Wiki FKKT - User contributions [en]

2026-BNT-seminar

2026-05-20T06:36:47Z

Brina Klinar: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija 2026- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
V tabelo] prosim vpišite temo vašega projekta in kratko oznako.

{| class="wikitable"
! datum predstavitve !! naslov !! kratka koda projekta !! predstavlja !! recenzent 1 !! recenzent 2
|-
| 18/03/2025 || Bionanotehnološki pristop k dolgoročnemu arhiviranju digitalnih podatkov z DNA zaporedjem || DNArchive || Kozel, Vid || Bajramovikj, Denis || Ribič, Rebeka
|-
| 18/03/2025 || Sistem za adsorpcijo in razgradnjo gliadina (uporaba v medicini in prehranski industriji) || GlutenBlock || Horvat, Nejc || Šenica Pavletič, Primož || Hvalec, Jan
|-
| 18/03/2025 || Zaščita titanovih implantantov s samoobnovljivim nanofilmom || ImplantShield || Perc, Anže || Agrež, Tim-David || Klopčič, Klemen
|-
| 18/03/2025 || Bionanosenzorski obliž za merjenje cirkadianega ritma preko sline || CircAlign || Kovaček, Lucija || Bervar, Amber || Mohar, Teja
|-
| 25/03/2025 || Mazilo z odzivnimi nanodelci za selektivno zdravljenje atopijskega dermatitisa || SmartDerm || Pezo Zupančič, Neža || Habot, Hanna || Vogrič, Vanja
|-
| 25/03/2025 || Verižica za zaznavanje drog || SafeSip || Bogataj, Lenart || Jarm, Lea || Bajramovikj, Denis
|-
| 25/03/2025 || Nalepka za kožo za neinvazivno spremljanje hidracijskega stanja preko znoja|| HydraShow || Ferjančič, Lara || Todorovska, Milena || Šenica Pavletič, Primož
|-
| 25/03/2025 || Injekcija za hitrejšo rekonstrukcijo sprednje križne vezi (ACL) || RegelAcl || Briševac, Tea || Klinar, Brina || Agrež, Tim-David
|-
| 01/04/2025 || Kontaktne leče za zdravljenje migrene || MigraLens || Pšeničnik, Tiara || Kozel, Vid || Bervar, Amber
|-
| 01/04/2025 || Zaščitna nanoprevleka proti adheziji bakterij v prebavilih || FloraCoat || Jukić, Lea || Horvat, Nejc || Habot, Hanna
|-
| 01/04/2025 || Personalizirana indukcija in moduliranje spanja z uporabo nanoteles || NanoNap || Petrovič, Filip || Perc, Anže || Jarm, Lea
|-
| 01/04/2025 || Sistem za predčasno zaznavanje cvetenja cianobakterij || BloomSense || Novak, Anja || Kovaček, Lucija || Todorovska, Milena
|-
| 01/04/2025 || Sistem za začasno dodatno oskrbo s kisikom pri ovirani ventilaciji || Atmos || Oman Sušnik, Tonja || Pezo Zupančič, Neža || Klinar, Brina
|-
| 08/04/2025 || Pristop k zdravljenju neonatalne zlatenice || ZlatoHome || Auer, Špela || Bogataj, Lenart || Kozel, Vid
|-
| 08/04/2025 || Pametni venski graft za regeneracijo in spremljanje žil || VitaVein || Dimovska, Andreja || Ferjančič, Lara || Horvat, Nejc
|-
| 08/04/2025 || Injekcija za regeneracijo zob || ReDent || Gomiršek, Katarina || Briševac, Tea || Perc, Anže
|-
| 08/04/2025 || Detektor Salmonelle v jajcih (doma, male farme) || EggGuard || Titova, Varvara || Pšeničnik, Tiara || Kovaček, Lucija
|-
| 08/04/2025 || Zaščitna mreža za okna, ki filtrira onesnažen zrak || NanoNet || Kristan, Maruša || Jukić, Lea || Pezo Zupančič, Neža
|-
| 15/04/2025 || Sistemska zaščita pred komarji || DermVeil || Škorjanc, Meri || Petrovič, Filip || Bogataj, Lenart
|-
| 15/04/2025 || NFC biosenzor za zaznavanje kvarjenja jagodičevja na osnovi detekcije etanola z PQQ-ADH
|| PredictaBerry || Bregar, Jana || Novak, Anja || Ferjančič, Lara
|-
| 15/04/2025 || Filter za vodo, onesnaženo s težkimi kovinami || NanoFilter || Smrečnik, Meta || Oman Sušnik, Tonja || Briševac, Tea
|-
| 15/04/2025 || Encimski reaktor za razgrajevanje nanoplastike v pitni vodi || Aquazyme || Tušek, Marcel || Auer, Špela || Pšeničnik, Tiara
|-
| 15/04/2025 ||Biosenzor za zaznavo AMH na podlagi pSi ||NovaTrace AMH || Zupan, Zala || Dimovska, Andreja || Jukić, Lea
|-
| 22/04/2025 || Mikrofluidni nanosenzorski sistem za zgodnje zaznavanje bolezni mačk preko analize urina || LitterLab || Lešnik, Tjaša || Gomiršek, Katarina || Tušek, Marcel
|-
| 22/04/2025 || Lipidni nanodelci za izboljšano terapijo z iRNA proti pršici Varroa destructor || BeeOProtect || Čarman, Jasna || Titova, Varvara || Novak, Anja
|-
| 06/05/2025 || Sistem za tarčno dostavo butirata v aktivirane CAR-T celice || CAR-TNano || Ribič, Rebeka || Kristan, Maruša || Oman Sušnik, Tonja
|-
| 06/05/2025 || Nanodelci za tarčno inhibicijo spermatogeneze || Reverso || Hvalec, Jan || Škorjanc, Meri || Auer, Špela
|-
| 06/05/2025 || Zdravljenje Glikogenoze tip 1A z dostavo zdravila v hepatocite || GlucozymeShuttle || Klopčič, Klemen || Bregar, Jana || Dimovska, Andreja
|-
| 06/05/2025 || Hitri diagnostični test za srčni infarkt || HeartCheck || Mohar, Teja || Smrečnik, Meta || Gomiršek, Katarina
|-
| 06/05/2025 || Nanodelci za razgradnjo plastike v morjih|| OceanHeal || Vogrič, Vanja || Petrovič, Filip || Titova, Varvara
|-
| 13/05/2025 || Dvofagna hidrogelna platforma za zdravljenje biofilmskih okužb kroničnih ran || PhageNanoGel || Bajramovikj, Denis || Zupan, Zala || Kristan, Maruša
|-
| 13/05/2025 || Zobna zalivka z vgrajenim sintetičnim DNA-identifikacijskim markerjem || ToothTag || Šenica Pavletič, Primož || Lešnik, Tjaša || Škorjanc, Meri
|-
| 13/05/2025 || Nanosenzorji za PFAS || Nanosense PFAS || Agrež, Tim-David || Čarman, Jasna || Bregar, Jana
|-
| 13/05/2025 || dekorativni lak za nohte z vlažilnim in zaščitnim učinkom || Polite || Bervar, Amber || Ribič, Rebeka || Smrečnik, Meta
|-
| 20/05/2025 ||Zaščitni premaz za vodne senzorje ||EcoGuard || Habot, Hanna || Hvalec, Jan || Tušek, Marcel
|-
| 20/05/2025 || nano-biosenzorski hitri test za klope || NanoTickGard || Jarm, Lea || Klopčič, Klemen || Zupan, Zala
|-
| 20/05/2025 || Peroralna dostava inzulina z biorazgradljivimi nanodelci || NanoInsulin || Todorovska, Milena || Mohar, Teja || Lešnik, Tjaša
|-
| 20/05/2025 || Odzivni delci za inhibicijo rasti japonskega dresnika || Sayonara || Klinar, Brina || Vogrič, Vanja || Čarman, Jasna
|-
| 27/05/2025 || || || kratke predstavitve || ||
|}

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte '''dva dni pred predstavitvijo,''' kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Predstavitev naj bo dolga 15 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morata predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 26_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 26_nano_Craik_Venter.doc
* 26_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 26_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

2026-BNT-seminar

2026-05-12T09:35:31Z

Brina Klinar: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija 2026- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
V tabelo] prosim vpišite temo vašega projekta in kratko oznako.

{| class="wikitable"
! datum predstavitve !! naslov !! kratka koda projekta !! predstavlja !! recenzent 1 !! recenzent 2
|-
| 18/03/2025 || Bionanotehnološki pristop k dolgoročnemu arhiviranju digitalnih podatkov z DNA zaporedjem || DNArchive || Kozel, Vid || Bajramovikj, Denis || Ribič, Rebeka
|-
| 18/03/2025 || Sistem za adsorpcijo in razgradnjo gliadina (uporaba v medicini in prehranski industriji) || GlutenBlock || Horvat, Nejc || Šenica Pavletič, Primož || Hvalec, Jan
|-
| 18/03/2025 || Zaščita titanovih implantantov s samoobnovljivim nanofilmom || ImplantShield || Perc, Anže || Agrež, Tim-David || Klopčič, Klemen
|-
| 18/03/2025 || Bionanosenzorski obliž za merjenje cirkadianega ritma preko sline || CircAlign || Kovaček, Lucija || Bervar, Amber || Mohar, Teja
|-
| 25/03/2025 || Mazilo z odzivnimi nanodelci za selektivno zdravljenje atopijskega dermatitisa || SmartDerm || Pezo Zupančič, Neža || Habot, Hanna || Vogrič, Vanja
|-
| 25/03/2025 || Verižica za zaznavanje drog || SafeSip || Bogataj, Lenart || Jarm, Lea || Bajramovikj, Denis
|-
| 25/03/2025 || Nalepka za kožo za neinvazivno spremljanje hidracijskega stanja preko znoja|| HydraShow || Ferjančič, Lara || Todorovska, Milena || Šenica Pavletič, Primož
|-
| 25/03/2025 || Injekcija za hitrejšo rekonstrukcijo sprednje križne vezi (ACL) || RegelAcl || Briševac, Tea || Klinar, Brina || Agrež, Tim-David
|-
| 01/04/2025 || Kontaktne leče za zdravljenje migrene || MigraLens || Pšeničnik, Tiara || Kozel, Vid || Bervar, Amber
|-
| 01/04/2025 || Zaščitna nanoprevleka proti adheziji bakterij v prebavilih || FloraCoat || Jukić, Lea || Horvat, Nejc || Habot, Hanna
|-
| 01/04/2025 || Personalizirana indukcija in moduliranje spanja z uporabo nanoteles || NanoNap || Petrovič, Filip || Perc, Anže || Jarm, Lea
|-
| 01/04/2025 || Sistem za predčasno zaznavanje cvetenja cianobakterij || BloomSense || Novak, Anja || Kovaček, Lucija || Todorovska, Milena
|-
| 01/04/2025 || Sistem za začasno dodatno oskrbo s kisikom pri ovirani ventilaciji || Atmos || Oman Sušnik, Tonja || Pezo Zupančič, Neža || Klinar, Brina
|-
| 08/04/2025 || Pristop k zdravljenju neonatalne zlatenice || ZlatoHome || Auer, Špela || Bogataj, Lenart || Kozel, Vid
|-
| 08/04/2025 || Pametni venski graft za regeneracijo in spremljanje žil || VitaVein || Dimovska, Andreja || Ferjančič, Lara || Horvat, Nejc
|-
| 08/04/2025 || Injekcija za regeneracijo zob || ReDent || Gomiršek, Katarina || Briševac, Tea || Perc, Anže
|-
| 08/04/2025 || Detektor Salmonelle v jajcih (doma, male farme) || EggGuard || Titova, Varvara || Pšeničnik, Tiara || Kovaček, Lucija
|-
| 08/04/2025 || Zaščitna mreža za okna, ki filtrira onesnažen zrak || NanoNet || Kristan, Maruša || Jukić, Lea || Pezo Zupančič, Neža
|-
| 15/04/2025 || Sistemska zaščita pred komarji || DermVeil || Škorjanc, Meri || Petrovič, Filip || Bogataj, Lenart
|-
| 15/04/2025 || NFC biosenzor za zaznavanje kvarjenja jagodičevja na osnovi detekcije etanola z PQQ-ADH
|| PredictaBerry || Bregar, Jana || Novak, Anja || Ferjančič, Lara
|-
| 15/04/2025 || Filter za vodo, onesnaženo s težkimi kovinami || NanoFilter || Smrečnik, Meta || Oman Sušnik, Tonja || Briševac, Tea
|-
| 15/04/2025 || Encimski reaktor za razgrajevanje nanoplastike v pitni vodi || Aquazyme || Tušek, Marcel || Auer, Špela || Pšeničnik, Tiara
|-
| 15/04/2025 ||Biosenzor za zaznavo AMH na podlagi pSi ||NovaTrace AMH || Zupan, Zala || Dimovska, Andreja || Jukić, Lea
|-
| 22/04/2025 || Mikrofluidni nanosenzorski sistem za zgodnje zaznavanje bolezni mačk preko analize urina || LitterLab || Lešnik, Tjaša || Gomiršek, Katarina || Tušek, Marcel
|-
| 22/04/2025 || Lipidni nanodelci za izboljšano terapijo z iRNA proti pršici Varroa destructor || BeeOProtect || Čarman, Jasna || Titova, Varvara || Novak, Anja
|-
| 06/05/2025 || Sistem za tarčno dostavo butirata v aktivirane CAR-T celice || CAR-TNano || Ribič, Rebeka || Kristan, Maruša || Oman Sušnik, Tonja
|-
| 06/05/2025 || Nanodelci za tarčno inhibicijo spermatogeneze || Reverso || Hvalec, Jan || Škorjanc, Meri || Auer, Špela
|-
| 06/05/2025 || Zdravljenje Glikogenoze tip 1A z dostavo zdravila v hepatocite || GlucozymeShuttle || Klopčič, Klemen || Bregar, Jana || Dimovska, Andreja
|-
| 06/05/2025 || Hitri diagnostični test za srčni infarkt || HeartCheck || Mohar, Teja || Smrečnik, Meta || Gomiršek, Katarina
|-
| 06/05/2025 || Nanodelci za razgradnjo plastike v morjih|| OceanHeal || Vogrič, Vanja || Petrovič, Filip || Titova, Varvara
|-
| 13/05/2025 || Dvofagna hidrogelna platforma za zdravljenje biofilmskih okužb kroničnih ran || PhageNanoGel || Bajramovikj, Denis || Zupan, Zala || Kristan, Maruša
|-
| 13/05/2025 || Zobna zalivka z vgrajenim sintetičnim DNA-identifikacijskim markerjem || ToothTag || Šenica Pavletič, Primož || Lešnik, Tjaša || Škorjanc, Meri
|-
| 13/05/2025 || Nanosenzorji za PFAS || Nanosense PFAS || Agrež, Tim-David || Čarman, Jasna || Bregar, Jana
|-
| 13/05/2025 || dekorativni lak za nohte z vlažilnim in zaščitnim učinkom || Polite || Bervar, Amber || Ribič, Rebeka || Smrečnik, Meta
|-
| 20/05/2025 || || || Habot, Hanna || Hvalec, Jan || Tušek, Marcel
|-
| 20/05/2025 || || || Jarm, Lea || Klopčič, Klemen || Zupan, Zala
|-
| 20/05/2025 || Peroralna dostava inzulina z biorazgradljivimi nanodelci || NanoInsulin || Todorovska, Milena || Mohar, Teja || Lešnik, Tjaša
|-
| 20/05/2025 || Pametni delci za inhibicijo rasti japonskega dresnika || Sayonara || Klinar, Brina || Vogrič, Vanja || Čarman, Jasna
|-
| 27/05/2025 || || || kratke predstavitve || ||
|}

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte '''dva dni pred predstavitvijo,''' kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Predstavitev naj bo dolga 15 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morata predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 26_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 26_nano_Craik_Venter.doc
* 26_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 26_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

2026-BNT-seminar

2026-05-12T09:34:54Z

Brina Klinar: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija 2026- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
V tabelo] prosim vpišite temo vašega projekta in kratko oznako.

{| class="wikitable"
! datum predstavitve !! naslov !! kratka koda projekta !! predstavlja !! recenzent 1 !! recenzent 2
|-
| 18/03/2025 || Bionanotehnološki pristop k dolgoročnemu arhiviranju digitalnih podatkov z DNA zaporedjem || DNArchive || Kozel, Vid || Bajramovikj, Denis || Ribič, Rebeka
|-
| 18/03/2025 || Sistem za adsorpcijo in razgradnjo gliadina (uporaba v medicini in prehranski industriji) || GlutenBlock || Horvat, Nejc || Šenica Pavletič, Primož || Hvalec, Jan
|-
| 18/03/2025 || Zaščita titanovih implantantov s samoobnovljivim nanofilmom || ImplantShield || Perc, Anže || Agrež, Tim-David || Klopčič, Klemen
|-
| 18/03/2025 || Bionanosenzorski obliž za merjenje cirkadianega ritma preko sline || CircAlign || Kovaček, Lucija || Bervar, Amber || Mohar, Teja
|-
| 25/03/2025 || Mazilo z odzivnimi nanodelci za selektivno zdravljenje atopijskega dermatitisa || SmartDerm || Pezo Zupančič, Neža || Habot, Hanna || Vogrič, Vanja
|-
| 25/03/2025 || Verižica za zaznavanje drog || SafeSip || Bogataj, Lenart || Jarm, Lea || Bajramovikj, Denis
|-
| 25/03/2025 || Nalepka za kožo za neinvazivno spremljanje hidracijskega stanja preko znoja|| HydraShow || Ferjančič, Lara || Todorovska, Milena || Šenica Pavletič, Primož
|-
| 25/03/2025 || Injekcija za hitrejšo rekonstrukcijo sprednje križne vezi (ACL) || RegelAcl || Briševac, Tea || Klinar, Brina || Agrež, Tim-David
|-
| 01/04/2025 || Kontaktne leče za zdravljenje migrene || MigraLens || Pšeničnik, Tiara || Kozel, Vid || Bervar, Amber
|-
| 01/04/2025 || Zaščitna nanoprevleka proti adheziji bakterij v prebavilih || FloraCoat || Jukić, Lea || Horvat, Nejc || Habot, Hanna
|-
| 01/04/2025 || Personalizirana indukcija in moduliranje spanja z uporabo nanoteles || NanoNap || Petrovič, Filip || Perc, Anže || Jarm, Lea
|-
| 01/04/2025 || Sistem za predčasno zaznavanje cvetenja cianobakterij || BloomSense || Novak, Anja || Kovaček, Lucija || Todorovska, Milena
|-
| 01/04/2025 || Sistem za začasno dodatno oskrbo s kisikom pri ovirani ventilaciji || Atmos || Oman Sušnik, Tonja || Pezo Zupančič, Neža || Klinar, Brina
|-
| 08/04/2025 || Pristop k zdravljenju neonatalne zlatenice || ZlatoHome || Auer, Špela || Bogataj, Lenart || Kozel, Vid
|-
| 08/04/2025 || Pametni venski graft za regeneracijo in spremljanje žil || VitaVein || Dimovska, Andreja || Ferjančič, Lara || Horvat, Nejc
|-
| 08/04/2025 || Injekcija za regeneracijo zob || ReDent || Gomiršek, Katarina || Briševac, Tea || Perc, Anže
|-
| 08/04/2025 || Detektor Salmonelle v jajcih (doma, male farme) || EggGuard || Titova, Varvara || Pšeničnik, Tiara || Kovaček, Lucija
|-
| 08/04/2025 || Zaščitna mreža za okna, ki filtrira onesnažen zrak || NanoNet || Kristan, Maruša || Jukić, Lea || Pezo Zupančič, Neža
|-
| 15/04/2025 || Sistemska zaščita pred komarji || DermVeil || Škorjanc, Meri || Petrovič, Filip || Bogataj, Lenart
|-
| 15/04/2025 || NFC biosenzor za zaznavanje kvarjenja jagodičevja na osnovi detekcije etanola z PQQ-ADH
|| PredictaBerry || Bregar, Jana || Novak, Anja || Ferjančič, Lara
|-
| 15/04/2025 || Filter za vodo, onesnaženo s težkimi kovinami || NanoFilter || Smrečnik, Meta || Oman Sušnik, Tonja || Briševac, Tea
|-
| 15/04/2025 || Encimski reaktor za razgrajevanje nanoplastike v pitni vodi || Aquazyme || Tušek, Marcel || Auer, Špela || Pšeničnik, Tiara
|-
| 15/04/2025 ||Biosenzor za zaznavo AMH na podlagi pSi ||NovaTrace AMH || Zupan, Zala || Dimovska, Andreja || Jukić, Lea
|-
| 22/04/2025 || Mikrofluidni nanosenzorski sistem za zgodnje zaznavanje bolezni mačk preko analize urina || LitterLab || Lešnik, Tjaša || Gomiršek, Katarina || Tušek, Marcel
|-
| 22/04/2025 || Lipidni nanodelci za izboljšano terapijo z iRNA proti pršici Varroa destructor || BeeOProtect || Čarman, Jasna || Titova, Varvara || Novak, Anja
|-
| 06/05/2025 || Sistem za tarčno dostavo butirata v aktivirane CAR-T celice || CAR-TNano || Ribič, Rebeka || Kristan, Maruša || Oman Sušnik, Tonja
|-
| 06/05/2025 || Nanodelci za tarčno inhibicijo spermatogeneze || Reverso || Hvalec, Jan || Škorjanc, Meri || Auer, Špela
|-
| 06/05/2025 || Zdravljenje Glikogenoze tip 1A z dostavo zdravila v hepatocite || GlucozymeShuttle || Klopčič, Klemen || Bregar, Jana || Dimovska, Andreja
|-
| 06/05/2025 || Hitri diagnostični test za srčni infarkt || HeartCheck || Mohar, Teja || Smrečnik, Meta || Gomiršek, Katarina
|-
| 06/05/2025 || Nanodelci za razgradnjo plastike v morjih|| OceanHeal || Vogrič, Vanja || Petrovič, Filip || Titova, Varvara
|-
| 13/05/2025 || Dvofagna hidrogelna platforma za zdravljenje biofilmskih okužb kroničnih ran || PhageNanoGel || Bajramovikj, Denis || Zupan, Zala || Kristan, Maruša
|-
| 13/05/2025 || Zobna zalivka z vgrajenim sintetičnim DNA-identifikacijskim markerjem || ToothTag || Šenica Pavletič, Primož || Lešnik, Tjaša || Škorjanc, Meri
|-
| 13/05/2025 || Nanosenzorji za PFAS || Nanosense PFAS || Agrež, Tim-David || Čarman, Jasna || Bregar, Jana
|-
| 13/05/2025 || dekorativni lak za nohte z vlažilnim in zaščitnim učinkom || Polite || Bervar, Amber || Ribič, Rebeka || Smrečnik, Meta
|-
| 20/05/2025 || || || Habot, Hanna || Hvalec, Jan || Tušek, Marcel
|-
| 20/05/2025 || || || Jarm, Lea || Klopčič, Klemen || Zupan, Zala
|-
| 20/05/2025 || Peroralna dostava inzulina z biorazgradljivimi nanodelci || NanoInsulin || Todorovska, Milena || Mohar, Teja || Lešnik, Tjaša
|-
| 20/05/2025 || Delci za inhibicijo rasti japonskega dresnika || Sayonara || Klinar, Brina || Vogrič, Vanja || Čarman, Jasna
|-
| 27/05/2025 || || || kratke predstavitve || ||
|}

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte '''dva dni pred predstavitvijo,''' kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Predstavitev naj bo dolga 15 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morata predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 26_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 26_nano_Craik_Venter.doc
* 26_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 26_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

SKIPPIT

2026-05-04T19:47:13Z

Brina Klinar: /* Aptamer */

SKIPPIT je projekt študentske skupine iz Barcelone, ki je na tekmovanju iGEM leta 2025 osvojila zlato medaljo.
==Uvod==
Sintezni biologi so se zadnjih 50 let na področju regulacije izražanja proteinov fokusirali predvsem na kontrolo transkripcije z manipulacijo DNA. Pogoste metode temeljijo na uporabi transkripcijskih faktorjev in kemijsko inducibilnih promotorjev ter na regulaciji izražanja genov z RNA interferenco ali CRISPR. Te metode so sicer efektivne, a je odziv navadno počasen, saj vsebuje dodatno stopnjo sinteze in procesiranja RNA, problem interferenčnih metod pa je lahko tudi izven tarčno delovanje. Razvoj sintezne biologije bi se v prihodnosti tako moral osredotočiti na razvoj učinkovitejših in hitrejših orodij, ki bi jih bilo mogoče programirati.

==Opis projekta==
Študentska skupina se je vprašala, ali bi bilo mogoče ustvariti element, ki bi izražanje proteina reguliral na ravni translacije. Njihova ideja temelji na uporabi elementov SCR (stop codon readthrough elements). Gre za sekvence mRNA, ki se organizirajo v strukture, ki so sposobne interagirati z ribosomom na mestu stop kodona. Ta interakcija onemogoči terminacijo translacije in protein se tako sintetizira preko stop kodona. Na osnovi elementa SCR so želeli ustvariti RNA stikalo, ki bi se odzvalo na določen signal s spremembo strukture elementa SCR in posledično induciralo ali onemogočilo preskok stop kodona.

Osnovna zgradba takega stikala vključuje:

• Funkcionalni element RNA (FRE – functional RNA element) – sekvenca RNA, katere delovanje je odvisno od njene sekundarne strukture (v tem primeru element SCR). Preizkusili so dva elementa – SCR-D in SECIS DIO2.

• Konformacijski element RNA (CRE – conformational RNA element) – sekvenca RNA, katere konformacija se spremeni po interakciji s specifičnim ligandom (aptamer). V tem stikalu so uporabili aptamer za teofilin (Theo-ON-5 aptamer).

• Veznik (linker) – kratek oligomer, ki povezuje funkcionalna dela in omogoča, da nahajata v ustreznih konformacijah glede na prisotnost ali odsotnost liganda. Veznike so načrtovali z računalniškim orodjem TADPOLE.

Končno stikalo so zasnovali tako, da bi bil v odsotnosti liganda SCR del interagiral z ribosomom na mestu stop kodona in induciral prestop stop kodona ter omogočal izražanje dveh proteinov. V prisotnosti liganda bi aptamerni del stikala spremenil konformacijo, kar bi vplivalo tudi na konformacijo SCR dela. Ta ne bi bil več zmožen interagirati z ribosomom na mestu stop kodona in translacija bi se ustavila po transkripciji prvega proteina, drugi pa se ne bi izrazil.

==Eksperimentalni del==
Pred sestavo stikala je skupina vsak element posebej testirala v celicah HEK293T in v brezceličnem sistemu zajčjih retikulocitov. Uporabili so test, ki je temeljil na izražanju dveh različnih luciferaz – luciferaze iz ožigalkarja Renilla reniformis in luciferaze iz kresničke. Incidenco preskoka stop kodona in posledično aktivnost posameznega elementa, so kvantificirali z razmerjem luminiscence luciferaze iz Renilla reniformis in luciferaze iz kresničke.

===SCR-D===
Kot prvi element SCR so preizkusili SCR-D. Konstrukt vsebuje zapis za luciferazo iz ožigalkarja Renilla reniformis, ki se konča s stop kodonom TGA. Temu sledi regija SCR-D, ki je od ostalih delov konstrukta ločena z dvema samoizrezovalnima zaporedjema T2A. Nazadnje sledi še zapis za luciferazo iz kresničke. Pričakovano je, da bo tak konstrukt omogočal izražanje obeh luciferaz, saj bi morala prisotnost celotnega, funkcionalnega zaporedja SCR-D omogočati preskok stop kodona. To se je tudi zgodilo – s tem konstruktom so dosegli 9-% preskok stop kodona v celicah HEK293T, kar je za sesalske celice veliko.

Žal se je izkazalo, da aktivnost SCR-D ni odvisna od sekundarne strukture celotnega konstrukta – v primerih, ko so odstranili vse razen najbolj ohranjenega dela (PreDiapin) ali pa so odstranili le manj ohranjen del konstrukta (Hypopin) se je izkazalo, da aktivnost ne pade na 0 %, kot bi pričakovali. V primeru, ko so mutirali močno ohranjen del (PreDiapin) je aktivnost padla le za 1 %, kar kaže na to, da specifično nukleotidno zaporedje tega dela ni ključno za aktivnost elementa. Na podlagi teh rezultatov so sklenili, da SCR-D ni primeren element za konstrukcijo RNA stikala, saj naj bi to delovalo na osnovi specifičnih strukturnih sprememb.

===SECIS===
V nadaljevanju so v celicah HEK293T karakterizirali SCR element SECIS (Selenocysteine Insertion Sequence). Gre za dobro okarakteriziran strukturni motiv s ponovljivo aktivnostjo preskoka stop kodona.

Konstrukt je ponovno vseboval zapisa za luciferazo iz ožigalkarja Renilla reniformis in za luciferazo iz kresničke. Men genoma se je nahajal stop kodon med dvema samoizrezovalnima zaporedjema T2A, Zadnji del konstrukta pa je zaporedje SECIS. Tak konstrukt bi moral ponovno omogočiti izražanje obeh luciferaz, saj naj bi prisotnost aktivnega SECIS interagirala s stop kodonom.

Literatura navaja, da dodajanje selena ojača aktivnost SECIS elementa v sesalskih celicah. Da bi to preverili, so testirali aktivnost pri različnih koncentracijah teofilina in selena v treh neodvisnih eksperimentalnih krogih.

Izkazalo se je, da je SECIS element stabilen in zanesljiv v celicah HEK293T in da je uspešnost preskoka stop kodona konsistentno 8 – 10-% pri vseh eksperimentalnih pogojih. Aktivnost SECIS največja ob 100 nM dodatku selena, čeprav ta sam po sebi ni potreben za samo aktivnost elementa, ampak jo samo ojača. Po drugi strani pa teofilin do 1 mM koncentracije rahlo zmanjša aktivnost SECIS, pri 5 mM koncentraciji pa jo močno zmanjša. Iz tega so sklenili, da mora biti delovna koncentracija teofilina med 0 in 1 mM.

Isti element so nato testirali še v brezceličnem ekspresijskem sistemu. V tem sistemu dodajanje selena ni bilo potrebno, saj ja komercialni lizat vseboval vse potrebne kofaktorje. V tem primeru je bil za delovanje potreben protein SBP2 (SECIS-binding protein 2). Ta prepozna lasnično zanko elementa SECIS in aktivira mehanizem za vstavljanje selenocisteina. Za zagotovitev prisotnosti tega proteina so uporabili plazmid na katerem je bil zapis za SBP2 pod promotorjem T7. Eksperimenti so pokazali, da je aktivnost SECIS v brezceličnem sistemu odvisna od koncentracije SBP2. V primeru, ko v sistem niso dodali SBP2, je bila aktivnost preskoka stop kodona 0-%, pri povišanju koncentracije SBP2 na 300 ng/μL, pa je narasla na 14 %, kar je celo višje od aktivnosti, ki so jo zaznali v celicah HEK293T.

