanisms“, Nat. Rev. Microbiol., let. 8, št. 5, str. 317–327, 2010.&lt;br /&gt;[4] B. K. Chan in S. T. Abedon, „Bacteriophage and their enzymes in biofilms“, str. 85–99, 2015.&lt;br /&gt;[5] T. K. Lu in J. J. Collins, „Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage“, Proc. Natl. Acad. Sci., let. 104, št. 27, str. 11197–11202, 2007.<br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa&diff=15350 2019-04-06T16:21:05Z

<p>Bm7118: /* UVOD */</p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> Adsorpcija bakteriofagov na gostiteljske receptorje je prvi korak v infekciji gostiteljske celice. Hkrati velja za najbolj zapleten korak, saj morajo virusi prepoznati zelo raznolike vzorce celičnih membran. Bakterije so tekom svojega razvoja razvile številne obrambne mehanizme proti adsorpciji bakteriofagov. Te obrambne mehanizme delimo v tri osnovne skupine:<br /> *blokiranje fagoreceptorjev, <br /> *proizvodnja zunajceličnega matriksa,<br /> *proizvodnja inhibitorjev adhezije.<br /> Komponente zunajceličnega matriksa (v nadaljevanju: ECM) ščitijo bakterijske celice pred adsorpcijo bakteriofagov s ustvarjanjem fizične bariere<br /> Bakterijski ECM omogoča življenjski slog bakterij, ki večinoma uspevajo v tesno zapakiranih skupnostih imenovanih biofilm. Čeprav je veliko znanega o različnih funkcijah ECM pri živalskih celicah, je bakterijski ECM še vedno manj raziskan in se običajno o njem govori v kontekstu biofilma.<br /> <br /> == KOMPONENTE ECM V BAKTERIJSKEM BIOFILMU ==<br /> [1]Raziskane komponente ECM so polimeri bogati z eksopolisaharidi, proteini, nukleinske kisline in lipidi. <br /> *Eksopolisaharidi ali zunajcelični polisaharidi imajo pomembno vlogo v virulentnosti bakterij in sporulaciji. Velik delež eksopolisaharidov v svoji strukturi vsebuje celulozo in adhezijski znotrajcelični polisaharid (PIA), ki bakterijam predstavljajo zaščito pred bakteriofagi in tudi imunskim sistemom. Polimerne komponene ECM, ki vsebujejo PIA proizvajajo številne gram negativne bakterije. Med drugim Staphylococcus epidermis, S. aureus. Številne bakterijske vrste so sposobne proizvodnje raznolikih eksopolisaharidov. <br /> <br /> *Proteinske komponente<br /> Bakterijski funkcionalni amiloidi so netopni vlaknasti agregati proteinov, ki vsebujejo paralelne beta ploskve. V bakterijah predstavljajo ključno proteinsko enoto ECM in jih proizvajajo tako gram negativne kot pozitivne bakterije. Pri gram pozitivnih bakterijah je najpogostejši proteinski predstavnik TasA, ki ga proizvajajo ''Bacillus subtilis''. TasA amiloidna vlakna so pritrjena na celično membrano in predstavljajo medcelično povezavo z drugimi zunajceličnimi komponentami.Vseeno amiloidi ne predstavljajo celotnega deleža proteinskih komponent v ECM. Poznamo tudi adhezine, ki so ključni v povezavi celice z medceličnim tkivom gostiteljske celice. <br /> <br /> *Zunajcelična DNA (eDNA)<br /> Je dvoverižna, nizkomulekularna skupina molekul z velikostjo od 0,5 do 21kb, strukturno povezanih s histoni v mono- in oligonukleosome. Velja za pomembno strukturno komponento v mnogih bakterijskih biofilmih. Dodajanje DNaze rastočemu biofilmu inhibira njegov razvoj in povzroča prekinitve v njegovi strukturi. Mlajšega nastanka kot je biofilm, bolj je občutljiv na DNaze. Kemijska vloga dolgih, nabitih molekul DNA je modeliranje lastnosti celične površine in spodbujanje adhezije med celicami samimi in z gostiteljskim tkivom. eDNA izločajo v ECM lizirane celice. <br /> <br /> *Lipidi<br /> ECM vsebuje tudi lipopolisaharide. Vloga katerih je navadno adhezijska. Surfaktin, viskozin, emulzan lahko dispergirajo hidrofobne substance in tako omogočijo, da so biodostopne. <br /> <br /> *Voda<br /> Voda predstavlja največji del ECM. Eksopolisaharidi matriksu, ki je visoko hidriran omogočajo počasnejše sušenje od okolice. Ohranjajo pa tudi strukturo matriksa ob povečani prisotnosti nevezane vode.<br /> <br /> == SIGNALIZACIJA MED PROIZVODNJO ZUNAJCELIČNEGA MATRIKSA ==<br /> *Signalizacija ECM ob adheziji bakterij, in začetni tvorbi biofilma[2]<br /> Biofilm, ki ga tvorijo bakterije je pogosto pritrjen na površino. Bakterije ob pritrjevanju na površino stimulirajo signalne poti, ki so ključne za proizvodnjo ECM. Poznamo več signalnih poti, ki jih sprožijo bakterije. Bakterija ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1 v prisotnosti zunajceličnega polisaharida Psl ustvarja signalno pot, ki aktivira proizvodjo bis-(3´-5´)-cikličnega dimernega GMP (v nadaljevanju c-di-GMP). Ciklični dimer GMP velja za sekundarnega obveščevalca v številnih bakterijskih vrstah. Sproža tvorbo bakterijskega biofilma, iz prosto gibajočih se bakterij s onemogočanjem bakterijskega gibanja. Znotrajcelične koncentracije c-di-GMP so skrbno regulirane s strani nasprotno delujoče digvanilat ciklaze, ki proizvajajo c-di-GMP iz dveh GTP molekul, in fosfodiestraze, ki prekine vez med 5´-fosfogvanilin (3´-5´)-gvanozo. <br /> <br /> *Signalizacija ECM med pospešeno rastjo biofilma[2]<br /> Prisotnost velikih količin induktorja c-di-GMP sproži vezavo na represor FleQ. Kompleks se veže na operon PelA-G, kar vodi v indukcijo transkripcije zapisov za ECM. Medtem ko nizke koncentracije c-di-GMP vodijo v represijo izražanja. Prisotnost Psl vodi v naraščanje koncentracije znotrajceličnega c-di-GMP. Poleg visoke vsebnosti c-di-GMP na indukcijo proizvodnje ECM vpliva tudi parakrino delovanje samega ECM. Dejstvo, da Psl deluje tudi na površini celic omogoča, aktivacijo proizvodnje ECM v sorodnih celicah, ki ga še ne proizvajajo. Poleg lastnosti, ki so ključne pri proizvodnji ECM in s tem zunajceličnega polisaharida, Psl sodeluje tudi pri širjenju biofilma oziroma kolonizaciji novih površin. Pri čeme bakterije ''P. aeruginosa'' PAO1 uporabljajo pilije. Zunajcelična DNA (v nadaljevanju eDNA) promovira celično migracijo preko ustvarjenih kanalčkov v bakterijskem biofilmu. Kar vodi v povečan volumen biofilma, saj je omogočena migracija celic preko teh kanalčkov. Celice se gibajo s pomočjo T4P in interagirajo s eDNA. Sledenje pilijev tipa 4 eDNA predstavlja usmerjeno gibanje celic in s tem povezano povečano proizvodnjo ECM na novo zasedenih območjih. V biofilmu bakterije P. aeruginosa ima eDNA poleg strukturne vloge tudi signalno.<br /> <br /> *Signalizacija ECM med poznimi fazami biofilmskega obstoja[2]<br /> Tekom zorenja biofilma prihaja do pomankanja hranil in akumulacije celičnih metabolitov. Bakterije, ki niso sposobne zapustiti biofilma postanejo ujete v ECM, kar vodi v njihov propad. Vendar pa bakterije same ne vedo kdaj je najbolj primeren čas za pobeg. Zato se pogosto v fazah, ko je čas za to še vedno delijo. Ob pomanjkanju hranilnih snovi in povečanju gostote ECM je za pobeg že prepozno. Celice, ki gradijo biofilm imajo na svoji površini polarne adhezijske komponente polisaharidov, ki so ključni za začetno vezavo na površino in tudi kasnejšo tvorbo biofilma ter s tem ECM. Ti adhezijski zunajcelični polisaharidi pa predstavljajo ločitveni problem za celice v poznih fazah obstoja biofilma. Celična smrt bakterij v biofilmu povzroči povečano prisotnost eDNA v okolju. Zunajcelična DNA, ki se sprošča v zunajcelično okolje, povzroča inhibicijo tvorjenja ECM tako statičnega kot na površini gibajočih se celic. Tvorbo novih filmov prepreči s vezavo na receptorje, ki so ključni za pritrditev celic na površino. ''S. aureus'' surfaktanti, tako imenovani majhni peptidi topni fenolni modulini (PSM), tvorijo amiloidna vlakna, ki imajo strukturno vlogo pri preprečevanju vezave bakterij na površino. V splošnem velja, da bakterije, ki imajo mutirane gene za izražanje PSM-jev tvorijo trdnejše, gostejše in bolj gladke biofilme.<br /> <br /> == PREPREČEVANJE POJAVA BIOFILMOV Z UPORABO BAKTERIOFAGOV ==<br /> Znaten delež bakterij in drugih mikroorganizmov, vključno s številnimi patogeni, obstaja kot komponenta biofilmov. Poznamo nekaj potencialnih bakterijskih virusov, znani kot fagi ali bakteriofagi, ki skupaj z različnimi encimi, ki jih kodirajo, služijo kot relativno netoksično antibiofilmsko sredstvo. Fagi imajo zato pomembno vlogo pri evoluciji bakterij, kot tudi pri globalnem biogeokemičnem kroženju ogljika in drugih elementov [3]. <br /> <br /> Vlogo fagov lahko iz te perspektive razdelimo v tri skupine: <br /> *biomedicinska uporaba fagov, <br /> *ekologija fagov,<br /> *interakcija fagov z bakterijskimi biofilmi [4]. <br /> Bakteriofagi, so virusi, ki okužijo bakterije in so specifični za vrsto ali sev bakterij. So med najštevilčnejšimi in najbolj raznolikimi mikroorganizmi na planetu. Raznolikost je večinoma posledica njihovega dinamičnega prilagajanja na mehanizme rezistence, ki so prisotni v gostiteljskih bakterijah [3].<br /> Pri odstranitvi biofilmov, fagi in njihovi encimi delujejo po treh splošnih mehanizmih:<br /> *EPS depolimeraze, kemično degradirajo EPS, ki je komponenta zunajceličnega matriksa, vendar so ti encimi zelo specifični za vrsto EPS, ki ga napadajo. Encime, ki degradirajo polisaharide lahko klasificiramo v dve skupini:<br /> **Hidrolaze (polisaharaze)<br /> **Liaze <br /> Liaze cepijo vezi med monosaharidi in C4 uronske kisline ter uvajajo dvojno vez med C4 in C5 uronske kisline. Hidrolaze pa cepijo glikozidne vezi.<br /> *Delovanje fagov proti tvorbi bakterijskih biofilmov. Ta pojav se sicer zgodi v kontekstu običajnih fagnih infekcij, kar povzroči lizo (''liza od znotraj'')[5].