Wiki FKKT - User contributions [en]

2017-bionano-seminar

2017-05-08T21:11:03Z

Darja Bozic:

= Bionanotehnologija- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Tema seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent/ka 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent/ka 2'''
|-
| Peter Prezelj||22.03.17||Spreminjanje vsebnosti in karakteristik hranilnih snovi v živilih in pripravljeni hrani z uporabo kovalentnih modifikacij, prečnega povezovanja in encimov||Vita Vidmar||Zala Gluhić
|-
| Boštjan Petrič||22.03.17||Reverzibilno tiskanje s peptidnimi /proteinskimi pigmenti, kovalentno vezanimi na celulozo prek amidne vezi||Luka Kavčič||Judita Avbelj
|-
| Ema Guštin||22.03.17||Nanoprevleka hrustanca za preprečitev osteoartritisa||Mojca Juteršek||Vid Jazbec
|-
| Tjaša Lapanja||29.03.17||Modificirana CHO celična linija prilagojena za ultrazvočno indukcijo izražanja proteinov v industrijskih bioreaktorjih||Bojana Lazović||Vita Vidmar
|-
| Maruša Prolič Kalinšek||29.03.17||Senzor za detekcijo Legionella bakterij na osnovi polidiacetilena||Eva Korošec||Luka Kavčič
|-
| Domen Klofutar||29.03.17||Novi načini prenosa informacij z izrabo kapacitet DNA: Prenos šifrirne in/ali steganografske DNA v ustni votlini preko naravno prisotnih gostiteljev Lactobacillus Casei in Veillonella Parvula||Tajda Buh||Mojca Juteršek
|-
| Simon Bolta||05.04.17||Z vezavo zunajceličnega kalcija do zmanjšanja bolečine v mišicah po treningu||Peter Prezelj||Bojana Lazović
|-
| Tomaž Rozmarič||05.04.17||Korekcija vida s pomočjo nano robotov||Boštjan Petrič||Eva Korošec
|-
| Urša Kapš||05.04.17||Nanodelci za strjevanje krvi||Ema Guštin||Tajda Buh
|-
| Julija Mazej||12.04.17||kapsule za vzpostavitev ravnovesja crevesne mikrobiote||Tjaša Lapanja||Peter Prezelj
|-
| Nataša Žigante||12.04.17||opis teme ali naslov||Maruša Prolič Kalinšek||Boštjan Petrič
|-
| Anja Herceg||12.04.17||Boj proti koroziji s pomočjo superhidrofobnega sol-gela z enkapsuliranimi zaščitnimi bakterijami||Domen Klofutar||Ema Guštin
|-
| Mirjam Kmetič||19.04.17||Nanoprotistrup na osnovi nanodelcev, ki vsebujejo inhibitor varespladib||Simon Bolta||Tjaša Lapanja
|-
| Mojca Kostanjevec||19.04.17||Nanodiski - dostavni sistem za tarčno ciljanje EpCAM na površini rakavih epitelijskih celic||Tomaž Rozmarič||Maruša Prolič Kalinšek
|-
| Jan Rozman||19.04.17||Sinteza nealergenega rekombinantnega kazeina za jedilno / biorazgradljivo embalažo||Urša Kapš||Domen Klofutar
|-
| Barbara Dušak||03.05.17||Izboljšava gojenja mesa n vitro||Julija Mazej||Simon Bolta
|-
| Mateja Cigoj||03.05.17||Probiotik z dodatkom nanodelcev za zdravljenje celiakije. Uporaba probiotičnih bakterij, ki izločajo peptidaze za razgradnjo glutena do neimunogenih fragmentov, in nanodelcev, ki vsebujejo modificirane naravne glutenske peptide specifične za HLA-DQ2 receptorje na limfocitih T, ki zavrejo Th1 posredovan avtoimunski odziv na gluten.||Nataša Žigante||Tomaž Rozmarič
|-
| Toni Nagode||03.05.17||Reverzibilno pritrjevanje predmetov na osnovi nanoslojev iz biotina in avidina||Anja Herceg||Urša Kapš
|-
| Tim Božič||10.05.17||Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)||Mirjam Kmetič||Julija Mazej
|-
| Darja Božič||10.05.17||Kontaktne leče iz proteinsko vtisnjenega polimera za zmanjšanje verjetnosti pojava proteinskih depozitov in okužb||Mojca Kostanjevec||Nataša Žigante
|-
| Petra Tavčar||10.05.17||Odstranjevalec škodljivih E-jev in BPA iz kupljenih pijač na osnovi kovalentno pritrjenih protiteles in aptamerov||Jan Rozman||Anja Herceg
|-
| Marjeta Horvat||17.05.17||FeO nanodelci za učinkovitejše odpravljanje zobnega kariesa||Barbara Dušak||Mirjam Kmetič
|-
| Danijela Jošić||17.05.17||Gensko spremenjen Lactobacillus, ki izloča nanodelce z spermicidnim in protimikrobnim delovanjem za dolgotrajno zaščito pred zanositvijo in spolno prenosljivimi boleznimi.||Mateja Cigoj||Mojca Kostanjevec
|-
| Tina Kuhar||17.05.17||Flaška za vodo z bionanosenzorjem za takojšnjo zaznavo kvalitete oziroma pitnosti nalite vode.||Toni Nagode||Jan Rozman
|-
| Nika Strašek||24.05.17||Uporabniku dostopen diagnostični test za zaznavo okužbe s boreliozo in klopnim meningitisom||Tim Božič||Barbara Dušak
|-
| Eva Vidak||24.05.17||Biosenzor za CO na osnovi transkripcijskega faktorja CooA iz bakterije Rhodospirillum rubrum||Darja Božič||Mateja Cigoj
|-
| Alja Zgonc||24.05.17||Senzor za zaznavanje miRNA v urinu za diagnozo nevrodegenerativnih bolezni||Petra Tavčar||Toni Nagode
|-
| Zala Gluhić||31.05.17||Varnejše uživanje alkohola z uporabo odorant-binding proteina LUSH.||Marjeta Horvat||Tim Božič
|-
| Judita Avbelj||31.05.17||Nanonaprava iz bioloških delov, ki z absorbcijo in razgradnjo delcev iz zraka preprečuje različne alergijske reakcije.||Danijela Jošić||Darja Božič
|-
| Vid Jazbec||31.05.17||Gensko spremenjene čebele odporne na insekticide.||Tina Kuhar||Petra Tavčar
|-
| Vita Vidmar||31.05.17||'Hot start' transglutaminaza za popravljanje razcepljenih lasnih konic||Nika Strašek||Marjeta Horvat
|-
| Luka Kavčič||31.05.17||Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)||Eva Vidak||Danijela Jošić
|-
| Mojca Juteršek||31.05.17||Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)||Alja Zgonc||Tina Kuhar
|-
| Bojana Lazović||07.06.17||Poenostavljen pristop k razvoju novih senzorjev FRET (Förster resonance energy transfer)||Zala Gluhić||Nika Strašek
|-
| Eva Korošec||07.06.17||Tattoo biosenzor za raven alkohola v krvi na osnovi alkohol oksidaze, povezan s pametnim telefonom, računalnikom ali avtomobilskimi ključi.||Judita Avbelj||Eva Vidak
|-
| Tajda Buh||07.06.17||opis teme ali naslov||Vid Jazbec||Alja Zgonc
|}

==Naloga==
'''Vaša naloga je: '''
Študent pripravi projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt.
Predlagana struktura:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Prva stran seminarja naj vsebuje naslov projekta, avtorje, povzetek (od 130 do 160 besed) in grafični povzetek (čez približno pol strani)
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo od 2000 do 2500 besed (vključno z literaturo). Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte '''dva dneva pred datumom predstavitve''', ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Vsak recenzent predlaga izboljšavo projekta.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik dva dneva pred predstavitvijo do polnoči.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem receptu:
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.doc(x) za seminar, npr. 19_nano_Craik_Venter.docx
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.ppt(x) za prezentacijo, npr. 19_nano_Craik_Venter.pptx

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

2017-bionano-seminar

2017-05-08T20:57:45Z

Darja Bozic:

= Bionanotehnologija- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Tema seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent/ka 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent/ka 2'''
|-
| Peter Prezelj||22.03.17||Spreminjanje vsebnosti in karakteristik hranilnih snovi v živilih in pripravljeni hrani z uporabo kovalentnih modifikacij, prečnega povezovanja in encimov||Vita Vidmar||Zala Gluhić
|-
| Boštjan Petrič||22.03.17||Reverzibilno tiskanje s peptidnimi /proteinskimi pigmenti, kovalentno vezanimi na celulozo prek amidne vezi||Luka Kavčič||Judita Avbelj
|-
| Ema Guštin||22.03.17||Nanoprevleka hrustanca za preprečitev osteoartritisa||Mojca Juteršek||Vid Jazbec
|-
| Tjaša Lapanja||29.03.17||Modificirana CHO celična linija prilagojena za ultrazvočno indukcijo izražanja proteinov v industrijskih bioreaktorjih||Bojana Lazović||Vita Vidmar
|-
| Maruša Prolič Kalinšek||29.03.17||Senzor za detekcijo Legionella bakterij na osnovi polidiacetilena||Eva Korošec||Luka Kavčič
|-
| Domen Klofutar||29.03.17||Novi načini prenosa informacij z izrabo kapacitet DNA: Prenos šifrirne in/ali steganografske DNA v ustni votlini preko naravno prisotnih gostiteljev Lactobacillus Casei in Veillonella Parvula||Tajda Buh||Mojca Juteršek
|-
| Simon Bolta||05.04.17||Z vezavo zunajceličnega kalcija do zmanjšanja bolečine v mišicah po treningu||Peter Prezelj||Bojana Lazović
|-
| Tomaž Rozmarič||05.04.17||Korekcija vida s pomočjo nano robotov||Boštjan Petrič||Eva Korošec
|-
| Urša Kapš||05.04.17||Nanodelci za strjevanje krvi||Ema Guštin||Tajda Buh
|-
| Julija Mazej||12.04.17||kapsule za vzpostavitev ravnovesja crevesne mikrobiote||Tjaša Lapanja||Peter Prezelj
|-
| Nataša Žigante||12.04.17||opis teme ali naslov||Maruša Prolič Kalinšek||Boštjan Petrič
|-
| Anja Herceg||12.04.17||Boj proti koroziji s pomočjo superhidrofobnega sol-gela z enkapsuliranimi zaščitnimi bakterijami||Domen Klofutar||Ema Guštin
|-
| Mirjam Kmetič||19.04.17||Nanoprotistrup na osnovi nanodelcev, ki vsebujejo inhibitor varespladib||Simon Bolta||Tjaša Lapanja
|-
| Mojca Kostanjevec||19.04.17||Nanodiski - dostavni sistem za tarčno ciljanje EpCAM na površini rakavih epitelijskih celic||Tomaž Rozmarič||Maruša Prolič Kalinšek
|-
| Jan Rozman||19.04.17||Sinteza nealergenega rekombinantnega kazeina za jedilno / biorazgradljivo embalažo||Urša Kapš||Domen Klofutar
|-
| Barbara Dušak||03.05.17||Izboljšava gojenja mesa n vitro||Julija Mazej||Simon Bolta
|-
| Mateja Cigoj||03.05.17||Probiotik z dodatkom nanodelcev za zdravljenje celiakije. Uporaba probiotičnih bakterij, ki izločajo peptidaze za razgradnjo glutena do neimunogenih fragmentov, in nanodelcev, ki vsebujejo modificirane naravne glutenske peptide specifične za HLA-DQ2 receptorje na limfocitih T, ki zavrejo Th1 posredovan avtoimunski odziv na gluten.||Nataša Žigante||Tomaž Rozmarič
|-
| Toni Nagode||03.05.17||Reverzibilno pritrjevanje predmetov na osnovi nanoslojev iz biotina in avidina||Anja Herceg||Urša Kapš
|-
| Tim Božič||10.05.17||Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)||Mirjam Kmetič||Julija Mazej
|-
| Darja Božič||10.05.17||Kontaktne leče iz proteinsko vtisnjenega polimera za zmanjšanje verjetnosti pojava proteinskih depozitov in verjetnosti okužb||Mojca Kostanjevec||Nataša Žigante
|-
| Petra Tavčar||10.05.17||Odstranjevalec škodljivih E-jev in BPA iz kupljenih pijač na osnovi kovalentno pritrjenih protiteles in aptamerov||Jan Rozman||Anja Herceg
|-
| Marjeta Horvat||17.05.17||FeO nanodelci za učinkovitejše odpravljanje zobnega kariesa||Barbara Dušak||Mirjam Kmetič
|-
| Danijela Jošić||17.05.17||Gensko spremenjen Lactobacillus, ki izloča nanodelce z spermicidnim in protimikrobnim delovanjem za dolgotrajno zaščito pred zanositvijo in spolno prenosljivimi boleznimi.||Mateja Cigoj||Mojca Kostanjevec
|-
| Tina Kuhar||17.05.17||Flaška za vodo z bionanosenzorjem za takojšnjo zaznavo kvalitete oziroma pitnosti nalite vode.||Toni Nagode||Jan Rozman
|-
| Nika Strašek||24.05.17||Uporabniku dostopen diagnostični test za zaznavo okužbe s boreliozo in klopnim meningitisom||Tim Božič||Barbara Dušak
|-
| Eva Vidak||24.05.17||Biosenzor za CO na osnovi transkripcijskega faktorja CooA iz bakterije Rhodospirillum rubrum||Darja Božič||Mateja Cigoj
|-
| Alja Zgonc||24.05.17||Senzor za zaznavanje miRNA v urinu za diagnozo nevrodegenerativnih bolezni||Petra Tavčar||Toni Nagode
|-
| Zala Gluhić||31.05.17||Varnejše uživanje alkohola z uporabo odorant-binding proteina LUSH.||Marjeta Horvat||Tim Božič
|-
| Judita Avbelj||31.05.17||Nanonaprava iz bioloških delov, ki z absorbcijo in razgradnjo delcev iz zraka preprečuje različne alergijske reakcije.||Danijela Jošić||Darja Božič
|-
| Vid Jazbec||31.05.17||Gensko spremenjene čebele odporne na insekticide.||Tina Kuhar||Petra Tavčar
|-
| Vita Vidmar||31.05.17||'Hot start' transglutaminaza za popravljanje razcepljenih lasnih konic||Nika Strašek||Marjeta Horvat
|-
| Luka Kavčič||31.05.17||Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)||Eva Vidak||Danijela Jošić
|-
| Mojca Juteršek||31.05.17||Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)||Alja Zgonc||Tina Kuhar
|-
| Bojana Lazović||07.06.17||Poenostavljen pristop k razvoju novih senzorjev FRET (Förster resonance energy transfer)||Zala Gluhić||Nika Strašek
|-
| Eva Korošec||07.06.17||Tattoo biosenzor za raven alkohola v krvi na osnovi alkohol oksidaze, povezan s pametnim telefonom, računalnikom ali avtomobilskimi ključi.||Judita Avbelj||Eva Vidak
|-
| Tajda Buh||07.06.17||opis teme ali naslov||Vid Jazbec||Alja Zgonc
|}

==Naloga==
'''Vaša naloga je: '''
Študent pripravi projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt.
Predlagana struktura:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Prva stran seminarja naj vsebuje naslov projekta, avtorje, povzetek (od 130 do 160 besed) in grafični povzetek (čez približno pol strani)
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo od 2000 do 2500 besed (vključno z literaturo). Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte '''dva dneva pred datumom predstavitve''', ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Vsak recenzent predlaga izboljšavo projekta.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik dva dneva pred predstavitvijo do polnoči.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem receptu:
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.doc(x) za seminar, npr. 19_nano_Craik_Venter.docx
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.ppt(x) za prezentacijo, npr. 19_nano_Craik_Venter.pptx

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

Izdelava sintetičnega genoma s pristopom sestavljanja celotnega genoma: Bakteriofag φX174 iz sintetičnih oligonukleotidov

2016-11-21T22:13:57Z

Darja Bozic:

[http://www.pnas.org/content/100/26/15440.full.pdf| Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phi X174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides]

== Povzetek ==
Raziskovalci inštituta J. Craig Venter Institute (JCVI) so razvili postopek, s katerim so v 14-ih dneh iz zbirke kemično pripravljenih oligonukleotidov sestavili infektivni genom bakteriofaga φX174 (5,386 bp). S tem so pokazali, da je mogoče na relativno enostaven in kratkotrajen način umetno poustvariti obsežno naravno genomsko strukturo dovolj pravilno, da je ta sposobna razviti, ohranjati in reproducirati svoj življenjski potencial. V ospredju članka Smith et al. 2003 <ref name="Smith et al. 2003"> Smith HO, Hutchison CA, Pfannkoch C, Venter JC. Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phiX174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100: 15440-15445. [http://www.pnas.org/content/100/26/15440.long| doi:10.1073/pnas.2237126100] </ref> je torej metoda za učinkovito izgrajevanje dolgih segmentov DNA (5-6kbp) iz kratkih sintetičnih oligonukleotidov.