===Aptamer===
V nadaljevanju so testirali teofilinski aptamer Theo-ON-5, ki so ga izbrali zaradi visoke specifičnosti, poleg tega pa ga v sesalski celicah ni. Zaradi dobro okarakterizirane sekundarne strukture je bil perfekten kandidat za uporabo v stikalu. Pred uporabo v stikalu so želeli preveriti odzivnost na teofilin in določiti optimalne eksperimentalne pogoje za uporabo v celicah HEK293T.

Konstrukt, ki so ga uporabili za testiranje, je vseboval zapis za luciferazo iz Renilla reniformis , ki mu je sledil tako imenovan psevdovozel, ki omogoča premik bralnega okvirja (frameshift pseudoknot). Del konstrukta sta bila tudi teofilinski aptamer in zapis za luciferazo iz kresničke. Ta dva elementa se v tem konstruktu nista nahajala v bralnem okvirju, ki bi omogočal njuno ekspresijo. V odsotnosti teofilina se psevdovozel ne zvije v pravilno strukturo, kar onemogoči premik bralnega okvirja, zato ne pride do izražanja luciferaze izn kresničke. Ko je teofilin prisoten se ta veže na aptamer, kar spremeni strukturo celotnega konstrukta in dovoli psevdovozlu, da zavzame ustrezno strukturo, ta pa lahko inducira premik bralnega okvirja, kar postavi gen za luciferazo iz kresničke v ustrezen bralni okvir in omogoča njegovo izražanje.

Žal se je izkazalo, da se aptamer v celicah HEK293T na teofilin ne odziva konsistentno. Čeprav so nekateri podatki nakazovali na pričakovan trend, so bile razlike minimalne in ne tako velike, kot tiste, ki so bile podane v literaturi. Ekipa je predvidevala, da bi se to lahko zgodilo zaradi temperaturne nestabilnosti aptamera – ta je bil originalno namreč okarakteriziran pri 30 °C. Uporaba pri 37 °C bi lahko tako povzročila delno denaturacijo njegove strukture, kar bi oviralo ustrezno zvitje in vezavo liganda.

Konstrukt so nadaljnje testirali še v brezceličnem sistemu. Ta funkcionira pri 30 °C, kar se je izkazalo za ustreznejšo temperaturo za delovanje aptamera. V tem primeru se je incidenca premika bralnega okvirja povečala iz 7 % pri 0 mM koncentraciji teofilina na 15 % pri 2,4 mM koncentraciji teofilina. Ti rezultati potrjujejo, da je teofilinski apamer popolnoma funkcionalen v brezceličnih ekspresijskih sistemi pri 30 °C.

===RNA stikala===
Po validaciji obeh elementov RNA stikala v brezceličnem sistemu in optimizaciji koncentracije SBP2 (300 ng/mL) in teofilina (0 – 2,4 mM) je bil čas za sestavo stikal. Sestavili so 4 konstrukte, ki so se med seboj razlikovali le po dolžini veznika (L5 – veznik dolg 5 nukleotidov, L7 – veznik dolg 7 nukleotidov, L8 – veznik dolg 8 nukleotidov in L9 – veznik dolg 9 nukleotidov). Te so načrtovali z računalniškim orodjem TADPOLE.

V primeru kontrole, ki je vsebovala le aktiven SECIS, je bila aktivnost preskoka stop kodona 6-% (manj kot pri prejšnjih testiranjih: 12 – 14 %). To variacijo je skupina pripisala razlikam v aktivnostih posameznih lizatov.

Ko sta bila dodana aptamer in veznik, se je aktivnost SECIS delno zmanjšala – incidenca preskoka stop kodona je padla s 6 % na pod 4 % pri L5, na 3 % pri L7 in L8 in na 2 % pri L9. Ob dodatku teofilina je aktivnost preskoka stop kodona padla na približno 1 % pri vseh variantah, kar demonstrira konsistenten efekt stikala.

Zanimivo je, da je jakost preklopa med stanjema odvisna od dolžine veznika – najkrajši veznik (L5) bolje ohranja začetno strukturo SECIS , kar verjetno pripomore k močnejšemu preklopu. Arhitektura veznika torej direktno vpliva na funkcionalno povezavo med aptamerom in SECIS.

==Zaključek==
Študentska skupina je z opisanimi eksperimenti dokazala, da sta SECIS DIO2 in aptamer Theo-ON-5 funkcionalna v brezceličnem sistemu zajčjih retikulocitov in da lahko s kombiniranjem le-teh sestavimo regulatorno enoto, ki se odziva na teofilin. Dolžina veznika med enotami stikala določa bazalno aktivnost stikala in jakost preklopa ter predstavlja zanimiv vidik za nadaljnje raziskave in sestavo podobnih konstruktov v prihodnosti.

==Viri==
Barcelona-UB: Creation of Riboswitches (2025) - iGEM Video Universe. Accessed April 29, 2026. https://video.igem.org/videos/embed/wnAAjLnQPJYmF384yfE5J7?loop=1&autoplay=1

SKIPPIT

2026-05-04T19:26:08Z

Brina Klinar: /* Opis projekta */

SKIPPIT je projekt študentske skupine iz Barcelone, ki je na tekmovanju iGEM leta 2025 osvojila zlato medaljo.
==Uvod==
Sintezni biologi so se zadnjih 50 let na področju regulacije izražanja proteinov fokusirali predvsem na kontrolo transkripcije z manipulacijo DNA. Pogoste metode temeljijo na uporabi transkripcijskih faktorjev in kemijsko inducibilnih promotorjev ter na regulaciji izražanja genov z RNA interferenco ali CRISPR. Te metode so sicer efektivne, a je odziv navadno počasen, saj vsebuje dodatno stopnjo sinteze in procesiranja RNA, problem interferenčnih metod pa je lahko tudi izven tarčno delovanje. Razvoj sintezne biologije bi se v prihodnosti tako moral osredotočiti na razvoj učinkovitejših in hitrejših orodij, ki bi jih bilo mogoče programirati.

==Opis projekta==
Študentska skupina se je vprašala, ali bi bilo mogoče ustvariti element, ki bi izražanje proteina reguliral na ravni translacije. Njihova ideja temelji na uporabi elementov SCR (stop codon readthrough elements). Gre za sekvence mRNA, ki se organizirajo v strukture, ki so sposobne interagirati z ribosomom na mestu stop kodona. Ta interakcija onemogoči terminacijo translacije in protein se tako sintetizira preko stop kodona. Na osnovi elementa SCR so želeli ustvariti RNA stikalo, ki bi se odzvalo na določen signal s spremembo strukture elementa SCR in posledično induciralo ali onemogočilo preskok stop kodona.

Osnovna zgradba takega stikala vključuje:

• Funkcionalni element RNA (FRE – functional RNA element) – sekvenca RNA, katere delovanje je odvisno od njene sekundarne strukture (v tem primeru element SCR). Preizkusili so dva elementa – SCR-D in SECIS DIO2.

• Konformacijski element RNA (CRE – conformational RNA element) – sekvenca RNA, katere konformacija se spremeni po interakciji s specifičnim ligandom (aptamer). V tem stikalu so uporabili aptamer za teofilin (Theo-ON-5 aptamer).

• Veznik (linker) – kratek oligomer, ki povezuje funkcionalna dela in omogoča, da nahajata v ustreznih konformacijah glede na prisotnost ali odsotnost liganda. Veznike so načrtovali z računalniškim orodjem TADPOLE.

Končno stikalo so zasnovali tako, da bi bil v odsotnosti liganda SCR del interagiral z ribosomom na mestu stop kodona in induciral prestop stop kodona ter omogočal izražanje dveh proteinov. V prisotnosti liganda bi aptamerni del stikala spremenil konformacijo, kar bi vplivalo tudi na konformacijo SCR dela. Ta ne bi bil več zmožen interagirati z ribosomom na mestu stop kodona in translacija bi se ustavila po transkripciji prvega proteina, drugi pa se ne bi izrazil.

==Eksperimentalni del==
Pred sestavo stikala je skupina vsak element posebej testirala v celicah HEK293T in v brezceličnem sistemu zajčjih retikulocitov. Uporabili so test, ki je temeljil na izražanju dveh različnih luciferaz – luciferaze iz ožigalkarja Renilla reniformis in luciferaze iz kresničke. Incidenco preskoka stop kodona in posledično aktivnost posameznega elementa, so kvantificirali z razmerjem luminiscence luciferaze iz Renilla reniformis in luciferaze iz kresničke.

===SCR-D===
Kot prvi element SCR so preizkusili SCR-D. Konstrukt vsebuje zapis za luciferazo iz ožigalkarja Renilla reniformis, ki se konča s stop kodonom TGA. Temu sledi regija SCR-D, ki je od ostalih delov konstrukta ločena z dvema samoizrezovalnima zaporedjema T2A. Nazadnje sledi še zapis za luciferazo iz kresničke. Pričakovano je, da bo tak konstrukt omogočal izražanje obeh luciferaz, saj bi morala prisotnost celotnega, funkcionalnega zaporedja SCR-D omogočati preskok stop kodona. To se je tudi zgodilo – s tem konstruktom so dosegli 9-% preskok stop kodona v celicah HEK293T, kar je za sesalske celice veliko.

Žal se je izkazalo, da aktivnost SCR-D ni odvisna od sekundarne strukture celotnega konstrukta – v primerih, ko so odstranili vse razen najbolj ohranjenega dela (PreDiapin) ali pa so odstranili le manj ohranjen del konstrukta (Hypopin) se je izkazalo, da aktivnost ne pade na 0 %, kot bi pričakovali. V primeru, ko so mutirali močno ohranjen del (PreDiapin) je aktivnost padla le za 1 %, kar kaže na to, da specifično nukleotidno zaporedje tega dela ni ključno za aktivnost elementa. Na podlagi teh rezultatov so sklenili, da SCR-D ni primeren element za konstrukcijo RNA stikala, saj naj bi to delovalo na osnovi specifičnih strukturnih sprememb.

===SECIS===
V nadaljevanju so v celicah HEK293T karakterizirali SCR element SECIS (Selenocysteine Insertion Sequence). Gre za dobro okarakteriziran strukturni motiv s ponovljivo aktivnostjo preskoka stop kodona.

Konstrukt je ponovno vseboval zapisa za luciferazo iz ožigalkarja Renilla reniformis in za luciferazo iz kresničke. Men genoma se je nahajal stop kodon med dvema samoizrezovalnima zaporedjema T2A, Zadnji del konstrukta pa je zaporedje SECIS. Tak konstrukt bi moral ponovno omogočiti izražanje obeh luciferaz, saj naj bi prisotnost aktivnega SECIS interagirala s stop kodonom.

Literatura navaja, da dodajanje selena ojača aktivnost SECIS elementa v sesalskih celicah. Da bi to preverili, so testirali aktivnost pri različnih koncentracijah teofilina in selena v treh neodvisnih eksperimentalnih krogih.

Izkazalo se je, da je SECIS element stabilen in zanesljiv v celicah HEK293T in da je uspešnost preskoka stop kodona konsistentno 8 – 10-% pri vseh eksperimentalnih pogojih. Aktivnost SECIS največja ob 100 nM dodatku selena, čeprav ta sam po sebi ni potreben za samo aktivnost elementa, ampak jo samo ojača. Po drugi strani pa teofilin do 1 mM koncentracije rahlo zmanjša aktivnost SECIS, pri 5 mM koncentraciji pa jo močno zmanjša. Iz tega so sklenili, da mora biti delovna koncentracija teofilina med 0 in 1 mM.

Isti element so nato testirali še v brezceličnem ekspresijskem sistemu. V tem sistemu dodajanje selena ni bilo potrebno, saj ja komercialni lizat vseboval vse potrebne kofaktorje. V tem primeru je bil za delovanje potreben protein SBP2 (SECIS-binding protein 2). Ta prepozna lasnično zanko elementa SECIS in aktivira mehanizem za vstavljanje selenocisteina. Za zagotovitev prisotnosti tega proteina so uporabili plazmid na katerem je bil zapis za SBP2 pod promotorjem T7. Eksperimenti so pokazali, da je aktivnost SECIS v brezceličnem sistemu odvisna od koncentracije SBP2. V primeru, ko v sistem niso dodali SBP2, je bila aktivnost preskoka stop kodona 0-%, pri povišanju koncentracije SBP2 na 300 ng/μL, pa je narasla na 14 %, kar je celo višje od aktivnosti, ki so jo zaznali v celicah HEK293T.

===Aptamer===
V nadaljevanju so testirali teofilinski aptamer Theo-ON-5, ki so ga izbrali zaradi visoke specifičnosti, poleg tega pa ga v sesalski celicah ni. Zaradi dobro okarakterizirane sekundarne strukture je bil perfekten kandidat za uporabo v stikalu. Pred uporabo v stikalu so želeli preveriti odzivnost na teofilin in določiti optimalne eksperimentalne pogoje za uporabo v celicah HEK293T.

Konstrukt, ki so ga uporabili za testiranje, je vseboval zapis za luciferazo iz Renilla reniformis , ki mu je sledil tako imenovan psevdovozel, ki omogoča premik bralnega okvirja (frameshift pseudoknot). Del konstrukta sta bila tudi teofilinski aptamer in zapis za luciferazo iz kresničke. Ta dva elementa se v tem konstruktu nista nahajala v bralnem okvirju, ki bi omogočal njuno ekspresijo. V odsotnosti teofilina se psevdovozel ne zvije v pravilno strukturo, kar onemogoči premik bralnega okvirja, zato ne pride do izražanja luciferaze izn kresničke. Ko je teofilin prisoten se ta veže na aptamer, kar spremeni strukturo celotnega konstrukta in dovoli psevdovozlu, da zavzame ustrezno strukturo, ta pa lahko inducira premik bralnega okvirja, kar postavi gen za luciferazo iz kresničke v ustrezen bralni okvir in omogoča njegovo izražanje.

Žal se je izkazalo, da se aptamer v celicah HEK293T na teofilin ne odziva konsistentno. Čeprav so nekateri podatki nakazovali na pričakovan trend, so bile razlike minimalne in ne tako velike, kot tiste, ki so bile podane v literaturi. Ekipa je predvidevala, da bi se to lahko zgodilo zaradi temperaturne nestabilnosti aptamera – ta je bil originalno namreč okarakteriziran pri 30 °C. Uporaba pri 37 °C bi lahko tako povzročila delno denaturacijo njegove strukture, kar bi oviralo ustrezno zvitje in vezavo liganda.

Konstrukt so nadaljnje testirali še v brezceličnem sistemu. Ta funkcionira pri 30 °C, kar se je izkazalo za ustreznejšo temperaturo za delovanje aptamera. V tem primeru se je aktivnost preskoka stop kodona povečala iz 7 % pri 0 mM koncentraciji teofilina na 15 % pri 2,4 mM koncentraciji teofilina. Ti rezultati potrjujejo, da je teofilinski apamer popolnoma funkcionalen v brezceličnih ekspresijskih sistemi pri 30 °C.

===RNA stikala===
Po validaciji obeh elementov RNA stikala v brezceličnem sistemu in optimizaciji koncentracije SBP2 (300 ng/mL) in teofilina (0 – 2,4 mM) je bil čas za sestavo stikal. Sestavili so 4 konstrukte, ki so se med seboj razlikovali le po dolžini veznika (L5 – veznik dolg 5 nukleotidov, L7 – veznik dolg 7 nukleotidov, L8 – veznik dolg 8 nukleotidov in L9 – veznik dolg 9 nukleotidov). Te so načrtovali z računalniškim orodjem TADPOLE.

V primeru kontrole, ki je vsebovala le aktiven SECIS, je bila aktivnost preskoka stop kodona 6-% (manj kot pri prejšnjih testiranjih: 12 – 14 %). To variacijo je skupina pripisala razlikam v aktivnostih posameznih lizatov.

Ko sta bila dodana aptamer in veznik, se je aktivnost SECIS delno zmanjšala – incidenca preskoka stop kodona je padla s 6 % na pod 4 % pri L5, na 3 % pri L7 in L8 in na 2 % pri L9. Ob dodatku teofilina je aktivnost preskoka stop kodona padla na približno 1 % pri vseh variantah, kar demonstrira konsistenten efekt stikala.

Zanimivo je, da je jakost preklopa med stanjema odvisna od dolžine veznika – najkrajši veznik (L5) bolje ohranja začetno strukturo SECIS , kar verjetno pripomore k močnejšemu preklopu. Arhitektura veznika torej direktno vpliva na funkcionalno povezavo med aptamerom in SECIS.

==Zaključek==
Študentska skupina je z opisanimi eksperimenti dokazala, da sta SECIS DIO2 in aptamer Theo-ON-5 funkcionalna v brezceličnem sistemu zajčjih retikulocitov in da lahko s kombiniranjem le-teh sestavimo regulatorno enoto, ki se odziva na teofilin. Dolžina veznika med enotami stikala določa bazalno aktivnost stikala in jakost preklopa ter predstavlja zanimiv vidik za nadaljnje raziskave in sestavo podobnih konstruktov v prihodnosti.

==Viri==
Barcelona-UB: Creation of Riboswitches (2025) - iGEM Video Universe. Accessed April 29, 2026. https://video.igem.org/videos/embed/wnAAjLnQPJYmF384yfE5J7?loop=1&autoplay=1

SKIPPIT

2026-05-03T20:06:40Z

Brina Klinar:

SKIPPIT je projekt študentske skupine iz Barcelone, ki je na tekmovanju iGEM leta 2025 osvojila zlato medaljo.
==Uvod==
Sintezni biologi so se zadnjih 50 let na področju regulacije izražanja proteinov fokusirali predvsem na kontrolo transkripcije z manipulacijo DNA. Pogoste metode temeljijo na uporabi transkripcijskih faktorjev in kemijsko inducibilnih promotorjev ter na regulaciji izražanja genov z RNA interferenco ali CRISPR. Te metode so sicer efektivne, a je odziv navadno počasen, saj vsebuje dodatno stopnjo sinteze in procesiranja RNA, problem interferenčnih metod pa je lahko tudi izven tarčno delovanje. Razvoj sintezne biologije bi se v prihodnosti tako moral osredotočiti na razvoj učinkovitejših in hitrejših orodij, ki bi jih bilo mogoče programirati.

==Opis projekta==
Študentska skupina se je vprašala, ali bi bilo mogoče ustvariti element, ki bi izražanje proteina reguliral na ravni transkripcije. Njihova ideja temelji na uporabi elementov SCR (stop codon readthrough elements). Gre za sekvence mRNA, ki se organizirajo v strukture, ki so sposobne interagirati z ribosomom na mestu stop kodona. Ta interakcija onemogoči terminacijo translacije in protein se tako sintetizira preko stop kodona. Na osnovi elementa SCR so želeli ustvariti RNA stikalo, ki bi se odzvalo na določen signal s spremembo strukture elementa SCR in posledično induciralo ali onemogočilo preskok stop kodona.

Osnovna zgradba takega stikala vključuje:

• Funkcionalni element RNA (FRE – functional RNA element) – sekvenca RNA, katere delovanje je odvisno od njene sekundarne strukture (v tem primeru element SCR). Preizkusili so dva elementa – SCR-D in SECIS DIO2.

• Konformacijski element RNA (CRE – conformational RNA element) – sekvenca RNA, katere konformacija se spremeni po interakciji s specifičnim ligandom (aptamer). V tem stikalu so uporabili aptamer za teofilin (Theo-ON-5 aptamer).

• Veznik (linker) – kratek oligomer, ki povezuje funkcionalna dela in omogoča, da nahajata v ustreznih konformacijah glede na prisotnost ali odsotnost liganda. Veznike so načrtovali z računalniškim orodjem TADPOLE.

Končno stikalo so zasnovali tako, da bi bil v odsotnosti liganda SCR del interagiral z ribosomom na mestu stop kodona in induciral prestop stop kodona ter omogočal izražanje dveh proteinov. V prisotnosti liganda bi aptamerni del stikala spremenil konformacijo, kar bi vplivalo tudi na konformacijo SCR dela. Ta ne bi bil več zmožen interagirati z ribosomom na mestu stop kodona in translacija bi se ustavila po transkripciji prvega proteina, drugi pa se ne bi izrazil.

==Eksperimentalni del==
Pred sestavo stikala je skupina vsak element posebej testirala v celicah HEK293T in v brezceličnem sistemu zajčjih retikulocitov. Uporabili so test, ki je temeljil na izražanju dveh različnih luciferaz – luciferaze iz ožigalkarja Renilla reniformis in luciferaze iz kresničke. Incidenco preskoka stop kodona in posledično aktivnost posameznega elementa, so kvantificirali z razmerjem luminiscence luciferaze iz Renilla reniformis in luciferaze iz kresničke.

===SCR-D===
Kot prvi element SCR so preizkusili SCR-D. Konstrukt vsebuje zapis za luciferazo iz ožigalkarja Renilla reniformis, ki se konča s stop kodonom TGA. Temu sledi regija SCR-D, ki je od ostalih delov konstrukta ločena z dvema samoizrezovalnima zaporedjema T2A. Nazadnje sledi še zapis za luciferazo iz kresničke. Pričakovano je, da bo tak konstrukt omogočal izražanje obeh luciferaz, saj bi morala prisotnost celotnega, funkcionalnega zaporedja SCR-D omogočati preskok stop kodona. To se je tudi zgodilo – s tem konstruktom so dosegli 9-% preskok stop kodona v celicah HEK293T, kar je za sesalske celice veliko.

Žal se je izkazalo, da aktivnost SCR-D ni odvisna od sekundarne strukture celotnega konstrukta – v primerih, ko so odstranili vse razen najbolj ohranjenega dela (PreDiapin) ali pa so odstranili le manj ohranjen del konstrukta (Hypopin) se je izkazalo, da aktivnost ne pade na 0 %, kot bi pričakovali. V primeru, ko so mutirali močno ohranjen del (PreDiapin) je aktivnost padla le za 1 %, kar kaže na to, da specifično nukleotidno zaporedje tega dela ni ključno za aktivnost elementa. Na podlagi teh rezultatov so sklenili, da SCR-D ni primeren element za konstrukcijo RNA stikala, saj naj bi to delovalo na osnovi specifičnih strukturnih sprememb.

===SECIS===
V nadaljevanju so v celicah HEK293T karakterizirali SCR element SECIS (Selenocysteine Insertion Sequence). Gre za dobro okarakteriziran strukturni motiv s ponovljivo aktivnostjo preskoka stop kodona.

Konstrukt je ponovno vseboval zapisa za luciferazo iz ožigalkarja Renilla reniformis in za luciferazo iz kresničke. Men genoma se je nahajal stop kodon med dvema samoizrezovalnima zaporedjema T2A, Zadnji del konstrukta pa je zaporedje SECIS. Tak konstrukt bi moral ponovno omogočiti izražanje obeh luciferaz, saj naj bi prisotnost aktivnega SECIS interagirala s stop kodonom.

Literatura navaja, da dodajanje selena ojača aktivnost SECIS elementa v sesalskih celicah. Da bi to preverili, so testirali aktivnost pri različnih koncentracijah teofilina in selena v treh neodvisnih eksperimentalnih krogih.

Izkazalo se je, da je SECIS element stabilen in zanesljiv v celicah HEK293T in da je uspešnost preskoka stop kodona konsistentno 8 – 10-% pri vseh eksperimentalnih pogojih. Aktivnost SECIS največja ob 100 nM dodatku selena, čeprav ta sam po sebi ni potreben za samo aktivnost elementa, ampak jo samo ojača. Po drugi strani pa teofilin do 1 mM koncentracije rahlo zmanjša aktivnost SECIS, pri 5 mM koncentraciji pa jo močno zmanjša. Iz tega so sklenili, da mora biti delovna koncentracija teofilina med 0 in 1 mM.

Isti element so nato testirali še v brezceličnem ekspresijskem sistemu. V tem sistemu dodajanje selena ni bilo potrebno, saj ja komercialni lizat vseboval vse potrebne kofaktorje. V tem primeru je bil za delovanje potreben protein SBP2 (SECIS-binding protein 2). Ta prepozna lasnično zanko elementa SECIS in aktivira mehanizem za vstavljanje selenocisteina. Za zagotovitev prisotnosti tega proteina so uporabili plazmid na katerem je bil zapis za SBP2 pod promotorjem T7. Eksperimenti so pokazali, da je aktivnost SECIS v brezceličnem sistemu odvisna od koncentracije SBP2. V primeru, ko v sistem niso dodali SBP2, je bila aktivnost preskoka stop kodona 0-%, pri povišanju koncentracije SBP2 na 300 ng/μL, pa je narasla na 14 %, kar je celo višje od aktivnosti, ki so jo zaznali v celicah HEK293T.

===Aptamer===
V nadaljevanju so testirali teofilinski aptamer Theo-ON-5, ki so ga izbrali zaradi visoke specifičnosti, poleg tega pa ga v sesalski celicah ni. Zaradi dobro okarakterizirane sekundarne strukture je bil perfekten kandidat za uporabo v stikalu. Pred uporabo v stikalu so želeli preveriti odzivnost na teofilin in določiti optimalne eksperimentalne pogoje za uporabo v celicah HEK293T.

Konstrukt, ki so ga uporabili za testiranje, je vseboval zapis za luciferazo iz Renilla reniformis , ki mu je sledil tako imenovan psevdovozel, ki omogoča premik bralnega okvirja (frameshift pseudoknot). Del konstrukta sta bila tudi teofilinski aptamer in zapis za luciferazo iz kresničke. Ta dva elementa se v tem konstruktu nista nahajala v bralnem okvirju, ki bi omogočal njuno ekspresijo. V odsotnosti teofilina se psevdovozel ne zvije v pravilno strukturo, kar onemogoči premik bralnega okvirja, zato ne pride do izražanja luciferaze izn kresničke. Ko je teofilin prisoten se ta veže na aptamer, kar spremeni strukturo celotnega konstrukta in dovoli psevdovozlu, da zavzame ustrezno strukturo, ta pa lahko inducira premik bralnega okvirja, kar postavi gen za luciferazo iz kresničke v ustrezen bralni okvir in omogoča njegovo izražanje.

Žal se je izkazalo, da se aptamer v celicah HEK293T na teofilin ne odziva konsistentno. Čeprav so nekateri podatki nakazovali na pričakovan trend, so bile razlike minimalne in ne tako velike, kot tiste, ki so bile podane v literaturi. Ekipa je predvidevala, da bi se to lahko zgodilo zaradi temperaturne nestabilnosti aptamera – ta je bil originalno namreč okarakteriziran pri 30 °C. Uporaba pri 37 °C bi lahko tako povzročila delno denaturacijo njegove strukture, kar bi oviralo ustrezno zvitje in vezavo liganda.

Konstrukt so nadaljnje testirali še v brezceličnem sistemu. Ta funkcionira pri 30 °C, kar se je izkazalo za ustreznejšo temperaturo za delovanje aptamera. V tem primeru se je aktivnost preskoka stop kodona povečala iz 7 % pri 0 mM koncentraciji teofilina na 15 % pri 2,4 mM koncentraciji teofilina. Ti rezultati potrjujejo, da je teofilinski apamer popolnoma funkcionalen v brezceličnih ekspresijskih sistemi pri 30 °C.

===RNA stikala===
Po validaciji obeh elementov RNA stikala v brezceličnem sistemu in optimizaciji koncentracije SBP2 (300 ng/mL) in teofilina (0 – 2,4 mM) je bil čas za sestavo stikal. Sestavili so 4 konstrukte, ki so se med seboj razlikovali le po dolžini veznika (L5 – veznik dolg 5 nukleotidov, L7 – veznik dolg 7 nukleotidov, L8 – veznik dolg 8 nukleotidov in L9 – veznik dolg 9 nukleotidov). Te so načrtovali z računalniškim orodjem TADPOLE.

V primeru kontrole, ki je vsebovala le aktiven SECIS, je bila aktivnost preskoka stop kodona 6-% (manj kot pri prejšnjih testiranjih: 12 – 14 %). To variacijo je skupina pripisala razlikam v aktivnostih posameznih lizatov.

Ko sta bila dodana aptamer in veznik, se je aktivnost SECIS delno zmanjšala – incidenca preskoka stop kodona je padla s 6 % na pod 4 % pri L5, na 3 % pri L7 in L8 in na 2 % pri L9. Ob dodatku teofilina je aktivnost preskoka stop kodona padla na približno 1 % pri vseh variantah, kar demonstrira konsistenten efekt stikala.

Zanimivo je, da je jakost preklopa med stanjema odvisna od dolžine veznika – najkrajši veznik (L5) bolje ohranja začetno strukturo SECIS , kar verjetno pripomore k močnejšemu preklopu. Arhitektura veznika torej direktno vpliva na funkcionalno povezavo med aptamerom in SECIS.

==Zaključek==
Študentska skupina je z opisanimi eksperimenti dokazala, da sta SECIS DIO2 in aptamer Theo-ON-5 funkcionalna v brezceličnem sistemu zajčjih retikulocitov in da lahko s kombiniranjem le-teh sestavimo regulatorno enoto, ki se odziva na teofilin. Dolžina veznika med enotami stikala določa bazalno aktivnost stikala in jakost preklopa ter predstavlja zanimiv vidik za nadaljnje raziskave in sestavo podobnih konstruktov v prihodnosti.