<br /> *Nekateri fagi pa so sposobni povzročiti ''lizo od zunaj'', s tem ko po množični adsorpciji hitro prekinejo ovojnico bakterijskih celic z virioni. Pri tem mehanizmu ni potrebna genska ekspresija fagov po adsorpciji na bakterijsko gostiteljsko celico [5].<br /> Biofilmi so bistveni za preživetje nekaterih bakterij v številnih naravnih in umetnih okoljih ter predstavljajo vir okužb in kontaminacij v medicini, industriji in prehrambnih obratih, zaradi rezistence na antimikrobna sredstva in obrambni sistem gostiteljev [5].<br /> [3]Zdravljenje z bakteriofagi je bilo predlagano kot ena od metod za nadzor bakterijskih biofilmov. Primer:<br /> *Fagi T4 lahko okužijo biofilme Escherichia coli, se znotraj njih replicirajo in uničijo biofilmsko morfologijo z ubijanjem celic.<br /> *Fagi se tudi modificirajo: E. coli, ki proizvaja polisaharidno kapsulo K1, je običajno rezistentna na infekcije s T7, vendar je dovzetna za okužbo s T7, ki je zasnovan za ekspresijo K1-5 endosialidaze. <br /> *Litični fag s polisaharidno depolimerazo povzroči lizo in EPS degradacijo in s tem zmanjša bakterijske biofilme. Te depolimeraze so na površinah fagov in degradirajo bakterijsko polisaharidno kapsulo.<br /> *Encimska razgradnja celično vezanega EPS polisaharida adhezina, znanega kot polimer β-1,6-N-acetil-Dglukozamina, z eksogeno uporabljeno disperzijo B (DspB), je potrdila redukcijo biofilmov različnih vrst bakterij. DspB je encim, ki ga proizvaja Actinobacillus actinomycetemcomitans in hidrolizira <br /> β-1,6-N-acetilDglukozamin, ki je torej ključen adhezin, potreben za tvorbo biofilma in integritete pri Staphylococcus in E. coli, vključno z E. coli K-12, kot tudi kliničnih izolatov. <br /> <br /> [3]Encimska razgradnja komponente EPS je torej koristna strategija za uničevanje biofilmov, čeprav bakterijske celice niso ubite. Predlagano je bilo modularno preoblikovanje fagov, pri majhnih začetnih inokulacijah, v kateri fag ubija bakterije na način, da izraža najbolj učinkovite EPS degradacijske encime, ki so specifični za ciljni biofilm. Encimsko aktivirani fagi se razmnožujejo znotraj biofilmov in dosegajo visoke lokalne koncentracije encimov in litičnih fagov, katerih tarča so biofilmske komponente. Hitra replikacija fagov povzroči bakterijsko lizo in ekspresijo encimov, ki degradirajo biofilm. Ta strategija je uspešna pri katalitskih metodah za odstranjevanje bakterijskih biofilmov v okolju, industriji in prostorih/pripomočkih zdravstvene oskrbe. Prav tako tak način zmanjša potrebe po izražanju velikih količin encimov na specifična mesta infekcij, ki so težje dostopna in izboljša učinkovitost terapije s fagi pri odstranjevanju biofilmov.<br /> <br /> == VIRI ==<br /> [1] A. Dragoš in Á. T. Kovács, „The Peculiar Functions of the Bacterial Extracellular Matrix“, Trends Microbiol., let. 25, št. 4, str. 257–266, 2017.&lt;br /&gt;[2] N. Steinberg in I. Kolodkin-Gal, „The Matrix Reloaded: How Sensing the Extracellular Matrix Synchronizes Bacterial Communities“, J. Bacteriol., let. 197, št. 13, str. 2092–2103, 2015.&lt;br /&gt;[3] S. J. Labrie, J. E. Samson, in S. Moineau, „Bacteriophage resistance mechanisms“, Nat. Rev. Microbiol., let. 8, št. 5, str. 317–327, 2010.&lt;br /&gt;[4] B. K. Chan in S. T. Abedon, „Bacteriophage and their enzymes in biofilms“, str. 85–99, 2015.&lt;br /&gt;[5] T. K. Lu in J. J. Collins, „Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage“, Proc. Natl. Acad. Sci., let. 104, št. 27, str. 11197–11202, 2007.<br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa&diff=15349 2019-04-06T16:20:46Z

<p>Bm7118: /* KOMPONENTE ECM V BAKTERIJSKEM BIOFILMU */</p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> Adsorpcija bakteriofagov na gostiteljske receptorje je prvi korak v infekciji gostiteljske celice. Hkrati velja za najbolj zapleten korak, saj morajo virusi prepoznati zelo raznolike vzorce celičnih membran. Bakterije so tekom svojega razvoja razvile številne obrambne mehanizme proti adsorpciji bakteriofagov. Te obrambne mehanizme delimo v tri osnovne skupine:<br /> *blokiranje fagoreceptorjev, <br /> *proizvodnja zunajceličnega matriksa,<br /> *proizvodnja inhibitorjev adhezije.<br /> Komponente zunajceličnega matriksa (v nadaljevanju ECM) ščitijo bakterijske celice pred adsorpcijo bakteriofagov s ustvarjanjem fizične bariere<br /> Bakterijski ECM omogoča življenjski slog bakterij, ki večinoma uspevajo v tesno zapakiranih skupnostih imenovanih biofilm. Čeprav je veliko znanega o različnih funkcijah ECM pri živalskih celicah, je bakterijski ECM še vedno manj raziskan in se običajno o njem govori v kontekstu biofilma.<br /> <br /> == KOMPONENTE ECM V BAKTERIJSKEM BIOFILMU ==<br /> [1]Raziskane komponente ECM so polimeri bogati z eksopolisaharidi, proteini, nukleinske kisline in lipidi. <br /> *Eksopolisaharidi ali zunajcelični polisaharidi imajo pomembno vlogo v virulentnosti bakterij in sporulaciji. Velik delež eksopolisaharidov v svoji strukturi vsebuje celulozo in adhezijski znotrajcelični polisaharid (PIA), ki bakterijam predstavljajo zaščito pred bakteriofagi in tudi imunskim sistemom. Polimerne komponene ECM, ki vsebujejo PIA proizvajajo številne gram negativne bakterije. Med drugim Staphylococcus epidermis, S. aureus. Številne bakterijske vrste so sposobne proizvodnje raznolikih eksopolisaharidov. <br /> <br /> *Proteinske komponente<br /> Bakterijski funkcionalni amiloidi so netopni vlaknasti agregati proteinov, ki vsebujejo paralelne beta ploskve. V bakterijah predstavljajo ključno proteinsko enoto ECM in jih proizvajajo tako gram negativne kot pozitivne bakterije. Pri gram pozitivnih bakterijah je najpogostejši proteinski predstavnik TasA, ki ga proizvajajo ''Bacillus subtilis''. TasA amiloidna vlakna so pritrjena na celično membrano in predstavljajo medcelično povezavo z drugimi zunajceličnimi komponentami.Vseeno amiloidi ne predstavljajo celotnega deleža proteinskih komponent v ECM. Poznamo tudi adhezine, ki so ključni v povezavi celice z medceličnim tkivom gostiteljske celice. <br /> <br /> *Zunajcelična DNA (eDNA)<br /> Je dvoverižna, nizkomulekularna skupina molekul z velikostjo od 0,5 do 21kb, strukturno povezanih s histoni v mono- in oligonukleosome. Velja za pomembno strukturno komponento v mnogih bakterijskih biofilmih. Dodajanje DNaze rastočemu biofilmu inhibira njegov razvoj in povzroča prekinitve v njegovi strukturi. Mlajšega nastanka kot je biofilm, bolj je občutljiv na DNaze. Kemijska vloga dolgih, nabitih molekul DNA je modeliranje lastnosti celične površine in spodbujanje adhezije med celicami samimi in z gostiteljskim tkivom. eDNA izločajo v ECM lizirane celice. <br /> <br /> *Lipidi<br /> ECM vsebuje tudi lipopolisaharide. Vloga katerih je navadno adhezijska. Surfaktin, viskozin, emulzan lahko dispergirajo hidrofobne substance in tako omogočijo, da so biodostopne. <br /> <br /> *Voda<br /> Voda predstavlja največji del ECM. Eksopolisaharidi matriksu, ki je visoko hidriran omogočajo počasnejše sušenje od okolice. Ohranjajo pa tudi strukturo matriksa ob povečani prisotnosti nevezane vode.<br /> <br /> == SIGNALIZACIJA MED PROIZVODNJO ZUNAJCELIČNEGA MATRIKSA ==<br /> *Signalizacija ECM ob adheziji bakterij, in začetni tvorbi biofilma[2]<br /> Biofilm, ki ga tvorijo bakterije je pogosto pritrjen na površino. Bakterije ob pritrjevanju na površino stimulirajo signalne poti, ki so ključne za proizvodnjo ECM. Poznamo več signalnih poti, ki jih sprožijo bakterije. Bakterija ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1 v prisotnosti zunajceličnega polisaharida Psl ustvarja signalno pot, ki aktivira proizvodjo bis-(3´-5´)-cikličnega dimernega GMP (v nadaljevanju c-di-GMP). Ciklični dimer GMP velja za sekundarnega obveščevalca v številnih bakterijskih vrstah. Sproža tvorbo bakterijskega biofilma, iz prosto gibajočih se bakterij s onemogočanjem bakterijskega gibanja. Znotrajcelične koncentracije c-di-GMP so skrbno regulirane s strani nasprotno delujoče digvanilat ciklaze, ki proizvajajo c-di-GMP iz dveh GTP molekul, in fosfodiestraze, ki prekine vez med 5´-fosfogvanilin (3´-5´)-gvanozo. <br /> <br /> *Signalizacija ECM med pospešeno rastjo biofilma[2]<br /> Prisotnost velikih količin induktorja c-di-GMP sproži vezavo na represor FleQ. Kompleks se veže na operon PelA-G, kar vodi v indukcijo transkripcije zapisov za ECM. Medtem ko nizke koncentracije c-di-GMP vodijo v represijo izražanja. Prisotnost Psl vodi v naraščanje koncentracije znotrajceličnega c-di-GMP. Poleg visoke vsebnosti c-di-GMP na indukcijo proizvodnje ECM vpliva tudi parakrino delovanje samega ECM. Dejstvo, da Psl deluje tudi na površini celic omogoča, aktivacijo proizvodnje ECM v sorodnih celicah, ki ga še ne proizvajajo. Poleg lastnosti, ki so ključne pri proizvodnji ECM in s tem zunajceličnega polisaharida, Psl sodeluje tudi pri širjenju biofilma oziroma kolonizaciji novih površin. Pri čeme bakterije ''P. aeruginosa'' PAO1 uporabljajo pilije. Zunajcelična DNA (v nadaljevanju eDNA) promovira celično migracijo preko ustvarjenih kanalčkov v bakterijskem biofilmu. Kar vodi v povečan volumen biofilma, saj je omogočena migracija celic preko teh kanalčkov. Celice se gibajo s pomočjo T4P in interagirajo s eDNA. Sledenje pilijev tipa 4 eDNA predstavlja usmerjeno gibanje celic in s tem povezano povečano proizvodnjo ECM na novo zasedenih območjih. V biofilmu bakterije P. aeruginosa ima eDNA poleg strukturne vloge tudi signalno.