== Ozadje ==
Hutchinson et al. so leta 1999 izdali članek<ref name="Hutchison et al. 1999"> Hutchison CA, Peterson SN, Gill SR, Cline RT, White O, Fraser CM, Smith HO, et al. Global transposon mutagenesis and a minimal Mycoplasma genome. Science 1999, 286: 2165-2169. [http://science.sciencemag.org/content/286/5447/2165| doi:10.1126/science.286.5447.2165]</ref>, ki opisuje idejo o konstruiranju organizma z minimalnim genomom, ki bi odprl vrata v nove razsežnosti raziskovanja skrivnosti življenja. Šlo bi za umetni organizem z najmanjšim možnim naborom genov, ki še omogoča življenje v permisivnih laboratorijskih pogojih. Na podlagi poizkusov z naključno mutagenezo, s katerimi so inaktivirali posamezne gene, so iz nabora genov bakterij iz rodu Mycoplasmae (te imajo najmanjši genom med znanimi prostoživečimi organizmi) izločili “pogrešljive” gene in na ta način oblikovali nabor “nepogrešljivih” genov. Predpostavili so, da bi ta nabor lahko predstavljal zadostno formulo za razvoj življenja in bi torej predstavljal genom “minimalnega organizma”. Taka osnovna celica, v kateri bi vsak gen imel popolnoma opredeljeno molekularno in biološko vlogo, bi znanstvenikom predstavljala podlago za dodajanje posameznih genov, preučevanje njihovih vlog in poljubno modeliranje organizmov z želenimi lastnostmi. Ideja je obetala z velikim raziskovalnim in proizvodnim potencialom, ki pa je hkrati (znova) odprl mnoga etična vprašanja in zadržke o potrebnosti, smiselnosti, smotrnosti in nevarnosti ustvarjanja novih živih bitij po golih človekovih željah in vzgibih. Nekateri pogledi na to problematiko iz raziskovalskega stališča so predstavljeni v razpravi etičnega odbora Univerze Stanford<ref name="Cho et al. 1999"> Cho MK, Magnus D, Caplan AL, McGee D, Group tEoG. Ethical Considerations in Synthesizing a Minimal Genome. Science 1999, 286:2087, 2089-2090. [http://science.sciencemag.org/content/286/5447/2087| doi:10.1126/science.286.5447.2087]</ref>, ki je bila v reviji Science leta 1999 objavljena skupaj s člankom, nekaj razmislekov bioetikov pa v razpravi Douglas in Savulescu<ref name="Douglas in Savoulescu 2010">Douglas T, Savulescu J. Synthetic biology and the ethics of knowledge. J Med Ethics 2010, 36: 687-693. [http://www.bep.ox.ac.uk/__data/assets/pdf_file/0020/17516/Douglas.Savulescu_Synthetic.Biology_JME.2010.pdf| doi:10.1136/jme.2010.038232] </ref>, iz leta 2010. 
Pri sestavi sintetičnega virusnega genoma, ki so jo predstavili Smith et al. 2003<ref name="Smith et al. 2003"/>, gre pravzaprav za razvoj tehničnega orodja za realizacijo te ideje. Zamisel o umetni sintezi organizmov je namreč precej prehitevala realno znanje in praktično izvedljivost izgradnje natančno opredeljenega zaporedja genomskih razsežnosti. Kemični postopki priprave nukleinskih kislin zaenkrat še vedno omogočajo sintezo nukleotidnih verig dolžine do okrog 200 baz. Z naraščajočo dolžino se veča tudi verjetnost napak in nepopolne sinteze. Zato je za oblikovanje genov in daljših genskih sestavov nujno razumevanje in obvladovanje sestavljanja iz krajših fragmentov.
 
Izbor genoma bakteriofaga φX174 za prototip za razvoj pristopa izvira iz njegove dobre raziskanosti. Kromosom φX174 je bil prvi genom, ki ga je znanstvenikom uspelo očistiti do homogenosti. Zanj je bilo prvič dokazana infektivnost v laboratoriju sintetizirane virusne DNA (pomnožene na podlagi intaktne naravne matrice)<ref name="Goulian et al. 1967"> Goulian M, Kornberg A, Sinsheimer RL. Enzymatic synthesis of DNA, XXIV. Synthesis of infectious phage phi-X174 DNA. Proc Natl Acad Sci USA 1967, 58: 2321-2328. [[http://www.pnas.org/content/58/6/2321.full.pdf]]</ref>, bakteriofag φX174 pa je bil tudi prvi organizem z v celoti znanim genomskim zaporedjem (Sanger et al., 1987)<ref name="Sanger et al.1978"> Sanger F, Coulson AR, Friedmann T, Air GM, Barrell BG, Brown NL, Fiddes JC, et al. The nucleotide sequence of bacteriophage phiX174. J Mol Biol 1978, 125: 225-246</ref>.

== Postopek izgradnje sintetičnega genoma ==

{|
<table border=1 cellpadding=2 cellspacing=0 align=center>

|-
! Stopnja
! Predviden čas

|-
| Načrtovanje oligonukleotidov 
(~42 baz; pokrivajo celotno sekvenco želenega končnega zaporedja, z dodanim eksogenim restrikcijskim zaporedjem na začetku in koncu)
| 8h

|-
| Sinteza oligonukleotidov 

(DNA sintetizator)
| 4 dni

|-
| Čiščenje oligonukleotidov 

(zmes oligonukleotidov z iste verige, gelska elektoforeza pod denaturacijskimi pogoji)
| 2 dni

|-
| 5’-fosforiliranje oligonukleotidov
| 4 h

|-
| Ligacija oligonukleotidov v daljše segmente 
(inkubacija zmesi vseh oligonukleotidov s termostabilno Taq ligazo pri 55°C)
| 18h

|-
| Izgrajevanje do končnih kromosomov z metodo PCA 
(sestavljanje segmentov do celotnega končnega zaporedja)
| 12-24h

|-
| Pomnoževanje dobljenih kromosomov s klasičnim PCR
| 3h

|-
| Čiščenje produktov 
(gelska elektroforeza)
| 8h

|-
| Cirkularizacija DNA v infektivne krožne molekule 
(restrikcija očiščene linearne dvoverižne DNA z encimom, ki prepozna dodani sekvenci na začetku in koncu kromosoma in ligacija v razredčenih razmerah)
| 4h

|-
| Elektroporacija v E. Coli, gojenje
| 24h

|-
| Ekstrakcija plakov, sekvenciranje
| Skupaj: ~2 tedna

|} 
Sekvenco genoma φX174 so Smith et al. razdelili v 42-bazne oligonukleotide (130 za vsako od komplementarnih verig) in jih načrtovali tako, da so se oligonukleotidi iz komplementarnih verig med seboj delno prekrivali (vsak oligonukleotid je bil komplementaren polovici dveh zaporednih olikonukleotidov komplementarne verige). Pri tem so lineariziran genom na vsaki strani podaljšali za prepoznavno zaporedje za restrikcijo s PstI, ki sicer ni prisotno nikjer drugje v genomu φX174, in ki je omogočilo kasnejše povezovanje koncev kompletne DNA v infektivne krožne molekule. 

Njihov postopek izgradnje genoma iz pripravljenih sintetičnih oligonukleotidov je vseboval naslednje ključne korake: 
: i) Čiščenje sintetičnih oligonukleotidov z gelsko elektroforezo 
: ii) Ligacija očiščenih oligonukleotidov pod zaostrenimi pogoji (55°C). Oligonukleotidi so pred ligacijo 5’ fosforilirani. 
: iii) Izgrajevanje DNA fragmentov v končni genom z metodo verižnega sestavljanja s polimerazo (PCA). 
=== Oligonukleotidi ===
Pri pripravi sintetičnega genoma ima čistost izhodnih oligonukleotidov zelo pomembno vlogo. Po kemični sintezi oligonukleotidov so med produkti prisotni oligonukleotidi z napakami - najpogosteje delecijami (npr. nedokončane sekvence, ali sekvence z izpuščenimi posameznimi nukleotidi). Uporaba takih oligonukleotidov bi vnesla visoko verjetnost mutacij v končni DNA. Ker je v neprečiščeni zmesi pravzaprav le okrog polovica oligonukleotidov popolnih, bi bila verjetnost sestave pravilnega celotnega genoma iz naključnih 130 oligonukleotiodov enaka (1/2)130 oz. ≈10–39. S stopnjo čiščenja z gelsko elektroforezo so to verjetnost znatno povišali. Uporaba oligonukleotidov s povsem enako dolžino jim je omogočila, da so vse oligonukleotide “očistili” hkrati, v zmesi. Pri tem so združili oligonukleotide z ene verige dvoverižne DNA ločeno od druge, in s tem poskušali preprečiti morebitno hibridizacijo med komplementarnimi deli.

=== Ligacija ===
Očiščene oligonukleotide so fosforilirali na 5’-koncu in izvedli ligacijo s termostabilno Taq ligazo. Taq ligaza deluje pri 55°C kar poveča specifičnost ligacije, saj povišana temperatura zmanjša verjetnost prileganja delno komplementarnih zaporedij in oligonukleotidov z vsebujočimi mutacijami. S to stopnjo so pridobili daljše dvoverižne DNA segmente. Teoretično bi lahko na tak način sestavili genom do končne dolžine, vendar v praksi prihaja do določenih omejitev, zaradi katerih to ni mogoče. Zato so po ligaciji dobljene segmente DNA (≈700bp) do končne dolžine povezali s postopkom verižnega izgrajevanja s polimerazo (angl. polymerase cycling assembly, PCA).

=== Verižno izgrajevanje s polimerazo (PCA)===
Reakcija PCA je analogna verižni reakciji s polimerazo PCR. Princip je enak, le da v reakcijski zmesi za PCA ni presežka oligonukleotidnih začetnikov. V zmesi imamo fragmente DNA – gradnike želene končne sekvence v obliki dvoverižnih, delno prekrivajočih se oligonukleotidov. V vsakem ciklu je DNA podvržena denaturaciji in ponovni renaturaciji, med katero se komplementarni deli verig prilegajo eden drugemu. Če oligonukleotid na 3’-koncu ne sega do konca 5’-konca komplementarnega, ki se mu prilega, ga polimeraza ustrezno podaljša. Verige v zmesi torej ena na drugo delujejo kot oligonukleotidni začetniki. Verige se v vsakem ciklu podaljšajo, dokler ne dosežejo končne dolžine oziroma, dokler podaljševanje ni več možno. Molekule iz reakcijske zmesi se lahko podaljšujejo le v smeri 5’→3’ in le enkrat do konca genoma po številnih ciklih. Popolno dolžino genoma torej lahko dosežejo le verige, ki vsebujejo 5’-končni del genomskega zaporedja. Pri reakciji ne pride do pomnoževanja – število verig od začetka ostaja isto. Da med reakcijo ne bi prišlo do razgrajevanja, je za reakcijo potrebna polimeraza brez 5’-eksonukleazne aktivnosti, z uporabo polimeraze s 3’→5’ eksonukleazno aktivnostjo, pa se poveča natančnost podaljševanja.

== Končna obdelava sintetičnih kromosomov in evalvacija viabilnih virionov ==
Tako so torej Smith et al. pridobili verige s kompletno dolžino, ki so jih od ostalih produktov ločili z gelsko elektroforezo. Kompletne verige DNA so nato pomnožili s klasičnim PCR, z oligonukleotidnima začetnikoma s 5’-konca vsake od komplementarnih verig. Produkte so cepili z restriktazo PstI in jih ponovno očistili z gelsko elektroforezo. Ligacijo ekstrahiranih linearnih DNA s popolno dolžino so izvedli v razredčeni raztopini, s čemer so se izognili povezovanja koncev med molekulami povečali verjetnost ligacije znotraj posamezne verige DNA. 
S tako dobljenimi krožnimi kromosomi so inficirali celice E.Coli. Infektivnost sintetičnih bakteriofagnih DNA je bila nižja od naravne. Razviti plaki so izkazovali heterogeno morfologijo. Pri enem plaku z morfologijo, tipično za divji tip φX174, so s sekvenciranjem potrdili identičnost sekvence uporabljenemu referenčnemu genomu φX174. Vse mutacije, ki so jih zasledili pri drugih analiziranih viabilnih virionih, so bile substitucije posameznih baz.

== Zaključki ==
Z opisanim postopkom je mogoče učinkovito sestavljati genetske kasete (dolžine 5-6kbp), vendar te brez dodatne selekcije vsebujejo približno eno napako na 500bp. Te napake se lahko popravi z usmerjeno mutagenezo. Raziskovalci so v času nastanka članka predvideli, da bi genom "minimalne" bakterijske celice lahko sestavili iz približno 60 takih kaset. 
Skupina je kasneje pristop nadgradila do te mere, da so s sintetičnim genomom uspeli rekonstruirati tudi bakterijsko celico <ref name="Gibson et al.2010"> Gibson DG, Glass JI, Lartigue C, Noskov VN, Chuang RY, Algire MA, Benders GA, et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science 2010, 329: 52-56.[http://science.sciencemag.org/content/329/5987/52| doi:10.1126/science.1190719]</ref>, pri kateri njen so lastni genetski material nadomestili s sintetični kromosomom. Letos pa so predstavili tudi prvo obliko “minimalnega bakterijskega genoma” <ref name="Hutchison et al. 2016"> Hutchison CA, Chuang RY, Noskov VN, Assad-Garcia N, Deerinck TJ, Ellisman MH, Gill J, et al. Design and synthesis of a minimal bacterial genome. Science 2016, 351: aad6253.[http://science.sciencemag.org/content/351/6280/aad6253| doi:10.1126/science.aad6253]</ref>. Ta obsega 531kbp (473 genov), kar je precej več od predpostavk iz leta 1999, snovalci pa ga predstavljajo kot delovno verzijo, za katero verjamejo, da bo v prihodnosti še skrčena in izboljšana. Omenjeni dosežki kažejo na to, da bo kmalu v laboratoriju mogoče sintetizirati praktično poljuben genom – tako po dolžini kot po vsebini. Kako racionalna je narava in kako malo pravzaprav zares vemo o skrivnosti genoma pa med drugim ilustrira dejstvo, da je trenutni “minimalen” celični genom od najmanjšega naravnega bakterijskega genoma (M. genitalum 525 genov, 580kbp) okrnjen le za slabih 10% (25 genov), ob tem pa kar 149 genov iz tega minimalnega nabora (skoraj tretjina) zaenkrat še nima povsem pojasnene biološke vloge <ref name="Hutchison et al. 2016"/>.
== Viri ==
<references />

Izdelava sintetičnega genoma s pristopom sestavljanja celotnega genoma: Bakteriofag φX174 iz sintetičnih oligonukleotidov

2016-11-21T22:11:28Z

Darja Bozic:

[http://www.pnas.org/content/100/26/15440.full.pdf| Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phi X174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides]

== Povzetek ==
Raziskovalci inštituta J. Craig Venter Institute (JCVI) so razvili postopek, s katerim so v 14-ih dneh iz zbirke kemično pripravljenih oligonukleotidov sestavili infektivni genom bakteriofaga φX174 (5,386 bp). S tem so pokazali, da je mogoče na relativno enostaven in kratkotrajen način umetno poustvariti obsežno naravno genomsko strukturo dovolj pravilno, da je ta sposobna razviti, ohranjati in reproducirati svoj življenjski potencial. V ospredju članka Smith et al. 2003 <ref name="Smith et al. 2003"> Smith HO, Hutchison CA, Pfannkoch C, Venter JC. Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phiX174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100: 15440-15445. [http://www.pnas.org/content/100/26/15440.long| doi:10.1073/pnas.2237126100] </ref> je torej metoda za učinkovito izgrajevanje dolgih segmentov DNA (5-6kbp) iz kratkih sintetičnih oligonukleotidov.

== Ozadje ==
Hutchinson et al. so leta 1999 izdali članek<ref name="Hutchison et al. 1999"> Hutchison CA, Peterson SN, Gill SR, Cline RT, White O, Fraser CM, Smith HO, et al. Global transposon mutagenesis and a minimal Mycoplasma genome. Science 1999, 286: 2165-2169. [http://science.sciencemag.org/content/286/5447/2165| doi:10.1126/science.286.5447.2165]</ref>, ki opisuje idejo o konstruiranju organizma z minimalnim genomom, ki bi odprl vrata v nove razsežnosti raziskovanja skrivnosti življenja. Šlo bi za umetni organizem z najmanjšim možnim naborom genov, ki še omogoča življenje v permisivnih laboratorijskih pogojih. Na podlagi poizkusov z naključno mutagenezo, s katerimi so inaktivirali posamezne gene, so iz nabora genov bakterij iz rodu Mycoplasmae (te imajo najmanjši genom med znanimi prostoživečimi organizmi) izločili “pogrešljive” gene in na ta način oblikovali nabor “nepogrešljivih” genov. Predpostavili so, da bi ta nabor lahko predstavljal zadostno formulo za razvoj življenja in bi torej predstavljal genom “minimalnega organizma”. Taka osnovna celica, v kateri bi vsak gen imel popolnoma opredeljeno molekularno in biološko vlogo, bi znanstvenikom predstavljala podlago za dodajanje posameznih genov, preučevanje njihovih vlog in poljubno modeliranje organizmov z želenimi lastnostmi. Ideja je obetala z velikim raziskovalnim in proizvodnim potencialom, ki pa je hkrati (znova) odprl mnoga etična vprašanja in zadržke o potrebnosti, smiselnosti, smotrnosti in nevarnosti ustvarjanja novih živih bitij po golih človekovih željah in vzgibih. Nekateri pogledi na to problematiko iz raziskovalskega stališča so predstavljeni v razpravi etičnega odbora Univerze Stanford<ref name="Cho et al. 1999"> Cho MK, Magnus D, Caplan AL, McGee D, Group tEoG. Ethical Considerations in Synthesizing a Minimal Genome. Science 1999, 286:2087, 2089-2090. [http://science.sciencemag.org/content/286/5447/2087| doi:10.1126/science.286.5447.2087]</ref>, ki je bila v reviji Science leta 1999 objavljena skupaj s člankom, nekaj razmislekov bioetikov pa v razpravi Douglas in Savulescu<ref name="Douglas in Savoulescu 2010">Douglas T, Savulescu J. Synthetic biology and the ethics of knowledge. J Med Ethics 2010, 36: 687-693. [http://www.bep.ox.ac.uk/__data/assets/pdf_file/0020/17516/Douglas.Savulescu_Synthetic.Biology_JME.2010.pdf| doi:10.1136/jme.2010.038232] </ref>, iz leta 2010. 
Pri sestavi sintetičnega virusnega genoma, ki so jo predstavili Smith et al. 2003<ref name="Smith et al. 2003"/>, gre pravzaprav za razvoj tehničnega orodja za realizacijo te ideje. Zamisel o umetni sintezi organizmov je namreč precej prehitevala realno znanje in praktično izvedljivost izgradnje natančno opredeljenega zaporedja genomskih razsežnosti. Kemični postopki priprave nukleinskih kislin zaenkrat še vedno omogočajo sintezo nukleotidnih verig dolžine do okrog 200 baz. Z naraščajočo dolžino se veča tudi verjetnost napak in nepopolne sinteze. Zato je za oblikovanje genov in daljših genskih sestavov nujno razumevanje in obvladovanje sestavljanja iz krajših fragmentov.
 
