Wiki FKKT - User contributions [en]

Razporejanje plazmidov v hčerinski celici

2024-05-05T05:56:39Z

Brina Klinar: /* Razporeditveni sistem tipa II */

=Uvod=
Plazmidi živijo s svojo gostiteljsko celico v simbiozi. Razvili so kar nekaj strategij za obstoj znotraj bakterijske populacije med katerimi je razporeditveni sistem. Vsi razporeditveni sistemi so sestavljeni iz treh delov: ene ali več kopij razporeditvenega mesta (centromer), CBP (centromerni vezavni protein) in NTP-aze.

=Izračun izgube plazmida=
Plazmidi z majhnim kopirnim številom se morajo za svoj obstoj nanašati na razporeditveni sistem, plazmidi z visokim številom kopij pa se zanašajo na pasivno difuzijo.
Za naključno distribucijo velja: Ploss = 2^(1-n), kjer je »n« število kopij v celici.

=Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov=
Razporeditveni sistemi so nujni za transport in vzpostavitev sistema s plazmidno DNA. Poznamo 3 razporeditvene sisteme, ki se razlikujejo po tipu razporejanja z NTP-azo. Centromeri so značilna ohranjena zaporedja na plazmidu, ki služijo kot prepoznavna mesta za CBP. CBP prepozna zaporedje na plazmidu in se tako veže na centromer. To deluje kot most med plazmidom in ustrezno NTP-azo, ki omogoča premik plazmida.

Tip I ima Walker ATP-azo, ki ločuje plazmid s formacijo dinamičnega vzorca na bakterijskem nukleoidu. Tip II uporablja aktinu podobno ATP-azo, ki polimerizira v dinamične filamente, ki potiskajo plazmida narazen. Tip III ima tubulinu podobne GTP-aze, ki prav tako delujejo preko dinamične polimerizacije mehanizma.
Različni tipi so prikazani na [https://journals.asm.org/cms/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019/asset/0bc1138d-60c0-4e59-95c9-fdfec9718c8d/assets/graphic/esp-0003-2019_fig_004.gif sliki 1].

=Arhitektura=
CBP-ji se lahko na prepoznavno mesto vežejo v več kopijah in tako tvorijo razporeditvene komplekse, katerih arhitektura je odvisna od tipa CBP. CBP tip I vsebuje motiv HTH2 in prepozna centromerno mesto parS, kamor se veže v več kopijah in gradi velike komplekse. To omogoča številne interakcije z ustrezno NTP-azo. CBP tip II (vsebuje RHH2 motiv) in tip III (vsebuje HTH2 motiv) tvorita podobne komplekse in sicer, oba tvorita vijačne, obročaste strukture in povzročita upogib DNA.

=Vizualizacija plazmidnih dinamik v celici=
==Tip I==
Najraje se nahajajo na četrtini ali polovici celice v majhnih in večjih celicah. V vseh primerih pa vpadajo z bakterijskimi nukleoidom. ParB in RHH2 so prisotni v velikih količinah znotraj celice in so kot žarišča, ki so odvisni od razporeditvenega mesta in korespondirajo na pozicijo plazmida. ParB iz F plazmidov so prisotni v skupkih v okolici F razporeditvenega mesta, parSF. Razporeditveni kompleksi plazmida F so najdeni znotraj večje mase nukleoida. ParA imajo oscilatorno vedenje, nekatere pa tvorijo dinamične gradiente.

==Tip II in III==
ParMR1 tvorijo dolge filamente. Plazmidi niso prisotni na obeh koncih ParM polimerov. Premik plazmidne DNA na nasproten pol celice žene ParM polimerizacija med sestrskima ParR-parC (R1 centromer) kompleksoma.

Tubulinu podobna GTP-aza iz Gram-pozitivnih bakterij tvori dinamične in citoskeletne filamente, kar nakazuje, da tip III deluje po filamentacijskem mehanizmu za razporejanje plazmidov znotraj celic.

Slikovna obdelava razporeditve in ločitve plazmidov z velikim številom kopij
Plazmidi naj bi sledili obliki ameriškega krofa. Prosto difundirajoči plazmidi so večinoma izven nukleoida v notranjem periferiju bakterije. Plazmidi z visokim kopirnim številom so v skupkih na polih celice in naključno razporejeni skozi celoten volumen celice z nižjo frekvenco znotraj nukleoida. To podpira model mešane distribucije, ki vključuje možnost nastajanja skupkov in naključno difuzijo individualnih plazmidov z visokim številom kopij.

=Mehanizmi razporejanja plazmidov=
Gonilo za razporeditev plazmidov predstavljajo ATP-aze in GTP-aze, ki zagotavljajo energijo za ustrezen premik plazmidov. Obstajata dva glavna razreda mehanizmov razporeditve plazmidov.

==Mehanizmi, ki vključujejo filamentacijo==
Po tem mehanizmu delujeta razporeditvena sistema tipa II in III.

===Razporeditveni sistem tipa II===
Razporeditvene ATP-aze tipa II (ParM) spadajo v razred aktinu podobnih proteinov. Te so sposobne polimerizacije in oblikovanja filamentov, ki potiskajo plazmida, pripeta na nasprotna konca snopa filamentov, narazen.

Monomeri ParM polimerizirajo v prisotnosti ATP, pri čemer tvorijo levosučne dvojne vijačnice, ki so polarne (polarnost je posledica asimetrije monomerov, zato vsak filament vsebuje top in oster konec). ParR (CBP), ki je vezan na parC plazmida, se veže na topi konec filamenta in ustvari kapo, ki prepreči razgradnjo filamenta kljub hidrolizi ATP. Novi ParM-ATP monomeri se nato vstavljajo na topi konec skozi konkavni stik med ParR/parC. Ko filament raste, potiska plazmid na topem koncu in plazmid se premika po celici. Filamenti se urejajo v antiparalelne snope, kar pomeni, da so topi konci (mesta, kamor se veže plazmid) na obeh straneh snopa. Ko filamenti v snopu rastejo potiskajo plazmide, vezane na tope konce, na nasprotna pola celice. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (A in B)

===Razporeditveni sistem tipa III===
Razporeditveni sistem tipa III prav tako deluje na principu polimerizacije, ampak pri tem kot gonilno moč uporablja tubulinu podobne GTPaze (TubZ). Monomeri TubZ polimerizirajo v prisotnosti GTP in tvorijo dvo- in štirivijačne filamente, ki so stabilizirani z GTP kapo. TubZ filamenti so polarni, kar pomeni, da rastejo na + koncu in se razgrajajo na – koncu. Tja se veže tudi TubR (CBP), vezan na tubC. Ko polimer raste na + strani in se razgrajuje na – strani, mu razporeditveni kompleks sledi, kar se kaže v premikanju plazmida. Kako pa ta vleka plazmidov prispeva k ločitvi plazmidov še ni pojasnjeno, saj TubZ filamenti niso bipolarni (premikanje poteka le v eno smer). [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (C)

==Mehanizem po principu Brownovega zobatega kolesa==
Razporeditveni sistem tipa I, ki je pri bakterijah najbolj pogost, za razliko od drugih dveh tipov pa ne deluje na principu polimerizacije. Pri njegovem mehanizmu sodelujejo ATP-aze tipa Walker (ParA). Te so sposobne interakcije z bakterijskim nukleoidom in v celici tvorijo dinamičen gradient. Interagirajo tudi s proteini ParB (CBP), ki nosijo plazmidni tovor in sledijo gradientu ParA. Predpostavljenih je bilo več modelov kako ParB sledijo gradientu ParA, vsi pa delujejo na osnovi principa Brownovega zobatega kolesa.

V prisotnosti ATP se ParA veže na DNA (ATP pri tem hidrolizira). V naslednjem koraku se na ParA veže ParB, ki je vezan na parS (nosi plazmid) in pri tem iz nukleoida izrine ParA. Ta oddifundira v citoplazmo, kjer čaka, da se nanj ponovno veže ATP. Ker pa je ta korak zelo počasen, začne na nukleoidu primanjkovati ParA. ParB se torej premika po nukleoidu in za seboj pušča ParA praznino – gibanje plazmida je zato usmerjano stran od nižje koncentracije ParA. Plazmida bi se po replikaciji tako ločila, če bi bila koncentracija ParA med njima najnižja.
Obstaja več različnih modelov mehanizma Brownovega zobatega kolesa, vsi temeljijo na asimetriji distribucije ParA na bakterijskem nukleoidu. Delovanje lahko povežemo s konceptom požganega mostu – ko se ParB s plazmidnim tovorom premakne po nukleoidu, na svoji poti iz nukleoida odstranjuje ParA in s tem 'požge most za seboj', saj se zaradi odsotnosti Par A ne more vrniti nazaj. Predlagane verzije se med seboj razlikujejo po tem, kako asimetrija razporeditve ParA ustvari energijo, potrebno za gibanje in v vlogi, ki je pripisana bakterijskemu kromosomu in ParA oligomerizaciji.

Vse ATPaze tipa I uporabljajo mehanizem Brownovega zobatega kolesa, vendar pa je relevanten model najverjetneje odvisen od različnih biokemijskih značilnosti in ravni ekspresije ParA in ParB. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/3928d857-a2ad-4de1-9c2b-e5caecb4e75b/assets/graphic/plas-0023-2014-fig5.gif Slika 3]

=Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici=
Dva različna plazmida, ki ne moreta stabilno obstajati v isti celici, sta nezdružljiva. Pri delitvah celice tako pride do izgube oziroma zmanjšanja števila vsaj enega od plazmidov, kar je posledica skupnih lastnosti nezdružljivih plazmidov. Do nezdružljivosti zaradi sorodnega načina razporejanja v celici pride tako pri razporejanju tipa 1 kot 2.

==Nezdružljivost pri ParA==
Če imamo v celici plazmid z visokim številom kopij in Par sistemom razporejanja, bo to onemogočilo stabilen soobstoj plazmida z enakim parA genom. Pretirano izražanje ParA, ki je prisoten v večih kopijah namreč povzroči, da se začneta plazmida ob delitvi naključno razporejati v hčerinske celice. Delež nezdružljivosti sovpada s koncentracijo ParA. Povečana koncentracija ParA destabilizira razporeditveni kompleks in mehanizem Brownovega zobatega kolesa, ki omogoča premikanje plazmidov po celici. Pri visoki koncentraciji ParA se praznine brez Par A lahko hitreje zapolnijo in tako onemogočijo gibanje plazmida po nukleoidu.

==Nezdružljivost pri ParB==
Analogno kot pri ParA dva plazmida, ki se razporejata s ParB, v isti celici nista stabilna, še posebej, če je eden od njiju plazmid z visokim številom kopij, saj je nezdružljivost odvisna od izražanja ParB. Previsoka koncentracija ParB najverjetneje povzroči koncentriranje plazmidov s parS genom v skupke in s tem zmanjša število plazmidov, ki se prosto gibljejo po celici. V tem primeru ParA ne more dovolj uspešno razdreti razporeditvenih kompleksov in sprostiti plazmidov, zato sčasoma pride do izgube enega od plazmidov. Hkrati so ugotovili, da lahko nekatere različice proteina, kot je ParBF, sprožijo rekombinacijo sorodnih plazmidov in tako povzročijo multimerizacijo. Multimer je plazmid, ki nastane s homologno rekombinacijo in vsebuje dve ponovitvi celotnega plazmidnega nukleotidnega zaporedja.

==Nezdružljivost pri enakih centromerih==
Če plazmida vsebujeta sorodno mesto za razporejanje, načeloma pride do nezdružljivosti. Vzrok ni povsem znan. Pri plazmidih z visokim številom kopij pride do naključnega razporejanja plazmidov, pri plazmidih, ki vsebujejo več parS mest pa tudi do zmanjšanega števila prostih ParB zaradi pretirane vezave na parS. Pri plazmidih z nizkim številom kopij opazimo zelo močno nezdružljivost, kjer je izguba števila plazmidov višja kot pri naključnem razporejanju. Eden od možnih vzrokov za to je pozna replikacija plazmidov. Če se eden od plazmidov podvoji ravno pred celično delitvijo, se kopiji namreč ne prerazporedita znotraj celice, ampak se obe dedujeta v isti hčerinski celici, kar privede do visoke izgube plazmidov.

=Regulacija izražanja par gena=
Izražanje par operonov direktno vpliva na stabilnost plazmidov in je v vseh primerih nadzorovano po principu avtoregulacije. Eden od proteinov par operona deluje kot represor, pogosto pa tudi eden od preostalih kot korepresor. V razporeditvenem sistemu tipa I so represorji ParA ATPaze, pri vseh ostalih sistemih pa proteini CBP. ParA represorji se z N-končnim delom s HTH (vijačnica-zavoj-vijačnica) motivom vežejo na DNA. Vezavno mesto ni povsem raziskano, vsebuje pa daljše obratne ponovitve, ki omogočijo vezavo ParA. Ta specifična vezava je mogoča ob vezavi ADP kot kofaktorja, pri vezavi ATP pa prevlada nespecifična vezava DNA, ki omogoči razporejanje plazmidov s pomočjo ParB.

=Zaključek=
Sistemi za razporejanje plazmidov so nujni za njihov obstoj in so kljub svoji preprostosti zelo natančno regulirani. Z dvema ključnima proteinoma in specifičnimi DNA zaporedji lahko predvsem plazmidi z manjšim številom kopij poskrbijo, da se ob delitvi uspešno dedujejo v obe hčerinski celici. Kljub široki uporabi plazmidnih vektorjev mnogi procesi, povezani z njihovim razporejanjem, še niso v celoti pojasnjeni. Raziskave v tej smeri bodo pripomogle k našemu razumevanju strukturne biologije in dinamike celotnega bakterijskega genoma.

=Viri=
Bouet, J.-Y.; Funnell, B. E. Plasmid Localization and Partition in Enterobacteriaceae. EcoSal Plus 2019, 8 (2), 10.1128/ecosalplus.ESP-0003–2019. https://doi.org/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019.

Schumacher, M. A. Bacterial Plasmid Partition Machinery: A Minimalist Approach to Survival. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012, 22 (1), 72–79. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2011.11.001.

Gerdes, K.; Møller-Jensen, J.; Jensen, R. B. Plasmid and Chromosome Partitioning: Surprises from Phylogeny. Mol. Microbiol. 2000, 37 (3), 455–466. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01975.x.

Baxter, J. C.; Funnell, B. E. Plasmid Partition Mechanisms. Microbiol. Spectr. 2014, 2 (6), 10.1128/microbiolspec.plas-0023–2014. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014.

Brooks, A. C.; Hwang, L. C. Reconstitutions of Plasmid Partition Systems and Their Mechanisms. Plasmid 2017, 91, 37–41. https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2017.03.004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Razporejanje plazmidov v hčerinski celici

2024-05-05T05:54:43Z

Brina Klinar: /* Razporeditveni sistem tipa II */

=Uvod=
Plazmidi živijo s svojo gostiteljsko celico v simbiozi. Razvili so kar nekaj strategij za obstoj znotraj bakterijske populacije med katerimi je razporeditveni sistem. Vsi razporeditveni sistemi so sestavljeni iz treh delov: ene ali več kopij razporeditvenega mesta (centromer), CBP (centromerni vezavni protein) in NTP-aze.

=Izračun izgube plazmida=
Plazmidi z majhnim kopirnim številom se morajo za svoj obstoj nanašati na razporeditveni sistem, plazmidi z visokim številom kopij pa se zanašajo na pasivno difuzijo.
Za naključno distribucijo velja: Ploss = 2^(1-n), kjer je »n« število kopij v celici.

=Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov=
Razporeditveni sistemi so nujni za transport in vzpostavitev sistema s plazmidno DNA. Poznamo 3 razporeditvene sisteme, ki se razlikujejo po tipu razporejanja z NTP-azo. Centromeri so značilna ohranjena zaporedja na plazmidu, ki služijo kot prepoznavna mesta za CBP. CBP prepozna zaporedje na plazmidu in se tako veže na centromer. To deluje kot most med plazmidom in ustrezno NTP-azo, ki omogoča premik plazmida.

Tip I ima Walker ATP-azo, ki ločuje plazmid s formacijo dinamičnega vzorca na bakterijskem nukleoidu. Tip II uporablja aktinu podobno ATP-azo, ki polimerizira v dinamične filamente, ki potiskajo plazmida narazen. Tip III ima tubulinu podobne GTP-aze, ki prav tako delujejo preko dinamične polimerizacije mehanizma.
Različni tipi so prikazani na [https://journals.asm.org/cms/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019/asset/0bc1138d-60c0-4e59-95c9-fdfec9718c8d/assets/graphic/esp-0003-2019_fig_004.gif sliki 1].

=Arhitektura=
CBP-ji se lahko na prepoznavno mesto vežejo v več kopijah in tako tvorijo razporeditvene komplekse, katerih arhitektura je odvisna od tipa CBP. CBP tip I vsebuje motiv HTH2 in prepozna centromerno mesto parS, kamor se veže v več kopijah in gradi velike komplekse. To omogoča številne interakcije z ustrezno NTP-azo. CBP tip II (vsebuje RHH2 motiv) in tip III (vsebuje HTH2 motiv) tvorita podobne komplekse in sicer, oba tvorita vijačne, obročaste strukture in povzročita upogib DNA.

=Vizualizacija plazmidnih dinamik v celici=
==Tip I==
Najraje se nahajajo na četrtini ali polovici celice v majhnih in večjih celicah. V vseh primerih pa vpadajo z bakterijskimi nukleoidom. ParB in RHH2 so prisotni v velikih količinah znotraj celice in so kot žarišča, ki so odvisni od razporeditvenega mesta in korespondirajo na pozicijo plazmida. ParB iz F plazmidov so prisotni v skupkih v okolici F razporeditvenega mesta, parSF. Razporeditveni kompleksi plazmida F so najdeni znotraj večje mase nukleoida. ParA imajo oscilatorno vedenje, nekatere pa tvorijo dinamične gradiente.

==Tip II in III==
ParMR1 tvorijo dolge filamente. Plazmidi niso prisotni na obeh koncih ParM polimerov. Premik plazmidne DNA na nasproten pol celice žene ParM polimerizacija med sestrskima ParR-parC (R1 centromer) kompleksoma.

Tubulinu podobna GTP-aza iz Gram-pozitivnih bakterij tvori dinamične in citoskeletne filamente, kar nakazuje, da tip III deluje po filamentacijskem mehanizmu za razporejanje plazmidov znotraj celic.

Slikovna obdelava razporeditve in ločitve plazmidov z velikim številom kopij
Plazmidi naj bi sledili obliki ameriškega krofa. Prosto difundirajoči plazmidi so večinoma izven nukleoida v notranjem periferiju bakterije. Plazmidi z visokim kopirnim številom so v skupkih na polih celice in naključno razporejeni skozi celoten volumen celice z nižjo frekvenco znotraj nukleoida. To podpira model mešane distribucije, ki vključuje možnost nastajanja skupkov in naključno difuzijo individualnih plazmidov z visokim številom kopij.

=Mehanizmi razporejanja plazmidov=
Gonilo za razporeditev plazmidov predstavljajo ATP-aze in GTP-aze, ki zagotavljajo energijo za ustrezen premik plazmidov. Obstajata dva glavna razreda mehanizmov razporeditve plazmidov.

==Mehanizmi, ki vključujejo filamentacijo==
Po tem mehanizmu delujeta razporeditvena sistema tipa II in III.

===Razporeditveni sistem tipa II===
Razporeditvene ATP-aze tipa II (ParM) spadajo v razred aktinu podobnih proteinov. Te so sposobne polimerizacije in oblikovanja filamentov, ki potiskajo plazmida, pripeta na nasprotna konca snopa filamentov, narazen.

Monomeri ParM polimerizirajo v prisotnosti ATP, pri čemer tvorijo levosučne dvojne vijačnice, ki so polarne (polarnost je posledica asimetrije monomerov, zato vsak filament vsebuje top in oster konec. ParR (CBP), ki je vezan na parC plazmida, se veže na topi konec filamenta in ustvari kapo, ki prepreči razgradnjo filamenta kljub hidrolizi ATP. Novi ParM-ATP monomeri se nato vstavljajo na topi konec skozi konkavni stik med ParR/parC. Ko filament raste, potiska plazmid na topem koncu in plazmid se premika po celici. Filamenti se urejajo v antiparalelne snope, kar pomeni, da so topi konci (mesta, kamor se veže plazmid) na obeh straneh snopa. Ko filamenti v snopu rastejo potiskajo plazmide, vezane na tope konce, na nasprotna pola celice. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (A in B)

===Razporeditveni sistem tipa III===
Razporeditveni sistem tipa III prav tako deluje na principu polimerizacije, ampak pri tem kot gonilno moč uporablja tubulinu podobne GTPaze (TubZ). Monomeri TubZ polimerizirajo v prisotnosti GTP in tvorijo dvo- in štirivijačne filamente, ki so stabilizirani z GTP kapo. TubZ filamenti so polarni, kar pomeni, da rastejo na + koncu in se razgrajajo na – koncu. Tja se veže tudi TubR (CBP), vezan na tubC. Ko polimer raste na + strani in se razgrajuje na – strani, mu razporeditveni kompleks sledi, kar se kaže v premikanju plazmida. Kako pa ta vleka plazmidov prispeva k ločitvi plazmidov še ni pojasnjeno, saj TubZ filamenti niso bipolarni (premikanje poteka le v eno smer). [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (C)

==Mehanizem po principu Brownovega zobatega kolesa==
Razporeditveni sistem tipa I, ki je pri bakterijah najbolj pogost, za razliko od drugih dveh tipov pa ne deluje na principu polimerizacije. Pri njegovem mehanizmu sodelujejo ATP-aze tipa Walker (ParA). Te so sposobne interakcije z bakterijskim nukleoidom in v celici tvorijo dinamičen gradient. Interagirajo tudi s proteini ParB (CBP), ki nosijo plazmidni tovor in sledijo gradientu ParA. Predpostavljenih je bilo več modelov kako ParB sledijo gradientu ParA, vsi pa delujejo na osnovi principa Brownovega zobatega kolesa.