<br /> <br /> *Signalizacija ECM med poznimi fazami biofilmskega obstoja[2]<br /> Tekom zorenja biofilma prihaja do pomankanja hranil in akumulacije celičnih metabolitov. Bakterije, ki niso sposobne zapustiti biofilma postanejo ujete v ECM, kar vodi v njihov propad. Vendar pa bakterije same ne vedo kdaj je najbolj primeren čas za pobeg. Zato se pogosto v fazah, ko je čas za to še vedno delijo. Ob pomanjkanju hranilnih snovi in povečanju gostote ECM je za pobeg že prepozno. Celice, ki gradijo biofilm imajo na svoji površini polarne adhezijske komponente polisaharidov, ki so ključni za začetno vezavo na površino in tudi kasnejšo tvorbo biofilma ter s tem ECM. Ti adhezijski zunajcelični polisaharidi pa predstavljajo ločitveni problem za celice v poznih fazah obstoja biofilma. Celična smrt bakterij v biofilmu povzroči povečano prisotnost eDNA v okolju. Zunajcelična DNA, ki se sprošča v zunajcelično okolje, povzroča inhibicijo tvorjenja ECM tako statičnega kot na površini gibajočih se celic. Tvorbo novih filmov prepreči s vezavo na receptorje, ki so ključni za pritrditev celic na površino. ''S. aureus'' surfaktanti, tako imenovani majhni peptidi topni fenolni modulini (PSM), tvorijo amiloidna vlakna, ki imajo strukturno vlogo pri preprečevanju vezave bakterij na površino. V splošnem velja, da bakterije, ki imajo mutirane gene za izražanje PSM-jev tvorijo trdnejše, gostejše in bolj gladke biofilme.<br /> <br /> == PREPREČEVANJE POJAVA BIOFILMOV Z UPORABO BAKTERIOFAGOV ==<br /> Znaten delež bakterij in drugih mikroorganizmov, vključno s številnimi patogeni, obstaja kot komponenta biofilmov. Poznamo nekaj potencialnih bakterijskih virusov, znani kot fagi ali bakteriofagi, ki skupaj z različnimi encimi, ki jih kodirajo, služijo kot relativno netoksično antibiofilmsko sredstvo. Fagi imajo zato pomembno vlogo pri evoluciji bakterij, kot tudi pri globalnem biogeokemičnem kroženju ogljika in drugih elementov [3]. <br /> <br /> Vlogo fagov lahko iz te perspektive razdelimo v tri skupine: <br /> *biomedicinska uporaba fagov, <br /> *ekologija fagov,<br /> *interakcija fagov z bakterijskimi biofilmi [4]. <br /> Bakteriofagi, so virusi, ki okužijo bakterije in so specifični za vrsto ali sev bakterij. So med najštevilčnejšimi in najbolj raznolikimi mikroorganizmi na planetu. Raznolikost je večinoma posledica njihovega dinamičnega prilagajanja na mehanizme rezistence, ki so prisotni v gostiteljskih bakterijah [3].<br /> Pri odstranitvi biofilmov, fagi in njihovi encimi delujejo po treh splošnih mehanizmih:<br /> *EPS depolimeraze, kemično degradirajo EPS, ki je komponenta zunajceličnega matriksa, vendar so ti encimi zelo specifični za vrsto EPS, ki ga napadajo. Encime, ki degradirajo polisaharide lahko klasificiramo v dve skupini:<br /> **Hidrolaze (polisaharaze)<br /> **Liaze <br /> Liaze cepijo vezi med monosaharidi in C4 uronske kisline ter uvajajo dvojno vez med C4 in C5 uronske kisline. Hidrolaze pa cepijo glikozidne vezi.<br /> *Delovanje fagov proti tvorbi bakterijskih biofilmov. Ta pojav se sicer zgodi v kontekstu običajnih fagnih infekcij, kar povzroči lizo (''liza od znotraj'')[5].<br /> *Nekateri fagi pa so sposobni povzročiti ''lizo od zunaj'', s tem ko po množični adsorpciji hitro prekinejo ovojnico bakterijskih celic z virioni. Pri tem mehanizmu ni potrebna genska ekspresija fagov po adsorpciji na bakterijsko gostiteljsko celico [5].<br /> Biofilmi so bistveni za preživetje nekaterih bakterij v številnih naravnih in umetnih okoljih ter predstavljajo vir okužb in kontaminacij v medicini, industriji in prehrambnih obratih, zaradi rezistence na antimikrobna sredstva in obrambni sistem gostiteljev [5].<br /> [3]Zdravljenje z bakteriofagi je bilo predlagano kot ena od metod za nadzor bakterijskih biofilmov. Primer:<br /> *Fagi T4 lahko okužijo biofilme Escherichia coli, se znotraj njih replicirajo in uničijo biofilmsko morfologijo z ubijanjem celic.<br /> *Fagi se tudi modificirajo: E. coli, ki proizvaja polisaharidno kapsulo K1, je običajno rezistentna na infekcije s T7, vendar je dovzetna za okužbo s T7, ki je zasnovan za ekspresijo K1-5 endosialidaze. <br /> *Litični fag s polisaharidno depolimerazo povzroči lizo in EPS degradacijo in s tem zmanjša bakterijske biofilme. Te depolimeraze so na površinah fagov in degradirajo bakterijsko polisaharidno kapsulo.<br /> *Encimska razgradnja celično vezanega EPS polisaharida adhezina, znanega kot polimer β-1,6-N-acetil-Dglukozamina, z eksogeno uporabljeno disperzijo B (DspB), je potrdila redukcijo biofilmov različnih vrst bakterij. DspB je encim, ki ga proizvaja Actinobacillus actinomycetemcomitans in hidrolizira <br /> β-1,6-N-acetilDglukozamin, ki je torej ključen adhezin, potreben za tvorbo biofilma in integritete pri Staphylococcus in E. coli, vključno z E. coli K-12, kot tudi kliničnih izolatov. <br /> <br /> [3]Encimska razgradnja komponente EPS je torej koristna strategija za uničevanje biofilmov, čeprav bakterijske celice niso ubite. Predlagano je bilo modularno preoblikovanje fagov, pri majhnih začetnih inokulacijah, v kateri fag ubija bakterije na način, da izraža najbolj učinkovite EPS degradacijske encime, ki so specifični za ciljni biofilm. Encimsko aktivirani fagi se razmnožujejo znotraj biofilmov in dosegajo visoke lokalne koncentracije encimov in litičnih fagov, katerih tarča so biofilmske komponente. Hitra replikacija fagov povzroči bakterijsko lizo in ekspresijo encimov, ki degradirajo biofilm. Ta strategija je uspešna pri katalitskih metodah za odstranjevanje bakterijskih biofilmov v okolju, industriji in prostorih/pripomočkih zdravstvene oskrbe. Prav tako tak način zmanjša potrebe po izražanju velikih količin encimov na specifična mesta infekcij, ki so težje dostopna in izboljša učinkovitost terapije s fagi pri odstranjevanju biofilmov.<br /> <br /> == VIRI ==<br /> [1] A. Dragoš in Á. T. Kovács, „The Peculiar Functions of the Bacterial Extracellular Matrix“, Trends Microbiol., let. 25, št. 4, str. 257–266, 2017.&lt;br /&gt;[2] N. Steinberg in I. Kolodkin-Gal, „The Matrix Reloaded: How Sensing the Extracellular Matrix Synchronizes Bacterial Communities“, J. Bacteriol., let. 197, št. 13, str. 2092–2103, 2015.&lt;br /&gt;[3] S. J. Labrie, J. E. Samson, in S. Moineau, „Bacteriophage resistance mechanisms“, Nat. Rev. Microbiol., let. 8, št. 5, str. 317–327, 2010.&lt;br /&gt;[4] B. K. Chan in S. T. Abedon, „Bacteriophage and their enzymes in biofilms“, str. 85–99, 2015.&lt;br /&gt;[5] T. K. Lu in J. J. Collins, „Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage“, Proc. Natl. Acad. Sci., let. 104, št. 27, str. 11197–11202, 2007.<br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa&diff=15348 2019-04-06T16:19:07Z

<p>Bm7118: /* SIGNALIZACIJA MED PROIZVODNJO ZUNAJCELIČNEGA MATRIKSA */</p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> Adsorpcija bakteriofagov na gostiteljske receptorje je prvi korak v infekciji gostiteljske celice. Hkrati velja za najbolj zapleten korak, saj morajo virusi prepoznati zelo raznolike vzorce celičnih membran. Bakterije so tekom svojega razvoja razvile številne obrambne mehanizme proti adsorpciji bakteriofagov. Te obrambne mehanizme delimo v tri osnovne skupine:<br /> *blokiranje fagoreceptorjev, <br /> *proizvodnja zunajceličnega matriksa,<br /> *proizvodnja inhibitorjev adhezije.<br /> Komponente zunajceličnega matriksa (v nadaljevanju ECM) ščitijo bakterijske celice pred adsorpcijo bakteriofagov s ustvarjanjem fizične bariere<br /> Bakterijski ECM omogoča življenjski slog bakterij, ki večinoma uspevajo v tesno zapakiranih skupnostih imenovanih biofilm. Čeprav je veliko znanega o različnih funkcijah ECM pri živalskih celicah, je bakterijski ECM še vedno manj raziskan in se običajno o njem govori v kontekstu biofilma.<br /> <br /> == KOMPONENTE ECM V BAKTERIJSKEM BIOFILMU ==<br /> [1]Raziskane komponente ECM so polimeri bogati z eksopolisaharidi, proteini, nukleinske kisline in lipidi. <br /> *Eksopolisaharidi ali zunajcelični polisaharidi imajo pomembno vlogo v virulentnosti bakterij in sporulaciji. Velik delež eksopolisaharidov v svoji strukturi vsebuje celulozo in adhezijski znotrajcelični polisaharid (PIA), ki bakterijam predstavljajo zaščito pred bakteriofagi in tudi imunskim sistemom. Polimerne komponene ECM, ki vsebujejo PIA proizvajajo številne gram negativne bakterije. Med drugim Staphylococcus epidermis, S. aureus. Številne bakterijske vrste so sposobne proizvodnje raznolikih eksopolisaharidov. <br /> <br /> *Proteinske komponente<br /> Bakterijski funkcionalni amiloidi so netopni vlaknasti agregati proteinov, ki vsebujejo paralelne beta ploskve. V bakterijah predstavljajo ključno proteinsko enoto ECM in jih proizvajajo tako gram negativne kot pozitivne bakterije. Pri gram pozitivnih bakterijah je najpogostejši proteinski predstavnik TasA, ki ga proizvajajo Bacillus subtilis. TasA amiloidna vlakna so pritrjena na celično membrano in predstavljajo medcelično povezavo z drugimi zunajceličnimi komponentami.Vseeno amiloidi ne predstavljajo celotnega deleža proteinskih komponent v ECM. Poznamo tudi adhezine, ki so ključni v povezavi celice z medceličnim tkivom gostiteljske celice. <br /> <br /> *Zunajcelična DNA (eDNA)<br /> Je dvoverižna, nizkomulekularna skupina molekul z velikostjo od 0,5 do 21kb, strukturno povezanih s histoni v mono- in oligonukleosome. Velja za pomembno strukturno komponento v mnogih bakterijskih biofilmih. Dodajanje DNaze rastočemu biofilmu inhibira njegov razvoj in povzroča prekinitve v njegovi strukturi. Mlajšega nastanka kot je biofilm, bolj je občutljiv na DNaze. Kemijska vloga dolgih, nabitih molekul DNA je modeliranje lastnosti celične površine in spodbujanje adhezije med celicami samimi in z gostiteljskim tkivom. eDNA izločajo v ECM lizirane celice. <br /> <br /> *Lipidi<br /> ECM vsebuje tudi lipopolisaharide. Vloga katerih je navadno adhezijska. Surfaktin, viskozin, emulzan lahko dispergirajo hidrofobne substance in tako omogočijo, da so biodostopne. <br /> <br /> *Voda<br /> Voda predstavlja največji del ECM. Eksopolisaharidi matriksu, ki je visoko hidriran omogočajo počasnejše sušenje od okolice. Ohranjajo pa tudi strukturo matriksa ob povečani prisotnosti nevezane vode.