https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=Bor+Kunstelj 2026-06-16T12:28:26Z User contributions MediaWiki 1.45.3 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Na%C4%8Drtovanje_mo%C4%8Dnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah&diff=24747 2025-05-05T18:46:09Z

<p>Bor Kunstelj: /* Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo */</p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39702268/ Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts] <br /> <br /> == Uvod == <br /> Promotorji so v sintezni biologiji ključnega pomena za natančno uravnavo ravni izražanja genov. Medtem ko lahko v prokariontih s precejšnjo lahkoto spreminjamo moč promotorja je ta naloga pri evkariontih precej bolj zapletena, saj imajo le te veliko bolj kompleksno delovanje in regulacijo. Tudi promotorji kvasovk so nam še vedno precejšnja uganka, kljub temu da so kvasovke, predvsem ''S. cerevisiae'', že vrsto let eden izmed ključnih modelnih organizmov. Zato se v sintezni biologiji kvasovk, še vedno v precejšnji meri uporabljajo nativni promotorji, ki so dobro raziskani. Alternativa slednjim bi lahko bili inducibilni sintetični promotorji. Raziskovalci so zasnovali številne sintetične osrednje promotorje z nativnimi zgornjimi aktivacijskimi elementi [1].<br /> <br /> == Strategije načrtovanja močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Inducibilni sinetični promotorji vsebujejo dva osnovna gradnika in sicer TATA-zaporedje in zgornje bakterijske operatorje. Te promotorje so optimizirali s tremi metodami. Pred operatorje so vstavili dolgo izolacijsko zaporedje ( &gt; 1-kbp), ki onemogoči neželeno aktivacijo s strani oddaljenih ojačevalcev. Fuzija bakterijskih operatorjev direktno na zaporedje-TATA ojača aktivacijo. Povečevanje ponovitev operatorjev lahko zamnjša puščanje in izboljša raven ekspresije [1].<br /> <br /> == Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Raziskovalci so izdelali sintetični promotor inducibilen z 1-(3-Acetil-2,4,6-trihydroksifhenil) etanon 2,4 (DAPG) v modelnem organizmu ''Komagataella phaffii'' (prej poznana kot ''Pichia pastoris''). Najprej so 197bp osrednjega promotorja KpAOX1 fuzirali pod operator ''phlO''. Torej, ko je prisoten DAPG v gojišču se le ta poveže z trnskripcijskim aktivatorjem, ki se veže na opertor, kar omogoči izražanje gena pod promotorjem ''KpAOX1''. Moč promotorjev so karakterizirali z izražanjem EGFP (''angl. enhanced green fluorescent protein''). Kvasovke v katerih je bil prisoten plazmid z zgoraj opisanim konstruktom so izkazovale več kot &gt;100-krat višjo raven ekspresije EGFP, tudi v odsotnosti induktorja DAPG. Po dodatku DAPG se je fluorescenca povišala za 8-krat. To nakazuje na močno puščanje tega sintetičnega promotorja. Raziskovalci so to težavo rešili tako, da so navzgor nad promotor vstavili genske fragmente v dolžini do 1,6 kb. Tako so zmanjšali puščanje za kar 376-krat medtem, ko se je raven ekspresije ob indukciji zmanjšala le za 1,6-krat. Razloga za puščanje tovrstnih promotorjev sta po navadi dva: endogeni transkripcijski aktivatorji, ki se lahko nahajajo tudi več kot 1kb navzgor od promotorja in pa prepisovanje izven gena (''angl. transcriptional readthrough'') [1].<br /> <br /> == Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov ==<br /> Kljub temu, da se v nekaterih člankih omenja velik vpliv oddaljenosti TATA-zaporedja od startkodona, ga tu pri svojih eksperimentih raziskovalci skoraj niso [2]. Minimalni sintetični promotor lahko v tem primeru vsebuje le bakterijski operator, TATA-zaporedje in kratek vmesnik. Da bi razširili uporabnost teh promotorjev so avtorji izhodiščnega članka načrtali še močne inducuibilne sintetične promotorje v ''Saccharomyces cerevisiae''. Že izredno kratek promotor z dolžino 110 bp z osrednjim promotorjem ''ScGAL1'' fuziran z operatorjem ''phlO'' je dosegel &gt;100-krat višjo raven ekspresije ob indukciji z DAPG. Ključ do tega uspeha leži v tem, da so TATA-zaporedje postavili takoj ob bakterijski operator [1].<br /> <br /> == Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja ==<br /> Ko so avtorji ugotovili način za zmanjšanje puščanja promotorjev so se odločili, da bodo okarakterizirali še vpliv popnovitev različnih operatorskih regij, na raven izražanja proteina pod takšnim promotorjem. Uporabili so induktorje DAPG, doksiciklin (Dox) in homoserin lakton (HSL), ki se vežejo na operatorje ''phlO'', ''tetO2'' in ''luxO''. Dve ponovitvi operatorja ''phlO'' povečata ekspresijo GFP za &gt;2000-krat, 6 ponovitev operatorske regije pa ob indukciji z DAPG že kar za &gt;3000-krat. Seveda razmerje med številom operatorjev in močjo indukcije ni monotono. <br /> Pri KpHSL-ON stikalu so naleteli na težavo, saj tudi pri 10 ponovitvah ''luxO'' ni prišlo do pričakovanega dviga ravni izražanja. Zato so se avtorji članka odločil, da bodo del ''luxO'' zamenjali z ostalimi ''luxO'' variantami iz bakterije ''Aliivibrio fischeri''. Na tak način so se izognili kriptični aktivaciji promotorja in statistično signifikantno povečali njegovo moč [1].<br /> <br /> == Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev ==<br /> Raziskovalci so uprabili KpDAPG-ON sistem za produkcijo nanotelesa ALX-0171 (gontivimab). Gene za nanotelesa so na C-terminalnem koncu fuzirali s signalno sekvenco paritvenega faktorja alfa (MFα). Za izražanje tega nanotelesa so uporabili 419bp dolg močan promotor DAPG-iSynP, PKpPhl6.0, vsebujoč šest ''phlO'' ponovitev in 61bp dolg vmestnik navzgor od zaporedja-TATA. Izkazalo se je, da je sintetični promotor 5-krat učinkovitejši za tovrstno proizvodnjo nanotelesa, kot bolj komercialno uveljavljen način indukcije z metanolom. <br /> Dokazali so, da je z sintetičnimi inducibilnimi promotorji moč izražati dva različna proteina pod dva različnima promotorjema. To so storili tak, da so v en sev vsatvili zapise za dve nanotelesi ALX-0171 and ALX-0081 pod promotorjema pDAPG-ON in KpTet-ON. Ekspresija je bila uspešna, a le ob dodatku ustreznega induktorja [1].<br /> <br /> == Ekspresijski sistemi brez induktorja ==<br /> Sistemi brez induktorja ali “Inducer-OFF” sistemi so pogosti v industriji, saj se z njimi lahko izognemo stroškom dodajanja induktorja. Tovrstni sistemi delujejo tako, da se ekspresija proteina prične šele, ko induktor odstranimo iz gojišča. Za ta namen so raziskovalci uporabili transkripcijski aktivator PhlTA, ki se deaktivira ob dodatku DAPG. Potem so ga še dodatno prilagodili za ta namen s pomočjo usmerjene evolucije. Najprej so z uporabo PCR mutrali ''phlTA''. Potem so le tega vstavili v vektor, ki je vseboval že predhodno narejen sintetični promotor s šestimi ponovitvami ''phlO'', ki so fuzirane na promotor ''ScGAL''. Zatem so s pomočjo PCR podvrženega mutacijam, ustvarili dve knjižnjici z 93 kloni, ki so jih prečesali za ON/OFF indukcijo z 5 μM DAPG. Rezulatati so pokazali, da je bila ključna mutacija za izboljšavo “Inducer-OFF” sistema PhlTA (E41G). Ko so to varinato vnesli v ''K. phaffii'' je prišlo ob dodatku DAPG do 702-kratne redukcije v primeru 61bp dolgega distančnika pred TATA-zaporedjem in 1572-kratne redukcije v primeru 11bp dolgega distančnika [1].<br /> <br /> == Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==<br /> Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavno domeno (RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt;) iz virusa SARS-CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt; . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt; so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C in 30°C, a so bili z izolacijo uspešni le pri kvasovkah gojenih pri 18°C, kar je v skladu s pričakovanji. V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši. <br /> Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt; proti vezavi na ta protein divjega tipa [1].<br /> <br /> == Zaključek ==<br /> V članku so raziskovalci demonstrirali učinkovite metode za pripravo različnih močnih inducibilnih močnih promotorjev v dveh pomembnih vrstah kvasovk ''Komagataella phaffii'' in ''Saccharomyces cerevisiae''. Dokazali so tudi, da lahko z variacijo števila operatorjev na začetku promotorja variirajo izražanja proteina. Poleg tega so demonstrirali tudi možnosti za proizvodnjo industrijsko pomembnih proteinov s pomočjo tovrstnih promotorjev. Avtorje je presenetilo, da je le 94-bp dolga promotorska sekvenca lahko delovala, kot močan sintetični inducibilni promotor, ki je po svoji moči presegel vse naravne kvasne promotorje.<br /> <br /> == Literatura ==<br /> [1] Tominaga, M., Shima, Y., Nozaki, K., Ito, Y., Someda, M., Shoya, Y., Hashii, N., Obata, C., Matsumoto-Kitano, M., Suematsu, K., Matsukawa, T., Hosoya, K., Hashiba, N., Kondo, A., &amp; Ishii, J. (2024b). Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts. Nature Communications, 15(1). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54865-z<br /> <br /> [2] Dvir, S., Velten, L., Sharon, E., Zeevi, D., Carey, L. B., Weinberger, A., &amp; Segal, E. (2013). Deciphering the rules by which 5′-UTR sequences affect protein expression in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(30). https://doi.org/10.1073/pnas.1222534110</div>

Bor Kunstelj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Na%C4%8Drtovanje_mo%C4%8Dnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah&diff=24746 2025-05-05T18:43:22Z

<p>Bor Kunstelj: /* Zaključek */</p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39702268/ Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts] <br /> <br /> == Uvod == <br /> Promotorji so v sintezni biologiji ključnega pomena za natančno uravnavo ravni izražanja genov. Medtem ko lahko v prokariontih s precejšnjo lahkoto spreminjamo moč promotorja je ta naloga pri evkariontih precej bolj zapletena, saj imajo le te veliko bolj kompleksno delovanje in regulacijo. Tudi promotorji kvasovk so nam še vedno precejšnja uganka, kljub temu da so kvasovke, predvsem ''S. cerevisiae'', že vrsto let eden izmed ključnih modelnih organizmov. Zato se v sintezni biologiji kvasovk, še vedno v precejšnji meri uporabljajo nativni promotorji, ki so dobro raziskani. Alternativa slednjim bi lahko bili inducibilni sintetični promotorji. Raziskovalci so zasnovali številne sintetične osrednje promotorje z nativnimi zgornjimi aktivacijskimi elementi [1].<br /> <br /> == Strategije načrtovanja močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Inducibilni sinetični promotorji vsebujejo dva osnovna gradnika in sicer TATA-zaporedje in zgornje bakterijske operatorje. Te promotorje so optimizirali s tremi metodami. Pred operatorje so vstavili dolgo izolacijsko zaporedje ( &gt; 1-kbp), ki onemogoči neželeno aktivacijo s strani oddaljenih ojačevalcev. Fuzija bakterijskih operatorjev direktno na zaporedje-TATA ojača aktivacijo. Povečevanje ponovitev operatorjev lahko zamnjša puščanje in izboljša raven ekspresije [1].<br /> <br /> == Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Raziskovalci so izdelali sintetični promotor inducibilen z 1-(3-Acetil-2,4,6-trihydroksifhenil) etanon 2,4 (DAPG) v modelnem organizmu ''Komagataella phaffii'' (prej poznana kot ''Pichia pastoris''). Najprej so 197bp osrednjega promotorja KpAOX1 fuzirali pod operator ''phlO''. Torej, ko je prisoten DAPG v gojišču se le ta poveže z trnskripcijskim aktivatorjem, ki se veže na opertor, kar omogoči izražanje gena pod promotorjem ''KpAOX1''. Moč promotorjev so karakterizirali z izražanjem EGFP (''angl. enhanced green fluorescent protein''). Kvasovke v katerih je bil prisoten plazmid z zgoraj opisanim konstruktom so izkazovale več kot &gt;100-krat višjo raven ekspresije EGFP, tudi v odsotnosti induktorja DAPG. Po dodatku DAPG se je fluorescenca povišala za 8-krat. To nakazuje na močno puščanje tega sintetičnega promotorja. Raziskovalci so to težavo rešili tako, da so navzgor nad promotor vstavili genske fragmente v dolžini do 1,6 kb. Tako so zmanjšali puščanje za kar 376-krat medtem, ko se je raven ekspresije ob indukciji zmanjšala le za 1,6-krat. Razloga za puščanje tovrstnih promotorjev sta po navadi dva: endogeni transkripcijski aktivatorji, ki se lahko nahajajo tudi več kot 1kb navzgor od promotorja in pa prepisovanje izven gena (''angl. transcriptional readthrough'') [1].<br /> <br /> == Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov ==<br /> Kljub temu, da se v nekaterih člankih omenja velik vpliv oddaljenosti TATA-zaporedja od startkodona, ga tu pri svojih eksperimentih raziskovalci skoraj niso [2]. Minimalni sintetični promotor lahko v tem primeru vsebuje le bakterijski operator, TATA-zaporedje in kratek vmesnik. Da bi razširili uporabnost teh promotorjev so avtorji izhodiščnega članka načrtali še močne inducuibilne sintetične promotorje v ''Saccharomyces cerevisiae''. Že izredno kratek promotor z dolžino 110 bp z osrednjim promotorjem ''ScGAL1'' fuziran z operatorjem ''phlO'' je dosegel &gt;100-krat višjo raven ekspresije ob indukciji z DAPG. Ključ do tega uspeha leži v tem, da so TATA-zaporedje postavili takoj ob bakterijski operator [1].<br /> <br /> == Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja ==<br /> Ko so avtorji ugotovili način za zmanjšanje puščanja promotorjev so se odločili, da bodo okarakterizirali še vpliv popnovitev različnih operatorskih regij, na raven izražanja proteina pod takšnim promotorjem. Uporabili so induktorje DAPG, doksiciklin (Dox) in homoserin lakton (HSL), ki se vežejo na operatorje ''phlO'', ''tetO2'' in ''luxO''. Dve ponovitvi operatorja ''phlO'' povečata ekspresijo GFP za &gt;2000-krat, 6 ponovitev operatorske regije pa ob indukciji z DAPG že kar za &gt;3000-krat. Seveda razmerje med številom operatorjev in močjo indukcije ni monotono. <br /> Pri KpHSL-ON stikalu so naleteli na težavo, saj tudi pri 10 ponovitvah ''luxO'' ni prišlo do pričakovanega dviga ravni izražanja. Zato so se avtorji članka odločil, da bodo del ''luxO'' zamenjali z ostalimi ''luxO'' variantami iz bakterije ''Aliivibrio fischeri''. Na tak način so se izognili kriptični aktivaciji promotorja in statistično signifikantno povečali njegovo moč [1].<br /> <br /> == Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev ==<br /> Raziskovalci so uprabili KpDAPG-ON sistem za produkcijo nanotelesa ALX-0171 (gontivimab). Gene za nanotelesa so na C-terminalnem koncu fuzirali s signalno sekvenco paritvenega faktorja alfa (MFα). Za izražanje tega nanotelesa so uporabili 419bp dolg močan promotor DAPG-iSynP, PKpPhl6.0, vsebujoč šest ''phlO'' ponovitev in 61bp dolg vmestnik navzgor od zaporedja-TATA. Izkazalo se je, da je sintetični promotor 5-krat učinkovitejši za tovrstno proizvodnjo nanotelesa, kot bolj komercialno uveljavljen način indukcije z metanolom. <br /> Dokazali so, da je z sintetičnimi inducibilnimi promotorji moč izražati dva različna proteina pod dva različnima promotorjema. To so storili tak, da so v en sev vsatvili zapise za dve nanotelesi ALX-0171 and ALX-0081 pod promotorjema pDAPG-ON in KpTet-ON. Ekspresija je bila uspešna, a le ob dodatku ustreznega induktorja [1].<br /> <br /> == Ekspresijski sistemi brez induktorja ==<br /> Sistemi brez induktorja ali “Inducer-OFF” sistemi so pogosti v industriji, saj se z njimi lahko izognemo stroškom dodajanja induktorja. Tovrstni sistemi delujejo tako, da se ekspresija proteina prične šele, ko induktor odstranimo iz gojišča. Za ta namen so raziskovalci uporabili transkripcijski aktivator PhlTA, ki se deaktivira ob dodatku DAPG. Potem so ga še dodatno prilagodili za ta namen s pomočjo usmerjene evolucije. Najprej so z uporabo PCR mutrali ''phlTA''. Potem so le tega vstavili v vektor, ki je vseboval že predhodno narejen sintetični promotor s šestimi ponovitvami ''phlO'', ki so fuzirane na promotor ''ScGAL''. Zatem so s pomočjo PCR podvrženega mutacijam, ustvarili dve knjižnjici z 93 kloni, ki so jih prečesali za ON/OFF indukcijo z 5 μM DAPG. Rezulatati so pokazali, da je bila ključna mutacija za izboljšavo “Inducer-OFF” sistema PhlTA (E41G). Ko so to varinato vnesli v ''K. phaffii'' je prišlo ob dodatku DAPG do 702-kratne redukcije v primeru 61bp dolgega distančnika pred TATA-zaporedjem in 1572-kratne redukcije v primeru 11bp dolgega distančnika [1].<br /> <br /> == Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==<br /> Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavno domeno (RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt;) iz virusa SARS-CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt; . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt; so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C namesto pri 30°C . V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši. <br /> Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt; proti vezavi na ta protein divjega tipa [1].<br /> <br /> == Zaključek ==<br /> V članku so raziskovalci demonstrirali učinkovite metode za pripravo različnih močnih inducibilnih močnih promotorjev v dveh pomembnih vrstah kvasovk ''Komagataella phaffii'' in ''Saccharomyces cerevisiae''. Dokazali so tudi, da lahko z variacijo števila operatorjev na začetku promotorja variirajo izražanja proteina. Poleg tega so demonstrirali tudi možnosti za proizvodnjo industrijsko pomembnih proteinov s pomočjo tovrstnih promotorjev. Avtorje je presenetilo, da je le 94-bp dolga promotorska sekvenca lahko delovala, kot močan sintetični inducibilni promotor, ki je po svoji moči presegel vse naravne kvasne promotorje.<br /> <br /> == Literatura ==<br /> [1] Tominaga, M., Shima, Y., Nozaki, K., Ito, Y., Someda, M., Shoya, Y., Hashii, N., Obata, C., Matsumoto-Kitano, M., Suematsu, K., Matsukawa, T., Hosoya, K., Hashiba, N., Kondo, A., &amp; Ishii, J. (2024b). Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts. Nature Communications, 15(1). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54865-z<br /> <br /> [2] Dvir, S., Velten, L., Sharon, E., Zeevi, D., Carey, L. B., Weinberger, A., &amp; Segal, E. (2013). Deciphering the rules by which 5′-UTR sequences affect protein expression in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(30). https://doi.org/10.1073/pnas.1222534110</div>

Bor Kunstelj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Na%C4%8Drtovanje_mo%C4%8Dnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah&diff=24745 2025-05-05T18:18:47Z

