Wiki FKKT - User contributions [en]

MBT seminarji 2017

2017-06-05T19:21:59Z

Danijela Josic:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017
# Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo "et al"; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017
# Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017
# A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Diagnostic value of recombinant Tp0821 protein in serodiagnosis for syphilis (Yafeng, ''et al''; Letters in applied microbiology, 2016, 62.4: 336-343; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26853900)[[Diagnostična vrednost rekombinantnega proteina Tp0821 v serodiagnostiki sifilisa]]. Tjaša Košir, 19. april 2017.
# Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) [[Zaznavanje zunajcelične miR-210 v urinu kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic]]. Petra Vivod, 12. april 2017
# Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017

'''Cepiva''' (19. april) 
#Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april
# A novel staphylococcal enterotoxin B subunit vaccine candidate elicits protective immune response in a mouse model (J. Y. Choi ''et al''; Toxicon 131, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041010117301071) [[Novo cepivo proti stafilokoknem enterotoksinu B izzove zaščitni imunski odziv pri miši]]. Amadeja Lapornik, 19. april 2017
#Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'') (J. Xing ''et al''; Microbial Pathogenesis 107, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857) [[Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije Vibrio Anguillarum kot kandidatna cepiva za ribo Paralichthys olivaceus]]. Mojca Hunski, 19. aprila 2017

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
# Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001, [[Strukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v Mycobacterium tuberculosis ]], Vid Jazbec
# Transcriptome analysis of the two unrelated fungal β-lactam producers Acremonium chrysogenum and Penicillium chrysogenum: Velvet-regulated genes are major targets during conventional strain improvement programs https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-017-3663-0,[[Analiza transkriptoma Acremonium chrysogenum in Penicillium chrysogenum, dveh nesorodnih gliv, ki proizvajata β-laktame. Ključne tarče v programih izboljšave sevov so velvet-regulirani geni]] , Zala Gluhić
# Biosynthesis of indigo in Escherichia coli expressing self-sufficient CYP102A from ''Streptomyces cattleya'' (H. J. Kim »et al«; Dyes and Pigments, maj 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0143720817300700) [[Biosinteza indiga v E. coli s CYP102A iz Streptomyces cattleya]]. Katja Malovrh, 26. april 2017

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola]. Petra Tavčar, 3. maj 2017
# Engineering ''S. equi'' subsp. ''zooepidemicus'' towards concurrent production of hyaluronic acid and chondroitin biopolymers of biomedical interest (Donatella Cimini ''et al''; AMB Express 7(61), 2017; https://amb-express.springeropen.com/articles/10.1186/s13568-017-0364-7) [[Inženiring Streptococcus zooepidemicus za sočasno proizvodnjo biomedicinsko zanimive hialuronske kisline in hondroitinskih biopolimerov]]. Tim Božič, 3. maj 2017
# CRISPRi-mediated metabolic engineering of ''E. coli'' for O-methylated anthocyanin production (Brady F. Cress ''et al''; Microbal Cell factories 16(10), 2017; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3) [[Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi]]. Tajda Buh, 3. maj 2017

'''Encimi''' (10. maj) 
# Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900)[[ Proizvodnja ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalizator s potencialno uporabo v živilski industriji ]]. Nataša Traven, 10. maj 2017
# Optimized production and characterization of a detergent-stable protease from ''Lysinibacillus fusiformis'' C250R (S. Mechri ''et al''; International journal of biological macromolecules 101, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813017302805) [[Izboljšana produkcija in karakterizacija na detergent odporne proteaze iz bakterije Lysinobasillus fusiformis C250R]]. Bine Tršavec, 10. maj 2017
# Investigating the impact of α-amylase, α-glucosidase and glucoamylase action on yeast-mediated bread dough fermentation and bread sugar levels (Struyf Nore ''et al''; Journal of cereal science 75, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0733521016304775) [[Vpliv dodajanja amilaze, glikozidaze in glukoamilaze na kvasno fermentacijo krušnega testa in raven sladkorja v kruhu]]. Simon Bolta, 10. maj 2017

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Enhancing digestibility and ethanol yield of ''Populus'' wood via expression of an engineered monolignol 4-O-methyltransferase (Y. Cai ''et al''; Nature Communications 7, 2016; http://www.nature.com/articles/ncomms11989) [[Povečana razgradnja biomase in večji izkoristek etanola z izražanjem mutirane monolignol 4-O-metiltransferaze v lesu rastlin rodu Populus]]. Inge Sotlar, 17. maj 2017
#
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5) [[Litična polisaharid monooksigenaza PaLPMO9H, iz glive Podospora anserina, katalizira oksidativno cepitev raznolikih matričnih glikanov celične stene rastlin]]. Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# In vitro metabolic engineering of bioelectricity generation by the complete oxidation of glucose http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616301161 [[Metabolno inženirstvo in vitro za proizvodnjo bioelektrike preko popolne oksidacije glukoze]] Barbara Dušak
# Metabolic engineering of ''Saccharomyces cerevisiae'' for ''de novo'' production of dihydrochalcones with known antioxidant, antidiabetic, and sweet tasting properties (M. Eichenberger in sodelavci; Metabolic Engineering 39, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616301859) [[Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za namen de novo proizvodnje dihidrohalkonov z znanimi antioksidantnimi in antidiabetičnimi učinki ter s sladkim okusom.]]Tjaša Grum, 24. maj 2017
# Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in ''Escherichia coli'' (J. Wang et al; Metabolic Engineering 41, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616302737) [[Vzpostavitev nove biosintezne poti za pridobivanje 3,4-dihidroksibutirične kisline iz ksiloze v bakteriji Escherichia coli]]. Sara Kimm Fuhrmann, 24. maj 2017

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) [[Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v bakteriji Escherichia coli, ki temelji na endogeni kontroli fermentacije]]. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). [[Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo]]. Matic Kovačič, 31. maj 2017
# Anja Herceg

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (7. junij) 
# Matjaž Ivanuša
# Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos (J C Salemo et al; J. Cell Sci. 129 (5), 2016; http://jcs.biologists.org/content/129/5/893). [[Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov]]. Danijela Jošić, 7. junij 2017
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

MBT seminarji 2017

2017-06-05T19:21:39Z

Danijela Josic:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017
# Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo "et al"; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017
# Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017
# A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Diagnostic value of recombinant Tp0821 protein in serodiagnosis for syphilis (Yafeng, ''et al''; Letters in applied microbiology, 2016, 62.4: 336-343; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26853900)[[Diagnostična vrednost rekombinantnega proteina Tp0821 v serodiagnostiki sifilisa]]. Tjaša Košir, 19. april 2017.
# Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) [[Zaznavanje zunajcelične miR-210 v urinu kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic]]. Petra Vivod, 12. april 2017
# Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017

'''Cepiva''' (19. april) 
#Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april
# A novel staphylococcal enterotoxin B subunit vaccine candidate elicits protective immune response in a mouse model (J. Y. Choi ''et al''; Toxicon 131, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041010117301071) [[Novo cepivo proti stafilokoknem enterotoksinu B izzove zaščitni imunski odziv pri miši]]. Amadeja Lapornik, 19. april 2017
#Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'') (J. Xing ''et al''; Microbial Pathogenesis 107, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857) [[Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije Vibrio Anguillarum kot kandidatna cepiva za ribo Paralichthys olivaceus]]. Mojca Hunski, 19. aprila 2017

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
# Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001, [[Strukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v Mycobacterium tuberculosis ]], Vid Jazbec
# Transcriptome analysis of the two unrelated fungal β-lactam producers Acremonium chrysogenum and Penicillium chrysogenum: Velvet-regulated genes are major targets during conventional strain improvement programs https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-017-3663-0,[[Analiza transkriptoma Acremonium chrysogenum in Penicillium chrysogenum, dveh nesorodnih gliv, ki proizvajata β-laktame. Ključne tarče v programih izboljšave sevov so velvet-regulirani geni]] , Zala Gluhić
# Biosynthesis of indigo in Escherichia coli expressing self-sufficient CYP102A from ''Streptomyces cattleya'' (H. J. Kim »et al«; Dyes and Pigments, maj 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0143720817300700) [[Biosinteza indiga v E. coli s CYP102A iz Streptomyces cattleya]]. Katja Malovrh, 26. april 2017

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola]. Petra Tavčar, 3. maj 2017
# Engineering ''S. equi'' subsp. ''zooepidemicus'' towards concurrent production of hyaluronic acid and chondroitin biopolymers of biomedical interest (Donatella Cimini ''et al''; AMB Express 7(61), 2017; https://amb-express.springeropen.com/articles/10.1186/s13568-017-0364-7) [[Inženiring Streptococcus zooepidemicus za sočasno proizvodnjo biomedicinsko zanimive hialuronske kisline in hondroitinskih biopolimerov]]. Tim Božič, 3. maj 2017
# CRISPRi-mediated metabolic engineering of ''E. coli'' for O-methylated anthocyanin production (Brady F. Cress ''et al''; Microbal Cell factories 16(10), 2017; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3) [[Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi]]. Tajda Buh, 3. maj 2017

'''Encimi''' (10. maj) 
# Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900)[[ Proizvodnja ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalizator s potencialno uporabo v živilski industriji ]]. Nataša Traven, 10. maj 2017
# Optimized production and characterization of a detergent-stable protease from ''Lysinibacillus fusiformis'' C250R (S. Mechri ''et al''; International journal of biological macromolecules 101, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813017302805) [[Izboljšana produkcija in karakterizacija na detergent odporne proteaze iz bakterije Lysinobasillus fusiformis C250R]]. Bine Tršavec, 10. maj 2017
# Investigating the impact of α-amylase, α-glucosidase and glucoamylase action on yeast-mediated bread dough fermentation and bread sugar levels (Struyf Nore ''et al''; Journal of cereal science 75, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0733521016304775) [[Vpliv dodajanja amilaze, glikozidaze in glukoamilaze na kvasno fermentacijo krušnega testa in raven sladkorja v kruhu]]. Simon Bolta, 10. maj 2017

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Enhancing digestibility and ethanol yield of ''Populus'' wood via expression of an engineered monolignol 4-O-methyltransferase (Y. Cai ''et al''; Nature Communications 7, 2016; http://www.nature.com/articles/ncomms11989) [[Povečana razgradnja biomase in večji izkoristek etanola z izražanjem mutirane monolignol 4-O-metiltransferaze v lesu rastlin rodu Populus]]. Inge Sotlar, 17. maj 2017
#
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5) [[Litična polisaharid monooksigenaza PaLPMO9H, iz glive Podospora anserina, katalizira oksidativno cepitev raznolikih matričnih glikanov celične stene rastlin]]. Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# In vitro metabolic engineering of bioelectricity generation by the complete oxidation of glucose http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616301161 [[Metabolno inženirstvo in vitro za proizvodnjo bioelektrike preko popolne oksidacije glukoze]] Barbara Dušak
# Metabolic engineering of ''Saccharomyces cerevisiae'' for ''de novo'' production of dihydrochalcones with known antioxidant, antidiabetic, and sweet tasting properties (M. Eichenberger in sodelavci; Metabolic Engineering 39, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616301859) [[Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za namen de novo proizvodnje dihidrohalkonov z znanimi antioksidantnimi in antidiabetičnimi učinki ter s sladkim okusom.]]Tjaša Grum, 24. maj 2017
# Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in ''Escherichia coli'' (J. Wang et al; Metabolic Engineering 41, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616302737) [[Vzpostavitev nove biosintezne poti za pridobivanje 3,4-dihidroksibutirične kisline iz ksiloze v bakteriji Escherichia coli]]. Sara Kimm Fuhrmann, 24. maj 2017

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) [[Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v bakteriji Escherichia coli, ki temelji na endogeni kontroli fermentacije]]. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). [[Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo]]. Matic Kovačič, 31. maj 2017
# Anja Herceg

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (7. junij) 
# Matjaž Ivanuša
# Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos (J C Salemo et al; J. Cell Sci. 129 (5), 2016;http://jcs.biologists.org/content/129/5/893). [[Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov]]. Danijela Jošić, 7. junij 2017
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T19:15:53Z

Danijela Josic: /* Priprava prenašalca in tovornih proteinov */

[http://jcs.biologists.org/content/129/5/893 Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos]

== Uvod ==
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med peptide bogate z [[arginin]]om, amfipatične peptide bogate z [[lizin]]om ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

== Izvedba ==
=== Delovanje prenašalca ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in [[kalmodulin]]a. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava prenašalca in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v sevu bakterije ''E. coli'' BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko histidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v ''E. coli'' in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v sevu bakterije ''E. coli'' BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim [[kalmodulin]]om. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: [[mioglobin]], hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa. Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskega proteina in tovornih proteinov močne, reverzibilne in povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s proteinom TAT-CaM so preverili na celični liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v enaki koncentraciji ter pufer z CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Dostava vseh testiranih tovornih proteinov v citoplazmo celic je bila uspešna, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so raziskovalci uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomembna ovira pri uporabi v celico vstopajočih peptidov je tudi citotoksičnost, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke koncentraciji nekaj 10 µmol/l. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že s koncentracijo 1 µmol/l, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

== Zaključek ==
Fuzijski protein TAT-CaM omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T19:15:10Z

Danijela Josic: /* Preverjanje učinkovitosti in varnosti */

[http://jcs.biologists.org/content/129/5/893 Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos]

== Uvod ==
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med peptide bogate z [[arginin]]om, amfipatične peptide bogate z [[lizin]]om ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

== Izvedba ==
=== Delovanje prenašalca ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in [[kalmodulin]]a. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava prenašalca in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v sevu bakterije ''E. coli'' BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v ''E. coli'' in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v sevu bakterije ''E. coli'' BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim [[kalmodulin]]om. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: [[mioglobin]], hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa. Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskega proteina in tovornih proteinov močne, reverzibilne in povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s proteinom TAT-CaM so preverili na celični liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v enaki koncentraciji ter pufer z CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Dostava vseh testiranih tovornih proteinov v citoplazmo celic je bila uspešna, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so raziskovalci uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomembna ovira pri uporabi v celico vstopajočih peptidov je tudi citotoksičnost, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke koncentraciji nekaj 10 µmol/l. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že s koncentracijo 1 µmol/l, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

== Zaključek ==
Fuzijski protein TAT-CaM omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T19:13:02Z

Danijela Josic: /* Preverjanje učinkovitosti in varnosti */

[http://jcs.biologists.org/content/129/5/893 Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos]

== Uvod ==
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med peptide bogate z [[arginin]]om, amfipatične peptide bogate z [[lizin]]om ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

== Izvedba ==
=== Delovanje prenašalca ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in [[kalmodulin]]a. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava prenašalca in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v sevu bakterije ''E. coli'' BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v ''E. coli'' in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v sevu bakterije ''E. coli'' BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim [[kalmodulin]]om. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: [[mioglobin]], hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa. Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskega proteina in tovornih proteinov močne, reverzibilne in povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s proteinom TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v enaki koncentraciji ter pufer z CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Dostava vseh testiranih tovornih proteinov v citoplazmo celic je bila uspešna, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so raziskovalci uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomembna ovira pri uporabi v celico vstopajočih peptidov je tudi citotoksičnost, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke koncentraciji nekaj 10 µmol/l. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že s koncentracijo 1 µmol/l, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

== Zaključek ==
Fuzijski protein TAT-CaM omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T19:10:18Z

Danijela Josic: /* Testiranje vezave TAT-CaM s tovorom */

[http://jcs.biologists.org/content/129/5/893 Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos]

== Uvod ==
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med peptide bogate z [[arginin]]om, amfipatične peptide bogate z [[lizin]]om ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

== Izvedba ==
=== Delovanje prenašalca ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in [[kalmodulin]]a. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava prenašalca in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v sevu bakterije ''E. coli'' BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v ''E. coli'' in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v sevu bakterije ''E. coli'' BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim [[kalmodulin]]om. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: [[mioglobin]], hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa. Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskega proteina in tovornih proteinov močne, reverzibilne in povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s proteinom TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v enaki koncentraciji ter pufer z CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Dostava vseh testiranih tovornih proteinov v citoplazmo celic je bila uspešna, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so raziskovalci uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomembna ovira pri uporabi v celico vstopajočih peptidov je tudi citotoksičnost, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

== Zaključek ==
Fuzijski protein TAT-CaM omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T19:07:18Z

Danijela Josic: /* Uvod */

[http://jcs.biologists.org/content/129/5/893 Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos]

== Uvod ==
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med peptide bogate z [[arginin]]om, amfipatične peptide bogate z [[lizin]]om ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

== Izvedba ==
=== Delovanje prenašalca ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in [[kalmodulin]]a. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava prenašalca in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v sevu bakterije ''E. coli'' BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v ''E. coli'' in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v sevu bakterije ''E. coli'' BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim [[kalmodulin]]om. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: [[mioglobin]], hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa. Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskih proteinov povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s proteinom TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v enaki koncentraciji ter pufer z CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Dostava vseh testiranih tovornih proteinov v citoplazmo celic je bila uspešna, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so raziskovalci uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomembna ovira pri uporabi v celico vstopajočih peptidov je tudi citotoksičnost, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

== Zaključek ==
Fuzijski protein TAT-CaM omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T19:04:18Z

Danijela Josic: /* Preverjanje učinkovitosti in varnosti */

[http://jcs.biologists.org/content/129/5/893 Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos]

== Uvod ==
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med: peptide bogate z [[arginin]]om, amfipatične peptide bogate z [[lizin]]om ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

== Izvedba ==
=== Delovanje prenašalca ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in [[kalmodulin]]a. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava prenašalca in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v sevu bakterije ''E. coli'' BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v ''E. coli'' in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v sevu bakterije ''E. coli'' BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim [[kalmodulin]]om. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: [[mioglobin]], hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa. Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskih proteinov povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s proteinom TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v enaki koncentraciji ter pufer z CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Dostava vseh testiranih tovornih proteinov v citoplazmo celic je bila uspešna, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so raziskovalci uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomembna ovira pri uporabi v celico vstopajočih peptidov je tudi citotoksičnost, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

== Zaključek ==
Fuzijski protein TAT-CaM omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T18:57:53Z

Danijela Josic: /* Priprava prenašalca in tovornih proteinov */

[http://jcs.biologists.org/content/129/5/893 Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos]

== Uvod ==
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med: peptide bogate z [[arginin]]om, amfipatične peptide bogate z [[lizin]]om ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

== Izvedba ==
=== Delovanje prenašalca ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in [[kalmodulin]]a. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava prenašalca in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v sevu bakterije ''E. coli'' BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v ''E. coli'' in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v sevu bakterije ''E. coli'' BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim [[kalmodulin]]om. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: [[mioglobin]], hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa. Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskih proteinov povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s peptidnim adaptorjem TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v koncentraciji 1 µmol/l ter pufer z 1 mM koncentracijo CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Vsi tovorni proteini so bili s proteinom TAT-CaM uspešno dostavljeni v citoplazmo celic, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so nato uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomemben pomislek je tudi citotoksičnost v celico vstopajočih peptidov, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

== Zaključek ==
Fuzijski protein TAT-CaM omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T18:55:11Z

Danijela Josic: /* Delovanje prenašalca */

[http://jcs.biologists.org/content/129/5/893 Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos]

== Uvod ==
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med: peptide bogate z [[arginin]]om, amfipatične peptide bogate z [[lizin]]om ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

== Izvedba ==
=== Delovanje prenašalca ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in [[kalmodulin]]a. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava prenašalca in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v sevu bakterije ''E. coli'' BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v ''E. coli'' in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v sevu bakterije ''E. coli'' BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim kalmodulinom. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: mioglobin, hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa. Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskih proteinov povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s peptidnim adaptorjem TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v koncentraciji 1 µmol/l ter pufer z 1 mM koncentracijo CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Vsi tovorni proteini so bili s proteinom TAT-CaM uspešno dostavljeni v citoplazmo celic, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so nato uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomemben pomislek je tudi citotoksičnost v celico vstopajočih peptidov, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

== Zaključek ==
Fuzijski protein TAT-CaM omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T18:52:51Z

Danijela Josic: /* Uvod */

[http://jcs.biologists.org/content/129/5/893 Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos]

== Uvod ==
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med: peptide bogate z [[arginin]]om, amfipatične peptide bogate z [[lizin]]om ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

== Izvedba ==
=== Delovanje prenašalca ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in kalmodulina. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava prenašalca in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v sevu bakterije ''E. coli'' BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v ''E. coli'' in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v sevu bakterije ''E. coli'' BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim kalmodulinom. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: mioglobin, hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa. Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskih proteinov povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s peptidnim adaptorjem TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v koncentraciji 1 µmol/l ter pufer z 1 mM koncentracijo CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Vsi tovorni proteini so bili s proteinom TAT-CaM uspešno dostavljeni v citoplazmo celic, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so nato uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomemben pomislek je tudi citotoksičnost v celico vstopajočih peptidov, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

== Zaključek ==
Fuzijski protein TAT-CaM omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T18:43:28Z

Danijela Josic: /* Priprava prenašalca in tovornih proteinov */

[http://jcs.biologists.org/content/129/5/893 Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos]

== Uvod ==
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med: peptide bogate z argininom, amfipatične peptide bogate z lizinom ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

== Izvedba ==
=== Delovanje prenašalca ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in kalmodulina. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava prenašalca in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v sevu bakterije ''E. coli'' BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v ''E. coli'' in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v sevu bakterije ''E. coli'' BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim kalmodulinom. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: mioglobin, hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa. Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskih proteinov povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s peptidnim adaptorjem TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v koncentraciji 1 µmol/l ter pufer z 1 mM koncentracijo CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Vsi tovorni proteini so bili s proteinom TAT-CaM uspešno dostavljeni v citoplazmo celic, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so nato uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomemben pomislek je tudi citotoksičnost v celico vstopajočih peptidov, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

== Zaključek ==
Fuzijski protein TAT-CaM omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T18:42:39Z

Danijela Josic: /* Priprava prenašalca in tovornih proteinov */

[http://jcs.biologists.org/content/129/5/893 Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos]

== Uvod ==
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med: peptide bogate z argininom, amfipatične peptide bogate z lizinom ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

== Izvedba ==
=== Delovanje prenašalca ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in kalmodulina. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava prenašalca in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v sevu bakterije ''E. coli'' BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v E. coli in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v sevu bakterije ''E. coli'' BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim kalmodulinom. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: mioglobin, hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa. Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskih proteinov povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s peptidnim adaptorjem TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v koncentraciji 1 µmol/l ter pufer z 1 mM koncentracijo CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Vsi tovorni proteini so bili s proteinom TAT-CaM uspešno dostavljeni v citoplazmo celic, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so nato uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomemben pomislek je tudi citotoksičnost v celico vstopajočih peptidov, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

== Zaključek ==
Fuzijski protein TAT-CaM omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T18:40:45Z

Danijela Josic: /* Priprava prenašalca in tovornih proteinov */

[http://jcs.biologists.org/content/129/5/893 Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos]

== Uvod ==
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med: peptide bogate z argininom, amfipatične peptide bogate z lizinom ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

== Izvedba ==
=== Delovanje prenašalca ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in kalmodulina. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava prenašalca in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v "E. coli" sevu BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v E. coli in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v "E. coli" sevu BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim kalmodulinom. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: mioglobin, hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa. Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskih proteinov povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s peptidnim adaptorjem TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v koncentraciji 1 µmol/l ter pufer z 1 mM koncentracijo CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Vsi tovorni proteini so bili s proteinom TAT-CaM uspešno dostavljeni v citoplazmo celic, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so nato uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomemben pomislek je tudi citotoksičnost v celico vstopajočih peptidov, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

== Zaključek ==
Fuzijski protein TAT-CaM omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T18:40:18Z

Danijela Josic: /* Priprava prenašalca in tovornih proteinov */

[http://jcs.biologists.org/content/129/5/893 Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos]

== Uvod ==
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med: peptide bogate z argininom, amfipatične peptide bogate z lizinom ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

== Izvedba ==
=== Delovanje prenašalca ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in kalmodulina. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava prenašalca in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v E. coli in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim kalmodulinom. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: mioglobin, hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa. Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskih proteinov povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s peptidnim adaptorjem TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v koncentraciji 1 µmol/l ter pufer z 1 mM koncentracijo CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Vsi tovorni proteini so bili s proteinom TAT-CaM uspešno dostavljeni v citoplazmo celic, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so nato uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomemben pomislek je tudi citotoksičnost v celico vstopajočih peptidov, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

== Zaključek ==
Fuzijski protein TAT-CaM omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T18:38:59Z

Danijela Josic: /* Testiranje vezave TAT-CaM s tovorom */

[http://jcs.biologists.org/content/129/5/893 Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos]

== Uvod ==
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med: peptide bogate z argininom, amfipatične peptide bogate z lizinom ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

== Izvedba ==
=== Delovanje prenašalca ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in kalmodulina. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava prenašalca in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v E. coli in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za N-končno kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim kalmodulinom. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: mioglobin, hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa. Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskih proteinov povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s peptidnim adaptorjem TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v koncentraciji 1 µmol/l ter pufer z 1 mM koncentracijo CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Vsi tovorni proteini so bili s proteinom TAT-CaM uspešno dostavljeni v citoplazmo celic, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so nato uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomemben pomislek je tudi citotoksičnost v celico vstopajočih peptidov, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

== Zaključek ==
Fuzijski protein TAT-CaM omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T18:38:06Z

Danijela Josic: /* V celice vstopajoči peptidi */

[http://jcs.biologists.org/content/129/5/893 Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos]

== Uvod ==
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med: peptide bogate z argininom, amfipatične peptide bogate z lizinom ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

== Izvedba ==
=== Delovanje prenašalca ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in kalmodulina. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava prenašalca in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v E. coli in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za N-končno kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim kalmodulinom. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: mioglobin, hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa (kdis=0,1 s-1). Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskih proteinov povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s peptidnim adaptorjem TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v koncentraciji 1 µmol/l ter pufer z 1 mM koncentracijo CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Vsi tovorni proteini so bili s proteinom TAT-CaM uspešno dostavljeni v citoplazmo celic, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so nato uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomemben pomislek je tudi citotoksičnost v celico vstopajočih peptidov, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

== Zaključek ==
Fuzijski protein TAT-CaM omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T18:34:56Z

Danijela Josic: /* Zaključek */

[http://jcs.biologists.org/content/129/5/893 Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos]

== V celice vstopajoči peptidi ==
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med: peptide bogate z argininom, amfipatične peptide bogate z lizinom ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

== Izvedba ==
=== Delovanje prenašalca ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in kalmodulina. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava prenašalca in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v E. coli in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za N-končno kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim kalmodulinom. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: mioglobin, hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa (kdis=0,1 s-1). Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskih proteinov povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s peptidnim adaptorjem TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v koncentraciji 1 µmol/l ter pufer z 1 mM koncentracijo CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Vsi tovorni proteini so bili s proteinom TAT-CaM uspešno dostavljeni v citoplazmo celic, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so nato uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomemben pomislek je tudi citotoksičnost v celico vstopajočih peptidov, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

== Zaključek ==
Fuzijski protein TAT-CaM omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T18:34:23Z

Danijela Josic: /* Testiranje vezave TAT-CaM fuzijskega proteina s tovorom */

[http://jcs.biologists.org/content/129/5/893 Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos]

== V celice vstopajoči peptidi ==
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med: peptide bogate z argininom, amfipatične peptide bogate z lizinom ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

== Izvedba ==
=== Delovanje prenašalca ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in kalmodulina. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava prenašalca in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v E. coli in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za N-končno kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim kalmodulinom. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: mioglobin, hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa (kdis=0,1 s-1). Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskih proteinov povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s peptidnim adaptorjem TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v koncentraciji 1 µmol/l ter pufer z 1 mM koncentracijo CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Vsi tovorni proteini so bili s proteinom TAT-CaM uspešno dostavljeni v citoplazmo celic, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so nato uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomemben pomislek je tudi citotoksičnost v celico vstopajočih peptidov, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

== Zaključek ==
Fuzijski protein TAT-CaM torej omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T18:33:17Z

Danijela Josic: /* Priprava fuzijskega peptidnega adaptorja in tovornih proteinov */

[http://jcs.biologists.org/content/129/5/893 Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos]

== V celice vstopajoči peptidi ==
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med: peptide bogate z argininom, amfipatične peptide bogate z lizinom ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

== Izvedba ==
=== Delovanje prenašalca ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in kalmodulina. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava prenašalca in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v E. coli in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za N-končno kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim kalmodulinom. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: mioglobin, hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM fuzijskega proteina s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa (kdis=0,1 s-1). Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskih proteinov povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s peptidnim adaptorjem TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v koncentraciji 1 µmol/l ter pufer z 1 mM koncentracijo CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Vsi tovorni proteini so bili s proteinom TAT-CaM uspešno dostavljeni v citoplazmo celic, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so nato uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomemben pomislek je tudi citotoksičnost v celico vstopajočih peptidov, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