==Viri==
Barcelona-UB: Creation of Riboswitches (2025) - iGEM Video Universe. Accessed April 29, 2026. https://video.igem.org/videos/embed/wnAAjLnQPJYmF384yfE5J7?loop=1&autoplay=1

SKIPPIT

2026-05-03T15:02:41Z

Brina Klinar: /* Opis projekta */

SKIPPIT

2026-05-03T15:02:01Z

Brina Klinar: /* Uvod */

SKIPPIT

2026-05-02T13:52:18Z

Brina Klinar:

SKIPPIT je projekt študentske skupine iz Barcelone, ki je na tekmovanju iGEM leta 2025 osvojila zlato medaljo.
==Uvod==
==Opis projekta==
==Zaključek==
==Viri==

SKIPPIT

2026-04-28T10:53:38Z

Brina Klinar: Created page with "==Uvod== ==Opis projekta== ==Zaključek== ==Viri=="

==Uvod==
==Opis projekta==
==Zaključek==
==Viri==

Seminarji SB 2025/26

2026-04-28T10:51:51Z

Brina Klinar:

V študijskem letu 2025/26 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OrthologTransformer OrthologTransformer] (Tim David Agrež)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetsko_kodirani_biosenzor_za_spremljanje_depolimerizacije_morskih_polisarahidov Genetsko kodirani biosenzor za spremljanje depolimerizacije morskih polisarahidov] (Vanja Vogrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacije_na_podlagi_RNA_v_heterogenih_populacijah_mimetičnih_celic Komunikacije na podlagi RNA v heterogenih populacijah mimetičnih celic] (Marcel Tušek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovanje_oscilatorjev_proteinov_na_membrani_vodenih_s_%C5%A1umom_v_%C5%BEivih_celicah Načrtovanje oscilatorjev proteinov na membrani vodenih s šumom v živih celicah] (Varvara Titova)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Samoinducibilno_molekulsko_stikalo_za_biosintezo_hialuronske_kisline_z_nizko_molekulsko_maso Samoinducibilno molekulsko stikalo za biosintezo hialuronske kisline z nizko molekulsko maso] (Nejc Horvat)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_metabolizma_bakterije_E.coli_za_fiksacijo_CO₂ Reprogramiranje metabolizma bakterije E. coli za fiksacijo CO₂] (Ana Kastelic)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organokataliziran_nastanek_protocelic_od_spodaj_navzgor Organokataliziran nastanek protocelic od spodaj navzgor] (Maruša Kristan)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilen_ribocim_za_prenos_signala_RNA Programabilen ribocim za prenos signala RNA] (Klemen Klopčič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vnos CU-bogatega elementa v 3′ UTR poveča stabilnost in izražanje sintetične mRNA In Vivo] (Lea Jarm)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_centralnega_metabolizma_pri_Komagataella_phaffii_za_učinkovito_sintezo_D-manoze Preoblikovanje centralnega metabolizma pri Komagataella phaffii za učinkovito sintezo D-manoze] (Špela Auer)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Medvrstni_prenos_kromosomov_v_kvasovkah_vodi_do_izboljšanja_fenotipa_in_raznolikih_transkripcijskih_odzivov Medvrstni prenos kromosomov v kvasovkah vodi do izboljšanja fenotipa in raznolikih transkripcijskih odzivov] (Anja Novak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NomNomNylon NomNomNylon] (Rebeka Ribič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FoCas FoCas] (Amber Bervar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TasAnchor TasAnchor] (Jasna Čarman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SKIPPIT SKIPPIT] (Brina Klinar)

(zgornji primer nadomestite s prvim letošnjim seminarjem iz študentskih projektov)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej najkasneje v ponedeljek do 23:59). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive (dostopno samo študentom tekočega letnika).

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2024/25]].

Seminarji SB 2025/26

2026-04-28T10:51:12Z

Brina Klinar:

V študijskem letu 2025/26 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OrthologTransformer OrthologTransformer] (Tim David Agrež)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetsko_kodirani_biosenzor_za_spremljanje_depolimerizacije_morskih_polisarahidov Genetsko kodirani biosenzor za spremljanje depolimerizacije morskih polisarahidov] (Vanja Vogrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacije_na_podlagi_RNA_v_heterogenih_populacijah_mimetičnih_celic Komunikacije na podlagi RNA v heterogenih populacijah mimetičnih celic] (Marcel Tušek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovanje_oscilatorjev_proteinov_na_membrani_vodenih_s_%C5%A1umom_v_%C5%BEivih_celicah Načrtovanje oscilatorjev proteinov na membrani vodenih s šumom v živih celicah] (Varvara Titova)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Samoinducibilno_molekulsko_stikalo_za_biosintezo_hialuronske_kisline_z_nizko_molekulsko_maso Samoinducibilno molekulsko stikalo za biosintezo hialuronske kisline z nizko molekulsko maso] (Nejc Horvat)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_metabolizma_bakterije_E.coli_za_fiksacijo_CO₂ Reprogramiranje metabolizma bakterije E. coli za fiksacijo CO₂] (Ana Kastelic)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organokataliziran_nastanek_protocelic_od_spodaj_navzgor Organokataliziran nastanek protocelic od spodaj navzgor] (Maruša Kristan)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilen_ribocim_za_prenos_signala_RNA Programabilen ribocim za prenos signala RNA] (Klemen Klopčič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vnos CU-bogatega elementa v 3′ UTR poveča stabilnost in izražanje sintetične mRNA In Vivo] (Lea Jarm)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_centralnega_metabolizma_pri_Komagataella_phaffii_za_učinkovito_sintezo_D-manoze Preoblikovanje centralnega metabolizma pri Komagataella phaffii za učinkovito sintezo D-manoze] (Špela Auer)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Medvrstni_prenos_kromosomov_v_kvasovkah_vodi_do_izboljšanja_fenotipa_in_raznolikih_transkripcijskih_odzivov Medvrstni prenos kromosomov v kvasovkah vodi do izboljšanja fenotipa in raznolikih transkripcijskih odzivov] (Anja Novak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NomNomNylon NomNomNylon] (Rebeka Ribič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FoCas FoCas] (Amber Bervar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TasAnchor TasAnchor] (Jasna Čarman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ SKIPPIT] (Brina Klinar)

(zgornji primer nadomestite s prvim letošnjim seminarjem iz študentskih projektov)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej najkasneje v ponedeljek do 23:59). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive (dostopno samo študentom tekočega letnika).

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2024/25]].

Seminarji SB 2025/26

2026-04-28T10:49:34Z

Brina Klinar:

V študijskem letu 2025/26 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OrthologTransformer OrthologTransformer] (Tim David Agrež)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetsko_kodirani_biosenzor_za_spremljanje_depolimerizacije_morskih_polisarahidov Genetsko kodirani biosenzor za spremljanje depolimerizacije morskih polisarahidov] (Vanja Vogrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacije_na_podlagi_RNA_v_heterogenih_populacijah_mimetičnih_celic Komunikacije na podlagi RNA v heterogenih populacijah mimetičnih celic] (Marcel Tušek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovanje_oscilatorjev_proteinov_na_membrani_vodenih_s_%C5%A1umom_v_%C5%BEivih_celicah Načrtovanje oscilatorjev proteinov na membrani vodenih s šumom v živih celicah] (Varvara Titova)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Samoinducibilno_molekulsko_stikalo_za_biosintezo_hialuronske_kisline_z_nizko_molekulsko_maso Samoinducibilno molekulsko stikalo za biosintezo hialuronske kisline z nizko molekulsko maso] (Nejc Horvat)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_metabolizma_bakterije_E.coli_za_fiksacijo_CO₂ Reprogramiranje metabolizma bakterije E. coli za fiksacijo CO₂] (Ana Kastelic)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organokataliziran_nastanek_protocelic_od_spodaj_navzgor Organokataliziran nastanek protocelic od spodaj navzgor] (Maruša Kristan)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilen_ribocim_za_prenos_signala_RNA Programabilen ribocim za prenos signala RNA] (Klemen Klopčič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vnos CU-bogatega elementa v 3′ UTR poveča stabilnost in izražanje sintetične mRNA In Vivo] (Lea Jarm)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_centralnega_metabolizma_pri_Komagataella_phaffii_za_učinkovito_sintezo_D-manoze Preoblikovanje centralnega metabolizma pri Komagataella phaffii za učinkovito sintezo D-manoze] (Špela Auer)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Medvrstni_prenos_kromosomov_v_kvasovkah_vodi_do_izboljšanja_fenotipa_in_raznolikih_transkripcijskih_odzivov Medvrstni prenos kromosomov v kvasovkah vodi do izboljšanja fenotipa in raznolikih transkripcijskih odzivov] (Anja Novak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NomNomNylon NomNomNylon] (Rebeka Ribič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FoCas FoCas] (Amber Bervar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TasAnchor TasAnchor] (Jasna Čarman)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ SKIPPIT] (Brina Klinar)

(zgornji primer nadomestite s prvim letošnjim seminarjem iz študentskih projektov)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej najkasneje v ponedeljek do 23:59). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive (dostopno samo študentom tekočega letnika).

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2024/25]].

Seminarji SB 2025/26

2026-04-28T10:48:59Z

Brina Klinar:

V študijskem letu 2025/26 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OrthologTransformer OrthologTransformer] (Tim David Agrež)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetsko_kodirani_biosenzor_za_spremljanje_depolimerizacije_morskih_polisarahidov Genetsko kodirani biosenzor za spremljanje depolimerizacije morskih polisarahidov] (Vanja Vogrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacije_na_podlagi_RNA_v_heterogenih_populacijah_mimetičnih_celic Komunikacije na podlagi RNA v heterogenih populacijah mimetičnih celic] (Marcel Tušek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovanje_oscilatorjev_proteinov_na_membrani_vodenih_s_%C5%A1umom_v_%C5%BEivih_celicah Načrtovanje oscilatorjev proteinov na membrani vodenih s šumom v živih celicah] (Varvara Titova)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Samoinducibilno_molekulsko_stikalo_za_biosintezo_hialuronske_kisline_z_nizko_molekulsko_maso Samoinducibilno molekulsko stikalo za biosintezo hialuronske kisline z nizko molekulsko maso] (Nejc Horvat)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_metabolizma_bakterije_E.coli_za_fiksacijo_CO₂ Reprogramiranje metabolizma bakterije E. coli za fiksacijo CO₂] (Ana Kastelic)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organokataliziran_nastanek_protocelic_od_spodaj_navzgor Organokataliziran nastanek protocelic od spodaj navzgor] (Maruša Kristan)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilen_ribocim_za_prenos_signala_RNA Programabilen ribocim za prenos signala RNA] (Klemen Klopčič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vnos CU-bogatega elementa v 3′ UTR poveča stabilnost in izražanje sintetične mRNA In Vivo] (Lea Jarm)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_centralnega_metabolizma_pri_Komagataella_phaffii_za_učinkovito_sintezo_D-manoze Preoblikovanje centralnega metabolizma pri Komagataella phaffii za učinkovito sintezo D-manoze] (Špela Auer)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Medvrstni_prenos_kromosomov_v_kvasovkah_vodi_do_izboljšanja_fenotipa_in_raznolikih_transkripcijskih_odzivov Medvrstni prenos kromosomov v kvasovkah vodi do izboljšanja fenotipa in raznolikih transkripcijskih odzivov] (Anja Novak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NomNomNylon NomNomNylon] (Rebeka Ribič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FoCas FoCas] (Amber Bervar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TasAnchor TasAnchor] (Jasna Čarman)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SKIPPIT] (Brina Klinar)

(zgornji primer nadomestite s prvim letošnjim seminarjem iz študentskih projektov)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej najkasneje v ponedeljek do 23:59). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive (dostopno samo študentom tekočega letnika).

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2024/25]].

Razporejanje plazmidov v hčerinski celici

2024-05-05T05:56:39Z

Brina Klinar: /* Razporeditveni sistem tipa II */

=Uvod=
Plazmidi živijo s svojo gostiteljsko celico v simbiozi. Razvili so kar nekaj strategij za obstoj znotraj bakterijske populacije med katerimi je razporeditveni sistem. Vsi razporeditveni sistemi so sestavljeni iz treh delov: ene ali več kopij razporeditvenega mesta (centromer), CBP (centromerni vezavni protein) in NTP-aze.

=Izračun izgube plazmida=
Plazmidi z majhnim kopirnim številom se morajo za svoj obstoj nanašati na razporeditveni sistem, plazmidi z visokim številom kopij pa se zanašajo na pasivno difuzijo.
Za naključno distribucijo velja: Ploss = 2^(1-n), kjer je »n« število kopij v celici.

=Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov=
Razporeditveni sistemi so nujni za transport in vzpostavitev sistema s plazmidno DNA. Poznamo 3 razporeditvene sisteme, ki se razlikujejo po tipu razporejanja z NTP-azo. Centromeri so značilna ohranjena zaporedja na plazmidu, ki služijo kot prepoznavna mesta za CBP. CBP prepozna zaporedje na plazmidu in se tako veže na centromer. To deluje kot most med plazmidom in ustrezno NTP-azo, ki omogoča premik plazmida.

Tip I ima Walker ATP-azo, ki ločuje plazmid s formacijo dinamičnega vzorca na bakterijskem nukleoidu. Tip II uporablja aktinu podobno ATP-azo, ki polimerizira v dinamične filamente, ki potiskajo plazmida narazen. Tip III ima tubulinu podobne GTP-aze, ki prav tako delujejo preko dinamične polimerizacije mehanizma.
Različni tipi so prikazani na [https://journals.asm.org/cms/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019/asset/0bc1138d-60c0-4e59-95c9-fdfec9718c8d/assets/graphic/esp-0003-2019_fig_004.gif sliki 1].

=Arhitektura=
CBP-ji se lahko na prepoznavno mesto vežejo v več kopijah in tako tvorijo razporeditvene komplekse, katerih arhitektura je odvisna od tipa CBP. CBP tip I vsebuje motiv HTH2 in prepozna centromerno mesto parS, kamor se veže v več kopijah in gradi velike komplekse. To omogoča številne interakcije z ustrezno NTP-azo. CBP tip II (vsebuje RHH2 motiv) in tip III (vsebuje HTH2 motiv) tvorita podobne komplekse in sicer, oba tvorita vijačne, obročaste strukture in povzročita upogib DNA.

=Vizualizacija plazmidnih dinamik v celici=
==Tip I==
Najraje se nahajajo na četrtini ali polovici celice v majhnih in večjih celicah. V vseh primerih pa vpadajo z bakterijskimi nukleoidom. ParB in RHH2 so prisotni v velikih količinah znotraj celice in so kot žarišča, ki so odvisni od razporeditvenega mesta in korespondirajo na pozicijo plazmida. ParB iz F plazmidov so prisotni v skupkih v okolici F razporeditvenega mesta, parSF. Razporeditveni kompleksi plazmida F so najdeni znotraj večje mase nukleoida. ParA imajo oscilatorno vedenje, nekatere pa tvorijo dinamične gradiente.

==Tip II in III==
ParMR1 tvorijo dolge filamente. Plazmidi niso prisotni na obeh koncih ParM polimerov. Premik plazmidne DNA na nasproten pol celice žene ParM polimerizacija med sestrskima ParR-parC (R1 centromer) kompleksoma.

Tubulinu podobna GTP-aza iz Gram-pozitivnih bakterij tvori dinamične in citoskeletne filamente, kar nakazuje, da tip III deluje po filamentacijskem mehanizmu za razporejanje plazmidov znotraj celic.

Slikovna obdelava razporeditve in ločitve plazmidov z velikim številom kopij
Plazmidi naj bi sledili obliki ameriškega krofa. Prosto difundirajoči plazmidi so večinoma izven nukleoida v notranjem periferiju bakterije. Plazmidi z visokim kopirnim številom so v skupkih na polih celice in naključno razporejeni skozi celoten volumen celice z nižjo frekvenco znotraj nukleoida. To podpira model mešane distribucije, ki vključuje možnost nastajanja skupkov in naključno difuzijo individualnih plazmidov z visokim številom kopij.

=Mehanizmi razporejanja plazmidov=
Gonilo za razporeditev plazmidov predstavljajo ATP-aze in GTP-aze, ki zagotavljajo energijo za ustrezen premik plazmidov. Obstajata dva glavna razreda mehanizmov razporeditve plazmidov.

==Mehanizmi, ki vključujejo filamentacijo==
Po tem mehanizmu delujeta razporeditvena sistema tipa II in III.

===Razporeditveni sistem tipa II===
Razporeditvene ATP-aze tipa II (ParM) spadajo v razred aktinu podobnih proteinov. Te so sposobne polimerizacije in oblikovanja filamentov, ki potiskajo plazmida, pripeta na nasprotna konca snopa filamentov, narazen.

Monomeri ParM polimerizirajo v prisotnosti ATP, pri čemer tvorijo levosučne dvojne vijačnice, ki so polarne (polarnost je posledica asimetrije monomerov, zato vsak filament vsebuje top in oster konec). ParR (CBP), ki je vezan na parC plazmida, se veže na topi konec filamenta in ustvari kapo, ki prepreči razgradnjo filamenta kljub hidrolizi ATP. Novi ParM-ATP monomeri se nato vstavljajo na topi konec skozi konkavni stik med ParR/parC. Ko filament raste, potiska plazmid na topem koncu in plazmid se premika po celici. Filamenti se urejajo v antiparalelne snope, kar pomeni, da so topi konci (mesta, kamor se veže plazmid) na obeh straneh snopa. Ko filamenti v snopu rastejo potiskajo plazmide, vezane na tope konce, na nasprotna pola celice. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (A in B)

===Razporeditveni sistem tipa III===
Razporeditveni sistem tipa III prav tako deluje na principu polimerizacije, ampak pri tem kot gonilno moč uporablja tubulinu podobne GTPaze (TubZ). Monomeri TubZ polimerizirajo v prisotnosti GTP in tvorijo dvo- in štirivijačne filamente, ki so stabilizirani z GTP kapo. TubZ filamenti so polarni, kar pomeni, da rastejo na + koncu in se razgrajajo na – koncu. Tja se veže tudi TubR (CBP), vezan na tubC. Ko polimer raste na + strani in se razgrajuje na – strani, mu razporeditveni kompleks sledi, kar se kaže v premikanju plazmida. Kako pa ta vleka plazmidov prispeva k ločitvi plazmidov še ni pojasnjeno, saj TubZ filamenti niso bipolarni (premikanje poteka le v eno smer). [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (C)

==Mehanizem po principu Brownovega zobatega kolesa==
Razporeditveni sistem tipa I, ki je pri bakterijah najbolj pogost, za razliko od drugih dveh tipov pa ne deluje na principu polimerizacije. Pri njegovem mehanizmu sodelujejo ATP-aze tipa Walker (ParA). Te so sposobne interakcije z bakterijskim nukleoidom in v celici tvorijo dinamičen gradient. Interagirajo tudi s proteini ParB (CBP), ki nosijo plazmidni tovor in sledijo gradientu ParA. Predpostavljenih je bilo več modelov kako ParB sledijo gradientu ParA, vsi pa delujejo na osnovi principa Brownovega zobatega kolesa.

V prisotnosti ATP se ParA veže na DNA (ATP pri tem hidrolizira). V naslednjem koraku se na ParA veže ParB, ki je vezan na parS (nosi plazmid) in pri tem iz nukleoida izrine ParA. Ta oddifundira v citoplazmo, kjer čaka, da se nanj ponovno veže ATP. Ker pa je ta korak zelo počasen, začne na nukleoidu primanjkovati ParA. ParB se torej premika po nukleoidu in za seboj pušča ParA praznino – gibanje plazmida je zato usmerjano stran od nižje koncentracije ParA. Plazmida bi se po replikaciji tako ločila, če bi bila koncentracija ParA med njima najnižja.
Obstaja več različnih modelov mehanizma Brownovega zobatega kolesa, vsi temeljijo na asimetriji distribucije ParA na bakterijskem nukleoidu. Delovanje lahko povežemo s konceptom požganega mostu – ko se ParB s plazmidnim tovorom premakne po nukleoidu, na svoji poti iz nukleoida odstranjuje ParA in s tem 'požge most za seboj', saj se zaradi odsotnosti Par A ne more vrniti nazaj. Predlagane verzije se med seboj razlikujejo po tem, kako asimetrija razporeditve ParA ustvari energijo, potrebno za gibanje in v vlogi, ki je pripisana bakterijskemu kromosomu in ParA oligomerizaciji.

Vse ATPaze tipa I uporabljajo mehanizem Brownovega zobatega kolesa, vendar pa je relevanten model najverjetneje odvisen od različnih biokemijskih značilnosti in ravni ekspresije ParA in ParB. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/3928d857-a2ad-4de1-9c2b-e5caecb4e75b/assets/graphic/plas-0023-2014-fig5.gif Slika 3]

=Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici=
Dva različna plazmida, ki ne moreta stabilno obstajati v isti celici, sta nezdružljiva. Pri delitvah celice tako pride do izgube oziroma zmanjšanja števila vsaj enega od plazmidov, kar je posledica skupnih lastnosti nezdružljivih plazmidov. Do nezdružljivosti zaradi sorodnega načina razporejanja v celici pride tako pri razporejanju tipa 1 kot 2.

==Nezdružljivost pri ParA==
Če imamo v celici plazmid z visokim številom kopij in Par sistemom razporejanja, bo to onemogočilo stabilen soobstoj plazmida z enakim parA genom. Pretirano izražanje ParA, ki je prisoten v večih kopijah namreč povzroči, da se začneta plazmida ob delitvi naključno razporejati v hčerinske celice. Delež nezdružljivosti sovpada s koncentracijo ParA. Povečana koncentracija ParA destabilizira razporeditveni kompleks in mehanizem Brownovega zobatega kolesa, ki omogoča premikanje plazmidov po celici. Pri visoki koncentraciji ParA se praznine brez Par A lahko hitreje zapolnijo in tako onemogočijo gibanje plazmida po nukleoidu.

==Nezdružljivost pri ParB==
Analogno kot pri ParA dva plazmida, ki se razporejata s ParB, v isti celici nista stabilna, še posebej, če je eden od njiju plazmid z visokim številom kopij, saj je nezdružljivost odvisna od izražanja ParB. Previsoka koncentracija ParB najverjetneje povzroči koncentriranje plazmidov s parS genom v skupke in s tem zmanjša število plazmidov, ki se prosto gibljejo po celici. V tem primeru ParA ne more dovolj uspešno razdreti razporeditvenih kompleksov in sprostiti plazmidov, zato sčasoma pride do izgube enega od plazmidov. Hkrati so ugotovili, da lahko nekatere različice proteina, kot je ParBF, sprožijo rekombinacijo sorodnih plazmidov in tako povzročijo multimerizacijo. Multimer je plazmid, ki nastane s homologno rekombinacijo in vsebuje dve ponovitvi celotnega plazmidnega nukleotidnega zaporedja.

==Nezdružljivost pri enakih centromerih==
Če plazmida vsebujeta sorodno mesto za razporejanje, načeloma pride do nezdružljivosti. Vzrok ni povsem znan. Pri plazmidih z visokim številom kopij pride do naključnega razporejanja plazmidov, pri plazmidih, ki vsebujejo več parS mest pa tudi do zmanjšanega števila prostih ParB zaradi pretirane vezave na parS. Pri plazmidih z nizkim številom kopij opazimo zelo močno nezdružljivost, kjer je izguba števila plazmidov višja kot pri naključnem razporejanju. Eden od možnih vzrokov za to je pozna replikacija plazmidov. Če se eden od plazmidov podvoji ravno pred celično delitvijo, se kopiji namreč ne prerazporedita znotraj celice, ampak se obe dedujeta v isti hčerinski celici, kar privede do visoke izgube plazmidov.

=Regulacija izražanja par gena=
Izražanje par operonov direktno vpliva na stabilnost plazmidov in je v vseh primerih nadzorovano po principu avtoregulacije. Eden od proteinov par operona deluje kot represor, pogosto pa tudi eden od preostalih kot korepresor. V razporeditvenem sistemu tipa I so represorji ParA ATPaze, pri vseh ostalih sistemih pa proteini CBP. ParA represorji se z N-končnim delom s HTH (vijačnica-zavoj-vijačnica) motivom vežejo na DNA. Vezavno mesto ni povsem raziskano, vsebuje pa daljše obratne ponovitve, ki omogočijo vezavo ParA. Ta specifična vezava je mogoča ob vezavi ADP kot kofaktorja, pri vezavi ATP pa prevlada nespecifična vezava DNA, ki omogoči razporejanje plazmidov s pomočjo ParB.

=Zaključek=
Sistemi za razporejanje plazmidov so nujni za njihov obstoj in so kljub svoji preprostosti zelo natančno regulirani. Z dvema ključnima proteinoma in specifičnimi DNA zaporedji lahko predvsem plazmidi z manjšim številom kopij poskrbijo, da se ob delitvi uspešno dedujejo v obe hčerinski celici. Kljub široki uporabi plazmidnih vektorjev mnogi procesi, povezani z njihovim razporejanjem, še niso v celoti pojasnjeni. Raziskave v tej smeri bodo pripomogle k našemu razumevanju strukturne biologije in dinamike celotnega bakterijskega genoma.

=Viri=
Bouet, J.-Y.; Funnell, B. E. Plasmid Localization and Partition in Enterobacteriaceae. EcoSal Plus 2019, 8 (2), 10.1128/ecosalplus.ESP-0003–2019. https://doi.org/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019.

Schumacher, M. A. Bacterial Plasmid Partition Machinery: A Minimalist Approach to Survival. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012, 22 (1), 72–79. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2011.11.001.

Gerdes, K.; Møller-Jensen, J.; Jensen, R. B. Plasmid and Chromosome Partitioning: Surprises from Phylogeny. Mol. Microbiol. 2000, 37 (3), 455–466. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01975.x.

Baxter, J. C.; Funnell, B. E. Plasmid Partition Mechanisms. Microbiol. Spectr. 2014, 2 (6), 10.1128/microbiolspec.plas-0023–2014. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014.

Brooks, A. C.; Hwang, L. C. Reconstitutions of Plasmid Partition Systems and Their Mechanisms. Plasmid 2017, 91, 37–41. https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2017.03.004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Razporejanje plazmidov v hčerinski celici

2024-05-05T05:54:43Z

Brina Klinar: /* Razporeditveni sistem tipa II */

=Uvod=
Plazmidi živijo s svojo gostiteljsko celico v simbiozi. Razvili so kar nekaj strategij za obstoj znotraj bakterijske populacije med katerimi je razporeditveni sistem. Vsi razporeditveni sistemi so sestavljeni iz treh delov: ene ali več kopij razporeditvenega mesta (centromer), CBP (centromerni vezavni protein) in NTP-aze.

=Izračun izgube plazmida=
Plazmidi z majhnim kopirnim številom se morajo za svoj obstoj nanašati na razporeditveni sistem, plazmidi z visokim številom kopij pa se zanašajo na pasivno difuzijo.
Za naključno distribucijo velja: Ploss = 2^(1-n), kjer je »n« število kopij v celici.

=Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov=
Razporeditveni sistemi so nujni za transport in vzpostavitev sistema s plazmidno DNA. Poznamo 3 razporeditvene sisteme, ki se razlikujejo po tipu razporejanja z NTP-azo. Centromeri so značilna ohranjena zaporedja na plazmidu, ki služijo kot prepoznavna mesta za CBP. CBP prepozna zaporedje na plazmidu in se tako veže na centromer. To deluje kot most med plazmidom in ustrezno NTP-azo, ki omogoča premik plazmida.

Tip I ima Walker ATP-azo, ki ločuje plazmid s formacijo dinamičnega vzorca na bakterijskem nukleoidu. Tip II uporablja aktinu podobno ATP-azo, ki polimerizira v dinamične filamente, ki potiskajo plazmida narazen. Tip III ima tubulinu podobne GTP-aze, ki prav tako delujejo preko dinamične polimerizacije mehanizma.
Različni tipi so prikazani na [https://journals.asm.org/cms/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019/asset/0bc1138d-60c0-4e59-95c9-fdfec9718c8d/assets/graphic/esp-0003-2019_fig_004.gif sliki 1].

=Arhitektura=
CBP-ji se lahko na prepoznavno mesto vežejo v več kopijah in tako tvorijo razporeditvene komplekse, katerih arhitektura je odvisna od tipa CBP. CBP tip I vsebuje motiv HTH2 in prepozna centromerno mesto parS, kamor se veže v več kopijah in gradi velike komplekse. To omogoča številne interakcije z ustrezno NTP-azo. CBP tip II (vsebuje RHH2 motiv) in tip III (vsebuje HTH2 motiv) tvorita podobne komplekse in sicer, oba tvorita vijačne, obročaste strukture in povzročita upogib DNA.

=Vizualizacija plazmidnih dinamik v celici=
==Tip I==
Najraje se nahajajo na četrtini ali polovici celice v majhnih in večjih celicah. V vseh primerih pa vpadajo z bakterijskimi nukleoidom. ParB in RHH2 so prisotni v velikih količinah znotraj celice in so kot žarišča, ki so odvisni od razporeditvenega mesta in korespondirajo na pozicijo plazmida. ParB iz F plazmidov so prisotni v skupkih v okolici F razporeditvenega mesta, parSF. Razporeditveni kompleksi plazmida F so najdeni znotraj večje mase nukleoida. ParA imajo oscilatorno vedenje, nekatere pa tvorijo dinamične gradiente.

==Tip II in III==
ParMR1 tvorijo dolge filamente. Plazmidi niso prisotni na obeh koncih ParM polimerov. Premik plazmidne DNA na nasproten pol celice žene ParM polimerizacija med sestrskima ParR-parC (R1 centromer) kompleksoma.

Tubulinu podobna GTP-aza iz Gram-pozitivnih bakterij tvori dinamične in citoskeletne filamente, kar nakazuje, da tip III deluje po filamentacijskem mehanizmu za razporejanje plazmidov znotraj celic.

Slikovna obdelava razporeditve in ločitve plazmidov z velikim številom kopij
Plazmidi naj bi sledili obliki ameriškega krofa. Prosto difundirajoči plazmidi so večinoma izven nukleoida v notranjem periferiju bakterije. Plazmidi z visokim kopirnim številom so v skupkih na polih celice in naključno razporejeni skozi celoten volumen celice z nižjo frekvenco znotraj nukleoida. To podpira model mešane distribucije, ki vključuje možnost nastajanja skupkov in naključno difuzijo individualnih plazmidov z visokim številom kopij.

=Mehanizmi razporejanja plazmidov=
Gonilo za razporeditev plazmidov predstavljajo ATP-aze in GTP-aze, ki zagotavljajo energijo za ustrezen premik plazmidov. Obstajata dva glavna razreda mehanizmov razporeditve plazmidov.

==Mehanizmi, ki vključujejo filamentacijo==
Po tem mehanizmu delujeta razporeditvena sistema tipa II in III.

===Razporeditveni sistem tipa II===
Razporeditvene ATP-aze tipa II (ParM) spadajo v razred aktinu podobnih proteinov. Te so sposobne polimerizacije in oblikovanja filamentov, ki potiskajo plazmida, pripeta na nasprotna konca snopa filamentov, narazen.

Monomeri ParM polimerizirajo v prisotnosti ATP, pri čemer tvorijo levosučne dvojne vijačnice, ki so polarne (polarnost je posledica asimetrije monomerov, zato vsak filament vsebuje top in oster konec. ParR (CBP), ki je vezan na parC plazmida, se veže na topi konec filamenta in ustvari kapo, ki prepreči razgradnjo filamenta kljub hidrolizi ATP. Novi ParM-ATP monomeri se nato vstavljajo na topi konec skozi konkavni stik med ParR/parC. Ko filament raste, potiska plazmid na topem koncu in plazmid se premika po celici. Filamenti se urejajo v antiparalelne snope, kar pomeni, da so topi konci (mesta, kamor se veže plazmid) na obeh straneh snopa. Ko filamenti v snopu rastejo potiskajo plazmide, vezane na tope konce, na nasprotna pola celice. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (A in B)

===Razporeditveni sistem tipa III===
Razporeditveni sistem tipa III prav tako deluje na principu polimerizacije, ampak pri tem kot gonilno moč uporablja tubulinu podobne GTPaze (TubZ). Monomeri TubZ polimerizirajo v prisotnosti GTP in tvorijo dvo- in štirivijačne filamente, ki so stabilizirani z GTP kapo. TubZ filamenti so polarni, kar pomeni, da rastejo na + koncu in se razgrajajo na – koncu. Tja se veže tudi TubR (CBP), vezan na tubC. Ko polimer raste na + strani in se razgrajuje na – strani, mu razporeditveni kompleks sledi, kar se kaže v premikanju plazmida. Kako pa ta vleka plazmidov prispeva k ločitvi plazmidov še ni pojasnjeno, saj TubZ filamenti niso bipolarni (premikanje poteka le v eno smer). [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (C)

==Mehanizem po principu Brownovega zobatega kolesa==
Razporeditveni sistem tipa I, ki je pri bakterijah najbolj pogost, za razliko od drugih dveh tipov pa ne deluje na principu polimerizacije. Pri njegovem mehanizmu sodelujejo ATP-aze tipa Walker (ParA). Te so sposobne interakcije z bakterijskim nukleoidom in v celici tvorijo dinamičen gradient. Interagirajo tudi s proteini ParB (CBP), ki nosijo plazmidni tovor in sledijo gradientu ParA. Predpostavljenih je bilo več modelov kako ParB sledijo gradientu ParA, vsi pa delujejo na osnovi principa Brownovega zobatega kolesa.