<br /> <br /> == SIGNALIZACIJA MED PROIZVODNJO ZUNAJCELIČNEGA MATRIKSA ==<br /> *Signalizacija ECM ob adheziji bakterij, in začetni tvorbi biofilma[2]<br /> Biofilm, ki ga tvorijo bakterije je pogosto pritrjen na površino. Bakterije ob pritrjevanju na površino stimulirajo signalne poti, ki so ključne za proizvodnjo ECM. Poznamo več signalnih poti, ki jih sprožijo bakterije. Bakterija ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1 v prisotnosti zunajceličnega polisaharida Psl ustvarja signalno pot, ki aktivira proizvodjo bis-(3´-5´)-cikličnega dimernega GMP (v nadaljevanju c-di-GMP). Ciklični dimer GMP velja za sekundarnega obveščevalca v številnih bakterijskih vrstah. Sproža tvorbo bakterijskega biofilma, iz prosto gibajočih se bakterij s onemogočanjem bakterijskega gibanja. Znotrajcelične koncentracije c-di-GMP so skrbno regulirane s strani nasprotno delujoče digvanilat ciklaze, ki proizvajajo c-di-GMP iz dveh GTP molekul, in fosfodiestraze, ki prekine vez med 5´-fosfogvanilin (3´-5´)-gvanozo. <br /> <br /> *Signalizacija ECM med pospešeno rastjo biofilma[2]<br /> Prisotnost velikih količin induktorja c-di-GMP sproži vezavo na represor FleQ. Kompleks se veže na operon PelA-G, kar vodi v indukcijo transkripcije zapisov za ECM. Medtem ko nizke koncentracije c-di-GMP vodijo v represijo izražanja. Prisotnost Psl vodi v naraščanje koncentracije znotrajceličnega c-di-GMP. Poleg visoke vsebnosti c-di-GMP na indukcijo proizvodnje ECM vpliva tudi parakrino delovanje samega ECM. Dejstvo, da Psl deluje tudi na površini celic omogoča, aktivacijo proizvodnje ECM v sorodnih celicah, ki ga še ne proizvajajo. Poleg lastnosti, ki so ključne pri proizvodnji ECM in s tem zunajceličnega polisaharida, Psl sodeluje tudi pri širjenju biofilma oziroma kolonizaciji novih površin. Pri čeme bakterije ''P. aeruginosa'' PAO1 uporabljajo pilije. Zunajcelična DNA (v nadaljevanju eDNA) promovira celično migracijo preko ustvarjenih kanalčkov v bakterijskem biofilmu. Kar vodi v povečan volumen biofilma, saj je omogočena migracija celic preko teh kanalčkov. Celice se gibajo s pomočjo T4P in interagirajo s eDNA. Sledenje pilijev tipa 4 eDNA predstavlja usmerjeno gibanje celic in s tem povezano povečano proizvodnjo ECM na novo zasedenih območjih. V biofilmu bakterije P. aeruginosa ima eDNA poleg strukturne vloge tudi signalno.<br /> <br /> *Signalizacija ECM med poznimi fazami biofilmskega obstoja[2]<br /> Tekom zorenja biofilma prihaja do pomankanja hranil in akumulacije celičnih metabolitov. Bakterije, ki niso sposobne zapustiti biofilma postanejo ujete v ECM, kar vodi v njihov propad. Vendar pa bakterije same ne vedo kdaj je najbolj primeren čas za pobeg. Zato se pogosto v fazah, ko je čas za to še vedno delijo. Ob pomanjkanju hranilnih snovi in povečanju gostote ECM je za pobeg že prepozno. Celice, ki gradijo biofilm imajo na svoji površini polarne adhezijske komponente polisaharidov, ki so ključni za začetno vezavo na površino in tudi kasnejšo tvorbo biofilma ter s tem ECM. Ti adhezijski zunajcelični polisaharidi pa predstavljajo ločitveni problem za celice v poznih fazah obstoja biofilma. Celična smrt bakterij v biofilmu povzroči povečano prisotnost eDNA v okolju. Zunajcelična DNA, ki se sprošča v zunajcelično okolje, povzroča inhibicijo tvorjenja ECM tako statičnega kot na površini gibajočih se celic. Tvorbo novih filmov prepreči s vezavo na receptorje, ki so ključni za pritrditev celic na površino. ''S. aureus'' surfaktanti, tako imenovani majhni peptidi topni fenolni modulini (PSM), tvorijo amiloidna vlakna, ki imajo strukturno vlogo pri preprečevanju vezave bakterij na površino. V splošnem velja, da bakterije, ki imajo mutirane gene za izražanje PSM-jev tvorijo trdnejše, gostejše in bolj gladke biofilme.<br /> <br /> == PREPREČEVANJE POJAVA BIOFILMOV Z UPORABO BAKTERIOFAGOV ==<br /> Znaten delež bakterij in drugih mikroorganizmov, vključno s številnimi patogeni, obstaja kot komponenta biofilmov. Poznamo nekaj potencialnih bakterijskih virusov, znani kot fagi ali bakteriofagi, ki skupaj z različnimi encimi, ki jih kodirajo, služijo kot relativno netoksično antibiofilmsko sredstvo. Fagi imajo zato pomembno vlogo pri evoluciji bakterij, kot tudi pri globalnem biogeokemičnem kroženju ogljika in drugih elementov [3]. <br /> <br /> Vlogo fagov lahko iz te perspektive razdelimo v tri skupine: <br /> *biomedicinska uporaba fagov, <br /> *ekologija fagov,<br /> *interakcija fagov z bakterijskimi biofilmi [4]. <br /> Bakteriofagi, so virusi, ki okužijo bakterije in so specifični za vrsto ali sev bakterij. So med najštevilčnejšimi in najbolj raznolikimi mikroorganizmi na planetu. Raznolikost je večinoma posledica njihovega dinamičnega prilagajanja na mehanizme rezistence, ki so prisotni v gostiteljskih bakterijah [3].<br /> Pri odstranitvi biofilmov, fagi in njihovi encimi delujejo po treh splošnih mehanizmih:<br /> *EPS depolimeraze, kemično degradirajo EPS, ki je komponenta zunajceličnega matriksa, vendar so ti encimi zelo specifični za vrsto EPS, ki ga napadajo. Encime, ki degradirajo polisaharide lahko klasificiramo v dve skupini:<br /> **Hidrolaze (polisaharaze)<br /> **Liaze <br /> Liaze cepijo vezi med monosaharidi in C4 uronske kisline ter uvajajo dvojno vez med C4 in C5 uronske kisline. Hidrolaze pa cepijo glikozidne vezi.<br /> *Delovanje fagov proti tvorbi bakterijskih biofilmov. Ta pojav se sicer zgodi v kontekstu običajnih fagnih infekcij, kar povzroči lizo (''liza od znotraj'')[5].<br /> *Nekateri fagi pa so sposobni povzročiti ''lizo od zunaj'', s tem ko po množični adsorpciji hitro prekinejo ovojnico bakterijskih celic z virioni. Pri tem mehanizmu ni potrebna genska ekspresija fagov po adsorpciji na bakterijsko gostiteljsko celico [5].<br /> Biofilmi so bistveni za preživetje nekaterih bakterij v številnih naravnih in umetnih okoljih ter predstavljajo vir okužb in kontaminacij v medicini, industriji in prehrambnih obratih, zaradi rezistence na antimikrobna sredstva in obrambni sistem gostiteljev [5].<br /> [3]Zdravljenje z bakteriofagi je bilo predlagano kot ena od metod za nadzor bakterijskih biofilmov. Primer:<br /> *Fagi T4 lahko okužijo biofilme Escherichia coli, se znotraj njih replicirajo in uničijo biofilmsko morfologijo z ubijanjem celic.<br /> *Fagi se tudi modificirajo: E. coli, ki proizvaja polisaharidno kapsulo K1, je običajno rezistentna na infekcije s T7, vendar je dovzetna za okužbo s T7, ki je zasnovan za ekspresijo K1-5 endosialidaze. <br /> *Litični fag s polisaharidno depolimerazo povzroči lizo in EPS degradacijo in s tem zmanjša bakterijske biofilme. Te depolimeraze so na površinah fagov in degradirajo bakterijsko polisaharidno kapsulo.<br /> *Encimska razgradnja celično vezanega EPS polisaharida adhezina, znanega kot polimer β-1,6-N-acetil-Dglukozamina, z eksogeno uporabljeno disperzijo B (DspB), je potrdila redukcijo biofilmov različnih vrst bakterij. DspB je encim, ki ga proizvaja Actinobacillus actinomycetemcomitans in hidrolizira <br /> β-1,6-N-acetilDglukozamin, ki je torej ključen adhezin, potreben za tvorbo biofilma in integritete pri Staphylococcus in E. coli, vključno z E. coli K-12, kot tudi kliničnih izolatov. <br /> <br /> [3]Encimska razgradnja komponente EPS je torej koristna strategija za uničevanje biofilmov, čeprav bakterijske celice niso ubite. Predlagano je bilo modularno preoblikovanje fagov, pri majhnih začetnih inokulacijah, v kateri fag ubija bakterije na način, da izraža najbolj učinkovite EPS degradacijske encime, ki so specifični za ciljni biofilm. Encimsko aktivirani fagi se razmnožujejo znotraj biofilmov in dosegajo visoke lokalne koncentracije encimov in litičnih fagov, katerih tarča so biofilmske komponente. Hitra replikacija fagov povzroči bakterijsko lizo in ekspresijo encimov, ki degradirajo biofilm. Ta strategija je uspešna pri katalitskih metodah za odstranjevanje bakterijskih biofilmov v okolju, industriji in prostorih/pripomočkih zdravstvene oskrbe. Prav tako tak način zmanjša potrebe po izražanju velikih količin encimov na specifična mesta infekcij, ki so težje dostopna in izboljša učinkovitost terapije s fagi pri odstranjevanju biofilmov.<br /> <br /> == VIRI ==<br /> [1] A. Dragoš in Á. T. Kovács, „The Peculiar Functions of the Bacterial Extracellular Matrix“, Trends Microbiol., let. 25, št. 4, str. 257–266, 2017.&lt;br /&gt;[2] N. Steinberg in I. Kolodkin-Gal, „The Matrix Reloaded: How Sensing the Extracellular Matrix Synchronizes Bacterial Communities“, J. Bacteriol., let. 197, št. 13, str. 2092–2103, 2015.&lt;br /&gt;[3] S. J. Labrie, J. E. Samson, in S. Moineau, „Bacteriophage resistance mechanisms“, Nat. Rev. Microbiol., let. 8, št. 5, str. 317–327, 2010.&lt;br /&gt;[4] B. K. Chan in S. T. Abedon, „Bacteriophage and their enzymes in biofilms“, str. 85–99, 2015.&lt;br /&gt;[5] T. K. Lu in J. J. Collins, „Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage“, Proc. Natl. Acad. Sci., let. 104, št. 27, str. 11197–11202, 2007.<br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa&diff=15347 2019-04-06T16:17:43Z