Izbor genoma bakteriofaga φX174 za prototip za razvoj pristopa izvira iz njegove dobre raziskanosti. Kromosom φX174 je bil prvi genom, ki ga je znanstvenikom uspelo očistiti do homogenosti. Zanj je bilo prvič dokazana infektivnost v laboratoriju sintetizirane virusne DNA (pomnožene na podlagi intaktne naravne matrice)<ref name="Goulian et al. 1967"> Goulian M, Kornberg A, Sinsheimer RL. Enzymatic synthesis of DNA, XXIV. Synthesis of infectious phage phi-X174 DNA. Proc Natl Acad Sci USA 1967, 58: 2321-2328. [[http://www.pnas.org/content/58/6/2321.full.pdf]]</ref>, bakteriofag φX174 pa je bil tudi prvi organizem z v celoti znanim genomskim zaporedjem (Sanger et al., 1987)<ref name="Sanger et al.1978"> Sanger F, Coulson AR, Friedmann T, Air GM, Barrell BG, Brown NL, Fiddes JC, et al. The nucleotide sequence of bacteriophage phiX174. J Mol Biol 1978, 125: 225-246</ref>.

== Postopek izgradnje sintetičnega genoma ==

{|
<table border=1 cellpadding=2 cellspacing=0 align=center>

|-
! Stopnja
! Predviden čas

|-
| Načrtovanje oligonukleotidov 
(~42 baz; pokrivajo celotno sekvenco želenega končnega zaporedja, z dodanim eksogenim restrikcijskim zaporedjem na začetku in koncu)
| 8h

|-
| Sinteza oligonukleotidov 

(DNA sintetizator)
| 4 dni

|-
| Čiščenje oligonukleotidov 

(zmes oligonukleotidov z iste verige, gelska elektoforeza pod denaturacijskimi pogoji)
| 2 dni

|-
| 5’-fosforiliranje oligonukleotidov
| 4 h

|-
| Ligacija oligonukleotidov v daljše segmente 
(inkubacija zmesi vseh oligonukleotidov s termostabilno Taq ligazo pri 55°C)
| 18h

|-
| Izgrajevanje do končnih kromosomov z metodo PCA 
(sestavljanje segmentov do celotnega končnega zaporedja)
| 12-24h

|-
| Pomnoževanje dobljenih kromosomov s klasičnim PCR
| 3h

|-
| Čiščenje produktov 
(gelska elektroforeza)
| 8h

|-
| Cirkularizacija DNA v infektivne krožne molekule 
(restrikcija očiščene linearne dvoverižne DNA z encimom, ki prepozna dodani sekvenci na začetku in koncu kromosoma in ligacija v razredčenih razmerah)
| 4h

|-
| Elektroporacija v E. Coli, gojenje
| 24h

|-
| Ekstrakcija plakov, sekvenciranje
| Skupaj: ~2 tedna

|} 
Sekvenco genoma φX174 so Smith et al. razdelili v 42 bazne oligonukleotide (130 za vsako od komplementarnih verig) in jih načrtovali tako, da so se oligonukleotidi iz komplementarnih verig med seboj delno prekrivali (vsak oligonukleotid je bil komplementaren polovici dveh zaporednih olikonukleotidov komplementarne verige). Pri tem so lineariziran genom na vsaki strani podaljšali za prepoznavno zaporedje za restrikcijo s PstI, ki sicer ni prisotno nikjer drugje v genomu φX174, in ki je omogočilo kasnejše povezovanje koncev kompletne DNA v infektivne krožne molekule. 

Njihov postopek izgradnje genoma iz pripravljenih sintetičnih oligonukleotidov je vseboval naslednje ključne korake: 
: i) Čiščenje sintetičnih oligonukleotidov z gelsko elektroforezo 
: ii) Ligacija očiščenih oligonukleotidov pod zaostrenimi pogoji (55°C). Oligonukleotidi so pred ligacijo 5’ fosforilirani. 
: iii) Izgrajevanje DNA fragmentov v končni genom z metodo verižnega sestavljanja s polimerazo (PCA). 
=== Oligonukleotidi ===
Pri pripravi sintetičnega genoma ima čistost izhodnih oligonukleotidov zelo pomembno vlogo. Po kemični sintezi oligonukleotidov so med produkti prisotni oligonukleotidi z napakami - najpogosteje delecijami (npr. nedokončane sekvence, ali sekvence z izpuščenimi posameznimi nukleotidi). Uporaba takih oligonukleotidov bi vnesla visoko verjetnost mutacij v končni DNA. Ker je v neprečiščeni zmesi pravzaprav le okrog polovica oligonukleotidov popolnih, bi bila verjetnost sestave pravilnega celotnega genoma iz naključnih 130 oligonukleotiodov enaka (1/2)130 oz. ≈10–39. S stopnjo čiščenja z gelsko elektroforezo so to verjetnost znatno povišali. Uporaba oligonukleotidov s povsem enako dolžino jim je omogočila, da so vse oligonukleotide “očistili” hkrati, v zmesi. Pri tem so združili oligonukleotide z ene verige dvoverižne DNA ločeno od druge, in s tem poskušali preprečiti morebitno hibridizacijo med komplementarnimi deli.

=== Ligacija ===
Očiščene oligonukleotide so fosforilirali na 5’-koncu in izvedli ligacijo s termostabilno Taq ligazo. Taq ligaza deluje pri 55°C kar poveča specifičnost ligacije, saj povišana temperatura zmanjša verjetnost prileganja delno komplementarnih zaporedij in oligonukleotidov z vsebujočimi mutacijami. S to stopnjo so pridobili daljše dvoverižne DNA segmente. Teoretično bi lahko na tak način sestavili genom do končne dolžine, vendar v praksi prihaja do določenih omejitev, zaradi katerih to ni mogoče. Zato so po ligaciji dobljene segmente DNA (≈700bp) do končne dolžine povezali s postopkom verižnega izgrajevanja s polimerazo (angl. polymerase cycling assembly, PCA).

=== Verižno izgrajevanje s polimerazo (PCA)===
Reakcija PCA je analogna verižni reakciji s polimerazo PCR. Princip je enak, le da v reakcijski zmesi za PCA ni presežka oligonukleotidnih začetnikov. V zmesi imamo fragmente DNA – gradnike želene končne sekvence v obliki dvoverižnih, delno prekrivajočih se oligonukleotidov. V vsakem ciklu je DNA podvržena denaturaciji in ponovni renaturaciji, med katero se komplementarni deli verig prilegajo eden drugemu. Če oligonukleotid na 3’-koncu ne sega do konca 5’-konca komplementarnega, ki se mu prilega, ga polimeraza ustrezno podaljša. Verige v zmesi torej ena na drugo delujejo kot oligonukleotidni začetniki. Verige se v vsakem ciklu podaljšajo, dokler ne dosežejo končne dolžine oziroma, dokler podaljševanje ni več možno. Molekule iz reakcijske zmesi se lahko podaljšujejo le v smeri 5’→3’ in le enkrat do konca genoma po številnih ciklih. Popolno dolžino genoma torej lahko dosežejo le verige, ki vsebujejo 5’-končni del genomskega zaporedja. Pri reakciji ne pride do pomnoževanja – število verig od začetka ostaja isto. Da med reakcijo ne bi prišlo do razgrajevanja, je za reakcijo potrebna polimeraza brez 5’-eksonukleazne aktivnosti, z uporabo polimeraze s 3’→5’ eksonukleazno aktivnostjo, pa se poveča natančnost podaljševanja.

== Končna obdelava sintetičnih kromosomov in evalvacija viabilnih virionov ==
Tako so torej Smith et al. pridobili verige s kompletno dolžino, ki so jih od ostalih produktov ločili z gelsko elektroforezo. Kompletne verige DNA so nato pomnožili s klasičnim PCR, z oligonukleotidnima začetnikoma s 5’-konca vsake od komplementarnih verig. Produkte so cepili z restriktazo PstI in jih ponovno očistili z gelsko elektroforezo. Ligacijo ekstrahiranih linearnih DNA s popolno dolžino so izvedli v razredčeni raztopini, s čemer so se izognili povezovanja koncev med molekulami povečali verjetnost ligacije znotraj posamezne verige DNA. 
S tako dobljenimi krožnimi kromosomi so inficirali celice E.Coli. Infektivnost sintetičnih bakteriofagnih DNA je bila nižja od naravne. Razviti plaki so izkazovali heterogeno morfologijo. Pri enem plaku z morfologijo, tipično za divji tip φX174, so s sekvenciranjem potrdili identičnost sekvence uporabljenemu referenčnemu genomu φX174. Vse mutacije, ki so jih zasledili pri drugih analiziranih viabilnih virionih, so bile substitucije posameznih baz.

== Zaključki ==
Z opisanim postopkom je mogoče učinkovito sestavljati genetske kasete (dolžine 5-6kbp), vendar te brez dodatne selekcije vsebujejo približno eno napako na 500bp. Te napake se lahko popravi z usmerjeno mutagenezo. Raziskovalci so v času nastanka članka predvideli, da bi genom "minimalne" bakterijske celice lahko sestavili iz približno 60 takih kaset. 
Skupina je kasneje pristop nadgradila do te mere, da so s sintetičnim genomom uspeli rekonstruirati tudi bakterijsko celico <ref name="Gibson et al.2010"> Gibson DG, Glass JI, Lartigue C, Noskov VN, Chuang RY, Algire MA, Benders GA, et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science 2010, 329: 52-56.[http://science.sciencemag.org/content/329/5987/52| doi:10.1126/science.1190719]</ref>, pri kateri njen so lastni genetski material nadomestili s sintetični kromosomom. Letos pa so predstavili tudi prvo obliko “minimalnega bakterijskega genoma” <ref name="Hutchison et al. 2016"> Hutchison CA, Chuang RY, Noskov VN, Assad-Garcia N, Deerinck TJ, Ellisman MH, Gill J, et al. Design and synthesis of a minimal bacterial genome. Science 2016, 351: aad6253.[http://science.sciencemag.org/content/351/6280/aad6253| doi:10.1126/science.aad6253]</ref>. Ta obsega 531kbp (473 genov), kar je precej več od predpostavk iz leta 1999, snovalci pa ga predstavljajo kot delovno verzijo, za katero verjamejo, da bo v prihodnosti še skrčena in izboljšana. Omenjeni dosežki kažejo na to, da bo kmalu v laboratoriju mogoče sintetizirati praktično poljuben genom – tako po dolžini kot po vsebini. Kako racionalna je narava in kako malo pravzaprav zares vemo o skrivnosti genoma pa med drugim ilustrira dejstvo, da je trenutni “minimalen” celični genom od najmanjšega naravnega bakterijskega genoma (M. genitalum 525 genov, 580kbp) okrnjen le za slabih 10% (25 genov), ob tem pa kar 149 genov iz tega minimalnega nabora (skoraj tretjina) zaenkrat še nima povsem pojasnene biološke vloge <ref name="Hutchison et al. 2016"/>.
== Viri ==
<references />

Izdelava sintetičnega genoma s pristopom sestavljanja celotnega genoma: Bakteriofag φX174 iz sintetičnih oligonukleotidov

2016-11-21T22:09:58Z

Darja Bozic:

[http://www.pnas.org/content/100/26/15440.full.pdf| Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phi X174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides]

== Povzetek ==
Raziskovalci inštituta J. Craig Venter Institute (JCVI) so razvili postopek, s katerim so v 14-ih dneh iz zbirke kemično pripravljenih oligonukleotidov sestavili infektivni genom bakteriofaga φX174 (5,386 bp). S tem so pokazali, da je mogoče na relativno enostaven in kratkotrajen način umetno poustvariti obsežno naravno genomsko strukturo dovolj pravilno, da je ta sposobna razviti, ohranjati in reproducirati svoj življenjski potencial. V ospredju članka Smith et al. 2003 <ref name="Smith et al. 2003"> Smith HO, Hutchison CA, Pfannkoch C, Venter JC. Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phiX174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100: 15440-15445. [http://www.pnas.org/content/100/26/15440.long| doi:10.1073/pnas.2237126100] </ref> je torej metoda za učinkovito izgrajevanje dolgih segmentov DNA (5-6kbp) iz kratkih sintetičnih oligonukleotidov.

== Ozadje ==
Hutchinson et al. so leta 1999 izdali članek<ref name="Hutchison et al. 1999"> Hutchison CA, Peterson SN, Gill SR, Cline RT, White O, Fraser CM, Smith HO, et al. Global transposon mutagenesis and a minimal Mycoplasma genome. Science 1999, 286: 2165-2169. [http://science.sciencemag.org/content/286/5447/2165| doi:10.1126/science.286.5447.2165]</ref>, ki opisuje idejo o konstruiranju organizma z minimalnim genomom, ki bi odprl vrata v nove razsežnosti raziskovanja skrivnosti življenja. Šlo bi za umetni organizem z najmanjšim možnim naborom genov, ki še omogoča življenje v permisivnih laboratorijskih pogojih. Na podlagi poizkusov z naključno mutagenezo, s katerimi so inaktivirali posamezne gene, so iz nabora genov bakterij iz rodu Mycoplasmae (te imajo najmanjši genom med znanimi prostoživečimi organizmi) izločili “pogrešljive” gene in na ta način oblikovali nabor “nepogrešljivih” genov. Predpostavili so, da bi ta nabor lahko predstavljal zadostno formulo za razvoj življenja in bi torej predstavljal genom “minimalnega organizma”. Taka osnovna celica, v kateri bi vsak gen imel popolnoma opredeljeno molekularno in biološko vlogo, bi znanstvenikom predstavljala podlago za dodajanje posameznih genov, preučevanje njihovih vlog in poljubno modeliranje organizmov z želenimi lastnostmi. Ideja je obetala z velikim raziskovalnim in proizvodnim potencialom, ki pa je hkrati(znova)odprl mnoga etična vprašanja in zadržke o potrebnosti, smiselnosti, smotrnosti in nevarnosti ustvarjanja novih živih bitij po golih človekovih željah in vzgibih. Nekateri pogledi na to problematiko iz raziskovalskega stališča so predstavljeni v razpravi etičnega odbora Univerze Stanford<ref name="Cho et al. 1999"> Cho MK, Magnus D, Caplan AL, McGee D, Group tEoG. Ethical Considerations in Synthesizing a Minimal Genome. Science 1999, 286:2087, 2089-2090. [http://science.sciencemag.org/content/286/5447/2087| doi:10.1126/science.286.5447.2087]</ref>, ki je bila v reviji Science leta 1999 objavljena skupaj s člankom, nekaj razmislekov bioetikov pa v razpravi Douglas in Savulescu<ref name="Douglas in Savoulescu 2010">Douglas T, Savulescu J. Synthetic biology and the ethics of knowledge. J Med Ethics 2010, 36: 687-693. [http://www.bep.ox.ac.uk/__data/assets/pdf_file/0020/17516/Douglas.Savulescu_Synthetic.Biology_JME.2010.pdf| doi:10.1136/jme.2010.038232] </ref>, iz leta 2010. 
Pri sestavi sintetičnega virusnega genoma, ki so jo predstavili Smith et al. 2003<ref name="Smith et al. 2003"/>, gre pravzaprav za razvoj tehničnega orodja za realizacijo te ideje. Zamisel o umetni sintezi organizmov je namreč precej prehitevala realno znanje in praktično izvedljivost izgradnje natančno opredeljenega zaporedja genomskih razsežnosti. Kemični postopki priprave nukleinskih kislin zaenkrat še vedno omogočajo sintezo nukleotidnih verig dolžine do okrog 200 baz. Z naraščajočo dolžino se veča tudi verjetnost napak in nepopolne sinteze. Zato je za oblikovanje genov in daljših genskih sestavov nujno razumevanje in obvladovanje sestavljanja iz krajših fragmentov.
 
Izbor genoma bakteriofaga φX174 za prototip za razvoj pristopa izvira iz njegove dobre raziskanosti. Kromosom φX174 je bil prvi genom, ki ga je znanstvenikom uspelo očistiti do homogenosti. Zanj je bilo prvič dokazana infektivnost v laboratoriju sintetizirane virusne DNA (pomnožene na podlagi intaktne naravne matrice)<ref name="Goulian et al. 1967"> Goulian M, Kornberg A, Sinsheimer RL. Enzymatic synthesis of DNA, XXIV. Synthesis of infectious phage phi-X174 DNA. Proc Natl Acad Sci USA 1967, 58: 2321-2328. [[http://www.pnas.org/content/58/6/2321.full.pdf]]</ref>, bakteriofag φX174 pa je bil tudi prvi organizem z v celoti znanim genomskim zaporedjem (Sanger et al., 1987)<ref name="Sanger et al.1978"> Sanger F, Coulson AR, Friedmann T, Air GM, Barrell BG, Brown NL, Fiddes JC, et al. The nucleotide sequence of bacteriophage phiX174. J Mol Biol 1978, 125: 225-246</ref>.