<p>Bor Kunstelj: /* Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo */</p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39702268/ Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts] <br /> <br /> == Uvod == <br /> Promotorji so v sintezni biologiji ključnega pomena za natančno uravnavo ravni izražanja genov. Medtem ko lahko v prokariontih s precejšnjo lahkoto spreminjamo moč promotorja je ta naloga pri evkariontih precej bolj zapletena, saj imajo le te veliko bolj kompleksno delovanje in regulacijo. Tudi promotorji kvasovk so nam še vedno precejšnja uganka, kljub temu da so kvasovke, predvsem ''S. cerevisiae'', že vrsto let eden izmed ključnih modelnih organizmov. Zato se v sintezni biologiji kvasovk, še vedno v precejšnji meri uporabljajo nativni promotorji, ki so dobro raziskani. Alternativa slednjim bi lahko bili inducibilni sintetični promotorji. Raziskovalci so zasnovali številne sintetične osrednje promotorje z nativnimi zgornjimi aktivacijskimi elementi [1].<br /> <br /> == Strategije načrtovanja močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Inducibilni sinetični promotorji vsebujejo dva osnovna gradnika in sicer TATA-zaporedje in zgornje bakterijske operatorje. Te promotorje so optimizirali s tremi metodami. Pred operatorje so vstavili dolgo izolacijsko zaporedje ( &gt; 1-kbp), ki onemogoči neželeno aktivacijo s strani oddaljenih ojačevalcev. Fuzija bakterijskih operatorjev direktno na zaporedje-TATA ojača aktivacijo. Povečevanje ponovitev operatorjev lahko zamnjša puščanje in izboljša raven ekspresije [1].<br /> <br /> == Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Raziskovalci so izdelali sintetični promotor inducibilen z 1-(3-Acetil-2,4,6-trihydroksifhenil) etanon 2,4 (DAPG) v modelnem organizmu ''Komagataella phaffii'' (prej poznana kot ''Pichia pastoris''). Najprej so 197bp osrednjega promotorja KpAOX1 fuzirali pod operator ''phlO''. Torej, ko je prisoten DAPG v gojišču se le ta poveže z trnskripcijskim aktivatorjem, ki se veže na opertor, kar omogoči izražanje gena pod promotorjem ''KpAOX1''. Moč promotorjev so karakterizirali z izražanjem EGFP (''angl. enhanced green fluorescent protein''). Kvasovke v katerih je bil prisoten plazmid z zgoraj opisanim konstruktom so izkazovale več kot &gt;100-krat višjo raven ekspresije EGFP, tudi v odsotnosti induktorja DAPG. Po dodatku DAPG se je fluorescenca povišala za 8-krat. To nakazuje na močno puščanje tega sintetičnega promotorja. Raziskovalci so to težavo rešili tako, da so navzgor nad promotor vstavili genske fragmente v dolžini do 1,6 kb. Tako so zmanjšali puščanje za kar 376-krat medtem, ko se je raven ekspresije ob indukciji zmanjšala le za 1,6-krat. Razloga za puščanje tovrstnih promotorjev sta po navadi dva: endogeni transkripcijski aktivatorji, ki se lahko nahajajo tudi več kot 1kb navzgor od promotorja in pa prepisovanje izven gena (''angl. transcriptional readthrough'') [1].<br /> <br /> == Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov ==<br /> Kljub temu, da se v nekaterih člankih omenja velik vpliv oddaljenosti TATA-zaporedja od startkodona, ga tu pri svojih eksperimentih raziskovalci skoraj niso [2]. Minimalni sintetični promotor lahko v tem primeru vsebuje le bakterijski operator, TATA-zaporedje in kratek vmesnik. Da bi razširili uporabnost teh promotorjev so avtorji izhodiščnega članka načrtali še močne inducuibilne sintetične promotorje v ''Saccharomyces cerevisiae''. Že izredno kratek promotor z dolžino 110 bp z osrednjim promotorjem ''ScGAL1'' fuziran z operatorjem ''phlO'' je dosegel &gt;100-krat višjo raven ekspresije ob indukciji z DAPG. Ključ do tega uspeha leži v tem, da so TATA-zaporedje postavili takoj ob bakterijski operator [1].<br /> <br /> == Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja ==<br /> Ko so avtorji ugotovili način za zmanjšanje puščanja promotorjev so se odločili, da bodo okarakterizirali še vpliv popnovitev različnih operatorskih regij, na raven izražanja proteina pod takšnim promotorjem. Uporabili so induktorje DAPG, doksiciklin (Dox) in homoserin lakton (HSL), ki se vežejo na operatorje ''phlO'', ''tetO2'' in ''luxO''. Dve ponovitvi operatorja ''phlO'' povečata ekspresijo GFP za &gt;2000-krat, 6 ponovitev operatorske regije pa ob indukciji z DAPG že kar za &gt;3000-krat. Seveda razmerje med številom operatorjev in močjo indukcije ni monotono. <br /> Pri KpHSL-ON stikalu so naleteli na težavo, saj tudi pri 10 ponovitvah ''luxO'' ni prišlo do pričakovanega dviga ravni izražanja. Zato so se avtorji članka odločil, da bodo del ''luxO'' zamenjali z ostalimi ''luxO'' variantami iz bakterije ''Aliivibrio fischeri''. Na tak način so se izognili kriptični aktivaciji promotorja in statistično signifikantno povečali njegovo moč [1].<br /> <br /> == Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev ==<br /> Raziskovalci so uprabili KpDAPG-ON sistem za produkcijo nanotelesa ALX-0171 (gontivimab). Gene za nanotelesa so na C-terminalnem koncu fuzirali s signalno sekvenco paritvenega faktorja alfa (MFα). Za izražanje tega nanotelesa so uporabili 419bp dolg močan promotor DAPG-iSynP, PKpPhl6.0, vsebujoč šest ''phlO'' ponovitev in 61bp dolg vmestnik navzgor od zaporedja-TATA. Izkazalo se je, da je sintetični promotor 5-krat učinkovitejši za tovrstno proizvodnjo nanotelesa, kot bolj komercialno uveljavljen način indukcije z metanolom. <br /> Dokazali so, da je z sintetičnimi inducibilnimi promotorji moč izražati dva različna proteina pod dva različnima promotorjema. To so storili tak, da so v en sev vsatvili zapise za dve nanotelesi ALX-0171 and ALX-0081 pod promotorjema pDAPG-ON in KpTet-ON. Ekspresija je bila uspešna, a le ob dodatku ustreznega induktorja [1].<br /> <br /> == Ekspresijski sistemi brez induktorja ==<br /> Sistemi brez induktorja ali “Inducer-OFF” sistemi so pogosti v industriji, saj se z njimi lahko izognemo stroškom dodajanja induktorja. Tovrstni sistemi delujejo tako, da se ekspresija proteina prične šele, ko induktor odstranimo iz gojišča. Za ta namen so raziskovalci uporabili transkripcijski aktivator PhlTA, ki se deaktivira ob dodatku DAPG. Potem so ga še dodatno prilagodili za ta namen s pomočjo usmerjene evolucije. Najprej so z uporabo PCR mutrali ''phlTA''. Potem so le tega vstavili v vektor, ki je vseboval že predhodno narejen sintetični promotor s šestimi ponovitvami ''phlO'', ki so fuzirane na promotor ''ScGAL''. Zatem so s pomočjo PCR podvrženega mutacijam, ustvarili dve knjižnjici z 93 kloni, ki so jih prečesali za ON/OFF indukcijo z 5 μM DAPG. Rezulatati so pokazali, da je bila ključna mutacija za izboljšavo “Inducer-OFF” sistema PhlTA (E41G). Ko so to varinato vnesli v ''K. phaffii'' je prišlo ob dodatku DAPG do 702-kratne redukcije v primeru 61bp dolgega distančnika pred TATA-zaporedjem in 1572-kratne redukcije v primeru 11bp dolgega distančnika [1].<br /> <br /> == Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==<br /> Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavno domeno (RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt;) iz virusa SARS-CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt; . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt; so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C namesto pri 30°C . V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši. <br /> Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt; proti vezavi na ta protein divjega tipa [1].<br /> <br /> == Zaključek ==<br /> V članku so raziskovalci demonstrirali učinkovite metode za pripravo različnih močnih inducibilnih močnih promotorjev v dveh pomembnih vrstah kvasovk ''Komagataella phaffii'' in ''Saccharomyces cerevisiae''. Dokazali so tudi, da lahko z variacijo števila operatorjev na začetku promotorja variirajo izražanja proteina. Poleg tega so demonstrirali tudi možnosti za proizvodnjo industrijsko pomembnih proteinov s pomočjo tovrstnih promotorjev. <br /> <br /> == Literatura ==<br /> [1] Tominaga, M., Shima, Y., Nozaki, K., Ito, Y., Someda, M., Shoya, Y., Hashii, N., Obata, C., Matsumoto-Kitano, M., Suematsu, K., Matsukawa, T., Hosoya, K., Hashiba, N., Kondo, A., &amp; Ishii, J. (2024b). Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts. Nature Communications, 15(1). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54865-z<br /> <br /> [2] Dvir, S., Velten, L., Sharon, E., Zeevi, D., Carey, L. B., Weinberger, A., &amp; Segal, E. (2013). Deciphering the rules by which 5′-UTR sequences affect protein expression in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(30). https://doi.org/10.1073/pnas.1222534110</div>

Bor Kunstelj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Na%C4%8Drtovanje_mo%C4%8Dnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah&diff=24744 2025-05-05T18:17:50Z

<p>Bor Kunstelj: /* Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo */</p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39702268/ Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts] <br /> <br /> == Uvod == <br /> Promotorji so v sintezni biologiji ključnega pomena za natančno uravnavo ravni izražanja genov. Medtem ko lahko v prokariontih s precejšnjo lahkoto spreminjamo moč promotorja je ta naloga pri evkariontih precej bolj zapletena, saj imajo le te veliko bolj kompleksno delovanje in regulacijo. Tudi promotorji kvasovk so nam še vedno precejšnja uganka, kljub temu da so kvasovke, predvsem ''S. cerevisiae'', že vrsto let eden izmed ključnih modelnih organizmov. Zato se v sintezni biologiji kvasovk, še vedno v precejšnji meri uporabljajo nativni promotorji, ki so dobro raziskani. Alternativa slednjim bi lahko bili inducibilni sintetični promotorji. Raziskovalci so zasnovali številne sintetične osrednje promotorje z nativnimi zgornjimi aktivacijskimi elementi [1].<br /> <br /> == Strategije načrtovanja močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Inducibilni sinetični promotorji vsebujejo dva osnovna gradnika in sicer TATA-zaporedje in zgornje bakterijske operatorje. Te promotorje so optimizirali s tremi metodami. Pred operatorje so vstavili dolgo izolacijsko zaporedje ( &gt; 1-kbp), ki onemogoči neželeno aktivacijo s strani oddaljenih ojačevalcev. Fuzija bakterijskih operatorjev direktno na zaporedje-TATA ojača aktivacijo. Povečevanje ponovitev operatorjev lahko zamnjša puščanje in izboljša raven ekspresije [1].<br /> <br /> == Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Raziskovalci so izdelali sintetični promotor inducibilen z 1-(3-Acetil-2,4,6-trihydroksifhenil) etanon 2,4 (DAPG) v modelnem organizmu ''Komagataella phaffii'' (prej poznana kot ''Pichia pastoris''). Najprej so 197bp osrednjega promotorja KpAOX1 fuzirali pod operator ''phlO''. Torej, ko je prisoten DAPG v gojišču se le ta poveže z trnskripcijskim aktivatorjem, ki se veže na opertor, kar omogoči izražanje gena pod promotorjem ''KpAOX1''. Moč promotorjev so karakterizirali z izražanjem EGFP (''angl. enhanced green fluorescent protein''). Kvasovke v katerih je bil prisoten plazmid z zgoraj opisanim konstruktom so izkazovale več kot &gt;100-krat višjo raven ekspresije EGFP, tudi v odsotnosti induktorja DAPG. Po dodatku DAPG se je fluorescenca povišala za 8-krat. To nakazuje na močno puščanje tega sintetičnega promotorja. Raziskovalci so to težavo rešili tako, da so navzgor nad promotor vstavili genske fragmente v dolžini do 1,6 kb. Tako so zmanjšali puščanje za kar 376-krat medtem, ko se je raven ekspresije ob indukciji zmanjšala le za 1,6-krat. Razloga za puščanje tovrstnih promotorjev sta po navadi dva: endogeni transkripcijski aktivatorji, ki se lahko nahajajo tudi več kot 1kb navzgor od promotorja in pa prepisovanje izven gena (''angl. transcriptional readthrough'') [1].<br /> <br /> == Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov ==<br /> Kljub temu, da se v nekaterih člankih omenja velik vpliv oddaljenosti TATA-zaporedja od startkodona, ga tu pri svojih eksperimentih raziskovalci skoraj niso [2]. Minimalni sintetični promotor lahko v tem primeru vsebuje le bakterijski operator, TATA-zaporedje in kratek vmesnik. Da bi razširili uporabnost teh promotorjev so avtorji izhodiščnega članka načrtali še močne inducuibilne sintetične promotorje v ''Saccharomyces cerevisiae''. Že izredno kratek promotor z dolžino 110 bp z osrednjim promotorjem ''ScGAL1'' fuziran z operatorjem ''phlO'' je dosegel &gt;100-krat višjo raven ekspresije ob indukciji z DAPG. Ključ do tega uspeha leži v tem, da so TATA-zaporedje postavili takoj ob bakterijski operator [1].<br /> <br /> == Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja ==<br /> Ko so avtorji ugotovili način za zmanjšanje puščanja promotorjev so se odločili, da bodo okarakterizirali še vpliv popnovitev različnih operatorskih regij, na raven izražanja proteina pod takšnim promotorjem. Uporabili so induktorje DAPG, doksiciklin (Dox) in homoserin lakton (HSL), ki se vežejo na operatorje ''phlO'', ''tetO2'' in ''luxO''. Dve ponovitvi operatorja ''phlO'' povečata ekspresijo GFP za &gt;2000-krat, 6 ponovitev operatorske regije pa ob indukciji z DAPG že kar za &gt;3000-krat. Seveda razmerje med številom operatorjev in močjo indukcije ni monotono. <br /> Pri KpHSL-ON stikalu so naleteli na težavo, saj tudi pri 10 ponovitvah ''luxO'' ni prišlo do pričakovanega dviga ravni izražanja. Zato so se avtorji članka odločil, da bodo del ''luxO'' zamenjali z ostalimi ''luxO'' variantami iz bakterije ''Aliivibrio fischeri''. Na tak način so se izognili kriptični aktivaciji promotorja in statistično signifikantno povečali njegovo moč [1].<br /> <br /> == Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev ==<br /> Raziskovalci so uprabili KpDAPG-ON sistem za produkcijo nanotelesa ALX-0171 (gontivimab). Gene za nanotelesa so na C-terminalnem koncu fuzirali s signalno sekvenco paritvenega faktorja alfa (MFα). Za izražanje tega nanotelesa so uporabili 419bp dolg močan promotor DAPG-iSynP, PKpPhl6.0, vsebujoč šest ''phlO'' ponovitev in 61bp dolg vmestnik navzgor od zaporedja-TATA. Izkazalo se je, da je sintetični promotor 5-krat učinkovitejši za tovrstno proizvodnjo nanotelesa, kot bolj komercialno uveljavljen način indukcije z metanolom. <br /> Dokazali so, da je z sintetičnimi inducibilnimi promotorji moč izražati dva različna proteina pod dva različnima promotorjema. To so storili tak, da so v en sev vsatvili zapise za dve nanotelesi ALX-0171 and ALX-0081 pod promotorjema pDAPG-ON in KpTet-ON. Ekspresija je bila uspešna, a le ob dodatku ustreznega induktorja [1].<br /> <br /> == Ekspresijski sistemi brez induktorja ==<br /> Sistemi brez induktorja ali “Inducer-OFF” sistemi so pogosti v industriji, saj se z njimi lahko izognemo stroškom dodajanja induktorja. Tovrstni sistemi delujejo tako, da se ekspresija proteina prične šele, ko induktor odstranimo iz gojišča. Za ta namen so raziskovalci uporabili transkripcijski aktivator PhlTA, ki se deaktivira ob dodatku DAPG. Potem so ga še dodatno prilagodili za ta namen s pomočjo usmerjene evolucije. Najprej so z uporabo PCR mutrali ''phlTA''. Potem so le tega vstavili v vektor, ki je vseboval že predhodno narejen sintetični promotor s šestimi ponovitvami ''phlO'', ki so fuzirane na promotor ''ScGAL''. Zatem so s pomočjo PCR podvrženega mutacijam, ustvarili dve knjižnjici z 93 kloni, ki so jih prečesali za ON/OFF indukcijo z 5 μM DAPG. Rezulatati so pokazali, da je bila ključna mutacija za izboljšavo “Inducer-OFF” sistema PhlTA (E41G). Ko so to varinato vnesli v ''K. phaffii'' je prišlo ob dodatku DAPG do 702-kratne redukcije v primeru 61bp dolgega distančnika pred TATA-zaporedjem in 1572-kratne redukcije v primeru 11bp dolgega distančnika [1].<br /> <br /> == Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==<br /> Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavni protein RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt; iz virusa SARS-CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt; . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt; so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C namesto pri 30°C . V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši. <br /> Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt; proti vezavi na ta protein divjega tipa [1].<br /> <br /> == Zaključek ==<br /> V članku so raziskovalci demonstrirali učinkovite metode za pripravo različnih močnih inducibilnih močnih promotorjev v dveh pomembnih vrstah kvasovk ''Komagataella phaffii'' in ''Saccharomyces cerevisiae''. Dokazali so tudi, da lahko z variacijo števila operatorjev na začetku promotorja variirajo izražanja proteina. Poleg tega so demonstrirali tudi možnosti za proizvodnjo industrijsko pomembnih proteinov s pomočjo tovrstnih promotorjev. <br /> <br /> == Literatura ==<br /> [1] Tominaga, M., Shima, Y., Nozaki, K., Ito, Y., Someda, M., Shoya, Y., Hashii, N., Obata, C., Matsumoto-Kitano, M., Suematsu, K., Matsukawa, T., Hosoya, K., Hashiba, N., Kondo, A., &amp; Ishii, J. (2024b). Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts. Nature Communications, 15(1). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54865-z<br /> <br /> [2] Dvir, S., Velten, L., Sharon, E., Zeevi, D., Carey, L. B., Weinberger, A., &amp; Segal, E. (2013). Deciphering the rules by which 5′-UTR sequences affect protein expression in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(30). https://doi.org/10.1073/pnas.1222534110</div>

Bor Kunstelj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Na%C4%8Drtovanje_mo%C4%8Dnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah&diff=24705 2025-05-04T18:31:35Z