V prisotnosti ATP se ParA veže na DNA (ATP pri tem hidrolizira). V naslednjem koraku se na ParA veže ParB, ki je vezan na parS (nosi plazmid) in pri tem iz nukleoida izrine ParA. Ta oddifundira v citoplazmo, kjer čaka, da se nanj ponovno veže ATP. Ker pa je ta korak zelo počasen, začne na nukleoidu primanjkovati ParA. ParB se torej premika po nukleoidu in za seboj pušča ParA praznino – gibanje plazmida je zato usmerjano stran od nižje koncentracije ParA. Plazmida bi se po replikaciji tako ločila, če bi bila koncentracija ParA med njima najnižja.
Obstaja več različnih modelov mehanizma Brownovega zobatega kolesa, vsi temeljijo na asimetriji distribucije ParA na bakterijskem nukleoidu. Delovanje lahko povežemo s konceptom požganega mostu – ko se ParB s plazmidnim tovorom premakne po nukleoidu, na svoji poti iz nukleoida odstranjuje ParA in s tem 'požge most za seboj', saj se zaradi odsotnosti Par A ne more vrniti nazaj. Predlagane verzije se med seboj razlikujejo po tem, kako asimetrija razporeditve ParA ustvari energijo, potrebno za gibanje in v vlogi, ki je pripisana bakterijskemu kromosomu in ParA oligomerizaciji.

Vse ATPaze tipa I uporabljajo mehanizem Brownovega zobatega kolesa, vendar pa je relevanten model najverjetneje odvisen od različnih biokemijskih značilnosti in ravni ekspresije ParA in ParB. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/3928d857-a2ad-4de1-9c2b-e5caecb4e75b/assets/graphic/plas-0023-2014-fig5.gif Slika 3]

=Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici=
Dva različna plazmida, ki ne moreta stabilno obstajati v isti celici, sta nezdružljiva. Pri delitvah celice tako pride do izgube oziroma zmanjšanja števila vsaj enega od plazmidov, kar je posledica skupnih lastnosti nezdružljivih plazmidov. Do nezdružljivosti zaradi sorodnega načina razporejanja v celici pride tako pri razporejanju tipa 1 kot 2.

==Nezdružljivost pri ParA==
Če imamo v celici plazmid z visokim številom kopij in Par sistemom razporejanja, bo to onemogočilo stabilen soobstoj plazmida z enakim parA genom. Pretirano izražanje ParA, ki je prisoten v večih kopijah namreč povzroči, da se začneta plazmida ob delitvi naključno razporejati v hčerinske celice. Delež nezdružljivosti sovpada s koncentracijo ParA. Povečana koncentracija ParA destabilizira razporeditveni kompleks in mehanizem Brownovega zobatega kolesa, ki omogoča premikanje plazmidov po celici. Pri visoki koncentraciji ParA se praznine brez Par A lahko hitreje zapolnijo in tako onemogočijo gibanje plazmida po nukleoidu.

==Nezdružljivost pri ParB==
Analogno kot pri ParA dva plazmida, ki se razporejata s ParB, v isti celici nista stabilna, še posebej, če je eden od njiju plazmid z visokim številom kopij, saj je nezdružljivost odvisna od izražanja ParB. Previsoka koncentracija ParB najverjetneje povzroči koncentriranje plazmidov s parS genom v skupke in s tem zmanjša število plazmidov, ki se prosto gibljejo po celici. V tem primeru ParA ne more dovolj uspešno razdreti razporeditvenih kompleksov in sprostiti plazmidov, zato sčasoma pride do izgube enega od plazmidov. Hkrati so ugotovili, da lahko nekatere različice proteina, kot je ParBF, sprožijo rekombinacijo sorodnih plazmidov in tako povzročijo multimerizacijo. Multimer je plazmid, ki nastane s homologno rekombinacijo in vsebuje dve ponovitvi celotnega plazmidnega nukleotidnega zaporedja.

==Nezdružljivost pri enakih centromerih==
Če plazmida vsebujeta sorodno mesto za razporejanje, načeloma pride do nezdružljivosti. Vzrok ni povsem znan. Pri plazmidih z visokim številom kopij pride do naključnega razporejanja plazmidov, pri plazmidih, ki vsebujejo več parS mest pa tudi do zmanjšanega števila prostih ParB zaradi pretirane vezave na parS. Pri plazmidih z nizkim številom kopij opazimo zelo močno nezdružljivost, kjer je izguba števila plazmidov višja kot pri naključnem razporejanju. Eden od možnih vzrokov za to je pozna replikacija plazmidov. Če se eden od plazmidov podvoji ravno pred celično delitvijo, se kopiji namreč ne prerazporedita znotraj celice, ampak se obe dedujeta v isti hčerinski celici, kar privede do visoke izgube plazmidov.

=Regulacija izražanja par gena=
Izražanje par operonov direktno vpliva na stabilnost plazmidov in je v vseh primerih nadzorovano po principu avtoregulacije. Eden od proteinov par operona deluje kot represor, pogosto pa tudi eden od preostalih kot korepresor. V razporeditvenem sistemu tipa I so represorji ParA ATPaze, pri vseh ostalih sistemih pa proteini CBP. ParA represorji se z N-končnim delom s HTH (vijačnica-zavoj-vijačnica) motivom vežejo na DNA. Vezavno mesto ni povsem raziskano, vsebuje pa daljše obratne ponovitve, ki omogočijo vezavo ParA. Ta specifična vezava je mogoča ob vezavi ADP kot kofaktorja, pri vezavi ATP pa prevlada nespecifična vezava DNA, ki omogoči razporejanje plazmidov s pomočjo ParB.

=Zaključek=
Sistemi za razporejanje plazmidov so nujni za njihov obstoj in so kljub svoji preprostosti zelo natančno regulirani. Z dvema ključnima proteinoma in specifičnimi DNA zaporedji lahko predvsem plazmidi z manjšim številom kopij poskrbijo, da se ob delitvi uspešno dedujejo v obe hčerinski celici. Kljub široki uporabi plazmidnih vektorjev mnogi procesi, povezani z njihovim razporejanjem, še niso v celoti pojasnjeni. Raziskave v tej smeri bodo pripomogle k našemu razumevanju strukturne biologije in dinamike celotnega bakterijskega genoma.

=Viri=
Bouet, J.-Y.; Funnell, B. E. Plasmid Localization and Partition in Enterobacteriaceae. EcoSal Plus 2019, 8 (2), 10.1128/ecosalplus.ESP-0003–2019. https://doi.org/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019.

Schumacher, M. A. Bacterial Plasmid Partition Machinery: A Minimalist Approach to Survival. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012, 22 (1), 72–79. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2011.11.001.

Gerdes, K.; Møller-Jensen, J.; Jensen, R. B. Plasmid and Chromosome Partitioning: Surprises from Phylogeny. Mol. Microbiol. 2000, 37 (3), 455–466. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01975.x.

Baxter, J. C.; Funnell, B. E. Plasmid Partition Mechanisms. Microbiol. Spectr. 2014, 2 (6), 10.1128/microbiolspec.plas-0023–2014. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014.

Brooks, A. C.; Hwang, L. C. Reconstitutions of Plasmid Partition Systems and Their Mechanisms. Plasmid 2017, 91, 37–41. https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2017.03.004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Razporejanje plazmidov v hčerinski celici

2024-05-05T05:42:40Z

Brina Klinar: /* Mehanizem po principu Brownovega zobatega kolesa */

=Uvod=
Plazmidi živijo s svojo gostiteljsko celico v simbiozi. Razvili so kar nekaj strategij za obstoj znotraj bakterijske populacije med katerimi je razporeditveni sistem. Vsi razporeditveni sistemi so sestavljeni iz treh delov: ene ali več kopij razporeditvenega mesta (centromer), CBP (centromerni vezavni protein) in NTP-aze.

=Izračun izgube plazmida=
Plazmidi z majhnim kopirnim številom se morajo za svoj obstoj nanašati na razporeditveni sistem, plazmidi z visokim številom kopij pa se zanašajo na pasivno difuzijo.
Za naključno distribucijo velja: Ploss = 2^(1-n), kjer je »n« število kopij v celici.

=Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov=
Razporeditveni sistemi so nujni za transport in vzpostavitev sistema s plazmidno DNA. Poznamo 3 razporeditvene sisteme, ki se razlikujejo po tipu razporejanja z NTP-azo. Centromeri so značilna ohranjena zaporedja na plazmidu, ki služijo kot prepoznavna mesta za CBP. CBP prepozna zaporedje na plazmidu in se tako veže na centromer. To deluje kot most med plazmidom in ustrezno NTP-azo, ki omogoča premik plazmida.

Tip I ima Walker ATP-azo, ki ločuje plazmid s formacijo dinamičnega vzorca na bakterijskem nukleoidu. Tip II uporablja aktinu podobno ATP-azo, ki polimerizira v dinamične filamente, ki potiskajo plazmida narazen. Tip III ima tubulinu podobne GTP-aze, ki prav tako delujejo preko dinamične polimerizacije mehanizma.
Različni tipi so prikazani na [https://journals.asm.org/cms/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019/asset/0bc1138d-60c0-4e59-95c9-fdfec9718c8d/assets/graphic/esp-0003-2019_fig_004.gif sliki 1].

=Arhitektura=
CBP-ji se lahko na prepoznavno mesto vežejo v več kopijah in tako tvorijo razporeditvene komplekse, katerih arhitektura je odvisna od tipa CBP. CBP tip I vsebuje motiv HTH2 in prepozna centromerno mesto parS, kamor se veže v več kopijah in gradi velike komplekse. To omogoča številne interakcije z ustrezno NTP-azo. CBP tip II (vsebuje RHH2 motiv) in tip III (vsebuje HTH2 motiv) tvorita podobne komplekse in sicer, oba tvorita vijačne, obročaste strukture in povzročita upogib DNA.

=Vizualizacija plazmidnih dinamik v celici=
==Tip I==
Najraje se nahajajo na četrtini ali polovici celice v majhnih in večjih celicah. V vseh primerih pa vpadajo z bakterijskimi nukleoidom. ParB in RHH2 so prisotni v velikih količinah znotraj celice in so kot žarišča, ki so odvisni od razporeditvenega mesta in korespondirajo na pozicijo plazmida. ParB iz F plazmidov so prisotni v skupkih v okolici F razporeditvenega mesta, parSF. Razporeditveni kompleksi plazmida F so najdeni znotraj večje mase nukleoida. ParA imajo oscilatorno vedenje, nekatere pa tvorijo dinamične gradiente.

==Tip II in III==
ParMR1 tvorijo dolge filamente. Plazmidi niso prisotni na obeh koncih ParM polimerov. Premik plazmidne DNA na nasproten pol celice žene ParM polimerizacija med sestrskima ParR-parC (R1 centromer) kompleksoma.

Tubulinu podobna GTP-aza iz Gram-pozitivnih bakterij tvori dinamične in citoskeletne filamente, kar nakazuje, da tip III deluje po filamentacijskem mehanizmu za razporejanje plazmidov znotraj celic.

Slikovna obdelava razporeditve in ločitve plazmidov z velikim številom kopij
Plazmidi naj bi sledili obliki ameriškega krofa. Prosto difundirajoči plazmidi so večinoma izven nukleoida v notranjem periferiju bakterije. Plazmidi z visokim kopirnim številom so v skupkih na polih celice in naključno razporejeni skozi celoten volumen celice z nižjo frekvenco znotraj nukleoida. To podpira model mešane distribucije, ki vključuje možnost nastajanja skupkov in naključno difuzijo individualnih plazmidov z visokim številom kopij.

=Mehanizmi razporejanja plazmidov=
Gonilo za razporeditev plazmidov predstavljajo ATP-aze in GTP-aze, ki zagotavljajo energijo za ustrezen premik plazmidov. Obstajata dva glavna razreda mehanizmov razporeditve plazmidov.

==Mehanizmi, ki vključujejo filamentacijo==
Po tem mehanizmu delujeta razporeditvena sistema tipa II in III.

===Razporeditveni sistem tipa II===
Razporeditvene ATP-aze tipa II (ParM) spadajo v razred aktinu podobnih proteinov. Te so sposobne polimerizacije in oblikovanja filamentov, ki potiskajo plazmida, pripeta na nasprotna konca filamenta, narazen (pri paličičastih bakterijah je to vzporedno z longitudinalno osjo celice).

Monomeri ParM polimerizirajo v prisotnosti ATP, pri čemer tvorijo levosučne dvojne vijačnice, ki so polarne (polarnost je posledica asimetrije monomerov, zato vsak filament vsebuje top in oster konec. ParR (CBP), ki je vezan na parC plazmida, se veže na topi konec filamenta in ustvari kapo, ki prepreči razgradnjo filamenta kljub hidrolizi ATP. Novi ParM-ATP monomeri se nato vstavljajo na topi konec skozi konkavni stik med ParR/parC. Ko filament raste, potiska plazmid na topem koncu in plazmid se premika po celici. Filamenti se urejajo v antiparalelne snope, kar pomeni, da so topi konci (mesta, kamor se veže plazmid) na obeh straneh snopa. Ko filamenti v snopu rastejo potiskajo plazmide, vezane na tope konce, na nasprotna pola celice. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (A in B)

===Razporeditveni sistem tipa III===
Razporeditveni sistem tipa III prav tako deluje na principu polimerizacije, ampak pri tem kot gonilno moč uporablja tubulinu podobne GTPaze (TubZ). Monomeri TubZ polimerizirajo v prisotnosti GTP in tvorijo dvo- in štirivijačne filamente, ki so stabilizirani z GTP kapo. TubZ filamenti so polarni, kar pomeni, da rastejo na + koncu in se razgrajajo na – koncu. Tja se veže tudi TubR (CBP), vezan na tubC. Ko polimer raste na + strani in se razgrajuje na – strani, mu razporeditveni kompleks sledi, kar se kaže v premikanju plazmida. Kako pa ta vleka plazmidov prispeva k ločitvi plazmidov še ni pojasnjeno, saj TubZ filamenti niso bipolarni (premikanje poteka le v eno smer). [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (C)

==Mehanizem po principu Brownovega zobatega kolesa==
Razporeditveni sistem tipa I, ki je pri bakterijah najbolj pogost, za razliko od drugih dveh tipov pa ne deluje na principu polimerizacije. Pri njegovem mehanizmu sodelujejo ATP-aze tipa Walker (ParA). Te so sposobne interakcije z bakterijskim nukleoidom in v celici tvorijo dinamičen gradient. Interagirajo tudi s proteini ParB (CBP), ki nosijo plazmidni tovor in sledijo gradientu ParA. Predpostavljenih je bilo več modelov kako ParB sledijo gradientu ParA, vsi pa delujejo na osnovi principa Brownovega zobatega kolesa.

V prisotnosti ATP se ParA veže na DNA (ATP pri tem hidrolizira). V naslednjem koraku se na ParA veže ParB, ki je vezan na parS (nosi plazmid) in pri tem iz nukleoida izrine ParA. Ta oddifundira v citoplazmo, kjer čaka, da se nanj ponovno veže ATP. Ker pa je ta korak zelo počasen, začne na nukleoidu primanjkovati ParA. ParB se torej premika po nukleoidu in za seboj pušča ParA praznino – gibanje plazmida je zato usmerjano stran od nižje koncentracije ParA. Plazmida bi se po replikaciji tako ločila, če bi bila koncentracija ParA med njima najnižja.
Obstaja več različnih modelov mehanizma Brownovega zobatega kolesa, vsi temeljijo na asimetriji distribucije ParA na bakterijskem nukleoidu. Delovanje lahko povežemo s konceptom požganega mostu – ko se ParB s plazmidnim tovorom premakne po nukleoidu, na svoji poti iz nukleoida odstranjuje ParA in s tem 'požge most za seboj', saj se zaradi odsotnosti Par A ne more vrniti nazaj. Predlagane verzije se med seboj razlikujejo po tem, kako asimetrija razporeditve ParA ustvari energijo, potrebno za gibanje in v vlogi, ki je pripisana bakterijskemu kromosomu in ParA oligomerizaciji.

Vse ATPaze tipa I uporabljajo mehanizem Brownovega zobatega kolesa, vendar pa je relevanten model najverjetneje odvisen od različnih biokemijskih značilnosti in ravni ekspresije ParA in ParB. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/3928d857-a2ad-4de1-9c2b-e5caecb4e75b/assets/graphic/plas-0023-2014-fig5.gif Slika 3]

=Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici=
Dva različna plazmida, ki ne moreta stabilno obstajati v isti celici, sta nezdružljiva. Pri delitvah celice tako pride do izgube oziroma zmanjšanja števila vsaj enega od plazmidov, kar je posledica skupnih lastnosti nezdružljivih plazmidov. Do nezdružljivosti zaradi sorodnega načina razporejanja v celici pride tako pri razporejanju tipa 1 kot 2.

==Nezdružljivost pri ParA==
Če imamo v celici plazmid z visokim številom kopij in Par sistemom razporejanja, bo to onemogočilo stabilen soobstoj plazmida z enakim parA genom. Pretirano izražanje ParA, ki je prisoten v večih kopijah namreč povzroči, da se začneta plazmida ob delitvi naključno razporejati v hčerinske celice. Delež nezdružljivosti sovpada s koncentracijo ParA. Povečana koncentracija ParA destabilizira razporeditveni kompleks in mehanizem Brownovega zobatega kolesa, ki omogoča premikanje plazmidov po celici. Pri visoki koncentraciji ParA se praznine brez Par A lahko hitreje zapolnijo in tako onemogočijo gibanje plazmida po nukleoidu.

==Nezdružljivost pri ParB==
Analogno kot pri ParA dva plazmida, ki se razporejata s ParB, v isti celici nista stabilna, še posebej, če je eden od njiju plazmid z visokim številom kopij, saj je nezdružljivost odvisna od izražanja ParB. Previsoka koncentracija ParB najverjetneje povzroči koncentriranje plazmidov s parS genom v skupke in s tem zmanjša število plazmidov, ki se prosto gibljejo po celici. V tem primeru ParA ne more dovolj uspešno razdreti razporeditvenih kompleksov in sprostiti plazmidov, zato sčasoma pride do izgube enega od plazmidov. Hkrati so ugotovili, da lahko nekatere različice proteina, kot je ParBF, sprožijo rekombinacijo sorodnih plazmidov in tako povzročijo multimerizacijo. Multimer je plazmid, ki nastane s homologno rekombinacijo in vsebuje dve ponovitvi celotnega plazmidnega nukleotidnega zaporedja.

==Nezdružljivost pri enakih centromerih==
Če plazmida vsebujeta sorodno mesto za razporejanje, načeloma pride do nezdružljivosti. Vzrok ni povsem znan. Pri plazmidih z visokim številom kopij pride do naključnega razporejanja plazmidov, pri plazmidih, ki vsebujejo več parS mest pa tudi do zmanjšanega števila prostih ParB zaradi pretirane vezave na parS. Pri plazmidih z nizkim številom kopij opazimo zelo močno nezdružljivost, kjer je izguba števila plazmidov višja kot pri naključnem razporejanju. Eden od možnih vzrokov za to je pozna replikacija plazmidov. Če se eden od plazmidov podvoji ravno pred celično delitvijo, se kopiji namreč ne prerazporedita znotraj celice, ampak se obe dedujeta v isti hčerinski celici, kar privede do visoke izgube plazmidov.

=Regulacija izražanja par gena=
Izražanje par operonov direktno vpliva na stabilnost plazmidov in je v vseh primerih nadzorovano po principu avtoregulacije. Eden od proteinov par operona deluje kot represor, pogosto pa tudi eden od preostalih kot korepresor. V razporeditvenem sistemu tipa I so represorji ParA ATPaze, pri vseh ostalih sistemih pa proteini CBP. ParA represorji se z N-končnim delom s HTH (vijačnica-zavoj-vijačnica) motivom vežejo na DNA. Vezavno mesto ni povsem raziskano, vsebuje pa daljše obratne ponovitve, ki omogočijo vezavo ParA. Ta specifična vezava je mogoča ob vezavi ADP kot kofaktorja, pri vezavi ATP pa prevlada nespecifična vezava DNA, ki omogoči razporejanje plazmidov s pomočjo ParB.

=Zaključek=
Sistemi za razporejanje plazmidov so nujni za njihov obstoj in so kljub svoji preprostosti zelo natančno regulirani. Z dvema ključnima proteinoma in specifičnimi DNA zaporedji lahko predvsem plazmidi z manjšim številom kopij poskrbijo, da se ob delitvi uspešno dedujejo v obe hčerinski celici. Kljub široki uporabi plazmidnih vektorjev mnogi procesi, povezani z njihovim razporejanjem, še niso v celoti pojasnjeni. Raziskave v tej smeri bodo pripomogle k našemu razumevanju strukturne biologije in dinamike celotnega bakterijskega genoma.

=Viri=
Bouet, J.-Y.; Funnell, B. E. Plasmid Localization and Partition in Enterobacteriaceae. EcoSal Plus 2019, 8 (2), 10.1128/ecosalplus.ESP-0003–2019. https://doi.org/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019.

Schumacher, M. A. Bacterial Plasmid Partition Machinery: A Minimalist Approach to Survival. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012, 22 (1), 72–79. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2011.11.001.

Gerdes, K.; Møller-Jensen, J.; Jensen, R. B. Plasmid and Chromosome Partitioning: Surprises from Phylogeny. Mol. Microbiol. 2000, 37 (3), 455–466. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01975.x.

Baxter, J. C.; Funnell, B. E. Plasmid Partition Mechanisms. Microbiol. Spectr. 2014, 2 (6), 10.1128/microbiolspec.plas-0023–2014. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014.

Brooks, A. C.; Hwang, L. C. Reconstitutions of Plasmid Partition Systems and Their Mechanisms. Plasmid 2017, 91, 37–41. https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2017.03.004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Razporejanje plazmidov v hčerinski celici

2024-05-04T20:10:24Z

Brina Klinar:

=Uvod=
Plazmidi živijo s svojo gostiteljsko celico v simbiozi. Razvili so kar nekaj strategij za obstoj znotraj bakterijske populacije med katerimi je razporeditveni sistem. Vsi razporeditveni sistemi so sestavljeni iz treh delov: ene ali več kopij razporeditvenega mesta (centromer), CBP (centromerni vezavni protein) in NTP-aze.

=Izračun izgube plazmida=
Plazmidi z majhnim kopirnim številom se morajo za svoj obstoj nanašati na razporeditveni sistem, plazmidi z visokim številom kopij pa se zanašajo na pasivno difuzijo.
Za naključno distribucijo velja: Ploss = 2^(1-n), kjer je »n« število kopij v celici.

=Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov=
Razporeditveni sistemi so nujni za transport in vzpostavitev sistema s plazmidno DNA. Poznamo 3 razporeditvene sisteme, ki se razlikujejo po tipu razporejanja z NTP-azo. Centromeri so značilna ohranjena zaporedja na plazmidu, ki služijo kot prepoznavna mesta za CBP. CBP prepozna zaporedje na plazmidu in se tako veže na centromer. To deluje kot most med plazmidom in ustrezno NTP-azo, ki omogoča premik plazmida.

Tip I ima Walker ATP-azo, ki ločuje plazmid s formacijo dinamičnega vzorca na bakterijskem nukleoidu. Tip II uporablja aktinu podobno ATP-azo, ki polimerizira v dinamične filamente, ki potiskajo plazmida narazen. Tip III ima tubulinu podobne GTP-aze, ki prav tako delujejo preko dinamične polimerizacije mehanizma.
Različni tipi so prikazani na [https://journals.asm.org/cms/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019/asset/0bc1138d-60c0-4e59-95c9-fdfec9718c8d/assets/graphic/esp-0003-2019_fig_004.gif sliki 1].

=Arhitektura=
CBP-ji se lahko na prepoznavno mesto vežejo v več kopijah in tako tvorijo razporeditvene komplekse, katerih arhitektura je odvisna od tipa CBP. CBP tip I vsebuje motiv HTH2 in prepozna centromerno mesto parS, kamor se veže v več kopijah in gradi velike komplekse. To omogoča številne interakcije z ustrezno NTP-azo. CBP tip II (vsebuje RHH2 motiv) in tip III (vsebuje HTH2 motiv) tvorita podobne komplekse in sicer, oba tvorita vijačne, obročaste strukture in povzročita upogib DNA.

=Vizualizacija plazmidnih dinamik v celici=
==Tip I==
Najraje se nahajajo na četrtini ali polovici celice v majhnih in večjih celicah. V vseh primerih pa vpadajo z bakterijskimi nukleoidom. ParB in RHH2 so prisotni v velikih količinah znotraj celice in so kot žarišča, ki so odvisni od razporeditvenega mesta in korespondirajo na pozicijo plazmida. ParB iz F plazmidov so prisotni v skupkih v okolici F razporeditvenega mesta, parSF. Razporeditveni kompleksi plazmida F so najdeni znotraj večje mase nukleoida. ParA imajo oscilatorno vedenje, nekatere pa tvorijo dinamične gradiente.

==Tip II in III==
ParMR1 tvorijo dolge filamente. Plazmidi niso prisotni na obeh koncih ParM polimerov. Premik plazmidne DNA na nasproten pol celice žene ParM polimerizacija med sestrskima ParR-parC (R1 centromer) kompleksoma.

Tubulinu podobna GTP-aza iz Gram-pozitivnih bakterij tvori dinamične in citoskeletne filamente, kar nakazuje, da tip III deluje po filamentacijskem mehanizmu za razporejanje plazmidov znotraj celic.

Slikovna obdelava razporeditve in ločitve plazmidov z velikim številom kopij
Plazmidi naj bi sledili obliki ameriškega krofa. Prosto difundirajoči plazmidi so večinoma izven nukleoida v notranjem periferiju bakterije. Plazmidi z visokim kopirnim številom so v skupkih na polih celice in naključno razporejeni skozi celoten volumen celice z nižjo frekvenco znotraj nukleoida. To podpira model mešane distribucije, ki vključuje možnost nastajanja skupkov in naključno difuzijo individualnih plazmidov z visokim številom kopij.

=Mehanizmi razporejanja plazmidov=
Gonilo za razporeditev plazmidov predstavljajo ATP-aze in GTP-aze, ki zagotavljajo energijo za ustrezen premik plazmidov. Obstajata dva glavna razreda mehanizmov razporeditve plazmidov.

==Mehanizmi, ki vključujejo filamentacijo==
Po tem mehanizmu delujeta razporeditvena sistema tipa II in III.

===Razporeditveni sistem tipa II===
Razporeditvene ATP-aze tipa II (ParM) spadajo v razred aktinu podobnih proteinov. Te so sposobne polimerizacije in oblikovanja filamentov, ki potiskajo plazmida, pripeta na nasprotna konca filamenta, narazen (pri paličičastih bakterijah je to vzporedno z longitudinalno osjo celice).

Monomeri ParM polimerizirajo v prisotnosti ATP, pri čemer tvorijo levosučne dvojne vijačnice, ki so polarne (polarnost je posledica asimetrije monomerov, zato vsak filament vsebuje top in oster konec. ParR (CBP), ki je vezan na parC plazmida, se veže na topi konec filamenta in ustvari kapo, ki prepreči razgradnjo filamenta kljub hidrolizi ATP. Novi ParM-ATP monomeri se nato vstavljajo na topi konec skozi konkavni stik med ParR/parC. Ko filament raste, potiska plazmid na topem koncu in plazmid se premika po celici. Filamenti se urejajo v antiparalelne snope, kar pomeni, da so topi konci (mesta, kamor se veže plazmid) na obeh straneh snopa. Ko filamenti v snopu rastejo potiskajo plazmide, vezane na tope konce, na nasprotna pola celice. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (A in B)

===Razporeditveni sistem tipa III===
Razporeditveni sistem tipa III prav tako deluje na principu polimerizacije, ampak pri tem kot gonilno moč uporablja tubulinu podobne GTPaze (TubZ). Monomeri TubZ polimerizirajo v prisotnosti GTP in tvorijo dvo- in štirivijačne filamente, ki so stabilizirani z GTP kapo. TubZ filamenti so polarni, kar pomeni, da rastejo na + koncu in se razgrajajo na – koncu. Tja se veže tudi TubR (CBP), vezan na tubC. Ko polimer raste na + strani in se razgrajuje na – strani, mu razporeditveni kompleks sledi, kar se kaže v premikanju plazmida. Kako pa ta vleka plazmidov prispeva k ločitvi plazmidov še ni pojasnjeno, saj TubZ filamenti niso bipolarni (premikanje poteka le v eno smer). [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (C)

==Mehanizem po principu Brownovega zobatega kolesa==
Razporeditveni sistem tipa I, ki je pri bakterijah najbolj pogost, za razliko od drugih dveh tipov pa ne deluje na principu polimerizacije. Pri njegovem mehanizmu sodelujejo ATP-aze tipa Walker (ParA). Te so sposobne interakcije z bakterijskim nukleoidom in v celici tvorijo dinamičen gradient. Interagirajo tudi s proteini ParB (CBP), ki nosijo plazmidni tovor in sledijo gradientu ParA. Predpostavljenih je bilo več modelov kako ParB sledijo gradientu ParA, vsi pa delujejo na osnovi principa Brownovega zobatega kolesa.

V prisotnosti ATP se ParA veže na DNA (ATP pri tem hidrolizira). V naslednjem koraku se na ParA veže ParB, ki je vezan na parS (nosi plazmid) in pri tem iz nukleoida izrine ParA. Ta oddifundia v citoplazmo, kjer čaka, da se nanj ponovno veže ATP. Ker pa je ta korak zelo počasen, začne na nukleoidu primanjkovati ParA. ParB se torej premika po nukleoidu in za seboj pušča ParA praznino – gibanje plazmida je zato usmerjano stran od nižje koncentracije ParA. Plazmida bi se po replikaciji tako ločila, če bi bila koncentracija ParA med njima najnižja.
Obstaja več različnih modelov mehanizma Brownovega zobatega kolesa, vsi temeljijo na asimetriji distribucije ParA na bakterijskem nukleoidu. Delovanje lahko povežemo s konceptom požganega mostu – ko se ParB s plazmidnim tovorom premakne po nukleoidu, na svoji poti iz nukleoida odstranjuje ParA in s tem 'požge most za seboj', saj se zaradi odsotnosti Par A ne more vrniti nazaj. Predlagane verzije se med seboj razlikujejo po tem, kako asimetrija razporeditve ParA ustvari energijo, potrebno za gibanje in v vlogi, ki je pripisana bakterijskemu kromosomu in ParA oligomerizaciji.