== Postopek izgradnje sintetičnega genoma ==

{|
<table border=1 cellpadding=2 cellspacing=0 align=center>

|-
! Stopnja
! Predviden čas

|-
| Načrtovanje oligonukleotidov 
(~42 baz; pokrivajo celotno sekvenco želenega končnega zaporedja, z dodanim eksogenim restrikcijskim zaporedjem na začetku in koncu)
| 8h

|-
| Sinteza oligonukleotidov 

(DNA sintetizator)
| 4 dni

|-
| Čiščenje oligonukleotidov 

(zmes oligonukleotidov z iste verige, gelska elektoforeza pod denaturacijskimi pogoji)
| 2 dni

|-
| 5’-fosforiliranje oligonukleotidov
| 4 h

|-
| Ligacija oligonukleotidov v daljše segmente 
(inkubacija zmesi vseh oligonukleotidov s termostabilno Taq ligazo pri 55°C)
| 18h

|-
| Izgrajevanje do končnih kromosomov z metodo PCA 
(sestavljanje segmentov do celotnega končnega zaporedja)
| 12-24h

|-
| Pomnoževanje dobljenih kromosomov s klasičnim PCR
| 3h

|-
| Čiščenje produktov 
(gelska elektroforeza)
| 8h

|-
| Cirkularizacija DNA v infektivne krožne molekule 
(restrikcija očiščene linearne dvoverižne DNA z encimom, ki prepozna dodani sekvenci na začetku in koncu kromosoma in ligacija v razredčenih razmerah)
| 4h

|-
| Elektroporacija v E. Coli, gojenje
| 24h

|-
| Ekstrakcija plakov, sekvenciranje
| Skupaj: ~2 tedna

|} 
Sekvenco genoma φX174 so Smith et al. razdelili v 42 bazne oligonukleotide (130 za vsako od komplementarnih verig) in jih načrtovali tako, da so se oligonukleotidi iz komplementarnih verig med seboj delno prekrivali (vsak oligonukleotid je bil komplementaren polovici dveh zaporednih olikonukleotidov komplementarne verige). Pri tem so lineariziran genom na vsaki strani podaljšali za prepoznavno zaporedje za restrikcijo s PstI, ki sicer ni prisotno nikjer drugje v genomu φX174, in ki je omogočilo kasnejše povezovanje koncev kompletne DNA v infektivne krožne molekule. 

Njihov postopek izgradnje genoma iz pripravljenih sintetičnih oligonukleotidov je vseboval naslednje ključne korake: 
: i) Čiščenje sintetičnih oligonukleotidov z gelsko elektroforezo 
: ii) Ligacija očiščenih oligonukleotidov pod zaostrenimi pogoji (55°C). Oligonukleotidi so pred ligacijo 5’ fosforilirani. 
: iii) Izgrajevanje DNA fragmentov v končni genom z metodo verižnega sestavljanja s polimerazo (PCA). 
=== Oligonukleotidi ===
Pri pripravi sintetičnega genoma ima čistost izhodnih oligonukleotidov zelo pomembno vlogo. Po kemični sintezi oligonukleotidov so med produkti prisotni oligonukleotidi z napakami - najpogosteje delecijami (npr. nedokončane sekvence, ali sekvence z izpuščenimi posameznimi nukleotidi). Uporaba takih oligonukleotidov bi vnesla visoko verjetnost mutacij v končni DNA. Ker je v neprečiščeni zmesi pravzaprav le okrog polovica oligonukleotidov popolnih, bi bila verjetnost sestave pravilnega celotnega genoma iz naključnih 130 oligonukleotiodov enaka (1/2)130 oz. ≈10–39. S stopnjo čiščenja z gelsko elektroforezo so to verjetnost znatno povišali. Uporaba oligonukleotidov s povsem enako dolžino jim je omogočila, da so vse oligonukleotide “očistili” hkrati, v zmesi. Pri tem so združili oligonukleotide z ene verige dvoverižne DNA ločeno od druge, in s tem poskušali preprečiti morebitno hibridizacijo med komplementarnimi deli.

=== Ligacija ===
Očiščene oligonukleotide so fosforilirali na 5’-koncu in izvedli ligacijo s termostabilno Taq ligazo. Taq ligaza deluje pri 55°C kar poveča specifičnost ligacije, saj povišana temperatura zmanjša verjetnost prileganja delno komplementarnih zaporedij in oligonukleotidov z vsebujočimi mutacijami. S to stopnjo so pridobili daljše dvoverižne DNA segmente. Teoretično bi lahko na tak način sestavili genom do končne dolžine, vendar v praksi prihaja do določenih omejitev, zaradi katerih to ni mogoče. Zato so po ligaciji dobljene segmente DNA (≈700bp) do končne dolžine povezali s postopkom verižnega izgrajevanja s polimerazo (angl. polymerase cycling assembly, PCA).

=== Verižno izgrajevanje s polimerazo (PCA)===
Reakcija PCA je analogna verižni reakciji s polimerazo PCR. Princip je enak, le da v reakcijski zmesi za PCA ni presežka oligonukleotidnih začetnikov. V zmesi imamo fragmente DNA – gradnike želene končne sekvence v obliki dvoverižnih, delno prekrivajočih se oligonukleotidov. V vsakem ciklu je DNA podvržena denaturaciji in ponovni renaturaciji, med katero se komplementarni deli verig prilegajo eden drugemu. Če oligonukleotid na 3’-koncu ne sega do konca 5’-konca komplementarnega, ki se mu prilega, ga polimeraza ustrezno podaljša. Verige v zmesi torej ena na drugo delujejo kot oligonukleotidni začetniki. Verige se v vsakem ciklu podaljšajo, dokler ne dosežejo končne dolžine oziroma, dokler podaljševanje ni več možno. Molekule iz reakcijske zmesi se lahko podaljšujejo le v smeri 5’→3’ in le enkrat do konca genoma po številnih ciklih. Popolno dolžino genoma torej lahko dosežejo le verige, ki vsebujejo 5’-končni del genomskega zaporedja. Pri reakciji ne pride do pomnoževanja – število verig od začetka ostaja isto. Da med reakcijo ne bi prišlo do razgrajevanja, je za reakcijo potrebna polimeraza brez 5’-eksonukleazne aktivnosti, z uporabo polimeraze s 3’→5’ eksonukleazno aktivnostjo, pa se poveča natančnost podaljševanja.

== Končna obdelava sintetičnih kromosomov in evalvacija viabilnih virionov ==
Tako so torej Smith et al. pridobili verige s kompletno dolžino, ki so jih od ostalih produktov ločili z gelsko elektroforezo. Kompletne verige DNA so nato pomnožili s klasičnim PCR, z oligonukleotidnima začetnikoma s 5’-konca vsake od komplementarnih verig. Produkte so cepili z restriktazo PstI in jih ponovno očistili z gelsko elektroforezo. Ligacijo ekstrahiranih linearnih DNA s popolno dolžino so izvedli v razredčeni raztopini, s čemer so se izognili povezovanja koncev med molekulami povečali verjetnost ligacije znotraj posamezne verige DNA. 
S tako dobljenimi krožnimi kromosomi so inficirali celice E.Coli. Infektivnost sintetičnih bakteriofagnih DNA je bila nižja od naravne. Razviti plaki so izkazovali heterogeno morfologijo. Pri enem plaku z morfologijo, tipično za divji tip φX174, so s sekvenciranjem potrdili identičnost sekvence uporabljenemu referenčnemu genomu φX174. Vse mutacije, ki so jih zasledili pri drugih analiziranih viabilnih virionih, so bile substitucije posameznih baz.

== Zaključki ==
Z opisanim postopkom je mogoče učinkovito sestavljati genetske kasete (dolžine 5-6kbp), vendar te brez dodatne selekcije vsebujejo približno eno napako na 500bp. Te napake se lahko popravi z usmerjeno mutagenezo. Raziskovalci so v času nastanka članka predvideli, da bi genom "minimalne" bakterijske celice lahko sestavili iz približno 60 takih kaset. 
Skupina je kasneje pristop nadgradila do te mere, da so s sintetičnim genomom uspeli rekonstruirati tudi bakterijsko celico <ref name="Gibson et al.2010"> Gibson DG, Glass JI, Lartigue C, Noskov VN, Chuang RY, Algire MA, Benders GA, et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science 2010, 329: 52-56.[http://science.sciencemag.org/content/329/5987/52| doi:10.1126/science.1190719]</ref>, pri kateri njen so lastni genetski material nadomestili s sintetični kromosomom. Letos pa so predstavili tudi prvo obliko “minimalnega bakterijskega genoma” <ref name="Hutchison et al. 2016"> Hutchison CA, Chuang RY, Noskov VN, Assad-Garcia N, Deerinck TJ, Ellisman MH, Gill J, et al. Design and synthesis of a minimal bacterial genome. Science 2016, 351: aad6253.[http://science.sciencemag.org/content/351/6280/aad6253| doi:10.1126/science.aad6253]</ref>. Ta obsega 531kbp (473 genov), kar je precej več od predpostavk iz leta 1999, snovalci pa ga predstavljajo kot delovno verzijo, za katero verjamejo, da bo v prihodnosti še skrčena in izboljšana. Omenjeni dosežki kažejo na to, da bo kmalu v laboratoriju mogoče sintetizirati praktično poljuben genom – tako po dolžini kot po vsebini. Kako racionalna je narava in kako malo pravzaprav zares vemo o skrivnosti genoma pa med drugim ilustrira dejstvo, da je trenutni “minimalen” celični genom od najmanjšega naravnega bakterijskega genoma (M. genitalum 525 genov, 580kbp) okrnjen le za slabih 10% (25 genov), ob tem pa kar 149 genov iz tega minimalnega nabora (skoraj tretjina) zaenkrat še nima povsem pojasnene biološke vloge <ref name="Hutchison et al. 2016"/>.
== Viri ==
<references />

Izdelava sintetičnega genoma s pristopom sestavljanja celotnega genoma: Bakteriofag φX174 iz sintetičnih oligonukleotidov

2016-11-21T21:54:00Z

Darja Bozic:

[http://www.pnas.org/content/100/26/15440.full.pdf| Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phi X174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides]

== Povzetek ==
Raziskovalci inštituta J. Craig Venter Institute (JCVI) so razvili postopek, s katerim so v 14-ih dneh iz zbirke kemično pripravljenih oligonukleotidov sestavili infektivni genom bakteriofaga φX174 (5,386 bp). S tem so pokazali, da je mogoče na relativno enostaven in kratkotrajen način umetno poustvariti obsežno naravno genomsko strukturo dovolj pravilno, da je ta sposobna razviti, ohranjati in reproducirati svoj življenjski potencial. V ospredju članka Smith et al. 2003 <ref name="Smith et al. 2003"> Smith HO, Hutchison CA, Pfannkoch C, Venter JC. Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phiX174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100: 15440-15445. [http://www.pnas.org/content/100/26/15440.long| doi:10.1073/pnas.2237126100] </ref> je torej metoda za učinkovito izgrajevanje dolgih segmentov DNA (5-6kbp) iz kratkih sintetičnih oligonukleotidov.

== Ozadje ==
Hutchinson et al. so leta 1999 izdali članek<ref name="Hutchison et al. 1999"> Hutchison CA, Peterson SN, Gill SR, Cline RT, White O, Fraser CM, Smith HO, et al. Global transposon mutagenesis and a minimal Mycoplasma genome. Science 1999, 286: 2165-2169. [http://science.sciencemag.org/content/286/5447/2165| doi:10.1126/science.286.5447.2165]</ref>, ki opisuje idejo o konstruiranju organizma z minimalnim genomom, ki bi odprl vrata v nove razsežnosti raziskovanja skrivnosti življenja. Šlo bi za umetni organizem z najmanjšim možnim naborom genov, ki še omogoča življenje v permisivnih laboratorijskih pogojih. Na podlagi poizkusov z naključno mutagenezo, s katerimi so posamezne gene, so iz nabora genov bakterij iz rodu Mycoplasmae (te imajo najmanjši genom med znanimi prostoživečimi organizmi) izločili “pogrešljive” gene in na ta način oblikovali nabor “nepogrešljivih” genov. Predpostavili so, da bi ta nabor lahko predstavljal zadostno formulo za razvoj življenja in bi torej predstavljal genom “minimalnega organizma”. Taka osnovna celica, v kateri bi vsak gen imel popolnoma opredeljeno molekularno in biološko vlogo, bi znanstvenikom predstavljala podlago za dodajanje posameznih genov, preučevanje njihovih vlog in poljubno modeliranje organizmov z želenimi lastnostmi. Ideja je obetala z velikim raziskovalnim in proizvodnim potencialom, ki pa je hkrati(znova)odprl mnoga etična vprašanja in zadržke o potrebnosti, smiselnosti, smotrnosti in nevarnosti ustvarjanja novih živih bitij po golih človekovih željah in vzgibih. Nekateri pogledi na to problematiko iz raziskovalskega stališča so predstavljeni v razpravi etičnega odbora Univerze Stanford<ref name="Cho et al. 1999"> Cho MK, Magnus D, Caplan AL, McGee D, Group tEoG. Ethical Considerations in Synthesizing a Minimal Genome. Science 1999, 286:2087, 2089-2090. [http://science.sciencemag.org/content/286/5447/2087| doi:10.1126/science.286.5447.2087]</ref>, ki je bila v reviji Science leta 1999 objavljena skupaj s člankom, nekaj razmislekov bioetikov pa v razpravi Douglas in Savulescu<ref name="Douglas in Savoulescu 2010">Douglas T, Savulescu J. Synthetic biology and the ethics of knowledge. J Med Ethics 2010, 36: 687-693. [http://www.bep.ox.ac.uk/__data/assets/pdf_file/0020/17516/Douglas.Savulescu_Synthetic.Biology_JME.2010.pdf| doi:10.1136/jme.2010.038232] </ref>, iz leta 2010. 
Pri sestavi sintetičnega virusnega genoma, ki so jo predstavili Smith et al. 2003<ref name="Smith et al. 2003"/>, gre pravzaprav za razvoj tehničnega orodja za realizacijo te ideje. Zamisel o umetni sintezi organizmov je namreč precej prehitevala realno znanje in praktično izvedljivost izgradnje natančno opredeljenega zaporedja genomskih razsežnosti. Kemični postopki priprave nukleinskih kislin zaenkrat še vedno omogočajo sintezo nukleotidnih verig dolžine do okrog 200 baz. Z naraščajočo dolžino se veča tudi verjetnost napak in nepopolne sinteze. Zato je za oblikovanje genov in daljših genskih sestavov nujno razumevanje in obvladovanje sestavljanja iz krajših fragmentov.
 
Izbor genoma bakteriofaga φX174 za prototip za razvoj pristopa izvira iz njegove dobre raziskanosti. Kromosom φX174 je bil prvi genom, ki ga je znanstvenikom uspelo očistiti do homogenosti. Zanj je bilo prvič dokazana infektivnost v laboratoriju sintetizirane virusne DNA (pomnožene na podlagi intaktne naravne matrice)<ref name="Goulian et al. 1967"> Goulian M, Kornberg A, Sinsheimer RL. Enzymatic synthesis of DNA, XXIV. Synthesis of infectious phage phi-X174 DNA. Proc Natl Acad Sci USA 1967, 58: 2321-2328. [[http://www.pnas.org/content/58/6/2321.full.pdf]]</ref>, bakteriofag φX174 pa je bil tudi prvi organizem z v celoti znanim genomskim zaporedjem (Sanger et al., 1987)<ref name="Sanger et al.1978"> Sanger F, Coulson AR, Friedmann T, Air GM, Barrell BG, Brown NL, Fiddes JC, et al. The nucleotide sequence of bacteriophage phiX174. J Mol Biol 1978, 125: 225-246</ref>.

== Postopek izgradnje sintetičnega genoma ==

{|
<table border=1 cellpadding=2 cellspacing=0 align=center>

|-
! Stopnja
! Predviden čas

|-
| Načrtovanje oligonukleotidov 
(~42 baz; pokrivajo celotno sekvenco želenega končnega zaporedja, z dodanim eksogenim restrikcijskim zaporedjem na začetku in koncu)
| 8h

|-
| Sinteza oligonukleotidov 

(DNA sintetizator)
| 4 dni

|-
| Čiščenje oligonukleotidov 

(zmes oligonukleotidov z iste verige, gelska elektoforeza pod denaturacijskimi pogoji)
| 2 dni

|-
| 5’-fosforiliranje oligonukleotidov
| 4 h

|-
| Ligacija oligonukleotidov v daljše segmente 
(inkubacija zmesi vseh oligonukleotidov s termostabilno Taq ligazo pri 55°C)
| 18h

|-
| Izgrajevanje do končnih kromosomov z metodo PCA 
(sestavljanje segmentov do celotnega končnega zaporedja)
| 12-24h

|-
| Pomnoževanje dobljenih kromosomov s klasičnim PCR
| 3h

|-
| Čiščenje produktov 
(gelska elektroforeza)
| 8h

|-
| Cirkularizacija DNA v infektivne krožne molekule 
(restrikcija očiščene linearne dvoverižne DNA z encimom, ki prepozna dodani sekvenci na začetku in koncu kromosoma in ligacija v razredčenih razmerah)
| 4h

|-
| Elektroporacija v E. Coli, gojenje
| 24h

|-
| Ekstrakcija plakov, sekvenciranje
| Skupaj: ~2 tedna

|} 
Sekvenco genoma φX174 so Smith et al. razdelili v 42 bazne oligonukleotide (130 za vsako od komplementarnih verig) in jih načrtovali tako, da so se oligonukleotidi iz komplementarnih verig med seboj delno prekrivali (vsak oligonukleotid je bil komplementaren polovici dveh zaporednih olikonukleotidov komplementarne verige). Pri tem so lineariziran genom na vsaki strani podaljšali za prepoznavno zaporedje za restrikcijo s PstI, ki sicer ni prisotno nikjer drugje v genomu φX174, in ki je omogočilo kasnejše povezovanje koncev kompletne DNA v infektivne krožne molekule. 