<p>Bor Kunstelj: /* Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah */</p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39702268/ Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts] <br /> <br /> == Uvod == <br /> Promotorji so v sintezni biologiji ključnega pomena za natančno uravnavo ravni izražanja genov. Medtem ko lahko v prokariontih s precejšnjo lahkoto spreminjamo moč promotorja je ta naloga pri evkariontih precej bolj zapletena, saj imajo le te veliko bolj kompleksno delovanje in regulacijo. Tudi promotorji kvasovk so nam še vedno precejšnja uganka, kljub temu da so kvasovke, predvsem ''S. cerevisiae'', že vrsto let eden izmed ključnih modelnih organizmov. Zato se v sintezni biologiji kvasovk, še vedno v precejšnji meri uporabljajo nativni promotorji, ki so dobro raziskani. Alternativa slednjim bi lahko bili inducibilni sintetični promotorji. Raziskovalci so zasnovali številne sintetične osrednje promotorje z nativnimi zgornjimi aktivacijskimi elementi [1].<br /> <br /> == Strategije načrtovanja močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Inducibilni sinetični promotorji vsebujejo dva osnovna gradnika in sicer TATA-zaporedje in zgornje bakterijske operatorje. Te promotorje so optimizirali s tremi metodami. Pred operatorje so vstavili dolgo izolacijsko zaporedje ( &gt; 1-kbp), ki onemogoči neželeno aktivacijo s strani oddaljenih ojačevalcev. Fuzija bakterijskih operatorjev direktno na zaporedje-TATA ojača aktivacijo. Povečevanje ponovitev operatorjev lahko zamnjša puščanje in izboljša raven ekspresije [1].<br /> <br /> == Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Raziskovalci so izdelali sintetični promotor inducibilen z 1-(3-Acetil-2,4,6-trihydroksifhenil) etanon 2,4 (DAPG) v modelnem organizmu ''Komagataella phaffii'' (prej poznana kot ''Pichia pastoris''). Najprej so 197bp osrednjega promotorja KpAOX1 fuzirali pod operator ''phlO''. Torej, ko je prisoten DAPG v gojišču se le ta poveže z trnskripcijskim aktivatorjem, ki se veže na opertor, kar omogoči izražanje gena pod promotorjem ''KpAOX1''. Moč promotorjev so karakterizirali z izražanjem EGFP (''angl. enhanced green fluorescent protein''). Kvasovke v katerih je bil prisoten plazmid z zgoraj opisanim konstruktom so izkazovale več kot &gt;100-krat višjo raven ekspresije EGFP, tudi v odsotnosti induktorja DAPG. Po dodatku DAPG se je fluorescenca povišala za 8-krat. To nakazuje na močno puščanje tega sintetičnega promotorja. Raziskovalci so to težavo rešili tako, da so navzgor nad promotor vstavili genske fragmente v dolžini do 1,6 kb. Tako so zmanjšali puščanje za kar 376-krat medtem, ko se je raven ekspresije ob indukciji zmanjšala le za 1,6-krat. Razloga za puščanje tovrstnih promotorjev sta po navadi dva: endogeni transkripcijski aktivatorji, ki se lahko nahajajo tudi več kot 1kb navzgor od promotorja in pa prepisovanje izven gena (''angl. transcriptional readthrough'') [1].<br /> <br /> == Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov ==<br /> Kljub temu, da se v nekaterih člankih omenja velik vpliv oddaljenosti TATA-zaporedja od startkodona, ga tu pri svojih eksperimentih raziskovalci skoraj niso [2]. Minimalni sintetični promotor lahko v tem primeru vsebuje le bakterijski operator, TATA-zaporedje in kratek vmesnik. Da bi razširili uporabnost teh promotorjev so avtorji izhodiščnega članka načrtali še močne inducuibilne sintetične promotorje v ''Saccharomyces cerevisiae''. Že izredno kratek promotor z dolžino 110 bp z osrednjim promotorjem ''ScGAL1'' fuziran z operatorjem ''phlO'' je dosegel &gt;100-krat višjo raven ekspresije ob indukciji z DAPG. Ključ do tega uspeha leži v tem, da so TATA-zaporedje postavili takoj ob bakterijski operator [1].<br /> <br /> == Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja ==<br /> Ko so avtorji ugotovili način za zmanjšanje puščanja promotorjev so se odločili, da bodo okarakterizirali še vpliv popnovitev različnih operatorskih regij, na raven izražanja proteina pod takšnim promotorjem. Uporabili so induktorje DAPG, doksiciklin (Dox) in homoserin lakton (HSL), ki se vežejo na operatorje ''phlO'', ''tetO2'' in ''luxO''. Dve ponovitvi operatorja ''phlO'' povečata ekspresijo GFP za &gt;2000-krat, 6 ponovitev operatorske regije pa ob indukciji z DAPG že kar za &gt;3000-krat. Seveda razmerje med številom operatorjev in močjo indukcije ni monotono. <br /> Pri KpHSL-ON stikalu so naleteli na težavo, saj tudi pri 10 ponovitvah ''luxO'' ni prišlo do pričakovanega dviga ravni izražanja. Zato so se avtorji članka odločil, da bodo del ''luxO'' zamenjali z ostalimi ''luxO'' variantami iz bakterije ''Aliivibrio fischeri''. Na tak način so se izognili kriptični aktivaciji promotorja in statistično signifikantno povečali njegovo moč [1].<br /> <br /> == Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev ==<br /> Raziskovalci so uprabili KpDAPG-ON sistem za produkcijo nanotelesa ALX-0171 (gontivimab). Gene za nanotelesa so na C-terminalnem koncu fuzirali s signalno sekvenco paritvenega faktorja alfa (MFα). Za izražanje tega nanotelesa so uporabili 419bp dolg močan promotor DAPG-iSynP, PKpPhl6.0, vsebujoč šest ''phlO'' ponovitev in 61bp dolg vmestnik navzgor od zaporedja-TATA. Izkazalo se je, da je sintetični promotor 5-krat učinkovitejši za tovrstno proizvodnjo nanotelesa, kot bolj komercialno uveljavljen način indukcije z metanolom. <br /> Dokazali so, da je z sintetičnimi inducibilnimi promotorji moč izražati dva različna proteina pod dva različnima promotorjema. To so storili tak, da so v en sev vsatvili zapise za dve nanotelesi ALX-0171 and ALX-0081 pod promotorjema pDAPG-ON in KpTet-ON. Ekspresija je bila uspešna, a le ob dodatku ustreznega induktorja [1].<br /> <br /> == Ekspresijski sistemi brez induktorja ==<br /> Sistemi brez induktorja ali “Inducer-OFF” sistemi so pogosti v industriji, saj se z njimi lahko izognemo stroškom dodajanja induktorja. Tovrstni sistemi delujejo tako, da se ekspresija proteina prične šele, ko induktor odstranimo iz gojišča. Za ta namen so raziskovalci uporabili transkripcijski aktivator PhlTA, ki se deaktivira ob dodatku DAPG. Potem so ga še dodatno prilagodili za ta namen s pomočjo usmerjene evolucije. Najprej so z uporabo PCR mutrali ''phlTA''. Potem so le tega vstavili v vektor, ki je vseboval že predhodno narejen sintetični promotor s šestimi ponovitvami ''phlO'', ki so fuzirane na promotor ''ScGAL''. Zatem so s pomočjo PCR podvrženega mutacijam, ustvarili dve knjižnjici z 93 kloni, ki so jih prečesali za ON/OFF indukcijo z 5 μM DAPG. Rezulatati so pokazali, da je bila ključna mutacija za izboljšavo “Inducer-OFF” sistema PhlTA (E41G). Ko so to varinato vnesli v ''K. phaffii'' je prišlo ob dodatku DAPG do 702-kratne redukcije v primeru 61bp dolgega distančnika pred TATA-zaporedjem in 1572-kratne redukcije v primeru 11bp dolgega distančnika [1].<br /> <br /> == Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==<br /> Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavni protein RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt; iz virusa CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt; . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt; so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C namesto pri 30°C . V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši. <br /> Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt; proti vezavi na ta protein divjega tipa [1].<br /> <br /> == Zaključek ==<br /> V članku so raziskovalci demonstrirali učinkovite metode za pripravo različnih močnih inducibilnih močnih promotorjev v dveh pomembnih vrstah kvasovk ''Komagataella phaffii'' in ''Saccharomyces cerevisiae''. Dokazali so tudi, da lahko z variacijo števila operatorjev na začetku promotorja variirajo izražanja proteina. Poleg tega so demonstrirali tudi možnosti za proizvodnjo industrijsko pomembnih proteinov s pomočjo tovrstnih promotorjev. <br /> <br /> == Literatura ==<br /> [1] Tominaga, M., Shima, Y., Nozaki, K., Ito, Y., Someda, M., Shoya, Y., Hashii, N., Obata, C., Matsumoto-Kitano, M., Suematsu, K., Matsukawa, T., Hosoya, K., Hashiba, N., Kondo, A., &amp; Ishii, J. (2024b). Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts. Nature Communications, 15(1). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54865-z<br /> <br /> [2] Dvir, S., Velten, L., Sharon, E., Zeevi, D., Carey, L. B., Weinberger, A., &amp; Segal, E. (2013). Deciphering the rules by which 5′-UTR sequences affect protein expression in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(30). https://doi.org/10.1073/pnas.1222534110</div>

Bor Kunstelj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Na%C4%8Drtovanje_mo%C4%8Dnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah&diff=24700 2025-05-04T14:50:37Z

<p>Bor Kunstelj: /* Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo */</p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39702268/ Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts] <br /> <br /> == Uvod == <br /> Promotorji so v sintezni biologiji ključnega pomena za natančno uravnavo ravni izražanja genov. Medtem ko lahko v prokariontih s precejšnjo lahkoto spreminjamo moč promotorja je ta naloga pri evkariontih precej bolj zapletena, saj imajo le te veliko bolj kompleksno delovanje in regulacijo. Tudi promotorji kvasovk so nam še vedno precejšnja uganka, kljub temu da so kvasovke, predvsem ''S. cerevisiae'', že vrsto let eden izmed ključnih modelnih organizmov. Zato se v sintezni biologiji kvasovk, še vedno v precejšnji meri uporabljajo nativni promotorji, ki so dobro raziskani. Alternativa slednjim bi lahko bili inducibilni sintetični promotorji. Raziskovalci so zasnovali številne sintetične osrednje promotorje z nativnimi zgornjimi aktivacijskimi elementi [1].<br /> <br /> == Strategije načrtovanja močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Inducibilni sinetični promotorji vsebujejo dva osnovna gradnika in sicer TATA-zaporedje in zgornje bakterijske operatorje. Te promotorje so optimizirali s tremi metodami. Pred operatorje so vstavili dolgo izolacijsko zaporedje ( &gt; 1-kbp), ki onemogoči neželeno aktivacijo s strani oddaljenih ojačevalcev. Fuzija bakterijskih operatorjev direktno na zaporedje-TATA ojača aktivacijo. Povečevanje ponovitev operatorjev lahko zamnjša puščanje in izboljša raven ekspresije [1].<br /> <br /> == Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Raziskovalci so izdelali sintetični promotor inducibilen z 1-(3-Acetil-2,4,6-trihydroksifhenil) etanon 2,4 (DAPG) v modelnem organizmu ''Komagataella phaffii'' (prej poznana kot ''Pichia pastoris''). Najprej so 197bp osrednjega promotorja KpAOX1 fuzirali pod operator ''phlO''. Torej, ko je prisoten DAPG v gojišču se le ta poveže z trnskripcijskim aktivatorjem, ki se veže na opertor, kar omogoči izražanje gena pod promotorjem ''KpAOX1''. Moč promotorjev so karakterizirali z izražanjem EGFP (''angl.'' enhanced green fluorescent protein). Kvasovke v katerih je bil prisoten plazmid z zgoraj opisanim konstruktom so izkazovale več kot &gt;100-krat višjo raven ekspresije EGFP, tudi v odsotnosti induktorja DAPG. Po dodatku DAPG se je fluorescenca povišala za 8-krat. To nakazuje na močno puščanje tega sintetičnega promotorja. Raziskovalci so to težavo rešili tako, da so navzgor nad promotor vstavili genske fragmente v dolžini do 1,6 kb. Tako so zmanjšali puščanje za kar 376-krat medtem, ko se je raven ekspresije ob indukciji zmanjšala le za 1,6-krat. Razloga za puščanje tovrstnih promotorjev sta po navadi dva: endogeni transkripcijski aktivatorji, ki se lahko nahajajo tudi več kot 1kb navzgor od promotorja in pa prepisovanje izven gena (''angl.'' transcriptional readthrough) [1].<br /> <br /> == Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov ==<br /> Kljub temu, da se v nekaterih člankih omenja velik vpliv oddaljenosti TATA-zaporedja od startkodona, ga tu pri svojih eksperimentih raziskovalci skoraj niso [2]. Minimalni sintetični promotor lahko v tem primeru vsebuje le bakterijski operator, TATA-zaporedje in kratek vmesnik. Da bi razširili uporabnost teh promotorjev so avtorji izhodiščnega članka načrtali še močne inducuibilne sintetične promotorje v ''Saccharomyces cerevisiae''. Že izredno kratek promotor z dolžino 110 bp z osrednjim promotorjem ''ScGAL1'' fuziran z operatorjem ''phlO'' je dosegel &gt;100-krat višjo raven ekspresije ob indukciji z DAPG. Ključ do tega uspeha leži v tem, da so TATA-zaporedje postavili takoj ob bakterijski operator [1].<br /> <br /> == Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja ==<br /> Ko so avtorji ugotovili način za zmanjšanje puščanja promotorjev so se odločili, da bodo okarakterizirali še vpliv popnovitev različnih operatorskih regij, na raven izražanja proteina pod takšnim promotorjem. Uporabili so induktorje DAPG, doksiciklin (Dox) in homoserin lakton (HSL), ki se vežejo na operatorje ''phlO'', ''tetO2'' in ''luxO''. Dve ponovitvi operatorja ''phlO'' povečata ekspresijo GFP za &gt;2000-krat, 6 ponovitev operatorske regije pa ob indukciji z DAPG že kar za &gt;3000-krat. Seveda razmerje med številom operatorjev in močjo indukcije ni monotono. <br /> Pri KpHSL-ON stikalu so naleteli na težavo, saj tudi pri 10 ponovitvah ''luxO'' ni prišlo do pričakovanega dviga ravni izražanja. Zato so se avtorji članka odločil, da bodo del ''luxO'' zamenjali z ostalimi ''luxO'' variantami iz bakterije ''Aliivibrio fischeri''. Na tak način so se izognili kriptični aktivaciji promotorja in statistično signifikantno povečali njegovo moč [1].<br /> <br /> == Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev ==<br /> Raziskovalci so uprabili KpDAPG-ON sistem za produkcijo nanotelesa ALX-0171 (gontivimab). Gene za nanotelesa so na C-terminalnem koncu fuzirali s signalno sekvenco paritvenega faktorja alfa (MFα). Za izražanje tega nanotelesa so uporabili 419bp dolg močan promotor DAPG-iSynP, PKpPhl6.0, vsebujoč šest ''phlO'' ponovitev in 61bp dolg vmestnik navzgor od zaporedja-TATA. Izkazalo se je, da je sintetični promotor 5-krat učinkovitejši za tovrstno proizvodnjo nanotelesa, kot bolj komercialno uveljavljen način indukcije z metanolom. <br /> Dokazali so, da je z sintetičnimi inducibilnimi promotorji moč izražati dva različna proteina pod dva različnima promotorjema. To so storili tak, da so v en sev vsatvili zapise za dve nanotelesi ALX-0171 and ALX-0081 pod promotorjema pDAPG-ON in KpTet-ON. Ekspresija je bila uspešna, a le ob dodatku ustreznega induktorja [1].<br /> <br /> == Ekspresijski sistemi brez induktorja ==<br /> Sistemi brez induktorja ali “Inducer-OFF” sistemi so pogosti v industriji, saj se z njimi lahko izognemo stroškom dodajanja induktorja. Tovrstni sistemi delujejo tako, da se ekspresija proteina prične šele, ko induktor odstranimo iz gojišča. Za ta namen so raziskovalci uporabili transkripcijski aktivator PhlTA, ki se deaktivira ob dodatku DAPG. Potem so ga še dodatno prilagodili za ta namen s pomočjo usmerjene evolucije. Najprej so z uporabo PCR mutrali ''phlTA''. Potem so le tega vstavili v vektor, ki je vseboval že predhodno narejen sintetični promotor s šestimi ponovitvami ''phlO'', ki so fuzirane na promotor ''ScGAL''. Zatem so s pomočjo PCR podvrženega mutacijam, ustvarili dve knjižnjici z 93 kloni, ki so jih prečesali za ON/OFF indukcijo z 5 μM DAPG. Rezulatati so pokazali, da je bila ključna mutacija za izboljšavo “Inducer-OFF” sistema PhlTA (E41G). Ko so to varinato vnesli v ''K. phaffii'' je prišlo ob dodatku DAPG do 702-kratne redukcije v primeru 61bp dolgega distančnika pred TATA-zaporedjem in 1572-kratne redukcije v primeru 11bp dolgega distančnika [1].<br /> <br /> == Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==<br /> Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavni protein RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt; iz virusa CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt; . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt; so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C namesto pri 30°C . V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši. <br /> Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBD&lt;sup&gt;om&lt;/sup&gt; proti vezavi na ta protein divjega tipa [1].<br /> <br /> == Zaključek ==<br /> V članku so raziskovalci demonstrirali učinkovite metode za pripravo različnih močnih inducibilnih močnih promotorjev v dveh pomembnih vrstah kvasovk ''Komagataella phaffii'' in ''Saccharomyces cerevisiae''. Dokazali so tudi, da lahko z variacijo števila operatorjev na začetku promotorja variirajo izražanja proteina. Poleg tega so demonstrirali tudi možnosti za proizvodnjo industrijsko pomembnih proteinov s pomočjo tovrstnih promotorjev. <br /> <br /> == Literatura ==<br /> [1] Tominaga, M., Shima, Y., Nozaki, K., Ito, Y., Someda, M., Shoya, Y., Hashii, N., Obata, C., Matsumoto-Kitano, M., Suematsu, K., Matsukawa, T., Hosoya, K., Hashiba, N., Kondo, A., &amp; Ishii, J. (2024b). Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts. Nature Communications, 15(1). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54865-z<br /> <br /> [2] Dvir, S., Velten, L., Sharon, E., Zeevi, D., Carey, L. B., Weinberger, A., &amp; Segal, E. (2013). Deciphering the rules by which 5′-UTR sequences affect protein expression in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(30). https://doi.org/10.1073/pnas.1222534110</div>

Bor Kunstelj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Na%C4%8Drtovanje_mo%C4%8Dnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah&diff=24699 2025-05-04T14:42:21Z