Vse ATPaze tipa I uporabljajo mehanizem Brownovega zobatega kolesa, vendar pa je relevanten model najverjetneje odvisen od različnih biokemijskih značilnosti in ravni ekspresije ParA in ParB. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/3928d857-a2ad-4de1-9c2b-e5caecb4e75b/assets/graphic/plas-0023-2014-fig5.gif Slika 3]

=Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici=
Dva različna plazmida, ki ne moreta stabilno obstajati v isti celici, sta nezdružljiva. Pri delitvah celice tako pride do izgube oziroma zmanjšanja števila vsaj enega od plazmidov, kar je posledica skupnih lastnosti nezdružljivih plazmidov. Do nezdružljivosti zaradi sorodnega načina razporejanja v celici pride tako pri razporejanju tipa 1 kot 2.

==Nezdružljivost pri ParA==
Če imamo v celici plazmid z visokim številom kopij in Par sistemom razporejanja, bo to onemogočilo stabilen soobstoj plazmida z enakim parA genom. Pretirano izražanje ParA, ki je prisoten v večih kopijah namreč povzroči, da se začneta plazmida ob delitvi naključno razporejati v hčerinske celice. Delež nezdružljivosti sovpada s koncentracijo ParA. Povečana koncentracija ParA destabilizira razporeditveni kompleks in mehanizem Brownovega zobatega kolesa, ki omogoča premikanje plazmidov po celici. Pri visoki koncentraciji ParA se praznine brez Par A lahko hitreje zapolnijo in tako onemogočijo gibanje plazmida po nukleoidu.

==Nezdružljivost pri ParB==
Analogno kot pri ParA dva plazmida, ki se razporejata s ParB, v isti celici nista stabilna, še posebej, če je eden od njiju plazmid z visokim številom kopij, saj je nezdružljivost odvisna od izražanja ParB. Previsoka koncentracija ParB najverjetneje povzroči koncentriranje plazmidov s parS genom v skupke in s tem zmanjša število plazmidov, ki se prosto gibljejo po celici. V tem primeru ParA ne more dovolj uspešno razdreti razporeditvenih kompleksov in sprostiti plazmidov, zato sčasoma pride do izgube enega od plazmidov. Hkrati so ugotovili, da lahko nekatere različice proteina, kot je ParBF, sprožijo rekombinacijo sorodnih plazmidov in tako povzročijo multimerizacijo. Multimer je plazmid, ki nastane s homologno rekombinacijo in vsebuje dve ponovitvi celotnega plazmidnega nukleotidnega zaporedja.

==Nezdružljivost pri enakih centromerih==
Če plazmida vsebujeta sorodno mesto za razporejanje, načeloma pride do nezdružljivosti. Vzrok ni povsem znan. Pri plazmidih z visokim številom kopij pride do naključnega razporejanja plazmidov, pri plazmidih, ki vsebujejo več parS mest pa tudi do zmanjšanega števila prostih ParB zaradi pretirane vezave na parS. Pri plazmidih z nizkim številom kopij opazimo zelo močno nezdružljivost, kjer je izguba števila plazmidov višja kot pri naključnem razporejanju. Eden od možnih vzrokov za to je pozna replikacija plazmidov. Če se eden od plazmidov podvoji ravno pred celično delitvijo, se kopiji namreč ne prerazporedita znotraj celice, ampak se obe dedujeta v isti hčerinski celici, kar privede do visoke izgube plazmidov.

=Regulacija izražanja par gena=
Izražanje par operonov direktno vpliva na stabilnost plazmidov in je v vseh primerih nadzorovano po principu avtoregulacije. Eden od proteinov par operona deluje kot represor, pogosto pa tudi eden od preostalih kot korepresor. V razporeditvenem sistemu tipa I so represorji ParA ATPaze, pri vseh ostalih sistemih pa proteini CBP. ParA represorji se z N-končnim delom s HTH (vijačnica-zavoj-vijačnica) motivom vežejo na DNA. Vezavno mesto ni povsem raziskano, vsebuje pa daljše obratne ponovitve, ki omogočijo vezavo ParA. Ta specifična vezava je mogoča ob vezavi ADP kot kofaktorja, pri vezavi ATP pa prevlada nespecifična vezava DNA, ki omogoči razporejanje plazmidov s pomočjo ParB.

=Zaključek=
Sistemi za razporejanje plazmidov so nujni za njihov obstoj in so kljub svoji preprostosti zelo natančno regulirani. Z dvema ključnima proteinoma in specifičnimi DNA zaporedji lahko predvsem plazmidi z manjšim številom kopij poskrbijo, da se ob delitvi uspešno dedujejo v obe hčerinski celici. Kljub široki uporabi plazmidnih vektorjev mnogi procesi, povezani z njihovim razporejanjem, še niso v celoti pojasnjeni. Raziskave v tej smeri bodo pripomogle k našemu razumevanju strukturne biologije in dinamike celotnega bakterijskega genoma.

=Viri=
Bouet, J.-Y.; Funnell, B. E. Plasmid Localization and Partition in Enterobacteriaceae. EcoSal Plus 2019, 8 (2), 10.1128/ecosalplus.ESP-0003–2019. https://doi.org/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019.

Schumacher, M. A. Bacterial Plasmid Partition Machinery: A Minimalist Approach to Survival. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012, 22 (1), 72–79. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2011.11.001.

Gerdes, K.; Møller-Jensen, J.; Jensen, R. B. Plasmid and Chromosome Partitioning: Surprises from Phylogeny. Mol. Microbiol. 2000, 37 (3), 455–466. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01975.x.

Baxter, J. C.; Funnell, B. E. Plasmid Partition Mechanisms. Microbiol. Spectr. 2014, 2 (6), 10.1128/microbiolspec.plas-0023–2014. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014.

Brooks, A. C.; Hwang, L. C. Reconstitutions of Plasmid Partition Systems and Their Mechanisms. Plasmid 2017, 91, 37–41. https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2017.03.004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Talk:Razporejanje plazmidov v hčerinski celici

2024-05-04T20:09:51Z

Brina Klinar: Created page with "Karin Kunstelj (Uvod, Izračun izgube plazmida, Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov, Arhitektura) Brina Klinar (Mehanizmi razporejanja plazmidov) Nina Cankar (Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici, Regulacija izražanja par gena)"

Karin Kunstelj (Uvod, Izračun izgube plazmida, Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov, Arhitektura)

Brina Klinar (Mehanizmi razporejanja plazmidov)

Nina Cankar (Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici, Regulacija izražanja par gena)

Razporejanje plazmidov v hčerinski celici

2024-05-04T20:02:41Z

Brina Klinar:

=Uvod=
Plazmidi živijo s svojo gostiteljsko celico v simbiozi. Razvili so kar nekaj strategij za obstoj znotraj bakterijske populacije med katerimi je razporeditveni sistem. Vsi razporeditveni sistemi so sestavljeni iz treh delov: ene ali več kopij razporeditvenega mesta (centromer), CBP (centromerni vezavni protein) in NTP-aze.

=Izračun izgube plazmida=
Plazmidi z majhnim kopirnim številom se morajo za svoj obstoj nanašati na razporeditveni sistem, plazmidi z visokim številom kopij pa se zanašajo na pasivno difuzijo.
Za naključno distribucijo velja: Ploss = 2^(1-n), kjer je »n« število kopij v celici.

=Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov=
Razporeditveni sistemi so nujni za transport in vzpostavitev sistema s plazmidno DNA. Poznamo 3 razporeditvene sisteme, ki se razlikujejo po tipu razporejanja z NTP-azo. Centromeri so značilna ohranjena zaporedja na plazmidu, ki služijo kot prepoznavna mesta za CBP. CBP prepozna zaporedje na plazmidu in se tako veže na centromer. To deluje kot most med plazmidom in ustrezno NTP-azo, ki omogoča premik plazmida.

Tip I ima Walker ATP-azo, ki ločuje plazmid s formacijo dinamičnega vzorca na bakterijskem nukleoidu. Tip II uporablja aktinu podobno ATP-azo, ki polimerizira v dinamične filamente, ki potiskajo plazmida narazen. Tip III ima tubulinu podobne GTP-aze, ki prav tako delujejo preko dinamične polimerizacije mehanizma.
Različni tipi so prikazani na [https://journals.asm.org/cms/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019/asset/0bc1138d-60c0-4e59-95c9-fdfec9718c8d/assets/graphic/esp-0003-2019_fig_004.gif sliki 1].

=Arhitektura=
CBP-ji se lahko na prepoznavno mesto vežejo v več kopijah in tako tvorijo razporeditvene komplekse, katerih arhitektura je odvisna od tipa CBP. CBP tip I vsebuje motiv HTH2 in prepozna centromerno mesto parS, kamor se veže v več kopijah in gradi velike komplekse. To omogoča številne interakcije z ustrezno NTP-azo. CBP tip II (vsebuje RHH2 motiv) in tip III (vsebuje HTH2 motiv) tvorita podobne komplekse in sicer, oba tvorita vijačne, obročaste strukture in povzročita upogib DNA.

=Vizualizacija plazmidnih dinamik v celici=
==Tip I==
Najraje se nahajajo na četrtini ali polovici celice v majhnih in večjih celicah. V vseh primerih pa vpadajo z bakterijskimi nukleoidom. ParB in RHH2 so prisotni v velikih količinah znotraj celice in so kot žarišča, ki so odvisni od razporeditvenega mesta in korespondirajo na pozicijo plazmida. ParB iz F plazmidov so prisotni v skupkih v okolici F razporeditvenega mesta, parSF. Razporeditveni kompleksi plazmida F so najdeni znotraj večje mase nukleoida. ParA imajo oscilatorno vedenje, nekatere pa tvorijo dinamične gradiente.

==Tip II in III==
ParMR1 tvorijo dolge filamente. Plazmidi niso prisotni na obeh koncih ParM polimerov. Premik plazmidne DNA na nasproten pol celice žene ParM polimerizacija med sestrskima ParR-parC (R1 centromer) kompleksoma.

Tubulinu podobna GTP-aza iz Gram-pozitivnih bakterij tvori dinamične in citoskeletne filamente, kar nakazuje, da tip III deluje po filamentacijskem mehanizmu za razporejanje plazmidov znotraj celic.

Slikovna obdelava razporeditve in ločitve plazmidov z velikim številom kopij
Plazmidi naj bi sledili obliki ameriškega krofa. Prosto difundirajoči plazmidi so večinoma izven nukleoida v notranjem periferiju bakterije. Plazmidi z visokim kopirnim številom so v skupkih na polih celice in naključno razporejeni skozi celoten volumen celice z nižjo frekvenco znotraj nukleoida. To podpira model mešane distribucije, ki vključuje možnost nastajanja skupkov in naključno difuzijo individualnih plazmidov z visokim številom kopij.

=Mehanizmi razporeditve plazmidov=
Gonilo za razporeditev plazmidov predstavljajo ATP-aze in GTP-aze, ki zagotavljajo energijo za ustrezen premik plazmidov. Obstajata dva glavna razreda mehanizmov razporeditve plazmidov.

==Mehanizmi, ki vključujejo filamentacijo==
Po tem mehanizmu delujeta razporeditvena sistema tipa II in III.

===Razporeditveni sistem tipa II===
Razporeditvene ATP-aze tipa II (ParM) spadajo v razred aktinu podobnih proteinov. Te so sposobne polimerizacije in oblikovanja filamentov, ki potiskajo plazmida, pripeta na nasprotna konca filamenta, narazen (pri paličičastih bakterijah je to vzporedno z longitudinalno osjo celice).

Monomeri ParM polimerizirajo v prisotnosti ATP, pri čemer tvorijo levosučne dvojne vijačnice, ki so polarne (polarnost je posledica asimetrije monomerov, zato vsak filament vsebuje top in oster konec. ParR (CBP), ki je vezan na parC plazmida, se veže na topi konec filamenta in ustvari kapo, ki prepreči razgradnjo filamenta kljub hidrolizi ATP. Novi ParM-ATP monomeri se nato vstavljajo na topi konec skozi konkavni stik med ParR/parC. Ko filament raste, potiska plazmid na topem koncu in plazmid se premika po celici. Filamenti se urejajo v antiparalelne snope, kar pomeni, da so topi konci (mesta, kamor se veže plazmid) na obeh straneh snopa. Ko filamenti v snopu rastejo potiskajo plazmide, vezane na tope konce, na nasprotna pola celice. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (A in B)

===Razporeditveni sistem tipa III===
Razporeditveni sistem tipa III prav tako deluje na principu polimerizacije, ampak pri tem kot gonilno moč uporablja tubulinu podobne GTPaze (TubZ). Monomeri TubZ polimerizirajo v prisotnosti GTP in tvorijo dvo- in štirivijačne filamente, ki so stabilizirani z GTP kapo. TubZ filamenti so polarni, kar pomeni, da rastejo na + koncu in se razgrajajo na – koncu. Tja se veže tudi TubR (CBP), vezan na tubC. Ko polimer raste na + strani in se razgrajuje na – strani, mu razporeditveni kompleks sledi, kar se kaže v premikanju plazmida. Kako pa ta vleka plazmidov prispeva k ločitvi plazmidov še ni pojasnjeno, saj TubZ filamenti niso bipolarni (premikanje poteka le v eno smer). [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (C)

==Mehanizem po principu Brownovega zobatega kolesa==
Razporeditveni sistem tipa I, ki je pri bakterijah najbolj pogost, za razliko od drugih dveh tipov pa ne deluje na principu polimerizacije. Pri njegovem mehanizmu sodelujejo ATP-aze tipa Walker (ParA). Te so sposobne interakcije z bakterijskim nukleoidom in v celici tvorijo dinamičen gradient. Interagirajo tudi s proteini ParB (CBP), ki nosijo plazmidni tovor in sledijo gradientu ParA. Predpostavljenih je bilo več modelov kako ParB sledijo gradientu ParA, vsi pa delujejo na osnovi principa Brownovega zobatega kolesa.

V prisotnosti ATP se ParA veže na DNA (ATP pri tem hidrolizira). V naslednjem koraku se na ParA veže ParB, ki je vezan na parS (nosi plazmid) in pri tem iz nukleoida izrine ParA. Ta oddifundia v citoplazmo, kjer čaka, da se nanj ponovno veže ATP. Ker pa je ta korak zelo počasen, začne na nukleoidu primanjkovati ParA. ParB se torej premika po nukleoidu in za seboj pušča ParA praznino – gibanje plazmida je zato usmerjano stran od nižje koncentracije ParA. Plazmida bi se po replikaciji tako ločila, če bi bila koncentracija ParA med njima najnižja.
Obstaja več različnih modelov mehanizma Brownovega zobatega kolesa, vsi temeljijo na asimetriji distribucije ParA na bakterijskem nukleoidu. Delovanje lahko povežemo s konceptom požganega mostu – ko se ParB s plazmidnim tovorom premakne po nukleoidu, na svoji poti iz nukleoida odstranjuje ParA in s tem 'požge most za seboj', saj se zaradi odsotnosti Par A ne more vrniti nazaj. Predlagane verzije se med seboj razlikujejo po tem, kako asimetrija razporeditve ParA ustvari energijo, potrebno za gibanje in v vlogi, ki je pripisana bakterijskemu kromosomu in ParA oligomerizaciji.

Vse ATPaze tipa I uporabljajo mehanizem Brownovega zobatega kolesa, vendar pa je relevanten model najverjetneje odvisen od različnih biokemijskih značilnosti in ravni ekspresije ParA in ParB. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/3928d857-a2ad-4de1-9c2b-e5caecb4e75b/assets/graphic/plas-0023-2014-fig5.gif Slika 3]

=Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici=
Dva različna plazmida, ki ne moreta stabilno obstajati v isti celici, sta nezdružljiva. Pri delitvah celice tako pride do izgube oziroma zmanjšanja števila vsaj enega od plazmidov, kar je posledica skupnih lastnosti nezdružljivih plazmidov. Do nezdružljivosti zaradi sorodnega načina razporejanja v celici pride tako pri razporejanju tipa 1 kot 2.

==Nezdružljivost pri ParA==
Če imamo v celici plazmid z visokim številom kopij in Par sistemom razporejanja, bo to onemogočilo stabilen soobstoj plazmida z enakim parA genom. Pretirano izražanje ParA, ki je prisoten v večih kopijah namreč povzroči, da se začneta plazmida ob delitvi naključno razporejati v hčerinske celice. Delež nezdružljivosti sovpada s koncentracijo ParA. Povečana koncentracija ParA destabilizira razporeditveni kompleks in mehanizem Brownovega zobatega kolesa, ki omogoča premikanje plazmidov po celici. Pri visoki koncentraciji ParA se praznine brez Par A lahko hitreje zapolnijo in tako onemogočijo gibanje plazmida po nukleoidu.

==Nezdružljivost pri ParB==
Analogno kot pri ParA dva plazmida, ki se razporejata s ParB, v isti celici nista stabilna, še posebej, če je eden od njiju plazmid z visokim številom kopij, saj je nezdružljivost odvisna od izražanja ParB. Previsoka koncentracija ParB najverjetneje povzroči koncentriranje plazmidov s parS genom v skupke in s tem zmanjša število plazmidov, ki se prosto gibljejo po celici. V tem primeru ParA ne more dovolj uspešno razdreti razporeditvenih kompleksov in sprostiti plazmidov, zato sčasoma pride do izgube enega od plazmidov. Hkrati so ugotovili, da lahko nekatere različice proteina, kot je ParBF, sprožijo rekombinacijo sorodnih plazmidov in tako povzročijo multimerizacijo. Multimer je plazmid, ki nastane s homologno rekombinacijo in vsebuje dve ponovitvi celotnega plazmidnega nukleotidnega zaporedja.

==Nezdružljivost pri enakih centromerih==
Če plazmida vsebujeta sorodno mesto za razporejanje, načeloma pride do nezdružljivosti. Vzrok ni povsem znan. Pri plazmidih z visokim številom kopij pride do naključnega razporejanja plazmidov, pri plazmidih, ki vsebujejo več parS mest pa tudi do zmanjšanega števila prostih ParB zaradi pretirane vezave na parS. Pri plazmidih z nizkim številom kopij opazimo zelo močno nezdružljivost, kjer je izguba števila plazmidov višja kot pri naključnem razporejanju. Eden od možnih vzrokov za to je pozna replikacija plazmidov. Če se eden od plazmidov podvoji ravno pred celično delitvijo, se kopiji namreč ne prerazporedita znotraj celice, ampak se obe dedujeta v isti hčerinski celici, kar privede do visoke izgube plazmidov.

=Regulacija izražanja par gena=
Izražanje par operonov direktno vpliva na stabilnost plazmidov in je v vseh primerih nadzorovano po principu avtoregulacije. Eden od proteinov par operona deluje kot represor, pogosto pa tudi eden od preostalih kot korepresor. V razporeditvenem sistemu tipa I so represorji ParA ATPaze, pri vseh ostalih sistemih pa proteini CBP. ParA represorji se z N-končnim delom s HTH (vijačnica-zavoj-vijačnica) motivom vežejo na DNA. Vezavno mesto ni povsem raziskano, vsebuje pa daljše obratne ponovitve, ki omogočijo vezavo ParA. Ta specifična vezava je mogoča ob vezavi ADP kot kofaktorja, pri vezavi ATP pa prevlada nespecifična vezava DNA, ki omogoči razporejanje plazmidov s pomočjo ParB.

=Zaključek=
Sistemi za razporejanje plazmidov so nujni za njihov obstoj in so kljub svoji preprostosti zelo natančno regulirani. Z dvema ključnima proteinoma in specifičnimi DNA zaporedji lahko predvsem plazmidi z manjšim številom kopij poskrbijo, da se ob delitvi uspešno dedujejo v obe hčerinski celici. Kljub široki uporabi plazmidnih vektorjev mnogi procesi, povezani z njihovim razporejanjem, še niso v celoti pojasnjeni. Raziskave v tej smeri bodo pripomogle k našemu razumevanju strukturne biologije in dinamike celotnega bakterijskega genoma.

=Viri=
Bouet, J.-Y.; Funnell, B. E. Plasmid Localization and Partition in Enterobacteriaceae. EcoSal Plus 2019, 8 (2), 10.1128/ecosalplus.ESP-0003–2019. https://doi.org/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019.

Schumacher, M. A. Bacterial Plasmid Partition Machinery: A Minimalist Approach to Survival. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012, 22 (1), 72–79. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2011.11.001.

Gerdes, K.; Møller-Jensen, J.; Jensen, R. B. Plasmid and Chromosome Partitioning: Surprises from Phylogeny. Mol. Microbiol. 2000, 37 (3), 455–466. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01975.x.

Baxter, J. C.; Funnell, B. E. Plasmid Partition Mechanisms. Microbiol. Spectr. 2014, 2 (6), 10.1128/microbiolspec.plas-0023–2014. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014.

Brooks, A. C.; Hwang, L. C. Reconstitutions of Plasmid Partition Systems and Their Mechanisms. Plasmid 2017, 91, 37–41. https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2017.03.004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Razporejanje plazmidov v hčerinski celici

2024-05-04T19:57:02Z

Brina Klinar: Undo revision 23306 by Brina Klinar (talk)

=Uvod=
Plazmidi živijo s svojo gostiteljsko celico v simbiozi. Razvili so kar nekaj strategij za obstoj znotraj bakterijske populacije med katerimi je razporeditveni sistem. Vsi razporeditveni sistemi so sestavljeni iz treh delov: ene ali več kopij razporeditvenega mesta (centromer), CBP (centromerni vezavni protein) in NTP-aze.
=Izračun izgube plazmida=
Plazmidi z majhnim kopirnim številom se morajo za svoj obstoj nanašati na razporeditveni sistem, plazmidi z visokim številom kopij pa se zanašajo na pasivno difuzijo.
Za naključno distribucijo velja: Ploss = 2^(1-n), kjer je »n« število kopij v celici.
=Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov=
Razporeditveni sistemi so nujni za transport in vzpostavitev sistema s plazmidno DNA. Poznamo 3 razporeditvene sisteme, ki se razlikujejo po tipu razporejanja z NTP-azo. Centromeri so značilna ohranjena zaporedja na plazmidu, ki služijo kot prepoznavna mesta za CBP. CBP prepozna zaporedje na plazmidu in se tako veže na centromer. To deluje kot most med plazmidom in ustrezno NTP-azo, ki omogoča premik plazmida.
Tip I ima Walker ATP-azo, ki ločuje plazmid s formacijo dinamičnega vzorca na bakterijskem nukleoidu. Tip II uporablja aktinu podobno ATP-azo, ki polimerizira v dinamične filamente, ki potiskajo plazmida narazen. Tip III ima tubulinu podobne GTP-aze, ki prav tako delujejo preko dinamične polimerizacije mehanizma.
Različni tipi so prikazani na [https://journals.asm.org/cms/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019/asset/0bc1138d-60c0-4e59-95c9-fdfec9718c8d/assets/graphic/esp-0003-2019_fig_004.gif sliki 1].
=Arhitektura=
CBP-ji se lahko na prepoznavno mesto vežejo v več kopijah in tako tvorijo razporeditvene komplekse,
katerih arhitektura je odvisna od tipa CBP. CBP tip I vsebuje motiv HTH2 in prepozna centromerno mesto parS, kamor se veže v več kopijah in gradi velike komplekse. To omogoča številne interakcije z ustrezno NTP-azo. CBP tip II (vsebuje RHH2 motiv) in tip III (vsebuje HTH2 motiv) tvorita podobne komplekse in sicer, oba tvorita vijačne, obročaste strukture in povzročita upogib DNA.
Vizualizacija plazmidnih dinamik v celici
==Tip I==
Najraje se nahajajo na četrtini ali polovici celice v majhnih in večjih celicah. V vseh primerih pa vpadajo z bakterijskimi nukleoidom. ParB in RHH2 so prisotni v velikih količinah znotraj celice in so kot žarišča, ki so odvisni od razporeditvenega mesta in korespondirajo na pozicijo plazmida. ParB iz F plazmidov so prisotni v skupkih v okolici F razporeditvenega mesta, parSF. Razporeditveni kompleksi plazmida F so najdeni znotraj večje mase nukleoida. ParA imajo oscilatorno vedenje, nekatere pa tvorijo dinamične gradiente.
==Tip II in III==
ParMR1 tvorijo dolge filamente. Plazmidi niso prisotni na obeh koncih ParM polimerov. Premik plazmidne DNA na nasproten pol celice žene ParM polimerizacija med sestrskima ParR-parC (R1 centromer) kompleksoma.
Tubulinu podobna GTP-aza iz Gram-pozitivnih bakterij tvori dinamične in citoskeletne filamente, kar nakazuje, da tip III deluje po filamentacijskem mehanizmu za razporejanje plazmidov znotraj celic.
Slikovna obdelava razporeditve in ločitve plazmidov z velikim številom kopij
Plazmidi naj bi sledili obliki ameriškega krofa. Prosto difundirajoči plazmidi so večinoma izven nukleoida v notranjem periferiju bakterije. Plazmidi z visokim kopirnim številom so v skupkih na polih celice in naključno razporejeni skozi celoten volumen celice z nižjo frekvenco znotraj nukleoida. To podpira model mešane distribucije, ki vključuje možnost nastajanja skupkov in naključno difuzijo individualnih plazmidov z visokim številom kopij.

=Mehanizmi razporeditve plazmidov=
Gonilo za razporeditev plazmidov predstavljajo ATP-aze in GTP-aze, ki zagotavljajo energijo za ustrezen premik plazmidov. Obstajata dva glavna razreda mehanizmov razporeditve plazmidov.
==Mehanizmi, ki vključujejo filamentacijo==
Po tem mehanizmu delujeta razporeditvena sistema tipa II in III.
===Razporeditveni sistem tipa II===
Razporeditvene ATP-aze tipa II (ParM) spadajo v razred aktinu podobnih proteinov. Te so sposobne polimerizacije in oblikovanja filamentov, ki potiskajo plazmida, pripeta na nasprotna konca filamenta, narazen (pri paličičastih bakterijah je to vzporedno z longitudinalno osjo celice).
Monomeri ParM polimerizirajo v prisotnosti ATP, pri čemer tvorijo levosučne dvojne vijačnice, ki so polarne (polarnost je posledica asimetrije monomerov, zato vsak filament vsebuje top in oster konec. ParR (CBP), ki je vezan na parC plazmida, se veže na topi konec filamenta in ustvari kapo, ki prepreči razgradnjo filamenta kljub hidrolizi ATP. Novi ParM-ATP monomeri se nato vstavljajo na topi konec skozi konkavni stik med ParR/parC. Ko filament raste, potiska plazmid na topem koncu in plazmid se premika po celici. Filamenti se urejajo v antiparalelne snope, kar pomeni, da so topi konci (mesta, kamor se veže plazmid) na obeh straneh snopa. Ko filamenti v snopu rastejo potiskajo plazmide, vezane na tope konce, na nasprotna pola celice. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (A in B)

===Razporeditveni sistem tipa III===
Razporeditveni sistem tipa III prav tako deluje na principu polimerizacije, ampak pri tem kot gonilno moč uporablja tubulinu podobne GTPaze (TubZ). Monomeri TubZ polimerizirajo v prisotnosti GTP in tvorijo dvo- in štirivijačne filamente, ki so stabilizirani z GTP kapo. TubZ filamenti so polarni, kar pomeni, da rastejo na + koncu in se razgrajajo na – koncu. Tja se veže tudi TubR (CBP), vezan na tubC. Ko polimer raste na + strani in se razgrajuje na – strani, mu razporeditveni kompleks sledi, kar se kaže v premikanju plazmida. Kako pa ta vleka plazmidov prispeva k ločitvi plazmidov še ni pojasnjeno, saj TubZ filamenti niso bipolarni (premikanje poteka le v eno smer). [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (C)

==Mehanizem po principu Brownovega zobatega kolesa==
Razporeditveni sistem tipa I, ki je pri bakterijah najbolj pogost, za razliko od drugih dveh tipov pa ne deluje na principu polimerizacije. Pri njegovem mehanizmu sodelujejo ATP-aze tipa Walker (ParA). Te so sposobne interakcije z bakterijskim nukleoidom in v celici tvorijo dinamičen gradient. Interagirajo tudi s proteini ParB (CBP), ki nosijo plazmidni tovor in sledijo gradientu ParA. Predpostavljenih je bilo več modelov kako ParB sledijo gradientu ParA, vsi pa delujejo na osnovi principa Brownovega zobatega kolesa.
V prisotnosti ATP se ParA veže na DNA (ATP pri tem hidrolizira). V naslednjem koraku se na ParA veže ParB, ki je vezan na parS (nosi plazmid) in pri tem iz nukleoida izrine ParA. Ta oddifundia v citoplazmo, kjer čaka, da se nanj ponovno veže ATP. Ker pa je ta korak zelo počasen, začne na nukleoidu primanjkovati ParA. ParB se torej premika po nukleoidu in za seboj pušča ParA praznino – gibanje plazmida je zato usmerjano stran od nižje koncentracije ParA. Plazmida bi se po replikaciji tako ločila, če bi bila koncentracija ParA med njima najnižja.
Obstaja več različnih modelov mehanizma Brownovega zobatega kolesa, vsi temeljijo na asimetriji distribucije ParA na bakterijskem nukleoidu. Delovanje lahko povežemo s konceptom požganega mostu – ko se ParB s plazmidnim tovorom premakne po nukleoidu, na svoji poti iz nukleoida odstranjuje ParA in s tem 'požge most za seboj', saj se zaradi odsotnosti Par A ne more vrniti nazaj. Predlagane verzije se med seboj razlikujejo po tem, kako asimetrija razporeditve ParA ustvari energijo, potrebno za gibanje in v vlogi, ki je pripisana bakterijskemu kromosomu in ParA oligomerizaciji.
Vse ATPaze tipa I uporabljajo mehanizem Brownovega zobatega kolesa, vendar pa je relevanten model najverjetneje odvisen od različnih biokemijskih značilnosti in ravni ekspresije ParA in ParB. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/3928d857-a2ad-4de1-9c2b-e5caecb4e75b/assets/graphic/plas-0023-2014-fig5.gif Slika 3]

=Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici=
Dva različna plazmida, ki ne moreta stabilno obstajati v isti celici, sta nezdružljiva. Pri delitvah celice tako pride do izgube oziroma zmanjšanja števila vsaj enega od plazmidov, kar je posledica skupnih lastnosti nezdružljivih plazmidov. Do nezdružljivosti zaradi sorodnega načina razporejanja v celici pride tako pri razporejanju tipa 1 kot 2.
==Nezdružljivost pri ParA==
Če imamo v celici plazmid z visokim številom kopij in Par sistemom razporejanja, bo to onemogočilo stabilen soobstoj plazmida z enakim parA genom. Pretirano izražanje ParA, ki je prisoten v večih kopijah namreč povzroči, da se začneta plazmida ob delitvi naključno razporejati v hčerinske celice. Delež nezdružljivosti sovpada s koncentracijo ParA. Povečana koncentracija ParA destabilizira razporeditveni kompleks in mehanizem Brownovega zobatega kolesa, ki omogoča premikanje plazmidov po celici. Pri visoki koncentraciji ParA se praznine brez Par A lahko hitreje zapolnijo in tako onemogočijo gibanje plazmida po nukleoidu.
==Nezdružljivost pri ParB==
Analogno kot pri ParA dva plazmida, ki se razporejata s ParB, v isti celici nista stabilna, še posebej, če je eden od njiju plazmid z visokim številom kopij, saj je nezdružljivost odvisna od izražanja ParB. Previsoka koncentracija ParB najverjetneje povzroči koncentriranje plazmidov s parS genom v skupke in s tem zmanjša število plazmidov, ki se prosto gibljejo po celici. V tem primeru ParA ne more dovolj uspešno razdreti razporeditvenih kompleksov in sprostiti plazmidov, zato sčasoma pride do izgube enega od plazmidov. Hkrati so ugotovili, da lahko nekatere različice proteina, kot je ParBF, sprožijo rekombinacijo sorodnih plazmidov in tako povzročijo multimerizacijo. Multimer je plazmid, ki nastane s homologno rekombinacijo in vsebuje dve ponovitvi celotnega plazmidnega nukleotidnega zaporedja.
Vir slike:[1]
==Nezdružljivost pri enakih centromerih==
Če plazmida vsebujeta sorodno mesto za razporejanje, načeloma pride do nezdružljivosti. Vzrok ni povsem znan. Pri plazmidih z visokim številom kopij pride do naključnega razporejanja plazmidov, pri plazmidih, ki vsebujejo več parS mest pa tudi do zmanjšanega števila prostih ParB zaradi pretirane vezave na parS. Pri plazmidih z nizkim številom kopij opazimo zelo močno nezdružljivost, kjer je izguba števila plazmidov višja kot pri naključnem razporejanju. Eden od možnih vzrokov za to je pozna replikacija plazmidov. Če se eden od plazmidov podvoji ravno pred celično delitvijo, se kopiji namreč ne prerazporedita znotraj celice, ampak se obe dedujeta v isti hčerinski celici, kar privede do visoke izgube plazmidov.
Vir slike: [2]
=Regulacija izražanja par gena=
Izražanje par operonov direktno vpliva na stabilnost plazmidov in je v vseh primerih nadzorovano po principu avtoregulacije. Eden od proteinov par operona deluje kot represor, pogosto pa tudi eden od preostalih kot korepresor. V razporeditvenem sistemu tipa I so represorji ParA ATPaze, pri vseh ostalih sistemih pa proteini CBP. ParA represorji se z N-končnim delom s HTH (vijačnica-zavoj-vijačnica) motivom vežejo na DNA. Vezavno mesto ni povsem raziskano, vsebuje pa daljše obratne ponovitve, ki omogočijo vezavo ParA. Ta specifična vezava je mogoča ob vezavi ADP kot kofaktorja, pri vezavi ATP pa prevlada nespecifična vezava DNA, ki omogoči razporejanje plazmidov s pomočjo ParB.
=Zaključek=
Sistemi za razporejanje plazmidov so nujni za njihov obstoj in so kljub svoji preprostosti zelo natančno regulirani. Z dvema ključnima proteinoma in specifičnimi DNA zaporedji lahko predvsem plazmidi z manjšim številom kopij poskrbijo, da se ob delitvi uspešno dedujejo v obe hčerinski celici. Kljub široki uporabi plazmidnih vektorjev mnogi procesi, povezani z njihovim razporejanjem, še niso v celoti pojasnjeni. Raziskave v tej smeri bodo pripomogle k našemu razumevanju strukturne biologije in dinamike celotnega bakterijskega genoma.