Njihov postopek izgradnje genoma iz pripravljenih sintetičnih oligonukleotidov je vseboval naslednje ključne korake: 
: i) Čiščenje sintetičnih oligonukleotidov z gelsko elektroforezo 
: ii) Ligacija očiščenih oligonukleotidov pod zaostrenimi pogoji (55°C). Oligonukleotidi so pred ligacijo 5’ fosforilirani. 
: iii) Izgrajevanje DNA fragmentov v končni genom z metodo verižnega sestavljanja s polimerazo (PCA). 
=== Oligonukleotidi ===
Pri pripravi sintetičnega genoma ima čistost izhodnih oligonukleotidov zelo pomembno vlogo. Po kemični sintezi oligonukleotidov so med produkti prisotni oligonukleotidi z napakami - najpogosteje delecijami (npr. nedokončane sekvence, ali sekvence z izpuščenimi posameznimi nukleotidi). Uporaba takih oligonukleotidov bi vnesla visoko verjetnost mutacij v končni DNA. Ker je v neprečiščeni zmesi pravzaprav le okrog polovica oligonukleotidov popolnih, bi bila verjetnost sestave pravilnega celotnega genoma iz naključnih 130 oligonukleotiodov enaka (1/2)130 oz. ≈10–39. S stopnjo čiščenja z gelsko elektroforezo so to verjetnost znatno povišali. Uporaba oligonukleotidov s povsem enako dolžino jim je omogočila, da so vse oligonukleotide “očistili” hkrati, v zmesi. Pri tem so združili oligonukleotide z ene verige dvoverižne DNA ločeno od druge, in s tem poskušali preprečiti morebitno hibridizacijo med komplementarnimi deli.

=== Ligacija ===
Očiščene oligonukleotide so fosforilirali na 5’-koncu in izvedli ligacijo s termostabilno Taq ligazo. Taq ligaza deluje pri 55°C kar poveča specifičnost ligacije, saj povišana temperatura zmanjša verjetnost prileganja delno komplementarnih zaporedij in oligonukleotidov z vsebujočimi mutacijami. S to stopnjo so pridobili daljše dvoverižne DNA segmente. Teoretično bi lahko na tak način sestavili genom do končne dolžine, vendar v praksi prihaja do določenih omejitev, zaradi katerih to ni mogoče. Zato so po ligaciji dobljene segmente DNA (≈700bp) do končne dolžine povezali s postopkom verižnega izgrajevanja s polimerazo (angl. polymerase cycling assembly, PCA).

=== Verižno izgrajevanje s polimerazo (PCA)===
Reakcija PCA je analogna verižni reakciji s polimerazo PCR. Princip je enak, le da v reakcijski zmesi za PCA ni presežka oligonukleotidnih začetnikov. V zmesi imamo fragmente DNA – gradnike želene končne sekvence v obliki dvoverižnih, delno prekrivajočih se oligonukleotidov. V vsakem ciklu je DNA podvržena denaturaciji in ponovni renaturaciji, med katero se komplementarni deli verig prilegajo eden drugemu. Če oligonukleotid na 3’-koncu ne sega do konca 5’-konca komplementarnega, ki se mu prilega, ga polimeraza ustrezno podaljša. Verige v zmesi torej ena na drugo delujejo kot oligonukleotidni začetniki. Verige se v vsakem ciklu podaljšajo, dokler ne dosežejo končne dolžine oziroma, dokler podaljševanje ni več možno. Molekule iz reakcijske zmesi se lahko podaljšujejo le v smeri 5’→3’ in le enkrat do konca genoma po številnih ciklih. Popolno dolžino genoma torej lahko dosežejo le verige, ki vsebujejo 5’-končni del genomskega zaporedja. Pri reakciji ne pride do pomnoževanja – število verig od začetka ostaja isto. Da med reakcijo ne bi prišlo do razgrajevanja, je za reakcijo potrebna polimeraza brez 5’-eksonukleazne aktivnosti, z uporabo polimeraze s 3’→5’ eksonukleazno aktivnostjo, pa se poveča natančnost podaljševanja.

== Končna obdelava sintetičnih kromosomov in evalvacija viabilnih virionov ==
Tako so torej Smith et al. pridobili verige s kompletno dolžino, ki so jih od ostalih produktov ločili z gelsko elektroforezo. Kompletne verige DNA so nato pomnožili s klasičnim PCR, z oligonukleotidnima začetnikoma s 5’-konca vsake od komplementarnih verig. Produkte so cepili z restriktazo PstI in jih ponovno očistili z gelsko elektroforezo. Ligacijo ekstrahiranih linearnih DNA s popolno dolžino so izvedli v razredčeni raztopini, s čemer so se izognili povezovanja koncev med molekulami povečali verjetnost ligacije znotraj posamezne verige DNA. 
S tako dobljenimi krožnimi kromosomi so inficirali celice E.Coli. Infektivnost sintetičnih bakteriofagnih DNA je bila nižja od naravne. Razviti plaki so izkazovali heterogeno morfologijo. Pri enem plaku z morfologijo, tipično za divji tip φX174, so s sekvenciranjem potrdili identičnost sekvence uporabljenemu referenčnemu genomu φX174. Vse mutacije, ki so jih zasledili pri drugih analiziranih viabilnih virionih, so bile substitucije posameznih baz.

== Zaključki ==
Z opisanim postopkom je mogoče učinkovito sestavljati genetske kasete (dolžine 5-6kbp), vendar te brez dodatne selekcije vsebujejo približno eno napako na 500bp. Te napake se lahko popravi z usmerjeno mutagenezo. Raziskovalci so v času nastanka članka predvideli, da bi genom "minimalne" bakterijske celice lahko sestavili iz približno 60 takih kaset. 
Skupina je kasneje pristop nadgradila do te mere, da so s sintetičnim genomom uspeli rekonstruirati tudi bakterijsko celico <ref name="Gibson et al.2010"> Gibson DG, Glass JI, Lartigue C, Noskov VN, Chuang RY, Algire MA, Benders GA, et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science 2010, 329: 52-56.[http://science.sciencemag.org/content/329/5987/52| doi:10.1126/science.1190719]</ref>, pri kateri njen so lastni genetski material nadomestili s sintetični kromosomom. Letos pa so predstavili tudi prvo obliko “minimalnega bakterijskega genoma” <ref name="Hutchison et al. 2016"> Hutchison CA, Chuang RY, Noskov VN, Assad-Garcia N, Deerinck TJ, Ellisman MH, Gill J, et al. Design and synthesis of a minimal bacterial genome. Science 2016, 351: aad6253.[http://science.sciencemag.org/content/351/6280/aad6253| doi:10.1126/science.aad6253]</ref>. Ta obsega 531kbp (473 genov), kar je precej več od predpostavk iz leta 1999, snovalci pa ga predstavljajo kot delovno verzijo, za katero verjamejo, da bo v prihodnosti še skrčena in izboljšana. Omenjeni dosežki kažejo na to, da bo kmalu v laboratoriju mogoče sintetizirati praktično poljuben genom – tako po dolžini kot po vsebini. Kako racionalna je narava in kako malo pravzaprav zares vemo o skrivnosti genoma pa med drugim ilustrira dejstvo, da je trenutni “minimalen” celični genom od najmanjšega naravnega bakterijskega genoma (M. genitalum 525 genov, 580kbp) okrnjen le za slabih 10% (25 genov), ob tem pa kar 149 genov iz tega minimalnega nabora (skoraj tretjina) zaenkrat še nima povsem pojasnene biološke vloge <ref name="Hutchison et al. 2016"/>.
== Viri ==
<references />

Seminarji SB 2016/17

2016-11-21T20:48:36Z

Darja Bozic:

V študijskem letu 2016/17 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI 
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.)
# [[Učinkovito ciljanje izraženih in utišanih genov v človeških zarodnih in induciranih pluripotentnih celicah z nukleazami z motivi cinkovih prstov]]. Angelika Vižintin (22. 11. 2016)
# [[Izdelava sintetičnega genoma s pristopom sestavljanja celotnega genoma: Bakteriofag φX174 iz sintetičnih oligonukleotidov]]. Darja Božič (22.11.2016)
# [[Modeliranje sintetične večcelične ure: Represilatorji, sklopljeni z zaznavanjem celične gostote]]. Vita Vidmar (22. 11. 2016)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI 
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
#[[Mezenhimske matične celice nove generacije]]. Danijela Jošić (22.11.2016)
#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bakterije%2C_ki_kelirajo_bakrove_ione%2C_v_boju_proti_Wilsonovi_bolezni Bakterije, ki kelirajo bakrove ione, v boju proti Wilsonovi bolezni. Simon Bolta (22. 11. 2016)]
#

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 12 minut (10-14). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Izdelava sintetičnega genoma s pristopom sestavljanja celotnega genoma: Bakteriofag φX174 iz sintetičnih oligonukleotidov

2016-11-21T20:43:47Z

Darja Bozic:

[http://www.pnas.org/content/100/26/15440.full.pdf| Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phi X174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides]

== Povzetek ==
Raziskovalci inštituta J. Craig Venter Institute (JCVI) so razvili postopek, s katerim so v 14-ih dneh iz zbirke kemično pripravljenih oligonukleotidov sestavili infektivni genom bakteriofaga φX174 (5,386 bp). S tem so pokazali, da je mogoče na relativno enostaven in kratkotrajen način umetno poustvariti obsežno naravno genomsko strukturo dovolj pravilno, da je ta sposobna razviti, ohranjati in reproducirati svoj življenjski potencial. V ospredju članka Smith et al. 2003 <ref name="Smith et al. 2003"> Smith HO, Hutchison CA, Pfannkoch C, Venter JC. Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phiX174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100: 15440-15445. [http://www.pnas.org/content/100/26/15440.long| doi:10.1073/pnas.2237126100] </ref> je torej metoda za učinkovito izgrajevanje dolgih segmentov DNA (5-6kbp) iz kratkih sintetičnih oligonukleotidov.

== Ozadje ==
Hutchinson et al. so leta 1999 izdali članek<ref name="Hutchison et al. 1999"> Hutchison CA, Peterson SN, Gill SR, Cline RT, White O, Fraser CM, Smith HO, et al. Global transposon mutagenesis and a minimal Mycoplasma genome. Science 1999, 286: 2165-2169. [http://science.sciencemag.org/content/286/5447/2165| doi:10.1126/science.286.5447.2165]</ref>, ki opisuje idejo o konstruiranju organizma z minimalnim genomom, ki bi odprl vrata v nove razsežnosti raziskovanja skrivnosti življenja. Šlo bi za umetni organizem z najmanjšim možnim naborom genov, ki še omogoča življenje v permisivnih laboratorijskih pogojih. Na podlagi poizkusov z naključno mutagenezo, s katerimi so posamezne gene, so iz nabora genov bakterij iz rodu Mycoplasmae (te imajo najmanjši genom med znanimi prostoživečimi organizmi) izločili “pogrešljive” gene in na ta način oblikovali nabor “nepogrešljivih” genov. Predpostavili so, da bi ta nabor lahko predstavljal zadostno formulo za razvoj življenja in bi torej predstavljal genom “minimalnega organizma”. Taka osnovna celica, v kateri bi vsak gen imel popolnoma opredeljeno molekularno in biološko vlogo, bi znanstvenikom predstavljala podlago za dodajanje posameznih genov, preučevanje njihovih vlog in poljubno modeliranje organizmov z želenimi lastnostmi. Ideja je obetala z velikim raziskovalnim in proizvodnim potencialom, ki pa je hkrati(znova)odprl mnoga etična vprašanja in zadržke o potrebnosti, smiselnosti, smotrnosti in nevarnosti ustvarjanja novih živih bitij po golih človekovih željah in vzgibih. Nekateri pogledi na to problematiko iz raziskovalskega stališča so predstavljeni v razpravi etičnega odbora Univerze Stanford<ref name="Cho et al. 1999"> Cho MK, Magnus D, Caplan AL, McGee D, Group tEoG. Ethical Considerations in Synthesizing a Minimal Genome. Science 1999, 286:2087, 2089-2090. [http://science.sciencemag.org/content/286/5447/2087| doi:10.1126/science.286.5447.2087]</ref>, ki je bila v reviji Science leta 1999 objavljena skupaj s člankom, nekaj razmislekov bioetikov pa v razpravi Douglas in Savulescu<ref name="Douglas in Savoulescu 2010">Douglas T, Savulescu J. Synthetic biology and the ethics of knowledge. J Med Ethics 2010, 36: 687-693. [http://www.bep.ox.ac.uk/__data/assets/pdf_file/0020/17516/Douglas.Savulescu_Synthetic.Biology_JME.2010.pdf| doi:10.1136/jme.2010.038232] </ref>, iz leta 2010. 
Pri sestavi sintetičnega virusnega genoma, ki so jo predstavili Smith et al. 2003<ref name="Smith et al. 2003"/>, gre pravzaprav za razvoj tehničnega orodja za realizacijo te ideje. Zamisel o umetni sintezi organizmov je namreč precej prehitevala realno znanje in praktično izvedljivost izgradnje natančno opredeljenega zaporedja genomskih razsežnosti. Kemični postopki priprave nukleinskih kislin zaenkrat še vedno omogočajo sintezo nukleotidnih verig dolžine do okrog 200 baz. Z naraščajočo dolžino se veča tudi verjetnost napak in nepopolne sinteze. Zato je za oblikovanje genov in daljših genskih sestavov nujno razumevanje in obvladovanje sestavljanja iz krajših fragmentov.
 
Izbor genoma bakteriofaga φX174 za prototip za razvoj pristopa izvira iz njegove dobre raziskanosti. Kromosom φX174 je bil prvi genom, ki ga je znanstvenikom uspelo očistiti do homogenosti. Zanj je bilo prvič dokazana infektivnost v laboratoriju sintetizirane virusne DNA (pomnožene na podlagi intaktne naravne matrice)<ref name="Goulian et al. 1967"> Goulian M, Kornberg A, Sinsheimer RL. Enzymatic synthesis of DNA, XXIV. Synthesis of infectious phage phi-X174 DNA. Proc Natl Acad Sci USA 1967, 58: 2321-2328. [[http://www.pnas.org/content/58/6/2321.full.pdf]]</ref>, bakteriofag φX174 pa je bil tudi prvi organizem z v celoti znanim genomskim zaporedjem (Sanger et al., 1987)<ref name="Sanger et al.1978"> Sanger F, Coulson AR, Friedmann T, Air GM, Barrell BG, Brown NL, Fiddes JC, et al. The nucleotide sequence of bacteriophage phiX174. J Mol Biol 1978, 125: 225-246</ref>.

== Postopek izgradnje sintetičnega genoma ==

{|
<table border=1 cellpadding=2 cellspacing=0 align=center>

|-
! Stopnja
! Predviden čas

|-
| Načrtovanje oligonukleotidov 
(~42 baz; pokrivajo celotno sekvenco želenega končnega zaporedja, z dodanim eksogenim restrikcijskim zaporedjem na začetku in koncu)
| 8h

|-
| Sinteza oligonukleotidov 

(DNA sintetizator)
| 4 dni

|-
| Čiščenje oligonukleotidov 

(zmes oligonukleotidov z iste verige, gelska elektoforeza pod denaturacijskimi pogoji)
| 2 dni

|-
| 5’-fosforiliranje oligonukleotidov
| 4 h

|-
| Ligacija oligonukleotidov v daljše segmente 
(inkubacija zmesi vseh oligonukleotidov s termostabilno Taq ligazo pri 55°C)
| 18h

|-
| Izgrajevanje do končnih kromosomov z metodo PCA 
(sestavljanje segmentov do celotnega končnega zaporedja)
| 12-24h

|-
| Pomnoževanje dobljenih kromosomov s klasičnim PCR
| 3h

|-
| Čiščenje produktov 
(gelska elektroforeza)
| 8h

|-
| Cirkularizacija DNA v infektivne krožne molekule 
(restrikcija očiščene linearne dvoverižne DNA z encimom, ki prepozna dodani sekvenci na začetku in koncu kromosoma in ligacija v razredčenih razmerah)
| 4h

|-
| Elektroporacija v E. Coli, gojenje
| 24h

|-
| Ekstrakcija plakov, sekvenciranje
| Skupaj: ~2 tedna

|} 
Sekvenco genoma φX174 so Smith et al. razdelili v 42 bazne oligonukleotide (130 za vsako od komplementarnih verig) in jih načrtovali tako, da so se oligonukleotidi iz komplementarnih verig med seboj delno prekrivali (vsak oligonukleotid je bil komplementaren polovici dveh zaporednih olikonukleotidov komplementarne verige). Pri tem so lineariziran genom na vsaki strani podaljšali za prepoznavno zaporedje za restrikcijo s PstI, ki sicer ni prisotno nikjer drugje v genomu φX174, in ki je omogočilo kasnejše povezovanje koncev kompletne DNA v infektivne krožne molekule. 