V prisotnosti ATP se ParA veže na DNA (ATP pri tem hidrolizira). V naslednjem koraku se na ParA veže ParB, ki je vezan na parS (nosi plazmid) in pri tem iz nukleoida izrine ParA. Ta oddifundira v citoplazmo, kjer čaka, da se nanj ponovno veže ATP. Ker pa je ta korak zelo počasen, začne na nukleoidu primanjkovati ParA. ParB se torej premika po nukleoidu in za seboj pušča ParA praznino – gibanje plazmida je zato usmerjano stran od nižje koncentracije ParA. Plazmida bi se po replikaciji tako ločila, če bi bila koncentracija ParA med njima najnižja.
Obstaja več različnih modelov mehanizma Brownovega zobatega kolesa, vsi temeljijo na asimetriji distribucije ParA na bakterijskem nukleoidu. Delovanje lahko povežemo s konceptom požganega mostu – ko se ParB s plazmidnim tovorom premakne po nukleoidu, na svoji poti iz nukleoida odstranjuje ParA in s tem 'požge most za seboj', saj se zaradi odsotnosti Par A ne more vrniti nazaj. Predlagane verzije se med seboj razlikujejo po tem, kako asimetrija razporeditve ParA ustvari energijo, potrebno za gibanje in v vlogi, ki je pripisana bakterijskemu kromosomu in ParA oligomerizaciji.

Vse ATPaze tipa I uporabljajo mehanizem Brownovega zobatega kolesa, vendar pa je relevanten model najverjetneje odvisen od različnih biokemijskih značilnosti in ravni ekspresije ParA in ParB. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/3928d857-a2ad-4de1-9c2b-e5caecb4e75b/assets/graphic/plas-0023-2014-fig5.gif Slika 3]

=Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici=
Dva različna plazmida, ki ne moreta stabilno obstajati v isti celici, sta nezdružljiva. Pri delitvah celice tako pride do izgube oziroma zmanjšanja števila vsaj enega od plazmidov, kar je posledica skupnih lastnosti nezdružljivih plazmidov. Do nezdružljivosti zaradi sorodnega načina razporejanja v celici pride tako pri razporejanju tipa 1 kot 2.

==Nezdružljivost pri ParA==
Če imamo v celici plazmid z visokim številom kopij in Par sistemom razporejanja, bo to onemogočilo stabilen soobstoj plazmida z enakim parA genom. Pretirano izražanje ParA, ki je prisoten v večih kopijah namreč povzroči, da se začneta plazmida ob delitvi naključno razporejati v hčerinske celice. Delež nezdružljivosti sovpada s koncentracijo ParA. Povečana koncentracija ParA destabilizira razporeditveni kompleks in mehanizem Brownovega zobatega kolesa, ki omogoča premikanje plazmidov po celici. Pri visoki koncentraciji ParA se praznine brez Par A lahko hitreje zapolnijo in tako onemogočijo gibanje plazmida po nukleoidu.

==Nezdružljivost pri ParB==
Analogno kot pri ParA dva plazmida, ki se razporejata s ParB, v isti celici nista stabilna, še posebej, če je eden od njiju plazmid z visokim številom kopij, saj je nezdružljivost odvisna od izražanja ParB. Previsoka koncentracija ParB najverjetneje povzroči koncentriranje plazmidov s parS genom v skupke in s tem zmanjša število plazmidov, ki se prosto gibljejo po celici. V tem primeru ParA ne more dovolj uspešno razdreti razporeditvenih kompleksov in sprostiti plazmidov, zato sčasoma pride do izgube enega od plazmidov. Hkrati so ugotovili, da lahko nekatere različice proteina, kot je ParBF, sprožijo rekombinacijo sorodnih plazmidov in tako povzročijo multimerizacijo. Multimer je plazmid, ki nastane s homologno rekombinacijo in vsebuje dve ponovitvi celotnega plazmidnega nukleotidnega zaporedja.

==Nezdružljivost pri enakih centromerih==
Če plazmida vsebujeta sorodno mesto za razporejanje, načeloma pride do nezdružljivosti. Vzrok ni povsem znan. Pri plazmidih z visokim številom kopij pride do naključnega razporejanja plazmidov, pri plazmidih, ki vsebujejo več parS mest pa tudi do zmanjšanega števila prostih ParB zaradi pretirane vezave na parS. Pri plazmidih z nizkim številom kopij opazimo zelo močno nezdružljivost, kjer je izguba števila plazmidov višja kot pri naključnem razporejanju. Eden od možnih vzrokov za to je pozna replikacija plazmidov. Če se eden od plazmidov podvoji ravno pred celično delitvijo, se kopiji namreč ne prerazporedita znotraj celice, ampak se obe dedujeta v isti hčerinski celici, kar privede do visoke izgube plazmidov.

=Regulacija izražanja par gena=
Izražanje par operonov direktno vpliva na stabilnost plazmidov in je v vseh primerih nadzorovano po principu avtoregulacije. Eden od proteinov par operona deluje kot represor, pogosto pa tudi eden od preostalih kot korepresor. V razporeditvenem sistemu tipa I so represorji ParA ATPaze, pri vseh ostalih sistemih pa proteini CBP. ParA represorji se z N-končnim delom s HTH (vijačnica-zavoj-vijačnica) motivom vežejo na DNA. Vezavno mesto ni povsem raziskano, vsebuje pa daljše obratne ponovitve, ki omogočijo vezavo ParA. Ta specifična vezava je mogoča ob vezavi ADP kot kofaktorja, pri vezavi ATP pa prevlada nespecifična vezava DNA, ki omogoči razporejanje plazmidov s pomočjo ParB.

=Zaključek=
Sistemi za razporejanje plazmidov so nujni za njihov obstoj in so kljub svoji preprostosti zelo natančno regulirani. Z dvema ključnima proteinoma in specifičnimi DNA zaporedji lahko predvsem plazmidi z manjšim številom kopij poskrbijo, da se ob delitvi uspešno dedujejo v obe hčerinski celici. Kljub široki uporabi plazmidnih vektorjev mnogi procesi, povezani z njihovim razporejanjem, še niso v celoti pojasnjeni. Raziskave v tej smeri bodo pripomogle k našemu razumevanju strukturne biologije in dinamike celotnega bakterijskega genoma.

=Viri=
Bouet, J.-Y.; Funnell, B. E. Plasmid Localization and Partition in Enterobacteriaceae. EcoSal Plus 2019, 8 (2), 10.1128/ecosalplus.ESP-0003–2019. https://doi.org/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019.

Schumacher, M. A. Bacterial Plasmid Partition Machinery: A Minimalist Approach to Survival. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012, 22 (1), 72–79. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2011.11.001.

Gerdes, K.; Møller-Jensen, J.; Jensen, R. B. Plasmid and Chromosome Partitioning: Surprises from Phylogeny. Mol. Microbiol. 2000, 37 (3), 455–466. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01975.x.

Baxter, J. C.; Funnell, B. E. Plasmid Partition Mechanisms. Microbiol. Spectr. 2014, 2 (6), 10.1128/microbiolspec.plas-0023–2014. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014.

Brooks, A. C.; Hwang, L. C. Reconstitutions of Plasmid Partition Systems and Their Mechanisms. Plasmid 2017, 91, 37–41. https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2017.03.004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Razporejanje plazmidov v hčerinski celici

2024-05-05T05:42:40Z

Brina Klinar: /* Mehanizem po principu Brownovega zobatega kolesa */

=Uvod=
Plazmidi živijo s svojo gostiteljsko celico v simbiozi. Razvili so kar nekaj strategij za obstoj znotraj bakterijske populacije med katerimi je razporeditveni sistem. Vsi razporeditveni sistemi so sestavljeni iz treh delov: ene ali več kopij razporeditvenega mesta (centromer), CBP (centromerni vezavni protein) in NTP-aze.

=Izračun izgube plazmida=
Plazmidi z majhnim kopirnim številom se morajo za svoj obstoj nanašati na razporeditveni sistem, plazmidi z visokim številom kopij pa se zanašajo na pasivno difuzijo.
Za naključno distribucijo velja: Ploss = 2^(1-n), kjer je »n« število kopij v celici.

=Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov=
Razporeditveni sistemi so nujni za transport in vzpostavitev sistema s plazmidno DNA. Poznamo 3 razporeditvene sisteme, ki se razlikujejo po tipu razporejanja z NTP-azo. Centromeri so značilna ohranjena zaporedja na plazmidu, ki služijo kot prepoznavna mesta za CBP. CBP prepozna zaporedje na plazmidu in se tako veže na centromer. To deluje kot most med plazmidom in ustrezno NTP-azo, ki omogoča premik plazmida.

Tip I ima Walker ATP-azo, ki ločuje plazmid s formacijo dinamičnega vzorca na bakterijskem nukleoidu. Tip II uporablja aktinu podobno ATP-azo, ki polimerizira v dinamične filamente, ki potiskajo plazmida narazen. Tip III ima tubulinu podobne GTP-aze, ki prav tako delujejo preko dinamične polimerizacije mehanizma.
Različni tipi so prikazani na [https://journals.asm.org/cms/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019/asset/0bc1138d-60c0-4e59-95c9-fdfec9718c8d/assets/graphic/esp-0003-2019_fig_004.gif sliki 1].

=Arhitektura=
CBP-ji se lahko na prepoznavno mesto vežejo v več kopijah in tako tvorijo razporeditvene komplekse, katerih arhitektura je odvisna od tipa CBP. CBP tip I vsebuje motiv HTH2 in prepozna centromerno mesto parS, kamor se veže v več kopijah in gradi velike komplekse. To omogoča številne interakcije z ustrezno NTP-azo. CBP tip II (vsebuje RHH2 motiv) in tip III (vsebuje HTH2 motiv) tvorita podobne komplekse in sicer, oba tvorita vijačne, obročaste strukture in povzročita upogib DNA.

=Vizualizacija plazmidnih dinamik v celici=
==Tip I==
Najraje se nahajajo na četrtini ali polovici celice v majhnih in večjih celicah. V vseh primerih pa vpadajo z bakterijskimi nukleoidom. ParB in RHH2 so prisotni v velikih količinah znotraj celice in so kot žarišča, ki so odvisni od razporeditvenega mesta in korespondirajo na pozicijo plazmida. ParB iz F plazmidov so prisotni v skupkih v okolici F razporeditvenega mesta, parSF. Razporeditveni kompleksi plazmida F so najdeni znotraj večje mase nukleoida. ParA imajo oscilatorno vedenje, nekatere pa tvorijo dinamične gradiente.

==Tip II in III==
ParMR1 tvorijo dolge filamente. Plazmidi niso prisotni na obeh koncih ParM polimerov. Premik plazmidne DNA na nasproten pol celice žene ParM polimerizacija med sestrskima ParR-parC (R1 centromer) kompleksoma.

Tubulinu podobna GTP-aza iz Gram-pozitivnih bakterij tvori dinamične in citoskeletne filamente, kar nakazuje, da tip III deluje po filamentacijskem mehanizmu za razporejanje plazmidov znotraj celic.

Slikovna obdelava razporeditve in ločitve plazmidov z velikim številom kopij
Plazmidi naj bi sledili obliki ameriškega krofa. Prosto difundirajoči plazmidi so večinoma izven nukleoida v notranjem periferiju bakterije. Plazmidi z visokim kopirnim številom so v skupkih na polih celice in naključno razporejeni skozi celoten volumen celice z nižjo frekvenco znotraj nukleoida. To podpira model mešane distribucije, ki vključuje možnost nastajanja skupkov in naključno difuzijo individualnih plazmidov z visokim številom kopij.

=Mehanizmi razporejanja plazmidov=
Gonilo za razporeditev plazmidov predstavljajo ATP-aze in GTP-aze, ki zagotavljajo energijo za ustrezen premik plazmidov. Obstajata dva glavna razreda mehanizmov razporeditve plazmidov.

==Mehanizmi, ki vključujejo filamentacijo==
Po tem mehanizmu delujeta razporeditvena sistema tipa II in III.

===Razporeditveni sistem tipa II===
Razporeditvene ATP-aze tipa II (ParM) spadajo v razred aktinu podobnih proteinov. Te so sposobne polimerizacije in oblikovanja filamentov, ki potiskajo plazmida, pripeta na nasprotna konca filamenta, narazen (pri paličičastih bakterijah je to vzporedno z longitudinalno osjo celice).

Monomeri ParM polimerizirajo v prisotnosti ATP, pri čemer tvorijo levosučne dvojne vijačnice, ki so polarne (polarnost je posledica asimetrije monomerov, zato vsak filament vsebuje top in oster konec. ParR (CBP), ki je vezan na parC plazmida, se veže na topi konec filamenta in ustvari kapo, ki prepreči razgradnjo filamenta kljub hidrolizi ATP. Novi ParM-ATP monomeri se nato vstavljajo na topi konec skozi konkavni stik med ParR/parC. Ko filament raste, potiska plazmid na topem koncu in plazmid se premika po celici. Filamenti se urejajo v antiparalelne snope, kar pomeni, da so topi konci (mesta, kamor se veže plazmid) na obeh straneh snopa. Ko filamenti v snopu rastejo potiskajo plazmide, vezane na tope konce, na nasprotna pola celice. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (A in B)

===Razporeditveni sistem tipa III===
Razporeditveni sistem tipa III prav tako deluje na principu polimerizacije, ampak pri tem kot gonilno moč uporablja tubulinu podobne GTPaze (TubZ). Monomeri TubZ polimerizirajo v prisotnosti GTP in tvorijo dvo- in štirivijačne filamente, ki so stabilizirani z GTP kapo. TubZ filamenti so polarni, kar pomeni, da rastejo na + koncu in se razgrajajo na – koncu. Tja se veže tudi TubR (CBP), vezan na tubC. Ko polimer raste na + strani in se razgrajuje na – strani, mu razporeditveni kompleks sledi, kar se kaže v premikanju plazmida. Kako pa ta vleka plazmidov prispeva k ločitvi plazmidov še ni pojasnjeno, saj TubZ filamenti niso bipolarni (premikanje poteka le v eno smer). [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (C)

==Mehanizem po principu Brownovega zobatega kolesa==
Razporeditveni sistem tipa I, ki je pri bakterijah najbolj pogost, za razliko od drugih dveh tipov pa ne deluje na principu polimerizacije. Pri njegovem mehanizmu sodelujejo ATP-aze tipa Walker (ParA). Te so sposobne interakcije z bakterijskim nukleoidom in v celici tvorijo dinamičen gradient. Interagirajo tudi s proteini ParB (CBP), ki nosijo plazmidni tovor in sledijo gradientu ParA. Predpostavljenih je bilo več modelov kako ParB sledijo gradientu ParA, vsi pa delujejo na osnovi principa Brownovega zobatega kolesa.

V prisotnosti ATP se ParA veže na DNA (ATP pri tem hidrolizira). V naslednjem koraku se na ParA veže ParB, ki je vezan na parS (nosi plazmid) in pri tem iz nukleoida izrine ParA. Ta oddifundira v citoplazmo, kjer čaka, da se nanj ponovno veže ATP. Ker pa je ta korak zelo počasen, začne na nukleoidu primanjkovati ParA. ParB se torej premika po nukleoidu in za seboj pušča ParA praznino – gibanje plazmida je zato usmerjano stran od nižje koncentracije ParA. Plazmida bi se po replikaciji tako ločila, če bi bila koncentracija ParA med njima najnižja.
Obstaja več različnih modelov mehanizma Brownovega zobatega kolesa, vsi temeljijo na asimetriji distribucije ParA na bakterijskem nukleoidu. Delovanje lahko povežemo s konceptom požganega mostu – ko se ParB s plazmidnim tovorom premakne po nukleoidu, na svoji poti iz nukleoida odstranjuje ParA in s tem 'požge most za seboj', saj se zaradi odsotnosti Par A ne more vrniti nazaj. Predlagane verzije se med seboj razlikujejo po tem, kako asimetrija razporeditve ParA ustvari energijo, potrebno za gibanje in v vlogi, ki je pripisana bakterijskemu kromosomu in ParA oligomerizaciji.

Vse ATPaze tipa I uporabljajo mehanizem Brownovega zobatega kolesa, vendar pa je relevanten model najverjetneje odvisen od različnih biokemijskih značilnosti in ravni ekspresije ParA in ParB. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/3928d857-a2ad-4de1-9c2b-e5caecb4e75b/assets/graphic/plas-0023-2014-fig5.gif Slika 3]

=Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici=
Dva različna plazmida, ki ne moreta stabilno obstajati v isti celici, sta nezdružljiva. Pri delitvah celice tako pride do izgube oziroma zmanjšanja števila vsaj enega od plazmidov, kar je posledica skupnih lastnosti nezdružljivih plazmidov. Do nezdružljivosti zaradi sorodnega načina razporejanja v celici pride tako pri razporejanju tipa 1 kot 2.

==Nezdružljivost pri ParA==
Če imamo v celici plazmid z visokim številom kopij in Par sistemom razporejanja, bo to onemogočilo stabilen soobstoj plazmida z enakim parA genom. Pretirano izražanje ParA, ki je prisoten v večih kopijah namreč povzroči, da se začneta plazmida ob delitvi naključno razporejati v hčerinske celice. Delež nezdružljivosti sovpada s koncentracijo ParA. Povečana koncentracija ParA destabilizira razporeditveni kompleks in mehanizem Brownovega zobatega kolesa, ki omogoča premikanje plazmidov po celici. Pri visoki koncentraciji ParA se praznine brez Par A lahko hitreje zapolnijo in tako onemogočijo gibanje plazmida po nukleoidu.

==Nezdružljivost pri ParB==
Analogno kot pri ParA dva plazmida, ki se razporejata s ParB, v isti celici nista stabilna, še posebej, če je eden od njiju plazmid z visokim številom kopij, saj je nezdružljivost odvisna od izražanja ParB. Previsoka koncentracija ParB najverjetneje povzroči koncentriranje plazmidov s parS genom v skupke in s tem zmanjša število plazmidov, ki se prosto gibljejo po celici. V tem primeru ParA ne more dovolj uspešno razdreti razporeditvenih kompleksov in sprostiti plazmidov, zato sčasoma pride do izgube enega od plazmidov. Hkrati so ugotovili, da lahko nekatere različice proteina, kot je ParBF, sprožijo rekombinacijo sorodnih plazmidov in tako povzročijo multimerizacijo. Multimer je plazmid, ki nastane s homologno rekombinacijo in vsebuje dve ponovitvi celotnega plazmidnega nukleotidnega zaporedja.

==Nezdružljivost pri enakih centromerih==
Če plazmida vsebujeta sorodno mesto za razporejanje, načeloma pride do nezdružljivosti. Vzrok ni povsem znan. Pri plazmidih z visokim številom kopij pride do naključnega razporejanja plazmidov, pri plazmidih, ki vsebujejo več parS mest pa tudi do zmanjšanega števila prostih ParB zaradi pretirane vezave na parS. Pri plazmidih z nizkim številom kopij opazimo zelo močno nezdružljivost, kjer je izguba števila plazmidov višja kot pri naključnem razporejanju. Eden od možnih vzrokov za to je pozna replikacija plazmidov. Če se eden od plazmidov podvoji ravno pred celično delitvijo, se kopiji namreč ne prerazporedita znotraj celice, ampak se obe dedujeta v isti hčerinski celici, kar privede do visoke izgube plazmidov.

=Regulacija izražanja par gena=
Izražanje par operonov direktno vpliva na stabilnost plazmidov in je v vseh primerih nadzorovano po principu avtoregulacije. Eden od proteinov par operona deluje kot represor, pogosto pa tudi eden od preostalih kot korepresor. V razporeditvenem sistemu tipa I so represorji ParA ATPaze, pri vseh ostalih sistemih pa proteini CBP. ParA represorji se z N-končnim delom s HTH (vijačnica-zavoj-vijačnica) motivom vežejo na DNA. Vezavno mesto ni povsem raziskano, vsebuje pa daljše obratne ponovitve, ki omogočijo vezavo ParA. Ta specifična vezava je mogoča ob vezavi ADP kot kofaktorja, pri vezavi ATP pa prevlada nespecifična vezava DNA, ki omogoči razporejanje plazmidov s pomočjo ParB.

=Zaključek=
Sistemi za razporejanje plazmidov so nujni za njihov obstoj in so kljub svoji preprostosti zelo natančno regulirani. Z dvema ključnima proteinoma in specifičnimi DNA zaporedji lahko predvsem plazmidi z manjšim številom kopij poskrbijo, da se ob delitvi uspešno dedujejo v obe hčerinski celici. Kljub široki uporabi plazmidnih vektorjev mnogi procesi, povezani z njihovim razporejanjem, še niso v celoti pojasnjeni. Raziskave v tej smeri bodo pripomogle k našemu razumevanju strukturne biologije in dinamike celotnega bakterijskega genoma.

=Viri=
Bouet, J.-Y.; Funnell, B. E. Plasmid Localization and Partition in Enterobacteriaceae. EcoSal Plus 2019, 8 (2), 10.1128/ecosalplus.ESP-0003–2019. https://doi.org/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019.

Schumacher, M. A. Bacterial Plasmid Partition Machinery: A Minimalist Approach to Survival. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012, 22 (1), 72–79. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2011.11.001.

Gerdes, K.; Møller-Jensen, J.; Jensen, R. B. Plasmid and Chromosome Partitioning: Surprises from Phylogeny. Mol. Microbiol. 2000, 37 (3), 455–466. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01975.x.

Baxter, J. C.; Funnell, B. E. Plasmid Partition Mechanisms. Microbiol. Spectr. 2014, 2 (6), 10.1128/microbiolspec.plas-0023–2014. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014.

Brooks, A. C.; Hwang, L. C. Reconstitutions of Plasmid Partition Systems and Their Mechanisms. Plasmid 2017, 91, 37–41. https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2017.03.004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Razporejanje plazmidov v hčerinski celici

2024-05-04T20:10:24Z

Brina Klinar:

=Uvod=
Plazmidi živijo s svojo gostiteljsko celico v simbiozi. Razvili so kar nekaj strategij za obstoj znotraj bakterijske populacije med katerimi je razporeditveni sistem. Vsi razporeditveni sistemi so sestavljeni iz treh delov: ene ali več kopij razporeditvenega mesta (centromer), CBP (centromerni vezavni protein) in NTP-aze.