<p>Bor Kunstelj: /* Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov */</p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39702268/ Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts] <br /> <br /> == Uvod == <br /> Promotorji so v sintezni biologiji ključnega pomena za natančno uravnavo ravni izražanja genov. Medtem ko lahko v prokariontih s precejšnjo lahkoto spreminjamo moč promotorja je ta naloga pri evkariontih precej bolj zapletena, saj imajo le te veliko bolj kompleksno delovanje in regulacijo. Tudi promotorji kvasovk so nam še vedno precejšnja uganka, kljub temu da so kvasovke, predvsem ''S. cerevisiae'', že vrsto let eden izmed ključnih modelnih organizmov. Zato se v sintezni biologiji kvasovk, še vedno v precejšnji meri uporabljajo nativni promotorji, ki so dobro raziskani. Alternativa slednjim bi lahko bili inducibilni sintetični promotorji. Raziskovalci so zasnovali številne sintetične osrednje promotorje z nativnimi zgornjimi aktivacijskimi elementi [1].<br /> <br /> == Strategije načrtovanja močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Inducibilni sinetični promotorji vsebujejo dva osnovna gradnika in sicer TATA-zaporedje in zgornje bakterijske operatorje. Te promotorje so optimizirali s tremi metodami. Pred operatorje so vstavili dolgo izolacijsko zaporedje ( &gt; 1-kbp), ki onemogoči neželeno aktivacijo s strani oddaljenih ojačevalcev. Fuzija bakterijskih operatorjev direktno na zaporedje-TATA ojača aktivacijo. Povečevanje ponovitev operatorjev lahko zamnjša puščanje in izboljša raven ekspresije [1].<br /> <br /> == Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Raziskovalci so izdelali sintetični promotor inducibilen z 1-(3-Acetil-2,4,6-trihydroksifhenil) etanon 2,4 (DAPG) v modelnem organizmu ''Komagataella phaffii'' (prej poznana kot ''Pichia pastoris''). Najprej so 197bp osrednjega promotorja KpAOX1 fuzirali pod operator ''phlO''. Torej, ko je prisoten DAPG v gojišču se le ta poveže z trnskripcijskim aktivatorjem, ki se veže na opertor, kar omogoči izražanje gena pod promotorjem ''KpAOX1''. Moč promotorjev so karakterizirali z izražanjem EGFP (''angl.'' enhanced green fluorescent protein). Kvasovke v katerih je bil prisoten plazmid z zgoraj opisanim konstruktom so izkazovale več kot &gt;100-krat višjo raven ekspresije EGFP, tudi v odsotnosti induktorja DAPG. Po dodatku DAPG se je fluorescenca povišala za 8-krat. To nakazuje na močno puščanje tega sintetičnega promotorja. Raziskovalci so to težavo rešili tako, da so navzgor nad promotor vstavili genske fragmente v dolžini do 1,6 kb. Tako so zmanjšali puščanje za kar 376-krat medtem, ko se je raven ekspresije ob indukciji zmanjšala le za 1,6-krat. Razloga za puščanje tovrstnih promotorjev sta po navadi dva: endogeni transkripcijski aktivatorji, ki se lahko nahajajo tudi več kot 1kb navzgor od promotorja in pa prepisovanje izven gena (''angl.'' transcriptional readthrough) [1].<br /> <br /> == Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov ==<br /> Kljub temu, da se v nekaterih člankih omenja velik vpliv oddaljenosti TATA-zaporedja od startkodona, ga tu pri svojih eksperimentih raziskovalci skoraj niso [2]. Minimalni sintetični promotor lahko v tem primeru vsebuje le bakterijski operator, TATA-zaporedje in kratek vmesnik. Da bi razširili uporabnost teh promotorjev so avtorji izhodiščnega članka načrtali še močne inducuibilne sintetične promotorje v ''Saccharomyces cerevisiae''. Že izredno kratek promotor z dolžino 110 bp z osrednjim promotorjem ''ScGAL1'' fuziran z operatorjem ''phlO'' je dosegel &gt;100-krat višjo raven ekspresije ob indukciji z DAPG. Ključ do tega uspeha leži v tem, da so TATA-zaporedje postavili takoj ob bakterijski operator [1].<br /> <br /> == Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja ==<br /> Ko so avtorji ugotovili način za zmanjšanje puščanja promotorjev so se odločili, da bodo okarakterizirali še vpliv popnovitev različnih operatorskih regij, na raven izražanja proteina pod takšnim promotorjem. Uporabili so induktorje DAPG, doksiciklin (Dox) in homoserin lakton (HSL), ki se vežejo na operatorje ''phlO'', ''tetO2'' in ''luxO''. Dve ponovitvi operatorja ''phlO'' povečata ekspresijo GFP za &gt;2000-krat, 6 ponovitev operatorske regije pa ob indukciji z DAPG že kar za &gt;3000-krat. Seveda razmerje med številom operatorjev in močjo indukcije ni monotono. <br /> Pri KpHSL-ON stikalu so naleteli na težavo, saj tudi pri 10 ponovitvah ''luxO'' ni prišlo do pričakovanega dviga ravni izražanja. Zato so se avtorji članka odločil, da bodo del ''luxO'' zamenjali z ostalimi ''luxO'' variantami iz bakterije ''Aliivibrio fischeri''. Na tak način so se izognili kriptični aktivaciji promotorja in statistično signifikantno povečali njegovo moč [1].<br /> <br /> == Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev ==<br /> Raziskovalci so uprabili KpDAPG-ON sistem za produkcijo nanotelesa ALX-0171 (gontivimab). Gene za nanotelesa so na C-terminalnem koncu fuzirali s signalno sekvenco paritvenega faktorja alfa (MFα). Za izražanje tega nanotelesa so uporabili 419bp dolg močan promotor DAPG-iSynP, PKpPhl6.0, vsebujoč šest ''phlO'' ponovitev in 61bp dolg vmestnik navzgor od zaporedja-TATA. Izkazalo se je, da je sintetični promotor 5-krat učinkovitejši za tovrstno proizvodnjo nanotelesa, kot bolj komercialno uveljavljen način indukcije z metanolom. <br /> Dokazali so, da je z sintetičnimi inducibilnimi promotorji moč izražati dva različna proteina pod dva različnima promotorjema. To so storili tak, da so v en sev vsatvili zapise za dve nanotelesi ALX-0171 and ALX-0081 pod promotorjema pDAPG-ON in KpTet-ON. Ekspresija je bila uspešna, a le ob dodatku ustreznega induktorja [1].<br /> <br /> == Ekspresijski sistemi brez induktorja ==<br /> Sistemi brez induktorja ali “Inducer-OFF” sistemi so pogosti v industriji, saj se z njimi lahko izognemo stroškom dodajanja induktorja. Tovrstni sistemi delujejo tako, da se ekspresija proteina prične šele, ko induktor odstranimo iz gojišča. Za ta namen so raziskovalci uporabili transkripcijski aktivator PhlTA, ki se deaktivira ob dodatku DAPG. Potem so ga še dodatno prilagodili za ta namen s pomočjo usmerjene evolucije. Najprej so z uporabo PCR mutrali ''phlTA''. Potem so le tega vstavili v vektor, ki je vseboval že predhodno narejen sintetični promotor s šestimi ponovitvami ''phlO'', ki so fuzirane na promotor ''ScGAL''. Zatem so s pomočjo PCR podvrženega mutacijam, ustvarili dve knjižnjici z 93 kloni, ki so jih prečesali za ON/OFF indukcijo z 5 μM DAPG. Rezulatati so pokazali, da je bila ključna mutacija za izboljšavo “Inducer-OFF” sistema PhlTA (E41G). Ko so to varinato vnesli v ''K. phaffii'' je prišlo ob dodatku DAPG do 702-kratne redukcije v primeru 61bp dolgega distančnika pred TATA-zaporedjem in 1572-kratne redukcije v primeru 11bp dolgega distančnika [1].<br /> <br /> == Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==<br /> Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavni protein RBDom iz virusa CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBDom . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBDom so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C namesto pri 30°C . V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši. <br /> Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBDom proti vezavi na ta protein divjega tipa [1].<br /> <br /> == Zaključek ==<br /> V članku so raziskovalci demonstrirali učinkovite metode za pripravo različnih močnih inducibilnih močnih promotorjev v dveh pomembnih vrstah kvasovk ''Komagataella phaffii'' in ''Saccharomyces cerevisiae''. Dokazali so tudi, da lahko z variacijo števila operatorjev na začetku promotorja variirajo izražanja proteina. Poleg tega so demonstrirali tudi možnosti za proizvodnjo industrijsko pomembnih proteinov s pomočjo tovrstnih promotorjev. <br /> <br /> == Literatura ==<br /> [1] Tominaga, M., Shima, Y., Nozaki, K., Ito, Y., Someda, M., Shoya, Y., Hashii, N., Obata, C., Matsumoto-Kitano, M., Suematsu, K., Matsukawa, T., Hosoya, K., Hashiba, N., Kondo, A., &amp; Ishii, J. (2024b). Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts. Nature Communications, 15(1). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54865-z<br /> <br /> [2] Dvir, S., Velten, L., Sharon, E., Zeevi, D., Carey, L. B., Weinberger, A., &amp; Segal, E. (2013). Deciphering the rules by which 5′-UTR sequences affect protein expression in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(30). https://doi.org/10.1073/pnas.1222534110</div>

Bor Kunstelj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Na%C4%8Drtovanje_mo%C4%8Dnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah&diff=24698 2025-05-04T14:37:26Z

<p>Bor Kunstelj: /* Uvod */</p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39702268/ Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts] <br /> <br /> == Uvod == <br /> Promotorji so v sintezni biologiji ključnega pomena za natančno uravnavo ravni izražanja genov. Medtem ko lahko v prokariontih s precejšnjo lahkoto spreminjamo moč promotorja je ta naloga pri evkariontih precej bolj zapletena, saj imajo le te veliko bolj kompleksno delovanje in regulacijo. Tudi promotorji kvasovk so nam še vedno precejšnja uganka, kljub temu da so kvasovke, predvsem ''S. cerevisiae'', že vrsto let eden izmed ključnih modelnih organizmov. Zato se v sintezni biologiji kvasovk, še vedno v precejšnji meri uporabljajo nativni promotorji, ki so dobro raziskani. Alternativa slednjim bi lahko bili inducibilni sintetični promotorji. Raziskovalci so zasnovali številne sintetične osrednje promotorje z nativnimi zgornjimi aktivacijskimi elementi [1].<br /> <br /> == Strategije načrtovanja močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Inducibilni sinetični promotorji vsebujejo dva osnovna gradnika in sicer TATA-zaporedje in zgornje bakterijske operatorje. Te promotorje so optimizirali s tremi metodami. Pred operatorje so vstavili dolgo izolacijsko zaporedje ( &gt; 1-kbp), ki onemogoči neželeno aktivacijo s strani oddaljenih ojačevalcev. Fuzija bakterijskih operatorjev direktno na zaporedje-TATA ojača aktivacijo. Povečevanje ponovitev operatorjev lahko zamnjša puščanje in izboljša raven ekspresije [1].<br /> <br /> == Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Raziskovalci so izdelali sintetični promotor inducibilen z 1-(3-Acetil-2,4,6-trihydroksifhenil) etanon 2,4 (DAPG) v modelnem organizmu ''Komagataella phaffii'' (prej poznana kot ''Pichia pastoris''). Najprej so 197bp osrednjega promotorja KpAOX1 fuzirali pod operator ''phlO''. Torej, ko je prisoten DAPG v gojišču se le ta poveže z trnskripcijskim aktivatorjem, ki se veže na opertor, kar omogoči izražanje gena pod promotorjem ''KpAOX1''. Moč promotorjev so karakterizirali z izražanjem EGFP (''angl.'' enhanced green fluorescent protein). Kvasovke v katerih je bil prisoten plazmid z zgoraj opisanim konstruktom so izkazovale več kot &gt;100-krat višjo raven ekspresije EGFP, tudi v odsotnosti induktorja DAPG. Po dodatku DAPG se je fluorescenca povišala za 8-krat. To nakazuje na močno puščanje tega sintetičnega promotorja. Raziskovalci so to težavo rešili tako, da so navzgor nad promotor vstavili genske fragmente v dolžini do 1,6 kb. Tako so zmanjšali puščanje za kar 376-krat medtem, ko se je raven ekspresije ob indukciji zmanjšala le za 1,6-krat. Razloga za puščanje tovrstnih promotorjev sta po navadi dva: endogeni transkripcijski aktivatorji, ki se lahko nahajajo tudi več kot 1kb navzgor od promotorja in pa prepisovanje izven gena (''angl.'' transcriptional readthrough) [1].<br /> <br /> == Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov ==<br /> Kljub temu, da se v nekaterih člankih omenja velik vpliv oddaljenosti TATA-zaporedja od startkodona, ga tu pri svojih eksperimentih raziskovalci skoraj niso [2]. Minimalni sintetični promotor lahko v tem primeru vsebuje le bakterijski operator, TATA-zaporedje in kratek vmesnik. Da bi razširili uporabnost teh promotorjev so avtorji izhodiščnega članka načrtali še močne inducuibilne sintetične promotorje v ''Saccharomyces cerevisiae''. Že izredno kratek promotor z dolžino 110 bp z opsrednjim promotorjem ''ScGAL1'' fuziran z operatorjem ''phlO'' je dosegel &gt;100-krat višjo raven ekspresije ob indukciji z DAPG. Ključ do tega uspeha leži v tem, da so TATA-zaporedje postavili takoj ob bakterijski operator [1].<br /> <br /> == Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja ==<br /> Ko so avtorji ugotovili način za zmanjšanje puščanja promotorjev so se odločili, da bodo okarakterizirali še vpliv popnovitev različnih operatorskih regij, na raven izražanja proteina pod takšnim promotorjem. Uporabili so induktorje DAPG, doksiciklin (Dox) in homoserin lakton (HSL), ki se vežejo na operatorje ''phlO'', ''tetO2'' in ''luxO''. Dve ponovitvi operatorja ''phlO'' povečata ekspresijo GFP za &gt;2000-krat, 6 ponovitev operatorske regije pa ob indukciji z DAPG že kar za &gt;3000-krat. Seveda razmerje med številom operatorjev in močjo indukcije ni monotono. <br /> Pri KpHSL-ON stikalu so naleteli na težavo, saj tudi pri 10 ponovitvah ''luxO'' ni prišlo do pričakovanega dviga ravni izražanja. Zato so se avtorji članka odločil, da bodo del ''luxO'' zamenjali z ostalimi ''luxO'' variantami iz bakterije ''Aliivibrio fischeri''. Na tak način so se izognili kriptični aktivaciji promotorja in statistično signifikantno povečali njegovo moč [1].<br /> <br /> == Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev ==<br /> Raziskovalci so uprabili KpDAPG-ON sistem za produkcijo nanotelesa ALX-0171 (gontivimab). Gene za nanotelesa so na C-terminalnem koncu fuzirali s signalno sekvenco paritvenega faktorja alfa (MFα). Za izražanje tega nanotelesa so uporabili 419bp dolg močan promotor DAPG-iSynP, PKpPhl6.0, vsebujoč šest ''phlO'' ponovitev in 61bp dolg vmestnik navzgor od zaporedja-TATA. Izkazalo se je, da je sintetični promotor 5-krat učinkovitejši za tovrstno proizvodnjo nanotelesa, kot bolj komercialno uveljavljen način indukcije z metanolom. <br /> Dokazali so, da je z sintetičnimi inducibilnimi promotorji moč izražati dva različna proteina pod dva različnima promotorjema. To so storili tak, da so v en sev vsatvili zapise za dve nanotelesi ALX-0171 and ALX-0081 pod promotorjema pDAPG-ON in KpTet-ON. Ekspresija je bila uspešna, a le ob dodatku ustreznega induktorja [1].<br /> <br /> == Ekspresijski sistemi brez induktorja ==<br /> Sistemi brez induktorja ali “Inducer-OFF” sistemi so pogosti v industriji, saj se z njimi lahko izognemo stroškom dodajanja induktorja. Tovrstni sistemi delujejo tako, da se ekspresija proteina prične šele, ko induktor odstranimo iz gojišča. Za ta namen so raziskovalci uporabili transkripcijski aktivator PhlTA, ki se deaktivira ob dodatku DAPG. Potem so ga še dodatno prilagodili za ta namen s pomočjo usmerjene evolucije. Najprej so z uporabo PCR mutrali ''phlTA''. Potem so le tega vstavili v vektor, ki je vseboval že predhodno narejen sintetični promotor s šestimi ponovitvami ''phlO'', ki so fuzirane na promotor ''ScGAL''. Zatem so s pomočjo PCR podvrženega mutacijam, ustvarili dve knjižnjici z 93 kloni, ki so jih prečesali za ON/OFF indukcijo z 5 μM DAPG. Rezulatati so pokazali, da je bila ključna mutacija za izboljšavo “Inducer-OFF” sistema PhlTA (E41G). Ko so to varinato vnesli v ''K. phaffii'' je prišlo ob dodatku DAPG do 702-kratne redukcije v primeru 61bp dolgega distančnika pred TATA-zaporedjem in 1572-kratne redukcije v primeru 11bp dolgega distančnika [1].<br /> <br /> == Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==<br /> Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavni protein RBDom iz virusa CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBDom . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBDom so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C namesto pri 30°C . V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši. <br /> Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBDom proti vezavi na ta protein divjega tipa [1].<br /> <br /> == Zaključek ==<br /> V članku so raziskovalci demonstrirali učinkovite metode za pripravo različnih močnih inducibilnih močnih promotorjev v dveh pomembnih vrstah kvasovk ''Komagataella phaffii'' in ''Saccharomyces cerevisiae''. Dokazali so tudi, da lahko z variacijo števila operatorjev na začetku promotorja variirajo izražanja proteina. Poleg tega so demonstrirali tudi možnosti za proizvodnjo industrijsko pomembnih proteinov s pomočjo tovrstnih promotorjev. <br /> <br /> == Literatura ==<br /> [1] Tominaga, M., Shima, Y., Nozaki, K., Ito, Y., Someda, M., Shoya, Y., Hashii, N., Obata, C., Matsumoto-Kitano, M., Suematsu, K., Matsukawa, T., Hosoya, K., Hashiba, N., Kondo, A., &amp; Ishii, J. (2024b). Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts. Nature Communications, 15(1). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54865-z<br /> <br /> [2] Dvir, S., Velten, L., Sharon, E., Zeevi, D., Carey, L. B., Weinberger, A., &amp; Segal, E. (2013). Deciphering the rules by which 5′-UTR sequences affect protein expression in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(30). https://doi.org/10.1073/pnas.1222534110</div>

Bor Kunstelj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Na%C4%8Drtovanje_mo%C4%8Dnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah&diff=24697 2025-05-04T14:37:12Z

<p>Bor Kunstelj: /* Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja */</p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39702268/ Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts] <br /> <br /> == Uvod == <br /> Promotorji so v sintezni biologiji ključnega pomena za natančno uravnavo ravni izražanja genov. Medtem ko lahko v prokariontih s precejšnjo lahkoto spreminjamo moč promotorja je ta naloga pri evkariontih precej bolj zapletena, saj imajo le te veliko bolj kompleksno delovanje in regulacijo. Tudi promotorji kvasovk so nam še vedno precejšnja uganka, kljub temu da so kvasovke, predvsem ''S. cerevisiae'', že vrsto let eden izmed ključnih modelnih organizmov. Zato se v sintezni biologiji kvasovk, še vedno v precejšnji meri uporabljajo nativni promotorji, ki so dobro raziskani. Alternativa slednjim bi lahko bili inducibilni sintetični promotorji. Raziskovalci so zasnovali številne sintetične osrednje promotorje z nativnimi zgornjimi aktivacijskimi elementi[1].<br /> <br /> == Strategije načrtovanja močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Inducibilni sinetični promotorji vsebujejo dva osnovna gradnika in sicer TATA-zaporedje in zgornje bakterijske operatorje. Te promotorje so optimizirali s tremi metodami. Pred operatorje so vstavili dolgo izolacijsko zaporedje ( &gt; 1-kbp), ki onemogoči neželeno aktivacijo s strani oddaljenih ojačevalcev. Fuzija bakterijskih operatorjev direktno na zaporedje-TATA ojača aktivacijo. Povečevanje ponovitev operatorjev lahko zamnjša puščanje in izboljša raven ekspresije [1].<br /> <br /> == Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Raziskovalci so izdelali sintetični promotor inducibilen z 1-(3-Acetil-2,4,6-trihydroksifhenil) etanon 2,4 (DAPG) v modelnem organizmu ''Komagataella phaffii'' (prej poznana kot ''Pichia pastoris''). Najprej so 197bp osrednjega promotorja KpAOX1 fuzirali pod operator ''phlO''. Torej, ko je prisoten DAPG v gojišču se le ta poveže z trnskripcijskim aktivatorjem, ki se veže na opertor, kar omogoči izražanje gena pod promotorjem ''KpAOX1''. Moč promotorjev so karakterizirali z izražanjem EGFP (''angl.'' enhanced green fluorescent protein). Kvasovke v katerih je bil prisoten plazmid z zgoraj opisanim konstruktom so izkazovale več kot &gt;100-krat višjo raven ekspresije EGFP, tudi v odsotnosti induktorja DAPG. Po dodatku DAPG se je fluorescenca povišala za 8-krat. To nakazuje na močno puščanje tega sintetičnega promotorja. Raziskovalci so to težavo rešili tako, da so navzgor nad promotor vstavili genske fragmente v dolžini do 1,6 kb. Tako so zmanjšali puščanje za kar 376-krat medtem, ko se je raven ekspresije ob indukciji zmanjšala le za 1,6-krat. Razloga za puščanje tovrstnih promotorjev sta po navadi dva: endogeni transkripcijski aktivatorji, ki se lahko nahajajo tudi več kot 1kb navzgor od promotorja in pa prepisovanje izven gena (''angl.'' transcriptional readthrough) [1].<br /> <br /> == Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov ==<br /> Kljub temu, da se v nekaterih člankih omenja velik vpliv oddaljenosti TATA-zaporedja od startkodona, ga tu pri svojih eksperimentih raziskovalci skoraj niso [2]. Minimalni sintetični promotor lahko v tem primeru vsebuje le bakterijski operator, TATA-zaporedje in kratek vmesnik. Da bi razširili uporabnost teh promotorjev so avtorji izhodiščnega članka načrtali še močne inducuibilne sintetične promotorje v ''Saccharomyces cerevisiae''. Že izredno kratek promotor z dolžino 110 bp z opsrednjim promotorjem ''ScGAL1'' fuziran z operatorjem ''phlO'' je dosegel &gt;100-krat višjo raven ekspresije ob indukciji z DAPG. Ključ do tega uspeha leži v tem, da so TATA-zaporedje postavili takoj ob bakterijski operator [1].<br /> <br /> == Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja ==<br /> Ko so avtorji ugotovili način za zmanjšanje puščanja promotorjev so se odločili, da bodo okarakterizirali še vpliv popnovitev različnih operatorskih regij, na raven izražanja proteina pod takšnim promotorjem. Uporabili so induktorje DAPG, doksiciklin (Dox) in homoserin lakton (HSL), ki se vežejo na operatorje ''phlO'', ''tetO2'' in ''luxO''. Dve ponovitvi operatorja ''phlO'' povečata ekspresijo GFP za &gt;2000-krat, 6 ponovitev operatorske regije pa ob indukciji z DAPG že kar za &gt;3000-krat. Seveda razmerje med številom operatorjev in močjo indukcije ni monotono. <br /> Pri KpHSL-ON stikalu so naleteli na težavo, saj tudi pri 10 ponovitvah ''luxO'' ni prišlo do pričakovanega dviga ravni izražanja. Zato so se avtorji članka odločil, da bodo del ''luxO'' zamenjali z ostalimi ''luxO'' variantami iz bakterije ''Aliivibrio fischeri''. Na tak način so se izognili kriptični aktivaciji promotorja in statistično signifikantno povečali njegovo moč [1].<br /> <br /> == Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev ==<br /> Raziskovalci so uprabili KpDAPG-ON sistem za produkcijo nanotelesa ALX-0171 (gontivimab). Gene za nanotelesa so na C-terminalnem koncu fuzirali s signalno sekvenco paritvenega faktorja alfa (MFα). Za izražanje tega nanotelesa so uporabili 419bp dolg močan promotor DAPG-iSynP, PKpPhl6.0, vsebujoč šest ''phlO'' ponovitev in 61bp dolg vmestnik navzgor od zaporedja-TATA. Izkazalo se je, da je sintetični promotor 5-krat učinkovitejši za tovrstno proizvodnjo nanotelesa, kot bolj komercialno uveljavljen način indukcije z metanolom. <br /> Dokazali so, da je z sintetičnimi inducibilnimi promotorji moč izražati dva različna proteina pod dva različnima promotorjema. To so storili tak, da so v en sev vsatvili zapise za dve nanotelesi ALX-0171 and ALX-0081 pod promotorjema pDAPG-ON in KpTet-ON. Ekspresija je bila uspešna, a le ob dodatku ustreznega induktorja [1].<br /> <br /> == Ekspresijski sistemi brez induktorja ==<br /> Sistemi brez induktorja ali “Inducer-OFF” sistemi so pogosti v industriji, saj se z njimi lahko izognemo stroškom dodajanja induktorja. Tovrstni sistemi delujejo tako, da se ekspresija proteina prične šele, ko induktor odstranimo iz gojišča. Za ta namen so raziskovalci uporabili transkripcijski aktivator PhlTA, ki se deaktivira ob dodatku DAPG. Potem so ga še dodatno prilagodili za ta namen s pomočjo usmerjene evolucije. Najprej so z uporabo PCR mutrali ''phlTA''. Potem so le tega vstavili v vektor, ki je vseboval že predhodno narejen sintetični promotor s šestimi ponovitvami ''phlO'', ki so fuzirane na promotor ''ScGAL''. Zatem so s pomočjo PCR podvrženega mutacijam, ustvarili dve knjižnjici z 93 kloni, ki so jih prečesali za ON/OFF indukcijo z 5 μM DAPG. Rezulatati so pokazali, da je bila ključna mutacija za izboljšavo “Inducer-OFF” sistema PhlTA (E41G). Ko so to varinato vnesli v ''K. phaffii'' je prišlo ob dodatku DAPG do 702-kratne redukcije v primeru 61bp dolgega distančnika pred TATA-zaporedjem in 1572-kratne redukcije v primeru 11bp dolgega distančnika [1].<br /> <br /> == Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==<br /> Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavni protein RBDom iz virusa CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBDom . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBDom so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C namesto pri 30°C . V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši. <br /> Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBDom proti vezavi na ta protein divjega tipa [1].<br /> <br /> == Zaključek ==<br /> V članku so raziskovalci demonstrirali učinkovite metode za pripravo različnih močnih inducibilnih močnih promotorjev v dveh pomembnih vrstah kvasovk ''Komagataella phaffii'' in ''Saccharomyces cerevisiae''. Dokazali so tudi, da lahko z variacijo števila operatorjev na začetku promotorja variirajo izražanja proteina. Poleg tega so demonstrirali tudi možnosti za proizvodnjo industrijsko pomembnih proteinov s pomočjo tovrstnih promotorjev. <br /> <br /> == Literatura ==<br /> [1] Tominaga, M., Shima, Y., Nozaki, K., Ito, Y., Someda, M., Shoya, Y., Hashii, N., Obata, C., Matsumoto-Kitano, M., Suematsu, K., Matsukawa, T., Hosoya, K., Hashiba, N., Kondo, A., &amp; Ishii, J. (2024b). Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts. Nature Communications, 15(1). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54865-z<br /> <br /> [2] Dvir, S., Velten, L., Sharon, E., Zeevi, D., Carey, L. B., Weinberger, A., &amp; Segal, E. (2013). Deciphering the rules by which 5′-UTR sequences affect protein expression in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(30). https://doi.org/10.1073/pnas.1222534110</div>