Njihov postopek izgradnje genoma iz pripravljenih sintetičnih oligonukleotidov je vseboval naslednje ključne korake: 
: i) Čiščenje sintetičnih oligonukleotidov z gelsko elektroforezo 
: ii) Ligacija očiščenih oligonukleotidov pod zaostrenimi pogoji (55°C). Oligonukleotidi so pred ligacijo 5’ fosforilirani. 
: iii) Izgrajevanje DNA fragmentov v končni genom z metodo cikličnega sestavljanja s polimerazo (PCA). 
=== Oligonukleotidi ===
Pri pripravi sintetičnega genoma ima čistost izhodnih oligonukleotidov zelo pomembno vlogo. Po kemični sintezi oligonukleotidov so med produkti prisotni oligonukleotidi z napakami - najpogosteje delecijami (npr. nedokončane sekvence, ali sekvence z izpuščenimi posameznimi nukleotidi). Uporaba takih oligonukleotidov bi vnesla visoko verjetnost mutacij v končni DNA. Ker je v neprečiščeni zmesi pravzaprav le okrog polovica oligonukleotidov popolnih, bi bila verjetnost sestave pravilnega celotnega genoma iz naključnih 130 oligonukleotiodov enaka (1/2)130 oz. ≈10–39. S stopnjo čiščenja z gelsko elektroforezo so to verjetnost znatno povišali. Uporaba oligonukleotidov s povsem enako dolžino jim je omogočila, da so vse oligonukleotide “očistili” hkrati, v zmesi. Pri tem so združili oligonukleotide z ene verige dvoverižne DNA ločeno od druge, in s tem poskušali preprečiti morebitno hibridizacijo med komplementarnimi deli.

=== Ligacija ===
Očiščene oligonukleotide so fosforilirali na 5’-koncu in izvedli ligacijo s termostabilno Taq ligazo. Taq ligaza deluje pri 55°C kar poveča specifičnost ligacije, saj povišana temperatura zmanjša verjetnost prileganja delno komplementarnih zaporedij in oligonukleotidov z vsebujočimi mutacijami. S to stopnjo so pridobili daljše dvoverižne DNA segmente. Teoretično bi lahko na tak način sestavili genom do končne dolžine, vendar v praksi prihaja do določenih omejitev, zaradi katerih to ni mogoče. Zato so po ligaciji dobljene segmente DNA (≈700bp) do končne dolžine povezali s postopkom cikličnega izgrajevanja s polimerazo (angl. polymerase cycling assembly, PCA).

=== Ciklično izgrajevanje s polimerazo (PCA)===
Reakcija PCA je analogna verižni reakciji s polimerazo PCR. Princip je enak, le da v reakcijski zmesi za PCA ni presežka oligonukleotidnih začetnikov. V zmesi imamo fragmente DNA – gradnike želene končne sekvence v obliki dvoverižnih, delno prekrivajočih se oligonukleotidov. V vsakem ciklu je DNA podvržena denaturaciji in ponovni renaturaciji, med katero se komplementarni deli verig prilegajo eden drugemu. Če oligonukleotid na 3’-koncu ne sega do konca 5’-konca komplementarnega, ki se mu prilega, ga polimeraza ustrezno podaljša. Verige v zmesi torej ena na drugo delujejo kot oligonukleotidni začetniki. Verige se v vsakem ciklu podaljšajo, dokler ne dosežejo končne dolžine oziroma, dokler podaljševanje ni več možno. Molekule iz reakcijske zmesi se lahko podaljšujejo le v smeri 5’→3’ in le enkrat do konca genoma po številnih ciklih. Popolno dolžino genoma torej lahko dosežejo le verige, ki vsebujejo 5’-končni del genomskega zaporedja. Pri reakciji ne pride do pomnoževanja – število verig od začetka ostaja isto. Da med reakcijo ne bi prišlo do razgrajevanja, je za reakcijo potrebna polimeraza brez 5’-eksonukleazne aktivnosti, z uporabo polimeraze s 3’→5’ eksonukleazno aktivnostjo, pa se poveča natančnost podaljševanja.

== Končna obdelava sintetičnih kromosomov in evalvacija viabilnih virionov ==
Tako so torej Smith et al. pridobili verige s kompletno dolžino, ki so jih od ostalih produktov ločili z gelsko elektroforezo. Kompletne verige DNA so nato pomnožili s klasičnim PCR, z oligonukleotidnima začetnikoma s 5’-konca vsake od komplementarnih verig. Produkte so cepili z restriktazo PstI in jih ponovno očistili z gelsko elektroforezo. Ligacijo ekstrahiranih linearnih DNA s popolno dolžino so izvedli v razredčeni raztopini, s čemer so se izognili povezovanja koncev med molekulami povečali verjetnost ligacije znotraj posamezne verige DNA. 
S tako dobljenimi krožnimi kromosomi so inficirali celice E.Coli. Infektivnost sintetičnih bakteriofagnih DNA je bila nižja od naravne. Razviti plaki so izkazovali heterogeno morfologijo. Pri enem plaku z morfologijo, tipično za divji tip φX174, so s sekvenciranjem potrdili identičnost sekvence uporabljenemu referenčnemu genomu φX174. Vse mutacije, ki so jih zasledili pri drugih analiziranih viabilnih virionih, so bile substitucije posameznih baz.

== Zaključki ==
Z opisanim postopkom je mogoče učinkovito sestavljati genetske kasete (dolžine 5-6kbp), vendar te brez dodatne selekcije vsebujejo približno eno napako na 500bp. Te napake se lahko popravi z usmerjeno mutagenezo. Raziskovalci so v času nastanka članka predvideli, da bi genom "minimalne" bakterijske celice lahko sestavili iz približno 60 takih kaset. 
Skupina je kasneje pristop nadgradila do te mere, da so s sintetičnim genomom uspeli rekonstruirati tudi bakterijsko celico <ref name="Gibson et al.2010"> Gibson DG, Glass JI, Lartigue C, Noskov VN, Chuang RY, Algire MA, Benders GA, et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science 2010, 329: 52-56.[http://science.sciencemag.org/content/329/5987/52| doi:10.1126/science.1190719]</ref>, pri kateri njen so lastni genetski material nadomestili s sintetični kromosomom. Letos pa so predstavili tudi prvo obliko “minimalnega bakterijskega genoma” <ref name="Hutchison et al. 2016"> Hutchison CA, Chuang RY, Noskov VN, Assad-Garcia N, Deerinck TJ, Ellisman MH, Gill J, et al. Design and synthesis of a minimal bacterial genome. Science 2016, 351: aad6253.[http://science.sciencemag.org/content/351/6280/aad6253| doi:10.1126/science.aad6253]</ref>. Ta obsega 531kbp (473 genov), kar je precej več od predpostavk iz leta 1999, snovalci pa ga predstavljajo kot delovno verzijo, za katero verjamejo, da bo v prihodnosti še skrčena in izboljšana. Omenjeni dosežki kažejo na to, da bo kmalu v laboratoriju mogoče sintetizirati praktično poljuben genom – tako po dolžini kot po vsebini. Kako racionalna je narava in kako malo pravzaprav zares vemo o skrivnosti genoma pa med drugim ilustrira dejstvo, da je trenutni “minimalen” celični genom od najmanjšega naravnega bakterijskega genoma (M. genitalum 525 genov, 580kbp) okrnjen le za slabih 10% (25 genov), ob tem pa kar 149 genov iz tega minimalnega nabora (skoraj tretjina) zaenkrat še nima povsem pojasnene biološke vloge <ref name="Hutchison et al. 2016"/>.
== Viri ==
<references />

Izdelava sintetičnega genoma s pristopom sestavljanja celotnega genoma: Bakteriofag φX174 iz sintetičnih oligonukleotidov

2016-11-21T20:02:28Z

Darja Bozic:

[http://www.pnas.org/content/100/26/15440.full.pdf| Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phi X174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides]

== Povzetek ==
Raziskovalci inštituta J. Craig Venter Institute (JCVI) so razvili postopek, s katerim so v 14-ih dneh iz zbirke kemično pripravljenih oligonukleotidov sestavili infektivni genom bakteriofaga φX174 (5,386 bp). S tem so pokazali, da je mogoče na relativno enostaven in kratkotrajen način umetno poustvariti obsežno naravno genomsko strukturo dovolj pravilno, da je ta sposobna razviti, ohranjati in reproducirati svoj življenjski potencial. V ospredju članka Smith et al. 2003 <ref name="Smith et al. 2003"> Smith HO, Hutchison CA, Pfannkoch C, Venter JC. Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phiX174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100: 15440-15445.</ref> je torej metoda za učinkovito izgrajevanje dolgih segmentov DNA (5-6kbp) iz kratkih sintetičnih oligonukleotidov.

== Ozadje ==
Hutchinson et al. so leta 1999 izdali članek<ref name="Hutchison et al. 1999"> Hutchison CA, Peterson SN, Gill SR, Cline RT, White O, Fraser CM, Smith HO, et al. Global transposon mutagenesis and a minimal Mycoplasma genome. Science 1999, 286: 2165-2169.</ref>, ki opisuje idejo o konstruiranju organizma z minimalnim genomom, ki bi odprl vrata v nove razsežnosti raziskovanja skrivnosti življenja. Šlo bi za umetni organizem z najmanjšim možnim naborom genov, ki še omogoča življenje v permisivnih laboratorijskih pogojih. Na podlagi poizkusov z naključno mutagenezo, s katerimi so posamezne gene, so iz nabora genov bakterij iz rodu Mycoplasmae (te imajo najmanjši genom med znanimi prostoživečimi organizmi) izločili “pogrešljive” gene in na ta način oblikovali nabor “nepogrešljivih” genov. Predpostavili so, da bi ta nabor lahko predstavljal zadostno formulo za razvoj življenja in bi torej predstavljal genom “minimalnega organizma”. Taka osnovna celica, v kateri bi vsak gen imel popolnoma opredeljeno molekularno in biološko vlogo, bi znanstvenikom predstavljala podlago za dodajanje posameznih genov, preučevanje njihovih vlog in poljubno modeliranje organizmov z želenimi lastnostmi. Ideja je obetala z velikim raziskovalnim in proizvodnim potencialom, ki pa je hkrati(znova)odprl mnoga etična vprašanja in zadržke o potrebnosti, smiselnosti, smotrnosti in nevarnosti ustvarjanja novih živih bitij po golih človekovih željah in vzgibih. Nekateri pogledi na to problematiko iz raziskovalskega stališča so predstavljeni v razpravi etičnega odbora Univerze Stanford<ref name="Cho et al. 1999"> Cho MK, Magnus D, Caplan AL, McGee D, Group tEoG. Ethical Considerations in Synthesizing a Minimal Genome. Science 1999, 286:2087, 2089-2090.</ref>, ki je bila v reviji Science leta 1999 objavljena skupaj s člankom, nekaj razmislekov bioetikov pa v razpravi Douglas in Savulescu<ref name="Douglas in Savoulescu 2010">Douglas T, Savulescu J. Synthetic biology and the ethics of knowledge. J Med Ethics 2010, 36: 687-693.</ref>, iz leta 2010. 
Pri sestavi sintetičnega virusnega genoma, ki so jo predstavili Smith et al. 2003<ref name="Smith et al. 2003"/>, gre pravzaprav za razvoj tehničnega orodja za realizacijo te ideje. Zamisel o umetni sintezi organizmov je namreč precej prehitevala realno znanje in praktično izvedljivost izgradnje natančno opredeljenega zaporedja genomskih razsežnosti. Kemični postopki priprave nukleinskih kislin zaenkrat še vedno omogočajo sintezo nukleotidnih verig dolžine do okrog 200 baz. Z naraščajočo dolžino se veča tudi verjetnost napak in nepopolne sinteze. Zato je za oblikovanje genov in daljših genskih sestavov nujno razumevanje in obvladovanje sestavljanja iz krajših fragmentov.
 
Izbor genoma bakteriofaga φX174 za prototip za razvoj pristopa izvira iz njegove dobre raziskanosti. Kromosom φX174 je bil prvi genom, ki ga je znanstvenikom uspelo očistiti do homogenosti. Zanj je bilo prvič dokazana infektivnost v laboratoriju sintetizirane virusne DNA (pomnožene na podlagi intaktne naravne matrice)<ref name="Goulian et al. 1967"> Goulian M, Kornberg A, Sinsheimer RL. Enzymatic synthesis of DNA, XXIV. Synthesis of infectious phage phi-X174 DNA. Proc Natl Acad Sci USA 1967, 58: 2321-2328.</ref>, bakteriofag φX174 pa je bil tudi prvi organizem z v celoti znanim genomskim zaporedjem (Sanger et al., 1987)<ref name="Sanger et al.1978"> Sanger F, Coulson AR, Friedmann T, Air GM, Barrell BG, Brown NL, Fiddes JC, et al. The nucleotide sequence of bacteriophage phiX174. J Mol Biol 1978, 125: 225-246.</ref>.

== Postopek izgradnje sintetičnega genoma ==

{|
<table border=1 cellpadding=2 cellspacing=0 align=center>

|-
! Stopnja
! Predviden čas

|-
| Načrtovanje oligonukleotidov 
(~42 baz; pokrivajo celotno sekvenco želenega končnega zaporedja, z dodanim eksogenim restrikcijskim zaporedjem na začetku in koncu)
| 8h

|-
| Sinteza oligonukleotidov 

(DNA sintetizator)
| 4 dni

|-
| Čiščenje oligonukleotidov 

(zmes oligonukleotidov z iste verige, gelska elektoforeza pod denaturacijskimi pogoji)
| 2 dni

|-
| 5’-fosforiliranje oligonukleotidov
| 4 h

|-
| Ligacija oligonukleotidov v daljše segmente 
(inkubacija zmesi vseh oligonukleotidov s termostabilno Taq ligazo pri 55°C)
| 18h

|-
| Izgrajevanje do končnih kromosomov z metodo PCA 
(sestavljanje segmentov do celotnega končnega zaporedja)
| 12-24h

|-
| Pomnoževanje dobljenih kromosomov s klasičnim PCR
| 3h

|-
| Čiščenje produktov 
(gelska elektroforeza)
| 8h

|-
| Cirkularizacija DNA v infektivne krožne molekule 
(restrikcija očiščene linearne dvoverižne DNA z encimom, ki prepozna dodani sekvenci na začetku in koncu kromosoma in ligacija v razredčenih razmerah)
| 4h

|-
| Elektroporacija v E. Coli, gojenje
| 24h

|-
| Ekstrakcija plakov, sekvenciranje
| Skupaj: ~2 tedna

|} 
Sekvenco genoma φX174 so Smith et al. razdelili v 42 bazne oligonukleotide (130 za vsako od komplementarnih verig) in jih načrtovali tako, da so se oligonukleotidi iz komplementarnih verig med seboj delno prekrivali (vsak oligonukleotid je bil komplementaren polovici dveh zaporednih olikonukleotidov komplementarne verige). Pri tem so lineariziran genom na vsaki strani podaljšali za prepoznavno zaporedje za restrikcijo s PstI, ki sicer ni prisotno nikjer drugje v genomu φX174, in ki je omogočilo kasnejše povezovanje koncev kompletne DNA v infektivne krožne molekule. 

Njihov postopek izgradnje genoma iz pripravljenih sintetičnih oligonukleotidov je vseboval naslednje ključne korake: 
: i) Čiščenje sintetičnih oligonukleotidov z gelsko elektroforezo 
: ii) Ligacija očiščenih oligonukleotidov pod zaostrenimi pogoji (55°C). Oligonukleotidi so pred ligacijo 5’ fosforilirani. 
: iii) Izgrajevanje DNA fragmentov v končni genom z metodo cikličnega sestavljanja s polimerazo (PCA). 
=== Oligonukleotidi ===
Pri pripravi sintetičnega genoma ima čistost izhodnih oligonukleotidov zelo pomembno vlogo. Po kemični sintezi oligonukleotidov so med produkti prisotni oligonukleotidi z napakami - najpogosteje delecijami (npr. nedokončane sekvence, ali sekvence z izpuščenimi posameznimi nukleotidi). Uporaba takih oligonukleotidov bi vnesla visoko verjetnost mutacij v končni DNA. Ker je v neprečiščeni zmesi pravzaprav le okrog polovica oligonukleotidov popolnih, bi bila verjetnost sestave pravilnega celotnega genoma iz naključnih 130 oligonukleotiodov enaka (1/2)130 oz. ≈10–39. S stopnjo čiščenja z gelsko elektroforezo so to verjetnost znatno povišali. Uporaba oligonukleotidov s povsem enako dolžino jim je omogočila, da so vse oligonukleotide “očistili” hkrati, v zmesi. Pri tem so združili oligonukleotide z ene verige dvoverižne DNA ločeno od druge, in s tem poskušali preprečiti morebitno hibridizacijo med komplementarnimi deli.

=== Ligacija ===
Očiščene oligonukleotide so fosforilirali na 5’-koncu in izvedli ligacijo s termostabilno Taq ligazo. Taq ligaza deluje pri 55°C kar poveča specifičnost ligacije, saj povišana temperatura zmanjša verjetnost prileganja delno komplementarnih zaporedij in oligonukleotidov z vsebujočimi mutacijami. S to stopnjo so pridobili daljše dvoverižne DNA segmente. Teoretično bi lahko na tak način sestavili genom do končne dolžine, vendar v praksi prihaja do določenih omejitev, zaradi katerih to ni mogoče. Zato so po ligaciji dobljene segmente DNA (≈700bp) do končne dolžine povezali s postopkom cikličnega izgrajevanja s polimerazo (angl. polymerase cycling assembly, PCA).

=== Ciklično izgrajevanje s polimerazo (PCA)===
Reakcija PCA je analogna verižni reakciji s polimerazo PCR. Princip je enak, le da v reakcijski zmesi za PCA ni presežka oligonukleotidnih začetnikov. V zmesi imamo fragmente DNA – gradnike želene končne sekvence v obliki dvoverižnih, delno prekrivajočih se oligonukleotidov. V vsakem ciklu je DNA podvržena denaturaciji in ponovni renaturaciji, med katero se komplementarni deli verig prilegajo eden drugemu. Če oligonukleotid na 3’-koncu ne sega do konca 5’-konca komplementarnega, ki se mu prilega, ga polimeraza ustrezno podaljša. Verige v zmesi torej ena na drugo delujejo kot oligonukleotidni začetniki. Verige se v vsakem ciklu podaljšajo, dokler ne dosežejo končne dolžine oziroma, dokler podaljševanje ni več možno. Molekule iz reakcijske zmesi se lahko podaljšujejo le v smeri 5’→3’ in le enkrat do konca genoma po številnih ciklih. Popolno dolžino genoma torej lahko dosežejo le verige, ki vsebujejo 5’-končni del genomskega zaporedja. Pri reakciji ne pride do pomnoževanja – število verig od začetka ostaja isto. Da med reakcijo ne bi prišlo do razgrajevanja, je za reakcijo potrebna polimeraza brez 5’-eksonukleazne aktivnosti, z uporabo polimeraze s 3’→5’ eksonukleazno aktivnostjo, pa se poveča natančnost podaljševanja.