=Izračun izgube plazmida=
Plazmidi z majhnim kopirnim številom se morajo za svoj obstoj nanašati na razporeditveni sistem, plazmidi z visokim številom kopij pa se zanašajo na pasivno difuzijo.
Za naključno distribucijo velja: Ploss = 2^(1-n), kjer je »n« število kopij v celici.

=Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov=
Razporeditveni sistemi so nujni za transport in vzpostavitev sistema s plazmidno DNA. Poznamo 3 razporeditvene sisteme, ki se razlikujejo po tipu razporejanja z NTP-azo. Centromeri so značilna ohranjena zaporedja na plazmidu, ki služijo kot prepoznavna mesta za CBP. CBP prepozna zaporedje na plazmidu in se tako veže na centromer. To deluje kot most med plazmidom in ustrezno NTP-azo, ki omogoča premik plazmida.

Tip I ima Walker ATP-azo, ki ločuje plazmid s formacijo dinamičnega vzorca na bakterijskem nukleoidu. Tip II uporablja aktinu podobno ATP-azo, ki polimerizira v dinamične filamente, ki potiskajo plazmida narazen. Tip III ima tubulinu podobne GTP-aze, ki prav tako delujejo preko dinamične polimerizacije mehanizma.
Različni tipi so prikazani na [https://journals.asm.org/cms/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019/asset/0bc1138d-60c0-4e59-95c9-fdfec9718c8d/assets/graphic/esp-0003-2019_fig_004.gif sliki 1].

=Arhitektura=
CBP-ji se lahko na prepoznavno mesto vežejo v več kopijah in tako tvorijo razporeditvene komplekse, katerih arhitektura je odvisna od tipa CBP. CBP tip I vsebuje motiv HTH2 in prepozna centromerno mesto parS, kamor se veže v več kopijah in gradi velike komplekse. To omogoča številne interakcije z ustrezno NTP-azo. CBP tip II (vsebuje RHH2 motiv) in tip III (vsebuje HTH2 motiv) tvorita podobne komplekse in sicer, oba tvorita vijačne, obročaste strukture in povzročita upogib DNA.

=Vizualizacija plazmidnih dinamik v celici=
==Tip I==
Najraje se nahajajo na četrtini ali polovici celice v majhnih in večjih celicah. V vseh primerih pa vpadajo z bakterijskimi nukleoidom. ParB in RHH2 so prisotni v velikih količinah znotraj celice in so kot žarišča, ki so odvisni od razporeditvenega mesta in korespondirajo na pozicijo plazmida. ParB iz F plazmidov so prisotni v skupkih v okolici F razporeditvenega mesta, parSF. Razporeditveni kompleksi plazmida F so najdeni znotraj večje mase nukleoida. ParA imajo oscilatorno vedenje, nekatere pa tvorijo dinamične gradiente.

==Tip II in III==
ParMR1 tvorijo dolge filamente. Plazmidi niso prisotni na obeh koncih ParM polimerov. Premik plazmidne DNA na nasproten pol celice žene ParM polimerizacija med sestrskima ParR-parC (R1 centromer) kompleksoma.

Tubulinu podobna GTP-aza iz Gram-pozitivnih bakterij tvori dinamične in citoskeletne filamente, kar nakazuje, da tip III deluje po filamentacijskem mehanizmu za razporejanje plazmidov znotraj celic.

Slikovna obdelava razporeditve in ločitve plazmidov z velikim številom kopij
Plazmidi naj bi sledili obliki ameriškega krofa. Prosto difundirajoči plazmidi so večinoma izven nukleoida v notranjem periferiju bakterije. Plazmidi z visokim kopirnim številom so v skupkih na polih celice in naključno razporejeni skozi celoten volumen celice z nižjo frekvenco znotraj nukleoida. To podpira model mešane distribucije, ki vključuje možnost nastajanja skupkov in naključno difuzijo individualnih plazmidov z visokim številom kopij.

=Mehanizmi razporejanja plazmidov=
Gonilo za razporeditev plazmidov predstavljajo ATP-aze in GTP-aze, ki zagotavljajo energijo za ustrezen premik plazmidov. Obstajata dva glavna razreda mehanizmov razporeditve plazmidov.

==Mehanizmi, ki vključujejo filamentacijo==
Po tem mehanizmu delujeta razporeditvena sistema tipa II in III.

===Razporeditveni sistem tipa II===
Razporeditvene ATP-aze tipa II (ParM) spadajo v razred aktinu podobnih proteinov. Te so sposobne polimerizacije in oblikovanja filamentov, ki potiskajo plazmida, pripeta na nasprotna konca filamenta, narazen (pri paličičastih bakterijah je to vzporedno z longitudinalno osjo celice).

Monomeri ParM polimerizirajo v prisotnosti ATP, pri čemer tvorijo levosučne dvojne vijačnice, ki so polarne (polarnost je posledica asimetrije monomerov, zato vsak filament vsebuje top in oster konec. ParR (CBP), ki je vezan na parC plazmida, se veže na topi konec filamenta in ustvari kapo, ki prepreči razgradnjo filamenta kljub hidrolizi ATP. Novi ParM-ATP monomeri se nato vstavljajo na topi konec skozi konkavni stik med ParR/parC. Ko filament raste, potiska plazmid na topem koncu in plazmid se premika po celici. Filamenti se urejajo v antiparalelne snope, kar pomeni, da so topi konci (mesta, kamor se veže plazmid) na obeh straneh snopa. Ko filamenti v snopu rastejo potiskajo plazmide, vezane na tope konce, na nasprotna pola celice. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (A in B)

===Razporeditveni sistem tipa III===
Razporeditveni sistem tipa III prav tako deluje na principu polimerizacije, ampak pri tem kot gonilno moč uporablja tubulinu podobne GTPaze (TubZ). Monomeri TubZ polimerizirajo v prisotnosti GTP in tvorijo dvo- in štirivijačne filamente, ki so stabilizirani z GTP kapo. TubZ filamenti so polarni, kar pomeni, da rastejo na + koncu in se razgrajajo na – koncu. Tja se veže tudi TubR (CBP), vezan na tubC. Ko polimer raste na + strani in se razgrajuje na – strani, mu razporeditveni kompleks sledi, kar se kaže v premikanju plazmida. Kako pa ta vleka plazmidov prispeva k ločitvi plazmidov še ni pojasnjeno, saj TubZ filamenti niso bipolarni (premikanje poteka le v eno smer). [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (C)

==Mehanizem po principu Brownovega zobatega kolesa==
Razporeditveni sistem tipa I, ki je pri bakterijah najbolj pogost, za razliko od drugih dveh tipov pa ne deluje na principu polimerizacije. Pri njegovem mehanizmu sodelujejo ATP-aze tipa Walker (ParA). Te so sposobne interakcije z bakterijskim nukleoidom in v celici tvorijo dinamičen gradient. Interagirajo tudi s proteini ParB (CBP), ki nosijo plazmidni tovor in sledijo gradientu ParA. Predpostavljenih je bilo več modelov kako ParB sledijo gradientu ParA, vsi pa delujejo na osnovi principa Brownovega zobatega kolesa.

V prisotnosti ATP se ParA veže na DNA (ATP pri tem hidrolizira). V naslednjem koraku se na ParA veže ParB, ki je vezan na parS (nosi plazmid) in pri tem iz nukleoida izrine ParA. Ta oddifundia v citoplazmo, kjer čaka, da se nanj ponovno veže ATP. Ker pa je ta korak zelo počasen, začne na nukleoidu primanjkovati ParA. ParB se torej premika po nukleoidu in za seboj pušča ParA praznino – gibanje plazmida je zato usmerjano stran od nižje koncentracije ParA. Plazmida bi se po replikaciji tako ločila, če bi bila koncentracija ParA med njima najnižja.
Obstaja več različnih modelov mehanizma Brownovega zobatega kolesa, vsi temeljijo na asimetriji distribucije ParA na bakterijskem nukleoidu. Delovanje lahko povežemo s konceptom požganega mostu – ko se ParB s plazmidnim tovorom premakne po nukleoidu, na svoji poti iz nukleoida odstranjuje ParA in s tem 'požge most za seboj', saj se zaradi odsotnosti Par A ne more vrniti nazaj. Predlagane verzije se med seboj razlikujejo po tem, kako asimetrija razporeditve ParA ustvari energijo, potrebno za gibanje in v vlogi, ki je pripisana bakterijskemu kromosomu in ParA oligomerizaciji.

Vse ATPaze tipa I uporabljajo mehanizem Brownovega zobatega kolesa, vendar pa je relevanten model najverjetneje odvisen od različnih biokemijskih značilnosti in ravni ekspresije ParA in ParB. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/3928d857-a2ad-4de1-9c2b-e5caecb4e75b/assets/graphic/plas-0023-2014-fig5.gif Slika 3]

=Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici=
Dva različna plazmida, ki ne moreta stabilno obstajati v isti celici, sta nezdružljiva. Pri delitvah celice tako pride do izgube oziroma zmanjšanja števila vsaj enega od plazmidov, kar je posledica skupnih lastnosti nezdružljivih plazmidov. Do nezdružljivosti zaradi sorodnega načina razporejanja v celici pride tako pri razporejanju tipa 1 kot 2.

==Nezdružljivost pri ParA==
Če imamo v celici plazmid z visokim številom kopij in Par sistemom razporejanja, bo to onemogočilo stabilen soobstoj plazmida z enakim parA genom. Pretirano izražanje ParA, ki je prisoten v večih kopijah namreč povzroči, da se začneta plazmida ob delitvi naključno razporejati v hčerinske celice. Delež nezdružljivosti sovpada s koncentracijo ParA. Povečana koncentracija ParA destabilizira razporeditveni kompleks in mehanizem Brownovega zobatega kolesa, ki omogoča premikanje plazmidov po celici. Pri visoki koncentraciji ParA se praznine brez Par A lahko hitreje zapolnijo in tako onemogočijo gibanje plazmida po nukleoidu.

==Nezdružljivost pri ParB==
Analogno kot pri ParA dva plazmida, ki se razporejata s ParB, v isti celici nista stabilna, še posebej, če je eden od njiju plazmid z visokim številom kopij, saj je nezdružljivost odvisna od izražanja ParB. Previsoka koncentracija ParB najverjetneje povzroči koncentriranje plazmidov s parS genom v skupke in s tem zmanjša število plazmidov, ki se prosto gibljejo po celici. V tem primeru ParA ne more dovolj uspešno razdreti razporeditvenih kompleksov in sprostiti plazmidov, zato sčasoma pride do izgube enega od plazmidov. Hkrati so ugotovili, da lahko nekatere različice proteina, kot je ParBF, sprožijo rekombinacijo sorodnih plazmidov in tako povzročijo multimerizacijo. Multimer je plazmid, ki nastane s homologno rekombinacijo in vsebuje dve ponovitvi celotnega plazmidnega nukleotidnega zaporedja.

==Nezdružljivost pri enakih centromerih==
Če plazmida vsebujeta sorodno mesto za razporejanje, načeloma pride do nezdružljivosti. Vzrok ni povsem znan. Pri plazmidih z visokim številom kopij pride do naključnega razporejanja plazmidov, pri plazmidih, ki vsebujejo več parS mest pa tudi do zmanjšanega števila prostih ParB zaradi pretirane vezave na parS. Pri plazmidih z nizkim številom kopij opazimo zelo močno nezdružljivost, kjer je izguba števila plazmidov višja kot pri naključnem razporejanju. Eden od možnih vzrokov za to je pozna replikacija plazmidov. Če se eden od plazmidov podvoji ravno pred celično delitvijo, se kopiji namreč ne prerazporedita znotraj celice, ampak se obe dedujeta v isti hčerinski celici, kar privede do visoke izgube plazmidov.

=Regulacija izražanja par gena=
Izražanje par operonov direktno vpliva na stabilnost plazmidov in je v vseh primerih nadzorovano po principu avtoregulacije. Eden od proteinov par operona deluje kot represor, pogosto pa tudi eden od preostalih kot korepresor. V razporeditvenem sistemu tipa I so represorji ParA ATPaze, pri vseh ostalih sistemih pa proteini CBP. ParA represorji se z N-končnim delom s HTH (vijačnica-zavoj-vijačnica) motivom vežejo na DNA. Vezavno mesto ni povsem raziskano, vsebuje pa daljše obratne ponovitve, ki omogočijo vezavo ParA. Ta specifična vezava je mogoča ob vezavi ADP kot kofaktorja, pri vezavi ATP pa prevlada nespecifična vezava DNA, ki omogoči razporejanje plazmidov s pomočjo ParB.

=Zaključek=
Sistemi za razporejanje plazmidov so nujni za njihov obstoj in so kljub svoji preprostosti zelo natančno regulirani. Z dvema ključnima proteinoma in specifičnimi DNA zaporedji lahko predvsem plazmidi z manjšim številom kopij poskrbijo, da se ob delitvi uspešno dedujejo v obe hčerinski celici. Kljub široki uporabi plazmidnih vektorjev mnogi procesi, povezani z njihovim razporejanjem, še niso v celoti pojasnjeni. Raziskave v tej smeri bodo pripomogle k našemu razumevanju strukturne biologije in dinamike celotnega bakterijskega genoma.

=Viri=
Bouet, J.-Y.; Funnell, B. E. Plasmid Localization and Partition in Enterobacteriaceae. EcoSal Plus 2019, 8 (2), 10.1128/ecosalplus.ESP-0003–2019. https://doi.org/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019.

Schumacher, M. A. Bacterial Plasmid Partition Machinery: A Minimalist Approach to Survival. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012, 22 (1), 72–79. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2011.11.001.

Gerdes, K.; Møller-Jensen, J.; Jensen, R. B. Plasmid and Chromosome Partitioning: Surprises from Phylogeny. Mol. Microbiol. 2000, 37 (3), 455–466. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01975.x.

Baxter, J. C.; Funnell, B. E. Plasmid Partition Mechanisms. Microbiol. Spectr. 2014, 2 (6), 10.1128/microbiolspec.plas-0023–2014. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014.

Brooks, A. C.; Hwang, L. C. Reconstitutions of Plasmid Partition Systems and Their Mechanisms. Plasmid 2017, 91, 37–41. https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2017.03.004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Talk:Razporejanje plazmidov v hčerinski celici

2024-05-04T20:09:51Z

Brina Klinar: Created page with "Karin Kunstelj (Uvod, Izračun izgube plazmida, Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov, Arhitektura) Brina Klinar (Mehanizmi razporejanja plazmidov) Nina Cankar (Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici, Regulacija izražanja par gena)"

Karin Kunstelj (Uvod, Izračun izgube plazmida, Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov, Arhitektura)

Brina Klinar (Mehanizmi razporejanja plazmidov)

Nina Cankar (Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici, Regulacija izražanja par gena)

Razporejanje plazmidov v hčerinski celici

2024-05-04T20:02:41Z

Brina Klinar:

=Uvod=
Plazmidi živijo s svojo gostiteljsko celico v simbiozi. Razvili so kar nekaj strategij za obstoj znotraj bakterijske populacije med katerimi je razporeditveni sistem. Vsi razporeditveni sistemi so sestavljeni iz treh delov: ene ali več kopij razporeditvenega mesta (centromer), CBP (centromerni vezavni protein) in NTP-aze.

=Izračun izgube plazmida=
Plazmidi z majhnim kopirnim številom se morajo za svoj obstoj nanašati na razporeditveni sistem, plazmidi z visokim številom kopij pa se zanašajo na pasivno difuzijo.
Za naključno distribucijo velja: Ploss = 2^(1-n), kjer je »n« število kopij v celici.

=Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov=
Razporeditveni sistemi so nujni za transport in vzpostavitev sistema s plazmidno DNA. Poznamo 3 razporeditvene sisteme, ki se razlikujejo po tipu razporejanja z NTP-azo. Centromeri so značilna ohranjena zaporedja na plazmidu, ki služijo kot prepoznavna mesta za CBP. CBP prepozna zaporedje na plazmidu in se tako veže na centromer. To deluje kot most med plazmidom in ustrezno NTP-azo, ki omogoča premik plazmida.

Tip I ima Walker ATP-azo, ki ločuje plazmid s formacijo dinamičnega vzorca na bakterijskem nukleoidu. Tip II uporablja aktinu podobno ATP-azo, ki polimerizira v dinamične filamente, ki potiskajo plazmida narazen. Tip III ima tubulinu podobne GTP-aze, ki prav tako delujejo preko dinamične polimerizacije mehanizma.
Različni tipi so prikazani na [https://journals.asm.org/cms/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019/asset/0bc1138d-60c0-4e59-95c9-fdfec9718c8d/assets/graphic/esp-0003-2019_fig_004.gif sliki 1].

=Arhitektura=
CBP-ji se lahko na prepoznavno mesto vežejo v več kopijah in tako tvorijo razporeditvene komplekse, katerih arhitektura je odvisna od tipa CBP. CBP tip I vsebuje motiv HTH2 in prepozna centromerno mesto parS, kamor se veže v več kopijah in gradi velike komplekse. To omogoča številne interakcije z ustrezno NTP-azo. CBP tip II (vsebuje RHH2 motiv) in tip III (vsebuje HTH2 motiv) tvorita podobne komplekse in sicer, oba tvorita vijačne, obročaste strukture in povzročita upogib DNA.

=Vizualizacija plazmidnih dinamik v celici=
==Tip I==
Najraje se nahajajo na četrtini ali polovici celice v majhnih in večjih celicah. V vseh primerih pa vpadajo z bakterijskimi nukleoidom. ParB in RHH2 so prisotni v velikih količinah znotraj celice in so kot žarišča, ki so odvisni od razporeditvenega mesta in korespondirajo na pozicijo plazmida. ParB iz F plazmidov so prisotni v skupkih v okolici F razporeditvenega mesta, parSF. Razporeditveni kompleksi plazmida F so najdeni znotraj večje mase nukleoida. ParA imajo oscilatorno vedenje, nekatere pa tvorijo dinamične gradiente.

==Tip II in III==
ParMR1 tvorijo dolge filamente. Plazmidi niso prisotni na obeh koncih ParM polimerov. Premik plazmidne DNA na nasproten pol celice žene ParM polimerizacija med sestrskima ParR-parC (R1 centromer) kompleksoma.

Tubulinu podobna GTP-aza iz Gram-pozitivnih bakterij tvori dinamične in citoskeletne filamente, kar nakazuje, da tip III deluje po filamentacijskem mehanizmu za razporejanje plazmidov znotraj celic.

Slikovna obdelava razporeditve in ločitve plazmidov z velikim številom kopij
Plazmidi naj bi sledili obliki ameriškega krofa. Prosto difundirajoči plazmidi so večinoma izven nukleoida v notranjem periferiju bakterije. Plazmidi z visokim kopirnim številom so v skupkih na polih celice in naključno razporejeni skozi celoten volumen celice z nižjo frekvenco znotraj nukleoida. To podpira model mešane distribucije, ki vključuje možnost nastajanja skupkov in naključno difuzijo individualnih plazmidov z visokim številom kopij.

=Mehanizmi razporeditve plazmidov=
Gonilo za razporeditev plazmidov predstavljajo ATP-aze in GTP-aze, ki zagotavljajo energijo za ustrezen premik plazmidov. Obstajata dva glavna razreda mehanizmov razporeditve plazmidov.

==Mehanizmi, ki vključujejo filamentacijo==
Po tem mehanizmu delujeta razporeditvena sistema tipa II in III.

===Razporeditveni sistem tipa II===
Razporeditvene ATP-aze tipa II (ParM) spadajo v razred aktinu podobnih proteinov. Te so sposobne polimerizacije in oblikovanja filamentov, ki potiskajo plazmida, pripeta na nasprotna konca filamenta, narazen (pri paličičastih bakterijah je to vzporedno z longitudinalno osjo celice).

Monomeri ParM polimerizirajo v prisotnosti ATP, pri čemer tvorijo levosučne dvojne vijačnice, ki so polarne (polarnost je posledica asimetrije monomerov, zato vsak filament vsebuje top in oster konec. ParR (CBP), ki je vezan na parC plazmida, se veže na topi konec filamenta in ustvari kapo, ki prepreči razgradnjo filamenta kljub hidrolizi ATP. Novi ParM-ATP monomeri se nato vstavljajo na topi konec skozi konkavni stik med ParR/parC. Ko filament raste, potiska plazmid na topem koncu in plazmid se premika po celici. Filamenti se urejajo v antiparalelne snope, kar pomeni, da so topi konci (mesta, kamor se veže plazmid) na obeh straneh snopa. Ko filamenti v snopu rastejo potiskajo plazmide, vezane na tope konce, na nasprotna pola celice. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (A in B)

===Razporeditveni sistem tipa III===
Razporeditveni sistem tipa III prav tako deluje na principu polimerizacije, ampak pri tem kot gonilno moč uporablja tubulinu podobne GTPaze (TubZ). Monomeri TubZ polimerizirajo v prisotnosti GTP in tvorijo dvo- in štirivijačne filamente, ki so stabilizirani z GTP kapo. TubZ filamenti so polarni, kar pomeni, da rastejo na + koncu in se razgrajajo na – koncu. Tja se veže tudi TubR (CBP), vezan na tubC. Ko polimer raste na + strani in se razgrajuje na – strani, mu razporeditveni kompleks sledi, kar se kaže v premikanju plazmida. Kako pa ta vleka plazmidov prispeva k ločitvi plazmidov še ni pojasnjeno, saj TubZ filamenti niso bipolarni (premikanje poteka le v eno smer). [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (C)

==Mehanizem po principu Brownovega zobatega kolesa==
Razporeditveni sistem tipa I, ki je pri bakterijah najbolj pogost, za razliko od drugih dveh tipov pa ne deluje na principu polimerizacije. Pri njegovem mehanizmu sodelujejo ATP-aze tipa Walker (ParA). Te so sposobne interakcije z bakterijskim nukleoidom in v celici tvorijo dinamičen gradient. Interagirajo tudi s proteini ParB (CBP), ki nosijo plazmidni tovor in sledijo gradientu ParA. Predpostavljenih je bilo več modelov kako ParB sledijo gradientu ParA, vsi pa delujejo na osnovi principa Brownovega zobatega kolesa.