== Zaključek ==
Fuzijski protein TAT-CaM torej omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T18:32:06Z

Danijela Josic: /* Zaključek */

[http://jcs.biologists.org/content/129/5/893 Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos]

== V celice vstopajoči peptidi ==
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med: peptide bogate z argininom, amfipatične peptide bogate z lizinom ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

== Izvedba ==
=== Delovanje prenašalca ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in kalmodulina. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava fuzijskega peptidnega adaptorja in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v E. coli in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za N-končno kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim kalmodulinom. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: mioglobin, hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM fuzijskega proteina s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa (kdis=0,1 s-1). Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskih proteinov povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s peptidnim adaptorjem TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v koncentraciji 1 µmol/l ter pufer z 1 mM koncentracijo CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Vsi tovorni proteini so bili s proteinom TAT-CaM uspešno dostavljeni v citoplazmo celic, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so nato uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomemben pomislek je tudi citotoksičnost v celico vstopajočih peptidov, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

== Zaključek ==
Fuzijski protein TAT-CaM torej omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T18:31:32Z

Danijela Josic: /* Delovanje prenašalca */

[http://jcs.biologists.org/content/129/5/893 Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos]

== V celice vstopajoči peptidi ==
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med: peptide bogate z argininom, amfipatične peptide bogate z lizinom ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

== Izvedba ==
=== Delovanje prenašalca ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in kalmodulina. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava fuzijskega peptidnega adaptorja in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v E. coli in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za N-končno kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim kalmodulinom. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: mioglobin, hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM fuzijskega proteina s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa (kdis=0,1 s-1). Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskih proteinov povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s peptidnim adaptorjem TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v koncentraciji 1 µmol/l ter pufer z 1 mM koncentracijo CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Vsi tovorni proteini so bili s proteinom TAT-CaM uspešno dostavljeni v citoplazmo celic, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so nato uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomemben pomislek je tudi citotoksičnost v celico vstopajočih peptidov, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

=== Zaključek ===
Fuzijski protein TAT-CaM torej omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T18:30:11Z

Danijela Josic: /* V celice vstopajoči peptidi */

[http://jcs.biologists.org/content/129/5/893 Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos]

== V celice vstopajoči peptidi ==
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med: peptide bogate z argininom, amfipatične peptide bogate z lizinom ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

=== Delovanje prenašalca ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in kalmodulina. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava fuzijskega peptidnega adaptorja in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v E. coli in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za N-končno kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim kalmodulinom. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: mioglobin, hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM fuzijskega proteina s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa (kdis=0,1 s-1). Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskih proteinov povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s peptidnim adaptorjem TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v koncentraciji 1 µmol/l ter pufer z 1 mM koncentracijo CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Vsi tovorni proteini so bili s proteinom TAT-CaM uspešno dostavljeni v citoplazmo celic, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so nato uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomemben pomislek je tudi citotoksičnost v celico vstopajočih peptidov, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

=== Zaključek ===
Fuzijski protein TAT-CaM torej omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T18:29:11Z

Danijela Josic:

[http://jcs.biologists.org/content/129/5/893 Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos]

=== V celice vstopajoči peptidi ===
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med: peptide bogate z argininom, amfipatične peptide bogate z lizinom ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

=== Delovanje prenašalca ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in kalmodulina. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava fuzijskega peptidnega adaptorja in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v E. coli in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za N-končno kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim kalmodulinom. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: mioglobin, hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM fuzijskega proteina s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa (kdis=0,1 s-1). Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskih proteinov povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s peptidnim adaptorjem TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v koncentraciji 1 µmol/l ter pufer z 1 mM koncentracijo CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Vsi tovorni proteini so bili s proteinom TAT-CaM uspešno dostavljeni v citoplazmo celic, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so nato uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomemben pomislek je tudi citotoksičnost v celico vstopajočih peptidov, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

=== Zaključek ===
Fuzijski protein TAT-CaM torej omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T18:26:05Z

Danijela Josic:

Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos Zunanja povezava: [http://jcs.biologists.org/content/129/5/893]

=== V celice vstopajoči peptidi ===
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med: peptide bogate z argininom, amfipatične peptide bogate z lizinom ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

=== Delovanje ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in kalmodulina. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava fuzijskega peptidnega adaptorja in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v E. coli in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za N-končno kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim kalmodulinom. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: mioglobin, hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM fuzijskega proteina s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa (kdis=0,1 s-1). Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskih proteinov povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s peptidnim adaptorjem TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v koncentraciji 1 µmol/l ter pufer z 1 mM koncentracijo CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Vsi tovorni proteini so bili s proteinom TAT-CaM uspešno dostavljeni v citoplazmo celic, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so nato uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomemben pomislek je tudi citotoksičnost v celico vstopajočih peptidov, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

=== Zaključek ===
Fuzijski protein TAT-CaM torej omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T18:23:35Z

Danijela Josic: /* Zaključek */

Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos

=== V celice vstopajoči peptidi ===
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med: peptide bogate z argininom, amfipatične peptide bogate z lizinom ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

=== Delovanje ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in kalmodulina. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava fuzijskega peptidnega adaptorja in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v E. coli in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za N-končno kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim kalmodulinom. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: mioglobin, hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM fuzijskega proteina s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa (kdis=0,1 s-1). Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskih proteinov povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s peptidnim adaptorjem TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v koncentraciji 1 µmol/l ter pufer z 1 mM koncentracijo CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Vsi tovorni proteini so bili s proteinom TAT-CaM uspešno dostavljeni v citoplazmo celic, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so nato uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomemben pomislek je tudi citotoksičnost v celico vstopajočih peptidov, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

=== Zaključek ===
Fuzijski protein TAT-CaM torej omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

[[MBT seminarji 2017]]

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T18:22:46Z

Danijela Josic: /* Zaključek */

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T18:21:09Z

Danijela Josic:

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T18:20:42Z

Danijela Josic: /* Preverjanje učinkovitosti in varnosti */

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos

=== V celice vstopajoči peptidi ===
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med: peptide bogate z argininom, amfipatične peptide bogate z lizinom ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

=== Delovanje ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in kalmodulina. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava fuzijskega peptidnega adaptorja in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v E. coli in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za N-končno kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim kalmodulinom. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: mioglobin, hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM fuzijskega proteina s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa (kdis=0,1 s-1). Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskih proteinov povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s peptidnim adaptorjem TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v koncentraciji 1 µmol/l ter pufer z 1 mM koncentracijo CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Vsi tovorni proteini so bili s proteinom TAT-CaM uspešno dostavljeni v citoplazmo celic, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so nato uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomemben pomislek je tudi citotoksičnost v celico vstopajočih peptidov, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

=== Zaključek ===
Fuzijski protein TAT-CaM torej omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T18:18:18Z

Danijela Josic:

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos

=== V celice vstopajoči peptidi ===
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med: peptide bogate z argininom, amfipatične peptide bogate z lizinom ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

=== Delovanje ===
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in kalmodulina. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

=== Priprava fuzijskega peptidnega adaptorja in tovornih proteinov ===
Fuzijski protein so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v E. coli in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za N-končno kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim kalmodulinom. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: mioglobin, hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

=== Testiranje vezave TAT-CaM fuzijskega proteina s tovorom ===
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa (kdis=0,1 s-1). Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskih proteinov povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

=== Preverjanje učinkovitosti in varnosti ===
Učinkovitost vnosa tovora v celice s peptidnim adaptorjem TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v koncentraciji 1 µmol/l ter pufer z 1 mM koncentracijo CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.

Vsi tovorni proteini so bili s proteinom TAT-CaM uspešno dostavljeni v citoplazmo celic, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so nato uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomemben pomislek je tudi citotoksičnost v celico vstopajočih peptidov, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

Fuzijski protein TAT-CaM torej omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

2017-06-05T18:15:51Z

Danijela Josic: New page: Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal esc...

Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos

=== V celice vstopajoči peptidi ===
V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijomed: peptide bogate z argininom, amfipatične peptide bogate z lizinom ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.
Delovanje
Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in kalmodulina. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.
Priprava fuzijskega peptidnega adaptorja in tovornih proteinov
Fuzijski protein so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko heksahistidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v E. coli in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za N-končno kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v E. coli sevu BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim kalmodulinom. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: mioglobin, hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.
Testiranje delovanja TAT-CaM fuzijskega proteina
Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa (kdis=0,1 s-1). Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskih proteinov povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.
Preverjanje učinkovitosti in varnosti
Učinkovitost vnosa tovora v celice s peptidnim adaptorjem TAT-CaM so preverili na liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v koncentraciji 1 µmol/l ter pufer z 1 mM koncentracijo CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo.
Vsi tovorni proteini so bili s proteinom TAT-CaM uspešno dostavljeni v citoplazmo celic, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so nato uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.
Pomemben pomislek je tudi citotoksičnost v celico vstopajočih peptidov, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke pri nekaj 10 µM koncentracijah. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že z 1 µM koncentracijo, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.
Fuzijski protein TAT-CaM torej omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

MBT seminarji 2017

2017-06-05T18:11:35Z

Danijela Josic:

MBT seminarji 2017

2017-06-05T18:09:01Z

Danijela Josic:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017
# Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo "et al"; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017
# Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017
# A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Diagnostic value of recombinant Tp0821 protein in serodiagnosis for syphilis (Yafeng, ''et al''; Letters in applied microbiology, 2016, 62.4: 336-343; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26853900)[[Diagnostična vrednost rekombinantnega proteina Tp0821 v serodiagnostiki sifilisa]]. Tjaša Košir, 19. april 2017.
# Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) [[Zaznavanje zunajcelične miR-210 v urinu kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic]]. Petra Vivod, 12. april 2017
# Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017

'''Cepiva''' (19. april) 
#Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april
# A novel staphylococcal enterotoxin B subunit vaccine candidate elicits protective immune response in a mouse model (J. Y. Choi ''et al''; Toxicon 131, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041010117301071) [[Novo cepivo proti stafilokoknem enterotoksinu B izzove zaščitni imunski odziv pri miši]]. Amadeja Lapornik, 19. april 2017
#Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'') (J. Xing ''et al''; Microbial Pathogenesis 107, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857) [[Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije Vibrio Anguillarum kot kandidatna cepiva za ribo Paralichthys olivaceus]]. Mojca Hunski, 19. aprila 2017

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
# Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001, [[Strukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v Mycobacterium tuberculosis ]], Vid Jazbec
# Transcriptome analysis of the two unrelated fungal β-lactam producers Acremonium chrysogenum and Penicillium chrysogenum: Velvet-regulated genes are major targets during conventional strain improvement programs https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-017-3663-0,[[Analiza transkriptoma Acremonium chrysogenum in Penicillium chrysogenum, dveh nesorodnih gliv, ki proizvajata β-laktame. Ključne tarče v programih izboljšave sevov so velvet-regulirani geni]] , Zala Gluhić
# Biosynthesis of indigo in Escherichia coli expressing self-sufficient CYP102A from ''Streptomyces cattleya'' (H. J. Kim »et al«; Dyes and Pigments, maj 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0143720817300700) [[Biosinteza indiga v E. coli s CYP102A iz Streptomyces cattleya]]. Katja Malovrh, 26. april 2017

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola]. Petra Tavčar, 3. maj 2017
# Engineering ''S. equi'' subsp. ''zooepidemicus'' towards concurrent production of hyaluronic acid and chondroitin biopolymers of biomedical interest (Donatella Cimini ''et al''; AMB Express 7(61), 2017; https://amb-express.springeropen.com/articles/10.1186/s13568-017-0364-7) [[Inženiring Streptococcus zooepidemicus za sočasno proizvodnjo biomedicinsko zanimive hialuronske kisline in hondroitinskih biopolimerov]]. Tim Božič, 3. maj 2017
# CRISPRi-mediated metabolic engineering of ''E. coli'' for O-methylated anthocyanin production (Brady F. Cress ''et al''; Microbal Cell factories 16(10), 2017; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3) [[Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi]]. Tajda Buh, 3. maj 2017

'''Encimi''' (10. maj) 
# Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900)[[ Proizvodnja ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalizator s potencialno uporabo v živilski industriji ]]. Nataša Traven, 10. maj 2017
# Optimized production and characterization of a detergent-stable protease from ''Lysinibacillus fusiformis'' C250R (S. Mechri ''et al''; International journal of biological macromolecules 101, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813017302805) [[Izboljšana produkcija in karakterizacija na detergent odporne proteaze iz bakterije Lysinobasillus fusiformis C250R]]. Bine Tršavec, 10. maj 2017
# Investigating the impact of α-amylase, α-glucosidase and glucoamylase action on yeast-mediated bread dough fermentation and bread sugar levels (Struyf Nore ''et al''; Journal of cereal science 75, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0733521016304775) [[Vpliv dodajanja amilaze, glikozidaze in glukoamilaze na kvasno fermentacijo krušnega testa in raven sladkorja v kruhu]]. Simon Bolta, 10. maj 2017

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Enhancing digestibility and ethanol yield of ''Populus'' wood via expression of an engineered monolignol 4-O-methyltransferase (Y. Cai ''et al''; Nature Communications 7, 2016; http://www.nature.com/articles/ncomms11989) [[Povečana razgradnja biomase in večji izkoristek etanola z izražanjem mutirane monolignol 4-O-metiltransferaze v lesu rastlin rodu Populus]]. Inge Sotlar, 17. maj 2017
#
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5) [[Litična polisaharid monooksigenaza PaLPMO9H, iz glive Podospora anserina, katalizira oksidativno cepitev raznolikih matričnih glikanov celične stene rastlin]]. Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# In vitro metabolic engineering of bioelectricity generation by the complete oxidation of glucose http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616301161 [[Metabolno inženirstvo in vitro za proizvodnjo bioelektrike preko popolne oksidacije glukoze]] Barbara Dušak
# Metabolic engineering of ''Saccharomyces cerevisiae'' for ''de novo'' production of dihydrochalcones with known antioxidant, antidiabetic, and sweet tasting properties (M. Eichenberger in sodelavci; Metabolic Engineering 39, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616301859) [[Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za namen de novo proizvodnje dihidrohalkonov z znanimi antioksidantnimi in antidiabetičnimi učinki ter s sladkim okusom.]]Tjaša Grum, 24. maj 2017
# Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in ''Escherichia coli'' (J. Wang et al; Metabolic Engineering 41, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616302737) [[Vzpostavitev nove biosintezne poti za pridobivanje 3,4-dihidroksibutirične kisline iz ksiloze v bakteriji Escherichia coli]]. Sara Kimm Fuhrmann, 24. maj 2017

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) [[Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v bakteriji Escherichia coli, ki temelji na endogeni kontroli fermentacije]]. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). [[Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo]]. Matic Kovačič, 31. maj 2017
# Anja Herceg

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (7. junij) 
# Matjaž Ivanuša
# Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos (J C Salemo et al; J. Cell Sci. 129 (5), 2016; http://jcs.biologists.org/content/129/5/893). Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov. Danijela Jošić, 7. junij 2017
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

2017-bionano-seminar

2017-05-15T19:23:06Z

Danijela Josic: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Tema seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent/ka 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent/ka 2'''
|-
| Peter Prezelj||22.03.17||Spreminjanje vsebnosti in karakteristik hranilnih snovi v živilih in pripravljeni hrani z uporabo kovalentnih modifikacij, prečnega povezovanja in encimov||Vita Vidmar||Zala Gluhić
|-
| Boštjan Petrič||22.03.17||Reverzibilno tiskanje s peptidnimi /proteinskimi pigmenti, kovalentno vezanimi na celulozo prek amidne vezi||Luka Kavčič||Judita Avbelj
|-
| Ema Guštin||22.03.17||Nanoprevleka hrustanca za preprečitev osteoartritisa||Mojca Juteršek||Vid Jazbec
|-
| Tjaša Lapanja||29.03.17||Modificirana CHO celična linija prilagojena za ultrazvočno indukcijo izražanja proteinov v industrijskih bioreaktorjih||Bojana Lazović||Vita Vidmar
|-
| Maruša Prolič Kalinšek||29.03.17||Senzor za detekcijo Legionella bakterij na osnovi polidiacetilena||Eva Korošec||Luka Kavčič
|-
| Domen Klofutar||29.03.17||Novi načini prenosa informacij z izrabo kapacitet DNA: Prenos šifrirne in/ali steganografske DNA v ustni votlini preko naravno prisotnih gostiteljev Lactobacillus Casei in Veillonella Parvula||Tajda Buh||Mojca Juteršek
|-
| Simon Bolta||05.04.17||Z vezavo zunajceličnega kalcija do zmanjšanja bolečine v mišicah po treningu||Peter Prezelj||Bojana Lazović
|-
| Tomaž Rozmarič||05.04.17||Korekcija vida s pomočjo nano robotov||Boštjan Petrič||Eva Korošec
|-
| Urša Kapš||05.04.17||Nanodelci za strjevanje krvi||Ema Guštin||Tajda Buh
|-
| Julija Mazej||12.04.17||kapsule za vzpostavitev ravnovesja crevesne mikrobiote||Tjaša Lapanja||Peter Prezelj
|-
| Nataša Žigante||12.04.17||opis teme ali naslov||Maruša Prolič Kalinšek||Boštjan Petrič
|-
| Anja Herceg||12.04.17||Boj proti koroziji s pomočjo superhidrofobnega sol-gela z enkapsuliranimi zaščitnimi bakterijami||Domen Klofutar||Ema Guštin
|-
| Mirjam Kmetič||19.04.17||Nanoprotistrup na osnovi nanodelcev, ki vsebujejo inhibitor varespladib||Simon Bolta||Tjaša Lapanja
|-
| Mojca Kostanjevec||19.04.17||Nanodiski - dostavni sistem za tarčno ciljanje EpCAM na površini rakavih epitelijskih celic||Tomaž Rozmarič||Maruša Prolič Kalinšek
|-
| Jan Rozman||19.04.17||Sinteza nealergenega rekombinantnega kazeina za jedilno / biorazgradljivo embalažo||Urša Kapš||Domen Klofutar
|-
| Barbara Dušak||03.05.17||Izboljšava gojenja mesa n vitro||Julija Mazej||Simon Bolta
|-
| Mateja Cigoj||03.05.17||Probiotik z dodatkom nanodelcev za zdravljenje celiakije. Uporaba probiotičnih bakterij, ki izločajo peptidaze za razgradnjo glutena do neimunogenih fragmentov, in nanodelcev, ki vsebujejo modificirane naravne glutenske peptide specifične za HLA-DQ2 receptorje na limfocitih T, ki zavrejo Th1 posredovan avtoimunski odziv na gluten.||Nataša Žigante||Tomaž Rozmarič
|-
| Toni Nagode||03.05.17||Reverzibilno pritrjevanje predmetov na osnovi nanoslojev iz biotina in avidina||Anja Herceg||Urša Kapš
|-
| Tim Božič||10.05.17||Optimizacija pigmentov povodnega konja za proizvodnjo sončne kreme||Mirjam Kmetič||Julija Mazej
|-
| Darja Božič||10.05.17||Kontaktne leče iz proteinsko vtisnjenega polimera za zmanjšanje verjetnosti pojava proteinskih depozitov in okužb||Mojca Kostanjevec||Nataša Žigante
|-
| Petra Tavčar||10.05.17||Odstranjevalec škodljivih E-jev in BPA iz kupljenih pijač na osnovi kovalentno pritrjenih protiteles in aptamerov||Jan Rozman||Anja Herceg
|-
| Marjeta Horvat||17.05.17||FeO nanodelci za učinkovitejše odpravljanje zobnega kariesa||Barbara Dušak||Mirjam Kmetič
|-
| Danijela Jošić||17.05.17||Gensko spremenjen Lactobacillus s spermicidnim in protimikrobnim delovanjem za dolgotrajno zaščito pred zanositvijo in spolno prenosljivimi boleznimi.||Mateja Cigoj||Mojca Kostanjevec
|-
| Tina Kuhar||17.05.17||Gensko spremenjen tobak, ki pomaga pri odvanjanju od kajenja||Toni Nagode||Jan Rozman
|-
| Nika Strašek||24.05.17||Uporabniku dostopen diagnostični test za zaznavo okužbe s boreliozo in klopnim meningitisom||Tim Božič||Barbara Dušak
|-
| Eva Vidak||24.05.17||Biosenzor za CO na osnovi transkripcijskega faktorja CooA iz bakterije Rhodospirillum rubrum||Darja Božič||Mateja Cigoj
|-
| Alja Zgonc||24.05.17||Senzor za zaznavanje miRNA v urinu za diagnozo nevrodegenerativnih bolezni||Petra Tavčar||Toni Nagode
|-
| Zala Gluhić||31.05.17||Varnejše uživanje alkohola z uporabo odorant-binding proteina LUSH.||Marjeta Horvat||Tim Božič
|-
| Judita Avbelj||31.05.17||Nanonaprava iz bioloških delov, ki z absorbcijo in razgradnjo delcev iz zraka preprečuje različne alergijske reakcije.||Danijela Jošić||Darja Božič
|-
| Vid Jazbec||31.05.17||Gensko spremenjene čebele odporne na insekticide.||Tina Kuhar||Petra Tavčar
|-
| Vita Vidmar||31.05.17||'Hot start' transglutaminaza za popravljanje razcepljenih lasnih konic||Nika Strašek||Marjeta Horvat
|-
| Luka Kavčič||31.05.17||Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)||Eva Vidak||Danijela Jošić
|-
| Mojca Juteršek||31.05.17||Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)||Alja Zgonc||Tina Kuhar
|-
| Bojana Lazović||07.06.17||Poenostavljen pristop k razvoju novih senzorjev FRET (Förster resonance energy transfer)||Zala Gluhić||Nika Strašek
|-
| Eva Korošec||07.06.17||Tattoo biosenzor za raven alkohola v krvi na osnovi alkohol oksidaze, povezan s pametnim telefonom, računalnikom ali avtomobilskimi ključi.||Judita Avbelj||Eva Vidak
|-
| Tajda Buh||07.06.17||opis teme ali naslov||Vid Jazbec||Alja Zgonc
|}

==Naloga==
'''Vaša naloga je: '''
Študent pripravi projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt.
Predlagana struktura:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Prva stran seminarja naj vsebuje naslov projekta, avtorje, povzetek (od 130 do 160 besed) in grafični povzetek (čez približno pol strani)
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo od 2000 do 2500 besed (vključno z literaturo). Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte '''dva dneva pred datumom predstavitve''', ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Vsak recenzent predlaga izboljšavo projekta.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik dva dneva pred predstavitvijo do polnoči.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem receptu:
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.doc(x) za seminar, npr. 19_nano_Craik_Venter.docx
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.ppt(x) za prezentacijo, npr. 19_nano_Craik_Venter.pptx

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

MBT seminarji 2017

2017-05-14T12:00:31Z

Danijela Josic:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017
# Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo "et al"; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017
# Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017
# A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Diagnostic value of recombinant Tp0821 protein in serodiagnosis for syphilis (Yafeng, ''et al''; Letters in applied microbiology, 2016, 62.4: 336-343; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26853900)[[Diagnostična vrednost rekombinantnega proteina Tp0821 v serodiagnostiki sifilisa]]. Tjaša Košir, 19. april 2017.
# Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) [[Zaznavanje zunajcelične miR-210 v urinu kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic]]. Petra Vivod, 12. april 2017
# Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017

'''Cepiva''' (19. april) 
#Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april
# A novel staphylococcal enterotoxin B subunit vaccine candidate elicits protective immune response in a mouse model (J. Y. Choi ''et al''; Toxicon 131, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041010117301071) [[Novo cepivo proti stafilokoknem enterotoksinu B izzove zaščitni imunski odziv pri miši]]. Amadeja Lapornik, 19. april 2017
#Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'') (J. Xing ''et al''; Microbial Pathogenesis 107, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857) [[Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije Vibrio Anguillarum kot kandidatna cepiva za ribo Paralichthys olivaceus]]. Mojca Hunski, 19. aprila 2017

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
# Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001, [[Strukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v Mycobacterium tuberculosis ]], Vid Jazbec
# Transcriptome analysis of the two unrelated fungal β-lactam producers Acremonium chrysogenum and Penicillium chrysogenum: Velvet-regulated genes are major targets during conventional strain improvement programs https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-017-3663-0,[[Analiza transkriptoma Acremonium chrysogenum in Penicillium chrysogenum, dveh nesorodnih gliv, ki proizvajata β-laktame. Ključne tarče v programih izboljšave sevov so velvet-regulirani geni]] , Zala Gluhić
# Biosynthesis of indigo in Escherichia coli expressing self-sufficient CYP102A from ''Streptomyces cattleya'' (H. J. Kim »et al«; Dyes and Pigments, maj 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0143720817300700) [[Biosinteza indiga v E. coli s CYP102A iz Streptomyces cattleya]]. Katja Malovrh, 26. april 2017

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola]. Petra Tavčar, 3. maj 2017
# Engineering ''S. equi'' subsp. ''zooepidemicus'' towards concurrent production of hyaluronic acid and chondroitin biopolymers of biomedical interest (Donatella Cimini ''et al''; AMB Express 7(61), 2017; https://amb-express.springeropen.com/articles/10.1186/s13568-017-0364-7) [[Inženiring Streptococcus zooepidemicus za sočasno proizvodnjo biomedicinsko zanimive hialuronske kisline in hondroitinskih biopolimerov]]. Tim Božič, 3. maj 2017
# CRISPRi-mediated metabolic engineering of ''E. coli'' for O-methylated anthocyanin production (Brady F. Cress ''et al''; Microbal Cell factories 16(10), 2017; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3) [[Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi]]. Tajda Buh, 3. maj 2017

'''Encimi''' (10. maj) 
# Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900)[[ Proizvodnja ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalizator s potencialno uporabo v živilski industriji ]]. Nataša Traven, 10. maj 2017
# Optimized production and characterization of a detergent-stable protease from ''Lysinibacillus fusiformis'' C250R (S. Mechri ''et al''; International journal of biological macromolecules 101, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813017302805) [[Izboljšana produkcija in karakterizacija na detergent odporne proteaze iz bakterije Lysinobasillus fusiformis C250R]]. Bine Tršavec, 10. maj 2017
# Investigating the impact of α-amylase, α-glucosidase and glucoamylase action on yeast-mediated bread dough fermentation and bread sugar levels (Struyf Nore ''et al''; Journal of cereal science 75, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0733521016304775) [[Vpliv dodajanja amilaze, glikozidaze in glukoamilaze na kvasno fermentacijo krušnega testa in raven sladkorja v kruhu]]. Simon Bolta, 10. maj 2017

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Inge Sotlar
#
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# In vitro metabolic engineering of bioelectricity generation by the complete oxidation of glucose http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616301161 Barbara Dušak
# Tjaša Grum
# Sara Kimm Fuhrmann

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
# Anja Herceg

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij) 
# Matjaž Ivanuša
# Danijela Jošić
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

2017-bionano-seminar

2017-03-15T20:04:46Z

Danijela Josic: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
! Ime in priimek !! Datum predstavitve !! Tema seminarja
|-
! Peter Prezelj
| 22.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Boštjan Petrič
| 22.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Ema Guštin
| 22.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Tjaša Lapanja
| 29.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Maruša Prolič Kalinšek
| 29.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Domen Klofutar
| 29.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Simon Bolta
| 05.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Tomaž Rozmarič
| 05.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Urša Kapš
| 05.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Julija Mazej
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Nataša Žigante
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Anja Herceg
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mirjam Kmetič
| 19.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mojca Kostanjevec
| 19.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Jan Rozman
| 19.04.17 || Sinteza nealergenega rekombinantnega kazeina za jedilno / biorazgradljivo embalažo
|-
! Barbara Dušak
| 03.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mateja Cigoj
| 03.05.17 || Probiotik z dodatkom nanodelcev za zdravljenje celiakije. Uporaba probiotičnih bakterij, ki izločajo peptidaze za razgradnjo glutena do neimunogenih fragmentov, in nanodelcev, ki vsebujejo modificirane naravne glutenske peptide specifične za HLA-DQ2 receptorje na limfocitih T, ki zavrejo Th1 posredovan avtoimunski odziv na gluten.
|-
! Toni Nagode
| 03.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Tim Božič
| 10.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Darja Božič
| 10.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Petra Tavčar
| 10.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Marjeta Horvat
| 17.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Danijela Jošić
| 17.05.17 || Gensko spremenjen Lactobacillus, ki izloča nanodelce z spermicidnim in protimikrobnim delovanjem za dolgotrajno zaščito pred zanositvijo in spolno prenosljivimi boleznimi.
|-
! Tina Kuhar
| 17.05.17 || Flaška za vodo z bionanosenzorjem za takojšnjo zaznavo kvalitete oziroma pitnosti nalite vode.
|-
! Nika Strašek
| 24.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Eva Vidak
| 24.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Alja Zgonc
| 24.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Zala Gluhić
| 31.05.17 || Varnejše uživanje alkohola z uporabo odorant-binding proteina LUSH.
|-
! Judita Avbelj
| 31.05.17 || Nanonaprava iz bioloških delov, ki z absorbcijo in razgradnjo delcev iz zraka preprečuje različne alergijske reakcije.
|-
! Vid Jazbec
| 31.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Vita Vidmar
| 07.06.17 || 'Hot start' transglutaminaza za popravljanje razcepljenih lasnih konic
|-
! Luka Kavčič
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mojca Juteršek
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|-
! Bojana Lazović
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|-
! Eva Korošec
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|-
! Tajda Buh
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|}

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja najdete v [http://ucilnica.fkkt.uni-lj.si/ spletni učilnici].