Bor Kunstelj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Na%C4%8Drtovanje_mo%C4%8Dnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah&diff=24696 2025-05-04T14:36:58Z

<p>Bor Kunstelj: /* Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev */</p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39702268/ Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts] <br /> <br /> == Uvod == <br /> Promotorji so v sintezni biologiji ključnega pomena za natančno uravnavo ravni izražanja genov. Medtem ko lahko v prokariontih s precejšnjo lahkoto spreminjamo moč promotorja je ta naloga pri evkariontih precej bolj zapletena, saj imajo le te veliko bolj kompleksno delovanje in regulacijo. Tudi promotorji kvasovk so nam še vedno precejšnja uganka, kljub temu da so kvasovke, predvsem ''S. cerevisiae'', že vrsto let eden izmed ključnih modelnih organizmov. Zato se v sintezni biologiji kvasovk, še vedno v precejšnji meri uporabljajo nativni promotorji, ki so dobro raziskani. Alternativa slednjim bi lahko bili inducibilni sintetični promotorji. Raziskovalci so zasnovali številne sintetične osrednje promotorje z nativnimi zgornjimi aktivacijskimi elementi[1].<br /> <br /> == Strategije načrtovanja močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Inducibilni sinetični promotorji vsebujejo dva osnovna gradnika in sicer TATA-zaporedje in zgornje bakterijske operatorje. Te promotorje so optimizirali s tremi metodami. Pred operatorje so vstavili dolgo izolacijsko zaporedje ( &gt; 1-kbp), ki onemogoči neželeno aktivacijo s strani oddaljenih ojačevalcev. Fuzija bakterijskih operatorjev direktno na zaporedje-TATA ojača aktivacijo. Povečevanje ponovitev operatorjev lahko zamnjša puščanje in izboljša raven ekspresije [1].<br /> <br /> == Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Raziskovalci so izdelali sintetični promotor inducibilen z 1-(3-Acetil-2,4,6-trihydroksifhenil) etanon 2,4 (DAPG) v modelnem organizmu ''Komagataella phaffii'' (prej poznana kot ''Pichia pastoris''). Najprej so 197bp osrednjega promotorja KpAOX1 fuzirali pod operator ''phlO''. Torej, ko je prisoten DAPG v gojišču se le ta poveže z trnskripcijskim aktivatorjem, ki se veže na opertor, kar omogoči izražanje gena pod promotorjem ''KpAOX1''. Moč promotorjev so karakterizirali z izražanjem EGFP (''angl.'' enhanced green fluorescent protein). Kvasovke v katerih je bil prisoten plazmid z zgoraj opisanim konstruktom so izkazovale več kot &gt;100-krat višjo raven ekspresije EGFP, tudi v odsotnosti induktorja DAPG. Po dodatku DAPG se je fluorescenca povišala za 8-krat. To nakazuje na močno puščanje tega sintetičnega promotorja. Raziskovalci so to težavo rešili tako, da so navzgor nad promotor vstavili genske fragmente v dolžini do 1,6 kb. Tako so zmanjšali puščanje za kar 376-krat medtem, ko se je raven ekspresije ob indukciji zmanjšala le za 1,6-krat. Razloga za puščanje tovrstnih promotorjev sta po navadi dva: endogeni transkripcijski aktivatorji, ki se lahko nahajajo tudi več kot 1kb navzgor od promotorja in pa prepisovanje izven gena (''angl.'' transcriptional readthrough) [1].<br /> <br /> == Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov ==<br /> Kljub temu, da se v nekaterih člankih omenja velik vpliv oddaljenosti TATA-zaporedja od startkodona, ga tu pri svojih eksperimentih raziskovalci skoraj niso [2]. Minimalni sintetični promotor lahko v tem primeru vsebuje le bakterijski operator, TATA-zaporedje in kratek vmesnik. Da bi razširili uporabnost teh promotorjev so avtorji izhodiščnega članka načrtali še močne inducuibilne sintetične promotorje v ''Saccharomyces cerevisiae''. Že izredno kratek promotor z dolžino 110 bp z opsrednjim promotorjem ''ScGAL1'' fuziran z operatorjem ''phlO'' je dosegel &gt;100-krat višjo raven ekspresije ob indukciji z DAPG. Ključ do tega uspeha leži v tem, da so TATA-zaporedje postavili takoj ob bakterijski operator [1].<br /> <br /> == Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja ==<br /> Ko so avtorji ugotovili način za zmanjšanje puščanja promotorjev so se odločili, da bodo okarakterizirali še vpliv popnovitev različnih operatorskih regij, na raven izražanja proteina pod takšnim promotorjem. Uporabili so induktorje DAPG, doksiciklin (Dox) in homoserin lakton (HSL), ki se vežejo na operatorje ''phlO'', ''tetO2'' in ''luxO''. Dve ponovitvi operatorja ''phlO'' povečata ekspresijo GFP za &gt;2000-krat, 6 ponovitev operatorske regije pa ob indukciji z DAPG že kar za &gt;3000-krat. Seveda razmerje med številom operatorjev in močjo indukcije ni monotono. <br /> Pri KpHSL-ON stikalu so naleteli na težavo, saj tudi pri 10 ponovitvah ''luxO'' ni prišlo do pričakovanega dviga ravni izražanja. Zato so se avtorji članka odločil, da bodo del ''luxO'' zamenjali z ostalimi ''luxO'' variantami iz bakterije ''Aliivibrio fischeri''. Na tak način so se izognili kriptični aktivaciji promotorja in statistično signifikantno povečali njegovo moč.<br /> <br /> <br /> == Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev ==<br /> Raziskovalci so uprabili KpDAPG-ON sistem za produkcijo nanotelesa ALX-0171 (gontivimab). Gene za nanotelesa so na C-terminalnem koncu fuzirali s signalno sekvenco paritvenega faktorja alfa (MFα). Za izražanje tega nanotelesa so uporabili 419bp dolg močan promotor DAPG-iSynP, PKpPhl6.0, vsebujoč šest ''phlO'' ponovitev in 61bp dolg vmestnik navzgor od zaporedja-TATA. Izkazalo se je, da je sintetični promotor 5-krat učinkovitejši za tovrstno proizvodnjo nanotelesa, kot bolj komercialno uveljavljen način indukcije z metanolom. <br /> Dokazali so, da je z sintetičnimi inducibilnimi promotorji moč izražati dva različna proteina pod dva različnima promotorjema. To so storili tak, da so v en sev vsatvili zapise za dve nanotelesi ALX-0171 and ALX-0081 pod promotorjema pDAPG-ON in KpTet-ON. Ekspresija je bila uspešna, a le ob dodatku ustreznega induktorja [1].<br /> <br /> == Ekspresijski sistemi brez induktorja ==<br /> Sistemi brez induktorja ali “Inducer-OFF” sistemi so pogosti v industriji, saj se z njimi lahko izognemo stroškom dodajanja induktorja. Tovrstni sistemi delujejo tako, da se ekspresija proteina prične šele, ko induktor odstranimo iz gojišča. Za ta namen so raziskovalci uporabili transkripcijski aktivator PhlTA, ki se deaktivira ob dodatku DAPG. Potem so ga še dodatno prilagodili za ta namen s pomočjo usmerjene evolucije. Najprej so z uporabo PCR mutrali ''phlTA''. Potem so le tega vstavili v vektor, ki je vseboval že predhodno narejen sintetični promotor s šestimi ponovitvami ''phlO'', ki so fuzirane na promotor ''ScGAL''. Zatem so s pomočjo PCR podvrženega mutacijam, ustvarili dve knjižnjici z 93 kloni, ki so jih prečesali za ON/OFF indukcijo z 5 μM DAPG. Rezulatati so pokazali, da je bila ključna mutacija za izboljšavo “Inducer-OFF” sistema PhlTA (E41G). Ko so to varinato vnesli v ''K. phaffii'' je prišlo ob dodatku DAPG do 702-kratne redukcije v primeru 61bp dolgega distančnika pred TATA-zaporedjem in 1572-kratne redukcije v primeru 11bp dolgega distančnika [1].<br /> <br /> == Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==<br /> Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavni protein RBDom iz virusa CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBDom . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBDom so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C namesto pri 30°C . V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši. <br /> Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBDom proti vezavi na ta protein divjega tipa [1].<br /> <br /> == Zaključek ==<br /> V članku so raziskovalci demonstrirali učinkovite metode za pripravo različnih močnih inducibilnih močnih promotorjev v dveh pomembnih vrstah kvasovk ''Komagataella phaffii'' in ''Saccharomyces cerevisiae''. Dokazali so tudi, da lahko z variacijo števila operatorjev na začetku promotorja variirajo izražanja proteina. Poleg tega so demonstrirali tudi možnosti za proizvodnjo industrijsko pomembnih proteinov s pomočjo tovrstnih promotorjev. <br /> <br /> == Literatura ==<br /> [1] Tominaga, M., Shima, Y., Nozaki, K., Ito, Y., Someda, M., Shoya, Y., Hashii, N., Obata, C., Matsumoto-Kitano, M., Suematsu, K., Matsukawa, T., Hosoya, K., Hashiba, N., Kondo, A., &amp; Ishii, J. (2024b). Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts. Nature Communications, 15(1). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54865-z<br /> <br /> [2] Dvir, S., Velten, L., Sharon, E., Zeevi, D., Carey, L. B., Weinberger, A., &amp; Segal, E. (2013). Deciphering the rules by which 5′-UTR sequences affect protein expression in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(30). https://doi.org/10.1073/pnas.1222534110</div>

Bor Kunstelj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Na%C4%8Drtovanje_mo%C4%8Dnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah&diff=24695 2025-05-04T14:36:40Z

<p>Bor Kunstelj: /* Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo */</p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39702268/ Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts] <br /> <br /> == Uvod == <br /> Promotorji so v sintezni biologiji ključnega pomena za natančno uravnavo ravni izražanja genov. Medtem ko lahko v prokariontih s precejšnjo lahkoto spreminjamo moč promotorja je ta naloga pri evkariontih precej bolj zapletena, saj imajo le te veliko bolj kompleksno delovanje in regulacijo. Tudi promotorji kvasovk so nam še vedno precejšnja uganka, kljub temu da so kvasovke, predvsem ''S. cerevisiae'', že vrsto let eden izmed ključnih modelnih organizmov. Zato se v sintezni biologiji kvasovk, še vedno v precejšnji meri uporabljajo nativni promotorji, ki so dobro raziskani. Alternativa slednjim bi lahko bili inducibilni sintetični promotorji. Raziskovalci so zasnovali številne sintetične osrednje promotorje z nativnimi zgornjimi aktivacijskimi elementi[1].<br /> <br /> == Strategije načrtovanja močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Inducibilni sinetični promotorji vsebujejo dva osnovna gradnika in sicer TATA-zaporedje in zgornje bakterijske operatorje. Te promotorje so optimizirali s tremi metodami. Pred operatorje so vstavili dolgo izolacijsko zaporedje ( &gt; 1-kbp), ki onemogoči neželeno aktivacijo s strani oddaljenih ojačevalcev. Fuzija bakterijskih operatorjev direktno na zaporedje-TATA ojača aktivacijo. Povečevanje ponovitev operatorjev lahko zamnjša puščanje in izboljša raven ekspresije [1].<br /> <br /> == Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Raziskovalci so izdelali sintetični promotor inducibilen z 1-(3-Acetil-2,4,6-trihydroksifhenil) etanon 2,4 (DAPG) v modelnem organizmu ''Komagataella phaffii'' (prej poznana kot ''Pichia pastoris''). Najprej so 197bp osrednjega promotorja KpAOX1 fuzirali pod operator ''phlO''. Torej, ko je prisoten DAPG v gojišču se le ta poveže z trnskripcijskim aktivatorjem, ki se veže na opertor, kar omogoči izražanje gena pod promotorjem ''KpAOX1''. Moč promotorjev so karakterizirali z izražanjem EGFP (''angl.'' enhanced green fluorescent protein). Kvasovke v katerih je bil prisoten plazmid z zgoraj opisanim konstruktom so izkazovale več kot &gt;100-krat višjo raven ekspresije EGFP, tudi v odsotnosti induktorja DAPG. Po dodatku DAPG se je fluorescenca povišala za 8-krat. To nakazuje na močno puščanje tega sintetičnega promotorja. Raziskovalci so to težavo rešili tako, da so navzgor nad promotor vstavili genske fragmente v dolžini do 1,6 kb. Tako so zmanjšali puščanje za kar 376-krat medtem, ko se je raven ekspresije ob indukciji zmanjšala le za 1,6-krat. Razloga za puščanje tovrstnih promotorjev sta po navadi dva: endogeni transkripcijski aktivatorji, ki se lahko nahajajo tudi več kot 1kb navzgor od promotorja in pa prepisovanje izven gena (''angl.'' transcriptional readthrough) [1].<br /> <br /> == Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov ==<br /> Kljub temu, da se v nekaterih člankih omenja velik vpliv oddaljenosti TATA-zaporedja od startkodona, ga tu pri svojih eksperimentih raziskovalci skoraj niso [2]. Minimalni sintetični promotor lahko v tem primeru vsebuje le bakterijski operator, TATA-zaporedje in kratek vmesnik. Da bi razširili uporabnost teh promotorjev so avtorji izhodiščnega članka načrtali še močne inducuibilne sintetične promotorje v ''Saccharomyces cerevisiae''. Že izredno kratek promotor z dolžino 110 bp z opsrednjim promotorjem ''ScGAL1'' fuziran z operatorjem ''phlO'' je dosegel &gt;100-krat višjo raven ekspresije ob indukciji z DAPG. Ključ do tega uspeha leži v tem, da so TATA-zaporedje postavili takoj ob bakterijski operator [1].<br /> <br /> == Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja ==<br /> Ko so avtorji ugotovili način za zmanjšanje puščanja promotorjev so se odločili, da bodo okarakterizirali še vpliv popnovitev različnih operatorskih regij, na raven izražanja proteina pod takšnim promotorjem. Uporabili so induktorje DAPG, doksiciklin (Dox) in homoserin lakton (HSL), ki se vežejo na operatorje ''phlO'', ''tetO2'' in ''luxO''. Dve ponovitvi operatorja ''phlO'' povečata ekspresijo GFP za &gt;2000-krat, 6 ponovitev operatorske regije pa ob indukciji z DAPG že kar za &gt;3000-krat. Seveda razmerje med številom operatorjev in močjo indukcije ni monotono. <br /> Pri KpHSL-ON stikalu so naleteli na težavo, saj tudi pri 10 ponovitvah ''luxO'' ni prišlo do pričakovanega dviga ravni izražanja. Zato so se avtorji članka odločil, da bodo del ''luxO'' zamenjali z ostalimi ''luxO'' variantami iz bakterije ''Aliivibrio fischeri''. Na tak način so se izognili kriptični aktivaciji promotorja in statistično signifikantno povečali njegovo moč.<br /> <br /> <br /> == Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev ==<br /> Raziskovalci so uprabili KpDAPG-ON sistem za produkcijo nanotelesa ALX-0171 (gontivimab). Gene za nanotelesa so na C-terminalnem koncu fuzirali s signalno sekvenco paritvenega faktorja alfa (MFα). Za izražanje tega nanotelesa so uporabili 419bp dolg močan promotor DAPG-iSynP, PKpPhl6.0, vsebujoč šest ''phlO'' ponovitev in 61bp dolg vmestnik navzgor od zaporedja-TATA. Izkazalo se je, da je sintetični promotor 5-krat učinkovitejši za tovrstno proizvodnjo nanotelesa, kot bolj komercialno uveljavljen način indukcije z metanolom. <br /> Dokazali so, da je z sintetičnimi inducibilnimi promotorji moč izražati dva različna proteina pod dva različnima promotorjema. To so storili tak, da so v en sev vsatvili zapise za dve nanotelesi ALX-0171 and ALX-0081 pod promotorjema pDAPG-ON in KpTet-ON. Ekspresija je bila uspešna, a le ob dodatku ustreznega induktorja. <br /> <br /> == Ekspresijski sistemi brez induktorja ==<br /> Sistemi brez induktorja ali “Inducer-OFF” sistemi so pogosti v industriji, saj se z njimi lahko izognemo stroškom dodajanja induktorja. Tovrstni sistemi delujejo tako, da se ekspresija proteina prične šele, ko induktor odstranimo iz gojišča. Za ta namen so raziskovalci uporabili transkripcijski aktivator PhlTA, ki se deaktivira ob dodatku DAPG. Potem so ga še dodatno prilagodili za ta namen s pomočjo usmerjene evolucije. Najprej so z uporabo PCR mutrali ''phlTA''. Potem so le tega vstavili v vektor, ki je vseboval že predhodno narejen sintetični promotor s šestimi ponovitvami ''phlO'', ki so fuzirane na promotor ''ScGAL''. Zatem so s pomočjo PCR podvrženega mutacijam, ustvarili dve knjižnjici z 93 kloni, ki so jih prečesali za ON/OFF indukcijo z 5 μM DAPG. Rezulatati so pokazali, da je bila ključna mutacija za izboljšavo “Inducer-OFF” sistema PhlTA (E41G). Ko so to varinato vnesli v ''K. phaffii'' je prišlo ob dodatku DAPG do 702-kratne redukcije v primeru 61bp dolgega distančnika pred TATA-zaporedjem in 1572-kratne redukcije v primeru 11bp dolgega distančnika [1].<br /> <br /> == Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==<br /> Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavni protein RBDom iz virusa CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBDom . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBDom so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C namesto pri 30°C . V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši. <br /> Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBDom proti vezavi na ta protein divjega tipa [1].<br /> <br /> == Zaključek ==<br /> V članku so raziskovalci demonstrirali učinkovite metode za pripravo različnih močnih inducibilnih močnih promotorjev v dveh pomembnih vrstah kvasovk ''Komagataella phaffii'' in ''Saccharomyces cerevisiae''. Dokazali so tudi, da lahko z variacijo števila operatorjev na začetku promotorja variirajo izražanja proteina. Poleg tega so demonstrirali tudi možnosti za proizvodnjo industrijsko pomembnih proteinov s pomočjo tovrstnih promotorjev. <br /> <br /> == Literatura ==<br /> [1] Tominaga, M., Shima, Y., Nozaki, K., Ito, Y., Someda, M., Shoya, Y., Hashii, N., Obata, C., Matsumoto-Kitano, M., Suematsu, K., Matsukawa, T., Hosoya, K., Hashiba, N., Kondo, A., &amp; Ishii, J. (2024b). Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts. Nature Communications, 15(1). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54865-z<br /> <br /> [2] Dvir, S., Velten, L., Sharon, E., Zeevi, D., Carey, L. B., Weinberger, A., &amp; Segal, E. (2013). Deciphering the rules by which 5′-UTR sequences affect protein expression in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(30). https://doi.org/10.1073/pnas.1222534110</div>