V prisotnosti ATP se ParA veže na DNA (ATP pri tem hidrolizira). V naslednjem koraku se na ParA veže ParB, ki je vezan na parS (nosi plazmid) in pri tem iz nukleoida izrine ParA. Ta oddifundia v citoplazmo, kjer čaka, da se nanj ponovno veže ATP. Ker pa je ta korak zelo počasen, začne na nukleoidu primanjkovati ParA. ParB se torej premika po nukleoidu in za seboj pušča ParA praznino – gibanje plazmida je zato usmerjano stran od nižje koncentracije ParA. Plazmida bi se po replikaciji tako ločila, če bi bila koncentracija ParA med njima najnižja.
Obstaja več različnih modelov mehanizma Brownovega zobatega kolesa, vsi temeljijo na asimetriji distribucije ParA na bakterijskem nukleoidu. Delovanje lahko povežemo s konceptom požganega mostu – ko se ParB s plazmidnim tovorom premakne po nukleoidu, na svoji poti iz nukleoida odstranjuje ParA in s tem 'požge most za seboj', saj se zaradi odsotnosti Par A ne more vrniti nazaj. Predlagane verzije se med seboj razlikujejo po tem, kako asimetrija razporeditve ParA ustvari energijo, potrebno za gibanje in v vlogi, ki je pripisana bakterijskemu kromosomu in ParA oligomerizaciji.

Vse ATPaze tipa I uporabljajo mehanizem Brownovega zobatega kolesa, vendar pa je relevanten model najverjetneje odvisen od različnih biokemijskih značilnosti in ravni ekspresije ParA in ParB. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/3928d857-a2ad-4de1-9c2b-e5caecb4e75b/assets/graphic/plas-0023-2014-fig5.gif Slika 3]

=Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici=
Dva različna plazmida, ki ne moreta stabilno obstajati v isti celici, sta nezdružljiva. Pri delitvah celice tako pride do izgube oziroma zmanjšanja števila vsaj enega od plazmidov, kar je posledica skupnih lastnosti nezdružljivih plazmidov. Do nezdružljivosti zaradi sorodnega načina razporejanja v celici pride tako pri razporejanju tipa 1 kot 2.

==Nezdružljivost pri ParA==
Če imamo v celici plazmid z visokim številom kopij in Par sistemom razporejanja, bo to onemogočilo stabilen soobstoj plazmida z enakim parA genom. Pretirano izražanje ParA, ki je prisoten v večih kopijah namreč povzroči, da se začneta plazmida ob delitvi naključno razporejati v hčerinske celice. Delež nezdružljivosti sovpada s koncentracijo ParA. Povečana koncentracija ParA destabilizira razporeditveni kompleks in mehanizem Brownovega zobatega kolesa, ki omogoča premikanje plazmidov po celici. Pri visoki koncentraciji ParA se praznine brez Par A lahko hitreje zapolnijo in tako onemogočijo gibanje plazmida po nukleoidu.

==Nezdružljivost pri ParB==
Analogno kot pri ParA dva plazmida, ki se razporejata s ParB, v isti celici nista stabilna, še posebej, če je eden od njiju plazmid z visokim številom kopij, saj je nezdružljivost odvisna od izražanja ParB. Previsoka koncentracija ParB najverjetneje povzroči koncentriranje plazmidov s parS genom v skupke in s tem zmanjša število plazmidov, ki se prosto gibljejo po celici. V tem primeru ParA ne more dovolj uspešno razdreti razporeditvenih kompleksov in sprostiti plazmidov, zato sčasoma pride do izgube enega od plazmidov. Hkrati so ugotovili, da lahko nekatere različice proteina, kot je ParBF, sprožijo rekombinacijo sorodnih plazmidov in tako povzročijo multimerizacijo. Multimer je plazmid, ki nastane s homologno rekombinacijo in vsebuje dve ponovitvi celotnega plazmidnega nukleotidnega zaporedja.

==Nezdružljivost pri enakih centromerih==
Če plazmida vsebujeta sorodno mesto za razporejanje, načeloma pride do nezdružljivosti. Vzrok ni povsem znan. Pri plazmidih z visokim številom kopij pride do naključnega razporejanja plazmidov, pri plazmidih, ki vsebujejo več parS mest pa tudi do zmanjšanega števila prostih ParB zaradi pretirane vezave na parS. Pri plazmidih z nizkim številom kopij opazimo zelo močno nezdružljivost, kjer je izguba števila plazmidov višja kot pri naključnem razporejanju. Eden od možnih vzrokov za to je pozna replikacija plazmidov. Če se eden od plazmidov podvoji ravno pred celično delitvijo, se kopiji namreč ne prerazporedita znotraj celice, ampak se obe dedujeta v isti hčerinski celici, kar privede do visoke izgube plazmidov.

=Regulacija izražanja par gena=
Izražanje par operonov direktno vpliva na stabilnost plazmidov in je v vseh primerih nadzorovano po principu avtoregulacije. Eden od proteinov par operona deluje kot represor, pogosto pa tudi eden od preostalih kot korepresor. V razporeditvenem sistemu tipa I so represorji ParA ATPaze, pri vseh ostalih sistemih pa proteini CBP. ParA represorji se z N-končnim delom s HTH (vijačnica-zavoj-vijačnica) motivom vežejo na DNA. Vezavno mesto ni povsem raziskano, vsebuje pa daljše obratne ponovitve, ki omogočijo vezavo ParA. Ta specifična vezava je mogoča ob vezavi ADP kot kofaktorja, pri vezavi ATP pa prevlada nespecifična vezava DNA, ki omogoči razporejanje plazmidov s pomočjo ParB.

=Zaključek=
Sistemi za razporejanje plazmidov so nujni za njihov obstoj in so kljub svoji preprostosti zelo natančno regulirani. Z dvema ključnima proteinoma in specifičnimi DNA zaporedji lahko predvsem plazmidi z manjšim številom kopij poskrbijo, da se ob delitvi uspešno dedujejo v obe hčerinski celici. Kljub široki uporabi plazmidnih vektorjev mnogi procesi, povezani z njihovim razporejanjem, še niso v celoti pojasnjeni. Raziskave v tej smeri bodo pripomogle k našemu razumevanju strukturne biologije in dinamike celotnega bakterijskega genoma.

=Viri=
Bouet, J.-Y.; Funnell, B. E. Plasmid Localization and Partition in Enterobacteriaceae. EcoSal Plus 2019, 8 (2), 10.1128/ecosalplus.ESP-0003–2019. https://doi.org/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019.

Schumacher, M. A. Bacterial Plasmid Partition Machinery: A Minimalist Approach to Survival. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012, 22 (1), 72–79. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2011.11.001.

Gerdes, K.; Møller-Jensen, J.; Jensen, R. B. Plasmid and Chromosome Partitioning: Surprises from Phylogeny. Mol. Microbiol. 2000, 37 (3), 455–466. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01975.x.

Baxter, J. C.; Funnell, B. E. Plasmid Partition Mechanisms. Microbiol. Spectr. 2014, 2 (6), 10.1128/microbiolspec.plas-0023–2014. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014.

Brooks, A. C.; Hwang, L. C. Reconstitutions of Plasmid Partition Systems and Their Mechanisms. Plasmid 2017, 91, 37–41. https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2017.03.004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Razporejanje plazmidov v hčerinski celici

2024-05-04T19:57:02Z

Brina Klinar: Undo revision 23306 by Brina Klinar (talk)

=Uvod=
Plazmidi živijo s svojo gostiteljsko celico v simbiozi. Razvili so kar nekaj strategij za obstoj znotraj bakterijske populacije med katerimi je razporeditveni sistem. Vsi razporeditveni sistemi so sestavljeni iz treh delov: ene ali več kopij razporeditvenega mesta (centromer), CBP (centromerni vezavni protein) in NTP-aze.
=Izračun izgube plazmida=
Plazmidi z majhnim kopirnim številom se morajo za svoj obstoj nanašati na razporeditveni sistem, plazmidi z visokim številom kopij pa se zanašajo na pasivno difuzijo.
Za naključno distribucijo velja: Ploss = 2^(1-n), kjer je »n« število kopij v celici.
=Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov=
Razporeditveni sistemi so nujni za transport in vzpostavitev sistema s plazmidno DNA. Poznamo 3 razporeditvene sisteme, ki se razlikujejo po tipu razporejanja z NTP-azo. Centromeri so značilna ohranjena zaporedja na plazmidu, ki služijo kot prepoznavna mesta za CBP. CBP prepozna zaporedje na plazmidu in se tako veže na centromer. To deluje kot most med plazmidom in ustrezno NTP-azo, ki omogoča premik plazmida.
Tip I ima Walker ATP-azo, ki ločuje plazmid s formacijo dinamičnega vzorca na bakterijskem nukleoidu. Tip II uporablja aktinu podobno ATP-azo, ki polimerizira v dinamične filamente, ki potiskajo plazmida narazen. Tip III ima tubulinu podobne GTP-aze, ki prav tako delujejo preko dinamične polimerizacije mehanizma.
Različni tipi so prikazani na [https://journals.asm.org/cms/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019/asset/0bc1138d-60c0-4e59-95c9-fdfec9718c8d/assets/graphic/esp-0003-2019_fig_004.gif sliki 1].
=Arhitektura=
CBP-ji se lahko na prepoznavno mesto vežejo v več kopijah in tako tvorijo razporeditvene komplekse,
katerih arhitektura je odvisna od tipa CBP. CBP tip I vsebuje motiv HTH2 in prepozna centromerno mesto parS, kamor se veže v več kopijah in gradi velike komplekse. To omogoča številne interakcije z ustrezno NTP-azo. CBP tip II (vsebuje RHH2 motiv) in tip III (vsebuje HTH2 motiv) tvorita podobne komplekse in sicer, oba tvorita vijačne, obročaste strukture in povzročita upogib DNA.
Vizualizacija plazmidnih dinamik v celici
==Tip I==
Najraje se nahajajo na četrtini ali polovici celice v majhnih in večjih celicah. V vseh primerih pa vpadajo z bakterijskimi nukleoidom. ParB in RHH2 so prisotni v velikih količinah znotraj celice in so kot žarišča, ki so odvisni od razporeditvenega mesta in korespondirajo na pozicijo plazmida. ParB iz F plazmidov so prisotni v skupkih v okolici F razporeditvenega mesta, parSF. Razporeditveni kompleksi plazmida F so najdeni znotraj večje mase nukleoida. ParA imajo oscilatorno vedenje, nekatere pa tvorijo dinamične gradiente.
==Tip II in III==
ParMR1 tvorijo dolge filamente. Plazmidi niso prisotni na obeh koncih ParM polimerov. Premik plazmidne DNA na nasproten pol celice žene ParM polimerizacija med sestrskima ParR-parC (R1 centromer) kompleksoma.
Tubulinu podobna GTP-aza iz Gram-pozitivnih bakterij tvori dinamične in citoskeletne filamente, kar nakazuje, da tip III deluje po filamentacijskem mehanizmu za razporejanje plazmidov znotraj celic.
Slikovna obdelava razporeditve in ločitve plazmidov z velikim številom kopij
Plazmidi naj bi sledili obliki ameriškega krofa. Prosto difundirajoči plazmidi so večinoma izven nukleoida v notranjem periferiju bakterije. Plazmidi z visokim kopirnim številom so v skupkih na polih celice in naključno razporejeni skozi celoten volumen celice z nižjo frekvenco znotraj nukleoida. To podpira model mešane distribucije, ki vključuje možnost nastajanja skupkov in naključno difuzijo individualnih plazmidov z visokim številom kopij.

=Mehanizmi razporeditve plazmidov=
Gonilo za razporeditev plazmidov predstavljajo ATP-aze in GTP-aze, ki zagotavljajo energijo za ustrezen premik plazmidov. Obstajata dva glavna razreda mehanizmov razporeditve plazmidov.
==Mehanizmi, ki vključujejo filamentacijo==
Po tem mehanizmu delujeta razporeditvena sistema tipa II in III.
===Razporeditveni sistem tipa II===
Razporeditvene ATP-aze tipa II (ParM) spadajo v razred aktinu podobnih proteinov. Te so sposobne polimerizacije in oblikovanja filamentov, ki potiskajo plazmida, pripeta na nasprotna konca filamenta, narazen (pri paličičastih bakterijah je to vzporedno z longitudinalno osjo celice).
Monomeri ParM polimerizirajo v prisotnosti ATP, pri čemer tvorijo levosučne dvojne vijačnice, ki so polarne (polarnost je posledica asimetrije monomerov, zato vsak filament vsebuje top in oster konec. ParR (CBP), ki je vezan na parC plazmida, se veže na topi konec filamenta in ustvari kapo, ki prepreči razgradnjo filamenta kljub hidrolizi ATP. Novi ParM-ATP monomeri se nato vstavljajo na topi konec skozi konkavni stik med ParR/parC. Ko filament raste, potiska plazmid na topem koncu in plazmid se premika po celici. Filamenti se urejajo v antiparalelne snope, kar pomeni, da so topi konci (mesta, kamor se veže plazmid) na obeh straneh snopa. Ko filamenti v snopu rastejo potiskajo plazmide, vezane na tope konce, na nasprotna pola celice. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (A in B)

===Razporeditveni sistem tipa III===
Razporeditveni sistem tipa III prav tako deluje na principu polimerizacije, ampak pri tem kot gonilno moč uporablja tubulinu podobne GTPaze (TubZ). Monomeri TubZ polimerizirajo v prisotnosti GTP in tvorijo dvo- in štirivijačne filamente, ki so stabilizirani z GTP kapo. TubZ filamenti so polarni, kar pomeni, da rastejo na + koncu in se razgrajajo na – koncu. Tja se veže tudi TubR (CBP), vezan na tubC. Ko polimer raste na + strani in se razgrajuje na – strani, mu razporeditveni kompleks sledi, kar se kaže v premikanju plazmida. Kako pa ta vleka plazmidov prispeva k ločitvi plazmidov še ni pojasnjeno, saj TubZ filamenti niso bipolarni (premikanje poteka le v eno smer). [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (C)

==Mehanizem po principu Brownovega zobatega kolesa==
Razporeditveni sistem tipa I, ki je pri bakterijah najbolj pogost, za razliko od drugih dveh tipov pa ne deluje na principu polimerizacije. Pri njegovem mehanizmu sodelujejo ATP-aze tipa Walker (ParA). Te so sposobne interakcije z bakterijskim nukleoidom in v celici tvorijo dinamičen gradient. Interagirajo tudi s proteini ParB (CBP), ki nosijo plazmidni tovor in sledijo gradientu ParA. Predpostavljenih je bilo več modelov kako ParB sledijo gradientu ParA, vsi pa delujejo na osnovi principa Brownovega zobatega kolesa.
V prisotnosti ATP se ParA veže na DNA (ATP pri tem hidrolizira). V naslednjem koraku se na ParA veže ParB, ki je vezan na parS (nosi plazmid) in pri tem iz nukleoida izrine ParA. Ta oddifundia v citoplazmo, kjer čaka, da se nanj ponovno veže ATP. Ker pa je ta korak zelo počasen, začne na nukleoidu primanjkovati ParA. ParB se torej premika po nukleoidu in za seboj pušča ParA praznino – gibanje plazmida je zato usmerjano stran od nižje koncentracije ParA. Plazmida bi se po replikaciji tako ločila, če bi bila koncentracija ParA med njima najnižja.
Obstaja več različnih modelov mehanizma Brownovega zobatega kolesa, vsi temeljijo na asimetriji distribucije ParA na bakterijskem nukleoidu. Delovanje lahko povežemo s konceptom požganega mostu – ko se ParB s plazmidnim tovorom premakne po nukleoidu, na svoji poti iz nukleoida odstranjuje ParA in s tem 'požge most za seboj', saj se zaradi odsotnosti Par A ne more vrniti nazaj. Predlagane verzije se med seboj razlikujejo po tem, kako asimetrija razporeditve ParA ustvari energijo, potrebno za gibanje in v vlogi, ki je pripisana bakterijskemu kromosomu in ParA oligomerizaciji.
Vse ATPaze tipa I uporabljajo mehanizem Brownovega zobatega kolesa, vendar pa je relevanten model najverjetneje odvisen od različnih biokemijskih značilnosti in ravni ekspresije ParA in ParB. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/3928d857-a2ad-4de1-9c2b-e5caecb4e75b/assets/graphic/plas-0023-2014-fig5.gif Slika 3]

=Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici=
Dva različna plazmida, ki ne moreta stabilno obstajati v isti celici, sta nezdružljiva. Pri delitvah celice tako pride do izgube oziroma zmanjšanja števila vsaj enega od plazmidov, kar je posledica skupnih lastnosti nezdružljivih plazmidov. Do nezdružljivosti zaradi sorodnega načina razporejanja v celici pride tako pri razporejanju tipa 1 kot 2.
==Nezdružljivost pri ParA==
Če imamo v celici plazmid z visokim številom kopij in Par sistemom razporejanja, bo to onemogočilo stabilen soobstoj plazmida z enakim parA genom. Pretirano izražanje ParA, ki je prisoten v večih kopijah namreč povzroči, da se začneta plazmida ob delitvi naključno razporejati v hčerinske celice. Delež nezdružljivosti sovpada s koncentracijo ParA. Povečana koncentracija ParA destabilizira razporeditveni kompleks in mehanizem Brownovega zobatega kolesa, ki omogoča premikanje plazmidov po celici. Pri visoki koncentraciji ParA se praznine brez Par A lahko hitreje zapolnijo in tako onemogočijo gibanje plazmida po nukleoidu.
==Nezdružljivost pri ParB==
Analogno kot pri ParA dva plazmida, ki se razporejata s ParB, v isti celici nista stabilna, še posebej, če je eden od njiju plazmid z visokim številom kopij, saj je nezdružljivost odvisna od izražanja ParB. Previsoka koncentracija ParB najverjetneje povzroči koncentriranje plazmidov s parS genom v skupke in s tem zmanjša število plazmidov, ki se prosto gibljejo po celici. V tem primeru ParA ne more dovolj uspešno razdreti razporeditvenih kompleksov in sprostiti plazmidov, zato sčasoma pride do izgube enega od plazmidov. Hkrati so ugotovili, da lahko nekatere različice proteina, kot je ParBF, sprožijo rekombinacijo sorodnih plazmidov in tako povzročijo multimerizacijo. Multimer je plazmid, ki nastane s homologno rekombinacijo in vsebuje dve ponovitvi celotnega plazmidnega nukleotidnega zaporedja.
Vir slike:[1]
==Nezdružljivost pri enakih centromerih==
Če plazmida vsebujeta sorodno mesto za razporejanje, načeloma pride do nezdružljivosti. Vzrok ni povsem znan. Pri plazmidih z visokim številom kopij pride do naključnega razporejanja plazmidov, pri plazmidih, ki vsebujejo več parS mest pa tudi do zmanjšanega števila prostih ParB zaradi pretirane vezave na parS. Pri plazmidih z nizkim številom kopij opazimo zelo močno nezdružljivost, kjer je izguba števila plazmidov višja kot pri naključnem razporejanju. Eden od možnih vzrokov za to je pozna replikacija plazmidov. Če se eden od plazmidov podvoji ravno pred celično delitvijo, se kopiji namreč ne prerazporedita znotraj celice, ampak se obe dedujeta v isti hčerinski celici, kar privede do visoke izgube plazmidov.
Vir slike: [2]
=Regulacija izražanja par gena=
Izražanje par operonov direktno vpliva na stabilnost plazmidov in je v vseh primerih nadzorovano po principu avtoregulacije. Eden od proteinov par operona deluje kot represor, pogosto pa tudi eden od preostalih kot korepresor. V razporeditvenem sistemu tipa I so represorji ParA ATPaze, pri vseh ostalih sistemih pa proteini CBP. ParA represorji se z N-končnim delom s HTH (vijačnica-zavoj-vijačnica) motivom vežejo na DNA. Vezavno mesto ni povsem raziskano, vsebuje pa daljše obratne ponovitve, ki omogočijo vezavo ParA. Ta specifična vezava je mogoča ob vezavi ADP kot kofaktorja, pri vezavi ATP pa prevlada nespecifična vezava DNA, ki omogoči razporejanje plazmidov s pomočjo ParB.
=Zaključek=
Sistemi za razporejanje plazmidov so nujni za njihov obstoj in so kljub svoji preprostosti zelo natančno regulirani. Z dvema ključnima proteinoma in specifičnimi DNA zaporedji lahko predvsem plazmidi z manjšim številom kopij poskrbijo, da se ob delitvi uspešno dedujejo v obe hčerinski celici. Kljub široki uporabi plazmidnih vektorjev mnogi procesi, povezani z njihovim razporejanjem, še niso v celoti pojasnjeni. Raziskave v tej smeri bodo pripomogle k našemu razumevanju strukturne biologije in dinamike celotnega bakterijskega genoma.