== Končna obdelava sintetičnih kromosomov in evalvacija viabilnih virionov ==
Tako so torej Smith et al. pridobili verige s kompletno dolžino, ki so jih od ostalih produktov ločili z gelsko elektroforezo. Kompletne verige DNA so nato pomnožili s klasičnim PCR, z oligonukleotidnima začetnikoma s 5’-konca vsake od komplementarnih verig. Produkte so cepili z restriktazo PstI in jih ponovno očistili z gelsko elektroforezo. Ligacijo ekstrahiranih linearnih DNA s popolno dolžino so izvedli v razredčeni raztopini, s čemer so se izognili povezovanja koncev med molekulami povečali verjetnost ligacije znotraj posamezne verige DNA. 
S tako dobljenimi krožnimi kromosomi so inficirali celice E.Coli. Infektivnost sintetičnih bakteriofagnih DNA je bila nižja od naravne. Razviti plaki so izkazovali heterogeno morfologijo. Pri enem plaku z morfologijo, tipično za divji tip φX174, so s sekvenciranjem potrdili identičnost sekvence uporabljenemu referenčnemu genomu φX174. Vse mutacije, ki so jih zasledili pri drugih analiziranih viabilnih virionih, so bile substitucije posameznih baz.

== Zaključki ==
Z opisanim postopkom je mogoče učinkovito sestavljati genetske kasete (dolžine 5-6kbp), vendar te brez dodatne selekcije vsebujejo približno eno napako na 500bp. Te napake se lahko popravi z usmerjeno mutagenezo. Raziskovalci so v času nastanka članka predvideli, da bi genom "minimalne" bakterijske celice lahko sestavili iz približno 60 takih kaset. 
Skupina je kasneje pristop nadgradila do te mere, da so s sintetičnim genomom uspeli rekonstruirati tudi bakterijsko celico <ref name="Gibson et al.2010"> Gibson DG, Glass JI, Lartigue C, Noskov VN, Chuang RY, Algire MA, Benders GA, et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science 2010, 329: 52-56.</ref>, pri kateri njen so lastni genetski material nadomestili s sintetični kromosomom. Letos pa so predstavili tudi prvo obliko “minimalnega bakterijskega genoma” <ref name="Hutchison et al. 2016"> Hutchison CA, Chuang RY, Noskov VN, Assad-Garcia N, Deerinck TJ, Ellisman MH, Gill J, et al. Design and synthesis of a minimal bacterial genome. Science 2016, 351: aad6253.</ref>. Ta obsega 531kbp (473 genov), kar je precej več od predpostavk iz leta 1999, snovalci pa ga predstavljajo kot delovno verzijo, za katero verjamejo, da bo v prihodnosti še skrčena in izboljšana. Omenjeni dosežki kažejo na to, da bo kmalu v laboratoriju mogoče sintetizirati praktično poljuben genom – tako po dolžini kot po vsebini. Kako racionalna je narava in kako malo pravzaprav zares vemo o skrivnosti genoma pa med drugim ilustrira dejstvo, da je trenutni “minimalen” celični genom od najmanjšega naravnega bakterijskega genoma (M. genitalum 525 genov, 580kbp) okrnjen le za slabih 10% (25 genov), ob tem pa kar 149 genov iz tega minimalnega nabora (skoraj tretjina) zaenkrat še nima povsem pojasnene biološke vloge <ref name="Hutchison et al. 2016"/>.
== Viri ==
<references />

Izdelava sintetičnega genoma s pristopom sestavljanja celotnega genoma: Bakteriofag φX174 iz sintetičnih oligonukleotidov

2016-11-21T20:00:18Z

Darja Bozic:

[http://www.pnas.org/content/100/26/15440.full.pdf| Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phi X174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides]

== Povzetek ==
Raziskovalci inštituta J. Craig Venter Institute (JCVI) so razvili postopek, s katerim so v 14-ih dneh iz zbirke kemično pripravljenih oligonukleotidov sestavili infektivni genom bakteriofaga φX174 (5,386 bp). S tem so pokazali, da je mogoče na relativno enostaven in kratkotrajen način umetno poustvariti obsežno naravno genomsko strukturo dovolj pravilno, da je ta sposobna razviti, ohranjati in reproducirati svoj življenjski potencial. V ospredju članka Smith et al. 2003 <ref name="Smith et al. 2003"> Smith HO, Hutchison CA, Pfannkoch C, Venter JC. Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phiX174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100: 15440-15445.</ref> je torej metoda za učinkovito izgrajevanje dolgih segmentov DNA (5-6kbp) iz kratkih sintetičnih oligonukleotidov.

== Ozadje ==
Hutchinson et al. so leta 1999 izdali članek<ref name="Hutchison et al. 1999"> Hutchison CA, Peterson SN, Gill SR, Cline RT, White O, Fraser CM, Smith HO, et al. Global transposon mutagenesis and a minimal Mycoplasma genome. Science 1999, 286: 2165-2169.</ref>, ki opisuje idejo o konstruiranju organizma z minimalnim genomom, ki bi odprl vrata v nove razsežnosti raziskovanja skrivnosti življenja. Šlo bi za umetni organizem z najmanjšim možnim naborom genov, ki še omogoča življenje v permisivnih laboratorijskih pogojih. Na podlagi poizkusov z naključno mutagenezo, s katerimi so posamezne gene, so iz nabora genov bakterij iz rodu Mycoplasmae (te imajo najmanjši genom med znanimi prostoživečimi organizmi) izločili “pogrešljive” gene in na ta način oblikovali nabor “nepogrešljivih” genov. Predpostavili so, da bi ta nabor lahko predstavljal zadostno formulo za razvoj življenja in bi torej predstavljal genom “minimalnega organizma”. Taka osnovna celica, v kateri bi vsak gen imel popolnoma opredeljeno molekularno in biološko vlogo, bi znanstvenikom predstavljala podlago za dodajanje posameznih genov, preučevanje njihovih vlog in poljubno modeliranje organizmov z želenimi lastnostmi. Ideja je obetala z velikim raziskovalnim in proizvodnim potencialom, ki pa je hkrati(znova)odprl mnoga etična vprašanja in zadržke o potrebnosti, smiselnosti, smotrnosti in nevarnosti ustvarjanja novih živih bitij po golih človekovih željah in vzgibih. Nekateri pogledi na to problematiko iz raziskovalskega stališča so predstavljeni v razpravi etičnega odbora Univerze Stanford<ref name="Cho et al. 1999"> Cho MK, Magnus D, Caplan AL, McGee D, Group tEoG. Ethical Considerations in Synthesizing a Minimal Genome. Science 1999, 286:2087, 2089-2090.</ref>, ki je bila v reviji Science leta 1999 objavljena skupaj s člankom, nekaj razmislekov bioetikov pa v razpravi Douglas in Savulescu<ref name="Douglas in Savoulescu 2010">Douglas T, Savulescu J. Synthetic biology and the ethics of knowledge. J Med Ethics 2010, 36: 687-693.</ref>, iz leta 2010. 
Pri sestavi sintetičnega virusnega genoma, ki so jo predstavili Smith et al. 2003<ref name="Smith et al. 2003"/>, gre pravzaprav za razvoj tehničnega orodja za realizacijo te ideje. Zamisel o umetni sintezi organizmov je namreč precej prehitevala realno znanje in praktično izvedljivost izgradnje natančno opredeljenega zaporedja genomskih razsežnosti. Kemični postopki priprave nukleinskih kislin zaenkrat še vedno omogočajo sintezo nukleotidnih verig dolžine do okrog 200 baz. Z naraščajočo dolžino se veča tudi verjetnost napak in nepopolne sinteze. Zato je za oblikovanje genov in daljših genskih sestavov nujno razumevanje in obvladovanje sestavljanja iz krajših fragmentov.
 
Izbor genoma bakteriofaga φX174 za prototip za razvoj pristopa izvira iz njegove dobre raziskanosti. Kromosom φX174 je bil prvi genom, ki ga je znanstvenikom uspelo očistiti do homogenosti. Zanj je bilo prvič dokazana infektivnost v laboratoriju sintetizirane virusne DNA (pomnožene na podlagi intaktne naravne matrice)<ref name="Goulian et al. 1967"> Goulian M, Kornberg A, Sinsheimer RL. Enzymatic synthesis of DNA, XXIV. Synthesis of infectious phage phi-X174 DNA. Proc Natl Acad Sci USA 1967, 58: 2321-2328.</ref>, bakteriofag φX174 pa je bil tudi prvi organizem z v celoti znanim genomskim zaporedjem (Sanger et al., 1987)<ref name="Sanger et al.1978"> Sanger F, Coulson AR, Friedmann T, Air GM, Barrell BG, Brown NL, Fiddes JC, et al. The nucleotide sequence of bacteriophage phiX174. J Mol Biol 1978, 125: 225-246.</ref>.

== Postopek izgradnje sintetičnega genoma ==

{|
<table border=1 cellpadding=2 cellspacing=0 align=center>

|-
! Stopnja
! Predviden čas

|-
| Načrtovanje oligonukleotidov 
(~42 baz; pokrivajo celotno sekvenco želenega končnega zaporedja, z dodanim eksogenim restrikcijskim zaporedjem na začetku in koncu)
| 8h

|-
| Sinteza oligonukleotidov 

(DNA sintetizator)
| 4 dni

|-
| Čiščenje oligonukleotidov 

(zmes oligonukleotidov z iste verige, gelska elektoforeza pod denaturacijskimi pogoji)
| 2 dni

|-
| 5’-fosforiliranje oligonukleotidov
| 4 h

|-
| Ligacija oligonukleotidov v daljše segmente 
(inkubacija zmesi vseh oligonukleotidov s termostabilno Taq ligazo pri 55°C)
| 18h

|-
| Izgrajevanje do končnih kromosomov z metodo PCA 
(sestavljanje segmentov do celotnega končnega zaporedja)
| 12-24h

|-
| Pomnoževanje dobljenih kromosomov s klasičnim PCR
| 3h

|-
| Čiščenje produktov 
(gelska elektroforeza)
| 8h

|-
| Cirkularizacija DNA v infektivne krožne molekule 
(restrikcija očiščene linearne dvoverižne DNA z encimom, ki prepozna dodani sekvenci na začetku in koncu kromosoma in ligacija v razredčenih razmerah)
| 4h

|-
| Elektroporacija v E. Coli, gojenje
| 24h

|-
| Ekstrakcija plakov, sekvenciranje
| Skupaj: ~2 tedna

|} 
Sekvenco genoma φX174 so Smith et al. razdelili v 42 bazne oligonukleotide (130 za vsako od komplementarnih verig) in jih načrtovali tako, da so se oligonukleotidi iz komplementarnih verig med seboj delno prekrivali (vsak oligonukleotid je bil komplementaren polovici dveh zaporednih olikonukleotidov komplementarne verige). Pri tem so lineariziran genom na vsaki strani podaljšali za prepoznavno zaporedje za restrikcijo s PstI, ki sicer ni prisotno nikjer drugje v genomu φX174, in ki je omogočilo kasnejše povezovanje koncev kompletne DNA v infektivne krožne molekule. 

Njihov postopek izgradnje genoma iz pripravljenih sintetičnih oligonukleotidov je vseboval naslednje ključne korake: 
: i) Čiščenje sintetičnih oligonukleotidov z gelsko elektroforezo 
: ii) Ligacija očiščenih oligonukleotidov pod zaostrenimi pogoji (55°C). Oligonukleotidi so pred ligacijo 5’ fosforilirani. 
: iii) Izgrajevanje DNA fragmentov v končni genom z metodo cikličnega sestavljanja s polimerazo (PCA). 
=== Oligonukleotidi ===
Pri pripravi sintetičnega genoma ima čistost izhodnih oligonukleotidov zelo pomembno vlogo. Po kemični sintezi oligonukleotidov so med produkti prisotni oligonukleotidi z napakami - najpogosteje delecijami (npr. nedokončane sekvence, ali sekvence z izpuščenimi posameznimi nukleotidi). Uporaba takih oligonukleotidov bi vnesla visoko verjetnost mutacij v končni DNA. Ker je v neprečiščeni zmesi pravzaprav le okrog polovica oligonukleotidov popolnih, bi bila verjetnost sestave pravilnega celotnega genoma iz naključnih 130 oligonukleotiodov enaka (1/2)130 oz. ≈10–39. S stopnjo čiščenja z gelsko elektroforezo so to verjetnost znatno povišali. Uporaba oligonukleotidov s povsem enako dolžino jim je omogočila, da so vse oligonukleotide “očistili” hkrati, v zmesi. Pri tem so združili oligonukleotide z ene verige dvoverižne DNA ločeno od druge, in s tem poskušali preprečiti morebitno hibridizacijo med komplementarnimi deli.

=== Ligacija ===
Očiščene oligonukleotide so fosforilirali na 5’-koncu in izvedli ligacijo s termostabilno Taq ligazo. Taq ligaza deluje pri 55°C kar poveča specifičnost ligacije, saj povišana temperatura zmanjša verjetnost prileganja delno komplementarnih zaporedij in oligonukleotidov z vsebujočimi mutacijami. S to stopnjo so pridobili daljše dvoverižne DNA segmente. Teoretično bi lahko na tak način sestavili genom do končne dolžine, vendar v praksi prihaja do določenih omejitev, zaradi katerih to ni mogoče. Zato so po ligaciji dobljene segmente DNA (≈700bp) do končne dolžine povezali s postopkom cikličnega izgrajevanja s polimerazo (angl. polymerase cycling assembly, PCA).

=== Ciklično izgrajevanje s polimerazo (PCA)===
Reakcija PCA je analogna verižni reakciji s polimerazo PCR. Princip je enak, le da v reakcijski zmesi za PCA ni presežka oligonukleotidnih začetnikov. V zmesi imamo fragmente DNA – gradnike želene končne sekvence v obliki dvoverižnih, delno prekrivajočih se oligonukleotidov. V vsakem ciklu je DNA podvržena denaturaciji in ponovni renaturaciji, med katero se komplementarni deli verig prilegajo eden drugemu. Če oligonukleotid na 3’-koncu ne sega do konca 5’-konca komplementarnega, ki se mu prilega, ga polimeraza ustrezno podaljša. Verige v zmesi torej ena na drugo delujejo kot oligonukleotidni začetniki. Verige se v vsakem ciklu podaljšajo, dokler ne dosežejo končne dolžine oziroma, dokler podaljševanje ni več možno. Molekule iz reakcijske zmesi se lahko podaljšujejo le v smeri 5’→3’ in le enkrat do konca genoma po številnih ciklih. Popolno dolžino genoma torej lahko dosežejo le verige, ki vsebujejo 5’-končni del genomskega zaporedja. Pri reakciji ne pride do pomnoževanja – število verig od začetka ostaja isto. Da med reakcijo ne bi prišlo do razgrajevanja, je za reakcijo potrebna polimeraza brez 5’-eksonukleazne aktivnosti, z uporabo polimeraze s 3’→5’ eksonukleazno aktivnostjo, pa se poveča natančnost podaljševanja.

== Končna obdelava sintetičnih kromosomov in evalvacija viabilnih virionov ==
Tako so torej Smith et al. pridobili verige s kompletno dolžino, ki so jih od ostalih produktov ločili z gelsko elektroforezo. Kompletne verige DNA so nato pomnožili s klasičnim PCR, z oligonukleotidnima začetnikoma s 5’-konca vsake od komplementarnih verig. Produkte so cepili z restriktazo PstI in jih ponovno očistili z gelsko elektroforezo. Ligacijo ekstrahiranih linearnih DNA s popolno dolžino so izvedli v razredčeni raztopini, s čemer so se izognili povezovanja koncev med molekulami povečali verjetnost ligacije znotraj posamezne verige DNA. 
S tako dobljenimi krožnimi kromosomi so inficirali celice E.Coli. Infektivnost sintetičnih bakteriofagnih DNA je bila nižja od naravne. Razviti plaki so izkazovali heterogeno morfologijo. Pri enem plaku z morfologijo, tipično za divji tip φX174, so s sekvenciranjem potrdili identičnost sekvence uporabljenemu referenčnemu genomu φX174. Vse mutacije, ki so jih zasledili pri drugih analiziranih viabilnih virionih, so bile substitucije posameznih baz.