Bor Kunstelj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Na%C4%8Drtovanje_mo%C4%8Dnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah&diff=24694 2025-05-04T14:36:07Z

<p>Bor Kunstelj: /* Strategije načrtovanja močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah */</p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39702268/ Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts] <br /> <br /> == Uvod == <br /> Promotorji so v sintezni biologiji ključnega pomena za natančno uravnavo ravni izražanja genov. Medtem ko lahko v prokariontih s precejšnjo lahkoto spreminjamo moč promotorja je ta naloga pri evkariontih precej bolj zapletena, saj imajo le te veliko bolj kompleksno delovanje in regulacijo. Tudi promotorji kvasovk so nam še vedno precejšnja uganka, kljub temu da so kvasovke, predvsem ''S. cerevisiae'', že vrsto let eden izmed ključnih modelnih organizmov. Zato se v sintezni biologiji kvasovk, še vedno v precejšnji meri uporabljajo nativni promotorji, ki so dobro raziskani. Alternativa slednjim bi lahko bili inducibilni sintetični promotorji. Raziskovalci so zasnovali številne sintetične osrednje promotorje z nativnimi zgornjimi aktivacijskimi elementi[1].<br /> <br /> == Strategije načrtovanja močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Inducibilni sinetični promotorji vsebujejo dva osnovna gradnika in sicer TATA-zaporedje in zgornje bakterijske operatorje. Te promotorje so optimizirali s tremi metodami. Pred operatorje so vstavili dolgo izolacijsko zaporedje ( &gt; 1-kbp), ki onemogoči neželeno aktivacijo s strani oddaljenih ojačevalcev. Fuzija bakterijskih operatorjev direktno na zaporedje-TATA ojača aktivacijo. Povečevanje ponovitev operatorjev lahko zamnjša puščanje in izboljša raven ekspresije [1].<br /> <br /> == Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Raziskovalci so izdelali sintetični promotor inducibilen z 1-(3-Acetil-2,4,6-trihydroksifhenil) etanon 2,4 (DAPG) v modelnem organizmu ''Komagataella phaffii'' (prej poznana kot ''Pichia pastoris''). Najprej so 197bp osrednjega promotorja KpAOX1 fuzirali pod operator ''phlO''. Torej, ko je prisoten DAPG v gojišču se le ta poveže z trnskripcijskim aktivatorjem, ki se veže na opertor, kar omogoči izražanje gena pod promotorjem ''KpAOX1''. Moč promotorjev so karakterizirali z izražanjem EGFP (''angl.'' enhanced green fluorescent protein). Kvasovke v katerih je bil prisoten plazmid z zgoraj opisanim konstruktom so izkazovale več kot &gt;100-krat višjo raven ekspresije EGFP, tudi v odsotnosti induktorja DAPG. Po dodatku DAPG se je fluorescenca povišala za 8-krat. To nakazuje na močno puščanje tega sintetičnega promotorja. Raziskovalci so to težavo rešili tako, da so navzgor nad promotor vstavili genske fragmente v dolžini do 1,6 kb. Tako so zmanjšali puščanje za kar 376-krat medtem, ko se je raven ekspresije ob indukciji zmanjšala le za 1,6-krat. Razloga za puščanje tovrstnih promotorjev sta po navadi dva: endogeni transkripcijski aktivatorji, ki se lahko nahajajo tudi več kot 1kb navzgor od promotorja in pa prepisovanje izven gena (''angl.'' transcriptional readthrough) [1].<br /> <br /> == Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov ==<br /> Kljub temu, da se v nekaterih člankih omenja velik vpliv oddaljenosti TATA-zaporedja od startkodona, ga tu pri svojih eksperimentih raziskovalci skoraj niso [2]. Minimalni sintetični promotor lahko v tem primeru vsebuje le bakterijski operator, TATA-zaporedje in kratek vmesnik. Da bi razširili uporabnost teh promotorjev so avtorji izhodiščnega članka načrtali še močne inducuibilne sintetične promotorje v ''Saccharomyces cerevisiae''. Že izredno kratek promotor z dolžino 110 bp z opsrednjim promotorjem ''ScGAL1'' fuziran z operatorjem ''phlO'' je dosegel &gt;100-krat višjo raven ekspresije ob indukciji z DAPG. Ključ do tega uspeha leži v tem, da so TATA-zaporedje postavili takoj ob bakterijski operator [1].<br /> <br /> == Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja ==<br /> Ko so avtorji ugotovili način za zmanjšanje puščanja promotorjev so se odločili, da bodo okarakterizirali še vpliv popnovitev različnih operatorskih regij, na raven izražanja proteina pod takšnim promotorjem. Uporabili so induktorje DAPG, doksiciklin (Dox) in homoserin lakton (HSL), ki se vežejo na operatorje ''phlO'', ''tetO2'' in ''luxO''. Dve ponovitvi operatorja ''phlO'' povečata ekspresijo GFP za &gt;2000-krat, 6 ponovitev operatorske regije pa ob indukciji z DAPG že kar za &gt;3000-krat. Seveda razmerje med številom operatorjev in močjo indukcije ni monotono. <br /> Pri KpHSL-ON stikalu so naleteli na težavo, saj tudi pri 10 ponovitvah ''luxO'' ni prišlo do pričakovanega dviga ravni izražanja. Zato so se avtorji članka odločil, da bodo del ''luxO'' zamenjali z ostalimi ''luxO'' variantami iz bakterije ''Aliivibrio fischeri''. Na tak način so se izognili kriptični aktivaciji promotorja in statistično signifikantno povečali njegovo moč.<br /> <br /> <br /> == Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev ==<br /> Raziskovalci so uprabili KpDAPG-ON sistem za produkcijo nanotelesa ALX-0171 (gontivimab). Gene za nanotelesa so na C-terminalnem koncu fuzirali s signalno sekvenco paritvenega faktorja alfa (MFα). Za izražanje tega nanotelesa so uporabili 419bp dolg močan promotor DAPG-iSynP, PKpPhl6.0, vsebujoč šest ''phlO'' ponovitev in 61bp dolg vmestnik navzgor od zaporedja-TATA. Izkazalo se je, da je sintetični promotor 5-krat učinkovitejši za tovrstno proizvodnjo nanotelesa, kot bolj komercialno uveljavljen način indukcije z metanolom. <br /> Dokazali so, da je z sintetičnimi inducibilnimi promotorji moč izražati dva različna proteina pod dva različnima promotorjema. To so storili tak, da so v en sev vsatvili zapise za dve nanotelesi ALX-0171 and ALX-0081 pod promotorjema pDAPG-ON in KpTet-ON. Ekspresija je bila uspešna, a le ob dodatku ustreznega induktorja. <br /> <br /> == Ekspresijski sistemi brez induktorja ==<br /> Sistemi brez induktorja ali “Inducer-OFF” sistemi so pogosti v industriji, saj se z njimi lahko izognemo stroškom dodajanja induktorja. Tovrstni sistemi delujejo tako, da se ekspresija proteina prične šele, ko induktor odstranimo iz gojišča. Za ta namen so raziskovalci uporabili transkripcijski aktivator PhlTA, ki se deaktivira ob dodatku DAPG. Potem so ga še dodatno prilagodili za ta namen s pomočjo usmerjene evolucije. Najprej so z uporabo PCR mutrali ''phlTA''. Potem so le tega vstavili v vektor, ki je vseboval že predhodno narejen sintetični promotor s šestimi ponovitvami ''phlO'', ki so fuzirane na promotor ''ScGAL''. Zatem so s pomočjo PCR podvrženega mutacijam, ustvarili dve knjižnjici z 93 kloni, ki so jih prečesali za ON/OFF indukcijo z 5 μM DAPG. Rezulatati so pokazali, da je bila ključna mutacija za izboljšavo “Inducer-OFF” sistema PhlTA (E41G). Ko so to varinato vnesli v ''K. phaffii'' je prišlo ob dodatku DAPG do 702-kratne redukcije v primeru 61bp dolgega distančnika pred TATA-zaporedjem in 1572-kratne redukcije v primeru 11bp dolgega distančnika [1].<br /> <br /> == Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==<br /> Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavni protein RBDom iz virusa CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBDom . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBDom so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C namesto pri 30°C . V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši. <br /> Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBDom proti vezavi na ta protein divjega tipa[1]. <br /> <br /> == Zaključek ==<br /> V članku so raziskovalci demonstrirali učinkovite metode za pripravo različnih močnih inducibilnih močnih promotorjev v dveh pomembnih vrstah kvasovk ''Komagataella phaffii'' in ''Saccharomyces cerevisiae''. Dokazali so tudi, da lahko z variacijo števila operatorjev na začetku promotorja variirajo izražanja proteina. Poleg tega so demonstrirali tudi možnosti za proizvodnjo industrijsko pomembnih proteinov s pomočjo tovrstnih promotorjev. <br /> <br /> == Literatura ==<br /> [1] Tominaga, M., Shima, Y., Nozaki, K., Ito, Y., Someda, M., Shoya, Y., Hashii, N., Obata, C., Matsumoto-Kitano, M., Suematsu, K., Matsukawa, T., Hosoya, K., Hashiba, N., Kondo, A., &amp; Ishii, J. (2024b). Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts. Nature Communications, 15(1). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54865-z<br /> <br /> [2] Dvir, S., Velten, L., Sharon, E., Zeevi, D., Carey, L. B., Weinberger, A., &amp; Segal, E. (2013). Deciphering the rules by which 5′-UTR sequences affect protein expression in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(30). https://doi.org/10.1073/pnas.1222534110</div>

Bor Kunstelj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Na%C4%8Drtovanje_mo%C4%8Dnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah&diff=24693 2025-05-04T14:35:55Z

<p>Bor Kunstelj: /* Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov */</p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39702268/ Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts] <br /> <br /> == Uvod == <br /> Promotorji so v sintezni biologiji ključnega pomena za natančno uravnavo ravni izražanja genov. Medtem ko lahko v prokariontih s precejšnjo lahkoto spreminjamo moč promotorja je ta naloga pri evkariontih precej bolj zapletena, saj imajo le te veliko bolj kompleksno delovanje in regulacijo. Tudi promotorji kvasovk so nam še vedno precejšnja uganka, kljub temu da so kvasovke, predvsem ''S. cerevisiae'', že vrsto let eden izmed ključnih modelnih organizmov. Zato se v sintezni biologiji kvasovk, še vedno v precejšnji meri uporabljajo nativni promotorji, ki so dobro raziskani. Alternativa slednjim bi lahko bili inducibilni sintetični promotorji. Raziskovalci so zasnovali številne sintetične osrednje promotorje z nativnimi zgornjimi aktivacijskimi elementi[1].<br /> <br /> == Strategije načrtovanja močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Inducibilni sinetični promotorji vsebujejo dva osnovna gradnika in sicer TATA-zaporedje in zgornje bakterijske operatorje. Te promotorje so optimizirali s tremi metodami. Pred operatorje so vstavili dolgo izolacijsko zaporedje ( &gt; 1-kbp), ki onemogoči neželeno aktivacijo s strani oddaljenih ojačevalcev. Fuzija bakterijskih operatorjev direktno na zaporedje-TATA ojača aktivacijo. Povečevanje ponovitev operatorjev lahko zamnjša puščanje in izboljša raven ekspresije[1]. <br /> <br /> == Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Raziskovalci so izdelali sintetični promotor inducibilen z 1-(3-Acetil-2,4,6-trihydroksifhenil) etanon 2,4 (DAPG) v modelnem organizmu ''Komagataella phaffii'' (prej poznana kot ''Pichia pastoris''). Najprej so 197bp osrednjega promotorja KpAOX1 fuzirali pod operator ''phlO''. Torej, ko je prisoten DAPG v gojišču se le ta poveže z trnskripcijskim aktivatorjem, ki se veže na opertor, kar omogoči izražanje gena pod promotorjem ''KpAOX1''. Moč promotorjev so karakterizirali z izražanjem EGFP (''angl.'' enhanced green fluorescent protein). Kvasovke v katerih je bil prisoten plazmid z zgoraj opisanim konstruktom so izkazovale več kot &gt;100-krat višjo raven ekspresije EGFP, tudi v odsotnosti induktorja DAPG. Po dodatku DAPG se je fluorescenca povišala za 8-krat. To nakazuje na močno puščanje tega sintetičnega promotorja. Raziskovalci so to težavo rešili tako, da so navzgor nad promotor vstavili genske fragmente v dolžini do 1,6 kb. Tako so zmanjšali puščanje za kar 376-krat medtem, ko se je raven ekspresije ob indukciji zmanjšala le za 1,6-krat. Razloga za puščanje tovrstnih promotorjev sta po navadi dva: endogeni transkripcijski aktivatorji, ki se lahko nahajajo tudi več kot 1kb navzgor od promotorja in pa prepisovanje izven gena (''angl.'' transcriptional readthrough) [1].<br /> <br /> == Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov ==<br /> Kljub temu, da se v nekaterih člankih omenja velik vpliv oddaljenosti TATA-zaporedja od startkodona, ga tu pri svojih eksperimentih raziskovalci skoraj niso [2]. Minimalni sintetični promotor lahko v tem primeru vsebuje le bakterijski operator, TATA-zaporedje in kratek vmesnik. Da bi razširili uporabnost teh promotorjev so avtorji izhodiščnega članka načrtali še močne inducuibilne sintetične promotorje v ''Saccharomyces cerevisiae''. Že izredno kratek promotor z dolžino 110 bp z opsrednjim promotorjem ''ScGAL1'' fuziran z operatorjem ''phlO'' je dosegel &gt;100-krat višjo raven ekspresije ob indukciji z DAPG. Ključ do tega uspeha leži v tem, da so TATA-zaporedje postavili takoj ob bakterijski operator [1].<br /> <br /> == Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja ==<br /> Ko so avtorji ugotovili način za zmanjšanje puščanja promotorjev so se odločili, da bodo okarakterizirali še vpliv popnovitev različnih operatorskih regij, na raven izražanja proteina pod takšnim promotorjem. Uporabili so induktorje DAPG, doksiciklin (Dox) in homoserin lakton (HSL), ki se vežejo na operatorje ''phlO'', ''tetO2'' in ''luxO''. Dve ponovitvi operatorja ''phlO'' povečata ekspresijo GFP za &gt;2000-krat, 6 ponovitev operatorske regije pa ob indukciji z DAPG že kar za &gt;3000-krat. Seveda razmerje med številom operatorjev in močjo indukcije ni monotono. <br /> Pri KpHSL-ON stikalu so naleteli na težavo, saj tudi pri 10 ponovitvah ''luxO'' ni prišlo do pričakovanega dviga ravni izražanja. Zato so se avtorji članka odločil, da bodo del ''luxO'' zamenjali z ostalimi ''luxO'' variantami iz bakterije ''Aliivibrio fischeri''. Na tak način so se izognili kriptični aktivaciji promotorja in statistično signifikantno povečali njegovo moč.<br /> <br /> <br /> == Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev ==<br /> Raziskovalci so uprabili KpDAPG-ON sistem za produkcijo nanotelesa ALX-0171 (gontivimab). Gene za nanotelesa so na C-terminalnem koncu fuzirali s signalno sekvenco paritvenega faktorja alfa (MFα). Za izražanje tega nanotelesa so uporabili 419bp dolg močan promotor DAPG-iSynP, PKpPhl6.0, vsebujoč šest ''phlO'' ponovitev in 61bp dolg vmestnik navzgor od zaporedja-TATA. Izkazalo se je, da je sintetični promotor 5-krat učinkovitejši za tovrstno proizvodnjo nanotelesa, kot bolj komercialno uveljavljen način indukcije z metanolom. <br /> Dokazali so, da je z sintetičnimi inducibilnimi promotorji moč izražati dva različna proteina pod dva različnima promotorjema. To so storili tak, da so v en sev vsatvili zapise za dve nanotelesi ALX-0171 and ALX-0081 pod promotorjema pDAPG-ON in KpTet-ON. Ekspresija je bila uspešna, a le ob dodatku ustreznega induktorja. <br /> <br /> == Ekspresijski sistemi brez induktorja ==<br /> Sistemi brez induktorja ali “Inducer-OFF” sistemi so pogosti v industriji, saj se z njimi lahko izognemo stroškom dodajanja induktorja. Tovrstni sistemi delujejo tako, da se ekspresija proteina prične šele, ko induktor odstranimo iz gojišča. Za ta namen so raziskovalci uporabili transkripcijski aktivator PhlTA, ki se deaktivira ob dodatku DAPG. Potem so ga še dodatno prilagodili za ta namen s pomočjo usmerjene evolucije. Najprej so z uporabo PCR mutrali ''phlTA''. Potem so le tega vstavili v vektor, ki je vseboval že predhodno narejen sintetični promotor s šestimi ponovitvami ''phlO'', ki so fuzirane na promotor ''ScGAL''. Zatem so s pomočjo PCR podvrženega mutacijam, ustvarili dve knjižnjici z 93 kloni, ki so jih prečesali za ON/OFF indukcijo z 5 μM DAPG. Rezulatati so pokazali, da je bila ključna mutacija za izboljšavo “Inducer-OFF” sistema PhlTA (E41G). Ko so to varinato vnesli v ''K. phaffii'' je prišlo ob dodatku DAPG do 702-kratne redukcije v primeru 61bp dolgega distančnika pred TATA-zaporedjem in 1572-kratne redukcije v primeru 11bp dolgega distančnika [1].<br /> <br /> == Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==<br /> Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavni protein RBDom iz virusa CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBDom . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBDom so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C namesto pri 30°C . V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši. <br /> Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBDom proti vezavi na ta protein divjega tipa[1]. <br /> <br /> == Zaključek ==<br /> V članku so raziskovalci demonstrirali učinkovite metode za pripravo različnih močnih inducibilnih močnih promotorjev v dveh pomembnih vrstah kvasovk ''Komagataella phaffii'' in ''Saccharomyces cerevisiae''. Dokazali so tudi, da lahko z variacijo števila operatorjev na začetku promotorja variirajo izražanja proteina. Poleg tega so demonstrirali tudi možnosti za proizvodnjo industrijsko pomembnih proteinov s pomočjo tovrstnih promotorjev. <br /> <br /> == Literatura ==<br /> [1] Tominaga, M., Shima, Y., Nozaki, K., Ito, Y., Someda, M., Shoya, Y., Hashii, N., Obata, C., Matsumoto-Kitano, M., Suematsu, K., Matsukawa, T., Hosoya, K., Hashiba, N., Kondo, A., &amp; Ishii, J. (2024b). Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts. Nature Communications, 15(1). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54865-z<br /> <br /> [2] Dvir, S., Velten, L., Sharon, E., Zeevi, D., Carey, L. B., Weinberger, A., &amp; Segal, E. (2013). Deciphering the rules by which 5′-UTR sequences affect protein expression in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(30). https://doi.org/10.1073/pnas.1222534110</div>

Bor Kunstelj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Na%C4%8Drtovanje_mo%C4%8Dnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah&diff=24692 2025-05-04T14:35:41Z