=Viri=
Bouet, J.-Y.; Funnell, B. E. Plasmid Localization and Partition in Enterobacteriaceae. EcoSal Plus 2019, 8 (2), 10.1128/ecosalplus.ESP-0003–2019. https://doi.org/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019.
Schumacher, M. A. Bacterial Plasmid Partition Machinery: A Minimalist Approach to Survival. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012, 22 (1), 72–79. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2011.11.001.
Gerdes, K.; Møller-Jensen, J.; Jensen, R. B. Plasmid and Chromosome Partitioning: Surprises from Phylogeny. Mol. Microbiol. 2000, 37 (3), 455–466. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01975.x.
Baxter, J. C.; Funnell, B. E. Plasmid Partition Mechanisms. Microbiol. Spectr. 2014, 2 (6), 10.1128/microbiolspec.plas-0023–2014. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014.
Møller‐Jensen, J.; Jensen, R. B.; Löwe, J.; Gerdes, K. Prokaryotic DNA Segregation by an Actin‐like Filament. EMBO J. 2002, 21 (12), 3119–3127. https://doi.org/10.1093/emboj/cdf320.
(11) Brooks, A. C.; Hwang, L. C. Reconstitutions of Plasmid Partition Systems and Their Mechanisms. Plasmid 2017, 91, 37–41. https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2017.03.004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Razporejanje plazmidov v hčerinski celici

2024-05-04T19:56:46Z

Brina Klinar: Undo revision 23307 by Brina Klinar (talk)

=Uvod=
Plazmidi živijo s svojo gostiteljsko celico v simbiozi. Razvili so kar nekaj strategij za obstoj znotraj bakterijske populacije med katerimi je razporeditveni sistem. Vsi razporeditveni sistemi so sestavljeni iz treh delov: ene ali več kopij razporeditvenega mesta (centromer), CBP (centromerni vezavni protein) in NTP-aze.
=Izračun izgube plazmida=
Plazmidi z majhnim kopirnim številom se morajo za svoj obstoj nanašati na razporeditveni sistem, plazmidi z visokim številom kopij pa se zanašajo na pasivno difuzijo.
Za naključno distribucijo velja: Ploss = 2^(1-n), kjer je »n« število kopij v celici.
=Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov=
Razporeditveni sistemi so nujni za transport in vzpostavitev sistema s plazmidno DNA. Poznamo 3 razporeditvene sisteme, ki se razlikujejo po tipu razporejanja z NTP-azo. Centromeri so značilna ohranjena zaporedja na plazmidu, ki služijo kot prepoznavna mesta za CBP. CBP prepozna zaporedje na plazmidu in se tako veže na centromer. To deluje kot most med plazmidom in ustrezno NTP-azo, ki omogoča premik plazmida.
Tip I ima Walker ATP-azo, ki ločuje plazmid s formacijo dinamičnega vzorca na bakterijskem nukleoidu. Tip II uporablja aktinu podobno ATP-azo, ki polimerizira v dinamične filamente, ki potiskajo plazmida narazen. Tip III ima tubulinu podobne GTP-aze, ki prav tako delujejo preko dinamične polimerizacije mehanizma.
Različni tipi so prikazani na [https://journals.asm.org/cms/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019/asset/0bc1138d-60c0-4e59-95c9-fdfec9718c8d/assets/graphic/esp-0003-2019_fig_004.gif sliki 1].
=Arhitektura=
CBP-ji se lahko na prepoznavno mesto vežejo v več kopijah in tako tvorijo razporeditvene komplekse, katerih arhitektura je odvisna od tipa CBP. CBP tip I vsebuje motiv HTH2 in prepozna centromerno mesto parS, kamor se veže v več kopijah in gradi velike komplekse. To omogoča številne interakcije z ustrezno NTP-azo. CBP tip II (vsebuje RHH2 motiv) in tip III (vsebuje HTH2 motiv) tvorita podobne komplekse in sicer, oba tvorita vijačne, obročaste strukture in povzročita upogib DNA.
=Vizualizacija plazmidnih dinamik v celici=
==Tip I==
Najraje se nahajajo na četrtini ali polovici celice v majhnih in večjih celicah. V vseh primerih pa vpadajo z bakterijskimi nukleoidom. ParB in RHH2 so prisotni v velikih količinah znotraj celice in so kot žarišča, ki so odvisni od razporeditvenega mesta in korespondirajo na pozicijo plazmida. ParB iz F plazmidov so prisotni v skupkih v okolici F razporeditvenega mesta, parSF. Razporeditveni kompleksi plazmida F so najdeni znotraj večje mase nukleoida. ParA imajo oscilatorno vedenje, nekatere pa tvorijo dinamične gradiente.
==Tip II in III==
ParMR1 tvorijo dolge filamente. Plazmidi niso prisotni na obeh koncih ParM polimerov. Premik plazmidne DNA na nasproten pol celice žene ParM polimerizacija med sestrskima ParR-parC (R1 centromer) kompleksoma.
Tubulinu podobna GTP-aza iz Gram-pozitivnih bakterij tvori dinamične in citoskeletne filamente, kar nakazuje, da tip III deluje po filamentacijskem mehanizmu za razporejanje plazmidov znotraj celic.
Slikovna obdelava razporeditve in ločitve plazmidov z velikim številom kopij
Plazmidi naj bi sledili obliki ameriškega krofa. Prosto difundirajoči plazmidi so večinoma izven nukleoida v notranjem periferiju bakterije. Plazmidi z visokim kopirnim številom so v skupkih na polih celice in naključno razporejeni skozi celoten volumen celice z nižjo frekvenco znotraj nukleoida. To podpira model mešane distribucije, ki vključuje možnost nastajanja skupkov in naključno difuzijo individualnih plazmidov z visokim številom kopij.

=Mehanizmi razporeditve plazmidov=
Gonilo za razporeditev plazmidov predstavljajo ATP-aze in GTP-aze, ki zagotavljajo energijo za ustrezen premik plazmidov. Obstajata dva glavna razreda mehanizmov razporeditve plazmidov.
==Mehanizmi, ki vključujejo filamentacijo==
Po tem mehanizmu delujeta razporeditvena sistema tipa II in III.
===Razporeditveni sistem tipa II===
Razporeditvene ATP-aze tipa II (ParM) spadajo v razred aktinu podobnih proteinov. Te so sposobne polimerizacije in oblikovanja filamentov, ki potiskajo plazmida, pripeta na nasprotna konca filamenta, narazen (pri paličičastih bakterijah je to vzporedno z longitudinalno osjo celice).
Monomeri ParM polimerizirajo v prisotnosti ATP, pri čemer tvorijo levosučne dvojne vijačnice, ki so polarne (polarnost je posledica asimetrije monomerov, zato vsak filament vsebuje top in oster konec. ParR (CBP), ki je vezan na parC plazmida, se veže na topi konec filamenta in ustvari kapo, ki prepreči razgradnjo filamenta kljub hidrolizi ATP. Novi ParM-ATP monomeri se nato vstavljajo na topi konec skozi konkavni stik med ParR/parC. Ko filament raste, potiska plazmid na topem koncu in plazmid se premika po celici. Filamenti se urejajo v antiparalelne snope, kar pomeni, da so topi konci (mesta, kamor se veže plazmid) na obeh straneh snopa. Ko filamenti v snopu rastejo potiskajo plazmide, vezane na tope konce, na nasprotna pola celice. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (A in B)

===Razporeditveni sistem tipa III===
Razporeditveni sistem tipa III prav tako deluje na principu polimerizacije, ampak pri tem kot gonilno moč uporablja tubulinu podobne GTPaze (TubZ). Monomeri TubZ polimerizirajo v prisotnosti GTP in tvorijo dvo- in štirivijačne filamente, ki so stabilizirani z GTP kapo. TubZ filamenti so polarni, kar pomeni, da rastejo na + koncu in se razgrajajo na – koncu. Tja se veže tudi TubR (CBP), vezan na tubC. Ko polimer raste na + strani in se razgrajuje na – strani, mu razporeditveni kompleks sledi, kar se kaže v premikanju plazmida. Kako pa ta vleka plazmidov prispeva k ločitvi plazmidov še ni pojasnjeno, saj TubZ filamenti niso bipolarni (premikanje poteka le v eno smer). [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (C)

==Mehanizem po principu Brownovega zobatega kolesa==
Razporeditveni sistem tipa I, ki je pri bakterijah najbolj pogost, za razliko od drugih dveh tipov pa ne deluje na principu polimerizacije. Pri njegovem mehanizmu sodelujejo ATP-aze tipa Walker (ParA). Te so sposobne interakcije z bakterijskim nukleoidom in v celici tvorijo dinamičen gradient. Interagirajo tudi s proteini ParB (CBP), ki nosijo plazmidni tovor in sledijo gradientu ParA. Predpostavljenih je bilo več modelov kako ParB sledijo gradientu ParA, vsi pa delujejo na osnovi principa Brownovega zobatega kolesa. 
V prisotnosti ATP se ParA veže na DNA (ATP pri tem hidrolizira). V naslednjem koraku se na ParA veže ParB, ki je vezan na parS (nosi plazmid) in pri tem iz nukleoida izrine ParA. Ta oddifundia v citoplazmo, kjer čaka, da se nanj ponovno veže ATP. Ker pa je ta korak zelo počasen, začne na nukleoidu primanjkovati ParA. ParB se torej premika po nukleoidu in za seboj pušča ParA praznino – gibanje plazmida je zato usmerjano stran od nižje koncentracije ParA. Plazmida bi se po replikaciji tako ločila, če bi bila koncentracija ParA med njima najnižja. 
Obstaja več različnih modelov mehanizma Brownovega zobatega kolesa, vsi temeljijo na asimetriji distribucije ParA na bakterijskem nukleoidu. Delovanje lahko povežemo s konceptom požganega mostu – ko se ParB s plazmidnim tovorom premakne po nukleoidu, na svoji poti iz nukleoida odstranjuje ParA in s tem 'požge most za seboj', saj se zaradi odsotnosti Par A ne more vrniti nazaj. Predlagane verzije se med seboj razlikujejo po tem, kako asimetrija razporeditve ParA ustvari energijo, potrebno za gibanje in v vlogi, ki je pripisana bakterijskemu kromosomu in ParA oligomerizaciji. 
Vse ATPaze tipa I uporabljajo mehanizem Brownovega zobatega kolesa, vendar pa je relevanten model najverjetneje odvisen od različnih biokemijskih značilnosti in ravni ekspresije ParA in ParB. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/3928d857-a2ad-4de1-9c2b-e5caecb4e75b/assets/graphic/plas-0023-2014-fig5.gif Slika 3]

=Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici=
Dva različna plazmida, ki ne moreta stabilno obstajati v isti celici, sta nezdružljiva. Pri delitvah celice tako pride do izgube oziroma zmanjšanja števila vsaj enega od plazmidov, kar je posledica skupnih lastnosti nezdružljivih plazmidov. Do nezdružljivosti zaradi sorodnega načina razporejanja v celici pride tako pri razporejanju tipa 1 kot 2.
==Nezdružljivost pri ParA==
Če imamo v celici plazmid z visokim številom kopij in Par sistemom razporejanja, bo to onemogočilo stabilen soobstoj plazmida z enakim parA genom. Pretirano izražanje ParA, ki je prisoten v večih kopijah namreč povzroči, da se začneta plazmida ob delitvi naključno razporejati v hčerinske celice. Delež nezdružljivosti sovpada s koncentracijo ParA. Povečana koncentracija ParA destabilizira razporeditveni kompleks in mehanizem Brownovega zobatega kolesa, ki omogoča premikanje plazmidov po celici. Pri visoki koncentraciji ParA se praznine brez Par A lahko hitreje zapolnijo in tako onemogočijo gibanje plazmida po nukleoidu.
==Nezdružljivost pri ParB==
Analogno kot pri ParA dva plazmida, ki se razporejata s ParB, v isti celici nista stabilna, še posebej, če je eden od njiju plazmid z visokim številom kopij, saj je nezdružljivost odvisna od izražanja ParB. Previsoka koncentracija ParB najverjetneje povzroči koncentriranje plazmidov s parS genom v skupke in s tem zmanjša število plazmidov, ki se prosto gibljejo po celici. V tem primeru ParA ne more dovolj uspešno razdreti razporeditvenih kompleksov in sprostiti plazmidov, zato sčasoma pride do izgube enega od plazmidov. Hkrati so ugotovili, da lahko nekatere različice proteina, kot je ParBF, sprožijo rekombinacijo sorodnih plazmidov in tako povzročijo multimerizacijo. Multimer je plazmid, ki nastane s homologno rekombinacijo in vsebuje dve ponovitvi celotnega plazmidnega nukleotidnega zaporedja.
Vir slike:[1]
==Nezdružljivost pri enakih centromerih==
Če plazmida vsebujeta sorodno mesto za razporejanje, načeloma pride do nezdružljivosti. Vzrok ni povsem znan. Pri plazmidih z visokim številom kopij pride do naključnega razporejanja plazmidov, pri plazmidih, ki vsebujejo več parS mest pa tudi do zmanjšanega števila prostih ParB zaradi pretirane vezave na parS. Pri plazmidih z nizkim številom kopij opazimo zelo močno nezdružljivost, kjer je izguba števila plazmidov višja kot pri naključnem razporejanju. Eden od možnih vzrokov za to je pozna replikacija plazmidov. Če se eden od plazmidov podvoji ravno pred celično delitvijo, se kopiji namreč ne prerazporedita znotraj celice, ampak se obe dedujeta v isti hčerinski celici, kar privede do visoke izgube plazmidov.
Vir slike: [2]
=Regulacija izražanja par gena=
Izražanje par operonov direktno vpliva na stabilnost plazmidov in je v vseh primerih nadzorovano po principu avtoregulacije. Eden od proteinov par operona deluje kot represor, pogosto pa tudi eden od preostalih kot korepresor. V razporeditvenem sistemu tipa I so represorji ParA ATPaze, pri vseh ostalih sistemih pa proteini CBP. ParA represorji se z N-končnim delom s HTH (vijačnica-zavoj-vijačnica) motivom vežejo na DNA. Vezavno mesto ni povsem raziskano, vsebuje pa daljše obratne ponovitve, ki omogočijo vezavo ParA. Ta specifična vezava je mogoča ob vezavi ADP kot kofaktorja, pri vezavi ATP pa prevlada nespecifična vezava DNA, ki omogoči razporejanje plazmidov s pomočjo ParB.
=Zaključek=
Sistemi za razporejanje plazmidov so nujni za njihov obstoj in so kljub svoji preprostosti zelo natančno regulirani. Z dvema ključnima proteinoma in specifičnimi DNA zaporedji lahko predvsem plazmidi z manjšim številom kopij poskrbijo, da se ob delitvi uspešno dedujejo v obe hčerinski celici. Kljub široki uporabi plazmidnih vektorjev mnogi procesi, povezani z njihovim razporejanjem, še niso v celoti pojasnjeni. Raziskave v tej smeri bodo pripomogle k našemu razumevanju strukturne biologije in dinamike celotnega bakterijskega genoma.

=Viri=
Bouet, J.-Y.; Funnell, B. E. Plasmid Localization and Partition in Enterobacteriaceae. EcoSal Plus 2019, 8 (2), 10.1128/ecosalplus.ESP-0003–2019. https://doi.org/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019.
Schumacher, M. A. Bacterial Plasmid Partition Machinery: A Minimalist Approach to Survival. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012, 22 (1), 72–79. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2011.11.001.
Gerdes, K.; Møller-Jensen, J.; Jensen, R. B. Plasmid and Chromosome Partitioning: Surprises from Phylogeny. Mol. Microbiol. 2000, 37 (3), 455–466. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01975.x.
Baxter, J. C.; Funnell, B. E. Plasmid Partition Mechanisms. Microbiol. Spectr. 2014, 2 (6), 10.1128/microbiolspec.plas-0023–2014. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014.
Møller‐Jensen, J.; Jensen, R. B.; Löwe, J.; Gerdes, K. Prokaryotic DNA Segregation by an Actin‐like Filament. EMBO J. 2002, 21 (12), 3119–3127. https://doi.org/10.1093/emboj/cdf320.
(11) Brooks, A. C.; Hwang, L. C. Reconstitutions of Plasmid Partition Systems and Their Mechanisms. Plasmid 2017, 91, 37–41. https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2017.03.004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Razporejanje plazmidov v hčerinski celici

2024-05-04T19:54:37Z

Brina Klinar:

=Uvod=
Plazmidi živijo s svojo gostiteljsko celico v simbiozi. Razvili so kar nekaj strategij za obstoj znotraj bakterijske populacije med katerimi je razporeditveni sistem. Vsi razporeditveni sistemi so sestavljeni iz treh delov: ene ali več kopij razporeditvenega mesta (centromer), CBP (centromerni vezavni protein) in NTP-aze.
=Izračun izgube plazmida=
Plazmidi z majhnim kopirnim številom se morajo za svoj obstoj nanašati na razporeditveni sistem, plazmidi z visokim številom kopij pa se zanašajo na pasivno difuzijo.
Za naključno distribucijo velja: Ploss = 2^(1-n), kjer je »n« število kopij v celici.
=Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov=
Razporeditveni sistemi so nujni za transport in vzpostavitev sistema s plazmidno DNA. Poznamo 3 razporeditvene sisteme, ki se razlikujejo po tipu razporejanja z NTP-azo. Centromeri so značilna ohranjena zaporedja na plazmidu, ki služijo kot prepoznavna mesta za CBP. CBP prepozna zaporedje na plazmidu in se tako veže na centromer. To deluje kot most med plazmidom in ustrezno NTP-azo, ki omogoča premik plazmida.
Tip I ima Walker ATP-azo, ki ločuje plazmid s formacijo dinamičnega vzorca na bakterijskem nukleoidu. Tip II uporablja aktinu podobno ATP-azo, ki polimerizira v dinamične filamente, ki potiskajo plazmida narazen. Tip III ima tubulinu podobne GTP-aze, ki prav tako delujejo preko dinamične polimerizacije mehanizma.
Različni tipi so prikazani na [https://journals.asm.org/cms/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019/asset/0bc1138d-60c0-4e59-95c9-fdfec9718c8d/assets/graphic/esp-0003-2019_fig_004.gif sliki 1].
=Arhitektura=
CBP-ji se lahko na prepoznavno mesto vežejo v več kopijah in tako tvorijo razporeditvene komplekse, katerih arhitektura je odvisna od tipa CBP. CBP tip I vsebuje motiv HTH2 in prepozna centromerno mesto parS, kamor se veže v več kopijah in gradi velike komplekse. To omogoča številne interakcije z ustrezno NTP-azo. CBP tip II (vsebuje RHH2 motiv) in tip III (vsebuje HTH2 motiv) tvorita podobne komplekse in sicer, oba tvorita vijačne, obročaste strukture in povzročita upogib DNA.
=Vizualizacija plazmidnih dinamik v celici=
==Tip I==
Najraje se nahajajo na četrtini ali polovici celice v majhnih in večjih celicah. V vseh primerih pa vpadajo z bakterijskimi nukleoidom. ParB in RHH2 so prisotni v velikih količinah znotraj celice in so kot žarišča, ki so odvisni od razporeditvenega mesta in korespondirajo na pozicijo plazmida. ParB iz F plazmidov so prisotni v skupkih v okolici F razporeditvenega mesta, parSF. Razporeditveni kompleksi plazmida F so najdeni znotraj večje mase nukleoida. ParA imajo oscilatorno vedenje, nekatere pa tvorijo dinamične gradiente.
==Tip II in III==
ParMR1 tvorijo dolge filamente. Plazmidi niso prisotni na obeh koncih ParM polimerov. Premik plazmidne DNA na nasproten pol celice žene ParM polimerizacija med sestrskima ParR-parC (R1 centromer) kompleksoma.
Tubulinu podobna GTP-aza iz Gram-pozitivnih bakterij tvori dinamične in citoskeletne filamente, kar nakazuje, da tip III deluje po filamentacijskem mehanizmu za razporejanje plazmidov znotraj celic.
Slikovna obdelava razporeditve in ločitve plazmidov z velikim številom kopij
Plazmidi naj bi sledili obliki ameriškega krofa. Prosto difundirajoči plazmidi so večinoma izven nukleoida v notranjem periferiju bakterije. Plazmidi z visokim kopirnim številom so v skupkih na polih celice in naključno razporejeni skozi celoten volumen celice z nižjo frekvenco znotraj nukleoida. To podpira model mešane distribucije, ki vključuje možnost nastajanja skupkov in naključno difuzijo individualnih plazmidov z visokim številom kopij.

=Mehanizmi razporeditve plazmidov=
Gonilo za razporeditev plazmidov predstavljajo ATP-aze in GTP-aze, ki zagotavljajo energijo za ustrezen premik plazmidov. Obstajata dva glavna razreda mehanizmov razporeditve plazmidov.
==Mehanizmi, ki vključujejo filamentacijo==
Po tem mehanizmu delujeta razporeditvena sistema tipa II in III.
===Razporeditveni sistem tipa II===
Razporeditvene ATP-aze tipa II (ParM) spadajo v razred aktinu podobnih proteinov. Te so sposobne polimerizacije in oblikovanja filamentov, ki potiskajo plazmida, pripeta na nasprotna konca filamenta, narazen (pri paličičastih bakterijah je to vzporedno z longitudinalno osjo celice).
Monomeri ParM polimerizirajo v prisotnosti ATP, pri čemer tvorijo levosučne dvojne vijačnice, ki so polarne (polarnost je posledica asimetrije monomerov, zato vsak filament vsebuje top in oster konec. ParR (CBP), ki je vezan na parC plazmida, se veže na topi konec filamenta in ustvari kapo, ki prepreči razgradnjo filamenta kljub hidrolizi ATP. Novi ParM-ATP monomeri se nato vstavljajo na topi konec skozi konkavni stik med ParR/parC. Ko filament raste, potiska plazmid na topem koncu in plazmid se premika po celici. Filamenti se urejajo v antiparalelne snope, kar pomeni, da so topi konci (mesta, kamor se veže plazmid) na obeh straneh snopa. Ko filamenti v snopu rastejo potiskajo plazmide, vezane na tope konce, na nasprotna pola celice. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (A in B)

===Razporeditveni sistem tipa III===
Razporeditveni sistem tipa III prav tako deluje na principu polimerizacije, ampak pri tem kot gonilno moč uporablja tubulinu podobne GTPaze (TubZ). Monomeri TubZ polimerizirajo v prisotnosti GTP in tvorijo dvo- in štirivijačne filamente, ki so stabilizirani z GTP kapo. TubZ filamenti so polarni, kar pomeni, da rastejo na + koncu in se razgrajajo na – koncu. Tja se veže tudi TubR (CBP), vezan na tubC. Ko polimer raste na + strani in se razgrajuje na – strani, mu razporeditveni kompleks sledi, kar se kaže v premikanju plazmida. Kako pa ta vleka plazmidov prispeva k ločitvi plazmidov še ni pojasnjeno, saj TubZ filamenti niso bipolarni (premikanje poteka le v eno smer). [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (C)

==Mehanizem po principu Brownovega zobatega kolesa==
Razporeditveni sistem tipa I, ki je pri bakterijah najbolj pogost, za razliko od drugih dveh tipov pa ne deluje na principu polimerizacije. Pri njegovem mehanizmu sodelujejo ATP-aze tipa Walker (ParA). Te so sposobne interakcije z bakterijskim nukleoidom in v celici tvorijo dinamičen gradient. Interagirajo tudi s proteini ParB (CBP), ki nosijo plazmidni tovor in sledijo gradientu ParA. Predpostavljenih je bilo več modelov kako ParB sledijo gradientu ParA, vsi pa delujejo na osnovi principa Brownovega zobatega kolesa.
V prisotnosti ATP se ParA veže na DNA (ATP pri tem hidrolizira). V naslednjem koraku se na ParA veže ParB, ki je vezan na parS (nosi plazmid) in pri tem iz nukleoida izrine ParA. Ta oddifundia v citoplazmo, kjer čaka, da se nanj ponovno veže ATP. Ker pa je ta korak zelo počasen, začne na nukleoidu primanjkovati ParA. ParB se torej premika po nukleoidu in za seboj pušča ParA praznino – gibanje plazmida je zato usmerjano stran od nižje koncentracije ParA. Plazmida bi se po replikaciji tako ločila, če bi bila koncentracija ParA med njima najnižja. 
Obstaja več različnih modelov mehanizma Brownovega zobatega kolesa, vsi temeljijo na asimetriji distribucije ParA na bakterijskem nukleoidu. Delovanje lahko povežemo s konceptom požganega mostu – ko se ParB s plazmidnim tovorom premakne po nukleoidu, na svoji poti iz nukleoida odstranjuje ParA in s tem 'požge most za seboj', saj se zaradi odsotnosti Par A ne more vrniti nazaj. Predlagane verzije se med seboj razlikujejo po tem, kako asimetrija razporeditve ParA ustvari energijo, potrebno za gibanje in v vlogi, ki je pripisana bakterijskemu kromosomu in ParA oligomerizaciji.
Vse ATPaze tipa I uporabljajo mehanizem Brownovega zobatega kolesa, vendar pa je relevanten model najverjetneje odvisen od različnih biokemijskih značilnosti in ravni ekspresije ParA in ParB. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/3928d857-a2ad-4de1-9c2b-e5caecb4e75b/assets/graphic/plas-0023-2014-fig5.gif Slika 3]

=Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici=
Dva različna plazmida, ki ne moreta stabilno obstajati v isti celici, sta nezdružljiva. Pri delitvah celice tako pride do izgube oziroma zmanjšanja števila vsaj enega od plazmidov, kar je posledica skupnih lastnosti nezdružljivih plazmidov. Do nezdružljivosti zaradi sorodnega načina razporejanja v celici pride tako pri razporejanju tipa 1 kot 2.
==Nezdružljivost pri ParA==
Če imamo v celici plazmid z visokim številom kopij in Par sistemom razporejanja, bo to onemogočilo stabilen soobstoj plazmida z enakim parA genom. Pretirano izražanje ParA, ki je prisoten v večih kopijah namreč povzroči, da se začneta plazmida ob delitvi naključno razporejati v hčerinske celice. Delež nezdružljivosti sovpada s koncentracijo ParA. Povečana koncentracija ParA destabilizira razporeditveni kompleks in mehanizem Brownovega zobatega kolesa, ki omogoča premikanje plazmidov po celici. Pri visoki koncentraciji ParA se praznine brez Par A lahko hitreje zapolnijo in tako onemogočijo gibanje plazmida po nukleoidu.
==Nezdružljivost pri ParB==
Analogno kot pri ParA dva plazmida, ki se razporejata s ParB, v isti celici nista stabilna, še posebej, če je eden od njiju plazmid z visokim številom kopij, saj je nezdružljivost odvisna od izražanja ParB. Previsoka koncentracija ParB najverjetneje povzroči koncentriranje plazmidov s parS genom v skupke in s tem zmanjša število plazmidov, ki se prosto gibljejo po celici. V tem primeru ParA ne more dovolj uspešno razdreti razporeditvenih kompleksov in sprostiti plazmidov, zato sčasoma pride do izgube enega od plazmidov. Hkrati so ugotovili, da lahko nekatere različice proteina, kot je ParBF, sprožijo rekombinacijo sorodnih plazmidov in tako povzročijo multimerizacijo. Multimer je plazmid, ki nastane s homologno rekombinacijo in vsebuje dve ponovitvi celotnega plazmidnega nukleotidnega zaporedja.
Vir slike:[1]
==Nezdružljivost pri enakih centromerih==
Če plazmida vsebujeta sorodno mesto za razporejanje, načeloma pride do nezdružljivosti. Vzrok ni povsem znan. Pri plazmidih z visokim številom kopij pride do naključnega razporejanja plazmidov, pri plazmidih, ki vsebujejo več parS mest pa tudi do zmanjšanega števila prostih ParB zaradi pretirane vezave na parS. Pri plazmidih z nizkim številom kopij opazimo zelo močno nezdružljivost, kjer je izguba števila plazmidov višja kot pri naključnem razporejanju. Eden od možnih vzrokov za to je pozna replikacija plazmidov. Če se eden od plazmidov podvoji ravno pred celično delitvijo, se kopiji namreč ne prerazporedita znotraj celice, ampak se obe dedujeta v isti hčerinski celici, kar privede do visoke izgube plazmidov.
Vir slike: [2]
=Regulacija izražanja par gena=
Izražanje par operonov direktno vpliva na stabilnost plazmidov in je v vseh primerih nadzorovano po principu avtoregulacije. Eden od proteinov par operona deluje kot represor, pogosto pa tudi eden od preostalih kot korepresor. V razporeditvenem sistemu tipa I so represorji ParA ATPaze, pri vseh ostalih sistemih pa proteini CBP. ParA represorji se z N-končnim delom s HTH (vijačnica-zavoj-vijačnica) motivom vežejo na DNA. Vezavno mesto ni povsem raziskano, vsebuje pa daljše obratne ponovitve, ki omogočijo vezavo ParA. Ta specifična vezava je mogoča ob vezavi ADP kot kofaktorja, pri vezavi ATP pa prevlada nespecifična vezava DNA, ki omogoči razporejanje plazmidov s pomočjo ParB.
=Zaključek=
Sistemi za razporejanje plazmidov so nujni za njihov obstoj in so kljub svoji preprostosti zelo natančno regulirani. Z dvema ključnima proteinoma in specifičnimi DNA zaporedji lahko predvsem plazmidi z manjšim številom kopij poskrbijo, da se ob delitvi uspešno dedujejo v obe hčerinski celici. Kljub široki uporabi plazmidnih vektorjev mnogi procesi, povezani z njihovim razporejanjem, še niso v celoti pojasnjeni. Raziskave v tej smeri bodo pripomogle k našemu razumevanju strukturne biologije in dinamike celotnega bakterijskega genoma.