==Naloga==
'''Vaša naloga je: '''
Študent pripravi projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt.
Predlagana struktura:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Prva stran seminarja naj vsebuje naslov projekta, avtorje, povzetek (od 130 do 160 besed) in grafični povzetek (čez približno pol strani)
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo od 2000 do 2500 besed (vključno z literaturo). Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo pripombe k projektu in postavijo po dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik en dan pred predstavitvijo do polnoči.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem receptu:
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.doc(x) za seminar, npr. 19_nano_Craik_Venter.docx
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.ppt(x) za prezentacijo, npr. 19_nano_Craik_Venter.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1WdCXoXo1zkRrVlLKIcEV1z_MyhavU-3ERBm9n2oiawI/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do predstavitve seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1ToLPn78T9W3G6Hm5hV0mLseFYghiLQMlRPGb0J5zft8/viewform mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.
Na [http://bit.ly/bntmnenja tej strani] lahko preverite, če ste svoje mnenje za določen seminar že oddali in če je bil oddan pravočasno.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

2017-bionano-seminar

2017-03-15T20:02:56Z

Danijela Josic: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
! Ime in priimek !! Datum predstavitve !! Tema seminarja
|-
! Peter Prezelj
| 22.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Boštjan Petrič
| 22.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Ema Guštin
| 22.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Tjaša Lapanja
| 29.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Maruša Prolič Kalinšek
| 29.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Domen Klofutar
| 29.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Simon Bolta
| 05.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Tomaž Rozmarič
| 05.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Urša Kapš
| 05.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Julija Mazej
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Nataša Žigante
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Anja Herceg
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mirjam Kmetič
| 19.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mojca Kostanjevec
| 19.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Jan Rozman
| 19.04.17 || Sinteza nealergenega rekombinantnega kazeina za jedilno / biorazgradljivo embalažo
|-
! Barbara Dušak
| 03.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mateja Cigoj
| 03.05.17 || Probiotik z dodatkom nanodelcev za zdravljenje celiakije. Uporaba probiotičnih bakterij, ki izločajo peptidaze za razgradnjo glutena do neimunogenih fragmentov, in nanodelcev, ki vsebujejo modificirane naravne glutenske peptide specifične za HLA-DQ2 receptorje na limfocitih T, ki zavrejo Th1 posredovan avtoimunski odziv na gluten.
|-
! Toni Nagode
| 03.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Tim Božič
| 10.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Darja Božič
| 10.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Petra Tavčar
| 10.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Marjeta Horvat
| 17.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Danijela Jošić
| 17.05.17 || Gensko spremenjen Lactobacillus, ki izloča nanodelce z spermicidnim in protimikrobnim delovanjem za dolgotrajno zaščito pred zanositvijo in spolno prenosljivimi boleznimi.
|-
! Tina Kuhar
| 17.05.17 || Flaška za vodo z bionanosenzorjem za takojsno zaznavo kvalitete oziroma pitnosti nalite vode.
|-
! Nika Strašek
| 24.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Eva Vidak
| 24.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Alja Zgonc
| 24.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Zala Gluhić
| 31.05.17 || Varnejše uživanje alkohola z uporabo odorant-binding proteina LUSH.
|-
! Judita Avbelj
| 31.05.17 || Nanonaprava iz bioloških delov, ki z absorbcijo in razgradnjo delcev iz zraka preprečuje različne alergijske reakcije.
|-
! Vid Jazbec
| 31.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Vita Vidmar
| 07.06.17 || 'Hot start' transglutaminaza za popravljanje razcepljenih lasnih konic
|-
! Luka Kavčič
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mojca Juteršek
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|-
! Bojana Lazović
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|-
! Eva Korošec
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|-
! Tajda Buh
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|}

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja najdete v [http://ucilnica.fkkt.uni-lj.si/ spletni učilnici].

==Naloga==
'''Vaša naloga je: '''
Študent pripravi projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt.
Predlagana struktura:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Prva stran seminarja naj vsebuje naslov projekta, avtorje, povzetek (od 130 do 160 besed) in grafični povzetek (čez približno pol strani)
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo od 2000 do 2500 besed (vključno z literaturo). Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo pripombe k projektu in postavijo po dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik en dan pred predstavitvijo do polnoči.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem receptu:
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.doc(x) za seminar, npr. 19_nano_Craik_Venter.docx
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.ppt(x) za prezentacijo, npr. 19_nano_Craik_Venter.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1WdCXoXo1zkRrVlLKIcEV1z_MyhavU-3ERBm9n2oiawI/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do predstavitve seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1ToLPn78T9W3G6Hm5hV0mLseFYghiLQMlRPGb0J5zft8/viewform mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.
Na [http://bit.ly/bntmnenja tej strani] lahko preverite, če ste svoje mnenje za določen seminar že oddali in če je bil oddan pravočasno.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

Mezenhimske matične celice nove generacije

2016-11-21T22:09:29Z

Danijela Josic:

SYSU-MEDICINE MSCavalry - Next generation Mesenchymal Stem Cells [http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE].

== Uvod ==
Mezenhimske matične celice (MMC) so obetavne kandidatke za celično zdravljenje vnetnih bolezni, kot je vnetna bolezen črevesja, zaradi njihovih sposobnosti zaviranja tako pridobljenega kot naravnega imunskega odziva. Klinični poskusi pa so pokazali, da po sistemski administraciji zelo majhen delež celic prispe do mesta vnetja in opravi svojo funkcijo zaradi neučinkovite kemotakse.
Na mednarodnem tekmovanju iz sintezne biologije iGEM v letu 2016 je sodelovala ekipa iz Univerze Sun Yat-Sen iz province Guangdong na Kitajskem z naslovom SYSU-Medicine, ki se je za svoj projekt odločila, da bo ustvarila izboljšane človeške mezenhimske matične celice (MMC) oziroma MMC nove generacije.

V ekipi SYSU-Medicine so želeli s pomočjo sintezne biologije ustvariti mezenhimske matične celice z izboljšano sposobnostjo usmerjenega in specifičnega potovanja na mesta z vnetjem. Za potrebe dokazovanja izboljšanih sposobnosti celic so uporabili označevalne proteine, ki so omogočili sledenje celicam tako ''in vitro'' kot ''in vivo''. Zdravilno delovanje celic so preizkusili tudi ''in vivo'' na mišjih modelih za dve pogosti vnetni bolezni: vnetno bolezen črevesja (VBČ) ter na modelu zakasnjene preobčutljivosti (''ang.'' delayed type hypersensitivity oz. DTH), ki je služil kot model za alergijski kontaktni dermatitis. Kot cilj so si zadali tudi oblikovati samomorilno stikalo, ki bi se sprožilo ob morebitni diferenciaciji mezenhimskih matičnih celic in s tem preprečilo njihov nenadzorovano delovanje v gostiteljskem organizmu.

=== Vnetje ===
Vnetje je proces, ki je osnova številnih bolezni in hkrati nenadomestljiv del procesa obnavljanja poškodovanega tkiva. Pri vnetju pride do kompleksnih interakcij med povzročitelji bolezni ali alergeni in imunskim sistemom, pri čemer imajo ključno vlogo kemokini in citokini. Ti delujejo kot prenašalci sporočil in se vežejo na specifične receptorje na površini tarčnih celic in vzpodbudijo sintezo dodatnih vnetnih signalnih molekul, ki povzročijo širjenje žil in prehod imunskih celic iz krvi v vneta tkiva. Če vnetje uide izpod nadzora, lahko pride do obsežne fibroze tkiva. V zadnjih letih je na področju zdravljenja vnetnih bolezni veliko pozornosti usmerjene v razvoj celične terapije z mezenhinskimi matičnimi celicami.

=== Mezenhimske matične celice ===
Mezenhimske matične celice so odrasle multipotentne matične celice, ki so prisotne v različnih tkivih kot so kostni mozeg, maščobno tkivo, periferna kri, zobna pulpa in številna embrionalna tkiva. MMC imajo sposobnost samoobnove in diferenciacije v več različnih celičnih tipov: osteoblaste (kostne celice), hondrocite (celice hrustanca) in adipocite (maščobne celice). Izločajo avtokrine in parakrine dejavnike, ki promovirajo nastanek žil (angiogenezo), zmanjšujejo vnetje in pospešujejo obnovo tkiva. Zaradi sposobnosti uravnavanja imunskega odziva je ena najbolj obetavnih možnosti uporabe mezenhimskih matičnih celic v zdravljenju vnetnih bolezni. Njihovo uporabnost omejuje nizka učinkovitost dostave celic na tarčna mesta in nespecifična distribucija v telesu pri vnosu z injekcijo v krvni obtok.

== Sintezna biologija ==

=== Izboljšanje kemotakse ===
Kemokini so signalne molekule ki nadzorujejo migracijo in lokalizacijo imunskih celic, kar je ključno za njihovo gibanje pri imunskem odzivu. Kemokinski receptorji so transmembranski proteini, ki po interakciji s specifičnim kemokinskim ligandom omogočijo vstop kalcijevih ionov v celico, kar sproži kemotakso. Mezenhimske matične celice gojene v kulturi kemokinske receptorje, odgovorne za navigacijo celic na mesta vnetja, izražajo v nizkih količinah, poleg tega pa študije kažejo na neučinkovito dostavo na tarčna mesta pri uporabi za zdravljenje.

V teoriji bi večje število receptorjev za vnetne citokine na površini celic omogočilo učinkovitejše zaznavanje citokinov in potovanje na mesto vnetja. S pomočjo metode kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) so ugotovili, da se pri modelu VBČ najbolj izraža kemokin CXCL12, ki se veže z receptorjem CXCR4, pri DTH pa CXCL13, ki mu ustreza kemokinski receptor CXCR5. Zato so v mezenhimske matične celice namenjene uporabi za posamezen model bolezni vstavili zapisa za pripadajoče specifična receptorja CXCR4 in CXCR5 pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja-1 α (EF-1 α), ki omogoča konstitutivno izražanje. Konstruktom so dodali še zapis za fluorecenčna reporterska proteina eGFP (varianta zelenega fluorescenčnega proteina) ali dTomato (rdeča fluorescenca) pod istim promotorjem, kar je omogočilo preverjanje ustrezne ekspresije sistema transformiranih celich s fluorescenčno mikroskopijo. V začetnih fazah poskusov so za transfekcijo celic uporabili lentivirusni ekspresijski vektor zaradi visoke učinkovitosti. V kasnejših fazah zaradi onkogenega tveganja pri uporabi lentivirusov prešli na uporabo elektroporacije.

=== Sledenje celicam ===
Da bi lahko zaznali spremembe v migraciji celic, so potrebovali sistem za vizualizacijo celic in sledenje celicam v živem organizmu, za kar fluorescenčni proteini večinoma niso primerni zaradi težav z avtofluorescenco molekul v celicah, ki povzroči visoko ozadje. V ta namen so v konstrukt dodatno vnesli zapis za encim[[ luciferaza]] 2-moonoksigenazo iz meduze ''Renilla reniformis'' (RLuc). Luciferaze so oksidativni encimi, ki katalizirajo reakcije pri katerih se sprošča svetloba in povzročijo bioluminiscenco. Ob dodatku substrata [[luciferin]]a pride do sproščanja svetlobe, ki jo lahko zaznamo z ustreznimi aparaturami. S pomočjo luciferaze lahko po injekciji luciferina opazujemo lokacijo vnešenih MMC ''in vivo'' s pomočjo IVIS spektra (sistem za spremljanje luminiscence ''in vivo'').

Da bi omogočili uporabo spremenjenih mezenhimskih matičnih celic v predkliničnih raziskavah, so kot končni konstrukt oblikovali plazmid, ki je poleg zapisa za kemokinski receptor vseboval zapis za luciferazo, reporterski protein dTomato in težko verigo človeškega [[feritin]]a (hFTH) pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja 1-α (EF1-α). [[Feritin]] lahko zaznamo s pomočjo magnetne resonance in zapis zanj na plazmidu omogoča alternativen način zaznavanja mezenhimskih matičnih celic v živem organizmu.

=== Oblikovanje samomorilnega stikala ===
Učinkovitost vnosa MMC, preživetje celic, njihov fenotip in aktivnost so močno odvisni od mikrookolja na mestu vnosa. Le to ima lastnosti rane med celjenjem in vsebuje imunske celice, novo nastalo žilje in citokine, ki pospešujejo fibrozo oziroma brazgotinjenje tkiva kot je TGF-''β''. Takšno okolje lahko sproži diferenciacijo MMC v krčljive miofibroblaste, ki sintetizirajo stresna vlakna iz ''α''-aktina iz gladkih mišičnih celic (α-SMA), kar vodi v povečanje brazgotinjenja tkiva in izgubo proti-vnetnih lastnosti celic.

V okviru projekta so s pomočjo kvantitativnega PCR dokazali, da MMC ob stimulaciji z TGF-''β'' izražajo ''α''-SMA v visokih koncentracijah. Odločili so se to lastnost izkoristiti za zaznavanje diferenciacije MMC. Oblikovali so biološki del, kjer so gen za fluorescenčni reporterski protein eGFP postavili pod kontrolo SMA promotorja. Dokazali so, da ob stimulaciji celic z TGF-''β'' dobijo fluorescenco reporterskega proteina in s tem lahko zaznajo celice, ki so se diferencirale.
Ta poskus je bil zasnova, ki jo bodo v prihodnje uporabili za oblikovanje samomorilskega stikala, ki bo ob zaznavanju diferenciacije MMC sprožilo apoptozo celice.

== Testiranje izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ==
Delovanje MMC nove generacije so ''in vitro'' preverili na 3 nivojih:

* Ohranjanje fenotipa: preverili so ali so spremenjene MMC ohranile sposobnost diferenciacije v osteoblaste, hondrocite in adipocite in izražanje specifičnih površinskih označevalcev s pomočjo pretočne citometrije.

* Ekspresija sistema: izražanje vstavljenega gena za kemokinske receptorje so preverili s pomočjo qPCR in fluorescence reporterskih proteinov s fluorescenčno mikroskopijo.

* Izboljšanje kemotakse: ''in vitro'' so izvedli test kemotakse pri katerem celice migrirajo skozi filter v smeri raztopine, ki vsebuje visoko koncentracijo kemokinov.

Za testiranje terapevtskega potenciala izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ''in vivo'' so ustvarili mišja modela dveh pogostih vnetnih bolezni: vnetne bolezni črevesja in zakasnjene preobčuljivosti. Stanje živali zdravljenih s spremenjenimi mezenhimskimi matičnimi celicami so primerjali z tistimi zdravljenimi s kontrolnimi MMC in z živalmi, ki niso bile zdravljene.

Model vnetne bolezni črevesja so dobili s pomočjo kemijske indukcije z 2, 4, 6 – trinitrobenzensulfonsko kislino (TNBS). Intrarektalna administracija TNBS povzroči vnetje črevesja z histopatološkimi najdbami podobnimi kot pri Chronovi bolezni.
Spremljali so prisotnost znakov bolezni, preživetje, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v črevesju ter infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah črevesja. ''In vivo'' so pri miših tretiranih s transformiranimi MMC preverjali usmerjenost celic na mesto vnetja s pomočjo IVIS spektra.

Miši z zakasnjeno preobčutljivostno reakcijo so uporabili kot eksperimentalni model za človeški alergijski kontaktni dermatitis. Zakasnjeno preobčutljivost so inducirali z uporabo raztopine fluoro-2, 4- dinitrobenzena (DNFB) tako, da so miši najprej senzitizirali preko kože na hrbtu in nato po enem tednu raztoptini DNFB izpostavili kožo na ušesih. Merili so debelino ušes (oteklino) in infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v ušesih. Prisotnost mezenhimskih matičnih celic so preverili z imunofluorescenco tkivnih rezin ušesa.

== Rezultati ==
# Transformirane mezenhimske matične celice so ohranile sposobnost diferenciacije v različne celične podtipe in izražanje značilnih površinskih označevalcev.
# S sintetiziranimi konstrukti so dosegli znatno povišanje izražanja kemokinskih receptorjev.
# Spremenjene MMC so imele značilno izboljšano sposobnost kemotakse ''in vitro''.
# S pomočjo reporterskih proteinov so uspešno vizualizirali celice tako ''in vitro'' kot ''in vivo''.
# Spremenjene mezenhimske matične celice so značilno izboljšale simptome bolezni, podaljšale preživetje, zmanjšale infiltracijo levkocitov na mesto vnetja, zmanjšale izražanje pro-vnetnih in povišale izražanje proti-vnetnih citokinov in imele boljše sposobnosti migracije na mesto vnetja v primerjavi s kontrolnimi MMC tako pri modelu VBČ kot pri modelu DTH.
# S pomočjo oblikovanega reporterja so uspešno zaznali diferenciacijo celic.
== Zaključek ==
Ekipa je za svoje delo prejela nagrado za najboljši terapevtski projekt in tudi za najboljši sestavljeni biološki del. Uspelo jim je sintetizirati mezenhimske matične celice z izboljšanimi protivnetnimi lastnostmi, ki jih lahko spremljamo ''in vivo'' in zaznamo njihovo diferenciacijo.
V prihodnjih poskusih napovedujejo dokončno izvedbo samomorilnega stikala, ki bi se sprožilo ob zaznavanju diferenciacije celic ter vnos zapisa za interlevkin-10, ki bi dodatno izboljšal protivnetno delovanje celic.

== Viri ==

2016.igem.org. (2016). Team:SYSU-MEDICINE - 2016.igem.org. [online] Dostopno na: http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE [Datum ogleda 21 Nov. 2016].

[[Seminarji SB 12016/17]]

Mezenhimske matične celice nove generacije

2016-11-21T22:08:46Z

Danijela Josic:

[SYSU-MEDICINE MSCavalry - Next generation Mesenchymal stem cells http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE].

== Uvod ==
Mezenhimske matične celice (MMC) so obetavne kandidatke za celično zdravljenje vnetnih bolezni, kot je vnetna bolezen črevesja, zaradi njihovih sposobnosti zaviranja tako pridobljenega kot naravnega imunskega odziva. Klinični poskusi pa so pokazali, da po sistemski administraciji zelo majhen delež celic prispe do mesta vnetja in opravi svojo funkcijo zaradi neučinkovite kemotakse.
Na mednarodnem tekmovanju iz sintezne biologije iGEM v letu 2016 je sodelovala ekipa iz Univerze Sun Yat-Sen iz province Guangdong na Kitajskem z naslovom SYSU-Medicine, ki se je za svoj projekt odločila, da bo ustvarila izboljšane človeške mezenhimske matične celice (MMC) oziroma MMC nove generacije.

V ekipi SYSU-Medicine so želeli s pomočjo sintezne biologije ustvariti mezenhimske matične celice z izboljšano sposobnostjo usmerjenega in specifičnega potovanja na mesta z vnetjem. Za potrebe dokazovanja izboljšanih sposobnosti celic so uporabili označevalne proteine, ki so omogočili sledenje celicam tako ''in vitro'' kot ''in vivo''. Zdravilno delovanje celic so preizkusili tudi ''in vivo'' na mišjih modelih za dve pogosti vnetni bolezni: vnetno bolezen črevesja (VBČ) ter na modelu zakasnjene preobčutljivosti (''ang.'' delayed type hypersensitivity oz. DTH), ki je služil kot model za alergijski kontaktni dermatitis. Kot cilj so si zadali tudi oblikovati samomorilno stikalo, ki bi se sprožilo ob morebitni diferenciaciji mezenhimskih matičnih celic in s tem preprečilo njihov nenadzorovano delovanje v gostiteljskem organizmu.

=== Vnetje ===
Vnetje je proces, ki je osnova številnih bolezni in hkrati nenadomestljiv del procesa obnavljanja poškodovanega tkiva. Pri vnetju pride do kompleksnih interakcij med povzročitelji bolezni ali alergeni in imunskim sistemom, pri čemer imajo ključno vlogo kemokini in citokini. Ti delujejo kot prenašalci sporočil in se vežejo na specifične receptorje na površini tarčnih celic in vzpodbudijo sintezo dodatnih vnetnih signalnih molekul, ki povzročijo širjenje žil in prehod imunskih celic iz krvi v vneta tkiva. Če vnetje uide izpod nadzora, lahko pride do obsežne fibroze tkiva. V zadnjih letih je na področju zdravljenja vnetnih bolezni veliko pozornosti usmerjene v razvoj celične terapije z mezenhinskimi matičnimi celicami.

=== Mezenhimske matične celice ===
Mezenhimske matične celice so odrasle multipotentne matične celice, ki so prisotne v različnih tkivih kot so kostni mozeg, maščobno tkivo, periferna kri, zobna pulpa in številna embrionalna tkiva. MMC imajo sposobnost samoobnove in diferenciacije v več različnih celičnih tipov: osteoblaste (kostne celice), hondrocite (celice hrustanca) in adipocite (maščobne celice). Izločajo avtokrine in parakrine dejavnike, ki promovirajo nastanek žil (angiogenezo), zmanjšujejo vnetje in pospešujejo obnovo tkiva. Zaradi sposobnosti uravnavanja imunskega odziva je ena najbolj obetavnih možnosti uporabe mezenhimskih matičnih celic v zdravljenju vnetnih bolezni. Njihovo uporabnost omejuje nizka učinkovitost dostave celic na tarčna mesta in nespecifična distribucija v telesu pri vnosu z injekcijo v krvni obtok.

== Sintezna biologija ==

=== Izboljšanje kemotakse ===
Kemokini so signalne molekule ki nadzorujejo migracijo in lokalizacijo imunskih celic, kar je ključno za njihovo gibanje pri imunskem odzivu. Kemokinski receptorji so transmembranski proteini, ki po interakciji s specifičnim kemokinskim ligandom omogočijo vstop kalcijevih ionov v celico, kar sproži kemotakso. Mezenhimske matične celice gojene v kulturi kemokinske receptorje, odgovorne za navigacijo celic na mesta vnetja, izražajo v nizkih količinah, poleg tega pa študije kažejo na neučinkovito dostavo na tarčna mesta pri uporabi za zdravljenje.

V teoriji bi večje število receptorjev za vnetne citokine na površini celic omogočilo učinkovitejše zaznavanje citokinov in potovanje na mesto vnetja. S pomočjo metode kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) so ugotovili, da se pri modelu VBČ najbolj izraža kemokin CXCL12, ki se veže z receptorjem CXCR4, pri DTH pa CXCL13, ki mu ustreza kemokinski receptor CXCR5. Zato so v mezenhimske matične celice namenjene uporabi za posamezen model bolezni vstavili zapisa za pripadajoče specifična receptorja CXCR4 in CXCR5 pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja-1 α (EF-1 α), ki omogoča konstitutivno izražanje. Konstruktom so dodali še zapis za fluorecenčna reporterska proteina eGFP (varianta zelenega fluorescenčnega proteina) ali dTomato (rdeča fluorescenca) pod istim promotorjem, kar je omogočilo preverjanje ustrezne ekspresije sistema transformiranih celich s fluorescenčno mikroskopijo. V začetnih fazah poskusov so za transfekcijo celic uporabili lentivirusni ekspresijski vektor zaradi visoke učinkovitosti. V kasnejših fazah zaradi onkogenega tveganja pri uporabi lentivirusov prešli na uporabo elektroporacije.

=== Sledenje celicam ===
Da bi lahko zaznali spremembe v migraciji celic, so potrebovali sistem za vizualizacijo celic in sledenje celicam v živem organizmu, za kar fluorescenčni proteini večinoma niso primerni zaradi težav z avtofluorescenco molekul v celicah, ki povzroči visoko ozadje. V ta namen so v konstrukt dodatno vnesli zapis za encim[[ luciferaza]] 2-moonoksigenazo iz meduze ''Renilla reniformis'' (RLuc). Luciferaze so oksidativni encimi, ki katalizirajo reakcije pri katerih se sprošča svetloba in povzročijo bioluminiscenco. Ob dodatku substrata [[luciferin]]a pride do sproščanja svetlobe, ki jo lahko zaznamo z ustreznimi aparaturami. S pomočjo luciferaze lahko po injekciji luciferina opazujemo lokacijo vnešenih MMC ''in vivo'' s pomočjo IVIS spektra (sistem za spremljanje luminiscence ''in vivo'').

Da bi omogočili uporabo spremenjenih mezenhimskih matičnih celic v predkliničnih raziskavah, so kot končni konstrukt oblikovali plazmid, ki je poleg zapisa za kemokinski receptor vseboval zapis za luciferazo, reporterski protein dTomato in težko verigo človeškega [[feritin]]a (hFTH) pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja 1-α (EF1-α). [[Feritin]] lahko zaznamo s pomočjo magnetne resonance in zapis zanj na plazmidu omogoča alternativen način zaznavanja mezenhimskih matičnih celic v živem organizmu.

=== Oblikovanje samomorilnega stikala ===
Učinkovitost vnosa MMC, preživetje celic, njihov fenotip in aktivnost so močno odvisni od mikrookolja na mestu vnosa. Le to ima lastnosti rane med celjenjem in vsebuje imunske celice, novo nastalo žilje in citokine, ki pospešujejo fibrozo oziroma brazgotinjenje tkiva kot je TGF-''β''. Takšno okolje lahko sproži diferenciacijo MMC v krčljive miofibroblaste, ki sintetizirajo stresna vlakna iz ''α''-aktina iz gladkih mišičnih celic (α-SMA), kar vodi v povečanje brazgotinjenja tkiva in izgubo proti-vnetnih lastnosti celic.

V okviru projekta so s pomočjo kvantitativnega PCR dokazali, da MMC ob stimulaciji z TGF-''β'' izražajo ''α''-SMA v visokih koncentracijah. Odločili so se to lastnost izkoristiti za zaznavanje diferenciacije MMC. Oblikovali so biološki del, kjer so gen za fluorescenčni reporterski protein eGFP postavili pod kontrolo SMA promotorja. Dokazali so, da ob stimulaciji celic z TGF-''β'' dobijo fluorescenco reporterskega proteina in s tem lahko zaznajo celice, ki so se diferencirale.
Ta poskus je bil zasnova, ki jo bodo v prihodnje uporabili za oblikovanje samomorilskega stikala, ki bo ob zaznavanju diferenciacije MMC sprožilo apoptozo celice.

== Testiranje izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ==
Delovanje MMC nove generacije so ''in vitro'' preverili na 3 nivojih:

* Ohranjanje fenotipa: preverili so ali so spremenjene MMC ohranile sposobnost diferenciacije v osteoblaste, hondrocite in adipocite in izražanje specifičnih površinskih označevalcev s pomočjo pretočne citometrije.

* Ekspresija sistema: izražanje vstavljenega gena za kemokinske receptorje so preverili s pomočjo qPCR in fluorescence reporterskih proteinov s fluorescenčno mikroskopijo.

* Izboljšanje kemotakse: ''in vitro'' so izvedli test kemotakse pri katerem celice migrirajo skozi filter v smeri raztopine, ki vsebuje visoko koncentracijo kemokinov.

Za testiranje terapevtskega potenciala izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ''in vivo'' so ustvarili mišja modela dveh pogostih vnetnih bolezni: vnetne bolezni črevesja in zakasnjene preobčuljivosti. Stanje živali zdravljenih s spremenjenimi mezenhimskimi matičnimi celicami so primerjali z tistimi zdravljenimi s kontrolnimi MMC in z živalmi, ki niso bile zdravljene.

Model vnetne bolezni črevesja so dobili s pomočjo kemijske indukcije z 2, 4, 6 – trinitrobenzensulfonsko kislino (TNBS). Intrarektalna administracija TNBS povzroči vnetje črevesja z histopatološkimi najdbami podobnimi kot pri Chronovi bolezni.
Spremljali so prisotnost znakov bolezni, preživetje, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v črevesju ter infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah črevesja. ''In vivo'' so pri miših tretiranih s transformiranimi MMC preverjali usmerjenost celic na mesto vnetja s pomočjo IVIS spektra.