<p>Bor Kunstelj: /* Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah */</p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39702268/ Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts] <br /> <br /> == Uvod == <br /> Promotorji so v sintezni biologiji ključnega pomena za natančno uravnavo ravni izražanja genov. Medtem ko lahko v prokariontih s precejšnjo lahkoto spreminjamo moč promotorja je ta naloga pri evkariontih precej bolj zapletena, saj imajo le te veliko bolj kompleksno delovanje in regulacijo. Tudi promotorji kvasovk so nam še vedno precejšnja uganka, kljub temu da so kvasovke, predvsem ''S. cerevisiae'', že vrsto let eden izmed ključnih modelnih organizmov. Zato se v sintezni biologiji kvasovk, še vedno v precejšnji meri uporabljajo nativni promotorji, ki so dobro raziskani. Alternativa slednjim bi lahko bili inducibilni sintetični promotorji. Raziskovalci so zasnovali številne sintetične osrednje promotorje z nativnimi zgornjimi aktivacijskimi elementi[1].<br /> <br /> == Strategije načrtovanja močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Inducibilni sinetični promotorji vsebujejo dva osnovna gradnika in sicer TATA-zaporedje in zgornje bakterijske operatorje. Te promotorje so optimizirali s tremi metodami. Pred operatorje so vstavili dolgo izolacijsko zaporedje ( &gt; 1-kbp), ki onemogoči neželeno aktivacijo s strani oddaljenih ojačevalcev. Fuzija bakterijskih operatorjev direktno na zaporedje-TATA ojača aktivacijo. Povečevanje ponovitev operatorjev lahko zamnjša puščanje in izboljša raven ekspresije[1]. <br /> <br /> == Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Raziskovalci so izdelali sintetični promotor inducibilen z 1-(3-Acetil-2,4,6-trihydroksifhenil) etanon 2,4 (DAPG) v modelnem organizmu ''Komagataella phaffii'' (prej poznana kot ''Pichia pastoris''). Najprej so 197bp osrednjega promotorja KpAOX1 fuzirali pod operator ''phlO''. Torej, ko je prisoten DAPG v gojišču se le ta poveže z trnskripcijskim aktivatorjem, ki se veže na opertor, kar omogoči izražanje gena pod promotorjem ''KpAOX1''. Moč promotorjev so karakterizirali z izražanjem EGFP (''angl.'' enhanced green fluorescent protein). Kvasovke v katerih je bil prisoten plazmid z zgoraj opisanim konstruktom so izkazovale več kot &gt;100-krat višjo raven ekspresije EGFP, tudi v odsotnosti induktorja DAPG. Po dodatku DAPG se je fluorescenca povišala za 8-krat. To nakazuje na močno puščanje tega sintetičnega promotorja. Raziskovalci so to težavo rešili tako, da so navzgor nad promotor vstavili genske fragmente v dolžini do 1,6 kb. Tako so zmanjšali puščanje za kar 376-krat medtem, ko se je raven ekspresije ob indukciji zmanjšala le za 1,6-krat. Razloga za puščanje tovrstnih promotorjev sta po navadi dva: endogeni transkripcijski aktivatorji, ki se lahko nahajajo tudi več kot 1kb navzgor od promotorja in pa prepisovanje izven gena (''angl.'' transcriptional readthrough) [1].<br /> <br /> == Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov ==<br /> Kljub temu, da se v nekaterih člankih omenja velik vpliv oddaljenosti TATA-zaporedja od startkodona, ga tu pri svojih eksperimentih raziskovalci skoraj niso [2]. Minimalni sintetični promotor lahko v tem primeru vsebuje le bakterijski operator, TATA-zaporedje in kratek vmesnik. Da bi razširili uporabnost teh promotorjev so avtorji izhodiščnega članka načrtali še močne inducuibilne sintetične promotorje v ''Saccharomyces cerevisiae''. Že izredno kratek promotor z dolžino 110 bp z opsrednjim promotorjem ''ScGAL1'' fuziran z operatorjem ''phlO'' je dosegel &gt;100-krat višjo raven ekspresije ob indukciji z DAPG. Ključ do tega uspeha leži v tem, da so TATA-zaporedje postavili takoj ob bakterijski operator[1]. <br /> <br /> == Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja ==<br /> Ko so avtorji ugotovili način za zmanjšanje puščanja promotorjev so se odločili, da bodo okarakterizirali še vpliv popnovitev različnih operatorskih regij, na raven izražanja proteina pod takšnim promotorjem. Uporabili so induktorje DAPG, doksiciklin (Dox) in homoserin lakton (HSL), ki se vežejo na operatorje ''phlO'', ''tetO2'' in ''luxO''. Dve ponovitvi operatorja ''phlO'' povečata ekspresijo GFP za &gt;2000-krat, 6 ponovitev operatorske regije pa ob indukciji z DAPG že kar za &gt;3000-krat. Seveda razmerje med številom operatorjev in močjo indukcije ni monotono. <br /> Pri KpHSL-ON stikalu so naleteli na težavo, saj tudi pri 10 ponovitvah ''luxO'' ni prišlo do pričakovanega dviga ravni izražanja. Zato so se avtorji članka odločil, da bodo del ''luxO'' zamenjali z ostalimi ''luxO'' variantami iz bakterije ''Aliivibrio fischeri''. Na tak način so se izognili kriptični aktivaciji promotorja in statistično signifikantno povečali njegovo moč.<br /> <br /> <br /> == Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev ==<br /> Raziskovalci so uprabili KpDAPG-ON sistem za produkcijo nanotelesa ALX-0171 (gontivimab). Gene za nanotelesa so na C-terminalnem koncu fuzirali s signalno sekvenco paritvenega faktorja alfa (MFα). Za izražanje tega nanotelesa so uporabili 419bp dolg močan promotor DAPG-iSynP, PKpPhl6.0, vsebujoč šest ''phlO'' ponovitev in 61bp dolg vmestnik navzgor od zaporedja-TATA. Izkazalo se je, da je sintetični promotor 5-krat učinkovitejši za tovrstno proizvodnjo nanotelesa, kot bolj komercialno uveljavljen način indukcije z metanolom. <br /> Dokazali so, da je z sintetičnimi inducibilnimi promotorji moč izražati dva različna proteina pod dva različnima promotorjema. To so storili tak, da so v en sev vsatvili zapise za dve nanotelesi ALX-0171 and ALX-0081 pod promotorjema pDAPG-ON in KpTet-ON. Ekspresija je bila uspešna, a le ob dodatku ustreznega induktorja. <br /> <br /> == Ekspresijski sistemi brez induktorja ==<br /> Sistemi brez induktorja ali “Inducer-OFF” sistemi so pogosti v industriji, saj se z njimi lahko izognemo stroškom dodajanja induktorja. Tovrstni sistemi delujejo tako, da se ekspresija proteina prične šele, ko induktor odstranimo iz gojišča. Za ta namen so raziskovalci uporabili transkripcijski aktivator PhlTA, ki se deaktivira ob dodatku DAPG. Potem so ga še dodatno prilagodili za ta namen s pomočjo usmerjene evolucije. Najprej so z uporabo PCR mutrali ''phlTA''. Potem so le tega vstavili v vektor, ki je vseboval že predhodno narejen sintetični promotor s šestimi ponovitvami ''phlO'', ki so fuzirane na promotor ''ScGAL''. Zatem so s pomočjo PCR podvrženega mutacijam, ustvarili dve knjižnjici z 93 kloni, ki so jih prečesali za ON/OFF indukcijo z 5 μM DAPG. Rezulatati so pokazali, da je bila ključna mutacija za izboljšavo “Inducer-OFF” sistema PhlTA (E41G). Ko so to varinato vnesli v ''K. phaffii'' je prišlo ob dodatku DAPG do 702-kratne redukcije v primeru 61bp dolgega distančnika pred TATA-zaporedjem in 1572-kratne redukcije v primeru 11bp dolgega distančnika [1].<br /> <br /> == Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==<br /> Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavni protein RBDom iz virusa CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBDom . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBDom so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C namesto pri 30°C . V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši. <br /> Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBDom proti vezavi na ta protein divjega tipa[1]. <br /> <br /> == Zaključek ==<br /> V članku so raziskovalci demonstrirali učinkovite metode za pripravo različnih močnih inducibilnih močnih promotorjev v dveh pomembnih vrstah kvasovk ''Komagataella phaffii'' in ''Saccharomyces cerevisiae''. Dokazali so tudi, da lahko z variacijo števila operatorjev na začetku promotorja variirajo izražanja proteina. Poleg tega so demonstrirali tudi možnosti za proizvodnjo industrijsko pomembnih proteinov s pomočjo tovrstnih promotorjev. <br /> <br /> == Literatura ==<br /> [1] Tominaga, M., Shima, Y., Nozaki, K., Ito, Y., Someda, M., Shoya, Y., Hashii, N., Obata, C., Matsumoto-Kitano, M., Suematsu, K., Matsukawa, T., Hosoya, K., Hashiba, N., Kondo, A., &amp; Ishii, J. (2024b). Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts. Nature Communications, 15(1). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54865-z<br /> <br /> [2] Dvir, S., Velten, L., Sharon, E., Zeevi, D., Carey, L. B., Weinberger, A., &amp; Segal, E. (2013). Deciphering the rules by which 5′-UTR sequences affect protein expression in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(30). https://doi.org/10.1073/pnas.1222534110</div>

Bor Kunstelj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Na%C4%8Drtovanje_mo%C4%8Dnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah&diff=24690 2025-05-04T14:34:58Z

<p>Bor Kunstelj: /* Ekspresijski sistemi brez induktorja */</p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39702268/ Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts] <br /> <br /> == Uvod == <br /> Promotorji so v sintezni biologiji ključnega pomena za natančno uravnavo ravni izražanja genov. Medtem ko lahko v prokariontih s precejšnjo lahkoto spreminjamo moč promotorja je ta naloga pri evkariontih precej bolj zapletena, saj imajo le te veliko bolj kompleksno delovanje in regulacijo. Tudi promotorji kvasovk so nam še vedno precejšnja uganka, kljub temu da so kvasovke, predvsem ''S. cerevisiae'', že vrsto let eden izmed ključnih modelnih organizmov. Zato se v sintezni biologiji kvasovk, še vedno v precejšnji meri uporabljajo nativni promotorji, ki so dobro raziskani. Alternativa slednjim bi lahko bili inducibilni sintetični promotorji. Raziskovalci so zasnovali številne sintetične osrednje promotorje z nativnimi zgornjimi aktivacijskimi elementi[1].<br /> <br /> == Strategije načrtovanja močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Inducibilni sinetični promotorji vsebujejo dva osnovna gradnika in sicer TATA-zaporedje in zgornje bakterijske operatorje. Te promotorje so optimizirali s tremi metodami. Pred operatorje so vstavili dolgo izolacijsko zaporedje ( &gt; 1-kbp), ki onemogoči neželeno aktivacijo s strani oddaljenih ojačevalcev. Fuzija bakterijskih operatorjev direktno na zaporedje-TATA ojača aktivacijo. Povečevanje ponovitev operatorjev lahko zamnjša puščanje in izboljša raven ekspresije[1]. <br /> <br /> == Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Raziskovalci so izdelali sintetični promotor inducibilen z 1-(3-Acetil-2,4,6-trihydroksifhenil) etanon 2,4 (DAPG) v modelnem organizmu ''Komagataella phaffii'' (prej poznana kot ''Pichia pastoris''). Najprej so 197bp osrednjega promotorja KpAOX1 fuzirali pod operator ''phlO''. Torej, ko je prisoten DAPG v gojišču se le ta poveže z trnskripcijskim aktivatorjem, ki se veže na opertor, kar omogoči izražanje gena pod promotorjem ''KpAOX1''. Moč promotorjev so karakterizirali z izražanjem EGFP (angl. enhanced green fluorescent protein). Kvasovke v katerih je bil prisoten plazmid z zgoraj opisanim konstruktom so izkazovale več kot &gt;100-krat višjo raven ekspresije EGFP, tudi v odsotnosti induktorja DAPG. Po dodatku DAPG se je fluorescenca povišala za 8-krat. To nakazuje na močno puščanje tega sintetičnega promotorja. Raziskovalci so to težavo rešili tako, da so navzgor nad promotor vstavili genske fragmente v dolžini do 1,6 kb. Tako so zmanjšali puščanje za kar 376-krat medtem, ko se je raven ekspresije ob indukciji zmanjšala le za 1,6-krat. Razloga za puščanje tovrstnih promotorjev sta po navadi dva: endogeni transkripcijski aktivatorji, ki se lahko nahajajo tudi več kot 1kb navzgor od promotorja in pa prepisovanje izven gena (angl. transcriptional readthrough)[1].<br /> <br /> == Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov ==<br /> Kljub temu, da se v nekaterih člankih omenja velik vpliv oddaljenosti TATA-zaporedja od startkodona, ga tu pri svojih eksperimentih raziskovalci skoraj niso [2]. Minimalni sintetični promotor lahko v tem primeru vsebuje le bakterijski operator, TATA-zaporedje in kratek vmesnik. Da bi razširili uporabnost teh promotorjev so avtorji izhodiščnega članka načrtali še močne inducuibilne sintetične promotorje v ''Saccharomyces cerevisiae''. Že izredno kratek promotor z dolžino 110 bp z opsrednjim promotorjem ''ScGAL1'' fuziran z operatorjem ''phlO'' je dosegel &gt;100-krat višjo raven ekspresije ob indukciji z DAPG. Ključ do tega uspeha leži v tem, da so TATA-zaporedje postavili takoj ob bakterijski operator[1]. <br /> <br /> == Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja ==<br /> Ko so avtorji ugotovili način za zmanjšanje puščanja promotorjev so se odločili, da bodo okarakterizirali še vpliv popnovitev različnih operatorskih regij, na raven izražanja proteina pod takšnim promotorjem. Uporabili so induktorje DAPG, doksiciklin (Dox) in homoserin lakton (HSL), ki se vežejo na operatorje ''phlO'', ''tetO2'' in ''luxO''. Dve ponovitvi operatorja ''phlO'' povečata ekspresijo GFP za &gt;2000-krat, 6 ponovitev operatorske regije pa ob indukciji z DAPG že kar za &gt;3000-krat. Seveda razmerje med številom operatorjev in močjo indukcije ni monotono. <br /> Pri KpHSL-ON stikalu so naleteli na težavo, saj tudi pri 10 ponovitvah ''luxO'' ni prišlo do pričakovanega dviga ravni izražanja. Zato so se avtorji članka odločil, da bodo del ''luxO'' zamenjali z ostalimi ''luxO'' variantami iz bakterije ''Aliivibrio fischeri''. Na tak način so se izognili kriptični aktivaciji promotorja in statistično signifikantno povečali njegovo moč.<br /> <br /> <br /> == Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev ==<br /> Raziskovalci so uprabili KpDAPG-ON sistem za produkcijo nanotelesa ALX-0171 (gontivimab). Gene za nanotelesa so na C-terminalnem koncu fuzirali s signalno sekvenco paritvenega faktorja alfa (MFα). Za izražanje tega nanotelesa so uporabili 419bp dolg močan promotor DAPG-iSynP, PKpPhl6.0, vsebujoč šest ''phlO'' ponovitev in 61bp dolg vmestnik navzgor od zaporedja-TATA. Izkazalo se je, da je sintetični promotor 5-krat učinkovitejši za tovrstno proizvodnjo nanotelesa, kot bolj komercialno uveljavljen način indukcije z metanolom. <br /> Dokazali so, da je z sintetičnimi inducibilnimi promotorji moč izražati dva različna proteina pod dva različnima promotorjema. To so storili tak, da so v en sev vsatvili zapise za dve nanotelesi ALX-0171 and ALX-0081 pod promotorjema pDAPG-ON in KpTet-ON. Ekspresija je bila uspešna, a le ob dodatku ustreznega induktorja. <br /> <br /> == Ekspresijski sistemi brez induktorja ==<br /> Sistemi brez induktorja ali “Inducer-OFF” sistemi so pogosti v industriji, saj se z njimi lahko izognemo stroškom dodajanja induktorja. Tovrstni sistemi delujejo tako, da se ekspresija proteina prične šele, ko induktor odstranimo iz gojišča. Za ta namen so raziskovalci uporabili transkripcijski aktivator PhlTA, ki se deaktivira ob dodatku DAPG. Potem so ga še dodatno prilagodili za ta namen s pomočjo usmerjene evolucije. Najprej so z uporabo PCR mutrali ''phlTA''. Potem so le tega vstavili v vektor, ki je vseboval že predhodno narejen sintetični promotor s šestimi ponovitvami ''phlO'', ki so fuzirane na promotor ''ScGAL''. Zatem so s pomočjo PCR podvrženega mutacijam, ustvarili dve knjižnjici z 93 kloni, ki so jih prečesali za ON/OFF indukcijo z 5 μM DAPG. Rezulatati so pokazali, da je bila ključna mutacija za izboljšavo “Inducer-OFF” sistema PhlTA (E41G). Ko so to varinato vnesli v ''K. phaffii'' je prišlo ob dodatku DAPG do 702-kratne redukcije v primeru 61bp dolgega distančnika pred TATA-zaporedjem in 1572-kratne redukcije v primeru 11bp dolgega distančnika [1].<br /> <br /> == Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==<br /> Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavni protein RBDom iz virusa CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBDom . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBDom so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C namesto pri 30°C . V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši. <br /> Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBDom proti vezavi na ta protein divjega tipa[1]. <br /> <br /> == Zaključek ==<br /> V članku so raziskovalci demonstrirali učinkovite metode za pripravo različnih močnih inducibilnih močnih promotorjev v dveh pomembnih vrstah kvasovk ''Komagataella phaffii'' in ''Saccharomyces cerevisiae''. Dokazali so tudi, da lahko z variacijo števila operatorjev na začetku promotorja variirajo izražanja proteina. Poleg tega so demonstrirali tudi možnosti za proizvodnjo industrijsko pomembnih proteinov s pomočjo tovrstnih promotorjev. <br /> <br /> == Literatura ==<br /> [1] Tominaga, M., Shima, Y., Nozaki, K., Ito, Y., Someda, M., Shoya, Y., Hashii, N., Obata, C., Matsumoto-Kitano, M., Suematsu, K., Matsukawa, T., Hosoya, K., Hashiba, N., Kondo, A., &amp; Ishii, J. (2024b). Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts. Nature Communications, 15(1). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54865-z<br /> <br /> [2] Dvir, S., Velten, L., Sharon, E., Zeevi, D., Carey, L. B., Weinberger, A., &amp; Segal, E. (2013). Deciphering the rules by which 5′-UTR sequences affect protein expression in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(30). https://doi.org/10.1073/pnas.1222534110</div>

Bor Kunstelj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Na%C4%8Drtovanje_mo%C4%8Dnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah&diff=24686 2025-05-04T10:33:26Z