=Viri=
Bouet, J.-Y.; Funnell, B. E. Plasmid Localization and Partition in Enterobacteriaceae. EcoSal Plus 2019, 8 (2), 10.1128/ecosalplus.ESP-0003–2019. https://doi.org/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019.
Schumacher, M. A. Bacterial Plasmid Partition Machinery: A Minimalist Approach to Survival. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012, 22 (1), 72–79. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2011.11.001.
Gerdes, K.; Møller-Jensen, J.; Jensen, R. B. Plasmid and Chromosome Partitioning: Surprises from Phylogeny. Mol. Microbiol. 2000, 37 (3), 455–466. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01975.x.
Baxter, J. C.; Funnell, B. E. Plasmid Partition Mechanisms. Microbiol. Spectr. 2014, 2 (6), 10.1128/microbiolspec.plas-0023–2014. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014.
Møller‐Jensen, J.; Jensen, R. B.; Löwe, J.; Gerdes, K. Prokaryotic DNA Segregation by an Actin‐like Filament. EMBO J. 2002, 21 (12), 3119–3127. https://doi.org/10.1093/emboj/cdf320.
(11) Brooks, A. C.; Hwang, L. C. Reconstitutions of Plasmid Partition Systems and Their Mechanisms. Plasmid 2017, 91, 37–41. https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2017.03.004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Razporejanje plazmidov v hčerinski celici

2024-05-04T19:52:58Z

Brina Klinar:

=Uvod=
Plazmidi živijo s svojo gostiteljsko celico v simbiozi. Razvili so kar nekaj strategij za obstoj znotraj bakterijske populacije med katerimi je razporeditveni sistem. Vsi razporeditveni sistemi so sestavljeni iz treh delov: ene ali več kopij razporeditvenega mesta (centromer), CBP (centromerni vezavni protein) in NTP-aze.
=Izračun izgube plazmida=
Plazmidi z majhnim kopirnim številom se morajo za svoj obstoj nanašati na razporeditveni sistem, plazmidi z visokim številom kopij pa se zanašajo na pasivno difuzijo.
Za naključno distribucijo velja: Ploss = 2^(1-n), kjer je »n« število kopij v celici.
=Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov=
Razporeditveni sistemi so nujni za transport in vzpostavitev sistema s plazmidno DNA. Poznamo 3 razporeditvene sisteme, ki se razlikujejo po tipu razporejanja z NTP-azo. Centromeri so značilna ohranjena zaporedja na plazmidu, ki služijo kot prepoznavna mesta za CBP. CBP prepozna zaporedje na plazmidu in se tako veže na centromer. To deluje kot most med plazmidom in ustrezno NTP-azo, ki omogoča premik plazmida.
Tip I ima Walker ATP-azo, ki ločuje plazmid s formacijo dinamičnega vzorca na bakterijskem nukleoidu. Tip II uporablja aktinu podobno ATP-azo, ki polimerizira v dinamične filamente, ki potiskajo plazmida narazen. Tip III ima tubulinu podobne GTP-aze, ki prav tako delujejo preko dinamične polimerizacije mehanizma.
Različni tipi so prikazani na [https://journals.asm.org/cms/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019/asset/0bc1138d-60c0-4e59-95c9-fdfec9718c8d/assets/graphic/esp-0003-2019_fig_004.gif sliki 1].
=Arhitektura=
CBP-ji se lahko na prepoznavno mesto vežejo v več kopijah in tako tvorijo razporeditvene komplekse, katerih arhitektura je odvisna od tipa CBP. CBP tip I vsebuje motiv HTH2 in prepozna centromerno mesto parS, kamor se veže v več kopijah in gradi velike komplekse. To omogoča številne interakcije z ustrezno NTP-azo. CBP tip II (vsebuje RHH2 motiv) in tip III (vsebuje HTH2 motiv) tvorita podobne komplekse in sicer, oba tvorita vijačne, obročaste strukture in povzročita upogib DNA.
=Vizualizacija plazmidnih dinamik v celici=
==Tip I==
Najraje se nahajajo na četrtini ali polovici celice v majhnih in večjih celicah. V vseh primerih pa vpadajo z bakterijskimi nukleoidom. ParB in RHH2 so prisotni v velikih količinah znotraj celice in so kot žarišča, ki so odvisni od razporeditvenega mesta in korespondirajo na pozicijo plazmida. ParB iz F plazmidov so prisotni v skupkih v okolici F razporeditvenega mesta, parSF. Razporeditveni kompleksi plazmida F so najdeni znotraj večje mase nukleoida. ParA imajo oscilatorno vedenje, nekatere pa tvorijo dinamične gradiente.
==Tip II in III==
ParMR1 tvorijo dolge filamente. Plazmidi niso prisotni na obeh koncih ParM polimerov. Premik plazmidne DNA na nasproten pol celice žene ParM polimerizacija med sestrskima ParR-parC (R1 centromer) kompleksoma.
Tubulinu podobna GTP-aza iz Gram-pozitivnih bakterij tvori dinamične in citoskeletne filamente, kar nakazuje, da tip III deluje po filamentacijskem mehanizmu za razporejanje plazmidov znotraj celic.
Slikovna obdelava razporeditve in ločitve plazmidov z velikim številom kopij
Plazmidi naj bi sledili obliki ameriškega krofa. Prosto difundirajoči plazmidi so večinoma izven nukleoida v notranjem periferiju bakterije. Plazmidi z visokim kopirnim številom so v skupkih na polih celice in naključno razporejeni skozi celoten volumen celice z nižjo frekvenco znotraj nukleoida. To podpira model mešane distribucije, ki vključuje možnost nastajanja skupkov in naključno difuzijo individualnih plazmidov z visokim številom kopij.

=Mehanizmi razporeditve plazmidov=
Gonilo za razporeditev plazmidov predstavljajo ATP-aze in GTP-aze, ki zagotavljajo energijo za ustrezen premik plazmidov. Obstajata dva glavna razreda mehanizmov razporeditve plazmidov.
==Mehanizmi, ki vključujejo filamentacijo==
Po tem mehanizmu delujeta razporeditvena sistema tipa II in III.
===Razporeditveni sistem tipa II===
Razporeditvene ATP-aze tipa II (ParM) spadajo v razred aktinu podobnih proteinov. Te so sposobne polimerizacije in oblikovanja filamentov, ki potiskajo plazmida, pripeta na nasprotna konca filamenta, narazen (pri paličičastih bakterijah je to vzporedno z longitudinalno osjo celice).
Monomeri ParM polimerizirajo v prisotnosti ATP, pri čemer tvorijo levosučne dvojne vijačnice, ki so polarne (polarnost je posledica asimetrije monomerov, zato vsak filament vsebuje top in oster konec. ParR (CBP), ki je vezan na parC plazmida, se veže na topi konec filamenta in ustvari kapo, ki prepreči razgradnjo filamenta kljub hidrolizi ATP. Novi ParM-ATP monomeri se nato vstavljajo na topi konec skozi konkavni stik med ParR/parC. Ko filament raste, potiska plazmid na topem koncu in plazmid se premika po celici. Filamenti se urejajo v antiparalelne snope, kar pomeni, da so topi konci (mesta, kamor se veže plazmid) na obeh straneh snopa. Ko filamenti v snopu rastejo potiskajo plazmide, vezane na tope konce, na nasprotna pola celice. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (A in B)

===Razporeditveni sistem tipa III===
Razporeditveni sistem tipa III prav tako deluje na principu polimerizacije, ampak pri tem kot gonilno moč uporablja tubulinu podobne GTPaze (TubZ). Monomeri TubZ polimerizirajo v prisotnosti GTP in tvorijo dvo- in štirivijačne filamente, ki so stabilizirani z GTP kapo. TubZ filamenti so polarni, kar pomeni, da rastejo na + koncu in se razgrajajo na – koncu. Tja se veže tudi TubR (CBP), vezan na tubC. Ko polimer raste na + strani in se razgrajuje na – strani, mu razporeditveni kompleks sledi, kar se kaže v premikanju plazmida. Kako pa ta vleka plazmidov prispeva k ločitvi plazmidov še ni pojasnjeno, saj TubZ filamenti niso bipolarni (premikanje poteka le v eno smer). [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (C)

==Mehanizem po principu Brownovega zobatega kolesa==
Razporeditveni sistem tipa I, ki je pri bakterijah najbolj pogost, za razliko od drugih dveh tipov pa ne deluje na principu polimerizacije. Pri njegovem mehanizmu sodelujejo ATP-aze tipa Walker (ParA). Te so sposobne interakcije z bakterijskim nukleoidom in v celici tvorijo dinamičen gradient. Interagirajo tudi s proteini ParB (CBP), ki nosijo plazmidni tovor in sledijo gradientu ParA. Predpostavljenih je bilo več modelov kako ParB sledijo gradientu ParA, vsi pa delujejo na osnovi principa Brownovega zobatega kolesa. 
V prisotnosti ATP se ParA veže na DNA (ATP pri tem hidrolizira). V naslednjem koraku se na ParA veže ParB, ki je vezan na parS (nosi plazmid) in pri tem iz nukleoida izrine ParA. Ta oddifundia v citoplazmo, kjer čaka, da se nanj ponovno veže ATP. Ker pa je ta korak zelo počasen, začne na nukleoidu primanjkovati ParA. ParB se torej premika po nukleoidu in za seboj pušča ParA praznino – gibanje plazmida je zato usmerjano stran od nižje koncentracije ParA. Plazmida bi se po replikaciji tako ločila, če bi bila koncentracija ParA med njima najnižja. 
Obstaja več različnih modelov mehanizma Brownovega zobatega kolesa, vsi temeljijo na asimetriji distribucije ParA na bakterijskem nukleoidu. Delovanje lahko povežemo s konceptom požganega mostu – ko se ParB s plazmidnim tovorom premakne po nukleoidu, na svoji poti iz nukleoida odstranjuje ParA in s tem 'požge most za seboj', saj se zaradi odsotnosti Par A ne more vrniti nazaj. Predlagane verzije se med seboj razlikujejo po tem, kako asimetrija razporeditve ParA ustvari energijo, potrebno za gibanje in v vlogi, ki je pripisana bakterijskemu kromosomu in ParA oligomerizaciji. 
Vse ATPaze tipa I uporabljajo mehanizem Brownovega zobatega kolesa, vendar pa je relevanten model najverjetneje odvisen od različnih biokemijskih značilnosti in ravni ekspresije ParA in ParB. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/3928d857-a2ad-4de1-9c2b-e5caecb4e75b/assets/graphic/plas-0023-2014-fig5.gif Slika 3]

=Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici=
Dva različna plazmida, ki ne moreta stabilno obstajati v isti celici, sta nezdružljiva. Pri delitvah celice tako pride do izgube oziroma zmanjšanja števila vsaj enega od plazmidov, kar je posledica skupnih lastnosti nezdružljivih plazmidov. Do nezdružljivosti zaradi sorodnega načina razporejanja v celici pride tako pri razporejanju tipa 1 kot 2.
==Nezdružljivost pri ParA==
Če imamo v celici plazmid z visokim številom kopij in Par sistemom razporejanja, bo to onemogočilo stabilen soobstoj plazmida z enakim parA genom. Pretirano izražanje ParA, ki je prisoten v večih kopijah namreč povzroči, da se začneta plazmida ob delitvi naključno razporejati v hčerinske celice. Delež nezdružljivosti sovpada s koncentracijo ParA. Povečana koncentracija ParA destabilizira razporeditveni kompleks in mehanizem Brownovega zobatega kolesa, ki omogoča premikanje plazmidov po celici. Pri visoki koncentraciji ParA se praznine brez Par A lahko hitreje zapolnijo in tako onemogočijo gibanje plazmida po nukleoidu.
==Nezdružljivost pri ParB==
Analogno kot pri ParA dva plazmida, ki se razporejata s ParB, v isti celici nista stabilna, še posebej, če je eden od njiju plazmid z visokim številom kopij, saj je nezdružljivost odvisna od izražanja ParB. Previsoka koncentracija ParB najverjetneje povzroči koncentriranje plazmidov s parS genom v skupke in s tem zmanjša število plazmidov, ki se prosto gibljejo po celici. V tem primeru ParA ne more dovolj uspešno razdreti razporeditvenih kompleksov in sprostiti plazmidov, zato sčasoma pride do izgube enega od plazmidov. Hkrati so ugotovili, da lahko nekatere različice proteina, kot je ParBF, sprožijo rekombinacijo sorodnih plazmidov in tako povzročijo multimerizacijo. Multimer je plazmid, ki nastane s homologno rekombinacijo in vsebuje dve ponovitvi celotnega plazmidnega nukleotidnega zaporedja.
Vir slike:[1]
==Nezdružljivost pri enakih centromerih==
Če plazmida vsebujeta sorodno mesto za razporejanje, načeloma pride do nezdružljivosti. Vzrok ni povsem znan. Pri plazmidih z visokim številom kopij pride do naključnega razporejanja plazmidov, pri plazmidih, ki vsebujejo več parS mest pa tudi do zmanjšanega števila prostih ParB zaradi pretirane vezave na parS. Pri plazmidih z nizkim številom kopij opazimo zelo močno nezdružljivost, kjer je izguba števila plazmidov višja kot pri naključnem razporejanju. Eden od možnih vzrokov za to je pozna replikacija plazmidov. Če se eden od plazmidov podvoji ravno pred celično delitvijo, se kopiji namreč ne prerazporedita znotraj celice, ampak se obe dedujeta v isti hčerinski celici, kar privede do visoke izgube plazmidov.
Vir slike: [2]
=Regulacija izražanja par gena=
Izražanje par operonov direktno vpliva na stabilnost plazmidov in je v vseh primerih nadzorovano po principu avtoregulacije. Eden od proteinov par operona deluje kot represor, pogosto pa tudi eden od preostalih kot korepresor. V razporeditvenem sistemu tipa I so represorji ParA ATPaze, pri vseh ostalih sistemih pa proteini CBP. ParA represorji se z N-končnim delom s HTH (vijačnica-zavoj-vijačnica) motivom vežejo na DNA. Vezavno mesto ni povsem raziskano, vsebuje pa daljše obratne ponovitve, ki omogočijo vezavo ParA. Ta specifična vezava je mogoča ob vezavi ADP kot kofaktorja, pri vezavi ATP pa prevlada nespecifična vezava DNA, ki omogoči razporejanje plazmidov s pomočjo ParB.
=Zaključek=
Sistemi za razporejanje plazmidov so nujni za njihov obstoj in so kljub svoji preprostosti zelo natančno regulirani. Z dvema ključnima proteinoma in specifičnimi DNA zaporedji lahko predvsem plazmidi z manjšim številom kopij poskrbijo, da se ob delitvi uspešno dedujejo v obe hčerinski celici. Kljub široki uporabi plazmidnih vektorjev mnogi procesi, povezani z njihovim razporejanjem, še niso v celoti pojasnjeni. Raziskave v tej smeri bodo pripomogle k našemu razumevanju strukturne biologije in dinamike celotnega bakterijskega genoma.

=Viri=
Bouet, J.-Y.; Funnell, B. E. Plasmid Localization and Partition in Enterobacteriaceae. EcoSal Plus 2019, 8 (2), 10.1128/ecosalplus.ESP-0003–2019. https://doi.org/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019.
Schumacher, M. A. Bacterial Plasmid Partition Machinery: A Minimalist Approach to Survival. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012, 22 (1), 72–79. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2011.11.001.
Gerdes, K.; Møller-Jensen, J.; Jensen, R. B. Plasmid and Chromosome Partitioning: Surprises from Phylogeny. Mol. Microbiol. 2000, 37 (3), 455–466. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01975.x.
Baxter, J. C.; Funnell, B. E. Plasmid Partition Mechanisms. Microbiol. Spectr. 2014, 2 (6), 10.1128/microbiolspec.plas-0023–2014. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014.
Møller‐Jensen, J.; Jensen, R. B.; Löwe, J.; Gerdes, K. Prokaryotic DNA Segregation by an Actin‐like Filament. EMBO J. 2002, 21 (12), 3119–3127. https://doi.org/10.1093/emboj/cdf320.
(11) Brooks, A. C.; Hwang, L. C. Reconstitutions of Plasmid Partition Systems and Their Mechanisms. Plasmid 2017, 91, 37–41. https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2017.03.004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Razporejanje plazmidov v hčerinski celici

2024-05-04T19:46:42Z

Brina Klinar: Created page with "=Uvod= Plazmidi živijo s svojo gostiteljsko celico v simbiozi. Razvili so kar nekaj strategij za obstoj znotraj bakterijske populacije med katerimi je razporeditveni sistem. Vsi razporeditveni sistemi so sestavljeni iz treh delov: ene ali več kopij razporeditvenega mesta (centromer), CBP (centromerni vezavni protein) in NTP-aze. =Izračun izgube plazmida= Plazmidi z majhnim kopirnim številom se morajo za svoj obstoj nanašati na razporeditveni sistem, plazmidi z visok..."

=Uvod=
Plazmidi živijo s svojo gostiteljsko celico v simbiozi. Razvili so kar nekaj strategij za obstoj znotraj bakterijske populacije med katerimi je razporeditveni sistem. Vsi razporeditveni sistemi so sestavljeni iz treh delov: ene ali več kopij razporeditvenega mesta (centromer), CBP (centromerni vezavni protein) in NTP-aze.
=Izračun izgube plazmida=
Plazmidi z majhnim kopirnim številom se morajo za svoj obstoj nanašati na razporeditveni sistem, plazmidi z visokim številom kopij pa se zanašajo na pasivno difuzijo.
Za naključno distribucijo velja: Ploss = 2^(1-n), kjer je »n« število kopij v celici.
=Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov=
Razporeditveni sistemi so nujni za transport in vzpostavitev sistema s plazmidno DNA. Poznamo 3 razporeditvene sisteme, ki se razlikujejo po tipu razporejanja z NTP-azo. Centromeri so značilna ohranjena zaporedja na plazmidu, ki služijo kot prepoznavna mesta za CBP. CBP prepozna zaporedje na plazmidu in se tako veže na centromer. To deluje kot most med plazmidom in ustrezno NTP-azo, ki omogoča premik plazmida.
Tip I ima Walker ATP-azo, ki ločuje plazmid s formacijo dinamičnega vzorca na bakterijskem nukleoidu. Tip II uporablja aktinu podobno ATP-azo, ki polimerizira v dinamične filamente, ki potiskajo plazmida narazen. Tip III ima tubulinu podobne GTP-aze, ki prav tako delujejo preko dinamične polimerizacije mehanizma.
Različni tipi so prikazani na [https://journals.asm.org/cms/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019/asset/0bc1138d-60c0-4e59-95c9-fdfec9718c8d/assets/graphic/esp-0003-2019_fig_004.gif sliki 1].
=Arhitektura=
CBP-ji se lahko na prepoznavno mesto vežejo v več kopijah in tako tvorijo razporeditvene komplekse,
katerih arhitektura je odvisna od tipa CBP. CBP tip I vsebuje motiv HTH2 in prepozna centromerno mesto parS, kamor se veže v več kopijah in gradi velike komplekse. To omogoča številne interakcije z ustrezno NTP-azo. CBP tip II (vsebuje RHH2 motiv) in tip III (vsebuje HTH2 motiv) tvorita podobne komplekse in sicer, oba tvorita vijačne, obročaste strukture in povzročita upogib DNA.
Vizualizacija plazmidnih dinamik v celici
==Tip I==
Najraje se nahajajo na četrtini ali polovici celice v majhnih in večjih celicah. V vseh primerih pa vpadajo z bakterijskimi nukleoidom. ParB in RHH2 so prisotni v velikih količinah znotraj celice in so kot žarišča, ki so odvisni od razporeditvenega mesta in korespondirajo na pozicijo plazmida. ParB iz F plazmidov so prisotni v skupkih v okolici F razporeditvenega mesta, parSF. Razporeditveni kompleksi plazmida F so najdeni znotraj večje mase nukleoida. ParA imajo oscilatorno vedenje, nekatere pa tvorijo dinamične gradiente.
==Tip II in III==
ParMR1 tvorijo dolge filamente. Plazmidi niso prisotni na obeh koncih ParM polimerov. Premik plazmidne DNA na nasproten pol celice žene ParM polimerizacija med sestrskima ParR-parC (R1 centromer) kompleksoma.
Tubulinu podobna GTP-aza iz Gram-pozitivnih bakterij tvori dinamične in citoskeletne filamente, kar nakazuje, da tip III deluje po filamentacijskem mehanizmu za razporejanje plazmidov znotraj celic.
Slikovna obdelava razporeditve in ločitve plazmidov z velikim številom kopij
Plazmidi naj bi sledili obliki ameriškega krofa. Prosto difundirajoči plazmidi so večinoma izven nukleoida v notranjem periferiju bakterije. Plazmidi z visokim kopirnim številom so v skupkih na polih celice in naključno razporejeni skozi celoten volumen celice z nižjo frekvenco znotraj nukleoida. To podpira model mešane distribucije, ki vključuje možnost nastajanja skupkov in naključno difuzijo individualnih plazmidov z visokim številom kopij.

=Mehanizmi razporeditve plazmidov=
Gonilo za razporeditev plazmidov predstavljajo ATP-aze in GTP-aze, ki zagotavljajo energijo za ustrezen premik plazmidov. Obstajata dva glavna razreda mehanizmov razporeditve plazmidov.
==Mehanizmi, ki vključujejo filamentacijo==
Po tem mehanizmu delujeta razporeditvena sistema tipa II in III.
===Razporeditveni sistem tipa II===
Razporeditvene ATP-aze tipa II (ParM) spadajo v razred aktinu podobnih proteinov. Te so sposobne polimerizacije in oblikovanja filamentov, ki potiskajo plazmida, pripeta na nasprotna konca filamenta, narazen (pri paličičastih bakterijah je to vzporedno z longitudinalno osjo celice).
Monomeri ParM polimerizirajo v prisotnosti ATP, pri čemer tvorijo levosučne dvojne vijačnice, ki so polarne (polarnost je posledica asimetrije monomerov, zato vsak filament vsebuje top in oster konec. ParR (CBP), ki je vezan na parC plazmida, se veže na topi konec filamenta in ustvari kapo, ki prepreči razgradnjo filamenta kljub hidrolizi ATP. Novi ParM-ATP monomeri se nato vstavljajo na topi konec skozi konkavni stik med ParR/parC. Ko filament raste, potiska plazmid na topem koncu in plazmid se premika po celici. Filamenti se urejajo v antiparalelne snope, kar pomeni, da so topi konci (mesta, kamor se veže plazmid) na obeh straneh snopa. Ko filamenti v snopu rastejo potiskajo plazmide, vezane na tope konce, na nasprotna pola celice. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (A in B)

===Razporeditveni sistem tipa III===
Razporeditveni sistem tipa III prav tako deluje na principu polimerizacije, ampak pri tem kot gonilno moč uporablja tubulinu podobne GTPaze (TubZ). Monomeri TubZ polimerizirajo v prisotnosti GTP in tvorijo dvo- in štirivijačne filamente, ki so stabilizirani z GTP kapo. TubZ filamenti so polarni, kar pomeni, da rastejo na + koncu in se razgrajajo na – koncu. Tja se veže tudi TubR (CBP), vezan na tubC. Ko polimer raste na + strani in se razgrajuje na – strani, mu razporeditveni kompleks sledi, kar se kaže v premikanju plazmida. Kako pa ta vleka plazmidov prispeva k ločitvi plazmidov še ni pojasnjeno, saj TubZ filamenti niso bipolarni (premikanje poteka le v eno smer). [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (C)

==Mehanizem po principu Brownovega zobatega kolesa==
Razporeditveni sistem tipa I, ki je pri bakterijah najbolj pogost, za razliko od drugih dveh tipov pa ne deluje na principu polimerizacije. Pri njegovem mehanizmu sodelujejo ATP-aze tipa Walker (ParA). Te so sposobne interakcije z bakterijskim nukleoidom in v celici tvorijo dinamičen gradient. Interagirajo tudi s proteini ParB (CBP), ki nosijo plazmidni tovor in sledijo gradientu ParA. Predpostavljenih je bilo več modelov kako ParB sledijo gradientu ParA, vsi pa delujejo na osnovi principa Brownovega zobatega kolesa.
V prisotnosti ATP se ParA veže na DNA (ATP pri tem hidrolizira). V naslednjem koraku se na ParA veže ParB, ki je vezan na parS (nosi plazmid) in pri tem iz nukleoida izrine ParA. Ta oddifundia v citoplazmo, kjer čaka, da se nanj ponovno veže ATP. Ker pa je ta korak zelo počasen, začne na nukleoidu primanjkovati ParA. ParB se torej premika po nukleoidu in za seboj pušča ParA praznino – gibanje plazmida je zato usmerjano stran od nižje koncentracije ParA. Plazmida bi se po replikaciji tako ločila, če bi bila koncentracija ParA med njima najnižja.
Obstaja več različnih modelov mehanizma Brownovega zobatega kolesa, vsi temeljijo na asimetriji distribucije ParA na bakterijskem nukleoidu. Delovanje lahko povežemo s konceptom požganega mostu – ko se ParB s plazmidnim tovorom premakne po nukleoidu, na svoji poti iz nukleoida odstranjuje ParA in s tem 'požge most za seboj', saj se zaradi odsotnosti Par A ne more vrniti nazaj. Predlagane verzije se med seboj razlikujejo po tem, kako asimetrija razporeditve ParA ustvari energijo, potrebno za gibanje in v vlogi, ki je pripisana bakterijskemu kromosomu in ParA oligomerizaciji.
Vse ATPaze tipa I uporabljajo mehanizem Brownovega zobatega kolesa, vendar pa je relevanten model najverjetneje odvisen od različnih biokemijskih značilnosti in ravni ekspresije ParA in ParB. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/3928d857-a2ad-4de1-9c2b-e5caecb4e75b/assets/graphic/plas-0023-2014-fig5.gif Slika 3]

=Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici=
Dva različna plazmida, ki ne moreta stabilno obstajati v isti celici, sta nezdružljiva. Pri delitvah celice tako pride do izgube oziroma zmanjšanja števila vsaj enega od plazmidov, kar je posledica skupnih lastnosti nezdružljivih plazmidov. Do nezdružljivosti zaradi sorodnega načina razporejanja v celici pride tako pri razporejanju tipa 1 kot 2.
==Nezdružljivost pri ParA==
Če imamo v celici plazmid z visokim številom kopij in Par sistemom razporejanja, bo to onemogočilo stabilen soobstoj plazmida z enakim parA genom. Pretirano izražanje ParA, ki je prisoten v večih kopijah namreč povzroči, da se začneta plazmida ob delitvi naključno razporejati v hčerinske celice. Delež nezdružljivosti sovpada s koncentracijo ParA. Povečana koncentracija ParA destabilizira razporeditveni kompleks in mehanizem Brownovega zobatega kolesa, ki omogoča premikanje plazmidov po celici. Pri visoki koncentraciji ParA se praznine brez Par A lahko hitreje zapolnijo in tako onemogočijo gibanje plazmida po nukleoidu.
==Nezdružljivost pri ParB==
Analogno kot pri ParA dva plazmida, ki se razporejata s ParB, v isti celici nista stabilna, še posebej, če je eden od njiju plazmid z visokim številom kopij, saj je nezdružljivost odvisna od izražanja ParB. Previsoka koncentracija ParB najverjetneje povzroči koncentriranje plazmidov s parS genom v skupke in s tem zmanjša število plazmidov, ki se prosto gibljejo po celici. V tem primeru ParA ne more dovolj uspešno razdreti razporeditvenih kompleksov in sprostiti plazmidov, zato sčasoma pride do izgube enega od plazmidov. Hkrati so ugotovili, da lahko nekatere različice proteina, kot je ParBF, sprožijo rekombinacijo sorodnih plazmidov in tako povzročijo multimerizacijo. Multimer je plazmid, ki nastane s homologno rekombinacijo in vsebuje dve ponovitvi celotnega plazmidnega nukleotidnega zaporedja.
Vir slike:[1]
==Nezdružljivost pri enakih centromerih==
Če plazmida vsebujeta sorodno mesto za razporejanje, načeloma pride do nezdružljivosti. Vzrok ni povsem znan. Pri plazmidih z visokim številom kopij pride do naključnega razporejanja plazmidov, pri plazmidih, ki vsebujejo več parS mest pa tudi do zmanjšanega števila prostih ParB zaradi pretirane vezave na parS. Pri plazmidih z nizkim številom kopij opazimo zelo močno nezdružljivost, kjer je izguba števila plazmidov višja kot pri naključnem razporejanju. Eden od možnih vzrokov za to je pozna replikacija plazmidov. Če se eden od plazmidov podvoji ravno pred celično delitvijo, se kopiji namreč ne prerazporedita znotraj celice, ampak se obe dedujeta v isti hčerinski celici, kar privede do visoke izgube plazmidov.
Vir slike: [2]
=Regulacija izražanja par gena=
Izražanje par operonov direktno vpliva na stabilnost plazmidov in je v vseh primerih nadzorovano po principu avtoregulacije. Eden od proteinov par operona deluje kot represor, pogosto pa tudi eden od preostalih kot korepresor. V razporeditvenem sistemu tipa I so represorji ParA ATPaze, pri vseh ostalih sistemih pa proteini CBP. ParA represorji se z N-končnim delom s HTH (vijačnica-zavoj-vijačnica) motivom vežejo na DNA. Vezavno mesto ni povsem raziskano, vsebuje pa daljše obratne ponovitve, ki omogočijo vezavo ParA. Ta specifična vezava je mogoča ob vezavi ADP kot kofaktorja, pri vezavi ATP pa prevlada nespecifična vezava DNA, ki omogoči razporejanje plazmidov s pomočjo ParB.
=Zaključek=
Sistemi za razporejanje plazmidov so nujni za njihov obstoj in so kljub svoji preprostosti zelo natančno regulirani. Z dvema ključnima proteinoma in specifičnimi DNA zaporedji lahko predvsem plazmidi z manjšim številom kopij poskrbijo, da se ob delitvi uspešno dedujejo v obe hčerinski celici. Kljub široki uporabi plazmidnih vektorjev mnogi procesi, povezani z njihovim razporejanjem, še niso v celoti pojasnjeni. Raziskave v tej smeri bodo pripomogle k našemu razumevanju strukturne biologije in dinamike celotnega bakterijskega genoma.