Miši z zakasnjeno preobčutljivostno reakcijo so uporabili kot eksperimentalni model za človeški alergijski kontaktni dermatitis. Zakasnjeno preobčutljivost so inducirali z uporabo raztopine fluoro-2, 4- dinitrobenzena (DNFB) tako, da so miši najprej senzitizirali preko kože na hrbtu in nato po enem tednu raztoptini DNFB izpostavili kožo na ušesih. Merili so debelino ušes (oteklino) in infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v ušesih. Prisotnost mezenhimskih matičnih celic so preverili z imunofluorescenco tkivnih rezin ušesa.

== Rezultati ==
# Transformirane mezenhimske matične celice so ohranile sposobnost diferenciacije v različne celične podtipe in izražanje značilnih površinskih označevalcev.
# S sintetiziranimi konstrukti so dosegli znatno povišanje izražanja kemokinskih receptorjev.
# Spremenjene MMC so imele značilno izboljšano sposobnost kemotakse ''in vitro''.
# S pomočjo reporterskih proteinov so uspešno vizualizirali celice tako ''in vitro'' kot ''in vivo''.
# Spremenjene mezenhimske matične celice so značilno izboljšale simptome bolezni, podaljšale preživetje, zmanjšale infiltracijo levkocitov na mesto vnetja, zmanjšale izražanje pro-vnetnih in povišale izražanje proti-vnetnih citokinov in imele boljše sposobnosti migracije na mesto vnetja v primerjavi s kontrolnimi MMC tako pri modelu VBČ kot pri modelu DTH.
# S pomočjo oblikovanega reporterja so uspešno zaznali diferenciacijo celic.
== Zaključek ==
Ekipa je za svoje delo prejela nagrado za najboljši terapevtski projekt in tudi za najboljši sestavljeni biološki del. Uspelo jim je sintetizirati mezenhimske matične celice z izboljšanimi protivnetnimi lastnostmi, ki jih lahko spremljamo ''in vivo'' in zaznamo njihovo diferenciacijo.
V prihodnjih poskusih napovedujejo dokončno izvedbo samomorilnega stikala, ki bi se sprožilo ob zaznavanju diferenciacije celic ter vnos zapisa za interlevkin-10, ki bi dodatno izboljšal protivnetno delovanje celic.

== Viri ==

2016.igem.org. (2016). Team:SYSU-MEDICINE - 2016.igem.org. [online] Dostopno na: http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE [Datum ogleda 21 Nov. 2016].

[[Seminarji SB 12016/17]]

Mezenhimske matične celice nove generacije

2016-11-21T22:07:59Z

Danijela Josic:

[SYSU-MEDICINE MSCavalry - Next generation Mesenchymal stem cells].

== Uvod ==
Mezenhimske matične celice (MMC) so obetavne kandidatke za celično zdravljenje vnetnih bolezni, kot je vnetna bolezen črevesja, zaradi njihovih sposobnosti zaviranja tako pridobljenega kot naravnega imunskega odziva. Klinični poskusi pa so pokazali, da po sistemski administraciji zelo majhen delež celic prispe do mesta vnetja in opravi svojo funkcijo zaradi neučinkovite kemotakse.
Na mednarodnem tekmovanju iz sintezne biologije iGEM v letu 2016 je sodelovala ekipa iz Univerze Sun Yat-Sen iz province Guangdong na Kitajskem z naslovom SYSU-Medicine, ki se je za svoj projekt odločila, da bo ustvarila izboljšane človeške mezenhimske matične celice (MMC) oziroma MMC nove generacije.

V ekipi SYSU-Medicine so želeli s pomočjo sintezne biologije ustvariti mezenhimske matične celice z izboljšano sposobnostjo usmerjenega in specifičnega potovanja na mesta z vnetjem. Za potrebe dokazovanja izboljšanih sposobnosti celic so uporabili označevalne proteine, ki so omogočili sledenje celicam tako ''in vitro'' kot ''in vivo''. Zdravilno delovanje celic so preizkusili tudi ''in vivo'' na mišjih modelih za dve pogosti vnetni bolezni: vnetno bolezen črevesja (VBČ) ter na modelu zakasnjene preobčutljivosti (''ang.'' delayed type hypersensitivity oz. DTH), ki je služil kot model za alergijski kontaktni dermatitis. Kot cilj so si zadali tudi oblikovati samomorilno stikalo, ki bi se sprožilo ob morebitni diferenciaciji mezenhimskih matičnih celic in s tem preprečilo njihov nenadzorovano delovanje v gostiteljskem organizmu.

=== Vnetje ===
Vnetje je proces, ki je osnova številnih bolezni in hkrati nenadomestljiv del procesa obnavljanja poškodovanega tkiva. Pri vnetju pride do kompleksnih interakcij med povzročitelji bolezni ali alergeni in imunskim sistemom, pri čemer imajo ključno vlogo kemokini in citokini. Ti delujejo kot prenašalci sporočil in se vežejo na specifične receptorje na površini tarčnih celic in vzpodbudijo sintezo dodatnih vnetnih signalnih molekul, ki povzročijo širjenje žil in prehod imunskih celic iz krvi v vneta tkiva. Če vnetje uide izpod nadzora, lahko pride do obsežne fibroze tkiva. V zadnjih letih je na področju zdravljenja vnetnih bolezni veliko pozornosti usmerjene v razvoj celične terapije z mezenhinskimi matičnimi celicami.

=== Mezenhimske matične celice ===
Mezenhimske matične celice so odrasle multipotentne matične celice, ki so prisotne v različnih tkivih kot so kostni mozeg, maščobno tkivo, periferna kri, zobna pulpa in številna embrionalna tkiva. MMC imajo sposobnost samoobnove in diferenciacije v več različnih celičnih tipov: osteoblaste (kostne celice), hondrocite (celice hrustanca) in adipocite (maščobne celice). Izločajo avtokrine in parakrine dejavnike, ki promovirajo nastanek žil (angiogenezo), zmanjšujejo vnetje in pospešujejo obnovo tkiva. Zaradi sposobnosti uravnavanja imunskega odziva je ena najbolj obetavnih možnosti uporabe mezenhimskih matičnih celic v zdravljenju vnetnih bolezni. Njihovo uporabnost omejuje nizka učinkovitost dostave celic na tarčna mesta in nespecifična distribucija v telesu pri vnosu z injekcijo v krvni obtok.

== Sintezna biologija ==

=== Izboljšanje kemotakse ===
Kemokini so signalne molekule ki nadzorujejo migracijo in lokalizacijo imunskih celic, kar je ključno za njihovo gibanje pri imunskem odzivu. Kemokinski receptorji so transmembranski proteini, ki po interakciji s specifičnim kemokinskim ligandom omogočijo vstop kalcijevih ionov v celico, kar sproži kemotakso. Mezenhimske matične celice gojene v kulturi kemokinske receptorje, odgovorne za navigacijo celic na mesta vnetja, izražajo v nizkih količinah, poleg tega pa študije kažejo na neučinkovito dostavo na tarčna mesta pri uporabi za zdravljenje.

V teoriji bi večje število receptorjev za vnetne citokine na površini celic omogočilo učinkovitejše zaznavanje citokinov in potovanje na mesto vnetja. S pomočjo metode kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) so ugotovili, da se pri modelu VBČ najbolj izraža kemokin CXCL12, ki se veže z receptorjem CXCR4, pri DTH pa CXCL13, ki mu ustreza kemokinski receptor CXCR5. Zato so v mezenhimske matične celice namenjene uporabi za posamezen model bolezni vstavili zapisa za pripadajoče specifična receptorja CXCR4 in CXCR5 pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja-1 α (EF-1 α), ki omogoča konstitutivno izražanje. Konstruktom so dodali še zapis za fluorecenčna reporterska proteina eGFP (varianta zelenega fluorescenčnega proteina) ali dTomato (rdeča fluorescenca) pod istim promotorjem, kar je omogočilo preverjanje ustrezne ekspresije sistema transformiranih celich s fluorescenčno mikroskopijo. V začetnih fazah poskusov so za transfekcijo celic uporabili lentivirusni ekspresijski vektor zaradi visoke učinkovitosti. V kasnejših fazah zaradi onkogenega tveganja pri uporabi lentivirusov prešli na uporabo elektroporacije.

=== Sledenje celicam ===
Da bi lahko zaznali spremembe v migraciji celic, so potrebovali sistem za vizualizacijo celic in sledenje celicam v živem organizmu, za kar fluorescenčni proteini večinoma niso primerni zaradi težav z avtofluorescenco molekul v celicah, ki povzroči visoko ozadje. V ta namen so v konstrukt dodatno vnesli zapis za encim[[ luciferaza]] 2-moonoksigenazo iz meduze ''Renilla reniformis'' (RLuc). Luciferaze so oksidativni encimi, ki katalizirajo reakcije pri katerih se sprošča svetloba in povzročijo bioluminiscenco. Ob dodatku substrata [[luciferin]]a pride do sproščanja svetlobe, ki jo lahko zaznamo z ustreznimi aparaturami. S pomočjo luciferaze lahko po injekciji luciferina opazujemo lokacijo vnešenih MMC ''in vivo'' s pomočjo IVIS spektra (sistem za spremljanje luminiscence ''in vivo'').

Da bi omogočili uporabo spremenjenih mezenhimskih matičnih celic v predkliničnih raziskavah, so kot končni konstrukt oblikovali plazmid, ki je poleg zapisa za kemokinski receptor vseboval zapis za luciferazo, reporterski protein dTomato in težko verigo človeškega [[feritin]]a (hFTH) pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja 1-α (EF1-α). [[Feritin]] lahko zaznamo s pomočjo magnetne resonance in zapis zanj na plazmidu omogoča alternativen način zaznavanja mezenhimskih matičnih celic v živem organizmu.

=== Oblikovanje samomorilnega stikala ===
Učinkovitost vnosa MMC, preživetje celic, njihov fenotip in aktivnost so močno odvisni od mikrookolja na mestu vnosa. Le to ima lastnosti rane med celjenjem in vsebuje imunske celice, novo nastalo žilje in citokine, ki pospešujejo fibrozo oziroma brazgotinjenje tkiva kot je TGF-''β''. Takšno okolje lahko sproži diferenciacijo MMC v krčljive miofibroblaste, ki sintetizirajo stresna vlakna iz ''α''-aktina iz gladkih mišičnih celic (α-SMA), kar vodi v povečanje brazgotinjenja tkiva in izgubo proti-vnetnih lastnosti celic.

V okviru projekta so s pomočjo kvantitativnega PCR dokazali, da MMC ob stimulaciji z TGF-''β'' izražajo ''α''-SMA v visokih koncentracijah. Odločili so se to lastnost izkoristiti za zaznavanje diferenciacije MMC. Oblikovali so biološki del, kjer so gen za fluorescenčni reporterski protein eGFP postavili pod kontrolo SMA promotorja. Dokazali so, da ob stimulaciji celic z TGF-''β'' dobijo fluorescenco reporterskega proteina in s tem lahko zaznajo celice, ki so se diferencirale.
Ta poskus je bil zasnova, ki jo bodo v prihodnje uporabili za oblikovanje samomorilskega stikala, ki bo ob zaznavanju diferenciacije MMC sprožilo apoptozo celice.

== Testiranje izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ==
Delovanje MMC nove generacije so ''in vitro'' preverili na 3 nivojih:

* Ohranjanje fenotipa: preverili so ali so spremenjene MMC ohranile sposobnost diferenciacije v osteoblaste, hondrocite in adipocite in izražanje specifičnih površinskih označevalcev s pomočjo pretočne citometrije.

* Ekspresija sistema: izražanje vstavljenega gena za kemokinske receptorje so preverili s pomočjo qPCR in fluorescence reporterskih proteinov s fluorescenčno mikroskopijo.

* Izboljšanje kemotakse: ''in vitro'' so izvedli test kemotakse pri katerem celice migrirajo skozi filter v smeri raztopine, ki vsebuje visoko koncentracijo kemokinov.

Za testiranje terapevtskega potenciala izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ''in vivo'' so ustvarili mišja modela dveh pogostih vnetnih bolezni: vnetne bolezni črevesja in zakasnjene preobčuljivosti. Stanje živali zdravljenih s spremenjenimi mezenhimskimi matičnimi celicami so primerjali z tistimi zdravljenimi s kontrolnimi MMC in z živalmi, ki niso bile zdravljene.

Model vnetne bolezni črevesja so dobili s pomočjo kemijske indukcije z 2, 4, 6 – trinitrobenzensulfonsko kislino (TNBS). Intrarektalna administracija TNBS povzroči vnetje črevesja z histopatološkimi najdbami podobnimi kot pri Chronovi bolezni.
Spremljali so prisotnost znakov bolezni, preživetje, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v črevesju ter infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah črevesja. ''In vivo'' so pri miših tretiranih s transformiranimi MMC preverjali usmerjenost celic na mesto vnetja s pomočjo IVIS spektra.

Miši z zakasnjeno preobčutljivostno reakcijo so uporabili kot eksperimentalni model za človeški alergijski kontaktni dermatitis. Zakasnjeno preobčutljivost so inducirali z uporabo raztopine fluoro-2, 4- dinitrobenzena (DNFB) tako, da so miši najprej senzitizirali preko kože na hrbtu in nato po enem tednu raztoptini DNFB izpostavili kožo na ušesih. Merili so debelino ušes (oteklino) in infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v ušesih. Prisotnost mezenhimskih matičnih celic so preverili z imunofluorescenco tkivnih rezin ušesa.

== Rezultati ==
# Transformirane mezenhimske matične celice so ohranile sposobnost diferenciacije v različne celične podtipe in izražanje značilnih površinskih označevalcev.
# S sintetiziranimi konstrukti so dosegli znatno povišanje izražanja kemokinskih receptorjev.
# Spremenjene MMC so imele značilno izboljšano sposobnost kemotakse ''in vitro''.
# S pomočjo reporterskih proteinov so uspešno vizualizirali celice tako ''in vitro'' kot ''in vivo''.
# Spremenjene mezenhimske matične celice so značilno izboljšale simptome bolezni, podaljšale preživetje, zmanjšale infiltracijo levkocitov na mesto vnetja, zmanjšale izražanje pro-vnetnih in povišale izražanje proti-vnetnih citokinov in imele boljše sposobnosti migracije na mesto vnetja v primerjavi s kontrolnimi MMC tako pri modelu VBČ kot pri modelu DTH.
# S pomočjo oblikovanega reporterja so uspešno zaznali diferenciacijo celic.
== Zaključek ==
Ekipa je za svoje delo prejela nagrado za najboljši terapevtski projekt in tudi za najboljši sestavljeni biološki del. Uspelo jim je sintetizirati mezenhimske matične celice z izboljšanimi protivnetnimi lastnostmi, ki jih lahko spremljamo ''in vivo'' in zaznamo njihovo diferenciacijo.
V prihodnjih poskusih napovedujejo dokončno izvedbo samomorilnega stikala, ki bi se sprožilo ob zaznavanju diferenciacije celic ter vnos zapisa za interlevkin-10, ki bi dodatno izboljšal protivnetno delovanje celic.

== Viri ==

2016.igem.org. (2016). Team:SYSU-MEDICINE - 2016.igem.org. [online] Dostopno na: http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE [Datum ogleda 21 Nov. 2016].

[[Seminarji SB 12016/17]]

Mezenhimske matične celice nove generacije

2016-11-21T22:06:47Z

Danijela Josic:

[http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE MSCavalry - Next generation Mesenchymal stem cells.

== Uvod ==
Mezenhimske matične celice (MMC) so obetavne kandidatke za celično zdravljenje vnetnih bolezni, kot je vnetna bolezen črevesja, zaradi njihovih sposobnosti zaviranja tako pridobljenega kot naravnega imunskega odziva. Klinični poskusi pa so pokazali, da po sistemski administraciji zelo majhen delež celic prispe do mesta vnetja in opravi svojo funkcijo zaradi neučinkovite kemotakse.
Na mednarodnem tekmovanju iz sintezne biologije iGEM v letu 2016 je sodelovala ekipa iz Univerze Sun Yat-Sen iz province Guangdong na Kitajskem z naslovom SYSU-Medicine, ki se je za svoj projekt odločila, da bo ustvarila izboljšane človeške mezenhimske matične celice (MMC) oziroma MMC nove generacije.

V ekipi SYSU-Medicine so želeli s pomočjo sintezne biologije ustvariti mezenhimske matične celice z izboljšano sposobnostjo usmerjenega in specifičnega potovanja na mesta z vnetjem. Za potrebe dokazovanja izboljšanih sposobnosti celic so uporabili označevalne proteine, ki so omogočili sledenje celicam tako ''in vitro'' kot ''in vivo''. Zdravilno delovanje celic so preizkusili tudi ''in vivo'' na mišjih modelih za dve pogosti vnetni bolezni: vnetno bolezen črevesja (VBČ) ter na modelu zakasnjene preobčutljivosti (''ang.'' delayed type hypersensitivity oz. DTH), ki je služil kot model za alergijski kontaktni dermatitis. Kot cilj so si zadali tudi oblikovati samomorilno stikalo, ki bi se sprožilo ob morebitni diferenciaciji mezenhimskih matičnih celic in s tem preprečilo njihov nenadzorovano delovanje v gostiteljskem organizmu.

=== Vnetje ===
Vnetje je proces, ki je osnova številnih bolezni in hkrati nenadomestljiv del procesa obnavljanja poškodovanega tkiva. Pri vnetju pride do kompleksnih interakcij med povzročitelji bolezni ali alergeni in imunskim sistemom, pri čemer imajo ključno vlogo kemokini in citokini. Ti delujejo kot prenašalci sporočil in se vežejo na specifične receptorje na površini tarčnih celic in vzpodbudijo sintezo dodatnih vnetnih signalnih molekul, ki povzročijo širjenje žil in prehod imunskih celic iz krvi v vneta tkiva. Če vnetje uide izpod nadzora, lahko pride do obsežne fibroze tkiva. V zadnjih letih je na področju zdravljenja vnetnih bolezni veliko pozornosti usmerjene v razvoj celične terapije z mezenhinskimi matičnimi celicami.

=== Mezenhimske matične celice ===
Mezenhimske matične celice so odrasle multipotentne matične celice, ki so prisotne v različnih tkivih kot so kostni mozeg, maščobno tkivo, periferna kri, zobna pulpa in številna embrionalna tkiva. MMC imajo sposobnost samoobnove in diferenciacije v več različnih celičnih tipov: osteoblaste (kostne celice), hondrocite (celice hrustanca) in adipocite (maščobne celice). Izločajo avtokrine in parakrine dejavnike, ki promovirajo nastanek žil (angiogenezo), zmanjšujejo vnetje in pospešujejo obnovo tkiva. Zaradi sposobnosti uravnavanja imunskega odziva je ena najbolj obetavnih možnosti uporabe mezenhimskih matičnih celic v zdravljenju vnetnih bolezni. Njihovo uporabnost omejuje nizka učinkovitost dostave celic na tarčna mesta in nespecifična distribucija v telesu pri vnosu z injekcijo v krvni obtok.

== Sintezna biologija ==

=== Izboljšanje kemotakse ===
Kemokini so signalne molekule ki nadzorujejo migracijo in lokalizacijo imunskih celic, kar je ključno za njihovo gibanje pri imunskem odzivu. Kemokinski receptorji so transmembranski proteini, ki po interakciji s specifičnim kemokinskim ligandom omogočijo vstop kalcijevih ionov v celico, kar sproži kemotakso. Mezenhimske matične celice gojene v kulturi kemokinske receptorje, odgovorne za navigacijo celic na mesta vnetja, izražajo v nizkih količinah, poleg tega pa študije kažejo na neučinkovito dostavo na tarčna mesta pri uporabi za zdravljenje.

V teoriji bi večje število receptorjev za vnetne citokine na površini celic omogočilo učinkovitejše zaznavanje citokinov in potovanje na mesto vnetja. S pomočjo metode kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) so ugotovili, da se pri modelu VBČ najbolj izraža kemokin CXCL12, ki se veže z receptorjem CXCR4, pri DTH pa CXCL13, ki mu ustreza kemokinski receptor CXCR5. Zato so v mezenhimske matične celice namenjene uporabi za posamezen model bolezni vstavili zapisa za pripadajoče specifična receptorja CXCR4 in CXCR5 pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja-1 α (EF-1 α), ki omogoča konstitutivno izražanje. Konstruktom so dodali še zapis za fluorecenčna reporterska proteina eGFP (varianta zelenega fluorescenčnega proteina) ali dTomato (rdeča fluorescenca) pod istim promotorjem, kar je omogočilo preverjanje ustrezne ekspresije sistema transformiranih celich s fluorescenčno mikroskopijo. V začetnih fazah poskusov so za transfekcijo celic uporabili lentivirusni ekspresijski vektor zaradi visoke učinkovitosti. V kasnejših fazah zaradi onkogenega tveganja pri uporabi lentivirusov prešli na uporabo elektroporacije.

=== Sledenje celicam ===
Da bi lahko zaznali spremembe v migraciji celic, so potrebovali sistem za vizualizacijo celic in sledenje celicam v živem organizmu, za kar fluorescenčni proteini večinoma niso primerni zaradi težav z avtofluorescenco molekul v celicah, ki povzroči visoko ozadje. V ta namen so v konstrukt dodatno vnesli zapis za encim[[ luciferaza]] 2-moonoksigenazo iz meduze ''Renilla reniformis'' (RLuc). Luciferaze so oksidativni encimi, ki katalizirajo reakcije pri katerih se sprošča svetloba in povzročijo bioluminiscenco. Ob dodatku substrata [[luciferin]]a pride do sproščanja svetlobe, ki jo lahko zaznamo z ustreznimi aparaturami. S pomočjo luciferaze lahko po injekciji luciferina opazujemo lokacijo vnešenih MMC ''in vivo'' s pomočjo IVIS spektra (sistem za spremljanje luminiscence ''in vivo'').

Da bi omogočili uporabo spremenjenih mezenhimskih matičnih celic v predkliničnih raziskavah, so kot končni konstrukt oblikovali plazmid, ki je poleg zapisa za kemokinski receptor vseboval zapis za luciferazo, reporterski protein dTomato in težko verigo človeškega [[feritin]]a (hFTH) pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja 1-α (EF1-α). [[Feritin]] lahko zaznamo s pomočjo magnetne resonance in zapis zanj na plazmidu omogoča alternativen način zaznavanja mezenhimskih matičnih celic v živem organizmu.

=== Oblikovanje samomorilnega stikala ===
Učinkovitost vnosa MMC, preživetje celic, njihov fenotip in aktivnost so močno odvisni od mikrookolja na mestu vnosa. Le to ima lastnosti rane med celjenjem in vsebuje imunske celice, novo nastalo žilje in citokine, ki pospešujejo fibrozo oziroma brazgotinjenje tkiva kot je TGF-''β''. Takšno okolje lahko sproži diferenciacijo MMC v krčljive miofibroblaste, ki sintetizirajo stresna vlakna iz ''α''-aktina iz gladkih mišičnih celic (α-SMA), kar vodi v povečanje brazgotinjenja tkiva in izgubo proti-vnetnih lastnosti celic.

V okviru projekta so s pomočjo kvantitativnega PCR dokazali, da MMC ob stimulaciji z TGF-''β'' izražajo ''α''-SMA v visokih koncentracijah. Odločili so se to lastnost izkoristiti za zaznavanje diferenciacije MMC. Oblikovali so biološki del, kjer so gen za fluorescenčni reporterski protein eGFP postavili pod kontrolo SMA promotorja. Dokazali so, da ob stimulaciji celic z TGF-''β'' dobijo fluorescenco reporterskega proteina in s tem lahko zaznajo celice, ki so se diferencirale.
Ta poskus je bil zasnova, ki jo bodo v prihodnje uporabili za oblikovanje samomorilskega stikala, ki bo ob zaznavanju diferenciacije MMC sprožilo apoptozo celice.

== Testiranje izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ==
Delovanje MMC nove generacije so ''in vitro'' preverili na 3 nivojih:

* Ohranjanje fenotipa: preverili so ali so spremenjene MMC ohranile sposobnost diferenciacije v osteoblaste, hondrocite in adipocite in izražanje specifičnih površinskih označevalcev s pomočjo pretočne citometrije.

* Ekspresija sistema: izražanje vstavljenega gena za kemokinske receptorje so preverili s pomočjo qPCR in fluorescence reporterskih proteinov s fluorescenčno mikroskopijo.

* Izboljšanje kemotakse: ''in vitro'' so izvedli test kemotakse pri katerem celice migrirajo skozi filter v smeri raztopine, ki vsebuje visoko koncentracijo kemokinov.

Za testiranje terapevtskega potenciala izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ''in vivo'' so ustvarili mišja modela dveh pogostih vnetnih bolezni: vnetne bolezni črevesja in zakasnjene preobčuljivosti. Stanje živali zdravljenih s spremenjenimi mezenhimskimi matičnimi celicami so primerjali z tistimi zdravljenimi s kontrolnimi MMC in z živalmi, ki niso bile zdravljene.

Model vnetne bolezni črevesja so dobili s pomočjo kemijske indukcije z 2, 4, 6 – trinitrobenzensulfonsko kislino (TNBS). Intrarektalna administracija TNBS povzroči vnetje črevesja z histopatološkimi najdbami podobnimi kot pri Chronovi bolezni.
Spremljali so prisotnost znakov bolezni, preživetje, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v črevesju ter infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah črevesja. ''In vivo'' so pri miših tretiranih s transformiranimi MMC preverjali usmerjenost celic na mesto vnetja s pomočjo IVIS spektra.

Miši z zakasnjeno preobčutljivostno reakcijo so uporabili kot eksperimentalni model za človeški alergijski kontaktni dermatitis. Zakasnjeno preobčutljivost so inducirali z uporabo raztopine fluoro-2, 4- dinitrobenzena (DNFB) tako, da so miši najprej senzitizirali preko kože na hrbtu in nato po enem tednu raztoptini DNFB izpostavili kožo na ušesih. Merili so debelino ušes (oteklino) in infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v ušesih. Prisotnost mezenhimskih matičnih celic so preverili z imunofluorescenco tkivnih rezin ušesa.

== Rezultati ==
# Transformirane mezenhimske matične celice so ohranile sposobnost diferenciacije v različne celične podtipe in izražanje značilnih površinskih označevalcev.
# S sintetiziranimi konstrukti so dosegli znatno povišanje izražanja kemokinskih receptorjev.
# Spremenjene MMC so imele značilno izboljšano sposobnost kemotakse ''in vitro''.
# S pomočjo reporterskih proteinov so uspešno vizualizirali celice tako ''in vitro'' kot ''in vivo''.
# Spremenjene mezenhimske matične celice so značilno izboljšale simptome bolezni, podaljšale preživetje, zmanjšale infiltracijo levkocitov na mesto vnetja, zmanjšale izražanje pro-vnetnih in povišale izražanje proti-vnetnih citokinov in imele boljše sposobnosti migracije na mesto vnetja v primerjavi s kontrolnimi MMC tako pri modelu VBČ kot pri modelu DTH.
# S pomočjo oblikovanega reporterja so uspešno zaznali diferenciacijo celic.
== Zaključek ==
Ekipa je za svoje delo prejela nagrado za najboljši terapevtski projekt in tudi za najboljši sestavljeni biološki del. Uspelo jim je sintetizirati mezenhimske matične celice z izboljšanimi protivnetnimi lastnostmi, ki jih lahko spremljamo ''in vivo'' in zaznamo njihovo diferenciacijo.
V prihodnjih poskusih napovedujejo dokončno izvedbo samomorilnega stikala, ki bi se sprožilo ob zaznavanju diferenciacije celic ter vnos zapisa za interlevkin-10, ki bi dodatno izboljšal protivnetno delovanje celic.

== Viri ==

2016.igem.org. (2016). Team:SYSU-MEDICINE - 2016.igem.org. [online] Dostopno na: http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE [Datum ogleda 21 Nov. 2016].