=Viri=
Bouet, J.-Y.; Funnell, B. E. Plasmid Localization and Partition in Enterobacteriaceae. EcoSal Plus 2019, 8 (2), 10.1128/ecosalplus.ESP-0003–2019. https://doi.org/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019.
Schumacher, M. A. Bacterial Plasmid Partition Machinery: A Minimalist Approach to Survival. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012, 22 (1), 72–79. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2011.11.001.
Gerdes, K.; Møller-Jensen, J.; Jensen, R. B. Plasmid and Chromosome Partitioning: Surprises from Phylogeny. Mol. Microbiol. 2000, 37 (3), 455–466. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01975.x.
Baxter, J. C.; Funnell, B. E. Plasmid Partition Mechanisms. Microbiol. Spectr. 2014, 2 (6), 10.1128/microbiolspec.plas-0023–2014. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014.
Møller‐Jensen, J.; Jensen, R. B.; Löwe, J.; Gerdes, K. Prokaryotic DNA Segregation by an Actin‐like Filament. EMBO J. 2002, 21 (12), 3119–3127. https://doi.org/10.1093/emboj/cdf320.
(11) Brooks, A. C.; Hwang, L. C. Reconstitutions of Plasmid Partition Systems and Their Mechanisms. Plasmid 2017, 91, 37–41. https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2017.03.004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Razporejanje plazmidov v hčerinski celici

2024-05-04T19:56:46Z

Brina Klinar: Undo revision 23307 by Brina Klinar (talk)

=Uvod=
Plazmidi živijo s svojo gostiteljsko celico v simbiozi. Razvili so kar nekaj strategij za obstoj znotraj bakterijske populacije med katerimi je razporeditveni sistem. Vsi razporeditveni sistemi so sestavljeni iz treh delov: ene ali več kopij razporeditvenega mesta (centromer), CBP (centromerni vezavni protein) in NTP-aze.
=Izračun izgube plazmida=
Plazmidi z majhnim kopirnim številom se morajo za svoj obstoj nanašati na razporeditveni sistem, plazmidi z visokim številom kopij pa se zanašajo na pasivno difuzijo.
Za naključno distribucijo velja: Ploss = 2^(1-n), kjer je »n« število kopij v celici.
=Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov=
Razporeditveni sistemi so nujni za transport in vzpostavitev sistema s plazmidno DNA. Poznamo 3 razporeditvene sisteme, ki se razlikujejo po tipu razporejanja z NTP-azo. Centromeri so značilna ohranjena zaporedja na plazmidu, ki služijo kot prepoznavna mesta za CBP. CBP prepozna zaporedje na plazmidu in se tako veže na centromer. To deluje kot most med plazmidom in ustrezno NTP-azo, ki omogoča premik plazmida.
Tip I ima Walker ATP-azo, ki ločuje plazmid s formacijo dinamičnega vzorca na bakterijskem nukleoidu. Tip II uporablja aktinu podobno ATP-azo, ki polimerizira v dinamične filamente, ki potiskajo plazmida narazen. Tip III ima tubulinu podobne GTP-aze, ki prav tako delujejo preko dinamične polimerizacije mehanizma.
Različni tipi so prikazani na [https://journals.asm.org/cms/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019/asset/0bc1138d-60c0-4e59-95c9-fdfec9718c8d/assets/graphic/esp-0003-2019_fig_004.gif sliki 1].
=Arhitektura=
CBP-ji se lahko na prepoznavno mesto vežejo v več kopijah in tako tvorijo razporeditvene komplekse, katerih arhitektura je odvisna od tipa CBP. CBP tip I vsebuje motiv HTH2 in prepozna centromerno mesto parS, kamor se veže v več kopijah in gradi velike komplekse. To omogoča številne interakcije z ustrezno NTP-azo. CBP tip II (vsebuje RHH2 motiv) in tip III (vsebuje HTH2 motiv) tvorita podobne komplekse in sicer, oba tvorita vijačne, obročaste strukture in povzročita upogib DNA.
=Vizualizacija plazmidnih dinamik v celici=
==Tip I==
Najraje se nahajajo na četrtini ali polovici celice v majhnih in večjih celicah. V vseh primerih pa vpadajo z bakterijskimi nukleoidom. ParB in RHH2 so prisotni v velikih količinah znotraj celice in so kot žarišča, ki so odvisni od razporeditvenega mesta in korespondirajo na pozicijo plazmida. ParB iz F plazmidov so prisotni v skupkih v okolici F razporeditvenega mesta, parSF. Razporeditveni kompleksi plazmida F so najdeni znotraj večje mase nukleoida. ParA imajo oscilatorno vedenje, nekatere pa tvorijo dinamične gradiente.
==Tip II in III==
ParMR1 tvorijo dolge filamente. Plazmidi niso prisotni na obeh koncih ParM polimerov. Premik plazmidne DNA na nasproten pol celice žene ParM polimerizacija med sestrskima ParR-parC (R1 centromer) kompleksoma.
Tubulinu podobna GTP-aza iz Gram-pozitivnih bakterij tvori dinamične in citoskeletne filamente, kar nakazuje, da tip III deluje po filamentacijskem mehanizmu za razporejanje plazmidov znotraj celic.
Slikovna obdelava razporeditve in ločitve plazmidov z velikim številom kopij
Plazmidi naj bi sledili obliki ameriškega krofa. Prosto difundirajoči plazmidi so večinoma izven nukleoida v notranjem periferiju bakterije. Plazmidi z visokim kopirnim številom so v skupkih na polih celice in naključno razporejeni skozi celoten volumen celice z nižjo frekvenco znotraj nukleoida. To podpira model mešane distribucije, ki vključuje možnost nastajanja skupkov in naključno difuzijo individualnih plazmidov z visokim številom kopij.

=Mehanizmi razporeditve plazmidov=
Gonilo za razporeditev plazmidov predstavljajo ATP-aze in GTP-aze, ki zagotavljajo energijo za ustrezen premik plazmidov. Obstajata dva glavna razreda mehanizmov razporeditve plazmidov.
==Mehanizmi, ki vključujejo filamentacijo==
Po tem mehanizmu delujeta razporeditvena sistema tipa II in III.
===Razporeditveni sistem tipa II===
Razporeditvene ATP-aze tipa II (ParM) spadajo v razred aktinu podobnih proteinov. Te so sposobne polimerizacije in oblikovanja filamentov, ki potiskajo plazmida, pripeta na nasprotna konca filamenta, narazen (pri paličičastih bakterijah je to vzporedno z longitudinalno osjo celice).
Monomeri ParM polimerizirajo v prisotnosti ATP, pri čemer tvorijo levosučne dvojne vijačnice, ki so polarne (polarnost je posledica asimetrije monomerov, zato vsak filament vsebuje top in oster konec. ParR (CBP), ki je vezan na parC plazmida, se veže na topi konec filamenta in ustvari kapo, ki prepreči razgradnjo filamenta kljub hidrolizi ATP. Novi ParM-ATP monomeri se nato vstavljajo na topi konec skozi konkavni stik med ParR/parC. Ko filament raste, potiska plazmid na topem koncu in plazmid se premika po celici. Filamenti se urejajo v antiparalelne snope, kar pomeni, da so topi konci (mesta, kamor se veže plazmid) na obeh straneh snopa. Ko filamenti v snopu rastejo potiskajo plazmide, vezane na tope konce, na nasprotna pola celice. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (A in B)

===Razporeditveni sistem tipa III===
Razporeditveni sistem tipa III prav tako deluje na principu polimerizacije, ampak pri tem kot gonilno moč uporablja tubulinu podobne GTPaze (TubZ). Monomeri TubZ polimerizirajo v prisotnosti GTP in tvorijo dvo- in štirivijačne filamente, ki so stabilizirani z GTP kapo. TubZ filamenti so polarni, kar pomeni, da rastejo na + koncu in se razgrajajo na – koncu. Tja se veže tudi TubR (CBP), vezan na tubC. Ko polimer raste na + strani in se razgrajuje na – strani, mu razporeditveni kompleks sledi, kar se kaže v premikanju plazmida. Kako pa ta vleka plazmidov prispeva k ločitvi plazmidov še ni pojasnjeno, saj TubZ filamenti niso bipolarni (premikanje poteka le v eno smer). [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (C)

==Mehanizem po principu Brownovega zobatega kolesa==
Razporeditveni sistem tipa I, ki je pri bakterijah najbolj pogost, za razliko od drugih dveh tipov pa ne deluje na principu polimerizacije. Pri njegovem mehanizmu sodelujejo ATP-aze tipa Walker (ParA). Te so sposobne interakcije z bakterijskim nukleoidom in v celici tvorijo dinamičen gradient. Interagirajo tudi s proteini ParB (CBP), ki nosijo plazmidni tovor in sledijo gradientu ParA. Predpostavljenih je bilo več modelov kako ParB sledijo gradientu ParA, vsi pa delujejo na osnovi principa Brownovega zobatega kolesa. 
V prisotnosti ATP se ParA veže na DNA (ATP pri tem hidrolizira). V naslednjem koraku se na ParA veže ParB, ki je vezan na parS (nosi plazmid) in pri tem iz nukleoida izrine ParA. Ta oddifundia v citoplazmo, kjer čaka, da se nanj ponovno veže ATP. Ker pa je ta korak zelo počasen, začne na nukleoidu primanjkovati ParA. ParB se torej premika po nukleoidu in za seboj pušča ParA praznino – gibanje plazmida je zato usmerjano stran od nižje koncentracije ParA. Plazmida bi se po replikaciji tako ločila, če bi bila koncentracija ParA med njima najnižja. 
Obstaja več različnih modelov mehanizma Brownovega zobatega kolesa, vsi temeljijo na asimetriji distribucije ParA na bakterijskem nukleoidu. Delovanje lahko povežemo s konceptom požganega mostu – ko se ParB s plazmidnim tovorom premakne po nukleoidu, na svoji poti iz nukleoida odstranjuje ParA in s tem 'požge most za seboj', saj se zaradi odsotnosti Par A ne more vrniti nazaj. Predlagane verzije se med seboj razlikujejo po tem, kako asimetrija razporeditve ParA ustvari energijo, potrebno za gibanje in v vlogi, ki je pripisana bakterijskemu kromosomu in ParA oligomerizaciji. 
Vse ATPaze tipa I uporabljajo mehanizem Brownovega zobatega kolesa, vendar pa je relevanten model najverjetneje odvisen od različnih biokemijskih značilnosti in ravni ekspresije ParA in ParB. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/3928d857-a2ad-4de1-9c2b-e5caecb4e75b/assets/graphic/plas-0023-2014-fig5.gif Slika 3]

=Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici=
Dva različna plazmida, ki ne moreta stabilno obstajati v isti celici, sta nezdružljiva. Pri delitvah celice tako pride do izgube oziroma zmanjšanja števila vsaj enega od plazmidov, kar je posledica skupnih lastnosti nezdružljivih plazmidov. Do nezdružljivosti zaradi sorodnega načina razporejanja v celici pride tako pri razporejanju tipa 1 kot 2.
==Nezdružljivost pri ParA==
Če imamo v celici plazmid z visokim številom kopij in Par sistemom razporejanja, bo to onemogočilo stabilen soobstoj plazmida z enakim parA genom. Pretirano izražanje ParA, ki je prisoten v večih kopijah namreč povzroči, da se začneta plazmida ob delitvi naključno razporejati v hčerinske celice. Delež nezdružljivosti sovpada s koncentracijo ParA. Povečana koncentracija ParA destabilizira razporeditveni kompleks in mehanizem Brownovega zobatega kolesa, ki omogoča premikanje plazmidov po celici. Pri visoki koncentraciji ParA se praznine brez Par A lahko hitreje zapolnijo in tako onemogočijo gibanje plazmida po nukleoidu.
==Nezdružljivost pri ParB==
Analogno kot pri ParA dva plazmida, ki se razporejata s ParB, v isti celici nista stabilna, še posebej, če je eden od njiju plazmid z visokim številom kopij, saj je nezdružljivost odvisna od izražanja ParB. Previsoka koncentracija ParB najverjetneje povzroči koncentriranje plazmidov s parS genom v skupke in s tem zmanjša število plazmidov, ki se prosto gibljejo po celici. V tem primeru ParA ne more dovolj uspešno razdreti razporeditvenih kompleksov in sprostiti plazmidov, zato sčasoma pride do izgube enega od plazmidov. Hkrati so ugotovili, da lahko nekatere različice proteina, kot je ParBF, sprožijo rekombinacijo sorodnih plazmidov in tako povzročijo multimerizacijo. Multimer je plazmid, ki nastane s homologno rekombinacijo in vsebuje dve ponovitvi celotnega plazmidnega nukleotidnega zaporedja.
Vir slike:[1]
==Nezdružljivost pri enakih centromerih==
Če plazmida vsebujeta sorodno mesto za razporejanje, načeloma pride do nezdružljivosti. Vzrok ni povsem znan. Pri plazmidih z visokim številom kopij pride do naključnega razporejanja plazmidov, pri plazmidih, ki vsebujejo več parS mest pa tudi do zmanjšanega števila prostih ParB zaradi pretirane vezave na parS. Pri plazmidih z nizkim številom kopij opazimo zelo močno nezdružljivost, kjer je izguba števila plazmidov višja kot pri naključnem razporejanju. Eden od možnih vzrokov za to je pozna replikacija plazmidov. Če se eden od plazmidov podvoji ravno pred celično delitvijo, se kopiji namreč ne prerazporedita znotraj celice, ampak se obe dedujeta v isti hčerinski celici, kar privede do visoke izgube plazmidov.
Vir slike: [2]
=Regulacija izražanja par gena=
Izražanje par operonov direktno vpliva na stabilnost plazmidov in je v vseh primerih nadzorovano po principu avtoregulacije. Eden od proteinov par operona deluje kot represor, pogosto pa tudi eden od preostalih kot korepresor. V razporeditvenem sistemu tipa I so represorji ParA ATPaze, pri vseh ostalih sistemih pa proteini CBP. ParA represorji se z N-končnim delom s HTH (vijačnica-zavoj-vijačnica) motivom vežejo na DNA. Vezavno mesto ni povsem raziskano, vsebuje pa daljše obratne ponovitve, ki omogočijo vezavo ParA. Ta specifična vezava je mogoča ob vezavi ADP kot kofaktorja, pri vezavi ATP pa prevlada nespecifična vezava DNA, ki omogoči razporejanje plazmidov s pomočjo ParB.
=Zaključek=
Sistemi za razporejanje plazmidov so nujni za njihov obstoj in so kljub svoji preprostosti zelo natančno regulirani. Z dvema ključnima proteinoma in specifičnimi DNA zaporedji lahko predvsem plazmidi z manjšim številom kopij poskrbijo, da se ob delitvi uspešno dedujejo v obe hčerinski celici. Kljub široki uporabi plazmidnih vektorjev mnogi procesi, povezani z njihovim razporejanjem, še niso v celoti pojasnjeni. Raziskave v tej smeri bodo pripomogle k našemu razumevanju strukturne biologije in dinamike celotnega bakterijskega genoma.

=Viri=
Bouet, J.-Y.; Funnell, B. E. Plasmid Localization and Partition in Enterobacteriaceae. EcoSal Plus 2019, 8 (2), 10.1128/ecosalplus.ESP-0003–2019. https://doi.org/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019.
Schumacher, M. A. Bacterial Plasmid Partition Machinery: A Minimalist Approach to Survival. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012, 22 (1), 72–79. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2011.11.001.
Gerdes, K.; Møller-Jensen, J.; Jensen, R. B. Plasmid and Chromosome Partitioning: Surprises from Phylogeny. Mol. Microbiol. 2000, 37 (3), 455–466. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01975.x.
Baxter, J. C.; Funnell, B. E. Plasmid Partition Mechanisms. Microbiol. Spectr. 2014, 2 (6), 10.1128/microbiolspec.plas-0023–2014. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014.
Møller‐Jensen, J.; Jensen, R. B.; Löwe, J.; Gerdes, K. Prokaryotic DNA Segregation by an Actin‐like Filament. EMBO J. 2002, 21 (12), 3119–3127. https://doi.org/10.1093/emboj/cdf320.
(11) Brooks, A. C.; Hwang, L. C. Reconstitutions of Plasmid Partition Systems and Their Mechanisms. Plasmid 2017, 91, 37–41. https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2017.03.004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Razporejanje plazmidov v hčerinski celici

2024-05-04T19:54:37Z

Brina Klinar:

=Uvod=
Plazmidi živijo s svojo gostiteljsko celico v simbiozi. Razvili so kar nekaj strategij za obstoj znotraj bakterijske populacije med katerimi je razporeditveni sistem. Vsi razporeditveni sistemi so sestavljeni iz treh delov: ene ali več kopij razporeditvenega mesta (centromer), CBP (centromerni vezavni protein) in NTP-aze.
=Izračun izgube plazmida=
Plazmidi z majhnim kopirnim številom se morajo za svoj obstoj nanašati na razporeditveni sistem, plazmidi z visokim številom kopij pa se zanašajo na pasivno difuzijo.
Za naključno distribucijo velja: Ploss = 2^(1-n), kjer je »n« število kopij v celici.
=Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov=
Razporeditveni sistemi so nujni za transport in vzpostavitev sistema s plazmidno DNA. Poznamo 3 razporeditvene sisteme, ki se razlikujejo po tipu razporejanja z NTP-azo. Centromeri so značilna ohranjena zaporedja na plazmidu, ki služijo kot prepoznavna mesta za CBP. CBP prepozna zaporedje na plazmidu in se tako veže na centromer. To deluje kot most med plazmidom in ustrezno NTP-azo, ki omogoča premik plazmida.
Tip I ima Walker ATP-azo, ki ločuje plazmid s formacijo dinamičnega vzorca na bakterijskem nukleoidu. Tip II uporablja aktinu podobno ATP-azo, ki polimerizira v dinamične filamente, ki potiskajo plazmida narazen. Tip III ima tubulinu podobne GTP-aze, ki prav tako delujejo preko dinamične polimerizacije mehanizma.
Različni tipi so prikazani na [https://journals.asm.org/cms/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019/asset/0bc1138d-60c0-4e59-95c9-fdfec9718c8d/assets/graphic/esp-0003-2019_fig_004.gif sliki 1].
=Arhitektura=
CBP-ji se lahko na prepoznavno mesto vežejo v več kopijah in tako tvorijo razporeditvene komplekse, katerih arhitektura je odvisna od tipa CBP. CBP tip I vsebuje motiv HTH2 in prepozna centromerno mesto parS, kamor se veže v več kopijah in gradi velike komplekse. To omogoča številne interakcije z ustrezno NTP-azo. CBP tip II (vsebuje RHH2 motiv) in tip III (vsebuje HTH2 motiv) tvorita podobne komplekse in sicer, oba tvorita vijačne, obročaste strukture in povzročita upogib DNA.
=Vizualizacija plazmidnih dinamik v celici=
==Tip I==
Najraje se nahajajo na četrtini ali polovici celice v majhnih in večjih celicah. V vseh primerih pa vpadajo z bakterijskimi nukleoidom. ParB in RHH2 so prisotni v velikih količinah znotraj celice in so kot žarišča, ki so odvisni od razporeditvenega mesta in korespondirajo na pozicijo plazmida. ParB iz F plazmidov so prisotni v skupkih v okolici F razporeditvenega mesta, parSF. Razporeditveni kompleksi plazmida F so najdeni znotraj večje mase nukleoida. ParA imajo oscilatorno vedenje, nekatere pa tvorijo dinamične gradiente.
==Tip II in III==
ParMR1 tvorijo dolge filamente. Plazmidi niso prisotni na obeh koncih ParM polimerov. Premik plazmidne DNA na nasproten pol celice žene ParM polimerizacija med sestrskima ParR-parC (R1 centromer) kompleksoma.
Tubulinu podobna GTP-aza iz Gram-pozitivnih bakterij tvori dinamične in citoskeletne filamente, kar nakazuje, da tip III deluje po filamentacijskem mehanizmu za razporejanje plazmidov znotraj celic.
Slikovna obdelava razporeditve in ločitve plazmidov z velikim številom kopij
Plazmidi naj bi sledili obliki ameriškega krofa. Prosto difundirajoči plazmidi so večinoma izven nukleoida v notranjem periferiju bakterije. Plazmidi z visokim kopirnim številom so v skupkih na polih celice in naključno razporejeni skozi celoten volumen celice z nižjo frekvenco znotraj nukleoida. To podpira model mešane distribucije, ki vključuje možnost nastajanja skupkov in naključno difuzijo individualnih plazmidov z visokim številom kopij.