<p>Bm7118: /* SIGNALIZACIJA MED PROIZVODNJO ZUNAJCELIČNEGA MATRIKSA */</p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> Adsorpcija bakteriofagov na gostiteljske receptorje je prvi korak v infekciji gostiteljske celice. Hkrati velja za najbolj zapleten korak, saj morajo virusi prepoznati zelo raznolike vzorce celičnih membran. Bakterije so tekom svojega razvoja razvile številne obrambne mehanizme proti adsorpciji bakteriofagov. Te obrambne mehanizme delimo v tri osnovne skupine:<br /> *blokiranje fagoreceptorjev, <br /> *proizvodnja zunajceličnega matriksa,<br /> *proizvodnja inhibitorjev adhezije.<br /> Komponente zunajceličnega matriksa (v nadaljevanju ECM) ščitijo bakterijske celice pred adsorpcijo bakteriofagov s ustvarjanjem fizične bariere<br /> Bakterijski ECM omogoča življenjski slog bakterij, ki večinoma uspevajo v tesno zapakiranih skupnostih imenovanih biofilm. Čeprav je veliko znanega o različnih funkcijah ECM pri živalskih celicah, je bakterijski ECM še vedno manj raziskan in se običajno o njem govori v kontekstu biofilma.<br /> <br /> == KOMPONENTE ECM V BAKTERIJSKEM BIOFILMU ==<br /> [1]Raziskane komponente ECM so polimeri bogati z eksopolisaharidi, proteini, nukleinske kisline in lipidi. <br /> *Eksopolisaharidi ali zunajcelični polisaharidi imajo pomembno vlogo v virulentnosti bakterij in sporulaciji. Velik delež eksopolisaharidov v svoji strukturi vsebuje celulozo in adhezijski znotrajcelični polisaharid (PIA), ki bakterijam predstavljajo zaščito pred bakteriofagi in tudi imunskim sistemom. Polimerne komponene ECM, ki vsebujejo PIA proizvajajo številne gram negativne bakterije. Med drugim Staphylococcus epidermis, S. aureus. Številne bakterijske vrste so sposobne proizvodnje raznolikih eksopolisaharidov. <br /> <br /> *Proteinske komponente<br /> Bakterijski funkcionalni amiloidi so netopni vlaknasti agregati proteinov, ki vsebujejo paralelne beta ploskve. V bakterijah predstavljajo ključno proteinsko enoto ECM in jih proizvajajo tako gram negativne kot pozitivne bakterije. Pri gram pozitivnih bakterijah je najpogostejši proteinski predstavnik TasA, ki ga proizvajajo Bacillus subtilis. TasA amiloidna vlakna so pritrjena na celično membrano in predstavljajo medcelično povezavo z drugimi zunajceličnimi komponentami.Vseeno amiloidi ne predstavljajo celotnega deleža proteinskih komponent v ECM. Poznamo tudi adhezine, ki so ključni v povezavi celice z medceličnim tkivom gostiteljske celice. <br /> <br /> *Zunajcelična DNA (eDNA)<br /> Je dvoverižna, nizkomulekularna skupina molekul z velikostjo od 0,5 do 21kb, strukturno povezanih s histoni v mono- in oligonukleosome. Velja za pomembno strukturno komponento v mnogih bakterijskih biofilmih. Dodajanje DNaze rastočemu biofilmu inhibira njegov razvoj in povzroča prekinitve v njegovi strukturi. Mlajšega nastanka kot je biofilm, bolj je občutljiv na DNaze. Kemijska vloga dolgih, nabitih molekul DNA je modeliranje lastnosti celične površine in spodbujanje adhezije med celicami samimi in z gostiteljskim tkivom. eDNA izločajo v ECM lizirane celice. <br /> <br /> *Lipidi<br /> ECM vsebuje tudi lipopolisaharide. Vloga katerih je navadno adhezijska. Surfaktin, viskozin, emulzan lahko dispergirajo hidrofobne substance in tako omogočijo, da so biodostopne. <br /> <br /> *Voda<br /> Voda predstavlja največji del ECM. Eksopolisaharidi matriksu, ki je visoko hidriran omogočajo počasnejše sušenje od okolice. Ohranjajo pa tudi strukturo matriksa ob povečani prisotnosti nevezane vode.<br /> <br /> == SIGNALIZACIJA MED PROIZVODNJO ZUNAJCELIČNEGA MATRIKSA ==<br /> *Signalizacija ECM ob adheziji bakterij, in začetni tvorbi biofilma[2]<br /> Biofilm, ki ga tvorijo bakterije je pogosto pritrjen na površino. Bakterije ob pritrjevanju na površino stimulirajo signalne poti, ki so ključne za proizvodnjo ECM. Poznamo več signalnih poti, ki jih sprožijo bakterije. Bakterija ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1 v prisotnosti zunajceličnega polisaharida Psl ustvarja signalno pot, ki aktivira proizvodjo bis-(3´-5´)-cikličnega dimernega GMP (v nadaljevanju c-di-GMP). Ciklični dimer GMP velja za sekundarnega obveščevalca v številnih bakterijskih vrstah. Sproža tvorbo bakterijskega biofilma, iz prosto gibajočih se bakterij s onemogočanjem bakterijskega gibanja. Znotrajcelične koncentracije c-di-GMP so skrbno regulirane s strani nasprotno delujoče digvanilat ciklaze, ki proizvajajo c-di-GMP iz dveh GTP molekul, in fosfodiestraze, ki prekine vez med 5´-fosfogvanilin (3´-5´)-gvanozo. <br /> <br /> *Signalizacija ECM med pospešeno rastjo biofilma[2]<br /> Prisotnost velikih količin induktorja c-di-GMP sproži vezavo na represor FleQ. Kompleks se veže na operon PelA-G, kar vodi v indukcijo transkripcije zapisov za ECM. Medtem ko nizke koncentracije c-di-GMP vodijo v represijo izražanja. Prisotnost Psl vodi v naraščanje koncentracije znotrajceličnega c-di-GMP. Poleg visoke vsebnosti c-di-GMP na indukcijo proizvodnje ECM vpliva tudi parakrino delovanje samega ECM. Dejstvo, da Psl deluje tudi na površini celic omogoča, aktivacijo proizvodnje ECM v sorodnih celicah, ki ga še ne proizvajajo. Poleg lastnosti, ki so ključne pri proizvodnji ECM in s tem zunajceličnega polisaharida, Psl sodeluje tudi pri širjenju biofilma oziroma kolonizaciji novih površin. Pri čeme bakterije ''P. aeruginosa'' PAO1 uporabljajo pilije. Zunajcelična DNA (v nadaljevanju eDNA) promovira celično migracijo preko ustvarjenih kanalčkov v bakterijskem biofilmu. Kar vodi v povečan volumen biofilma, saj je omogočena migracija celic preko teh kanalčkov. Celice se gibajo s pomočjo T4P in interagirajo s eDNA. Sledenje pilijev tipa 4 eDNA predstavlja usmerjeno gibanje celic in s tem povezano povečano proizvodnjo ECM na novo zasedenih območjih. V biofilmu bakterije P. aeruginosa ima eDNA poleg strukturne vloge tudi signalno.<br /> <br /> *Signalizacija ECM med poznimi fazami biofilmskega obstoja[2]<br /> Tekom zorenja biofilma prihaja do pomankanja hranil in akumulacije celičnih metabolitov. Bakterije, ki niso sposobne zapustiti biofilma postanejo ujete v ECM, kar vodi v njihov propad. Vendar pa bakterije same ne vedo kdaj je najbolj primeren čas za pobeg. Zato se pogosto v fazah, ko je čas za to še vedno delijo. Ob pomanjkanju hranilnih snovi in povečanju gostote ECM je za pobeg že prepozno. Celice, ki gradijo biofilm imajo na svoji površini polarne adhezijske komponente polisaharidov, ki so ključni za začetno vezavo na površino in tudi kasnejšo tvorbo biofilma ter s tem ECM. Ti adhezijski zunajcelični polisaharidi pa predstavljajo ločitveni problem za celice v poznih fazah obstoja biofilma. Celična smrt bakterij v biofilmu povzroči povečano prisotnost eDNA v okolju. Zunajcelična DNA, ki se sprošča v zunajcelično okolje, povzroča inhibicijo tvorjenja ECM tako statičnega kot na površini gibajočih se celic. Tvorbo novih filmov prepreči s vezavo na receptorje, ki so ključni za pritrditev celic na površino. S. aureus surfaktanti, tako imenovani majhni peptidi topni fenolni modulini (PSM), tvorijo amiloidna vlakna, ki imajo strukturno vlogo pri preprečevanju vezave bakterij na površino. V splošnem velja, da bakterije, ki imajo mutirane gene za izražanje PSM-jev tvorijo trdnejše, gostejše in bolj gladke biofilme.<br /> <br /> == PREPREČEVANJE POJAVA BIOFILMOV Z UPORABO BAKTERIOFAGOV ==<br /> Znaten delež bakterij in drugih mikroorganizmov, vključno s številnimi patogeni, obstaja kot komponenta biofilmov. Poznamo nekaj potencialnih bakterijskih virusov, znani kot fagi ali bakteriofagi, ki skupaj z različnimi encimi, ki jih kodirajo, služijo kot relativno netoksično antibiofilmsko sredstvo. Fagi imajo zato pomembno vlogo pri evoluciji bakterij, kot tudi pri globalnem biogeokemičnem kroženju ogljika in drugih elementov [3]. <br /> <br /> Vlogo fagov lahko iz te perspektive razdelimo v tri skupine: <br /> *biomedicinska uporaba fagov, <br /> *ekologija fagov,<br /> *interakcija fagov z bakterijskimi biofilmi [4]. <br /> Bakteriofagi, so virusi, ki okužijo bakterije in so specifični za vrsto ali sev bakterij. So med najštevilčnejšimi in najbolj raznolikimi mikroorganizmi na planetu. Raznolikost je večinoma posledica njihovega dinamičnega prilagajanja na mehanizme rezistence, ki so prisotni v gostiteljskih bakterijah [3].<br /> Pri odstranitvi biofilmov, fagi in njihovi encimi delujejo po treh splošnih mehanizmih:<br /> *EPS depolimeraze, kemično degradirajo EPS, ki je komponenta zunajceličnega matriksa, vendar so ti encimi zelo specifični za vrsto EPS, ki ga napadajo. Encime, ki degradirajo polisaharide lahko klasificiramo v dve skupini:<br /> **Hidrolaze (polisaharaze)<br /> **Liaze <br /> Liaze cepijo vezi med monosaharidi in C4 uronske kisline ter uvajajo dvojno vez med C4 in C5 uronske kisline. Hidrolaze pa cepijo glikozidne vezi.<br /> *Delovanje fagov proti tvorbi bakterijskih biofilmov. Ta pojav se sicer zgodi v kontekstu običajnih fagnih infekcij, kar povzroči lizo (''liza od znotraj'')[5].<br /> *Nekateri fagi pa so sposobni povzročiti ''lizo od zunaj'', s tem ko po množični adsorpciji hitro prekinejo ovojnico bakterijskih celic z virioni. Pri tem mehanizmu ni potrebna genska ekspresija fagov po adsorpciji na bakterijsko gostiteljsko celico [5].