[[Seminarji SB 12016/17]]

Mezenhimske matične celice nove generacije

2016-11-21T22:04:51Z

Danijela Josic:

MSCavalry - Next generation Mesenchymal stem cells.
[http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE]

== Uvod ==
Mezenhimske matične celice (MMC) so obetavne kandidatke za celično zdravljenje vnetnih bolezni, kot je vnetna bolezen črevesja, zaradi njihovih sposobnosti zaviranja tako pridobljenega kot naravnega imunskega odziva. Klinični poskusi pa so pokazali, da po sistemski administraciji zelo majhen delež celic prispe do mesta vnetja in opravi svojo funkcijo zaradi neučinkovite kemotakse.
Na mednarodnem tekmovanju iz sintezne biologije iGEM v letu 2016 je sodelovala ekipa iz Univerze Sun Yat-Sen iz province Guangdong na Kitajskem z naslovom SYSU-Medicine, ki se je za svoj projekt odločila, da bo ustvarila izboljšane človeške mezenhimske matične celice (MMC) oziroma MMC nove generacije.

V ekipi SYSU-Medicine so želeli s pomočjo sintezne biologije ustvariti mezenhimske matične celice z izboljšano sposobnostjo usmerjenega in specifičnega potovanja na mesta z vnetjem. Za potrebe dokazovanja izboljšanih sposobnosti celic so uporabili označevalne proteine, ki so omogočili sledenje celicam tako ''in vitro'' kot ''in vivo''. Zdravilno delovanje celic so preizkusili tudi ''in vivo'' na mišjih modelih za dve pogosti vnetni bolezni: vnetno bolezen črevesja (VBČ) ter na modelu zakasnjene preobčutljivosti (''ang.'' delayed type hypersensitivity oz. DTH), ki je služil kot model za alergijski kontaktni dermatitis. Kot cilj so si zadali tudi oblikovati samomorilno stikalo, ki bi se sprožilo ob morebitni diferenciaciji mezenhimskih matičnih celic in s tem preprečilo njihov nenadzorovano delovanje v gostiteljskem organizmu.

=== Vnetje ===
Vnetje je proces, ki je osnova številnih bolezni in hkrati nenadomestljiv del procesa obnavljanja poškodovanega tkiva. Pri vnetju pride do kompleksnih interakcij med povzročitelji bolezni ali alergeni in imunskim sistemom, pri čemer imajo ključno vlogo kemokini in citokini. Ti delujejo kot prenašalci sporočil in se vežejo na specifične receptorje na površini tarčnih celic in vzpodbudijo sintezo dodatnih vnetnih signalnih molekul, ki povzročijo širjenje žil in prehod imunskih celic iz krvi v vneta tkiva. Če vnetje uide izpod nadzora, lahko pride do obsežne fibroze tkiva. V zadnjih letih je na področju zdravljenja vnetnih bolezni veliko pozornosti usmerjene v razvoj celične terapije z mezenhinskimi matičnimi celicami.

=== Mezenhimske matične celice ===
Mezenhimske matične celice so odrasle multipotentne matične celice, ki so prisotne v različnih tkivih kot so kostni mozeg, maščobno tkivo, periferna kri, zobna pulpa in številna embrionalna tkiva. MMC imajo sposobnost samoobnove in diferenciacije v več različnih celičnih tipov: osteoblaste (kostne celice), hondrocite (celice hrustanca) in adipocite (maščobne celice). Izločajo avtokrine in parakrine dejavnike, ki promovirajo nastanek žil (angiogenezo), zmanjšujejo vnetje in pospešujejo obnovo tkiva. Zaradi sposobnosti uravnavanja imunskega odziva je ena najbolj obetavnih možnosti uporabe mezenhimskih matičnih celic v zdravljenju vnetnih bolezni. Njihovo uporabnost omejuje nizka učinkovitost dostave celic na tarčna mesta in nespecifična distribucija v telesu pri vnosu z injekcijo v krvni obtok.

== Sintezna biologija ==

=== Izboljšanje kemotakse ===
Kemokini so signalne molekule ki nadzorujejo migracijo in lokalizacijo imunskih celic, kar je ključno za njihovo gibanje pri imunskem odzivu. Kemokinski receptorji so transmembranski proteini, ki po interakciji s specifičnim kemokinskim ligandom omogočijo vstop kalcijevih ionov v celico, kar sproži kemotakso. Mezenhimske matične celice gojene v kulturi kemokinske receptorje, odgovorne za navigacijo celic na mesta vnetja, izražajo v nizkih količinah, poleg tega pa študije kažejo na neučinkovito dostavo na tarčna mesta pri uporabi za zdravljenje.

V teoriji bi večje število receptorjev za vnetne citokine na površini celic omogočilo učinkovitejše zaznavanje citokinov in potovanje na mesto vnetja. S pomočjo metode kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) so ugotovili, da se pri modelu VBČ najbolj izraža kemokin CXCL12, ki se veže z receptorjem CXCR4, pri DTH pa CXCL13, ki mu ustreza kemokinski receptor CXCR5. Zato so v mezenhimske matične celice namenjene uporabi za posamezen model bolezni vstavili zapisa za pripadajoče specifična receptorja CXCR4 in CXCR5 pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja-1 α (EF-1 α), ki omogoča konstitutivno izražanje. Konstruktom so dodali še zapis za fluorecenčna reporterska proteina eGFP (varianta zelenega fluorescenčnega proteina) ali dTomato (rdeča fluorescenca) pod istim promotorjem, kar je omogočilo preverjanje ustrezne ekspresije sistema transformiranih celich s fluorescenčno mikroskopijo. V začetnih fazah poskusov so za transfekcijo celic uporabili lentivirusni ekspresijski vektor zaradi visoke učinkovitosti. V kasnejših fazah zaradi onkogenega tveganja pri uporabi lentivirusov prešli na uporabo elektroporacije.

=== Sledenje celicam ===
Da bi lahko zaznali spremembe v migraciji celic, so potrebovali sistem za vizualizacijo celic in sledenje celicam v živem organizmu, za kar fluorescenčni proteini večinoma niso primerni zaradi težav z avtofluorescenco molekul v celicah, ki povzroči visoko ozadje. V ta namen so v konstrukt dodatno vnesli zapis za encim[[ luciferaza]] 2-moonoksigenazo iz meduze ''Renilla reniformis'' (RLuc). Luciferaze so oksidativni encimi, ki katalizirajo reakcije pri katerih se sprošča svetloba in povzročijo bioluminiscenco. Ob dodatku substrata [[luciferin]]a pride do sproščanja svetlobe, ki jo lahko zaznamo z ustreznimi aparaturami. S pomočjo luciferaze lahko po injekciji luciferina opazujemo lokacijo vnešenih MMC ''in vivo'' s pomočjo IVIS spektra (sistem za spremljanje luminiscence ''in vivo'').

Da bi omogočili uporabo spremenjenih mezenhimskih matičnih celic v predkliničnih raziskavah, so kot končni konstrukt oblikovali plazmid, ki je poleg zapisa za kemokinski receptor vseboval zapis za luciferazo, reporterski protein dTomato in težko verigo človeškega [[feritin]]a (hFTH) pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja 1-α (EF1-α). [[Feritin]] lahko zaznamo s pomočjo magnetne resonance in zapis zanj na plazmidu omogoča alternativen način zaznavanja mezenhimskih matičnih celic v živem organizmu.

=== Oblikovanje samomorilnega stikala ===
Učinkovitost vnosa MMC, preživetje celic, njihov fenotip in aktivnost so močno odvisni od mikrookolja na mestu vnosa. Le to ima lastnosti rane med celjenjem in vsebuje imunske celice, novo nastalo žilje in citokine, ki pospešujejo fibrozo oziroma brazgotinjenje tkiva kot je TGF-''β''. Takšno okolje lahko sproži diferenciacijo MMC v krčljive miofibroblaste, ki sintetizirajo stresna vlakna iz ''α''-aktina iz gladkih mišičnih celic (α-SMA), kar vodi v povečanje brazgotinjenja tkiva in izgubo proti-vnetnih lastnosti celic.

V okviru projekta so s pomočjo kvantitativnega PCR dokazali, da MMC ob stimulaciji z TGF-''β'' izražajo ''α''-SMA v visokih koncentracijah. Odločili so se to lastnost izkoristiti za zaznavanje diferenciacije MMC. Oblikovali so biološki del, kjer so gen za fluorescenčni reporterski protein eGFP postavili pod kontrolo SMA promotorja. Dokazali so, da ob stimulaciji celic z TGF-''β'' dobijo fluorescenco reporterskega proteina in s tem lahko zaznajo celice, ki so se diferencirale.
Ta poskus je bil zasnova, ki jo bodo v prihodnje uporabili za oblikovanje samomorilskega stikala, ki bo ob zaznavanju diferenciacije MMC sprožilo apoptozo celice.

== Testiranje izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ==
Delovanje MMC nove generacije so ''in vitro'' preverili na 3 nivojih:

* Ohranjanje fenotipa: preverili so ali so spremenjene MMC ohranile sposobnost diferenciacije v osteoblaste, hondrocite in adipocite in izražanje specifičnih površinskih označevalcev s pomočjo pretočne citometrije.

* Ekspresija sistema: izražanje vstavljenega gena za kemokinske receptorje so preverili s pomočjo qPCR in fluorescence reporterskih proteinov s fluorescenčno mikroskopijo.

* Izboljšanje kemotakse: ''in vitro'' so izvedli test kemotakse pri katerem celice migrirajo skozi filter v smeri raztopine, ki vsebuje visoko koncentracijo kemokinov.

Za testiranje terapevtskega potenciala izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ''in vivo'' so ustvarili mišja modela dveh pogostih vnetnih bolezni: vnetne bolezni črevesja in zakasnjene preobčuljivosti. Stanje živali zdravljenih s spremenjenimi mezenhimskimi matičnimi celicami so primerjali z tistimi zdravljenimi s kontrolnimi MMC in z živalmi, ki niso bile zdravljene.

Model vnetne bolezni črevesja so dobili s pomočjo kemijske indukcije z 2, 4, 6 – trinitrobenzensulfonsko kislino (TNBS). Intrarektalna administracija TNBS povzroči vnetje črevesja z histopatološkimi najdbami podobnimi kot pri Chronovi bolezni.
Spremljali so prisotnost znakov bolezni, preživetje, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v črevesju ter infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah črevesja. ''In vivo'' so pri miših tretiranih s transformiranimi MMC preverjali usmerjenost celic na mesto vnetja s pomočjo IVIS spektra.

Miši z zakasnjeno preobčutljivostno reakcijo so uporabili kot eksperimentalni model za človeški alergijski kontaktni dermatitis. Zakasnjeno preobčutljivost so inducirali z uporabo raztopine fluoro-2, 4- dinitrobenzena (DNFB) tako, da so miši najprej senzitizirali preko kože na hrbtu in nato po enem tednu raztoptini DNFB izpostavili kožo na ušesih. Merili so debelino ušes (oteklino) in infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v ušesih. Prisotnost mezenhimskih matičnih celic so preverili z imunofluorescenco tkivnih rezin ušesa.

== Rezultati ==
# Transformirane mezenhimske matične celice so ohranile sposobnost diferenciacije v različne celične podtipe in izražanje značilnih površinskih označevalcev.
# S sintetiziranimi konstrukti so dosegli znatno povišanje izražanja kemokinskih receptorjev.
# Spremenjene MMC so imele značilno izboljšano sposobnost kemotakse ''in vitro''.
# S pomočjo reporterskih proteinov so uspešno vizualizirali celice tako ''in vitro'' kot ''in vivo''.
# Spremenjene mezenhimske matične celice so značilno izboljšale simptome bolezni, podaljšale preživetje, zmanjšale infiltracijo levkocitov na mesto vnetja, zmanjšale izražanje pro-vnetnih in povišale izražanje proti-vnetnih citokinov in imele boljše sposobnosti migracije na mesto vnetja v primerjavi s kontrolnimi MMC tako pri modelu VBČ kot pri modelu DTH.
# S pomočjo oblikovanega reporterja so uspešno zaznali diferenciacijo celic.
== Zaključek ==
Ekipa je za svoje delo prejela nagrado za najboljši terapevtski projekt in tudi za najboljši sestavljeni biološki del. Uspelo jim je sintetizirati mezenhimske matične celice z izboljšanimi protivnetnimi lastnostmi, ki jih lahko spremljamo ''in vivo'' in zaznamo njihovo diferenciacijo.
V prihodnjih poskusih napovedujejo dokončno izvedbo samomorilnega stikala, ki bi se sprožilo ob zaznavanju diferenciacije celic ter vnos zapisa za interlevkin-10, ki bi dodatno izboljšal protivnetno delovanje celic.

== Viri ==

2016.igem.org. (2016). Team:SYSU-MEDICINE - 2016.igem.org. [online] Dostopno na: http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE [Datum ogleda 21 Nov. 2016].

[[Seminarji SB 12016/17]]

Mezenhimske matične celice nove generacije

2016-11-21T22:02:59Z

Danijela Josic:

MSCavalry - Next generation Mesenchymal stem cells.
[http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE]

== Uvod ==
Mezenhimske matične celice (MMC) so obetavne kandidatke za celično zdravljenje vnetnih bolezni, kot je vnetna bolezen črevesja, zaradi njihovih sposobnosti zaviranja tako pridobljenega kot naravnega imunskega odziva. Klinični poskusi pa so pokazali, da po sistemski administraciji zelo majhen delež celic prispe do mesta vnetja in opravi svojo funkcijo zaradi neučinkovite kemotakse.
Na mednarodnem tekmovanju iz sintezne biologije iGEM v letu 2016 je sodelovala ekipa iz Univerze Sun Yat-Sen iz province Guangdong na Kitajskem z naslovom SYSU-Medicine, ki se je za svoj projekt odločila, da bo ustvarila izboljšane človeške mezenhimske matične celice (MMC) oziroma MMC nove generacije.

V ekipi SYSU-Medicine so želeli s pomočjo sintezne biologije ustvariti mezenhimske matične celice z izboljšano sposobnostjo usmerjenega in specifičnega potovanja na mesta z vnetjem. Za potrebe dokazovanja izboljšanih sposobnosti celic so uporabili označevalne proteine, ki so omogočili sledenje celicam tako ''in vitro'' kot ''in vivo''. Zdravilno delovanje celic so preizkusili tudi ''in vivo'' na mišjih modelih za dve pogosti vnetni bolezni: vnetno bolezen črevesja (VBČ) ter na modelu zakasnjene preobčutljivosti (''ang.'' delayed type hypersensitivity oz. DTH), ki je služil kot model za alergijski kontaktni dermatitis. Kot cilj so si zadali tudi oblikovati samomorilno stikalo, ki bi se sprožilo ob morebitni diferenciaciji mezenhimskih matičnih celic in s tem preprečilo njihov nenadzorovano delovanje v gostiteljskem organizmu.

=== Vnetje ===
Vnetje je proces, ki je osnova številnih bolezni in hkrati nenadomestljiv del procesa obnavljanja poškodovanega tkiva. Pri vnetju pride do kompleksnih interakcij med povzročitelji bolezni ali alergeni in imunskim sistemom, pri čemer imajo ključno vlogo kemokini in citokini. Ti delujejo kot prenašalci sporočil in se vežejo na specifične receptorje na površini tarčnih celic in vzpodbudijo sintezo dodatnih vnetnih signalnih molekul, ki povzročijo širjenje žil in prehod imunskih celic iz krvi v vneta tkiva. Če vnetje uide izpod nadzora, lahko pride do obsežne fibroze tkiva. V zadnjih letih je na področju zdravljenja vnetnih bolezni veliko pozornosti usmerjene v razvoj celične terapije z mezenhinskimi matičnimi celicami.

=== Mezenhimske matične celice ===
Mezenhimske matične celice so odrasle multipotentne matične celice, ki so prisotne v različnih tkivih kot so kostni mozeg, maščobno tkivo, periferna kri, zobna pulpa in številna embrionalna tkiva. MMC imajo sposobnost samoobnove in diferenciacije v več različnih celičnih tipov: osteoblaste (kostne celice), hondrocite (celice hrustanca) in adipocite (maščobne celice). Izločajo avtokrine in parakrine dejavnike, ki promovirajo nastanek žil (angiogenezo), zmanjšujejo vnetje in pospešujejo obnovo tkiva. Zaradi sposobnosti uravnavanja imunskega odziva je ena najbolj obetavnih možnosti uporabe mezenhimskih matičnih celic v zdravljenju vnetnih bolezni. Njihovo uporabnost omejuje nizka učinkovitost dostave celic na tarčna mesta in nespecifična distribucija v telesu pri vnosu z injekcijo v krvni obtok.

== Sintezna biologija ==

=== Izboljšanje kemotakse ===
Kemokini so signalne molekule ki nadzorujejo migracijo in lokalizacijo imunskih celic, kar je ključno za njihovo gibanje pri imunskem odzivu. Kemokinski receptorji so transmembranski proteini, ki po interakciji s specifičnim kemokinskim ligandom omogočijo vstop kalcijevih ionov v celico, kar sproži kemotakso. Mezenhimske matične celice gojene v kulturi kemokinske receptorje, odgovorne za navigacijo celic na mesta vnetja, izražajo v nizkih količinah, poleg tega pa študije kažejo na neučinkovito dostavo na tarčna mesta pri uporabi za zdravljenje.

V teoriji bi večje število receptorjev za vnetne citokine na površini celic omogočilo učinkovitejše zaznavanje citokinov in potovanje na mesto vnetja. S pomočjo metode kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) so ugotovili, da se pri modelu VBČ najbolj izraža kemokin CXCL12, ki se veže z receptorjem CXCR4, pri DTH pa CXCL13, ki mu ustreza kemokinski receptor CXCR5. Zato so v mezenhimske matične celice namenjene uporabi za posamezen model bolezni vstavili zapisa za pripadajoče specifična receptorja CXCR4 in CXCR5 pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja-1 α (EF-1 α), ki omogoča konstitutivno izražanje. Konstruktom so dodali še zapis za fluorecenčna reporterska proteina eGFP (varianta zelenega fluorescenčnega proteina) ali dTomato (rdeča fluorescenca) pod istim promotorjem, kar je omogočilo preverjanje ustrezne ekspresije sistema transformiranih celich s fluorescenčno mikroskopijo. V začetnih fazah poskusov so za transfekcijo celic uporabili lentivirusni ekspresijski vektor zaradi visoke učinkovitosti. V kasnejših fazah zaradi onkogenega tveganja pri uporabi lentivirusov prešli na uporabo elektroporacije.

=== Sledenje celicam ===
Da bi lahko zaznali spremembe v migraciji celic, so potrebovali sistem za vizualizacijo celic in sledenje celicam v živem organizmu, za kar fluorescenčni proteini večinoma niso primerni zaradi težav z avtofluorescenco molekul v celicah, ki povzroči visoko ozadje. V ta namen so v konstrukt dodatno vnesli zapis za encim[[ luciferaza]] 2-moonoksigenazo iz meduze ''Renilla reniformis'' (RLuc). Luciferaze so oksidativni encimi, ki katalizirajo reakcije pri katerih se sprošča svetloba in povzročijo bioluminiscenco. Ob dodatku substrata [[luciferin]]a pride do sproščanja svetlobe, ki jo lahko zaznamo z ustreznimi aparaturami. S pomočjo luciferaze lahko po injekciji luciferina opazujemo lokacijo vnešenih MMC ''in vivo'' s pomočjo IVIS spektra (sistem za spremljanje luminiscence ''in vivo'').

Da bi omogočili uporabo spremenjenih mezenhimskih matičnih celic v predkliničnih raziskavah, so kot končni konstrukt oblikovali plazmid, ki je poleg zapisa za kemokinski receptor vseboval zapis za luciferazo, reporterski protein dTomato in težko verigo človeškega [[feritin]]a (hFTH) pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja 1-α (EF1-α). [[Feritin]] lahko zaznamo s pomočjo magnetne resonance in zapis zanj na plazmidu omogoča alternativen način zaznavanja mezenhimskih matičnih celic v živem organizmu.

=== Oblikovanje samomorilnega stikala ===
Učinkovitost vnosa MMC, preživetje celic, njihov fenotip in aktivnost so močno odvisni od mikrookolja na mestu vnosa. Le to ima lastnosti rane med celjenjem in vsebuje imunske celice, novo nastalo žilje in citokine, ki pospešujejo fibrozo oziroma brazgotinjenje tkiva kot je TGF-''β''. Takšno okolje lahko sproži diferenciacijo MMC v krčljive miofibroblaste, ki sintetizirajo stresna vlakna iz ''α''-aktina iz gladkih mišičnih celic (α-SMA), kar vodi v povečanje brazgotinjenja tkiva in izgubo proti-vnetnih lastnosti celic.

V okviru projekta so s pomočjo kvantitativnega PCR dokazali, da MMC ob stimulaciji z TGF-''β'' izražajo ''α''-SMA v visokih koncentracijah. Odločili so se to lastnost izkoristiti za zaznavanje diferenciacije MMC. Oblikovali so biološki del, kjer so gen za fluorescenčni reporterski protein eGFP postavili pod kontrolo SMA promotorja. Dokazali so, da ob stimulaciji celic z TGF-''β'' dobijo fluorescenco reporterskega proteina in s tem lahko zaznajo celice, ki so se diferencirale.
Ta poskus je bil zasnova, ki jo bodo v prihodnje uporabili za oblikovanje samomorilskega stikala, ki bo ob zaznavanju diferenciacije MMC sprožilo apoptozo celice.

== Testiranje izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ==
Delovanje MMC nove generacije so ''in vitro'' preverili na 3 nivojih:

* Ohranjanje fenotipa: preverili so ali so spremenjene MMC ohranile sposobnost diferenciacije v osteoblaste, hondrocite in adipocite in izražanje specifičnih površinskih označevalcev s pomočjo pretočne citometrije.

* Ekspresija sistema: izražanje vstavljenega gena za kemokinske receptorje so preverili s pomočjo qPCR in fluorescence reporterskih proteinov s fluorescenčno mikroskopijo.

* Izboljšanje kemotakse: ''in vitro'' so izvedli test kemotakse pri katerem celice migrirajo skozi filter v smeri raztopine, ki vsebuje visoko koncentracijo kemokinov.

Za testiranje terapevtskega potenciala izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ''in vivo'' so ustvarili mišja modela dveh pogostih vnetnih bolezni: vnetne bolezni črevesja in zakasnjene preobčuljivosti. Stanje živali zdravljenih s spremenjenimi mezenhimskimi matičnimi celicami so primerjali z tistimi zdravljenimi s kontrolnimi MMC in z živalmi, ki niso bile zdravljene.

Model vnetne bolezni črevesja so dobili s pomočjo kemijske indukcije z 2, 4, 6 – trinitrobenzensulfonsko kislino (TNBS). Intrarektalna administracija TNBS povzroči vnetje črevesja z histopatološkimi najdbami podobnimi kot pri Chronovi bolezni.
Spremljali so prisotnost znakov bolezni, preživetje, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v črevesju ter infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah črevesja. ''In vivo'' so pri miših tretiranih s transformiranimi MMC preverjali usmerjenost celic na mesto vnetja s pomočjo IVIS spektra.

Miši z zakasnjeno preobčutljivostno reakcijo so uporabili kot eksperimentalni model za človeški alergijski kontaktni dermatitis. Zakasnjeno preobčutljivost so inducirali z uporabo raztopine fluoro-2, 4- dinitrobenzena (DNFB) tako, da so miši najprej senzitizirali preko kože na hrbtu in nato po enem tednu raztoptini DNFB izpostavili kožo na ušesih. Merili so debelino ušes (oteklino) in infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v ušesih. Prisotnost mezenhimskih matičnih celic so preverili z imunofluorescenco tkivnih rezin ušesa.

== Rezultati ==
# Transformirane mezenhimske matične celice so ohranile sposobnost diferenciacije v različne celične podtipe in izražanje značilnih površinskih označevalcev.

# S sintetiziranimi konstrukti so dosegli znatno povišanje izražanja kemokinskih receptorjev.

# Spremenjene MMC so imele značilno izboljšano sposobnost kemotakse ''in vitro''.

# S pomočjo reporterskih proteinov so uspešno vizualizirali celice tako ''in vitro'' kot ''in vivo''.

# Spremenjene mezenhimske matične celice so značilno izboljšale simptome bolezni, podaljšale preživetje, zmanjšale infiltracijo levkocitov na mesto vnetja, zmanjšale izražanje pro-vnetnih in povišale izražanje proti-vnetnih citokinov in imele boljše sposobnosti migracije na mesto vnetja v primerjavi s kontrolnimi MMC tako pri modelu VBČ kot pri modelu DTH.

# S pomočjo oblikovanega reporterja so uspešno zaznali diferenciacijo celic.
== Zaključek ==
Ekipa je za svoje delo prejela nagrado za najboljši terapevtski projekt in tudi za najboljši sestavljeni biološki del. Uspelo jim je sintetizirati mezenhimske matične celice z izboljšanimi protivnetnimi lastnostmi, ki jih lahko spremljamo ''in vivo'' in zaznamo njihovo diferenciacijo.
V prihodnjih poskusih napovedujejo dokončno izvedbo samomorilnega stikala, ki bi se sprožilo ob zaznavanju diferenciacije celic ter vnos zapisa za interlevkin-10, ki bi dodatno izboljšal protivnetno delovanje celic.

== Viri ==

2016.igem.org. (2016). Team:SYSU-MEDICINE - 2016.igem.org. [online] Dostopno na: http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE [Datum ogleda 21 Nov. 2016].

[[Seminarji SB 12016/17]]

Mezenhimske matične celice nove generacije

2016-11-21T21:59:59Z

Danijela Josic:

MSCavalry - Next generation Mesenchymal stem cells.
[http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE]

== Uvod ==
Mezenhimske matične celice (MMC) so obetavne kandidatke za celično zdravljenje vnetnih bolezni, kot je vnetna bolezen črevesja, zaradi njihovih sposobnosti zaviranja tako pridobljenega kot naravnega imunskega odziva. Klinični poskusi pa so pokazali, da po sistemski administraciji zelo majhen delež celic prispe do mesta vnetja in opravi svojo funkcijo zaradi neučinkovite kemotakse.
Na mednarodnem tekmovanju iz sintezne biologije iGEM v letu 2016 je sodelovala ekipa iz Univerze Sun Yat-Sen iz province Guangdong na Kitajskem z naslovom SYSU-Medicine, ki se je za svoj projekt odločila, da bo ustvarila izboljšane človeške mezenhimske matične celice (MMC) oziroma MMC nove generacije.

V ekipi SYSU-Medicine so želeli s pomočjo sintezne biologije ustvariti mezenhimske matične celice z izboljšano sposobnostjo usmerjenega in specifičnega potovanja na mesta z vnetjem. Za potrebe dokazovanja izboljšanih sposobnosti celic so uporabili označevalne proteine, ki so omogočili sledenje celicam tako ''in vitro'' kot ''in vivo''. Zdravilno delovanje celic so preizkusili tudi ''in vivo'' na mišjih modelih za dve pogosti vnetni bolezni: vnetno bolezen črevesja (VBČ) ter na modelu zakasnjene preobčutljivosti (''ang.'' delayed type hypersensitivity oz. DTH), ki je služil kot model za alergijski kontaktni dermatitis. Kot cilj so si zadali tudi oblikovati samomorilno stikalo, ki bi se sprožilo ob morebitni diferenciaciji mezenhimskih matičnih celic in s tem preprečilo njihov nenadzorovano delovanje v gostiteljskem organizmu.

=== Vnetje ===
Vnetje je proces, ki je osnova številnih bolezni in hkrati nenadomestljiv del procesa obnavljanja poškodovanega tkiva. Pri vnetju pride do kompleksnih interakcij med povzročitelji bolezni ali alergeni in imunskim sistemom, pri čemer imajo ključno vlogo kemokini in citokini. Ti delujejo kot prenašalci sporočil in se vežejo na specifične receptorje na površini tarčnih celic in vzpodbudijo sintezo dodatnih vnetnih signalnih molekul, ki povzročijo širjenje žil in prehod imunskih celic iz krvi v vneta tkiva. Če vnetje uide izpod nadzora, lahko pride do obsežne fibroze tkiva. V zadnjih letih je na področju zdravljenja vnetnih bolezni veliko pozornosti usmerjene v razvoj celične terapije z mezenhinskimi matičnimi celicami.

=== Mezenhimske matične celice ===
Mezenhimske matične celice so odrasle multipotentne matične celice, ki so prisotne v različnih tkivih kot so kostni mozeg, maščobno tkivo, periferna kri, zobna pulpa in številna embrionalna tkiva. MMC imajo sposobnost samoobnove in diferenciacije v več različnih celičnih tipov: osteoblaste (kostne celice), hondrocite (celice hrustanca) in adipocite (maščobne celice). Izločajo avtokrine in parakrine dejavnike, ki promovirajo nastanek žil (angiogenezo), zmanjšujejo vnetje in pospešujejo obnovo tkiva. Zaradi sposobnosti uravnavanja imunskega odziva je ena najbolj obetavnih možnosti uporabe mezenhimskih matičnih celic v zdravljenju vnetnih bolezni. Njihovo uporabnost omejuje nizka učinkovitost dostave celic na tarčna mesta in nespecifična distribucija v telesu pri vnosu z injekcijo v krvni obtok.