=Viri=
Bouet, J.-Y.; Funnell, B. E. Plasmid Localization and Partition in Enterobacteriaceae. EcoSal Plus 2019, 8 (2), 10.1128/ecosalplus.ESP-0003–2019. https://doi.org/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019.
Schumacher, M. A. Bacterial Plasmid Partition Machinery: A Minimalist Approach to Survival. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012, 22 (1), 72–79. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2011.11.001.
Gerdes, K.; Møller-Jensen, J.; Jensen, R. B. Plasmid and Chromosome Partitioning: Surprises from Phylogeny. Mol. Microbiol. 2000, 37 (3), 455–466. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01975.x.
Baxter, J. C.; Funnell, B. E. Plasmid Partition Mechanisms. Microbiol. Spectr. 2014, 2 (6), 10.1128/microbiolspec.plas-0023–2014. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014.
Møller‐Jensen, J.; Jensen, R. B.; Löwe, J.; Gerdes, K. Prokaryotic DNA Segregation by an Actin‐like Filament. EMBO J. 2002, 21 (12), 3119–3127. https://doi.org/10.1093/emboj/cdf320.
(11) Brooks, A. C.; Hwang, L. C. Reconstitutions of Plasmid Partition Systems and Their Mechanisms. Plasmid 2017, 91, 37–41. https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2017.03.004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Molekularna biologija plazmidov

2024-05-04T10:22:35Z

Brina Klinar:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2023/24 obravnavajo plazmide, ki jih sicer biokemiki poznamo predvsem kot vektorje v DNA-tehnologiji. Pregledali bomo njihovo klasifikacijo, načine podvojevanja in razporejanja v hčerinske celice, njihov prenos s konjugacijo, pomen pri širjenju odpornosti proti antibiotikom. Na koncu si bomo ogledali še nekaj primerov uporabe plazmidov na različnih biotehnoloških in medicinskih področjih. Okvirni naslovi tem so navedeni na spodnjem seznamu.

Vse teme temeljijo na preglednih člankih, kar pomeni, da obravnavajo zaključene teme, na katerih je bilo opravljenega že veliko dela. Zato praviloma vsako temo obdelajo po trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200–1800 besed), ki ste jih uporabili. Če izjemoma seminar pripravita dva študenta, je obseg povzetka 1000-1500 besed, če je študent sam, pa 800-1200 besed.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'. Predstavitev naj bo dolga 15–20 minut, temu pa bo sledila razprava (pribl. 5 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali, in vključite le malo splošnega uvoda, kjer je mogoče pa izpostavite ključne razlike v procesih med bakterijami, evkarionti in arhejami. Če seminar predstavljata dva študenta, imata na voljo 12-15 minut, če je študent sam, pa 8-10 minut.

Seminarske predstavitve bodo potekale med 24. aprilom in 15. majem 2024. V tem času ne bo klasičnih predavanj, torej bodo tako ponedeljkovi kot sredini termini namenjeni seminarjem.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. ~10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).

Razdelitev seminarjev je potekala v okolju Google Drive, kjer so (bile) navedene povezave do izhodiščnih člankov, s katerimi lahko začnete iskanje literature. Večinoma navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili kvaliteten 15-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro en za drugim, tako da boste osnove hitro osvojili in jih ni treba ponavljati.

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki>. Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularna_biologija_koronavirusov Molekularna biologija koronavirusov (2020/21)].

Seznam tem in referenti:

24. april: 
# [[Klasifikacija plazmidov]] (Jan Hvalec, Tjaša Lešnik, Nika Makuc) 
# [[Replikacija plazmidov po mehanizmu téta]] (Nika Janc, Špela Puhov, Lara Ferjančič) 
# [[Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga]] (Tinkara Robek, Lara Pajnhart, Tina Kosovel) 

6. maj: 
# [[Interakcije plazmid - kromosom]] (Anita Mulalic, Tiara Pšeničnik, Špela Longar) 
# [[Razporejanje plazmidov v hčerinski celici]] (Karin Kunstelj, Brina Klinar, Nina Cankar) 
# Prenos plazmidov s konjugacijo med gramnegativnimi bakterijami
# [[Konjugacijski prenos plazmidov pri bakteriji Bacillus subtilis]] (Mark Frantar, Simon Kristl, Andraž Snedec) 
# Modeli konjugacije med črevesnimi bakterijami

8. maj: 
# [[Širjenje odpornosti proti antibiotikom med talnimi bakterijami]] (Debora Kociper, Uma Jordan Ferbežar, Dan Kolnik) 
# [[Vloga plazmidov v bakterijski evoluciji]] (Klara Kolenc, Veronika Trobiš, Teja Mohar) 
# Pomen plazmida Ti za patogenost agrobakterij

13. maj: 
# [[Vloga plazmidov pri virulenčnosti klamidij]] (Nik Matek, Mark Varlamov, Anže Perc) 
# Kriptični plazmidi v človeških prebavilih
# Vloga plazmidov pri kvarjenju piva, ki ga povzročajo mlečne bakterije
# Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev
# Plazmidni replikoni v farmacevtski industriji

15. maj: 
# Atipična sistema segregacije pri plazmidih z nizkim številom kopij

BIO2 Povzetki seminarjev 2023

2023-11-13T20:18:57Z

Brina Klinar:

= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2023/24 =
==Anja Kokol - Pomen kompertmentalizirane signalizacije v membranskih raftih pri razvoju raka==
Raziskovanje lipidnih raftov, membranskih domen, bogatih s holesterolom in sfingolipidi, je izboljšalo razumevanje celične membrane pri signalni transdukciji. Te sortirne platforme igrajo ključno vlogo pri kompartmentalizaciji signalnih poti in s tem spodbujajo ali zavirajo preživetje, smrt in metastazo tumorskih celic. Transformirane celice vsebujejo višjo raven znotrajceličnega holesterola in s tem posledično več membranskih raftov. Rafti so, zraven prenosa signalov, pomembni za aktivacijo receptorjev, endocitozo, znotrajcelični promet in organizacijo z lipidi in proteini. V obliki lipidnih lupin zagotavljajo proteinom, ki so jih tako ločili od ostalih, primerno mikrookolje in s pomočjo takšnega mehanizma vklopijo ali izklopijo določene poti prenosa signala. Na celične procese pomembno vpliva asimetrija holesterola v plazemski membrani, ki se vzdržuje z aktivnim transportom holesterola iz notranjega v zunanji del. Zaradi prenosa signala po lipidnih raftih lahko pride do prekomerne ekspresije in aktivacije številnih poti in sistemov rastnih faktorjev, kar pripomore k razvoju tumorja. Eden od njih je tudi aktivator signalne poti PI3K/AKT, ki je pomemben udeleženec pri nastanku raka. Značilnost sesalskih celic je prisotnost receptorjev smrti na njihovi površini. Ti zagotavljajo sposobnost apoptoze. Ligandi receptorjev smrti sprožijo značilno signalizacijo preko oligomerizacije receptorjev, kar posledično povzroči rekrutiranje specializiranih adapterskih proteinov znotraj lipidnih raftov. S preučevanjem membranskih raftov se je rodil tudi koncept CASMER, s pomočjo katerega se je razvila nova ideja zdravljenja raka.

==Vid Kozel - Vloga onkogenov in tumor zavirajočih genov pri razvoju raka==
Onkogeni kodirajo okvarjene proteine ter s tem povzročajo tumorje. Nastanejo iz spremenjenih proto-onkogenov. Za naše zdravje so zelo nevarni, saj spodbujajo delovanje procesov, ki vodijo do raka. Aktivirajo se zaradi genetske spremembe proto-onkogenov, najpogosteje do tega pride zaradi točkovnih mutacij; mutacije z večjo funkcionalnostjo, kromosomske translokacije, virusna integracija, epigenetske spremembe, spremembe regulatornih proteinov. Tumor zavirajoči geni ali tumorski supresorji tvorijo regulatorne proteine, ki preprečujejo delitev rakavih celic ter spodbujajo popravljanje DNA. Aktivirajo se s transkripcijsko aktivacijo, posttranslacijskimi modifikacijami ali interakcijami med proteini. Njihova glavna naloga je vzdrževanje genoma, prav tako pa preprečujejo nenadzorovano rast celic.
Pot RAS-RAF-MEK-ERK je signalna pot onkogenov, ki ima vlogo pri rasti, delitvi, preživetju in diferenciaciji celic. Njena nenormalna aktivacija lahko povzroči nastanek tumorjev. Pot se začne z aktivacijo RAS, do katere pride zaradi zunajceličnih signalov. RAS potem aktivira še RAF in sproži kaskado fosforilacije. Nato se aktivira MEK, ki sproži dvojno fosforilacijo in aktivira ERK, aktivacija le-te pa vodi do razmnoževanja, preživetja ali diferenciacije celic.
TP53 je gen, ki kodira tumor supresorski protein p53, ta pa zatira tumorje. Na poškodbe DNA odgovarja tako, da ustavi celični cikel ter nato popravi DNA, sproži apoptozo ali pa senescenco. Njegovo delovanje inhibira MDM2, ki ga lahko dodatno stabilizira MDM4. Ob mutacijah na TP53, ter posledično na P53, ta izgubi sposobnost obrambe proti tumorjem.
Z ugotavljanjem mutacij onkogenov/tumorskih supresorjev, ali s tem da ti služijo kot biomarkerji, lahko zdravniki napovejo verjetno napredovanje raka ter izberejo ustrezno zdravljenje.

==Nina Majerle - Z G-proteini sklopljeni vzorčno prepoznavni receptorji izraženi v nevtrofilcih==
Nevtrofilci so najpogostejši levkociti v človeški krvi in so ključnega pomena za pravilno delovanje imunskega sistema. Na površini izražajo različne receptorje, ki prepoznavajo molekulske vzorce tipične za patogene organizme in za poškodovane gostiteljske celice. Ti receptorji so ključnega pomena za delovanje nevtrofilcev, saj jim omogočajo regulacijo vnetnega odziva, diferenciacijo, priklic drugih celic imunskega sistema in fagocitozo. Mnogi od teh receptorjev pripadajo družini z G-proteini sklopljenih receptorjev. GPCR-ji imajo značilno strukturo sedmih α-vijačnic, prenos signala prek GPCR-jev pa največkrat poteka preko heterotrimernih G-proteinov. Seminarska naloga obravnava tako splošne značilnosti GPCR-jev, kot tudi podrobneje opiše mehanizme delovanja in funkcije nekaterih bolj znanih GPCR-jev izraženih na membranah nevtrofilcev, ki delujejo po principu vzorčnega prepoznavanja: družina formil peptidnih receptorjev (FPRs), purinergični receptor P2Y2R in dva člana družine receptorjev prostih maščobnih kislin FFA2R in GPR84. Poleg tega prek relevantnih primerov razlaga nekatere ključne pojme in koncepte v biokemiji kot so ortosterično vezavno mesto, alosterični receptorski modulatorji, vzorčno prepoznavanje, homologna in heterologna desenzibilizacija, receptorska transaktivacija, funkcionalna selektivnost in pa tudi pojme, ki se nanašajo na same nevtrofilce kot sta kemotaksija in primiranje. Na koncu se seminarska naloga naveže še na uporabnost poznavanja strukture in delovanja GPCR-jev izraženih v nevtrofilcih pri zdravljenju različnih imunskih obolenj.

==Jakob Urh Veler - Gvanilil ciklaze kot ključni receptorji in encimi pri celični biosignalizaciji==
Družina proteinov gvanilat ciklaze/gvanilil ciklaze (GC) v svoji katalitični domeni ciklizirajo GTP v cGMP. Ciklični GMP je sekundarni sporočevalec. Z nadaljno kaskado vpliva na protein kinaze (cGK), fosfodiesteraze (PDE) in ionske kanalčke (CNG). So pomembne za pravilno delovanje več organskih sistemov. Glede na strukturne, funkcionalne in regulatorne značilnosti GC delimo na membranske (mGC/pGC) in topne (sGC) oblike. Poznamo tipične in atipične sGC. Po priporočeni nomenklaturi poznamo 7 tipov mGC: MG-A, MG-B, MG-C, MG-D, MG-E, MG-F in MG-G. Vlogo encima in receptorja opravljajo topne gvanilil ciklaze v citosolu in membranske na celični membrani. Aktivirane so lahko tudi z endogenim NO, O2, HCO3-, natriuretskimi hormoni in s Ca2+-vezanimi proteini. V nadaljevanju podrobneje opisana aktivacija sGC z NO ter aktivacija GC-A z atrijskim natriuretskim hormonom (ANF). Z manipulacijo genov za zapis gvanilil ciklaz so odkrili njihove vloge v celicah in pomen specifičnih domen. Z različno stopnjo izražanja izoencimov je v celicah visoka diverziteta GC, zato je to mrežo signalizacije brez in vivo opazovanja zahtevno raziskovati. Približno 60 let že raziskujejo gvanilil ciklaze. Razumevanje te signalne poti je ključnega pomena za zdravljenje določenih bolezenskih stanj, saj imajo zdravila več tarčnih mest za delovanje.

==Domen Trontelj - G protein sklopljeni receptorji v fiziologiji okusa in farmakologiji==
G protein sklopljeni receptorji (GPCR), predstavljajo največjo družino receptorjev pri sesalcih in so ključni za uravnavanje večine fizioloških funkcij. Poleg posredovanja pri zaznavi vonja in vida, so prav tako prenašalci signala treh osnovnih okusov- sladko, umami in grenko, prav tako pa so ključnega pomena pri zaznavanju okusa kokumi. Nahajajo se v specializiranih okuševalnih celicah (TRC) znotraj brbončic. Tip I okuševalnih GPCR-jev (TAS1R) so heterodimerni kompleksi, ki skužijo kot receptorji za sladko (TAS1R2/TAS1R3) ali umami (TAS1R1/TAS1R3) okus, medtem ko Tip II obsega monomerne receptorje za grenak okus ali pa kokumi/kalcijeve receptorje.
Receptorji za sladko, umami in kokumi delijo strukturne podobnosti, saj vsebujejo več mest za vezavo agonistov z izrazito selektivnostjo, medtem ko večina grenkih receptorjev vsebuje le eno vezavno mesto, ki neselektivno sprejme veliko različnih ligandov. Vezava agonistov na receptor aktivira sekundarnih prenašalce, kar privede do vdora kalcija, to vodi do depolarizacije celice in na koncu sprostitve nevrotransmiterja.
Kljub nedavnim napredkom na področju raziskav konformacijskih sprememb, potrebnih za aktivacijo receptorja, ostaja še veliko nerešenih. V zadnjih letih so različni pristopi, ki združujejo heterologno izražanje, mutagenezo, homologno modeliranje in knockout študije na miših, skupaj ponudili vpogled v strukturo in pozicijo vezavnih mest za ligande in mehanizme ortosterične in alosterične modulacije.

==Karin Kunstelj - Potencialne terapije zdravljenja akutne mielonične levkemije najdene prav v metabolizmu celic kostnega mozga in njegovega mikrookolja==
Izogibanje detekciji in odgovoru imunskega odziva sodi med glavne težave levkemije poleg neuspešne imunoterapije. Burne poti mikrookolja so v ozadju odgovora tako rakavih kot zdravil celic, problem pa se pojavi, ko rakave celice prevzamejo vodilno vlogo metabolizmov in nadzorujejo reakcije sebi v prid. Mednje spadata tudi produkcija energije in izogibanje detekciji in pa odgovoru imunskih celic. Novo možnost terapije bi potemtakem lahko predstavljalo ciljanje povezav med mikrookoljem kostnega mozga in levkemičnimi celicami. V seminarju je podrobno opisano mikrookolje kostnega mozga, pomembne metabolične poti ogljikovih hidratov, aminokislin in maščobnih kislin. Opisani so tudi procesi levkemičnih celic, ki zdravljenju povzročajo težave in neuspešnost. Prav tako opozori na nove potencialne terapije zdravljenja akutne mielonične levkemije. Svoj fokus orientirajo in najdejo prav v mikrookolju kostnega mozga in problematičnih levkemičnih celic. Metabolizem levkemičnih celic, ki povzroča obolenja in preglavice tako obrne v svoj prid. Na koncu pa še poudari na pomembnost dodatnih raziskav in študij zaradi nedovršenih, premalo eksaktnih in pa preveč nasprotujočih-si rezultatov.

==Tonja Oman Sušnik - Metabolizem glukoze, senescenca živčnih celic in Alzheimerjeva bolezen==
Alzheimerjeva bolezen je nevrodegenerativna bolezen z visoko pojavnostjo predvsem med starejšimi. Pri njej sčasoma pride do upada miselnih sposobnosti in razvoja drugih psiholoških motenj. Njen razvoj je sicer že precej dobro raziskan, a zdravila, ki bi v celoti odpravil škodo storjeno na možganih, še ne poznamo. Tekom same bolezni se prepleta mnogo simptomov, ki so odvisni eden od drugega. To so med drugimi inzulinska rezistenca, celična senescenca, nevroinflamacija, nalaganje proteinskih plakov in oslabljen metabolizem glukoze. Najpomembnejša pri tem je celična senescenca, ki je v močni povezavi s staranjem. Ta napade tako živčne celice kot tudi glialne celice in povzroči nalaganje proteinov ter oslabljeno energijsko proizvodnjo celice. Slabša energetska preskrbljenost, kar je za nevrone izredno nevarno in se odraža v njihovem slabšem delovanju ter zmanjšani sinaptični plastičnosti, pa je tudi posledica zmanjšanega prevzema glukoze. Z boleznijo se število glukoznih transporterjev zmanjšuje, veča pa se inzulinska rezistenca. Nevroni zato ne sprejmejo dovolj glukoze za proizvodnjo ATP. Kako bi samo znanje o teh fizioloških okvarah prenesli na zdravljenje, še ni znano, a na to temo poteka mnogo tekočih raziskav. Najbolj ugodno bi bilo odstranjevanje senescentih celic, neposredno targetiranje glukoznega metabolizma ali razbijanje proteinskih plakov. Pozitivne rezultate dajejo tudi raziskave, kjer so opazovali odzivnost metabolizma glukoze na srednje intenzivno vadbo. Ta se je že pri enkrat tedenski vadbi močno izboljšal, napredovanje bolezni pa skoraj popolnoma zaustavilo.

==Jan Hvalec - Uravnavanje metabolizma endotelijskih in imunskih celic==
Endotelijske celice gradijo notranjo površino žil. Njihova funkcija je tesno povezana z ohranjanjem homeostaze tkiv, regulacijo krvnega pretoka in angiogeneze. Za opravljanje svoje naloge imajo prilagojen metabolizem z znižano stopnjo oksidativne fosforilacije in pospešeno glikolizo. Angiogeneza temelji na kolektivni migraciji endotelijskih celic, pri čemer konične celice usmerjajo poganjek, medtem ko ga stebelne celice podaljšujejo s proliferacijo. Rast žil se začne z razgradnjo bazalne membrane in izbiro konične celice pod vplivom vaskularnega endotelijskega faktorja (VEGF) in inducibilnega faktorja hipoksije (HIF), ki ju sproščajo telesne celice v hipoksičnih pogojih. Vlogo konične celice prevzame celica s hitrejšo energetsko proizvodnjo. Ker VEGF in HIF pospešita izražanje encima PFKFB3, ki pospešuje glikolizo, so ravni PFKFB3 višje v konici kot v steblu poganjka. Druga vrsta celic, ki glede na diferenciacijo prilagodi svoj metabolizem, so celice imunskega sistema. T-celice pomagalke in citotoksične celice se zanašajo na glikolizo in presnovo glutamina za tvorbo potrebne količine energije. Medtem ko se M1 makrofagi tudi zanašajo na glikolizo, je vloga metabolne poti drugačna, saj jo prednostno uporabljajo za vzdrževanje polnega stanja delovanja (razgradnjo fagocitiranih delcev). Nasprotno se spominske in regulatorne T-celice zanašajo na oksidacijo maščobnih kislin za učinkovitejšo proizvodnjo ATP, oksidativno fosforilacijo pa uporabljajo za vzdrževanje učinkovitega dolgoročnega delovanja.

==Mark Frantar - Energetika možganov in nevrodegenerativne bolezni==
Možgani so zaradi številnih funkcij, kot so vzdrževanje membranskega potenciala, recikliranje živčnih prenašalcev ter prenašanje signalov, energijsko izjemno zahteven organ. Za delovanje stalno potrebujejo energijo v obliki ATP, ki jo večinoma dobijo iz glukoze z oksidativno fosforilacijo, nekaj pa iz aerobne glikolize v citoplazmi. Za dostavljanje virov energije do nevronov skrbi nevrovaskularna enota, sestavljena iz endotelijskih celic kapilar, astrocitov ter nevronov. Nevroni lahko za vir energije uporabijo tudi ketone ali laktat, ki se proizvede v astrocitih s pretvorbo piruvata z laktat dehidrogenazo, nato pa je transportiran v nevrone skozi monokarboksilatne transporterje (MCT). Pri nevrodegenerativnih boleznih (NDB) pride do okvare metabolizma v možganih, najpogosteje do hipometabolizma glukoze. To vodi v stalno pomanjkanje energije, ki povzroči propad nevronskih celic, nabiranje agregatov nevrotoksičnih proteinov in disfunkcijo mitohondrijev, to pa še nadaljnje okvari metabolizem. Za upočasnjevanje napredovanja NDB obstaha več terapij in zdravil, a jih večina še ni dovolj testirana. Zdravila podpirajo mitohondrijske funkcije, izboljšujejo inzulinsko senzitivnost, zmanjšujejo inflamacijo, ipd. Uporabljajo se tudi ketonski prehranski dodatki ali ketogena dieta, saj gre pri NDB lahko le za okvaro metabolizma glukoze, medtem ko je metabolizem ketonov normalen. Optimizacija energetike možganov je torej temeljnega pomena pri NDB in bi morala biti prvi korak pri poskusih zakasnitve pojava in napredovanja NDB.

==Uma Jordan Ferbežar - Mnogi obrazi piruvat kinaze M2: Poudarek na vlogi pri vnetnih procesih==
Piruvat kinaza je encim, ki katalizira zadnji korak glikolize, v katerem nastaneta ATP in piruvat. Obstaja v štirih različnih izoformih, ki se nahajajo v različnih tkivih, vsi pa imajo katalitično vlogo. Izoform PKM2 je edini, ki se pojavlja v različnih konformacijah, in sicer dveh tetramernih (aktivna R-oblika in neaktivna T-oblika) ter dimerni in monomerni. Prehod med tetramerno in dimerno obliko je izjemno dinamičen in odvisen od okoliščin ter potreb celice, nadzorujejo pa ga številni regulatorji. Aktivna tetramerna oblika sodeluje v glikolizi, medtem ko ima dimerna oblika drugačne vloge - lahko se, na primer, premakne v jedro, kjer nadzoruje izražanje genov ter regulacijo različnih prepisovalnih faktorjev. Dimerno obliko opazimo tudi pri rakavih in imunskih celicah, kjer sodeluje pri spremembi metabolizma iz oksidativne fosforilacije v aerobno glikolizo, kar celicam ob povečani porabi glukoze omogoča zadostno količino ATP ter prekurzorjev za sintezo potrebnih makromolekul, kot so lipidi in proteini. PKM2 v povečanih količinah najdemo pri bolnikih z različnimi vnetnimi obolenji, kot je na primer revmatoidni artritis. Deluje tako na celice prirojenega in pridobljenega imunskega sistema, in sicer predvsem s povečevanjem količine proinflamatornih citokinov preko uravnavanja njihovega izražanja, sodeluje pa tudi pri diferenciaciji T celic in njihovi komunikaciji. Zaradi številnih načinov regulacije predstavlja dobro tarčo za zdravljenje vnetnih obolenj.

==Tinkara Robek - Signalizacija cikla: Intermediati cikla citronske kisline v vlogi miometabokinov==
Cikel citronske kisline predstavlja temelj katabolnih procesov za pridobivanje energetsko bogatih molekul v sklopu metabolizma v živih bitjih. Je ključen korak pri predelavi z ogljikom bogatih spojin pri pridobivanju ATP-molekul. Intermediati cikla so poleg členov cikla in izhodnih spojin za sintezo drugih biološko pomembnih molekul tudi pomembne signalne molekule. Med drugim spadajo med miometabokine; majhne molekule iz skupine citokinov, ki jih izločajo miocite in regulirajo komunikacijo med različnimi tipi tkiv. V večji meri se iz mišičnh celic izločajo v krvni obtok v akutni fazi intenzivnejše fizične aktivnosti in nato opravljajo specifične signalne funkcije v različnih tkivih in s tem vplivajo na potek vnetnih procesov v organizmu in izražanje proteinov. Njihovo funkcionalnost se lahko opredeli kot avtokrino, endokrino in parakrino. Delujejo s pomočjo njim specifičnim transporterjev in se po opravljeni nalogi v večini transportirajo po krvnem obtoku do jeter, kjer se razgradijo. Do sedaj je bilo odkritih in raziskanih največ funkcij citrata in sukcinata, v ospredje pa stopa tudi alfa ketoglutarat, predvsem s svojimi antioksidativnimi učinki. Obsegajo relativno novo področje fiziologije, zaradi česar je potrebno nadaljevati z raziskovanjem značilnosti in vplivov teh molekul za potrditev domnev.

==Nika Makuc - Glutamat-oksaloacetat transaminaza kot terapevtska tarča za zdravljenje ishemične možganske kapi==
Ishemična možganska kap predstavlja večino primerov možganske kapi, do katere pride zaradi zapore krvnih žil. Metode zdravljenja ishemične možganske kapi vključujejo trombolitično zdravljenje, ki pa se uporablja v omejenem obsegu in le pri manj kot 10 % vseh bolnikov z možgansko kapjo. Glutamat je aminokislina, ki ima v osrednjem živčevju funkcijo najpogostejšega vzdražnega nevrotransmiterja, v patoloških razmerah pa deluje kot močan nevrotoksin. Povišan zunajcelični glutamat ima osrednjo vlogo pri poškodbah možganov, do katerih pride zaradi ishemične možganske kapi. Novo terapevtsko tarčo pri zaščiti pred to vrsto poškodb pa predstavlja encim glutamat-oksaloacetat transaminaza (GOT), ki med ishemično možgansko kapjo zniža raven glutamata na mestu kapi. Pri presnovi glutamata s pomočjo GOT v možganskem tkivu nastajajo tudi vmesni produkti cikla citronske kisline. GOT torej lahko med ishemično možgansko kapjo omogoči, da se sicer ekscitotoksični glutamat pretvori v življenjsko pomembne vmesne produkte cikla citronske kisline. Opravljenih je bilo že več študij, ki so se osredotočale na zaščito nevronov z zmanjšanjem glutamata pri ishemični kapi, a so bile v praksi neuspešne. Sistemsko dajanje oksaloacetata predstavlja novo strategijo za zmanjšanje škodljivega učinka glutamata v možganskem tkivu po ishemični kapi. Učinek oksaloacetata namreč temelji predvsem na sposobnosti te molekule, da zmanjša raven glutamata v možganih in krvi zaradi aktivacije encima GOT.

==Brina Klinar - Vloga citrat transportnega proteina in citrata v celičnih procesih==
Citrat transportni protein (CTP) je transportni protein družine transmembranskih prenašalcev SCL25, ki se nahaja v notranji membrani mitohondrija. Njegova primarna vloga je import citrata v mitohondij ali eksport v citosol. Ustrezna aktivnost in pravilno CTP je ključnega pomena za optimalno delovanje celice. Ustrezne količine citrata v citosolu in mitohondriju so namreč pomembne za produkcijo energije, sintezo acetil-CoA kot prekurzorja biosinteze horesterola in maščobnih kislin in kot donorja acetilne skupine za actilacijske reakcije posttranslacijskih in epigenetskih modifikacij, vnetne procese in celično regulacijo. Za ohranjanje homeostaze citrata v citosolu obstajajo tudi alternativne poti, neodvisne od CTP, npr. prevzem ekstracelularnega citrata v celico prek plazmalemskih citratnih transporterjev. Kljub temu, se izguba CTP z mutacijami kaže v hudih napakah zgodnjega možganskega razvoja, kot sta npr. DiGeorgejev sindrom in L-2/D-2-hidroksiglutarna aciduria, kar nakazuje na velik pomen tega transportnega proteina. Po drugi strani pa ima inhibicija CTP inducirana s sintetičnimi inhibitorji CTP obetavno prihodnost na področju zdravljenja raka in presnovnega sindroma.