<p>Bor Kunstelj: /* Literatura */</p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39702268/ Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts] <br /> <br /> == Uvod == <br /> Promotorji so v sintezni biologiji ključnega pomena za natančno uravnavo ravni izražanja genov. Medtem ko lahko v prokariontih s precejšnjo lahkoto spreminjamo moč promotorja je ta naloga pri evkariontih precej bolj zapletena, saj imajo le te veliko bolj kompleksno delovanje in regulacijo. Tudi promotorji kvasovk so nam še vedno precejšnja uganka, kljub temu da so kvasovke, predvsem ''S. cerevisiae'', že vrsto let eden izmed ključnih modelnih organizmov. Zato se v sintezni biologiji kvasovk, še vedno v precejšnji meri uporabljajo nativni promotorji, ki so dobro raziskani. Alternativa slednjim bi lahko bili inducibilni sintetični promotorji. Raziskovalci so zasnovali številne sintetične osrednje promotorje z nativnimi zgornjimi aktivacijskimi elementi[1].<br /> <br /> == Strategije načrtovanja močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Inducibilni sinetični promotorji vsebujejo dva osnovna gradnika in sicer TATA-zaporedje in zgornje bakterijske operatorje. Te promotorje so optimizirali s tremi metodami. Pred operatorje so vstavili dolgo izolacijsko zaporedje ( &gt; 1-kbp), ki onemogoči neželeno aktivacijo s strani oddaljenih ojačevalcev. Fuzija bakterijskih operatorjev direktno na zaporedje-TATA ojača aktivacijo. Povečevanje ponovitev operatorjev lahko zamnjša puščanje in izboljša raven ekspresije[1]. <br /> <br /> == Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Raziskovalci so izdelali sintetični promotor inducibilen z 1-(3-Acetil-2,4,6-trihydroksifhenil) etanon 2,4 (DAPG) v modelnem organizmu ''Komagataella phaffii'' (prej poznana kot ''Pichia pastoris''). Najprej so 197bp osrednjega promotorja KpAOX1 fuzirali pod operator ''phlO''. Torej, ko je prisoten DAPG v gojišču se le ta poveže z trnskripcijskim aktivatorjem, ki se veže na opertor, kar omogoči izražanje gena pod promotorjem ''KpAOX1''. Moč promotorjev so karakterizirali z izražanjem EGFP (angl. enhanced green fluorescent protein). Kvasovke v katerih je bil prisoten plazmid z zgoraj opisanim konstruktom so izkazovale več kot &gt;100-krat višjo raven ekspresije EGFP, tudi v odsotnosti induktorja DAPG. Po dodatku DAPG se je fluorescenca povišala za 8-krat. To nakazuje na močno puščanje tega sintetičnega promotorja. Raziskovalci so to težavo rešili tako, da so navzgor nad promotor vstavili genske fragmente v dolžini do 1,6 kb. Tako so zmanjšali puščanje za kar 376-krat medtem, ko se je raven ekspresije ob indukciji zmanjšala le za 1,6-krat. Razloga za puščanje tovrstnih promotorjev sta po navadi dva: endogeni transkripcijski aktivatorji, ki se lahko nahajajo tudi več kot 1kb navzgor od promotorja in pa prepisovanje izven gena (angl. transcriptional readthrough)[1].<br /> <br /> == Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov ==<br /> Kljub temu, da se v nekaterih člankih omenja velik vpliv oddaljenosti TATA-zaporedja od startkodona, ga tu pri svojih eksperimentih raziskovalci skoraj niso [2]. Minimalni sintetični promotor lahko v tem primeru vsebuje le bakterijski operator, TATA-zaporedje in kratek vmesnik. Da bi razširili uporabnost teh promotorjev so avtorji izhodiščnega članka načrtali še močne inducuibilne sintetične promotorje v ''Saccharomyces cerevisiae''. Že izredno kratek promotor z dolžino 110 bp z opsrednjim promotorjem ''ScGAL1'' fuziran z operatorjem ''phlO'' je dosegel &gt;100-krat višjo raven ekspresije ob indukciji z DAPG. Ključ do tega uspeha leži v tem, da so TATA-zaporedje postavili takoj ob bakterijski operator[1]. <br /> <br /> == Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja ==<br /> Ko so avtorji ugotovili način za zmanjšanje puščanja promotorjev so se odločili, da bodo okarakterizirali še vpliv popnovitev različnih operatorskih regij, na raven izražanja proteina pod takšnim promotorjem. Uporabili so induktorje DAPG, doksiciklin (Dox) in homoserin lakton (HSL), ki se vežejo na operatorje ''phlO'', ''tetO2'' in ''luxO''. Dve ponovitvi operatorja ''phlO'' povečata ekspresijo GFP za &gt;2000-krat, 6 ponovitev operatorske regije pa ob indukciji z DAPG že kar za &gt;3000-krat. Seveda razmerje med številom operatorjev in močjo indukcije ni monotono. <br /> Pri KpHSL-ON stikalu so naleteli na težavo, saj tudi pri 10 ponovitvah ''luxO'' ni prišlo do pričakovanega dviga ravni izražanja. Zato so se avtorji članka odločil, da bodo del ''luxO'' zamenjali z ostalimi ''luxO'' variantami iz bakterije ''Aliivibrio fischeri''. Na tak način so se izognili kriptični aktivaciji promotorja in statistično signifikantno povečali njegovo moč.<br /> <br /> <br /> == Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev ==<br /> Raziskovalci so uprabili KpDAPG-ON sistem za produkcijo nanotelesa ALX-0171 (gontivimab). Gene za nanotelesa so na C-terminalnem koncu fuzirali s signalno sekvenco paritvenega faktorja alfa (MFα). Za izražanje tega nanotelesa so uporabili 419bp dolg močan promotor DAPG-iSynP, PKpPhl6.0, vsebujoč šest ''phlO'' ponovitev in 61bp dolg vmestnik navzgor od zaporedja-TATA. Izkazalo se je, da je sintetični promotor 5-krat učinkovitejši za tovrstno proizvodnjo nanotelesa, kot bolj komercialno uveljavljen način indukcije z metanolom. <br /> Dokazali so, da je z sintetičnimi inducibilnimi promotorji moč izražati dva različna proteina pod dva različnima promotorjema. To so storili tak, da so v en sev vsatvili zapise za dve nanotelesi ALX-0171 and ALX-0081 pod promotorjema pDAPG-ON in KpTet-ON. Ekspresija je bila uspešna, a le ob dodatku ustreznega induktorja. <br /> <br /> == Ekspresijski sistemi brez induktorja ==<br /> Sistemi brez induktorja ali “Inducer-OFF” sistemi so pogosti v industriji, saj se z njimi lahko izognemo stroškom dodajanja induktorja. Tovrstni sistemi delujejo tako, da se ekspresija proteina prične šele, ko induktor odstranimo iz gojišča. Za ta namen so raziskovalci uporabili transkripcijski aktivator PhlTA, ki se deaktivira ob dodatku DAPG. Potem so ga še dodatno prilagodili za ta namen s pomočjo usmerjene evolucije. Najprej so z uporabo PCR mutrali ''phlTA''. Potem so le tega vstavili v vektor, ki je vseboval že predhodno narejen sintetični promotor s šestimi ponovitvami ''phlO'', ki so fuzirane na promotor ''ScGAL''. Zatem so s pomočjo PCR podvrženega mutacijam, ustvarili dve knjižnjici z 93 kloni, ki so jih prečesali za ON/OFF indukcijo z 5 μM DAPG. Rezulatati so pokazali, da je bila ključna mutacija za izboljšavo “Inducer-OFF” sistema PhlTA (E41G). Ko so to varinato vnesli v ''K. phaffii'' je prišlo ob dodatku DAPG do 702-kratne redukcije v primeru 61bp dolgega distančnika pred TATA-zaporedjem in 1572-kratne redukcije v primeru 11bp dolgega distančnika[1]. <br /> <br /> == Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==<br /> Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavni protein RBDom iz virusa CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBDom . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBDom so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C namesto pri 30°C . V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši. <br /> Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBDom proti vezavi na ta protein divjega tipa[1]. <br /> <br /> == Zaključek ==<br /> V članku so raziskovalci demonstrirali učinkovite metode za pripravo različnih močnih inducibilnih močnih promotorjev v dveh pomembnih vrstah kvasovk ''Komagataella phaffii'' in ''Saccharomyces cerevisiae''. Dokazali so tudi, da lahko z variacijo števila operatorjev na začetku promotorja variirajo izražanja proteina. Poleg tega so demonstrirali tudi možnosti za proizvodnjo industrijsko pomembnih proteinov s pomočjo tovrstnih promotorjev. <br /> <br /> == Literatura ==<br /> [1] Tominaga, M., Shima, Y., Nozaki, K., Ito, Y., Someda, M., Shoya, Y., Hashii, N., Obata, C., Matsumoto-Kitano, M., Suematsu, K., Matsukawa, T., Hosoya, K., Hashiba, N., Kondo, A., &amp; Ishii, J. (2024b). Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts. Nature Communications, 15(1). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54865-z<br /> <br /> [2] Dvir, S., Velten, L., Sharon, E., Zeevi, D., Carey, L. B., Weinberger, A., &amp; Segal, E. (2013). Deciphering the rules by which 5′-UTR sequences affect protein expression in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(30). https://doi.org/10.1073/pnas.1222534110</div>

Bor Kunstelj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Na%C4%8Drtovanje_mo%C4%8Dnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah&diff=24685 2025-05-04T10:33:09Z

<p>Bor Kunstelj: Created page with &quot;Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39702268/ Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts] == Uvod == Promotorji so v sintezni biologiji ključnega pomena za natančno uravnavo ravni izražanja genov. Medtem ko lahko v prokariontih s precejšnjo lahkoto spreminjamo moč promotorja je ta naloga pri evkariontih precej bolj zapletena, saj imajo le te veliko bolj kompleksno delovanje in regulacijo. Tudi promotorji kvasovk so nam še vedno p...&quot;</p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39702268/ Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts] <br /> <br /> == Uvod == <br /> Promotorji so v sintezni biologiji ključnega pomena za natančno uravnavo ravni izražanja genov. Medtem ko lahko v prokariontih s precejšnjo lahkoto spreminjamo moč promotorja je ta naloga pri evkariontih precej bolj zapletena, saj imajo le te veliko bolj kompleksno delovanje in regulacijo. Tudi promotorji kvasovk so nam še vedno precejšnja uganka, kljub temu da so kvasovke, predvsem ''S. cerevisiae'', že vrsto let eden izmed ključnih modelnih organizmov. Zato se v sintezni biologiji kvasovk, še vedno v precejšnji meri uporabljajo nativni promotorji, ki so dobro raziskani. Alternativa slednjim bi lahko bili inducibilni sintetični promotorji. Raziskovalci so zasnovali številne sintetične osrednje promotorje z nativnimi zgornjimi aktivacijskimi elementi[1].<br /> <br /> == Strategije načrtovanja močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Inducibilni sinetični promotorji vsebujejo dva osnovna gradnika in sicer TATA-zaporedje in zgornje bakterijske operatorje. Te promotorje so optimizirali s tremi metodami. Pred operatorje so vstavili dolgo izolacijsko zaporedje ( &gt; 1-kbp), ki onemogoči neželeno aktivacijo s strani oddaljenih ojačevalcev. Fuzija bakterijskih operatorjev direktno na zaporedje-TATA ojača aktivacijo. Povečevanje ponovitev operatorjev lahko zamnjša puščanje in izboljša raven ekspresije[1]. <br /> <br /> == Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==<br /> Raziskovalci so izdelali sintetični promotor inducibilen z 1-(3-Acetil-2,4,6-trihydroksifhenil) etanon 2,4 (DAPG) v modelnem organizmu ''Komagataella phaffii'' (prej poznana kot ''Pichia pastoris''). Najprej so 197bp osrednjega promotorja KpAOX1 fuzirali pod operator ''phlO''. Torej, ko je prisoten DAPG v gojišču se le ta poveže z trnskripcijskim aktivatorjem, ki se veže na opertor, kar omogoči izražanje gena pod promotorjem ''KpAOX1''. Moč promotorjev so karakterizirali z izražanjem EGFP (angl. enhanced green fluorescent protein). Kvasovke v katerih je bil prisoten plazmid z zgoraj opisanim konstruktom so izkazovale več kot &gt;100-krat višjo raven ekspresije EGFP, tudi v odsotnosti induktorja DAPG. Po dodatku DAPG se je fluorescenca povišala za 8-krat. To nakazuje na močno puščanje tega sintetičnega promotorja. Raziskovalci so to težavo rešili tako, da so navzgor nad promotor vstavili genske fragmente v dolžini do 1,6 kb. Tako so zmanjšali puščanje za kar 376-krat medtem, ko se je raven ekspresije ob indukciji zmanjšala le za 1,6-krat. Razloga za puščanje tovrstnih promotorjev sta po navadi dva: endogeni transkripcijski aktivatorji, ki se lahko nahajajo tudi več kot 1kb navzgor od promotorja in pa prepisovanje izven gena (angl. transcriptional readthrough)[1].<br /> <br /> == Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov ==<br /> Kljub temu, da se v nekaterih člankih omenja velik vpliv oddaljenosti TATA-zaporedja od startkodona, ga tu pri svojih eksperimentih raziskovalci skoraj niso [2]. Minimalni sintetični promotor lahko v tem primeru vsebuje le bakterijski operator, TATA-zaporedje in kratek vmesnik. Da bi razširili uporabnost teh promotorjev so avtorji izhodiščnega članka načrtali še močne inducuibilne sintetične promotorje v ''Saccharomyces cerevisiae''. Že izredno kratek promotor z dolžino 110 bp z opsrednjim promotorjem ''ScGAL1'' fuziran z operatorjem ''phlO'' je dosegel &gt;100-krat višjo raven ekspresije ob indukciji z DAPG. Ključ do tega uspeha leži v tem, da so TATA-zaporedje postavili takoj ob bakterijski operator[1]. <br /> <br /> == Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja ==<br /> Ko so avtorji ugotovili način za zmanjšanje puščanja promotorjev so se odločili, da bodo okarakterizirali še vpliv popnovitev različnih operatorskih regij, na raven izražanja proteina pod takšnim promotorjem. Uporabili so induktorje DAPG, doksiciklin (Dox) in homoserin lakton (HSL), ki se vežejo na operatorje ''phlO'', ''tetO2'' in ''luxO''. Dve ponovitvi operatorja ''phlO'' povečata ekspresijo GFP za &gt;2000-krat, 6 ponovitev operatorske regije pa ob indukciji z DAPG že kar za &gt;3000-krat. Seveda razmerje med številom operatorjev in močjo indukcije ni monotono. <br /> Pri KpHSL-ON stikalu so naleteli na težavo, saj tudi pri 10 ponovitvah ''luxO'' ni prišlo do pričakovanega dviga ravni izražanja. Zato so se avtorji članka odločil, da bodo del ''luxO'' zamenjali z ostalimi ''luxO'' variantami iz bakterije ''Aliivibrio fischeri''. Na tak način so se izognili kriptični aktivaciji promotorja in statistično signifikantno povečali njegovo moč.<br /> <br /> <br /> == Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev ==<br /> Raziskovalci so uprabili KpDAPG-ON sistem za produkcijo nanotelesa ALX-0171 (gontivimab). Gene za nanotelesa so na C-terminalnem koncu fuzirali s signalno sekvenco paritvenega faktorja alfa (MFα). Za izražanje tega nanotelesa so uporabili 419bp dolg močan promotor DAPG-iSynP, PKpPhl6.0, vsebujoč šest ''phlO'' ponovitev in 61bp dolg vmestnik navzgor od zaporedja-TATA. Izkazalo se je, da je sintetični promotor 5-krat učinkovitejši za tovrstno proizvodnjo nanotelesa, kot bolj komercialno uveljavljen način indukcije z metanolom. <br /> Dokazali so, da je z sintetičnimi inducibilnimi promotorji moč izražati dva različna proteina pod dva različnima promotorjema. To so storili tak, da so v en sev vsatvili zapise za dve nanotelesi ALX-0171 and ALX-0081 pod promotorjema pDAPG-ON in KpTet-ON. Ekspresija je bila uspešna, a le ob dodatku ustreznega induktorja. <br /> <br /> == Ekspresijski sistemi brez induktorja ==<br /> Sistemi brez induktorja ali “Inducer-OFF” sistemi so pogosti v industriji, saj se z njimi lahko izognemo stroškom dodajanja induktorja. Tovrstni sistemi delujejo tako, da se ekspresija proteina prične šele, ko induktor odstranimo iz gojišča. Za ta namen so raziskovalci uporabili transkripcijski aktivator PhlTA, ki se deaktivira ob dodatku DAPG. Potem so ga še dodatno prilagodili za ta namen s pomočjo usmerjene evolucije. Najprej so z uporabo PCR mutrali ''phlTA''. Potem so le tega vstavili v vektor, ki je vseboval že predhodno narejen sintetični promotor s šestimi ponovitvami ''phlO'', ki so fuzirane na promotor ''ScGAL''. Zatem so s pomočjo PCR podvrženega mutacijam, ustvarili dve knjižnjici z 93 kloni, ki so jih prečesali za ON/OFF indukcijo z 5 μM DAPG. Rezulatati so pokazali, da je bila ključna mutacija za izboljšavo “Inducer-OFF” sistema PhlTA (E41G). Ko so to varinato vnesli v ''K. phaffii'' je prišlo ob dodatku DAPG do 702-kratne redukcije v primeru 61bp dolgega distančnika pred TATA-zaporedjem in 1572-kratne redukcije v primeru 11bp dolgega distančnika[1]. <br /> <br /> == Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==<br /> Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavni protein RBDom iz virusa CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBDom . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBDom so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C namesto pri 30°C . V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši. <br /> Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBDom proti vezavi na ta protein divjega tipa[1]. <br /> <br /> == Zaključek ==<br /> V članku so raziskovalci demonstrirali učinkovite metode za pripravo različnih močnih inducibilnih močnih promotorjev v dveh pomembnih vrstah kvasovk ''Komagataella phaffii'' in ''Saccharomyces cerevisiae''. Dokazali so tudi, da lahko z variacijo števila operatorjev na začetku promotorja variirajo izražanja proteina. Poleg tega so demonstrirali tudi možnosti za proizvodnjo industrijsko pomembnih proteinov s pomočjo tovrstnih promotorjev. <br /> <br /> == Literatura ==<br /> [1] Tominaga, M., Shima, Y., Nozaki, K., Ito, Y., Someda, M., Shoya, Y., Hashii, N., Obata, C., Matsumoto-Kitano, M., Suematsu, K., Matsukawa, T., Hosoya, K., Hashiba, N., Kondo, A., &amp; Ishii, J. (2024b). Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts. Nature Communications, 15(1). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54865-z<br /> [2] Dvir, S., Velten, L., Sharon, E., Zeevi, D., Carey, L. B., Weinberger, A., &amp; Segal, E. (2013). Deciphering the rules by which 5′-UTR sequences affect protein expression in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(30). https://doi.org/10.1073/pnas.1222534110</div>

Bor Kunstelj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2024/25&diff=24671 2025-05-04T09:05:11Z

<p>Bor Kunstelj: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2024/25 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_umetnih_medvrstnih_promotorjev_z_različnimi_transkripcijskimi_močmi Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi] (Miljan Trajković) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preprečevanje_nastanka_multimerov_pogosto_uporabljenih_plazmidov_v_sintezni_biologiji Preprečevanje nastanka multimerov pogosto uporabljenih plazmidov v sintezni biologiji] (Lev Jošt)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_Nicotiane_benthamiane_za_proizvodnjo_krisoeriola_z_uporabo_tehnik_sintezne_biologije Priprava ''Nicotiane benthamiane'' za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije] (Nika Frelih)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gensko_spremenjeni_receptorji_za_komunikacijo_med_celicami_preko_topnih_signalov_in_zaznavanje_bolezni Gensko spremenjeni receptorji za komunikacijo med celicami preko topnih signalov in zaznavanje bolezni] (Zara Bunc)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nadzor_nad_izražanjem_heterolognih_genov_pri_Bdellovibrio_bacteriovorus_z_uporabo_sintezne_biologije Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije] (Živa Flego)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_konzorcija_kvasovk_za_de_novo_biosintezo_rastlinskih_lignanov Uporaba konzorcija kvasovk za de novo biosintezo rastlinskih lignanov] (Urša Lah)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sonogenetsko_nadzorovane_gensko_spremenjene_celice_za_zdravljenje_raka_v_mišjih_tumorskih_modelih Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih] (Pia Mencin) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Združitev_difuzijskega_modela_in_transformerja_za_sintezo_izboljšanih_promotorjev_ter_napoved_moči_sintetičnih_promotorjev_z_uporabo_globokega_učenja Združitev difuzijskega modela in transformerja za sintezo izboljšanih promotorjev ter napoved moči sintetičnih promotorjev z uporabo globokega učenja] (Tinkara Korošec) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_dvojno_svetlobo_nadzirani_kokulturni_sistem_omogoča_uravnavanje_sestave_populacije Z dvojno svetlobo nadzirani sistem omogoča uravnavanje sestave populacije] (Ula Mikoš)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Načrtovanje_močnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah Načrtovanje močnih inducibilnih sinteznih promotorjev v kvasovkah] (Bor Kunstelj)<br /> <br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynPlode SynPlode] (Leila Bohorč)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETal:_izdelovanje_eteričnega_olja_sandalovine_iz_PET_plastike PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike] (Lara Krampač)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET_TWINS:_Praktična_uporaba_PETaze_za_učinkovitejše_recikliranje_plastike PET TWINS: Praktična uporaba PETaze za učinkovitejše recikliranje plastike] (Tina Urh)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAU-China:_Nodulska_tovarna_DHA_in_EPA CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA] (Luka Fink)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/nuCloud:_Nov_oblak_za_shranjevanje_podatkov_na_osnovi_nukleotidov nuCloud: Nov oblak za shranjevanje podatkov na osnovi nukleotidov] (Aleš Poljanšek)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_metoda_diagnosticiranja_multiple_skleroze_-_miRADAR Nova metoda diagnosticiranja multiple skleroze - miRADAR] (Petja Premrl)<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v torek torej najkasneje v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored bo razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2023/24]].</div>

Bor Kunstelj