== Sintezna biologija ==

=== Izboljšanje kemotakse ===
Kemokini so signalne molekule ki nadzorujejo migracijo in lokalizacijo imunskih celic, kar je ključno za njihovo gibanje pri imunskem odzivu. Kemokinski receptorji so transmembranski proteini, ki po interakciji s specifičnim kemokinskim ligandom omogočijo vstop kalcijevih ionov v celico, kar sproži kemotakso. Mezenhimske matične celice gojene v kulturi kemokinske receptorje, odgovorne za navigacijo celic na mesta vnetja, izražajo v nizkih količinah, poleg tega pa študije kažejo na neučinkovito dostavo na tarčna mesta pri uporabi za zdravljenje.

V teoriji bi večje število receptorjev za vnetne citokine na površini celic omogočilo učinkovitejše zaznavanje citokinov in potovanje na mesto vnetja. S pomočjo metode kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) so ugotovili, da se pri modelu VBČ najbolj izraža kemokin CXCL12, ki se veže z receptorjem CXCR4, pri DTH pa CXCL13, ki mu ustreza kemokinski receptor CXCR5. Zato so v mezenhimske matične celice namenjene uporabi za posamezen model bolezni vstavili zapisa za pripadajoče specifična receptorja CXCR4 in CXCR5 pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja-1 α (EF-1 α), ki omogoča konstitutivno izražanje. Konstruktom so dodali še zapis za fluorecenčna reporterska proteina eGFP (varianta zelenega fluorescenčnega proteina) ali dTomato (rdeča fluorescenca) pod istim promotorjem, kar je omogočilo preverjanje ustrezne ekspresije sistema transformiranih celich s fluorescenčno mikroskopijo. V začetnih fazah poskusov so za transfekcijo celic uporabili lentivirusni ekspresijski vektor zaradi visoke učinkovitosti. V kasnejših fazah zaradi onkogenega tveganja pri uporabi lentivirusov prešli na uporabo elektroporacije.

=== Sledenje celicam ===
Da bi lahko zaznali spremembe v migraciji celic, so potrebovali sistem za vizualizacijo celic in sledenje celicam v živem organizmu, za kar fluorescenčni proteini večinoma niso primerni zaradi težav z avtofluorescenco molekul v celicah, ki povzroči visoko ozadje. V ta namen so v konstrukt dodatno vnesli zapis za encim[[ luciferaza]] 2-moonoksigenazo iz meduze ''Renilla reniformis'' (RLuc). Luciferaze so oksidativni encimi, ki katalizirajo reakcije pri katerih se sprošča svetloba in povzročijo bioluminiscenco. Ob dodatku substrata [[luciferin]]a pride do sproščanja svetlobe, ki jo lahko zaznamo z ustreznimi aparaturami. S pomočjo luciferaze lahko po injekciji luciferina opazujemo lokacijo vnešenih MMC ''in vivo'' s pomočjo IVIS spektra (sistem za spremljanje luminiscence ''in vivo'').

Da bi omogočili uporabo spremenjenih mezenhimskih matičnih celic v predkliničnih raziskavah, so kot končni konstrukt oblikovali [[plazmid]], ki je poleg zapisa za kemokinski receptor vseboval zapis za luciferazo, reporterski protein dTomato in težko verigo človeškega [[feritin]]a (hFTH) pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja 1-α (EF1-α). [[Ferit]]in lahko zaznamo s pomočjo magnetne resonance in zapis zanj na [[plazmid]]u omogoča alternativen način zaznavanja mezenhimskih matičnih celic v živem organizmu.

=== Oblikovanje samomorilnega stikala ===
Učinkovitost vnosa MMC, preživetje celic, njihov [[fenotip]] in aktivnost so močno odvisni od mikrookolja na mestu vnosa. Le to ima lastnosti rane med celjenjem in vsebuje imunske celice, novo nastalo žilje in citokine, ki pospešujejo fibrozo oziroma brazgotinjenje tkiva kot je TGF-''β''. Takšno okolje lahko sproži diferenciacijo MMC v krčljive miofibroblaste, ki sintetizirajo stresna vlakna iz ''α''-aktina iz gladkih mišičnih celic (α-SMA), kar vodi v povečanje brazgotinjenja tkiva in izgubo proti-vnetnih lastnosti celic.

V okviru projekta so s pomočjo kvantitativnega PCR dokazali, da MMC ob stimulaciji z TGF-''β'' izražajo ''α''-SMA v visokih koncentracijah. Odločili so se to lastnost izkoristiti za zaznavanje diferenciacije MMC. Oblikovali so biološki del, kjer so gen za fluorescenčni reporterski protein eGFP postavili pod kontrolo SMA promotorja. Dokazali so, da ob stimulaciji celic z TGF-''β'' dobijo fluorescenco reporterskega proteina in s tem lahko zaznajo celice, ki so se diferencirale.
Ta poskus je bil zasnova, ki jo bodo v prihodnje uporabili za oblikovanje samomorilskega stikala, ki bo ob zaznavanju diferenciacije MMC sprožilo apoptozo celice.

== Testiranje izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ==
Delovanje MMC nove generacije so ''in vitro'' preverili na 3 nivojih:

* Ohranjanje fenotipa: preverili so ali so spremenjene MMC ohranile sposobnost diferenciacije v osteoblaste, hondrocite in adipocite in izražanje specifičnih površinskih označevalcev s pomočjo pretočne citometrije.

* Ekspresija sistema: izražanje vstavljenega gena za kemokinske receptorje so preverili s pomočjo qPCR in fluorescence reporterskih proteinov s fluorescenčno mikroskopijo.

* Izboljšanje kemotakse: ''in vitro'' so izvedli test kemotakse pri katerem celice migrirajo skozi filter v smeri raztopine, ki vsebuje visoko koncentracijo kemokinov.

Za testiranje terapevtskega potenciala izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ''in vivo'' so ustvarili mišja modela dveh pogostih vnetnih bolezni: vnetne bolezni črevesja in zakasnjene preobčuljivosti. Stanje živali zdravljenih s spremenjenimi mezenhimskimi matičnimi celicami so primerjali z tistimi zdravljenimi s kontrolnimi MMC in z živalmi, ki niso bile zdravljene.

Model vnetne bolezni črevesja so dobili s pomočjo kemijske indukcije z 2, 4, 6 – trinitrobenzensulfonsko kislino (TNBS). Intrarektalna administracija TNBS povzroči vnetje črevesja z histopatološkimi najdbami podobnimi kot pri Chronovi bolezni.
Spremljali so prisotnost znakov bolezni, preživetje, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v črevesju ter infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah črevesja. ''In vivo'' so pri miših tretiranih s transformiranimi MMC preverjali usmerjenost celic na mesto vnetja s pomočjo IVIS spektra.

Miši z zakasnjeno preobčutljivostno reakcijo so uporabili kot eksperimentalni model za človeški alergijski kontaktni dermatitis. Zakasnjeno preobčutljivost so inducirali z uporabo raztopine fluoro-2, 4- dinitrobenzena (DNFB) tako, da so miši najprej senzitizirali preko kože na hrbtu in nato po enem tednu raztoptini DNFB izpostavili kožo na ušesih. Merili so debelino ušes (oteklino) in infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v ušesih. Prisotnost mezenhimskih matičnih celic so preverili z imunofluorescenco tkivnih rezin ušesa.

== Rezultati ==
# Transformirane mezenhimske matične celice so ohranile sposobnost diferenciacije v različne celične podtipe in izražanje značilnih površinskih označevalcev.

# S sintetiziranimi konstrukti so dosegli znatno povišanje izražanja kemokinskih receptorjev.

# Spremenjene MMC so imele značilno izboljšano sposobnost kemotakse ''in vitro''.

# S pomočjo reporterskih proteinov so uspešno vizualizirali celice tako ''in vitro'' kot ''in vivo''.

# Spremenjene mezenhimske matične celice so značilno izboljšale simptome bolezni, podaljšale preživetje, zmanjšale infiltracijo levkocitov na mesto vnetja, zmanjšale izražanje pro-vnetnih in povišale izražanje proti-vnetnih citokinov in imele boljše sposobnosti migracije na mesto vnetja v primerjavi s kontrolnimi MMC tako pri modelu VBČ kot pri modelu DTH.

# S pomočjo oblikovanega reporterja so uspešno zaznali diferenciacijo celic.
== Zaključek ==
Ekipa je za svoje delo prejela nagrado za najboljši terapevtski projekt in tudi za najboljši sestavljeni biološki del. Uspelo jim je sintetizirati mezenhimske matične celice z izboljšanimi protivnetnimi lastnostmi, ki jih lahko spremljamo ''in vivo'' in zaznamo njihovo diferenciacijo.
V prihodnjih poskusih napovedujejo dokončno izvedbo samomorilnega stikala, ki bi se sprožilo ob zaznavanju diferenciacije celic ter vnos zapisa za interlevkin-10, ki bi dodatno izboljšal protivnetno delovanje celic.

== Viri ==

2016.igem.org. (2016). Team:SYSU-MEDICINE - 2016.igem.org. [online] Dostopno na: http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE [Datum ogleda 21 Nov. 2016].

[[Seminarji SB 12016/17]]

Mezenhimske matične celice nove generacije

2016-11-21T21:57:15Z

Danijela Josic:

MSCavalry - Next generation Mesenchymal stem cells.
[http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE]

== Uvod ==
Mezenhimske matične celice (MMC) so obetavne kandidatke za celično zdravljenje vnetnih bolezni, kot je vnetna bolezen črevesja, zaradi njihovih sposobnosti zaviranja tako pridobljenega kot naravnega imunskega odziva. Klinični poskusi pa so pokazali, da po sistemski administraciji zelo majhen delež celic prispe do mesta vnetja in opravi svojo funkcijo zaradi neučinkovite kemotakse.
Na mednarodnem tekmovanju iz sintezne biologije iGEM v letu 2016 je sodelovala ekipa iz Univerze Sun Yat-Sen iz province Guangdong na Kitajskem z naslovom SYSU-Medicine, ki se je za svoj projekt odločila, da bo ustvarila izboljšane človeške mezenhimske matične celice (MMC) oziroma MMC nove generacije.

V ekipi SYSU-Medicine so želeli s pomočjo sintezne biologije ustvariti mezenhimske matične celice z izboljšano sposobnostjo usmerjenega in specifičnega potovanja na mesta z vnetjem. Za potrebe dokazovanja izboljšanih sposobnosti celic so uporabili označevalne proteine, ki so omogočili sledenje celicam tako ''in vitro'' kot ''in vivo''. Zdravilno delovanje celic so preizkusili tudi ''in vivo'' na mišjih modelih za dve pogosti vnetni bolezni: vnetno bolezen črevesja (VBČ) ter na modelu zakasnjene preobčutljivosti (''ang.'' delayed type hypersensitivity oz. DTH), ki je služil kot model za alergijski kontaktni dermatitis. Kot cilj so si zadali tudi oblikovati samomorilno stikalo, ki bi se sprožilo ob morebitni diferenciaciji mezenhimskih matičnih celic in s tem preprečilo njihov nenadzorovano delovanje v gostiteljskem organizmu.

=== Vnetje ===
Vnetje je proces, ki je osnova številnih bolezni in hkrati nenadomestljiv del procesa obnavljanja poškodovanega tkiva. Pri vnetju pride do kompleksnih interakcij med povzročitelji bolezni ali alergeni in imunskim sistemom, pri čemer imajo ključno vlogo kemokini in citokini. Ti delujejo kot prenašalci sporočil in se vežejo na specifične receptorje na površini tarčnih celic in vzpodbudijo sintezo dodatnih vnetnih signalnih molekul, ki povzročijo širjenje žil in prehod imunskih celic iz krvi v vneta tkiva. Če vnetje uide izpod nadzora, lahko pride do obsežne fibroze tkiva. V zadnjih letih je na področju zdravljenja vnetnih bolezni veliko pozornosti usmerjene v razvoj celične terapije z mezenhinskimi matičnimi celicami.

=== Mezenhimske matične celice ===
Mezenhimske matične celice so odrasle multipotentne matične celice, ki so prisotne v različnih tkivih kot so kostni mozeg, maščobno tkivo, periferna kri, zobna pulpa in številna embrionalna tkiva. MMC imajo sposobnost samoobnove in diferenciacije v več različnih celičnih tipov: osteoblaste (kostne celice), hondrocite (celice hrustanca) in adipocite (maščobne celice). Izločajo avtokrine in parakrine dejavnike, ki promovirajo nastanek žil (angiogenezo), zmanjšujejo vnetje in pospešujejo obnovo tkiva. Zaradi sposobnosti uravnavanja imunskega odziva je ena najbolj obetavnih možnosti uporabe mezenhimskih matičnih celic v zdravljenju vnetnih bolezni. Njihovo uporabnost omejuje nizka učinkovitost dostave celic na tarčna mesta in nespecifična distribucija v telesu pri vnosu z injekcijo v krvni obtok.

== Sintezna biologija ==

=== Izboljšanje kemotakse ===
Kemokini so signalne molekule ki nadzorujejo migracijo in lokalizacijo imunskih celic, kar je ključno za njihovo gibanje pri imunskem odzivu. Kemokinski receptorji so transmembranski proteini, ki po interakciji s specifičnim kemokinskim ligandom omogočijo vstop kalcijevih ionov v celico, kar sproži kemotakso. Mezenhimske matične celice gojene v kulturi kemokinske receptorje, odgovorne za navigacijo celic na mesta vnetja, izražajo v nizkih količinah, poleg tega pa študije kažejo na neučinkovito dostavo na tarčna mesta pri uporabi za zdravljenje.

V teoriji bi večje število receptorjev za vnetne citokine na površini celic omogočilo učinkovitejše zaznavanje citokinov in potovanje na mesto vnetja. S pomočjo metode kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) so ugotovili, da se pri modelu VBČ najbolj izraža kemokin CXCL12, ki se veže z receptorjem CXCR4, pri DTH pa CXCL13, ki mu ustreza kemokinski receptor CXCR5. Zato so v mezenhimske matične celice namenjene uporabi za posamezen model bolezni vstavili zapisa za pripadajoče specifična receptorja CXCR4 in CXCR5 pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja-1 α (EF-1 α), ki omogoča konstitutivno izražanje. Konstruktom so dodali še zapis za fluorecenčna reporterska proteina eGFP (varianta zelenega fluorescenčnega proteina) ali dTomato (rdeča fluorescenca) pod istim promotorjem, kar je omogočilo preverjanje ustrezne ekspresije sistema transformiranih celich s fluorescenčno mikroskopijo. V začetnih fazah poskusov so za transfekcijo celic uporabili lentivirusni ekspresijski vektor zaradi visoke učinkovitosti. V kasnejših fazah zaradi onkogenega tveganja pri uporabi lentivirusov prešli na uporabo elektroporacije.

=== Sledenje celicam ===
Da bi lahko zaznali spremembe v migraciji celic, so potrebovali sistem za vizualizacijo celic in sledenje celicam v živem organizmu, za kar fluorescenčni proteini večinoma niso primerni zaradi težav z avtofluorescenco molekul v celicah, ki povzroči visoko ozadje. V ta namen so v konstrukt dodatno vnesli zapis za encim[[ luciferaza]] 2-moonoksigenazo iz meduze ''Renilla reniformis'' (RLuc). Luciferaze so oksidativni encimi, ki katalizirajo reakcije pri katerih se sprošča svetloba in povzročijo bioluminiscenco. Ob dodatku substrata [[luciferin]]a pride do sproščanja svetlobe, ki jo lahko zaznamo z ustreznimi aparaturami. S pomočjo luciferaze lahko po injekciji luciferina opazujemo lokacijo vnešenih MMC ''in vivo'' s pomočjo IVIS spektra (sistem za spremljanje luminiscence ''in vivo'').

Da bi omogočili uporabo spremenjenih mezenhimskih matičnih celic v predkliničnih raziskavah, so kot končni konstrukt oblikovali plazmid, ki je poleg zapisa za kemokinski receptor vseboval zapis za luciferazo, reporterski protein dTomato in težko verigo človeškega feritina (hFTH) pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja 1-α (EF1-α). Feritin lahko zaznamo s pomočjo magnetne resonance in zapis zanj na plazmidu omogoča alternativen način zaznavanja mezenhimskih matičnih celic v živem organizmu.

=== Oblikovanje samomorilnega stikala ===
Učinkovitost vnosa MMC, preživetje celic, njihov fenotip in aktivnost so močno odvisni od mikrookolja na mestu vnosa. Le to ima lastnosti rane med celjenjem in vsebuje imunske celice, novo nastalo žilje in citokine, ki pospešujejo fibrozo oziroma brazgotinjenje tkiva kot je TGF-''β''. Takšno okolje lahko sproži diferenciacijo MMC v krčljive miofibroblaste, ki sintetizirajo stresna vlakna iz ''α''-aktina iz gladkih mišičnih celic (α-SMA), kar vodi v povečanje brazgotinjenja tkiva in izgubo proti-vnetnih lastnosti celic.

V okviru projekta so s pomočjo kvantitativnega PCR dokazali, da MMC ob stimulaciji z TGF-''β'' izražajo ''α''-SMA v visokih koncentracijah. Odločili so se to lastnost izkoristiti za zaznavanje diferenciacije MMC. Oblikovali so biološki del, kjer so gen za fluorescenčni reporterski protein eGFP postavili pod kontrolo SMA promotorja. Dokazali so, da ob stimulaciji celic z TGF-''β'' dobijo fluorescenco reporterskega proteina in s tem lahko zaznajo celice, ki so se diferencirale.
Ta poskus je bil zasnova, ki jo bodo v prihodnje uporabili za oblikovanje samomorilskega stikala, ki bo ob zaznavanju diferenciacije MMC sprožilo apoptozo celice.

== Testiranje izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ==
Delovanje MMC nove generacije so ''in vitro'' preverili na 3 nivojih:

* Ohranjanje fenotipa: preverili so ali so spremenjene MMC ohranile sposobnost diferenciacije v osteoblaste, hondrocite in adipocite in izražanje specifičnih površinskih označevalcev s pomočjo pretočne citometrije.

* Ekspresija sistema: izražanje vstavljenega gena za kemokinske receptorje so preverili s pomočjo qPCR in fluorescence reporterskih proteinov s fluorescenčno mikroskopijo.

* Izboljšanje kemotakse: ''in vitro'' so izvedli test kemotakse pri katerem celice migrirajo skozi filter v smeri raztopine, ki vsebuje visoko koncentracijo kemokinov.

Za testiranje terapevtskega potenciala izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ''in vivo'' so ustvarili mišja modela dveh pogostih vnetnih bolezni: vnetne bolezni črevesja in zakasnjene preobčuljivosti. Stanje živali zdravljenih s spremenjenimi mezenhimskimi matičnimi celicami so primerjali z tistimi zdravljenimi s kontrolnimi MMC in z živalmi, ki niso bile zdravljene.

Model vnetne bolezni črevesja so dobili s pomočjo kemijske indukcije z 2, 4, 6 – trinitrobenzensulfonsko kislino (TNBS). Intrarektalna administracija TNBS povzroči vnetje črevesja z histopatološkimi najdbami podobnimi kot pri Chronovi bolezni.
Spremljali so prisotnost znakov bolezni, preživetje, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v črevesju ter infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah črevesja. ''In vivo'' so pri miših tretiranih s transformiranimi MMC preverjali usmerjenost celic na mesto vnetja s pomočjo IVIS spektra.

Miši z zakasnjeno preobčutljivostno reakcijo so uporabili kot eksperimentalni model za človeški alergijski kontaktni dermatitis. Zakasnjeno preobčutljivost so inducirali z uporabo raztopine fluoro-2, 4- dinitrobenzena (DNFB) tako, da so miši najprej senzitizirali preko kože na hrbtu in nato po enem tednu raztoptini DNFB izpostavili kožo na ušesih. Merili so debelino ušes (oteklino) in infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v ušesih. Prisotnost mezenhimskih matičnih celic so preverili z imunofluorescenco tkivnih rezin ušesa.

== Rezultati ==
# Transformirane mezenhimske matične celice so ohranile sposobnost diferenciacije v različne celične podtipe in izražanje značilnih površinskih označevalcev.

# S sintetiziranimi konstrukti so dosegli znatno povišanje izražanja kemokinskih receptorjev.

# Spremenjene MMC so imele značilno izboljšano sposobnost kemotakse ''in vitro''.

# S pomočjo reporterskih proteinov so uspešno vizualizirali celice tako ''in vitro'' kot ''in vivo''.

# Spremenjene mezenhimske matične celice so značilno izboljšale simptome bolezni, podaljšale preživetje, zmanjšale infiltracijo levkocitov na mesto vnetja, zmanjšale izražanje pro-vnetnih in povišale izražanje proti-vnetnih citokinov in imele boljše sposobnosti migracije na mesto vnetja v primerjavi s kontrolnimi MMC tako pri modelu VBČ kot pri modelu DTH.

# S pomočjo oblikovanega reporterja so uspešno zaznali diferenciacijo celic.
== Zaključek ==
Ekipa je za svoje delo prejela nagrado za najboljši terapevtski projekt in tudi za najboljši sestavljeni biološki del. Uspelo jim je sintetizirati mezenhimske matične celice z izboljšanimi protivnetnimi lastnostmi, ki jih lahko spremljamo ''in vivo'' in zaznamo njihovo diferenciacijo.
V prihodnjih poskusih napovedujejo dokončno izvedbo samomorilnega stikala, ki bi se sprožilo ob zaznavanju diferenciacije celic ter vnos zapisa za interlevkin-10, ki bi dodatno izboljšal protivnetno delovanje celic.

== Viri ==

2016.igem.org. (2016). Team:SYSU-MEDICINE - 2016.igem.org. [online] Dostopno na: http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE [Datum ogleda 21 Nov. 2016].

[[Seminarji SB 12016/17]]

Mezenhimske matične celice nove generacije

2016-11-21T21:54:47Z

Danijela Josic:

MSCavalry - Next generation Mesenchymal stem cells.
[http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE]

== Uvod ==
Mezenhimske matične celice (MMC) so obetavne kandidatke za celično zdravljenje vnetnih bolezni, kot je vnetna bolezen črevesja, zaradi njihovih sposobnosti zaviranja tako pridobljenega kot naravnega imunskega odziva. Klinični poskusi pa so pokazali, da po sistemski administraciji zelo majhen delež celic prispe do mesta vnetja in opravi svojo funkcijo zaradi neučinkovite kemotakse.
Na mednarodnem tekmovanju iz sintezne biologije iGEM v letu 2016 je sodelovala ekipa iz Univerze Sun Yat-Sen iz province Guangdong na Kitajskem z naslovom SYSU-Medicine, ki se je za svoj projekt odločila, da bo ustvarila izboljšane človeške mezenhimske matične celice (MMC) oziroma MMC nove generacije.

V ekipi SYSU-Medicine so želeli s pomočjo sintezne biologije ustvariti mezenhimske matične celice z izboljšano sposobnostjo usmerjenega in specifičnega potovanja na mesta z vnetjem. Za potrebe dokazovanja izboljšanih sposobnosti celic so uporabili označevalne proteine, ki so omogočili sledenje celicam tako ''in vitro'' kot ''in vivo''. Zdravilno delovanje celic so preizkusili tudi ''in vivo'' na mišjih modelih za dve pogosti vnetni bolezni: vnetno bolezen črevesja (VBČ) ter na modelu zakasnjene preobčutljivosti (''ang.'' delayed type hypersensitivity oz. DTH), ki je služil kot model za alergijski kontaktni dermatitis. Kot cilj so si zadali tudi oblikovati samomorilno stikalo, ki bi se sprožilo ob morebitni diferenciaciji mezenhimskih matičnih celic in s tem preprečilo njihov nenadzorovano delovanje v gostiteljskem organizmu.

=== Vnetje ===
Vnetje je proces, ki je osnova številnih bolezni in hkrati nenadomestljiv del procesa obnavljanja poškodovanega tkiva. Pri vnetju pride do kompleksnih interakcij med povzročitelji bolezni ali alergeni in imunskim sistemom, pri čemer imajo ključno vlogo kemokini in citokini. Ti delujejo kot prenašalci sporočil in se vežejo na specifične receptorje na površini tarčnih celic in vzpodbudijo sintezo dodatnih vnetnih signalnih molekul, ki povzročijo širjenje žil in prehod imunskih celic iz krvi v vneta tkiva. Če vnetje uide izpod nadzora, lahko pride do obsežne fibroze tkiva. V zadnjih letih je na področju zdravljenja vnetnih bolezni veliko pozornosti usmerjene v razvoj celične terapije z mezenhinskimi matičnimi celicami.

=== Mezenhimske matične celice ===
Mezenhimske matične celice so odrasle multipotentne matične celice, ki so prisotne v različnih tkivih kot so kostni mozeg, maščobno tkivo, periferna kri, zobna pulpa in številna embrionalna tkiva. MMC imajo sposobnost samoobnove in diferenciacije v več različnih celičnih tipov: osteoblaste (kostne celice), hondrocite (celice hrustanca) in adipocite (maščobne celice). Izločajo avtokrine in parakrine dejavnike, ki promovirajo nastanek žil (angiogenezo), zmanjšujejo vnetje in pospešujejo obnovo tkiva. Zaradi sposobnosti uravnavanja imunskega odziva je ena najbolj obetavnih možnosti uporabe mezenhimskih matičnih celic v zdravljenju vnetnih bolezni. Njihovo uporabnost omejuje nizka učinkovitost dostave celic na tarčna mesta in nespecifična distribucija v telesu pri vnosu z injekcijo v krvni obtok.

== Sintezna biologija ==

=== Izboljšanje kemotakse ===
Kemokini so signalne molekule ki nadzorujejo migracijo in lokalizacijo imunskih celic, kar je ključno za njihovo gibanje pri imunskem odzivu. Kemokinski receptorji so transmembranski proteini, ki po interakciji s specifičnim kemokinskim ligandom omogočijo vstop kalcijevih ionov v celico, kar sproži kemotakso. Mezenhimske matične celice gojene v kulturi kemokinske receptorje, odgovorne za navigacijo celic na mesta vnetja, izražajo v nizkih količinah, poleg tega pa študije kažejo na neučinkovito dostavo na tarčna mesta pri uporabi za zdravljenje.

V teoriji bi večje število receptorjev za vnetne citokine na površini celic omogočilo učinkovitejše zaznavanje citokinov in potovanje na mesto vnetja. S pomočjo metode kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) so ugotovili, da se pri modelu VBČ najbolj izraža kemokin CXCL12, ki se veže z receptorjem CXCR4, pri DTH pa CXCL13, ki mu ustreza kemokinski receptor CXCR5. Zato so v mezenhimske matične celice namenjene uporabi za posamezen model bolezni vstavili zapisa za pripadajoče specifična receptorja CXCR4 in CXCR5 pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja-1 α (EF-1 α), ki omogoča konstitutivno izražanje. Konstruktom so dodali še zapis za fluorecenčna reporterska proteina eGFP (varianta zelenega fluorescenčnega proteina) ali dTomato (rdeča fluorescenca) pod istim promotorjem, kar je omogočilo preverjanje ustrezne ekspresije sistema transformiranih celich s fluorescenčno mikroskopijo. V začetnih fazah poskusov so za transfekcijo celic uporabili lentivirusni ekspresijski vektor zaradi visoke učinkovitosti. V kasnejših fazah zaradi onkogenega tveganja pri uporabi lentivirusov prešli na uporabo elektroporacije.

=== Sledenje celicam ===
Da bi lahko zaznali spremembe v migraciji celic, so potrebovali sistem za vizualizacijo celic in sledenje celicam v živem organizmu, za kar fluorescenčni proteini večinoma niso primerni zaradi težav z avtofluorescenco molekul v celicah, ki povzroči visoko ozadje. V ta namen so v konstrukt dodatno vnesli zapis za encim[[ luciferaza]] 2-moonoksigenazo iz meduze ''Renilla reniformis'' (RLuc). Luciferaze so oksidativni encimi, ki katalizirajo reakcije pri katerih se sprošča svetloba in povzročijo bioluminiscenco. Ob dodatku substrata [[luciferina]] pride do sproščanja svetlobe, ki jo lahko zaznamo z ustreznimi aparaturami. S pomočjo luciferaze lahko po injekciji luciferina opazujemo lokacijo vnešenih MMC ''in vivo'' s pomočjo IVIS spektra (sistem za spremljanje luminiscence ''in vivo'').