=Mehanizmi razporeditve plazmidov=
Gonilo za razporeditev plazmidov predstavljajo ATP-aze in GTP-aze, ki zagotavljajo energijo za ustrezen premik plazmidov. Obstajata dva glavna razreda mehanizmov razporeditve plazmidov.
==Mehanizmi, ki vključujejo filamentacijo==
Po tem mehanizmu delujeta razporeditvena sistema tipa II in III.
===Razporeditveni sistem tipa II===
Razporeditvene ATP-aze tipa II (ParM) spadajo v razred aktinu podobnih proteinov. Te so sposobne polimerizacije in oblikovanja filamentov, ki potiskajo plazmida, pripeta na nasprotna konca filamenta, narazen (pri paličičastih bakterijah je to vzporedno z longitudinalno osjo celice).
Monomeri ParM polimerizirajo v prisotnosti ATP, pri čemer tvorijo levosučne dvojne vijačnice, ki so polarne (polarnost je posledica asimetrije monomerov, zato vsak filament vsebuje top in oster konec. ParR (CBP), ki je vezan na parC plazmida, se veže na topi konec filamenta in ustvari kapo, ki prepreči razgradnjo filamenta kljub hidrolizi ATP. Novi ParM-ATP monomeri se nato vstavljajo na topi konec skozi konkavni stik med ParR/parC. Ko filament raste, potiska plazmid na topem koncu in plazmid se premika po celici. Filamenti se urejajo v antiparalelne snope, kar pomeni, da so topi konci (mesta, kamor se veže plazmid) na obeh straneh snopa. Ko filamenti v snopu rastejo potiskajo plazmide, vezane na tope konce, na nasprotna pola celice. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (A in B)

===Razporeditveni sistem tipa III===
Razporeditveni sistem tipa III prav tako deluje na principu polimerizacije, ampak pri tem kot gonilno moč uporablja tubulinu podobne GTPaze (TubZ). Monomeri TubZ polimerizirajo v prisotnosti GTP in tvorijo dvo- in štirivijačne filamente, ki so stabilizirani z GTP kapo. TubZ filamenti so polarni, kar pomeni, da rastejo na + koncu in se razgrajajo na – koncu. Tja se veže tudi TubR (CBP), vezan na tubC. Ko polimer raste na + strani in se razgrajuje na – strani, mu razporeditveni kompleks sledi, kar se kaže v premikanju plazmida. Kako pa ta vleka plazmidov prispeva k ločitvi plazmidov še ni pojasnjeno, saj TubZ filamenti niso bipolarni (premikanje poteka le v eno smer). [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (C)

==Mehanizem po principu Brownovega zobatega kolesa==
Razporeditveni sistem tipa I, ki je pri bakterijah najbolj pogost, za razliko od drugih dveh tipov pa ne deluje na principu polimerizacije. Pri njegovem mehanizmu sodelujejo ATP-aze tipa Walker (ParA). Te so sposobne interakcije z bakterijskim nukleoidom in v celici tvorijo dinamičen gradient. Interagirajo tudi s proteini ParB (CBP), ki nosijo plazmidni tovor in sledijo gradientu ParA. Predpostavljenih je bilo več modelov kako ParB sledijo gradientu ParA, vsi pa delujejo na osnovi principa Brownovega zobatega kolesa.
V prisotnosti ATP se ParA veže na DNA (ATP pri tem hidrolizira). V naslednjem koraku se na ParA veže ParB, ki je vezan na parS (nosi plazmid) in pri tem iz nukleoida izrine ParA. Ta oddifundia v citoplazmo, kjer čaka, da se nanj ponovno veže ATP. Ker pa je ta korak zelo počasen, začne na nukleoidu primanjkovati ParA. ParB se torej premika po nukleoidu in za seboj pušča ParA praznino – gibanje plazmida je zato usmerjano stran od nižje koncentracije ParA. Plazmida bi se po replikaciji tako ločila, če bi bila koncentracija ParA med njima najnižja. 
Obstaja več različnih modelov mehanizma Brownovega zobatega kolesa, vsi temeljijo na asimetriji distribucije ParA na bakterijskem nukleoidu. Delovanje lahko povežemo s konceptom požganega mostu – ko se ParB s plazmidnim tovorom premakne po nukleoidu, na svoji poti iz nukleoida odstranjuje ParA in s tem 'požge most za seboj', saj se zaradi odsotnosti Par A ne more vrniti nazaj. Predlagane verzije se med seboj razlikujejo po tem, kako asimetrija razporeditve ParA ustvari energijo, potrebno za gibanje in v vlogi, ki je pripisana bakterijskemu kromosomu in ParA oligomerizaciji.
Vse ATPaze tipa I uporabljajo mehanizem Brownovega zobatega kolesa, vendar pa je relevanten model najverjetneje odvisen od različnih biokemijskih značilnosti in ravni ekspresije ParA in ParB. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/3928d857-a2ad-4de1-9c2b-e5caecb4e75b/assets/graphic/plas-0023-2014-fig5.gif Slika 3]

=Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici=
Dva različna plazmida, ki ne moreta stabilno obstajati v isti celici, sta nezdružljiva. Pri delitvah celice tako pride do izgube oziroma zmanjšanja števila vsaj enega od plazmidov, kar je posledica skupnih lastnosti nezdružljivih plazmidov. Do nezdružljivosti zaradi sorodnega načina razporejanja v celici pride tako pri razporejanju tipa 1 kot 2.
==Nezdružljivost pri ParA==
Če imamo v celici plazmid z visokim številom kopij in Par sistemom razporejanja, bo to onemogočilo stabilen soobstoj plazmida z enakim parA genom. Pretirano izražanje ParA, ki je prisoten v večih kopijah namreč povzroči, da se začneta plazmida ob delitvi naključno razporejati v hčerinske celice. Delež nezdružljivosti sovpada s koncentracijo ParA. Povečana koncentracija ParA destabilizira razporeditveni kompleks in mehanizem Brownovega zobatega kolesa, ki omogoča premikanje plazmidov po celici. Pri visoki koncentraciji ParA se praznine brez Par A lahko hitreje zapolnijo in tako onemogočijo gibanje plazmida po nukleoidu.
==Nezdružljivost pri ParB==
Analogno kot pri ParA dva plazmida, ki se razporejata s ParB, v isti celici nista stabilna, še posebej, če je eden od njiju plazmid z visokim številom kopij, saj je nezdružljivost odvisna od izražanja ParB. Previsoka koncentracija ParB najverjetneje povzroči koncentriranje plazmidov s parS genom v skupke in s tem zmanjša število plazmidov, ki se prosto gibljejo po celici. V tem primeru ParA ne more dovolj uspešno razdreti razporeditvenih kompleksov in sprostiti plazmidov, zato sčasoma pride do izgube enega od plazmidov. Hkrati so ugotovili, da lahko nekatere različice proteina, kot je ParBF, sprožijo rekombinacijo sorodnih plazmidov in tako povzročijo multimerizacijo. Multimer je plazmid, ki nastane s homologno rekombinacijo in vsebuje dve ponovitvi celotnega plazmidnega nukleotidnega zaporedja.
Vir slike:[1]
==Nezdružljivost pri enakih centromerih==
Če plazmida vsebujeta sorodno mesto za razporejanje, načeloma pride do nezdružljivosti. Vzrok ni povsem znan. Pri plazmidih z visokim številom kopij pride do naključnega razporejanja plazmidov, pri plazmidih, ki vsebujejo več parS mest pa tudi do zmanjšanega števila prostih ParB zaradi pretirane vezave na parS. Pri plazmidih z nizkim številom kopij opazimo zelo močno nezdružljivost, kjer je izguba števila plazmidov višja kot pri naključnem razporejanju. Eden od možnih vzrokov za to je pozna replikacija plazmidov. Če se eden od plazmidov podvoji ravno pred celično delitvijo, se kopiji namreč ne prerazporedita znotraj celice, ampak se obe dedujeta v isti hčerinski celici, kar privede do visoke izgube plazmidov.
Vir slike: [2]
=Regulacija izražanja par gena=
Izražanje par operonov direktno vpliva na stabilnost plazmidov in je v vseh primerih nadzorovano po principu avtoregulacije. Eden od proteinov par operona deluje kot represor, pogosto pa tudi eden od preostalih kot korepresor. V razporeditvenem sistemu tipa I so represorji ParA ATPaze, pri vseh ostalih sistemih pa proteini CBP. ParA represorji se z N-končnim delom s HTH (vijačnica-zavoj-vijačnica) motivom vežejo na DNA. Vezavno mesto ni povsem raziskano, vsebuje pa daljše obratne ponovitve, ki omogočijo vezavo ParA. Ta specifična vezava je mogoča ob vezavi ADP kot kofaktorja, pri vezavi ATP pa prevlada nespecifična vezava DNA, ki omogoči razporejanje plazmidov s pomočjo ParB.
=Zaključek=
Sistemi za razporejanje plazmidov so nujni za njihov obstoj in so kljub svoji preprostosti zelo natančno regulirani. Z dvema ključnima proteinoma in specifičnimi DNA zaporedji lahko predvsem plazmidi z manjšim številom kopij poskrbijo, da se ob delitvi uspešno dedujejo v obe hčerinski celici. Kljub široki uporabi plazmidnih vektorjev mnogi procesi, povezani z njihovim razporejanjem, še niso v celoti pojasnjeni. Raziskave v tej smeri bodo pripomogle k našemu razumevanju strukturne biologije in dinamike celotnega bakterijskega genoma.

=Viri=
Bouet, J.-Y.; Funnell, B. E. Plasmid Localization and Partition in Enterobacteriaceae. EcoSal Plus 2019, 8 (2), 10.1128/ecosalplus.ESP-0003–2019. https://doi.org/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019.
Schumacher, M. A. Bacterial Plasmid Partition Machinery: A Minimalist Approach to Survival. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012, 22 (1), 72–79. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2011.11.001.
Gerdes, K.; Møller-Jensen, J.; Jensen, R. B. Plasmid and Chromosome Partitioning: Surprises from Phylogeny. Mol. Microbiol. 2000, 37 (3), 455–466. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01975.x.
Baxter, J. C.; Funnell, B. E. Plasmid Partition Mechanisms. Microbiol. Spectr. 2014, 2 (6), 10.1128/microbiolspec.plas-0023–2014. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014.
Møller‐Jensen, J.; Jensen, R. B.; Löwe, J.; Gerdes, K. Prokaryotic DNA Segregation by an Actin‐like Filament. EMBO J. 2002, 21 (12), 3119–3127. https://doi.org/10.1093/emboj/cdf320.
(11) Brooks, A. C.; Hwang, L. C. Reconstitutions of Plasmid Partition Systems and Their Mechanisms. Plasmid 2017, 91, 37–41. https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2017.03.004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Razporejanje plazmidov v hčerinski celici

2024-05-04T19:52:58Z

Brina Klinar:

=Uvod=
Plazmidi živijo s svojo gostiteljsko celico v simbiozi. Razvili so kar nekaj strategij za obstoj znotraj bakterijske populacije med katerimi je razporeditveni sistem. Vsi razporeditveni sistemi so sestavljeni iz treh delov: ene ali več kopij razporeditvenega mesta (centromer), CBP (centromerni vezavni protein) in NTP-aze.
=Izračun izgube plazmida=
Plazmidi z majhnim kopirnim številom se morajo za svoj obstoj nanašati na razporeditveni sistem, plazmidi z visokim številom kopij pa se zanašajo na pasivno difuzijo.
Za naključno distribucijo velja: Ploss = 2^(1-n), kjer je »n« število kopij v celici.
=Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov=
Razporeditveni sistemi so nujni za transport in vzpostavitev sistema s plazmidno DNA. Poznamo 3 razporeditvene sisteme, ki se razlikujejo po tipu razporejanja z NTP-azo. Centromeri so značilna ohranjena zaporedja na plazmidu, ki služijo kot prepoznavna mesta za CBP. CBP prepozna zaporedje na plazmidu in se tako veže na centromer. To deluje kot most med plazmidom in ustrezno NTP-azo, ki omogoča premik plazmida.
Tip I ima Walker ATP-azo, ki ločuje plazmid s formacijo dinamičnega vzorca na bakterijskem nukleoidu. Tip II uporablja aktinu podobno ATP-azo, ki polimerizira v dinamične filamente, ki potiskajo plazmida narazen. Tip III ima tubulinu podobne GTP-aze, ki prav tako delujejo preko dinamične polimerizacije mehanizma.
Različni tipi so prikazani na [https://journals.asm.org/cms/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019/asset/0bc1138d-60c0-4e59-95c9-fdfec9718c8d/assets/graphic/esp-0003-2019_fig_004.gif sliki 1].
=Arhitektura=
CBP-ji se lahko na prepoznavno mesto vežejo v več kopijah in tako tvorijo razporeditvene komplekse, katerih arhitektura je odvisna od tipa CBP. CBP tip I vsebuje motiv HTH2 in prepozna centromerno mesto parS, kamor se veže v več kopijah in gradi velike komplekse. To omogoča številne interakcije z ustrezno NTP-azo. CBP tip II (vsebuje RHH2 motiv) in tip III (vsebuje HTH2 motiv) tvorita podobne komplekse in sicer, oba tvorita vijačne, obročaste strukture in povzročita upogib DNA.
=Vizualizacija plazmidnih dinamik v celici=
==Tip I==
Najraje se nahajajo na četrtini ali polovici celice v majhnih in večjih celicah. V vseh primerih pa vpadajo z bakterijskimi nukleoidom. ParB in RHH2 so prisotni v velikih količinah znotraj celice in so kot žarišča, ki so odvisni od razporeditvenega mesta in korespondirajo na pozicijo plazmida. ParB iz F plazmidov so prisotni v skupkih v okolici F razporeditvenega mesta, parSF. Razporeditveni kompleksi plazmida F so najdeni znotraj večje mase nukleoida. ParA imajo oscilatorno vedenje, nekatere pa tvorijo dinamične gradiente.
==Tip II in III==
ParMR1 tvorijo dolge filamente. Plazmidi niso prisotni na obeh koncih ParM polimerov. Premik plazmidne DNA na nasproten pol celice žene ParM polimerizacija med sestrskima ParR-parC (R1 centromer) kompleksoma.
Tubulinu podobna GTP-aza iz Gram-pozitivnih bakterij tvori dinamične in citoskeletne filamente, kar nakazuje, da tip III deluje po filamentacijskem mehanizmu za razporejanje plazmidov znotraj celic.
Slikovna obdelava razporeditve in ločitve plazmidov z velikim številom kopij
Plazmidi naj bi sledili obliki ameriškega krofa. Prosto difundirajoči plazmidi so večinoma izven nukleoida v notranjem periferiju bakterije. Plazmidi z visokim kopirnim številom so v skupkih na polih celice in naključno razporejeni skozi celoten volumen celice z nižjo frekvenco znotraj nukleoida. To podpira model mešane distribucije, ki vključuje možnost nastajanja skupkov in naključno difuzijo individualnih plazmidov z visokim številom kopij.

=Mehanizmi razporeditve plazmidov=
Gonilo za razporeditev plazmidov predstavljajo ATP-aze in GTP-aze, ki zagotavljajo energijo za ustrezen premik plazmidov. Obstajata dva glavna razreda mehanizmov razporeditve plazmidov.
==Mehanizmi, ki vključujejo filamentacijo==
Po tem mehanizmu delujeta razporeditvena sistema tipa II in III.
===Razporeditveni sistem tipa II===
Razporeditvene ATP-aze tipa II (ParM) spadajo v razred aktinu podobnih proteinov. Te so sposobne polimerizacije in oblikovanja filamentov, ki potiskajo plazmida, pripeta na nasprotna konca filamenta, narazen (pri paličičastih bakterijah je to vzporedno z longitudinalno osjo celice).
Monomeri ParM polimerizirajo v prisotnosti ATP, pri čemer tvorijo levosučne dvojne vijačnice, ki so polarne (polarnost je posledica asimetrije monomerov, zato vsak filament vsebuje top in oster konec. ParR (CBP), ki je vezan na parC plazmida, se veže na topi konec filamenta in ustvari kapo, ki prepreči razgradnjo filamenta kljub hidrolizi ATP. Novi ParM-ATP monomeri se nato vstavljajo na topi konec skozi konkavni stik med ParR/parC. Ko filament raste, potiska plazmid na topem koncu in plazmid se premika po celici. Filamenti se urejajo v antiparalelne snope, kar pomeni, da so topi konci (mesta, kamor se veže plazmid) na obeh straneh snopa. Ko filamenti v snopu rastejo potiskajo plazmide, vezane na tope konce, na nasprotna pola celice. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (A in B)

===Razporeditveni sistem tipa III===
Razporeditveni sistem tipa III prav tako deluje na principu polimerizacije, ampak pri tem kot gonilno moč uporablja tubulinu podobne GTPaze (TubZ). Monomeri TubZ polimerizirajo v prisotnosti GTP in tvorijo dvo- in štirivijačne filamente, ki so stabilizirani z GTP kapo. TubZ filamenti so polarni, kar pomeni, da rastejo na + koncu in se razgrajajo na – koncu. Tja se veže tudi TubR (CBP), vezan na tubC. Ko polimer raste na + strani in se razgrajuje na – strani, mu razporeditveni kompleks sledi, kar se kaže v premikanju plazmida. Kako pa ta vleka plazmidov prispeva k ločitvi plazmidov še ni pojasnjeno, saj TubZ filamenti niso bipolarni (premikanje poteka le v eno smer). [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (C)

==Mehanizem po principu Brownovega zobatega kolesa==
Razporeditveni sistem tipa I, ki je pri bakterijah najbolj pogost, za razliko od drugih dveh tipov pa ne deluje na principu polimerizacije. Pri njegovem mehanizmu sodelujejo ATP-aze tipa Walker (ParA). Te so sposobne interakcije z bakterijskim nukleoidom in v celici tvorijo dinamičen gradient. Interagirajo tudi s proteini ParB (CBP), ki nosijo plazmidni tovor in sledijo gradientu ParA. Predpostavljenih je bilo več modelov kako ParB sledijo gradientu ParA, vsi pa delujejo na osnovi principa Brownovega zobatega kolesa. 
V prisotnosti ATP se ParA veže na DNA (ATP pri tem hidrolizira). V naslednjem koraku se na ParA veže ParB, ki je vezan na parS (nosi plazmid) in pri tem iz nukleoida izrine ParA. Ta oddifundia v citoplazmo, kjer čaka, da se nanj ponovno veže ATP. Ker pa je ta korak zelo počasen, začne na nukleoidu primanjkovati ParA. ParB se torej premika po nukleoidu in za seboj pušča ParA praznino – gibanje plazmida je zato usmerjano stran od nižje koncentracije ParA. Plazmida bi se po replikaciji tako ločila, če bi bila koncentracija ParA med njima najnižja. 
Obstaja več različnih modelov mehanizma Brownovega zobatega kolesa, vsi temeljijo na asimetriji distribucije ParA na bakterijskem nukleoidu. Delovanje lahko povežemo s konceptom požganega mostu – ko se ParB s plazmidnim tovorom premakne po nukleoidu, na svoji poti iz nukleoida odstranjuje ParA in s tem 'požge most za seboj', saj se zaradi odsotnosti Par A ne more vrniti nazaj. Predlagane verzije se med seboj razlikujejo po tem, kako asimetrija razporeditve ParA ustvari energijo, potrebno za gibanje in v vlogi, ki je pripisana bakterijskemu kromosomu in ParA oligomerizaciji. 
Vse ATPaze tipa I uporabljajo mehanizem Brownovega zobatega kolesa, vendar pa je relevanten model najverjetneje odvisen od različnih biokemijskih značilnosti in ravni ekspresije ParA in ParB. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/3928d857-a2ad-4de1-9c2b-e5caecb4e75b/assets/graphic/plas-0023-2014-fig5.gif Slika 3]

=Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici=
Dva različna plazmida, ki ne moreta stabilno obstajati v isti celici, sta nezdružljiva. Pri delitvah celice tako pride do izgube oziroma zmanjšanja števila vsaj enega od plazmidov, kar je posledica skupnih lastnosti nezdružljivih plazmidov. Do nezdružljivosti zaradi sorodnega načina razporejanja v celici pride tako pri razporejanju tipa 1 kot 2.
==Nezdružljivost pri ParA==
Če imamo v celici plazmid z visokim številom kopij in Par sistemom razporejanja, bo to onemogočilo stabilen soobstoj plazmida z enakim parA genom. Pretirano izražanje ParA, ki je prisoten v večih kopijah namreč povzroči, da se začneta plazmida ob delitvi naključno razporejati v hčerinske celice. Delež nezdružljivosti sovpada s koncentracijo ParA. Povečana koncentracija ParA destabilizira razporeditveni kompleks in mehanizem Brownovega zobatega kolesa, ki omogoča premikanje plazmidov po celici. Pri visoki koncentraciji ParA se praznine brez Par A lahko hitreje zapolnijo in tako onemogočijo gibanje plazmida po nukleoidu.
==Nezdružljivost pri ParB==
Analogno kot pri ParA dva plazmida, ki se razporejata s ParB, v isti celici nista stabilna, še posebej, če je eden od njiju plazmid z visokim številom kopij, saj je nezdružljivost odvisna od izražanja ParB. Previsoka koncentracija ParB najverjetneje povzroči koncentriranje plazmidov s parS genom v skupke in s tem zmanjša število plazmidov, ki se prosto gibljejo po celici. V tem primeru ParA ne more dovolj uspešno razdreti razporeditvenih kompleksov in sprostiti plazmidov, zato sčasoma pride do izgube enega od plazmidov. Hkrati so ugotovili, da lahko nekatere različice proteina, kot je ParBF, sprožijo rekombinacijo sorodnih plazmidov in tako povzročijo multimerizacijo. Multimer je plazmid, ki nastane s homologno rekombinacijo in vsebuje dve ponovitvi celotnega plazmidnega nukleotidnega zaporedja.
Vir slike:[1]
==Nezdružljivost pri enakih centromerih==
Če plazmida vsebujeta sorodno mesto za razporejanje, načeloma pride do nezdružljivosti. Vzrok ni povsem znan. Pri plazmidih z visokim številom kopij pride do naključnega razporejanja plazmidov, pri plazmidih, ki vsebujejo več parS mest pa tudi do zmanjšanega števila prostih ParB zaradi pretirane vezave na parS. Pri plazmidih z nizkim številom kopij opazimo zelo močno nezdružljivost, kjer je izguba števila plazmidov višja kot pri naključnem razporejanju. Eden od možnih vzrokov za to je pozna replikacija plazmidov. Če se eden od plazmidov podvoji ravno pred celično delitvijo, se kopiji namreč ne prerazporedita znotraj celice, ampak se obe dedujeta v isti hčerinski celici, kar privede do visoke izgube plazmidov.
Vir slike: [2]
=Regulacija izražanja par gena=
Izražanje par operonov direktno vpliva na stabilnost plazmidov in je v vseh primerih nadzorovano po principu avtoregulacije. Eden od proteinov par operona deluje kot represor, pogosto pa tudi eden od preostalih kot korepresor. V razporeditvenem sistemu tipa I so represorji ParA ATPaze, pri vseh ostalih sistemih pa proteini CBP. ParA represorji se z N-končnim delom s HTH (vijačnica-zavoj-vijačnica) motivom vežejo na DNA. Vezavno mesto ni povsem raziskano, vsebuje pa daljše obratne ponovitve, ki omogočijo vezavo ParA. Ta specifična vezava je mogoča ob vezavi ADP kot kofaktorja, pri vezavi ATP pa prevlada nespecifična vezava DNA, ki omogoči razporejanje plazmidov s pomočjo ParB.
=Zaključek=
Sistemi za razporejanje plazmidov so nujni za njihov obstoj in so kljub svoji preprostosti zelo natančno regulirani. Z dvema ključnima proteinoma in specifičnimi DNA zaporedji lahko predvsem plazmidi z manjšim številom kopij poskrbijo, da se ob delitvi uspešno dedujejo v obe hčerinski celici. Kljub široki uporabi plazmidnih vektorjev mnogi procesi, povezani z njihovim razporejanjem, še niso v celoti pojasnjeni. Raziskave v tej smeri bodo pripomogle k našemu razumevanju strukturne biologije in dinamike celotnega bakterijskega genoma.