<br /> Biofilmi so bistveni za preživetje nekaterih bakterij v številnih naravnih in umetnih okoljih ter predstavljajo vir okužb in kontaminacij v medicini, industriji in prehrambnih obratih, zaradi rezistence na antimikrobna sredstva in obrambni sistem gostiteljev [5].<br /> [3]Zdravljenje z bakteriofagi je bilo predlagano kot ena od metod za nadzor bakterijskih biofilmov. Primer:<br /> *Fagi T4 lahko okužijo biofilme Escherichia coli, se znotraj njih replicirajo in uničijo biofilmsko morfologijo z ubijanjem celic.<br /> *Fagi se tudi modificirajo: E. coli, ki proizvaja polisaharidno kapsulo K1, je običajno rezistentna na infekcije s T7, vendar je dovzetna za okužbo s T7, ki je zasnovan za ekspresijo K1-5 endosialidaze. <br /> *Litični fag s polisaharidno depolimerazo povzroči lizo in EPS degradacijo in s tem zmanjša bakterijske biofilme. Te depolimeraze so na površinah fagov in degradirajo bakterijsko polisaharidno kapsulo.<br /> *Encimska razgradnja celično vezanega EPS polisaharida adhezina, znanega kot polimer β-1,6-N-acetil-Dglukozamina, z eksogeno uporabljeno disperzijo B (DspB), je potrdila redukcijo biofilmov različnih vrst bakterij. DspB je encim, ki ga proizvaja Actinobacillus actinomycetemcomitans in hidrolizira <br /> β-1,6-N-acetilDglukozamin, ki je torej ključen adhezin, potreben za tvorbo biofilma in integritete pri Staphylococcus in E. coli, vključno z E. coli K-12, kot tudi kliničnih izolatov. <br /> <br /> [3]Encimska razgradnja komponente EPS je torej koristna strategija za uničevanje biofilmov, čeprav bakterijske celice niso ubite. Predlagano je bilo modularno preoblikovanje fagov, pri majhnih začetnih inokulacijah, v kateri fag ubija bakterije na način, da izraža najbolj učinkovite EPS degradacijske encime, ki so specifični za ciljni biofilm. Encimsko aktivirani fagi se razmnožujejo znotraj biofilmov in dosegajo visoke lokalne koncentracije encimov in litičnih fagov, katerih tarča so biofilmske komponente. Hitra replikacija fagov povzroči bakterijsko lizo in ekspresijo encimov, ki degradirajo biofilm. Ta strategija je uspešna pri katalitskih metodah za odstranjevanje bakterijskih biofilmov v okolju, industriji in prostorih/pripomočkih zdravstvene oskrbe. Prav tako tak način zmanjša potrebe po izražanju velikih količin encimov na specifična mesta infekcij, ki so težje dostopna in izboljša učinkovitost terapije s fagi pri odstranjevanju biofilmov.<br /> <br /> == VIRI ==<br /> [1] A. Dragoš in Á. T. Kovács, „The Peculiar Functions of the Bacterial Extracellular Matrix“, Trends Microbiol., let. 25, št. 4, str. 257–266, 2017.&lt;br /&gt;[2] N. Steinberg in I. Kolodkin-Gal, „The Matrix Reloaded: How Sensing the Extracellular Matrix Synchronizes Bacterial Communities“, J. Bacteriol., let. 197, št. 13, str. 2092–2103, 2015.&lt;br /&gt;[3] S. J. Labrie, J. E. Samson, in S. Moineau, „Bacteriophage resistance mechanisms“, Nat. Rev. Microbiol., let. 8, št. 5, str. 317–327, 2010.&lt;br /&gt;[4] B. K. Chan in S. T. Abedon, „Bacteriophage and their enzymes in biofilms“, str. 85–99, 2015.&lt;br /&gt;[5] T. K. Lu in J. J. Collins, „Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage“, Proc. Natl. Acad. Sci., let. 104, št. 27, str. 11197–11202, 2007.<br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa&diff=15345 2019-04-06T16:15:44Z

<p>Bm7118: /* SIGNALIZACIJA MED PROIZVODNJO ZUNAJCELIČNEGA MATRIKSA */</p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> Adsorpcija bakteriofagov na gostiteljske receptorje je prvi korak v infekciji gostiteljske celice. Hkrati velja za najbolj zapleten korak, saj morajo virusi prepoznati zelo raznolike vzorce celičnih membran. Bakterije so tekom svojega razvoja razvile številne obrambne mehanizme proti adsorpciji bakteriofagov. Te obrambne mehanizme delimo v tri osnovne skupine:<br /> *blokiranje fagoreceptorjev, <br /> *proizvodnja zunajceličnega matriksa,<br /> *proizvodnja inhibitorjev adhezije.<br /> Komponente zunajceličnega matriksa (v nadaljevanju ECM) ščitijo bakterijske celice pred adsorpcijo bakteriofagov s ustvarjanjem fizične bariere<br /> Bakterijski ECM omogoča življenjski slog bakterij, ki večinoma uspevajo v tesno zapakiranih skupnostih imenovanih biofilm. Čeprav je veliko znanega o različnih funkcijah ECM pri živalskih celicah, je bakterijski ECM še vedno manj raziskan in se običajno o njem govori v kontekstu biofilma.<br /> <br /> == KOMPONENTE ECM V BAKTERIJSKEM BIOFILMU ==<br /> [1]Raziskane komponente ECM so polimeri bogati s eksopolisaharidi, proteini, nukleinske kisline in lipidi. <br /> *Eksopolisaharidi ali zunajcelični polisaharidi imajo pomembno vlogo v virulentnosti bakterij in sporulaciji. Velik delež eksopolisaharidov v svoji strukturi vsebuje celulozo in adhezijski znotrajcelični polisaharid (PIA), ki bakterijam predstavljajo zaščito pred bakteriofagi in tudi imunskim sistemom. Polimerne komponene ECM, ki vsebujejo PIA proizvajajo številne gram negativne bakterije. Med drugim Staphylococcus epidermis, S. aureus. Številne bakterijske vrste so sposobne proizvodnje raznolikih eksopolisaharidov. <br /> <br /> *Proteinske komponente<br /> Bakterijski funkcionalni amiloidi so netopni vlaknasti agregati proteinov, ki vsebujejo paralelne beta ploskve. V bakterijah predstavljajo ključno proteinsko enoto ECM in jih proizvajajo tako gram negativne kot pozitivne bakterije. Pri gram pozitivnih bakterijah je najpogostejši proteinski predstavnik TasA, ki ga proizvajajo Bacillus subtilis. TasA amiloidna vlakna so pritrjena na celično membrano in predstavljajo medcelično povezavo, v povezavi z drugimi zunajceličnimi komponentami.Vseeno amiloidi ne predstavljajo celotnega deleža proteinskih komponent v ECM. Poznamo tudi adhezine, ki so ključni v povezavi celice s medceličnim tkivom gostiteljske celice. <br /> <br /> *Zunajcelična DNA (eDNA)<br /> Je dvoverižna, nizkomulekularna skupina molekul z velikostjo od 0,5 do 21kb, strukturno povezanih s histoni v mono- in oligonukleosome. Velja za pomembno strukturno komponento v mnogih bakterijskih biofilmih. Dodajanje DNaze rastočemu biofilmu inhibira njegov razvoj in povzroča prekinitve v njegovi strukturi. Mlajšega nastanka kot je biofilm, bolj je občutljiv na DNaze. Kemijska vloga dolgih, nabitih molekul DNA molekul je modeliranje lastnosti celične površine in spodbujanje adhezije med celicami sami in s gostiteljskim tkivom. eDNA izločajo v ECM lizirane celice. <br /> <br /> *Lipidi<br /> ECM vsebuje tudi lipopolisaharide. Vloga katerih je navadno adhezijska. Surfaktin, viskozin, emulzan lahko dispergirajo hidrofobne substance in tako omogočijo, da so biodostopne. <br /> <br /> *Voda<br /> Voda predstavlja največji del ECM. Eksopolisaharidi matriksu, ki je visoko hidriran omogočajo počasnejše sušenje od okolice. Ohranjajo pa tudi strukturo matriksa ob povečani prisotnosti nevezane vode.<br /> <br /> == SIGNALIZACIJA MED PROIZVODNJO ZUNAJCELIČNEGA MATRIKSA ==<br /> *Signalizacija ECM ob adheziji bakterij, in začetni tvorbi biofilma[2]<br /> Biofilm, ki ga tvorijo bakterije je pogosto pritrjen na površino. Bakterije ob pritrjevanju na površino stimulirajo signalne poti, ki so ključne za proizvodnjo ECM. Poznamo več signalnih poti, ki jih sprožijo bakterije. Bakterija Pseudomonas aeruginosa PAO1 v prisotnosti zunajceličnega polisaharida Psl ustvarja signalno pot, ki aktivira proizvodjo bis-(3´-5´)-cikličnega dimernega GMP (v nadaljevanju c-di-GMP). Ciklični dimer GMP velja za sekundarnega obveščevalca v številnih bakterijskih vrstah. Sproža tvorbo bakterijskega biofilma, iz prosto gibajočih se bakterij s onemogočanjem bakterijskega gibanja. Znotrajcelične koncentracije c-di-GMP so skrbno regulirane s strani nasprotno delujoče digvanilat ciklaze, ki proizvajajo c-di-GMP iz dveh GTP molekul, in fosfodiestraze, ki prekine vez med 5´-fosfogvanilin (3´-5´)-gvanozo. <br /> <br /> *Signalizacija ECM med pospešeno rastjo biofilma[2]<br /> Prisotnost velikih količin induktorja c-di-GMP sproži vezavo na represor FleQ. Kompleks se veže na operon PelA-G, kar vodi v indukcijo transkripcije zapisov za ECM. Medtem ko nizke koncentracije c-di-GMP vodijo v represijo izražanja. Prisotnost Psl vodi v naraščanje koncentracije znotrajceličnega c-di-GMP. Poleg visoke vsebnosti c-di-GMP na indukcijo proizvodnje ECM vpliva tudi parakrino delovanje samega ECM. Dejstvo, da Psl deluje tudi na površini celic omogoča, aktivacijo proizvodnje ECM v sorodnih celicah, ki ga še ne proizvajajo. Poleg lastnosti, ki so ključne pri proizvodnji ECM in s tem zunajceličnega polisaharida, Psl sodeluje tudi pri širjenju biofilma oziroma kolonizaciji novih površin. Pri čemer bakterije P aeruginosa PAO1 uporabljajo pilije. Zunajcelična DNA (v nadaljevanju eDNA) promovira celično migracijo preko ustvarjenih kanalčkov v bakterijskem biofilmu. Kar vodi v povečan volumen biofilma, saj je omogočena migracija celic preko teh kanalčkov. Celice se gibajo s pomočjo T4P in interagirajo s eDNA. Sledenje pilijev tipa 4 eDNA predstavlja usmerjeno gibanje celic in s tem povezano povečano proizvodnjo ECM na novo zasedenih območjih. V biofilmu bakterije P. aeruginosa ima eDNA poleg strukturne vloge tudi signalno.