== Zaključki ==
Z opisanim postopkom je mogoče učinkovito sestavljati genetske kasete (dolžine 5-6kbp), vendar te brez dodatne selekcije vsebujejo približno eno napako na 500bp. Te napake se lahko popravi z usmerjeno mutagenezo. Raziskovalci so v času nastanka članka predvideli, da bi genom "minimalne" bakterijske celice lahko sestavili iz približno 60 takih kaset. 
Skupina je kasneje pristop nadgradila do te mere, da so s sintetičnim genomom uspeli rekonstruirati tudi bakterijsko celico <ref name="Gibson et al.2010"> Gibson DG, Glass JI, Lartigue C, Noskov VN, Chuang RY, Algire MA, Benders GA, et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science 2010, 329: 52-56.</ref>, pri kateri njen so lastni genetski material nadomestili s sintetični kromosomom. Letos pa so predstavili tudi prvo obliko “minimalnega bakterijskega genoma” <ref name="Hutchison et al. 2016"> Hutchison CA, Chuang RY, Noskov VN, Assad-Garcia N, Deerinck TJ, Ellisman MH, Gill J, et al. Design and synthesis of a minimal bacterial genome. Science 2016, 351: aad6253.</ref>. Ta obsega 531kbp (473 genov), kar je precej več od predpostavk iz leta 1999, snovalci pa ga predstavljajo kot delovno verzijo, za katero verjamejo, da bo v prihodnosti še skrčena in izboljšana. Omenjeni dosežki kažejo na to, da bo kmalu v laboratoriju mogoče sintetizirati praktično poljuben genom – tako po dolžini kot po vsebini. Kako racionalna je narava in kako malo pravzaprav zares vemo o skrivnosti genoma pa med drugim ilustrira dejstvo, da je trenutni “minimalen” celični genom od najmanjšega naravnega bakterijskega genoma (M. genitalum 525 genov, 580kbp) okrnjen le za slabih 10% (25 genov), ob tem pa kar 149 genov iz tega minimalnega nabora (skoraj tretjina) zaenkrat še nima povsem pojasnene biološke vloge <ref name="Hutchison et al. 2016"/>.
== Viri ==
1 Smith HO, Hutchison CA, Pfannkoch C, Venter JC. Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phiX174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100: 15440-15445. 

2 Hutchison CA, Peterson SN, Gill SR, Cline RT, White O, Fraser CM, Smith HO, et al. Global transposon mutagenesis and a minimal Mycoplasma genome. Science 1999, 286: 2165-2169. 

3 Cho MK, Magnus D, Caplan AL, McGee D, Group tEoG. Ethical Considerations in Synthesizing a Minimal Genome. Science 1999, 286:2087, 2089-2090. 

4 Douglas T, Savulescu J. Synthetic biology and the ethics of knowledge. J Med Ethics 2010, 36: 687-693. 

5 Goulian M, Kornberg A, Sinsheimer RL. Enzymatic synthesis of DNA, XXIV. Synthesis of infectious phage phi-X174 DNA. Proc Natl Acad Sci USA 1967, 58: 2321-2328. 

6 Sanger F, Coulson AR, Friedmann T, Air GM, Barrell BG, Brown NL, Fiddes JC, et al. The nucleotide sequence of bacteriophage phiX174. J Mol Biol 1978, 125: 225-246. 

7 Gibson DG, Glass JI, Lartigue C, Noskov VN, Chuang RY, Algire MA, Benders GA, et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science 2010, 329: 52-56. 

8 Hutchison CA, Chuang RY, Noskov VN, Assad-Garcia N, Deerinck TJ, Ellisman MH, Gill J, et al. Design and synthesis of a minimal bacterial genome. Science 2016, 351: aad6253.

Izdelava sintetičnega genoma s pristopom sestavljanja celotnega genoma: Bakteriofag φX174 iz sintetičnih oligonukleotidov

2016-11-21T19:57:40Z

Darja Bozic: New page: [http://www.pnas.org/content/100/26/15440.full.pdf| Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phi X174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides] == Povzetek == Raziskov...

[http://www.pnas.org/content/100/26/15440.full.pdf| Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phi X174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides]

== Povzetek ==
Raziskovalci inštituta J. Craig Venter Institute (JCVI) so razvili postopek, s katerim so v 14-ih dneh iz zbirke kemično pripravljenih oligonukleotidov sestavili infektivni genom bakteriofaga φX174 (5,386 bp). S tem so pokazali, da je mogoče na relativno enostaven in kratkotrajen način umetno poustvariti obsežno naravno genomsko strukturo dovolj pravilno, da je ta sposobna razviti, ohranjati in reproducirati svoj življenjski potencial. V ospredju članka Smith et al. 2003 <ref name="Smith et al. 2003"> Smith HO, Hutchison CA, Pfannkoch C, Venter JC. Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phiX174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100: 15440-15445.</ref> je torej metoda za učinkovito izgrajevanje dolgih segmentov DNA (5-6kbp) iz kratkih sintetičnih oligonukleotidov.

== Ozadje ==
Hutchinson et al. so leta 1999 izdali članek<ref name="Hutchison et al. 1999"> Hutchison CA, Peterson SN, Gill SR, Cline RT, White O, Fraser CM, Smith HO, et al. Global transposon mutagenesis and a minimal Mycoplasma genome. Science 1999, 286: 2165-2169.</ref>, ki opisuje idejo o konstruiranju organizma z minimalnim genomom, ki bi odprl vrata v nove razsežnosti raziskovanja skrivnosti življenja. Šlo bi za umetni organizem z najmanjšim možnim naborom genov, ki še omogoča življenje v permisivnih laboratorijskih pogojih. Na podlagi poizkusov z naključno mutagenezo, s katerimi so posamezne gene, so iz nabora genov bakterij iz rodu Mycoplasmae (te imajo najmanjši genom med znanimi prostoživečimi organizmi) izločili “pogrešljive” gene in na ta način oblikovali nabor “nepogrešljivih” genov. Predpostavili so, da bi ta nabor lahko predstavljal zadostno formulo za razvoj življenja in bi torej predstavljal genom “minimalnega organizma”. Taka osnovna celica, v kateri bi vsak gen imel popolnoma opredeljeno molekularno in biološko vlogo, bi znanstvenikom predstavljala podlago za dodajanje posameznih genov, preučevanje njihovih vlog in poljubno modeliranje organizmov z želenimi lastnostmi. Ideja je obetala z velikim raziskovalnim in proizvodnim potencialom, ki pa je hkrati(znova)odprl mnoga etična vprašanja in zadržke o potrebnosti, smiselnosti, smotrnosti in nevarnosti ustvarjanja novih živih bitij po golih človekovih željah in vzgibih. Nekateri pogledi na to problematiko iz raziskovalskega stališča so predstavljeni v razpravi etičnega odbora Univerze Stanford<ref name="Cho et al. 1999"> Cho MK, Magnus D, Caplan AL, McGee D, Group tEoG. Ethical Considerations in Synthesizing a Minimal Genome. Science 1999, 286:2087, 2089-2090.</ref>, ki je bila v reviji Science leta 1999 objavljena skupaj s člankom, nekaj razmislekov bioetikov pa v razpravi Douglas in Savulescu<ref name="Douglas in Savoulescu 2010">Douglas T, Savulescu J. Synthetic biology and the ethics of knowledge. J Med Ethics 2010, 36: 687-693.</ref>, iz leta 2010. 
Pri sestavi sintetičnega virusnega genoma, ki so jo predstavili Smith et al. 2003<ref name="Smith et al. 2003"/>, gre pravzaprav za razvoj tehničnega orodja za realizacijo te ideje. Zamisel o umetni sintezi organizmov je namreč precej prehitevala realno znanje in praktično izvedljivost izgradnje natančno opredeljenega zaporedja genomskih razsežnosti. Kemični postopki priprave nukleinskih kislin zaenkrat še vedno omogočajo sintezo nukleotidnih verig dolžine do okrog 200 baz. Z naraščajočo dolžino se veča tudi verjetnost napak in nepopolne sinteze. Zato je za oblikovanje genov in daljših genskih sestavov nujno razumevanje in obvladovanje sestavljanja iz krajših fragmentov.
 
Izbor genoma bakteriofaga φX174 za prototip za razvoj pristopa izvira iz njegove dobre raziskanosti. Kromosom φX174 je bil prvi genom, ki ga je znanstvenikom uspelo očistiti do homogenosti. Zanj je bilo prvič dokazana infektivnost v laboratoriju sintetizirane virusne DNA (pomnožene na podlagi intaktne naravne matrice)<ref name="Goulian et al. 1967"> Goulian M, Kornberg A, Sinsheimer RL. Enzymatic synthesis of DNA, XXIV. Synthesis of infectious phage phi-X174 DNA. Proc Natl Acad Sci USA 1967, 58: 2321-2328.</ref>, bakteriofag φX174 pa je bil tudi prvi organizem z v celoti znanim genomskim zaporedjem (Sanger et al., 1987)<ref name="Sanger et al.1978"> Sanger F, Coulson AR, Friedmann T, Air GM, Barrell BG, Brown NL, Fiddes JC, et al. The nucleotide sequence of bacteriophage phiX174. J Mol Biol 1978, 125: 225-246.</ref>.

== Postopek izgradnje sintetičnega genoma ==

{|
<table border=1 cellpadding=2 cellspacing=0 align=center>

|-
! Stopnja
! Predviden čas

|-
| Načrtovanje oligonukleotidov 
(~42 baz; pokrivajo celotno sekvenco želenega končnega zaporedja, z dodanim eksogenim restrikcijskim zaporedjem na začetku in koncu)
| 8h

|-
| Sinteza oligonukleotidov 

(DNA sintetizator)
| 4 dni

|-
| Čiščenje oligonukleotidov 

(zmes oligonukleotidov z iste verige, gelska elektoforeza pod denaturacijskimi pogoji)
| 2 dni

|-
| 5’-fosforiliranje oligonukleotidov
| 4 h

|-
| Ligacija oligonukleotidov v daljše segmente 
(inkubacija zmesi vseh oligonukleotidov s termostabilno Taq ligazo pri 55°C)
| 18h

|-
| Izgrajevanje do končnih kromosomov z metodo PCA 
(sestavljanje segmentov do celotnega končnega zaporedja)
| 12-24h

|-
| Pomnoževanje dobljenih kromosomov s klasičnim PCR
| 3h

|-
| Čiščenje produktov 
(gelska elektroforeza)
| 8h

|-
| Cirkularizacija DNA v infektivne krožne molekule 
(restrikcija očiščene linearne dvoverižne DNA z encimom, ki prepozna dodani sekvenci na začetku in koncu kromosoma in ligacija v razredčenih razmerah)
| 4h

|-
| Elektroporacija v E. Coli, gojenje
| 24h

|-
| Ekstrakcija plakov, sekvenciranje
| Skupaj: ~2 tedna

|} 
Sekvenco genoma φX174 so Smith et al. razdelili v 42 bazne oligonukleotide (130 za vsako od komplementarnih verig) in jih načrtovali tako, da so se oligonukleotidi iz komplementarnih verig med seboj delno prekrivali (vsak oligonukleotid je bil komplementaren polovici dveh zaporednih olikonukleotidov komplementarne verige). Pri tem so lineariziran genom na vsaki strani podaljšali za prepoznavno zaporedje za restrikcijo s PstI, ki sicer ni prisotno nikjer drugje v genomu φX174, in ki je omogočilo kasnejše povezovanje koncev kompletne DNA v infektivne krožne molekule. 

Njihov postopek izgradnje genoma iz pripravljenih sintetičnih oligonukleotidov je vseboval naslednje ključne korake: 
: i) Čiščenje sintetičnih oligonukleotidov z gelsko elektroforezo 
: ii) Ligacija očiščenih oligonukleotidov pod zaostrenimi pogoji (55°C). Oligonukleotidi so pred ligacijo 5’ fosforilirani. 
: iii) Izgrajevanje DNA fragmentov v končni genom z metodo cikličnega sestavljanja s polimerazo (PCA). 
=== Oligonukleotidi ===
Pri pripravi sintetičnega genoma ima čistost izhodnih oligonukleotidov zelo pomembno vlogo. Po kemični sintezi oligonukleotidov so med produkti prisotni oligonukleotidi z napakami - najpogosteje delecijami (npr. nedokončane sekvence, ali sekvence z izpuščenimi posameznimi nukleotidi). Uporaba takih oligonukleotidov bi vnesla visoko verjetnost mutacij v končni DNA. Ker je v neprečiščeni zmesi pravzaprav le okrog polovica oligonukleotidov popolnih, bi bila verjetnost sestave pravilnega celotnega genoma iz naključnih 130 oligonukleotiodov enaka (1/2)130 oz. ≈10–39. S stopnjo čiščenja z gelsko elektroforezo so to verjetnost znatno povišali. Uporaba oligonukleotidov s povsem enako dolžino jim je omogočila, da so vse oligonukleotide “očistili” hkrati, v zmesi. Pri tem so združili oligonukleotide z ene verige dvoverižne DNA ločeno od druge, in s tem poskušali preprečiti morebitno hibridizacijo med komplementarnimi deli.

=== Ligacija ===
Očiščene oligonukleotide so fosforilirali na 5’-koncu in izvedli ligacijo s termostabilno Taq ligazo. Taq ligaza deluje pri 55°C kar poveča specifičnost ligacije, saj povišana temperatura zmanjša verjetnost prileganja delno komplementarnih zaporedij in oligonukleotidov z vsebujočimi mutacijami. S to stopnjo so pridobili daljše dvoverižne DNA segmente. Teoretično bi lahko na tak način sestavili genom do končne dolžine, vendar v praksi prihaja do določenih omejitev, zaradi katerih to ni mogoče. Zato so po ligaciji dobljene segmente DNA (≈700bp) do končne dolžine povezali s postopkom cikličnega izgrajevanja s polimerazo (angl. polymerase cycling assembly, PCA).

=== Ciklično izgrajevanje s polimerazo (PCA)===
Reakcija PCA je analogna verižni reakciji s polimerazo PCR. Princip je enak, le da v reakcijski zmesi za PCA ni presežka oligonukleotidnih začetnikov. V zmesi imamo fragmente DNA – gradnike želene končne sekvence v obliki dvoverižnih, delno prekrivajočih se oligonukleotidov. V vsakem ciklu je DNA podvržena denaturaciji in ponovni renaturaciji, med katero se komplementarni deli verig prilegajo eden drugemu. Če oligonukleotid na 3’-koncu ne sega do konca 5’-konca komplementarnega, ki se mu prilega, ga polimeraza ustrezno podaljša. Verige v zmesi torej ena na drugo delujejo kot oligonukleotidni začetniki. Verige se v vsakem ciklu podaljšajo, dokler ne dosežejo končne dolžine oziroma, dokler podaljševanje ni več možno. Molekule iz reakcijske zmesi se lahko podaljšujejo le v smeri 5’→3’ in le enkrat do konca genoma po številnih ciklih. Popolno dolžino genoma torej lahko dosežejo le verige, ki vsebujejo 5’-končni del genomskega zaporedja. Pri reakciji ne pride do pomnoževanja – število verig od začetka ostaja isto. Da med reakcijo ne bi prišlo do razgrajevanja, je za reakcijo potrebna polimeraza brez 5’-eksonukleazne aktivnosti, z uporabo polimeraze s 3’→5’ eksonukleazno aktivnostjo, pa se poveča natančnost podaljševanja.

== Končna obdelava sintetičnih kromosomov in evalvacija viabilnih virionov ==
Tako so torej Smith et al. pridobili verige s kompletno dolžino, ki so jih od ostalih produktov ločili z gelsko elektroforezo. Kompletne verige DNA so nato pomnožili s klasičnim PCR, z oligonukleotidnima začetnikoma s 5’-konca vsake od komplementarnih verig. Produkte so cepili z restriktazo PstI in jih ponovno očistili z gelsko elektroforezo. Ligacijo ekstrahiranih linearnih DNA s popolno dolžino so izvedli v razredčeni raztopini, s čemer so se izognili povezovanja koncev med molekulami povečali verjetnost ligacije znotraj posamezne verige DNA. 
S tako dobljenimi krožnimi kromosomi so inficirali celice E.Coli. Infektivnost sintetičnih bakteriofagnih DNA je bila nižja od naravne. Razviti plaki so izkazovali heterogeno morfologijo. Pri enem plaku z morfologijo, tipično za divji tip φX174, so s sekvenciranjem potrdili identičnost sekvence uporabljenemu referenčnemu genomu φX174. Vse mutacije, ki so jih zasledili pri drugih analiziranih viabilnih virionih, so bile substitucije posameznih baz.

== Zaključki ==
Z opisanim postopkom je mogoče učinkovito sestavljati genetske kasete (dolžine 5-6kbp), vendar te brez dodatne selekcije vsebujejo približno eno napako na 500bp. Te napake se lahko popravi z usmerjeno mutagenezo. Raziskovalci so v času nastanka članka predvideli, da bi genom "minimalne" bakterijske celice lahko sestavili iz približno 60 takih kaset. 
Skupina je kasneje pristop nadgradila do te mere, da so s sintetičnim genomom uspeli rekonstruirati tudi bakterijsko celico <ref name="Gibson et al.2010"> Gibson DG, Glass JI, Lartigue C, Noskov VN, Chuang RY, Algire MA, Benders GA, et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science 2010, 329: 52-56.</ref>, pri kateri njen so lastni genetski material nadomestili s sintetični kromosomom. Letos pa so predstavili tudi prvo obliko “minimalnega bakterijskega genoma” <ref name="Hutchison et al. 2016"> Hutchison CA, Chuang RY, Noskov VN, Assad-Garcia N, Deerinck TJ, Ellisman MH, Gill J, et al. Design and synthesis of a minimal bacterial genome. Science 2016, 351: aad6253.</ref>. Ta obsega 531kbp (473 genov), kar je precej več od predpostavk iz leta 1999, snovalci pa ga predstavljajo kot delovno verzijo, za katero verjamejo, da bo v prihodnosti še skrčena in izboljšana. Omenjeni dosežki kažejo na to, da bo kmalu v laboratoriju mogoče sintetizirati praktično poljuben genom – tako po dolžini kot po vsebini. Kako racionalna je narava in kako malo pravzaprav zares vemo o skrivnosti genoma pa med drugim ilustrira dejstvo, da je trenutni “minimalen” celični genom od najmanjšega naravnega bakterijskega genoma (M. genitalum 525 genov, 580kbp) okrnjen le za slabih 10% (25 genov), ob tem pa kar 149 genov iz tega minimalnega nabora (skoraj tretjina) zaenkrat še nima povsem pojasnene biološke vloge <ref name="Hutchison et al. 2016"/>.