=Viri=
Bouet, J.-Y.; Funnell, B. E. Plasmid Localization and Partition in Enterobacteriaceae. EcoSal Plus 2019, 8 (2), 10.1128/ecosalplus.ESP-0003–2019. https://doi.org/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019.
Schumacher, M. A. Bacterial Plasmid Partition Machinery: A Minimalist Approach to Survival. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012, 22 (1), 72–79. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2011.11.001.
Gerdes, K.; Møller-Jensen, J.; Jensen, R. B. Plasmid and Chromosome Partitioning: Surprises from Phylogeny. Mol. Microbiol. 2000, 37 (3), 455–466. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01975.x.
Baxter, J. C.; Funnell, B. E. Plasmid Partition Mechanisms. Microbiol. Spectr. 2014, 2 (6), 10.1128/microbiolspec.plas-0023–2014. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014.
Møller‐Jensen, J.; Jensen, R. B.; Löwe, J.; Gerdes, K. Prokaryotic DNA Segregation by an Actin‐like Filament. EMBO J. 2002, 21 (12), 3119–3127. https://doi.org/10.1093/emboj/cdf320.
(11) Brooks, A. C.; Hwang, L. C. Reconstitutions of Plasmid Partition Systems and Their Mechanisms. Plasmid 2017, 91, 37–41. https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2017.03.004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Razporejanje plazmidov v hčerinski celici

2024-05-04T19:46:42Z

Brina Klinar: Created page with "=Uvod= Plazmidi živijo s svojo gostiteljsko celico v simbiozi. Razvili so kar nekaj strategij za obstoj znotraj bakterijske populacije med katerimi je razporeditveni sistem. Vsi razporeditveni sistemi so sestavljeni iz treh delov: ene ali več kopij razporeditvenega mesta (centromer), CBP (centromerni vezavni protein) in NTP-aze. =Izračun izgube plazmida= Plazmidi z majhnim kopirnim številom se morajo za svoj obstoj nanašati na razporeditveni sistem, plazmidi z visok..."

=Uvod=
Plazmidi živijo s svojo gostiteljsko celico v simbiozi. Razvili so kar nekaj strategij za obstoj znotraj bakterijske populacije med katerimi je razporeditveni sistem. Vsi razporeditveni sistemi so sestavljeni iz treh delov: ene ali več kopij razporeditvenega mesta (centromer), CBP (centromerni vezavni protein) in NTP-aze.
=Izračun izgube plazmida=
Plazmidi z majhnim kopirnim številom se morajo za svoj obstoj nanašati na razporeditveni sistem, plazmidi z visokim številom kopij pa se zanašajo na pasivno difuzijo.
Za naključno distribucijo velja: Ploss = 2^(1-n), kjer je »n« število kopij v celici.
=Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov=
Razporeditveni sistemi so nujni za transport in vzpostavitev sistema s plazmidno DNA. Poznamo 3 razporeditvene sisteme, ki se razlikujejo po tipu razporejanja z NTP-azo. Centromeri so značilna ohranjena zaporedja na plazmidu, ki služijo kot prepoznavna mesta za CBP. CBP prepozna zaporedje na plazmidu in se tako veže na centromer. To deluje kot most med plazmidom in ustrezno NTP-azo, ki omogoča premik plazmida.
Tip I ima Walker ATP-azo, ki ločuje plazmid s formacijo dinamičnega vzorca na bakterijskem nukleoidu. Tip II uporablja aktinu podobno ATP-azo, ki polimerizira v dinamične filamente, ki potiskajo plazmida narazen. Tip III ima tubulinu podobne GTP-aze, ki prav tako delujejo preko dinamične polimerizacije mehanizma.
Različni tipi so prikazani na [https://journals.asm.org/cms/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019/asset/0bc1138d-60c0-4e59-95c9-fdfec9718c8d/assets/graphic/esp-0003-2019_fig_004.gif sliki 1].
=Arhitektura=
CBP-ji se lahko na prepoznavno mesto vežejo v več kopijah in tako tvorijo razporeditvene komplekse,
katerih arhitektura je odvisna od tipa CBP. CBP tip I vsebuje motiv HTH2 in prepozna centromerno mesto parS, kamor se veže v več kopijah in gradi velike komplekse. To omogoča številne interakcije z ustrezno NTP-azo. CBP tip II (vsebuje RHH2 motiv) in tip III (vsebuje HTH2 motiv) tvorita podobne komplekse in sicer, oba tvorita vijačne, obročaste strukture in povzročita upogib DNA.
Vizualizacija plazmidnih dinamik v celici
==Tip I==
Najraje se nahajajo na četrtini ali polovici celice v majhnih in večjih celicah. V vseh primerih pa vpadajo z bakterijskimi nukleoidom. ParB in RHH2 so prisotni v velikih količinah znotraj celice in so kot žarišča, ki so odvisni od razporeditvenega mesta in korespondirajo na pozicijo plazmida. ParB iz F plazmidov so prisotni v skupkih v okolici F razporeditvenega mesta, parSF. Razporeditveni kompleksi plazmida F so najdeni znotraj večje mase nukleoida. ParA imajo oscilatorno vedenje, nekatere pa tvorijo dinamične gradiente.
==Tip II in III==
ParMR1 tvorijo dolge filamente. Plazmidi niso prisotni na obeh koncih ParM polimerov. Premik plazmidne DNA na nasproten pol celice žene ParM polimerizacija med sestrskima ParR-parC (R1 centromer) kompleksoma.
Tubulinu podobna GTP-aza iz Gram-pozitivnih bakterij tvori dinamične in citoskeletne filamente, kar nakazuje, da tip III deluje po filamentacijskem mehanizmu za razporejanje plazmidov znotraj celic.
Slikovna obdelava razporeditve in ločitve plazmidov z velikim številom kopij
Plazmidi naj bi sledili obliki ameriškega krofa. Prosto difundirajoči plazmidi so večinoma izven nukleoida v notranjem periferiju bakterije. Plazmidi z visokim kopirnim številom so v skupkih na polih celice in naključno razporejeni skozi celoten volumen celice z nižjo frekvenco znotraj nukleoida. To podpira model mešane distribucije, ki vključuje možnost nastajanja skupkov in naključno difuzijo individualnih plazmidov z visokim številom kopij.

=Mehanizmi razporeditve plazmidov=
Gonilo za razporeditev plazmidov predstavljajo ATP-aze in GTP-aze, ki zagotavljajo energijo za ustrezen premik plazmidov. Obstajata dva glavna razreda mehanizmov razporeditve plazmidov.
==Mehanizmi, ki vključujejo filamentacijo==
Po tem mehanizmu delujeta razporeditvena sistema tipa II in III.
===Razporeditveni sistem tipa II===
Razporeditvene ATP-aze tipa II (ParM) spadajo v razred aktinu podobnih proteinov. Te so sposobne polimerizacije in oblikovanja filamentov, ki potiskajo plazmida, pripeta na nasprotna konca filamenta, narazen (pri paličičastih bakterijah je to vzporedno z longitudinalno osjo celice).
Monomeri ParM polimerizirajo v prisotnosti ATP, pri čemer tvorijo levosučne dvojne vijačnice, ki so polarne (polarnost je posledica asimetrije monomerov, zato vsak filament vsebuje top in oster konec. ParR (CBP), ki je vezan na parC plazmida, se veže na topi konec filamenta in ustvari kapo, ki prepreči razgradnjo filamenta kljub hidrolizi ATP. Novi ParM-ATP monomeri se nato vstavljajo na topi konec skozi konkavni stik med ParR/parC. Ko filament raste, potiska plazmid na topem koncu in plazmid se premika po celici. Filamenti se urejajo v antiparalelne snope, kar pomeni, da so topi konci (mesta, kamor se veže plazmid) na obeh straneh snopa. Ko filamenti v snopu rastejo potiskajo plazmide, vezane na tope konce, na nasprotna pola celice. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (A in B)

===Razporeditveni sistem tipa III===
Razporeditveni sistem tipa III prav tako deluje na principu polimerizacije, ampak pri tem kot gonilno moč uporablja tubulinu podobne GTPaze (TubZ). Monomeri TubZ polimerizirajo v prisotnosti GTP in tvorijo dvo- in štirivijačne filamente, ki so stabilizirani z GTP kapo. TubZ filamenti so polarni, kar pomeni, da rastejo na + koncu in se razgrajajo na – koncu. Tja se veže tudi TubR (CBP), vezan na tubC. Ko polimer raste na + strani in se razgrajuje na – strani, mu razporeditveni kompleks sledi, kar se kaže v premikanju plazmida. Kako pa ta vleka plazmidov prispeva k ločitvi plazmidov še ni pojasnjeno, saj TubZ filamenti niso bipolarni (premikanje poteka le v eno smer). [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/e77bc2b3-23b7-4f17-8bb9-2b9a07926e99/assets/graphic/plas-0023-2014-fig2.gif Slika 2] (C)

==Mehanizem po principu Brownovega zobatega kolesa==
Razporeditveni sistem tipa I, ki je pri bakterijah najbolj pogost, za razliko od drugih dveh tipov pa ne deluje na principu polimerizacije. Pri njegovem mehanizmu sodelujejo ATP-aze tipa Walker (ParA). Te so sposobne interakcije z bakterijskim nukleoidom in v celici tvorijo dinamičen gradient. Interagirajo tudi s proteini ParB (CBP), ki nosijo plazmidni tovor in sledijo gradientu ParA. Predpostavljenih je bilo več modelov kako ParB sledijo gradientu ParA, vsi pa delujejo na osnovi principa Brownovega zobatega kolesa.
V prisotnosti ATP se ParA veže na DNA (ATP pri tem hidrolizira). V naslednjem koraku se na ParA veže ParB, ki je vezan na parS (nosi plazmid) in pri tem iz nukleoida izrine ParA. Ta oddifundia v citoplazmo, kjer čaka, da se nanj ponovno veže ATP. Ker pa je ta korak zelo počasen, začne na nukleoidu primanjkovati ParA. ParB se torej premika po nukleoidu in za seboj pušča ParA praznino – gibanje plazmida je zato usmerjano stran od nižje koncentracije ParA. Plazmida bi se po replikaciji tako ločila, če bi bila koncentracija ParA med njima najnižja.
Obstaja več različnih modelov mehanizma Brownovega zobatega kolesa, vsi temeljijo na asimetriji distribucije ParA na bakterijskem nukleoidu. Delovanje lahko povežemo s konceptom požganega mostu – ko se ParB s plazmidnim tovorom premakne po nukleoidu, na svoji poti iz nukleoida odstranjuje ParA in s tem 'požge most za seboj', saj se zaradi odsotnosti Par A ne more vrniti nazaj. Predlagane verzije se med seboj razlikujejo po tem, kako asimetrija razporeditve ParA ustvari energijo, potrebno za gibanje in v vlogi, ki je pripisana bakterijskemu kromosomu in ParA oligomerizaciji.
Vse ATPaze tipa I uporabljajo mehanizem Brownovega zobatega kolesa, vendar pa je relevanten model najverjetneje odvisen od različnih biokemijskih značilnosti in ravni ekspresije ParA in ParB. [https://journals.asm.org/cms/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014/asset/3928d857-a2ad-4de1-9c2b-e5caecb4e75b/assets/graphic/plas-0023-2014-fig5.gif Slika 3]

=Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici=
Dva različna plazmida, ki ne moreta stabilno obstajati v isti celici, sta nezdružljiva. Pri delitvah celice tako pride do izgube oziroma zmanjšanja števila vsaj enega od plazmidov, kar je posledica skupnih lastnosti nezdružljivih plazmidov. Do nezdružljivosti zaradi sorodnega načina razporejanja v celici pride tako pri razporejanju tipa 1 kot 2.
==Nezdružljivost pri ParA==
Če imamo v celici plazmid z visokim številom kopij in Par sistemom razporejanja, bo to onemogočilo stabilen soobstoj plazmida z enakim parA genom. Pretirano izražanje ParA, ki je prisoten v večih kopijah namreč povzroči, da se začneta plazmida ob delitvi naključno razporejati v hčerinske celice. Delež nezdružljivosti sovpada s koncentracijo ParA. Povečana koncentracija ParA destabilizira razporeditveni kompleks in mehanizem Brownovega zobatega kolesa, ki omogoča premikanje plazmidov po celici. Pri visoki koncentraciji ParA se praznine brez Par A lahko hitreje zapolnijo in tako onemogočijo gibanje plazmida po nukleoidu.
==Nezdružljivost pri ParB==
Analogno kot pri ParA dva plazmida, ki se razporejata s ParB, v isti celici nista stabilna, še posebej, če je eden od njiju plazmid z visokim številom kopij, saj je nezdružljivost odvisna od izražanja ParB. Previsoka koncentracija ParB najverjetneje povzroči koncentriranje plazmidov s parS genom v skupke in s tem zmanjša število plazmidov, ki se prosto gibljejo po celici. V tem primeru ParA ne more dovolj uspešno razdreti razporeditvenih kompleksov in sprostiti plazmidov, zato sčasoma pride do izgube enega od plazmidov. Hkrati so ugotovili, da lahko nekatere različice proteina, kot je ParBF, sprožijo rekombinacijo sorodnih plazmidov in tako povzročijo multimerizacijo. Multimer je plazmid, ki nastane s homologno rekombinacijo in vsebuje dve ponovitvi celotnega plazmidnega nukleotidnega zaporedja.
Vir slike:[1]
==Nezdružljivost pri enakih centromerih==
Če plazmida vsebujeta sorodno mesto za razporejanje, načeloma pride do nezdružljivosti. Vzrok ni povsem znan. Pri plazmidih z visokim številom kopij pride do naključnega razporejanja plazmidov, pri plazmidih, ki vsebujejo več parS mest pa tudi do zmanjšanega števila prostih ParB zaradi pretirane vezave na parS. Pri plazmidih z nizkim številom kopij opazimo zelo močno nezdružljivost, kjer je izguba števila plazmidov višja kot pri naključnem razporejanju. Eden od možnih vzrokov za to je pozna replikacija plazmidov. Če se eden od plazmidov podvoji ravno pred celično delitvijo, se kopiji namreč ne prerazporedita znotraj celice, ampak se obe dedujeta v isti hčerinski celici, kar privede do visoke izgube plazmidov.
Vir slike: [2]
=Regulacija izražanja par gena=
Izražanje par operonov direktno vpliva na stabilnost plazmidov in je v vseh primerih nadzorovano po principu avtoregulacije. Eden od proteinov par operona deluje kot represor, pogosto pa tudi eden od preostalih kot korepresor. V razporeditvenem sistemu tipa I so represorji ParA ATPaze, pri vseh ostalih sistemih pa proteini CBP. ParA represorji se z N-končnim delom s HTH (vijačnica-zavoj-vijačnica) motivom vežejo na DNA. Vezavno mesto ni povsem raziskano, vsebuje pa daljše obratne ponovitve, ki omogočijo vezavo ParA. Ta specifična vezava je mogoča ob vezavi ADP kot kofaktorja, pri vezavi ATP pa prevlada nespecifična vezava DNA, ki omogoči razporejanje plazmidov s pomočjo ParB.
=Zaključek=
Sistemi za razporejanje plazmidov so nujni za njihov obstoj in so kljub svoji preprostosti zelo natančno regulirani. Z dvema ključnima proteinoma in specifičnimi DNA zaporedji lahko predvsem plazmidi z manjšim številom kopij poskrbijo, da se ob delitvi uspešno dedujejo v obe hčerinski celici. Kljub široki uporabi plazmidnih vektorjev mnogi procesi, povezani z njihovim razporejanjem, še niso v celoti pojasnjeni. Raziskave v tej smeri bodo pripomogle k našemu razumevanju strukturne biologije in dinamike celotnega bakterijskega genoma.

=Viri=
Bouet, J.-Y.; Funnell, B. E. Plasmid Localization and Partition in Enterobacteriaceae. EcoSal Plus 2019, 8 (2), 10.1128/ecosalplus.ESP-0003–2019. https://doi.org/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019.
Schumacher, M. A. Bacterial Plasmid Partition Machinery: A Minimalist Approach to Survival. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012, 22 (1), 72–79. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2011.11.001.
Gerdes, K.; Møller-Jensen, J.; Jensen, R. B. Plasmid and Chromosome Partitioning: Surprises from Phylogeny. Mol. Microbiol. 2000, 37 (3), 455–466. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01975.x.
Baxter, J. C.; Funnell, B. E. Plasmid Partition Mechanisms. Microbiol. Spectr. 2014, 2 (6), 10.1128/microbiolspec.plas-0023–2014. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014.
Møller‐Jensen, J.; Jensen, R. B.; Löwe, J.; Gerdes, K. Prokaryotic DNA Segregation by an Actin‐like Filament. EMBO J. 2002, 21 (12), 3119–3127. https://doi.org/10.1093/emboj/cdf320.
(11) Brooks, A. C.; Hwang, L. C. Reconstitutions of Plasmid Partition Systems and Their Mechanisms. Plasmid 2017, 91, 37–41. https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2017.03.004.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Molekularna biologija plazmidov

2024-05-04T10:22:35Z

Brina Klinar:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2023/24 obravnavajo plazmide, ki jih sicer biokemiki poznamo predvsem kot vektorje v DNA-tehnologiji. Pregledali bomo njihovo klasifikacijo, načine podvojevanja in razporejanja v hčerinske celice, njihov prenos s konjugacijo, pomen pri širjenju odpornosti proti antibiotikom. Na koncu si bomo ogledali še nekaj primerov uporabe plazmidov na različnih biotehnoloških in medicinskih področjih. Okvirni naslovi tem so navedeni na spodnjem seznamu.

Vse teme temeljijo na preglednih člankih, kar pomeni, da obravnavajo zaključene teme, na katerih je bilo opravljenega že veliko dela. Zato praviloma vsako temo obdelajo po trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200–1800 besed), ki ste jih uporabili. Če izjemoma seminar pripravita dva študenta, je obseg povzetka 1000-1500 besed, če je študent sam, pa 800-1200 besed.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'. Predstavitev naj bo dolga 15–20 minut, temu pa bo sledila razprava (pribl. 5 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali, in vključite le malo splošnega uvoda, kjer je mogoče pa izpostavite ključne razlike v procesih med bakterijami, evkarionti in arhejami. Če seminar predstavljata dva študenta, imata na voljo 12-15 minut, če je študent sam, pa 8-10 minut.

Seminarske predstavitve bodo potekale med 24. aprilom in 15. majem 2024. V tem času ne bo klasičnih predavanj, torej bodo tako ponedeljkovi kot sredini termini namenjeni seminarjem.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. ~10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).

Razdelitev seminarjev je potekala v okolju Google Drive, kjer so (bile) navedene povezave do izhodiščnih člankov, s katerimi lahko začnete iskanje literature. Večinoma navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili kvaliteten 15-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro en za drugim, tako da boste osnove hitro osvojili in jih ni treba ponavljati.

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki>. Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularna_biologija_koronavirusov Molekularna biologija koronavirusov (2020/21)].

Seznam tem in referenti:

24. april: 
# [[Klasifikacija plazmidov]] (Jan Hvalec, Tjaša Lešnik, Nika Makuc) 
# [[Replikacija plazmidov po mehanizmu téta]] (Nika Janc, Špela Puhov, Lara Ferjančič) 
# [[Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga]] (Tinkara Robek, Lara Pajnhart, Tina Kosovel) 

6. maj: 
# [[Interakcije plazmid - kromosom]] (Anita Mulalic, Tiara Pšeničnik, Špela Longar) 
# [[Razporejanje plazmidov v hčerinski celici]] (Karin Kunstelj, Brina Klinar, Nina Cankar) 
# Prenos plazmidov s konjugacijo med gramnegativnimi bakterijami
# [[Konjugacijski prenos plazmidov pri bakteriji Bacillus subtilis]] (Mark Frantar, Simon Kristl, Andraž Snedec) 
# Modeli konjugacije med črevesnimi bakterijami

8. maj: 
# [[Širjenje odpornosti proti antibiotikom med talnimi bakterijami]] (Debora Kociper, Uma Jordan Ferbežar, Dan Kolnik) 
# [[Vloga plazmidov v bakterijski evoluciji]] (Klara Kolenc, Veronika Trobiš, Teja Mohar) 
# Pomen plazmida Ti za patogenost agrobakterij

13. maj: 
# [[Vloga plazmidov pri virulenčnosti klamidij]] (Nik Matek, Mark Varlamov, Anže Perc) 
# Kriptični plazmidi v človeških prebavilih
# Vloga plazmidov pri kvarjenju piva, ki ga povzročajo mlečne bakterije
# Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev
# Plazmidni replikoni v farmacevtski industriji

15. maj: 
# Atipična sistema segregacije pri plazmidih z nizkim številom kopij

BIO2 Povzetki seminarjev 2023

2023-11-13T20:18:57Z

Brina Klinar:

= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2023/24 =
==Anja Kokol - Pomen kompertmentalizirane signalizacije v membranskih raftih pri razvoju raka==
Raziskovanje lipidnih raftov, membranskih domen, bogatih s holesterolom in sfingolipidi, je izboljšalo razumevanje celične membrane pri signalni transdukciji. Te sortirne platforme igrajo ključno vlogo pri kompartmentalizaciji signalnih poti in s tem spodbujajo ali zavirajo preživetje, smrt in metastazo tumorskih celic. Transformirane celice vsebujejo višjo raven znotrajceličnega holesterola in s tem posledično več membranskih raftov. Rafti so, zraven prenosa signalov, pomembni za aktivacijo receptorjev, endocitozo, znotrajcelični promet in organizacijo z lipidi in proteini. V obliki lipidnih lupin zagotavljajo proteinom, ki so jih tako ločili od ostalih, primerno mikrookolje in s pomočjo takšnega mehanizma vklopijo ali izklopijo določene poti prenosa signala. Na celične procese pomembno vpliva asimetrija holesterola v plazemski membrani, ki se vzdržuje z aktivnim transportom holesterola iz notranjega v zunanji del. Zaradi prenosa signala po lipidnih raftih lahko pride do prekomerne ekspresije in aktivacije številnih poti in sistemov rastnih faktorjev, kar pripomore k razvoju tumorja. Eden od njih je tudi aktivator signalne poti PI3K/AKT, ki je pomemben udeleženec pri nastanku raka. Značilnost sesalskih celic je prisotnost receptorjev smrti na njihovi površini. Ti zagotavljajo sposobnost apoptoze. Ligandi receptorjev smrti sprožijo značilno signalizacijo preko oligomerizacije receptorjev, kar posledično povzroči rekrutiranje specializiranih adapterskih proteinov znotraj lipidnih raftov. S preučevanjem membranskih raftov se je rodil tudi koncept CASMER, s pomočjo katerega se je razvila nova ideja zdravljenja raka.