<br /> <br /> *Signalizacija ECM med poznimi fazami biofilmskega obstoja[2]<br /> Tekom zorenja biofilma prihaja do pomankanja hranil in akumulacije celičnih metabolitov. Bakterije, ki niso sposobne zapustiti biofilma postanejo ujete v ECM, kar vodi v njihov propad. Vendar pa bakterije same ne vedo kdaj je najbolj primeren čas za pobeg. Zato se pogosto v fazah, ko je čas za to še vedno delijo. Ob pomanjkanju hranilnih snovi in povečanju gostote ECM je za pobeg že prepozno. Celice, ki gradijo biofilm imajo na svoji površini polarne adhezijske komponente polisaharidov, ki so ključni za začetno vezavo na površino in tudi kasnejšo tvorbo biofilma ter s tem ECM. Ti adhezijski zunajcelični polisaharidi pa predstavljajo ločitveni problem za celice v poznih fazah obstoja biofilma. Celična smrt bakterij v biofilmu povzroči povečano prisotnost eDNA v okolju. Zunajcelična DNA, ki se sprošča v zunajcelično okolje, povzroča inhibicijo tvorjenja ECM tako statičnega kot na površini gibajočih se celic. Tvorbo novih filmov prepreči s vezavo na receptorje, ki so ključni za pritrditev celic na površino. S. aureus surfaktanti, tako imenovani majhni peptidi topni fenolni modulini (PSM), tvorijo amiloidna vlakna, ki imajo strukturno vlogo pri preprečevanju vezave bakterij na površino. V splošnem velja, da bakterije, ki imajo mutirane gene za izražanje PSM-jev tvorijo trdnejše, gostejše in bolj gladke biofilme.<br /> <br /> == PREPREČEVANJE POJAVA BIOFILMOV Z UPORABO BAKTERIOFAGOV ==<br /> Znaten delež bakterij in drugih mikroorganizmov, vključno s številnimi patogeni, obstaja kot komponenta biofilmov. Poznamo nekaj potencialnih bakterijskih virusov, znani kot fagi ali bakteriofagi, ki skupaj z različnimi encimi, ki jih kodirajo, služijo kot relativno netoksično antibiofilmsko sredstvo. Fagi imajo zato pomembno vlogo pri evoluciji bakterij, kot tudi pri globalnem biogeokemičnem kroženju ogljika in drugih elementov [3]. <br /> <br /> Vlogo fagov lahko iz te perspektive razdelimo v tri skupine: <br /> *biomedicinska uporaba fagov, <br /> *ekologija fagov,<br /> *interakcija fagov z bakterijskimi biofilmi [4]. <br /> Bakteriofagi, so virusi, ki okužijo bakterije in so specifični za vrsto ali sev bakterij. So med najštevilčnejšimi in najbolj raznolikimi mikroorganizmi na planetu. Raznolikost je večinoma posledica njihovega dinamičnega prilagajanja na mehanizme rezistence, ki so prisotni v gostiteljskih bakterijah [3].<br /> Pri odstranitvi biofilmov, fagi in njihovi encimi delujejo po treh splošnih mehanizmih:<br /> *EPS depolimeraze, kemično degradirajo EPS, ki je komponenta zunajceličnega matriksa, vendar so ti encimi zelo specifični za vrsto EPS, ki ga napadajo. Encime, ki degradirajo polisaharide lahko klasificiramo v dve skupini:<br /> **Hidrolaze (polisaharaze)<br /> **Liaze <br /> Liaze cepijo vezi med monosaharidi in C4 uronske kisline ter uvajajo dvojno vez med C4 in C5 uronske kisline. Hidrolaze pa cepijo glikozidne vezi.<br /> *Delovanje fagov proti tvorbi bakterijskih biofilmov. Ta pojav se sicer zgodi v kontekstu običajnih fagnih infekcij, kar povzroči lizo (''liza od znotraj'')[5].<br /> *Nekateri fagi pa so sposobni povzročiti ''lizo od zunaj'', s tem ko po množični adsorpciji hitro prekinejo ovojnico bakterijskih celic z virioni. Pri tem mehanizmu ni potrebna genska ekspresija fagov po adsorpciji na bakterijsko gostiteljsko celico [5].<br /> Biofilmi so bistveni za preživetje nekaterih bakterij v številnih naravnih in umetnih okoljih ter predstavljajo vir okužb in kontaminacij v medicini, industriji in prehrambnih obratih, zaradi rezistence na antimikrobna sredstva in obrambni sistem gostiteljev [5].<br /> [3]Zdravljenje z bakteriofagi je bilo predlagano kot ena od metod za nadzor bakterijskih biofilmov. Primer:<br /> *Fagi T4 lahko okužijo biofilme Escherichia coli, se znotraj njih replicirajo in uničijo biofilmsko morfologijo z ubijanjem celic.<br /> *Fagi se tudi modificirajo: E. coli, ki proizvaja polisaharidno kapsulo K1, je običajno rezistentna na infekcije s T7, vendar je dovzetna za okužbo s T7, ki je zasnovan za ekspresijo K1-5 endosialidaze. <br /> *Litični fag s polisaharidno depolimerazo povzroči lizo in EPS degradacijo in s tem zmanjša bakterijske biofilme. Te depolimeraze so na površinah fagov in degradirajo bakterijsko polisaharidno kapsulo.<br /> *Encimska razgradnja celično vezanega EPS polisaharida adhezina, znanega kot polimer β-1,6-N-acetil-Dglukozamina, z eksogeno uporabljeno disperzijo B (DspB), je potrdila redukcijo biofilmov različnih vrst bakterij. DspB je encim, ki ga proizvaja Actinobacillus actinomycetemcomitans in hidrolizira <br /> β-1,6-N-acetilDglukozamin, ki je torej ključen adhezin, potreben za tvorbo biofilma in integritete pri Staphylococcus in E. coli, vključno z E. coli K-12, kot tudi kliničnih izolatov. <br /> <br /> [3]Encimska razgradnja komponente EPS je torej koristna strategija za uničevanje biofilmov, čeprav bakterijske celice niso ubite. Predlagano je bilo modularno preoblikovanje fagov, pri majhnih začetnih inokulacijah, v kateri fag ubija bakterije na način, da izraža najbolj učinkovite EPS degradacijske encime, ki so specifični za ciljni biofilm. Encimsko aktivirani fagi se razmnožujejo znotraj biofilmov in dosegajo visoke lokalne koncentracije encimov in litičnih fagov, katerih tarča so biofilmske komponente. Hitra replikacija fagov povzroči bakterijsko lizo in ekspresijo encimov, ki degradirajo biofilm. Ta strategija je uspešna pri katalitskih metodah za odstranjevanje bakterijskih biofilmov v okolju, industriji in prostorih/pripomočkih zdravstvene oskrbe. Prav tako tak način zmanjša potrebe po izražanju velikih količin encimov na specifična mesta infekcij, ki so težje dostopna in izboljša učinkovitost terapije s fagi pri odstranjevanju biofilmov.<br /> <br /> == VIRI ==<br /> [1] A. Dragoš in Á. T. Kovács, „The Peculiar Functions of the Bacterial Extracellular Matrix“, Trends Microbiol., let. 25, št. 4, str. 257–266, 2017.&lt;br /&gt;[2] N. Steinberg in I. Kolodkin-Gal, „The Matrix Reloaded: How Sensing the Extracellular Matrix Synchronizes Bacterial Communities“, J. Bacteriol., let. 197, št. 13, str. 2092–2103, 2015.&lt;br /&gt;[3] S. J. Labrie, J. E. Samson, in S. Moineau, „Bacteriophage resistance mechanisms“, Nat. Rev. Microbiol., let. 8, št. 5, str. 317–327, 2010.&lt;br /&gt;[4] B. K. Chan in S. T. Abedon, „Bacteriophage and their enzymes in biofilms“, str. 85–99, 2015.&lt;br /&gt;[5] T. K. Lu in J. J. Collins, „Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage“, Proc. Natl. Acad. Sci., let. 104, št. 27, str. 11197–11202, 2007.<br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Bm7118 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa&diff=15344 2019-04-06T16:10:24Z

<p>Bm7118: /* UVOD */</p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> Adsorpcija bakteriofagov na gostiteljske receptorje je prvi korak v infekciji gostiteljske celice. Hkrati velja za najbolj zapleten korak, saj morajo virusi prepoznati zelo raznolike vzorce celičnih membran. Bakterije so tekom svojega razvoja razvile številne obrambne mehanizme proti adsorpciji bakteriofagov. Te obrambne mehanizme delimo v tri osnovne skupine:<br /> *blokiranje fagoreceptorjev, <br /> *proizvodnja zunajceličnega matriksa,<br /> *proizvodnja inhibitorjev adhezije.<br /> Komponente zunajceličnega matriksa (v nadaljevanju ECM) ščitijo bakterijske celice pred adsorpcijo bakteriofagov s ustvarjanjem fizične bariere<br /> Bakterijski ECM omogoča življenjski slog bakterij, ki večinoma uspevajo v tesno zapakiranih skupnostih imenovanih biofilm. Čeprav je veliko znanega o različnih funkcijah ECM pri živalskih celicah, je bakterijski ECM še vedno manj raziskan in se običajno o njem govori v kontekstu biofilma.<br /> <br /> == KOMPONENTE ECM V BAKTERIJSKEM BIOFILMU ==<br /> [1]Raziskane komponente ECM so polimeri bogati s eksopolisaharidi, proteini, nukleinske kisline in lipidi. <br /> *Eksopolisaharidi ali zunajcelični polisaharidi imajo pomembno vlogo v virulentnosti bakterij in sporulaciji. Velik delež eksopolisaharidov v svoji strukturi vsebuje celulozo in adhezijski znotrajcelični polisaharid (PIA), ki bakterijam predstavljajo zaščito pred bakteriofagi in tudi imunskim sistemom. Polimerne komponene ECM, ki vsebujejo PIA proizvajajo številne gram negativne bakterije. Med drugim Staphylococcus epidermis, S. aureus. Številne bakterijske vrste so sposobne proizvodnje raznolikih eksopolisaharidov. <br /> <br /> *Proteinske komponente<br /> Bakterijski funkcionalni amiloidi so netopni vlaknasti agregati proteinov, ki vsebujejo paralelne beta ploskve. V bakterijah predstavljajo ključno proteinsko enoto ECM in jih proizvajajo tako gram negativne kot pozitivne bakterije. Pri gram pozitivnih bakterijah je najpogostejši proteinski predstavnik TasA, ki ga proizvajajo Bacillus subtilis. TasA amiloidna vlakna so pritrjena na celično membrano in predstavljajo medcelično povezavo, v povezavi z drugimi zunajceličnimi komponentami.Vseeno amiloidi ne predstavljajo celotnega deleža proteinskih komponent v ECM. Poznamo tudi adhezine, ki so ključni v povezavi celice s medceličnim tkivom gostiteljske celice. <br /> <br /> *Zunajcelična DNA (eDNA)<br /> Je dvoverižna, nizkomulekularna skupina molekul z velikostjo od 0,5 do 21kb, strukturno povezanih s histoni v mono- in oligonukleosome. Velja za pomembno strukturno komponento v mnogih bakterijskih biofilmih. Dodajanje DNaze rastočemu biofilmu inhibira njegov razvoj in povzroča prekinitve v njegovi strukturi. Mlajšega nastanka kot je biofilm, bolj je občutljiv na DNaze. Kemijska vloga dolgih, nabitih molekul DNA molekul je modeliranje lastnosti celične površine in spodbujanje adhezije med celicami sami in s gostiteljskim tkivom. eDNA izločajo v ECM lizirane celice. <br /> <br /> *Lipidi<br /> ECM vsebuje tudi lipopolisaharide. Vloga katerih je navadno adhezijska. Surfaktin, viskozin, emulzan lahko dispergirajo hidrofobne substance in tako omogočijo, da so biodostopne. <br /> <br /> *Voda<br /> Voda predstavlja največji del ECM. Eksopolisaharidi matriksu, ki je visoko hidriran omogočajo počasnejše sušenje od okolice. Ohranjajo pa tudi strukturo matriksa ob povečani prisotnosti nevezane vode.