Da bi omogočili uporabo spremenjenih mezenhimskih matičnih celic v predkliničnih raziskavah, so kot končni konstrukt oblikovali plazmid, ki je poleg zapisa za kemokinski receptor vseboval zapis za luciferazo, reporterski protein dTomato in težko verigo človeškega feritina (hFTH) pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja 1-α (EF1-α). Feritin lahko zaznamo s pomočjo magnetne resonance in zapis zanj na plazmidu omogoča alternativen način zaznavanja mezenhimskih matičnih celic v živem organizmu.

=== Oblikovanje samomorilnega stikala ===
Učinkovitost vnosa MMC, preživetje celic, njihov fenotip in aktivnost so močno odvisni od mikrookolja na mestu vnosa. Le to ima lastnosti rane med celjenjem in vsebuje imunske celice, novo nastalo žilje in citokine, ki pospešujejo fibrozo oziroma brazgotinjenje tkiva kot je TGF-''β''. Takšno okolje lahko sproži diferenciacijo MMC v krčljive miofibroblaste, ki sintetizirajo stresna vlakna iz ''α''-aktina iz gladkih mišičnih celic (α-SMA), kar vodi v povečanje brazgotinjenja tkiva in izgubo proti-vnetnih lastnosti celic.

V okviru projekta so s pomočjo kvantitativnega PCR dokazali, da MMC ob stimulaciji z TGF-''β'' izražajo ''α''-SMA v visokih koncentracijah. Odločili so se to lastnost izkoristiti za zaznavanje diferenciacije MMC. Oblikovali so biološki del, kjer so gen za fluorescenčni reporterski protein eGFP postavili pod kontrolo SMA promotorja. Dokazali so, da ob stimulaciji celic z TGF-''β'' dobijo fluorescenco reporterskega proteina in s tem lahko zaznajo celice, ki so se diferencirale.
Ta poskus je bil zasnova, ki jo bodo v prihodnje uporabili za oblikovanje samomorilskega stikala, ki bo ob zaznavanju diferenciacije MMC sprožilo apoptozo celice.

== Testiranje izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ==
Delovanje MMC nove generacije so ''in vitro'' preverili na 3 nivojih:

* Ohranjanje fenotipa: preverili so ali so spremenjene MMC ohranile sposobnost diferenciacije v osteoblaste, hondrocite in adipocite in izražanje specifičnih površinskih označevalcev s pomočjo pretočne citometrije.

* Ekspresija sistema: izražanje vstavljenega gena za kemokinske receptorje so preverili s pomočjo qPCR in fluorescence reporterskih proteinov s fluorescenčno mikroskopijo.

* Izboljšanje kemotakse: ''in vitro'' so izvedli test kemotakse pri katerem celice migrirajo skozi filter v smeri raztopine, ki vsebuje visoko koncentracijo kemokinov.

Za testiranje terapevtskega potenciala izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ''in vivo'' so ustvarili mišja modela dveh pogostih vnetnih bolezni: vnetne bolezni črevesja in zakasnjene preobčuljivosti. Stanje živali zdravljenih s spremenjenimi mezenhimskimi matičnimi celicami so primerjali z tistimi zdravljenimi s kontrolnimi MMC in z živalmi, ki niso bile zdravljene.

Model vnetne bolezni črevesja so dobili s pomočjo kemijske indukcije z 2, 4, 6 – trinitrobenzensulfonsko kislino (TNBS). Intrarektalna administracija TNBS povzroči vnetje črevesja z histopatološkimi najdbami podobnimi kot pri Chronovi bolezni.
Spremljali so prisotnost znakov bolezni, preživetje, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v črevesju ter infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah črevesja. ''In vivo'' so pri miših tretiranih s transformiranimi MMC preverjali usmerjenost celic na mesto vnetja s pomočjo IVIS spektra.

Miši z zakasnjeno preobčutljivostno reakcijo so uporabili kot eksperimentalni model za človeški alergijski kontaktni dermatitis. Zakasnjeno preobčutljivost so inducirali z uporabo raztopine fluoro-2, 4- dinitrobenzena (DNFB) tako, da so miši najprej senzitizirali preko kože na hrbtu in nato po enem tednu raztoptini DNFB izpostavili kožo na ušesih. Merili so debelino ušes (oteklino) in infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v ušesih. Prisotnost mezenhimskih matičnih celic so preverili z imunofluorescenco tkivnih rezin ušesa.

== Rezultati ==
# Transformirane mezenhimske matične celice so ohranile sposobnost diferenciacije v različne celične podtipe in izražanje značilnih površinskih označevalcev.

# S sintetiziranimi konstrukti so dosegli znatno povišanje izražanja kemokinskih receptorjev.

# Spremenjene MMC so imele značilno izboljšano sposobnost kemotakse ''in vitro''.

# S pomočjo reporterskih proteinov so uspešno vizualizirali celice tako ''in vitro'' kot ''in vivo''.

# Spremenjene mezenhimske matične celice so značilno izboljšale simptome bolezni, podaljšale preživetje, zmanjšale infiltracijo levkocitov na mesto vnetja, zmanjšale izražanje pro-vnetnih in povišale izražanje proti-vnetnih citokinov in imele boljše sposobnosti migracije na mesto vnetja v primerjavi s kontrolnimi MMC tako pri modelu VBČ kot pri modelu DTH.

# S pomočjo oblikovanega reporterja so uspešno zaznali diferenciacijo celic.
== Zaključek ==
Ekipa je za svoje delo prejela nagrado za najboljši terapevtski projekt in tudi za najboljši sestavljeni biološki del. Uspelo jim je sintetizirati mezenhimske matične celice z izboljšanimi protivnetnimi lastnostmi, ki jih lahko spremljamo ''in vivo'' in zaznamo njihovo diferenciacijo.
V prihodnjih poskusih napovedujejo dokončno izvedbo samomorilnega stikala, ki bi se sprožilo ob zaznavanju diferenciacije celic ter vnos zapisa za interlevkin-10, ki bi dodatno izboljšal protivnetno delovanje celic.

== Viri ==

2016.igem.org. (2016). Team:SYSU-MEDICINE - 2016.igem.org. [online] Dostopno na: http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE [Datum ogleda 21 Nov. 2016].

[[Seminarji SB 12016/17]]

Mezenhimske matične celice nove generacije

2016-11-21T21:53:58Z

Danijela Josic:

MSCavalry - Next generation Mesenchymal stem cells.
[http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE]

== Uvod ==
Mezenhimske matične celice (MMC) so obetavne kandidatke za celično zdravljenje vnetnih bolezni, kot je vnetna bolezen črevesja, zaradi njihovih sposobnosti zaviranja tako pridobljenega kot naravnega imunskega odziva. Klinični poskusi pa so pokazali, da po sistemski administraciji zelo majhen delež celic prispe do mesta vnetja in opravi svojo funkcijo zaradi neučinkovite kemotakse.
Na mednarodnem tekmovanju iz sintezne biologije iGEM v letu 2016 je sodelovala ekipa iz Univerze Sun Yat-Sen iz province Guangdong na Kitajskem z naslovom SYSU-Medicine, ki se je za svoj projekt odločila, da bo ustvarila izboljšane človeške mezenhimske matične celice (MMC) oziroma MMC nove generacije.

V ekipi SYSU-Medicine so želeli s pomočjo sintezne biologije ustvariti mezenhimske matične celice z izboljšano sposobnostjo usmerjenega in specifičnega potovanja na mesta z vnetjem. Za potrebe dokazovanja izboljšanih sposobnosti celic so uporabili označevalne proteine, ki so omogočili sledenje celicam tako ''in vitro'' kot ''in vivo''. Zdravilno delovanje celic so preizkusili tudi ''in vivo'' na mišjih modelih za dve pogosti vnetni bolezni: vnetno bolezen črevesja (VBČ) ter na modelu zakasnjene preobčutljivosti (''ang.'' delayed type hypersensitivity oz. DTH), ki je služil kot model za alergijski kontaktni dermatitis. Kot cilj so si zadali tudi oblikovati samomorilno stikalo, ki bi se sprožilo ob morebitni diferenciaciji mezenhimskih matičnih celic in s tem preprečilo njihov nenadzorovano delovanje v gostiteljskem organizmu.

=== Vnetje ===
Vnetje je proces, ki je osnova številnih bolezni in hkrati nenadomestljiv del procesa obnavljanja poškodovanega tkiva. Pri vnetju pride do kompleksnih interakcij med povzročitelji bolezni ali alergeni in imunskim sistemom, pri čemer imajo ključno vlogo kemokini in citokini. Ti delujejo kot prenašalci sporočil in se vežejo na specifične receptorje na površini tarčnih celic in vzpodbudijo sintezo dodatnih vnetnih signalnih molekul, ki povzročijo širjenje žil in prehod imunskih celic iz krvi v vneta tkiva. Če vnetje uide izpod nadzora, lahko pride do obsežne fibroze tkiva. V zadnjih letih je na področju zdravljenja vnetnih bolezni veliko pozornosti usmerjene v razvoj celične terapije z mezenhinskimi matičnimi celicami.

=== Mezenhimske matične celice ===
Mezenhimske matične celice so odrasle multipotentne matične celice, ki so prisotne v različnih tkivih kot so kostni mozeg, maščobno tkivo, periferna kri, zobna pulpa in številna embrionalna tkiva. MMC imajo sposobnost samoobnove in diferenciacije v več različnih celičnih tipov: osteoblaste (kostne celice), hondrocite (celice hrustanca) in adipocite (maščobne celice). Izločajo avtokrine in parakrine dejavnike, ki promovirajo nastanek žil (angiogenezo), zmanjšujejo vnetje in pospešujejo obnovo tkiva. Zaradi sposobnosti uravnavanja imunskega odziva je ena najbolj obetavnih možnosti uporabe mezenhimskih matičnih celic v zdravljenju vnetnih bolezni. Njihovo uporabnost omejuje nizka učinkovitost dostave celic na tarčna mesta in nespecifična distribucija v telesu pri vnosu z injekcijo v krvni obtok.

== Sintezna biologija ==

=== Izboljšanje kemotakse ===
Kemokini so signalne molekule ki nadzorujejo migracijo in lokalizacijo imunskih celic, kar je ključno za njihovo gibanje pri imunskem odzivu. Kemokinski receptorji so transmembranski proteini, ki po interakciji s specifičnim kemokinskim ligandom omogočijo vstop kalcijevih ionov v celico, kar sproži kemotakso. Mezenhimske matične celice gojene v kulturi kemokinske receptorje, odgovorne za navigacijo celic na mesta vnetja, izražajo v nizkih količinah, poleg tega pa študije kažejo na neučinkovito dostavo na tarčna mesta pri uporabi za zdravljenje.

V teoriji bi večje število receptorjev za vnetne citokine na površini celic omogočilo učinkovitejše zaznavanje citokinov in potovanje na mesto vnetja. S pomočjo metode kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) so ugotovili, da se pri modelu VBČ najbolj izraža kemokin CXCL12, ki se veže z receptorjem CXCR4, pri DTH pa CXCL13, ki mu ustreza kemokinski receptor CXCR5. Zato so v mezenhimske matične celice namenjene uporabi za posamezen model bolezni vstavili zapisa za pripadajoče specifična receptorja CXCR4 in CXCR5 pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja-1 α (EF-1 α), ki omogoča konstitutivno izražanje. Konstruktom so dodali še zapis za fluorecenčna reporterska proteina eGFP (varianta zelenega fluorescenčnega proteina) ali dTomato (rdeča fluorescenca) pod istim promotorjem, kar je omogočilo preverjanje ustrezne ekspresije sistema transformiranih celich s fluorescenčno mikroskopijo. V začetnih fazah poskusov so za transfekcijo celic uporabili lentivirusni ekspresijski vektor zaradi visoke učinkovitosti. V kasnejših fazah zaradi onkogenega tveganja pri uporabi lentivirusov prešli na uporabo elektroporacije.

=== Sledenje celicam ===
Da bi lahko zaznali spremembe v migraciji celic, so potrebovali sistem za vizualizacijo celic in sledenje celicam v živem organizmu, za kar fluorescenčni proteini večinoma niso primerni zaradi težav z avtofluorescenco molekul v celicah, ki povzroči visoko ozadje. V ta namen so v konstrukt dodatno vnesli zapis za encim[[ luciferaza]] 2-moonoksigenazo iz meduze ''Renilla reniformis'' (RLuc). Luciferaze so oksidativni encimi, ki katalizirajo reakcije pri katerih se sprošča svetloba in povzročijo bioluminiscenco. Ob dodatku substrata luciferina pride do sproščanja svetlobe, ki jo lahko zaznamo z ustreznimi aparaturami. S pomočjo luciferaze lahko po injekciji luciferina opazujemo lokacijo vnešenih MMC ''in vivo'' s pomočjo IVIS spektra (sistem za spremljanje luminiscence ''in vivo'').

Da bi omogočili uporabo spremenjenih mezenhimskih matičnih celic v predkliničnih raziskavah, so kot končni konstrukt oblikovali plazmid, ki je poleg zapisa za kemokinski receptor vseboval zapis za luciferazo, reporterski protein dTomato in težko verigo človeškega feritina (hFTH) pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja 1-α (EF1-α). Feritin lahko zaznamo s pomočjo magnetne resonance in zapis zanj na plazmidu omogoča alternativen način zaznavanja mezenhimskih matičnih celic v živem organizmu.

=== Oblikovanje samomorilnega stikala ===
Učinkovitost vnosa MMC, preživetje celic, njihov fenotip in aktivnost so močno odvisni od mikrookolja na mestu vnosa. Le to ima lastnosti rane med celjenjem in vsebuje imunske celice, novo nastalo žilje in citokine, ki pospešujejo fibrozo oziroma brazgotinjenje tkiva kot je TGF-''β''. Takšno okolje lahko sproži diferenciacijo MMC v krčljive miofibroblaste, ki sintetizirajo stresna vlakna iz ''α''-aktina iz gladkih mišičnih celic (α-SMA), kar vodi v povečanje brazgotinjenja tkiva in izgubo proti-vnetnih lastnosti celic.

V okviru projekta so s pomočjo kvantitativnega PCR dokazali, da MMC ob stimulaciji z TGF-''β'' izražajo ''α''-SMA v visokih koncentracijah. Odločili so se to lastnost izkoristiti za zaznavanje diferenciacije MMC. Oblikovali so biološki del, kjer so gen za fluorescenčni reporterski protein eGFP postavili pod kontrolo SMA promotorja. Dokazali so, da ob stimulaciji celic z TGF-''β'' dobijo fluorescenco reporterskega proteina in s tem lahko zaznajo celice, ki so se diferencirale.
Ta poskus je bil zasnova, ki jo bodo v prihodnje uporabili za oblikovanje samomorilskega stikala, ki bo ob zaznavanju diferenciacije MMC sprožilo apoptozo celice.

== Testiranje izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ==
Delovanje MMC nove generacije so ''in vitro'' preverili na 3 nivojih:

* Ohranjanje fenotipa: preverili so ali so spremenjene MMC ohranile sposobnost diferenciacije v osteoblaste, hondrocite in adipocite in izražanje specifičnih površinskih označevalcev s pomočjo pretočne citometrije.

* Ekspresija sistema: izražanje vstavljenega gena za kemokinske receptorje so preverili s pomočjo qPCR in fluorescence reporterskih proteinov s fluorescenčno mikroskopijo.

* Izboljšanje kemotakse: ''in vitro'' so izvedli test kemotakse pri katerem celice migrirajo skozi filter v smeri raztopine, ki vsebuje visoko koncentracijo kemokinov.

Za testiranje terapevtskega potenciala izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ''in vivo'' so ustvarili mišja modela dveh pogostih vnetnih bolezni: vnetne bolezni črevesja in zakasnjene preobčuljivosti. Stanje živali zdravljenih s spremenjenimi mezenhimskimi matičnimi celicami so primerjali z tistimi zdravljenimi s kontrolnimi MMC in z živalmi, ki niso bile zdravljene.

Model vnetne bolezni črevesja so dobili s pomočjo kemijske indukcije z 2, 4, 6 – trinitrobenzensulfonsko kislino (TNBS). Intrarektalna administracija TNBS povzroči vnetje črevesja z histopatološkimi najdbami podobnimi kot pri Chronovi bolezni.
Spremljali so prisotnost znakov bolezni, preživetje, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v črevesju ter infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah črevesja. ''In vivo'' so pri miših tretiranih s transformiranimi MMC preverjali usmerjenost celic na mesto vnetja s pomočjo IVIS spektra.

Miši z zakasnjeno preobčutljivostno reakcijo so uporabili kot eksperimentalni model za človeški alergijski kontaktni dermatitis. Zakasnjeno preobčutljivost so inducirali z uporabo raztopine fluoro-2, 4- dinitrobenzena (DNFB) tako, da so miši najprej senzitizirali preko kože na hrbtu in nato po enem tednu raztoptini DNFB izpostavili kožo na ušesih. Merili so debelino ušes (oteklino) in infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v ušesih. Prisotnost mezenhimskih matičnih celic so preverili z imunofluorescenco tkivnih rezin ušesa.

== Rezultati ==
# Transformirane mezenhimske matične celice so ohranile sposobnost diferenciacije v različne celične podtipe in izražanje značilnih površinskih označevalcev.

# S sintetiziranimi konstrukti so dosegli znatno povišanje izražanja kemokinskih receptorjev.

# Spremenjene MMC so imele značilno izboljšano sposobnost kemotakse ''in vitro''.

# S pomočjo reporterskih proteinov so uspešno vizualizirali celice tako ''in vitro'' kot ''in vivo''.

# Spremenjene mezenhimske matične celice so značilno izboljšale simptome bolezni, podaljšale preživetje, zmanjšale infiltracijo levkocitov na mesto vnetja, zmanjšale izražanje pro-vnetnih in povišale izražanje proti-vnetnih citokinov in imele boljše sposobnosti migracije na mesto vnetja v primerjavi s kontrolnimi MMC tako pri modelu VBČ kot pri modelu DTH.

# S pomočjo oblikovanega reporterja so uspešno zaznali diferenciacijo celic.
== Zaključek ==
Ekipa je za svoje delo prejela nagrado za najboljši terapevtski projekt in tudi za najboljši sestavljeni biološki del. Uspelo jim je sintetizirati mezenhimske matične celice z izboljšanimi protivnetnimi lastnostmi, ki jih lahko spremljamo ''in vivo'' in zaznamo njihovo diferenciacijo.
V prihodnjih poskusih napovedujejo dokončno izvedbo samomorilnega stikala, ki bi se sprožilo ob zaznavanju diferenciacije celic ter vnos zapisa za interlevkin-10, ki bi dodatno izboljšal protivnetno delovanje celic.

== Viri ==

2016.igem.org. (2016). Team:SYSU-MEDICINE - 2016.igem.org. [online] Dostopno na: http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE [Datum ogleda 21 Nov. 2016].

[[Seminarji SB 12016/17]]

Mezenhimske matične celice nove generacije

2016-11-21T21:52:21Z

Danijela Josic:

MSCavalry - Next generation Mesenchymal stem cells.
[http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE]

== Uvod ==
Mezenhimske matične celice (MMC) so obetavne kandidatke za celično zdravljenje vnetnih bolezni, kot je vnetna bolezen črevesja, zaradi njihovih sposobnosti zaviranja tako pridobljenega kot naravnega imunskega odziva. Klinični poskusi pa so pokazali, da po sistemski administraciji zelo majhen delež celic prispe do mesta vnetja in opravi svojo funkcijo zaradi neučinkovite kemotakse.
Na mednarodnem tekmovanju iz sintezne biologije iGEM v letu 2016 je sodelovala ekipa iz Univerze Sun Yat-Sen iz province Guangdong na Kitajskem z naslovom SYSU-Medicine, ki se je za svoj projekt odločila, da bo ustvarila izboljšane človeške mezenhimske matične celice (MMC) oziroma MMC nove generacije.

V ekipi SYSU-Medicine so želeli s pomočjo sintezne biologije ustvariti mezenhimske matične celice z izboljšano sposobnostjo usmerjenega in specifičnega potovanja na mesta z vnetjem. Za potrebe dokazovanja izboljšanih sposobnosti celic so uporabili označevalne proteine, ki so omogočili sledenje celicam tako ''in vitro'' kot ''in vivo''. Zdravilno delovanje celic so preizkusili tudi ''in vivo'' na mišjih modelih za dve pogosti vnetni bolezni: vnetno bolezen črevesja (VBČ) ter na modelu zakasnjene preobčutljivosti (''ang.'' delayed type hypersensitivity oz. DTH), ki je služil kot model za alergijski kontaktni dermatitis. Kot cilj so si zadali tudi oblikovati samomorilno stikalo, ki bi se sprožilo ob morebitni diferenciaciji mezenhimskih matičnih celic in s tem preprečilo njihov nenadzorovano delovanje v gostiteljskem organizmu.

=== Vnetje ===
Vnetje je proces, ki je osnova številnih bolezni in hkrati nenadomestljiv del procesa obnavljanja poškodovanega tkiva. Pri vnetju pride do kompleksnih interakcij med povzročitelji bolezni ali alergeni in imunskim sistemom, pri čemer imajo ključno vlogo kemokini in citokini. Ti delujejo kot prenašalci sporočil in se vežejo na specifične receptorje na površini tarčnih celic in vzpodbudijo sintezo dodatnih vnetnih signalnih molekul, ki povzročijo širjenje žil in prehod imunskih celic iz krvi v vneta tkiva. Če vnetje uide izpod nadzora, lahko pride do obsežne fibroze tkiva. V zadnjih letih je na področju zdravljenja vnetnih bolezni veliko pozornosti usmerjene v razvoj celične terapije z mezenhinskimi matičnimi celicami.

=== Mezenhimske matične celice ===
Mezenhimske matične celice so odrasle multipotentne matične celice, ki so prisotne v različnih tkivih kot so kostni mozeg, maščobno tkivo, periferna kri, zobna pulpa in številna embrionalna tkiva. MMC imajo sposobnost samoobnove in diferenciacije v več različnih celičnih tipov: osteoblaste (kostne celice), hondrocite (celice hrustanca) in adipocite (maščobne celice). Izločajo avtokrine in parakrine dejavnike, ki promovirajo nastanek žil (angiogenezo), zmanjšujejo vnetje in pospešujejo obnovo tkiva. Zaradi sposobnosti uravnavanja imunskega odziva je ena najbolj obetavnih možnosti uporabe mezenhimskih matičnih celic v zdravljenju vnetnih bolezni. Njihovo uporabnost omejuje nizka učinkovitost dostave celic na tarčna mesta in nespecifična distribucija v telesu pri vnosu z injekcijo v krvni obtok.

== Sintezna biologija ==

=== Izboljšanje kemotakse ===
Kemokini so signalne molekule ki nadzorujejo migracijo in lokalizacijo imunskih celic, kar je ključno za njihovo gibanje pri imunskem odzivu. Kemokinski receptorji so transmembranski proteini, ki po interakciji s specifičnim kemokinskim ligandom omogočijo vstop kalcijevih ionov v celico, kar sproži kemotakso. Mezenhimske matične celice gojene v kulturi kemokinske receptorje, odgovorne za navigacijo celic na mesta vnetja, izražajo v nizkih količinah, poleg tega pa študije kažejo na neučinkovito dostavo na tarčna mesta pri uporabi za zdravljenje.

V teoriji bi večje število receptorjev za vnetne citokine na površini celic omogočilo učinkovitejše zaznavanje citokinov in potovanje na mesto vnetja. S pomočjo metode kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) so ugotovili, da se pri modelu VBČ najbolj izraža kemokin CXCL12, ki se veže z receptorjem CXCR4, pri DTH pa CXCL13, ki mu ustreza kemokinski receptor CXCR5. Zato so v mezenhimske matične celice namenjene uporabi za posamezen model bolezni vstavili zapisa za pripadajoče specifična receptorja CXCR4 in CXCR5 pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja-1 α (EF-1 α), ki omogoča konstitutivno izražanje. Konstruktom so dodali še zapis za fluorecenčna reporterska proteina eGFP (varianta zelenega fluorescenčnega proteina) ali dTomato (rdeča fluorescenca) pod istim promotorjem, kar je omogočilo preverjanje ustrezne ekspresije sistema transformiranih celich s fluorescenčno mikroskopijo. V začetnih fazah poskusov so za transfekcijo celic uporabili lentivirusni ekspresijski vektor zaradi visoke učinkovitosti. V kasnejših fazah zaradi onkogenega tveganja pri uporabi lentivirusov prešli na uporabo elektroporacije.

=== Sledenje celicam ===
Da bi lahko zaznali spremembe v migraciji celic, so potrebovali sistem za vizualizacijo celic in sledenje celicam v živem organizmu, za kar fluorescenčni proteini večinoma niso primerni zaradi težav z avtofluorescenco molekul v celicah, ki povzroči visoko ozadje. V ta namen so v konstrukt dodatno vnesli zapis za encim luciferaza 2-moonoksigenazo iz meduze ''Renilla reniformis'' (RLuc). Luciferaze so oksidativni encimi, ki katalizirajo reakcije pri katerih se sprošča svetloba in povzročijo bioluminiscenco. Ob dodatku substrata luciferina pride do sproščanja svetlobe, ki jo lahko zaznamo z ustreznimi aparaturami. S pomočjo luciferaze lahko po injekciji luciferina opazujemo lokacijo vnešenih MMC ''in vivo'' s pomočjo IVIS spektra (sistem za spremljanje luminiscence ''in vivo'').

Da bi omogočili uporabo spremenjenih mezenhimskih matičnih celic v predkliničnih raziskavah, so kot končni konstrukt oblikovali plazmid, ki je poleg zapisa za kemokinski receptor vseboval zapis za luciferazo, reporterski protein dTomato in težko verigo človeškega feritina (hFTH) pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja 1-α (EF1-α). Feritin lahko zaznamo s pomočjo magnetne resonance in zapis zanj na plazmidu omogoča alternativen način zaznavanja mezenhimskih matičnih celic v živem organizmu.

=== Oblikovanje samomorilnega stikala ===
Učinkovitost vnosa MMC, preživetje celic, njihov fenotip in aktivnost so močno odvisni od mikrookolja na mestu vnosa. Le to ima lastnosti rane med celjenjem in vsebuje imunske celice, novo nastalo žilje in citokine, ki pospešujejo fibrozo oziroma brazgotinjenje tkiva kot je TGF-''β''. Takšno okolje lahko sproži diferenciacijo MMC v krčljive miofibroblaste, ki sintetizirajo stresna vlakna iz ''α''-aktina iz gladkih mišičnih celic (α-SMA), kar vodi v povečanje brazgotinjenja tkiva in izgubo proti-vnetnih lastnosti celic.

V okviru projekta so s pomočjo kvantitativnega PCR dokazali, da MMC ob stimulaciji z TGF-''β'' izražajo ''α''-SMA v visokih koncentracijah. Odločili so se to lastnost izkoristiti za zaznavanje diferenciacije MMC. Oblikovali so biološki del, kjer so gen za fluorescenčni reporterski protein eGFP postavili pod kontrolo SMA promotorja. Dokazali so, da ob stimulaciji celic z TGF-''β'' dobijo fluorescenco reporterskega proteina in s tem lahko zaznajo celice, ki so se diferencirale.
Ta poskus je bil zasnova, ki jo bodo v prihodnje uporabili za oblikovanje samomorilskega stikala, ki bo ob zaznavanju diferenciacije MMC sprožilo apoptozo celice.

== Testiranje izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ==
Delovanje MMC nove generacije so ''in vitro'' preverili na 3 nivojih:

* Ohranjanje fenotipa: preverili so ali so spremenjene MMC ohranile sposobnost diferenciacije v osteoblaste, hondrocite in adipocite in izražanje specifičnih površinskih označevalcev s pomočjo pretočne citometrije.

* Ekspresija sistema: izražanje vstavljenega gena za kemokinske receptorje so preverili s pomočjo qPCR in fluorescence reporterskih proteinov s fluorescenčno mikroskopijo.

* Izboljšanje kemotakse: ''in vitro'' so izvedli test kemotakse pri katerem celice migrirajo skozi filter v smeri raztopine, ki vsebuje visoko koncentracijo kemokinov.

Za testiranje terapevtskega potenciala izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ''in vivo'' so ustvarili mišja modela dveh pogostih vnetnih bolezni: vnetne bolezni črevesja in zakasnjene preobčuljivosti. Stanje živali zdravljenih s spremenjenimi mezenhimskimi matičnimi celicami so primerjali z tistimi zdravljenimi s kontrolnimi MMC in z živalmi, ki niso bile zdravljene.