==Vid Kozel - Vloga onkogenov in tumor zavirajočih genov pri razvoju raka==
Onkogeni kodirajo okvarjene proteine ter s tem povzročajo tumorje. Nastanejo iz spremenjenih proto-onkogenov. Za naše zdravje so zelo nevarni, saj spodbujajo delovanje procesov, ki vodijo do raka. Aktivirajo se zaradi genetske spremembe proto-onkogenov, najpogosteje do tega pride zaradi točkovnih mutacij; mutacije z večjo funkcionalnostjo, kromosomske translokacije, virusna integracija, epigenetske spremembe, spremembe regulatornih proteinov. Tumor zavirajoči geni ali tumorski supresorji tvorijo regulatorne proteine, ki preprečujejo delitev rakavih celic ter spodbujajo popravljanje DNA. Aktivirajo se s transkripcijsko aktivacijo, posttranslacijskimi modifikacijami ali interakcijami med proteini. Njihova glavna naloga je vzdrževanje genoma, prav tako pa preprečujejo nenadzorovano rast celic.
Pot RAS-RAF-MEK-ERK je signalna pot onkogenov, ki ima vlogo pri rasti, delitvi, preživetju in diferenciaciji celic. Njena nenormalna aktivacija lahko povzroči nastanek tumorjev. Pot se začne z aktivacijo RAS, do katere pride zaradi zunajceličnih signalov. RAS potem aktivira še RAF in sproži kaskado fosforilacije. Nato se aktivira MEK, ki sproži dvojno fosforilacijo in aktivira ERK, aktivacija le-te pa vodi do razmnoževanja, preživetja ali diferenciacije celic.
TP53 je gen, ki kodira tumor supresorski protein p53, ta pa zatira tumorje. Na poškodbe DNA odgovarja tako, da ustavi celični cikel ter nato popravi DNA, sproži apoptozo ali pa senescenco. Njegovo delovanje inhibira MDM2, ki ga lahko dodatno stabilizira MDM4. Ob mutacijah na TP53, ter posledično na P53, ta izgubi sposobnost obrambe proti tumorjem.
Z ugotavljanjem mutacij onkogenov/tumorskih supresorjev, ali s tem da ti služijo kot biomarkerji, lahko zdravniki napovejo verjetno napredovanje raka ter izberejo ustrezno zdravljenje.

==Nina Majerle - Z G-proteini sklopljeni vzorčno prepoznavni receptorji izraženi v nevtrofilcih==
Nevtrofilci so najpogostejši levkociti v človeški krvi in so ključnega pomena za pravilno delovanje imunskega sistema. Na površini izražajo različne receptorje, ki prepoznavajo molekulske vzorce tipične za patogene organizme in za poškodovane gostiteljske celice. Ti receptorji so ključnega pomena za delovanje nevtrofilcev, saj jim omogočajo regulacijo vnetnega odziva, diferenciacijo, priklic drugih celic imunskega sistema in fagocitozo. Mnogi od teh receptorjev pripadajo družini z G-proteini sklopljenih receptorjev. GPCR-ji imajo značilno strukturo sedmih α-vijačnic, prenos signala prek GPCR-jev pa največkrat poteka preko heterotrimernih G-proteinov. Seminarska naloga obravnava tako splošne značilnosti GPCR-jev, kot tudi podrobneje opiše mehanizme delovanja in funkcije nekaterih bolj znanih GPCR-jev izraženih na membranah nevtrofilcev, ki delujejo po principu vzorčnega prepoznavanja: družina formil peptidnih receptorjev (FPRs), purinergični receptor P2Y2R in dva člana družine receptorjev prostih maščobnih kislin FFA2R in GPR84. Poleg tega prek relevantnih primerov razlaga nekatere ključne pojme in koncepte v biokemiji kot so ortosterično vezavno mesto, alosterični receptorski modulatorji, vzorčno prepoznavanje, homologna in heterologna desenzibilizacija, receptorska transaktivacija, funkcionalna selektivnost in pa tudi pojme, ki se nanašajo na same nevtrofilce kot sta kemotaksija in primiranje. Na koncu se seminarska naloga naveže še na uporabnost poznavanja strukture in delovanja GPCR-jev izraženih v nevtrofilcih pri zdravljenju različnih imunskih obolenj.

==Jakob Urh Veler - Gvanilil ciklaze kot ključni receptorji in encimi pri celični biosignalizaciji==
Družina proteinov gvanilat ciklaze/gvanilil ciklaze (GC) v svoji katalitični domeni ciklizirajo GTP v cGMP. Ciklični GMP je sekundarni sporočevalec. Z nadaljno kaskado vpliva na protein kinaze (cGK), fosfodiesteraze (PDE) in ionske kanalčke (CNG). So pomembne za pravilno delovanje več organskih sistemov. Glede na strukturne, funkcionalne in regulatorne značilnosti GC delimo na membranske (mGC/pGC) in topne (sGC) oblike. Poznamo tipične in atipične sGC. Po priporočeni nomenklaturi poznamo 7 tipov mGC: MG-A, MG-B, MG-C, MG-D, MG-E, MG-F in MG-G. Vlogo encima in receptorja opravljajo topne gvanilil ciklaze v citosolu in membranske na celični membrani. Aktivirane so lahko tudi z endogenim NO, O2, HCO3-, natriuretskimi hormoni in s Ca2+-vezanimi proteini. V nadaljevanju podrobneje opisana aktivacija sGC z NO ter aktivacija GC-A z atrijskim natriuretskim hormonom (ANF). Z manipulacijo genov za zapis gvanilil ciklaz so odkrili njihove vloge v celicah in pomen specifičnih domen. Z različno stopnjo izražanja izoencimov je v celicah visoka diverziteta GC, zato je to mrežo signalizacije brez in vivo opazovanja zahtevno raziskovati. Približno 60 let že raziskujejo gvanilil ciklaze. Razumevanje te signalne poti je ključnega pomena za zdravljenje določenih bolezenskih stanj, saj imajo zdravila več tarčnih mest za delovanje.

==Domen Trontelj - G protein sklopljeni receptorji v fiziologiji okusa in farmakologiji==
G protein sklopljeni receptorji (GPCR), predstavljajo največjo družino receptorjev pri sesalcih in so ključni za uravnavanje večine fizioloških funkcij. Poleg posredovanja pri zaznavi vonja in vida, so prav tako prenašalci signala treh osnovnih okusov- sladko, umami in grenko, prav tako pa so ključnega pomena pri zaznavanju okusa kokumi. Nahajajo se v specializiranih okuševalnih celicah (TRC) znotraj brbončic. Tip I okuševalnih GPCR-jev (TAS1R) so heterodimerni kompleksi, ki skužijo kot receptorji za sladko (TAS1R2/TAS1R3) ali umami (TAS1R1/TAS1R3) okus, medtem ko Tip II obsega monomerne receptorje za grenak okus ali pa kokumi/kalcijeve receptorje.
Receptorji za sladko, umami in kokumi delijo strukturne podobnosti, saj vsebujejo več mest za vezavo agonistov z izrazito selektivnostjo, medtem ko večina grenkih receptorjev vsebuje le eno vezavno mesto, ki neselektivno sprejme veliko različnih ligandov. Vezava agonistov na receptor aktivira sekundarnih prenašalce, kar privede do vdora kalcija, to vodi do depolarizacije celice in na koncu sprostitve nevrotransmiterja.
Kljub nedavnim napredkom na področju raziskav konformacijskih sprememb, potrebnih za aktivacijo receptorja, ostaja še veliko nerešenih. V zadnjih letih so različni pristopi, ki združujejo heterologno izražanje, mutagenezo, homologno modeliranje in knockout študije na miših, skupaj ponudili vpogled v strukturo in pozicijo vezavnih mest za ligande in mehanizme ortosterične in alosterične modulacije.

==Karin Kunstelj - Potencialne terapije zdravljenja akutne mielonične levkemije najdene prav v metabolizmu celic kostnega mozga in njegovega mikrookolja==
Izogibanje detekciji in odgovoru imunskega odziva sodi med glavne težave levkemije poleg neuspešne imunoterapije. Burne poti mikrookolja so v ozadju odgovora tako rakavih kot zdravil celic, problem pa se pojavi, ko rakave celice prevzamejo vodilno vlogo metabolizmov in nadzorujejo reakcije sebi v prid. Mednje spadata tudi produkcija energije in izogibanje detekciji in pa odgovoru imunskih celic. Novo možnost terapije bi potemtakem lahko predstavljalo ciljanje povezav med mikrookoljem kostnega mozga in levkemičnimi celicami. V seminarju je podrobno opisano mikrookolje kostnega mozga, pomembne metabolične poti ogljikovih hidratov, aminokislin in maščobnih kislin. Opisani so tudi procesi levkemičnih celic, ki zdravljenju povzročajo težave in neuspešnost. Prav tako opozori na nove potencialne terapije zdravljenja akutne mielonične levkemije. Svoj fokus orientirajo in najdejo prav v mikrookolju kostnega mozga in problematičnih levkemičnih celic. Metabolizem levkemičnih celic, ki povzroča obolenja in preglavice tako obrne v svoj prid. Na koncu pa še poudari na pomembnost dodatnih raziskav in študij zaradi nedovršenih, premalo eksaktnih in pa preveč nasprotujočih-si rezultatov.

==Tonja Oman Sušnik - Metabolizem glukoze, senescenca živčnih celic in Alzheimerjeva bolezen==
Alzheimerjeva bolezen je nevrodegenerativna bolezen z visoko pojavnostjo predvsem med starejšimi. Pri njej sčasoma pride do upada miselnih sposobnosti in razvoja drugih psiholoških motenj. Njen razvoj je sicer že precej dobro raziskan, a zdravila, ki bi v celoti odpravil škodo storjeno na možganih, še ne poznamo. Tekom same bolezni se prepleta mnogo simptomov, ki so odvisni eden od drugega. To so med drugimi inzulinska rezistenca, celična senescenca, nevroinflamacija, nalaganje proteinskih plakov in oslabljen metabolizem glukoze. Najpomembnejša pri tem je celična senescenca, ki je v močni povezavi s staranjem. Ta napade tako živčne celice kot tudi glialne celice in povzroči nalaganje proteinov ter oslabljeno energijsko proizvodnjo celice. Slabša energetska preskrbljenost, kar je za nevrone izredno nevarno in se odraža v njihovem slabšem delovanju ter zmanjšani sinaptični plastičnosti, pa je tudi posledica zmanjšanega prevzema glukoze. Z boleznijo se število glukoznih transporterjev zmanjšuje, veča pa se inzulinska rezistenca. Nevroni zato ne sprejmejo dovolj glukoze za proizvodnjo ATP. Kako bi samo znanje o teh fizioloških okvarah prenesli na zdravljenje, še ni znano, a na to temo poteka mnogo tekočih raziskav. Najbolj ugodno bi bilo odstranjevanje senescentih celic, neposredno targetiranje glukoznega metabolizma ali razbijanje proteinskih plakov. Pozitivne rezultate dajejo tudi raziskave, kjer so opazovali odzivnost metabolizma glukoze na srednje intenzivno vadbo. Ta se je že pri enkrat tedenski vadbi močno izboljšal, napredovanje bolezni pa skoraj popolnoma zaustavilo.

==Jan Hvalec - Uravnavanje metabolizma endotelijskih in imunskih celic==
Endotelijske celice gradijo notranjo površino žil. Njihova funkcija je tesno povezana z ohranjanjem homeostaze tkiv, regulacijo krvnega pretoka in angiogeneze. Za opravljanje svoje naloge imajo prilagojen metabolizem z znižano stopnjo oksidativne fosforilacije in pospešeno glikolizo. Angiogeneza temelji na kolektivni migraciji endotelijskih celic, pri čemer konične celice usmerjajo poganjek, medtem ko ga stebelne celice podaljšujejo s proliferacijo. Rast žil se začne z razgradnjo bazalne membrane in izbiro konične celice pod vplivom vaskularnega endotelijskega faktorja (VEGF) in inducibilnega faktorja hipoksije (HIF), ki ju sproščajo telesne celice v hipoksičnih pogojih. Vlogo konične celice prevzame celica s hitrejšo energetsko proizvodnjo. Ker VEGF in HIF pospešita izražanje encima PFKFB3, ki pospešuje glikolizo, so ravni PFKFB3 višje v konici kot v steblu poganjka. Druga vrsta celic, ki glede na diferenciacijo prilagodi svoj metabolizem, so celice imunskega sistema. T-celice pomagalke in citotoksične celice se zanašajo na glikolizo in presnovo glutamina za tvorbo potrebne količine energije. Medtem ko se M1 makrofagi tudi zanašajo na glikolizo, je vloga metabolne poti drugačna, saj jo prednostno uporabljajo za vzdrževanje polnega stanja delovanja (razgradnjo fagocitiranih delcev). Nasprotno se spominske in regulatorne T-celice zanašajo na oksidacijo maščobnih kislin za učinkovitejšo proizvodnjo ATP, oksidativno fosforilacijo pa uporabljajo za vzdrževanje učinkovitega dolgoročnega delovanja.

==Mark Frantar - Energetika možganov in nevrodegenerativne bolezni==
Možgani so zaradi številnih funkcij, kot so vzdrževanje membranskega potenciala, recikliranje živčnih prenašalcev ter prenašanje signalov, energijsko izjemno zahteven organ. Za delovanje stalno potrebujejo energijo v obliki ATP, ki jo večinoma dobijo iz glukoze z oksidativno fosforilacijo, nekaj pa iz aerobne glikolize v citoplazmi. Za dostavljanje virov energije do nevronov skrbi nevrovaskularna enota, sestavljena iz endotelijskih celic kapilar, astrocitov ter nevronov. Nevroni lahko za vir energije uporabijo tudi ketone ali laktat, ki se proizvede v astrocitih s pretvorbo piruvata z laktat dehidrogenazo, nato pa je transportiran v nevrone skozi monokarboksilatne transporterje (MCT). Pri nevrodegenerativnih boleznih (NDB) pride do okvare metabolizma v možganih, najpogosteje do hipometabolizma glukoze. To vodi v stalno pomanjkanje energije, ki povzroči propad nevronskih celic, nabiranje agregatov nevrotoksičnih proteinov in disfunkcijo mitohondrijev, to pa še nadaljnje okvari metabolizem. Za upočasnjevanje napredovanja NDB obstaha več terapij in zdravil, a jih večina še ni dovolj testirana. Zdravila podpirajo mitohondrijske funkcije, izboljšujejo inzulinsko senzitivnost, zmanjšujejo inflamacijo, ipd. Uporabljajo se tudi ketonski prehranski dodatki ali ketogena dieta, saj gre pri NDB lahko le za okvaro metabolizma glukoze, medtem ko je metabolizem ketonov normalen. Optimizacija energetike možganov je torej temeljnega pomena pri NDB in bi morala biti prvi korak pri poskusih zakasnitve pojava in napredovanja NDB.

==Uma Jordan Ferbežar - Mnogi obrazi piruvat kinaze M2: Poudarek na vlogi pri vnetnih procesih==
Piruvat kinaza je encim, ki katalizira zadnji korak glikolize, v katerem nastaneta ATP in piruvat. Obstaja v štirih različnih izoformih, ki se nahajajo v različnih tkivih, vsi pa imajo katalitično vlogo. Izoform PKM2 je edini, ki se pojavlja v različnih konformacijah, in sicer dveh tetramernih (aktivna R-oblika in neaktivna T-oblika) ter dimerni in monomerni. Prehod med tetramerno in dimerno obliko je izjemno dinamičen in odvisen od okoliščin ter potreb celice, nadzorujejo pa ga številni regulatorji. Aktivna tetramerna oblika sodeluje v glikolizi, medtem ko ima dimerna oblika drugačne vloge - lahko se, na primer, premakne v jedro, kjer nadzoruje izražanje genov ter regulacijo različnih prepisovalnih faktorjev. Dimerno obliko opazimo tudi pri rakavih in imunskih celicah, kjer sodeluje pri spremembi metabolizma iz oksidativne fosforilacije v aerobno glikolizo, kar celicam ob povečani porabi glukoze omogoča zadostno količino ATP ter prekurzorjev za sintezo potrebnih makromolekul, kot so lipidi in proteini. PKM2 v povečanih količinah najdemo pri bolnikih z različnimi vnetnimi obolenji, kot je na primer revmatoidni artritis. Deluje tako na celice prirojenega in pridobljenega imunskega sistema, in sicer predvsem s povečevanjem količine proinflamatornih citokinov preko uravnavanja njihovega izražanja, sodeluje pa tudi pri diferenciaciji T celic in njihovi komunikaciji. Zaradi številnih načinov regulacije predstavlja dobro tarčo za zdravljenje vnetnih obolenj.

==Tinkara Robek - Signalizacija cikla: Intermediati cikla citronske kisline v vlogi miometabokinov==
Cikel citronske kisline predstavlja temelj katabolnih procesov za pridobivanje energetsko bogatih molekul v sklopu metabolizma v živih bitjih. Je ključen korak pri predelavi z ogljikom bogatih spojin pri pridobivanju ATP-molekul. Intermediati cikla so poleg členov cikla in izhodnih spojin za sintezo drugih biološko pomembnih molekul tudi pomembne signalne molekule. Med drugim spadajo med miometabokine; majhne molekule iz skupine citokinov, ki jih izločajo miocite in regulirajo komunikacijo med različnimi tipi tkiv. V večji meri se iz mišičnh celic izločajo v krvni obtok v akutni fazi intenzivnejše fizične aktivnosti in nato opravljajo specifične signalne funkcije v različnih tkivih in s tem vplivajo na potek vnetnih procesov v organizmu in izražanje proteinov. Njihovo funkcionalnost se lahko opredeli kot avtokrino, endokrino in parakrino. Delujejo s pomočjo njim specifičnim transporterjev in se po opravljeni nalogi v večini transportirajo po krvnem obtoku do jeter, kjer se razgradijo. Do sedaj je bilo odkritih in raziskanih največ funkcij citrata in sukcinata, v ospredje pa stopa tudi alfa ketoglutarat, predvsem s svojimi antioksidativnimi učinki. Obsegajo relativno novo področje fiziologije, zaradi česar je potrebno nadaljevati z raziskovanjem značilnosti in vplivov teh molekul za potrditev domnev.

==Nika Makuc - Glutamat-oksaloacetat transaminaza kot terapevtska tarča za zdravljenje ishemične možganske kapi==
Ishemična možganska kap predstavlja večino primerov možganske kapi, do katere pride zaradi zapore krvnih žil. Metode zdravljenja ishemične možganske kapi vključujejo trombolitično zdravljenje, ki pa se uporablja v omejenem obsegu in le pri manj kot 10 % vseh bolnikov z možgansko kapjo. Glutamat je aminokislina, ki ima v osrednjem živčevju funkcijo najpogostejšega vzdražnega nevrotransmiterja, v patoloških razmerah pa deluje kot močan nevrotoksin. Povišan zunajcelični glutamat ima osrednjo vlogo pri poškodbah možganov, do katerih pride zaradi ishemične možganske kapi. Novo terapevtsko tarčo pri zaščiti pred to vrsto poškodb pa predstavlja encim glutamat-oksaloacetat transaminaza (GOT), ki med ishemično možgansko kapjo zniža raven glutamata na mestu kapi. Pri presnovi glutamata s pomočjo GOT v možganskem tkivu nastajajo tudi vmesni produkti cikla citronske kisline. GOT torej lahko med ishemično možgansko kapjo omogoči, da se sicer ekscitotoksični glutamat pretvori v življenjsko pomembne vmesne produkte cikla citronske kisline. Opravljenih je bilo že več študij, ki so se osredotočale na zaščito nevronov z zmanjšanjem glutamata pri ishemični kapi, a so bile v praksi neuspešne. Sistemsko dajanje oksaloacetata predstavlja novo strategijo za zmanjšanje škodljivega učinka glutamata v možganskem tkivu po ishemični kapi. Učinek oksaloacetata namreč temelji predvsem na sposobnosti te molekule, da zmanjša raven glutamata v možganih in krvi zaradi aktivacije encima GOT.

==Brina Klinar - Vloga citrat transportnega proteina in citrata v celičnih procesih==
Citrat transportni protein (CTP) je transportni protein družine transmembranskih prenašalcev SCL25, ki se nahaja v notranji membrani mitohondrija. Njegova primarna vloga je import citrata v mitohondij ali eksport v citosol. Ustrezna aktivnost in pravilno CTP je ključnega pomena za optimalno delovanje celice. Ustrezne količine citrata v citosolu in mitohondriju so namreč pomembne za produkcijo energije, sintezo acetil-CoA kot prekurzorja biosinteze horesterola in maščobnih kislin in kot donorja acetilne skupine za actilacijske reakcije posttranslacijskih in epigenetskih modifikacij, vnetne procese in celično regulacijo. Za ohranjanje homeostaze citrata v citosolu obstajajo tudi alternativne poti, neodvisne od CTP, npr. prevzem ekstracelularnega citrata v celico prek plazmalemskih citratnih transporterjev. Kljub temu, se izguba CTP z mutacijami kaže v hudih napakah zgodnjega možganskega razvoja, kot sta npr. DiGeorgejev sindrom in L-2/D-2-hidroksiglutarna aciduria, kar nakazuje na velik pomen tega transportnega proteina. Po drugi strani pa ima inhibicija CTP inducirana s sintetičnimi inhibitorji CTP obetavno prihodnost na področju zdravljenja raka in presnovnega sindroma.