<br /> <br /> == SIGNALIZACIJA MED PROIZVODNJO ZUNAJCELIČNEGA MATRIKSA ==<br /> *Signalizacija ECM ob adheziji bakterij, in začetni tvorbi biofilma[2]<br /> Biofilm, ki ga tvorijo bakterije je pogosto pritrjen na površino. Bakterije ob pritrjevanju na površino stimulirajo signalne poti, ki so ključne za proizvodnjo ECM. Poznamo več signalnih poti, ki jih sprožijo bakterije. Bakterija Pseudomonas aeruginosa PAO1 v prisotnosti zunajceličnega polisaharida Psl ustvarja signalno pot, ki aktivira proizvodjo bis-(3´-5´)-cikličnega dimernega GMP (v nadaljevanju c-di-GMP). Ciklični dimer GMP velja za sekundarnega obveščevalca v številnih bakterijskih vrstah. Sproža tvorbo bakterijskega biofilma, iz prosto gibajočih se bakterij s onemogočanjem bakterijskega gibanja. Znotrajcelične koncentracije c-di-GMP so skrbno regulirane s strani nasprotno delujoče digvanilat ciklaze, ki proizvajajo c-di-GMP iz dveh GTP molekul, in fosfodiestraze, ki prekine vez med 5´-fosfogvanilin (3´-5´)-gvanozo. <br /> <br /> *Signalizacija ECM med pospešeno rastjo biofilma[2]<br /> Prisotnost velikih količin induktorja c-di-GMP sproži vezavo na represor FleQ. Kompleks se veže na operon PelA-G, kar vodi v indukcijo transkripcije zapisov za ECM. Medtem ko nizke koncentracije vodijo v represijo. Prisotnost Psl vodi v naraščanje koncentracije znotrajceličnega c-di-GMP. Poleg visoke vsebnosti c-di-GMP na indukcijo proizvodnje ECM vpliva tudi parakrino delovanje samega ECM. Dejstvo, da Psl deluje tudi na površini celic omogoča, aktivacijo proizvodnje ECM v sorodnih celicah, ki ga še ne proizvajajo. Poleg lastnosti, ki so ključne pri proizvodnji ECM in s tem zunajceličnega polisaharida, Psl sodeluje tudi pri širjenju biofilma oziroma kolonizaciji novih površin. Pri čemer bakterije P aeruginosa PAO1 uporabljajo pilije. Zunajcelična DNA (v nadaljevanju eDNA) promovira celično migracijo preko ustvarjenih kanalčkov v bakterijskem biofilmu. Kar vodi v povečan volumen biofilma, saj je omogočena migracija celic preko teh kanalčkov. Celice se gibajo s pomočjo T4P in interagirajo s eDNA. Sledenje pilijev tipa 4 eDNA predstavlja usmerjeno gibanje celic in s tem povezano povečano proizvodnjo ECM na novo zasedenih območjih. V biofilmu bakterije P. aeruginosa ima eDNA poleg strukturne vloge tudi signalno.<br /> <br /> *Signalizacija ECM med poznimi fazami biofilmskega obstoja[2]<br /> Tekom zorenja biofilma prihaja do pomankanja hranil in akumulacije celičnih metabolitov. Bakterije, ki niso sposobne zapustiti biofilma postanejo ujete v ECM, kar vodi v njihov propad. Vendar pa bakterije same ne vedo kdaj je najbolj primeren čas za pobeg. Zato se pogosto v fazah, ko je čas za to še vedno delijo. Ob pomanjkanju hranilnih snovi in povečanju gostote ECM je za pobeg že prepozno. Celice, ki gradijo biofilm imajo na svoji površini polarne adhezijske komponente polisaharidov, ki so ključni za začetno vezavo na površino in tudi kasnejšo tvorbo biofilma ter s tem ECM. Ti adhezijski zunajcelični polisaharidi pa predstavljajo ločitveni problem za celice v poznih fazah obstoja biofilma. Celična smrt bakterij v biofilmu povzroči povečano prisotnost eDNA v okolju. Zunajcelična DNA, ki se sprošča v zunajcelično okolje, povzroča inhibicijo tvorjenja ECM tako statičnega kot na površini gibajočih se celic. Tvorbo novih filmov prepreči s vezavo na receptorje, ki so ključni za pritrditev celic na površino. S. aureus surfaktanti, tako imenovani majhni peptidi topni fenolni modulini (PSM), tvorijo amiloidna vlakna, ki imajo strukturno vlogo pri preprečevanju vezave bakterij na površino. V splošnem velja, da bakterije, ki imajo mutirane gene za izražanje PSM-jev tvorijo trdnejše, gostejše in bolj gladke biofilme.<br /> <br /> == PREPREČEVANJE POJAVA BIOFILMOV Z UPORABO BAKTERIOFAGOV ==<br /> Znaten delež bakterij in drugih mikroorganizmov, vključno s številnimi patogeni, obstaja kot komponenta biofilmov. Poznamo nekaj potencialnih bakterijskih virusov, znani kot fagi ali bakteriofagi, ki skupaj z različnimi encimi, ki jih kodirajo, služijo kot relativno netoksično antibiofilmsko sredstvo. Fagi imajo zato pomembno vlogo pri evoluciji bakterij, kot tudi pri globalnem biogeokemičnem kroženju ogljika in drugih elementov [3]. <br /> <br /> Vlogo fagov lahko iz te perspektive razdelimo v tri skupine: <br /> *biomedicinska uporaba fagov, <br /> *ekologija fagov,<br /> *interakcija fagov z bakterijskimi biofilmi [4]. <br /> Bakteriofagi, so virusi, ki okužijo bakterije in so specifični za vrsto ali sev bakterij. So med najštevilčnejšimi in najbolj raznolikimi mikroorganizmi na planetu. Raznolikost je večinoma posledica njihovega dinamičnega prilagajanja na mehanizme rezistence, ki so prisotni v gostiteljskih bakterijah [3].<br /> Pri odstranitvi biofilmov, fagi in njihovi encimi delujejo po treh splošnih mehanizmih:<br /> *EPS depolimeraze, kemično degradirajo EPS, ki je komponenta zunajceličnega matriksa, vendar so ti encimi zelo specifični za vrsto EPS, ki ga napadajo. Encime, ki degradirajo polisaharide lahko klasificiramo v dve skupini:<br /> **Hidrolaze (polisaharaze)<br /> **Liaze <br /> Liaze cepijo vezi med monosaharidi in C4 uronske kisline ter uvajajo dvojno vez med C4 in C5 uronske kisline. Hidrolaze pa cepijo glikozidne vezi.<br /> *Delovanje fagov proti tvorbi bakterijskih biofilmov. Ta pojav se sicer zgodi v kontekstu običajnih fagnih infekcij, kar povzroči lizo (''liza od znotraj'')[5].<br /> *Nekateri fagi pa so sposobni povzročiti ''lizo od zunaj'', s tem ko po množični adsorpciji hitro prekinejo ovojnico bakterijskih celic z virioni. Pri tem mehanizmu ni potrebna genska ekspresija fagov po adsorpciji na bakterijsko gostiteljsko celico [5].<br /> Biofilmi so bistveni za preživetje nekaterih bakterij v številnih naravnih in umetnih okoljih ter predstavljajo vir okužb in kontaminacij v medicini, industriji in prehrambnih obratih, zaradi rezistence na antimikrobna sredstva in obrambni sistem gostiteljev [5].<br /> [3]Zdravljenje z bakteriofagi je bilo predlagano kot ena od metod za nadzor bakterijskih biofilmov. Primer:<br /> *Fagi T4 lahko okužijo biofilme Escherichia coli, se znotraj njih replicirajo in uničijo biofilmsko morfologijo z ubijanjem celic.<br /> *Fagi se tudi modificirajo: E. coli, ki proizvaja polisaharidno kapsulo K1, je običajno rezistentna na infekcije s T7, vendar je dovzetna za okužbo s T7, ki je zasnovan za ekspresijo K1-5 endosialidaze. <br /> *Litični fag s polisaharidno depolimerazo povzroči lizo in EPS degradacijo in s tem zmanjša bakterijske biofilme. Te depolimeraze so na površinah fagov in degradirajo bakterijsko polisaharidno kapsulo.<br /> *Encimska razgradnja celično vezanega EPS polisaharida adhezina, znanega kot polimer β-1,6-N-acetil-Dglukozamina, z eksogeno uporabljeno disperzijo B (DspB), je potrdila redukcijo biofilmov različnih vrst bakterij. DspB je encim, ki ga proizvaja Actinobacillus actinomycetemcomitans in hidrolizira <br /> β-1,6-N-acetilDglukozamin, ki je torej ključen adhezin, potreben za tvorbo biofilma in integritete pri Staphylococcus in E. coli, vključno z E. coli K-12, kot tudi kliničnih izolatov. <br /> <br /> [3]Encimska razgradnja komponente EPS je torej koristna strategija za uničevanje biofilmov, čeprav bakterijske celice niso ubite. Predlagano je bilo modularno preoblikovanje fagov, pri majhnih začetnih inokulacijah, v kateri fag ubija bakterije na način, da izraža najbolj učinkovite EPS degradacijske encime, ki so specifični za ciljni biofilm. Encimsko aktivirani fagi se razmnožujejo znotraj biofilmov in dosegajo visoke lokalne koncentracije encimov in litičnih fagov, katerih tarča so biofilmske komponente. Hitra replikacija fagov povzroči bakterijsko lizo in ekspresijo encimov, ki degradirajo biofilm. Ta strategija je uspešna pri katalitskih metodah za odstranjevanje bakterijskih biofilmov v okolju, industriji in prostorih/pripomočkih zdravstvene oskrbe. Prav tako tak način zmanjša potrebe po izražanju velikih količin encimov na specifična mesta infekcij, ki so težje dostopna in izboljša učinkovitost terapije s fagi pri odstranjevanju biofilmov.<br /> <br /> == VIRI ==<br /> [1] A. Dragoš in Á. T. Kovács, „The Peculiar Functions of the Bacterial Extracellular Matrix“, Trends Microbiol., let. 25, št. 4, str. 257–266, 2017.&lt;br /&gt;[2] N. Steinberg in I. Kolodkin-Gal, „The Matrix Reloaded: How Sensing the Extracellular Matrix Synchronizes Bacterial Communities“, J. Bacteriol., let. 197, št. 13, str. 2092–2103, 2015.&lt;br /&gt;[3] S. J. Labrie, J. E. Samson, in S. Moineau, „Bacteriophage resistance mechanisms“, Nat. Rev. Microbiol., let. 8, št. 5, str. 317–327, 2010.&lt;br /&gt;[4] B. K. Chan in S. T. Abedon, „Bacteriophage and their enzymes in biofilms“, str. 85–99, 2015.&lt;br /&gt;[5] T. K. Lu in J. J. Collins, „Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage“, Proc. Natl. Acad. Sci., let. 104, št. 27, str. 11197–11202, 2007.<br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Bm7118