Model vnetne bolezni črevesja so dobili s pomočjo kemijske indukcije z 2, 4, 6 – trinitrobenzensulfonsko kislino (TNBS). Intrarektalna administracija TNBS povzroči vnetje črevesja z histopatološkimi najdbami podobnimi kot pri Chronovi bolezni.
Spremljali so prisotnost znakov bolezni, preživetje, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v črevesju ter infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah črevesja. ''In vivo'' so pri miših tretiranih s transformiranimi MMC preverjali usmerjenost celic na mesto vnetja s pomočjo IVIS spektra.

Miši z zakasnjeno preobčutljivostno reakcijo so uporabili kot eksperimentalni model za človeški alergijski kontaktni dermatitis. Zakasnjeno preobčutljivost so inducirali z uporabo raztopine fluoro-2, 4- dinitrobenzena (DNFB) tako, da so miši najprej senzitizirali preko kože na hrbtu in nato po enem tednu raztoptini DNFB izpostavili kožo na ušesih. Merili so debelino ušes (oteklino) in infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v ušesih. Prisotnost mezenhimskih matičnih celic so preverili z imunofluorescenco tkivnih rezin ušesa.

== Rezultati ==
# Transformirane mezenhimske matične celice so ohranile sposobnost diferenciacije v različne celične podtipe in izražanje značilnih površinskih označevalcev.

# S sintetiziranimi konstrukti so dosegli znatno povišanje izražanja kemokinskih receptorjev.

# Spremenjene MMC so imele značilno izboljšano sposobnost kemotakse ''in vitro''.

# S pomočjo reporterskih proteinov so uspešno vizualizirali celice tako ''in vitro'' kot ''in vivo''.

# Spremenjene mezenhimske matične celice so značilno izboljšale simptome bolezni, podaljšale preživetje, zmanjšale infiltracijo levkocitov na mesto vnetja, zmanjšale izražanje pro-vnetnih in povišale izražanje proti-vnetnih citokinov in imele boljše sposobnosti migracije na mesto vnetja v primerjavi s kontrolnimi MMC tako pri modelu VBČ kot pri modelu DTH.

# S pomočjo oblikovanega reporterja so uspešno zaznali diferenciacijo celic.
== Zaključek ==
Ekipa je za svoje delo prejela nagrado za najboljši terapevtski projekt in tudi za najboljši sestavljeni biološki del. Uspelo jim je sintetizirati mezenhimske matične celice z izboljšanimi protivnetnimi lastnostmi, ki jih lahko spremljamo ''in vivo'' in zaznamo njihovo diferenciacijo.
V prihodnjih poskusih napovedujejo dokončno izvedbo samomorilnega stikala, ki bi se sprožilo ob zaznavanju diferenciacije celic ter vnos zapisa za interlevkin-10, ki bi dodatno izboljšal protivnetno delovanje celic.

== Viri ==

2016.igem.org. (2016). Team:SYSU-MEDICINE - 2016.igem.org. [online] Dostopno na: http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE [Datum ogleda 21 Nov. 2016].

[[Seminarji SB 12016/17]]

Mezenhimske matične celice nove generacije

2016-11-21T21:50:11Z

Danijela Josic:

MSCavalry - Next generation Mesenchymal stem cells.
[http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE]

== Uvod ==
Mezenhimske matične celice (MMC) so obetavne kandidatke za celično zdravljenje vnetnih bolezni, kot je vnetna bolezen črevesja, zaradi njihovih sposobnosti zaviranja tako pridobljenega kot naravnega imunskega odziva. Klinični poskusi pa so pokazali, da po sistemski administraciji zelo majhen delež celic prispe do mesta vnetja in opravi svojo funkcijo zaradi neučinkovite kemotakse.
Na mednarodnem tekmovanju iz sintezne biologije iGEM v letu 2016 je sodelovala ekipa iz Univerze Sun Yat-Sen iz province Guangdong na Kitajskem z naslovom SYSU-Medicine, ki se je za svoj projekt odločila, da bo ustvarila izboljšane človeške mezenhimske matične celice (MMC) oziroma MMC nove generacije.

V ekipi SYSU-Medicine so želeli s pomočjo sintezne biologije ustvariti mezenhimske matične celice z izboljšano sposobnostjo usmerjenega in specifičnega potovanja na mesta z vnetjem. Za potrebe dokazovanja izboljšanih sposobnosti celic so uporabili označevalne proteine, ki so omogočili sledenje celicam tako ''in vitro'' kot ''in vivo''. Zdravilno delovanje celic so preizkusili tudi ''in vivo'' na mišjih modelih za dve pogosti vnetni bolezni: vnetno bolezen črevesja (VBČ) ter na modelu zakasnjene preobčutljivosti (''ang.'' delayed type hypersensitivity oz. DTH), ki je služil kot model za [[alergijski kontaktni dermatitis]]. Kot cilj so si zadali tudi oblikovati samomorilno stikalo, ki bi se sprožilo ob morebitni diferenciaciji mezenhimskih matičnih celic in s tem preprečilo njihov nenadzorovano delovanje v gostiteljskem organizmu.

=== Vnetje ===
Vnetje je proces, ki je osnova številnih bolezni in hkrati nenadomestljiv del procesa obnavljanja poškodovanega tkiva. Pri vnetju pride do kompleksnih interakcij med povzročitelji bolezni ali alergeni in imunskim sistemom, pri čemer imajo ključno vlogo kemokini in citokini. Ti delujejo kot prenašalci sporočil in se vežejo na specifične receptorje na površini tarčnih celic in vzpodbudijo sintezo dodatnih vnetnih signalnih molekul, ki povzročijo širjenje žil in prehod imunskih celic iz krvi v vneta tkiva. Če vnetje uide izpod nadzora, lahko pride do obsežne fibroze tkiva. V zadnjih letih je na področju zdravljenja vnetnih bolezni veliko pozornosti usmerjene v razvoj celične terapije z mezenhinskimi matičnimi celicami.

=== Mezenhimske matične celice ===
Mezenhimske matične celice so odrasle multipotentne matične celice, ki so prisotne v različnih tkivih kot so kostni mozeg, maščobno tkivo, periferna kri, zobna pulpa in številna embrionalna tkiva. MMC imajo sposobnost samoobnove in diferenciacije v več različnih celičnih tipov: osteoblaste (kostne celice), hondrocite (celice hrustanca) in adipocite (maščobne celice). Izločajo avtokrine in parakrine dejavnike, ki promovirajo nastanek žil (angiogenezo), zmanjšujejo vnetje in pospešujejo obnovo tkiva. Zaradi sposobnosti uravnavanja imunskega odziva je ena najbolj obetavnih možnosti uporabe mezenhimskih matičnih celic v zdravljenju vnetnih bolezni. Njihovo uporabnost omejuje nizka učinkovitost dostave celic na tarčna mesta in nespecifična distribucija v telesu pri vnosu z injekcijo v krvni obtok.

== Sintezna biologija ==

=== Izboljšanje kemotakse ===
Kemokini so signalne molekule ki nadzorujejo migracijo in lokalizacijo imunskih celic, kar je ključno za njihovo gibanje pri imunskem odzivu. Kemokinski receptorji so transmembranski proteini, ki po interakciji s specifičnim kemokinskim ligandom omogočijo vstop kalcijevih ionov v celico, kar sproži kemotakso. Mezenhimske matične celice gojene v kulturi kemokinske receptorje, odgovorne za navigacijo celic na mesta vnetja, izražajo v nizkih količinah, poleg tega pa študije kažejo na neučinkovito dostavo na tarčna mesta pri uporabi za zdravljenje.

V teoriji bi večje število receptorjev za vnetne citokine na površini celic omogočilo učinkovitejše zaznavanje citokinov in potovanje na mesto vnetja. S pomočjo metode kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) so ugotovili, da se pri modelu VBČ najbolj izraža kemokin CXCL12, ki se veže z receptorjem CXCR4, pri DTH pa CXCL13, ki mu ustreza kemokinski receptor CXCR5. Zato so v mezenhimske matične celice namenjene uporabi za posamezen model bolezni vstavili zapisa za pripadajoče specifična receptorja CXCR4 in CXCR5 pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja-1 α (EF-1 α), ki omogoča konstitutivno izražanje. Konstruktom so dodali še zapis za fluorecenčna reporterska proteina eGFP (varianta zelenega fluorescenčnega proteina) ali dTomato (rdeča fluorescenca) pod istim promotorjem, kar je omogočilo preverjanje ustrezne ekspresije sistema transformiranih celich s fluorescenčno mikroskopijo. V začetnih fazah poskusov so za transfekcijo celic uporabili lentivirusni ekspresijski vektor zaradi visoke učinkovitosti. V kasnejših fazah zaradi onkogenega tveganja pri uporabi lentivirusov prešli na uporabo elektroporacije.

=== Sledenje celicam ===
Da bi lahko zaznali spremembe v migraciji celic, so potrebovali sistem za vizualizacijo celic in sledenje celicam v živem organizmu, za kar fluorescenčni proteini večinoma niso primerni zaradi težav z avtofluorescenco molekul v celicah, ki povzroči visoko ozadje. V ta namen so v konstrukt dodatno vnesli zapis za encim luciferaza 2-moonoksigenazo iz meduze ''Renilla reniformis'' (RLuc). Luciferaze so oksidativni encimi, ki katalizirajo reakcije pri katerih se sprošča svetloba in povzročijo bioluminiscenco. Ob dodatku substrata luciferina pride do sproščanja svetlobe, ki jo lahko zaznamo z ustreznimi aparaturami. S pomočjo luciferaze lahko po injekciji luciferina opazujemo lokacijo vnešenih MMC ''in vivo'' s pomočjo IVIS spektra (sistem za spremljanje luminiscence ''in vivo'').

Da bi omogočili uporabo spremenjenih mezenhimskih matičnih celic v predkliničnih raziskavah, so kot končni konstrukt oblikovali plazmid, ki je poleg zapisa za kemokinski receptor vseboval zapis za luciferazo, reporterski protein dTomato in težko verigo človeškega feritina (hFTH) pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja 1-α (EF1-α). Feritin lahko zaznamo s pomočjo magnetne resonance in zapis zanj na plazmidu omogoča alternativen način zaznavanja mezenhimskih matičnih celic v živem organizmu.

=== Oblikovanje samomorilnega stikala ===
Učinkovitost vnosa MMC, preživetje celic, njihov fenotip in aktivnost so močno odvisni od mikrookolja na mestu vnosa. Le to ima lastnosti rane med celjenjem in vsebuje imunske celice, novo nastalo žilje in citokine, ki pospešujejo fibrozo oziroma brazgotinjenje tkiva kot je TGF-''β''. Takšno okolje lahko sproži diferenciacijo MMC v krčljive miofibroblaste, ki sintetizirajo stresna vlakna iz ''α''-aktina iz gladkih mišičnih celic (α-SMA), kar vodi v povečanje brazgotinjenja tkiva in izgubo proti-vnetnih lastnosti celic.

V okviru projekta so s pomočjo kvantitativnega PCR dokazali, da MMC ob stimulaciji z TGF-''β'' izražajo ''α''-SMA v visokih koncentracijah. Odločili so se to lastnost izkoristiti za zaznavanje diferenciacije MMC. Oblikovali so biološki del, kjer so gen za fluorescenčni reporterski protein eGFP postavili pod kontrolo SMA promotorja. Dokazali so, da ob stimulaciji celic z TGF-''β'' dobijo fluorescenco reporterskega proteina in s tem lahko zaznajo celice, ki so se diferencirale.
Ta poskus je bil zasnova, ki jo bodo v prihodnje uporabili za oblikovanje samomorilskega stikala, ki bo ob zaznavanju diferenciacije MMC sprožilo apoptozo celice.

== Testiranje izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ==
Delovanje MMC nove generacije so ''in vitro'' preverili na 3 nivojih:

* Ohranjanje fenotipa: preverili so ali so spremenjene MMC ohranile sposobnost diferenciacije v osteoblaste, hondrocite in adipocite in izražanje specifičnih površinskih označevalcev s pomočjo pretočne citometrije.

* Ekspresija sistema: izražanje vstavljenega gena za kemokinske receptorje so preverili s pomočjo qPCR in fluorescence reporterskih proteinov s fluorescenčno mikroskopijo.

* Izboljšanje kemotakse: ''in vitro'' so izvedli test kemotakse pri katerem celice migrirajo skozi filter v smeri raztopine, ki vsebuje visoko koncentracijo kemokinov.

Za testiranje terapevtskega potenciala izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ''in vivo'' so ustvarili mišja modela dveh pogostih vnetnih bolezni: vnetne bolezni črevesja in zakasnjene preobčuljivosti. Stanje živali zdravljenih s spremenjenimi mezenhimskimi matičnimi celicami so primerjali z tistimi zdravljenimi s kontrolnimi MMC in z živalmi, ki niso bile zdravljene.

Model vnetne bolezni črevesja so dobili s pomočjo kemijske indukcije z 2, 4, 6 – trinitrobenzensulfonsko kislino (TNBS). Intrarektalna administracija TNBS povzroči vnetje črevesja z histopatološkimi najdbami podobnimi kot pri Chronovi bolezni.
Spremljali so prisotnost znakov bolezni, preživetje, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v črevesju ter infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah črevesja. ''In vivo'' so pri miših tretiranih s transformiranimi MMC preverjali usmerjenost celic na mesto vnetja s pomočjo IVIS spektra.

Miši z zakasnjeno preobčutljivostno reakcijo so uporabili kot eksperimentalni model za človeški alergijski kontaktni dermatitis. Zakasnjeno preobčutljivost so inducirali z uporabo raztopine fluoro-2, 4- dinitrobenzena (DNFB) tako, da so miši najprej senzitizirali preko kože na hrbtu in nato po enem tednu raztoptini DNFB izpostavili kožo na ušesih. Merili so debelino ušes (oteklino) in infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v ušesih. Prisotnost mezenhimskih matičnih celic so preverili z imunofluorescenco tkivnih rezin ušesa.

== Rezultati ==
# Transformirane mezenhimske matične celice so ohranile sposobnost diferenciacije v različne celične podtipe in izražanje značilnih površinskih označevalcev.

# S sintetiziranimi konstrukti so dosegli znatno povišanje izražanja kemokinskih receptorjev.

# Spremenjene MMC so imele značilno izboljšano sposobnost kemotakse ''in vitro''.

# S pomočjo reporterskih proteinov so uspešno vizualizirali celice tako ''in vitro'' kot ''in vivo''.

# Spremenjene mezenhimske matične celice so značilno izboljšale simptome bolezni, podaljšale preživetje, zmanjšale infiltracijo levkocitov na mesto vnetja, zmanjšale izražanje pro-vnetnih in povišale izražanje proti-vnetnih citokinov in imele boljše sposobnosti migracije na mesto vnetja v primerjavi s kontrolnimi MMC tako pri modelu VBČ kot pri modelu DTH.

# S pomočjo oblikovanega reporterja so uspešno zaznali diferenciacijo celic.
== Zaključek ==
Ekipa je za svoje delo prejela nagrado za najboljši terapevtski projekt in tudi za najboljši sestavljeni biološki del. Uspelo jim je sintetizirati mezenhimske matične celice z izboljšanimi protivnetnimi lastnostmi, ki jih lahko spremljamo ''in vivo'' in zaznamo njihovo diferenciacijo.
V prihodnjih poskusih napovedujejo dokončno izvedbo samomorilnega stikala, ki bi se sprožilo ob zaznavanju diferenciacije celic ter vnos zapisa za interlevkin-10, ki bi dodatno izboljšal protivnetno delovanje celic.

== Viri ==

2016.igem.org. (2016). Team:SYSU-MEDICINE - 2016.igem.org. [online] Dostopno na: http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE [Datum ogleda 21 Nov. 2016].

[[Seminarji SB 12016/17]]

Mezenhimske matične celice nove generacije

2016-11-21T21:48:23Z

Danijela Josic:

MSCavalry - Next generation Mesenchymal stem cells.
[http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE]

== Uvod ==
Mezenhimske matične celice (MMC) so obetavne kandidatke za celično zdravljenje vnetnih bolezni, kot je vnetna bolezen črevesja, zaradi njihovih sposobnosti zaviranja tako pridobljenega kot naravnega imunskega odziva. Klinični poskusi pa so pokazali, da po sistemski administraciji zelo majhen delež celic prispe do mesta vnetja in opravi svojo funkcijo zaradi neučinkovite kemotakse.
Na mednarodnem tekmovanju iz sintezne biologije iGEM v letu 2016 je sodelovala ekipa iz Univerze Sun Yat-Sen iz province Guangdong na Kitajskem z naslovom SYSU-Medicine, ki se je za svoj projekt odločila, da bo ustvarila izboljšane človeške mezenhimske matične celice (MMC) oziroma MMC nove generacije.

V ekipi SYSU-Medicine so želeli s pomočjo sintezne biologije ustvariti mezenhimske matične celice z izboljšano sposobnostjo usmerjenega in specifičnega potovanja na mesta z vnetjem. Za potrebe dokazovanja izboljšanih sposobnosti celic so uporabili označevalne proteine, ki so omogočili sledenje celicam tako ''in vitro'' kot ''in vivo''. Zdravilno delovanje celic so preizkusili tudi ''in vivo'' na mišjih modelih za dve pogosti vnetni bolezni: vnetno bolezen črevesja (VBČ) ter na modelu zakasnjene preobčutljivosti (''ang.'' delayed type hypersensitivity oz. DTH), ki je služil kot model za alergijski kontaktni dermatitis. Kot cilj so si zadali tudi oblikovati samomorilno stikalo, ki bi se sprožilo ob morebitni diferenciaciji mezenhimskih matičnih celic in s tem preprečilo njihov nenadzorovano delovanje v gostiteljskem organizmu.

=== Vnetje ===
Vnetje je proces, ki je osnova številnih bolezni in hkrati nenadomestljiv del procesa obnavljanja poškodovanega tkiva. Pri vnetju pride do kompleksnih interakcij med povzročitelji bolezni ali alergeni in imunskim sistemom, pri čemer imajo ključno vlogo kemokini in citokini. Ti delujejo kot prenašalci sporočil in se vežejo na specifične receptorje na površini tarčnih celic in vzpodbudijo sintezo dodatnih vnetnih signalnih molekul, ki povzročijo širjenje žil in prehod imunskih celic iz krvi v vneta tkiva. Če vnetje uide izpod nadzora, lahko pride do obsežne fibroze tkiva. V zadnjih letih je na področju zdravljenja vnetnih bolezni veliko pozornosti usmerjene v razvoj celične terapije z mezenhinskimi matičnimi celicami.

=== Mezenhimske matične celice ===
Mezenhimske matične celice so odrasle multipotentne matične celice, ki so prisotne v različnih tkivih kot so kostni mozeg, maščobno tkivo, periferna kri, zobna pulpa in številna embrionalna tkiva. MMC imajo sposobnost samoobnove in diferenciacije v več različnih celičnih tipov: osteoblaste (kostne celice), hondrocite (celice hrustanca) in adipocite (maščobne celice). Izločajo avtokrine in parakrine dejavnike, ki promovirajo nastanek žil (angiogenezo), zmanjšujejo vnetje in pospešujejo obnovo tkiva. Zaradi sposobnosti uravnavanja imunskega odziva je ena najbolj obetavnih možnosti uporabe mezenhimskih matičnih celic v zdravljenju vnetnih bolezni. Njihovo uporabnost omejuje nizka učinkovitost dostave celic na tarčna mesta in nespecifična distribucija v telesu pri vnosu z injekcijo v krvni obtok.

== Sintezna biologija ==

=== Izboljšanje kemotakse ===
Kemokini so signalne molekule ki nadzorujejo migracijo in lokalizacijo imunskih celic, kar je ključno za njihovo gibanje pri imunskem odzivu. Kemokinski receptorji so transmembranski proteini, ki po interakciji s specifičnim kemokinskim ligandom omogočijo vstop kalcijevih ionov v celico, kar sproži kemotakso. Mezenhimske matične celice gojene v kulturi kemokinske receptorje, odgovorne za navigacijo celic na mesta vnetja, izražajo v nizkih količinah, poleg tega pa študije kažejo na neučinkovito dostavo na tarčna mesta pri uporabi za zdravljenje.

V teoriji bi večje število receptorjev za vnetne citokine na površini celic omogočilo učinkovitejše zaznavanje citokinov in potovanje na mesto vnetja. S pomočjo metode kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) so ugotovili, da se pri modelu VBČ najbolj izraža kemokin CXCL12, ki se veže z receptorjem CXCR4, pri DTH pa CXCL13, ki mu ustreza kemokinski receptor CXCR5. Zato so v mezenhimske matične celice namenjene uporabi za posamezen model bolezni vstavili zapisa za pripadajoče specifična receptorja CXCR4 in CXCR5 pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja-1 α (EF-1 α), ki omogoča konstitutivno izražanje. Konstruktom so dodali še zapis za fluorecenčna reporterska proteina eGFP (varianta zelenega fluorescenčnega proteina) ali dTomato (rdeča fluorescenca) pod istim promotorjem, kar je omogočilo preverjanje ustrezne ekspresije sistema transformiranih celich s fluorescenčno mikroskopijo. V začetnih fazah poskusov so za transfekcijo celic uporabili lentivirusni ekspresijski vektor zaradi visoke učinkovitosti. V kasnejših fazah zaradi onkogenega tveganja pri uporabi lentivirusov prešli na uporabo elektroporacije.

=== Sledenje celicam ===
Da bi lahko zaznali spremembe v migraciji celic, so potrebovali sistem za vizualizacijo celic in sledenje celicam v živem organizmu, za kar fluorescenčni proteini večinoma niso primerni zaradi težav z avtofluorescenco molekul v celicah, ki povzroči visoko ozadje. V ta namen so v konstrukt dodatno vnesli zapis za encim luciferaza 2-moonoksigenazo iz meduze ''Renilla reniformis'' (RLuc). Luciferaze so oksidativni encimi, ki katalizirajo reakcije pri katerih se sprošča svetloba in povzročijo bioluminiscenco. Ob dodatku substrata luciferina pride do sproščanja svetlobe, ki jo lahko zaznamo z ustreznimi aparaturami. S pomočjo luciferaze lahko po injekciji luciferina opazujemo lokacijo vnešenih MMC ''in vivo'' s pomočjo IVIS spektra (sistem za spremljanje luminiscence ''in vivo'').

Da bi omogočili uporabo spremenjenih mezenhimskih matičnih celic v predkliničnih raziskavah, so kot končni konstrukt oblikovali plazmid, ki je poleg zapisa za kemokinski receptor vseboval zapis za luciferazo, reporterski protein dTomato in težko verigo človeškega feritina (hFTH) pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja 1-α (EF1-α). Feritin lahko zaznamo s pomočjo magnetne resonance in zapis zanj na plazmidu omogoča alternativen način zaznavanja mezenhimskih matičnih celic v živem organizmu.

=== Oblikovanje samomorilnega stikala ===
Učinkovitost vnosa MMC, preživetje celic, njihov fenotip in aktivnost so močno odvisni od mikrookolja na mestu vnosa. Le to ima lastnosti rane med celjenjem in vsebuje imunske celice, novo nastalo žilje in citokine, ki pospešujejo fibrozo oziroma brazgotinjenje tkiva kot je TGF-''β''. Takšno okolje lahko sproži diferenciacijo MMC v krčljive miofibroblaste, ki sintetizirajo stresna vlakna iz ''α''-aktina iz gladkih mišičnih celic (α-SMA), kar vodi v povečanje brazgotinjenja tkiva in izgubo proti-vnetnih lastnosti celic.

V okviru projekta so s pomočjo kvantitativnega PCR dokazali, da MMC ob stimulaciji z TGF-''β'' izražajo ''α''-SMA v visokih koncentracijah. Odločili so se to lastnost izkoristiti za zaznavanje diferenciacije MMC. Oblikovali so biološki del, kjer so gen za fluorescenčni reporterski protein eGFP postavili pod kontrolo SMA promotorja. Dokazali so, da ob stimulaciji celic z TGF-''β'' dobijo fluorescenco reporterskega proteina in s tem lahko zaznajo celice, ki so se diferencirale.
Ta poskus je bil zasnova, ki jo bodo v prihodnje uporabili za oblikovanje samomorilskega stikala, ki bo ob zaznavanju diferenciacije MMC sprožilo apoptozo celice.

== Testiranje izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ==
Delovanje MMC nove generacije so ''in vitro'' preverili na 3 nivojih:

* Ohranjanje fenotipa: preverili so ali so spremenjene MMC ohranile sposobnost diferenciacije v osteoblaste, hondrocite in adipocite in izražanje specifičnih površinskih označevalcev s pomočjo pretočne citometrije.

* Ekspresija sistema: izražanje vstavljenega gena za kemokinske receptorje so preverili s pomočjo qPCR in fluorescence reporterskih proteinov s fluorescenčno mikroskopijo.

* Izboljšanje kemotakse: ''in vitro'' so izvedli test kemotakse pri katerem celice migrirajo skozi filter v smeri raztopine, ki vsebuje visoko koncentracijo kemokinov.

Za testiranje terapevtskega potenciala izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ''in vivo'' so ustvarili mišja modela dveh pogostih vnetnih bolezni: vnetne bolezni črevesja in zakasnjene preobčuljivosti. Stanje živali zdravljenih s spremenjenimi mezenhimskimi matičnimi celicami so primerjali z tistimi zdravljenimi s kontrolnimi MMC in z živalmi, ki niso bile zdravljene.

Model vnetne bolezni črevesja so dobili s pomočjo kemijske indukcije z 2, 4, 6 – trinitrobenzensulfonsko kislino (TNBS). Intrarektalna administracija TNBS povzroči vnetje črevesja z histopatološkimi najdbami podobnimi kot pri Chronovi bolezni.
Spremljali so prisotnost znakov bolezni, preživetje, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v črevesju ter infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah črevesja. ''In vivo'' so pri miših tretiranih s transformiranimi MMC preverjali usmerjenost celic na mesto vnetja s pomočjo IVIS spektra.

Miši z zakasnjeno preobčutljivostno reakcijo so uporabili kot eksperimentalni model za človeški alergijski kontaktni dermatitis. Zakasnjeno preobčutljivost so inducirali z uporabo raztopine fluoro-2, 4- dinitrobenzena (DNFB) tako, da so miši najprej senzitizirali preko kože na hrbtu in nato po enem tednu raztoptini DNFB izpostavili kožo na ušesih. Merili so debelino ušes (oteklino) in infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah, koncentracijo pro- in protivnetnih citokinov v ušesih. Prisotnost mezenhimskih matičnih celic so preverili z imunofluorescenco tkivnih rezin ušesa.

== Rezultati ==
# Transformirane mezenhimske matične celice so ohranile sposobnost diferenciacije v različne celične podtipe in izražanje značilnih površinskih označevalcev.

# S sintetiziranimi konstrukti so dosegli znatno povišanje izražanja kemokinskih receptorjev.

# Spremenjene MMC so imele značilno izboljšano sposobnost kemotakse ''in vitro''.

# S pomočjo reporterskih proteinov so uspešno vizualizirali celice tako ''in vitro'' kot ''in vivo''.

# Spremenjene mezenhimske matične celice so značilno izboljšale simptome bolezni, podaljšale preživetje, zmanjšale infiltracijo levkocitov na mesto vnetja, zmanjšale izražanje pro-vnetnih in povišale izražanje proti-vnetnih citokinov in imele boljše sposobnosti migracije na mesto vnetja v primerjavi s kontrolnimi MMC tako pri modelu VBČ kot pri modelu DTH.

# S pomočjo oblikovanega reporterja so uspešno zaznali diferenciacijo celic.
== Zaključek ==
Ekipa je za svoje delo prejela nagrado za najboljši terapevtski projekt in tudi za najboljši sestavljeni biološki del. Uspelo jim je sintetizirati mezenhimske matične celice z izboljšanimi protivnetnimi lastnostmi, ki jih lahko spremljamo ''in vivo'' in zaznamo njihovo diferenciacijo.
V prihodnjih poskusih napovedujejo dokončno izvedbo samomorilnega stikala, ki bi se sprožilo ob zaznavanju diferenciacije celic ter vnos zapisa za interlevkin-10, ki bi dodatno izboljšal protivnetno delovanje celic.

== Viri ==

2016.igem.org. (2016). Team:SYSU-MEDICINE - 2016.igem.org. [online] Dostopno na: http://2016.igem.org/Team:SYSU-MEDICINE [Datum ogleda 21 Nov. 2016].

[[Seminarji SB 12016/17]]